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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023177229
(43)【公開日】2023-12-13
(54)【発明の名称】体外における哺乳動物胚を選別する方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/04 20060101AFI20231206BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/04
【審査請求】未請求
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023031088
(22)【出願日】2023-03-01
(31)【優先権主張番号】P 2022088499
(32)【優先日】2022-05-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】304036743
【氏名又は名称】国立大学法人宇都宮大学
(74)【代理人】
【識別番号】100107984
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 雅紀
(74)【代理人】
【識別番号】100182305
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 鉄平
(74)【代理人】
【識別番号】100096482
【弁理士】
【氏名又は名称】東海 裕作
(74)【代理人】
【識別番号】100131093
【弁理士】
【氏名又は名称】堀内 真
(74)【代理人】
【識別番号】100150902
【弁理士】
【氏名又は名称】山内 正子
(74)【代理人】
【識別番号】100141391
【弁理士】
【氏名又は名称】園元 修一
(74)【代理人】
【識別番号】100221958
【弁理士】
【氏名又は名称】篠田 真希恵
(74)【代理人】
【識別番号】100192441
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 仁
(72)【発明者】
【氏名】松本 浩道
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA18
4B063QA20
4B063QQ08
4B063QQ20
4B063QR49
4B063QR58
4B063QS07
4B063QS40
4B063QX02
(57)【要約】
【課題】着床能力の高い哺乳動物胚を、比較的簡便に選別する方法の提供。
【解決手段】哺乳動物胚における活性酸素種（ＲＯＳ）濃度が増加すること、及び／又は、哺乳動物胚におけるグルタチオン（ＧＳＨ）濃度が低下することを指標として、着床する可能性が高い哺乳動物胚を体外において選別する。
【選択図】なし
【解決手段】哺乳動物胚における活性酸素種（ＲＯＳ）濃度が増加すること、及び／又は、哺乳動物胚におけるグルタチオン（ＧＳＨ）濃度が低下することを指標として、着床する可能性が高い哺乳動物胚を体外において選別する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の工程（ａ）～（ｃ）を含む、着床能力の高い哺乳動物胚を体外において選別する方法。
（ａ）活性酸素種検出用蛍光指示薬又はグルタチオン検出用蛍光指示薬と、取得された被検対象の哺乳動物胚とをインビトロで接触させる工程；
（ｂ）被検対象の哺乳動物胚における、活性酸素種検出用蛍光指示薬由来の蛍光量を指標として、被検対象の哺乳動物胚における活性酸素種濃度を測定するか、あるいは、被検対象の哺乳動物胚における、グルタチオン検出用蛍光指示薬由来の蛍光量を指標として、被検対象の哺乳動物胚におけるグルタチオン濃度を測定する工程；
（ｃ）工程（ｂ）において測定した活性酸素種濃度が、比較対照の哺乳動物胚における活性酸素種濃度よりも高い場合、被検対象の哺乳動物胚を、比較対照の哺乳動物胚よりも着床能力の高い哺乳動物胚として選択するか、あるいは、工程（ｂ）において測定したグルタチオン濃度が、比較対照の哺乳動物胚におけるグルタチオン濃度よりも低い場合、被検対象の哺乳動物胚を、比較対照の哺乳動物胚よりも着床能力の高い哺乳動物胚として選択する工程；
（ａ）活性酸素種検出用蛍光指示薬又はグルタチオン検出用蛍光指示薬と、取得された被検対象の哺乳動物胚とをインビトロで接触させる工程；
（ｂ）被検対象の哺乳動物胚における、活性酸素種検出用蛍光指示薬由来の蛍光量を指標として、被検対象の哺乳動物胚における活性酸素種濃度を測定するか、あるいは、被検対象の哺乳動物胚における、グルタチオン検出用蛍光指示薬由来の蛍光量を指標として、被検対象の哺乳動物胚におけるグルタチオン濃度を測定する工程；
（ｃ）工程（ｂ）において測定した活性酸素種濃度が、比較対照の哺乳動物胚における活性酸素種濃度よりも高い場合、被検対象の哺乳動物胚を、比較対照の哺乳動物胚よりも着床能力の高い哺乳動物胚として選択するか、あるいは、工程（ｂ）において測定したグルタチオン濃度が、比較対照の哺乳動物胚におけるグルタチオン濃度よりも低い場合、被検対象の哺乳動物胚を、比較対照の哺乳動物胚よりも着床能力の高い哺乳動物胚として選択する工程；
【請求項2】
工程（ａ）において、活性酸素種検出用蛍光指示薬及びグルタチオン検出用蛍光指示薬と、取得された被検対象の哺乳動物胚とをインビトロで接触させ、
工程（ｂ）において、被検対象の哺乳動物胚における、活性酸素種検出用蛍光指示薬由来の蛍光量及びグルタチオン検出用蛍光指示薬由来の蛍光量を指標として、被検対象の哺乳動物胚における活性酸素種濃度及びグルタチオン濃度を測定し、
工程（ｃ）において、工程（ｂ）において測定した活性酸素種濃度が、比較対照の哺乳動物胚における活性酸素種濃度よりも高く、かつ、工程（ｂ）において測定したグルタチオン濃度が、比較対照の哺乳動物胚におけるグルタチオン濃度よりも低い場合、被検対象の哺乳動物胚を、比較対照の哺乳動物胚よりも着床能力の高い哺乳動物胚として選択する、請求項１に記載の方法。
工程（ｂ）において、被検対象の哺乳動物胚における、活性酸素種検出用蛍光指示薬由来の蛍光量及びグルタチオン検出用蛍光指示薬由来の蛍光量を指標として、被検対象の哺乳動物胚における活性酸素種濃度及びグルタチオン濃度を測定し、
工程（ｃ）において、工程（ｂ）において測定した活性酸素種濃度が、比較対照の哺乳動物胚における活性酸素種濃度よりも高く、かつ、工程（ｂ）において測定したグルタチオン濃度が、比較対照の哺乳動物胚におけるグルタチオン濃度よりも低い場合、被検対象の哺乳動物胚を、比較対照の哺乳動物胚よりも着床能力の高い哺乳動物胚として選択する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
比較対照の哺乳動物胚が、アルギニン及びロイシンのいずれも含まない培養液中で体外培養した哺乳動物胚；又はアルギニンを含む培養液中で培養した哺乳動物胚；である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
工程（ａ）の前に、被検対象の哺乳動物胚を、アルギニン及びロイシンを含む培養液中で体外培養する工程（ｐ）をさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項5】
被検対象の哺乳動物胚が、胚盤胞期の哺乳動物胚である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項6】
工程（ｂ）において、イメージングサイトメーターを用いて、被検対象の哺乳動物胚における活性酸素種濃度を測定する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項7】
活性酸素種検出用蛍光指示薬又はグルタチオン検出用蛍光指示薬を含む、着床能力の高い哺乳動物胚を体外において選別するためのキット。
【請求項8】
活性酸素種検出用蛍光指示薬及びグルタチオン検出用蛍光指示薬を含む、請求項７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、哺乳動物胚における活性酸素種（Reactive Oxygen Species；以下、「ＲＯＳ」ともいう）濃度が増加すること、及び／又は、哺乳動物胚におけるグルタチオン（Glutathione；以下、「ＧＳＨ」ともいう）濃度が低下することを指標として、着床する可能性が高い哺乳動物胚を体外において選別する方法や、ＲＯＳ検出用蛍光指示薬及び／又はＧＳＨ検出用蛍光指示薬を含む、かかる選別方法に用いるキットに関する。
【背景技術】
【0002】
体外受精や顕微授精等の生殖補助技術は、不妊治療を目的とした医療分野のみならず、優良家畜の生産、家畜改良等を目的とした畜産分野においても欠かせない技術となっている。体外において、哺乳動物精子と哺乳動物卵子とを受精させた後、卵割により２細胞期胚、４細胞期胚、８細胞期胚と細胞増殖により割球が増加し、桑実胚を経て、胚盤胞期の哺乳動物胚へと発生する。哺乳動物胚を移植する場合、通常、着床前の状態である胚盤胞期の胚が使用されるが、受胎率が低いことが問題となっており、例えば、ウシの場合、４０～５０％であり、ヒトの場合、２５～３５％程度である。その原因として、体外培養環境と生体内環境との相違により、発生不良の胚が存在することが考えられている。このため、着床能力の高い哺乳動物胚を選別する方法が求められている。
【0003】
例えば、哺乳動物胚の生育状態を、Veeckによる分類法やGardnerによる分類法を用いて、評価する方法が知られている（非特許文献１）。また、最近では、哺乳動物胚の培養液中に含まれる可溶性ＣＤ１４６を指標にして、着床する可能性の高い哺乳動物胚を選別する方法が報告されている（特許文献１）。
【0004】
