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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023177246
(43)【公開日】2023-12-13
(54)【発明の名称】乳がん患者の予後を予測する方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/574 20060101AFI20231206BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20231206BHJP
【ＦＩ】
G01N33/574 B
G01N33/53 V
G01N33/53 Y
【審査請求】未請求
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023064127
(22)【出願日】2023-04-11
(31)【優先権主張番号】P 2022088201
(32)【優先日】2022-05-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】510097747
【氏名又は名称】国立研究開発法人国立がん研究センター
(71)【出願人】
【識別番号】000004086
【氏名又は名称】日本化薬株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000109
【氏名又は名称】弁理士法人特許事務所サイクス
(72)【発明者】
【氏名】平岡 伸介
(72)【発明者】
【氏名】渡瀬 智佳史
(72)【発明者】
【氏名】上原 一貴
(57)【要約】
【課題】乳がんの予後不良群（乳がんの再発）を予測（予見）する検査方法を提供すること。
【解決手段】乳がん患者の予後を判定するための検査方法であって、前記患者から採取された試料におけるシアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原を検出すること、およびシアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原を発現している場合に患者の予後が不良である可能性があると判定することを含む、検査方法；シアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原に対する抗体を含む、乳がん患者の予後予測用の試薬；並びにシアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原に対する抗体と、前記抗体を検出するための試薬とを含む、乳がん患者の予後予測用の検査キット。
【選択図】なし
【解決手段】乳がん患者の予後を判定するための検査方法であって、前記患者から採取された試料におけるシアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原を検出すること、およびシアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原を発現している場合に患者の予後が不良である可能性があると判定することを含む、検査方法；シアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原に対する抗体を含む、乳がん患者の予後予測用の試薬；並びにシアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原に対する抗体と、前記抗体を検出するための試薬とを含む、乳がん患者の予後予測用の検査キット。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
乳がん患者の予後を判定するための検査方法であって、
前記患者から採取された試料におけるシアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原を検出すること、および
シアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原を発現している場合に患者の予後が不良である可能性があると判定すること、
を含む、検査方法。
前記患者から採取された試料におけるシアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原を検出すること、および
シアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原を発現している場合に患者の予後が不良である可能性があると判定すること、
を含む、検査方法。
【請求項2】
前記試料におけるシアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原の発現割合または発現量が予め定められた参照値未満である場合に、患者の予後が良好である可能性があると判定し、前記試料におけるシアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原の発現割合または発現量が予め定められた参照値以上である場合に、患者の予後が不良である可能性があると判定する、請求項１に記載の検査方法。
【請求項3】
予後が無再発生存期間である、請求項１又は２に記載の検出方法。
【請求項4】
シアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原の検出を、糖鎖のエピトープを認識する抗体を用いた免疫学的方法により行う、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項5】
免疫学的方法が、組織試料を用いた免疫組織化学法、又は血液試料を用いた免疫学的測定法である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
糖鎖のエピトープを認識する抗体が、下記式（Ｘ）に記載の糖鎖構造を有する糖タンパク質と反応する抗体である、請求項４に記載の方法。
【化1】
【請求項7】
シアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原に対する抗体を含む、乳がん患者の予後予測用の試薬。
【請求項8】
シアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原に対する抗体と、前記抗体を検出するための試薬とを含む、乳がん患者の予後予測用の検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、乳がんの予後不良群（乳がんの再発）を予測（予見）する方法に関する。本発明はさらに、上記の検査方法を行うための抗体、および検査キットに関する。本発明により、治療法の選択をより早期に判断でき、患者である治療対象者の負担軽減につながると考えられる。
【背景技術】
【0002】
乳がんの診断および治療効果判定には、エコー、ＭＲＩ等の画像診断の他、病理診断、遺伝子診断、血液腫瘍マーカー等が用いられている。これらのうち、治療効果判定に用いられるものは画像診断であり、補助的に血液腫瘍マーカーも用いられる。画像診断は侵襲性が低く技術的な発展も著しいが、判定には数値化が難しく、専門医の読図能力を必要とする。また石灰化症例等においては画像からは病勢を判断できない場合もある。新たな技術としてリキッドバイオプシーが期待されているが、依然、研究段階であり、臨床応用には至っていない。よって、画像診断よりもさらに向上した診断能を発揮することが期待できるものは、血液腫瘍マーカーとなる。
【0003】
ＮＣＣ－ＳＴ－４３９は、ヌードマウス移植ヒト胃低分化腺がん株ＳＴ－４を免疫原として国立がんセンターの広橋らにて作製されたモノクローナル抗体により認識される抗原である（非特許文献１）。ＮＣＣ－ＳＴ－４３９は、分子量１００万以上のムチン様高分子蛋白質であり、構造的には、ムチンのコア蛋白にＮ－アセチルガラクトサミンを介して直接ＩＩ型糖鎖であるシアリルルイスＸ抗原が結合している腫瘍関連糖鎖抗原である（非特許文献２）。免疫組織化学的検討では、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９は、大腸がん、膵がんなどの消化器系がん、肺腺がんや乳がんの各組織での過剰発現が認められている（非特許文献３）。血中腫瘍マーカーとしては、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９は、乳がん、大腸がん、肺がんや膵がんでの高い陽性率が報告されている（非特許文献４及び５）。特に、乳がんの再発時には、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９は、他の腫瘍マーカーに先駆けて陽性化し、再発乳がんに対しての感度が比較的高く、ＣＥＡやＣＡ１５－３との同時測定により高い診断効率が得られること（非特許文献６及び７）や、再発乳がんや転移性乳がん治療効果を反映して変動することが報告されている（非特許文献８）。従って、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９は、臨床では主に再発乳がんや進行乳がんの治療効果判定の補助に用いられている。
【0004】
ＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗体によって認識される抗原決定基は、シアル酸残基を末端に有するムチン型糖蛋白質であり、ムチンのコア蛋白質中のセリン／スレオニン残基にＯ－グリコシド結合したＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を介してＩＩ型糖鎖であるシアリルルイスＸが結合した構造であることが明らかにされている（非特許文献２）。ＮＣＣ－ＳＴ－４３９と構造の類似した糖鎖抗原には、ＣＤ１５ｓ（ＣＳＬＥＸ－１），ＨＥＣＡ－４５２などがある。
【0005】
ＣＤ１５ｓ抗体は、患者胃癌細胞より調製した膜蛋白質画分を免疫することにより得られた抗体である。ＣＤ１５ｓ抗体が認識する抗原は，亜末端のフコース残基を含むシアリルルイスＸであることが分かっている（非特許文献９）。
【0006】
ＨＥＣＡ－４５２抗体は、皮膚のリンパ球抗原（ＣＬＡ）を認識するラットモノクローナル抗体である。ＨＥＣＡ－４５２抗体が認識する抗原は、シアリルルイスＸとシアリルルイスａであることが報告されている（非特許文献１０）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｈｉｒｏｈａｓｈｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｉａｌｙｌ－ｓｕｇａｒ ｒｅｓｉｄｕｅ ｏｆ ａ ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｓｅｒａ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｇａｎｎ ７５：４８５－４８８，１９８４．
