特開 2023-175664 ＲＴ－ＰＣＲを用いてｉｎ ｓｉｔｕ標的増幅と空間固有分子識別子（ＳＵＭＩ）同定とを組み合わせた方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023175664

(43)【公開日】2023-12-12

(54)【発明の名称】ＲＴ－ＰＣＲを用いてｉｎ ｓｉｔｕ標的増幅と空間固有分子識別子（ＳＵＭＩ）同定とを組み合わせた方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6869 20180101AFI20231205BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALN20231205BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6869 Z

C12Q1/686 Z

【審査請求】未請求

【請求項の数】9

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2023087766

(22)【出願日】2023-05-29

(31)【優先権主張番号】22176171

(32)【優先日】2022-05-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(71)【出願人】

【識別番号】520094891

【氏名又は名称】ミルテニー バイオテック ベー．フェー． ウント コー． カー・ゲー

【氏名又は名称原語表記】Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｂ．Ｖ． ＆ Ｃｏ． ＫＧ

【住所又は居所原語表記】Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ－Ｅｂｅｒｔ－Ｓｔｒａｓｓｅ ６８， ５１４２９ Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ

(74)【代理人】

【識別番号】100114890

【弁理士】

【氏名又は名称】アインゼル・フェリックス＝ラインハルト

(74)【代理人】

【識別番号】100098501

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 拓

(74)【代理人】

【識別番号】100116403

【弁理士】

【氏名又は名称】前川 純一

(74)【代理人】

【識別番号】100134315

【弁理士】

【氏名又は名称】永島 秀郎

(74)【代理人】

【識別番号】100162880

【弁理士】

【氏名又は名称】上島 類

(72)【発明者】

【氏名】ロバート ピナード

(72)【発明者】

【氏名】アンドレアス ボズィオ

(72)【発明者】

【氏名】トーマス ロートマン

(72)【発明者】

【氏名】細野 正裕

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA13

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR08

4B063QR32

4B063QR35

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS25

(57)【要約】      （修正有）

【課題】ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ内の標的配列の空間位置および配列情報を獲得する方法の提供。
【解決手段】逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）によって増幅した第１のオリゴヌクレオチドを鋳型としてＲＴ－ＰＣＲにより第２のオリゴヌクレオチドを増幅して第１及び第２のＰＣＲハンドルとしての配列および標的配列を有する第３のオリゴヌクレオチドを得、第２のＰＣＲハンドルに相補的な配列と、空間固有分子識別子（ＳＵＭＩ）としての配列を含む第４のオリゴヌクレオチドが提供され、第４のオリゴヌクレオチドのＳＵＭＩの配列を決定し、第４のオリゴヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを鋳型として使用して、ポリメラーゼで前記第３のオリゴヌクレオチドを伸長させ、伸長させられた前記第３のオリゴヌクレオチド内へＳＵＭＩを組み込み、配列を決定し、伸長させられた前記第３のオリゴヌクレオチド内へＳＵＭＩを組み込むステップを含む方法。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも１つのＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ内の標的配列の空間位置および配列情報を獲得する方法であって、
ａ．前記少なくとも１つのＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡの相補的区画に第１のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップであって、前記第１のオリゴヌクレオチドに第１のＰＣＲハンドルとしての配列が提供される、第１のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップ、
ｂ．逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を用いて、前記少なくとも１つのＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡを鋳型として使用して前記第１のオリゴヌクレオチドを増幅するステップ、
ｃ．増幅された前記第１のオリゴヌクレオチドから前記少なくとも１つのＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡを除去するステップ、
ｄ．増幅された前記第１のオリゴヌクレオチドの相補的区画に第２のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップであって、前記第２のオリゴヌクレオチドに第２のＰＣＲハンドルとしての配列が提供される、第２のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップ、
ｅ．逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を用いて、増幅された前記第１のオリゴヌクレオチドを鋳型として使用して前記第２のオリゴヌクレオチドを増幅し、それにより、第１および第２のＰＣＲハンドルとしての配列および前記標的配列を有する第３のオリゴヌクレオチドを得るステップ、
ｆ．増幅された前記第２のオリゴヌクレオチドから前記第３のオリゴヌクレオチドを除去するステップ、
ｇ．サンプル上での専用の空間位置で第４のオリゴヌクレオチドを提供するステップであって、前記第４のオリゴヌクレオチドは、前記第２のＰＣＲハンドルに相補的な配列と、少なくとも２つの核酸を有する空間固有分子識別子（ＳＵＭＩ）としての少なくとも１つの配列とをそれぞれ含む複数のコンカテマーを有する、第４のオリゴヌクレオチドを提供するステップ、
ｈ．前記第４のオリゴヌクレオチドの空間位置を決定するために、第１のシーケンシングステップにより前記第４のオリゴヌクレオチドの前記ＳＵＭＩの配列を決定し、それにより、前記空間位置をＳＵＭＩ配列とリンクするステップ、
ｉ．前記第３のオリゴヌクレオチドを前記第２のＰＣＲハンドルで前記第４のオリゴヌクレオチドの相補的配列に対してハイブリダイズさせるステップ、
ｊ．前記第４のオリゴヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを鋳型として使用して、ポリメラーゼで前記第３のオリゴヌクレオチドを伸長させ、それにより、伸長させられた前記第３のオリゴヌクレオチド内へ前記ＳＵＭＩを組み込むステップ、
ｋ．伸長させられた前記第３のオリゴヌクレオチドを脱ハイブリダイズし、第２のシーケンシングステップによって、伸長させられた前記第３のオリゴヌクレオチドの配列を決定するステップ、
ｌ．伸長させられた前記第３のオリゴヌクレオチドの配列情報を、前記第１のシーケンシングステップで得られた空間位置の情報とリンクするステップ
を含む、方法。

