(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023176119
(43)【公開日】2023-12-13
(54)【発明の名称】コラーゲン分解阻害能を測定する方法及びその利用
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/37 20060101AFI20231206BHJP
C07K 14/78 20060101ALN20231206BHJP
C12N 9/50 20060101ALN20231206BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/37
C07K14/78
C12N9/50
【審査請求】有
【請求項の数】6
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022088230
(22)【出願日】2022-05-31
(11)【特許番号】
(45)【特許公報発行日】2023-01-16
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＢＲＩＪ
(71)【出願人】
【識別番号】000106324
【氏名又は名称】サンスター株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】浦川 李花
(72)【発明者】
【氏名】有田 卓矢
【テーマコード（参考）】
4B050
4B063
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B050CC07
4B050KK18
4B050LL03
4B063QA05
4B063QQ36
4B063QR16
4B063QR48
4B063QR57
4B063QX01
4H045AA30
4H045CA40
4H045DA89
4H045EA50
(57)【要約】
【課題】コラーゲン分解阻害能を簡便に評価する方法の提供。
【解決手段】（Ａ）被験物質、及び歯周病関連マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに（Ｂ）前記コラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、前記被験物質の、コラーゲン分解阻害能を測定する方法。
【選択図】なし
【解決手段】（Ａ）被験物質、及び歯周病関連マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに（Ｂ）前記コラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、前記被験物質の、コラーゲン分解阻害能を測定する方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（Ａ）被験物質、及び歯周病関連マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに
（Ｂ）前記コラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
前記被験物質の、コラーゲン分解阻害能を測定する方法。
（Ｂ）前記コラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
前記被験物質の、コラーゲン分解阻害能を測定する方法。
【請求項2】
（Ａ－１）被験物質とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、
（Ａ－２）歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに
（Ｂ）被験物質、及び歯周病関連ＭＭＰと接触したコラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
前記被験物質の、コラーゲン分解阻害能を測定する方法。
（Ａ－２）歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに
（Ｂ）被験物質、及び歯周病関連ＭＭＰと接触したコラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
前記被験物質の、コラーゲン分解阻害能を測定する方法。
【請求項3】
前記歯周病関連ＭＭＰが、２種以上のＭＭＰを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記歯周病関連ＭＭＰが、
少なくとも２種の歯周病関連コラゲナーゼ、及び
少なくとも１種の歯周病関連ゼラチナーゼを含む、請求項１又は２に記載の方法。
少なくとも２種の歯周病関連コラゲナーゼ、及び
少なくとも１種の歯周病関連ゼラチナーゼを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項5】
前記歯周病関連ＭＭＰが、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－８、及びＭＭＰ－９を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項6】
前記コラーゲン含有固形物が、Ｉ型コラーゲン含有固形物である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項7】
（Ａ）被験物質、及び歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに
（Ｂ）前記コラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
コラーゲン分解阻害能を有する物質をスクリーニングする方法。
（Ｂ）前記コラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
コラーゲン分解阻害能を有する物質をスクリーニングする方法。
【請求項8】
（Ａ－１）被験物質とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、
（Ａ－２）歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに
（Ｂ）被験物質、及び歯周病関連ＭＭＰと接触したコラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
コラーゲン分解阻害能を有する物質をスクリーニングする方法。
（Ａ－２）歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに
（Ｂ）被験物質、及び歯周病関連ＭＭＰと接触したコラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
コラーゲン分解阻害能を有する物質をスクリーニングする方法。
【請求項9】
前記歯周病関連ＭＭＰが、２種以上のＭＭＰを含む、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項10】
前記歯周病関連ＭＭＰが、
少なくとも２種の歯周病関連コラゲナーゼ、及び
少なくとも１種の歯周病関連ゼラチナーゼを含む、請求項７又は８に記載の方法。
