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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023175325
(43)【公開日】2023-12-12
(54)【発明の名称】タウオパチーの鑑別診断法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20231205BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 D
G01N33/53 Y
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022087713
(22)【出願日】2022-05-30
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り （１）２０２１年６月１４日 「順天堂大学学術情報リポジトリ」にて公開 （２）２０２２年３月１８日 「順天堂大学学術情報リポジトリ」にて公開
(71)【出願人】
【識別番号】502285457
【氏名又は名称】学校法人順天堂
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】谷口 大祐
(72)【発明者】
【氏名】服部 信孝
(72)【発明者】
【氏名】波田野 琢
(72)【発明者】
【氏名】今居 譲
(57)【要約】
【課題】タウオパチーのうち、大脳皮質基底核変性症とＰＳＰとを区別して容易に診断できる方法を提供すること。
【解決手段】ヒト由来の検体にヒトタウ蛋白のＡ１６８から始まるＣ末断片のＮ末側を認識する抗体及びヒトタウ蛋白のＮ３６８で切断されたＮ末断片のＣ末側を認識する抗体を反応させることを特徴とする、ヒト検体中の大脳皮質基底核変性症に特異的なタウ断片の検出方法。
【選択図】なし
【解決手段】ヒト由来の検体にヒトタウ蛋白のＡ１６８から始まるＣ末断片のＮ末側を認識する抗体及びヒトタウ蛋白のＮ３６８で切断されたＮ末断片のＣ末側を認識する抗体を反応させることを特徴とする、ヒト検体中の大脳皮質基底核変性症に特異的なタウ断片の検出方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒト由来の検体にヒトタウ蛋白のＡ１６８から始まるＣ末断片のＮ末側を認識する抗体及びヒトタウ蛋白のＮ３６８で切断されたＮ末断片のＣ末側を認識する抗体を反応させることを特徴とする、ヒト検体中の大脳皮質基底核変性症に特異的なタウ断片の検出方法。
【請求項2】
前記ヒトタウ蛋白のＡ１６８から始まるＣ末断片のＮ末側を認識する抗体と反応し、前記ヒトタウ蛋白のＮ３６８で切断されたＮ末断片のＣ末側を認識する抗体と反応しない検体が、大脳皮質基底核変性症に特異的なタウ断片を有する検体であると判定する請求項１記載の検出方法。
【請求項3】
前記抗体の反応が、免疫組織染色である請求項１又は２記載の検出方法。
【請求項4】
ヒト由来の検体に対して、ヒトタウ蛋白のＡ１６８から始まるＣ末断片のＮ末側を認識する抗体、ヒトタウ蛋白のＮ３６８で切断されたＮ末断片のＣ末側を認識する抗体、及びヒトタウ蛋白のＡ１６８－Ｎ３６８断片を認識する抗体から選ばれる１種以上の抗体を用いてウエスタンブロット法を行うことを特徴とする、ヒト検体中の大脳皮質基底核変性症に特異的なタウ断片の検出方法。
【請求項5】
ヒト由来の検体が、タウ蛋白を含有するヒト由来の検体である請求項１～４のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項6】
ヒトタウ蛋白のＡ１６８から始まるＣ末断片のＮ末側を認識する抗体及びヒトタウ蛋白のＮ３６８で切断されたＮ末断片のＣ末側を認識する抗体を含有する大脳皮質基底核変性症診断薬。