本発明者らは、アルギニン及びロイシン添加群の哺乳動物胚の着床率が、無添加群の哺乳動物胚の着床率と比べ、増加することや、アルギニン添加群の哺乳動物胚の着床率が、無添加群の哺乳動物胚の着床率と比べ、減少することを報告している（非特許文献２）。かかる結果から、本発明者は、哺乳動物胚において、アルギニンから一酸化窒素合成酵素により合成された一酸化窒素が、哺乳動物胚の着床率に影響を及ぼしている可能性を考え、検討した結果、哺乳動物胚における一酸化窒素濃度を指標として、着床する可能性が高い哺乳動物胚を選択できることを報告している（特許文献２）。
【0005】
一方、一般的に、ＲＯＳが哺乳動物胚に蓄積すると酸化ダメージが生じた結果、哺乳動物胚の着床率は低下すると考えられている（特許文献３）。このため、哺乳動物胚におけるＲＯＳ濃度が増加することを指標として、着床能力の高い哺乳動物胚を選別できるとは考えられていなかった。また、哺乳動物胚におけるＧＳＨ濃度が低下することを指標として、着床能力の高い哺乳動物胚を選別できることも知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特表２０１８－５１３９７９号公報
【特許文献2】特開２０２０－１８４９９４
【特許文献3】国際公開第２０１８／０５６４６１号パンフレット
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Baczkowski, T. et al., Reprod, Biol. (2004) 4:5-22
【非特許文献2】第１０９回日本繁殖生物学会大会 Ｐ－１６ 抄録
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明の課題は、着床能力の高い哺乳動物胚を、比較的簡便に選別する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者は、前述のとおり、アルギニン及びロイシン添加群の哺乳動物胚の着床率が、無添加群の哺乳動物胚の着床率と比べ、増加することや、アルギニン添加群の哺乳動物胚の着床率が、無添加群の哺乳動物胚の着床率と比べ、減少することを報告している（非特許文献２）。しかしながら、このような、哺乳動物胚の対外培養に用いる培養液中のアミノ酸の違いにより、哺乳動物胚の着床率が変化するメカニズムについては明らかにされていなかった。
【0010】
そこで、哺乳動物胚において、ＲＯＳ濃度と、インテグリンα５β１（ＩＴＧＡ５Ｂ１）、すなわち、胚着床関連因子の１つであり（文献「Dev.Biol. 2004; 268: 135-151」参照）、胚の着床率を正に制御する因子（文献「Int. J. Dev. Biol. 2014; 58: 261-271」参照）の発現量とを測定し、哺乳動物胚の着床率と、哺乳動物胚におけるＲＯＳ濃度及びＩＴＧＡ５Ｂ１発現量との関連性を解析した。その結果、アルギニン及びロイシン添加群の哺乳動物胚（すなわち、着床率がより高い哺乳動物胚）におけるＲＯＳ濃度及びＩＴＧＡ５Ｂ１発現量は、共に、アルギニン添加群の哺乳動物胚や無添加群の哺乳動物胚（すなわち、着床率がより低い哺乳動物胚）におけるＲＯＳ濃度及びＩＴＧＡ５Ｂ１発現量と比べ、増加することを見いだした。また、哺乳動物胚におけるＲＯＳ濃度とＩＴＧＡ５Ｂ１発現量との間には、正の相関関係があることを確認した。さらに、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）は、ＧＳＨを用いてＲＯＳを消去する抗酸化酵素であることから、ＧＰｘの発現量とＧＳＨ濃度についても解析した結果、アルギニン及びロイシン添加群の哺乳動物胚におけるＧＰｘ４の発現量及びＧＳＨ濃度は、共に、アルギニン添加群の哺乳動物胚や無添加群の哺乳動物胚におけるＧＰｘ４の発現量及びＧＳＨ濃度と比べ、低下することが確認された。本発明は、これらの知見に基づき、完成するに至ったものである。
【0011】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕以下の工程（ａ）～（ｃ）を含む、着床能力の高い哺乳動物胚を体外において選別する方法。
（ａ）活性酸素種検出用蛍光指示薬又はグルタチオン検出用蛍光指示薬と、取得された被検対象の哺乳動物胚とをインビトロで接触させる工程；
（ｂ）被検対象の哺乳動物胚における、活性酸素種検出用蛍光指示薬由来の蛍光量を指標として、被検対象の哺乳動物胚における活性酸素種濃度を測定するか、あるいは、被検対象の哺乳動物胚における、グルタチオン検出用蛍光指示薬由来の蛍光量を指標として、被検対象の哺乳動物胚におけるグルタチオン濃度を測定する工程；
（ｃ）工程（ｂ）において測定した活性酸素種濃度が、比較対照の哺乳動物胚における活性酸素種濃度よりも高い場合、被検対象の哺乳動物胚を、比較対照の哺乳動物胚よりも着床能力の高い哺乳動物胚として選択するか、あるいは、工程（ｂ）において測定したグルタチオン濃度が、比較対照の哺乳動物胚におけるグルタチオン濃度よりも低い場合、被検対象の哺乳動物胚を、比較対照の哺乳動物胚よりも着床能力の高い哺乳動物胚として選択する工程；
〔２〕工程（ａ）において、活性酸素種検出用蛍光指示薬及びグルタチオン検出用蛍光指示薬と、取得された被検対象の哺乳動物胚とをインビトロで接触させ、
工程（ｂ）において、被検対象の哺乳動物胚における、活性酸素種検出用蛍光指示薬由来の蛍光量及びグルタチオン検出用蛍光指示薬由来の蛍光量を指標として、被検対象の哺乳動物胚における活性酸素種濃度及びグルタチオン濃度を測定し、
工程（ｃ）において、工程（ｂ）において測定した活性酸素種濃度が、比較対照の哺乳動物胚における活性酸素種濃度よりも高く、かつ、工程（ｂ）において測定したグルタチオン濃度が、比較対照の哺乳動物胚におけるグルタチオン濃度よりも低い場合、被検対象の哺乳動物胚を、比較対照の哺乳動物胚よりも着床能力の高い哺乳動物胚として選択する、上記〔１〕に記載の方法。
〔３〕比較対照の哺乳動物胚が、アルギニン及びロイシンのいずれも含まない培養液中で体外培養した哺乳動物胚；又はアルギニンを含む培養液中で培養した哺乳動物胚；である、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕工程（ａ）の前に、被検対象の哺乳動物胚を、アルギニン及びロイシンを含む培養液中で体外培養する工程（ｐ）をさらに含む、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔５〕被検対象の哺乳動物胚が、胚盤胞期の哺乳動物胚である、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔６〕工程（ｂ）において、イメージングサイトメーターを用いて、被検対象の哺乳動物胚における活性酸素種濃度を測定する、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔７〕活性酸素種検出用蛍光指示薬又はグルタチオン検出用蛍光指示薬を含む、着床能力の高い哺乳動物胚を体外において選別するためのキット。
〔８〕活性酸素種検出用蛍光指示薬及びグルタチオン検出用蛍光指示薬を含む、上記〔７〕に記載のキット。
〔１〕以下の工程（ａ）～（ｃ）を含む、着床能力の高い哺乳動物胚を体外において選別する方法。
（ａ）活性酸素種検出用蛍光指示薬又はグルタチオン検出用蛍光指示薬と、取得された被検対象の哺乳動物胚とをインビトロで接触させる工程；
（ｂ）被検対象の哺乳動物胚における、活性酸素種検出用蛍光指示薬由来の蛍光量を指標として、被検対象の哺乳動物胚における活性酸素種濃度を測定するか、あるいは、被検対象の哺乳動物胚における、グルタチオン検出用蛍光指示薬由来の蛍光量を指標として、被検対象の哺乳動物胚におけるグルタチオン濃度を測定する工程；
（ｃ）工程（ｂ）において測定した活性酸素種濃度が、比較対照の哺乳動物胚における活性酸素種濃度よりも高い場合、被検対象の哺乳動物胚を、比較対照の哺乳動物胚よりも着床能力の高い哺乳動物胚として選択するか、あるいは、工程（ｂ）において測定したグルタチオン濃度が、比較対照の哺乳動物胚におけるグルタチオン濃度よりも低い場合、被検対象の哺乳動物胚を、比較対照の哺乳動物胚よりも着床能力の高い哺乳動物胚として選択する工程；
〔２〕工程（ａ）において、活性酸素種検出用蛍光指示薬及びグルタチオン検出用蛍光指示薬と、取得された被検対象の哺乳動物胚とをインビトロで接触させ、
工程（ｂ）において、被検対象の哺乳動物胚における、活性酸素種検出用蛍光指示薬由来の蛍光量及びグルタチオン検出用蛍光指示薬由来の蛍光量を指標として、被検対象の哺乳動物胚における活性酸素種濃度及びグルタチオン濃度を測定し、
工程（ｃ）において、工程（ｂ）において測定した活性酸素種濃度が、比較対照の哺乳動物胚における活性酸素種濃度よりも高く、かつ、工程（ｂ）において測定したグルタチオン濃度が、比較対照の哺乳動物胚におけるグルタチオン濃度よりも低い場合、被検対象の哺乳動物胚を、比較対照の哺乳動物胚よりも着床能力の高い哺乳動物胚として選択する、上記〔１〕に記載の方法。
〔３〕比較対照の哺乳動物胚が、アルギニン及びロイシンのいずれも含まない培養液中で体外培養した哺乳動物胚；又はアルギニンを含む培養液中で培養した哺乳動物胚；である、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕工程（ａ）の前に、被検対象の哺乳動物胚を、アルギニン及びロイシンを含む培養液中で体外培養する工程（ｐ）をさらに含む、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔５〕被検対象の哺乳動物胚が、胚盤胞期の哺乳動物胚である、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔６〕工程（ｂ）において、イメージングサイトメーターを用いて、被検対象の哺乳動物胚における活性酸素種濃度を測定する、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔７〕活性酸素種検出用蛍光指示薬又はグルタチオン検出用蛍光指示薬を含む、着床能力の高い哺乳動物胚を体外において選別するためのキット。