【請求項2】

前記第４のオリゴヌクレオチドは、伸長させられた前記第３のオリゴヌクレオチドを制限酵素によってまたは化学的にセグメント化することを可能にする配列をさらに有することを特徴とする、請求項１記載の方法。

【請求項3】

前記第４のオリゴヌクレオチドは、前記第２のＰＣＲハンドルに相補的な配列および空間固有分子識別子（ＳＵＭＩ）としての少なくとも１つの配列を有する環状オリゴヌクレオチドのローリングサイクル増幅（ＲＣＡ）により提供されることを特徴とする、請求項１または２記載の方法。

【請求項4】

前記ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）は、光および／または熱により活性化されることと特徴とする、請求項３記載の方法。

【請求項5】

前記第１のシーケンシングステップは、伸長された前記第３のオリゴヌクレオチド内へ、前記ＳＵＭＩ配列を組み込んだ後に実施されることを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。

【請求項6】

前記第３のオリゴヌクレオチドは、タンパク質を結合することが可能である抗原認識部分を有することを特徴とする、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。

【請求項7】

前記第３のオリゴヌクレオチドは、抗原認識部分がリンクされているバーコードタグ配列を有することを特徴とする、請求項６記載の方法。

【請求項8】

前記サンプルの細胞をさらに単一細胞シーケンシングに供することを特徴とする、請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。

【請求項9】

in situシーケンシングの後に細胞を単一細胞シーケンシングに供することを特徴とする、請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、in vitroシーケンシングによる高密度空間分析のための組織片からハイブリダイゼーションおよび／または増幅により、ＲＮＡまたはＤＮＡのターゲットキャプチャと組み合わせた空間固有分子識別（ＳＵＭＩ）を含むロロニーのシーケンシングおよびin situローカライゼーションのための方法に関する。シーケンシング法の変更は、タンパク質および代謝産物分子のローカライゼーションを可能にする。

【0002】

背景技術
パドロックオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズした核酸の短い部分を重合化する際に極めて好結果となることが証明されている。大抵のパドロックアプローチは、標的をｃＤＮＡへ逆転写することから始まる。

【0003】

パドロック法は、例えば、「Highly multiplexed subcellular RNA sequencing in situ」、Lee et al., Science. 2014 March 21; 343(6177): 1360-1363. doi:10.1126/science.1250212または「Efficient In Situ Detection of mRNAs using the Chlorella virus DNA ligase for Padlock Probe Ligation」Nils SchneiderおよびMatthias Meier; February 5, 2020 -Cold Spring Harbor Laboratory Pressに開示されている。

【0004】

ヒトＤＮＡ配列の標的多重増幅のための汎用アッセイは、Sujatha Krishnakumar et alにより公開され；ＰＮＡＳは２００８年２月１９日にレビューのために送付された。

【0005】

さらに、国際公開第２０１７１４３１５５号は、プールされた核酸ライブラリーを用いる細胞の多重改変およびその分析を開示し、国際公開第２０１８０４５１８１号は、蛍光in situシーケンシングによる検出のための核酸配列のライブラリーを生成する方法を開示している。

【0006】

公開されたパドロック法は、ＤＮＡまたはＲＮＡのシーケンシングを可能にするが、シーケンシングされたＤＮＡまたはＲＮＡの起源の細胞内および組織内位置の空間情報が全く得られない。

【0007】

複数のｍＲＮＡについて単一細胞レベルで解像することを可能にする顕微鏡撮像は、転写物量およびローカライゼーションに関する貴重な情報を提供し、この情報は、組織不均一性、分子発生および疾患の治療を理解するために重要な要素である。

【0008】

蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）に基づく方法は、転写産物について組織切片中で直接標識し、空間情報をキャプチャすることを可能にする。しかしながら、使用することができるプローブの数は限られ、蛍光信号のオーバーラップがしばしば問題となる。さらに、共焦点顕微鏡の光学分解能の限界にしばしば到達し、したがって、同時に検出することができるプローブの数は減少する。ＳｅｑＦＩＳＨ＋は、シーケンシャル蛍光in situハイブリダイゼーションアプローチであり、既に蛍光体で標識されたプローブを使用するのではなく、蛍光標識された二次プローブのための標的部位として機能するバーコード配列を含む転写産物特異的プローブを使用する。多様な標的特異的プローブは、プロービングのシーケンシャルラウンドの間にこれらのバーコードサイトに結合する二次プローブを使用して同定される。二次プローブにより検出されるプローブの量の制限により、制限された量が蛍光し、それにより信号を識別することができる。複数の分離された画像を集め、コンピューターにより集計して、高解像度機器顕微鏡を必要とせずに複合高解像度画像を作成する。