【請求項7】
ヒトタウ蛋白のＡ１６８から始まるＣ末断片のＮ末側を認識する抗体、ヒトタウ蛋白のＮ３６８で切断されたＮ末断片のＣ末側を認識する抗体、及びヒトタウ蛋白のＡ１６８－Ｎ３６８断片を認識する抗体から選ばれる１種以上の抗体を含有する、ウエスタンブロット用大脳皮質基底核変性症診断薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、タウオパチーの鑑別診断法に関する。
【背景技術】
【0002】
タウオパチーは、ヒトの脳の神経細胞やグリア細胞において不溶化タウの沈着を伴う神経変性疾患群である。タウオパチーには、アルツハイマー病、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）などがある。
このうち、ＣＢＤとＰＳＰはともにパーキンソニズムを呈する代表的なタウオパチーであるが、両者は臨床的に鑑別が困難なことが多い。確定診断は、病理学的にはアストロサイトのタウ病理の形態、生化学的には患者脳不溶画分のタウＣ末側タウ断片のバンドパターンの違いによってなされるが、診断には経験を要する。
このうち、ＣＢＤとＰＳＰはともにパーキンソニズムを呈する代表的なタウオパチーであるが、両者は臨床的に鑑別が困難なことが多い。確定診断は、病理学的にはアストロサイトのタウ病理の形態、生化学的には患者脳不溶画分のタウＣ末側タウ断片のバンドパターンの違いによってなされるが、診断には経験を要する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
本発明の課題は、タウオパチーのうち、ＣＢＤとＰＳＰとを区別して容易に診断できる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0004】
ＣＢＤは、生化学的にはサルコシル不溶分画中に３７－４０ｋＤａのＣ末側タウ断片を認める点が特徴的だが、その生成機序は解明されていなかった。そこで 、本発明者は、タウ蛋白の切断酵素としてリソソーム酵素であるアスパラギンエンドペプチダーゼ（レグマイン）を想定して検討したところ、レグマインで処理したタウ凝集体の切断パターンの違いにより、３７－４０ｋＤａのＣ末側タウ断片が生じることを見出した。また、切断パターンの違いはＣＢＤに特異的なタウ凝集体の構造から生じることも見出し、レグマイン切断断片を認識する抗体を用いることにより、ウエスタンブロット法でＣＢＤとＰＳＰを鑑別できることを見出した。さらに、レグマイン切断部位を特異的に認識する抗体を用いることで、今まで免疫組織学的に区別が困難であったＣＢＤのアストロサイト斑とＰＳＰに特異的な房状アストロサイトを区別できることを見出し、本発明を完成した。
【0005】
すなわち、本発明は、次の発明［１］～［７］を提供するものである。
［１］ヒト由来の検体にヒトタウ蛋白のＡ１６８から始まるＣ末断片のＮ末側を認識する抗体及びヒトタウ蛋白のＮ３６８で切断されたＮ末断片のＣ末側を認識する抗体を反応させることを特徴とする、ヒト検体中のＣＢＤに特異的なタウ断片の検出方法。
［２］前記ヒトタウ蛋白のＡ１６８から始まるＣ末断片のＮ末側を認識する抗体と反応し、前記ヒトタウ蛋白のＮ３６８で切断されたＮ末断片のＣ末側を認識する抗体と反応しない検体が、ＣＢＤに特異的なタウ断片を有する検体であると判定する［１］記載の検出方法。
［３］前記抗体の反応が、免疫組織染色である［１］又は［２］記載の検出方法。
［４］ヒト由来の検体に対して、ヒトタウ蛋白のＡ１６８から始まるＣ末断片のＮ末側を認識する抗体、ヒトタウ蛋白のＮ３６８で切断されたＮ末断片のＣ末側を認識する抗体、及びヒトタウ蛋白のＡ１６８－Ｎ３６８断片を認識する抗体から選ばれる１種以上の抗体を用いてウエスタンブロット法を行うことを特徴とする、ヒト検体中のＣＢＤに特異的なタウ断片の検出方法。