〔８〕活性酸素種検出用蛍光指示薬及びグルタチオン検出用蛍光指示薬を含む、上記〔７〕に記載のキット。
【0012】
また本発明の実施の他の形態として、
着床能力の高い哺乳動物胚を体外において選別するためのデータを収集又は作成する方法；
着床能力の高い哺乳動物胚を体外において選別するための情報を提供する方法；
着床能力の高い哺乳動物胚を体外において選別するために必要な情報を提供する方法；
着床能力の高い哺乳動物胚を体外において判断するための情報を提供する方法；等
を挙げることができる。これらの方法としては、上記工程（ａ）及び（ｂ）を含み、かつ、工程（ｂ）の後に、工程（ｂ）において測定した活性酸素種濃度が、比較対照の哺乳動物胚における活性酸素種濃度よりも高い場合、及び／又は、工程（ｂ）において測定したグルタチオン濃度が、比較対照の哺乳動物胚におけるグルタチオン濃度よりも低い場合、被検対象の哺乳動物胚を、比較対照の哺乳動物胚よりも着床能力の高い哺乳動物胚として選択するためのデータ（情報）を収集、作成、又は提供する工程（Ｃ）；を含むものが好ましい。
着床能力の高い哺乳動物胚を体外において選別するためのデータを収集又は作成する方法；
着床能力の高い哺乳動物胚を体外において選別するための情報を提供する方法；
着床能力の高い哺乳動物胚を体外において選別するために必要な情報を提供する方法；
着床能力の高い哺乳動物胚を体外において判断するための情報を提供する方法；等
を挙げることができる。これらの方法としては、上記工程（ａ）及び（ｂ）を含み、かつ、工程（ｂ）の後に、工程（ｂ）において測定した活性酸素種濃度が、比較対照の哺乳動物胚における活性酸素種濃度よりも高い場合、及び／又は、工程（ｂ）において測定したグルタチオン濃度が、比較対照の哺乳動物胚におけるグルタチオン濃度よりも低い場合、被検対象の哺乳動物胚を、比較対照の哺乳動物胚よりも着床能力の高い哺乳動物胚として選択するためのデータ（情報）を収集、作成、又は提供する工程（Ｃ）；を含むものが好ましい。
【発明の効果】
【0013】
本発明によると、着床する可能性が高い哺乳動物胚を、比較的簡便に選別することができる。このため、本発明は、不妊治療を目的とした医療分野や、優良家畜（例えば、霜降り形質を示すウシ）の生産、家畜改良等を目的とした畜産分野などの生殖補助技術（例えば、体外受精、顕微授精）を必要とする分野に資するものである。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】実施例１において、３種類の群（無添加群［ｎ＝２７］、Ａｒｇ添加群［ｎ＝３０］、及びＡｒｇ＋Ｌｅｕ添加群［ｎ＝３１］）の哺乳動物胚におけるＲＯＳ濃度を、ＲＯＳ蛍光画像を基に測定した結果を示す図である。図１Ａにおけるバーサイズは、１００μｍを示す。図１Ｂにおいて、縦軸のＲＯＳ濃度は、無添加群の哺乳動物胚におけるＲＯＳ濃度の平均値を１としたときの相対値として示す。図中の「＊」は、統計学的に有意差があること（ｐ＜０.０５）を示す。
【図2】実施例１において、３種類の群（無添加群［ｎ＝３８］、Ａｒｇ添加群［ｎ＝３２］、及びＡｒｇ＋Ｌｅｕ添加群［ｎ＝３７］）の哺乳動物胚におけるＩＴＧＡ５Ｂ１発現量を、ＩＴＧＡ５Ｂ１蛍光画像を基に測定した結果を示す図である。縦軸のＩＴＧＡ５Ｂ１発現量は、無添加群の哺乳動物胚におけるＩＴＧＡ５Ｂ１発現量の平均値を１としたときの相対値として示す。図中の各点は、個々の哺乳動物胚に相当する。図中の「＊」は、統計学的に有意差があること（ｐ＜０.０５）を示す。
【図3】実施例２において、３種類の群（無添加群［ｎ＝３１］、Ａｒｇ＋Ｌｅｕ添加群［ｎ＝３５］、及びＡｒｇ＋Ｌｅｕ＋ＡｓＡ添加群［ｎ＝３３］）の哺乳動物胚におけるＲＯＳ濃度を、ＲＯＳ蛍光画像を基に測定した結果を示す図である。図３Ａにおけるバーサイズは、１００μｍを示す。図３Ｂにおいて、縦軸のＲＯＳ濃度は、無添加群の哺乳動物胚におけるＲＯＳ濃度の平均値を１としたときの相対値として示す。図中の「＊」は、統計学的に有意差があること（ｐ＜０.０５）を示す。
【図4】実施例２において、３種類の群（無添加群［ｎ＝３１］、Ａｒｇ＋Ｌｅｕ添加群［ｎ＝３５］、及びＡｒｇ＋Ｌｅｕ＋ＡｓＡ添加群［ｎ＝３３］）の哺乳動物胚におけるＩＴＧＡ５Ｂ１発現量を、ＩＴＧＡ５Ｂ１蛍光画像を基に測定した結果を示す図である。図４Ａにおけるバーサイズは、３０μｍを示す。図４Ｂにおいて、縦軸のＩＴＧＡ５Ｂ１発現量は、無添加群の哺乳動物胚におけるＩＴＧＡ５Ｂ１発現量の平均値を１としたときの相対値として示す。図中の各点は、個々の哺乳動物胚に相当する。図中の「＊」は、統計学的に有意差があること（ｐ＜０.０５）を示す。
【図5】図１～４の結果を基に、３種類の群（無添加群［図５Ａ］、Ａｒｇ＋Ｌｅｕ添加群［図５Ｂ］、及びＡｒｇ＋Ｌｅｕ＋ＡｓＡ添加群［図５Ｃ］）それぞれにおいて、哺乳動物胚におけるＲＯＳ濃度とＩＴＧＡ５Ｂ１発現量との相関関係を解析した結果を示す図である。
【図6】実施例３において、３種類の群（無添加群［ｎ＝３０］、Ａｒｇ＋Ｌｅｕ添加群［ｎ＝３０］、及びＡｒｇ＋Ｌｅｕ＋ＡｓＡ添加群［ｎ＝３０］）の哺乳動物胚におけるＧＰｘ１発現量（図６Ａ）及びＧＰｘ４発現量（図６Ｂ）を、ＧＰｘ１蛍光画像及びＧＰｘ４蛍光画像を基に測定した結果を示す図である。縦軸のＧＰｘ１発現量及びＧＰｘ４発現量は、それぞれ無添加群の哺乳動物胚におけるＧＰｘ１発現量及びＧＰｘ４発現量の平均値を１としたときの相対値として示す。図中の各点は、個々の哺乳動物胚に相当する。図中の「＊」は、統計学的に有意差があること（ｐ＜０.０５）を示す。
【図7】実施例３において、３種類の群（無添加群［ｎ＝３０］、Ａｒｇ添加群［ｎ＝３０］、及びＡｒｇ＋Ｌｅｕ添加群［ｎ＝３０］）の哺乳動物胚におけるＧＳＨ濃度を、ＧＳＨ蛍光画像を基に測定した結果を示す図である。縦軸のＧＳＨ濃度は、無添加群の哺乳動物胚におけるＧＳＨ濃度の平均値を１としたときの相対値として示す。図中の「＊」は、統計学的に有意差があること（ｐ＜０.０５）を示す。
【発明を実施するための形態】
【0015】
本発明の方法は、活性酸素種検出用蛍光指示薬又はグルタチオン検出用蛍光指示薬と、取得された被検対象の哺乳動物胚とをインビトロで接触させる工程（ａ）；と、被検対象の哺乳動物胚における、活性酸素種検出用蛍光指示薬由来の蛍光量（換言すると、蛍光輝度）を指標として、被検対象の哺乳動物胚における活性酸素種濃度を測定するか、あるいは、被検対象の哺乳動物胚における、グルタチオン検出用蛍光指示薬由来の蛍光量を指標として、被検対象の哺乳動物胚におけるグルタチオン濃度を測定する工程（ｂ）；と、工程（ｂ）において測定した活性酸素種濃度が、比較対照の哺乳動物胚における活性酸素種濃度よりも高い場合、被検対象の哺乳動物胚を、比較対照の哺乳動物胚よりも着床能力の高い哺乳動物胚として選択するか、あるいは、工程（ｂ）において測定したグルタチオン濃度が、比較対照の哺乳動物胚におけるグルタチオン濃度よりも低い場合、被検対象の哺乳動物胚を、比較対照の哺乳動物胚よりも着床能力の高い哺乳動物胚として選択する工程（ｃ）；とを順次含む、着床能力の高い哺乳動物胚を体外において選別する方法（以下、「本件選別方法」ということがある）であり、哺乳動物がヒトの場合、本件選別方法には、体外において、ヒト胚の状態を診断し、女性の子宮に着床させるヒト胚を選別する工程；や、工程（ｃ）において着床能力の高い胚として選択したヒト胚を、女性の子宮に着床させる工程；等のいわゆる医師による医療行為は含まれない。他方、哺乳動物が非ヒト哺乳動物の場合、本件選別方法としては、工程（ｃ）において着床能力の高い胚として選択した非ヒト哺乳動物胚を、当該非ヒト哺乳動物と同一種の非ヒト哺乳動物胚の子宮に着床させる工程をさらに含むものであってもよい。
【0016】
本件選別方法においては、着床能力の高い哺乳動物胚をより効率よく選別する観点から、
工程（ａ）において、活性酸素種検出用蛍光指示薬及びグルタチオン検出用蛍光指示薬と、取得された被検対象の哺乳動物胚とをインビトロで接触させ、
工程（ｂ）において、被検対象の哺乳動物胚における、活性酸素種検出用蛍光指示薬由来の蛍光量及びグルタチオン検出用蛍光指示薬由来の蛍光量を指標として、被検対象の哺乳動物胚における活性酸素種濃度及びグルタチオン濃度を測定し、
工程（ｃ）において、工程（ｂ）において測定した活性酸素種濃度が、比較対照の哺乳動物胚における活性酸素種濃度よりも高く、かつ、工程（ｂ）において測定したグルタチオン濃度が、比較対照の哺乳動物胚におけるグルタチオン濃度よりも低い場合、被検対象の哺乳動物胚を、比較対照の哺乳動物胚よりも着床能力の高い哺乳動物胚として選択することが好ましい。
工程（ａ）において、活性酸素種検出用蛍光指示薬及びグルタチオン検出用蛍光指示薬と、取得された被検対象の哺乳動物胚とをインビトロで接触させ、
工程（ｂ）において、被検対象の哺乳動物胚における、活性酸素種検出用蛍光指示薬由来の蛍光量及びグルタチオン検出用蛍光指示薬由来の蛍光量を指標として、被検対象の哺乳動物胚における活性酸素種濃度及びグルタチオン濃度を測定し、
工程（ｃ）において、工程（ｂ）において測定した活性酸素種濃度が、比較対照の哺乳動物胚における活性酸素種濃度よりも高く、かつ、工程（ｂ）において測定したグルタチオン濃度が、比較対照の哺乳動物胚におけるグルタチオン濃度よりも低い場合、被検対象の哺乳動物胚を、比較対照の哺乳動物胚よりも着床能力の高い哺乳動物胚として選択することが好ましい。
【0017】
