特開 2023-176072 酵素の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023176072

(43)【公開日】2023-12-13

(54)【発明の名称】酵素の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/15 20060101AFI20231206BHJP

   C12N 9/26 20060101ALI20231206BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20231206BHJP

【ＦＩ】

C12N1/15 ZNA

C12N9/26 A

C12P21/02 C

【審査請求】未請求

【請求項の数】3

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022088157

(22)【出願日】2022-05-31

(71)【出願人】

【識別番号】504157024

【氏名又は名称】国立大学法人東北大学

(71)【出願人】

【識別番号】519127797

【氏名又は名称】三菱商事ライフサイエンス株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100160978

【弁理士】

【氏名又は名称】榎本 政彦

(72)【発明者】

【氏名】阿部 敬悦

(72)【発明者】

【氏名】見村 晃紀

【テーマコード（参考）】

4B050

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B050CC03

4B050DD05

4B050EE02

4B050LL02

4B050LL10

4B064AG01

4B064CA07

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA10

4B064DA20

4B065AA63X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065CA32

4B065CA41

4B065CA60

(57)【要約】

【課題】本発明は、糸状菌液体培養により、アミラーゼなどの加水分解酵素を効率良く生産することを課題とする。
【解決手段】
本発明者は、ＧＡＧ生合成クラスターの少なくとも一部を欠損し、かつα－１，３－グルカンを発現しない変異型の糸状菌を最小培地で培養することで、酵素発現の誘導等をすることなく、さらに、宿主に異種タンパク質発現ベクターの導入などで高発現化することなく、加水分解酵素をこの変異型糸状菌が発現することを見出し、本発明を完成させた。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

変異型の糸状菌を使用した高分子化合物の製造方法であって、
変異型糸状菌が、ＧＡＧ生合成クラスターの少なくとも一部を欠損し、かつα－１，３－グルカンを発現しない変異型であり、
変異型糸状菌が、高分子化合物を高発現化する変異工程がなく、得られた変異糸状菌であり、
変異型糸状菌を最小培地で培養する工程を含む、
高分子化合物の製造方法。

【請求項2】

糸状菌が、アスペルギルス属に属する糸状菌である、請求項１の製造方法

【請求項3】

高分子化合物が、アミラーゼである、請求項１又は２の製造方法

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、変異型菌糸体から、簡便な培養により、加水分解酵素を製造する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

糸状菌は、菌糸と呼ばれる管状の細胞から構成されているものの総称であり、代表的な麹菌（アスペルギルス・オリゼ（ Ａ ｓ ｐ ｅ ｒ ｇ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｏ ｒ ｙ ｚ ａ ｅ ） 等は、醤油、酒、味噌などの食品醸造、酵素生産、及びバイオマス利用等のために工業的に広く用いられている。酵素生産では、アミラーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼの産業用酵素等の発酵生産に使用されている。

【0003】

しかし、糸状菌は、液体培養を行うと、糸状菌が絡まり、塊状に集菌し、高密度液体培養の効率が低下する課題があった。この課題を解決する方法として、Ｇ Ａ Ｇ 生合成クラスターの少なくとも一部を欠損し、かつα － １ ， ３ － グルカンを発現しない変異型の糸状菌が報告されている（特許文献１）。

【0004】

麹菌Aspergillus は、アミラーゼを分泌する糸状菌として知られているが、麹菌のアミラーゼ遺伝子が発現するには、マルトースの誘導が必要とされ、培地のC源として、マルトースを使用し、アミラーゼを生産する必要がある。また、グルコースが存在すると、マルトースが存在しても、アミラーゼ遺伝子の発現が抑制されることが知られている（非特許文献１）

【0005】

一方で、固体培養時には、菌体を栄養飢餓状態にさせることによって、酵素生産性が向上する。さらに、アミラーゼは培養後期に細胞壁（キチン）へ吸着されてしまい、液体培養では菌体外への分泌量が低下するという事も知られている（非特許文献２）。

【0006】

また、α－１，３－グルカンを発現しない変異型の糸状菌でアミラーゼ等を高発現ベクターで導入し、同種又は異種タンパク質を高効率で生産する方法が開示されている（特許文献２）

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】WO2018/203566

【特許文献2】WO2014/073674

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】生物工学 第98巻 第4号（2020）ｐ186-190

【非特許文献2】Hiroki S. et al. (2011) Identification of potential cell wall component that allows Taka-amylase A adsorption in submerged cultures of Aspergillus oryzae. Appl Microbiol Biotechnol. 92:961-969.