［５］ヒト由来の検体が、タウ蛋白を含有するヒト由来の検体である［１］ ～［４］のいずれかに記載の検出方法。
［６］ヒトタウ蛋白のＡ１６８から始まるＣ末断片のＮ末側を認識する抗体及びヒトタウ蛋白のＮ３６８で切断されたＮ末断片のＣ末側を認識する抗体を含有するＣＢＤ診断薬。
［７］ヒトタウ蛋白のＡ１６８から始まるＣ末断片のＮ末側を認識する抗体、ヒトタウ蛋白のＮ３６８で切断されたＮ末断片のＣ末側を認識する抗体、及びヒトタウ蛋白のＡ１６８－N３６８断片を認識する抗体から選ばれる１種以上の抗体を含有する、ウエスタンブロット用ＣＢＤ診断薬。
［１］ヒト由来の検体にヒトタウ蛋白のＡ１６８から始まるＣ末断片のＮ末側を認識する抗体及びヒトタウ蛋白のＮ３６８で切断されたＮ末断片のＣ末側を認識する抗体を反応させることを特徴とする、ヒト検体中のＣＢＤに特異的なタウ断片の検出方法。
［２］前記ヒトタウ蛋白のＡ１６８から始まるＣ末断片のＮ末側を認識する抗体と反応し、前記ヒトタウ蛋白のＮ３６８で切断されたＮ末断片のＣ末側を認識する抗体と反応しない検体が、ＣＢＤに特異的なタウ断片を有する検体であると判定する［１］記載の検出方法。
［３］前記抗体の反応が、免疫組織染色である［１］又は［２］記載の検出方法。
［４］ヒト由来の検体に対して、ヒトタウ蛋白のＡ１６８から始まるＣ末断片のＮ末側を認識する抗体、ヒトタウ蛋白のＮ３６８で切断されたＮ末断片のＣ末側を認識する抗体、及びヒトタウ蛋白のＡ１６８－Ｎ３６８断片を認識する抗体から選ばれる１種以上の抗体を用いてウエスタンブロット法を行うことを特徴とする、ヒト検体中のＣＢＤに特異的なタウ断片の検出方法。
［５］ヒト由来の検体が、タウ蛋白を含有するヒト由来の検体である［１］ ～［４］のいずれかに記載の検出方法。
［６］ヒトタウ蛋白のＡ１６８から始まるＣ末断片のＮ末側を認識する抗体及びヒトタウ蛋白のＮ３６８で切断されたＮ末断片のＣ末側を認識する抗体を含有するＣＢＤ診断薬。
［７］ヒトタウ蛋白のＡ１６８から始まるＣ末断片のＮ末側を認識する抗体、ヒトタウ蛋白のＮ３６８で切断されたＮ末断片のＣ末側を認識する抗体、及びヒトタウ蛋白のＡ１６８－N３６８断片を認識する抗体から選ばれる１種以上の抗体を含有する、ウエスタンブロット用ＣＢＤ診断薬。
【発明の効果】
【0006】
本発明方法によれば、簡便な免疫組織染色法又はウエスタンブロット法の手段により、ＣＢＤとＰＳＰとを明確に区別して診断できる。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1】タウ蛋白全長と、レグマイン切断部位、Ａ１６８Ｃ末断片、Ｎ３６８Ｎ末断片、抗Ａ１６８抗体と抗Ｎ３６８抗体の認識部位を示す図である。
【図2】患者脳の１％サルコシル不溶画分のウエスタンブロットの図である。黒矢頭でＣＢＤの特異的な３７－４０ｋＤａＣ末断片を示している。タウＣ末抗体は、市販品タウモノクローナル抗体Ｔ４６を使用した。
【図3】ＰＳＰとＣＢＤの不溶化タウにレグマインを反応させ、経時的変化を見たウエスタンブロットの図である。黒矢頭で全長タウ、白矢頭で３７－４０ｋＤａＣ末断片を示している。
【図4】ＰＳＰの房状アストロサイトとＣＢＤのアストロサイト斑の、抗リン酸化タウ抗体と抗Ａ１６８抗体による蛍光二重免疫組織染色の図である。抗リン酸化タウ抗体は、市販されているモノクローナル抗体ＡＴ８を使用した。
【図5】ＰＳＰの房状アストロサイトとＣＢＤのアストロサイト斑の抗リン酸化タウ抗体と抗Ｎ３６８抗体による蛍光二重免疫組織染色の図である。
【図6】不溶化タウの立体構造をグアニジン塩酸塩で壊したのちにレグマインを反応させ、経時的変化を見たウエスタンブロットの図である。黒矢頭で全長タウ、白矢頭で３７－４０ｋＤａＣ末断片を示している。
【発明を実施するための形態】
【0008】
