特開 2023-175685 尿路微生物検出のための組成物、方法、およびキット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023175685

(43)【公開日】2023-12-12

(54)【発明の名称】尿路微生物検出のための組成物、方法、およびキット

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20231205BHJP

   C12Q 1/689 20180101ALN20231205BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALN20231205BHJP

【ＦＩ】

C12M1/00 A

C12Q1/689 Z

C12Q1/686 Z

【審査請求】有

【請求項の数】20

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2023131862

(22)【出願日】2023-08-14

(62)【分割の表示】P 2020544379の分割

【原出願日】2018-11-13

(31)【優先権主張番号】62/585,273

(32)【優先日】2017-11-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

２．ＮＯＮＩＤＥＴ

３．ＴＷＥＥＮ

４．ＢＲＩＪ

(71)【出願人】

【識別番号】514078933

【氏名又は名称】ライフ テクノロジーズ コーポレイション

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田 洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(74)【代理人】

【識別番号】100162422

【弁理士】

【氏名又は名称】志村 将

(72)【発明者】

【氏名】リ ケリー

(72)【発明者】

【氏名】パガニ イオアンナ

(72)【発明者】

【氏名】リ ジシェン

(72)【発明者】

【氏名】パテル スナリ

(72)【発明者】

【氏名】ヴァルマ カミニ

(72)【発明者】

【氏名】フォンセカ ジョルジ

(72)【発明者】

【氏名】プリ ニティン

(72)【発明者】

【氏名】ダイアモンド エヴァン

(57)【要約】      （修正有）

【課題】核酸増幅のためのアレイを提供する。
【解決手段】複数の反応部位を含む支持体であって、前記複数の反応部位が前記支持体内または前記支持体上に位置する、支持体を含み、前記複数の反応部位が各々、（ｉ）複数の異なる標的配列を含む対照核酸分子と、（ｉｉ）対応する標的配列を増幅するように構成された増幅プライマー対と、（ｉｉｉ）前記対の前記増幅プライマーのうちの少なくとも１つの伸長によって生成される核酸配列にハイブリダイズするように構成された検出可能な標識プローブと、を含む、アレイとする。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

核酸試料中の複数の核酸配列を増幅するための方法であって、
各々が一対の増幅プライマーを含む少なくとも５つの異なるアッセイを使用して、各々が複数の核酸配列を含む試料源由来の一定分量を含む少なくとも５つの増幅反応混合物を形成することであって、前記アッセイが表１におけるアッセイの群から選択される、形成することと、
各増幅反応混合物を反応容器に適用することと、
前記反応容器上で複数の増幅反応を行うことと、
前記複数の増幅反応中に前記反応容器上の１つ以上の場所内の標的核酸配列に対応する増幅産物を検出することと、を含む、方法。

【請求項2】

前記反応を増幅産物検出システムで利用することと、
前記増幅産物検出システムを動作させて、
任意に関連表を使用して、前記反応容器上の前記増幅反応混合物の場所を、前記増幅反応混合物で利用されるアッセイＩＤのうちの１つ以上と関連付けることと、をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記反応容器が、複数のウェルを有するプレートである、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記反応容器がアレイである、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記反応容器がオープンアレイプレートである、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記反応容器がチップマイクロアレイである、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

表１におけるアッセイの群から選択される少なくとも１０個の異なるアッセイを使用して、各々が複数の核酸配列を含む試料源由来の一定分量を含む少なくとも１０個の増幅反応混合物を形成する、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

表１におけるアッセイの群から選択される少なくとも１５個の異なるアッセイを使用して、各々が複数の核酸配列を含む試料源由来の一定分量を含む少なくとも１５個の増幅反応混合物を形成する、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

表１におけるアッセイのうちの１７個を使用して、各々が複数の核酸配列を含む試料源由来の一定分量を含む反応混合物を形成する、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記試料源が尿検体である、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記増幅産物が、５６～１０５ヌクレオチド長のアンプリコンを有する前記核酸試料の標的アンプリコンを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０８４＿ｓ１が、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの遺伝子の注釈を付けられていない領域の核酸配列の一部を標的とする一対のプライマーを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０８８＿ｓ１が、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉのクピンスーパーファミリー遺伝子であるシュウ酸デカルボキシラーゼ／古細菌ホスホグルコースイソメラーゼＣＯＧ２１４０の核酸配列の一部を標的とする一対のプライマーを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０８０＿ｓ１が、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ（別名、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）のピリドキサールリン酸依存性ヒスチジンデカルボキシラーゼ（ｈｄｃ）遺伝子の核酸配列の一部を標的とする一対のプライマーを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０８７＿ｓ１が、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅの遺伝子の仮説タンパク質の核酸配列の一部を標的とする一対のプライマーを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

アッセイＩＤ Ｂａ０４６４６２４７＿ｓ１が、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓのアミノトランスフェラーゼクラスＶ遺伝子の核酸配列の一部を標的とする一対のプライマーを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項17】

アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０８６＿ｓ１が、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍのＰｈｎＢ－ＭｅｒＲファミリー転写調節因子遺伝子の核酸配列の一部を標的とする一対のプライマーを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項18】

アッセイＩＤ Ｂａ０４６４６２４２＿ｓ１が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＣＯＧ０７８９ Ｄｎａ結合転写調節因子ＭｅｒＲファミリー（Ｚｎｔｒ）遺伝子の核酸配列の一部を標的とする一対のプライマーを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項19】

アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０７９＿ｓ１が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａのｐａｒＣ（ＤＮＡトポイソメラーゼＩＶサブユニットＡ）遺伝子の核酸配列の一部を標的とする一対のプライマーを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項20】

アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０８３＿ｓ１が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのａｃｔ様タンパク質遺伝子の核酸配列の一部を標的とする一対のプライマーを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項21】

アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０７８＿ｓ１が、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉのＦｅ２＋輸送系タンパク質ＦｅｏＡ遺伝子ＣＯＧ１９１８の核酸配列の一部を標的とする一対のプライマーを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項22】

アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０７６＿ｓ１が、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓのｕｒｅＲ遺伝子であるａｒａＣの核酸配列の一部を標的とする一対のプライマーを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項23】

アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０７７＿ｓ１が、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓのＳＵＭＦ１遺伝子の核酸配列の一部を標的とする一対のプライマーを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項24】

アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０８２＿ｓ１が、ラジカルＳＡＭスーパーファミリー、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｔｕａｒｔｉｉの推定鉄硫黄修飾タンパク質遺伝子であるスルファターゼ成熟酵素ＡｓｌＢ ＣＯＧ０６４１の核酸配列の一部を標的とする一対のプライマーを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項25】

アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０８１＿ｓ１が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのヘリックスターンヘリックスドメインタンパク質遺伝子であるＮ２９６＿１７６０の核酸配列の一部を標的とする一対のプライマーを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項26】

アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０８５＿ｓ１が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓのｃｄａＲ遺伝子の核酸配列の一部を標的とする一対のプライマーを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項27】

アッセイＩＤ Ｂａ０４６４６２７６＿ｓ１が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅのＳＩＰ遺伝子の核酸配列の一部を標的とする一対のプライマーを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項28】

アッセイＩＤ Ｆｎ０４６４６２３３＿ｓ１が、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓのＩＰＴ１遺伝子の核酸配列の一部を標的とする一対のプライマーを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項29】

核酸試料中の複数の核酸配列を増幅するための方法であって、
各々が複数の核酸配列を含む試料源由来の一定分量を含む複数の増幅反応混合物を形成することであって、前記試料源が尿検体である、形成することと、
前記複数の増幅反応混合物を反応容器に適用することであって、前記反応容器が、各々が表１における対応する標的領域位置および対応する標的領域サイズを有する異なる遺伝子を標的とする少なくとも５つのアッセイで構成されており、各アッセイが一対の増幅プライマーを含む、適用することと、
前記反応容器上で複数の増幅反応を行うことと、
前記複数の増幅反応中に前記反応容器上の場所内の標的核酸配列に対応する増幅産物を検出することと、を含む、方法。

【請求項30】

前記反応容器を増幅産物検出システムで利用することと、
前記増幅産物検出システムを動作させて、
任意に関連表を使用して、前記反応容器上の前記増幅反応混合物の場所を、前記反応容器上で利用される前記アッセイのうちの１つ以上と関連付けることと、をさらに含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記反応容器が、複数のウェルを有するプレートである、請求項２９に記載の方法。

【請求項32】

前記反応容器がアレイである、請求項２９に記載の方法。

【請求項33】

前記反応容器がオープンアレイプレートである、請求項２９に記載の方法。

【請求項34】

前記反応容器がチップマイクロアレイである、請求項２９に記載の方法。

【請求項35】

前記反応容器が、各々が表１に列記される異なる遺伝子を標的とする少なくとも１０個のアッセイで構成されている、請求項２９に記載の方法。

【請求項36】

前記反応容器が、各々が表１に列記される異なる遺伝子を標的とする少なくとも１５個のアッセイで構成されている、請求項２９に記載の方法。

【請求項37】

前記反応容器が、表１に列記される遺伝子の各々を標的とするアッセイで構成されている、請求項２９に記載の方法。

【請求項38】

前記少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイが、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉにおける注釈を付けられていない領域に対応する遺伝子の９３であるアンプリコンを増幅する、請求項２９に記載の方法。

【請求項39】

前記少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイが、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉにおけるクピンスーパーファミリーであるシュウ酸デカルボキシラーゼ／古細菌ホスホグルコースイソメラーゼＣＯＧ２１４０に対応する遺伝子の１０３ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅する、請求項２９に記載の方法。

【請求項40】

前記少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイが、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ（別名、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）におけるピリドキサールリン酸依存性ヒスチジンデカルボキシラーゼ（ｈｄｃ）に対応する遺伝子の９８サイズのアンプリコンを増幅する、請求項２９に記載の方法。

【請求項41】

前記少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイが、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅにおける仮説タンパク質に対応する遺伝子の８８ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅する、請求項２９に記載の方法。

【請求項42】

前記少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイが、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓにおけるアミノトランスフェラーゼクラスＶに対応する遺伝子の９５ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅する、請求項２９に記載の方法。

【請求項43】

前記少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイが、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍにおけるＰｈｎＢ－ＭｅｒＲファミリー転写調節因子に対応する遺伝子の９８ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅する、請求項２９に記載の方法。

【請求項44】

前記少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおけるＣＯＧ０７８９ Ｄｎａ結合転写調節因子ＭｅｒＲファミリー（Ｚｎｔｒ）に対応する遺伝子の６３ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅する、請求項２９に記載の方法。

【請求項45】

前記少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイが、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａにおけるｐａｒＣ（ＤＮＡトポイソメラーゼＩＶサブユニットＡ）に対応する遺伝子の９３ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅する、請求項２９に記載の方法。

【請求項46】

前記少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイが、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅにおけるａｃｔ様タンパク質に対応する遺伝子の５６ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅する、請求項２９に記載の方法。

【請求項47】

前記少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイが、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉにおけるＦｅ２＋輸送系タンパク質ＦｅｏＡ ＣＯＧ１９１８に対応する遺伝子の９１ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅する、請求項２９に記載の方法。

【請求項48】

前記少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイが、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓにおけるｕｒｅＲであるａｒａＣに対応する遺伝子の１００ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅する、請求項２９に記載の方法。

【請求項49】

前記少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイが、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓにおけるＳＵＭＦ１に対応する遺伝子の７６ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅する、請求項２９に記載の方法。

【請求項50】

前記少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイが、ラジカルＳＡＭスーパーファミリー、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｔｕａｒｔｉｉにおける推定鉄硫黄修飾タンパク質であるスルファターゼ成熟酵素ＡｓｌＢ ＣＯＧ０６４１に対応する遺伝子の１００ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅する、請求項２９に記載の方法。

【請求項51】

前記少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａにおけるヘリックスターンヘリックスドメインタンパク質であるＮ２９６＿１７６０に対応する遺伝子の７０ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅する、請求項２９に記載の方法。

【請求項52】

前記少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓにおけるｃｄａＲに対応する遺伝子の８５ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅する、請求項２９に記載の方法。

【請求項53】

前記少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅにおけるＳＩＰに対応する遺伝子の６６ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅する、請求項２９に記載の方法。

【請求項54】

前記少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイが、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓにおけるＩＰＴ１に対応する遺伝子の１０５ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅する、請求項２９に記載の方法。

【請求項55】

生物学的試料中の少なくとも１つの標的核酸の存在または不在を決定するための組成物であって、
少なくとも５つの異なる増幅プライマー対であって、前記対の前記プライマーが各々、表１における標的微生物の核酸配列の領域の全てまたは一部に特異的にハイブリダイズするように構成された標的ハイブリダイゼーション領域を含み、好適な条件下で前記プライマー対がアンプリコンを生成する、少なくとも５つの異なる増幅プライマー対と、
前記プライマー対によって生成された前記アンプリコンの領域の全てまたは一部に特異的にハイブリダイズするように構成された少なくとも５つの検出プローブと、を備える、組成物。

【請求項56】

複数の異なる標的核酸配列を含む対照核酸分子をさらに備え、前記複数の標的核酸配列が表１における少なくとも５つの遺伝子に特異的である、請求項５５に記載の組成物。

【請求項57】

前記組成物が、アッセイのパネルまたはコレクションである、請求項５５に記載の組成物。

【請求項58】

前記アッセイのパネルまたはコレクションが、ＴａｑＭａｎアッセイのパネルまたはコレクションを含む、請求項５７に記載の組成物。

【請求項59】

前記少なくとも１つの標的核酸が、尿路感染症に関連する微生物のバイオマーカーである、請求項５５に記載の組成物。

【請求項60】

前記組成物が固体支持体を備える、請求項５５に記載の組成物。

【請求項61】

前記少なくとも５つの増幅プライマー対が前記固体支持体上の場所によって分離されている、請求項６０に記載の組成物。

【請求項62】

前記組成物が、少なくとも１０個の異なる増幅プライマー対を備え、前記対の前記プライマーが各々、表１における標的微生物の核酸配列の領域の全てまたは一部に特異的にハイブリダイズするように構成された標的ハイブリダイゼーション領域を含み、好適な条件下で前記プライマー対がアンプリコンを生成する、請求項５５に記載の組成物。

【請求項63】

前記組成物が、少なくとも１５個の異なる増幅プライマー対を備え、前記対の前記プライマーが各々、表１における標的微生物の核酸配列の領域の全てまたは一部に特異的にハイブリダイズするように構成された標的ハイブリダイゼーション領域を含み、好適な条件下で前記プライマー対がアンプリコンを生成する、請求項５５に記載の組成物。

【請求項64】

前記組成物が、少なくとも１７個の異なる増幅プライマー対を備え、前記対の前記プライマーが各々、表１における標的微生物の核酸配列の領域の全てまたは一部に特異的にハイブリダイズするように構成された標的ハイブリダイゼーション領域を含み、好適な条件下で前記プライマー対がアンプリコンを生成する、請求項５５に記載の組成物。

【請求項65】

Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド２０２１００～２０２８００に対応する領域内に位置する受入番号ＮＺ＿ＧＧ７０４５７４．１における７０１の核酸配列内にある、請求項５５に記載の組成物。

【請求項66】

Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド１３７４００～１３８２００に対応する領域内に位置する受入番号ＮＺ＿ＡＮＡＶ０１０００００４．１における８０１の核酸配列内にある、請求項５５に記載の組成物。

【請求項67】

Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ（別名、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）の標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド１１５８６００～１１５９４００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ０１４７４８．１における８０１の核酸配列内にある、請求項５５に記載の組成物。

【請求項68】

Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド３２７４０００～３２７４８００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ００８８２３．１における８０１の核酸配列内にある、請求項５５に記載の組成物。

【請求項69】

Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド１７６９１００～１７６９９００に対応する領域内に位置する受入番号ＨＦ５５８５３０．１における８０１の核酸配列内にある、請求項５５に記載の組成物。

【請求項70】

Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド１７３００～１８１００に対応する領域内に位置する受入番号ＮＺ＿ＧＬ４７６１３１．１における８０１の核酸配列内にある、請求項５５に記載の組成物。

【請求項71】

Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド４３３６０００～４３３６７００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ０１５８４３．２における７０１の核酸配列内にある、請求項５５に記載の組成物。

【請求項72】

Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド２８５１７００～２８５２６００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ０２０３５８．１における８０１の核酸配列内にある、請求項５５に記載の組成物。

【請求項73】

Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド２０９０００～２０９０８００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ００７７２７．１における８０１の核酸配列内にある、請求項５５に記載の組成物。

【請求項74】

Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド３７５８００～３７６６００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ００４３４５．１における８０１の核酸配列内にある、請求項５５に記載の組成物。

【請求項75】

Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド５８０２００～５８１０００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ０１７０８２．１における８０１の核酸配列内にある、請求項５５に記載の組成物。

【請求項76】

Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド１０２００～１０２８００に対応する領域内に位置する受入番号ＪＰＩＸ０１０００００６．１における８０１の核酸配列内にある、請求項５５に記載の組成物。

【請求項77】

Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｔｕａｒｔｉｉの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド４９３０００～４９３８００に対応する領域内に位置する受入番号ＮＺ＿ＤＳ６０７６６３．１における８０１の核酸配列内にある、請求項５５に記載の組成物。

【請求項78】

Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド１８５７６００～１８５８４００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ００６８３１．１における８０１の核酸配列内にある、請求項５５に記載の組成物。

【請求項79】

Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド２００４００～２０１０００に対応する領域内に位置する受入番号ＡＰ００８９３４．１における６０１の核酸配列内にある、請求項５５に記載の組成物。

【請求項80】

Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド４１０００～４１６００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ０１０３１９．１における６０１の核酸配列内にある、請求項５５に記載の組成物。

【請求項81】

Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド８００～１５００に対応する領域内に位置する受入番号ＡＹ８８４２０３．１における７０１の核酸配列内にある、請求項５５に記載の組成物。

【請求項82】

複数の増幅反応を評価するための核酸構築物であって、
複数の異なる標的核酸配列を含む対照核酸分子を含み、前記複数の標的核酸配列が、ＤＮＡプラスミドに挿入された表１における少なくとも５つの遺伝子に指向される、核酸構築物。

【請求項83】

前記複数の標的核酸配列が、前記ＤＮＡプラスミド中の表１における遺伝子のうちの少なくとも１０個に指向される、請求項８２に記載の核酸構築物。

【請求項84】

前記複数の標的核酸配列が、前記ＤＮＡプラスミド中の表１における遺伝子のうちの少なくとも１５個に指向される、請求項８２に記載の核酸構築物。

【請求項85】

前記複数の標的核酸配列が、前記ＤＮＡプラスミド中の表１における遺伝子の各々に指向される、請求項８２に記載の核酸構築物。

【請求項86】

Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド２０２１００～２０２８００に対応する領域内に位置する受入番号ＮＺ＿ＧＧ７０４５７４．１における７０１の核酸配列内にある、請求項８２に記載の核酸構築物。

【請求項87】

Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド１３７４００～１３８２００に対応する領域内に位置する受入番号ＮＺ＿ＡＮＡＶ０１０００００４．１における８０１の核酸配列内にある、請求項８２に記載の核酸構築物。

【請求項88】

Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ（別名、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）の標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド１１５８６００～１１５９４００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ０１４７４８．１における８０１の核酸配列内にある、請求項８２に記載の核酸構築物。

【請求項89】

Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド３２７４０００～３２７４８００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ００８８２３．１における８０１の核酸配列内にある、請求項８２に記載の核酸構築物。

【請求項90】

Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド１７６９１００～１７６９９００に対応する領域内に位置する受入番号ＨＦ５５８５３０．１における８０１の核酸配列内にある、請求項８２に記載の核酸構築物。

【請求項91】

Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド１７３００～１８１００に対応する領域内に位置する受入番号ＮＺ＿ＧＬ４７６１３１．１における８０１の核酸配列内にある、請求項８２に記載の核酸構築物。

【請求項92】

Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド４３３６０００～４３３６７００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ０１５８４３．２における７０１の核酸配列内にある、請求項８２に記載の核酸構築物。

【請求項93】

Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド２８５１７００～２８５２６００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ０２０３５８．１における８０１の核酸配列内にある、請求項８２に記載の核酸構築物。

【請求項94】

Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド２０９０００～２０９０８００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ００７７２７．１における８０１の核酸配列内にある、請求項８２に記載の核酸構築物。

【請求項95】

Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド３７５８００～３７６６００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ００４３４５．１における８０１の核酸配列内にある、請求項８２に記載の核酸構築物。

【請求項96】

Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド５８０２００～５８１０００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ０１７０８２．１における８０１の核酸配列内にある、請求項８２に記載の核酸構築物。

【請求項97】

Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド１０２００～１０２８００に対応する領域内に位置する受入番号ＪＰＩＸ０１０００００６．１における８０１の核酸配列内にある、請求項８２に記載の核酸構築物。

【請求項98】

Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｔｕａｒｔｉｉの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド４９３０００～４９３８００に対応する領域内に位置する受入番号ＮＺ＿ＤＳ６０７６６３．１における８０１の核酸配列内にある、請求項８２に記載の核酸構築物。

【請求項99】

Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド１８５７６００～１８５８４００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ００６８３１．１における８０１の核酸配列内にある、請求項８２に記載の核酸構築物。

【請求項100】

Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド２００４００～２０１０００に対応する領域内に位置する受入番号ＡＰ００８９３４．１における６０１の核酸配列内にある、請求項８２に記載の核酸構築物。

【請求項101】

Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド４１０００～４１６００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ０１０３１９．１における６０１の核酸配列内にある、請求項８２に記載の核酸構築物。

【請求項102】

Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド８００～１５００に対応する領域内に位置する受入番号ＡＹ８８４２０３．１における７０１の核酸配列内にある、請求項８２に記載の核酸構築物。

【請求項103】

核酸試料中の複数の核酸配列を増幅するための方法であって、
複数の増幅反応を行うことであって、前記増幅反応が各々、核酸試料の一部と、各々が表１に記載の生物、ならびに対応するアンプリコンサイズ、領域、および受入番号に関連する標的核酸配列の群からの異なる標的核酸配列に対応する増幅産物を産生するように構成された一対の増幅プライマーとを含む、行うことと、
前記増幅反応から複数の異なる増幅産物を形成することと、
前記複数の異なる増幅産物のうちの少なくとも１つの存在または不在を決定することと、を含む、方法。

【請求項104】

前記複数の増幅反応を行うことであって、前記増幅反応のうちの少なくとも１０個が、核酸試料の一部と、各々が表１に記載の生物、ならびに対応するアンプリコンサイズ、領域、および／または受入番号に関連する標的核酸配列の前記群からの異なる標的核酸配列に対応する増幅産物を産生するように構成された一対の増幅プライマーを含む、行うことをさらに含む、請求項１０３に記載の方法。

【請求項105】

前記複数の増幅反応を行うことであって、前記増幅反応のうちの少なくとも１５個が、核酸試料の一部と、各々が表１に記載の生物、ならびに対応するアンプリコンサイズ、領域、および／または受入番号に関連する標的核酸配列の前記群からの異なる標的核酸配列に対応する増幅産物を産生するように構成された一対の増幅プライマーを含む、行うことをさらに含む、請求項１０３に記載の方法。

【請求項106】

前記複数の増幅反応を行うことであって、前記増幅反応の全てが、陰性対照を除いて、核酸試料の一部と、各々が表１に記載の生物、ならびに対応するアンプリコンサイズ、領域、および／または受入番号に関連する標的核酸配列の前記群からの異なる標的核酸配列に対応する増幅産物を産生するように構成された一対の増幅プライマーを含む、行うことをさらに含む、請求項１０３に記載の方法。

【請求項107】

核酸試料中の複数の核酸配列を増幅するための方法であって、
（ａ）複数の増幅反応を行うことであって、前記増幅反応のうちの少なくとも５つが、核酸試料の一部と、前記標的核酸配列に対応する増幅産物を産生するように構成された一対の増幅プライマーとを含み、各標的核酸配列が、表１に記載の異なる遺伝子の増幅産物である、行うことと、
（ｂ）複数の異なる増幅産物を形成することと、
（ｃ）前記複数の異なる増幅産物のうちの少なくとも１つの存在または不在を決定することと、を含む、方法。

【請求項108】

前記増幅反応のうちの少なくとも５つが、表１に列記されるアッセイＩＤから選択される一対の増幅プライマーを含む、請求項１０７に記載の方法。

【請求項109】

前記増幅反応のうちの少なくとも１０個が、表１に列記されるアッセイＩＤから選択される一対の増幅プライマーを含む、請求項１０７に記載の方法。

【請求項110】

前記増幅反応のうちの少なくとも１５個が、表１に列記されるアッセイＩＤから選択される一対の増幅プライマーを含む、請求項１０７に記載の方法。

【請求項111】

前記増幅反応のうちの１７個が、表１に列記されるアッセイＩＤから選択される一対の増幅プライマーを含む、請求項１０７に記載の方法。

【請求項112】

複数の増幅反応を行い、前記増幅反応のうちの少なくとも１０個が、核酸試料の一部と、前記標的核酸配列に対応する増幅産物を産生するように構成された一対の増幅プライマーとを含み、前記標的核酸配列が、表１に列記される遺伝子の一部の増幅産物である、請求項１０７に記載の方法。

【請求項113】

複数の増幅反応を行い、前記増幅反応のうちの少なくとも１５個が、核酸試料の一部と、前記標的核酸配列に対応する増幅産物を産生するように構成された一対の増幅プライマーとを含み、各前記標的核酸配列が、表１に記載の異なる遺伝子の増幅産物である、請求項１０７に記載の方法。

【請求項114】

前記複数の増幅反応を行い、前記増幅反応のうちの１７個が、陰性対照を除いて、核酸試料の一部と、前記標的核酸配列に対応する増幅産物を産生するように構成された一対の増幅プライマーとを含み、各前記標的核酸配列が、表１に記載の異なる遺伝子の増幅産物である、請求項１０７に記載の方法。

【請求項115】

前記増幅産物が５６～１０５ヌクレオチド長である、請求項１０７に記載の方法。

【請求項116】

増幅産物を産生するように構成された前記増幅プライマーの少なくとも１つの対が、前記対応する標的核酸配列の一部に相補的なまたはそれと同一の核酸配列を含むプライマーを含む、請求項１０７に記載の方法。

【請求項117】

前記増幅プライマーの少なくとも１つの対の前記対応する標的核酸配列が、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、無細胞ＤＮＡ、循環ＤＮＡ、またはｃＤＮＡ中に存在する核酸配列と同一のまたはそれに相補的な核酸配列を含む、請求項１０７に記載の方法。

【請求項118】

前記対応する標的核酸配列が、標的微生物のゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、無細胞ＤＮＡ、循環ＤＮＡ、またはｃＤＮＡ中に存在するか、またはそれに由来する、請求項１１７に記載の方法。

【請求項119】

前記標的微生物が表１に列記される微生物である、請求項１１８に記載の方法。

【請求項120】

前記形成することが、１０～１０，０００個の異なる増幅産物を並行して形成することを含む、請求項１０７に記載の方法。

【請求項121】

前記複数の増幅反応のうちの少なくとも２つが各々、異なる対応する標的核酸配列を増幅するように構成された一対の増幅プライマーを含む、請求項１０７に記載の方法。

【請求項122】

前記対応する標的核酸配列が、表１に列記される遺伝子またはその対応するｃＤＮＡの核酸配列の一部を含む、請求項１０７に記載の方法。

【請求項123】

前記遺伝子が、表１に列記される微生物中に存在する、請求項１２２に記載の方法。

【請求項124】

前記複数の増幅反応が各々、５６～１０５ヌクレオチド長の増幅産物を産生するように構成された一組の増幅プライマーを含む、請求項１０７に記載の方法。

【請求項125】

前記形成することが、表１に列記される遺伝子の一部に相補的なまたはそれと同一の核酸配列を含む１つ以上の増幅産物を形成することを含む、請求項１０７に記載の方法。

【請求項126】

前記形成することが、表１に列記される微生物に由来する核酸試料を使用して、表１に列記される全ての遺伝子毎に別個の増幅産物を形成することを含む、請求項１２５に記載の方法。

【請求項127】

前記形成することが、表１に列記される全ての微生物遺伝子毎に別個の増幅産物を形成することを含む、請求項１２５に記載の方法。

【請求項128】

前記形成することが、表１に列記される微生物遺伝子のうちの少なくとも２つの任意の組み合わせ毎に別個の増幅産物を形成することを含む、請求項１２５に記載の方法。

【請求項129】

前記複数の増幅反応のうちの１つ以上が、前記対応する標的核酸配列の一部と同一のまたはそれに相補的な配列を含む検出可能な標識プローブをさらに含む、請求項１０７に記載の方法。

【請求項130】

少なくとも１つの増幅反応の前記検出可能な標識プローブが、５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによる切断を受けるように構成されている、請求項１２９に記載の方法。

【請求項131】

少なくとも１つの増幅反応の前記検出可能な標識プローブが、その５’末端に蛍光標識およびその３’末端にクエンチャーを含む、請求項１２９に記載の方法。

【請求項132】

前記検出可能な標識プローブが副溝結合剤（ＭＧＢ）部分をさらに含む、請求項１２９に記載の方法。

【請求項133】

前記増幅反応のうちの少なくとも１つが、支持体内または支持体上に存在する個別の反応部位で生じ、前記支持体が１つ以上の個別の反応部位を含む、請求項１０７に記載の方法。

【請求項134】

前記支持体が、マルチウェルプレート、マイクロ流体カード、および複数の貫通孔反応部位を含むプレートから選択される、請求項１３３に記載の方法。

【請求項135】

前記個別の反応部位が、前記増幅プライマーのうちの１つ以上を含み、前記増幅することが、前記核酸試料の一部を前記個別の反応部位に分配することをさらに含む、請求項１３３に記載の方法。

【請求項136】

前記個別の反応部位が、一対の増幅プライマーおよび核酸プローブを含有する溶液の乾燥堆積物を含み、前記プライマーも前記プローブもいずれも、表１に列記される遺伝子に由来する核酸配列を増幅するように構成されている、請求項１３３に記載の方法。

【請求項137】

前記個別の反応部位が、前記核酸試料の前記一部が前記反応部位に分配される前または分配された後のいずれかに前記反応部位に分配されるポリメラーゼおよび／またはヌクレオチドをさらに含む、請求項１３５に記載の方法。

【請求項138】

前記核酸試料が尿検体から調製される、請求項１０７に記載の方法。

【請求項139】

前記複数の増幅反応を前記行うことの前に前記核酸試料を尿検体から調製することを含む、請求項１０７に記載の方法。

【請求項140】

試料中の微生物核酸の存在を検出するための方法であって、
（ａ）核酸試料の一部を支持体内に位置する個別の反応チャンバに分配することと、
（ｂ）並行増幅反応を行い、少なくとも５つの増幅産物を各々個別の反応チャンバ内に形成することであって、各増幅反応が、微生物のゲノム中に存在するか、またはそれに由来する標的核酸配列に対応する増幅産物を産生するように構成された一対の増幅プライマーを含み、前記対応する標的核酸配列が、表１に列記される遺伝子またはその対応するｃＤＮＡの核酸配列の一部を含む、形成することと、
（ｃ）前記増幅産物が前記個別の反応チャンバのうちの１つ以上内に形成されたかを決定することと、を含む、方法。

【請求項141】

前記増幅反応のうちの少なくとも５つが、表１に列記されるアッセイＩＤから選択される一対の増幅プライマーを含む、請求項１４０に記載の方法。

【請求項142】

前記増幅反応のうちの少なくとも１０個が、表１に列記されるアッセイＩＤから選択される一対の増幅プライマーを含む、請求項１４０に記載の方法。

【請求項143】

前記増幅反応のうちの少なくとも１５個が、表１に列記されるアッセイＩＤから選択される一対の増幅プライマーを含む、請求項１４０に記載の方法。

【請求項144】

前記増幅反応のうちの１７個が、表１に列記されるアッセイＩＤから選択される一対の増幅プライマーを含む、請求項１４０に記載の方法。

【請求項145】

少なくとも１０個の増幅産物が前記並行増幅反応中に形成される、請求項１４０に記載の方法。

【請求項146】

少なくとも１５個の増幅産物が前記並行増幅反応中に形成される、請求項１４０に記載の方法。

【請求項147】

少なくとも１７個の増幅産物が前記並行増幅反応中に形成される、請求項１４０に記載の方法。

【請求項148】

前記増幅産物が５６～１０５ヌクレオチド長である、請求項１４０に記載の方法。

【請求項149】

前記決定することが、任意にリアルタイムで、検出可能な標識プローブの前記増幅産物へのハイブリダイゼーションを検出することを含む、請求項１４０に記載の方法。

【請求項150】

前記標的核酸配列に対応する増幅産物を産生するように構成された前記増幅プライマーの少なくとも１つの対が、前記対応する標的核酸配列の一部に相補的なまたはそれと同一の核酸配列を含むプライマーを含む、請求項１４０に記載の方法。

【請求項151】

前記増幅プライマーの少なくとも１つの対の前記対応する標的核酸配列が、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、無細胞ＤＮＡ、循環ＤＮＡ、またはｃＤＮＡ中に存在する核酸配列と同一のまたはそれに相補的な核酸配列を含む、請求項１４０に記載の方法。

【請求項152】

前記対応する標的核酸配列が、標的微生物のゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、無細胞ＤＮＡ、循環ＤＮＡまたはｃＤＮＡ中に存在するか、またはそれに由来する、請求項１５１に記載の方法。

【請求項153】

前記微生物が表１に列記される微生物である、請求項１５２に記載の方法。

【請求項154】

前記形成することが、１０～１０，０００個の異なる増幅産物を並行して形成することを含む、請求項１４０に記載の方法。

【請求項155】

前記増幅反応のうちの少なくとも２つが各々、異なる対応する標的核酸配列を増幅するように構成された一対の増幅プライマーを含む、請求項１４０に記載の方法。

【請求項156】

前記遺伝子が、表１に列記される微生物中に存在する、請求項１４０に記載の方法。

【請求項157】

前記増幅反応が各々、表１に列記される遺伝子の少なくとも一部を増幅するように構成された増幅プライマーを含む、請求項１４０に記載の方法。

【請求項158】

前記形成することが、表１に列記される遺伝子の一部に相補的なまたはそれと同一の核酸配列を含む１つ以上の増幅産物を形成することを含む、請求項１４０に記載の方法。

【請求項159】

前記複数の増幅反応が各々、５６～１０５ヌクレオチド長の増幅産物を産生するように構成された一組の増幅プライマーを含む、請求項１４０に記載の方法。

【請求項160】

前記形成することが、表１に列記される微生物に由来する核酸試料を使用して、表１に列記される全ての遺伝子毎に別個の増幅産物を形成することを含む、請求項１５８に記載の方法。

【請求項161】

前記形成することが、表１に列記される全ての微生物遺伝子毎に別個の増幅産物を形成することを含む、請求項１５８に記載の方法。

【請求項162】

前記形成することが、表１に列記される微生物遺伝子のうちの少なくとも２つの任意の組み合わせ毎に別個の増幅産物を形成することを含む、請求項１５８に記載の方法。

【請求項163】

前記複数の前記増幅反応のうちの１つ以上が、対応する標的核酸配列の一部と同一のまたはそれに相補的な配列を含む検出可能な標識プローブをさらに含む、請求項１４０に記載の方法。

【請求項164】

少なくとも１つの増幅反応の前記検出可能な標識プローブが、５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによる切断を受けるように構成されている、請求項１６３に記載の方法。

【請求項165】

少なくとも１つの増幅反応の前記検出可能な標識プローブが、その５’末端に蛍光標識およびその３’末端にクエンチャーを含む、請求項１６３に記載の方法。

【請求項166】

前記検出可能な標識プローブが副溝結合剤（ＭＧＢ）部分をさらに含む、請求項１６３に記載の方法。

【請求項167】

前記増幅反応のうちの少なくとも１つが、支持体内または支持体上に存在する個別の反応部位で生じ、前記支持体が１つ以上の個別の反応部位を含む、請求項１４０の請求項に記載の方法。

【請求項168】

前記支持体が、マルチウェルプレート、マイクロ流体カード、および複数の貫通孔反応部位を含むプレートから選択される、請求項１６７に記載の方法。

【請求項169】

前記個別の反応部位が、前記増幅プライマーのうちの１つ以上を含み、前記増幅することが、前記核酸試料の一部を前記個別の反応部位に分配することをさらに含む、請求項請求項１４０に記載の方法。

【請求項170】

前記個別の反応チャンバが、一対の増幅プライマーおよび核酸プローブを含有する溶液の乾燥堆積物を含み、前記プライマーも前記プローブもいずれも、表１に列記される遺伝子に由来する核酸配列を増幅するように構成されている、請求項１４０に記載の方法。

【請求項171】

前記個別の反応チャンバが、前記核酸試料の前記一部が前記反応部位に分配される前または分配された後のいずれかに前記個別の反応チャンバに分配されるポリメラーゼおよび／またはヌクレオチドをさらに含む、請求項１７０に記載の方法。

【請求項172】

前記核酸試料が尿検体から調製される、請求項１４０に記載の方法。

【請求項173】

前記分配することの前に前記核酸試料を尿検体から調製することを含む、請求項１４０に記載の方法。

【請求項174】

核酸増幅のための支持体であって、
複数の反応部位を含む支持体であって、前記複数の反応部位が前記支持体内または前記支持体の表面上に位置する、支持体と、
前記反応部位のうちの少なくとも５つと、を含み、前記反応部位が、
（１）標的核酸配列に対応する増幅産物を産生するように構成された増幅プライマー対であって、前記増幅産物が表１における微生物に対応する、増幅プライマー対と、
（２）前記増幅産物にハイブリダイズするように構成された検出可能な標識プローブと、を含み、
前記少なくとも５つの前記反応部位が各々、異なる増幅プライマー対を対応する検出可能な標識プローブとともに含む、支持体。

【請求項175】

少なくとも１０個の前記反応部位を含み、前記少なくとも１０個の前記反応部位が各々、異なる増幅プライマー対を対応する検出可能な標識プローブとともに含む、請求項１７４に記載の支持体。

【請求項176】

少なくとも１５個の前記反応部位を含み、前記少なくとも１５個の前記反応部位が各々、異なる増幅プライマー対を対応する検出可能な標識プローブとともに含む、請求項１７４に記載の支持体。

【請求項177】

少なくとも１７個の前記反応部位を含み、前記少なくとも１７個の前記反応部位が各々、異なる増幅プライマー対を対応する検出可能な標識プローブとともに含む、請求項１７４に記載の支持体。

【請求項178】

前記増幅産物が５６～１０５ヌクレオチド長である、請求項１７４に記載の支持体。

【請求項179】

前記反応部位が各々、表１から選択される遺伝子の少なくとも一部または表１に列記される遺伝子の核酸誘導体を増幅するように構成された一対の増幅プライマーおよびプローブを含む、請求項１７４に記載の支持体。

【請求項180】

前記反応部位が各々、表１に列記されるアッセイＩＤから選択される一対の増幅プライマーおよびプローブを含む、請求項１７９に記載の支持体。

【請求項181】

少なくとも１つの反応部位の増幅プライマー対が、前記対応する標的核酸配列の一部に相補的なまたはそれと同一の核酸配列を含むプライマーを含む、請求項１７９に記載の支持体。

【請求項182】

前記対応する標的核酸配列が、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、無細胞ＤＮＡ、循環ＤＮＡ、またはｃＤＮＡ中に存在する核酸配列と同一のまたはそれに相補的な核酸配列を含む、請求項１８１に記載の支持体。

【請求項183】

前記対応する標的核酸配列が、標的微生物に由来するゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、無細胞ＤＮＡ、循環ＤＮＡまたはｃＤＮＡ中に存在するか、またはそれに由来する、請求項１８２に記載の支持体。

【請求項184】

前記標的微生物が表１から選択される、請求項１８３に記載の支持体。

【請求項185】

前記反応部位のうちの２つ以上が同じ核酸試料の一部を含む、請求項１７４に記載の支持体。

【請求項186】

前記核酸試料が尿検体に由来する、請求項１８５に記載の支持体。

【請求項187】

前記反応部位のうちの少なくとも１つが増幅産物を含む、請求項１７４に記載の支持体。

【請求項188】

反応部位の前記増幅産物が、表１に列記される遺伝子の一部に相補的なまたはそれと同一の核酸配列を含む、請求項１８７に記載の支持体。

【請求項189】

前記支持体が、異なる増幅産物を含む１０～１０，０００個の反応部位を含む、請求項１７４に記載の支持体。

【請求項190】

前記支持体が、表１に列記される全ての遺伝子と同一のまたはそれに相補的な増幅産物を含む反応部位を含む、請求項１８９に記載の支持体。

【請求項191】

前記反応部位のうちの少なくとも２つが各々、異なる対応する標的核酸配列を増幅するように構成された一対の増幅プライマーを含む、請求項１７４に記載の支持体。

【請求項192】

前記対応する標的核酸配列が、表１に列記される遺伝子またはその対応するｃＤＮＡの核酸配列の一部を含む、請求項１７４に記載の支持体。

【請求項193】

前記複数の反応部位が、表１に列記される微生物に由来する核酸試料を使用した表１に列記される全ての遺伝子の増幅産物を含む、請求項１７４に記載の支持体。

【請求項194】

前記複数の反応部位が、表１に列記される少なくとも２つの微生物に由来する核酸試料を使用した表１に列記される遺伝子のうちの少なくとも２つの任意の組み合わせの増幅産物を含む、請求項１７４に記載の支持体。

【請求項195】

前記反応部位のうちの少なくとも１つの前記検出可能な標識プローブが、５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによる切断を受けるように構成されている、請求項１７４に記載の支持体。

【請求項196】

少なくとも１つの前記反応部位の前記検出可能な標識プローブが、その５’末端に蛍光標識およびその３’末端にクエンチャーを含む、請求項１７４に記載の支持体。

【請求項197】

前記検出可能な標識プローブが副溝結合剤（ＭＧＢ）部分をさらに含む、請求項１７４に記載の支持体。

【請求項198】

前記支持体が、マルチウェルプレート、マイクロ流体カード、および複数の貫通孔反応部位を含むプレートから選択される、請求項１７４に記載の支持体。

【請求項199】

前記個別の反応部位のうちの１つ以上が、前記一対の増幅プライマーおよび前記検出可能な標識プローブを含有する溶液の乾燥堆積物を含む、請求項１７４に記載の支持体。

【請求項200】

前記個別の反応部位がポリメラーゼおよび／またはヌクレオチドをさらに含む、請求項１７４に記載の支持体。

【請求項201】

前記個別の反応部位のうちの１つ以上が、前記一対の増幅プライマー、前記検出可能な標識プローブ、ポリメラーゼ、およびヌクレオチドを含む凍結乾燥組成物を含む、請求項１７４に記載の支持体。

【請求項202】

前記増幅プライマー対および前記検出可能な標識プローブが、表１に列記されるアッセイのうちの１つに由来する、請求項１７４に記載の支持体。

【請求項203】

生物学的試料中の表１に列記される微生物のうちの１つ以上由来の少なくとも１つの標的核酸の存在または不在を決定するための組成物であって、
（ａ）少なくとも１つの増幅プライマー対であって、前記対の前記プライマーが各々、前記標的核酸の領域の全てまたは一部に特異的にハイブリダイズするように構成された標的ハイブリダイゼーション領域を含み、好適な条件下で前記プライマー対が表１における遺伝子からアンプリコンを生成する、少なくとも１つの増幅プライマー対と、
（ｂ）前記プライマー対によって生成された前記アンプリコンの領域の全てまたは一部に特異的にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つの検出プローブと、を含む、組成物。

【請求項204】

前記アンプリコンが５６～１０５ヌクレオチド長である、請求項２０３に記載の組成物。

【請求項205】

表１に列記される少なくとも１つのアッセイを含む、請求項２０３に記載の組成物。

【請求項206】

バイオマーカーのパネルを検出するための一組のヌクレオチドプローブを含み、前記プローブがある遺伝子群のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ配列に相補的であり、前記遺伝子群が表１に列記される遺伝子の任意の組み合わせから選択されることを特徴とする、請求項２０３に記載の組成物。