【非特許文献3】Rappleye C.A. et al. (2004) RNA interference in Histoplasma capsulatum demonstrates a role for α-(1,3)-glucan in virulence. Mol. Microbiol. 53:153-165.

【非特許文献4】Beauvais A. et al. (2005) Two α(1-3) Glucan Synthases with Different Functions in Aspergillus fumigatus. Appl. Environ. Microbiol. 71:1531-1538.

【非特許文献5】Maubon D. et al. (2006) AGS3, an α(1-3)glucan synthase gene family member of Aspergillus fumigatus, modulates mycelium growth in the lung of experimentally infected mice. Fungal Genet. Biol. 43:366-375.

【非特許文献6】Henry C. et al. (2011) α1,3 glucans are dispensable in Aspergillus fumigatus. Eukaryot. Cell 11:26-29

【非特許文献7】Mizutani O. et al. (2008) A defect of LigD(human Lig4 homolog) for nonhomologous end joining significantly improves efficiency of gene-targeting in Aspergillus oryzae. Fung. Genet. Biol., 45:878-889.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明は、糸状菌液体培養により、アミラーゼなどの加水分解酵素を効率良く生産することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者は、ＧＡＧ生合成クラスターの少なくとも一部を欠損し、かつα－１，３－グルカンを発現しない変異型の糸状菌を最小培地で培養することで、酵素発現の誘導等をすることなく、さらに、宿主に異種タンパク質発現ベクターの導入などで高発現化することなく、加水分解酵素をこの変異型糸状菌が発現することを見出し、本発明を完成させた。

【0011】

本発明は以下のような発明である。
（１）変異型の糸状菌を使用した高分子化合物の製造方法であって、
変異型糸状菌が、ＧＡＧ生合成クラスターの少なくとも一部を欠損し、かつα－１，３－グルカンを発現しない変異型であり、
変異型糸状菌が、高分子化合物を高発現化する変異工程がなく、得られた変異糸状菌であり、
変異型糸状菌を最小培地で培養する工程を含む、
高分子化合物の製造方法、
（２）糸状菌が、アスペルギルス属に属する糸状菌である、前記（１）の製造方法、
（３）高分子化合物が、アミラーゼである、前記（１）又は（２）の製造方法。

【発明の効果】

【0012】

本発明によると、簡便な培養により、酵素を生産することができる。さらに、意外にも最少培地の継代培養という長期間の培養条件においても、野生株よりも有意に菌体外への酵素生産性が向上しているという効果も有していることを見出した。本効果により、継代培養、連続培養などで、持続的に酵素を生産することができる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】アミラーゼの生産性

【発明を実施するための形態】

【0014】

本発明の変異型糸状菌は、ガラクトサミノガラクタン（ＧＡＧ）生合成クラスターの少なくとも一部を欠損し、かつα－１，３－グルカンを発現しない糸状菌である。本発明で使用する変異型糸状菌は、WO2018/203566に記載の方法で得ることができる。より具体的な方法は、次段から記載する。

【0015】

本発明の糸状菌は、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属がより好ましい。本発明において用いるアスペルギルス属の糸状菌としては、例えば、アスペルギルス オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス ニドランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ ／ Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）等が挙げられ、アスペルギルス オリゼ、アスペルギルス ソーヤ、アスペルギルス ニドランス、またはアスペルギルス ニガーが好ましく、アスペルギルス オリゼ、アスペルギルス ソーヤがより好ましく、アスペルギルス オリゼがより好ましい。

【0016】

本発明のα－１，３－グルカンを発現しない変異型の糸状菌とは、糸状菌の変異株であって、α－１，３－グルカンを全く発現しないものだけでなく、α－１，３－グルカンを実質的に発現しないものも包含する。より具体的には、α－１，３－グルカンを実質的に発現しない変異株とは、ごくわずかにα－１，３－グルカンを発現するにとどまり、本発明の効果である菌体の凝集が有意に抑制されている変異株を示し、例えば、α－１，３－グルカンの発現量が野生株の３０％ 以下、より好ましくは野生株の１０％以下である株等が挙げられる。また、本発明における糸状菌変異株には、元々α－１，３－グルカンを発現しない糸状菌も含まれる。