本発明の一形態は、ヒト由来の検体に、ヒトタウ蛋白のＡ１６８から始まるＣ末断片のＮ末側を認識する抗体及びヒトタウ蛋白のＮ３６８で切断されたＮ末断片のＣ末側を認識する抗体を反応させることを特徴とする、ヒト検体中のＣＢＤに特異的なタウ断片の検出方法である。
【0009】
本発明に用いられる検体としては、ヒト由来のタウ蛋白の存在が疑われる細胞を含む組織、髄液等の体液などが挙げられる。そのような細胞としては、神経細胞、アストロサイトを含む組織、体液、及び患者体液由来のタウ蛋白を感染させた培養細胞が挙げられる。
【0010】
本発明に用いられる抗体は、ヒトタウ蛋白のＡ１６８から始まるＣ末断片のＮ末側を認識する抗体と、ヒトタウ蛋白のＮ３６８で切断されたＮ末断片のＣ末側を認識する抗体である。
ヒトタウ蛋白のＡ１６８から始まるＣ末断片は、図１に示すＡ１６８Ｃ末断片、すなわちタウ蛋白の１６８番目のアラニン（Ａ）から始まるＣ末断片である。従って、ヒトタウ蛋白のＡ１６８から始まるＣ末断片のＮ末側を認識する抗体は、図１のＡ１６８Ｃ末断片のＮ末側を認識する抗体（抗Ａ１６８抗体）である。
このような抗Ａ１６８抗体としては、Ａ１６８から始まる６～２０ペプチド、好ましくはＡ１６８から始まる６～１６ペプチドを抗原として用いて、通常のモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の製造法に従って製造することができる。得られた抗体から、Ａ１６８Ｃ末断片のＮ末側を認識する抗体を、アフィニティー精製で単離するのが好ましい。
ヒトタウ蛋白のＡ１６８から始まるＣ末断片は、図１に示すＡ１６８Ｃ末断片、すなわちタウ蛋白の１６８番目のアラニン（Ａ）から始まるＣ末断片である。従って、ヒトタウ蛋白のＡ１６８から始まるＣ末断片のＮ末側を認識する抗体は、図１のＡ１６８Ｃ末断片のＮ末側を認識する抗体（抗Ａ１６８抗体）である。
このような抗Ａ１６８抗体としては、Ａ１６８から始まる６～２０ペプチド、好ましくはＡ１６８から始まる６～１６ペプチドを抗原として用いて、通常のモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の製造法に従って製造することができる。得られた抗体から、Ａ１６８Ｃ末断片のＮ末側を認識する抗体を、アフィニティー精製で単離するのが好ましい。
【0011】
ヒトタウ蛋白のＮ３６８で切断されたＮ末断片は、図１に示すＮ３６８Ｎ末断片、すなわちタウ蛋白の３６８番目のアスパラギン（Ｎ）で切断されたＮ末断片である。従って、ヒトタウ蛋白のＮ３６８で切断されＮ末断片のＣ末側を認識する抗体は、図１のＮ３６８Ｎ末断片のＣ末側を認識する抗体（抗Ｎ３６８抗体）である。
このような抗Ｎ３６８抗体としては、例えばＮ３６８をＮ末側とする６～２０ペプチド、好ましくはＮ３６８をＮ末側とする６～１６ペプチドを抗原として用いて、通常のモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の製造法に従って製造することができる。得られた抗体から、Ｎ３６８Ｎ末断片のＣ末側を認識する抗体を、アフィニティー精製で単離するのが好ましい。また、Ｎ３６８Ｎ末断片のＣ末側を認識する抗体は、市販されているものを使用することもできる。
このような抗Ｎ３６８抗体としては、例えばＮ３６８をＮ末側とする６～２０ペプチド、好ましくはＮ３６８をＮ末側とする６～１６ペプチドを抗原として用いて、通常のモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の製造法に従って製造することができる。得られた抗体から、Ｎ３６８Ｎ末断片のＣ末側を認識する抗体を、アフィニティー精製で単離するのが好ましい。また、Ｎ３６８Ｎ末断片のＣ末側を認識する抗体は、市販されているものを使用することもできる。
【0012】