本発明のキットは、「着床能力の高い哺乳動物胚を体外において選別するため」という用途に特定された、活性酸素種検出用蛍光指示薬又はグルタチオン検出用蛍光指示薬を含むキット（以下、「本件キット」ということがある）であり、本件キットには、一般にこの種の検出キットに用いられる成分、例えば、当該指示薬の溶媒、担体、ｐＨ緩衝剤、安定剤の他、取扱説明書、着床能力の高い哺乳動物胚を選別するための説明書等の添付文書が通常含まれる。
【0018】
本件キットとしては、着床能力の高い哺乳動物胚をより効率よく選別する観点から、活性酸素種検出用蛍光指示薬及びグルタチオン検出用蛍光指示薬の両方を含むものが好ましい。
【0019】
上記活性酸素種検出用蛍光指示薬としては、哺乳動物胚に接触させたときに、当該胚におけるＲＯＳの存在量と相関して発光強度・寿命が変化する蛍光プローブを含むものであればよく、かかる蛍光プローブとしては、細胞膜透過性を有し、哺乳動物胚内に移行するものが好ましい。かかる蛍光プローブとしては、例えば、ＨＰＦ（hydroxyphenyl fluorescein）、ＡＰＦ（aminophenyl fluorescein）ＯｘｉＯＲＡＮＧＥ（登録商標）、ＨｙＳＯｘ、ＨＹＤＲＯＰ（登録商標）、ＨＹＤＲＯＰ－ＥＸ（登録商標）（いずれも、五稜化薬社製）、CellROX Deep Red、CellROX Green、CellROX Orange（いずれも、Thermo Fisher社製）、ＤＣＦＨ－ＤＡ（2',7'-Dichlorodihydrofluorescin diacetate）等を挙げることができる。上記活性酸素種検出用蛍光指示薬由来の蛍光量は、哺乳動物胚におけるＲＯＳ濃度と相関するため、かかる蛍光量を指標として、哺乳動物胚におけるＲＯＳ濃度を測定することができる。
【0020】
上記活性酸素種としては、例えば、ラジカル種（例えば、スーパーオキシド、ヒドロキシルラジカル、ヒドロペルオキシラジカル、ペルオキシラジカル、アルキルペルオキシルラジカル、アルコキシラジカル、二酸化窒素、一酸化窒素、チイル／ペルチイルラジカル等）、非ラジカル種（例えば、過酸化水素、一重項酸素、脂質ヒドロペルオキシド、次亜塩素酸、オゾン、ペルオキシ亜硝酸等）などを挙げることができる。
【0021】
上記グルタチオン検出用蛍光指示薬としては、哺乳動物胚に接触させたときに、当該胚におけるＧＳＨの存在量と相関して発光強度・寿命が変化する蛍光プローブを含むものであればよく、かかる蛍光プローブとしては、細胞膜透過性を有し、哺乳動物胚内に移行するものが好ましい。かかる蛍光プローブとしては、例えば、QuicGSH（登録商標）3.0（五稜化薬社製）、ThiolTracker Violet、ＭＣＢ（monochlorobimane）（いずれも、Thermo Fisher社製）、Thiolite Green（AAT Bioquest社製）等を挙げることができる。上記グルタチオン検出用蛍光指示薬由来の蛍光量は、哺乳動物胚におけるＧＳＨ濃度と相関するため、かかる蛍光量を指標として、哺乳動物胚におけるＧＳＨ濃度を測定することができる。
【0022】
本明細書において、「着床能力の高い哺乳動物胚を体外において選別する」とは、哺乳動物の体外に存在する哺乳動物胚の中から、着床能力の高い哺乳動物胚（例えば、ＩＴＧＡ５Ｂ１等の胚着床関連因子の発現が上昇した哺乳動物胚）を選択することを意味し、具体的には、体外受精、顕微授精等の方法により、哺乳動物精子と哺乳動物卵子とをインビトロで受精し、必要に応じて体外培養することにより得られた哺乳動物胚の中から、着床能力の高い哺乳動物胚を選択することを意味する。したがって、「着床能力の高い哺乳動物胚を体外において選別する」には、哺乳動物の生体内で哺乳動物精子を、排卵期の哺乳動物子宮内に注入する方法（人工授精［ＩＵＩ］）により、哺乳動物精子と哺乳動物卵子とをインビボで授精し、哺乳動物の生体内に存在する哺乳動物胚から、着床能力の高い哺乳動物胚を選択することは含まれない。
【0023】
上記哺乳動物としては、ヒトや、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等の非ヒト霊長類などの非ヒト哺乳動物を例示することができ、中でも、マウス、ブタ、ヒトを好適に例示することができる。
【0024】
上記胚としては、受精直後の胚（すなわち、受精卵）～着床前の状態の胚（すなわち、胚盤胞期の胚）に含まれる発生段階の胚であればよく、具体的には、受精卵（接合子）、２細胞期の胚、４細胞期の胚、８細胞期の胚、桑実胚、胚盤胞期の胚を挙げることができ、胚盤胞期の胚を好適に例示することができる。また、上記胚には、精子と卵子とを体外受精、顕微授精等の方法により作製された胚の他、除核卵子（レシピエント卵子）又は除核受精胚（レシピエント胚）に、ドナー細胞の核を注入（マイクロインジェクション）することにより作製された受精核移植胚も含まれる。
【0025】
上記工程（ａ）において、活性酸素種検出用蛍光指示薬又はグルタチオン検出用蛍光指示薬と、取得された被検対象の哺乳動物胚とをインビトロで接触させる方法としては、哺乳動物胚の生存及び発生に悪影響を及ぼすことなく、活性酸素種検出用蛍光指示薬又はグルタチオン検出用蛍光指示薬の特性を考慮して接触時間（インキュベート時間）；接触時の温度、二酸化炭素（ＣＯ２）濃度、及び酸素（Ｏ２）濃度；接触に用いる溶媒；等の条件は適宜選択することができる。
【0026】
上記工程（ａ）における接触時間としては、特に制限されず、例えば、１分～２４時間の範囲内であり、好ましくは５分～１２時間、より好ましくは１０分～６時間、さらに好ましくは１０分～３時間、さらにより好ましくは１０分～１時間である。
【0027】
上記工程（ａ）における接触時の温度としては、例えば、０～４０℃の範囲内であり、好ましくは４～４０℃、より好ましくは１４～３９℃、さらに好ましくは２０～３９℃、さらにより好ましくは３０～３８℃である。また、上記工程（ａ）における接触時のＣＯ２濃度としては、例えば、１～１０％の範囲内であり、好ましくは２～８％、より好ましくは約５％（４～６％）である。また、上記工程（ａ）における接触時のＯ２濃度は、正常酸素濃度（１８～２２％Ｏ２）であっても、低酸素濃度（０～１０％Ｏ２）であってもよい。なお、活性酸素種検出用蛍光指示薬又はグルタチオン検出用蛍光指示薬と接触させる前に、哺乳動物胚を体外培養する場合、上記工程（ａ）の接触条件は、体外培養時と同じ条件を選択することができる。
【0028】
上記接触に用いる溶媒としては、例えば、生理食塩水や、緩衝効果のある生理食塩水（例えば、ＰＢＳ、トリス緩衝生理食塩水［Tris Buffered Saline；ＴＢＳ］、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水）、リンゲル液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、重炭酸リンゲル液、５％グルコース水溶液、培養液等を挙げることができる。
【0029】
上記工程（ａ）において、哺乳動物胚を哺乳動物の生体外で培養するのに適した培養条件下となるように、培養液、培養時間、温度、二酸化炭素（ＣＯ２）濃度、酸素（Ｏ２）濃度等の条件は適宜選択することがきる。
【0030】
本発明において、哺乳動物胚は、哺乳動物の生体外で受精卵を作製できる公知の方法、例えば、哺乳動物精子を、顕微鏡下でガラスピペット（顕微授精用インジェクションピペット）等を用いて、採取された少なくとも１つの哺乳動物卵子内に注入する方法（すなわち、顕微授精）；哺乳動物精子と、哺乳動物卵子とを、培養液中で自然に受精させる方法（すなわち、体外受精による媒精）；等により受精直後の胚を得た後、必要に応じて各発生段階まで体外培養することにより取得することができる。また、本発明において、哺乳動物胚の数としては、１つでもよいし、複数（例えば、２以上、３以上、５以上、１０以上、２０以上、３０以上、６０以上、１００以上）でもよい。
【0031】
上記工程（ｂ）において、被検対象の哺乳動物胚における活性酸素種濃度やグルタチオン濃度を測定する方法としては、哺乳動物胚における、活性酸素種検出用蛍光指示薬由来の蛍光量やグルタチオン検出用蛍光指示薬由来の蛍光量を、被検対象の哺乳動物胚が生きた状態で測定できる方法（ライブイメージング法）であればよく、イメージングサイトメーターを用いて測定する方法を好適に例示することができる。ここで「イメージングサイトメーター（イメージサイトメーターともいう）」とは、顕微鏡による蛍光画像の取得と、取得された蛍光画像の解析とを自動的に行うことができる画像解析システムを意味する。上記工程（ｂ）の測定方法の具体的な形態としては、１又は複数の哺乳動物胚について、各胚中で発せされる活性酸素種検出用蛍光指示薬由来の蛍光量やグルタチオン検出用蛍光指示薬由来の蛍光量を検出・定量し、蛍光画像として取得すること；かかる蛍光画像を基にして得られた、各胚における全蛍光量や最大蛍光量などの蛍光量に関する値を、ヒストグラムやドットプロットなどで表示した解析データを取得すること；かかる解析データを基にして得られた、蛍光量に関する定量結果を取得すること；等を自動的に行う方法を挙げることができる。
【0032】
上記イメージングサイトメーターとしては、例えば、共焦点レーザー顕微鏡システム（A1R HD25、ニコン社製）、共焦点レーザー顕微鏡システム（ＴＣＳ ＳＰ８、ライカマイクロシステムズ社製）、スピニングディスク型共焦点システム（SpinSR10、オリンパス社製）、マルチアングルライブイメージングシステム（Lightsheet Z.1、ZEISS社製）等を挙げることができる。
【0033】
上記比較対照の哺乳動物胚としては、被検対象とは異なる哺乳動物胚であればよく、通常、被検対象の哺乳動物胚と同一種の胚であり、好ましくは、上記工程（ａ）の前に、アルギニン及びロイシンのいずれも含まない培養液中で体外培養した哺乳動物胚や、アルギニンを含む培養液中で体外培養した哺乳動物胚である。
【0034】