【0017】

本発明にかかるα－１，３－グルカンを発現しない糸状菌変異株としてはα－１，３－グルカン合成酵素遺伝子ａｇｓの少なくとも一つを欠損しているものが挙げられる。α－１，３－グルカン合成酵素遺伝子ａｇｓとしては、アスペルギルス ニドランスのａｇｓＡ （Genbank accession No. AN5885）、ａｇｓＢ（Genbank accession No. AN3307）、アスペルギルス オリゼのａｇｓＡ 、ａｇｓＢ 、ａｇｓＣ 、アスペルギルス ソーヤのａｇｓＡ 、ａｇｓＢ 、ａｇｓＣ、アスペルギルス フミガタスのａｇｓ１（Genbank accession No. AFUA_3G00910） 、アスペルギルス ニガーのａｇｓＥ（Genbank accession No.ANI_1_360084） 、ペニシリウム クリソゲナムのａｇｓＢ（Genbank accession No. Pc16g06130）などが挙げられる。ここで、アスペルギルス オリゼのａｇｓＡ 、ａｇｓＢ 、ａｇｓＣは、アスペルギルスデータベースＡｓｐＧＤ （ http://www.aspergillusgenome.org） に、遺伝子番号ａｇｓＡ（AOR_1_956014）、ａｇｓＢ （AOR_1_2634154）、ａｇｓＣ（AOR_1_1350024）で登録されている。アスペルギルス オリゼのＡｇｓＡの推定アミノ酸配列（配列番号１） 、アスペルギルス オリゼのＡｇｓＡをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号２）である。アスペルギルス オリゼのＡｇｓＢの推定アミノ酸配列（配列番号３）に、アスペルギルス オリゼのＡｇｓＢ をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号４） に示す。アスペルギルス オリゼのＡｇｓＣの推定アミノ酸配列（配列番号５）、アスペルギルス オリゼのＡｇ ｓＣをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号６）に示す。アスペルギルスニドランスのＡｇｓＡの推定アミノ酸配列（配列番号７）に、アスペルギルスニドランスのＡｇｓＡをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号８）に示す。また、アスペルギルス ニドランスのＡｇｓＢの推定アミノ酸配列（配列番号９）に、アスペルギルス ニドランスのＡｇｓＢ をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号１０）に示す。本発明においては、アスペルギルス ソーヤのＡｇｓＡ 、ＡｇｓＢ 及びＡｇｓＣ のアミノ酸配列としては、ＧｅｎＢａｎ ｋ に登録されている遺伝子配列（Genbank accession No. DF093557-DF093585）から、アスペルギルス オリゼとの相同性に基づき推定したアミノ酸配列等が挙げられる。アスペルギルス ソーヤのＡｇｓＡの推定アミノ酸配列（配列番号１１）に、アスペルギルス ソーヤの上記ＡｇｓＡをコードする推定核酸分子の塩基配列（配列番号１２）に示す。また、アスペルギルス ソーヤのＡｇｓＢの推定アミノ酸配列（配列番号１３）に、アスペルギルス ソーヤのＡｇｓＢをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号１４）に示す。また、アスペルギルス ソーヤのＡｇｓＣの推定アミノ酸配列（配列番号１５）、アスペルギルス ソーヤのＡｇｓＣをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号１６）に示す。アスペルギルス ニガーのＡｇｓＥの推定アミノ酸配列（配列番号１７）に示す 。アスペルギルス ニガーのＡｇｓＥ をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号１８）に示す。アスペルギルス フミガタスのＡｇｓ１の推定アミノ酸配列（配列番号１９）に示す。アスペルギルス フミガタスのＡｇｓ１をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号２０）に示す。変異型糸状菌としては、これらのα－１，３－グルカン合成酵素遺伝子の１つ又は２つ以上を欠損しているものが挙げられ、３つ全てを欠損しているものが好ましい。