【請求項207】

前記一組のプローブが１～１７個の異なるプローブからなる、請求項２０６に記載の組成物。

【請求項208】

前記遺伝子群が、表１に列記される遺伝子から選択される５つの異なる遺伝子からなる、請求項２０６に記載の組成物。

【請求項209】

試料中の少なくとも５つの異なる標的核酸が増幅および検出され、前記標的核酸が表１に列記される５つの異なる微生物由来である、請求項２０３に記載の組成物。

【請求項210】

前記５つの標的核酸が、表１に列記される前記５つの異なる微生物の各々について列記されたアッセイを使用して増幅および検出される、請求項２０９に記載の組成物。

【請求項211】

前記遺伝子群が、表１に列記される遺伝子から選択される１０個の異なる遺伝子からなる、請求項２０６に記載の組成物。

【請求項212】

試料中の少なくとも１０個の異なる標的核酸が増幅および検出され、前記標的核酸が表１に列記される１０個の異なる微生物由来である、請求項２１１に記載の組成物。

【請求項213】

前記１０個の標的核酸が、表１に列記される前記１０個の異なる微生物の各々について列記されたアッセイを使用して増幅および検出される、請求項２１２に記載の組成物。

【請求項214】

前記遺伝子群が、表１に列記される遺伝子から選択される１５個の異なる遺伝子からなる、請求項２０６に記載の組成物。

【請求項215】

試料中の少なくとも１５個の異なる標的核酸が増幅および検出され、前記標的核酸が表１に列記される１５個の異なる微生物由来である、請求項２１４に記載の組成物。

【請求項216】

前記１５個の標的核酸が、表１に列記される前記１５個の異なる微生物の各々について列記されたアッセイを使用して増幅および検出される、請求項２１５に記載の組成物。

【請求項217】

前記遺伝子群が、表１に列記される遺伝子から選択される１７個の異なる遺伝子からなる、請求項２０６に記載の組成物。

【請求項218】

試料中の少なくとも１７個の異なる標的核酸が増幅および検出され、前記標的核酸が表１に列記される１７個の異なる微生物由来である、請求項２１７に記載の組成物。

【請求項219】

前記１７個の標的核酸が、表１に列記される前記１７個の異なる微生物の各々について列記されたアッセイを使用して増幅および検出される、請求項２１８に記載の組成物。

【請求項220】

生物学的試料に関連するバイオマーカーのパネルをプロファイリングする方法であって、
（ａ）対象から前記生物学的試料を得ることと、
（ｂ）前記試料の少なくともいくらかの部分を少なくとも５つの個別の増幅反応と接触させることであって、前記個別の反応が各々、標的特異的プライマーセットおよびポリメラーゼを含む、接触させることと、
（ｃ）増幅産物を産生することができる増幅条件下で個別の反応あたり少なくとも１つの標的配列を増幅することと、
（ｃ）前記複数の個別の反応の各々を、前記標的特異的プライマーによって産生された前記増幅産物に特異的な検出可能な標識プローブと接触させることと、
（ｄ）前記複数の個別の増幅反応の各々における前記増幅産物の存在または不在を決定して、前記生物学的試料のバイオマーカープロファイルに達することであって、前記バイオマーカーが表１に列記される遺伝子に関連する、達することと、を含む、方法。

【請求項221】

少なくとも１０個の個別の増幅反応が、前記試料の前記少なくともいくらかの部分によって接触される、請求項２２０に記載の方法。

【請求項222】

少なくとも１５個の個別の増幅反応が、前記試料の前記少なくともいくらかの部分によって接触される、請求項２２０に記載の方法。

【請求項223】

少なくとも１７個の個別の増幅反応が、前記試料の前記少なくともいくらかの部分によって接触される、請求項２２０に記載の方法。

【請求項224】

前記バイオマーカーが泌尿生殖器感染症および／または微生物叢に関連する、請求項２２０に記載の方法。

【請求項225】

前記パネルが、１～１７個の異なるバイオマーカーセットを含む、請求項２２０に記載の方法。

【請求項226】

前記複数の個別の増幅反応が固体支持体上にある、請求項２２０に記載の方法。

【請求項227】

前記複数の個別の増幅反応が各々、表１から選択される単一のアッセイを含む、請求項２２０に記載の方法。

【請求項228】

対照核酸分子を含む試料中の複数の標的核酸配列を増幅するための方法であって、
複数の増幅反応を並行して行うことであって、前記複数の増幅反応が各々、前記試料の一部と、前記対照核酸分子中の対応する標的配列を増幅するように構成された増幅プライマー対とを含み、前記対照核酸分子が複数の異なる標的配列を含む、行うことと、
前記対照核酸分子中の少なくとも２つの異なる標的配列に対応する複数の異なる増幅産物を形成することと、
前記増幅反応における少なくとも２つの異なる増幅産物の存在を決定することと、を含む、方法。

【請求項229】

前記対照核酸分子が、表１に記載の異なる微生物由来の少なくとも５つの異なる標的配列を含む、請求項２２８に記載の方法。

【請求項230】

前記対照核酸分子が、表１に記載の異なる微生物由来の少なくとも１０個の異なる標的配列を含む、請求項２２９に記載の方法。

【請求項231】

前記対照核酸分子が、表１に記載の異なる微生物由来の少なくとも１５個の異なる標的配列を含む、請求項２３０に記載の方法。

【請求項232】

前記対照核酸分子が、表１に記載の異なる微生物由来の全ての異なる標的配列を含む、請求項２２８に記載の方法。

【請求項233】

前記複数の異なる標的配列が、表１に記載の異なる微生物のゲノム配列またはトランスクリプトーム配列に由来する、請求項２２８に記載の方法。

【請求項234】

前記複数の異なる標的配列が、表１から選択される任意の数の微生物遺伝子に由来する、請求項２２８に記載の方法。

【請求項235】

前記形成することが、５～１００個の異なる増幅産物を並行して形成することを含む、請求項２２８に記載の方法。

【請求項236】

前記形成することが、１０～５０個の異なる増幅産物を並行して形成することを含む、請求項２３５に記載の方法。

【請求項237】

対応する標的配列を増幅するように構成された少なくとも１つの増幅プライマー対が、前記対応する標的配列の一部に相補的なまたはそれと同一の核酸配列を含むプライマーを含む、請求項２２８に記載の方法。

【請求項238】

前記複数の増幅反応のうちの少なくとも２つが各々、異なる対応する標的配列を増幅するように構成された増幅プライマー対を含む、請求項２２８に記載の方法。

【請求項239】

前記複数の増幅反応のうちの１つ以上の増幅反応が、前記対応する標的配列の一部と同一のまたはそれに相補的な配列を含む検出可能な標識プローブをさらに含む、請求項２２８に記載の方法。

【請求項240】

少なくとも１つの増幅反応の前記検出可能な標識プローブが、５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによる切断を受けるように構成されている、請求項２３９に記載の方法。

【請求項241】

少なくとも１つの増幅反応の前記検出可能な標識プローブが、その５’末端に蛍光標識およびその３’末端にクエンチャーを含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項242】

前記対照核酸分子がＤＮＡプラスミドである、請求項２２８に記載の方法。

【請求項243】

前記ＤＮＡプラスミドが線状である、請求項２４２に記載の方法。

【請求項244】

前記増幅反応を行うことの前に前記対照核酸分子を含む前記試料を細胞から調製することをさらに含む、請求項２２８に記載の方法。

【請求項245】

対照核酸分子を含む試料中の複数の標的核酸配列を増幅するための方法であって、
前記試料を複数の反応体積に分配することであって、前記対照核酸分子が複数の異なる標的配列を含み、前記反応体積が、前記対照核酸分子中の対応する標的配列を増幅するように構成された少なくとも２つの異なる増幅プライマー対を含む、分配することと、
前記反応体積中で増幅反応を行い、前記対照核酸分子中の少なくとも２つの異なる標的配列に対応する複数の異なる増幅産物を形成することと、
前記増幅反応における少なくとも２つの異なる増幅産物の存在を決定することと、を含む、方法。

【請求項246】

複数の増幅反応を評価するための方法であって、
核酸試料の一部を支持体内または支持体上に位置する個別の反応チャンバに分配することであって、前記核酸試料が対照核酸分子を含み、前記対照核酸分子が複数の異なる標的配列を含む、分配することと、
複数の並行増幅反応を行い、前記対照核酸分子中の少なくとも２つの異なる標的配列に対応する複数の異なる標的増幅産物を前記個別の反応チャンバ内で形成することであって、
各増幅反応が、前記対照核酸分子中に存在する対応する標的配列を増幅するように構成された増幅プライマー対を含み、前記増幅反応のうちの少なくとも２つが、前記対照核酸分子中に存在する異なる対応する標的配列を増幅するように構成された増幅プライマーを含む、形成することと、
前記個別の反応チャンバのうちの少なくとも２つ内で形成された少なくとも２つの異なる標的増幅産物を定量化することと、を含む、方法。

【請求項247】

前記方法が、前記対照核酸分子の連続希釈液である一組の試料を使用して行われる、請求項２４６に記載の方法。

【請求項248】

前記連続希釈された対照核酸分子由来の前記定量化された標的増幅産物に基づいて、前記対照核酸分子の標的配列のうちの少なくとも１つの検出限界を決定することをさらに含む、請求項２４７に記載の方法。

【請求項249】

前記連続希釈された対照核酸分子由来の前記定量化された標的増幅産物に基づいて、前記対照核酸分子の標的配列のうちの少なくとも１つのダイナミックレンジを決定することをさらに含む、請求項２４７に記載の方法。

【請求項250】

前記定量化することが、任意にリアルタイムで、検出可能な標識プローブの前記増幅産物へのハイブリダイゼーションを検出することを含む、請求項２４６に記載の方法。

【請求項251】

前記対照核酸分子が、表１に記載の微生物由来の少なくとも５つの異なる標的配列を含む、請求項２４６に記載の方法。

【請求項252】

前記対照核酸分子が、表１に記載の微生物由来の少なくとも１０個の異なる標的配列を含む、請求項２５１に記載の方法。

【請求項253】

前記対照核酸分子が、表１に記載の微生物由来の少なくとも１５個の異なる標的配列を含む、請求項２５２に記載の方法。

【請求項254】

前記対照核酸分子が、表１に記載の微生物由来のほぼ全ての異なる標的配列を含む、請求項２４６に記載の方法。

【請求項255】

前記複数の標的配列が、表１における異なる微生物のゲノム配列に由来する、請求項２４６に記載の方法。

【請求項256】

前記形成することが、５～１００個の異なる増幅産物を形成することを含む、請求項２４６に記載の方法。

【請求項257】

前記形成することが、１～１７個の異なる増幅産物を形成することを含む、請求項２５６に記載の方法。

【請求項258】

前記複数の増幅反応のうちの１つ以上の増幅反応が、前記対応する標的配列の一部と同一のまたはそれに相補的な配列を含む検出可能な標識プローブをさらに含む、請求項２４６に記載の方法。

【請求項259】

少なくとも１つの増幅反応の前記検出可能な標識プローブが、５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによる切断を受けるように構成されている、請求項２５８に記載の方法。

【請求項260】

少なくとも１つの増幅反応の前記検出可能な標識プローブが、その５’末端に蛍光標識およびその３’末端にクエンチャーを含む、請求項２５９に記載の方法。

【請求項261】

前記個別の反応チャンバが、前記試料の前記一部が前記反応チャンバに分配される前または分配された後のいずれかに前記個別の反応チャンバに分配されるポリメラーゼおよび／またはヌクレオチドをさらに含む、請求項２６０に記載の方法。

【請求項262】

前記対照核酸分子がＤＮＡプラスミドである、請求項２４６に記載の方法。

【請求項263】

前記ＤＮＡプラスミドが線状である、請求項２６２に記載の方法。

【請求項264】

複数の異なる増幅標的配列を含む核酸構築物であって、前記増幅標的配列のうちの少なくとも２つが、表１から選択される遺伝子またはその対応するｃＤＮＡの少なくとも５６ヌクレオチド部分を含む、核酸構築物。

【請求項265】

複数の異なる増幅標的配列を含む核酸構築物であって、前記増幅標的配列のうちの少なくとも２つが、表１から選択される少なくとも２つの異なる微生物または微生物遺伝子に由来する、核酸構築物。

【請求項266】

核酸増幅のためのアレイであって、
複数の反応部位を含む支持体であって、前記複数の反応部位が前記支持体内または前記支持体上に位置する、支持体を含み、
前記複数の反応部位が各々、
（ｉ）複数の異なる標的配列を含む対照核酸分子と、
（ｉｉ）対応する標的配列を増幅するように構成された増幅プライマー対と、
（ｉｉｉ）前記対の前記増幅プライマーのうちの少なくとも１つの伸長によって生成される核酸配列にハイブリダイズするように構成された検出可能な標識プローブと、を含む、アレイ。

【請求項267】

前記異なる標的配列のうちの少なくとも２つが、表１から選択される遺伝子またはその対応するｃＤＮＡの少なくとも５６ヌクレオチド部分を含む、請求項２６６に記載のアレイ。

【請求項268】

前記対照核酸分子が、表１に記載の微生物由来の少なくとも５つの異なる標的配列を含む、請求項２６６に記載のアレイ。

【請求項269】

前記対照核酸分子が、表１に記載の微生物由来の少なくとも１０個の異なる標的配列を含む、請求項２６８に記載のアレイ。

【請求項270】

前記対照核酸分子が、表１に記載の微生物由来の少なくとも１５個の異なる標的配列を含む、請求項２６９に記載のアレイ。

【請求項271】

前記対照核酸分子が、表１に記載の微生物由来の全ての異なる標的配列を含む、請求項２７０に記載のアレイ。

【請求項272】

前記対照核酸分子がプラスミドである、請求項２６６に記載のアレイ。

【請求項273】

前記プラスミドが線状である、請求項２７２に記載のアレイ。

【請求項274】

前記反応部位のうちの少なくとも１つが増幅産物を含む、請求項２６６に記載のアレイ。

【請求項275】

前記支持体が、異なる増幅産物を含む１０～１０，０００個の反応部位を含む、請求項２６６に記載のアレイ。

【請求項276】

前記反応部位のうちの少なくとも２つが各々、異なる対応する標的配列を増幅するように構成された増幅プライマー対を含む、請求項２６６に記載のアレイ。

【請求項277】

少なくとも１つの反応部位の前記検出可能な標識プローブが、５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによる切断を受けるように構成されている、請求項２６６に記載のアレイ。

【請求項278】

少なくとも１つの反応部位の前記検出可能な標識プローブが、その５’末端に蛍光標識およびその３’末端にクエンチャーを含む、請求項２６６に記載のアレイ。

【請求項279】

前記検出可能な標識プローブが副溝結合剤部分をさらに含む、請求項２６６に記載のアレイ。

【請求項280】

前記支持体が、マルチウェルプレート、マイクロ流体カード、および複数の貫通孔反応部位を含むプレートから選択される、請求項２６６に記載のアレイ。

【請求項281】

前記複数の反応部位がポリメラーゼおよび／またはヌクレオチドをさらに含む、請求項２６６に記載のアレイ。

【請求項282】

複数の標的核酸配列を増幅するための方法であって、
対照核酸分子および試験核酸試料の両方を複数の反応体積に分配することであって、前記対照核酸分子が複数の異なる標的配列を含み、前記試験核酸試料が１つ以上の試験核酸分子を含む、分配することと、
前記反応体積を核酸増幅条件に供し、前記対照核酸分子中の異なる標的配列を増幅するために各々使用される増幅プライマー対を使用して前記反応体積中の前記対照核酸分子の少なくとも２つの異なる標的配列を増幅することと、
前記反応体積中の少なくとも２つの異なる増幅された標的配列の存在を検出することと、を含む、方法。

【請求項283】

前記対照核酸分子が環状である、請求項２８２に記載の方法。

【請求項284】

前記対照核酸分子が線状である、請求項２８３に記載の方法。

【請求項285】

前記対照核酸分子および前記試験核酸試料由来の試験核酸分子を異なる反応体積に分配することをさらに含む、請求項２８２に記載の方法。

【請求項286】

前記試験核酸試料が、異なる標的配列を各々含む２つ以上の異なる標的核酸分子も含む、請求項２８２に記載の方法。

【請求項287】

前記標的核酸試料中の異なる標的配列を増幅するために各々使用される増幅プライマー対を使用して前記反応体積中の前記試験核酸試料の少なくとも２つの異なる標的配列を増幅することをさらに含む、請求項２８６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

多種多様の微生物が疾患および障害を引き起こすか、またはその一因となり得る。感染病原体は、個体から個体に伝播し、その集団に疾病をもたらし得る。個体の微生物集団に不均衡が生じたときに共生関係にある宿主上または宿主中に存在する微生物が宿主病をもたらす。ヒトマイクロバイオームプロジェクトは、ヒトおよび動物マイクロバイオームの組成および特定の組織における均衡を維持する能力に関する豊かな洞察を提供している。

【0002】

泌尿生殖器、膀胱、および尿路組織は、細菌、真菌、ウイルス、および／または寄生虫微生物（例えば、尿路病原体）の発生が不均衡を引き起こし、その部位に深刻な影響を及ぼし得る豊かな環境である。

【0003】

毎年、約１億５千万人が、症候性であるか無症候性であるかにかかわらず重大な健康問題を提示する尿路感染症（ＵＴＩ）に罹患している。現在、ＵＴＩは、臨床症状および尿分析（細菌培養、および白血球の存在）に基づいて診断され、抗生物質で治療されている。しかしながら、ヒト尿路が多様かつ複雑な微生物群を宿主としており、新たな証拠により、膀胱および尿路微生物叢（ＵＴＭ）が泌尿器の健康にプラスおよびマイナスの両方の重大な影響を及ぼし得ることが示されている。現在の尿路診断法は目標スループット不足に悩まされており、微生物培養分析（検尿）に依存している。対照的に、パネルに基づく分子試験は、特定の種の存在を特定するのみならず、尿微生物叢をプロファイリングすることもでき、その生物学的意義を理解する助けとなり、適切な抗生物質に関する指針を提供しそれにより、過剰治療を軽減することができる。

【0004】

従来の培養に基づく方法は、多くの場合、特に多微生物性または混合フローラ環境下で、ＵＴＩにおける病原体細菌または真菌を検出し損なう。これは、少なくとも部分的に、全ての尿路病原体が、ある特定の種および／または微生物を検出し損ない得る標準培養条件下で、同等に良好に増殖するわけではないという理由による。加えて、現在の培養に基づく方法は、多大な時間を必要とし、スループットが低く、感度および／または特異度を欠き得る。したがって、尿路感染症の多微生物性質は、尿培養に固有の制限を打開し、かつ尿中に存在する尿路病原体の迅速かつ正確な測定を提供することができるアッセイシステムの開発を必要としている。尿微生物モニタリングおよび検出で使用するための現在の技術は多大な費用を必要とし、感度および／もしくは特異度を欠き、かつ／または複雑なまたは非常に長いワークフローを必要とする。泌尿生殖器、膀胱、および尿路感染症ならびに微生物叢をモニタリングおよびプロファイリングするための特有の効率的な費用効率の高いシステムが必要とされている。

【発明の概要】

【0005】

一態様では、核酸試料中の複数の核酸配列を増幅するための方法であって、増幅プライマー対を各々含む少なくとも５つの異なるアッセイを使用して、複数の核酸配列を含む試料源由来のアリコートを各々含む少なくとも５つの増幅反応混合物を形成することであって、アッセイが表１におけるアッセイ群から選択される、形成することと、各増幅反応混合物を反応容器に適用することと、複数の増幅反応を反応容器上で行うことと、複数の増幅反応中に反応容器上の１つ以上の位置内の標的核酸配列に対応する増幅産物を検出することと、を含む、方法が提供される。一実施形態では、本方法は、反応を増幅産物検出システムで利用することと、増幅産物検出システムを動作させて、任意に関連表を使用して、反応容器上の増幅反応混合物の位置を、増幅反応混合物で利用されるアッセイＩＤのうちの１つ以上と関連付けることと、をさらに含む。本方法の一実施形態では、反応容器は、複数のウェルを有するプレートである。本方法の別の実施形態では、反応容器は、アレイである。本方法の別の実施形態では、反応容器は、オープンアレイプレートである。本方法のさらに別の実施形態では、反応容器は、チップマイクロアレイである。一実施形態では、本方法は、表１におけるアッセイ群から選択される少なくとも１０個の異なるアッセイを使用して、複数の核酸配列を含む試料源由来のアリコートを各々含む少なくとも１０個の増幅反応混合物を形成することを含む。一実施形態では、本方法は、表１におけるアッセイ群から選択される少なくとも１５個の異なるアッセイを使用して、複数の核酸配列を含む試料源由来のアリコートを各々含む少なくとも１５個の増幅反応混合物を形成することを含む。一実施形態では、本方法は、表１におけるアッセイ群から選択される１７個の異なるアッセイを使用して、複数の核酸配列を含む試料源由来のアリコートを各々含む１７個の増幅反応混合物を形成することを含む。一実施形態では、本方法は、表１における全てのアッセイを使用して、複数の核酸配列を含む試料源由来のアリコートを各々含む反応混合物を形成することを含む。本方法の一実施形態では、試料源は、尿検体である。本方法の一実施形態では、増幅産物は、５６～１０５ヌクレオチド長のアンプリコンを有する核酸試料の標的アンプリコンを含む。本方法の一実施形態では、アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０８４＿ｓ１は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの遺伝子の注釈を付けられていない領域の核酸配列の一部を標的とするプライマー対を含む。本方法の一実施形態では、アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０８８＿ｓ１は、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉのクピンスーパーファミリー遺伝子のシュウ酸デカルボキシラーゼ／古細菌ホスホグルコースイソメラーゼ（例えば、ＣＯＧ２１４０等）の核酸配列の一部を標的とするプライマー対を含む。本方法の一実施形態では、アッセイＩＤ Ｂａ０７２８６６１７＿ｓ１および／またはＢａ０７２８６６１６＿ｓ１は、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉの鉄錯体輸送系基質結合タンパク質の核酸配列の一部を標的とするプライマー対を含む。本方法の一実施形態では、アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０８０＿ｓ１は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ（以前のＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）のピリドキサールリン酸依存性ヒスチジンデカルボキシラーゼ（ｈｄｃ）遺伝子の核酸配列の一部を標的とするプライマー対を含む。本方法の一実施形態では、アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０８７＿ｓ１は、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅの遺伝子の仮説的タンパク質の核酸配列の一部を標的とするプライマー対を含む。本方法の一実施形態では、アッセイＩＤ Ｂａ０４６４６２４７＿ｓ１は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓのアミノトランスフェラーゼクラスＶ遺伝子の核酸配列の一部を標的とするプライマー対を含む。本方法の一実施形態では、アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０８６＿ｓ１は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍのＰｈｎＢ－ＭｅｒＲファミリー転写調節因子遺伝子の核酸配列の一部を標的とするプライマー対を含む。本方法の一実施形態では、アッセイＩＤ Ｂａ０４６４６２４２＿ｓ１は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＤＮＡ結合転写調節因子ＭｅｒＲファミリー（Ｚｎｔｒ）遺伝子（例えば、ＣＯＧ０７８９等）の核酸配列の一部を標的とするプライマー対を含む。本方法の一実施形態では、アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０７９＿ｓ１は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａのｐａｒＣ（ＤＮＡトポイソメラーゼＩＶサブユニットＡ）遺伝子の核酸配列の一部を標的とするプライマー対を含む。本方法の一実施形態では、アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０８３＿ｓ１は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのａｃｔ様タンパク質遺伝子の核酸配列の一部を標的とするプライマー対を含む。本方法の一実施形態では、アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０７８＿ｓ１は、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉのＦｅ２＋輸送系タンパク質ＦｅｏＡ遺伝子であるＣＯＧ１９１８の核酸配列の一部を標的とするプライマー対を含む。本方法の一実施形態では、アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０７６＿ｓ１は、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓのｕｒｅＲ遺伝子であるａｒａＣの核酸配列の一部を標的とするプライマー対を含む。本方法の一実施形態では、アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０７７＿ｓ１は、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓのＳＵＭＦ１遺伝子の核酸配列の一部を標的とするプライマー対を含む。本方法の一実施形態では、アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０８２＿ｓ１は、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｔｕａｒｔｉｉの推定鉄硫黄修飾タンパク質遺伝子であるラジカルＳＡＭスーパーファミリーのスルファターゼ成熟酵素ＡｓｌＢ（例えば、ＣＯＧ０６４１等）の核酸配列の一部を標的とするプライマー対を含む。本方法の一実施形態では、アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０８１＿ｓ１は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのヘリックスターンヘリックスドメインタンパク質遺伝子であるＮ２９６＿１７６０の核酸配列の一部を標的とするプライマー対を含む。本方法の一実施形態では、アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０８５＿ｓ１は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓのｃｄａＲ遺伝子の核酸配列の一部を標的とするプライマー対を含む。本方法の一実施形態では、アッセイＩＤ Ｂａ０４６４６２７６＿ｓ１は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅのＳＩＰ遺伝子の核酸配列の一部を標的とするプライマー対を含む。本方法の一実施形態では、アッセイＩＤ Ｆｎ０４６４６２３３＿ｓ１は、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓのＩＰＴ１遺伝子の核酸配列の一部を標的とするプライマー対を含む。

【0006】

別の態様では、核酸試料中の複数の核酸配列を増幅するための方法であって、複数の核酸配列を含む試料源由来のアリコートを各々含む複数の増幅反応混合物を形成することであって、試料源が尿検体である、形成することと、複数の増幅反応混合物を反応容器に適用することであって、反応容器が、表１における対応する標的領域位置および対応する標的領域サイズを有する異なる遺伝子を各々標的とする少なくとも５つのアッセイで構成されており、各アッセイが増幅プライマー対を含む、適用することと、複数の増幅反応を反応容器上で行うことと、複数の増幅反応中に反応容器上の位置内の標的核酸配列に対応する増幅産物検出することと、を含む、方法が提供される。一実施形態では、本方法は、反応容器を増幅産物検出システム内で利用することと、増幅産物検出システムを動作させて、任意に関連表を使用して、反応容器上の増幅反応混合物の位置を、反応容器で利用されるアッセイのうちの１つ以上と関連付けることと、をさらに含む。本方法の一実施形態では、反応容器は、複数のウェルを有するプレートである。本方法の別の実施形態では、反応容器は、アレイである。本方法の別の実施形態では、反応容器は、オープンアレイプレートである。本方法のさらに別の実施形態では、反応容器は、チップマイクロアレイである。本方法の一実施形態では、反応容器は、表１に列記される異なる遺伝子を各々標的とする少なくとも１０個のアッセイで構成されている。本方法の一実施形態では、反応容器は、表１に列記される異なる遺伝子を各々標的とする少なくとも１５個のアッセイで構成されている。本方法の一実施形態では、反応容器は、表１に列記される遺伝子のうちの１７個を標的とするアッセイで構成されている。本方法の一実施形態では、反応容器は、表１に列記される遺伝子の各々を標的とするアッセイで構成されている。一実施形態では、本方法は、９３ヌクレオチド長であり、かつＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉにおける注釈を付けられていない領域の遺伝子に対応するアンプリコンを増幅する少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイを含む。一実施形態では、本方法は、１０３ヌクレオチド長であり、かつＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉにおけるクピンスーパーファミリー遺伝子のシュウ酸デカルボキシラーゼ／古細菌ホスホグルコースイソメラーゼ（例えば、ＣＯＧ２１４０を含む）に対応するアンプリコンを増幅する少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイを含む。一実施形態では、本方法は、６２および／または１１０ヌクレオチド長であり、かつＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉの鉄錯体輸送系基質結合タンパク質の核酸配列の一部に対応するアンプリコンを増幅する少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイを含む。一実施形態では、本方法は、９８ヌクレオチド長であり、かつＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ（以前のＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）におけるピリドキサールリン酸依存性ヒスチジンデカルボキシラーゼ（ｈｄｃ）遺伝子に対応するアンプリコンを増幅する少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイを含む。一実施形態では、本方法は、８８ヌクレオチド長であり、かつＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅにおける仮説的タンパク質の遺伝子に対応するアンプリコンを増幅する少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイを含む。一実施形態では、本方法は、９５ヌクレオチド長であり、かつＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓにおけるアミノトランスフェラーゼクラスＶ遺伝子に対応するアンプリコンを増幅する少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイを含む。一実施形態では、本方法は、９８ヌクレオチド長であり、かつＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍにおけるＰｈｎＢ－ＭｅｒＲファミリー転写調節因子遺伝子に対応するアンプリコンを増幅する少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイを含む。一実施形態では、本方法は、６３ヌクレオチド長であり、かつＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおけるＤＮＡ結合転写調節因子ＭｅｒＲファミリー（Ｚｎｔｒ）遺伝子（例えば、ＣＯＧ０７８９を含む）に対応するアンプリコンを増幅する少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイを含む。一実施形態では、本方法は、９３ヌクレオチド長であり、かつＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａにおけるｐａｒＣ（ＤＮＡトポイソメラーゼＩＶサブユニットＡ）遺伝子に対応するアンプリコンを増幅する少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイを含む。一実施形態では、本方法は、５６ヌクレオチド長であり、かつＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅにおけるａｃｔ様タンパク質に対応するアンプリコンを増幅する少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイを含む。一実施形態では、本方法は、９１ヌクレオチド長であり、かつＭｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉにおけるＦｅ２＋輸送系タンパク質ＦｅｏＡ遺伝子（例えば、ＣＯＧ１９１８を含む）に対応するアンプリコンを増幅する少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイを含む。一実施形態では、本方法は、１００ヌクレオチド長であり、かつＰｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓにおけるｕｒｅＲ遺伝子であるａｒａＣに対応するアンプリコンを増幅する少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイを含む。一実施形態では、本方法は、７６ヌクレオチド長であり、かつＰｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓにおけるＳＵＭＦ１遺伝子に対応するアンプリコンを増幅する少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイを含む。一実施形態では、本方法は、１００ヌクレオチド長であり、かつＰｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｔｕａｒｔｉｉにおける推定鉄硫黄修飾タンパク質であるラジカルＳＡＭスーパーファミリーのスルファターゼ成熟酵素ＡｓｌＢ遺伝子（例えば、ＣＯＧ０６４１を含む）に対応するアンプリコンを増幅する少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイを含む。一実施形態では、本方法は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａにおけるヘリックスターンヘリックスドメインタンパク質遺伝子（例えば、Ｎ２９６＿１７６０を含む）の７０ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅する少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイを含む。一実施形態では、本方法は、８５ヌクレオチド長であり、かつＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓにおけるｃｄａＲ遺伝子に対応するアンプリコンを増幅する少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイを含む。一実施形態では、本方法は、６６ヌクレオチド長であり、かつＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅにおけるＳＩＰ遺伝子に対応するアンプリコンを増幅する少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイを含む。一実施形態では、本方法は、１０５ヌクレオチド長であり、かつＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓにおけるＩＰＴ１遺伝子に対応するアンプリコンを増幅する少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイを含む。

【0007】

別の態様では、生物学的試料中の少なくとも１つの標的核酸の存在または不在を決定するための組成物であって、少なくとも５つの異なる増幅プライマー対であって、該対の該プライマーが各々、表１における標的微生物の核酸配列の領域の全てまたは一部に特異的にハイブリダイズするように構成された標的ハイブリダイゼーション領域を含み、好適な条件下で該プライマー対がアンプリコンを生成する、少なくとも５つの異なる増幅プライマー対と、該プライマー対によって生成された該アンプリコンの領域の全てまたは一部に特異的にハイブリダイズするように構成された少なくとも５つの検出プローブと、を含む、組成物が提供される。一実施形態では、本組成物は、複数の異なる標的核酸配列を含む対照核酸分子をさらに含み、該複数の異なる標的核酸配列は、表１における少なくとも５つの遺伝子に特異的である。一実施形態では、本組成物は、アッセイのパネルまたはコレクションである。一実施形態では、アッセイのパネルまたはコレクションは、ＴａｑＭアッセイのパネルまたはコレクションを含む。本組成物の一実施形態では、少なくとも１つの標的核酸は、尿路感染症に関連する微生物のバイオマーカーである。一実施形態では、本組成物は、固体支持体を含む。本組成物の一実施形態では、少なくとも５つの増幅プライマー対は、固体支持体上の位置によって分離されている。一実施形態では、本組成物は、少なくとも１０個の異なる増幅プライマー対を含み、該対の該プライマーが各々、表１における標的微生物の核酸配列の領域の全てまたは一部に特異的にハイブリダイズするように構成された標的ハイブリダイゼーション領域を含み、好適な条件下で該プライマー対がアンプリコンを生成する。一実施形態では、本組成物は、少なくとも１５個の異なる増幅プライマー対を含み、該対の該プライマーが各々、表１における標的微生物の核酸配列の領域の全てまたは一部に特異的にハイブリダイズするように構成された標的ハイブリダイゼーション領域を含み、好適な条件下で該プライマー対がアンプリコンを生成する。一実施形態では、本組成物は、少なくとも１７個の異なる増幅プライマー対を含み、該対の該プライマーが各々、表１における標的微生物の核酸配列の領域の全てまたは一部に特異的にハイブリダイズするように構成された標的ハイブリダイゼーション領域を含み、好適な条件下で該プライマー対がアンプリコンを生成する。本組成物の一実施形態では、少なくとも１つの標的核酸は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉに特異的であり、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉゲノムのヌクレオチド２０２１００～２０２８００に対応する領域内に位置する受入番号ＮＺ＿ＧＧ７０４５７４．１における７０１核酸配列内にある。本組成物の一実施形態では、少なくとも１つの標的核酸は、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉに特異的であり、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉゲノムのヌクレオチド１３７４００～１３８２００に対応する領域内に位置する受入番号ＮＺ＿ＡＮＡＶ０１０００００４．１における８０１核酸配列内にある。本組成物の一実施形態では、少なくとも１つの標的核酸は、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉに特異的であり、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉゲノムのヌクレオチド２７７０００～２７７８００に対応する領域内に位置する受入番号ＮＺ＿ＡＮＡＶ０１０００００１．１における８０１核酸配列内にある。本組成物の一実施形態では、少なくとも１つの標的核酸は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ（以前のＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）に特異的であり、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ（以前のＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）ゲノムのヌクレオチド１１５８６００～１１５９４００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ０１４７４８．１における８０１核酸配列内にある。本組成物の一実施形態では、少なくとも１つの標的核酸は、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅに特異的であり、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅゲノムのヌクレオチド３２７４０００～３２７４８００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ００８８２３．１における８０１核酸配列内にある。本組成物の一実施形態では、少なくとも１つの標的核酸は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓに特異的であり、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓゲノムのヌクレオチド１７６９１００～１７６９９００に対応する領域内に位置する受入番号ＨＦ５５８５３０．１における８０１核酸配列内にある。本組成物の一実施形態では、少なくとも１つの標的核酸は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍに特異的であり、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍゲノムのヌクレオチド１７３００～１８１００に対応する領域内に位置する受入番号ＮＺ＿ＧＬ４７６１３１．１における８０１核酸配列内にある。本組成物の一実施形態では、少なくとも１つの標的核酸は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに特異的であり、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉゲノムのヌクレオチド４３３６０００～４３３６７００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ０１５８４３．２における７０１核酸配列内にある。本組成物の一実施形態では、少なくとも１つの標的核酸は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａに特異的であり、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａゲノムのヌクレオチド２８５１７００～２８５２６００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ０２０３５８．１における８０１核酸配列内にある。本組成物の一実施形態では、少なくとも１つの標的核酸は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに特異的であり、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅゲノムのヌクレオチド２０９０００～２０９０８００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ００７７２７．１における８０１核酸配列内にある。本組成物の一実施形態では、少なくとも１つの標的核酸は、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉに特異的であり、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉゲノムのヌクレオチド３７５８００～３７６６００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ００４３４５．１における８０１核酸配列内にある。本組成物の一実施形態では、少なくとも１つの標的核酸は、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓに特異的であり、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓゲノムのヌクレオチド５８０２００～５８１０００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ０１７０８２．１における８０１核酸配列内にある。一実施形態では、本組成物は、５’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼをさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、熱安定性である。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼである。一実施形態では、本組成物の検出プローブは、ＴａｑＭａｎプローブまたは５’ヌクレアーゼプローブである。

【0008】

本組成物の一実施形態では、少なくとも１つの標的核酸は、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓに特異的であり、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓゲノムのヌクレオチド１０２００～１０２８００に対応する領域内に位置する受入番号ＪＰＩＸ０１０００００６．１における８０１核酸配列内にある。本組成物の一実施形態では、少なくとも１つの標的核酸は、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｔｕａｒｔｉｉに特異的であり、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｔｕａｒｔｉｉゲノムのヌクレオチド４９３０００～４９３８００に対応する領域内に位置する受入番号ＮＺ＿ＤＳ６０７６６３．１における８０１核酸配列内にある。本組成物の一実施形態では、少なくとも１つの標的核酸は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに特異的であり、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａゲノムのヌクレオチド１８５７６００～１８５８４００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ００６８３１．１における８０１核酸配列内にある。本組成物の一実施形態では、少なくとも１つの標的核酸は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓに特異的であり、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓゲノムのヌクレオチド２００４００～２０１０００に対応する領域内に位置する受入番号ＡＰ００８９３４．１における６０１核酸配列内にある。本組成物の一実施形態では、少なくとも１つの標的核酸は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅに特異的であり、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅゲノムのヌクレオチド４１０００～４１６００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ０１０３１９．１における６０１核酸配列内にある。本組成物の一実施形態では、少なくとも１つの標的核酸は、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓに特異的であり、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓゲノムのヌクレオチド８００～１５００に対応する領域内に位置する受入番号ＡＹ８８４２０３．１における７０１核酸配列内にある。

【0009】

別の態様では、複数の異なる標的核酸配列を含む対照核酸分子を含み、該複数の標的核酸配列が、ＤＮＡプラスミドに挿入された表１における少なくとも５つの遺伝子に指向される、複数の増幅反応を評価するための核酸構築物が提供される。本核酸構築物の一実施形態では、該複数の標的核酸配列は、ＤＮＡプラスミド中の表１における遺伝子のうちの少なくとも１０個に指向される。本核酸構築物の一実施形態では、該複数の標的核酸配列は、ＤＮＡプラスミド中の表１における遺伝子のうちの少なくとも１５個に指向される。本核酸構築物の一実施形態では、該複数の標的核酸配列は、ＤＮＡプラスミド中の表１における遺伝子の各々に指向される。本核酸構築物の一実施形態では、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの標的核酸配列は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉゲノムのヌクレオチド２０２１００～２０２８００に対応する領域内に位置する受入番号ＮＺ＿ＧＧ７０４５７４．１における７０１核酸配列内にある。本核酸構築物の一実施形態では、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉの標的核酸配列は、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉゲノムのヌクレオチド１３７４００～１３８２００に対応する領域内に位置する受入番号ＮＺ＿ＡＮＡＶ０１０００００４．１における８０１核酸配列内にある。本核酸構築物の一実施形態では、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉの標的核酸配列は、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉゲノムのヌクレオチド２７７０００～２７７８００に対応する領域内に位置する受入番号ＮＺ＿ＡＮＡＶ０１０００００１．１における８０１核酸配列内にある。本核酸構築物の一実施形態では、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ（以前のＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）の標的核酸配列は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ（以前のＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）ゲノムのヌクレオチド１１５８６００～１１５９４００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ０１４７４８．１における８０１核酸配列内にある。本核酸構築物の一実施形態では、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅの標的核酸配列は、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅゲノムのヌクレオチド３２７４０００～３２７４８００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ００８８２３．１における８０１核酸配列内にある。本核酸構築物の一実施形態では、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓの標的核酸配列は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓゲノムのヌクレオチド１７６９１００～１７６９９００に対応する領域内に位置する受入番号ＨＦ５５８５３０．１における８０１核酸配列内にある。本核酸構築物の一実施形態では、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍの標的核酸配列は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍゲノムのヌクレオチド１７３００～１８１００に対応する領域内に位置する受入番号ＮＺ＿ＧＬ４７６１３１．１における８０１核酸配列内にある。本核酸構築物の一実施形態では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの標的核酸配列は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉゲノムのヌクレオチド４３３６０００～４３３６７００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ０１５８４３．２における７０１核酸配列内にある。本核酸構築物の一実施形態では、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａの標的核酸配列は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａゲノムのヌクレオチド２８５１７００～２８５２６００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ０２０３５８．１における８０１核酸配列内にある。本核酸構築物の一実施形態では、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの標的核酸配列は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅゲノムのヌクレオチド２０９０００～２０９０８００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ００７７２７．１における８０１核酸配列内にある。本核酸構築物の一実施形態では、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉの標的核酸配列は、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉゲノムのヌクレオチド３７５８００～３７６６００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ００４３４５．１における８０１核酸配列内にある。本核酸構築物の一実施形態では、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓの標的核酸配列は、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓゲノムのヌクレオチド５８０２００～５８１０００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ０１７０８２．１における８０１核酸配列内にある。本核酸構築物の一実施形態では、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓの標的核酸配列は、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓゲノムのヌクレオチド１０２００～１０２８００に対応する領域内に位置する受入番号ＪＰＩＸ０１０００００６．１における８０１核酸配列内にある。本核酸構築物の一実施形態では、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｔｕａｒｔｉｉの標的核酸配列は、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｔｕａｒｔｉｉゲノムのヌクレオチド４９３０００～４９３８００に対応する領域内に位置する受入番号ＮＺ＿ＤＳ６０７６６３．１における８０１核酸配列内にある。本核酸構築物の一実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの標的核酸配列は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａゲノムのヌクレオチド１８５７６００～１８５８４００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ００６８３１．１における８０１核酸配列内にある。本核酸構築物の一実施形態では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓの標的核酸配列は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓゲノムのヌクレオチド２００４００～２０１０００に対応する領域内に位置する受入番号ＡＰ００８９３４．１における６０１核酸配列内にある。本核酸構築物の一実施形態では、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅの標的核酸配列は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅゲノムのヌクレオチド４１０００～４１６００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ０１０３１９．１における６０１核酸配列内にある。本核酸構築物の一実施形態では、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの標的核酸配列は、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓゲノムのヌクレオチド８００～１５００に対応する領域内に位置する受入番号ＡＹ８８４２０３．１における７０１核酸配列内にある。

【0010】

別の態様では、核酸試料中の複数の核酸配列を増幅するための方法であって、複数の増幅反応を行うことであって、該増幅反応が各々、核酸試料の一部と、表１に記載の生物、ならびに対応するアンプリコンサイズ、領域、および受入番号に関連する標的核酸配列群からの異なる標的核酸配列に対応する増幅産物を産生するように各々構成された増幅プライマー対とを含む、行うことと、増幅反応から複数の異なる増幅産物を形成することと、該複数の異なる増幅産物のうちの少なくとも１つの存在または不在を決定することと、を含む、方法が提供される。一実施形態では、本方法は、複数の増幅反応を行うことを含み、増幅反応のうちの少なくとも１０個が核酸試料の一部と、表１に記載の生物、ならびに対応するアンプリコンサイズ、領域、および受入番号に関連する標的核酸配列群からの異なる標的核酸配列に対応する増幅産物を産生するように各々構成された増幅プライマー対とを含む。一実施形態では、本方法は、複数の増幅反応を行うことを含み、増幅反応のうちの少なくとも１５個が、核酸試料の一部と、表１に記載の生物、ならびに対応するアンプリコンサイズ、領域、および受入番号に関連する標的核酸配列群からの異なる標的核酸配列に対応する増幅産物を産生するように各々構成された増幅プライマー対とを含む。一実施形態では、本方法は、複数の増幅反応を行うことを含み、陰性対照を除く増幅反応の全てが、核酸試料の一部と、表１に記載の生物、ならびに対応するアンプリコンサイズ、領域、および受入番号に関連する標的核酸配列群からの異なる標的核酸配列に対応する増幅産物を産生するように各々構成された増幅プライマー対とを含む。