【0009】

しかしながら、このアプローチは、多数の遺伝子を同時に評価することを可能にするが、転写産物の配列情報をキャプチャしない。単一細胞ＲＮＡシーケンシング（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）に基づく他の方法は、全体のトランスクリプトームをプロファイルし、配列情報をキャプチャすることができる。しかしながら、組織または単一細胞レベルでのオリジナルの位置もしばしば失われる。単一細胞に近い分解能で配列情報および空間情報の両方をキャプチャする方法は、依然として困難な課題のままである。いくつかのアプローチは、ＦＩＳＳＥＱおよびＢａｒｉｓｔａＳｅｑ（約１５の塩基の制限された読み取り長さでタスクを達成するための他のギャップ充填パドロックベースのアプローチ）を使用する。

【0010】

最近では、in situゲノムシーケンシング（ＩＧＳ）が、サンプル内のゲノムを同時にシーケンシングかつ撮像する方法として記載されている。この方法は、A. C. Payne et al. Science 10.1126/science. aay3446 (2020)、（２０２０年１２月３１日に最初のオンラインリリース）により公開されたショートリードin situシーケンシング、次にアンプリコンの解離、ＰＣＲおよびペアエンドシーケンシングによるＵＭＩを有する遺伝子配列と関連するアンプリコンのex situシーケンシングにより固有分子識別子（ＵＭＩ）をローカライゼーションするワークフローを説明している。

【0011】

ごく最近では、「空間固有分子識別子（ＳＵＭＩ）を含むパドロックオリゴヌクレオチドを用いる標的ＲＮＡまたはｃ－ＤＮＡ のin vitroシーケンシングとin situシーケンシングとを組み合わせた方法」が説明された（欧州特許第２２１５４７１２．８号明細書）。この方法は、in situシーケンシング（ＳＵＭＩ）およびin vitroシーケンシング（ＳＵＭＩおよび標的配列）の組合せによりパドロック中に組み込まれた標的配列の空間同定を説明する。標的配列およびＳＵＭＩ配列は同じパドロックおよび結果として得られるロロニーの部分であるため、標的情報の密度は、細胞の領域内でin situでシーケンシングすることができるロロニーの数により制限される。以下の発明は、この制限を克服する。

【0012】

発明の概要
本発明の対象は、
少なくとも１つのＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ内の標的配列の空間位置および配列情報を獲得する方法であって、
ａ．少なくとも１つのＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡの相補的区画に第１のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップであって、第１のオリゴヌクレオチドに第１のＰＣＲハンドルとしての配列が提供される、第１のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップ、
ｂ．逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を用いて、少なくとも１つのＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡを鋳型として使用して第１のオリゴヌクレオチドを増幅するステップ、
ｃ．増幅された第１のオリゴヌクレオチドから少なくとも１つのＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡを除去するステップ、
ｄ．増幅された第１のオリゴヌクレオチドの相補的区画に第２のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップであって、第２のオリゴヌクレオチドに第２のＰＣＲハンドルとしての配列が提供される、第２のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるステップ、
ｅ．逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を用いて、増幅された第１のオリゴヌクレオチドを鋳型として使用して第２のオリゴヌクレオチドを増幅し、それにより、第１および第２のＰＣＲハンドルとしての配列および標的配列を有する第３のオリゴヌクレオチドを得るステップ、
ｆ．増幅された第２のオリゴヌクレオチドから第３のオリゴヌクレオチドを除去するステップ、
ｇ．サンプル上での専用の空間位置で第４のオリゴヌクレオチドを提供するステップであって、第４のオリゴヌクレオチドは、第２のＰＣＲハンドルに相補的な配列と、少なくとも２つの核酸を有する空間固有分子識別子（ＳＵＭＩ）としての少なくとも１つの配列とをそれぞれ含む複数のコンカテマーを有する、第４のオリゴヌクレオチドを提供するステップ、
ｈ．第４のオリゴヌクレオチドの空間位置を決定するために、第１のシーケンシングステップにより第４のオリゴヌクレオチドのＳＵＭＩの配列を決定し、それにより、空間位置をＳＵＭＩ配列とリンクするステップ、
ｉ．第３のオリゴヌクレオチドを第２のＰＣＲハンドルで第４のオリゴヌクレオチドの相補的配列に対してハイブリダイズさせるステップ、
ｊ．第４のオリゴヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを鋳型として使用して、ポリメラーゼで第３のオリゴヌクレオチドを伸長させ、それにより、伸長させられた第３のオリゴヌクレオチド内へＳＵＭＩを組み込むステップ、
ｋ．伸長させられた第３のオリゴヌクレオチドを脱ハイブリダイズし、第２のシーケンシングステップによって、伸長させられた第３のオリゴヌクレオチドの配列を決定するステップ、
ｌ．伸長させられた第３のオリゴヌクレオチドの配列情報を、第１のシーケンシングステップで得られた空間位置の情報とリンクするステップ
を含む、方法である。