本件選別方法において、哺乳動物胚における活性酸素種濃度やグルタチオン濃度は、絶対値であっても、相対値であってもよい。活性酸素種濃度やグルタチオン濃度の絶対値は、例えば、既知の活性酸素種濃度やグルタチオン濃度を有する哺乳動物胚（標準）を用いて、活性酸素種検出用蛍光指示薬由来の蛍光量やグルタチオン検出用蛍光指示薬由来の蛍光量との関係を示す検量線を作成し、かかる検量線を基に算出することができる。また、被検対象の哺乳動物胚における活性酸素種濃度やグルタチオン濃度の相対値は、例えば、比較対照の哺乳動物胚における活性酸素種濃度（すなわち、活性酸素種検出用蛍光指示薬由来の蛍光量）やグルタチオン濃度（すなわち、グルタチオン検出用蛍光指示薬由来の蛍光量）を基準にして算出することができる。なお、比較対照の哺乳動物胚における活性酸素種濃度やグルタチオン濃度は、比較対照の哺乳動物胚を、被検対象の哺乳動物胚と同様の処理を行い、算出することが好ましい。
【0035】
上記「比較対照の哺乳動物胚における活性酸素種濃度やグルタチオン濃度」としては、比較対照の哺乳動物胚集団における活性酸素種濃度やグルタチオン濃度をそれぞれ測定し、それらの値に基づき、統計解析ソフトウェアを用いたＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic）曲線等を用いて算出された閾値（カットオフ値）であってもよい。また、上記「比較対照の哺乳動物胚における活性酸素種濃度やグルタチオン濃度」は、本件選別方法を実施する際、その都度測定したものを用いてもよいし、予め測定した値を用いてもよい。
【0036】
本件選別方法としては、哺乳動物胚の着床率を高めるために、上記工程（ａ）の前に、被検対象の哺乳動物胚を、アルギニン及びロイシンを含む培養液中で体外培養する工程（ｐ）をさらに含むものが好ましい。本明細書において、哺乳動物胚を培養液中で体外培養する場合、培養時間の下限としては、例えば、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、３０時間、３６時間、４８時間等であり、培養時間の上限としては、例えば、６０時間、４８時間、３６時間、３０時間である。したがって、哺乳動物胚を培養液中で体外培養する場合、培養時間としては、例えば、１２～６０時間、１６～４８時間、２０～３６時間、２０～３０時間等を挙げることができる。
【0037】
本明細書において、培養液中のアルギニンの濃度としては、例えば、０．００１～１０ｍＭの範囲内であり、０．００３～６ｍＭ、０．００６～３ｍＭ、０．０１～３ｍＭ、０．０３～３ｍＭ、０．０６～３ｍＭ、０．００６～１ｍＭ、０．０１～１ｍＭ、０．０３～３ｍＭ、０．０６～１ｍＭ等を挙げることができる。
【0038】
本明細書において、培養液中のロイシンの濃度としては、例えば、０．００１～１０ｍＭの範囲内であり、０．００３～６ｍＭ、０．００６～３ｍＭ、０．０１～３ｍＭ、０．０３～３ｍＭ、０．０６～３ｍＭ、０．００６～１ｍＭ、０．０１～１ｍＭ、０．０３～３ｍＭ、０．０６～１ｍＭ等を挙げることができる。
【0039】
本明細書において、培養液としては、哺乳動物胚の培養に適した培養液であればよく、血清（例えば、０．１～３０［ｖ／ｖ］％のＦＢＳ、ＣＳ等）を含む培養液であっても、無血清培養液であってもよいが、血清中に含まれるイオン化血清アルブミンによる影響を最小限にする観点から、無血清培養液が好ましい。かかる「無血清培養液」とは、無調整又は未精製の血清を含まない培養液を意味し、血清代替物を含む培養液は、無血清培養液に含まれる。かかる血清代替物としては、具体的には、市販のＢ２７サプリメント（－インスリン）（Life Technologies社製）、Ｎ２サプリメント（LifeTechnologies社製）、Ｂ２７サプリメント（Life Technologies社製）、Knockout Serum Replacement（Invitrogen社製）等を挙げることができる。上記培養液の具体例としては、例えば、ウシ胚を培養する場合、ＴＣＭ－１９９培養液（文献「Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1950; 73: 1-8」参照）；ｍＳＯＦ培養液（特開２０１２－２１０１９９号公報参照）；等を挙げることができ、ブタ胚を培養する場合、ＮＣＳＵ－２３培養液（文献「Theriogenology 1992;37: 95-109」参照）；ＰＺＭ培養液（文献「Biol. Reprod. 2002; 66: 112-119」参照）；等を挙げることができ、ヒツジ胚を培養する場合、Ｅａｇｌｅ’ｓＭＥＭ培養液（文献「J. Anim. Sci. 1976; 42: 912-917」参照）を挙げることができ、ウサギ胚を培養する場合、Ｈａｍ’ｓＦ１０培養液（文献「Exp. Cell Res. 1963; 29: 515-526」参照）；Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ培養液（文献「J. Anim. Sci. 1976; 42: 912-917」参照）；ＲＰＭＩ１６４０培養液（文献「J. Am. Med. Assoc. 1967; 199: 519-524」参照）；等を挙げることができ、ラット胚を培養する場合、ｍ－ＫＲＢ培養液；ＨＥＣＭ－１培養液（文献「Hum. Reprod. 1991; 6: 1445-1448」参照）；等を挙げることができ、ハムスター胚を培養する場合、Ｅａｇｌｅ’ｓＭＥＭ培養液（文献「J. Anim. Sci. 1976; 42: 912-917」参照）を挙げることができ、マウス胚を培養する場合、ＴＹＨ培養液（文献「Jpn.J. Anim. Reprod. 1971; 16: 147-157）；ＣＺＢ培養液（文献「J. Reprod. Fertil. 1989; 86:679-688」参照）；ＫＳＯＭ培養液（文献「Isaji et al., J. Reprod. Dev. 2015, 61: 503-510.」参照）；等を挙げることができ、ヒト胚を培養する場合、modified ＨＴＦ培養液（文献「J. Assist. Reprod. Genet.1995; 12: 97-105」参照）；１０％の血漿タンパク質分画（血漿タンパク質分画［ＰＰＦ；plasma protein fraction］、ヒトアルブミン［ＨＡＳ；human albumin］、ＳＳＳ；serum substitute supplement［Irvine Scientific社製］等）を含むクリベージメディウム（SAGE［登録商標］Cleavage Medium CooperSurgical,Inc.、コネチカット、米国）；スパームウォッシングメディウム（Irvine Scientific、カリフォルニア、米国）；ファティリゼイション（ＨＴＦ）メディウム（SAGE In-Vitro Fertilization、コネチカット、米国）；Ferticult（登録商標）Sperm Washing Flushing Medium（FertiPro N.V.、ベールネム、ベルギー）；Insemination Medium；NI fertilization Medium（NAKA ivf medium, ナカメディカル、日本) ；等を挙げることができる。
【0040】
上記培養液には、任意成分、例えば、還元剤（例えば、２－メルカプトエタノール、ジチオトレイトール［dithiothreitol；ＤＴＴ］等）、鉄源（例えば、トランスフェリン等）、ミネラル（例えば、亜セレン酸ナトリウム）、アミノ酸（例えば、グルタミン、アラニン、アスパラギン、セリン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、プロリン、チロシン）、ビタミン類（例えば、塩化コリン、パントテン酸、葉酸、ニコチンアミド、塩酸ピリドキサル、リボフラビン、塩酸チアミン、アスコルビン酸、ビオチン、イノシトール等）、糖類（例えば、グルコース等）、有機アミン類（例えば、プトレシン等）、ステロイド（例えば、プロゲステロン、β-エストラジオール等）、抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン等）、インターロイキン類（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－６等）、接着因子（例えば、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コラーゲン、フィブロネクチン等）、有機酸（例えば、ピルビン酸、コハク酸、乳酸等）若しくはその塩、緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳ等）などが含まれる。本明細書において「任意成分」とは、含んでもよいし含まなくてもよい成分のことを意味する。
【0041】
本明細書において、哺乳動物胚の体外培養における温度は、通常約３０～４０℃の範囲内であり、好ましくは約３７℃である。また、哺乳動物胚の体外培養時のＣＯ２濃度は、通常約１～１０％の範囲内であり、好ましくは約５％である。また、哺乳動物胚の体外培養時のＯ２濃度は、正常酸素濃度（１８～２２％Ｏ２）であっても、低酸素濃度（０～１０％Ｏ２）であってもよい。
【0042】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。以下の実施例において、精子の前培養、媒精、及び胚の培養は、インキュベーター内（５％ＣＯ２／２０％Ｏ２、３７℃条件下、以下同じ）で行った。なお、ＨＴＦ培養液及びＫＳＯＭ培養液は、定法に従って調製した。
【実施例0043】
実施例１．３種類の群（無添加群、Ａｒｇ添加群、及びＡｒｇ＋Ｌｅｕ添加群）の哺乳動物胚におけるＲＯＳ濃度及びＩＴＧＡ５Ｂ１発現量の測定
哺乳動物胚の着床率と、当該胚におけるＲＯＳ濃度及びＩＴＧＡ５Ｂ１発現量との関連性を解析した。
哺乳動物胚の着床率と、当該胚におけるＲＯＳ濃度及びＩＴＧＡ５Ｂ１発現量との関連性を解析した。
【0044】
１－１ 方法
［媒精］