【0011】

別の態様では、核酸試料中の複数の核酸配列を増幅するための方法であって、（ａ）複数の増幅反応を行うことであって、該増幅反応のうちの少なくとも５つが、核酸試料の一部と、該標的核酸配列に対応する増幅産物を産生するように構成された増幅プライマー対とを含み、各標的核酸配列が、表１における遺伝子群から選択される異なる遺伝子の増幅産物である、行うことと、（ｂ）複数の異なる増幅産物を形成することと、（ｃ）該複数の異なる増幅産物のうちの少なくとも１つの存在または不在を決定することと、を含む、方法が提供される。本方法の一実施形態では、該増幅反応のうちの少なくとも５つが、表１に列記されるアッセイＩＤから選択される増幅プライマー対を含む。本方法の一実施形態では、該増幅反応のうちの少なくとも１０個が、表１に列記されるアッセイＩＤから選択される増幅プライマー対を含む。本方法の一実施形態では、該増幅反応のうちの少なくとも１５個が、表１に列記されるアッセイＩＤから選択される増幅プライマー対を含む。本方法の一実施形態では、該増幅反応の全てが、表１に列記されるアッセイＩＤから選択される増幅プライマー対を含む。本方法は、いくつかの実施形態では、複数の増幅反応を行うことを含み、該増幅反応のうちの少なくとも１０個が、核酸試料の一部と、前記標的核酸配列に対応する増幅産物を産生するように構成された増幅プライマー対とを含み、該標的核酸配列が、表１に列記される遺伝子の一部の増幅産物である。本方法は、いくつかの実施形態では、複数の増幅反応を行うことを含み、該増幅反応のうちの少なくとも１５個が、核酸試料の一部と、前記標的核酸配列に対応する増幅産物を産生するように構成された増幅プライマー対とを含み、各該標的核酸配列が、表１に記載の異なる遺伝子の増幅産物である。本方法は、いくつかの実施形態では、複数の増幅反応を行うことを含み、陰性対照を除く該増幅反応の全てが、核酸試料の一部と、前記標的核酸配列に対応する増幅産物を産生するように構成された増幅プライマー対とを含み、各該標的核酸配列が、表１に記載の異なる遺伝子の増幅産物である。本方法のいくつかの実施形態では、該増幅産物は、５６～１０５ヌクレオチド長である。本方法のいくつかの実施形態では、増幅産物を産生するように構成された該増幅プライマーの少なくとも１つの対は、該対応する標的核酸配列の一部に相補的なまたはそれと同一の核酸配列を含むプライマーを含む。本方法のいくつかの実施形態では、該増幅プライマーの少なくとも１つの対の該対応する標的核酸配列は、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、無細胞ＤＮＡ、循環ＤＮＡ、またはｃＤＮＡ中に存在する核酸配列と同一のまたはそれに相補的な核酸配列を含む。本方法のいくつかの実施形態では、該対応する標的核酸配列は、標的微生物のゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、無細胞ＤＮＡ、循環ＤＮＡ、またはｃＤＮＡ中に存在するか、またはそれに由来する。本方法のいくつかの実施形態では、該標的微生物は、表１に列記される微生物である。本方法のいくつかの実施形態では、該形成することは、１０～１０，０００個の異なる増幅産物を並行して形成することを含む。本方法のいくつかの実施形態では、該複数の増幅反応のうちの少なくとも２つは各々、異なる対応する標的核酸配列を増幅するように構成された増幅プライマー対を含む。本方法のいくつかの実施形態では、該対応する標的核酸配列は、表１に列記される遺伝子またはその対応するｃＤＮＡの核酸配列の一部を含む。本方法のいくつかの実施形態では、該遺伝子は、表１に列記される微生物中に存在する。本方法のいくつかの実施形態では、該複数の増幅反応は各々、５６～１０５ヌクレオチド長の増幅産物を産生するように構成された増幅プライマーセットを含む。本方法のいくつかの実施形態では、該形成することは、表１に列記される遺伝子の一部に相補的なまたはそれと同一の核酸配列を含む１つ以上の増幅産物を形成することを含む。本方法のいくつかの実施形態では、該形成することは、表１に列記される微生物に由来する核酸試料を使用して、表１に列記される全ての遺伝子ごとに別個の増幅産物を形成することを含む。本方法のいくつかの実施形態では、該形成することは、表１に列記される全ての微生物遺伝子ごとに別個の増幅産物を形成することを含む。

【0012】

核酸試料中の複数の核酸配列を増幅するための方法のいくつかの実施形態では、該形成することは、表１に列記される微生物遺伝子のうちの少なくとも２つの任意の組み合わせごとに別個の増幅産物を形成することを含む。本方法のいくつかの実施形態では、該複数の増幅反応のうちの１つ以上は、該対応する標的核酸配列の一部と同一のまたはそれに相補的な配列を含む検出可能な標識プローブをさらに含む。本方法のいくつかの実施形態では、少なくとも１つの増幅反応の該検出可能な標識プローブは、５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによる切断を受けるように構成されている。本方法のいくつかの実施形態では、少なくとも１つの増幅反応の該検出可能な標識プローブは、その５’末端に蛍光標識およびその３’末端にクエンチャーを含む。本方法のいくつかの実施形態では、該検出可能な標識プローブは、副溝結合剤（ＭＧＢ）部分をさらに含む。本方法のいくつかの実施形態では、該増幅反応のうちの少なくとも１つは、支持体内または支持体上に存在する個別の反応部位で生じ、該支持体は、１つ以上の個別の反応部位を含む。本方法のいくつかの実施形態では、該支持体は、マルチウェルプレート、マイクロ流体カード、および複数の貫通孔反応部位を含むプレートから選択される。本方法のいくつかの実施形態では、該個別の反応部位は、該増幅プライマーのうちの１つ以上を含み、該増幅することは、該核酸試料の一部を該個別の反応部位に分配することをさらに含む。本方法のいくつかの実施形態では、該個別の反応部位は、増幅プライマー対および核酸プローブを含有する溶液の乾燥堆積物を含み、該プライマーおよび該プローブはいずれも、表１に列記される遺伝子に由来する核酸配列を増幅するように構成されている。本方法のいくつかの実施形態では、該個別の反応部位は、該核酸試料の該一部が該反応部位に分配される前または分配された後のいずれかに該反応部位に分配されるポリメラーゼおよび／またはヌクレオチドをさらに含む。本方法のいくつかの実施形態では、該核酸試料は、尿検体から調製される。いくつかの実施形態では、本方法は、該複数の増幅反応を該行うことの前に該核酸試料を尿検体から調製することをさらに含む。

【0013】

別の態様では、試料中の微生物核酸の存在を検出するための方法であって、（ａ）核酸試料の一部を支持体内に位置する個別の反応チャンバに分配することと、（ｂ）並行増幅反応を行い、少なくとも５つの増幅産物を各々個別の反応チャンバ内で形成することであって、各増幅反応が、微生物のゲノム中に存在するか、またはそれに由来する標的核酸配列に対応する増幅産物を産生するように構成された増幅プライマー対を含み、該対応する標的核酸配列が、表１に列記される遺伝子またはその対応するｃＤＮＡの核酸配列の一部を含む、形成することと、（ｃ）該増幅産物が該個別の反応チャンバのうちの１つ以上内で形成されたかを決定することと、を含む、方法が提供される。本方法の一実施形態では、該増幅反応のうちの少なくとも５つが、表１に列記されるアッセイＩＤから選択される増幅プライマー対を含む。本方法の一実施形態では、該増幅反応のうちの少なくとも１０個が、表１に列記されるアッセイＩＤから選択される増幅プライマー対を含む。本方法の一実施形態では、該増幅反応のうちの少なくとも１５個が、表１に列記されるアッセイＩＤから選択される増幅プライマー対を含む。本方法の一実施形態では、該増幅反応の全てが、表１に列記されるアッセイＩＤから選択される増幅プライマー対を含む。本方法の一実施形態では、少なくとも１０個の増幅産物は、並行増幅反応中に形成される。本方法の一実施形態では、少なくとも１５個の増幅産物は、並行増幅反応中に形成される。本方法の一実施形態では、少なくとも１７個の増幅産物は、並行増幅反応中に形成される。本方法の一実施形態では、該増幅産物は、５６～１０５ヌクレオチド長である。本方法の一実施形態では、該決定することは、任意にリアルタイムで、検出可能な標識プローブの該増幅産物へのハイブリダイゼーションを検出することを含む。本方法の一実施形態では、前記標的核酸配列に対応する増幅産物を産生するように構成された該増幅プライマーの少なくとも１つの対は、該対応する標的核酸配列の一部に相補的なまたはそれと同一の核酸配列を含むプライマーを含む。本方法の一実施形態では、該増幅プライマーの少なくとも１つの対の該対応する標的核酸配列は、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、無細胞ＤＮＡ、循環ＤＮＡ、またはｃＤＮＡ中に存在する核酸配列と同一のまたはそれに相補的な核酸配列を含む。本方法の一実施形態では、該対応する標的核酸配列は、標的微生物のゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、無細胞ＤＮＡ、循環ＤＮＡ、またはｃＤＮＡ中に存在するか、またはそれに由来する。本方法の一実施形態では、該微生物は、表１に列記される微生物である。本方法の一実施形態では、該形成することは、１０～１０，０００個の異なる増幅産物を並行して形成することを含む。

【0014】

試料中の微生物核酸の存在を検出するための方法の一実施形態では、該増幅反応のうちの少なくとも２つは各々、異なる対応する標的核酸配列を増幅するように構成された増幅プライマー対を含む。本方法の一実施形態では、該遺伝子は、表１に列記される微生物中に存在する。本方法の一実施形態では、該増幅反応は各々、表１に列記される遺伝子の少なくとも一部を増幅するように構成された増幅プライマーを含む。本方法の一実施形態では、該形成することは、表１に列記される遺伝子の一部に相補的なまたはそれと同一の核酸配列を含む１つ以上の増幅産物を形成することを含む。本方法の一実施形態では、該複数の増幅反応は各々、５６～１０５ヌクレオチド長の増幅産物を産生するように構成された増幅プライマーセットを含む。本方法の一実施形態では、該形成することは、表１に列記される微生物に由来する核酸試料を使用して、表１に列記される全ての遺伝子ごとに別個の増幅産物を形成することを含む。本方法の一実施形態では、該形成することは、表１に列記される全ての微生物遺伝子ごとに別個の増幅産物を形成することを含む。本方法の一実施形態では、該形成することは、表１に列記される微生物遺伝子のうちの少なくとも２つの任意の組み合わせごとに別個の増幅産物を形成することを含む。本方法の一実施形態では、該複数の該増幅反応のうちの１つ以上は、対応する標的核酸配列の一部と同一のまたはそれに相補的な配列を含む検出可能な標識プローブをさらに含む。本方法の一実施形態では、少なくとも１つの増幅反応の該検出可能な標識プローブは、５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによる切断を受けるように構成されている。本方法の一実施形態では、少なくとも１つの増幅反応の該検出可能な標識プローブは、その５’末端に蛍光標識およびその３’末端にクエンチャーを含む。本方法の一実施形態では、該検出可能な標識プローブは、副溝結合剤（ＭＧＢ）部分をさらに含む。本方法の一実施形態では、該増幅反応のうちの少なくとも１つは、支持体内または支持体上に存在する個別の反応部位で生じ、該支持体は、１つ以上の個別の反応部位を含む。本方法の一実施形態では、該支持体は、マルチウェルプレート、マイクロ流体カード、および複数の貫通孔反応部位を含むプレートから選択される。本方法の一実施形態では、該個別の反応部位は、該増幅プライマーのうちの１つ以上を含み、該増幅することは、核酸試料の一部を該個別の反応部位に分配することをさらに含む。本方法の一実施形態では、該個別の反応チャンバは、増幅プライマー対および核酸プローブを含有する溶液の乾燥堆積物を含み、該プライマーおよび該プローブはいずれも、表１に列記される遺伝子に由来する核酸配列を増幅するように構成されている。本方法の一実施形態では、該個別の反応チャンバは、該核酸試料の該一部が該反応部位に分配される前または分配された後のいずれかに個別の反応チャンバに分配されるポリメラーゼおよび／またはヌクレオチドをさらに含む。本方法の一実施形態では、該核酸試料は、尿検体から調製される。一実施形態では、本方法は、該分配することの前に該核酸試料を尿検体から調製することをさらに含む。

【0015】

別の態様では、核酸増幅のための支持体であって、複数の反応部位を含む支持体であって、該複数の反応部位が該支持体内または該支持体の表面上に位置する、支持体を含み、該反応部位のうちの少なくとも５つが、（１）標的核酸配列に対応する増幅産物を産生するように構成された増幅プライマー対であって、該増幅産物が表１における微生物に対応する、増幅プライマー対と、（２）該増幅産物にハイブリダイズするように構成された検出可能な標識プローブと、を含み、少なくとも５つの該反応部位が各々、異なる増幅プライマー対を対応する検出可能な標識プローブとともに含む、支持体が提供される。一実施形態では、本支持体は、少なくとも１０個の該反応部位を含み、少なくとも１０個の該反応部位が各々、異なる増幅プライマー対を対応する検出可能な標識プローブとともに含む。一実施形態では、本支持体は、少なくとも１５個の該反応部位を含み、少なくとも１５個の該反応部位が各々、異なる増幅プライマー対を対応する検出可能な標識プローブとともに含む。一実施形態では、本支持体は、少なくとも１７個の該反応部位を含み、少なくとも１７個の該反応部位が各々、異なる増幅プライマー対を対応する検出可能な標識プローブとともに含む。本支持体の一実施形態では、該増幅産物は、５６～１０５ヌクレオチド長である。本支持体の一実施形態では、該反応部位は各々、表１から選択される遺伝子の少なくとも一部または表１に列記される遺伝子の核酸誘導体を増幅するように構成された増幅プライマー対およびプローブを含む。本支持体の一実施形態では、該反応部位は各々、表１に列記されるアッセイＩＤから選択される増幅プライマー対およびプローブを含む。本支持体の一実施形態では、少なくとも１つの反応部位の増幅プライマー対は、該対応する標的核酸配列の一部に相補的なまたはそれと同一の核酸配列を含むプライマーを含む。本支持体の一実施形態では、該対応する標的核酸配列は、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、無細胞ＤＮＡ、循環ＤＮＡ、またはｃＤＮＡ中に存在する核酸配列と同一のまたはそれに相補的な核酸配列を含む。本支持体の一実施形態では、該対応する標的核酸配列は、標的微生物に由来するゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、無細胞ＤＮＡ、循環ＤＮＡ、またはｃＤＮＡ中に存在するか、またはそれに由来する。本支持体の一実施形態では、該標的微生物は、表１から選択される。本支持体の一実施形態では、該反応部位のうちの２つ以上は、同じ核酸試料の一部を含む。本支持体の一実施形態では、該核酸試料は、尿検体に由来する。本支持体の一実施形態では、該反応部位のうちの少なくとも１つは、増幅産物を含む。本支持体の一実施形態では、反応部位の該増幅産物は、表１に列記される遺伝子の一部に相補的なまたはそれと同一の核酸配列を含む。本支持体の一実施形態では、該支持体は、異なる増幅産物を含む１０～１０，０００個の反応部位を含む。本支持体の一実施形態では、該支持体は、表１に列記される全ての遺伝子と同一のまたはそれに相補的な増幅産物を含む反応部位を含む。本支持体の一実施形態では、該反応部位のうちの少なくとも２つは各々、異なる対応する標的核酸配列を増幅するように構成された増幅プライマー対を含む。本支持体の一実施形態では、該対応する標的核酸配列は、表１に列記される遺伝子またはその対応するｃＤＮＡの核酸配列の一部を含む。本支持体の一実施形態では、該複数の反応部位は、表１に列記される微生物に由来する核酸試料を使用した表１に列記される全ての遺伝子の増幅産物を含む。本支持体の一実施形態では、該複数の反応部位は、表１に列記される少なくとも２つの微生物に由来する核酸試料を使用した表１に列記される遺伝子のうちの少なくとも２つの任意の組み合わせの増幅産物を含む。本支持体の一実施形態では、該反応部位のうちの少なくとも１つの該検出可能な標識プローブは、５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによる切断を受けるように構成されている。本支持体の一実施形態では、少なくとも１つの該反応部位の該検出可能な標識プローブは、その５’末端に蛍光標識およびその３’末端にクエンチャーを含む。本支持体の一実施形態では、該検出可能な標識プローブは、副溝結合剤（ＭＧＢ）部分をさらに含む。本支持体の一実施形態では、該支持体は、マルチウェルプレート、マイクロ流体カード、および複数の貫通孔反応部位を含むプレートから選択される。本支持体の一実施形態では、該個別の反応部位のうちの１つ以上は、該増幅プライマー対および該検出可能な標識プローブを含有する溶液の乾燥堆積物を含む。本支持体の一実施形態では、該個別の反応部位は、ポリメラーゼおよび／またはヌクレオチドをさらに含む。本支持体の一実施形態では、該個別の反応部位のうちの１つ以上は、該増幅プライマー対、該検出可能な標識プローブ、ポリメラーゼ、およびヌクレオチドを含む凍結乾燥組成物を含む。本支持体の一実施形態では、該増幅プライマー対および該検出可能な標識プローブは、表１に列記されるアッセイのうちの１つに由来する。

【0016】

さらに別の態様では、生物学的試料中の表１に列記される微生物のうちの１つ以上由来の少なくとも１つの標的核酸の存在または不在を決定するための組成物であって、（ａ）少なくとも１つの増幅プライマー対であって、該対の該プライマーが各々、該標的核酸の領域の全てまたは一部に特異的にハイブリダイズするように構成された標的ハイブリダイゼーション領域を含み、好適な条件下で該プライマー対が表１における遺伝子由来のアンプリコンを生成する、少なくとも１つの増幅プライマー対と、（ｂ）該プライマー対によって生成された該アンプリコンの領域の全てまたは一部に特異的にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つの検出プローブと、を含む、組成物が提供される。本組成物の一実施形態では、該アンプリコンは、５６～１０５ヌクレオチド長である。一実施形態では、本組成物は、表１に列記される少なくとも１つのアッセイを含む。一実施形態では、本組成物は、バイオマーカーのパネルを検出するためのヌクレオチドプローブセットを含み、該プローブは、遺伝子群のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ配列に相補的であり、該遺伝子群が表１に列記される遺伝子の任意の組み合わせから選択されることを特徴とする。本組成物の一実施形態では、該プローブセットは、１～１７個の異なるプローブからなる。本組成物の一実施形態では、該遺伝子群は、表１に列記される遺伝子から選択される５つの異なる遺伝子からなる。本組成物の一実施形態では、試料中の少なくとも５個の異なる標的核酸が増幅および検出され、該標的核酸は、表１に列記される５個の異なる微生物由来である。本組成物の一実施形態では、該５個の標的核酸は、表１に列記される該５つの異なる微生物の各々について列記されたアッセイを使用して増幅および検出される。本組成物の一実施形態では、該遺伝子群は、表１に列記される遺伝子から選択される１０個の異なる遺伝子からなる。本組成物の一実施形態では、試料中の少なくとも１０個の異なる標的核酸が増幅および検出され、該標的核酸は、表１に列記される１０個の異なる微生物由来である。本組成物の一実施形態では、該１０個の標的核酸は、表１に列記される該１０個の異なる微生物の各々について列記されたアッセイを使用して増幅および検出される。本組成物の一実施形態では、該遺伝子群は、表１に列記される遺伝子から選択される１５個の異なる遺伝子からなる。本組成物の一実施形態では、試料中の少なくとも１５個の異なる標的核酸が増幅および検出され、該標的核酸は、表１に列記される１５個の異なる微生物由来である。本組成物の一実施形態では、該１５個の標的核酸は、表１に列記される該１５個の異なる微生物の各々について列記されたアッセイを使用して増幅および検出される。本組成物の一実施形態では、該遺伝子群は、表１に列記される遺伝子から選択される１７個の異なる遺伝子からなる。本組成物の一実施形態では、試料中の少なくとも１７個の異なる標的核酸が増幅および検出され、該標的核酸は、表１に列記される１７個の異なる微生物由来である。本組成物の一実施形態では、該１７個の標的核酸は、表１に列記される該１７個の異なる微生物の各々について列記されたアッセイを使用して増幅および検出される。一実施形態では、本組成物は、５’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼをさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、熱安定性である。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼである。一実施形態では、本組成物の検出プローブは、ＴａｑＭａｎプローブまたは５’ヌクレアーゼプローブである。

【0017】

別の態様では、生物学的試料に関連するバイオマーカーのパネルをプロファイリングする方法であって、（ａ）対象から該生物学的試料を得ることと、（ｂ）該試料の少なくともいくらかの部分を少なくとも５つの個別の増幅反応と接触させることであって、該個別の反応が各々、標的特異的プライマーセットおよびポリメラーゼを含む、接触させることと、（ｃ）増幅産物を産生することができる増幅条件下で個別の反応あたり少なくとも１つの標的配列を増幅することと、（ｃ）該複数の個別の反応の各々を、該標的特異的プライマーによって産生された該増幅産物に特異的な検出可能な標識プローブと接触させることと、（ｄ）該複数の個別の増幅反応の各々における該増幅産物の存在または不在を決定して、該生物学的試料のバイオマーカープロファイルに達することであって、該バイオマーカーが表１に列記される遺伝子に関連する、達することと、を含む、方法が提供される。本方法の一実施形態では、少なくとも１０個の個別の増幅反応が、該試料の少なくともいくらかの部分によって接触される。本方法の一実施形態では、少なくとも１５個の個別の増幅反応が、該試料の少なくともいくらかの部分によって接触される。本方法の一実施形態では、少なくとも１７個の個別の増幅反応が、該試料の少なくともいくらかの部分によって接触される。本方法の一実施形態では、該バイオマーカーは、泌尿生殖器感染症および／または微生物叢に関連する。本方法の一実施形態では、該パネルは、１～１７個の異なるバイオマーカーセットを含む。本方法の一実施形態では、該複数の個別の増幅反応は、固体支持体上にある。本方法の一実施形態では、該複数の個別の増幅反応は各々、表１から選択される単一のアッセイを含む。別の態様では、対照核酸分子を含む試料中の複数の標的核酸配列を増幅するための方法であって、複数の増幅反応を並行して行うことであって、複数の増幅反応が各々、試料の一部と、対照核酸分子中の対応する標的配列を増幅するように構成された増幅プライマー対とを含み、対照核酸分子が複数の異なる標的配列を含む、行うことと、対照核酸分子中の少なくとも２つの異なる標的配列に対応する複数の異なる増幅産物を形成することと、増幅反応における少なくとも２つの異なる増幅産物の存在を決定することと、を含む、方法が提供される。本方法の一実施形態では、対照核酸分子は、表１に記載の異なる微生物由来の少なくとも５つの異なる標的配列を含む。本方法の一実施形態では、対照核酸分子は、表１に記載の異なる微生物由来の少なくとも１０個の異なる標的配列を含む。本方法の一実施形態では、対照核酸分子は、表１に記載の異なる微生物由来の少なくとも１５個の異なる標的配列を含む。本方法の一実施形態では、対照核酸分子は、表１に記載の異なる微生物由来の全ての異なる標的配列を含む。本方法の一実施形態では、複数の異なる標的配列は、表１に記載の異なる微生物のゲノム配列またはトランスクリプトーム配列に由来する。本方法の一実施形態では、複数の異なる標的配列は、表１から選択される任意の数の微生物遺伝子に由来する。本方法の一実施形態では、形成することは、５～１００個の異なる増幅産物を並行して形成することを含む。本方法の一実施形態では、形成することは、１０～５０個の異なる増幅産物を並行して形成することを含む。本方法の一実施形態では、対応する標的配列を増幅するように構成された少なくとも１つの増幅プライマー対は、対応する標的配列の一部に相補的なまたはそれと同一の核酸配列を含むプライマーを含む。本方法の一実施形態では、複数の増幅反応のうちの少なくとも２つは各々、異なる対応する標的配列を増幅するように構成された増幅プライマー対を含む。本方法の一実施形態では、複数の増幅反応のうちの１つ以上の増幅反応は、対応する標的配列の一部と同一のまたはそれに相補的な配列を含む検出可能な標識プローブをさらに含む。本方法の一実施形態では、少なくとも１つの増幅反応の検出可能な標識プローブは、５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによる切断を受けるように構成されている。本方法の一実施形態では、少なくとも１つの増幅反応の検出可能な標識プローブは、その５’末端に蛍光標識およびその３’末端にクエンチャーを含む。本方法の一実施形態では、対照核酸分子は、ＤＮＡプラスミドである。本方法の一実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、線状である。一実施形態では、本方法は、増幅反応を行うことの前に対照核酸分子を含む試料を細胞から調製することをさらに含む。

【0018】

さらに別の態様では、対照核酸分子を含む試料中の複数の標的核酸配列を増幅するための方法であって、試料を複数の反応体積に分配することであって、対照核酸分子が複数の異なる標的配列を含み、反応体積が、対照核酸分子中の対応する標的配列を増幅するように構成された少なくとも２つの異なる増幅プライマー対を含む、分配することと、反応体積中で増幅反応を行い、対照核酸分子中の少なくとも２つの異なる標的配列に対応する複数の異なる増幅産物を形成することと、増幅反応における少なくとも２つの異なる増幅産物の存在を決定することと、を含む、方法が提供される。

【0019】

さらに別の態様では、複数の増幅反応を評価するための方法であって、核酸試料の一部を支持体内または支持体上に位置する個別の反応チャンバに分配することであって、核酸試料が対照核酸分子を含み、対照核酸分子が複数の異なる標的配列を含む、分配することと、複数の並行増幅反応を行い、対照核酸分子中の少なくとも２つの異なる標的配列に対応する複数の異なる標的増幅産物を個別の反応チャンバ内で形成することであって、各増幅反応が、対照核酸分子中に存在する対応する標的配列を増幅するように構成された増幅プライマー対を含み、増幅反応のうちの少なくとも２つが、対照核酸分子中に存在する異なる対応する標的配列を増幅するように構成された増幅プライマーを含む、形成することと、個別の反応チャンバのうちの少なくとも２つ内で形成された少なくとも２つの異なる標的増幅産物を定量化することと、を含む、方法が提供される。一実施形態では、本方法は、対照核酸分子の連続希釈液である一組の試料を使用して行われる。一実施形態では、本方法は、連続希釈された対照核酸分子由来の定量化された標的増幅産物に基づいて、対照核酸分子の標的配列のうちの少なくとも１つの検出限界を決定することをさらに含む。一実施形態では、本方法は、連続希釈された対照核酸分子由来の定量化された標的増幅産物に基づいて、対照核酸分子の標的配列のうちの少なくとも１つのダイナミックレンジを決定することをさらに含む。本方法の一実施形態では、定量化することは、任意にリアルタイムで、検出可能な標識プローブの増幅産物へのハイブリダイゼーションを検出することを含む。本方法の一実施形態では、対照核酸分子は、表１に記載の微生物由来の少なくとも５つの異なる標的配列を含む。本方法の一実施形態では、対照核酸分子は、表１に記載の微生物由来の少なくとも１０個の異なる標的配列を含む。本方法の一実施形態では、対照核酸分子は、表１に記載の微生物由来の少なくとも１５個の異なる標的配列を含む。本方法の一実施形態では、対照核酸分子は、表１に記載の微生物由来のほぼ全ての異なる標的配列を含む。本方法の一実施形態では、複数の標的配列は、表１における異なる微生物のゲノム配列に由来する。本方法の一実施形態では、形成することは、５～１００個の異なる増幅産物を形成することを含む。本方法の一実施形態では、形成することは、１～１７個の異なる増幅産物を形成することを含む。本方法の一実施形態では、複数の増幅反応のうちの１つ以上の増幅反応は、対応する標的配列の一部と同一のまたはそれに相補的な配列を含む検出可能な標識プローブをさらに含む。本方法の一実施形態では、少なくとも１つの増幅反応の検出可能な標識プローブは、５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによる切断を受けるように構成されている。本方法の一実施形態では、少なくとも１つの増幅反応の検出可能な標識プローブは、その５’末端に蛍光標識およびその３’末端にクエンチャーを含む。本方法の一実施形態では、個別の反応チャンバは、試料の一部が反応チャンバに分配される前または分配された後のいずれかに個別の反応チャンバに分配されるポリメラーゼおよび／またはヌクレオチドをさらに含む。本方法の一実施形態では、対照核酸分子は、ＤＮＡプラスミドである。本方法の一実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、線状である。

【0020】

なお別の態様では、複数の異なる増幅標的配列を含む核酸構築物であって、増幅標的配列のうちの少なくとも２つが、表１から選択される遺伝子またはその対応するｃＤＮＡの少なくとも５６ヌクレオチド部分を含む、核酸構築物が提供される。別の態様では、複数の異なる増幅標的配列を含む核酸構築物であって、増幅標的配列のうちの少なくとも２つが、表１から選択される少なくとも２つの異なる微生物または微生物遺伝子に由来する、核酸構築物が提供される。

【0021】

別の態様では、核酸増幅のためのアレイであって、複数の反応部位を含む支持体であって、複数の反応部位が支持体内または支持体上に位置する、支持体を含み、複数の反応部位が各々、（ｉ）複数の異なる標的配列を含む対照核酸分子と、（ｉｉ）対応する標的配列を増幅するように構成された増幅プライマー対と、（ｉｉｉ）それらの対の増幅プライマーのうちの少なくとも１つの伸長によって生成された核酸配列にハイブリダイズするように構成された検出可能な標識プローブと、を含む、アレイが提供される。本アレイの一実施形態では、異なる標的配列のうちの少なくとも２つは、表１から選択される遺伝子またはその対応するｃＤＮＡの少なくとも５６ヌクレオチド部分を含む。本アレイの一実施形態では、対照核酸分子は、表１に記載の微生物由来の少なくとも５つの異なる標的配列を含む。本アレイの一実施形態では、対照核酸分子は、表１に記載の微生物由来の少なくとも１０個の異なる標的配列を含む。本アレイの一実施形態では、対照核酸分子は、表１に記載の微生物由来の少なくとも１５個の異なる標的配列を含む。本アレイの一実施形態では、対照核酸分子は、表１に記載の微生物由来の全ての異なる標的配列を含む。本アレイの一実施形態では、対照核酸分子は、プラスミドである。本アレイの一実施形態では、プラスミドは、線状である。本アレイの一実施形態では、反応部位のうちの少なくとも１つは、増幅産物を含む。本アレイの一実施形態では、支持体は、異なる増幅産物を含む１０～１０，０００個の反応部位を含む。本アレイの一実施形態では、反応部位のうちの少なくとも２つは各々、異なる対応する標的配列を増幅するように構成された増幅プライマー対を含む。本アレイの一実施形態では、少なくとも１つの反応部位の検出可能な標識プローブは、５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによる切断を受けるように構成されている。本アレイの一実施形態では、少なくとも１つの反応部位の検出可能な標識プローブは、その５’末端に蛍光標識およびその３’末端にクエンチャーを含む。本アレイの一実施形態では、検出可能な標識プローブは、副溝結合剤部分をさらに含む。本アレイの一実施形態では、支持体は、マルチウェルプレート、マイクロ流体カード、および複数の貫通孔反応部位を含むプレートから選択される。本アレイの一実施形態では、複数の反応部位は、ポリメラーゼおよび／またはヌクレオチドをさらに含む。

【0022】

さらに別の態様では、複数の標的核酸配列を増幅するための方法であって、対照核酸分子および試験核酸試料の両方を複数の反応体積に分配することであって、対照核酸分子が複数の異なる標的配列を含み、試験核酸試料が１つ以上の試験核酸分子を含む、分配することと、反応体積を核酸増幅条件に供し、対照核酸分子中の異なる標的配列を増幅するために各々使用される増幅プライマー対を使用して反応体積中の対照核酸分子の少なくとも２つの異なる標的配列を増幅することと、反応体積中の少なくとも２つの異なる増幅された標的配列の存在を検出することと、を含む、方法が提供される。本方法の一実施形態では、対照核酸分子は、環状である。本方法の一実施形態では、対照核酸分子は、線状である。一実施形態では、本方法は、対照核酸分子および試験核酸試料由来の試験核酸分子を異なる反応体積に分配することをさらに含む。本方法の一実施形態では、試験核酸試料は、異なる標的配列を各々含む２つ以上の異なる標的核酸分子も含む。一実施形態では、本方法は、標的核酸試料中の異なる標的配列を増幅するために各々使用される増幅プライマー対を使用して反応体積中の試験核酸試料の少なくとも２つの異なる標的配列を増幅することをさらに含む。

【0023】

別の態様では、生物学的試料中の尿路病原体の存在を検出するための方法であって、表１から選択される少なくとも１つのアッセイの使用を含む、方法が提供される。一実施形態では、本方法は、表１から選択される少なくとも１０、少なくとも１５、または好ましくは少なくとも１７個のアッセイの使用を含む。一実施形態では、尿路病原体の存在を検出するための方法は、本明細書に記載の複数の標的核酸配列を合成および／または増幅するための方法の使用を含む。いくつかの実施形態では、合成および／または増幅するための方法は、ＰＣＲを含む。いくつかの実施形態では、ＰＣＲは、ｑＰＣＲである。いくつかの実施形態では、合成および／または増幅することは、ＴａｑＭａｎ ＯｐｅｎＡｒｒａｙ等の固体支持体上で行われる。いくつかの実施形態では、生物学的試料中の尿路病原体の存在を検出するためのｑＰＣＲ法は、従来の培養に基づく方法を使用して得られた結果よりも少なくとも２倍正確であり、かつ／またはそれよりも少なくとも２倍感度の高い結果を提供する。いくつかの実施形態では、生物学的試料中の尿路病原体の存在を検出するためのｑＰＣＲ法は、従来の培養に基づく方法を使用して得られた結果よりも少なくとも３倍正確であり、かつ／またはそれよりも少なくとも３倍感度の高い結果を提供する。いくつかの実施形態では、検出するための方法の精度および／または感度は、サンガーシーケンシング法を使用して検証される。
任意の特定の要素または行為の考察を容易に特定するために、参照番号の最上位桁（複数可）は、その要素が最初に紹介された図の番号を指す。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】一実施形態による複数の核酸配列を増幅するためのワークフロー１００を説明する。

【図2】一実施形態による反応容器２００を説明する。

【図3】一実施形態による核酸試料中の複数の核酸配列を増幅するための方法３００を説明する。

【図4】示されるように、線状化した対照ＤＮＡプラスミド（すなわち、スーパープラスミド）試料を鋳型として様々な濃度で使用した１７のＵＴＭアッセイ（アッセイのリストについては表１を参照のこと）および２つの対照アッセイ（ＲＮａｓｅＰおよび異種）のパネルの連続希釈液データを示す。

【図5】原液、サブアレイ（５μＬ）または貫通孔（３３ｎＬ）あたりのＰＣＲ反応との関連でのコピー／μＬを提示する代替方法を説明する。

【図6】線状化した対照ＤＮＡプラスミド（すなわち、スーパープラスミド）試料を鋳型として様々な濃度で使用した１７のＵＴＭアッセイ（アッセイのリストについては表１を参照のこと）および２つの対照アッセイ（ＲＮａｓｅＰおよび異種）のパネルについての連続希釈液アッセイのＲ二乗および勾配を要約する実験結果を示す。

【図7】線状化した対照ＤＮＡプラスミド（すなわち、スーパープラスミド）試料を鋳型として様々な濃度で使用した表１に列記される１７個の微生物の群から選択される９つの異なる標的のパネルに指向されたアッセイの検出限界およびダイナミックレンジのグラフ結果を示す。各グラフにおいて、Ｘ軸は、鋳型濃度のｌｏｇ₁₀を示し、Ｙ軸は、ＰＣＲのＣｔ値を示す。

【図8】ＡＴＣＣ ｇＤＮＡ包括性パネルに対する１７のＵＴＭアッセイ（アッセイのリストについては表１を参照のこと）の精度および特異度を評価した実験結果を説明する。

【図9】ＡＴＣＣ ｇＤＮＡ排他性パネルに対する１７のＵＴＭアッセイ（アッセイのリストについては表１を参照のこと）の精度および特異度を評価した実験結果を説明する。

【図10】１１５個の尿試料の収集物から、本明細書に記載のｑＰＣＲ ＵＴＭアッセイまたは培養に基づく方法を使用して所与の尿路病原体に対して陽性と特定された試料の数を説明する。

【図11】ｑＰＣＲ ＵＴＭアッセイ（アッセイのリストについては表１を参照のこと）を使用して１７個の尿試料の精度および特異度を評価した実験結果を説明する。尿検体を、本明細書に記載のｑＰＣＲ ＵＴＭアッセイまたは従来の培養法のいずれかを使用して分析した。ｑＰＣＲの陽性結果を平均Ｃｔ値（三連で行ったアッセイについて）として示し、濃い灰色の強調表示した四角形の両方で示している。培養の陽性結果を濃い灰色の強調表示した四角形で示している。

【図12】陰性のまたは決定的でない培養増殖を有する試料の陽性のＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）結果を確認するためにサンガーシーケンシングによる尿試料の直交試験を示す。

【図13A】本明細書に記載のｑＰＣＲ ＵＴＭアッセイによって試験した試料と従来の培養法によって分析した試料との間の一致数を説明する。

【図13B】本明細書に記載のｑＰＣＲ ＵＴＭアッセイによって試験した試料と従来の培養法によって分析した試料との間の一致数を説明する。

【発明を実施するための形態】

【0025】

本開示は、生物学的試料中の選択された組の微生物の増幅および特徴付けのための方法、組成物、およびキットに関する。例えば、本明細書に開示される実施形態は、泌尿生殖器、膀胱、および尿路マイクロバイオームの成分および動態を検出および／またはモニタリングするための方法、組成物、およびキットを提供する。

【0026】

本明細書に開示される方法、組成物、およびキットは、一連の細菌、真菌、原虫、およびウイルスを含む、尿フローラの健常な微生物および病原性の微生物の検出のために利用され得る。

【0027】

本明細書に提供される方法、組成物、およびキットは、細菌性および真菌性膀胱および尿路感染症（ＵＴＩ）に関連する病原体および微生物叢の検出に使用され得る。本方法および本組成物からの結果は、試験された試料が得られた個体に好適な治療レジメン（複数可）の決定に使用され得る。本明細書に提供される方法および組成物は、個体の治療中および治療後に微生物叢の組成および／または動態をモニタリングするためにさらに使用され得る。

【0028】

微生物核酸は、試料を複数の個別の増幅反応に供することによって試料中で検出され得、各反応が、標的微生物核酸の少なくとも一部に特異的であるように設計された増幅プライマー対、プライマーによって増幅された標的配列に特異的な検出可能な標識プローブを用いて行われる。いくつかの態様では、本明細書に開示される複数の個別の増幅反応は、増幅プライマーおよび検出器プローブが設計または構成される微生物の各々の個別の増幅産物を生成し得る。いくつかの実施形態では、試料の微生物プロファイルは、個別の増幅反応由来の標的増幅産物の存在または不在（＋または－）を決定することによって達せられる。いくつかの実施形態では、異なる標的増幅産物を各々含む複数の個別の増幅反応は、所与の試料の微生物プロファイルに達するように同時に分析される。

【0029】

検出アッセイは、微生物種特異的遺伝子標的の増幅および検出のためのオリゴヌクレオチドプライマーおよび検出可能な標識プローブを利用し得る。いくつかの検出アッセイは、微生物種特異的遺伝子標的の増幅および検出のためにＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイを利用し得る。

【0030】

追加の増幅反応およびアッセイが、参照および／または対照反応およびアッセイとして行われ得る。制限なく、これらの参照および／または対照反応およびアッセイを相対的定量化用途に使用して、生物学的試料もしくは核酸試料の妥当性を評価する、微生物存在を正規化する、および／または生物学的試料もしくは核酸試料中の増幅阻害物質の存在を検出することができる。かかる参照および／または対照アッセイの例示的な標的核酸としては、原核生物１６Ｓ ｒＲＮＡ、ヒトＲＮａｓｅ Ｐ遺伝子ＤＮＡ（ＲＮａｓｅＰ）、付加外因性核酸、および／または異種核酸（異種；ＸＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0031】

方法、組成物、およびキットは、いくつかの事例では、複数のシングルプレックス核酸増幅反応を同じアッセイ条件下でおよび／または実質的に同時に行う際に使用され得る。

【0032】

試料中の標的配列を増幅することは、試料の少なくともいくらかの部分を本明細書に開示される標的特異的プライマーおよび少なくとも１つのポリメラーゼと増幅条件下で接触させ、それにより、少なくとも１つの増幅された標的配列を生成することを含み得る。これは、試料の少なくともいくらかの部分を標的特異的プライマー対および少なくとも１つのポリメラーゼと増幅条件下で接触させ、それにより、少なくとも１つの増幅された標的配列を生成することを含み得る。

【0033】

いくつかの実施形態では、増幅プライマー対および検出可能な標識プローブを各々含む少なくとも５つの異なるアッセイを使用して、核酸試料中の核酸配列がアリコートされて、核酸配列を含む試料源由来のアリコートを各々含む少なくとも５つの異なる増幅反応混合物を形成し得る。いくつかの実施形態では、異なるアッセイは、表１に列記されるＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイＩＤの群から選択される。

【表1-1】

【表1-2】

【0034】

いくつかの態様では、各増幅反応混合物が反応容器に適用され、その後、増幅反応が反応容器上で行われ、続いて、増幅反応中に反応容器上の１つ以上の位置内の標的核酸配列に対応する増幅産物が検出される。本明細書に開示されるように、反応は、反応容器上の増幅反応混合物の位置を、増幅反応混合物で利用されるアッセイＩＤのうちの１つ以上と関連付けるように動作された増幅産物検出システムで利用され得る。様々な実施形態では、反応容器は、管、ウェルを有するプレート、カード、アレイ、オープンアレイ、またはチップマイクロアレイであり得る。いくつかの実施形態では、反応容器は、固体支持体（「支持体」）である。いくつかの実施形態では、反応容器または支持体は、１つの反応部位または複数の反応部位をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、反応部位は、該反応容器のうちのいずれか上または内に位置するチャンバ、ウェル、貫通孔、スポット、容器、または区画であり得るが、これらに限定されない。

【0035】

いくつかの態様では、本方法は、表１におけるアッセイ群から選択される複数の異なるアッセイを使用して、核酸配列を含む試料源由来のアリコートを各々含む複数の増幅反応混合物を形成することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、表１におけるアッセイ群（アッセイＩＤのリストを参照のこと）から選択される少なくとも５つの異なるアッセイを使用して、核酸配列を含む試料源由来のアリコートを各々含む少なくとも５つの増幅反応混合物を形成することを含む。他の実施形態では、本方法は、表１におけるアッセイ群から選択される少なくとも１０個の異なるアッセイを使用して、核酸配列を含む試料源由来のアリコートを各々含む少なくとも１０個の増幅反応混合物を形成すること、または表１におけるアッセイ群から選択される少なくとも１５個の異なるアッセイを使用して、核酸配列を含む試料源由来のアリコートを各々含む少なくとも１５個の増幅反応混合物を形成すること、または表１における全てのアッセイを使用して、核酸配列を含む試料源由来のアリコートを各々含む反応混合物を形成することを含む。

【0036】

いくつかの実施形態では、試料源は、典型的には尿検体であるが、必ずしもそうではない。いくつかの実施形態では、尿検体は、排尿、カテーテルの使用、または恥骨上膀胱穿刺によって収集される。

【0037】

本明細書に開示される反応で利用され得るアッセイについては、表１を参照されたい。例えば、いくつかの実施形態では、アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０８４＿ｓ１は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの遺伝子の注釈を付けられていない領域の核酸配列の一部を標的とするプライマー対を含み得る。他の実施形態では、アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０８８＿ｓ１は、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉのクピンスーパーファミリー遺伝子のシュウ酸デカルボキシラーゼ／古細菌ホスホグルコースイソメラーゼであるＣＯＧ２１４０の核酸配列の一部を標的とするプライマー対を含み得る。他の実施形態では、アッセイＩＤ Ｂａ０７２８６６１７＿ｓ１および／またはＢａ０７２８６６１６＿ｓ１は、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉの鉄錯体輸送系基質結合タンパク質の核酸配列の一部を標的とするプライマー対を含み得る。他の実施形態では、アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０８０＿ｓ１は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ（以前のＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）のピリドキサールリン酸依存性ヒスチジンデカルボキシラーゼ（ｈｄｃ）遺伝子の核酸配列の一部を標的とするプライマー対を含み得る。他の実施形態では、アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０８７＿ｓ１は、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅの遺伝子の仮説的タンパク質の核酸配列の一部を標的とするプライマー対を含み得る。他の実施形態では、アッセイＩＤ Ｂａ０４６４６２４７＿ｓ１は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓのアミノトランスフェラーゼクラスＶ遺伝子の核酸配列の一部を標的とするプライマー対を含み得る。他の実施形態では、アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０８６＿ｓ１は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍのＰｈｎＢ－ＭｅｒＲファミリー転写調節因子遺伝子の核酸配列の一部を標的とするプライマー対を含み得る。他の実施形態では、アッセイＩＤ Ｂａ０４６４６２４２＿ｓ１は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＤＮＡ結合転写調節因子ＭｅｒＲファミリー（Ｚｎｔｒ）遺伝子であるＣＯＧ０７８９の核酸配列の一部を標的とするプライマー対を含み得る。他の実施形態では、アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０７９＿ｓ１は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａのｐａｒＣ（ＤＮＡトポイソメラーゼＩＶサブユニットＡ）遺伝子の核酸配列の一部を標的とするプライマー対を含み得る。他の実施形態では、アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０８３＿ｓ１は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのａｃｔ様タンパク質遺伝子の核酸配列の一部を標的とするプライマー対を含み得る。他の実施形態では、アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０７８＿ｓ１は、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉのＦｅ２＋輸送系タンパク質ＦｅｏＡ遺伝子であるＣＯＧ１９１８の核酸配列の一部を標的とするプライマー対を含み得る。他の実施形態では、アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０７６＿ｓ１は、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓのｕｒｅＲ遺伝子であるａｒａＣの核酸配列の一部を標的とするプライマー対を含み得る。他の実施形態では、アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０７７＿ｓ１は、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓのＳＵＭＦ１遺伝子の核酸配列の一部を標的とするプライマー対を含み得る。他の実施形態では、アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０８２＿ｓ１は、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｔｕａｒｔｉｉの推定鉄硫黄修飾タンパク質遺伝子であるラジカルＳＡＭスーパーファミリーのスルファターゼ成熟酵素ＡｓｌＢであるＣＯＧ０６４１の核酸配列の一部を標的とするプライマー対を含み得る。他の実施形態では、アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０８１＿ｓ１は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのヘリックスターンヘリックスドメインタンパク質遺伝子であるＮ２９６＿１７６０の核酸配列の一部を標的とするプライマー対を含み得る。他の実施形態では、アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０８５＿ｓ１は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓのｃｄａＲ遺伝子の核酸配列の一部を標的とするプライマー対を含み得る。他の実施形態では、アッセイＩＤ Ｂａ０４６４６２７６＿ｓ１は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅのＳＩＰ遺伝子の核酸配列の一部を標的とするプライマー対を含み得る。他の実施形態では、アッセイＩＤ Ｆｎ０４６４６２３３＿ｓ１は、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓのＩＰＴ１遺伝子の核酸配列の一部を標的とするプライマー対を含み得る。