【0013】

本発明の方法はさらに、サンプル内のタンパク質または代謝産物の空間位置を得るために使用することができる。タンパク質のローカライゼーションのために、第３のオリゴヌクレオチドは、第１および第２のＰＣＲハンドルに接してバーコードタグを含む。バーコードタグは、タンパク質をコードする。第３のオリゴヌクレオチドは、タンパク質に結合する抗体にリンクされている。

【0014】

詳細な説明
少なくとも１つのＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ鎖を有するサンプル中の標的配列の空間位置および配列情報を獲得する方法の全ての実施形態および変形態様は、空間的な単一細胞タンパク質発現のための方法においても適用することができる。

【0015】

好ましくは、空間固有分子識別子（ＳＵＭＩ）は、２～５００ｂｐを有する。

【0016】

標的配列は、少なくとも、一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ標的について本発明の目的のａおよびｂのステップで定義されたような第１のオリゴヌクレオチドのハイブリダイズした３’末端および第２のオリゴヌクレオチドのハイブリダイズした５’末端の核酸を含むが、ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡとのハイブリダイゼーション後にギャップを充填するオリゴヌクレオチドの領域の配列を含んでいてもよい。

【0017】

この方法の別の実施形態では、第４のオリゴヌクレオチドは、環状オリゴヌクレオチドのローリングサークル増幅により生成されてよい。第４のオリゴヌクレオチドは、伸長させられた第３のオリゴヌクレオチドを制限酵素によって化学的にセグメント化することを可能にする配列を有していてもよい。

【0018】

本発明では、伸長させられた標的ＳＵＭＩ配列は、ステップｆ）での伸長させられた標的ＳＵＭＩ配列または伸長させられたバーコードタグＳＵＭＩ配列の収集の前かつＳＵＭＩのin situシーケンシングまたはシーケンシャル蛍光in situハイブリダイゼーションによるロロニーの空間位置の決定の前もしくは後に、汎用のＰＣＲ反応により増幅されてよい。

【0019】

汎用ＰＣＲ増幅に対する代替の実施形態として、伸長させられた標的ＳＵＭＩ配列または伸長させられたバーコードタグＳＵＭＩ配列が、パドロックプローブ自体の部分であってよい。ここで、伸長させられた標的ＳＵＭＩ配列または伸長させられたバーコードタグＳＵＭＩ配列の５’末端および３’末端は、ＳＵＭＩロロニーのＳＵＭＩ配列に相補的な領域５’および３’に結合して、それによりパドロックを生成する。ＳＵＭＩ配列のパドロックギャップ充填およびライゲーションの後に、標的配列は、ＳＵＭＩ配列にリンクされて、環を形成する。ギャップが充填されかつライゲーションされて環状鋳型を形成するパドロックプローブ（パドロックは、充填されることもできるが、このプロセスでさらにライゲーションされるのみであることもできる）は、パドロックのギャップ充填部分内のＳＵＭＩをコード化するために使用される。最終的に、環化されたパドロックプローブは、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）のための鋳型として使用して、定義されたシーケンシングのために使用されるＤＮＡ鎖を生成してよい。

【0020】

本発明では、ワークフローは、生体分子の他のクラスについてＳＵＭＩシーケンシングにより空間ローカライゼーションを可能にするために変更することができる。ここでは、オリゴヌクレオチドが、生体分子バインダにリンクされる。オリゴヌクレオチドは、生体分子のバインダ（例えば、特定のタンパク質へのバインダとして特異的な抗体）をコードする配列（バーコードタグ）を含む。ＳＵＭＩ配列をＳＵＭＩロロニーのバーコードタグ配列とリンクさせた後、バインダにリンクされた生体分子についてのin situかつin vitroシーケンシングの空間マルチオミクス結果が得られる。

【0021】

本発明では、第４のオリゴヌクレオチドとしてのロロニーの形成前に、潜在的なデジタル病理イメージングプロセスにリンクすることができる外力（例えば光または熱）により開始することができる。

【0022】

本発明では、細胞を採取し、単一細胞シーケンス分析にかけてよい。

【0023】

本発明は、in vitroシーケンシングによって同定される標的核酸（ＳＵＭＩおよび標的）の空間局在のための鋳型としてＳＵＭＩロロニーを使用することにより、in situシーケンシングまたはシーケンシャルin situハイブリダイゼーションからの空間分解能の制限を克服する方法を記載する。

【0024】

本発明の方法およびその実施形態を、図面を参照してさらに説明する。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】核酸分析のための高密度（ＨＤ）空間固有分子識別子（ＳＵＭＩ）シーケンシングワークフローについてのオリゴヌクレオチドデザインを示す図である。

【図2】核酸分析用の高密度（ＨＤ）空間固有分子識別子（ＳＵＭＩ）シーケンシングワークフローを示す図である。

【図3】タンパク質および代謝産物分析のための高密度（ＨＤ）空間固有分子識別子（ＳＵＭＩ）シーケンシングワークフローを示す図である。

【図4】高密度（ＨＤ）空間固有分子識別子（ＳＵＭＩ）ハイブリダイゼーションのためのオリゴヌクレオチド設計および核酸、タンパク質または代謝産物分析のためのシーケンシングワークフローを示す図である。