少なくとも２種の歯周病関連コラゲナーゼ、及び
少なくとも１種の歯周病関連ゼラチナーゼを含む、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項11】
前記歯周病関連ＭＭＰが、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－８、及びＭＭＰ－９を含む、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項12】
前記コラーゲン含有固形物が、Ｉ型コラーゲン含有固形物である、請求項７又は８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、コラーゲン分解阻害能を測定する方法及びその利用等に関する。
【背景技術】
【0002】
マトリックスメタロプロテアーゼ（Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ；ＭＭＰ）は、活性部位に亜鉛（ＩＩ）イオンを保有する細胞外マトリックス分解酵素の総称である。その主たる基質は、コラーゲン、ラミニン、ゼラチン、フィブロネクチン等の生体高分子である。
【0003】
ＭＭＰは、生体内における組織のリモデリングや創傷治癒の過程において、不要な細胞外マトリックスを分解し、血管新生や新たな組織の構築を制御することによって恒常性を維持する働きをすると考えられている。しかし、ＭＭＰの活性が亢進しすぎると組織破壊が進行し、歯周病、関節リウマチ、腫瘍浸潤やその転移現象等に関わるとされているため、ＭＭＰによるコラーゲン等の分解を阻害する成分の探索が行われている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特開２０１０－２２０５６１号公報
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Int. J. Environ. Res. Public Health 2020, 17(14), 4923
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
これまでに、繊維芽細胞を用いたコラーゲン分解阻害剤のスクリーニング方法が検討されている（特許文献１）。しかしながら、当該方法は、細胞を用いた評価系であることから、繊維芽細胞が分泌するＭＭＰしか評価できないこと、操作が煩雑であること、及びコラーゲンゲルを用いた評価系であるところコラーゲンゲルはゲルを均一に作製することが難しいこと等から、より簡便な評価方法の開発が望まれていた。
【0007】
今回、本発明者らは、コラーゲン分解阻害能を簡便に評価する方法について、検討を進めた。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、歯周病関連マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）及びコラーゲン含有固形物を用いることによって、ＭＭＰによるコラーゲン分解に対する阻害能を簡便に測定し得ることを見出し、さらに改良を重ねた。
【0009】
本開示は、例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
（Ａ）被験物質、及び歯周病関連マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに
（Ｂ）前記コラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
前記被験物質の、コラーゲン分解阻害能を測定する方法。
項２．
（Ａ－１）被験物質とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、
（Ａ－２）歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに
（Ｂ）被験物質、及び歯周病関連ＭＭＰと接触したコラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
前記被験物質の、コラーゲン分解阻害能を測定する方法。
項３．
前記歯周病関連ＭＭＰが、２種以上のＭＭＰを含む、項１又は２に記載の方法。
項４．
前記歯周病関連ＭＭＰが、
少なくとも２種の歯周病関連コラゲナーゼ、及び
少なくとも１種の歯周病関連ゼラチナーゼを含む、項１又は２に記載の方法。
項５．
前記歯周病関連ＭＭＰが、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－８、及びＭＭＰ－９を含む、項１又は２に記載の方法。
項６．
前記コラーゲン含有固形物が、Ｉ型コラーゲン含有固形物である、項１～５のいずれか１項に記載の方法。
項７．
（Ａ）被験物質、及び歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに
（Ｂ）前記コラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
コラーゲン分解阻害能を有する物質をスクリーニングする方法。
項８．
（Ａ－１）被験物質とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、
（Ａ－２）歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに
（Ｂ）被験物質、及び歯周病関連ＭＭＰと接触したコラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
コラーゲン分解阻害能を有する物質をスクリーニングする方法。
項９．
前記歯周病関連ＭＭＰが、２種以上のＭＭＰを含む、項７又は８に記載の方法。
項１０．
前記歯周病関連ＭＭＰが、
少なくとも２種の歯周病関連コラゲナーゼ、及び
少なくとも１種の歯周病関連ゼラチナーゼを含む、項７又は８に記載の方法。
項１１．
前記歯周病関連ＭＭＰが、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－８、及びＭＭＰ－９を含む、項７又は８に記載の方法。
項１２．
前記コラーゲン含有固形物が、Ｉ型コラーゲン含有固形物である、項７～１１のいずれか１項に記載の方法。
項１．
（Ａ）被験物質、及び歯周病関連マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに
（Ｂ）前記コラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
前記被験物質の、コラーゲン分解阻害能を測定する方法。
項２．
（Ａ－１）被験物質とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、
（Ａ－２）歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに
（Ｂ）被験物質、及び歯周病関連ＭＭＰと接触したコラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
前記被験物質の、コラーゲン分解阻害能を測定する方法。
項３．
前記歯周病関連ＭＭＰが、２種以上のＭＭＰを含む、項１又は２に記載の方法。
項４．