【0038】

いくつかの実施形態では、表１に列記されるアッセイ等の種特異的アッセイを使用して核酸試料の増幅によって生成された標的アンプリコンは、２０～２００ヌクレオチド長、３０～１５０ヌクレオチド長、４０～１２０ヌクレオチド長、または５０～１１０ヌクレオチド長、例えば、５６～１０５ヌクレオチド長のアンプリコンを有し得る。

【0039】

核酸試料中の核酸配列を増幅することは、いくつかの実施形態では、核酸配列を含む試料源由来のアリコートを各々含む増幅反応混合物を形成することであって、試料源が尿検体である、形成することと、増幅反応混合物を反応容器に適用することであって、反応容器が、表１に列記される対応する標的領域内に位置する異なる遺伝子を各々標的とする少なくとも５つのアッセイで構成されている適用することとを含み得る。各アッセイは、増幅プライマー対を含み、増幅反応を反応容器上で行い、増幅反応中に反応容器上の位置内の標的核酸配列に対応する増幅産物についての検出が行われる。いくつかの実施形態では、増幅産物検出システムは、反応容器上または反応容器内の増幅反応混合物の位置を、反応容器上で利用されるアッセイのうちの１つ以上と関連付ける。様々な実施形態では、反応容器は、ウェルを有するプレート、アレイ、複数の貫通孔を有するＯｐｅｎＡｒｒａｙ、またはチップマイクロアレイである。

【0040】

様々な実施形態では、反応容器は、いくつかの事例では、表１に列記される異なる遺伝子を各々標的とする少なくとも５つのアッセイで構成され得る。いくつかの実施形態では、反応容器は、いくつかの事例では、表１に列記される異なる遺伝子を各々標的とする少なくとも１０個のアッセイ、または表１に列記される異なる遺伝子を各々標的とする少なくとも１５個のアッセイ、または表１に列記される遺伝子のうちの１つを各々標的とする１７個のアッセイで構成され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイは、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉにおける注釈を付けられていない領域に対応する遺伝子の９３ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅し得る。いくつかの実施形態では、少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイは、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉのクピンスーパーファミリーのシュウ酸デカルボキシラーゼ／古細菌ホスホグルコースイソメラーゼであるＣＯＧ２１４０に対応する遺伝子の１０３ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅し得る。いくつかの実施形態では、少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイは、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉの鉄錯体輸送系基質結合タンパク質におけるクピンスーパーファミリーのシュウ酸デカルボキシラーゼ／古細菌ホスホグルコースイソメラーゼであるＣＯＧ２１４０に対応する遺伝子の６２および／または１１０ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅し得る。いくつかの実施形態では、少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイは、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ（以前のＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）におけるピリドキサールリン酸依存性ヒスチジンデカルボキシラーゼ（ｈｄｃ）に対応する遺伝子の９８ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅し得る。いくつかの実施形態では、少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイは、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅにおける仮説的タンパク質に対応する遺伝子の８８ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅し得る。いくつかの実施形態では、少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓにおけるアミノトランスフェラーゼクラスＶに対応する遺伝子の９５ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅し得る。いくつかの実施形態では、少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍにおけるＰｈｎＢ－ＭｅｒＲファミリー転写調節因子に対応する遺伝子の９８ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅し得る。いくつかの実施形態では、少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおけるＤＮＡ結合転写調節因子ＭｅｒＲファミリー（Ｚｎｔｒ）であるＣＯＧ０７８９に対応する遺伝子の６３ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅し得る。いくつかの実施形態では、少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイは、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａにおけるｐａｒＣ（ＤＮＡトポイソメラーゼＩＶサブユニットＡ）に対応する遺伝子の９３ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅し得る。いくつかの実施形態では、少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイは、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅにおけるａｃｔ様タンパク質に対応する遺伝子の５６ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅し得る。いくつかの実施形態では、少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイは、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉにおけるＦｅ２＋輸送系タンパク質ＦｅｏＡであるＣＯＧ１９１８に対応する遺伝子の９１ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅し得る。いくつかの実施形態では、少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイは、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓにおけるｕｒｅＲであるａｒａＣに対応する遺伝子の１００ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅し得る。いくつかの実施形態では、少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイは、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓにおけるＳＵＭＦ１に対応する遺伝子の７６ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅し得る。いくつかの実施形態では、少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイは、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｔｕａｒｔｉｉにおける推定鉄硫黄修飾タンパク質であるラジカルＳＡＭスーパーファミリーのスルファターゼ成熟酵素ＡｓｌＢであるＣＯＧ０６４１に対応する遺伝子の１００ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅し得る。いくつかの実施形態では、少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａにおけるヘリックスターンヘリックスドメインタンパク質であるＮ２９６＿１７６０に対応する遺伝子の７０ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅し得る。いくつかの実施形態では、少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓにおけるｃｄａＲに対応する遺伝子の８５ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅し得る。いくつかの実施形態では、少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅにおけるＳＩＰに対応する遺伝子の６６ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅し得る。いくつかの実施形態では、少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイは、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓにおけるＩＰＴ１に対応する遺伝子の１０５ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅し得る。いくつかの実施形態では、少なくとも５個、少なくとも１０個、または少なくとも１５個のアッセイのうちの少なくとも１つのアッセイは、表１における太字テキストで強調表示された３つのアッセイＩＤのうちのいずれかから選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも５個、少なくとも１０個、または少なくとも１５個のアッセイのうちの少なくとも１つのアッセイは、表１における太字テキストで強調表示された３つの微生物種のうちのいずれかに特異的である。いくつかの実施形態では、少なくとも５個、少なくとも１０個、または少なくとも１５個のアッセイのうちの少なくとも１つのアッセイは、表１における太字テキストで強調表示された３つのアッセイＩＤのうちのいずれかから選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも５個、少なくとも１０個、または少なくとも１５個のアッセイのうちの少なくとも１つのアッセイは、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ（ＥｎＣ）、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ（ＰＶ）、および／またはＰｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｔｕａｒｔｉｉ（ＰＳ）について表１に列記される３つのアッセイＩＤのうちのいずれかから選択される。

【0041】

これらの方法に従って、生物学的試料中の少なくとも１つの標的核酸の存在または不在を決定するための組成物は、少なくとも５つの異なる増幅プライマー対を含み、その対のそのプライマーが各々、表１における標的微生物の核酸配列の領域の全てまたは一部に特異的にハイブリダイズするように構成された標的ハイブリダイゼーション領域を含み、好適な条件下でプライマー対がアンプリコンを生成し、少なくとも５つの検出プローブがプライマー対によって生成されたアンプリコンの領域の全てまたは一部に特異的にハイブリダイズするように構成されている。いくつかの実施形態では、本組成物は、異なる標的核酸配列を含む対照核酸分子を含み、これらの標的核酸配列は、表１における遺伝子のうちの少なくとも５つに特異的である。いくつかの実施形態では、対照核酸分子は、表１に列記される異なる遺伝子（例えば、表１に列記される少なくとも５個、少なくとも１０個、または少なくとも１５個の異なる遺伝子、または表１に列記される全ての遺伝子）に特異的な複数の標的核酸配列を含むＤＮＡプラスミドである。いくつかの実施形態では、本組成物は、アッセイのパネルまたはコレクション、例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイのパネルまたはコレクションである。いくつかの実施形態では、本組成物は、アッセイのパネルまたはコレクション、例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイのパネルまたはコレクションである。表１に列記されるＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイ（特異的アッセイＩＤを有する）のうちの少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、または全てを含む。いくつかの実施形態では、アッセイのパネルまたはコレクションは、複数のＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイを含む。いくつかの実施形態では、アッセイのパネルまたはコレクションは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手または提供された複数のＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイを含む。

【0042】

少なくとも１つの標的核酸は、尿路感染症に関連する微生物のバイオマーカーであり得、かつ／または本組成物は、固体支持体であり得る。少なくとも５つの増幅プライマー対は、固体支持体上の位置によって分離されている。他の実施形態では、本組成物は、少なくとも１０個、少なくとも１５個、または１７個の異なる増幅プライマー対を含み、この対のこのプライマーが各々、表１における遺伝子の核酸配列の領域の全てまたは一部標的に特異的にハイブリダイズするように構成された標的ハイブリダイゼーション領域を含み、好適な条件下でプライマー対がアンプリコンを生成する。いくつかの実施形態では、表１における標的遺伝子の核酸配列の領域の全てまたは一部に特異的にハイブリダイズするように構成されたプライマー対から生成された関連アンプリコンは、表１に列記される各対応するアッセイに対して指示されたサイズを有する。

【0043】

いくつかの態様では、本明細書に提供される方法は、標的核酸領域（「標的領域」）内の標的核酸配列（または相補的配列）にハイブリダイズするように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーまたはプライマーセットおよび／またはプローブを含むアッセイを利用する。いくつかの実施形態では、標的領域は、特定の受入番号に関連するより大きい配列内にある。いくつかの実施形態では、標的領域は、５００～１０００ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、標的領域は、表１に列記される標的領域のうちのいずれかから選択される。例えば、いくつかの実施形態では、選択された微生物種の標的核酸配列は、特定の受入番号に関連する配列内の標的領域内にあり得、該領域は、受入番号に関連する該配列内に特定可能な位置を有する。いくつかの実施形態では、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの標的核酸配列は、ゲノムのヌクレオチド２０２１００～２０２８００に対応する領域内に位置する受入番号ＮＺ＿ＧＧ７０４５７４．１における７０１核酸配列内にあり得る。いくつかの実施形態では、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉの標的核酸配列は、ゲノムのヌクレオチド１３７４００～１３８２００に対応する領域内に位置する受入番号ＮＺ＿ＡＮＡＶ０１０００００４．１における８０１核酸配列内にあり得る。いくつかの実施形態では、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉの標的核酸配列は、ゲノムのヌクレオチド２７７０００～２７７８００に対応する領域内に位置する受入番号ＮＺ＿ＡＮＡＶ０１０００００１．１における８０１核酸配列内にあり得る。いくつかの実施形態では、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ（以前のＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）の標的核酸配列は、ゲノムのヌクレオチド１１５８６００～１１５９４００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ０１４７４８．１における８０１核酸配列内にあり得る。いくつかの実施形態では、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅの標的核酸配列は、ゲノムのヌクレオチド３２７４０００～３２７４８００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ００８８２３．１における８０１核酸配列内にあり得る。いくつかの実施形態では、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓの標的核酸配列は、ゲノムのヌクレオチド１７６９１００～１７６９９００に対応する領域内に位置する受入番号ＨＦ５５８５３０．１における８０１核酸配列内にあり得る。いくつかの実施形態では、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍの標的核酸配列は、ゲノムのヌクレオチド１７３００～１８１００に対応する領域内に位置する受入番号ＮＺ＿ＧＬ４７６１３１．１における８０１核酸配列内にあり得る。いくつかの実施形態では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの標的核酸配列は、ゲノムのヌクレオチド４３３６０００～４３３６７００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ０１５８４３．２における７０１核酸配列内にあり得る。いくつかの実施形態では、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａの標的核酸配列は、ゲノムのヌクレオチド２８５１７００～２８５２６００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ０２０３５８．１における８０１核酸配列内にあり得る。いくつかの実施形態では、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの標的核酸配列は、ゲノムのヌクレオチド２０９０００～２０９０８００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ００７７２７．１における８０１核酸配列内にあり得る。いくつかの実施形態では、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉの標的核酸配列は、ゲノムのヌクレオチド３７５８００～３７６６００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ００４３４５．１における８０１核酸配列内にあり得る。Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓの標的核酸配列は、ゲノムのヌクレオチド５８０２００～５８１０００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ０１７０８２．１における８０１核酸配列内にあり得る。いくつかの実施形態では、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓの標的核酸配列は、ゲノムのヌクレオチド１０２００～１０２８００に対応する領域内に位置する受入番号ＪＰＩＸ０１０００００６．１における８０１核酸配列内にあり得る。いくつかの実施形態では、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｔｕａｒｔｉｉの標的核酸配列は、ゲノムのヌクレオチド４９３０００～４９３８００に対応する領域内に位置する受入番号ＮＺ＿ＤＳ６０７６６３．１における８０１核酸配列内にあり得る。いくつかの実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの標的核酸配列は、ゲノムのヌクレオチド１８５７６００～１８５８４００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ００６８３１．１における８０１核酸配列内にあり得る。いくつかの実施形態では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓの標的核酸配列は、ゲノムのヌクレオチド２００４００～２０１０００に対応する領域内に位置する受入番号ＡＰ００８９３４．１における６０１核酸配列内にあり得る。いくつかの実施形態では、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅの標的核酸配列は、ゲノムのヌクレオチド４１０００～４１６００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ０１０３１９．１における６０１核酸配列内にあり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの標的核酸配列は、ゲノムのヌクレオチド８００～１５００に対応する領域内に位置する受入番号ＡＹ８８４２０３．１における７０１核酸配列内にあり得る。

【0044】

したがって、いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドに挿入された表１における標的とされる遺伝子のうちの少なくとも５つに指向された異なる標的核酸配列を含む対照核酸分子を含む、増幅反応を評価するための核酸構築物が利用され得る。複数の標的核酸配列は、いくつかの事例では、ＤＮＡプラスミドに挿入された表１における遺伝子のうちの少なくとも１０個、またはＤＮＡプラスミドに挿入された表１における遺伝子のうちの少なくとも１５個、またはＤＮＡプラスミドに挿入された表１における遺伝子の各々に指向され得る。いくつかの実施形態では、複数の標的核酸配列を含むＤＮＡプラスミドは、増幅の陽性対照核酸として使用され得る。

【0045】

いくつかの実施形態では、複数の標的核酸配列を含むＤＮＡプラスミド（「スーパープラスミド」）は、表１に列記されるアッセイから選択されるアッセイを使用して生成されたアンプリコンと同一のまたはそれに相補的な少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、または１７個の異なる標的核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、ゲノムのヌクレオチド２０２１００～２０２８００に対応する領域内に位置する受入番号ＮＺ＿ＧＧ７０４５７４．１における７０１核酸配列内にあるＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの標的核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、ゲノムのヌクレオチド１３７４００～１３８２００に対応する領域内に位置する受入番号ＮＺ＿ＡＮＡＶ０１０００００４．１における８０１核酸配列内にあるＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉの標的核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、ゲノムのヌクレオチド２７７０００～２７７８００に対応する領域内に位置する受入番号ＮＺ＿ＡＮＡＶ０１０００００１．１における８０１核酸配列内にあるＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉの標的核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、ゲノムのヌクレオチド１１５８６００～１１５９４００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ０１４７４８．１における８０１核酸配列内にあるＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ（以前のＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）の標的核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、ゲノムのヌクレオチド３２７４０００～３２７４８００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ００８８２３．１における８０１核酸配列内にあるＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅの標的核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、ゲノムのヌクレオチド１７６９１００～１７６９９００に対応する領域内に位置する受入番号ＨＦ５５８５３０．１における８０１核酸配列内にあるＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓの標的核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、ゲノムのヌクレオチド１７３００～１８１００に対応する領域内に位置する受入番号ＮＺ＿ＧＬ４７６１３１．１における８０１核酸配列内にあるＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍの標的核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、ゲノムのヌクレオチド４３３６０００～４３３６７００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ０１５８４３．２における７０１核酸配列内にあるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの標的核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、ゲノムのヌクレオチド２８５１７００～２８５２６００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ０２０３５８．１における８０１核酸配列内にあるＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａの標的核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、ゲノムのヌクレオチド２０９０００～２０９０８００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ００７７２７．１における８０１核酸配列内にあるＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの標的核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、ゲノムのヌクレオチド３７５８００～３７６６００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ００４３４５．１における８０１核酸配列内にあるＭｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉの標的核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、ゲノムのヌクレオチド５８０２００～５８１０００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ０１７０８２．１における８０１核酸配列内にあるＰｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓの標的核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、ゲノムのヌクレオチド１０２００～１０２８００に対応する領域内に位置する受入番号ＪＰＩＸ０１０００００６．１における８０１核酸配列内にあるＰｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓの標的核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、ゲノムのヌクレオチド４９３０００～４９３８００に対応する領域内に位置する受入番号ＮＺ＿ＤＳ６０７６６３．１における８０１核酸配列内にあるＰｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｔｕａｒｔｉｉの標的核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、ゲノムのヌクレオチド１８５７６００～１８５８４００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ００６８３１．１における８０１核酸配列内にあるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの標的核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、ゲノムのヌクレオチド２００４００～２０１０００に対応する領域内に位置する受入番号ＡＰ００８９３４．１における６０１核酸配列内にあるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓの標的核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、ゲノムのヌクレオチド４１０００～４１６００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ０１０３１９．１における６０１核酸配列内にあるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅの標的核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、ゲノムのヌクレオチド８００～１５００に対応する領域内に位置する受入番号ＡＹ８８４２０３．１における７０１核酸配列内にあるＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの標的核酸配列を含み得る。

【0046】

したがって、核酸試料中の核酸配列を増幅するための方法は、増幅反応を行うことであって、増幅反応が各々、核酸試料の一部と、表１に記載の微生物、ならびに対応するアンプリコンサイズ、領域、および受入番号を含む標的核酸配列群からの異なる標的核酸配列に対応する増幅産物を産生するように各々構成された増幅プライマー対とを含む、行うことと、増幅反応から異なる増幅産物を形成することと、異なる増幅産物のうちの少なくとも１つの存在または不在を決定することとを含み得る。開示される方法は、表１に記載の生物、ならびに対応するアンプリコンサイズ、領域、および受入番号の核酸配列を標的とする増幅反応のうちの少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、または全てを利用し得る。

【0047】

いくつかの実施形態では、核酸試料中の核酸配列を増幅するための方法は、（ａ）核酸試料の一部と、標的核酸配列に対応する増幅産物を産生するように構成された増幅プライマー対とを含む増幅反応を行うことであって、各標的核酸配列が表１に記載の異なる遺伝子増幅産物である、行うことと、（ｂ）異なる増幅産物を形成することと、（ｃ）異なる増幅産物のうちの少なくとも１つの存在または不在を決定することであって、増幅反応のうちの少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、または全てが、表１に列記されるアッセイＩＤから選択される増幅プライマー対を含む、決定することとを含む。

【0048】

いくつかの実施形態では、形成することは、５～１００個の異なる増幅産物を並行して形成すること、または１０～５０個の異なる増幅産物を並行して形成することを含み得る。

【0049】

いくつかの実施形態では、増幅産物またはアンプリコンは、約５０～１１０ヌクレオチド長、例えば、５６～１０５ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、増幅プライマー対は、対応する標的核酸配列の一部または全てに相補的なまたはそれと同一の核酸配列を含む増幅産物を産生し得る。いくつかの実施形態では、対応する標的核酸配列は、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、無細胞ＤＮＡ、循環ＤＮＡ、および／またはｃＤＮＡ中に存在する核酸配列と同一のまたはそれに相補的な核酸配列を含み得る。対応する標的核酸配列は、標的微生物のゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、無細胞ＤＮＡ、循環ＤＮＡ、またはｃＤＮＡ中に存在し得るか、またはそれに由来し得、標的微生物は、表１に列記される微生物である。いくつかの実施形態では、本方法は、１０～１０，０００個の異なる増幅産物を並行して産生し得る。増幅反応のうちの少なくとも２つは各々、異なる対応する標的核酸配列を増幅するように構成された増幅プライマー対を含み得る。対応する標的核酸配列は、表１に列記される遺伝子またはその対応するｃＤＮＡの核酸配列の一部を含み得る。遺伝子は、典型的には、表１に列記される微生物中に存在するであろう。いくつかの実施形態では、増幅反応は各々、約５０～１１０ヌクレオチド長の増幅産物を産生するように構成された増幅プライマーセットを含み得、かつ／または表１に列記される遺伝子の一部に相補的なまたはそれと同一の核酸配列を含む増幅産物のうちの１つ以上を形成し得る。いくつかの実施形態では、表１に列記される少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個の微生物、または各微生物に由来する核酸試料を使用して、表１に列記される遺伝子のうちの少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、または全てごとに別個の増幅産物が形成される。増幅反応のうちの１つ以上は、対応する標的核酸配列および／または増幅産物（例えば、アンプリコン）の一部と同一のまたはそれに相補的な配列を含む検出可能な標識プローブをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、検出可能な標識プローブは、５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによる切断を受けるように構成され得る。いくつかの実施形態では、検出可能な標識プローブは、その５’末端に蛍光標識およびその３’末端にクエンチャーを含み得る。さらに他の実施形態では、検出可能な標識プローブは、副溝結合剤（ＭＧＢ）部分をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、増幅反応のうちの少なくとも１つは、反応容器内または反応容器上に存在する個別の反応部位で生じ得、反応容器は、１つ以上の個別の反応部位を含む。

【0050】

いくつかの実施形態では、反応容器は、マルチウェルプレート、マイクロ流体カード、および貫通孔反応部位を含むプレートから選択され得る。個別の反応部位は、増幅プライマーのうちの１つ以上を含み得、増幅することは、核酸試料の一部を個別の反応部位分配することをさらに含み得る。個別の反応部位は、増幅プライマー対および核酸プローブを含む溶液の乾燥堆積物を含み得、プライマーおよびプローブはいずれも表１に列記される遺伝子に由来する核酸配列を増幅するように構成されている。個別の反応部位は、核酸試料の一部が反応部位に分配される前または分配された後のいずれかにポリメラーゼおよびヌクレオチドをさらに含み得る。核酸試料は、尿検体から調製され得る。

【0051】

したがって、試料中の微生物核酸の存在を検出するための方法は、（ａ）核酸試料の一部を反応容器または支持体内に位置する個別の反応部位またはチャンバに分配することと、（ｂ）並行増幅反応を行い、少なくとも５つの増幅産物を各々個別の反応部位またはチャンバ内で形成することであって、各増幅反応が、微生物のゲノム中に存在するか、またはそれに由来する標的核酸配列に対応する増幅産物を産生するように構成された増幅プライマー対を含み得、対応する標的核酸配列が、表１に列記される遺伝子またはその対応するｃＤＮＡの核酸配列の一部を含み得る、形成することと、（ｃ）増幅産物が個別の反応部位またはチャンバのうちの１つ以上内で形成されたかを決定することであって、増幅反応のうちの少なくとも５つが、表１に列記されるアッセイＩＤから選択される増幅プライマー対を含む、決定することとを含み得る。他の実施形態では、増幅反応のうちの少なくとも１０個、または１５個、または全てが、表１に列記されるアッセイＩＤから選択される増幅プライマー対を含む。

【0052】

検出可能な標識プローブの増幅産物へのハイブリダイゼーションは、任意にリアルタイムで検出され得る。増幅プライマーの少なくとも１つの対は、標的核酸配列に対応する増幅産物を産生するように構成され得、対応する標的核酸配列の一部に相補的なまたはそれと同一の核酸配列を含むプライマーを含む。増幅プライマーの少なくとも１つの対の対応する標的核酸配列は、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、無細胞ＤＮＡ、循環ＤＮＡ、および／またはｃＤＮＡ中に存在する核酸配列と同一のまたはそれに相補的な核酸配列を含み得る。対応する標的核酸配列は、標的微生物のゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、無細胞ＤＮＡ、循環ＤＮＡ、および／またはｃＤＮＡ中に存在し得るか、またはそれに由来し得る。様々な実施形態では、微生物は、表１に列記される微生物種である。

【0053】

これらの方法を行うために使用される個別の反応部位またはチャンバは、核酸試料の一部が反応部位に分配される前または分配された後のいずれかに反応部位に添加または分配されるポリメラーゼおよびヌクレオチドを含み得る。

【0054】

いくつかの実施形態では、核酸増幅のための反応容器または支持体は、容器もしくは支持体内または支持体の表面上に位置する反応部位を含み得る。いくつかの実施形態では、反応部位のうちの少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、または全てが、（１）標的核酸配列に対応する増幅産物を産生するための異なる増幅プライマー対を含み、この増幅産物は、表１における微生物に対応する。いくつかの他の実施形態では、反応部位のうちの少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、または全てが、（２）増幅産物にハイブリダイズするように構成された検出可能な標識プローブをさらに含む。したがって、いくつかの実施形態では、反応部位のうちの少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、または各々が、異なる増幅プライマー対を、増幅プライマー対によって生成された増幅産物またはアンプリコンに特異的な対応する検出可能な標識プローブとともに含み得る。

【0055】

いくつかの実施形態では、反応部位は各々、表１から選択される遺伝子の少なくとも一部または表１に列記される遺伝子の核酸誘導体を増幅するように構成された増幅プライマー対およびプローブを含み得る。いくつかの実施形態では、反応部位は各々、表１に列記されるアッセイＩＤから選択される増幅プライマー対およびプローブを含み得る。

【0056】

生物学的試料中の表１に列記される微生物のうちの１つ以上由来の少なくとも１つの標的核酸の存在または不在を決定するための組成物は、（ａ）少なくとも１つの増幅プライマー対であって、その対のそのプライマーが各々、標的核酸の領域の全てまたは一部に特異的にハイブリダイズするように構成された標的ハイブリダイゼーション領域を含み、好適な条件下でプライマー対が表１における遺伝子由来のアンプリコンを生成する、少なくとも１つの増幅プライマー対と、（ｂ）プライマー対によって生成されたアンプリコンの領域の全てまたは一部に特異的にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つの検出プローブとを含み得る。他の実施形態でも同様に、アンプリコンは、約５０～１１０ヌクレオチド長、例えば、５６～１０５ヌクレオチド長であり得、本組成物は、表１に列記される少なくとも１つのアッセイを含み得る。本組成物は、バイオマーカーのパネルを検出するためのヌクレオチドプローブセットを含み得、このプローブは、遺伝子群のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ配列に相補的であり、この遺伝子群が表１に列記される遺伝子の任意の組み合わせから選択されることを特徴とする。プローブセットは、１～１７個の異なるプローブからなり得る。遺伝子群は、表１に列記される遺伝子から選択される少なくとも５個の異なる遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、試料中の少なくとも５個の異なる標的核酸が増幅および検出され、標的核酸は、表１に列記される５個の異なる微生物由来である（他の実施形態は、表１における生物のうちの１０、１５、または１７個を標的とし得る）。いくつかの実施形態では、標的核酸は、表１に列記される５個の異なる微生物の各々について列記されたアッセイを使用して増幅および検出される。いくつかの実施形態では、標的核酸は、表１に列記されるアンプリコンサイズを有する対応するアンプリコンを生成するために増幅される。

【0057】

いくつかの実施形態では、生物学的試料は対象から得られ、生物学的試料の少なくともいくらかの部分が個別の増幅反応と接触し、個別の反応あたり少なくとも１つの標的配列が増幅産物を産生するために増幅される。いくつかの実施形態では、生物学的試料は、少なくとも５個、少なくとも１０個、または少なくとも１５個の個別の増幅反応と接触し、個別の反応あたり少なくとも１つの標的配列が、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個の増幅産物を産生するために増幅される。いくつかの他の実施形態では、個別の反応は各々、標的特異的プライマーによって産生された増幅産物に特異的な検出可能な標識プローブと接触し、個別の増幅反応の各々における増幅産物の存在または不在が決定される。いくつかの実施形態では、個別の増幅反応の各々における増幅産物の存在または不在は、生物学的試料のバイオマーカープロファイルに達するために使用され、これらのバイオマーカーは、表１に列記される遺伝子のうちのいずれかに関連する。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、表１に列記される遺伝子のうちの少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、または全てに関連する。

【0058】

バイオマーカーは、膀胱、尿路、および／または泌尿生殖器感染症および／または微生物叢に関連する。パネルは、１～１７個の異なるバイオマーカーセットを含み得る。個別の増幅反応は、固体支持体上に存在し得、個別の増幅反応が各々、表１から選択される単一の異なるアッセイを利用する。

【0059】

試料の一部と、対照核酸分子中の対応する標的配列を増幅するように構成された増幅プライマー対とを各々含む増幅反応は並行して行われ得、対照核酸分子は、異なる標的配列を含み得る。いくつかの実施形態では、対照核酸分子中の異なる標的配列に対応する異なる増幅産物が形成され、増幅反応における少なくとも２つの異なる増幅産物の存在が決定される。様々な実施形態では、対照核酸分子は、表１に記載の異なる微生物由来の異なる標的配列のうちの少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、または全てを含み得る。

【0060】

いくつかの実施形態では、異なる標的配列は、表１に記載の異なる微生物、より具体的には、表１に列記される選択される標的遺伝子のゲノム配列またはトランスクリプトーム配列に由来する。少なくとも１つの増幅プライマー対は、対応する標的配列を増幅するように構成され得、対応する標的配列の一部に相補的なまたはそれと同一の核酸配列を含むプライマーを含む。増幅反応のうちの少なくとも２つは各々、異なる対応する標的配列を増幅するように構成された増幅プライマー対を含み得る。

【0061】

増幅反応のうちの１つ以上は、対応する標的配列の一部と同一のまたはそれに相補的な配列を含む検出可能な標識プローブを含み得る。少なくとも１つの増幅反応の検出可能な標識プローブは、５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによる切断を受けるように構成され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの増幅反応の検出可能な標識プローブは、その５’末端に蛍光標識およびその３’末端にクエンチャーを含み得る。対照核酸分子は、ＤＮＡプラスミド（例えば、スーパープラスミド）であり得、いくつかの事例では、プラスミドまたはスーパープラスミドは、線状である。対照核酸分子を含む試料は、増幅反応を行うことの前に細胞から調製され得る。

【0062】

いくつかの実施形態では、対照核酸分子を含む試料中の標的核酸配列を増幅するための方法は、試料を反応体積に分配することを含み得、対照核酸分子は、異なる標的配列を含み得、反応体積は、対照核酸分子中の対応する標的配列を増幅するように構成された少なくとも２つの異なる増幅プライマー対を含む。いくつかの実施形態では、増幅反応は反応体積中で行われ、対照核酸分子中の少なくとも２つの異なる標的配列に対応する異なる増幅産物が形成される。その後、増幅反応における少なくとも２つの異なる増幅産物の存在が決定され得る。

【0063】

核酸試料の一部は、支持体内または支持体上に位置する個別の反応チャンバに分配され得、核酸試料は、対照核酸分子を含み得、対照核酸分子は、異なる標的配列を含み得る。いくつかの実施形態では、増幅反応は並行して行われ、対照核酸分子中の少なくとも２つの異なる標的配列に対応する異なる標的増幅産物が個別の反応チャンバ内で形成され、各増幅反応は、対照核酸分子中に存在する対応する標的配列を増幅するように構成された増幅プライマー対を含み、増幅プライマーを含む増幅反応のうちの少なくとも２つは、対照核酸分子中に存在する異なる対応する標的配列を増幅するように構成されている。個別の反応チャンバのうちの少なくとも２つ内で形成された少なくとも２つの異なる標的増幅産物が定量化され得る。本方法は、対照核酸分子の連続希釈液である一組の試料を使用して行われ得る。

【0064】

対照核酸分子の標的配列のうちの少なくとも１つの検出限界は、連続希釈された対照核酸分子由来の定量化された標的増幅産物に基づいて決定され得る。

【0065】

対照核酸分子の標的配列のうちの少なくとも１つのダイナミックレンジは、連続希釈された対照核酸分子由来の定量化された標的増幅産物に基づいて決定され得る。

【0066】

いくつかの実施形態では、定量化することは、任意にリアルタイムで、検出可能な標識プローブの増幅産物へのハイブリダイゼーションを検出することを含み得る。対照核酸分子は、表１に記載の微生物由来の異なる標的配列のうちの少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、または全てを含み得る。標的配列は、表１に列記される異なる微生物のゲノム配列に由来し得る。１～１７個の異なる増幅産物が形成され得る。複数の増幅反応のうちの１つ以上の増幅反応は、対応する標的配列の一部と同一のまたはそれに相補的な配列を含む検出可能な標識プローブをさらに含み得る。少なくとも１つの増幅反応の検出可能な標識プローブは、５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによる切断を受けるように構成され得る。少なくとも１つの増幅反応の検出可能な標識プローブは、その５’末端に蛍光標識およびその３’末端にクエンチャーを含み得る。個別の反応チャンバは、試料の一部が反応チャンバに分配される前または分配された後のいずれかに反応チャンバに添加されるポリメラーゼおよびヌクレオチドをさらに含み得る。対照核酸分子は、ＤＮＡプラスミド、例えば、本明細書に記載のスーパープラスミド等の線状プラスミドであり得る。

【0067】

核酸構築物は、増幅標的配列のうちの少なくとも２つが表１から選択される遺伝子またはその対応するｃＤＮＡの少なくとも５６ヌクレオチド部分を含む、異なる増幅標的配列を含み得る。

【0068】

核酸構築物は、増幅標的配列のうちの少なくとも２つが表１から選択される少なくとも２つの異なる微生物または微生物遺伝子に由来する、異なる増幅標的配列を含み得る。

【0069】

核酸増幅のための支持体は、アレイであり得る。いくつかの実施形態では、アレイは、アレイ内またはアレイ上に位置する反応部位を含み得る。いくつかの実施形態では、反応部位は各々、（ｉ）対応する標的配列を増幅するように構成された増幅プライマー対と、（ｉｉ）その対のその増幅プライマーのうちの少なくとも１つの伸長によって生成された核酸配列にハイブリダイズするように構成された検出可能な標識プローブとを含み得る。いくつかの他の実施形態では、反応部位のうちの少なくとも１つは、（ｉｉｉ）異なる標的配列を含む対照核酸分子をさらに含み得る。異なる標的配列のうちの少なくとも２つは、表１から選択される遺伝子またはその対応するｃＤＮＡの少なくとも５６ヌクレオチド部分を含み得る。対照核酸分子は、表１に記載の微生物由来の異なる標的配列のうちの少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、または全てを含み得る。対照核酸分子は、プラスミド、例えば、本明細書に記載のスーパープラスミド等の線状プラスミドであり得る。いくつかの実施形態では、反応部位のうちの少なくとも１つは、増幅産物を含む。

【0070】

支持体は、異なる増幅産物を含む１０～１０，０００個の反応部位を含み得る。いくつかの実施形態では、反応部位のうちの少なくとも２つは各々、異なる対応する標的配列を増幅するように構成された増幅プライマー対を含む。少なくとも１つの反応部位の検出可能な標識プローブは、５’ヌクレアーゼアッセイを使用したポリメラーゼによる切断を受けるように構成され得る。少なくとも１つの反応部位の検出可能な標識プローブは、その５’末端に蛍光標識およびその３’末端にクエンチャーを含み得る。検出可能な標識プローブは、副溝結合剤部分をさらに含み得る。支持体は、マルチウェルプレート、マイクロ流体カード、および貫通孔反応部位を含むプレートから選択され得る。反応部位は、ポリメラーゼおよび／またはヌクレオチドをさらに含み得る。

【0071】

標的核酸配列を増幅するための方法は、対照核酸分子および／または試験核酸試料を反応体積に分配することであって、対照核酸分子が異なる標的配列を含み、試験核酸試料が１つ以上の試験核酸分子を含む、分配することと、反応体積を核酸増幅条件に供し、対照核酸分子中の異なる標的配列を増幅するために各々使用される増幅プライマー対を使用して反応体積中の対照核酸分子の少なくとも２つの異なる標的配列を増幅することと、反応体積中の少なくとも２つの異なる増幅された標的配列の存在を検出することとを含み得る。対照核酸分子は、環状または線状であり得る。対照核酸分子および試験核酸試料は、異なる反応部位に分配され得る。試験核酸試料は、異なる標的配列を各々含む２つ以上の異なる標的核酸分子も含み得る。反応体積中の試験核酸試料の少なくとも２つの異なる標的配列は、標的核酸試料中の異なる標的配列を増幅するために各々使用される増幅プライマー対を使用して増幅され得る。

【0072】

いくつかの実施形態では、反応混合物は、少なくともいくつかの核酸試料の一部を表１の標的特異的プライマー対およびプローブセット（またはアッセイ）ならびに少なくとも１つのポリメラーゼと接触させることによって形成される。いくつかの実施形態では、反応混合物は、増幅条件下でインキュベートされ、それにより、少なくとも１つの増幅された標的配列を生成する。いくつかの追加の実施形態では、少なくとも１つの増幅された標的配列が検出され、核酸試料中の増幅された標的配列の存在が決定される。各標的特異的プライマーおよびプローブセットは、標的配列を特異的に増幅するように設計された順方向プライマーおよび逆方向プライマーと、順方向プライマーおよび逆方向プライマーによって増幅された核酸に特異的な検出可能な標識プローブとを含み得る。

【0073】

本明細書に開示される方法、組成物、およびキットは、単一試料調製時に表１に列記される微生物の存在を検出するために開発されたアッセイを使用して、生物学的試料中のある特定の組の標的微生物を検出、プロファイリング、およびモニタリングするために利用され得る。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）ＴａｑＭａｎ（商標）アッセイは、標的核酸を増幅および検出するために組み合わせで機能するように設計された増幅プライマー対と蛍光標識プローブとの組み合わせであり、開示される方法および組成物は、表１に列記されるＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）ＴａｑＭａｎ（商標）アッセイ（アッセイＩＤ）に提供されるプライマー対およびプローブを含み得る。

【0074】

各プライマー／プローブ組み合わせが表１における選択された微生物に特異的である増幅プライマー対および対応する検出可能な標識プローブのパネルが提供される。反応、抽出、および／または他の対照標的とは無関係の微生物パネルは、表１に列記される微生物に特異的なプライマー対を含み得る。

【0075】

表１に列記される特異的な標的遺伝子に対する増幅プライマー対のパネルが本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、反応、抽出、および／または他の対照標的とは無関係の遺伝子パネルは、表１に列記される遺伝子のうちの少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、または全てに特異的なプライマー対を含む。

【0076】

開示される方法は、各プライマー／プローブ組み合わせが表１に列記される微生物遺伝子標的に特異的である増幅プライマー対および対応する検出可能な標識プローブのパネルを利用し得る。いくつかの実施形態では、反応、抽出、および／または他の対照標的とは無関係の微生物遺伝子パネルは、微生物遺伝子のうちの表１に列記される少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、または全てに特異的なプライマー対を含む。

【0077】

生物学的試料中の微生物のタイプまたは存在は、生物学的試料から調製された核酸試料を分析することによって特定または決定され得る。ある源、例えば、対象または患者から得られるか、または収集されると、生物学的試料は、試料中に存在する核酸を抽出するための既知の方法に従って処理され得る。他の事例では、全核酸試料が、生物学的試料から調製され得る。いくつかの事例では、生物学的試料中の微生物を濃縮するステップは、核酸抽出前に行われ得る。いくつかの実施形態では、核酸試料は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の既知の方法に従って増幅される。いくつかの好ましい実施形態では、ＰＣＲは、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）である。

【0078】

定量的方法をＰＣＲに基づく技術（例えば、ｑＰＣＲ）に適用する際に、蛍光プローブまたは他の検出可能な標識が反応に組み込まれて、標的増幅の進行を決定するための手段を提供し得る。蛍光プローブの場合、この反応は、産生された核酸産物の量に対して相対的な割合で蛍光を発せさせ得る。したがって、ＰＣＲを使用して、微生物遺伝子に対応するヌクレオチド配列のアッセイは、標的配列であり、生物学的試料中の微生物の存在もしくは不在または生物学的試料の微生物プロファイルを決定するために使用され得る。

【0079】

増幅反応は、反応部位を有する支持体上で生じ得、各反応部位は、１つの増幅プライマー対を含み得る。増幅反応は、反応容器内で生じ得、各反応は、１つの増幅プライマー対を含み得る。反応容器は、少なくとも１つの標的特異的オリゴヌクレオチドプローブをさらに含み得、このプローブは、支持体中または支持体上の個別の反応部位中に存在する増幅プライマー対によって増幅された核酸部分に特異的である。反応部位は、支持体プレート内の貫通孔であり得、各貫通孔は、本明細書に記載の１つの増幅プライマー対および少なくとも１つの検出可能な標識プローブを含み得る。プライマーまたはプライマーおよびプローブは、反応容器の各反応部位内で乾燥させられ得る。反応部位は全て、いくつかの事例では、同じ支持体または反応容器上に存在し得る。

【0080】

支持体は、増幅試薬（例えば、プローブおよび／またはプライマー等のオリゴヌクレオチド）の固定化、結合、または配置のために表面を任意の利用可能な方法によって提供し、それにより、それらが自由に拡散するか、または互いに対して移動することが著しくまたは完全に防がれるようになり得る。試薬は、例えば、支持体と接触した状態で配置され、任意に、共有的もしくは非共有的に結合されるか、または部分的に／完全に包埋され得る。好適な支持体が市販されており、当業者には明らかであろう。固体支持体は、本明細書に記載の方法、組成物、およびキットに使用され得る。かかる固体支持体には、紙、ニトロセルロース、ミエリン、ガラス、シリカ、ナイロン、プラスチック、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、もしくはポリスチレン、または他の固体材料が含まれ得るが、これらに限定されない。加えて、支持体は、機械的強度、電気伝導性、または他の所望の物理的特性を提供するために、ガラスまたは金属等のさらなる固体表面上に重ねられ得る、アガロース、ポリアクリルアミド、多糖、またはタンパク質等の材料から構築されたゲルであり得る。支持体は、平らな表面（平面）、または表面結合オリゴヌクレオチドがほぼ同じ平面内に結合した少なくとも１つの構造を含み得る。固体支持体は、いくつかの事例では、非平面であり得、さらには不連続単位、例えば、マイクロビーズから形成され得る。

【0081】

本明細書で使用される場合、「表面」という用語は、所望のオリゴヌクレオチド（複数可）が結合または固定化される固体支持体上の任意の略二次元構造を意味する。

【0082】

増幅反応容器は、例えば、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、および／もしくはｄＵＴＰ）、１つ以上のポリメラーゼ、緩衝液（複数可）、１つ以上の塩（複数可）、１つ以上の洗剤（複数可）、１つ以上の増幅阻害物質遮断剤（複数可）、ならびに／または１つ以上の消泡剤（複数可）等の本明細書に開示される増幅反応混合物の他の成分試薬も含み得る。したがって、半固体または固体支持体には、増幅反応混合物またはマスターミックスとともに増幅プライマー対を含む反応部位または反応チャンバが提供され得る。反応容器または個別の反応部位内のプライマー対と反応混合物との組み合わせは、乾燥させられ得る。反応部位または反応容器内の反応混合物は凍結乾燥させられ得、いくつかの実施形態では、乾燥堆積物として反応部位または容器に適用され得る。半固体または固体支持体には、反応混合物を形成するために増幅マスターミックスとともに増幅プライマー対および検出可能な標識プローブを含む反応部位が提供され得る。反応部位または反応容器内の反応混合物は、乾燥させられる場合がある。反応部位または反応容器内の反応混合物は、凍結乾燥させられる場合もある。

【0083】

表１に列記される遺伝子のうちの少なくとも５個、少なくとも１０個、または少なくとも１５個に特異的なプライマーまたはプライマー対を含む反応部位を含む支持体が提供され得る。表１に列記される全ての遺伝子に特異的なプライマーまたはプライマー対を含む支持体が提供され得るか、または表１に列記される遺伝子のうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、もしくは１７個に特異的な異なるプライマーまたはプライマー対を各々含む反応部位を含む支持体が提供され得る。提供される支持体は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の内部および／または外部対照に特異的なプライマーまたはプライマー対を含む反応部位をさらに含み得る。

【0084】

本開示の主題をより明確かつ簡潔に説明および指摘するために、ある特定の定義が、以下の記述および添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語に提供され得る。本明細書を通じて、特定の用語の例証は、非限定的な例とみなされるべきである。