【0018】

本発明の、α－１，３－グルカン合成酵素遺伝子ａｇｓの欠損とは、ゲノム中のα－１，３－グルカン合成酵素のコード領域の全部または一部が欠失しているもの、コード領域の全部または一部に別の核酸分子が挿入されているもの、当該コード領域の全部または一部が別の核酸分子で置換されているもの等が挙げられる。また、α－１，３－グルカン合成酵素遺伝子ａｇｓの欠損には、上記コード領域への所定の核酸分子の付加、欠失及び置換だけでなく、α－１，３－グルカンが一定の条件下でのみ発現されるように設計された、コンディショナルな遺伝子欠損も含まれる。

【0019】

ガラクトサミノガラクタンは、アスペルギルス フミガタスにおいて同定された細胞外多糖であり、ガラクトース（Ｇａｌ）、Ｎアセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）及びガラクトサミン（ＧａｌＮ）から構成される 。そして、ＧＡＧ生合成クラスターを構成する遺伝子としては、ｕｇｅ３、ｓｐｈ３、ｅｇａ３、ａｇｄ３及びｇｔｂ３が挙げられる。

【0020】

従って、本発明にかかるＧＡＧ生合成クラスターの少なくとも一部も欠損している糸状菌変異株としては、ｕｇｅ３、ｓｐｈ３、ｅｇａ３、ａｇｄ３及びｇｔｂ３からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子を欠損しているもの等が挙げられる。本発明の一実施形態においては、例えば、ＧＡＧ生合成クラスターの少なくとも一部も欠損している糸状菌変異株としては、これらの遺伝子の内、少なくともｕｇｅ３及びｓｐｈ３を欠損しているもの等が挙げられる。

【0021】

ＧＡＧ生合成クラスターを構成するこれらの遺伝子の例としては、例えば、アスペルギルス オリゼのｕｇｅ３（Genbank accession No.AOR_1_2588174）、ｓｐｈ３(Genbank accession No. AOR_1_2586174)、ｅｇａ３（Genbank accession No. AOR_1_2584174）、ａｇｄ３（Genbank accession No. AOR_1_2582174）及びｇｔｂ３（Genbank accession No. AOR_1_2580174）、アスペルギルス ニドランスのｕｇｅ３（Genbank accession No.AN2951）、ｓｐｈ３（Genbank accession No.AN2952）、ｅｇａ３（Genbank accession No.AN2953）、ａｇｄ３（Genbank accession No.AN2954）及びｇｔｂ３（Genbank accession No.AN2955）、アスペルギルス ソーヤのｕｇｅ３、ｓｐｈ３、ｅｇａ３、ａｇｄ３及びｇｔｂ３、アスペルギルス ニガーのｕｇｅ３（Genbank accession No. ANI_1_1578024）、ｓｐｈ３（Genbank accession No.ANI_1_3046024）、ｅｇａ３（Genbank accession No.ANI_1_1582024）、ａｇｄ３（Genbank accession No.ANI_1_3048024）及びｇｔｂ３（Genbank accession No.ANI_1_3050024）、アスペルギルス フミガタスのｕｇｅ３（Genbank accession No.AFUA_3G07910）、ｓｐｈ３（Genbank accession No. AFUA_3G07900）、ｅｇａ３（Genbank accession No.AFUA_3G07890）、ａｇｄ３（Genbank accession No.AFUA_3G07870）及びｇｔｂ３（Genbank accession No. AFUA_3G07860）などが挙げられる。

【0022】

アスペルギルス オリゼのＵｇｅ３のアミノ酸配列（配列番号２１）及びＵｇｅ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号２２）に示す。また、アスペルギルス オリゼのＳｐｈ３のアミノ酸配列（配列番号２３）及びＳｐｈ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号２４）に示す。また、アスペルギルス オリゼのＥｇａ３のアミノ酸配列（配列番号２５）及びＥｇａ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号２６）に示す。また、アスペルギルス オリゼのＡｇｄ３のアミノ酸配列（配列番号２７）及びＡｇｄ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号２８）に示す。また、アスペルギルス オリゼのＧｔｂ３のアミノ酸配列（配列番号２９）に、アスペルギルス オリゼのＧｔｂ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号３０）に示す。