前記歯周病関連ＭＭＰが、
少なくとも２種の歯周病関連コラゲナーゼ、及び
少なくとも１種の歯周病関連ゼラチナーゼを含む、項１又は２に記載の方法。
項５．
前記歯周病関連ＭＭＰが、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－８、及びＭＭＰ－９を含む、項１又は２に記載の方法。
項６．
前記コラーゲン含有固形物が、Ｉ型コラーゲン含有固形物である、項１～５のいずれか１項に記載の方法。
項７．
（Ａ）被験物質、及び歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに
（Ｂ）前記コラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
コラーゲン分解阻害能を有する物質をスクリーニングする方法。
項８．
（Ａ－１）被験物質とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、
（Ａ－２）歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに
（Ｂ）被験物質、及び歯周病関連ＭＭＰと接触したコラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
コラーゲン分解阻害能を有する物質をスクリーニングする方法。
項９．
前記歯周病関連ＭＭＰが、２種以上のＭＭＰを含む、項７又は８に記載の方法。
項１０．
前記歯周病関連ＭＭＰが、
少なくとも２種の歯周病関連コラゲナーゼ、及び
少なくとも１種の歯周病関連ゼラチナーゼを含む、項７又は８に記載の方法。
項１１．
前記歯周病関連ＭＭＰが、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－８、及びＭＭＰ－９を含む、項７又は８に記載の方法。
項１２．
前記コラーゲン含有固形物が、Ｉ型コラーゲン含有固形物である、項７～１１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の効果】
【0010】
ＭＭＰによるコラーゲン分解に対する阻害能を簡便に測定する方法が提供される。また、ＭＭＰによるコラーゲン分解に対する阻害能を有する物質を簡便にスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【発明を実施するための形態】
【0012】
以下、本開示に包含される各実施形態について、さらに詳細に説明する。
本開示は、（Ａ）被験物質、及び歯周病関連マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに（Ｂ）前記コラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、前記被験物質の、コラーゲン分解阻害能を測定する方法を包含する。本明細書において、当該方法を、「本開示の測定方法」と表記することがある。また、前記（Ａ）及び（Ｂ）の各工程を「（Ａ）工程」、「（Ｂ）工程」等と表記することがある。
また、「本開示の測定方法」は、（Ａ－１）被験物質とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、（Ａ－２）歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに（Ｂ）被験物質、及び歯周病関連ＭＭＰと接触したコラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、前記被験物質の、コラーゲン分解阻害能を測定する方法をも包含する。また、前記（Ａ－１）、（Ａ－２）及び（Ｂ）の各工程を「（Ａ－１）工程」、「（Ａ－２）工程」、「（Ｂ）工程」等と表記することがある。
本開示は、（Ａ）被験物質、及び歯周病関連マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに（Ｂ）前記コラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、前記被験物質の、コラーゲン分解阻害能を測定する方法を包含する。本明細書において、当該方法を、「本開示の測定方法」と表記することがある。また、前記（Ａ）及び（Ｂ）の各工程を「（Ａ）工程」、「（Ｂ）工程」等と表記することがある。
また、「本開示の測定方法」は、（Ａ－１）被験物質とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、（Ａ－２）歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに（Ｂ）被験物質、及び歯周病関連ＭＭＰと接触したコラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、前記被験物質の、コラーゲン分解阻害能を測定する方法をも包含する。また、前記（Ａ－１）、（Ａ－２）及び（Ｂ）の各工程を「（Ａ－１）工程」、「（Ａ－２）工程」、「（Ｂ）工程」等と表記することがある。
【0013】
歯周病関連マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）としては、歯周病に関連することが知られているＭＭＰである限り、特に限定されない。
歯周病関連ＭＭＰとしては、例えば、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３、ＭＭＰ－７、ＭＭＰ－８、ＭＭＰ－９、ＭＭＰ－１３、ＭＭＰ－１４等が挙げられる（非特許文献１）。これらは、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
歯周病関連ＭＭＰとしては、例えば、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３、ＭＭＰ－７、ＭＭＰ－８、ＭＭＰ－９、ＭＭＰ－１３、ＭＭＰ－１４等が挙げられる（非特許文献１）。これらは、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【0014】
また、本開示の測定方法に用いられるＭＭＰは、２種以上のＭＭＰを含むことが好ましい。
理論に拘束されることを望むものではないが、ＭＭＰは他のＭＭＰを活性化する（例えば、ＭＭＰ－１３がＭＭＰ－９を活性化する、ＭＭＰ－９がＭＭＰ－２を活性化する等）ことが報告されていることから、２種以上のＭＭＰを組み合わせることによって、効率的にコラーゲン含有固形物を分解することができると期待される。
理論に拘束されることを望むものではないが、ＭＭＰは他のＭＭＰを活性化する（例えば、ＭＭＰ－１３がＭＭＰ－９を活性化する、ＭＭＰ－９がＭＭＰ－２を活性化する等）ことが報告されていることから、２種以上のＭＭＰを組み合わせることによって、効率的にコラーゲン含有固形物を分解することができると期待される。
【0015】
また、本開示の測定方法に用いられるＭＭＰは、少なくとも２種の歯周病関連コラゲナーゼ、及び少なくとも１種の歯周病関連ゼラチナーゼを含むことが好ましい。
本明細書において、「コラゲナーゼ」とは、主に三重らせん構造を持つ繊維状のコラーゲンを分解する酵素を意味する。歯周病関連コラゲナーゼとしては、例えば、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－８、ＭＭＰ－１３等が挙げられる（非特許文献１）。