以下の手順〔１〕～〔７〕に従って、体外にて哺乳動物精子と卵子の媒精を行った。
〔１〕オスの５ヶ月齢ＩＣＲマウスを安楽死させた後、精巣上体の尾部を摘出し、回収した。
〔２〕４００μＬのＨＴＦ培養液を、精子前培養用ディッシュに滴下し、ＨＴＦ培養液の滴（ドロップ）を調製した後、その上を、流動パラフィン（ナカライテスク社製）で覆った。
〔３〕回収した精巣上体の尾部を把持した状態でハサミにて精巣上体管に傷をつけ、得られた精子塊を１ｍＬの２６Ｇ針付きツベルクリン用シリンジ（テルモ社製）を用いてＨＴＦ培養液のドロップに移し、媒精前の精子の培養（前培養）を２時間行った。
〔４〕メスの５ヶ月齢ＩＣＲマウスに、妊馬血清性腺刺激ホルモン（ＰＭＳＧ；pregnantmare serum gonadotropin）を腹腔内投与し、ＰＭＳＧ投与４８時間後にヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ；Human chorionic gonadotropin）を投与することにより過排卵を誘起し、ｈＣＧ投与１２～１６時間後にマウスを安楽死させ、卵管を回収した。
〔５〕２００μＬのＨＴＦ培養液を、媒精用ディッシュに滴下し、ＨＴＦ培養液のドロップを調製した後、その上を、流動パラフィンで覆った。
〔６〕回収した卵管を、媒精用ディッシュにおける流動パラフィン内に移し、ピンセットで把持した状態で１ｍＬの２６Ｇ針付きツベルクリン用シリンジにて膨大部の卵管壁を引き裂き、得られた卵子塊を、ＨＴＦ培養液のドロップに移した。
〔７〕前培養した精子を、マイクロピペッター（ニチリョー社製）を用いて７００精子／μＬに調整し、媒精用ディッシュにおける、卵子塊を含むＨＴＦ培養液のドロップ内に移し、媒精を行った。
［媒精］
以下の手順〔１〕～〔７〕に従って、体外にて哺乳動物精子と卵子の媒精を行った。
〔１〕オスの５ヶ月齢ＩＣＲマウスを安楽死させた後、精巣上体の尾部を摘出し、回収した。
〔２〕４００μＬのＨＴＦ培養液を、精子前培養用ディッシュに滴下し、ＨＴＦ培養液の滴（ドロップ）を調製した後、その上を、流動パラフィン（ナカライテスク社製）で覆った。
〔３〕回収した精巣上体の尾部を把持した状態でハサミにて精巣上体管に傷をつけ、得られた精子塊を１ｍＬの２６Ｇ針付きツベルクリン用シリンジ（テルモ社製）を用いてＨＴＦ培養液のドロップに移し、媒精前の精子の培養（前培養）を２時間行った。
〔４〕メスの５ヶ月齢ＩＣＲマウスに、妊馬血清性腺刺激ホルモン（ＰＭＳＧ；pregnantmare serum gonadotropin）を腹腔内投与し、ＰＭＳＧ投与４８時間後にヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ；Human chorionic gonadotropin）を投与することにより過排卵を誘起し、ｈＣＧ投与１２～１６時間後にマウスを安楽死させ、卵管を回収した。
〔５〕２００μＬのＨＴＦ培養液を、媒精用ディッシュに滴下し、ＨＴＦ培養液のドロップを調製した後、その上を、流動パラフィンで覆った。
〔６〕回収した卵管を、媒精用ディッシュにおける流動パラフィン内に移し、ピンセットで把持した状態で１ｍＬの２６Ｇ針付きツベルクリン用シリンジにて膨大部の卵管壁を引き裂き、得られた卵子塊を、ＨＴＦ培養液のドロップに移した。
〔７〕前培養した精子を、マイクロピペッター（ニチリョー社製）を用いて７００精子／μＬに調整し、媒精用ディッシュにおける、卵子塊を含むＨＴＦ培養液のドロップ内に移し、媒精を行った。
【0045】
［胚の体外培養］
以下の手順〔１〕及び〔２〕に従って、哺乳動物胚の体外培養を行った。
〔１〕媒精から４時間後、受精卵を回収し、ＨＴＦ培養液に移し発生培養を行った。
〔２〕発生培養約９０時間後に、胚盤胞期まで発生が進んだ胚を、無添加群、Ａｒｇ添加群、及びＡｒｇ＋Ｌｅｕ添加群に分け、無添加群においては、アルギニン及びロイシンのいずれも含まないＫＳＯＭ培養液中で２４時間培養し、Ａｒｇ添加群においては、０．２ｍＭのアルギニンを含むＫＳＯＭ培養液中で２４時間培養し、Ａｒｇ＋Ｌｅｕ添加群においては、０．２ｍＭのアルギニン及び０．２ｍＭのロイシンを含むＫＳＯＭ培養液中で２４時間培養した。
以下の手順〔１〕及び〔２〕に従って、哺乳動物胚の体外培養を行った。
〔１〕媒精から４時間後、受精卵を回収し、ＨＴＦ培養液に移し発生培養を行った。
〔２〕発生培養約９０時間後に、胚盤胞期まで発生が進んだ胚を、無添加群、Ａｒｇ添加群、及びＡｒｇ＋Ｌｅｕ添加群に分け、無添加群においては、アルギニン及びロイシンのいずれも含まないＫＳＯＭ培養液中で２４時間培養し、Ａｒｇ添加群においては、０．２ｍＭのアルギニンを含むＫＳＯＭ培養液中で２４時間培養し、Ａｒｇ＋Ｌｅｕ添加群においては、０．２ｍＭのアルギニン及び０．２ｍＭのロイシンを含むＫＳＯＭ培養液中で２４時間培養した。
【0046】
［胚におけるＲＯＳ濃度の測定］
以下の手順〔１〕～〔３〕に従って、哺乳動物胚におけるＲＯＳ濃度を測定した。
〔１〕３種類の群（無添加群、Ａｒｇ添加群、及びＡｒｇ＋Ｌｅｕ添加群）の培養液中に、それぞれ、ＲＯＳ検出試薬（CellROX Orange、Thermo Fisher社製）を終濃度が５μＭとなるように添加し、２０分間インキュベーター内でインキュベートした。
〔２〕胚を新しいＫＳＯＭ培養液で洗浄した後、ガラスボトムディッシュ（松浪硝子工業社製）に移した。
〔３〕共焦点レーザー顕微鏡システム（ＴＣＳ ＳＰ８、ライカ マイクロシステムズ社製）を用いて、５４５ｎｍの励起波長で励起し、波長５６５ｎｍの橙色蛍光画像（ＲＯＳ蛍光画像）（図１Ａ）と、胚の明視野像を取得し、取得したＲＯＳ蛍光画像における蛍光輝度を定量することにより、胚におけるＲＯＳ濃度（産生量）を測定した（図１Ｂ参照）。
以下の手順〔１〕～〔３〕に従って、哺乳動物胚におけるＲＯＳ濃度を測定した。
〔１〕３種類の群（無添加群、Ａｒｇ添加群、及びＡｒｇ＋Ｌｅｕ添加群）の培養液中に、それぞれ、ＲＯＳ検出試薬（CellROX Orange、Thermo Fisher社製）を終濃度が５μＭとなるように添加し、２０分間インキュベーター内でインキュベートした。
〔２〕胚を新しいＫＳＯＭ培養液で洗浄した後、ガラスボトムディッシュ（松浪硝子工業社製）に移した。
〔３〕共焦点レーザー顕微鏡システム（ＴＣＳ ＳＰ８、ライカ マイクロシステムズ社製）を用いて、５４５ｎｍの励起波長で励起し、波長５６５ｎｍの橙色蛍光画像（ＲＯＳ蛍光画像）（図１Ａ）と、胚の明視野像を取得し、取得したＲＯＳ蛍光画像における蛍光輝度を定量することにより、胚におけるＲＯＳ濃度（産生量）を測定した（図１Ｂ参照）。
【0047】
［胚におけるＩＴＧＡ５Ｂ１発現量の測定］
以下の手順〔１〕～〔１０〕に従って、哺乳動物胚におけるＩＴＧＡ５Ｂ１発現量を測定した。
〔１〕３種類の群（無添加群、Ａｒｇ添加群、及びＡｒｇ＋Ｌｅｕ添加群）で培養した胚を、それぞれ３.７％ホルムアルデヒド液（富士フイルム和光純薬社製）で胚を３０分間固定した。
〔２〕０.１％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳで胚を洗浄した。
〔３〕胚を３.７％Ｔｗｅｅｎ ２０（富士フイルム和光純薬社製）で５分間透過処理を行った。
〔４〕０.１％ ＢＳＡを含むＰＢＳで胚を洗浄した。
〔５〕ラット抗ＩＴＧＡ５Ｂ１抗体（メルク社製）を用い、胚を一晩４℃で処理した。
〔６〕０.５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００と０.５％ ＢＳＡを含むＰＢＳで胚を洗浄した
。
〔７〕Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ５９４標識ロバ抗ラットＩｇＧ抗体（Thermo Fisher社製）を用い、胚を１時間室温で処理した。
〔８〕０.５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００と０.５％ ＢＳＡを含むＰＢＳで胚を洗浄した。
〔９〕核染色として、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で胚を３０分間室温で処理した。
〔１０〕共焦点レーザー顕微鏡システム（ＴＣＳ ＳＰ８、ライカ マイクロシステムズ社製）を用いて、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ５９４由来の蛍光画像（すなわち、ＩＴＧＡ５Ｂ１蛍光画像）を取得し、ＩＴＧＡ５Ｂ１蛍光画像における蛍光輝度を定量することにより、胚におけるＩＴＧＡ５Ｂ１発現量を測定した（図２参照）。
以下の手順〔１〕～〔１０〕に従って、哺乳動物胚におけるＩＴＧＡ５Ｂ１発現量を測定した。
〔１〕３種類の群（無添加群、Ａｒｇ添加群、及びＡｒｇ＋Ｌｅｕ添加群）で培養した胚を、それぞれ３.７％ホルムアルデヒド液（富士フイルム和光純薬社製）で胚を３０分間固定した。
〔２〕０.１％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳで胚を洗浄した。
〔３〕胚を３.７％Ｔｗｅｅｎ ２０（富士フイルム和光純薬社製）で５分間透過処理を行った。
〔４〕０.１％ ＢＳＡを含むＰＢＳで胚を洗浄した。
〔５〕ラット抗ＩＴＧＡ５Ｂ１抗体（メルク社製）を用い、胚を一晩４℃で処理した。
〔６〕０.５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００と０.５％ ＢＳＡを含むＰＢＳで胚を洗浄した
。
〔７〕Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ５９４標識ロバ抗ラットＩｇＧ抗体（Thermo Fisher社製）を用い、胚を１時間室温で処理した。
〔８〕０.５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００と０.５％ ＢＳＡを含むＰＢＳで胚を洗浄した。