【0023】

アスペルギルス ニドランスのＵ ｇ ｅ ３ のアミノ酸配列（配列番号３２）に示す。また、前述したアスペルギルス ニドランスのＳｐｈ３のアミノ酸配列（配列番号３３）及びＳｐｈ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号３４）に示す。また、アスペルギルス ニドランスのＥｇａ３のアミノ酸配列（配列番号３５）及びＥｇａ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号３６）に示す。また、アスペルギルス ニドランスのＡｇｄ３のアミノ酸配列（配列番号３７）及びＡｇｄ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号３８）に示す。また、アスペルギルス ニドランスのＧｔｂ３のアミノ酸配列（配列番号３９）に、アスペルギルス ニドランスのＧｔｂ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号４０）に示す。

【0024】

本発明においては、アスペルギルス ソーヤのＵｇｅ３、Ｓｐｈ３、Ｅｇａ３、Ａｇｄ３及びＧｔｂ３のアミノ酸配列としては、ＧｅｎＢａｎｋに登録されているアスペルギルス ソーヤの遺伝子配列（Genbank accession No.DF093557-DF093585）から、アスペルギルス オリゼとの相同性に基づき推定したアミノ酸配列等が挙げられる。アスペルギルス ソーヤのＵｇｅ３の推定アミノ酸配列（配列番号４１）及びＵｇｅ３をコードする推定核酸分子の塩基配列（配列番号４２）に示す。アスペルギルス ソーヤのＳｐｈ３の推定アミノ酸配列（配列番号４３）及びＳｐｈ３をコードする推定核酸分子の塩基配列（配列番号４４）に示す。アスペルギルス ソーヤのＥｇａ３の推定アミノ酸配列（配列番号４５）及びＥｇａ３をコードする推定核酸分子の塩基配列（配列番号４６）に示す。また、アスペルギルス ソーヤのＡｇｄ３の推定アミノ酸配列（配列番号４７）及びＡｇｄ３をコードする推定核酸分子の塩基配列（配列番号４８）に示す。また、アスペルギルス ソーヤのＧｔｂ３の推定アミノ酸配列（配列番号４９）に、アスペルギルス ソーヤのＧｔｂ３をコードする推定核酸分子の塩基配列（配列番号５０）に示す。

【0025】

アスペルギルス ニガーのＵｇｅ３の推定アミノ酸配列（配列番号５１）及びＵｇｅ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号５２）に示す。アスペルギルス ニガーのＳｐｈ３の推定アミノ酸配列（配列番号５３）及びＳｐｈ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号５４）に示す。アスペルギルス ニガーのＥｇａ３の推定アミノ酸配列（配列番号５５）及びＥｇａ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号５６）に示す。アスペルギルス ニガーのＡｇｄ３の推定アミノ酸配列（配列番号５７）及びＡｇｄ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号５８）に示す。アスペルギルス ニガーのＧｔｂ３の推定アミノ酸配列（配列番号５９）に示す。アスペルギルス ニガーのＧｔｂ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号６０）に示す。アスペルギルス フミガタスのＵｇｅ３の推定アミノ酸配列（配列番号６１）及びＵｇｅ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号６２）に示す。アスペルギルス フミガタスのＳｐｈ３の推定アミノ酸配列（配列番号６３）及びＳｐｈ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号６４）に示す。アスペルギルス フミガタスのＥｇａ３の推定アミノ酸配列（配列番号６５）及びＥｇａ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号６６）に示す。アスペルギルス フミガタスのＡｇｄ３の推定アミノ酸配列（配列番号６７）及びＡｇｄ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号６８）に示す。アスペルギルス フミガタスのＧｔｂ３の推定アミノ酸配列（配列番号６９）に示す。アスペルギルス フミガタスのＧｔｂ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号７０）に示す。

【0026】

本発明において、ＧＡＧ生合成クラスターの少なくとも一部の欠損とは、例えば、ゲノム中のＧＡＧ生合成クラスターのうちコード領域の全部または一部が欠失しているもの、コード領域の全部または一部に別の核酸分子が挿入されているもの、当該コード領域の全部または一部が別の核酸分子で置換されているもの等が挙げられる。また、ＧＡＧ生合成クラスターの少なくとも一部の欠損には、上記コード領域への所定の核酸分子の付加、欠失及び置換だけでなく、ＧＡＧが一定の条件下でのみ発現されるように設計された、コンディショナルな遺伝子欠損も含まれる。