【図5】増幅されたプローブを含むＳＵＭＩの等温増幅を示す図である。

【図6】ＳＵＭＩ配列により伸長させられた標的増幅産物のための鋳型として機能することができる環状オリゴヌクレオチドから生成された、in situでシーケンシングされたロロニーの例を示す図である。

【0026】

図１は、核酸分析のための高密度（ＨＤ）空間固有分子識別子（ＳＵＭＩ）シーケンシングワークフローについてのオリゴヌクレオチドデザインを示す。（Ａ）環状の第１の配列（ＳＵＭＩ配列の汎用配列５’）。（Ｂ）空間固有分子識別子（ＳＵＭＩ）配列（各環状分子についての固有配列）。（Ｃ）環状の第２の配列（ＳＵＭＩ配列の汎用配列３’）。（Ｄ）汎用ローリングサークル増幅用に使用されるプライミング領域。（Ｅ）ローリングサークル増幅の開始後に、ポリメラーゼにより伸長させられた核酸。（Ｆ）ローリングサークル増幅の数ラウンド後に生成されるロロニー。

【0027】

図２は、核酸分析用の高密度（ＨＤ）空間固有分子識別子（ＳＵＭＩ）シーケンシングワークフローを示す。（Ａ）ＳＵＭＩ環状核酸鋳型を、固定されかつ透過処理された組織切片に添加する。ＳＵＭＩ配列の汎用配列５’（１ｓｔ）とＳＵＭＩ配列の汎用配列３’（２ｎｄ）と空間的固有分子識別子（ＳＵＭＩ）とが、全てＳＵＭＩ環状核酸鋳型の部分である。（Ｂ）ＳＵＭＩ環状核酸鋳型から生成されたロロニー。ＳＵＭＩ環状核酸鋳型分子からの配列を、ローリングサークル増幅後に鋳型配列の複数のコンカテマーに変換する。ロロニー（細胞の表示内で円で囲まれている）は、空間的に記録されているＳＵＭＩ配列情報（例として１、２および３）を導き出すためにin situでシーケンシングされる。注：単一細胞および３つのＳＵＭＩロロニーだけが、説明のために示されている。（Ｃ）in situターゲットキャプチャは、オリゴヌクレオチドの標的特異的ペアを、固定されかつ透過処理された組織の切片に直接使用して、メッセンジャーＲＮＡの特異的部分を最初に逆転写し、次いで増幅する標的ＲＴ－ＰＣＲ反応によって行われる。オリゴヌクレオチドは、標的核酸またはその相補的配列に直接結合する一次配列を含み、汎用ＰＣＲハンドル（１ｓｔおよび２ｎｄ）の配列のセットも含む。（Ｄ）得られた二本鎖産物は、汎用ＰＣＲハンドル（１ｓｔおよび２ｎｄ）と所望の標的とを含む。さらに、標的配列のin situ増幅（必要な場合に）は、第１（１ｓｔ）のＰＣＲハンドルおよび第２のＰＣＲハンドル（２ｎｄ）を標識した汎用ＰＣＲハンドルにより達成される。（Ｅ）ロロニーは、汎用標的増幅産物のための鋳型として機能する。それにより、標的配列産物は、ＳＵＭＩ配列を含み、標的増幅産物にリンクするように伸長させられる。より詳細には、二本鎖の増幅された標的配列を、一本鎖オリゴヌクレオチドに変性させ、増幅された標的産物の鎖の一方の第２のＰＣＲハンドル（２ｎｄハンドル）は、ＳＵＭＩ配列（１ｓｔハンドル）の相補的なロロニー汎用配列５’とハイブリダイズする。ロロニーへのハイブリダイゼーションの後に、標的増幅産物の３’末端は、in situでＳＵＭＩ配列を越えて伸長させられる。１つのロロニーは、高密度（ＨＤ）空間固有分子識別子（ＳＵＭＩ）シーケンシングワークフローのための基礎を提供する多くの標的配列用の鋳型として機能する。（Ｆ）伸長させられた標的ＳＵＭＩ配列を、場合により、（１ｓｔ）および（２ｎｄ）ハンドルに相補的なＰＣＲプライマーにより増幅し、最終的に、in vitroでの更なるプロセシング用の組織切片から除去される（付加的なＰＣＲは、in vitroで行われてもよい）。伸長させられた標的ＳＵＭＩ配列分子は、環化され、増幅されて、in vitroでロロニーを形成する。ロロニーは、フローセル内に装填され、in vitroシーケンシング用の鋳型として機能する。このフローセルを、機器内に装入し、ロロニーのin vitroシーケンシングを実施する。（Ｇ）ＳＵＭＩおよび標的配列の配列情報を得る（多数の標的配列は、同じＳＵＭＩ配列とリンクされてよい）。ＳＵＭＩ配列のin vivo位置およびリンクされた（ＳＵＭＩ配列－標的増幅産物）in vitro配列は、空間位置を得るために対にされる。