〔９〕核染色として、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で胚を３０分間室温で処理した。
〔１０〕共焦点レーザー顕微鏡システム（ＴＣＳ ＳＰ８、ライカ マイクロシステムズ社製）を用いて、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ５９４由来の蛍光画像（すなわち、ＩＴＧＡ５Ｂ１蛍光画像）を取得し、ＩＴＧＡ５Ｂ１蛍光画像における蛍光輝度を定量することにより、胚におけるＩＴＧＡ５Ｂ１発現量を測定した（図２参照）。
【0048】
１－２ 結果
胚におけるＲＯＳ濃度を測定した結果、Ａｒｇ添加群の胚における中央値（１.２８）及び第３四分位（１.６１）が、無添加群の胚における中央値（１.０６）及び第３四分位（１.２１）と比べ、有意に増加し、さらに、Ａｒｇ＋Ｌｅｕ添加群の胚における中央値（１.５５）及び第３四分位（１.８７）が、Ａｒｇ添加群の胚における上記中央値及び上記第３四分位や、無添加群の胚における上記中央値及び上記第３四分位と比べ、有意に増加した（図１Ｂ参照）。
胚におけるＲＯＳ濃度を測定した結果、Ａｒｇ添加群の胚における中央値（１.２８）及び第３四分位（１.６１）が、無添加群の胚における中央値（１.０６）及び第３四分位（１.２１）と比べ、有意に増加し、さらに、Ａｒｇ＋Ｌｅｕ添加群の胚における中央値（１.５５）及び第３四分位（１.８７）が、Ａｒｇ添加群の胚における上記中央値及び上記第３四分位や、無添加群の胚における上記中央値及び上記第３四分位と比べ、有意に増加した（図１Ｂ参照）。
【0049】
また、胚におけるＩＴＧＡ５Ｂ１発現量を測定した場合では、Ａｒｇ添加群の胚における中央値（１.１４）及び第３四分位（１.４３）は、無添加群の胚における中央値（０.８８）及び第３四分位（１.３５）とほとんど変わらなかったものの、Ａｒｇ＋Ｌｅｕ添加群の胚における中央値（１.５６）及び第３四分位（２.３１）が、Ａｒｇ添加群の胚における上記中央値及び上記第３四分位や、無添加群の胚における上記中央値及び上記第３四分位と比べ、有意に増加した（図２参照）。
【0050】
これらの結果は、アルギニン及びロイシン添加群の哺乳動物胚（すなわち、着床率がより高い哺乳動物胚）におけるＲＯＳ濃度及びＩＴＧＡ５Ｂ１発現量は、共に、アルギニン添加群の哺乳動物胚や無添加群の哺乳動物胚（すなわち、着床率がより低い哺乳動物胚）におけるＲＯＳ濃度及びＩＴＧＡ５Ｂ１発現量と比べ、増加することを示している。また、胚におけるＲＯＳ濃度及びＴＧＡ５Ｂ１発現量との間には、正の相関関係があることを示している。これらの結果から、被検対象の胚におけるＲＯＳ濃度が、比較対照の胚におけるＲＯＳ濃度よりも高い場合、被検対象の胚は、比較対照の胚よりも着床能力が高いと評価できることを示している。
【0051】
実施例２．３種類の群（無添加群、Ａｒｇ添加群、及びＡｒｇ＋Ｌｅｕ＋ＡｓＡ添加群）の哺乳動物胚におけるＲＯＳ濃度及びＩＴＧＡ５Ｂ１発現量の測定
実施例１において、哺乳動物胚におけるＲＯＳ濃度とＩＴＧＡ５Ｂ１発現量との間には、正の相関関係があることが示された。この点をさらに確認するために、Ａｒｇ＋Ｌｅｕ添加群に、抗酸化物質であるＬ－アスコルビン酸（ＡｓＡ）を添加し、ＲＯＳ濃度を低下させた場合、それに伴い、ＩＴＧＡ５Ｂ１発現量も低下するかどうかを検討した。
実施例１において、哺乳動物胚におけるＲＯＳ濃度とＩＴＧＡ５Ｂ１発現量との間には、正の相関関係があることが示された。この点をさらに確認するために、Ａｒｇ＋Ｌｅｕ添加群に、抗酸化物質であるＬ－アスコルビン酸（ＡｓＡ）を添加し、ＲＯＳ濃度を低下させた場合、それに伴い、ＩＴＧＡ５Ｂ１発現量も低下するかどうかを検討した。
【0052】
２－１ 方法
［媒精］
哺乳動物精子と卵子の媒精は、実施例１の項目［媒精］に記載の方法に従って行った。
［媒精］
哺乳動物精子と卵子の媒精は、実施例１の項目［媒精］に記載の方法に従って行った。
【0053】
［胚の体外培養］
以下の手順〔１〕及び〔２〕に従って、哺乳動物胚の体外培養を行った。
〔１〕媒精から４時間後、受精卵を回収し、ＨＴＦ培養液に移し発生培養を行った。
〔２〕発生培養約９０時間後に、胚盤胞期まで発生が進んだ胚を、無添加群、Ａｒｇ添加群、及びＡｒｇ＋Ｌｅｕ＋ＡｓＡ添加群に分け、無添加群においては、アルギニン及びロイシンのいずれも含まないＫＳＯＭ培養液中で２４時間培養し、Ａｒｇ添加群においては、０．２ｍＭのアルギニンを含むＫＳＯＭ培養液中で２４時間培養し、Ａｒｇ＋Ｌｅｕ＋ＡｓＡ添加群においては、０．２ｍＭのアルギニン、０．２ｍＭのロイシン、及び０．２２７ｍＭのＬ－アスコルビン酸（富士フイルム和光純薬社製）を含むＫＳＯＭ培養液中で２４時間培養した。
以下の手順〔１〕及び〔２〕に従って、哺乳動物胚の体外培養を行った。
〔１〕媒精から４時間後、受精卵を回収し、ＨＴＦ培養液に移し発生培養を行った。
〔２〕発生培養約９０時間後に、胚盤胞期まで発生が進んだ胚を、無添加群、Ａｒｇ添加群、及びＡｒｇ＋Ｌｅｕ＋ＡｓＡ添加群に分け、無添加群においては、アルギニン及びロイシンのいずれも含まないＫＳＯＭ培養液中で２４時間培養し、Ａｒｇ添加群においては、０．２ｍＭのアルギニンを含むＫＳＯＭ培養液中で２４時間培養し、Ａｒｇ＋Ｌｅｕ＋ＡｓＡ添加群においては、０．２ｍＭのアルギニン、０．２ｍＭのロイシン、及び０．２２７ｍＭのＬ－アスコルビン酸（富士フイルム和光純薬社製）を含むＫＳＯＭ培養液中で２４時間培養した。
【0054】
［胚におけるＲＯＳ濃度の測定］
哺乳動物胚におけるＲＯＳ濃度は、実施例１の項目［胚におけるＲＯＳ濃度の測定］に記載の方法に従って行った。
哺乳動物胚におけるＲＯＳ濃度は、実施例１の項目［胚におけるＲＯＳ濃度の測定］に記載の方法に従って行った。
【0055】
［胚におけるＩＴＧＡ５Ｂ１発現量の測定］
哺乳動物胚におけるＩＴＧＡ５Ｂ１発現量は、実施例１の項目［胚におけるＩＴＧＡ５Ｂ１発現量の測定］に記載の方法に従って行った。
哺乳動物胚におけるＩＴＧＡ５Ｂ１発現量は、実施例１の項目［胚におけるＩＴＧＡ５Ｂ１発現量の測定］に記載の方法に従って行った。
【0056】
２－２ 結果
胚におけるＲＯＳ濃度を測定した結果、Ａｒｇ＋Ｌｅｕ添加群の胚における中央値（１.５６）及び第３四分位（２.０２）が、無添加群の胚における中央値（０.９５）及び第３四分位（１.２８）と比べ、有意に増加したのに対して、Ａｒｇ＋Ｌｅｕ＋ＡｓＡ添加群の胚における中央値（１.０６）及び第３四分位（１.３１）は、Ａｒｇ＋Ｌｅｕ添加群の胚における上記中央値及び上記第３四分位と比べ、有意に減少した（図３Ｂ参照）。
胚におけるＲＯＳ濃度を測定した結果、Ａｒｇ＋Ｌｅｕ添加群の胚における中央値（１.５６）及び第３四分位（２.０２）が、無添加群の胚における中央値（０.９５）及び第３四分位（１.２８）と比べ、有意に増加したのに対して、Ａｒｇ＋Ｌｅｕ＋ＡｓＡ添加群の胚における中央値（１.０６）及び第３四分位（１.３１）は、Ａｒｇ＋Ｌｅｕ添加群の胚における上記中央値及び上記第３四分位と比べ、有意に減少した（図３Ｂ参照）。
【0057】
この結果は、抗酸化物質であるＡｓＡを、Ａｒｇ＋Ｌｅｕ添加群に添加することにより、胚におけるＲＯＳ産生量が低下したことを示している。
【0058】
また、胚におけるＩＴＧＡ５Ｂ１発現量を測定した結果、Ａｒｇ＋Ｌｅｕ添加群の胚における中央値（２.０１）及び第３四分位（３.６４）が、無添加群の胚における中央値（１.０５）及び第３四分位（１.４１）と比べ、有意に増加したのに対して、Ａｒｇ＋Ｌｅｕ＋ＡｓＡ添加群の胚における中央値（０.９３）及び第３四分位（１.８１）が、Ａｒｇ＋Ｌｅｕ添加群の胚における上記中央値及び上記第３四分位と比べ、有意に減少した（図４Ｂ参照）。
【0059】
この結果は、抗酸化物質であるＡｓＡを、Ａｒｇ＋Ｌｅｕ添加群に添加することにより、胚におけるＲＯＳ産生量が低下したことに伴い、胚におけるＩＴＧＡ５Ｂ１発現量も減少したことを示している。すなわち、胚におけるＲＯＳ濃度とＩＴＧＡ５Ｂ１発現量との間には、正の相関関係があることを示す実施例１の結果を支持している。
【0060】
さらに、図１～４の結果を基に、３種類の群（無添加群、Ａｒｇ＋Ｌｅｕ添加群、及びＡｒｇ＋Ｌｅｕ＋ＡｓＡ添加群）それぞれにおいて、哺乳動物胚におけるＲＯＳ濃度とＩＴＧＡ５Ｂ１発現量との相関関係を解析した結果、ＲＯＳ濃度が高い胚は、ＩＴＧＡ５Ｂ１発現量も高く、また、ＲＯＳ濃度が低い胚は、ＩＴＧＡ５Ｂ１発現量も低いことが示された（図５参照）。すなわち、個々の胚に着目した場合でも、ＲＯＳ濃度とＩＴＧＡ５Ｂ１発現量との間には、正の相関関係があることが確認された。
【0061】
実施例３．３種類の群（無添加群、Ａｒｇ添加群、及びＡｒｇ＋Ｌｅｕ＋ＡｓＡ添加群）の哺乳動物胚におけるＧＰｘ発現量及びＧＳＨ濃度の測定
ＧＰｘは、ＧＳＨを用いてＲＯＳを消去する抗酸化酵素であることから、ＧＰｘの発現量とＧＳＨ濃度についても解析を進めた。
ＧＰｘは、ＧＳＨを用いてＲＯＳを消去する抗酸化酵素であることから、ＧＰｘの発現量とＧＳＨ濃度についても解析を進めた。
【0062】
３－１ 方法
［媒精］
哺乳動物精子と卵子の媒精は、実施例１の項目［媒精］に記載の方法に従って行った。
［媒精］
哺乳動物精子と卵子の媒精は、実施例１の項目［媒精］に記載の方法に従って行った。
【0063】
［胚の体外培養］
哺乳動物胚の体外培養は、実施例１の項目［胚の体外培養］に記載の方法に従って行った。
哺乳動物胚の体外培養は、実施例１の項目［胚の体外培養］に記載の方法に従って行った。
【0064】
［胚におけるＧＰｘ発現量の測定］
以下の手順〔１〕～〔１３〕に従って、哺乳動物胚におけるＧＰｘ（ＧＰｘ１及びＧＰｘ４）発現量を測定した。
〔１〕３種類の群（無添加群、Ａｒｇ添加群、及びＡｒｇ＋Ｌｅｕ添加群）で培養した胚を、それぞれ３.７％ホルムアルデヒド液（富士フイルム和光純薬社製）で胚を３０分間固定した。