【0085】

本開示は、増幅対照として使用するための組成物およびこの組成物を核酸増幅プロセスで使用するための方法に言及し得る。提供されるそれらの使用のための対照組成物および方法は、その使用者に、核酸増幅ワークフローをモニタリング、評価、トラブルシューティング、および制御するための手段および方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される対照核酸分子は、少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、または少なくとも１７個の異なる標的配列を含む。

【0086】

提供される抽出および／または増幅対照核酸組成物は、核酸増幅および／または検出を伴うワークフローの陽性および／または陰性対照としての機能を果たし得る。本明細書に提供されるそれらの使用のための対照組成物および方法は、生物学的試料中の微生物に由来する選択された核酸、またはそれらのそれぞれのｃＤＮＡの増幅および特徴付けのための組成物および方法と併せて使用され得る。本明細書に提供されるそれらの使用のための対照組成物および方法は、選択された組織および解剖学的領域の微生物叢プロファイルを検出および／または評価するための、例えば、膀胱、尿路、および泌尿生殖器のマイクロバイオーム成分および動態を検出および／またはモニタリングするための組成物および方法と併せて使用され得る。したがって、生物学的試料中の標的核酸または微生物についての選択された組のアッセイの増幅反応と併せて使用される場合、使用される対照核酸分子は、増幅および／または検出アッセイが指向される同じ標的配列を含む。いくつかの実施形態では、対照核酸分子は、アッセイが指向される標的配列のサブセットを含み得る。対照核酸分子は、追加の参照または対照アッセイが指向される追加の標的配列を含み得る。対照核酸分子は、対照アッセイが指向される異種標的配列（いずれの生物にも相同性を示さない）を含み得る。いくつかの実施形態では、対照核酸分子は、本明細書でスーパープラスミドと称される複数の標的配列を含むプラスミド分子であり得る。いくつかの実施形態では、スーパープラスミド対照核酸分子は、線状化されている。

【0087】

いくつかの実施形態では、対照核酸分子試料中の標的配列を増幅するための方法であって、試料の少なくともいくらかの部分を標的特異的プライマーおよびポリメラーゼと増幅条件下で接触させ、それにより、少なくとも１つの増幅された標的配列を生成することを含む、方法が本明細書に提供される。本明細書に記載されるように、対照核酸分子は、異なる標的核酸配列を含み得る。本開示は、対照核酸分子試料中の標的配列を増幅するための方法であって、試料の少なくともいくらかの部分を本明細書に開示される標的特異的プライマーおよびポリメラーゼと増幅条件下で接触させ、それにより、少なくとも１つの増幅された標的配列を生成することを含み、標的特異的プライマーが各々非常に多数の別個の反応（例えば、シングルプレックス反応）で提供される、方法を提供する。本開示は、対照核酸分子試料中の標的配列を増幅するための方法であって、試料の少なくともいくらかの部分を本明細書に開示される標的特異的プライマーおよびポリメラーゼと増幅条件下で接触させ、それにより、少なくとも１つの増幅された標的配列を生成することを含み、標的特異的プライマーが単一の組み合わせ反応（例えば、マルチプレックス反応）で提供される、方法を提供する。本明細書に提供される方法は、試料の少なくともいくらかの部分を本明細書に開示される標的特異的プライマーおよびプローブセット（例えば、アッセイ）ならびにポリメラーゼと増幅条件下で接触させ、それにより、少なくとも１つの増幅された標的配列を生成することと、少なくとも１つの増幅された標的配列の存在を検出することとを含む。いくつかの実施形態では、各アッセイは、標的配列を特異的に増幅するように設計された順方向プライマーおよび逆方向プライマーと、順方向プライマーおよび逆方向プライマー（例えば、アンプリコン）によって増幅された核酸に特異的な検出可能な標識プローブとを含む。

【0088】

本明細書に提供される方法は、異なる標的配列を含む対照核酸分子を含む試料を複数の個別の増幅反応（すなわち、シングルプレックス反応）に供することを含み、各個別の反応が、対照核酸分子中の標的配列の少なくとも一部に特異的であるように設計された増幅プライマー対と、プライマーによって増幅された標的配列に特異的な検出可能な標識プローブとを用いて行われる。複数の個別の増幅反応は、増幅プライマーおよび検出器プローブが設計される標的配列の各々の別個の反応で個別の増幅産物を生成し得る。複数の増幅反応の評価は、個別の（シングルプレックス）増幅反応由来の標的増幅産物の存在もしくは不在を決定することによって、かつ／またはそれを定量化することによって達せされ得る。

【0089】

本明細書に提供される方法は、異なる標的配列を含む対照核酸分子を含む試料を、対照核酸試料中の標的配列に特異的であるように設計されたプライマー対の組み合わせを含む増幅反応（すなわち、マルチプレックス反応）に供することを含む。反応は、対照核酸分子中の少なくとも２つの異なる標的配列に特異的であるように設計された少なくとも２つの異なる増幅プライマー対と、異なるプライマーによって増幅された異なる標的配列の各々に特異的な検出可能な標識プローブとを用いて行われる。増幅反応は、増幅プライマーと検出器プローブとの組み合わせが設計される標的配列の各々の複数の増幅産物を生成し得る。複数の増幅反応の評価は、組み合わせ（マルチプレックス）増幅反応における標的増幅産物の存在もしくは不在を決定することによって、かつ／またはそれを定量化することによって達せられ得る。

【0090】

本明細書に提供される組成物および方法の検出アッセイは、対照核酸特異的標的配列の増幅および検出のためのオリゴヌクレオチドプライマーおよび検出可能な標識プローブの使用を伴い得る。標的特異的プライマーおよびプローブセットは、反応において単一の核酸標的に特異的な単一のプライマーセットおよびプローブセットを有するシングルプレックス反応の一部として提供され得る。あるいは、標的特異的プライマーおよびプローブセットは、同じ反応において複数の異なる核酸標的に特異的な複数のプライマーセットおよびプローブセットを有するマルチプレックス反応の一部として提供され得る。

【0091】

本明細書に提供される組成物および方法の検出アッセイは、対照核酸特異的標的配列の増幅および検出のためのオリゴヌクレオチドプライマーおよび検出可能な核酸結合部分の使用を伴う。標的特異的プライマーおよび検出可能な核酸結合部分は、シングルプレックス反応の一部として提供される。あるいは、標的特異的プライマーおよび検出可能な核酸結合部分は、マルチプレックス反応の一部として提供され得る。検出可能な核酸結合部分は、核酸結合色素であり得る。この色素は、二本鎖ＤＮＡ結合色素であり得る。いくつかの実施形態では、この色素は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎであり得る。

【0092】

本明細書に提供される組成物、方法、およびキットは、追加の参照または対照反応およびアッセイとして行われる追加の増幅反応およびアッセイを含む。制限なく、これらの追加の参照または対照反応およびアッセイを相対的定量化用途に使用して、生物学的試料または核酸試料の妥当性を評価する、微生物存在を正規化する、および／または生物学的または核酸試料中の増幅阻害物質の存在を検出することができる。かかる追加の参照または対照アッセイの例示的な標的核酸としては、原核生物１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列、ヒトＲＮａｓｅ Ｐ遺伝子配列、異種核酸（ＸＮＡ）配列、および／または付加外因性核酸が挙げられるが、これらに限定されない。

【0093】

本開示は、シングルプレックス核酸増幅反応を同じアッセイ条件下でおよび／または実質的に同時に行うための組成物、方法、およびキットに関する。本開示は、マルチプレックス核酸増幅反応を同じアッセイ条件下でおよび／または実質的に同時に行うための組成物、方法、およびキットにも関する。

【0094】

いくつかの実施形態では、本開示は、ある特定の標的微生物に由来するある特定の組の標的配列を含む対照核酸分子を検出し、それをモニタリングし、かつその抽出および／または増幅を評価するための組成物、方法、およびキットに関する。いくつかの実施形態では、対照核酸分子は、複数の標的配列を含むプラスミド（すなわち、複数標的プラスミドまたはスーパープラスミド）の一部である。例えば、本明細書に記載のいくつかの実施形態では、増幅対照核酸分子は、表１に列記される微生物および／または微生物遺伝子に由来する少なくとも２つの異なる標的配列を含むように開発される。

【0095】

Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイは、特定の標的核酸を増幅および検出するために組み合わせで機能するように設計された増幅プライマー対（順方向プライマーおよび逆方向プライマー）と蛍光標識プローブとの組み合わせである。本明細書に開示される組成物および方法は、微生物特異的および／または遺伝子特異的ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイを含み得る。本明細書に開示される組成物および方法は、膀胱、泌尿生殖器、および／または尿路微生物叢に指向された微生物特異的ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイを含み得る。本明細書に開示される組成物および方法は、表１に列記されるＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイで提供されるプライマー対およびプローブのうちの少なくとも１つを含む。本方法は、表１に列記されるＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイで提供される少なくとも２つの異なる組のプライマー対およびプローブを含み得る。本方法は、表１に列記されるＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイで提供される異なる組のプライマー対およびプローブの選択された群またはパネルを含み得る。本方法は、表１に列記されるＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイで提供される異なる組のプライマー対およびプローブの全てを含み得る。

【0096】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＴａｑＭアッセイの使用により、培養に基づく方法から収集されたデータと比較してより感度の高いより正確な尿路微生物叢を検出および特定するための方法が提供される。ＵＴＩ病原体を検出および特定するための従来のまたは日常的な（「ゴールドスタンダード」）アプローチは、尿培養を尿試料から調製することおよび微生物の増殖を２４時間モニタリングすることである。培養物が微生物の増殖を示すか否かは、尿試料が所与の尿路病原体に陽性（増殖あり）であるか陰性（増殖なし）であるかを決定するために使用される。これは、検尿のための「培養に基づく」方法と称される。

【0097】

尿培養結果は、典型的には、微生物増殖の量および純度に基づいてカテゴリー化される。細菌および／または真菌増殖を定義するための一般に使用されている基準は、尿１ミリリットルあたり１０⁵超のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の存在である。ＵＴＩ培養物は、典型的には、１０⁵ＣＦＵ／ｍＬ超の微生物濃度が存在する場合、特定の微生物に対して陽性であるとみなされ、この濃度未満は、陰性であるか、または「著しい増殖を有しない」ものとみなされるであろう。多くの場合、認識された閾値（１０⁵ＣＦＵ／ｍＬ超）未満で、特に１つより多くのタイプの生物が存在する場合、増殖した生物が汚染物質である可能性が高い。閾値を超えると、真の尿路感染症が発症している可能性がより高い。しかしながら、いくつかの事例では、尿１ミリリットルあたり１０⁵ＣＦＵ超の濃度での増殖が存在し得るが、ＵＴＭを正確に特定または区別するにはあまりにも多くの異なる微生物（「混合フローラ」）が存在する。これらの事例では、培養結果は、複数の（例えば、２つ以上の）生物の増殖も混入検体である可能性が高いため、決定的でないデータを有する「陰性」とも称される。したがって、「真の陰性」培養物は、増殖なしまたは低増殖（１０⁵ＣＦＵ／ｍＬ未満）を有するものであり、「真の陽性」培養物は、著しい増殖（すなわち、１０⁵ＣＦＵ／ｍＬ超）を有するものである一方で、１０⁵ＣＦＵ／ｍＬ超で混合フローラを有する「陰性」試料は、結果が決定的でないまたは特定不能であるものである。

【0098】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＴａｑＭアッセイの使用は、ＵＴＩ病原体の検出および／または特定について従来の培養に基づく方法から得られた結果と比較して少なくとも２倍感度が高いおよび／または正確である。いくつかの実施形態では、ＵＴＩ ＴａｑＭアッセイは、従来の培養法から得られた結果と比較して少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、または１０倍感度が高いおよび／または正確であり得る。いくつかの実施形態では、ＵＴＩ ＴａｑＭアッセイは、従来の培養法から得られた結果と比較して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９９％（およびこれらの間の全ての百分率数字を含む）感度が高いおよび／または正確であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＴａｑＭアッセイの使用は、同じ尿試料を試験した場合、従来の培養に基づく方法を使用して特定された微生物の数と比較して、尿試料中の少なくとも１、２、３、５、１０、１５、または１７個多くの微生物（表１に列記されるもの由来）の存在を特定し得る。

【0099】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＰＣＲ法は、陽性および／または陰性検尿結果（尿路病原体の存在を特定するため）を提供し得、この結果は、サンガーシーケンシング法によって得られた陽性および／または陰性検尿結果と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（およびこれらの間の全ての百分率数字を含む）一致する。

【0100】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＰＣＲ法は、陽性および／または陰性検尿結果（尿路病原体の存在を特定するため）を提供し得、この結果は、従来の培養に基づく方法によって得られた陽性および／または陰性検尿結果と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（およびこれらの間の全ての百分率数字を含む）一致する。

【0101】

異なる微生物の選択されたゲノム配列またはトランスクリプトーム配列に由来する標的配列を含む対照核酸分子が提供される。標的配列は、細菌、真菌、原虫、および／またはウイルス由来のゲノム配列またはトランスクリプトーム配列に由来し得る。対照核酸分子は、表１の異なる微生物の異なるゲノム配列またはトランスクリプトーム配列に由来する異なる標的配列、例えば、２～約１７個の異なる標的配列、または５～１７個の異なる標的配列、または１０～１７個、または１５～１７個の異なる標的配列を含み得る。いくつかの実施形態では、異なる微生物遺伝子に由来する少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、または少なくとも１７個の異なる標的配列を含む対照核酸分子が提供される。

【0102】

対照核酸分子中の異なる標的配列の長さが異なり得る。例えば、いくつかの実施形態では、対照核酸分子中の異なる標的配列は各々、約１５ヌクレオチド長～約１０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、対照核酸分子中の異なる標的配列は各々、約２０～約８００、約２５～約６００、約３０～約５００、約４０～約４００、約５０～約３００、約５６～１０５ヌクレオチド長である。

【0103】

対照核酸分子は、ゲノム配列もしくはトランスクリプトーム配列または異なる標的配列のいずれかの側または両側に隣接する配列の一部を含み得る。例えば、対照核酸分子は、対照核酸分子の異なる標的配列のうちの少なくとも２つの３’隣接配列の一部、５’隣接配列の一部、または３’隣接配列および５’隣接配列の両方の一部を含み得る。対照核酸分子は、対照核酸分子の異なるゲノムまたはトランスクリプトーム標的配列の各々に対応する３’隣接配列の一部、５’隣接配列の一部、または３’隣接配列および５’隣接配列の両方の一部を含み得る。標的配列の各々に隣接するゲノムまたはトランスクリプトーム領域（複数可）に対応する一方の隣接配列（３’または５’の場合）または両方の隣接配列（３’および５’の場合）は、５～５００ヌクレオチド長であり得る。標的配列の各々に隣接するゲノムまたはトランスクリプトーム領域（複数可）に対応する隣接配列（複数可）は、約１０～４００、約１５～２００、約２０～１００、または約２５～５０ヌクレオチド長であり得る。対照核酸分子は、異なる微生物の選択されたゲノム配列またはトランスクリプトーム配列に由来する標的配列、ならびにそれらの対応する３’、５’、または３’および５’ゲノムまたはトランスクリプトーム隣接配列であり得る。対照核酸分子は、異なる標的配列の一部のみに対応する隣接配列を含み得る。例えば、隣接配列は、異なる標的配列のうちの１、２、３、４、５、６、１０、１５、２０、２５、または３０個等のみの標的核酸分子中に含まれ得る。異なる標的配列とそれらの対応する３’隣接配列のみが対照核酸分子中に含まれ得、かつ／または異なる標的配列とそれらの対応する５’隣接配列のみが対照核酸分子中に含まれ得、かつ／または異なる標的配列とそれらの対応する３’隣接配列および５’隣接配列の両方が対照核酸分子中に含まれ得る。異なる標的配列と、各標的配列の対応する３’隣接配列、５’隣接配列、３’隣接配列および５’隣接配列、または隣接配列なしのいずれかの組み合わせが、対照核酸分子中に存在し得る。対照核酸分子は、いくつかの事例では、いずれの対応するゲノムまたはトランスクリプトーム隣接配列も含まない場合がある。

【0104】

異なる標的配列を含む対照核酸分子（隣接配列を含むか含まないかにかかわらず）の長さが異なり得る。全対照核酸分子の長さは、０．５ｋｂ～５０ｋｂ長であり得る。全対照核酸分子は、約１ｋｂ～２０ｋｂ、約２ｋｂ～１５ｋｂ、約３ｋｂ～１０ｋｂ長、または約４ｋｂ～５ｋｂ長であり得る。対照核酸分子の配列の一部または全てが、ベクター、プラスミド、またはウイルスを含むが、これらに限定されない核酸構築物に挿入されるか、またはその内部に含まれ得る。

【0105】

定量的方法をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく技術（例えば、ｑＰＣＲ）に適用する際に、蛍光プローブまたは他の検出可能な標識が反応に組み込まれて、標的増幅の進行を決定するための手段を提供し得る。蛍光プローブまたは核酸結合部分等の他の検出可能な標識の使用により、この反応は、産生された核酸産物の量に対して相対的な割合で蛍光を発せさせ得る。したがって、ＰＣＲを使用する際、対照標的配列に対応するヌクレオチド配列のアッセイは、対照核酸試料の増幅反応および／または抽出プロセスの有効性を決定するために使用され得る。蛍光プローブは、特定の核酸の検出のために配列特異的様式で使用され得る。検出可能な標識は、核酸の一般的な検出のために非配列特異的様式で使用され得る。

【0106】

増幅反応は、反応部位を有する支持体上で生じ、各反応部位は、１つの増幅プライマー対を含み得る。増幅反応は、反応容器内で生じ、各反応は、１つの増幅プライマー対を含み得る。反応容器は、少なくとも１つの標的特異的オリゴヌクレオチドプローブをさらに含み得、このプローブは、反応容器内に存在する増幅プライマー対によって増幅された核酸の一部に特異的である。上述のように、反応容器は、個別の反応部位を含み得る。いくつかの実施形態では、反応部位は、支持体プレート内の貫通孔であり得、各貫通孔は、本明細書に記載の１つの増幅プライマー対および少なくとも１つの検出可能な標識プローブを含み得る。プライマーおよびプローブは、対照核酸分子を含む対照核酸試料との接触前に各反応部位または反応容器内で乾燥させられ得る。

【0107】

増幅反応容器は、例えば、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、および／またはｄＵＴＰ）、ポリメラーゼ、緩衝液（複数可）、少なくとも１つの塩（複数可）、少なくとも１つの洗剤（複数可）、少なくとも１つの増幅阻害物質遮断剤（複数可）、および／または少なくとも１つの消泡剤（複数可）等の増幅反応混合物の他の成分試薬も含み得る。したがって、半固体または固体支持体には、増幅マスターミックスとともに対照核酸分子および増幅プライマー対を含む反応部位が提供され得る。反応部位または反応容器内のプライマー対とマスターミックスとの組み合わせは、対照核酸試料の添加前に乾燥させられ得る。半固体または固体支持体には、増幅マスターミックスとともに対照核酸分子、増幅プライマー対、および検出可能な標識プローブを含む反応部位が提供され得る。反応部位または反応容器内のプライマー対とプローブとマスターミックスとの組み合わせは、対照核酸試料の添加前に乾燥させられ得る。

【0108】

いくつかの実施形態では、核酸試料は、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）等のＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。核酸試料は、一本鎖または二本鎖核酸分子を含み得る。核酸試料は、例えば、培養細胞または生物学的試験試料を含む、任意の源から得られ得る。核酸試料が、当該技術分野で既知の様々な手技、例えば、ＭａｇＭＡＸ（商標）Ｍｕｌｔｉ－Ｓａｍｐｌｅ Ｕｌｔｒａ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＭａｇＭＡＸ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ－９６ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅ ＰｒｏｃｅｓｓｏｒおよびＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（商標）Ｆｌｅｘ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（商標）６１００ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ＰｒｅｐＳｔａｔｉｏｎおよびＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（商標）６７００ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）等のうちのいずれかを使用して生物学的源から単離され得ることが理解されるであろう。核酸試料が、機械力、制限エンドヌクレアーゼ切断、または当該技術分野で既知の任意の方法等の手技の使用を含む、分析前に断片化され得ることが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、核酸試料は、増幅および／または分析されるときに粗溶解物中に存在し得る。

【0109】

本明細書で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」という単語は、別途明確に述べられない限り、少なくとも１つを意味する。本明細書では、単数形の使用は、別途明確に述べられない限り、複数形を含む。例えであって、限定するものではなく、「標的核酸」は、１つより多くの標的核酸、例えば、特定の標的核酸種の１つ以上のコピー、ならびに２つ以上の異なる標的核酸種が存在し得ることを意味する。「および／または」という用語は、スラッシュの前後の用語が一緒にまたは別々に受け取られ得ることを意味する。例証のためであって、限定するものではなく、「Ｘおよび／またはＹ」は、「Ｘ」もしくは「Ｙ」または「Ｘ」および「Ｙ」を意味し得る。

【0110】

取るに足りないわずかな偏差が本明細書における教示の範囲内であるように、本開示で論じられる温度、濃度、時間等の前に暗示的な「約」が存在することが理解されるであろう。また、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「を含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「を含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「を含み得る（ｍａｙ ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「を含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「を含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、限定するようには意図されていない。前述の概要および詳述の両方が例示および説明のためのみのものであり、本教示を限定するものではないことを理解されたい。

【0111】

本明細書で具体的に言及されない限り、様々な成分「を含む」ことを列挙する本明細書における実施形態は、列挙される成分「からなる」または「から本質的になる」とも企図され、様々な成分「からなる」ことを列挙する本明細書における実施形態は、列挙される成分「を含む」または「から本質的になる」とも企図され、様々な成分「から本質的になる」ことを列挙する本明細書における実施形態は、列挙される成分「からなる」または「を含む」とも企図される（この互換性は、特許請求の範囲におけるこれらの用語の使用には適用されない）。

【0112】

本明細書で使用される場合、「増幅」、「核酸増幅」、または「増幅する」という用語は、核酸鋳型の複数のコピーの産生、または核酸鋳型に相補的な複数の核酸配列コピーの産生を指す。これらの用語（「重合する」という用語を含む）は、核酸鋳型を伸長すること（例えば、重合により）も指し得る。増幅反応は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等のポリメラーゼ媒介伸長反応であり得る。しかしながら、既知の増幅反応のうちのいずれかが本明細書に記載の使用に好適であり得る。典型的には標的核酸の「指数関数的」増加を指す「増幅する」という用語は、核酸の選択された標的配列の数の線形増加および指数関数的増加の両方を説明するために本明細書で使用され得る。

【0113】

本明細書で使用される「アンプリコン」および「増幅産物」という用語は、概して、増幅反応の産物を指す。アンプリコンは、二本鎖または一本であり得、二本鎖増幅産物を変性させることによって得られる分離成分の鎖を含み得る。ある特定の実施形態では、１回の増幅サイクルのアンプリコンが、その後の増幅サイクルにおける鋳型としての機能を果たすことができる。

【0114】

「ハイブリダイズする」および「アニールする」という基語の変形を含むが、これらに限定されない「アニールすること」および「ハイブリダイズすること」という用語は、互換的に使用され、二本鎖、三本鎖、または他のより高次の構造の形成をもたらす、１つの核酸の別の核酸とのヌクレオチド塩基対合相互作用を意味する。一次相互作用は、典型的には、ヌクレオチド塩基特異的であり、例えば、ワトソン・クリックおよびフーグスティーン型水素結合による、Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、およびＧ：Ｃである。ある特定の実施形態では、塩基の積み重ねおよび疎水性相互作用は、二本鎖の安定性にも寄与し得る。プライマーおよびプローブが相補的配列にアニールする条件は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８５）およびＷｅｔｍｕｒ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１：３４９（１９６８）に記載されている。

【0115】

概して、かかるアニールリングが行われるかは、とりわけ、標的隣接配列および／もしくはアンプリコン中のプライマーの相補的部分の相補的部分およびそれらの対応する結合部位、またはレポータープローブの対応する相補的部分およびその結合部位の長さ、ｐＨ、温度、一価および二価陽イオンの存在、ハイブリダイズしている領域内のＧヌクレオチドとＣヌクレオチドの割合、培地の粘度、ならびに変性剤の存在によって影響される。かかる可変物は、ハイブリダイゼーションに必要な時間に影響を及ぼす。したがって、好ましいアニーリング条件は、特定の用途に依存するであろう。しかしながら、かかる条件は、過度の実験なしに当業者によって日常的に決定され得る。好ましくは、アニーリング条件は、プライマーおよび／またはプローブが、対応する標的隣接配列またはアンプリコン中の相補的配列と選択的にハイブリダイズするが、第２の反応温度で反応組成物中の異なる標的核酸または非標的配列に著しい程度にハイブリダイズしないことを可能にするように選択される。

【0116】

本明細書で使用される「またはそれらの組み合わせ」という用語は、その用語に先行する列記される用語の全ての順列および組み合わせを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、またはそれらの組み合わせ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、またはＡＢＣのうちの少なくとも１つを含み、順序が特定の文脈で重要である場合、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＡＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＢＡＣ、またはＣＡＢのうちの少なくとも１つを含むよう意図されている。この例に続いて、１つ以上の項目または用語の繰り返し、例えば、ＢＢ、ＡＡＡ、ＡＡＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢ等を含む組み合わせが明示的に含まれる。当業者であれば、別途文脈から明らかではない限り、典型的にはいずれの組み合わせにも項目または用語の数に制限がないことを理解するであろう。

【0117】

本明細書で使用される「変性させる」および「変性」という用語は、少なくとも１つの標的核酸を含むゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）断片、二本鎖アンプリコン、または少なくとも１つの二本鎖区域を含むポリヌクレオチドを含むが、これらに限定されない二本鎖ポリヌクレオチドが、必要に応じて、２つの一本鎖ポリヌクレオチドまたは１つの一本鎖もしくは実質的に一本鎖のポリヌクレオチドに変換される任意のプロセスを指す。二本鎖ポリヌクレオチドの変性には、例えば、二本鎖ポリヌクレオチドまたは２つのオリゴヌクレオチドを含む二本鎖の２つの個別の一本鎖成分の放出であるが、これらに限定されない、二本鎖核酸を一本鎖または実質的に一本鎖にする様々な熱的および化学的技法が含まれるが、これらに限定されない。当業者であれば、増幅反応のその後のアニーリングまたは酵素的ステップ、またはある特定の方法では、蛍光シグナルの検出を実質的に妨害しない限り、用いられる変性技法が概して非限定的であることを理解するであろう。

【0118】

本明細書で使用される場合、「Ｔｍ」という用語は、融解温度に関して使用される。融解温度は、二本鎖核酸分子集団が半解離して一本鎖になる温度である。

【0119】

本明細書で使用される「副溝結合剤」という用語は、時には配列特異的様式で、二本鎖ＤＮＡの副溝に適合する小分子を指す。一般に、副溝結合剤は、三日月様形状を採用することができる長くて平らな分子であり、それ故に、二重らせんの副溝にぴったりと適合し、多くの場合、水と置き換わる。副溝結合分子は、典型的には、例えば、フラン環、ベンゼン環、またはピロール環であるが、これらに限定されない、自由にねじれた結合によって結合されたいくつかの芳香族環を含む。

【0120】

「エンドポイント」測定という用語は、反応が停止した時点でのみデータ収集が生じる方法を指す。

【0121】

「リアルタイム」および「リアルタイム連続」という用語は互換的であり、重合反応の過程で周期的なモニタリングによりデータ収集が生じる方法を指す。したがって、これらの方法は、増幅と検出を組み合わせて単一のステップにする。

【0122】

本明細書で使用される場合、「Ｃｔ」および「サイクル閾値」という用語は、蛍光強度がバックグラウンド蛍光よりも高い時点を指す。これらは、標的増幅が最初に検出された時点（またはＰＣＲサイクル）によって特徴付けられる。その結果として、出発材料中の標的ＤＮＡの量が多いほど、蛍光シグナルの著しい増加が速く出現し、より低いＣｔをもたらす。

【0123】

本明細書で使用される場合、「プライマー」という用語およびその誘導体は、概して、標的核酸にハイブリダイズすることができる任意のポリヌクレオチドを指す。プライマーは、核酸合成をプライムするのに役立ち得る。プライマーは、核酸分子増幅または重合中にヌクレオチドモノマーの共有結合によって伸長される合成的にまたは生物学的に産生された一本鎖オリゴヌクレオチドである。核酸増幅は、多くの場合、核酸ポリメラーゼまたは逆転写酵素による核酸合成に基づく。多くのかかるポリメラーゼまたは逆転写酵素は、かかる核酸合成を開始するために伸長され得るプライマーの存在を必要とする。プライマーは、典型的には、約１１塩基～約３５塩基長であるが、必要に応じてより短いまたはより長いプライマーが使用され得る。ある特定の実施形態では、プライマーは、１７塩基長またはそれ以上である。ある特定の実施形態では、プライマーは、約１７塩基～約２５塩基長である。プライマーは、標準、非標準、誘導体化、および修飾ヌクレオチドを含み得る。当業者であれば理解するであろうように、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、様々な伸長、合成、または増幅反応において１つ以上のプライマーとして使用され得る。

【0124】

典型的には、ＰＣＲ反応は、増幅されるＲＮＡまたはＤＮＡの領域の境界を定める「上流」または「順方向」プライマーおよび「下流」または「逆方向」プライマーを含む増幅プライマー対を用いる。第１のプライマーおよび第２のプライマーは、順方向プライマーまたは逆方向プライマーのいずれかであり得、本明細書で互換的に使用され、限定するものではない。

【0125】

「相補性」および「相補的」という用語は互換的であり、互いに塩基対を形成するポリヌクレオチドの能力を指す。塩基対は、典型的には、逆平行ポリヌクレオチド鎖または領域内のヌクレオチド単位間の水素結合によって形成される。相補的ポリヌクレオチド鎖または領域は、ワトソン・クリック様式で塩基対合し得る（例えば、ＡとＴ、ＡとＵ、ＣとＧ）。１００％相補性とは、１つのポリヌクレオチド鎖または領域の各ヌクレオチド単位が第２のポリヌクレオチド鎖または領域の各ヌクレオチド単位と水素結合することができる状況を指す。「完全ではない相補性」とは、２つの鎖の全てではないがいくつかのヌクレオチド単位または２つの単位が互いに水素結合することができる状況を指す。

【0126】

本明細書で使用される場合、「逆相補体」という用語は、ワトソン・クリック塩基対合によって定義される規則、ならびにＤＮＡ－ＤＮＡ、ＲＮＡ－ＲＮＡ、およびＲＮＡ－ＤＮＡ二重らせんの逆平行性質に従って第２のオリゴヌクレオチドにアニール／塩基対合または実質的にアニール／塩基対合する配列を指す。したがって、一例として、ＲＮＡ配列５’－ＡＡＵＵＵＧＣの逆相補体は、５’－ＧＣＡＡＡＵＵであろう。Ｇ－Ｕ対合を含むが、これに限定されない代替の塩基対合スキームも、逆相補体に含まれ得る。

【0127】

本明細書で使用される場合、「プローブ」という用語は、設計または選択により、定義されたストリンジェンシー下で標的核酸配列に特異的に（すなわち、優先的に）ハイブリダイズすることを可能にする特異的ヌクレオチド配列を含む合成的にまたは生物学的に産生された核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を指す。

【0128】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される増幅対照核酸は、生物学的試料由来の核酸試料中の標的核酸を増幅、検出、プロファイリング、および／またはモニタリングするための方法、組成物、およびキットと併せて使用される。

【0129】

「生物学的試料」または「試験試料」は、細胞、組織切片、例えば、生検および剖検試料、ならびに組織学的目的のために採取された凍結切片、ならびに細胞または組織由来の体液または分泌物検体を含む。かかる試料は、生検、血液および血液画分または産物（例えば、血清、血小板、赤血球等）、リンパ、骨髄、痰、気管支肺胞洗浄、羊水、毛髪、皮膚、培養細胞、例えば、初代培養物、外植片、および形質転換細胞、糞便、尿等を含む。いくつかの実施形態では、試料が尿に由来する場合、試料は、排尿、カテーテルの使用、または恥骨上膀胱穿刺によって収集され得る。標的核酸調製前、生物学的試料は、新鮮な、凍結した、またはホルマリンもしくはパラホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥ）であり得る。「生検」とは、診断的評価または予後評価のために組織試料を除去するプロセスを指し、組織検体自体も指す。適用される生検技法は、他の要因の中でもとりわけ、評価される組織のタイプ（例えば、皮膚、粘膜等）、組織試料のサイズおよびタイプに依存するであろう。代表的な生検技法には、切除生検、切開生検、針生検、および外科生検が挙げられるが、これらに限定されない。

【0130】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される増幅対照核酸は、生物学的または試験試料中のある特定の組の標的微生物由来の核酸を増幅、検出、プロファイリング、および／またはモニタリングするための方法、組成物、およびキットと併せて使用される。いくつかの実施形態では、生物学的または試験試料は、尿路（例えば、泌尿生殖器粘膜、尿道、泌尿生殖器領域）由来であり、これらの解剖学的部位由来の細胞、組織、および／または体液（例えば、尿路分泌物、尿流体、および泌尿生殖器分泌物）である。

【0131】

尿試料は、当業者に容易に知られている任意の尿収集デバイス、容器、または機器を使用して収集され得る。いくつかの実施形態では、例えば、尿は、ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）採尿カップ、ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）検尿保存管、ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）Ｐｌｕｓ Ｃ＆Ｓ保存管、Ｈｏｌｏｇｉｃｓ（登録商標）Ａｐｔｉｍａ Ｕｒｉｎｅ Ｓｐｅｃｉｍｅｎ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｔｕｂｅｓ等を使用して収集され得る。尿検体は、当業者に既知の任意の手段によって収集され得る。例えば、尿は、排尿、カテーテルの使用、または恥骨上膀胱穿刺によって収集され得る。例えば、尿道または泌尿生殖器生物学的試料と互換性のある収集システム、試薬、および培地は当該技術分野で既知であり、本明細書に開示される方法、組成物、およびキットとの使用のために企図される。

【0132】

核酸が、当該技術分野で既知の様々な手技のうちのいずれかを使用して、例えば、ＭａｇＭＡＸ（商標）Ｍｕｌｔｉ－Ｓａｍｐｌｅ Ｕｌｔｒａ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＭａｇＭＡＸ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ－９６ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ） 、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（商標）Ｆｌｅｘ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（商標）Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｆｏｒ ＦＦＰＥ（Ａｍｂｉｏｎ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）ＦＦＰＥ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（商標）６１００ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ＰｒｅｐＳｔａｔｉｏｎおよびＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（商標）６７００ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）等を使用して、生物学的試料から単離され得ることが理解されるであろう。生物学的試料由来の標的核酸が、機械力、超音波処理、制限エンドヌクレアーゼ切断、または当該技術分野で既知の任意の方法等の手技の使用を含む、分析前に切断または剪断され得ることが理解されるであろう。

【0133】

本明細書で使用される場合、「鋳型」という用語は、「標的分子」または「標的核酸」と互換的であり、増幅、コピーもしくは伸長、合成、または配列決定される二本鎖または一本鎖核酸分子を指す。二本鎖ＤＮＡ分子の場合、第１および第２の鎖を形成するためのその鎖の変性が行われて、これらの分子を増幅、配列決定、または合成する。標的核酸は、増幅または合成反応に有用なプライマーがポリメラーゼによる伸長前にハイブリダイズすることができる核酸配列を含み得る。鋳型の一部に相補的なプライマーが好適な条件下でハイブリダイズされ、その後、ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）が鋳型またはその一部に相補的な核酸分子を合成し得る。本開示に従って新たに合成された分子は、元の鋳型と同じまたはそれよりも短い長さであり得る。新たに合成された分子の合成または伸長中のミスマッチ組み込みにより、１つまたはいくつかのミスマッチ塩基対がもたらされ得る。したがって、合成された分子は、鋳型に正確に相補的である必要はない。鋳型は、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子であり得る。新たに合成された分子は、その後の核酸合成または増幅のための鋳型としての機能を果たし得る。

【0134】

標的核酸は、核酸（例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ）、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、無細胞ＤＮＡ、循環ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または他の成熟低分子ＲＮＡであり得、核酸類似体または他の核酸模倣体を含み得る。標的は、メチル化、非メチル化、またはそれらの両方であり得る。標的は、亜硫酸水素塩処理され、ウラシルに変換された非メチル化シトシンであり得る。さらに、「標的核酸」が標的核酸自体、ならびにその代替物、例えば、増幅産物および天然配列を指し得ることが理解されるであろう。

【0135】

標的核酸は、任意の源から得られ得、任意の数の異なる組成成分を含み得る。本教示の標的分子は、ウイルス、古細菌、原生生物、原核生物、および真核生物、例えば、真核生物から得られた生物学的試料由来のもの、最も好ましくは、霊長類等の哺乳動物、例えば、チンパンジーまたはヒトを含むが、これらに限定されない任意の数の源に由来し得る。標的核酸が、当該技術分野で既知の様々な手技のうちのいずれか、例えば、ＭａｇＭＡＸ（商標）Ｍｕｌｔｉ－Ｓａｍｐｌｅ Ｕｌｔｒａ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＭａｇＭＡＸ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ－９６ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅ ＰｒｏｃｅｓｓｏｒおよびＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（商標）Ｆｌｅｘ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（商標）Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｆｏｒ ＦＦＰＥおよびＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）ＦＦＰＥ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（商標）６１００ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ＰｒｅｐＳｔａｔｉｏｎおよびＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（商標）６７００ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）等を使用して生物学的試料から単離され得ることが理解されるであろう。標的核酸が、機械力、超音波処理、制限エンドヌクレアーゼ切断、または当該技術分野で既知の任意の方法等の手技の使用を含む、分析前に切断または剪断され得ることが理解されるであろう。概して、本教示の標的核酸は一本鎖であるが、いくつかの実施形態では、標的核酸は二本鎖であり得、一本鎖は変性に起因し得る。

【0136】

本明細書で使用される「組み込む」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子またはプライマーの一部になることを意味する。

【0137】

本明細書で使用される「核酸結合部分」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド等の結合している核酸分子に親和性を有する分子を指す。

【0138】

本明細書で使用される「核酸結合色素」という用語は、二本鎖ポリヌクレオチドに特異的であるか、または一本鎖ポリヌクレオチドよりも二本鎖ポリヌクレオチドと会合したときに実質的に強い蛍光増強を少なくとも示す蛍光分子を指す。典型的には、核酸結合色素分子は、二本鎖区域の主溝もしくは副溝における結合ではなく、二本鎖区域の塩基対間のインターカレーションによって、またはそれらの両方によってポリヌクレオチドの二本鎖区域と会合する。核酸結合色素の非限定的な例としては、臭化エチジウム、ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ誘導体（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８およびＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２を含むが、これらに限定されない）、インターカレート剤（例えば、ランタニドキレート（例えば、２つの蛍光四座β－ジケトン－Ｅｕ３＋キレートを保有するナフタレンジイミド誘導体（ＮＤＩ－（ＢＨＨＣＴ－Ｅｕ３＋）２であるが、これに限定されない））（例えば、Ｎｏｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓｕｐｐｌ．Ｎｏ．１ １０５（２００１）を参照のこと）、およびある特定の非対称シアニン色素、例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎおよびＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）が挙げられる。

【0139】

本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、互換的に使用され、ヌクレオチド間リン酸ジエステル結合連結、またはヌクレオチド間類似体、および関連対イオン、例えば、Ｈ＋、ＮＨ４＋、トリアルキルアンモニウム、Ｍｇ２＋、Ｎａ＋等によって連結された２’－デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）およびリボヌクレオチド（ＲＮＡ）を含むが、これらに限定されない、ヌクレオチドモノマーの一本鎖および二本鎖ポリマーを指す。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドから完全に構成され得るか、リボヌクレオチドから完全に構成され得るか、またはそのキメラ混合物から構成され得、ヌクレオチド類似体を含み得る。ヌクレオチドモノマー単位は、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体を含むが、これらに限定されない、本明細書に記載のヌクレオチドのうちのいずれかを含み得る。ポリヌクレオチドは、典型的には、数個のモノマー単位、例えば、５～４０（当該技術分野でオリゴヌクレオチドと称されることもある場合）から、数千個のモノマーヌクレオチド単位までのサイズの範囲である。別途示されない限り、ポリヌクレオチド配列が表されるときはいつでも、ヌクレオチドが左から右に５’から３’の順序であり、別途述べられない限り、「Ａ」がデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」がデオキシシトシンを示し、「Ｇ」がデオキシグアノシンを示し、「Ｔ」がデオキシチミジンを示し、「Ｕ」がデオキシウリジンを示すことが理解されるであろう。

【0140】

「ヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシドのリン酸エステル、例えば、三リン酸エステルを指し、エステル化の最も一般的な部位は、ペントースのＣ－５位に結合したヒドロキシル基である。

【0141】

「ヌクレオシド」という用語は、２’－デオキシ形態および２’－ヒドロキシル形態を含む、１’位でペントースに連結している、プリン、デアザプリン、またはピリミジンヌクレオシド塩基、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、デアザアデニン、デアザグアノシン等からなる化合物を指す。ヌクレオシド塩基がプリンまたは７－デアザプリンである場合、ペントースがプリンまたはデアザプリンの９位で核酸塩基に結合しており、核酸塩基がピリミジンである場合、ペントースがピリミジンの１位で核酸塩基に結合している。

【0142】

「類似体」という用語は、修飾塩基部分、修飾糖部分、および／または修飾リン酸エステル部分を有する合成類似体を含む。リン酸塩類似体は、一般に、リン酸塩の類似体を含み、リン原子が＋５酸化状態にあり、酸素原子のうちの１つ以上が非酸素部分、例えば、硫黄と置き換えられている。例示的なリン酸塩類似体には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニリデート、ホスホラミデート、ボロノホスフェート（関連対イオン、例えば、Ｈ＋、ＮＨ４＋、Ｎａ＋を含む）が含まれる。例示的な塩基類似体には、２，６－ジアミノプリン、ヒポキサンチン、プソイドウリジン、Ｃ－５－プロピン、イソシトシン、イソグアニン、２－チオピリミジンが含まれる。例示的な糖類似体には、２’位または３’位が、水素、ヒドロキシ、アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、アリルオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、およびフェノキシ）、アジド、アミノまたはアルキルアミノ、フルオロ、クロロ、およびブロモである２’修飾または３’修飾が含まれる。

【0143】

本明細書で使用される場合、「スーパープラスミド」という用語は、複数個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも１７個の目的とする標的核酸配列を含む挿入断片を含むプラスミド（ＤＮＡ分子）を指す。標的核酸配列は、ゲノム配列またはトランスクリプトーム配列であり得る。標的核酸配列は、異種核酸（ＸＮＡ）であり得る。標的核酸配列は、ゲノム配列、トランスクリプトーム配列、または異種核酸配列の任意の組み合わせであり得る。

【0144】

本明細書で使用される場合、「反応容器」という用語は、概して、反応が本教示に従って生じ得る任意の容器、チャンバ、デバイス、カード、プレート、チップ、アレイ、またはアセンブリを指す。いくつかの実施形態では、反応容器は、微小管（例えば、０．２ｍＬまたは０．５ｍＬ反応管、例えば、ＭｉｃｒｏＡｍｐ（商標）Ｏｐｔｉｃａｌ ｔｕｂｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）もしくは微小遠心管であるが、これらに限定されない）、または分子生物学研究所で一般的に実用される種類の他の容器であり得る。いくつかの実施形態では、反応容器は、個別の反応部位を含み得、例えば、反応部位は、マルチウェルプレート（４８、９６、または３８４ウェルマイクロタイタープレート等）のウェル、スライドガラス上のスポット、マイクロ流体デバイスのＴａｑＭａｎ（商標）Ａｒｒａｙ Ｃａｒｄまたはチャネルもしくはチャンバ内のウェル（ＴａｑＭａｎ（商標）低密度アレイを含むが、これに限定されない）、またはＴａｑＭａｎ（商標）ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲプレートの貫通孔（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含み得る。例えであって、限定するものではなく、複数の反応部位が同じ支持体上または同じ反応容器内に存在し得る。いくつかの実施形態では、例えば、ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）プレートは、３０７２個の貫通孔または異なる反応部位を有する反応プレートである。かかるプレート内のかかる貫通孔は、単一のＴａｑＭａｎ（商標）アッセイを含み得る。いくつかの実施形態では、ラボオンチップ様デバイスが、例えば、ＣａｌｉｐｅｒまたはＦｌｕｉｄｉｇｍから入手可能である。ことが認識されるであろう。様々な反応容器（それらのうちのいくつかが複数の反応部位を含む）が市販されているか、本教示との関連で使用するために設計され得る。