【0028】

図３は、タンパク質および代謝産物分析のための高密度（ＨＤ）空間固有分子識別子（ＳＵＭＩ）シーケンシングワークフローを示す。（Ａ）抗体を同定するためのバーコードタグ領域を含むオリゴヌクレオチドに結合された抗体。（Ｂ）代謝産物を同定するためのバーコードタグ領域を含むオリゴヌクレオチドに結合したバインダ。（Ｃ）さらに、バーコードタグ配列のin situ増幅は、それぞれの汎用プライマー（１ｓｔ＆２ｎｄ）を使用する汎用ＰＣＲハンドルにより達成される。（Ｄ）バーコードタグ配列は、図２に示すようにＳＵＭＩ配列にリンクされる。

【0029】

図４は、高密度（ＨＤ）空間固有分子識別子（ＳＵＭＩ）ハイブリダイゼーションのためのオリゴヌクレオチド設計および核酸、タンパク質または代謝産物分析のためのシーケンシングワークフローを示す。（Ａ）ＳＵＭＩ配列の汎用配列５’（１ｓｔ）。（Ｂ）空間固有分子識別子（ＳＵＭＩ）配列（ここに例として示された４つの検出バーコード領域を有する固有配列）。４つのバーコード領域は、それぞれ２～２０のヌクレオチドを有する。バーコード領域は、コーディング能力を高めるために＞４であってよく、全てのバーコードは、固有配列を有する（図示されていない）。（Ｃ）単量体化のための制限部位を含んでいてもよいＳＵＭＩ配列の汎用配列３’（２ｎｄ）。（Ｄ）全体的なローリングサークル増幅用に使用されるプライミング領域。

【0030】

図５は、増幅されたプローブを含むＳＵＭＩの等温増幅を示す。（Ａ）固定されかつ透過処理された組織切片を、ＳＵＭＩロロニー上に置く。ロロニー（ガラスフローセル上の黒色点）は、in situでシーケンシングされる。（Ｂ）メッセンジャーＲＮＡの標的部分を、近接ライゲーションプローブによってセクション上で直接増幅する。（Ｃ）ロロニーは、汎用ターゲットキャプチャ産物のための鋳型として機能しかつＳＵＭＩ、ＳＵＭＩ配列の汎用配列３’（２ｎｄ）を含み、かつこの例では制限部位（任意）も含む。それにより、標的配列をＳＵＭＩ配列により伸長させ、固有単量体に切断することができる。ＳＵＭＩ配列のロロニー汎用配列５’（１ｓｔ）に相補的である標的産物の第２のＰＣＲハンドル（２ｎｄ）は、３’ＯＨブロッキングヌクレオチド（アジドまたはジスルフィド基）を含み、還元剤、例えばホスフィンを用いて脱保護した後にだけ、in situでＳＵＭＩ配列を越えて伸長させられる。１つのロロニーは、高密度（ＨＤ）空間固有分子識別子（ＳＵＭＩ）シーケンシングワークフローのための基礎を提供する多くの標的配列用の鋳型として機能する。伸長させられた標的ＳＵＭＩ配列を、図示されるように高プロセッシブ酵素、例えばＰｈｉ２９酵素を用いるＰＣＲプライマー（１ｓｔ＆２ｎｄ）により増幅し（指数関数的ＲＣＡ）、場合により、フローセルから抽出する前もしくは後に制限酵素を用いて引き続き切断し、さらにＰＣＲによってプロセシングかつ増幅することができる（図２のワークフロー参照）。

【0031】

図６は、ＳＵＭＩ配列により伸長させられた標的増幅産物のための鋳型として機能することができる環状オリゴヌクレオチドから生成された、in situでシーケンシングされたロロニーの例を示す。ロロニーはフローセル上に置かれ、合成によるシーケンシング（ＳＢＳ：sequencing by synthesis）に供される。調べられた塩基のそれぞれについての蛍光チャネルの全てを示す１つのサイクルおよびＴの固有の組み込みが図示されている（サイクル６）。後に標的増幅産物をＳＵＭＩ配列によりin situで伸長する。ＳＵＭＩ伸長させられた標的増幅産物を、組織切片から取り出し、直接in vitroシーケンシングに供する。

【0032】

図１および図４に示されるように、オリゴヌクレオチドは、最低限でも少なくとも２つのヌクレオチドを有する１つのＳＵＭＩを有する。ＳＵＭＩの５’および３’で環状オリゴヌクレオチドは、５～５０のヌクレオチドを有する汎用配列（１ｓｔ＆２ｎｄ）を有する。本発明の方法では、一本鎖環状鋳型は、ローリングサークル増幅が可能なポリメラーゼにより、ＤＮＡナノボールまたはロロニーを形成する複数のＤＮＡコンカテマーに複製される。この目的のために、本発明で使用されるオリゴヌクレオチドは、ローリングサークル増幅のための５～５０のヌクレオチドを有する少なくとも１つのプライマー領域を有してよい。