【0027】

また、本発明において、ｕｇｅ３の欠損とは、例えば、ゲノム中のＵｇｅ３コード領域の全部または一部が欠失しているもの、コード領域の全部または一部に別の核酸分子が挿入されているもの、当該コード領域の全部または一部が別の核酸分子で置換されているもの等が挙げられる。本発明において、ｓｐｈ３の欠損とは、例えば、ゲノム中のＳｐｈ３コード領域の全部または一部が欠失しているもの、コード領域の全部または一部に別の核酸分子が挿入されているもの、当該コード領域の全部または一部が別の核酸分子で置換されているもの等が挙げられる。本発明において、ｅｇａ３の欠損とは、例えば、ゲノム中のＥｇａ３コード領域の全部または一部が欠失しているもの、コード領域の全部または一部に別の核酸分子が挿入されているもの、当該コード領域の全部または一部が別の核酸分子で置換されているもの等が挙げられる。本発明において、ａｇｄ３の欠損とは、例えば、ゲノム中のＡｇｄ３コード領域の全部または一部が欠失しているもの、コード領域の全部または一部に別の核酸分子が挿入されているもの、当該コード領域の全部または一部が別の核酸分子で置換されているもの等が挙げられる。本発明において、ｇｔｂ３の欠損とは、例えば、ゲノム中のＧｔｂ３コード領域の全部または一部が欠失しているもの、コード領域の全部または一部に別の核酸分子が挿入されているもの、当該コード領域の全部または一部が別の核酸分子で置換されているもの等が挙げられる。

【0028】

また、ｕｇｅ３、ｓｐｈ３、ｅｇａ３、ａｇｄ３及びｇｔｂ３についても、これらの遺伝子の欠損には、上記コード領域への所定の核酸分子の付加、欠失及び置換だけでなく、ＧＡＧが一定の条件下でのみ発現されるように設計された、コンディショナルな遺伝子欠損も含まれる。

【0029】

かかる変異株の作製方法としては、糸状菌に対し、自体公知の方法（例えば、非特許文献３～６に記載の方法）を適宜用いて、例えば、α－１，３－グルカン遺伝子の破壊カセットの構築及びゲノム遺伝子への当該カセットの導入、ＧＡＧ生合成クラスターを構成する遺伝子の破壊カセットの構築及びゲノム遺伝子への当該カセットの導入等により行うことができる。本発明においては、これらの遺伝子操作に供する糸状菌として、例えば、高確率に目的部位への遺伝子導入を可能にするために、遺伝子ｌｉｇＤ破壊及び／又は遺伝子ａｄｅＡ破壊（好ましくはこれらの両方）の変異を予め導入しておいたものを用いてもよい。ここで、ｌｉｇＤは、ＤＮＡの修復における非相同組換え修復に関わる遺伝子であり、当該遺伝子を破壊することによって、相対的に相同組換えにより目的部位へ遺伝子導入された形質転換体が高効率に取得できるようになるため好ましい。当該遺伝子を破壊する変異としては、例えば、ｓＣマーカーを用いて破壊したｌｉｇＤ：：ｓＣ変異（非特許文献７）等が挙げられる。また、ａｄｅＡはアデニン要求性遺伝子であり、これを破壊する変異としては、例えば、ピリチアミン耐性遺伝子（ｐｔｒＡ）で破壊したａｄｅＡΔ：：ｐｔｒＡ（非特許文献７）等が挙げられる。従って、本発明の糸状菌変異株としては、これらの変異をさらに有するものも挙げられる。