本明細書において、「ゼラチナーゼ」とは、主にコラーゲンの繊維状構造が壊れ、末端が露出したポリペプチド鎖を分解する酵素を意味する。歯周病関連ゼラチナーゼとしては、例えば、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９等が挙げられる（非特許文献１）。
理論に拘束されることを望むものではないが、主に三重らせん構造を持つ繊維状のコラーゲンを分解する歯周病関連コラゲナーゼと、主にコラーゲンの繊維状構造が壊れ、末端が露出したポリペプチド鎖を分解する歯周病関連ゼラチナーゼとを組み合わせることによって、より効率的にコラーゲン含有固形物を分解することができると推測される。
本明細書において、「コラゲナーゼ」とは、主に三重らせん構造を持つ繊維状のコラーゲンを分解する酵素を意味する。歯周病関連コラゲナーゼとしては、例えば、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－８、ＭＭＰ－１３等が挙げられる（非特許文献１）。
本明細書において、「ゼラチナーゼ」とは、主にコラーゲンの繊維状構造が壊れ、末端が露出したポリペプチド鎖を分解する酵素を意味する。歯周病関連ゼラチナーゼとしては、例えば、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９等が挙げられる（非特許文献１）。
理論に拘束されることを望むものではないが、主に三重らせん構造を持つ繊維状のコラーゲンを分解する歯周病関連コラゲナーゼと、主にコラーゲンの繊維状構造が壊れ、末端が露出したポリペプチド鎖を分解する歯周病関連ゼラチナーゼとを組み合わせることによって、より効率的にコラーゲン含有固形物を分解することができると推測される。
【0016】
中でも、本開示の測定方法に用いられるＭＭＰとしては、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－８、及びＭＭＰ－９からなる群より選択される少なくとも２種（例えば、ＭＭＰ－１及びＭＭＰ－８、ＭＭＰ－１及びＭＭＰ－９、又はＭＭＰ－８及びＭＭＰ－９）を含むことが好ましく、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－８、及びＭＭＰ－９全てを含むことが好ましい。
【0017】
コラーゲン含有固形物としては、コラーゲンを含む固形物である限り、特に限定されない。なお本明細書において、「固形物」は、ゲル状物（液体分散媒のコロイドうち固体状のもの）を包含しないことが好ましい。例えば、固形物の形状としては、ディスク状、ブロック状、シート状、粉末状等が挙げられる。
また、コラーゲン含有固形物は、例えば、コラーゲン含有乾燥固形物等であってもよい。
また、コラーゲン含有固形物は、例えば、コラーゲンにより形成されるポア（孔）構造（例えば、ハニカム構造等）等を有していてもよい。
また、コラーゲン含有固形物は、例えば、コラーゲン含有乾燥固形物等であってもよい。
また、コラーゲン含有固形物は、例えば、コラーゲンにより形成されるポア（孔）構造（例えば、ハニカム構造等）等を有していてもよい。
【0018】
コラーゲン含有固形物に含まれるコラーゲンとしては、例えば、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン等が挙げられる。これらは、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。中でも、Ｉ型コラーゲンが好ましい。
【0019】
コラーゲン含有固形物は、コラーゲンを主成分として含有することが好ましい。
コラーゲン含有固形物中、コラーゲンの含有量は、特に限定されないが、例えば、５５質量％以上であることが好ましい。当該範囲の上限又は下限は、例えば、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００質量％程度であってもよい。より具体的には、６０～１００質量％程度等であってもよい。
コラーゲン含有固形物中、コラーゲンの含有量は、特に限定されないが、例えば、５５質量％以上であることが好ましい。当該範囲の上限又は下限は、例えば、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００質量％程度であってもよい。より具体的には、６０～１００質量％程度等であってもよい。
【0020】
コラーゲン含有固形物は、コラーゲンを含み、さらに他の成分を含んでいてもよい。当該他の成分としては、基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤、コーティング剤、着色料、ｐＨ調整剤等が例示される。これらの成分は、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【0021】
被験物質としては、特に制限されず、例えば、化合物、組成物等であり得る。化合物としては、例えば低分子化合物や、核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ等）やタンパク質（例えば抗体又はその一部等）、ポリマー等の高分子化合物であってよい。組成物としても、生物（例えば動物、植物、微生物等）から得た抽出物等であってもよく、化合物を２種以上組み合わせたものであってもよい。
【0022】
（Ａ）被験物質、及び歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物とを接触する工程とは、換言すれば、被験物質及び歯周病関連ＭＭＰを同時にコラーゲン含有固形物と接触する工程（接触時に被験物質及び歯周病関連ＭＭＰを予め混合した後にコラーゲン含有固形物と接触する工程を含む）を意味する。
被験物質及び歯周病関連ＭＭＰを予め混合する場合、被験物質と歯周病関連ＭＭＰとの接触時間としては、例えば、１０秒～７日程度、又は３分～１日程度等とすることができる。
被験物質及び歯周病関連ＭＭＰを予め混合する場合、接触方法としては、特に限定されない。例えば、被験物質を含む水溶液に歯周病関連ＭＭＰを添加する方法、歯周病関連ＭＭＰを含む水溶液に被験物質を添加する方法等が挙げられる。
被験物質及び歯周病関連ＭＭＰを予め混合する場合、接触時の温度としては、特に限定されない。例えば、２５～４０℃程度、又は３０～４０℃程度等とすることができる。
被験物質及び歯周病関連ＭＭＰを予め混合する場合、被験物質と歯周病関連ＭＭＰとの接触時間としては、例えば、１０秒～７日程度、又は３分～１日程度等とすることができる。
被験物質及び歯周病関連ＭＭＰを予め混合する場合、接触方法としては、特に限定されない。例えば、被験物質を含む水溶液に歯周病関連ＭＭＰを添加する方法、歯周病関連ＭＭＰを含む水溶液に被験物質を添加する方法等が挙げられる。
被験物質及び歯周病関連ＭＭＰを予め混合する場合、接触時の温度としては、特に限定されない。例えば、２５～４０℃程度、又は３０～４０℃程度等とすることができる。
【0023】