【0033】

本発明の一実施形態では、汎用配列は、ＳＵＭＩ配列に直接続かなくてよく、ＳＵＭＩ配列から可変の距離で配置されていてよい。

【0034】

本発明の別の実施形態では、ローリングサークル増幅を開始するプライマー領域は、同一であってよい。

【0035】

他の実施形態では、ＳＵＭＩを含むオリゴヌクレオチドは、組織切片上に提供される場合、環状でなくてもよいが、環化は、組織上で直接行われてよい。

【0036】

本発明の一実施形態では、ターゲットキャプチャは、標的としてのＤＮＡから開始されてよい。線状オリゴヌクレオチドのそれぞれの設計調整を考慮する必要がある。

【0037】

図３に示すように、線状オリゴは、タンパク質または代謝産物をコードするために使用されてよい。ここでもまた、線状オリゴヌクレオチドの３’末端は、バーコードタグとＳＵＭＩ配列を１つの核酸分子内へ組み合わせるために、環状オリゴヌクレオチドから生成されるロロニーの配列に相補的である。

【0038】

本発明の第１の実施形態では、図１に示すように、空間固有分子識別子（ＳＵＭＩ）を含む環状オリゴヌクレオチドは、組織切片上でロロニーを生成するために使用される。ロロニーは、空間固有分子識別子（ＳＵＭＩ）を同定するin situシーケンシング用のシーケンシング鋳型として機能する。全てのロロニーについての細胞内空間情報が記録され、ＳＵＭＩ配列とリンクされる。in situシーケンシングは、in situターゲットキャプチャの前または後に行ってよい。

【0039】

本発明の一般的なステップを図２に示す。ここでは、メッセンジャーＲＮＡの標的部分は、固定されかつ透過処理された組織の切片上で直接増幅される。ｍＲＮＡ上の目的の配列は、メッセンジャーＲＮＡを直接標的とする２つの特異的オリゴヌクレオチドを使用するＲＴ－ＰＣＲ反応を用いて増幅され、オリゴヌクレオチドは、増幅のために標的領域に隣接する一次配列と、ＰＣＲハンドルとしての汎用配列のセットとを含む。ロロニーは、環状オリゴヌクレオチドから生成され、in situシーケンシングのためのシーケンシング鋳型として、またＳＵＭＩ配列により伸長させられる標的増幅産物のための鋳型として機能する。標的増幅産物がin situでＳＵＭＩ配列により伸長させられ、ＳＵＭＩ配列がin situシーケンシングにより決定された後に、ＳＵＭＩ伸長標的増幅産物を組織切片から除去し、in vitroシーケンシングに直接供される。環化、ロロニー化およびin vitroシーケンシングの前に、ＳＵＭＩ伸長標的増幅産物を増幅することが望ましいことがある。

【0040】

同定された変異を含む標的配列の細胞内位置は、in vitroで得られた標的配列／ＳＵＭＩを、in situシーケンシングからのＳＵＭＩ配列にリンクさせることにより明らかにされる。数百の固有ＳＵＭＩロロニーを１つのセル内で空間的に分解することができ、各ロロニーは鋳型として数千のコンカテマー化されたＳＵＭＩ配列を提供するため、１つのセル内で数十万の標的増幅ｍＲＮＡ配列を、細胞分解能で理論的に空間的に同定することができ、それにより、高密度（ＨＤ）法が提供される。

【0041】

本発明の第２の実施形態では、タンパク質および代謝産物の細胞内位置が、シーケンシングワークフローにより明らかにされる。図３に示す線形オリゴヌクレオチド設計は、細胞内タンパク質位置を決定するために、タンパク質についての結合原理として「抗原認識部分」を使用する。

【0042】

「抗原認識部分」の用語は、細胞サンプルの細胞上に発現されたマーカーに対する、任意の種類の抗体または断片化された抗体または断片化された抗体誘導体を指す。この用語は、完全にインタクトの抗体、断片化された抗体または断片化された抗体誘導体、例えばＦａｂ、Ｆａｂ￠、Ｆ（ａｂ￠）２、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖ、ナノボディに関する。このような断片化された抗体誘導体は、これらの種類の分子を含む共有結合または非共有結合を含む組換え手順により合成されてよい。抗原認識部分の更なる例は、ＴＣＲ分子を標的とするペプチド／ＭＨＣ複合体、細胞接着受容体分子、共刺激分子に対する受容体、人工的に操作された結合分子、例えば、例えば細胞表面分子を標的とするペプチドまたはアプタマーである。抗体に対するこのような抗原認識部分は、生物試料（標的細胞）によりまたは細胞内に発現される抗原、例えばＩＬ２、ＦｏｘＰ３、ＣＤ１５４、または細胞外に発現される抗原、例えばＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ３４、ＣＤ５６、およびＣＤ１３３に対してもよい。

【0043】

第１の実施形態の変形形態として、ロロニーの空間的ローカライゼーションのためのハイブリダイゼーションに基づくＳＵＭＩ解読原理のための環状オリゴヌクレオチドが、図４に示されている。ＳＵＭＩのin situシーケンシングが得られない場合、ハイブリダイゼーションに基づく方法が有利であってよい。この場合では、多色解読方式が、ロロニーを解読するために用いられてよい。本発明の方法において使用される検出プローブは、バーコード領域の少なくとも一部に結合することが可能である２～２０のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを有していてよい。生成されたロロニーは、前述のように、ターゲットキャプチャ伸長のための鋳型として機能し続ける（図２参照）。核酸分析のための高密度（ＨＤ）空間固有分子識別子（ＳＵＭＩ）ハイブリダイゼーションおよびシーケンシングワークフローについて、ＳＵＭＩ配列を解読するためのin vitroシーケンシングのために、比較的長いシーケンシングリード長さが必要である。