【0145】

「レポーター基」という用語は、本明細書で広義に使用され、任意の特定可能または検出可能なタグ、標識、または部分を指す。

【0146】

「熱安定性」という用語は、酵素に関して使用される場合、熱による不活性化に耐性を示す酵素（核酸ポリメラーゼ活性を有するポリペプチド等）を指す。「熱安定性」酵素は、熱処理によって不活性化され得る「熱不安定性」ポリメラーゼとは対照的である。熱不安定性タンパク質は、生理学的温度で不活性化され得、中温安定性（約４５℃～約６５℃で不活性化）および熱安定性（約６５℃超で不活性化）にカテゴリー化され得る。例えば、熱不安定性Ｔ５およびＴ７ ＤＮＡポリメラーゼの活性は、酵素を約９０℃の温度に約３０秒間曝露することによって完全に不活性化され得る。熱安定性ポリメラーゼ活性は、熱不安定性ポリメラーゼよりも熱不活性化に高い耐性を示す。しかしながら、熱安定性ポリメラーゼは、熱不活性化に完全に耐性を示す酵素を指すようには意図されておらず、それ故に、例えば、特に長時間にわたっておよび／または反復数の事例にわたって熱に曝露された場合、熱処理がポリメラーゼ活性をある程度低下させる。熱安定性ポリメラーゼは、典型的には、熱不安定性ＤＮＡポリメラーゼよりも高い最適温度も有する。

【0147】

「作業濃度」という用語は、特定の機能（核酸分子の合成または消化等）を果たす溶液中で使用される最適な濃度または最適に近い濃度での試薬の濃度を指す。試薬の作業濃度は、試薬の「１倍濃度」または「１倍溶液」（試薬が溶液中に存在する場合）とも同等に記述される。したがって、試薬のより高い濃度も作業濃度に基づいて記述され得、例えば、試薬の「２倍濃度」または「２倍溶液」は、試薬の作業濃度よりも２倍高い濃度または溶液と定義され、「５倍濃度」または「５倍溶液」は、作業濃度よりも５倍高いといった具合である。

【0148】

「反応混合物」および／または「マスターミックス」という用語は、標的核酸を合成または増幅するために使用される様々な（いくつかまたは全ての）試薬および／または成分を含む組成物を指し得る。かかる反応は、固体支持体または半固体支持体（例えば、アレイ）を使用して行われる場合もある。反応は、使用者によって所望に応じてシングルプレックスまたはマルチプレックス型式で行われる場合もある。これらの反応は、典型的には、酵素、水性緩衝液、塩、増幅プライマー、標的核酸、およびヌクレオシド三リン酸を含む。増幅反応混合物および／またはマスターミックスは、例えば、緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ）、１つ以上の塩（例えば、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ）、グリセロール、ｄＮＴＰ（ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ、ｄＣ、ｄＵ）、組換えＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、色素（例えば、ＲＯＸ受動参照色素もしくは追跡用色素）、１つ以上の洗剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｂｒｉｊ－５８）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ゼラチン（例えば、魚もしくはウシ源）、および／または消泡剤のうちの１つ以上を含み得る。状況に応じて、混合物は、完全または不完全増幅反応混合物のいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、マスターミックスは、増幅反応での使用前に増幅プライマーを含まない。いくつかの他の実施形態では、マスターミックスは、増幅反応での使用前に標的核酸を含まない。いくつかの実施形態では、増幅マスターミックスは、増幅プライマーとの接触前に標的核酸試料と混合される。いくつかの他の実施形態では、増幅マスターミックスは、標的核酸試料との接触前に増幅プライマーと混合される。

【0149】

いくつかの実施形態では、増幅反応混合物は、増幅プライマーおよびマスターミックスを含む。いくつかの他の実施形態では、増幅反応混合物は、増幅プライマー、検出可能な標識プローブ、およびマスターミックスを含む。いくつかの実施形態では、増幅プライマーおよびマスターミックスの反応混合物、または増幅プライマー、プローブ、およびマスターミックスの反応混合物は、保管容器または反応容器内で乾燥する。いくつかの他の実施形態では、増幅プライマーおよびマスターミックスの反応混合物、または増幅プライマー、プローブ、およびマスターミックスの反応混合物は、保管容器または反応容器内で凍結乾燥する。

【0150】

本開示は、単一の核酸源または試料由来の複数の標的特異的配列の増幅に関する。例えば、いくつかの実施形態では、その単一の核酸試料は、ＲＮＡ（微生物または別様のもの）を含み得、他の実施形態では、その単一の核酸試料は、ゲノムＤＮＡ（微生物ゲノムＤＮＡを含む）を含み得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの他の源（例えば、外部対照核酸）由来の核酸分子は、標的特異的増幅前に反応混合物中の単一の核酸試料と組み合わせられる。試料が単一の個体由来であり得ることが想定される。標的特異的プライマーおよびプライマー対は、核酸分子の特定の領域、例えば、対照核酸分子を増幅することができる標的特異的配列である。標的特異的プライマーは、ＲＮＡの逆転写をプライムして、標的特異的ｃＤＮＡを生成することができる。標的特異的プライマーは、微生物ＤＮＡ、例えば、細菌ＤＮＡ、真菌（例えば、酵母）ＤＮＡ、原虫ＤＮＡ、またはウイルスＤＮＡを増幅することができる。

【0151】

一実施形態では、１つ以上の標的配列を含む試料は、本明細書に開示される標的特異的プライマーのうちのいずれか１つ以上を使用して増幅され得る。別の実施形態では、本明細書に開示される方法ならびに関連組成物およびキットを使用して得られた増幅された標的配列は、核酸配列決定等であるが、これに限定されない下流プロセスに連結され得る。例えば、増幅された標的配列の核酸配列が確認されると、核酸配列は１つ以上の参照試料と比較され得る。増幅手順からのアウトプットは、例えば、核酸配列決定によって任意に分析されて、標的特異的プライマーに基づいて予期された増幅産物が増幅アウトプット中に存在するかを決定することができる。いくつかの実施形態では、選択的増幅によって生成されたアンプリコンは、配列決定前にクローニングされ得るか、またはこれらのアンプリコンは、クローニングなしに直接配列決定され得る。当業者であれば、アンプリコンが任意の好適なＤＮＡ配列決定プラットホームを使用して配列決定され得ることを理解するであろう。例えば、アンプリコンは、Ｉｏｎ Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍａｃｈｉｎｅ（商標）（ＰＧＭ（商標））ＳｙｓｔｅｍまたはＩｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）または当業者に既知の任意の他の市販のプラットホームまたは手法を使用して配列決定され得る。

【0152】

いくつかの実施形態では、産生されるアンプリコンの長さは、選択されたプライマー対の使用によって調節され得る。いくつかの態様では、プライマー対（例えば、順方向プライマーおよび逆方向プライマー）の各プライマーは、選択されたプライマー対を用いて標的核酸を増幅することにより、特定のサイズを有するアンプリコンがもたらされるように、標的核酸の異なる領域の全てまたは一部に特異的にハイブリダイズするように構成され得る。各プライマーがハイブリダイズする標的核酸の異なる領域は、少なくとも１０個のヌクレオチド、少なくとも２０個のヌクレオチド、少なくとも５０個のヌクレオチド、少なくとも１００個のヌクレオチド、少なくとも２５０個のヌクレオチド、少なくとも５００個のヌクレオチド、少なくとも７５０個のヌクレオチド等によって分離され得る。したがって、いくつかの実施形態では、選択されたプライマーセットは、少なくとも１０ヌクレオチド長、少なくとも２０ヌクレオチド長、少なくとも５０ヌクレオチド長、少なくとも１００ヌクレオチド長、少なくとも２５０ヌクレオチド長、少なくとも５００ヌクレオチド長、少なくとも７５０ヌクレオチド長等のアンプリコンを産生することができる。いくつかの実施形態では、選択されたプライマー対は、５００塩基長未満、３００塩基長未満、２００塩基長未満、または１００塩基長未満のアンプリコンを産生する。いくつかの実施形態では、産生されるアンプリコンは、２０～５００ヌクレオチド長である。例えば、アンプリコンは、２０ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長、２００ヌクレオチド長、３００ヌクレオチド長、４００ヌクレオチド長、５００ヌクレオチド長、またはそれらの間の任意の長さ（例えば、２０～５００（それらの上限および下限を含む）ヌクレオチド長の任意の長さ）であり得る。本明細書に記載の方法、組成物、およびキットに従う使用のために増幅プライマーセットを設計および選択して所望のアンプリコンサイズをもたらすためのシステムおよび方法は、当業者に既知である。例えば、ＷＯ２０１３／１３４３４１ Ａ１およびｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｉｍｅｒ－ｂｌａｓｔ／を参照されたい。当業者であれば、アンプリコン長を決定するための標準方法も容易に決定することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ＤＮＡサイズマーカーを使用して、相対的アンプリコンサイズを実証することができる。

【0153】

一実施形態では、１つ以上の標的配列を含む核酸対照は、本明細書に開示される標的特異的プライマーのうちのいずれか１つ以上を使用して増幅され得る。別の実施形態では、本明細書に開示される方法ならびに関連組成物およびキットを使用して得られた増幅された標的配列は、核酸配列決定等であるが、これに限定されない下流プロセスに連結され得る。例えば、増幅された標的配列の核酸配列が確認されると、核酸配列は１つ以上の参照試料と比較され得る。増幅手順からのアウトプットは、例えば、核酸配列決定によって任意に分析されて、標的特異的プライマーに基づいて予期された増幅産物が増幅アウトプット中に存在するかを決定することができる。いくつかの実施形態では、選択的増幅によって生成されたアンプリコンは、配列決定前にクローニングされ得るか、またはこれらのアンプリコンは、クローニングなしに直接配列決定され得る。アンプリコンは、任意の好適なＤＮＡ配列決定プラットホームを使用して配列決定され得る。例えば、アンプリコンは、Ｉｏｎ Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍａｃｈｉｎｅ（商標）（ＰＧＭ（商標））ＳｙｓｔｅｍまたはＩｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）または任意の他の市販の機器類を使用して配列決定され得る。

【0154】

標的核酸を増幅するために使用される方法は、当業者が利用可能な任意ものであり得る。核酸の標的配列のコピーを増加させるための任意のインビトロ手段が利用され得る。これらには、線状、対数的、リアルタイム、定量的、エンドポイント、および／または任意の他の増幅法が含まれる。本開示が、概して、核酸増幅反応としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲまたはｑＰＣＲ）を使用して論じられ得るが、本明細書に記載の組成物、方法、およびキットが、ポリメラーゼ媒介増幅反応（ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、リコンビナーゼ－ポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、およびローリングサークル増幅（ＲＣＡ）等）、ならびにリガーゼ媒介増幅反応（リガーゼ検出反応（ＬＤＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、および各々のギャップバージョン等）の両方、およびＬＤＲとＰＣＲ等の核酸増幅反応の組み合わせを含む他のタイプの核酸増幅反応を用いて有効であるはずであることが予想される（例えば、米国特許第６，７９７，４７０号を参照のこと）。核酸合成のための例示的な方法としては、とりわけ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、例えば、米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号、同第４，９６５，１８８号、および／または同第５，０３５，９９６号を参照のこと）、等温手技（１つ以上のＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００６／０８１２２２号を参照のこと）、鎖置換（例えば、米国特許第ＲＥ３９００７Ｅ号を参照のこと）、プライマー分子の部分的破壊（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００６／０８７５７４号を参照のこと）を使用）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｗｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０－５６９（１９９０））、および／またはＢａｒａｎｙ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８９－１９３（１９９１）を参照のこと）、Ｑβ ＲＮＡレプリカーゼ系（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ１９９４／０１６１０８号を参照のこと）、ＲＮＡ転写に基づく系（例えば、ＴＡＳ、３ＳＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（例えば、米国特許第５，８５４，０３３号、米国特許公開第２００４／２６５８９７号、Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：２２５－２３２（１９９８）、および／またはＢａｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２６：５０７３－５０７８（１９９８）を参照のこと）、および鎖置換増幅（ＳＤＡ）（Ｌｉｔｔｌｅ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４５：７７７－７８４（１９９９））が挙げられる。これらの系は、当業者が利用可能な多くの他の系とともに、本明細書に記載の使用のための標的核酸の重合および／または増幅における使用に好適であり得る。

【0155】

ある特定の実施形態では、増幅技法は、例えば、二本鎖核酸を変性させて成分鎖を分離するステップ、プライマーまたはプライマーセットをアンプリコンの標的配列またはプライマー結合部位（複数可）（または必要に応じていずれかの相補体）にハイブリダイズするステップ、およびＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドを使用して鋳型依存的様式でヌクレオチドの鎖を合成するステップであるが、これらに限定されない、少なくとも１つの増幅サイクルを含む。増幅サイクルは、繰り返されても繰り返されなくてもよい。ある特定の実施形態では、増幅サイクルは、例えば、２０増幅サイクル、２５増幅サイクル、３０増幅サイクル、３５増幅サイクル、４０増幅サイクル、４５増幅サイクル、または４５増幅サイクル超であるが、これらに限定されない、多数の増幅サイクルを含む。

【0156】

いくつかの実施形態では、増幅することは、例えば、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００、９６００、２７００、または２４００ ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）ＶｉｉＡ（商標）７ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、ＳｔｅｐＯｎｅ（登録商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（登録商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）３または５ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）６Ｋ、７Ｋ、または１２Ｋ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）Ｄｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ糖（全てＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）であるが、これらに限定されない、機器を使用した熱サイクリングを含む。本方法で使用するための分光光度的サーマルサイクラーの他の例としては、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱ（商標）、Ｃｅｐｈｅｉｄ ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）ＩＩ、Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ ３０００、Ｉｄａｈｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｒ．Ａ．Ｐ．Ｉ．Ｄ．（商標）、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｒｏｍｏ ４（商標）、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）２．０、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｍｘ３０００Ｐ（商標）、およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｍｘ４０００（商標）が挙げられるが、これらに限定されない。様々な機器が市販されており、本明細書に開示される方法との使用に好適であることが認識されるであろう。

【0157】

いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡ配列の逆転写および結果として生じるｃＤＮＡの増幅の両方が同じ反応混合物中で生じる逆転写－ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）が行われる。いくつかの実施形態では、ＲＴ－ＰＣＲは、二段階または多段階プロセスとして行われる。他の実施形態では、ＲＴ－ＰＣＲは、一段階で行われる（例えば、一段階ＲＴ－ＰＣＲ）。いくつかの実施形態では、ＲＴ－ＰＣＲ反応混合物は、増幅されたｃＤＮＡの検出も同じ反応混合物中で生じるように、検出可能な標識された標的特異的プローブをさらに含む。

【0158】

ある特定の実施形態では、増幅反応は、同じアッセイ条件下でおよび／または実質的に同時に並行して行われる複数または多数のシングルプレックス反応を含む。いくつかの実施形態では、増幅反応を並行して行うことにより、異なる増幅産物が形成される。ある特定の実施形態では、増幅反応を並行して行うことにより、１０～１０，０００個の異なる増幅産物が形成され得る。いくつかの実施形態では、増幅反応を並行して行うことにより、１０～１０００個の異なる増幅産物が形成され得る。ある特定の実施形態では、増幅反応を並行して行うことにより、１０～１００個の異なる増幅産物または１０～５０個の異なる増幅産物が形成され得る。

【0159】

ある特定の実施形態では、増幅反応は、多数の異なる標的核酸および／または多数の異なる増幅産物種が多数の異なるプライマーセットを使用して同時に増幅されるマルチプレックス増幅を含む。ある特定の実施形態では、多数のシングルプレックスまたは低プレックス反応（例えば、２プレックス、３プレックス、４プレックス、５プレックス、または６プレックス反応であるが、これらに限定されない）を含むマルチプレックス増幅反応およびシングルプレックス増幅反応が並行して行われる。

【0160】

本明細書に記載されるように、核酸を重合および／または増幅するための例示的な方法には、例えば、ポリメラーゼ媒介伸長反応が含まれる。例えば、ポリメラーゼ媒介伸長反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲまたはｑＰＣＲ）であり得る。他の実施形態では、核酸増幅反応は、シングルプレックスまたはマルチプレックスＰＣＲまたはｑＰＣＲ反応である。例えば、本明細書に記載の使用に好適な核酸を重合および／または増幅および検出するための例示的な方法は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイとして市販されている（例えば、全て参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第４，８８９，８１８号、同第５，０７９，３５２号、同第５，２１０，０１５号、同第５，４３６，１３４号、同第５，４８７，９７２号、同第５，６５８，７５１号、同第５，２１０，０１５号、同第５，４８７，９７２号、同第５，５３８，８４８号、同第５，６１８，７１１号、同第５，６７７，１５２号、同第５，７２３，５９１号、同第５，７７３，２５８号、同第５，７８９，２２４号、同第５，８０１，１５５号、同第５，８０４，３７５号、同第５，８７６，９３０号、同第５，９９４，０５６号、同第６，０３０，７８７号、同第６，０８４，尿検体１０２号、同第６，１２７，１５５号、同第６，１７１，７８５号、同第６，２１４，９７９号、同第６，２５８，５６９号、同第６，８１４，９３４号、同第６，８２１，７２７号、同第７，１４１，３７７号、および／または同第７，４４５，９００号を参照のこと）。ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイは、典型的には、５’から３’へのヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる少なくとも１つのプライマー、およびプライマーに対して３’側の標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブを使用して、標的ポリヌクレオチド上で核酸増幅を行うことによって行われる。オリゴヌクレオチドプローブは、典型的には、検出可能な標識（例えば、蛍光レポーター分子）およびレポーター分子の蛍光をクエンチすることができるクエンチャー分子を含む。典型的には、検出可能な標識およびクエンチャー分子は、単一プローブの一部であるが、そうである必要はない。増幅が進むにつれて、ポリメラーゼはプローブを消化して、検出可能な標識をクエンチャー分子から分離する。検出可能な標識（例えば、蛍光）が反応中にモニタリングされ、標識の検出が核酸増幅の発生に相当する（例えば、シグナルが高いほど、増幅の量が多くなる）。ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイの変形（例えば、ＬＮＡ（商標）スパイクＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ）が当該技術分野で既知であり、本明細書に記載の方法での使用に好適であろう。

【0161】

ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイで使用されるプローブ等の５’－ヌクレアーゼプローブに加えて、様々なプローブが当該技術分野で既知であり、提供される方法での増幅された核酸の検出に好適である。例示的なプローブには、様々なステムループ分子ビーコン（例えば、米国特許第６，１０３，４７６号および同第５，９２５，５１７号、ならびにＴｙａｇｉ ａｎｄ Ｋｒａｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３０３－３０８（１９９６））、ステムレスまたは線状ビーコン（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／２１８８１号、米国特許第６，４８５，９０１号）、ＰＮＡ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ（商標）（例えば、米国特許第６，３５５，４２１号および同第６，５９３，０９１号）、線状ＰＮＡビーコン（例えば、Ｋｕｂｉｓｔａ ｅｔ ａｌ．，ＳＰＩＥ ４２６４：５３－５８（２００１））、非ＦＲＥＴプローブ（例えば、米国特許第６，１５０，０９７号）、Ｓｕｎｒｉｓｅ（登録商標）／Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ（登録商標）プローブ（米国特許第６，５４８，２５０号）、ステムループおよびデュプレックスＳｃｏｒｐｉｏｎｓ（商標）プローブ（Ｓｏｌｉｎａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２９：Ｅ９６（２００１）および米国特許第６，５８９，７４３号）、バルジループプローブ（米国特許第６，５９０，０９１号）、プソイドノットプローブ（米国特許第６，５８９，２５０号）、サイクリコン（米国特許第６，３８３，７５２号）、ＭＧＢ Ｅｃｌｉｐｓｅ（商標）プローブ（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヘアピンプローブ（米国特許第６，５９６，４９０号）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）ライトアッププローブ（Ｓｖａｎｖｉｋ，ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２８１：２６－３５（２０００））、自己集合ナノ粒子プローブ、フェロセン修飾プローブ（例えば、米国特許第６，４８５，９０１号、Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５：４６３－４７１（２００１）、Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１７：８０４－８０７（１９９９）、Ｉｓａｃｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ．１４：３２１－３２８（２０００）、Ｗｏｌｆｆｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７６６：７６９－７７１（２００１）、Ｔｓｏｕｒｋａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．３０：４２０８－４２１５（２００２）、Ｒｉｃｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０：４０８８－４０９３（２００２）、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）．３４：３２９－３３２（２００２）、Ｍａｘｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９６０６－９６１２（２００２）、Ｂｒｏｕｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：２４９－５６（２００２）、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１５：１１８－１２６（２００２）、およびＹｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１４：１１１５５－１１１６１（２００１）に記載のもの）、ＱｕａｎｔｉＰｒｏｂｅｓ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ）、ＨｙＢｅａｃｏｎｓ（登録商標）（Ｆｒｅｎｃｈ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ １５：３６３－３７４（２００１））、置換プローブ（Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：ｅ５（２００２））、ＨｙｂＰｒｏｂｅｓ（Ｃａｒｄｕｌｌｏ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：８７９０－８７９４（１９８８））、ＭＧＢ Ａｌｅｒｔ（ｗｗｗ．ｎａｎｏｇｅｎ．ｃｏｍ）、Ｑ－ＰＮＡ（Ｆｉａｎｄａｃａ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１１：６０９－６１１（２００１））、Ｐｌｅｘｏｒ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＬＵＸ（商標）プライマー（Ｎａｚａｒｅｎｋｏ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：ｅ３７（２００２））、ＤｚｙＮＡプライマー（Ｔｏｄｄ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４６：６２５－６３０（２０００））が挙げられるが、これらに限定されない。検出可能な標識プローブは、例えば、ブラックホールクエンチャー（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（商標）クエンチャー（ＩＤＴ）、ＱＳＹクエンチャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ならびにＤａｂｓｙｌおよびＤａｂｃｙｌスルホネート／カルボキシレートクエンチャー（Ｅｐｏｃｈ）を含む、検出可能な標識の蛍光をクエンチする検出不能なクエンチャー部分も含み得る。検出可能な標識プローブは、例えば、フルオロフォアが一方のプローブ上にあり、クエンチャーが他方のプローブ上にある、２つのプローブも含み得、これらの２つのプローブの標的上でのハイブリダイゼーションがシグナルをクエンチするか、標的上でのハイブリダイゼーションが蛍光の変化によりシグナル特性を変化させる。例示的な系には、ＦＲＥＴ、サリチル酸／ＤＴＰＡリガンド系（Ｏｓｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｎｇｌ．２９（１０）：１１６７（１９９０））、置換ハイブリダイゼーション、相同プローブ、および／または欧州特許第ＥＰ０７０６８５号および／または米国特許第６，２３８，９２７号に記載のアッセイも含まれ得る。検出可能な標識は、カルボキシレート基の代わりにＳＯ３を有するフルオレセイン色素のスルホン酸塩誘導体、フルオレセインのホスホロアミダイト形態、Ｃｙ５のホスホロアミダイト形態（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）も含み得る。上で引用される全ての参考文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0162】

本明細書で使用される場合、「検出可能な標識」という用語は、核酸合成および／または増幅を示す様々なシグナル伝達分子のうちのいずれかを指す。反応混合物は、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎおよび／または他のＤＮＡ結合色素等の検出可能な標識を含み得る。かかる検出可能な標識は、例えば、核酸インターカレート剤または非インターカレート剤を含み得るか、またはそれであり得る。本明細書で使用される場合、インターカレート剤は、二本鎖核酸分子の積み重ねられた塩基対間の非共有的挿入を可能にする薬剤または部分である。非インターカレート剤は、二本鎖核酸分子に挿入しないものである。核酸結合剤は、検出可能なシグナルを直接または間接的に生成し得る。シグナルは、例えば、蛍光および／または吸光度を直接使用して、または例えば、二本鎖核酸分子に対する近接性によって検出可能に影響される任意の部分またはリガンドを間接的に使用して、検出可能であり得る。本明細書で使用される場合、インターカレート剤は、二本鎖核酸分子の積み重ねられた塩基対間の非共有的挿入を可能にする薬剤または部分である。置換標識部分または核酸結合剤に結合した結合リガンド等の非インターカレート剤酸が好適である。典型的には、核酸結合剤は、同じ核酸結合剤が溶液中に存在するか、または一本鎖核酸に結合しているときに生成されたシグナルと区別可能であるように、二本鎖核酸に結合しているときに検出可能なシグナルを生成することが必要とされる。例えば、臭化エチジウム等のインターカレート剤は、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡに結合しているか、または溶液中に存在しているときよりも、二本鎖ＤＮＡにインターカレートされたときに強烈に蛍光を発する（例えば、米国特許第５，９９４，０５６号、同第６，１７１，７８５号、および／または同第６，８１４，９３４号）。同様に、アクチノマイシンＤは、一本鎖核酸に結合しているときにＵＶ／ＶＩＳスペクトルの赤色部分で蛍光を発し、二本鎖核酸に結合しているときにＵＶ／ＶＩＳスペクトルの緑色部分で蛍光を発する。さらに別の例では、光反応性ソラレンである４－アミノメチル－４－５’，８－トリメチルソラレン（ＡＭＴ）は、長波長で吸収の低下および二本鎖ＤＮＡへのインターカレーション時に蛍光を呈することが報告されている（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．＆Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．，３：７８５－７９１（１９８１）。例えば、米国特許第４，２５７，７７４号は、蛍光インターカレート剤のＤＮＡへの直接結合について記載している（例えば、エチジウム塩、ダウノマイシン、メパクリン、およびアクリジンオレンジ、４’，６－ジアミジノ－α－フェニルインドール）。非インターカレート剤（例えば、副溝結合剤部分（ＭＧＢ）、例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８、ジスタマイシン、ネトロプシンも、本明細書に記載の組成物、方法、およびキットとの使用に好適であり得る。例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８（Ｓｅａｒｌｅ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８（１３）：３７５３－３７６２（１９９０））は、標的核酸の量の増加に伴う蛍光の変化を呈する。

【0163】

本明細書に記載されるように、１つ以上の検出可能な標識および／またはクエンチ剤は、１つ以上のプライマーおよび／またはプローブ（例えば、検出可能な標識）に結合し得る。検出可能な標識は、遊離しているときまたは標的核酸のうちの１つに結合しているときにシグナルを放出し得る。検出可能な標識は、別の検出可能な標識に近接しているときにもシグナルを放出し得る。検出可能な標識は、シグナルがクエンチャー分子に十分にごく近接していないときにのみ検出可能であるように、クエンチャー分子とも使用され得る。例えば、いくつかの実施形態では、アッセイシステムは、検出可能な標識をクエンチ分子から遊離させ得る。いくつかの検出可能な標識のうちのいずれかを使用して、本明細書に記載の方法で使用されるプライマーおよびプローブを標識することができる。本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、プライマーに組み込まれ得るプローブに結合し得るか、またはさもなければ増幅された標的核酸（例えば、インターカレート色素または非インターカレート色素等の検出可能な核酸結合剤）に結合し得る。１つより多くの検出可能な標識を使用する場合、検出可能な標識が互いに区別され得るように、または検出可能な標識が一緒になっていずれかの検出可能な標識によって単独では放出されないシグナルを放出するように、各々のスペクトル特性が異なるはずである。例示的な検出可能な標識としては、例えば、蛍光色素またはフルオロフォア（例えば、光によって励起された蛍光またはリン光を放出することができる化学基）、蛍光ドナー色素からの蛍光シグナルをクエンチすることができる「アクセプター色素」等が挙げられる。好適な検出可能な標識には、当業者に既知であろうように、とりわけ、例えば、フルオレセイン（例えば、５－カルボキシ－２，７－ジクロロフルオレセイン、５－カルボキシフルオレセイン（５－ＦＡＭ）、５－ヒドロキシトリプタミン（５－ＨＡＴ）、６－ＪＯＥ、６－カルボキシフルオレセイン（６－ＦＡＭ）、ＦＩＴＣ、６－カルボキシ－１，４－ジクロロ－２’，７’－ジクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、６－カルボキシ－１，４－ジクロロ－２’，４’，５’，７’－テトラクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、６－カルボキシ－４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ（登録商標）フルオロフォア（例えば、３５０、４０５、４３０、４８８、５００、５１４、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６１０、６３３、６３５、６４７、６６０、６８０、７００、７５０）、ＢＯＤＩＰＹ（商標）フルオロフォア（例えば、４９２／５１５、４９３／５０３、５００／５１０、５０５／５１５、５３０／５５０、５４２／５６３、５５８／５６８、５６４／５７０、５７６／５８９、５８１／５９１、６３０／６５０－Ｘ、６５０／６６５－Ｘ、６６５／６７６、ＦＬ、ＦＬ ＡＴＰ、ＦＩ－セラミド、Ｒ６Ｇ ＳＥ、ＴＭＲ、ＴＭＲ－Ｘコンジュゲート、ＴＭＲ－Ｘ、ＳＥ、ＴＲ、ＴＲ ＡＴＰ、ＴＲ－Ｘ ＳＥ）、クマリン（例えば、７－アミノ－４－メチルクマリン、ＡＭＣ、ＡＭＣＡ、ＡＭＣＡ－Ｓ、ＡＭＣＡ－Ｘ、ＡＢＱ、ＣＰＭメチルクマリン、クマリンファロイジン、ヒドロキシクマリン、ＣＭＦＤＡ、メトキシクマリン）、カルセイン、カルセインＡＭ、カルセインブルー、カルシウム色素（例えば、カルシウムクリムゾン、カルシウムグリーン、カルシウムオレンジ、カルコフロールホワイト）、カスケードブルー、カスケードイエロー、ＣｙＴＭ色素（例えば、３、３．１８、３．５、５、５．１８、５．５、７）、シアンＧＦＰ、環状ＡＭＰフルオロセンサ（ＦｉＣＲｈＲ）、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ．ＥＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＢＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ）、ＦＲＥＴドナー／アクセプター対（例えば、フルオレセイン／テトラメチルローダミン、ＩＡＥＤＡＮＳ／フルオレセイン、ＥＤＡＮＳ／ダブシル、フルオレセイン／フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ／ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、フルオレセイン／ＱＳＹ７およびＱＳＹ９）、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）およびＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ（商標）（例えば、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｂｌｕｅ ＤＮＤ－２２、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｂｌｕｅ－Ｗｈｉｔｅ ＤＰＸ、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｙｅｌｌｏｗ ＨＣＫ－１２３、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＤＮＤ－２６、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｒｅｄ ＤＮＤ－９９、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ（商標）Ｂｌｕｅ ＤＮＤ－１６７、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＤＮＤ－１８９、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＤＮＤ－１５３、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ（商標）Ｙｅｌｌｏｗ／Ｂｌｕｅ ＤＮＤ－１６０、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ（商標）Ｙｅｌｌｏｗ／Ｂｌｕｅ １０，０００ＭＷデキストラン）、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（例えば、４８８、４８８－Ｘ、５００、５１４）、ローダミン（例えば、リアルタイムＰＣＲ検出システム１１０、１２３、Ｂ、Ｂ２００、ＢＢ、ＢＧ、Ｂ ｅｘｔｒａ、５－カルボキシテトラメチルローダミン（５－ＴＡＭＲＡ）、５ ＧＬＤ、６－カルボキシローダミン６Ｇ、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ、Ｐｈａｌｌｉｃｉｄｉｎｅ、Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎｅ、Ｒｅｄ、Ｒｈｏｄ－２、ＲＯＸ（６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン）、５－ＲＯＸ（カルボキシ－Ｘ－ローダミン）、Ｓｕｌｐｈｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ ｃａｎ Ｃ、Ｓｕｌｐｈｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇ Ｅｘｔｒａ、ＴＡＭＲＡ（６－カルボキシテトラメチルローダミン）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、ＷＴ）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ－Ｘ、ＶＩＣ、および他の標識（例えば、米国特許公開第２００９／０１９７２５４号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のもの）が含まれ得る。当業者に既知であろうように、他の検出可能な標識も使用され得る（例えば、米国特許公開第２００９／０１９７２５４号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。これらの系および検出可能な標識のうちのいずれか、ならびに多くの他のものを使用して、増幅された標的核酸を検出することができる。

【0164】

他のＤＮＡ結合色素が当業者に利用され得、単独で、またはアッセイシステムの他の薬剤および／または成分と組み合わせて使用され得る。例示的なＤＮＡ結合色素には、とりわけ、例えば、アクリジン（例えば、アクリジンオレンジ、アクリフラビン）、アクチノマイシンＤ（Ｊａｉｎ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６８：２１（１９７２））、アントラマイシン、ＢＯＢＯ（商標）－１、ＢＯＢＯ（商標）－３、ＢＯ－ＰＲＯ（商標）－１、クロモマイシン、ＤＡＰＩ（Ｋａｐｕｓｅｉｎｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．６（１１２）：３５１９（１９７９））、ダウノマイシン、ジスタマイシン（例えば、ジスタマイシンＤ）、色素（米国特許第７，３８７，８８７号に記載のもの）、エリプチシン、エチジウム塩（例えば、臭化エチジウム）、フルオロクマリン、蛍光インターカレート剤（米国特許第４，２５７，７７４号に記載のもの）、ＧｅｌＳｔａｒ（登録商標）（Ｌｏｎｚａ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８（Ｓｅａｒｌｅ ａｎｄ Ｅｍｂｒｅｙ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：３７５３－３７６２（１９９０））、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２、ホミジウム、ＪＯ－ＰＲＯ（商標）－１、ＬＩＺ色素、ＬＯ－ＰＲＯ（商標）－１、メパクリン、ミトラマイシン、ＮＥＤ色素、ネトロプシン、４’，６－ジアミジノ－α－フェニルインドール、プロフラビン、ＰＯＰＯ（商標）－１、ＰＯＰＯ（商標）－３、ＰＯ－ＰＲＯ（商標）－１、ヨウ化プロピジウム、ルテニウムポリピリジル、Ｓ５、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉ（米国特許第５，４３６，１３４号および同第５，６５８，７５１号）、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＩＩ、ＳＹＴＯＸ（登録商標）ｂｌｕｅ、ＳＹＴＯＸ（登録商標）ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯ（登録商標）４３、ＳＹＴＯ（登録商標）４４、ＳＹＴＯ（登録商標）４５、ＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｂｌｕｅ、ＴＯ－ＰＲＯ（登録商標）－１、ＳＹＴＯ（登録商標）１１、ＳＹＴＯ（登録商標）１３、ＳＹＴＯ（登録商標）１５、ＳＹＴＯ（登録商標）１６、ＳＹＴＯ（登録商標）２０、ＳＹＴＯ（登録商標）２３、チアゾールオレンジ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、ＴＯＴＯ（商標）－３、ＹＯ－ＰＲＯ（登録商標）－１、およびＹＯＹＯ（登録商標）－３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が含まれ得る。例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉ（例えば、米国特許第５，４３６，１３４号、同第５，６５８，７５１号、および／または同第６，５６９，９２７号）が、ＰＣＲ反応をモニタリングするために使用されている。当業者であれば理解するであろうように、他のＤＮＡ結合色素も好適であり得る。

【0165】

いくつかの態様では、検出可能な標識またはシグナルの検出は、フルオロフォアからの蛍光の変化を検出する任意の試薬または機器を使用して行われ得る。例えば、検出は、任意の分光光度的サーマルサイクラーを使用して行われ得る。分光光度的サーマルサイクラーの例としては、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢ）ＰＲＩＳＭ（登録商標）７０００、ＡＢ ７３００リアルタイムＰＣＲシステム、ＡＢ ７５００リアルタイムＰＣＲシステム、ＡＢ ＰＲＩＳＭ（商標）７９００ＨＴ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＩＣｙｃｌｅｒ ＩＱ（商標）、Ｃｅｐｈｅｉｄ ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）ＩＩ、Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ ３０００、Ｉｄａｈｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｒ．Ａ．Ｐ．Ｉ．Ｄ．（商標）、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｒｏｍｏ ４（商標）、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）２．０、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｍｘ３０００Ｐ（商標）、およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｍｘ４０００（商標）が挙げられるが、これらに限定されない。新たな機器が急速に開発されており、任意の同様の機器が本方法に使用され得ることに留意されたい。

【0166】

開示される核酸増幅反応で用いられ得る核酸ポリメラーゼは、例えば、原核生物、真菌、ウイルス、バクテリオファージ、植物、および／または真核生物核酸ポリメラーゼを含む、所望の反応を行うように機能する任意のものであり得る。本明細書で使用される場合、「ＤＮＡポリメラーゼ」という用語は、核酸鎖を鋳型として使用してＤＮＡ鎖をデノボ合成する酵素またはポリペプチドを指す。概して、ＤＮＡポリメラーゼは、既存のＤＮＡまたはＲＮＡをＤＮＡ合成の鋳型として使用し、それが適切なヌクレオチドの組み込みについて読む鋳型鎖に沿ってデオキシリボヌクレオチドの重合を触媒する。新たに合成されたＤＮＡ鎖は、鋳型鎖に相補的である。ＤＮＡポリメラーゼは、遊離ヌクレオチドを新たに生じた鎖の３’－ヒドロキシル末端のみに付加し得る。これは、ヌクレオシド一リン酸のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）から成長オリゴヌクレオチド鎖の３’－ヒドロキシル基への移行によりオリゴヌクレオチドを合成する。これにより、５’から３’への方向に新たな鎖が伸長する。ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ合成反応を開始するためにヌクレオチドを既存の３’－ＯＨ基のみに付加し得るため、ＤＮＡポリメラーゼは、第１のヌクレオチドを付加することができるプライマーを必要とする。好適なプライマーには、ＲＮＡもしくはＤＮＡのオリゴヌクレオチド、またはそれらのキメラ（例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡキメラプライマー）が含まれ得る。ＤＮＡポリメラーゼは、天然に存在するＤＮＡポリメラーゼまたは上述の活性を有する天然酵素の変異形であり得る。例えば、これには、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠くＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、またはエンドヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼが含まれ得る。

【0167】

本教示に従って使用されるポリメラーゼは、典型的には５’から３’への方向に核酸鋳型から核酸分子を合成することができる任意の酵素であり得る。好適な核酸ポリメラーゼには、ホロ酵素、ホロ酵素の機能的部分、キメラもしくは融合ポリメラーゼもしくはポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、または核酸分子の合成をもたらすことができる任意の修飾されたポリメラーゼも含まれ得る。本開示内で、ＤＮＡポリメラーゼには、ポリメラーゼ、末端トランスフェラーゼ、逆転写酵素、テロメラーゼ、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ、および／またはポリメラーゼ活性を有する任意のポリペプチドも含まれ得る。

【0168】

本明細書に開示される方法で使用される核酸ポリメラーゼは、中温性または好熱性であり得る。例示的な中温性ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ断片ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ等が挙げられる。ポリメラーゼの非限定的な例としては、例えば、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、真核生物ミトコンドリアＤＮＡポリメラーゼγ、原核生物ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、および／もしくはＶ、真核生物ポリメラーゼα、β、γ、δ、ε、η、ζ、ι、および／もしくはκ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩアルファおよび／もしくはエプシロンサブユニット、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩＶ、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼＶ、Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａポリメラーゼ、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅポリメラーゼ４、損傷乗り越え合成ポリメラーゼ、逆転写酵素、ならびに／またはテロメラーゼが挙げられ得る。使用され得る好適な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの非限定的な例としては、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａ（Ｔｎｅ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｔｍａ） ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（ＴｌｉまたはＶＥＮＴ（商標））ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｏｓｉｉ（Ｐｗｏ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｃａ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｌｆｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ（Ｓａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ（Ｔａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ（Ｔｆｌ／Ｔｕｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ（Ｔｒｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ（ＤＹＮＡＺＹＭＥ（商標））ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｍｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、マイコバクテリウムＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｔｂ、Ｍｌｅｐ）、ならびにそれらの突然変異体、変異形、および誘導体（米国特許第５，４３６，１４９号、米国特許第４，８８９，８１８号、米国特許第４，９６５，１８８号、米国特許第５，０７９，３５２号、米国特許第５，６１４，３６５号、米国特許第５，３７４，５５３号、米国特許第５，２７０，１７９号、米国特許第５，０４７，３４２号、米国特許第５，５１２，４６２号、ＷＯ９２／０６１８８、ＷＯ９２／０６２００、ＷＯ９６／１０６４０、Ｂａｒｎｅｓ，Ｇｅｎｅ １１２：２９－３５（１９９２）、Ｌａｗｙｅｒ，ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｍｅｔｈ．Ａｐｐｌ．２：２７５－２８７（１９９３）、Ｆｌａｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２（１５）：３２５９－３２６０（１９９４））が挙げられるが、これらに限定されない。Ｔ３、Ｔ５、およびＳＰ６等のＲＮＡポリメラーゼ、ならびにそれらの突然変異体、変異形、および誘導体も本教示に従って使用され得る。概して、任意のＩ型ＤＮＡポリメラーゼが本発明に従って使用され得るが、ＩＩＩ型またはファミリーＡ、Ｂ、Ｃ等のＤＮＡポリメラーゼを含むが、これらに限定されない他のＤＮＡポリメラーゼも使用され得る。加えて、任意の遺伝子操作されたＤＮＡポリメラーゼ、低下したまたはわずかな３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性を有する任意のもの（例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ）、および／または遺伝子操作されたＤＮＡポリメラーゼ（例えば、活性部位突然変異Ｆ６６７ＹまたはＦ６６７Ｙ等価物を有するもの（例えば、Ｔｔｈにおいて）、ＡｍｐｌｉＴａｑ（商標）ＦＳ、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（商標））、ＡｍｐｌｉＴａｑ（商標）Ｇｏｌｄ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（商標）Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｉ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＩ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＩＩ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｇａｍｍａ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、ならびに／またはそれらの任意の誘導体および断片が、本教示に従って使用され得る。３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠くＤＮＡポリメラーゼの例としては、Ｔａｑ、Ｔｎｅ（エキソ－）、Ｔｍａ（エキソ－）、Ｐｆｕ（エキソ－）、Ｐｗｏ（エキソ－）、およびＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにそれらの突然変異体、変異形、および誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。当業者であれば理解するであろうように、他の核酸ポリメラーゼも好適であり得る。

【0169】

本明細書に提供される方法、組成物、およびキットで使用するための酵素には、逆転写酵素活性を有する任意の酵素またはポリペプチドも含まれ得る。かかる酵素としては、レトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、Ｂ型肝炎逆転写酵素、カリフラワーモザイクウイルス逆転写酵素、細菌性逆転写酵素、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓａｉｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７－４９１（１９８８）、米国特許第４，８８９，８１８号および同第４，９６５，１８８号）、Ｔｎｅ ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ９６／１０６４０）、Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５，３７４，５５３号）、およびそれらの突然変異体、断片、変異形、または誘導体（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９４８，６１４号および同第６，０１５，６６８号を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。当業者であれば理解するであろうように、修飾された逆転写酵素および逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、当該技術分野で周知の組換えまたは遺伝子操作技法によって得られ得る。突然変異体逆転写酵素またはポリメラーゼは、例えば、部位特異的またはランダム突然変異誘発によって目的とする逆転写酵素またはポリメラーゼをコードする遺伝子（複数可）を突然変異させることによって得られ得る。かかる突然変異には、点突然変異、欠失突然変異、および挿入突然変異が含まれ得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の点突然変異（例えば、１つ以上のアミノ酸の１つ以上の異なるアミノ酸での置換）が、本発明で使用するための突然変異逆転写酵素またはポリメラーゼを構築するために使用される。逆転写酵素またはポリメラーゼの断片は、当該技術分野で周知の組換え技法による欠失突然変異、またはいくつかの周知のタンパク質分解酵素のうちのいずれかを使用した目的とする逆転写酵素（複数可）もしくはポリメラーゼ（複数可）の酵素消化によっても得られ得る。

【0170】

本明細書に提供される方法で使用するための逆転写酵素活性を有する例示的なポリペプチドには、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ－ＭＬＶ）逆転写酵素、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、ラウス関連ウイルス（ＲＡＶ）逆転写酵素、骨髄芽球症関連ウイルス（ＭＡＶ）逆転写酵素、およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）逆転写酵素、およびＷＯ９８／４７９２１に記載されるもの、ならびにそれらの誘導体、変異形、断片、または突然変異体、およびそれらの組み合わせが含まれる。さらなる実施形態では、逆転写酵素は、ＲＮａｓｅ Ｈ活性が低下または実質的に低下し、Ｍ－ＭＬＶ Ｈ－逆転写酵素、ＲＳＶ Ｈ－逆転写酵素、ＡＭＶ Ｈ－逆転写酵素、ＲＡＶ Ｈ－逆転写酵素、ＭＡＶ Ｈ－逆転写酵素、およびＨＩＶ Ｈ－逆転写酵素、ならびにそれらの誘導体、変異形、断片、または突然変異体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。特に興味の対象となる逆転写酵素には、ＡＭＶ ＲＴおよびＭ－ＭＬＶ ＲＴ、ならびに任意に低下したまたは実質的に低下したＲＮａｓｅ Ｈ活性を有するＡＭＶ ＲＴおよびＭ－ＭＬＶ ＲＴ（例えば、ＡＭＶ ＲＴアルファＨ－／ＢＨ＋およびＭ－ＭＬＶ ＲＴ Ｈ－）が含まれる。本発明で使用するための逆転写酵素には、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から入手可能なＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ（商標）、およびＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩが含まれる。概して、各々の全内容が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ９８／４７９２１、米国特許第５，２４４，７９７号、および同第５，６６８，００５号を参照されたい。