【非特許文献2】Ｋｕｍａｍｏｔｏ Ｋ，ｅｔ ａｌ：Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２４７：５１４－５１７，１９９８．
【非特許文献3】Ｗａｔａｎａｂｅ Ｍ，ｅｔ ａｌ：Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｄｅｆｉｎｅｄ ｂｙ ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒａｉｓｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ａｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ．Ｊｐｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（Ｇａｎｎ）７６：４３－５２，１９８５．
【非特許文献4】大倉久直ほか：各種癌・良性疾患患者血清によるＮＣＣ－ＳＴ－４３９ＥＩＡキットの臨床的検討（１）．癌と化学療法 １４：１９０１－１９０６，１９８７．
【非特許文献5】大倉久直ほか：各種癌・良性疾患患者血清によるＮＣＣ－ＳＴ－４３９ＥＩＡキットの臨床的検討（２）．癌と化学療法 １４：１９０７－１９１２，１９８７．
【非特許文献6】児玉 宏： 診療と新薬２９：７３１－７３８，１９９２．
【非特許文献7】山本 裕 他： 乳癌の臨床１６：２６９－２７３，２００１．
【非特許文献8】ＫＵＲＥＢＡＹＡＳＨＩ，Ｊｕｎｉｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｔｕｍｏｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ａｄｖａｎｃｅｄ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ：ａ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ． Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ， ２００４，１１．４：３８９－３９５．
【非特許文献9】神奈木玲児：ＳＬＸとシアリルルイスＸ系腫瘍マーカーの概要．肝胆膵 ４４（６）：７６９－７７８，２００２．
【非特許文献10】ＢＥＲＧ，Ｅｌｌｅｎ Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ａ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｍｍｏｎ ｔｏ ｂｏｔｈ ｓｉａｌｙｌ Ｌｅ （ａ） ａｎｄ ｓｉａｌｙｌ Ｌｅ （Ｘ） ｉｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＥＬＡＭ－１．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９１，２６６．２３：１４８６９－１４８７２．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
乳がんの術後補助療法は、ホルモンレセプター陽性乳がんについてはホルモン療法が、ホルモンレセプター陰性乳がんについては化学療法が主に試みられているが、必ずしも奏功するとは限らない。乳がんの予後不良群（乳がんの再発）がある程度予測（予見）することができれば、ホルモン療法や化学療法による治療よりも、免疫チェックポイント阻害薬などのバイオ医薬品など新しい治療法をより早期に試みることが可能となる。そしてこの診断法を用いる患者である治療対象者の負担軽減につながると考えられる。そのため、本発明は、乳がんの予後不良群（乳がんの再発）を予測（予見）する検査方法を提供することを課題とする。本発明はさらに、上記の検査方法を行うための抗体、および検査キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねたところ、乳がん患者から採取された試料からシアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原が検出された場合、患者の予後が不良となることを見出した。本開示は、以下の態様を含む。
【0010】
＜１＞ 乳がん患者の予後を判定するための検査方法であって、
前記患者から採取された試料におけるシアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原を検出すること、および
シアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原を発現している場合に患者の予後が不良である可能性があると判定すること、
を含む、検査方法。
＜２＞ 前記試料におけるシアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原の発現割合または発現量が予め定められた参照値未満である場合に、患者の予後が良好である可能性があると判定し、前記試料におけるシアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原の発現割合または発現量が予め定められた参照値以上である場合に、患者の予後が不良である可能性があると判定する、＜１＞に記載の検査方法。