ヒト由来の検体に、ヒトタウ蛋１６８から始まるＣ末断片のＮ末側を認識する抗体及びヒトタウ蛋白のＮ３６８で切断されたＮ末断片のＣ末側を認識する抗体を反応させる手段としては、ウエスタンブロット法と免疫組織染色法が挙げられるが、免疫組織染色法が好ましい。
【0013】
免疫組織染色は、蛍光染色及び色素染色のいずれでもよい。蛍光染色には、ＦＩＴＣ、Ａｌｅｘａ、Ｆｌｕｏｒ色素、Ｃｙ色素などの蛍光色素を用いても、ＰＥ、ＡＰＣなどの蛍光蛋白を用いてもよい。色素染色においては、標識酵素、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどを用いることができる。また、染色方法としては、直接法、間接法、増感法のいずれでもよい。
ここで、抗Ａ１６８抗体と抗Ｎ３６８抗体を用いて免疫組織染色する場合の手順としては、スライドガラス上に薄切した患者脳検体を、加熱法により不活化し、一次抗体、二次抗体を反応させる。自家蛍光を消失させる処理を行い、カバーガラスで封入することで、顕微鏡観察を行うことができる。
ここで、抗Ａ１６８抗体と抗Ｎ３６８抗体を用いて免疫組織染色する場合の手順としては、スライドガラス上に薄切した患者脳検体を、加熱法により不活化し、一次抗体、二次抗体を反応させる。自家蛍光を消失させる処理を行い、カバーガラスで封入することで、顕微鏡観察を行うことができる。
【0014】
図４のように、ＰＳＰの房状アストロサイトは前記２種の抗体のいずれにも反応した。一方、図５のようにＣＢＤのアストロサイト斑では、抗Ａ１６８抗体は反応したが、抗Ｎ３６８抗体とは反応せず、ＣＢＤでは、Ｎ１６７で切断されるが、Ｎ３６８では切断耐性があることが判明した。
【0015】
免疫染色組織染色の結果から、前記ヒトタウ蛋白のＡ１６８から始まるＣ末断片のＮ末側を認識する抗体と反応し、前記ヒトタウ蛋白のＮ３６８で切断されたＮ末断片のＣ末側を認識する抗体と反応しない検体が、ＣＢＤに特異的なタウ断片を有する検体であると判定することができる。
【0016】
本発明の一態様は、ヒトタウ蛋白のＡ１６８から始まるＣ末断片のＮ末側を認識する抗体及びヒトタウ蛋白のＮ３６８で切断されたＮ末断片のＣ末側を認識する抗体を含有するＣＢＤ診断薬である。
本発明の診断薬に用いられる抗体は、前記の抗体自体でもよく、種々の酵素、色素などで標識された抗体であってもよい。また、本発明の診断薬には、緩衝剤、不活化剤、プロトコールなどが含まれていてもよい。
本発明の診断薬に用いられる抗体は、前記の抗体自体でもよく、種々の酵素、色素などで標識された抗体であってもよい。また、本発明の診断薬には、緩衝剤、不活化剤、プロトコールなどが含まれていてもよい。
【0017】
本発明の別の一態様は、ヒト由来の検体に対して、ヒトタウ蛋白のＡ１６８から始まるＣ末断片のＮ末側を認識する抗体、ヒトタウ蛋白のＮ３６８で切断されたＮ末断片のＣ末側を認識する抗体、及びヒトタウ蛋白のＡ１６８－Ｎ３６８断片を認識する抗体から選ばれる１種以上の抗体を用いてウエスタンブロット法を行うことを特徴とする、ヒト検体中のＣＢＤに特異的なタウ断片の検出方法である。
【0018】
本発明に用いられる検体としては、ヒト由来のタウ蛋白の存在が疑われる細胞を含む組織由来の細胞懸濁液、髄液等の体液などが挙げられる。そのような細胞としては、神経細胞、アストロサイトを含む組織、体液、及び患者体液由来のタウ蛋白を感染させた培養細胞が挙げられる。
【0019】
本発明に用いられるヒトタウ蛋白のＡ１６８から始まるＣ末断片のＮ末側を認識する抗体、及びヒトタウ蛋白のＮ３６８で切断されたＮ末断片のＣ末側を認識する抗体は、前記のものを用いることができる。また、ヒトタウ蛋白のＡ１６８－Ｎ３６８断片を認識する抗体としては、市販のこの断片を認識する抗体を使用することができる。
【0020】