【0171】

本明細書に提供される方法で使用するための逆転写酵素活性を有するポリペプチドは、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）、Ｓｉｇｍａ（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、またはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．）から商業的に入手され得る。あるいは、逆転写酵素活性を有するポリペプチドは、当業者に周知の天然タンパク質を単離および精製するための標準手技に従ってそれらの天然ウイルスまたは細菌源から単離され得る（例えば、Ｈｏｕｔｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２９：５１７（１９７９）を参照のこと）。加えて、逆転写酵素活性を有するポリペプチドは、当業者が精通している組換えＤＮＡ技法によって調製され得る（例えば、Ｋｏｔｅｗｉｃｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：２６５（１９８８）、Ｓｏｌｔｉｓ ａｎｄ Ｓｋａｌｋａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３３７２－３３７６（１９８８）を参照のこと）。

【0172】

本明細書に開示される組成物、方法、およびキットで使用するためのＤＮＡポリメラーゼは、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から商業的に入手され得る。

【0173】

本明細書に記載の方法を行うためのキットも提供される。本明細書に記載の方法を行うための増幅対照核酸を含むキットも提供される。本明細書で使用される場合、「キット」という用語は、パッケージングされた関連成分、典型的には、１つ以上の化合物または組成物セットを指す。いくつかの実施形態では、本キットは、少なくとも１つの増幅対照核酸組成物を含み得、対照核酸由来の少なくとも１つの標的配列を重合および／または増幅するためのオリゴヌクレオチド対もしくはプライマー対、核酸ポリメラーゼ、および／または対照核酸の検出のための検出可能な標識で標識された対応する１つ以上のプローブをさらに含み得る。本キットは、プラスミド、または本明細書に記載のスーパープラスミド等の形態で少なくとも１つの増幅対照核酸分子を含む少なくとも１つの増幅対照核酸組成物を含み得、対照核酸分子由来の少なくとも１つの標的配列を重合および／または増幅するためのオリゴヌクレオチド対、核酸ポリメラーゼ、および／または対照核酸の検出のための検出可能な標識で標識された対応する１つ以上のプローブをさらに含み得る。本キットは、対照反応で使用される他の所定の標的核酸を含む試料も含み得る。本キットは、生物学的試料由来の少なくとも１つの標的核酸を重合および／または増幅するためのオリゴヌクレオチド対またはプライマー対も含み得る。本キットは、増幅反応を完了するために使用され得る原液、緩衝液、酵素、洗剤、増幅安定化成分、ＲＮａｓｅ阻害剤成分、増幅および／または検出に使用される検出可能な標識または他の試薬、管、膜等も任意に含み得る。いくつかの実施形態では、複数のプライマーセットが含まれる。一実施形態では、本キットは、例えば、１つ以上の容器内に提供される、緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ）、１つ以上の塩（例えば、ＫＣｌ）、グリセロール、ｄＮＴＰ（ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ、ｄＣ、ｄＵ）、組換えＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、色素（例えば、ＲＯＸ受動参照色素）、１つ以上の洗剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｂｒｉｊ－５８）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ゼラチン（例えば、魚もしくはウシ源）、および／または消泡剤のうちの１つ以上を含み得る。当業者であれば理解するであろう特定のシステムおよびキットの他の実施形態も企図される。

【0174】

いくつかの実施形態では、図１を参照して、核酸配列を増幅するためのワークフロー１００は、尿検体を収集することと、当業者が容易に利用することができ、かつ／または当業者に既知の任意のシステムまたは方法を使用して試料上で試料調製を行うこととを含む。いくつかの実施形態では、試料調製システムは、オープンアレイマイクロ流体プレートでのその後の利用のために、尿中の微生物細胞から核酸試料を抽出する。オープンアレイマイクロ流体プレートは、疎水性外部および親水性内部を各々含む複数の貫通孔を含む。貫通孔の内部は、増幅反応のために選択されたアッセイでスポットされている。調製された試料がオープンアレイマイクロ流体プレート上に装填されると、プレートの流動性特性により、各貫通孔内に等体積の試料が保持される。いくつかの実施形態では、オープンアレイマイクロ流体プレートが装填されると、それがリアルタイムＰＣＲまたは定量的ＰＣＲ検出システムに移されて、増幅反応を受ける。増幅反応中、いくつかの実施形態では、リアルタイム／定量的ＰＣＲ検出システムは、蛍光色素の検出によってアンプリコンの形成を検出する。蛍光色素の検出は、特定の貫通孔内で利用されるアッセイに対応する微生物の存在を示す。

【0175】

いくつかの実施形態では、図２を参照して、各が貫通孔を含むマイクロサブアレイを含む顕微鏡スライドサイズプレート等の反応容器２００が利用される。いくつかの実施形態では、各プレートは、３，０７２個の貫通孔または反応部位を含む。いくつかの実施形態では、各プレートは、６４個の貫通孔を有する４８個のサブアレイを含む。いくつかの実施形態では、各貫通孔は、直径３００μｍ、深さ３００μｍである。いくつかの実施形態では、貫通孔は各々、疎水性外部および親水性内部を含む。いくつかの実施形態では、親水性内部は、表１に列記されるアッセイ等のアッセイでスポットされる。いくつかの実施形態では、反応混合物は、表面張力により貫通孔内に保持される。

【0176】

いくつかの実施形態では、図３を参照して、核酸試料中の核酸配列を増幅するための方法３００は、核酸配列を含む試料源由来のアリコートを各々含む少なくとも５つの増幅反応混合物を形成することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、増幅プライマー対を各々含む少なくとも５つの異なるアッセイを使用し、これらのアッセイは、表１におけるアッセイ群から選択される。いくつかの実施形態では、本方法は、各増幅反応混合物を反応容器に適用する。いくつかの実施形態では、本方法は、この反応を増幅産物検出システムで利用する。いくつかの実施形態では、本方法は、増幅産物検出システムを動作させる。いくつかの実施形態では、増幅産物検出システムは、関連表において、反応容器上の増幅反応混合物の位置を、増幅反応混合物で利用されるアッセイＩＤのうちの１つ以上と関連付ける。いくつかの実施形態では、増幅産物検出システムは、増幅反応を反応容器上で行う。いくつかの実施形態では、増幅産物検出システムは、増幅反応中に反応容器上の１つ以上の位置内の標的核酸配列に対応する増幅産物を検出する。

【0177】

本教示がこれらの例示的な実施形態の観点で記載されているが、当業者であれば、過度の実験なしにこれらの例示的な実施形態の多数の変形および修正が可能であることを容易に理解するであろう。全てのかかる変形および修正は、本開示の範囲内である。本教示の態様は、以下の実施例に照らしてさらに理解され得、これらの実施例は、決して本開示の範囲を限定するもの解釈されるべきではない。

【実施例0178】

ＴａｑＭａｎ（商標）アッセイのパネルを、様々なＵＴＭに関連するシグネチャー遺伝子を標的とすることによって尿路微生物叢（ＵＴＭ）を検出および／またはプロファイルするように設計した。かかるアッセイのパネルを、膀胱、尿路、および泌尿生殖器領域に関連する病原微生物を含む１７個の異なる微生物種を区別するように設計した。パネルは、表１に列記されるアッセイを含む、微生物（細菌および／または真菌）を検出するためのアッセイを含む。表１に列記される１７種のうち、大半が幅広い細菌を網羅する細菌種である（グラム陰性１３個およびグラム陽性３個）。パネルは、１つの真菌標的も網羅した。表１に列記される微生物は全て、尿路の健康状態に密接に関連している。

【0179】

これらのパネルについて、蛍光標識アッセイを、図２に説明されるように、ハイスループットＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）プレート上にスポットした。表１に列記される各アッセイに特異的なアンプリコン配列を含むプラスミド（例えば、スーパープラスミド）も本明細書に記載のされるように設計および調製した。スーパープラスミドＤＮＡを、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）３Ｄ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使用したデジタルＰＣＲによって定量化した。表１に列記されるＵＴＭアッセイの全てのアンプリコンの合成配列を含むスーパープラスミドを構築し、陽性対照として使用した。包括性パネルおよび排他性パネルのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）対照をＡＴＣＣから購入した。パネルアッセイを、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）１２Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（商標）上でＴａｑＭａｎ（登録商標）ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（登録商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、合成スーパープラスミドおよび／またはＡＴＣＣゲノムＤＮＡ試料で評価した。アッセイパネルの評価のために使用したワークフローおよびシステムについては本明細書にさらに詳細に記載しており、図１および図３でも説明している。

【0180】

増幅対照核酸分子の場合、ＤＮＡ配列を設計し、対応するＤＮＡ分子を、上述のパネルにおける微生物特異的アッセイの全ての標的アンプリコンおよびそれらの隣接領域の一部、ならびにヒトＲＮａｓｅ Ｐ遺伝子配列由来の１００～２００個のヌクレオチド異種配列および配列断片を含むいくつかの対照鋳型を含むように合成した。下流線状化のための特有の制限部位も、標的アンプリコンおよびそれらの対応する５’隣接配列および３’隣接配列の各々の一部を含むＤＮＡ配列中に設計した。合成されたＤＮＡ分子を細菌プラスミドベクターにクローニングして、複数標的プラスミド（すなわち、スーパープラスミド）を作製した。これらの実施例では、スーパープラスミドを、表１に列記される１７個のアッセイのパネル（「ＵＴＭスーパープラスミド」）の標的配列を上述の他の対照配列とともに含むように設計した。スーパープラスミドのＥ．ｃｏｌｉへの形質転換およびその後のプラスミドＤＮＡ抽出後、プラスミドを制限酵素消化によって特有の制限部位で線状化し、プラスミド調製物を定量化した。線状化した対照プラスミド調製物を１×１０⁷コピー／マイクロリットルの最終濃度に正規化し、１×１０⁷コピー／マイクロリットルから１×１０²コピー／マイクロリットルの濃度に連続希釈し、下記の指示濃度で使用した。

【0181】

実施例１
線状化した対照プラスミド調製物の増幅を、上述の１７個の異なるＴａｑＭａｎ（商標）アッセイのパネルおよび２つの対照アッセイ（異種およびＲＮａｓｅ Ｐ）で事前にスポットしたＴａｑＭａｎ（商標）ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）プレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して試験した。各アッセイは、増幅プライマー対および検出可能な標識を有するオリゴヌクレオチドＴａｑＭａｎ（商標）プローブを含んだ。ＴａｑＭａｎ（商標）増幅プライマーおよびプローブを、表１に示されるアッセイごとに列記した対応する遺伝子に標的特異的であるように設計した。増幅反応を実行し、製造業者（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の指示に従ってＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）１２Ｋ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍで分析した。

【0182】

増幅前に、増幅対照プラスミド調製物を５ｌｏｇにわたって１０⁷コピー／マイクロリットルから１０²コピー／マイクロリットルに連続希釈した。サブアレイごとに、ＰＣＲ反応混合物を、２．５マイクロリットルの希釈対照プラスミド調製物を、製造業者の指示に従って、２．５マイクロリットルのＴａｑＭａｎ（商標）ＯｐｅｎＡｒｒａｙ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に添加することによって調製した。対照核酸試料を様々な濃度で有する５マイクロリットルのＰＣＲ反応混合物を、ＯｐｅｎＡｒｒａｙ Ａｃｃｕｆｉｌｌ Ｓｙｓｔｅｍを使用してＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）プレート上に装填し、製造業者の指示に従ってＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）１２Ｋ Ｆｌｅｘ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）上で実行した。４つの複製物を希釈ごとに実行した。

【0183】

試験した全てのアッセイが、少なくとも１００コピー／マイクロリットルまでの検出限界（ＬＯＤ）を示した。試験した異なるアッセイの各々で線状化した対照プラスミドを用いて良好なＰＣＲ感度を達成した。図４は、スーパープラスミド対照ＤＮＡをインプット試料として利用したアッセイの分析的感度を説明する。図４において、１０⁷コピー／μＬ原液から１０²コピー／μＬのアッセイの全ての鋳型を含むＵＴＭスーパープラスミドを用いて連続希釈を行った。図５は、原液、サブアレイ（５μＬ）または貫通孔（３３ｎＬ）あたりのＰＣＲ反応との関連でコピー／μＬを提示する選択肢を示す変換表を説明する。

【0184】

実施例２
図６および図７は、上述のオープンアレイ上での尿路微生物叢（ＵＴＭ）アッセイ（ＴａｑＭａｎ（商標）アッセイ）のダイナミックレンジを試験した研究からの実験結果を説明する。１：１０連続希釈を、５ｌｏｇにわたる１０⁷コピー／μＬから１０²コピー／μＬまでの原液からＵＴＭスーパープラスミドを用いて行った。ＰＣＲ反応を、２．５μＬの希釈対照プラスミドを６４個の貫通孔を含むサブアレイごとに２．５μＬのマスターミックスに混合することによってによって調製した。各サブアレイを５６個のアッセイでスポットし、各希釈を４つの複製物で実行した。図６は、標的／アッセイ毎の連続希釈液のＲ二乗および勾配を要約する。ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）プレート上で試験した異なるアッセイの各々で線状化対照プラスミドを用いて良好なＰＣＲ効率および再現性を達成した（図６）。図７は、散布図として示されるアッセイのうちの９つを説明する。各散布図について、Ｘ軸は、スーパープラスミド対照鋳型濃度（コピー／μＬ）のｌｏｇ₁₀であり、Ｙ軸は、各濃度でのＣｔ値である。図６および図７に示されるように、試験した全てのアッセイの検出限界（ＬＯＤ）は、希釈の少なくとも５ｌｏｇにわたって少なくとも１００コピー／マイクロリットルであり、０．９９超のＲ²を有した。まとめると、このデータは、少なくとも５ｌｏｇにわたって良好なダイナミックレンジを示し、強力かつ再現可能な線状性も示す。

【0185】

実施例３
表１に列記される１７個の異なるＵＴＭ ＴａｑＭａｎ（商標）アッセイのパネルを、試験した標的を含むＡＴＣＣ微生物培養物から購入したｇＤＮＡ試料のパネル（図８）および試験した標的を除くＡＴＣＣ微生物培養物から購入したｇＤＮＡ試料のパネル（図９）を使用して、それらの精度および特異度について評価した。ＡＴＣＣ ｇＤＮＡ試料を、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）３Ｄ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用したｄＰＣＲによって定量化した。図８および図９の両方において、各行は、表１に列記される対応する微生物の検出のために使用したＴａｑＭアッセイＩＤ番号を表す。図８において、列は、示される微生物由来の試験した標的を含む様々なＡＴＣＣ ｇＤＮＡ試料、および本明細書に記載されるように調製したスーパープラスミド核酸分子／陽性対照試料（最後の列）を含む各アッセイに使用した試料タイプを表す。図９において、列は、「ＮＴＣ」－鋳型なし対照／陰性対照試料（最初の列）、示される様々な微生物由来の試験した標的を除く様々なＡＴＣＣ ｇＤＮＡ試料、および本明細書に記載されるように調製したスーパープラスミド核酸分子／陽性対照試料（最後の列）を含む各アッセイに使用した試料タイプを表す。試験した全てのｇＤＮＡ試料を、ｄＰＣＲ読み出しに基づいて１０⁵コピー／μＬの濃度で使用した。図８および図９の両方において陽性対照として含んだＵＴＭスーパープラスミド（「ＳＰ－ＵＴＭ」）も１０⁵コピー／μＬの濃度で使用した。体積２．５μＬの各対照試料を２．５μＬのＴａｑＭａｎ（商標）ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と混合して、合計５μＬのＰＣＲ反応物を作製した。ＰＣＲ反応物を、全てのＵＴＭアッセイを上述のようにスポットしたＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）プレートの各サブアレイ上に装填した。ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）プレートを、製造業者の指示に従ってＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）１２ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で熱サイクルに供した。

【0186】

図８において、斜めの数字（破線縁）は、所望のオンターゲットのシグナルの４つの複製物の平均Ｃｔ値を表す。ランダムバックグラウンドノイズが図８および図９の両方に示されているが、通常は４つの複製物のうちの１つで検出した散発的シグナルであった。オンターゲットのシグナルとオフターゲットのシグナルとの間の大きなＣｔ差のため（１０超のΔＣｔ）、バックグラウンドＣｔ値が有意でないと決定した。示されるように、望ましいオンターゲット（精度）および有意ではないオフターゲット（特異度）で優れた性能が観察された。ＡＴＣＣ包括性パネルを使用して得たデータ（図８）は、優れた精度およびパネル内特異度を示し、ＡＴＣＣ排他性パネルを使用して得たデータ（図９）は、密接に関連した近縁種で高特異度を示す。

【0187】

実施例４
尿貯蔵研究試料を、製造業者の指示に従ってＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）プラットホーム上でＭａｇＭＡＸ（商標）Ｍｕｌｔｉ－Ｓａｍｐｌｅ Ｕｌｔｒａ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して処理した。その後、試料を、上述の標的特異的ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＵＴＭアッセイを使用したナノ流体ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（登録商標）ｑＰＣＲ技術によってスクリーニングした。尿試料から抽出したＤＮＡを、別個の独立した研究（「部位１ ｑＰＣＲ」および「部位２ ｑＰＣＲ」）（各々表１に列記されるアッセイのうちの１６個を使用し、１つのアッセイが部位間で異なった（＊Ｅ．Ｃｏｌｉ））下で、ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）プレートを２つの異なる時点／位置で使用して実行した。ＯｐｅｎＡｒｒａｙ上でのｑＰＣＲにおけるＵＴＭ ＴａｑＭアッセイを使用して指示された尿路病原体を有するものに対して陽性として特定された試料の数を図１０に示す（各微生物に対して第１および第２のバー）。

【0188】

加えて、尿試料を血液－寒天プレート上で２４時間培養し、ＣＦＵ／ｍＬを試料ごとに計数した。その後、尿路病原体を、製造業者の指示に従ってＶｉｔｅｋ－２（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ）プラットホームを使用して特定した。培養法を使用して指示された尿路病原体を含むものに対して陽性と特定された尿試料の数を図１０に示す（各微生物に対して第３のバー）。図１０が示すように、ｑＰＣＲ結果は、本明細書に記載のＵＴＭ ＴａｑＭアッセイを使用して異なる位置で行った２つの別個のｑＰＣＲ研究間で高度に再現性のあるものであり、９７％超の一致であった。しかしながら、ｑＰＣＲと比較して培養物との一致は低かった（例えば、８０％未満）。このデータは、ｑＰＣＲ ＵＴＭ ＴａｑＭアッセイが従来の培養に基づく方法よりも多くの尿路病原体を特定することができたことをさらに示す。

【0189】

図１１において、培養法を使用して一組の尿試料を試験し、陽性または陰性のいずれかとして印付けた。少なくとも１つの病原体の同一性を有し、かつ１０＾５ＣＦＵ／ｍＬ以上の著しい増殖を示した各試料を培養陽性として印付けた（図１１の第２の列を参照のこと）。著しい増殖が存在しなかった場合（１０＾５ＣＦＵ／ｍＬ以下）またはマイクロデータが入手不能であった場合、培養試料を培養陰性として印付けた。数個の追加の試料が著しい増殖を示したが、これらも培養陰性として印付けた。これは、２つより多くの生物が存在した場合の培養制限に起因し、混合フローラを適切に区別することおよび／またはそれらを陽性培養と特定すること（混入培養に対して）が不可能であった。このような場合、２つより多くの生物が存在する（すなわち、「混合フローラ」を有する）ため、検尿結果は決定的でないまたは特定不能であると見出され、培養陰性としてカテゴリー化した。その後、陽性および陰性培養結果を、本明細書に記載され、かつ上の表１に列記されるＵＴＭ ＴａｑＭアッセイを使用したＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）プレートを使用して同じ尿試料について得た結果と比較した（図１１の「培養およびｑＰＣＲ陽性」対「ｑＰＣＲ陽性のみ」を参照のこと）。

【0190】

ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）プレート上で行ったｑＰＣＲから得た結果を、特定された様々な病原体の平均Ｃ_T値（３つの技術的複製物の平均）として示す（図１１の強調表示した四角形を参照のこと）。培養結果と一致したｑＰＣＲ試料結果を濃い灰色で強調表示している。培養結果と一致したｑＰＣＲ結果を薄い灰色で強調表示している。

【0191】

いくつかの培養不一致試料（すなわち、ｑＰＣＲにより陽性および培養増殖に対して陰性を示した試料のサブセットを、サンガーシーケンシング法を使用してさらに検証した。配列決定結果は、試験した各試料についてＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）ｑＰＣＲを使用して得た結果と１００％一致した（図１２を参照のこと）。これらの実験からの結果は、本明細書に記載のＵＴＭアッセイパネルを使用したＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）ｑＰＣＲの感度が、尿路微生物を特定および／または検出するための従来の培養法を使用した場合よりも高いことを示唆する。

【0192】

図１３Ａおよび図１３Ｂは、従来の培養法または表１のＵＴＭ ＴａｑＭアッセイを使用して尿路病原体に対して陽性または陰性のいずれかと特定された試料の数の一致をさらに説明する。真の陽性と真の陰性（増殖なし）の一致は、９５．８％であった（図１３Ａを参照のこと）。ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）ナノ流体プラットホーム上でのｑＰＣＲアッセイにより、培養法によって特定された全ての陽性試料が陽性であることを確認した。

【0193】

培養陰性試料を観察および制限に基づいて異なるコアテゴリーに分けた。ＵＴＭ ＴａｑＭアッセイのパネルを使用したｑＰＣＲは、従来の培養法よりも多くの尿路病原体を特定することができ、それ故に、全培養陰性試料の不一致は高かった（図１３Ｂを参照のこと）。

【0194】

まとめると、このデータは、本明細書に提示されるＵＴＭ ＴａｑＭアッセイを使用したＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）ｑＰＣＲが「ゴールドスタンダード」培養データと比較して感度が高く、正確であることを示す。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【手続補正書】

【提出日】2023-09-12

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

核酸増幅のためのアレイであって、
複数の反応部位を含む支持体であって、前記複数の反応部位が前記支持体内または前記支持体上に位置する、支持体を含み、
前記複数の反応部位が各々、
（ｉ）複数の異なる標的配列を含む対照核酸分子と、
（ｉｉ）対応する標的配列またはその相補体を増幅するように構成された増幅プライマー対と、
（ｉｉｉ）前記対の前記増幅プライマーのうちの少なくとも１つの伸長によって生成される核酸配列にハイブリダイズするように構成された検出可能な標識プローブと、を含み、
前記複数の異なる標的配列の少なくとも２つが、表１において特定されている１９個の微生物遺伝子標的領域から選択される配列の少なくとも一部を含み、
前記検出可能な標識プローブが、５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによる切断を受けるように構成されている、アレイ。

【請求項2】

前記微生物遺伝子標的領域から選択される配列の前記少なくとも一部が、少なくとも５６ヌクレオチド部分である、請求項１に記載のアレイ。

【請求項3】

前記反応部位のうちの少なくとも１つが増幅産物を含む、請求項１に記載のアレイ。

【請求項4】

前記支持体が、異なる増幅産物を含む１０～１０，０００個の反応部位を含む、請求項１に記載のアレイ。

【請求項5】

前記反応部位のうちの少なくとも２つが各々、異なる対応する標的配列を増幅するように構成された増幅プライマー対を含む、請求項１に記載のアレイ。

【請求項6】

核酸増幅のためのアレイであって、
複数の反応部位を含む支持体であって、前記複数の反応部位が前記支持体内または前記支持体上に位置する、支持体を含み、
前記複数の反応部位が各々、
（ｉ）複数の異なる標的配列を含む対照核酸分子と、
（ｉｉ）対応する標的配列またはその相補体を増幅するように構成された増幅プライマー対と、
（ｉｉｉ）前記対の前記増幅プライマーのうちの少なくとも１つの伸長によって生成される核酸配列にハイブリダイズするように構成された検出可能な標識プローブと、を含み、
前記複数の異なる標的配列の少なくとも２つが、表１において受入番号NZ_ANAV01000004.1、NZ_ANAV01000001.1、CP008823.1、HF558530.1、CP015843.2、CP020358.1、CP007727.1、CP017082.1、JPIX01000006.1、NZ_DS607663.1、CP006831.1、AP008934.1、CP010319.1及びAY884203.1として特定されている微生物遺伝子標的領域から選択される配列の少なくとも一部を含み、
前記検出可能な標識プローブが、５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによる切断を受けるように構成されている、アレイ。

【請求項7】

前記微生物遺伝子標的領域から選択される配列の前記少なくとも一部が、少なくとも５６ヌクレオチド部分である、請求項６に記載のアレイ。

【請求項8】

前記反応部位のうちの少なくとも１つが増幅産物を含む、請求項６に記載のアレイ。

【請求項9】

前記支持体が、異なる増幅産物を含む１０～１０，０００個の反応部位を含む、請求項６に記載のアレイ。

【請求項10】

前記反応部位のうちの少なくとも２つが各々、異なる対応する標的配列を増幅するように構成された増幅プライマー対を含む、請求項６に記載のアレイ。

【請求項11】

核酸増幅のためのアレイであって、
複数の反応部位を含む支持体であって、前記複数の反応部位が前記支持体内または前記支持体上に位置する、支持体を含み、
前記複数の反応部位が各々、
（ｉ）複数の異なる標的配列を含む対照核酸分子と、
（ｉｉ）対応する標的配列またはその相補体を増幅するように構成された増幅プライマー対と、
（ｉｉｉ）前記対の前記増幅プライマーのうちの少なくとも１つの伸長によって生成される核酸配列にハイブリダイズするように構成された検出可能な標識プローブと、を含み、
前記複数の異なる標的配列の少なくとも２つが、表１において特定されている１９個の微生物遺伝子標的領域から選択される配列の少なくとも一部を含み、
前記アレイが、前記少なくとも２つの標的配列の検出のためのサンガーシーケンシング法によって得られた結果と少なくとも８０％一致する、前記少なくとも２つの標的配列の検出のための検尿結果を提供し、
前記検出可能な標識プローブが、５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによる切断を受けるように構成されている、アレイ。

【請求項12】

前記微生物遺伝子標的領域から選択される配列の前記少なくとも一部が、少なくとも５６ヌクレオチド部分である、請求項１１に記載のアレイ。

【請求項13】

前記反応部位のうちの少なくとも１つが増幅産物を含む、請求項１１に記載のアレイ。

【請求項14】

前記支持体が、異なる増幅産物を含む１０～１０，０００個の反応部位を含む、請求項１１に記載のアレイ。

【請求項15】

前記反応部位のうちの少なくとも２つが各々、異なる対応する標的配列を増幅するように構成された増幅プライマー対を含む、請求項１１に記載のアレイ。

【請求項16】

前記少なくとも２つの標的配列の検出のためのサンガーシーケンシング法によって得られた結果と少なくとも９０％一致する、前記少なくとも２つの標的配列の検出のための検尿結果を提供する、請求項１１に記載のアレイ。

【請求項17】

前記少なくとも２つの標的配列の検出のためのサンガーシーケンシング法によって得られた結果と少なくとも９５％一致する、前記少なくとも２つの標的配列の検出のための検尿結果を提供する、請求項１１に記載のアレイ。

【請求項18】

前記少なくとも２つの標的配列の検出のためのサンガーシーケンシング法によって得られた結果と少なくとも９９％一致する、前記少なくとも２つの標的配列の検出のための検尿結果を提供する、請求項１１に記載のアレイ。

【請求項19】

前記少なくとも２つの標的配列に関連する病原体の培養に基づく検出によって得られた結果より少なくとも２０％感度が高い、前記少なくとも２つの標的配列の検出のための検尿結果を提供する、請求項１に記載のアレイ。

【請求項20】

前記少なくとも２つの標的配列に関連する病原体の培養に基づく検出によって得られた結果より少なくとも２０％正確な、前記少なくとも２つの標的配列の検出のための検尿結果を提供する、請求項１に記載のアレイ。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１９４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0194】