＜３＞ 予後が無再発生存期間である、＜１＞又は＜２＞に記載の検出方法。
＜４＞ シアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原の検出を、糖鎖のエピトープを認識する抗体を用いた免疫学的方法により行う、＜１＞又は＜２＞に記載の方法。
＜５＞ 免疫学的方法が、組織試料を用いた免疫組織化学法、又は血液試料を用いた免疫学的測定法である、＜４＞に記載の方法。
＜６＞ 糖鎖のエピトープを認識する抗体が、下記式（Ｘ）に記載の糖鎖構造を有する糖タンパク質と反応する抗体である、＜４＞に記載の方法。
＜７＞ シアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原に対する抗体を含む、乳がん患者の予後予測用の試薬。
＜８＞ シアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原に対する抗体と、前記抗体を検出するための試薬とを含む、乳がん患者の予後予測用の検査キット。
前記患者から採取された試料におけるシアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原を検出すること、および
シアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原を発現している場合に患者の予後が不良である可能性があると判定すること、
を含む、検査方法。
＜２＞ 前記試料におけるシアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原の発現割合または発現量が予め定められた参照値未満である場合に、患者の予後が良好である可能性があると判定し、前記試料におけるシアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原の発現割合または発現量が予め定められた参照値以上である場合に、患者の予後が不良である可能性があると判定する、＜１＞に記載の検査方法。
＜３＞ 予後が無再発生存期間である、＜１＞又は＜２＞に記載の検出方法。
＜４＞ シアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原の検出を、糖鎖のエピトープを認識する抗体を用いた免疫学的方法により行う、＜１＞又は＜２＞に記載の方法。
＜５＞ 免疫学的方法が、組織試料を用いた免疫組織化学法、又は血液試料を用いた免疫学的測定法である、＜４＞に記載の方法。
＜６＞ 糖鎖のエピトープを認識する抗体が、下記式（Ｘ）に記載の糖鎖構造を有する糖タンパク質と反応する抗体である、＜４＞に記載の方法。
【化1】
＜８＞ シアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原に対する抗体と、前記抗体を検出するための試薬とを含む、乳がん患者の予後予測用の検査キット。
【発明の効果】
【0011】
本発明によれば、乳がん組織のシアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原を検出することにより、乳がんを有する患者の予後を予測することができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図8】図８は、ホルモンレセプター陽性・陰性群のそれぞれを対象とした血清中のＮＣＣ－ＳＴ－４３９陽性患者群（陽性判定基準：１．０ Ｕ／ｍＬ以上）及びＮＣＣ－ＳＴ－４３９陰性患者群のＫａｐｌａｎ―Ｍｅｉｅｒ生存曲線を示す。
【図9】図９は、バイオマーカー亜型分類のそれぞれを対象とした血清中のＮＣＣ－ＳＴ－４３９陽性患者群（陽性判定基準：１．０ Ｕ／ｍＬ以上）及びＮＣＣ－ＳＴ－４３９陰性患者群のＫａｐｌａｎ―Ｍｅｉｅｒ生存曲線を示す。
【図10】図１０は、全浸潤癌症例を対象とした血清中のＮＣＣ－ＳＴ－４３９陽性患者群（陽性判定基準：男性および５０歳以上の女性４．５ Ｕ／ｍＬ以上、５０歳未満の女性７．０ Ｕ／ｍＬ以上）及びＮＣＣ－ＳＴ－４３９陰性患者群のＫａｐｌａｎ―Ｍｅｉｅｒ生存曲線を示す。
【図11】図１１は、ホルモンレセプター陽性・陰性群のそれぞれを対象とした血清中のＮＣＣ－ＳＴ－４３９陽性患者群（陽性判定基準：男性および５０歳以上の女性４．５ Ｕ／ｍＬ以上、５０歳未満の女性７．０ Ｕ／ｍＬ以上）及びＮＣＣ－ＳＴ－４３９陰性患者群のＫａｐｌａｎ―Ｍｅｉｅｒ生存曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本発明は、乳がん患者の予後を判定するための検査方法であって、前記患者から採取された試料におけるシアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原を検出すること、およびシアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原を発現している場合に患者の予後が不良である可能性があると判定すること、を含む、検査方法である。
【0014】
前記乳がんとは、乳腺の組織にできるがんである。乳がんは各バイオマーカーの陽性／陰性によりサブタイプに分類され、サブタイプごとに治療方針が決められる。バイオマーカーとしては、ホルモンレセプター、ＨＥＲ２がある。ホルモンレセプター陰性ＨＥＲ２陰性の場合は、トリプルネガティブと分類される。