（Ａ－１）被験物質とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、及び（Ａ－２）歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物とを接触する工程の順序は特に限定されない。つまり、本開示の測定方法は、（Ａ－１）被験物質とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、及び（Ａ－２）歯周病関連ＭＭＰと、被験物質と接触したコラーゲン含有固形物とを接触する工程を含んでいてもよく、（Ａ－２）歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物とを接触する工程、及び（Ａ－１）被験物質と、歯周病関連ＭＭＰと接触したコラーゲン含有固形物とを接触する工程を含んでいてもよい。
【0024】
被験物質とコラーゲン含有固形物とを接触した後、歯周病関連ＭＭＰと、被験物質と接触したコラーゲン含有固形物とを接触するまでの期間、又は歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物とを接触した後、被験物質と、歯周病関連ＭＭＰと接触したコラーゲン含有固形物とを接触するまでの期間は、特に限定されず、例えば、１０秒～７日程度、又は３分～１日程度等とすることができる。
【0025】
本開示の測定方法は、例えば、（Ａ－１）工程と（Ａ－２）工程の間に、洗浄工程を含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。
【0026】
接触方法（被験物質及び／又は歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物との接触方法）としては、特に限定されない。例えば、被験物質及び／又は歯周病関連ＭＭＰを含む水溶液にコラーゲン含有固形物を浸漬する方法、被験物質及び／又は歯周病関連ＭＭＰを含む水溶液をコラーゲン含有固形物に添加する方法等が挙げられる。
【0027】
接触時（被験物質及び／又は歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物との接触時）の温度としては、特に限定されない。例えば、２５～４０℃程度、又は３０～４０℃程度等とすることができる。
【0028】
接触時間（被験物質及び／又は歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物との接触時間）としては、特に限定されない。例えば、１０秒～１４日程度、３分～７日程度、又は１～５日程度等とすることができる。
【0029】
歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物との接触時における歯周病関連ＭＭＰの濃度としては、ＭＭＰによりコラーゲンを分解し得る限り、特に限定されない。例えば、０．１～１００μｇ／ｍＬ程度、又は１００～２００００Ｕ／ｍｌ程度等とすることができる。
【0030】
（Ｂ）コラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する方法としては、特に限定されない。例えば、目視によりコラーゲン含有固形物の大きさを確認する方法、顕微鏡観察等によりコラーゲン含有固形物の構造の変化を確認する方法、コラーゲン染色により定量する方法等が挙げられる。
【0031】
本開示の測定方法によれば、被験物質のコラーゲン分解阻害能（より具体的には、ＭＭＰによるコラーゲン分解に対する阻害能）を測定することができる。
例えば、本開示の測定方法が、歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物とを接触した後に、被験物質と当該コラーゲン含有固形物とを接触し、コラーゲン含有固形物の分解の程度が抑制された場合、当該被験物質は、ＭＭＰによるコラーゲン分解の進行を抑制することが期待される。
例えば、本開示の測定方法が、被験物質及び歯周病関連ＭＭＰを同時にコラーゲン含有固形物と接触し、コラーゲン含有固形物の分解の程度が抑制された場合、当該被験物質は、ＭＭＰによるコラーゲン分解を予防することが期待される。
例えば、本開示の測定方法が、歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物とを接触する前に、被験物質とコラーゲン含有固形物とを接触し、コラーゲン含有固形物の分解の程度が抑制された場合、当該被験物質は、歯周組織破壊の早期段階においてＭＭＰによるコラーゲン分解を予防することが期待される。
例えば、本開示の測定方法が、歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物とを接触した後に、被験物質と当該コラーゲン含有固形物とを接触し、コラーゲン含有固形物の分解の程度が抑制された場合、当該被験物質は、ＭＭＰによるコラーゲン分解の進行を抑制することが期待される。
例えば、本開示の測定方法が、被験物質及び歯周病関連ＭＭＰを同時にコラーゲン含有固形物と接触し、コラーゲン含有固形物の分解の程度が抑制された場合、当該被験物質は、ＭＭＰによるコラーゲン分解を予防することが期待される。
例えば、本開示の測定方法が、歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物とを接触する前に、被験物質とコラーゲン含有固形物とを接触し、コラーゲン含有固形物の分解の程度が抑制された場合、当該被験物質は、歯周組織破壊の早期段階においてＭＭＰによるコラーゲン分解を予防することが期待される。
【0032】
また、本開示は、（Ａ）被験物質、及び歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに（Ｂ）前記コラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、コラーゲン分解阻害能を有する物質をスクリーニングする方法をも包含する。本明細書において、当該方法を、「本開示のスクリーニング方法」と表記することがある。また、前記（Ａ）及び（Ｂ）の各工程を「（Ａ）工程」、「（Ｂ）工程」等と表記することがある。
また、「本開示のスクリーニング方法」は、（Ａ－１）被験物質とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、（Ａ－２）歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに（Ｂ）被験物質、及び歯周病関連ＭＭＰと接触したコラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、コラーゲン分解阻害能を有する物質をスクリーニングする方法をも包含する。また、前記（Ａ－１）、（Ａ－２）及び（Ｂ）の各工程を「（Ａ－１）工程」、「（Ａ－２）工程」、「（Ｂ）工程」等と表記することがある。
また、「本開示のスクリーニング方法」は、（Ａ－１）被験物質とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、（Ａ－２）歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに（Ｂ）被験物質、及び歯周病関連ＭＭＰと接触したコラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、コラーゲン分解阻害能を有する物質をスクリーニングする方法をも包含する。また、前記（Ａ－１）、（Ａ－２）及び（Ｂ）の各工程を「（Ａ－１）工程」、「（Ａ－２）工程」、「（Ｂ）工程」等と表記することがある。