【0044】

第２の実施形態では、この方法は、目的の組織領域に限定されるべきである。目的の組織領域は、顕微鏡のような従来の撮像技術により同定される。in situシーケンシングの方法を目的の領域にフォーカスするために、ロロニー形成は、外力（例えば光または熱）により制御されるべきである。ロロニーは、シーケンシング鋳型として機能するため、ロロニーなしでは、シーケンシングは行われない。重合およびロロニー形成の開始は、ポリメラーゼをブロックすることによるかまたはプライマーをブロックすることにより阻害されてよい。このブロッキング原理は、外力、例えば光または熱により除去されてよく、これは、概念的には撮像技術により方向付けることができる。

【0045】

第３の実施形態では、ＳＵＭＩ解読（例えば、in situシーケンシング）の後に、組織切片を消化し、個々の細胞を単離してよい。ロロニー含有細胞を選別し、最終的に単一細胞シーケンシングに供する。ロロニー含有細胞の選別は、ローリングサークル増幅の結果として増加した核酸含有量により、またはロロニー配列に向かうハイブリダイゼーションプローブから導き出された蛍光強度により達成されてよい。in situシーケンシングからのＳＵＭＩ配列は、単一細胞シーケンシングにより同定されてもよいため、単一細胞シーケンシングからの情報内容を、in situシーケンシングから導き出されたＳＵＭＩを介する空間的位置にリンクしてよい。

【0046】

この第３の変形態様では、特異的ロロニーは、標的遺伝子（図２）または標的抗体もしくは標的分子結合部のバーコードタグ（図３）に対応する特異的プライマーを用いることにより環状オリゴヌクレオチドから生成することができ、例えばアンプリコンのサブセットの選択的増幅を可能にするＲＣＡのために用いられるＰｈｉ２９酵素により認識される。最後に、シーケンシングされたデータは、目的のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ転写物または抗体または分子結合部がもともと環状オリゴヌクレオチドと相互作用する組織上の領域にリンクバックされる。

【0047】

第４の実施形態では、図５に視覚化されているように、標的ＳＵＭＩ配列を確立して、また、高プロセッシブポリメラーゼ、例えばＰｈｉ２９を用いる指数関数的ＲＣＡにより増幅する。ここでも、ロロニーは、汎用ターゲットキャプチャ産物のための鋳型として機能し、ＳＵＭＩを含む。１つのロロニーが、高密度（ＨＤ）空間固有分子識別子（ＳＵＭＩ）シーケンシングワークフローについての基礎を提供する多くの標的配列のための鋳型として機能してよい。

【0048】

開示された方法を用いて分析されたサンプルは、無脊椎動物（例えば、エレガンス線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ））、脊椎動物（例えば、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ））および哺乳動物（例えば、ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））の動物全体、器官、組織切片、細胞凝集体、または単一細胞のような任意の試料に由来してよい。生物学的サンプルは、組織切片、細胞凝集体、懸濁細胞、または接着細胞の形態を有していてよい。細胞は、生きていても死んでいてもよい。

【0049】

ロロニーの空間情報、すなわちサンプル上のロロニーの位置は、例えば撮像ステップにより決定される。本発明による方法のさらに別の変形態様では、サンプルを単離された細胞に変換し、次いで、これをマイクロキャビティ内に捕捉するかまたは接着することにより固定化する。

【0050】

撮像は、例えば、例えば欧州特許第０８１０４２８号明細書、欧州特許第１１８１５２５号明細書、欧州特許第１１３６８２２号明細書または欧州特許第１２２４４７２号明細書に記載された「マルチエピトープリガンドカルトグラフィー（Multi Epitope Ligand Cartography）」、「チップベースのサイトメトリー（Chip-based Cytometry）」または「マルチオミクス（Multiomics）」として公知の技術を用いて実施されてよい。この技術では、細胞を固定化し、蛍光部分と結合した抗体と接触させる。抗体は、生物学的試料上の（例えば細胞表面上の）それぞれの抗原により認識され、非結合マーカーを除去し、蛍光部分を励起させた後に、抗原の位置を、蛍光部分の蛍光発光により検出する。所定の変形態様では、蛍光部分に結合した抗体の代わりに、ＭＡＬＤＩイメージングまたはＣｙＴＯＦにおいて検出可能な部分に結合した抗体を使用することができる。当業者は、蛍光部分に基づく手法をどのように変更して、これらの検出部分と連携させるかを承知している。標的部分の位置は、蛍光放射の波長に対して十分な分解能および感度を有するデジタル撮像装置によって達成される。デジタル撮像装置、例えば蛍光顕微鏡を用いて、光学的拡大の有無にかかわらず使用されてよい。得られる画像は、例えばＲＡＷ、ＴＩＦ、ＪＰＥＧ、またはＨＤＦ５フォーマットで、ハードドライブのような適切な記憶装置に記憶される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【外国語明細書】