【0015】
前記ホルモンレセプターとは、乳がんのホルモン療法の適応やその有効性を予測する指標となっており、エストロゲンが結合するエストロゲンレセプター（ＥＲ）とプロゲステロンが結合するプロゲステロンレセプター（ＰｇＲ）である。ホルモンレセプターの陽性／陰性の判定は、公知の方法に従って行うことができる。例えば、免疫組織化学染色法により陽性細胞の占有率を評価する方法や、陽性細胞率と染色強度をスコア化して評価する方法を用いることができる。陽性細胞率を評価する方法としてＪ ｓｃｏｒｅがあり、陽性細胞率１０％以上を陽性と判定する。陽性細胞率と染色強度をスコア化して評価する方法としてＡｌｌｒｅｄ ｓｃｏｒｅやＨ ｓｃｏｒｅがある。Ａｌｌｒｅｄ ｓｃｏｒｅは、陽性細胞率と染色強度から８段階に分類し、３以上を陽性と判定する。ホルモン受容体の判定は、ＡＳＣＯ／ＣＡＰガイドラインに準拠して行うこともできる。
【0016】
前記ＨＥＲ２とは、乳がんのトラスツズマブ適正使用選択のためのバイオマーカーである。ＨＥＲ２の陽性／陰性の判定は、公知の方法に従って行うことができる。例えば、ＨＥＲ２タンパク質の過剰発現をみる免疫組織化学染色法、ＨＥＲ２遺伝子の増幅を検索する蛍光ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＦＩＳＨ）法などを用いることができる。ＩＨＣ法による判定は、例えば、染色された陽性細胞が占める割合に基づくスコアによって行う。ＦＩＳＨ法による判定は、例えば、細胞あたりのＨＥＲ２遺伝子の数に基づき行うことができる。また第１７染色体のセントロメア（ＣＥＰ１７）蛍光シグナルとＨＥＲ２遺伝子の蛍光シグナルをカウントし、各々のシグナル総数の比率から行うこともできる。ＨＥＲ２の判定は、アメリカ臨床腫瘍学会（ＡＳＣＯ）およびアメリカ病理学会（ＣＡＰ）によるガイドライン（ＡＳＣＯ／ＣＡＰガイドライン）に準拠して行うことができる。
【0017】
前記検査方法において、前記がん患者とは乳がん患者のことであり、ホルモンレセプター陰性の乳がん患者であることが好ましく、ホルモンレセプター及びＨＥＲ２ともに陰性である乳がん患者であることが好ましい。
【0018】
前記患者から採取された試料とは、腫瘍の外科切除検体あるいは生検検体（以下、組織とも記す場合がある）又は血清であり、採取方法としては、外科切除あるいは生検又は採血等が挙げられる。前記患者から採取された試料としては、外科切除検体又は血清であることが好ましい。
【0019】
前記糖タンパク質とは、シアル酸残基を末端に有するムチン型糖蛋白質であり、ムチンのコア蛋白質中のセリン／スレオニン残基にＯ－グリコシド結合したＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を介してＩＩ型糖鎖であるシアリルルイスＸが結合した構造を持つタンパク質である。
【0020】
前記シアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原の検出方法としては、糖鎖のエピトープを認識する抗体を用いた免疫学的方法が挙げられる。免疫学的方法としては、組織試料を用いた免疫組織化学法、又は血液試料を用いた免疫学的測定法が挙げられる。
【0021】
糖鎖のエピトープを認識する抗体としては、好ましくは、下記式（Ｘ）に記載の糖鎖構造を有する糖タンパク質と反応する抗体である。前記糖タンパク質の検出に用いる抗体としては、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗体、ＣＤ１５ｓ抗体、ＨＥＣＡ－４５２抗体、ＦＨ－６抗体、２Ｈ５抗体、ＧＳＣ１５４－２７抗体、及び国際公報ＷＯ２０１９／１８９８８２号公報に記載されているＳ１８２０１Ｒ抗体、Ｓ１８２０２Ｒ抗体、Ｓ１８２０３Ｒ抗体、Ｓ１８２０４Ｒ抗体等が挙げられる。その中でも、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗体、ＣＤ１５ｓ抗体が好ましい。下記式（Ｙ）に記載の糖鎖構造を有する糖タンパク質と反応する抗体がより好ましく、下記式（Ｙ）に記載の糖鎖構造を有する糖タンパク質と反応する抗体としてはＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗体が挙げられる。
【0022】
免疫学的方法に用いるキットとしては、ＥｎＶｉｓｉｏｎＴＭ ＦＬＥＸ（アジレント・テクノロジー株式会社）、ベンタナ ｕｌｔｒａＶｉｅｗ ＤＡＢ ユニバーサルキット（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）、ベンタナ ＯｐｔｉＶｉｅｗ ＤＡＢ ユニバーサルキット（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）、ラナザイム ＳＴ-４３９プレート（日本化薬株式会社）、ルミパルス ＳＴ-４３９「ＮＫ」（富士レビオ株式会社）、ＳＬＸ「ＤＰ」ＩＲＭＡキット（ＤＥＮＩＳファーマ株式会社）、Ｎ-テスト ＥＩＡプレート ＣＳＬＥＸ-Ｈ ニットーボー（ニットーボーメディカル株式会社）等が挙げられる。
【0023】
【化2】
【0024】
【化3】
【0025】