ウエスタンブロット法は、例えば、患者脳不溶画分中のタウ蛋白を抗Ａ１６８抗体に反応させる。または、患者脳不溶化中のタウ蛋白をレグマインに反応させたのち例えば抗Ａ１６８抗体に反応させる。
図２のように、ＣＢＤの患者脳不溶画分中のタウ蛋白は抗Ａ１６８抗体と反応させると３７－４０ｋＤａの明瞭なバンドが得られるが、ＰＳＰでは明瞭なバンドは認めない。また、図３のように患者脳不溶画分中のタウ蛋白をレグマインに反応させたのちに抗Ａ１６８抗体に反応させると、ＣＢＤではレグマインに切断耐性のある３７－４０ｋＤａのバンドが得られるが、ＰＳＰではレグマインによる切断が進むため、３７－４０ｋＤａのバンドは経時的に消失することが判明した。
図２のように、ＣＢＤの患者脳不溶画分中のタウ蛋白は抗Ａ１６８抗体と反応させると３７－４０ｋＤａの明瞭なバンドが得られるが、ＰＳＰでは明瞭なバンドは認めない。また、図３のように患者脳不溶画分中のタウ蛋白をレグマインに反応させたのちに抗Ａ１６８抗体に反応させると、ＣＢＤではレグマインに切断耐性のある３７－４０ｋＤａのバンドが得られるが、ＰＳＰではレグマインによる切断が進むため、３７－４０ｋＤａのバンドは経時的に消失することが判明した。
【0021】
レグマインの切断パターンの違いによるＣＢＤでみられるタウ凝集体の構造の違いは、ウエスタンブロットでも区別できる。この方法では、抗Ａ１６８抗体の使用のほか、市販されている抗タウ抗体の利用も可能である。抗Ａ１６８抗体を使用の場合は、抗Ａ１６８抗体で認識されるバンドが生じるか否かで区別ができる。抗タウ抗体の場合は、分子量の違い（ウエスタンブロットのバンドのパターン）で区別できる。
【0022】
本発明の別の一態様は、ヒトタウ蛋白のＡ１６８から始まるＣ末断片のＮ末側を認識する抗体、ヒトタウ蛋白のＮ３６８で切断されたＮ末断片のＣ末側を認識する抗体、及びヒトタウ蛋白のＡ１６８－N３６８断片を認識する抗体から選ばれる１種以上の抗体を含有する、ウエスタンブロット用ＣＢＤ診断薬である。
本発明の診断薬に用いられる抗体は、前記の抗体自体でもよく、種々の酵素、色素などで標識された抗体であってもよい。また、本発明の診断薬には、緩衝剤、不活化剤、プロトコールなどが含まれていてもよい。
本発明の診断薬に用いられる抗体は、前記の抗体自体でもよく、種々の酵素、色素などで標識された抗体であってもよい。また、本発明の診断薬には、緩衝剤、不活化剤、プロトコールなどが含まれていてもよい。
【0023】
ＣＢＤではアルツハイマー病やＰＳＰ、コントロール群と比較してレグマインの機能に異常はなく、Ｎ３６８部位での切断抵抗性はタウ凝集体の構造を壊すことで消失したことから、切断パターンの違いはタウ凝集体の構造の違いが原因であることが示唆された。また、レグマイン切断部位を特異的に認識する抗体を用いることで、アストロサイト斑とＰＳＰで見られる房状アストロサイトを免疫組織学的に区別できることが明らかになった。
【実施例0024】
次に実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定さるものではない。
【0025】
実施例１（抗Ａ１６８抗体の作製）
タウ蛋白のレグマイン切断断片であるＡ１６８から始まる１０アミノ酸のＣ末端にシステイン残基を加えた１１アミノ酸をペプチド抗原（配列番号１）としてウサギ２羽にそれぞれ計４回免疫し、免疫開始後４９日目に全採血を行う。Ａ１６８－Ｃ末断片から始まるリコンビナントタウに対する反応が強い血清のアフィニティー精製を行う。アフィニティー精製はリコンビナント全長タウとリコンビナントＡ１６８－Ｃ末断片をそれぞれ固層化したカラムを用い、Ａ１６８－Ｃ末断片に反応し、全長タウに反応しない抗体を精製する。