【0033】
本開示のスクリーニング方法における（Ａ）工程、（Ａ－１）工程、（Ａ－２）工程、及び（Ｂ）工程については、上述した本開示の測定方法における（Ａ）工程、（Ａ－１）工程、（Ａ－２）工程、及び（Ｂ）工程についての記載を援用することができる。
【0034】
本開示のスクリーニング方法によれば、コラーゲン分解阻害能（より具体的には、ＭＭＰによるコラーゲン分解に対する阻害能）を有する被験物質をスクリーニングすることができる。
【0035】
なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（The term "comprising" includes "consisting essentially of” and "consisting of."）。また、本開示は、本明細書に説明した構成要件の任意の組み合わせを全て包含する。
【0036】
また、上述した本開示の各実施形態について説明した各種特性（性質、構造、機能等）は、本開示に包含される主題を特定するにあたり、どのように組み合わせられてもよい。すなわち、本開示には、本明細書に記載される組み合わせ可能な各特性のあらゆる組み合わせからなる主題が全て包含される。
【実施例0037】
本開示の内容を以下の実験例を用いて具体的に説明する。しかし、本開示はこれらに何ら限定されるものではない。下記において、特に言及する場合を除いて、実験は大気圧及び常温条件下で行っている。また特に言及する場合を除いて、「％」は「容量％」を意味する。
【0038】
ＭＭＰ－１ ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１０ｍＭ ＣａＣｌ２，０．０５％ Ｂｒｉｊ－３５，ｐＨ７．５）を純水で５倍に希釈し、最終の濃度が１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，２ｍＭ ＣａＣｌ２，０．０１％ Ｂｒｉｊ－３５となるよう調製した。表１に示すように１００μｌのＭＭＰ溶液を作製し、コラーゲンディスク（ＡｔｅｌｏＣｅｌｌ ハニカムディスク９６（ウシ皮由来Ｉ型コラーゲン含有）、高研社製）に処理した。３６℃にて３日間インキュベートし、ディスク添加直後、添加から１日後、２日後、及び３日後の時点で顕微鏡にて観察した。なお、ＭＭＰの終濃度は、ＭＭＰ－１ １０μｇ／ｍｌ（７０００Ｕ／ｍｌ）、ＭＭＰ－８ １０μｇ／ｍｌ（１５００Ｕ／ｍｌ）、ＭＭＰ－９ １２μｇ／ｍｌ（２４０Ｕ／ｍｌ）であった。結果を図１に示す。
【0039】
【表1】
【0040】
図１に示すとおり、Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒを添加したＮＣでは、コラーゲンディスクは溶解しなかった。
ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－８、又はＭＭＰ－９を単独で添加した場合、コラーゲンディスクの構造に変化は見られなかった。
ＭＭＰ－１及びＭＭＰ－８、あるいはＭＭＰ－８及びＭＭＰ－９を添加した場合、コラーゲンディスクは、添加２日後に厚さが薄くなり始めたが、３日後でも構造が崩れることはなかった。
ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－８、及びＭＭＰ－９を添加したコラーゲンディスクは添加２日後に構造が崩れ溶解した。
ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－８、又はＭＭＰ－９を単独で添加した場合、コラーゲンディスクの構造に変化は見られなかった。
ＭＭＰ－１及びＭＭＰ－８、あるいはＭＭＰ－８及びＭＭＰ－９を添加した場合、コラーゲンディスクは、添加２日後に厚さが薄くなり始めたが、３日後でも構造が崩れることはなかった。
ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－８、及びＭＭＰ－９を添加したコラーゲンディスクは添加２日後に構造が崩れ溶解した。
【0041】
ＭＭＰ－１ ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１０ｍＭ ＣａＣｌ２，０．０５％ Ｂｒｉｊ－３５，ｐＨ７．５）を純水で５倍に希釈し、最終の濃度が１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，２ｍＭ ＣａＣｌ２，０．０１％ Ｂｒｉｊ－３５となるよう調製した。表２に示すように１００μｌのＭＭＰ溶液を作製したものに、水で２００倍希釈したＭＭＰ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＮＮＧＨ、阻害剤）またはコントロールとして水を５０μｌ添加し混合して、コラーゲンディスク（ＡｔｅｌｏＣｅｌｌ ハニカムディスク９６（ウシ皮由来Ｉ型コラーゲン含有）、高研社製）に処理した。３６℃にて７日間インキュベートし、ディスク添加直後、添加から１日後、２日後、３日後、４日後、及び７日後の時点で顕微鏡にて観察した。なお、ＭＭＰの終濃度は、ＭＭＰ－１ １０μｇ／ｍｌ（７０００Ｕ／ｍｌ）、ＭＭＰ－８ １０μｇ／ｍｌ（１５００Ｕ／ｍｌ）、ＭＭＰ－９ １２μｇ／ｍｌ（２４０Ｕ／ｍｌ）であった。結果を図２に示す。
【0042】
【表2】
【0043】
阻害剤に代えて水を添加したコントロールでは、添加２日後にコラーゲンディスクが溶解した。一方で、阻害剤を添加した場合は添加７日後も構造を保っており、ＭＭＰの阻害によってコラーゲンディスクの分解が妨げられた。これにより、ＭＭＰのはたらきによりコラーゲンディスクが分解されていることが示された。
【図1】
【図2】
【手続補正書】
【提出日】2022-05-31
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（Ａ）被験物質、及び歯周病関連マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに
（Ｂ）前記コラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
前記被験物質の、コラーゲン分解阻害能を測定する方法であり、
前記歯周病関連ＭＭＰが、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－８、及びＭＭＰ－９を含む、方法。
（Ｂ）前記コラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
前記被験物質の、コラーゲン分解阻害能を測定する方法であり、
前記歯周病関連ＭＭＰが、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－８、及びＭＭＰ－９を含む、方法。
【請求項2】
（Ａ－１）被験物質とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、
（Ａ－２）歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに
（Ｂ）被験物質、及び歯周病関連ＭＭＰと接触したコラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
前記被験物質の、コラーゲン分解阻害能を測定する方法であり、
前記歯周病関連ＭＭＰが、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－８、及びＭＭＰ－９を含む、方法。
（Ａ－２）歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに
（Ｂ）被験物質、及び歯周病関連ＭＭＰと接触したコラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
前記被験物質の、コラーゲン分解阻害能を測定する方法であり、
前記歯周病関連ＭＭＰが、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－８、及びＭＭＰ－９を含む、方法。
【請求項3】
前記コラーゲン含有固形物が、Ｉ型コラーゲン含有固形物である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
（Ａ）被験物質、及び歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに
（Ｂ）前記コラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
コラーゲン分解阻害能を有する物質をスクリーニングする方法であり、
前記歯周病関連ＭＭＰが、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－８、及びＭＭＰ－９を含む、方法。
（Ｂ）前記コラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
コラーゲン分解阻害能を有する物質をスクリーニングする方法であり、
前記歯周病関連ＭＭＰが、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－８、及びＭＭＰ－９を含む、方法。
【請求項5】
（Ａ－１）被験物質とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、
（Ａ－２）歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに
（Ｂ）被験物質、及び歯周病関連ＭＭＰと接触したコラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
コラーゲン分解阻害能を有する物質をスクリーニングする方法であり、
前記歯周病関連ＭＭＰが、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－８、及びＭＭＰ－９を含む、方法。
（Ａ－２）歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに
（Ｂ）被験物質、及び歯周病関連ＭＭＰと接触したコラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
コラーゲン分解阻害能を有する物質をスクリーニングする方法であり、
前記歯周病関連ＭＭＰが、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－８、及びＭＭＰ－９を含む、方法。
【請求項6】
前記コラーゲン含有固形物が、Ｉ型コラーゲン含有固形物である、請求項４又は５に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】2022-09-16
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（Ａ）被験物質、及び歯周病関連マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに
（Ｂ）前記コラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
前記被験物質の、コラーゲン分解阻害能を測定する方法であり、
前記歯周病関連ＭＭＰが、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－８、及びＭＭＰ－９を含み、
線維芽細胞を用いない、方法。
（Ｂ）前記コラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
前記被験物質の、コラーゲン分解阻害能を測定する方法であり、
前記歯周病関連ＭＭＰが、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－８、及びＭＭＰ－９を含み、
線維芽細胞を用いない、方法。
【請求項2】
（Ａ－１）被験物質とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、
（Ａ－２）歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに
（Ｂ）被験物質、及び歯周病関連ＭＭＰと接触したコラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
前記被験物質の、コラーゲン分解阻害能を測定する方法であり、
前記歯周病関連ＭＭＰが、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－８、及びＭＭＰ－９を含み、
線維芽細胞を用いない、方法。
（Ａ－２）歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに
（Ｂ）被験物質、及び歯周病関連ＭＭＰと接触したコラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
前記被験物質の、コラーゲン分解阻害能を測定する方法であり、
前記歯周病関連ＭＭＰが、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－８、及びＭＭＰ－９を含み、
線維芽細胞を用いない、方法。
【請求項3】
前記コラーゲン含有固形物が、Ｉ型コラーゲン含有固形物である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
（Ａ）被験物質、及び歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに
（Ｂ）前記コラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
コラーゲン分解阻害能を有する物質をスクリーニングする方法であり、
前記歯周病関連ＭＭＰが、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－８、及びＭＭＰ－９を含み、
線維芽細胞を用いない、方法。
（Ｂ）前記コラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
コラーゲン分解阻害能を有する物質をスクリーニングする方法であり、
前記歯周病関連ＭＭＰが、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－８、及びＭＭＰ－９を含み、