本発明の検査方法において、好ましくは、前記試料におけるシアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原の発現割合または発現量が予め定められた参照値未満である場合に、患者の予後が良好である可能性があると判定し、前記試料におけるシアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原の発現割合または発現量が予め定められた参照値以上である場合に、患者の予後が不良である可能性があると判定することができる。
【0026】
本発明の検査方法において、好ましくは、前記乳がん患者の予後を判定するための検査方法は、前記患者から採取された試料におけるシアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原の発現を検出することを含み、前記試料におけるシアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原の発現が糖タンパク質を発現しているがん細胞が全がん細胞に対して１％未満である場合または血清中の糖タンパク質の濃度が１．０ Ｕ／ｍＬ未満の場合、前記患者の予後が良好である可能性があると判定し、前記試料におけるシアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原の発現が糖タンパク質を発現しているがん細胞が全がん細胞に対して１％以上である場合または血清中の糖タンパク質の濃度が１．０ Ｕ／ｍＬ以上の場合、前記患者の予後が不良である可能性があると判定する、検査方法である。
【0027】
前記試料が腫瘍の外科切除検体あるいは生検検体である場合は、前記シアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原の検出方法としては免疫組織化学法が好ましい。免疫組織化学法は、抗原抗体反応を利用して組織や細胞内に存在する抗原物質の局在を同定する手法である。
【0028】
前記試料が腫瘍の外科切除検体あるいは生検検体である場合は、前記検出方法として、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗体を用いた免疫組織化学法が好ましい。免疫組織化学法とは、腫瘍の摘出手術において得られた腫瘍の外科切除検体あるいは生検検体をホルマリン固定パラフィン包埋組織薄切切片とし、シアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原を認識する抗体を結合させ、その後、抗体を検出する試薬を反応させ、染色された陽性細胞の割合と陽性強度を測定する。
【0029】
前記試料が腫瘍の外科切除検体あるいは生検検体である場合の前記がん患者の予後を予測する検査方法において、前記がん患者はホルモンレセプター陰性の乳がん患者であることが好ましく、ホルモンレセプター及びＨＥＲ２ともに陰性である乳がん患者であることが好ましい。
【0030】
前記抗体を検出する試薬としては、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗体、ＣＤ１５ｓ抗体、Ｓ１８２０１Ｒ抗体、Ｓ１８２０２Ｒ抗体、Ｓ１８２０３Ｒ抗体、Ｓ１８２０４Ｒ抗体が挙げられる。前記乳がん患者の予後予測用抗体としては、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗体、Ｓ１８２０１Ｒ抗体、Ｓ１８２０２Ｒ抗体、Ｓ１８２０３Ｒ抗体及びＳ１８２０４Ｒ抗体が好ましく、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗体がより好ましい。
【0031】
前記免疫組織化学法において、測定に使用できる測定機器としては、自動免疫組織染色システムが挙げられる。
【0032】
前記試料が血清である場合は、前記糖タンパク質の検出方法としては免疫学的測定法が好ましい。免疫学的測定法は、抗原抗体反応を利用して血清や尿等に含まれる抗原物質の濃度を測定する手法である。
【0033】
前記試料が血清である場合は、前記検出方法として、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗体を用いた免疫学的測定法が好ましい。
【0034】
前記糖タンパク質の発現が認められた場合、予後が不良であると可能性があると判定する。前記試料が腫瘍の外科切除検体あるいは生検検体である場合は、前記検出方法において、糖タンパク質を発現しているがん細胞が全がん細胞に対して１％以上であると、前記患者の予後が不良であると判定することができる。前記判定方法において、１％以上であることが予後が不良であると判定するためには適しており、１０％以上であることがより予後が不良であると判定するためには適している。前記試料が血清である場合は、血清中の糖タンパク質の濃度が１．０ Ｕ／ｍＬ以上であると、前記患者の予後が不良であると判定することができる。前記判定方法において、１．０ Ｕ／ｍＬ以上であることが予後が不良であると判定するためには適しており、男性および５０歳以上の女性４．５ Ｕ／ｍＬ以上、５０歳未満の女性７．０ Ｕ／ｍＬ以上であることがより予後が不良であると判定するためには適している。前記判定方法において、試料が血清であることが予後が不良であると判定するためには適しており、組織であることがより予後が不良であると判定するためには適している。
【0035】