タウ蛋白のレグマイン切断断片であるＡ１６８から始まる１０アミノ酸のＣ末端にシステイン残基を加えた１１アミノ酸をペプチド抗原（配列番号１）としてウサギ２羽にそれぞれ計４回免疫し、免疫開始後４９日目に全採血を行う。Ａ１６８－Ｃ末断片から始まるリコンビナントタウに対する反応が強い血清のアフィニティー精製を行う。アフィニティー精製はリコンビナント全長タウとリコンビナントＡ１６８－Ｃ末断片をそれぞれ固層化したカラムを用い、Ａ１６８－Ｃ末断片に反応し、全長タウに反応しない抗体を精製する。
【0026】
実施例２（検体と抗体との反応）
（材料）
患者脳凍結組織、又は患者脳ホルマリン固定パラフィン組織切片。
（材料）
患者脳凍結組織、又は患者脳ホルマリン固定パラフィン組織切片。
【0027】
（方法）
免疫組織染色法では、ホルマリン固定パラフィン包埋した患者脳組織を薄切しスライドガラスに伸展する。脱パラフィン処理後にｐＨ９の緩衝液で熱賦活化を行う。ブロッキング後に一次抗体を反応させる。この際の一次抗体は２００倍希釈を目安に使用する。二次抗体としてＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ色素を反応させた後に、自家蛍光を消失させ、カバーガラスで封入する。観察は共焦点顕微鏡で行う。
ウエスタンブロット法では、患者脳凍結組織から細胞懸濁液を作成し、サルコシルと反応させた後に超遠心を行い、ペレット（サルコシル不溶画分）を得る。得られたペレットはタウ凝集体の立体構造を壊す目的でグアニジン塩酸塩を処理した群と処理しない群に分け、それぞれレグマインで処理したのちに、ウエスタンブロットを行い、抗Ａ１６８抗体と反応させる。
免疫組織染色法では、ホルマリン固定パラフィン包埋した患者脳組織を薄切しスライドガラスに伸展する。脱パラフィン処理後にｐＨ９の緩衝液で熱賦活化を行う。ブロッキング後に一次抗体を反応させる。この際の一次抗体は２００倍希釈を目安に使用する。二次抗体としてＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ色素を反応させた後に、自家蛍光を消失させ、カバーガラスで封入する。観察は共焦点顕微鏡で行う。
ウエスタンブロット法では、患者脳凍結組織から細胞懸濁液を作成し、サルコシルと反応させた後に超遠心を行い、ペレット（サルコシル不溶画分）を得る。得られたペレットはタウ凝集体の立体構造を壊す目的でグアニジン塩酸塩を処理した群と処理しない群に分け、それぞれレグマインで処理したのちに、ウエスタンブロットを行い、抗Ａ１６８抗体と反応させる。
【0028】
（結果）
免疫組織染色では，アストロサイト斑にはＮ３６８切断部位を認識する抗体で染色性がなかったが、ＰＳＰの房状アストロサイトでは染色性を認めた。
ウエスタンブロット法で、抗１６８抗体はＣＢＤの３７－４０ｋＤａのＣ末側タウ断片を認識したが、ＰＳＰにはほとんど反応しなかった。
レグマインはタウ凝集体のＮ１６７、Ｎ３６８部位を切断したが、ＣＢＤのタウ凝集体でのみＮ３６８での切断に抵抗性を認めた。Ｎ１６７で切断され、Ｎ３６８で切断されなかったタウ断片により３７－４０ｋＤａのＣ末側タウ断片は形成されていた。図６のように、Ｎ３６８部位での切断抵抗性はタウ凝集体の構造を壊すことで消失した。
免疫組織染色では，アストロサイト斑にはＮ３６８切断部位を認識する抗体で染色性がなかったが、ＰＳＰの房状アストロサイトでは染色性を認めた。
ウエスタンブロット法で、抗１６８抗体はＣＢＤの３７－４０ｋＤａのＣ末側タウ断片を認識したが、ＰＳＰにはほとんど反応しなかった。
レグマインはタウ凝集体のＮ１６７、Ｎ３６８部位を切断したが、ＣＢＤのタウ凝集体でのみＮ３６８での切断に抵抗性を認めた。Ｎ１６７で切断され、Ｎ３６８で切断されなかったタウ断片により３７－４０ｋＤａのＣ末側タウ断片は形成されていた。図６のように、Ｎ３６８部位での切断抵抗性はタウ凝集体の構造を壊すことで消失した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】