まとめると、このデータは、本明細書に提示されるＵＴＭ ＴａｑＭアッセイを使用したＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）ｑＰＣＲが「ゴールドスタンダード」培養データと比較して感度が高く、正確であることを示す。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕核酸試料中の複数の核酸配列を増幅するための方法であって、
各々が一対の増幅プライマーを含む少なくとも５つの異なるアッセイを使用して、各々が複数の核酸配列を含む試料源由来の一定分量を含む少なくとも５つの増幅反応混合物を形成することであって、前記アッセイが表１におけるアッセイの群から選択される、形成することと、
各増幅反応混合物を反応容器に適用することと、
前記反応容器上で複数の増幅反応を行うことと、
前記複数の増幅反応中に前記反応容器上の１つ以上の場所内の標的核酸配列に対応する増幅産物を検出することと、を含む、方法。
〔２〕前記反応を増幅産物検出システムで利用することと、
前記増幅産物検出システムを動作させて、
任意に関連表を使用して、前記反応容器上の前記増幅反応混合物の場所を、前記増幅反応混合物で利用されるアッセイＩＤのうちの１つ以上と関連付けることと、をさらに含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記反応容器が、複数のウェルを有するプレートである、前記〔１〕に記載の方法。
〔４〕前記反応容器がアレイである、前記〔１〕に記載の方法。
〔５〕前記反応容器がオープンアレイプレートである、前記〔１〕に記載の方法。
〔６〕前記反応容器がチップマイクロアレイである、前記〔１〕に記載の方法。
〔７〕表１におけるアッセイの群から選択される少なくとも１０個の異なるアッセイを使用して、各々が複数の核酸配列を含む試料源由来の一定分量を含む少なくとも１０個の増幅反応混合物を形成する、前記〔１〕に記載の方法。
〔８〕表１におけるアッセイの群から選択される少なくとも１５個の異なるアッセイを使用して、各々が複数の核酸配列を含む試料源由来の一定分量を含む少なくとも１５個の増幅反応混合物を形成する、前記〔１〕に記載の方法。
〔９〕表１におけるアッセイのうちの１７個を使用して、各々が複数の核酸配列を含む試料源由来の一定分量を含む反応混合物を形成する、前記〔１〕に記載の方法。
〔１０〕前記試料源が尿検体である、前記〔１〕に記載の方法。
〔１１〕前記増幅産物が、５６～１０５ヌクレオチド長のアンプリコンを有する前記核酸試料の標的アンプリコンを含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔１２〕アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０８４＿ｓ１が、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの遺伝子の注釈を付けられていない領域の核酸配列の一部を標的とする一対のプライマーを含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔１３〕アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０８８＿ｓ１が、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉのクピンスーパーファミリー遺伝子であるシュウ酸デカルボキシラーゼ／古細菌ホスホグルコースイソメラーゼＣＯＧ２１４０の核酸配列の一部を標的とする一対のプライマーを含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔１４〕アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０８０＿ｓ１が、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ（別名、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）のピリドキサールリン酸依存性ヒスチジンデカルボキシラーゼ（ｈｄｃ）遺伝子の核酸配列の一部を標的とする一対のプライマーを含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔１５〕アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０８７＿ｓ１が、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅの遺伝子の仮説タンパク質の核酸配列の一部を標的とする一対のプライマーを含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔１６〕アッセイＩＤ Ｂａ０４６４６２４７＿ｓ１が、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓのアミノトランスフェラーゼクラスＶ遺伝子の核酸配列の一部を標的とする一対のプライマーを含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔１７〕アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０８６＿ｓ１が、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍのＰｈｎＢ－ＭｅｒＲファミリー転写調節因子遺伝子の核酸配列の一部を標的とする一対のプライマーを含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔１８〕アッセイＩＤ Ｂａ０４６４６２４２＿ｓ１が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＣＯＧ０７８９ Ｄｎａ結合転写調節因子ＭｅｒＲファミリー（Ｚｎｔｒ）遺伝子の核酸配列の一部を標的とする一対のプライマーを含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔１９〕アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０７９＿ｓ１が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａのｐａｒＣ（ＤＮＡトポイソメラーゼＩＶサブユニットＡ）遺伝子の核酸配列の一部を標的とする一対のプライマーを含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔２０〕アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０８３＿ｓ１が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのａｃｔ様タンパク質遺伝子の核酸配列の一部を標的とする一対のプライマーを含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔２１〕アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０７８＿ｓ１が、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉのＦｅ２＋輸送系タンパク質ＦｅｏＡ遺伝子ＣＯＧ１９１８の核酸配列の一部を標的とする一対のプライマーを含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔２２〕アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０７６＿ｓ１が、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓのｕｒｅＲ遺伝子であるａｒａＣの核酸配列の一部を標的とする一対のプライマーを含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔２３〕アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０７７＿ｓ１が、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓのＳＵＭＦ１遺伝子の核酸配列の一部を標的とする一対のプライマーを含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔２４〕アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０８２＿ｓ１が、ラジカルＳＡＭスーパーファミリー、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｔｕａｒｔｉｉの推定鉄硫黄修飾タンパク質遺伝子であるスルファターゼ成熟酵素ＡｓｌＢ ＣＯＧ０６４１の核酸配列の一部を標的とする一対のプライマーを含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔２５〕アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０８１＿ｓ１が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのヘリックスターンヘリックスドメインタンパク質遺伝子であるＮ２９６＿１７６０の核酸配列の一部を標的とする一対のプライマーを含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔２６〕アッセイＩＤ Ｂａ０４９３２０８５＿ｓ１が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓのｃｄａＲ遺伝子の核酸配列の一部を標的とする一対のプライマーを含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔２７〕アッセイＩＤ Ｂａ０４６４６２７６＿ｓ１が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅのＳＩＰ遺伝子の核酸配列の一部を標的とする一対のプライマーを含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔２８〕アッセイＩＤ Ｆｎ０４６４６２３３＿ｓ１が、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓのＩＰＴ１遺伝子の核酸配列の一部を標的とする一対のプライマーを含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔２９〕核酸試料中の複数の核酸配列を増幅するための方法であって、
各々が複数の核酸配列を含む試料源由来の一定分量を含む複数の増幅反応混合物を形成することであって、前記試料源が尿検体である、形成することと、
前記複数の増幅反応混合物を反応容器に適用することであって、前記反応容器が、各々が表１における対応する標的領域位置および対応する標的領域サイズを有する異なる遺伝子を標的とする少なくとも５つのアッセイで構成されており、各アッセイが一対の増幅プライマーを含む、適用することと、
前記反応容器上で複数の増幅反応を行うことと、
前記複数の増幅反応中に前記反応容器上の場所内の標的核酸配列に対応する増幅産物を検出することと、を含む、方法。
〔３０〕前記反応容器を増幅産物検出システムで利用することと、
前記増幅産物検出システムを動作させて、
任意に関連表を使用して、前記反応容器上の前記増幅反応混合物の場所を、前記反応容器上で利用される前記アッセイのうちの１つ以上と関連付けることと、をさらに含む、前記〔２９〕に記載の方法。
〔３１〕前記反応容器が、複数のウェルを有するプレートである、前記〔２９〕に記載の方法。
〔３２〕前記反応容器がアレイである、前記〔２９〕に記載の方法。
〔３３〕前記反応容器がオープンアレイプレートである、前記〔２９〕に記載の方法。
〔３４〕前記反応容器がチップマイクロアレイである、前記〔２９〕に記載の方法。
〔３５〕前記反応容器が、各々が表１に列記される異なる遺伝子を標的とする少なくとも１０個のアッセイで構成されている、前記〔２９〕に記載の方法。
〔３６〕前記反応容器が、各々が表１に列記される異なる遺伝子を標的とする少なくとも１５個のアッセイで構成されている、前記〔２９〕に記載の方法。
〔３７〕前記反応容器が、表１に列記される遺伝子の各々を標的とするアッセイで構成されている、前記〔２９〕に記載の方法。
〔３８〕前記少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイが、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉにおける注釈を付けられていない領域に対応する遺伝子の９３であるアンプリコンを増幅する、前記〔２９〕に記載の方法。
〔３９〕前記少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイが、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉにおけるクピンスーパーファミリーであるシュウ酸デカルボキシラーゼ／古細菌ホスホグルコースイソメラーゼＣＯＧ２１４０に対応する遺伝子の１０３ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅する、前記〔２９〕に記載の方法。
〔４０〕前記少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイが、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ（別名、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）におけるピリドキサールリン酸依存性ヒスチジンデカルボキシラーゼ（ｈｄｃ）に対応する遺伝子の９８サイズのアンプリコンを増幅する、前記〔２９〕に記載の方法。
〔４１〕前記少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイが、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅにおける仮説タンパク質に対応する遺伝子の８８ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅する、前記〔２９〕に記載の方法。
〔４２〕前記少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイが、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓにおけるアミノトランスフェラーゼクラスＶに対応する遺伝子の９５ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅する、前記〔２９〕に記載の方法。
〔４３〕前記少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイが、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍにおけるＰｈｎＢ－ＭｅｒＲファミリー転写調節因子に対応する遺伝子の９８ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅する、前記〔２９〕に記載の方法。
〔４４〕前記少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおけるＣＯＧ０７８９ Ｄｎａ結合転写調節因子ＭｅｒＲファミリー（Ｚｎｔｒ）に対応する遺伝子の６３ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅する、前記〔２９〕に記載の方法。
〔４５〕前記少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイが、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａにおけるｐａｒＣ（ＤＮＡトポイソメラーゼＩＶサブユニットＡ）に対応する遺伝子の９３ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅する、前記〔２９〕に記載の方法。
〔４６〕前記少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイが、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅにおけるａｃｔ様タンパク質に対応する遺伝子の５６ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅する、前記〔２９〕に記載の方法。
〔４７〕前記少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイが、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉにおけるＦｅ２＋輸送系タンパク質ＦｅｏＡ ＣＯＧ１９１８に対応する遺伝子の９１ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅する、前記〔２９〕に記載の方法。
〔４８〕前記少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイが、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓにおけるｕｒｅＲであるａｒａＣに対応する遺伝子の１００ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅する、前記〔２９〕に記載の方法。
〔４９〕前記少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイが、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓにおけるＳＵＭＦ１に対応する遺伝子の７６ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅する、前記〔２９〕に記載の方法。
〔５０〕前記少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイが、ラジカルＳＡＭスーパーファミリー、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｔｕａｒｔｉｉにおける推定鉄硫黄修飾タンパク質であるスルファターゼ成熟酵素ＡｓｌＢ ＣＯＧ０６４１に対応する遺伝子の１００ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅する、前記〔２９〕に記載の方法。
〔５１〕前記少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａにおけるヘリックスターンヘリックスドメインタンパク質であるＮ２９６＿１７６０に対応する遺伝子の７０ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅する、前記〔２９〕に記載の方法。
〔５２〕前記少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓにおけるｃｄａＲに対応する遺伝子の８５ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅する、前記〔２９〕に記載の方法。
〔５３〕前記少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅにおけるＳＩＰに対応する遺伝子の６６ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅する、前記〔２９〕に記載の方法。
〔５４〕前記少なくとも５つのアッセイのうちの１つのアッセイが、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓにおけるＩＰＴ１に対応する遺伝子の１０５ヌクレオチド長のアンプリコンを増幅する、前記〔２９〕に記載の方法。
〔５５〕生物学的試料中の少なくとも１つの標的核酸の存在または不在を決定するための組成物であって、
少なくとも５つの異なる増幅プライマー対であって、前記対の前記プライマーが各々、表１における標的微生物の核酸配列の領域の全てまたは一部に特異的にハイブリダイズするように構成された標的ハイブリダイゼーション領域を含み、好適な条件下で前記プライマー対がアンプリコンを生成する、少なくとも５つの異なる増幅プライマー対と、
前記プライマー対によって生成された前記アンプリコンの領域の全てまたは一部に特異的にハイブリダイズするように構成された少なくとも５つの検出プローブと、を備える、組成物。
〔５６〕複数の異なる標的核酸配列を含む対照核酸分子をさらに備え、前記複数の標的核酸配列が表１における少なくとも５つの遺伝子に特異的である、前記〔５５〕に記載の組成物。
〔５７〕前記組成物が、アッセイのパネルまたはコレクションである、前記〔５５〕に記載の組成物。
〔５８〕前記アッセイのパネルまたはコレクションが、ＴａｑＭａｎアッセイのパネルまたはコレクションを含む、前記〔５７〕に記載の組成物。
〔５９〕前記少なくとも１つの標的核酸が、尿路感染症に関連する微生物のバイオマーカーである、前記〔５５〕に記載の組成物。
〔６０〕前記組成物が固体支持体を備える、前記〔５５〕に記載の組成物。
〔６１〕前記少なくとも５つの増幅プライマー対が前記固体支持体上の場所によって分離されている、前記〔６０〕に記載の組成物。
〔６２〕前記組成物が、少なくとも１０個の異なる増幅プライマー対を備え、前記対の前記プライマーが各々、表１における標的微生物の核酸配列の領域の全てまたは一部に特異的にハイブリダイズするように構成された標的ハイブリダイゼーション領域を含み、好適な条件下で前記プライマー対がアンプリコンを生成する、前記〔５５〕に記載の組成物。
〔６３〕前記組成物が、少なくとも１５個の異なる増幅プライマー対を備え、前記対の前記プライマーが各々、表１における標的微生物の核酸配列の領域の全てまたは一部に特異的にハイブリダイズするように構成された標的ハイブリダイゼーション領域を含み、好適な条件下で前記プライマー対がアンプリコンを生成する、前記〔５５〕に記載の組成物。
〔６４〕前記組成物が、少なくとも１７個の異なる増幅プライマー対を備え、前記対の前記プライマーが各々、表１における標的微生物の核酸配列の領域の全てまたは一部に特異的にハイブリダイズするように構成された標的ハイブリダイゼーション領域を含み、好適な条件下で前記プライマー対がアンプリコンを生成する、前記〔５５〕に記載の組成物。
〔６５〕Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド２０２１００～２０２８００に対応する領域内に位置する受入番号ＮＺ＿ＧＧ７０４５７４．１における７０１の核酸配列内にある、前記〔５５〕に記載の組成物。
〔６６〕Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド１３７４００～１３８２００に対応する領域内に位置する受入番号ＮＺ＿ＡＮＡＶ０１０００００４．１における８０１の核酸配列内にある、前記〔５５〕に記載の組成物。
〔６７〕Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ（別名、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）の標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド１１５８６００～１１５９４００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ０１４７４８．１における８０１の核酸配列内にある、前記〔５５〕に記載の組成物。
〔６８〕Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド３２７４０００～３２７４８００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ００８８２３．１における８０１の核酸配列内にある、前記〔５５〕に記載の組成物。
〔６９〕Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド１７６９１００～１７６９９００に対応する領域内に位置する受入番号ＨＦ５５８５３０．１における８０１の核酸配列内にある、前記〔５５〕に記載の組成物。
〔７０〕Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド１７３００～１８１００に対応する領域内に位置する受入番号ＮＺ＿ＧＬ４７６１３１．１における８０１の核酸配列内にある、前記〔５５〕に記載の組成物。
〔７１〕Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド４３３６０００～４３３６７００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ０１５８４３．２における７０１の核酸配列内にある、前記〔５５〕に記載の組成物。
〔７２〕Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド２８５１７００～２８５２６００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ０２０３５８．１における８０１の核酸配列内にある、前記〔５５〕に記載の組成物。
〔７３〕Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド２０９０００～２０９０８００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ００７７２７．１における８０１の核酸配列内にある、前記〔５５〕に記載の組成物。
〔７４〕Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド３７５８００～３７６６００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ００４３４５．１における８０１の核酸配列内にある、前記〔５５〕に記載の組成物。
〔７５〕Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド５８０２００～５８１０００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ０１７０８２．１における８０１の核酸配列内にある、前記〔５５〕に記載の組成物。
〔７６〕Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド１０２００～１０２８００に対応する領域内に位置する受入番号ＪＰＩＸ０１０００００６．１における８０１の核酸配列内にある、前記〔５５〕に記載の組成物。
〔７７〕Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｔｕａｒｔｉｉの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド４９３０００～４９３８００に対応する領域内に位置する受入番号ＮＺ＿ＤＳ６０７６６３．１における８０１の核酸配列内にある、前記〔５５〕に記載の組成物。
〔７８〕Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド１８５７６００～１８５８４００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ００６８３１．１における８０１の核酸配列内にある、前記〔５５〕に記載の組成物。
〔７９〕Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド２００４００～２０１０００に対応する領域内に位置する受入番号ＡＰ００８９３４．１における６０１の核酸配列内にある、前記〔５５〕に記載の組成物。
〔８０〕Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド４１０００～４１６００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ０１０３１９．１における６０１の核酸配列内にある、前記〔５５〕に記載の組成物。
〔８１〕Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド８００～１５００に対応する領域内に位置する受入番号ＡＹ８８４２０３．１における７０１の核酸配列内にある、前記〔５５〕に記載の組成物。
〔８２〕複数の増幅反応を評価するための核酸構築物であって、
複数の異なる標的核酸配列を含む対照核酸分子を含み、前記複数の標的核酸配列が、ＤＮＡプラスミドに挿入された表１における少なくとも５つの遺伝子に指向される、核酸構築物。
〔８３〕前記複数の標的核酸配列が、前記ＤＮＡプラスミド中の表１における遺伝子のうちの少なくとも１０個に指向される、前記〔８２〕に記載の核酸構築物。
〔８４〕前記複数の標的核酸配列が、前記ＤＮＡプラスミド中の表１における遺伝子のうちの少なくとも１５個に指向される、前記〔８２〕に記載の核酸構築物。
〔８５〕前記複数の標的核酸配列が、前記ＤＮＡプラスミド中の表１における遺伝子の各々に指向される、前記〔８２〕に記載の核酸構築物。
〔８６〕Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド２０２１００～２０２８００に対応する領域内に位置する受入番号ＮＺ＿ＧＧ７０４５７４．１における７０１の核酸配列内にある、前記〔８２〕に記載の核酸構築物。
〔８７〕Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド１３７４００～１３８２００に対応する領域内に位置する受入番号ＮＺ＿ＡＮＡＶ０１０００００４．１における８０１の核酸配列内にある、前記〔８２〕に記載の核酸構築物。
〔８８〕Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ（別名、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）の標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド１１５８６００～１１５９４００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ０１４７４８．１における８０１の核酸配列内にある、前記〔８２〕に記載の核酸構築物。
〔８９〕Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド３２７４０００～３２７４８００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ００８８２３．１における８０１の核酸配列内にある、前記〔８２〕に記載の核酸構築物。
〔９０〕Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド１７６９１００～１７６９９００に対応する領域内に位置する受入番号ＨＦ５５８５３０．１における８０１の核酸配列内にある、前記〔８２〕に記載の核酸構築物。
〔９１〕Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド１７３００～１８１００に対応する領域内に位置する受入番号ＮＺ＿ＧＬ４７６１３１．１における８０１の核酸配列内にある、前記〔８２〕に記載の核酸構築物。
〔９２〕Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド４３３６０００～４３３６７００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ０１５８４３．２における７０１の核酸配列内にある、前記〔８２〕に記載の核酸構築物。
〔９３〕Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド２８５１７００～２８５２６００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ０２０３５８．１における８０１の核酸配列内にある、前記〔８２〕に記載の核酸構築物。
〔９４〕Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド２０９０００～２０９０８００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ００７７２７．１における８０１の核酸配列内にある、前記〔８２〕に記載の核酸構築物。
〔９５〕Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド３７５８００～３７６６００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ００４３４５．１における８０１の核酸配列内にある、前記〔８２〕に記載の核酸構築物。
〔９６〕Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド５８０２００～５８１０００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ０１７０８２．１における８０１の核酸配列内にある、前記〔８２〕に記載の核酸構築物。
〔９７〕Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド１０２００～１０２８００に対応する領域内に位置する受入番号ＪＰＩＸ０１０００００６．１における８０１の核酸配列内にある、前記〔８２〕に記載の核酸構築物。
〔９８〕Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｔｕａｒｔｉｉの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド４９３０００～４９３８００に対応する領域内に位置する受入番号ＮＺ＿ＤＳ６０７６６３．１における８０１の核酸配列内にある、前記〔８２〕に記載の核酸構築物。
〔９９〕Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド１８５７６００～１８５８４００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ００６８３１．１における８０１の核酸配列内にある、前記〔８２〕に記載の核酸構築物。
〔１００〕Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド２００４００～２０１０００に対応する領域内に位置する受入番号ＡＰ００８９３４．１における６０１の核酸配列内にある、前記〔８２〕に記載の核酸構築物。
〔１０１〕Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド４１０００～４１６００に対応する領域内に位置する受入番号ＣＰ０１０３１９．１における６０１の核酸配列内にある、前記〔８２〕に記載の核酸構築物。
〔１０２〕Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの標的核酸配列が、ゲノムのヌクレオチド８００～１５００に対応する領域内に位置する受入番号ＡＹ８８４２０３．１における７０１の核酸配列内にある、前記〔８２〕に記載の核酸構築物。
〔１０３〕核酸試料中の複数の核酸配列を増幅するための方法であって、
複数の増幅反応を行うことであって、前記増幅反応が各々、核酸試料の一部と、各々が表１に記載の生物、ならびに対応するアンプリコンサイズ、領域、および受入番号に関連する標的核酸配列の群からの異なる標的核酸配列に対応する増幅産物を産生するように構成された一対の増幅プライマーとを含む、行うことと、
前記増幅反応から複数の異なる増幅産物を形成することと、
前記複数の異なる増幅産物のうちの少なくとも１つの存在または不在を決定することと、を含む、方法。
〔１０４〕前記複数の増幅反応を行うことであって、前記増幅反応のうちの少なくとも１０個が、核酸試料の一部と、各々が表１に記載の生物、ならびに対応するアンプリコンサイズ、領域、および／または受入番号に関連する標的核酸配列の前記群からの異なる標的核酸配列に対応する増幅産物を産生するように構成された一対の増幅プライマーを含む、行うことをさらに含む、前記〔１０３〕に記載の方法。
〔１０５〕前記複数の増幅反応を行うことであって、前記増幅反応のうちの少なくとも１５個が、核酸試料の一部と、各々が表１に記載の生物、ならびに対応するアンプリコンサイズ、領域、および／または受入番号に関連する標的核酸配列の前記群からの異なる標的核酸配列に対応する増幅産物を産生するように構成された一対の増幅プライマーを含む、行うことをさらに含む、前記〔１０３〕に記載の方法。
〔１０６〕前記複数の増幅反応を行うことであって、前記増幅反応の全てが、陰性対照を除いて、核酸試料の一部と、各々が表１に記載の生物、ならびに対応するアンプリコンサイズ、領域、および／または受入番号に関連する標的核酸配列の前記群からの異なる標的核酸配列に対応する増幅産物を産生するように構成された一対の増幅プライマーを含む、行うことをさらに含む、前記〔１０３〕に記載の方法。
〔１０７〕核酸試料中の複数の核酸配列を増幅するための方法であって、
（ａ）複数の増幅反応を行うことであって、前記増幅反応のうちの少なくとも５つが、核酸試料の一部と、前記標的核酸配列に対応する増幅産物を産生するように構成された一対の増幅プライマーとを含み、各標的核酸配列が、表１に記載の異なる遺伝子の増幅産物である、行うことと、
（ｂ）複数の異なる増幅産物を形成することと、
（ｃ）前記複数の異なる増幅産物のうちの少なくとも１つの存在または不在を決定することと、を含む、方法。
〔１０８〕前記増幅反応のうちの少なくとも５つが、表１に列記されるアッセイＩＤから選択される一対の増幅プライマーを含む、前記〔１０７〕に記載の方法。
〔１０９〕前記増幅反応のうちの少なくとも１０個が、表１に列記されるアッセイＩＤから選択される一対の増幅プライマーを含む、前記〔１０７〕に記載の方法。
〔１１０〕前記増幅反応のうちの少なくとも１５個が、表１に列記されるアッセイＩＤから選択される一対の増幅プライマーを含む、前記〔１０７〕に記載の方法。
〔１１１〕前記増幅反応のうちの１７個が、表１に列記されるアッセイＩＤから選択される一対の増幅プライマーを含む、前記〔１０７〕に記載の方法。
〔１１２〕複数の増幅反応を行い、前記増幅反応のうちの少なくとも１０個が、核酸試料の一部と、前記標的核酸配列に対応する増幅産物を産生するように構成された一対の増幅プライマーとを含み、前記標的核酸配列が、表１に列記される遺伝子の一部の増幅産物である、前記〔１０７〕に記載の方法。
〔１１３〕複数の増幅反応を行い、前記増幅反応のうちの少なくとも１５個が、核酸試料の一部と、前記標的核酸配列に対応する増幅産物を産生するように構成された一対の増幅プライマーとを含み、各前記標的核酸配列が、表１に記載の異なる遺伝子の増幅産物である、前記〔１０７〕に記載の方法。
〔１１４〕前記複数の増幅反応を行い、前記増幅反応のうちの１７個が、陰性対照を除いて、核酸試料の一部と、前記標的核酸配列に対応する増幅産物を産生するように構成された一対の増幅プライマーとを含み、各前記標的核酸配列が、表１に記載の異なる遺伝子の増幅産物である、前記〔１０７〕に記載の方法。
〔１１５〕前記増幅産物が５６～１０５ヌクレオチド長である、前記〔１０７〕に記載の方法。
〔１１６〕増幅産物を産生するように構成された前記増幅プライマーの少なくとも１つの対が、前記対応する標的核酸配列の一部に相補的なまたはそれと同一の核酸配列を含むプライマーを含む、前記〔１０７〕に記載の方法。
〔１１７〕前記増幅プライマーの少なくとも１つの対の前記対応する標的核酸配列が、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、無細胞ＤＮＡ、循環ＤＮＡ、またはｃＤＮＡ中に存在する核酸配列と同一のまたはそれに相補的な核酸配列を含む、前記〔１０７〕に記載の方法。
〔１１８〕前記対応する標的核酸配列が、標的微生物のゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、無細胞ＤＮＡ、循環ＤＮＡ、またはｃＤＮＡ中に存在するか、またはそれに由来する、前記〔１１７〕に記載の方法。
〔１１９〕前記標的微生物が表１に列記される微生物である、前記〔１１８〕に記載の方法。
〔１２０〕前記形成することが、１０～１０，０００個の異なる増幅産物を並行して形成することを含む、前記〔１０７〕に記載の方法。
〔１２１〕前記複数の増幅反応のうちの少なくとも２つが各々、異なる対応する標的核酸配列を増幅するように構成された一対の増幅プライマーを含む、前記〔１０７〕に記載の方法。
〔１２２〕前記対応する標的核酸配列が、表１に列記される遺伝子またはその対応するｃＤＮＡの核酸配列の一部を含む、前記〔１０７〕に記載の方法。
〔１２３〕前記遺伝子が、表１に列記される微生物中に存在する、前記〔１２２〕に記載の方法。
〔１２４〕前記複数の増幅反応が各々、５６～１０５ヌクレオチド長の増幅産物を産生するように構成された一組の増幅プライマーを含む、前記〔１０７〕に記載の方法。
〔１２５〕前記形成することが、表１に列記される遺伝子の一部に相補的なまたはそれと同一の核酸配列を含む１つ以上の増幅産物を形成することを含む、前記〔１０７〕に記載の方法。
〔１２６〕前記形成することが、表１に列記される微生物に由来する核酸試料を使用して、表１に列記される全ての遺伝子毎に別個の増幅産物を形成することを含む、前記〔１２５〕に記載の方法。
〔１２７〕前記形成することが、表１に列記される全ての微生物遺伝子毎に別個の増幅産物を形成することを含む、前記〔１２５〕に記載の方法。
〔１２８〕前記形成することが、表１に列記される微生物遺伝子のうちの少なくとも２つの任意の組み合わせ毎に別個の増幅産物を形成することを含む、前記〔１２５〕に記載の方法。
〔１２９〕前記複数の増幅反応のうちの１つ以上が、前記対応する標的核酸配列の一部と同一のまたはそれに相補的な配列を含む検出可能な標識プローブをさらに含む、前記〔１０７〕に記載の方法。
〔１３０〕少なくとも１つの増幅反応の前記検出可能な標識プローブが、５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによる切断を受けるように構成されている、前記〔１２９〕に記載の方法。
〔１３１〕少なくとも１つの増幅反応の前記検出可能な標識プローブが、その５’末端に蛍光標識およびその３’末端にクエンチャーを含む、前記〔１２９〕に記載の方法。
〔１３２〕前記検出可能な標識プローブが副溝結合剤（ＭＧＢ）部分をさらに含む、前記〔１２９〕に記載の方法。
〔１３３〕前記増幅反応のうちの少なくとも１つが、支持体内または支持体上に存在する個別の反応部位で生じ、前記支持体が１つ以上の個別の反応部位を含む、前記〔１０７〕に記載の方法。
〔１３４〕前記支持体が、マルチウェルプレート、マイクロ流体カード、および複数の貫通孔反応部位を含むプレートから選択される、前記〔１３３〕に記載の方法。
〔１３５〕前記個別の反応部位が、前記増幅プライマーのうちの１つ以上を含み、前記増幅することが、前記核酸試料の一部を前記個別の反応部位に分配することをさらに含む、前記〔１３３〕に記載の方法。
〔１３６〕前記個別の反応部位が、一対の増幅プライマーおよび核酸プローブを含有する溶液の乾燥堆積物を含み、前記プライマーも前記プローブもいずれも、表１に列記される遺伝子に由来する核酸配列を増幅するように構成されている、前記〔１３３〕に記載の方法。
〔１３７〕前記個別の反応部位が、前記核酸試料の前記一部が前記反応部位に分配される前または分配された後のいずれかに前記反応部位に分配されるポリメラーゼおよび／またはヌクレオチドをさらに含む、前記〔１３５〕に記載の方法。
〔１３８〕前記核酸試料が尿検体から調製される、前記〔１０７〕に記載の方法。
〔１３９〕前記複数の増幅反応を前記行うことの前に前記核酸試料を尿検体から調製することを含む、前記〔１０７〕に記載の方法。
〔１４０〕試料中の微生物核酸の存在を検出するための方法であって、
（ａ）核酸試料の一部を支持体内に位置する個別の反応チャンバに分配することと、
（ｂ）並行増幅反応を行い、少なくとも５つの増幅産物を各々個別の反応チャンバ内に形成することであって、各増幅反応が、微生物のゲノム中に存在するか、またはそれに由来する標的核酸配列に対応する増幅産物を産生するように構成された一対の増幅プライマーを含み、前記対応する標的核酸配列が、表１に列記される遺伝子またはその対応するｃＤＮＡの核酸配列の一部を含む、形成することと、
（ｃ）前記増幅産物が前記個別の反応チャンバのうちの１つ以上内に形成されたかを決定することと、を含む、方法。
〔１４１〕前記増幅反応のうちの少なくとも５つが、表１に列記されるアッセイＩＤから選択される一対の増幅プライマーを含む、前記〔１４０〕に記載の方法。
〔１４２〕前記増幅反応のうちの少なくとも１０個が、表１に列記されるアッセイＩＤから選択される一対の増幅プライマーを含む、前記〔１４０〕に記載の方法。
〔１４３〕前記増幅反応のうちの少なくとも１５個が、表１に列記されるアッセイＩＤから選択される一対の増幅プライマーを含む、前記〔１４０〕に記載の方法。
〔１４４〕前記増幅反応のうちの１７個が、表１に列記されるアッセイＩＤから選択される一対の増幅プライマーを含む、前記〔１４０〕に記載の方法。
〔１４５〕少なくとも１０個の増幅産物が前記並行増幅反応中に形成される、前記〔１４０〕に記載の方法。
〔１４６〕少なくとも１５個の増幅産物が前記並行増幅反応中に形成される、前記〔１４０〕に記載の方法。
〔１４７〕少なくとも１７個の増幅産物が前記並行増幅反応中に形成される、前記〔１４０〕に記載の方法。
〔１４８〕前記増幅産物が５６～１０５ヌクレオチド長である、前記〔１４０〕に記載の方法。
〔１４９〕前記決定することが、任意にリアルタイムで、検出可能な標識プローブの前記増幅産物へのハイブリダイゼーションを検出することを含む、前記〔１４０〕に記載の方法。
〔１５０〕前記標的核酸配列に対応する増幅産物を産生するように構成された前記増幅プライマーの少なくとも１つの対が、前記対応する標的核酸配列の一部に相補的なまたはそれと同一の核酸配列を含むプライマーを含む、前記〔１４０〕に記載の方法。
〔１５１〕前記増幅プライマーの少なくとも１つの対の前記対応する標的核酸配列が、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、無細胞ＤＮＡ、循環ＤＮＡ、またはｃＤＮＡ中に存在する核酸配列と同一のまたはそれに相補的な核酸配列を含む、前記〔１４０〕に記載の方法。
〔１５２〕前記対応する標的核酸配列が、標的微生物のゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、無細胞ＤＮＡ、循環ＤＮＡまたはｃＤＮＡ中に存在するか、またはそれに由来する、前記〔１５１〕に記載の方法。
〔１５３〕前記微生物が表１に列記される微生物である、前記〔１５２〕に記載の方法。
〔１５４〕前記形成することが、１０～１０，０００個の異なる増幅産物を並行して形成することを含む、前記〔１４０〕に記載の方法。
〔１５５〕前記増幅反応のうちの少なくとも２つが各々、異なる対応する標的核酸配列を増幅するように構成された一対の増幅プライマーを含む、前記〔１４０〕に記載の方法。
〔１５６〕前記遺伝子が、表１に列記される微生物中に存在する、前記〔１４０〕に記載の方法。
〔１５７〕前記増幅反応が各々、表１に列記される遺伝子の少なくとも一部を増幅するように構成された増幅プライマーを含む、前記〔１４０〕に記載の方法。
〔１５８〕前記形成することが、表１に列記される遺伝子の一部に相補的なまたはそれと同一の核酸配列を含む１つ以上の増幅産物を形成することを含む、前記〔１４０〕に記載の方法。
〔１５９〕前記複数の増幅反応が各々、５６～１０５ヌクレオチド長の増幅産物を産生するように構成された一組の増幅プライマーを含む、前記〔１４０〕に記載の方法。
〔１６０〕前記形成することが、表１に列記される微生物に由来する核酸試料を使用して、表１に列記される全ての遺伝子毎に別個の増幅産物を形成することを含む、前記〔１５８〕に記載の方法。
〔１６１〕前記形成することが、表１に列記される全ての微生物遺伝子毎に別個の増幅産物を形成することを含む、前記〔１５８〕に記載の方法。
〔１６２〕前記形成することが、表１に列記される微生物遺伝子のうちの少なくとも２つの任意の組み合わせ毎に別個の増幅産物を形成することを含む、前記〔１５８〕に記載の方法。
〔１６３〕前記複数の前記増幅反応のうちの１つ以上が、対応する標的核酸配列の一部と同一のまたはそれに相補的な配列を含む検出可能な標識プローブをさらに含む、前記〔１４０〕に記載の方法。
〔１６４〕少なくとも１つの増幅反応の前記検出可能な標識プローブが、５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによる切断を受けるように構成されている、前記〔１６３〕に記載の方法。
〔１６５〕少なくとも１つの増幅反応の前記検出可能な標識プローブが、その５’末端に蛍光標識およびその３’末端にクエンチャーを含む、前記〔１６３〕に記載の方法。
〔１６６〕前記検出可能な標識プローブが副溝結合剤（ＭＧＢ）部分をさらに含む、前記〔１６３〕に記載の方法。
〔１６７〕前記増幅反応のうちの少なくとも１つが、支持体内または支持体上に存在する個別の反応部位で生じ、前記支持体が１つ以上の個別の反応部位を含む、前記〔１４０〕の態様に記載の方法。
〔１６８〕前記支持体が、マルチウェルプレート、マイクロ流体カード、および複数の貫通孔反応部位を含むプレートから選択される、前記〔１６７〕に記載の方法。
〔１６９〕前記個別の反応部位が、前記増幅プライマーのうちの１つ以上を含み、前記増幅することが、前記核酸試料の一部を前記個別の反応部位に分配することをさらに含む、態様前記〔１４０〕に記載の方法。
〔１７０〕前記個別の反応チャンバが、一対の増幅プライマーおよび核酸プローブを含有する溶液の乾燥堆積物を含み、前記プライマーも前記プローブもいずれも、表１に列記される遺伝子に由来する核酸配列を増幅するように構成されている、前記〔１４０〕に記載の方法。
〔１７１〕前記個別の反応チャンバが、前記核酸試料の前記一部が前記反応部位に分配される前または分配された後のいずれかに前記個別の反応チャンバに分配されるポリメラーゼおよび／またはヌクレオチドをさらに含む、前記〔１７０〕に記載の方法。
〔１７２〕前記核酸試料が尿検体から調製される、前記〔１４０〕に記載の方法。
〔１７３〕前記分配することの前に前記核酸試料を尿検体から調製することを含む、前記〔１４０〕に記載の方法。
〔１７４〕核酸増幅のための支持体であって、
複数の反応部位を含む支持体であって、前記複数の反応部位が前記支持体内または前記支持体の表面上に位置する、支持体と、
前記反応部位のうちの少なくとも５つと、を含み、前記反応部位が、
（１）標的核酸配列に対応する増幅産物を産生するように構成された増幅プライマー対であって、前記増幅産物が表１における微生物に対応する、増幅プライマー対と、
（２）前記増幅産物にハイブリダイズするように構成された検出可能な標識プローブと、を含み、
前記少なくとも５つの前記反応部位が各々、異なる増幅プライマー対を対応する検出可能な標識プローブとともに含む、支持体。
〔１７５〕少なくとも１０個の前記反応部位を含み、前記少なくとも１０個の前記反応部位が各々、異なる増幅プライマー対を対応する検出可能な標識プローブとともに含む、前記〔１７４〕に記載の支持体。
〔１７６〕少なくとも１５個の前記反応部位を含み、前記少なくとも１５個の前記反応部位が各々、異なる増幅プライマー対を対応する検出可能な標識プローブとともに含む、前記〔１７４〕に記載の支持体。
〔１７７〕少なくとも１７個の前記反応部位を含み、前記少なくとも１７個の前記反応部位が各々、異なる増幅プライマー対を対応する検出可能な標識プローブとともに含む、前記〔１７４〕に記載の支持体。
〔１７８〕前記増幅産物が５６～１０５ヌクレオチド長である、前記〔１７４〕に記載の支持体。
〔１７９〕前記反応部位が各々、表１から選択される遺伝子の少なくとも一部または表１に列記される遺伝子の核酸誘導体を増幅するように構成された一対の増幅プライマーおよびプローブを含む、前記〔１７４〕に記載の支持体。
〔１８０〕前記反応部位が各々、表１に列記されるアッセイＩＤから選択される一対の増幅プライマーおよびプローブを含む、前記〔１７９〕に記載の支持体。
〔１８１〕少なくとも１つの反応部位の増幅プライマー対が、前記対応する標的核酸配列の一部に相補的なまたはそれと同一の核酸配列を含むプライマーを含む、前記〔１７９〕に記載の支持体。
〔１８２〕前記対応する標的核酸配列が、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、無細胞ＤＮＡ、循環ＤＮＡ、またはｃＤＮＡ中に存在する核酸配列と同一のまたはそれに相補的な核酸配列を含む、前記〔１８１〕に記載の支持体。
〔１８３〕前記対応する標的核酸配列が、標的微生物に由来するゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、無細胞ＤＮＡ、循環ＤＮＡまたはｃＤＮＡ中に存在するか、またはそれに由来する、前記〔１８２〕に記載の支持体。
〔１８４〕前記標的微生物が表１から選択される、前記〔１８３〕に記載の支持体。
〔１８５〕前記反応部位のうちの２つ以上が同じ核酸試料の一部を含む、前記〔１７４〕に記載の支持体。
〔１８６〕前記核酸試料が尿検体に由来する、前記〔１８５〕に記載の支持体。
〔１８７〕前記反応部位のうちの少なくとも１つが増幅産物を含む、前記〔１７４〕に記載の支持体。
〔１８８〕反応部位の前記増幅産物が、表１に列記される遺伝子の一部に相補的なまたはそれと同一の核酸配列を含む、前記〔１８７〕に記載の支持体。
〔１８９〕前記支持体が、異なる増幅産物を含む１０～１０，０００個の反応部位を含む、前記〔１７４〕に記載の支持体。
〔１９０〕前記支持体が、表１に列記される全ての遺伝子と同一のまたはそれに相補的な増幅産物を含む反応部位を含む、前記〔１８９〕に記載の支持体。
〔１９１〕前記反応部位のうちの少なくとも２つが各々、異なる対応する標的核酸配列を増幅するように構成された一対の増幅プライマーを含む、前記〔１７４〕に記載の支持体。
〔１９２〕前記対応する標的核酸配列が、表１に列記される遺伝子またはその対応するｃＤＮＡの核酸配列の一部を含む、前記〔１７４〕に記載の支持体。
〔１９３〕前記複数の反応部位が、表１に列記される微生物に由来する核酸試料を使用した表１に列記される全ての遺伝子の増幅産物を含む、前記〔１７４〕に記載の支持体。
〔１９４〕前記複数の反応部位が、表１に列記される少なくとも２つの微生物に由来する核酸試料を使用した表１に列記される遺伝子のうちの少なくとも２つの任意の組み合わせの増幅産物を含む、前記〔１７４〕に記載の支持体。
〔１９５〕前記反応部位のうちの少なくとも１つの前記検出可能な標識プローブが、５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによる切断を受けるように構成されている、前記〔１７４〕に記載の支持体。
〔１９６〕少なくとも１つの前記反応部位の前記検出可能な標識プローブが、その５’末端に蛍光標識およびその３’末端にクエンチャーを含む、前記〔１７４〕に記載の支持体。
〔１９７〕前記検出可能な標識プローブが副溝結合剤（ＭＧＢ）部分をさらに含む、前記〔１７４〕に記載の支持体。
〔１９８〕前記支持体が、マルチウェルプレート、マイクロ流体カード、および複数の貫通孔反応部位を含むプレートから選択される、前記〔１７４〕に記載の支持体。
〔１９９〕前記個別の反応部位のうちの１つ以上が、前記一対の増幅プライマーおよび前記検出可能な標識プローブを含有する溶液の乾燥堆積物を含む、前記〔１７４〕に記載の支持体。
〔２００〕前記個別の反応部位がポリメラーゼおよび／またはヌクレオチドをさらに含む、前記〔１７４〕に記載の支持体。
〔２０１〕前記個別の反応部位のうちの１つ以上が、前記一対の増幅プライマー、前記検出可能な標識プローブ、ポリメラーゼ、およびヌクレオチドを含む凍結乾燥組成物を含む、前記〔１７４〕に記載の支持体。
〔２０２〕前記増幅プライマー対および前記検出可能な標識プローブが、表１に列記されるアッセイのうちの１つに由来する、前記〔１７４〕に記載の支持体。
〔２０３〕生物学的試料中の表１に列記される微生物のうちの１つ以上由来の少なくとも１つの標的核酸の存在または不在を決定するための組成物であって、
（ａ）少なくとも１つの増幅プライマー対であって、前記対の前記プライマーが各々、前記標的核酸の領域の全てまたは一部に特異的にハイブリダイズするように構成された標的ハイブリダイゼーション領域を含み、好適な条件下で前記プライマー対が表１における遺伝子からアンプリコンを生成する、少なくとも１つの増幅プライマー対と、
（ｂ）前記プライマー対によって生成された前記アンプリコンの領域の全てまたは一部に特異的にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つの検出プローブと、を含む、組成物。
〔２０４〕前記アンプリコンが５６～１０５ヌクレオチド長である、前記〔２０３〕に記載の組成物。
〔２０５〕表１に列記される少なくとも１つのアッセイを含む、前記〔２０３〕に記載の組成物。
〔２０６〕バイオマーカーのパネルを検出するための一組のヌクレオチドプローブを含み、前記プローブがある遺伝子群のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ配列に相補的であり、前記遺伝子群が表１に列記される遺伝子の任意の組み合わせから選択されることを特徴とする、前記〔２０３〕に記載の組成物。
〔２０７〕前記一組のプローブが１～１７個の異なるプローブからなる、前記〔２０６〕に記載の組成物。
〔２０８〕前記遺伝子群が、表１に列記される遺伝子から選択される５つの異なる遺伝子からなる、前記〔２０６〕に記載の組成物。
〔２０９〕試料中の少なくとも５つの異なる標的核酸が増幅および検出され、前記標的核酸が表１に列記される５つの異なる微生物由来である、前記〔２０３〕に記載の組成物。
〔２１０〕前記５つの標的核酸が、表１に列記される前記５つの異なる微生物の各々について列記されたアッセイを使用して増幅および検出される、前記〔２０９〕に記載の組成物。
〔２１１〕前記遺伝子群が、表１に列記される遺伝子から選択される１０個の異なる遺伝子からなる、前記〔２０６〕に記載の組成物。
〔２１２〕試料中の少なくとも１０個の異なる標的核酸が増幅および検出され、前記標的核酸が表１に列記される１０個の異なる微生物由来である、前記〔２１１〕に記載の組成物。
〔２１３〕前記１０個の標的核酸が、表１に列記される前記１０個の異なる微生物の各々について列記されたアッセイを使用して増幅および検出される、前記〔２１２〕に記載の組成物。
〔２１４〕前記遺伝子群が、表１に列記される遺伝子から選択される１５個の異なる遺伝子からなる、前記〔２０６〕に記載の組成物。
〔２１５〕試料中の少なくとも１５個の異なる標的核酸が増幅および検出され、前記標的核酸が表１に列記される１５個の異なる微生物由来である、前記〔２１４〕に記載の組成物。
〔２１６〕前記１５個の標的核酸が、表１に列記される前記１５個の異なる微生物の各々について列記されたアッセイを使用して増幅および検出される、前記〔２１５〕に記載の組成物。
〔２１７〕前記遺伝子群が、表１に列記される遺伝子から選択される１７個の異なる遺伝子からなる、前記〔２０６〕に記載の組成物。
〔２１８〕試料中の少なくとも１７個の異なる標的核酸が増幅および検出され、前記標的核酸が表１に列記される１７個の異なる微生物由来である、前記〔２１７〕に記載の組成物。
〔２１９〕前記１７個の標的核酸が、表１に列記される前記１７個の異なる微生物の各々について列記されたアッセイを使用して増幅および検出される、前記〔２１８〕に記載の組成物。
〔２２０〕生物学的試料に関連するバイオマーカーのパネルをプロファイリングする方法であって、
（ａ）対象から前記生物学的試料を得ることと、
（ｂ）前記試料の少なくともいくらかの部分を少なくとも５つの個別の増幅反応と接触させることであって、前記個別の反応が各々、標的特異的プライマーセットおよびポリメラーゼを含む、接触させることと、
（ｃ）増幅産物を産生することができる増幅条件下で個別の反応あたり少なくとも１つの標的配列を増幅することと、
（ｃ）前記複数の個別の反応の各々を、前記標的特異的プライマーによって産生された前記増幅産物に特異的な検出可能な標識プローブと接触させることと、
（ｄ）前記複数の個別の増幅反応の各々における前記増幅産物の存在または不在を決定して、前記生物学的試料のバイオマーカープロファイルに達することであって、前記バイオマーカーが表１に列記される遺伝子に関連する、達することと、を含む、方法。
〔２２１〕少なくとも１０個の個別の増幅反応が、前記試料の前記少なくともいくらかの部分によって接触される、前記〔２２０〕に記載の方法。
〔２２２〕少なくとも１５個の個別の増幅反応が、前記試料の前記少なくともいくらかの部分によって接触される、前記〔２２０〕に記載の方法。
〔２２３〕少なくとも１７個の個別の増幅反応が、前記試料の前記少なくともいくらかの部分によって接触される、前記〔２２０〕に記載の方法。
〔２２４〕前記バイオマーカーが泌尿生殖器感染症および／または微生物叢に関連する、前記〔２２０〕に記載の方法。
〔２２５〕前記パネルが、１～１７個の異なるバイオマーカーセットを含む、前記〔２２０〕に記載の方法。
〔２２６〕前記複数の個別の増幅反応が固体支持体上にある、前記〔２２０〕に記載の方法。
〔２２７〕前記複数の個別の増幅反応が各々、表１から選択される単一のアッセイを含む、前記〔２２０〕に記載の方法。
〔２２８〕対照核酸分子を含む試料中の複数の標的核酸配列を増幅するための方法であって、
複数の増幅反応を並行して行うことであって、前記複数の増幅反応が各々、前記試料の一部と、前記対照核酸分子中の対応する標的配列を増幅するように構成された増幅プライマー対とを含み、前記対照核酸分子が複数の異なる標的配列を含む、行うことと、
前記対照核酸分子中の少なくとも２つの異なる標的配列に対応する複数の異なる増幅産物を形成することと、
前記増幅反応における少なくとも２つの異なる増幅産物の存在を決定することと、を含む、方法。
〔２２９〕前記対照核酸分子が、表１に記載の異なる微生物由来の少なくとも５つの異なる標的配列を含む、前記〔２２８〕に記載の方法。
〔２３０〕前記対照核酸分子が、表１に記載の異なる微生物由来の少なくとも１０個の異なる標的配列を含む、前記〔２２９〕に記載の方法。
〔２３１〕前記対照核酸分子が、表１に記載の異なる微生物由来の少なくとも１５個の異なる標的配列を含む、前記〔２３０〕に記載の方法。
〔２３２〕前記対照核酸分子が、表１に記載の異なる微生物由来の全ての異なる標的配列を含む、前記〔２２８〕に記載の方法。
〔２３３〕前記複数の異なる標的配列が、表１に記載の異なる微生物のゲノム配列またはトランスクリプトーム配列に由来する、前記〔２２８〕に記載の方法。
〔２３４〕前記複数の異なる標的配列が、表１から選択される任意の数の微生物遺伝子に由来する、前記〔２２８〕に記載の方法。
〔２３５〕前記形成することが、５～１００個の異なる増幅産物を並行して形成することを含む、前記〔２２８〕に記載の方法。
〔２３６〕前記形成することが、１０～５０個の異なる増幅産物を並行して形成することを含む、前記〔２３５〕に記載の方法。
〔２３７〕対応する標的配列を増幅するように構成された少なくとも１つの増幅プライマー対が、前記対応する標的配列の一部に相補的なまたはそれと同一の核酸配列を含むプライマーを含む、前記〔２２８〕に記載の方法。
〔２３８〕前記複数の増幅反応のうちの少なくとも２つが各々、異なる対応する標的配列を増幅するように構成された増幅プライマー対を含む、前記〔２２８〕に記載の方法。
〔２３９〕前記複数の増幅反応のうちの１つ以上の増幅反応が、前記対応する標的配列の一部と同一のまたはそれに相補的な配列を含む検出可能な標識プローブをさらに含む、前記〔２２８〕に記載の方法。
〔２４０〕少なくとも１つの増幅反応の前記検出可能な標識プローブが、５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによる切断を受けるように構成されている、前記〔２３９〕に記載の方法。
〔２４１〕少なくとも１つの増幅反応の前記検出可能な標識プローブが、その５’末端に蛍光標識およびその３’末端にクエンチャーを含む、前記〔１７〕に記載の方法。
〔２４２〕前記対照核酸分子がＤＮＡプラスミドである、前記〔２２８〕に記載の方法。
〔２４３〕前記ＤＮＡプラスミドが線状である、前記〔２４２〕に記載の方法。
〔２４４〕前記増幅反応を行うことの前に前記対照核酸分子を含む前記試料を細胞から調製することをさらに含む、前記〔２２８〕に記載の方法。
〔２４５〕対照核酸分子を含む試料中の複数の標的核酸配列を増幅するための方法であって、
前記試料を複数の反応体積に分配することであって、前記対照核酸分子が複数の異なる標的配列を含み、前記反応体積が、前記対照核酸分子中の対応する標的配列を増幅するように構成された少なくとも２つの異なる増幅プライマー対を含む、分配することと、
前記反応体積中で増幅反応を行い、前記対照核酸分子中の少なくとも２つの異なる標的配列に対応する複数の異なる増幅産物を形成することと、
前記増幅反応における少なくとも２つの異なる増幅産物の存在を決定することと、を含む、方法。
〔２４６〕複数の増幅反応を評価するための方法であって、
核酸試料の一部を支持体内または支持体上に位置する個別の反応チャンバに分配することであって、前記核酸試料が対照核酸分子を含み、前記対照核酸分子が複数の異なる標的配列を含む、分配することと、
複数の並行増幅反応を行い、前記対照核酸分子中の少なくとも２つの異なる標的配列に対応する複数の異なる標的増幅産物を前記個別の反応チャンバ内で形成することであって、
各増幅反応が、前記対照核酸分子中に存在する対応する標的配列を増幅するように構成された増幅プライマー対を含み、前記増幅反応のうちの少なくとも２つが、前記対照核酸分子中に存在する異なる対応する標的配列を増幅するように構成された増幅プライマーを含む、形成することと、
前記個別の反応チャンバのうちの少なくとも２つ内で形成された少なくとも２つの異なる標的増幅産物を定量化することと、を含む、方法。
〔２４７〕前記方法が、前記対照核酸分子の連続希釈液である一組の試料を使用して行われる、前記〔２４６〕に記載の方法。
〔２４８〕前記連続希釈された対照核酸分子由来の前記定量化された標的増幅産物に基づいて、前記対照核酸分子の標的配列のうちの少なくとも１つの検出限界を決定することをさらに含む、前記〔２４７〕に記載の方法。
〔２４９〕前記連続希釈された対照核酸分子由来の前記定量化された標的増幅産物に基づいて、前記対照核酸分子の標的配列のうちの少なくとも１つのダイナミックレンジを決定することをさらに含む、前記〔２４７〕に記載の方法。
〔２５０〕前記定量化することが、任意にリアルタイムで、検出可能な標識プローブの前記増幅産物へのハイブリダイゼーションを検出することを含む、前記〔２４６〕に記載の方法。
〔２５１〕前記対照核酸分子が、表１に記載の微生物由来の少なくとも５つの異なる標的配列を含む、前記〔２４６〕に記載の方法。
〔２５２〕前記対照核酸分子が、表１に記載の微生物由来の少なくとも１０個の異なる標的配列を含む、前記〔２５１〕に記載の方法。
〔２５３〕前記対照核酸分子が、表１に記載の微生物由来の少なくとも１５個の異なる標的配列を含む、前記〔２５２〕に記載の方法。
〔２５４〕前記対照核酸分子が、表１に記載の微生物由来のほぼ全ての異なる標的配列を含む、前記〔２４６〕に記載の方法。
〔２５５〕前記複数の標的配列が、表１における異なる微生物のゲノム配列に由来する、前記〔２４６〕に記載の方法。
〔２５６〕前記形成することが、５～１００個の異なる増幅産物を形成することを含む、前記〔２４６〕に記載の方法。
〔２５７〕前記形成することが、１～１７個の異なる増幅産物を形成することを含む、前記〔２５６〕に記載の方法。
〔２５８〕前記複数の増幅反応のうちの１つ以上の増幅反応が、前記対応する標的配列の一部と同一のまたはそれに相補的な配列を含む検出可能な標識プローブをさらに含む、前記〔２４６〕に記載の方法。
〔２５９〕少なくとも１つの増幅反応の前記検出可能な標識プローブが、５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによる切断を受けるように構成されている、前記〔２５８〕に記載の方法。
〔２６０〕少なくとも１つの増幅反応の前記検出可能な標識プローブが、その５’末端に蛍光標識およびその３’末端にクエンチャーを含む、前記〔２５９〕に記載の方法。
〔２６１〕前記個別の反応チャンバが、前記試料の前記一部が前記反応チャンバに分配される前または分配された後のいずれかに前記個別の反応チャンバに分配されるポリメラーゼおよび／またはヌクレオチドをさらに含む、前記〔２６０〕に記載の方法。
〔２６２〕前記対照核酸分子がＤＮＡプラスミドである、前記〔２４６〕に記載の方法。
〔２６３〕前記ＤＮＡプラスミドが線状である、前記〔２６２〕に記載の方法。
〔２６４〕複数の異なる増幅標的配列を含む核酸構築物であって、前記増幅標的配列のうちの少なくとも２つが、表１から選択される遺伝子またはその対応するｃＤＮＡの少なくとも５６ヌクレオチド部分を含む、核酸構築物。
〔２６５〕複数の異なる増幅標的配列を含む核酸構築物であって、前記増幅標的配列のうちの少なくとも２つが、表１から選択される少なくとも２つの異なる微生物または微生物遺伝子に由来する、核酸構築物。
〔２６６〕核酸増幅のためのアレイであって、
複数の反応部位を含む支持体であって、前記複数の反応部位が前記支持体内または前記支持体上に位置する、支持体を含み、
前記複数の反応部位が各々、
（ｉ）複数の異なる標的配列を含む対照核酸分子と、
（ｉｉ）対応する標的配列を増幅するように構成された増幅プライマー対と、
（ｉｉｉ）前記対の前記増幅プライマーのうちの少なくとも１つの伸長によって生成される核酸配列にハイブリダイズするように構成された検出可能な標識プローブと、を含む、アレイ。
〔２６７〕前記異なる標的配列のうちの少なくとも２つが、表１から選択される遺伝子またはその対応するｃＤＮＡの少なくとも５６ヌクレオチド部分を含む、前記〔２６６〕に記載のアレイ。
〔２６８〕前記対照核酸分子が、表１に記載の微生物由来の少なくとも５つの異なる標的配列を含む、前記〔２６６〕に記載のアレイ。
〔２６９〕前記対照核酸分子が、表１に記載の微生物由来の少なくとも１０個の異なる標的配列を含む、前記〔２６８〕に記載のアレイ。
〔２７０〕前記対照核酸分子が、表１に記載の微生物由来の少なくとも１５個の異なる標的配列を含む、前記〔２６９〕に記載のアレイ。
〔２７１〕前記対照核酸分子が、表１に記載の微生物由来の全ての異なる標的配列を含む、前記〔２７０〕に記載のアレイ。
〔２７２〕前記対照核酸分子がプラスミドである、前記〔２６６〕に記載のアレイ。
〔２７３〕前記プラスミドが線状である、前記〔２７２〕に記載のアレイ。
〔２７４〕前記反応部位のうちの少なくとも１つが増幅産物を含む、前記〔２６６〕に記載のアレイ。
〔２７５〕前記支持体が、異なる増幅産物を含む１０～１０，０００個の反応部位を含む、前記〔２６６〕に記載のアレイ。
〔２７６〕前記反応部位のうちの少なくとも２つが各々、異なる対応する標的配列を増幅するように構成された増幅プライマー対を含む、前記〔２６６〕に記載のアレイ。
〔２７７〕少なくとも１つの反応部位の前記検出可能な標識プローブが、５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによる切断を受けるように構成されている、前記〔２６６〕に記載のアレイ。
〔２７８〕少なくとも１つの反応部位の前記検出可能な標識プローブが、その５’末端に蛍光標識およびその３’末端にクエンチャーを含む、前記〔２６６〕に記載のアレイ。
〔２７９〕前記検出可能な標識プローブが副溝結合剤部分をさらに含む、前記〔２６６〕に記載のアレイ。
〔２８０〕前記支持体が、マルチウェルプレート、マイクロ流体カード、および複数の貫通孔反応部位を含むプレートから選択される、前記〔２６６〕に記載のアレイ。
〔２８１〕前記複数の反応部位がポリメラーゼおよび／またはヌクレオチドをさらに含む、前記〔２６６〕に記載のアレイ。
〔２８２〕複数の標的核酸配列を増幅するための方法であって、
対照核酸分子および試験核酸試料の両方を複数の反応体積に分配することであって、前記対照核酸分子が複数の異なる標的配列を含み、前記試験核酸試料が１つ以上の試験核酸分子を含む、分配することと、
前記反応体積を核酸増幅条件に供し、前記対照核酸分子中の異なる標的配列を増幅するために各々使用される増幅プライマー対を使用して前記反応体積中の前記対照核酸分子の少なくとも２つの異なる標的配列を増幅することと、
前記反応体積中の少なくとも２つの異なる増幅された標的配列の存在を検出することと、を含む、方法。
〔２８３〕前記対照核酸分子が環状である、前記〔２８２〕に記載の方法。
〔２８４〕前記対照核酸分子が線状である、前記〔２８３〕に記載の方法。
〔２８５〕前記対照核酸分子および前記試験核酸試料由来の試験核酸分子を異なる反応体積に分配することをさらに含む、前記〔２８２〕に記載の方法。
〔２８６〕前記試験核酸試料が、異なる標的配列を各々含む２つ以上の異なる標的核酸分子も含む、前記〔２８２〕に記載の方法。
〔２８７〕前記標的核酸試料中の異なる標的配列を増幅するために各々使用される増幅プライマー対を使用して前記反応体積中の前記試験核酸試料の少なくとも２つの異なる標的配列を増幅することをさらに含む、前記〔２８６〕に記載の方法。

【外国語明細書】