〔２〕０.１％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳで胚を洗浄した。
〔３〕胚を０．２５％Ｔｗｅｅｎ ２０（富士フイルム和光純薬社製）で５分間透過処理を行った。
〔４〕０.１％ ＢＳＡを含むＰＢＳで胚を洗浄した。
〔５〕ヤギ抗ＧＰｘ１抗体（R&D Systems社製）を用い、胚を一晩４℃で処理した。
〔６〕０.５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００と０.５％ ＢＳＡを含むＰＢＳで胚を洗浄した
。
〔７〕Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ５９４標識ロバ抗ヤギＩｇＧ抗体（Thermo Fisher社製）を用い、胚を１時間室温で処理した。
〔８〕マウス抗ＧＰｘ４抗体（Proteintech社製）を用い、胚を１時間室温で処理した。
〔９〕０.５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００と０.５％ ＢＳＡを含むＰＢＳで胚を洗浄した
。
〔１０〕ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Thermo Fisher社製）又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８標識ロバ抗マウスＩｇＧ抗体（Thermo Fisher社製）を用い、胚を１時間室温で処理した。
〔１１〕０.５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００と０.５％ ＢＳＡを含むＰＢＳで胚を洗浄した。
〔１２〕核染色として、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で胚を３０分間室温で処理した。
〔１３〕共焦点レーザー顕微鏡システム（ＴＣＳ ＳＰ８、ライカ マイクロシステムズ社製）を用いて、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ５９４由来の蛍光画像（すなわち、ＧＰｘ１蛍光画像）と、ＦＩＴＣ又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８由来の蛍光画像（すなわち、ＧＰｘ４蛍光画像）とを取得し、ＧＰｘ１蛍光画像及びＧＰｘ４蛍光画像における蛍光輝度を定量することにより、胚におけるＧＰｘ１発現量及びＧＰｘ４発現量を測定した（図６参照）。
以下の手順〔１〕～〔１３〕に従って、哺乳動物胚におけるＧＰｘ（ＧＰｘ１及びＧＰｘ４）発現量を測定した。
〔１〕３種類の群（無添加群、Ａｒｇ添加群、及びＡｒｇ＋Ｌｅｕ添加群）で培養した胚を、それぞれ３.７％ホルムアルデヒド液（富士フイルム和光純薬社製）で胚を３０分間固定した。
〔２〕０.１％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳで胚を洗浄した。
〔３〕胚を０．２５％Ｔｗｅｅｎ ２０（富士フイルム和光純薬社製）で５分間透過処理を行った。
〔４〕０.１％ ＢＳＡを含むＰＢＳで胚を洗浄した。
〔５〕ヤギ抗ＧＰｘ１抗体（R&D Systems社製）を用い、胚を一晩４℃で処理した。
〔６〕０.５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００と０.５％ ＢＳＡを含むＰＢＳで胚を洗浄した
。
〔７〕Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ５９４標識ロバ抗ヤギＩｇＧ抗体（Thermo Fisher社製）を用い、胚を１時間室温で処理した。
〔８〕マウス抗ＧＰｘ４抗体（Proteintech社製）を用い、胚を１時間室温で処理した。
〔９〕０.５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００と０.５％ ＢＳＡを含むＰＢＳで胚を洗浄した
。
〔１０〕ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Thermo Fisher社製）又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８標識ロバ抗マウスＩｇＧ抗体（Thermo Fisher社製）を用い、胚を１時間室温で処理した。
〔１１〕０.５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００と０.５％ ＢＳＡを含むＰＢＳで胚を洗浄した。
〔１２〕核染色として、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で胚を３０分間室温で処理した。
〔１３〕共焦点レーザー顕微鏡システム（ＴＣＳ ＳＰ８、ライカ マイクロシステムズ社製）を用いて、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ５９４由来の蛍光画像（すなわち、ＧＰｘ１蛍光画像）と、ＦＩＴＣ又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８由来の蛍光画像（すなわち、ＧＰｘ４蛍光画像）とを取得し、ＧＰｘ１蛍光画像及びＧＰｘ４蛍光画像における蛍光輝度を定量することにより、胚におけるＧＰｘ１発現量及びＧＰｘ４発現量を測定した（図６参照）。
【0065】
［胚におけるＧＳＨ濃度の測定］
以下の手順〔１〕～〔３〕に従って、哺乳動物胚におけるＧＳＨ濃度を測定した。
〔１〕３種類の群（無添加群、Ａｒｇ添加群、及びＡｒｇ＋Ｌｅｕ添加群）の培養液中に、それぞれ、ＧＳＨ検出試薬（ThiolTracker Violet、Thermo Fisher社製）を終濃度が２０μＭとなるように添加し、２０分間インキュベーター内でインキュベートした。
〔２〕胚を新しいＫＳＯＭ培養液で洗浄した後、ガラスボトムディッシュ（松浪硝子工業社製）に移した。
〔３〕共焦点レーザー顕微鏡システム（ＴＣＳ ＳＰ８、ライカ マイクロシステムズ社製）を用いて、４０５ｎｍの励起波長で励起し、波長５２５ｎｍの緑色蛍光画像（ＧＳＨ蛍光画像）と、胚の明視野像を取得し、取得したＧＳＨ蛍光画像における蛍光輝度を定量することにより、胚におけるＧＳＨ濃度を測定した（図７参照）。
以下の手順〔１〕～〔３〕に従って、哺乳動物胚におけるＧＳＨ濃度を測定した。
〔１〕３種類の群（無添加群、Ａｒｇ添加群、及びＡｒｇ＋Ｌｅｕ添加群）の培養液中に、それぞれ、ＧＳＨ検出試薬（ThiolTracker Violet、Thermo Fisher社製）を終濃度が２０μＭとなるように添加し、２０分間インキュベーター内でインキュベートした。
〔２〕胚を新しいＫＳＯＭ培養液で洗浄した後、ガラスボトムディッシュ（松浪硝子工業社製）に移した。
〔３〕共焦点レーザー顕微鏡システム（ＴＣＳ ＳＰ８、ライカ マイクロシステムズ社製）を用いて、４０５ｎｍの励起波長で励起し、波長５２５ｎｍの緑色蛍光画像（ＧＳＨ蛍光画像）と、胚の明視野像を取得し、取得したＧＳＨ蛍光画像における蛍光輝度を定量することにより、胚におけるＧＳＨ濃度を測定した（図７参照）。
【0066】
３－２ 結果
胚におけるＧＰｘ１発現量を測定した結果、３種類の群間で違いは認められなかった（図６Ａ参照）。一方、胚におけるＧＰｘ４発現量を測定した結果、Ａｒｇ＋Ｌｅｕ添加群の胚における中央値（０.８２）及び第３四分位（０.９３）が、Ａｒｇ添加群の胚における中央値（０.９９）及び第３四分位（１.２１）や、無添加群の胚における中央値（１.００）及び第３四分位（１.１２）と比べ、有意に低下した（図６Ｂ参照）。
胚におけるＧＰｘ１発現量を測定した結果、３種類の群間で違いは認められなかった（図６Ａ参照）。一方、胚におけるＧＰｘ４発現量を測定した結果、Ａｒｇ＋Ｌｅｕ添加群の胚における中央値（０.８２）及び第３四分位（０.９３）が、Ａｒｇ添加群の胚における中央値（０.９９）及び第３四分位（１.２１）や、無添加群の胚における中央値（１.００）及び第３四分位（１.１２）と比べ、有意に低下した（図６Ｂ参照）。
【0067】
この結果は、アルギニン及びロイシン添加群の哺乳動物胚（すなわち、着床率がより高い哺乳動物胚）におけるＧＰｘ４発現量は、共に、アルギニン添加群の哺乳動物胚や無添加群の哺乳動物胚（すなわち、着床率がより低い哺乳動物胚）におけるＧＰｘ４発現量と比べ、低下することを示している。また、アルギニン及びロイシン添加群の哺乳動物胚において、ＲＯＳ濃度が上昇したのは、ＲＯＳを消去するＧＰｘ４の発現量が低下したことが原因であると考えられる。
【0068】
さらに、胚におけるＧＳＨ濃度を測定した結果、Ａｒｇ＋Ｌｅｕ添加群の胚における中央値（０.６８）及び第３四分位（０.８０）が、Ａｒｇ添加群の胚における中央値（０.９０）及び第３四分位（１.０７）や、無添加群の胚における中央値（０.９６）及び第３四分位（１.１８）と比べ、有意に低下した（図７参照）。
【0069】
この結果は、アルギニン及びロイシン添加群の哺乳動物胚（すなわち、着床率がより高い哺乳動物胚）におけるＧＳＨ濃度は、共に、アルギニン添加群の哺乳動物胚や無添加群の哺乳動物胚（すなわち、着床率がより低い哺乳動物胚）におけるＧＳＨ濃度と比べ、低下することを示しており、被検対象の胚におけるＧＳＨ濃度が、比較対照の胚におけるＧＳＨ濃度よりも低い場合、被検対象の胚は、比較対照の胚よりも着床能力が高いと評価できることを示している。
【産業上の利用可能性】
【0070】
本発明は、不妊治療を目的とした医療分野や、優良家畜（例えば、霜降り形質を示すウシ）の生産、家畜改良等を目的とした畜産分野などの生殖補助技術（例えば、体外受精、顕微授精）を必要とする分野に資するものである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