線維芽細胞を用いない、方法。
【請求項5】
（Ａ－１）被験物質とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、
（Ａ－２）歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに
（Ｂ）被験物質、及び歯周病関連ＭＭＰと接触したコラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
コラーゲン分解阻害能を有する物質をスクリーニングする方法であり、
前記歯周病関連ＭＭＰが、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－８、及びＭＭＰ－９を含み、
線維芽細胞を用いない、方法。
（Ａ－２）歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに
（Ｂ）被験物質、及び歯周病関連ＭＭＰと接触したコラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
コラーゲン分解阻害能を有する物質をスクリーニングする方法であり、
前記歯周病関連ＭＭＰが、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－８、及びＭＭＰ－９を含み、
線維芽細胞を用いない、方法。
【請求項6】
前記コラーゲン含有固形物が、Ｉ型コラーゲン含有固形物である、請求項４又は５に記載の方法。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0006】
これまでに、線維芽細胞を用いたコラーゲン分解阻害剤のスクリーニング方法が検討されている（特許文献１）。しかしながら、当該方法は、細胞を用いた評価系であることから、線維芽細胞が分泌するＭＭＰしか評価できないこと、操作が煩雑であること、及びコラーゲンゲルを用いた評価系であるところコラーゲンゲルはゲルを均一に作製することが難しいこと等から、より簡便な評価方法の開発が望まれていた。
【手続補正書】
【提出日】2022-11-15
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（Ａ）被験物質、及び歯周病関連マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに
（Ｂ）前記コラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
前記被験物質の、コラーゲン分解阻害能を測定する方法であり、
前記歯周病関連ＭＭＰが、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－８、及びＭＭＰ－９を含み、
細胞を用いない、方法。
（Ｂ）前記コラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
前記被験物質の、コラーゲン分解阻害能を測定する方法であり、
前記歯周病関連ＭＭＰが、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－８、及びＭＭＰ－９を含み、
細胞を用いない、方法。
【請求項2】
（Ａ－１）被験物質とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、
（Ａ－２）歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに
（Ｂ）被験物質、及び歯周病関連ＭＭＰと接触したコラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
前記被験物質の、コラーゲン分解阻害能を測定する方法であり、
前記歯周病関連ＭＭＰが、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－８、及びＭＭＰ－９を含み、
細胞を用いない、方法。
（Ａ－２）歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに
（Ｂ）被験物質、及び歯周病関連ＭＭＰと接触したコラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
前記被験物質の、コラーゲン分解阻害能を測定する方法であり、
前記歯周病関連ＭＭＰが、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－８、及びＭＭＰ－９を含み、
細胞を用いない、方法。
【請求項3】
前記コラーゲン含有固形物が、Ｉ型コラーゲン含有固形物である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
（Ａ）被験物質、及び歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに
（Ｂ）前記コラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
コラーゲン分解阻害能を有する物質をスクリーニングする方法であり、
前記歯周病関連ＭＭＰが、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－８、及びＭＭＰ－９を含み、
細胞を用いない、方法。
（Ｂ）前記コラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
コラーゲン分解阻害能を有する物質をスクリーニングする方法であり、
前記歯周病関連ＭＭＰが、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－８、及びＭＭＰ－９を含み、
細胞を用いない、方法。
【請求項5】
（Ａ－１）被験物質とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、
（Ａ－２）歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに
（Ｂ）被験物質、及び歯周病関連ＭＭＰと接触したコラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
コラーゲン分解阻害能を有する物質をスクリーニングする方法であり、
前記歯周病関連ＭＭＰが、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－８、及びＭＭＰ－９を含み、
細胞を用いない、方法。
（Ａ－２）歯周病関連ＭＭＰとコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに
（Ｂ）被験物質、及び歯周病関連ＭＭＰと接触したコラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
コラーゲン分解阻害能を有する物質をスクリーニングする方法であり、
前記歯周病関連ＭＭＰが、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－８、及びＭＭＰ－９を含み、
細胞を用いない、方法。
【請求項6】
前記コラーゲン含有固形物が、Ｉ型コラーゲン含有固形物である、請求項４又は５に記載の方法。