【0030】

本発明では、前述までの菌糸体変異株を培養して、アミラーゼ等の高分子化合物を簡便に得られる製造方法を提供する。

【0031】

本発明では、前述の糸状菌変異体を使用することで、マルトースでの誘導をすることなく、炭素源としてグルコースを用いて、酵素生産をすることができる。酵素の生産方法としては、酵素の工業生産で適用される方法を採用でき、糸状菌変異体の培養は、合成培地、最小培地を使用することができる。より具体的には、CD最小培地が好適に使用できる。炭素源としては、グルコースが最適であるが、デンプン、加工デンプンなども使用することができる。炭素源の添加量としては特に限定されないが、例えば、０．５～１０％、より好ましくは１～４％の範囲で適宜採用することができる。また、通常の糸状菌を液体培養する際に添加されるものを使用することができる。例えば、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、ふすま、肉エキス等の窒素源、カリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩等の無機塩を添加することができる。さらに、ビタミン、アミノ酸などを添加してもよい。培養温度、時間、ｐH等の条件は、糸状菌で採用される一般的な温度、時間、ｐＨ等の条件を採用できる。具体的に例示すると、２０～４５℃、より好ましくは２５～３７℃の範囲で適宜採用することができる。培養時間も特に限定されないが、例えば、１２～２４０時間、より好ましくは２４～１４４時間の範囲で適宜採用することができる。また、継代培養も可能であり、例えば７２時間培養後、培養液の一部を採取し、新たな培地に培養液を添加し、さらに７２時間培養するなどの方法も可能である。また、連続培養をすることも可能である。

【0032】

培養方法は、前段の培地を液体培養で行えば特に限定されるものではない。例えば振盪培養法、ジャー・ファーメンターによる好気的培養法が利用できる。バッチ培養、または連続培養や通電による電気培養法も利用できる。

【0033】

培養培地から酵素の回収方法としては、特に限定されず、公知の方法（遠心分離、再結晶、蒸留法、溶媒抽出法、クロマトグラフィー等）を適宜採用することができる。

【実施例0034】

以下に、本願発明を具体的に示すが、本願発明は、これに限定されるものではない。

【実施例0035】

（１）変異型糸状菌
国際公開WO2018/203566に記載の方法により、変異株を作成した。野生株としては、 Ａ． ｏｒｙｚａｅ のＮＳ４株（遺伝子型；ｎｉａＤ－，ｓＣ－）の改変株を用いた。変異株としては、３種のα－１，３－グルカン合成酵素遺伝子欠損（ａｇｓＡΔａｇｓＢΔａｇｓＣΔ）、ＧＡＧ生合成クラスター欠損（Δｓｐｈ３Δｕｇｅ３）を使用した。使用した変異株の遺伝子型は、表１に示す。

【0036】

【表1】

【0037】

（２）液体培地の調製
培養は全て液体培地で実施した。培地としては、Ｃ ｚ ａ ｐ ｅ ｋ － Ｄ ｏ ｘ （ Ｃ Ｄ ）培地を使用し、グルコース２％とし、７０ｍＭの硝酸ナトリウムの代わりに７ ０ ｍ Ｍ のグルタミン酸ナトリウムを添加、ｐＨ６．５に調整した（最小培地）。マルトース誘導培地としては、２％マルトースとなるよう調整した培地を使用した。

【0038】

（３）麹菌の培養
麹菌の培養はバッフル付きの３００ｍＬ三角フラスコを用いて実施した。３００ｍｌ三角フラスコに前述の液体培地を１００ｍｌ入れて、１２１℃２０分滅菌処理後、麹菌胞子懸濁液を10⁶/mL植菌した。３０℃インキュベーター内、回転数１４０ｒｐｍで７２時間振とう培養を行った。培養終了後、培養液を遠心分離およびフィルターろ過して固液分離し、培養上清を得た。

【0039】

野生株と変異株について、培養上清のアミラーゼ活性を測定した。マルトース未添加の最小培地とマルトース誘導培地でのアミラーゼ生産性を比較した。アミラーゼ活性の測定方法は、α-アミラーゼ測定キット（キッコーマンバイオケミファ株式会社製）にて測定した。具体的には、培養開始後７２時間経過後に、菌体をろ過し、培養上清中のアミラーゼ活性を測定した。測定結果は、図１に示す。

【0040】

マルトース未添加の最小培地では、培養７２時間を２回継代培養した培養上清中のアミラーゼ活性を測定した。測定した結果は、図１の結果と同様に、変異株は、アミラーゼ活性が野生株と比較し、優位に高い結果を示した。

【0041】

図に示すように、本願の変異株は、組み換えなどによりアミラーゼ高発現変異をせずに、最小培地でアミラーゼを生産することができる。さらに、本願の変異株は、継代培養、連続培養でもアミラーゼを生産することができるため、酵素などの高分子化合物の工業生産に有用である。