前記予後とは、外科切除後の経過期間であり、予後が不良であるとは、外科切除後の経過期間にがんの再発又は死亡が起こることである。前記検出方法において予測できる予後としては、無再発生存期間（ＲＦＳ：ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ―ｆｒｅｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ）が適している。
【0036】
本発明はさらに、シアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原に対する抗体を含む、乳がん患者の予後予測用の試薬に関する。シアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原に対する抗体としては、例えば、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗体、ＣＤ１５ｓ抗体、ＨＥＣＡ－４５２抗体、Ｓ１８２０１Ｒ抗体、Ｓ１８２０２Ｒ抗体、Ｓ１８２０３Ｒ抗体及びＳ１８２０４Ｒ抗体が挙げられる。前記乳がん患者の予後予測用の試薬として用いる抗体としては、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗体が好ましい。また、ホルモンレセプター陰性乳がん患者の予後予測用の試薬として用いる抗体としては、上記式（Ｙ）に記載の糖鎖構造を有する糖タンパク質と反応するＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗体を使用することが好ましい。
【0037】
本発明はさらに、シアリルルイスＸ構造を持つ糖鎖抗原に対する抗体と、前記抗体を検出するための試薬とを含む、乳がん患者の予後予測用の検査キットに関する。前記検査キットで用いる組織標本は、ホルマリン、パラホルムアルデヒド、エタノールなどを用いる固定法により固定されたパラフィン切片、あるいは当該分野で常用されるその他の包埋材を用いて包埋された組織切片、または凍結組織切片などである。前記組織標本に前記抗体を添加し，組織標本中の抗原に抗体を結合させる。前記抗体を検出する試薬としては、酵素抗体法、蛍光抗体法、金コロイド法などにおいて使用する試薬が挙げられる。キットの形態としては、酵素抗体法、蛍光抗体法、金コロイド法を用いた免疫組織化学染色キットが挙げられ、酵素抗体法、蛍光抗体法を用いた免疫組織化学染色キットが好ましく、酵素抗体法を用いた免疫組織化学染色キットが特に好ましい。
以下の実施例により本発明を更に詳細に説明する。
以下の実施例により本発明を更に詳細に説明する。
【実施例0038】
１．患者の選択
原発性乳がんの術前診断にて２００９年１月～１２月に国立がん研究センター中央病院乳腺外科で外科切除された、両側性乳がん症例を除く、連続症例の３３６症例を患者として選択した。臨床病理データは診療録から情報を収集した。
原発性乳がんの術前診断にて２００９年１月～１２月に国立がん研究センター中央病院乳腺外科で外科切除された、両側性乳がん症例を除く、連続症例の３３６症例を患者として選択した。臨床病理データは診療録から情報を収集した。
【0039】
予後解析は、術前化学療法を実施していない浸潤癌症例（ｎ＝２６０）および臨床的に浸潤癌と判断され術前化学療法実施後に外科切除された症例（ｎ＝４４）の合計３０４症例について実施した。
【0040】
２．病理学的解析
外科切除検体は、病変部を全割して病理学的に解析し、腫瘍は乳癌取り扱い規約第１７版（金原出版、東京）およびＷＨＯ分類（ＷＨＯ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｕｍｏｕｒｓ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｔｕｍｏｕｒｓ，ＷＨＯ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｕｒｓ ｅｄｉｔｏｒｉａｌ ｂｏａｒｄ（ｅｄ．）， ＩＡＲＣ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＵＩＣＣ ＴＮＭ分類８版（Ｔｈｅ ＴＮＭ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｔｕｍｏｕｒｓ，８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｒｉｅｒｌｅｙ ＪＤ，Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ ＭＫ，Ｗｉｔｔｅｋｉｎｄ ｃ（ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）に従って分類した。以下の解析には代表腫瘍組織である最大割面部分を使用した。
外科切除検体は、病変部を全割して病理学的に解析し、腫瘍は乳癌取り扱い規約第１７版（金原出版、東京）およびＷＨＯ分類（ＷＨＯ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｕｍｏｕｒｓ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｔｕｍｏｕｒｓ，ＷＨＯ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｕｒｓ ｅｄｉｔｏｒｉａｌ ｂｏａｒｄ（ｅｄ．）， ＩＡＲＣ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＵＩＣＣ ＴＮＭ分類８版（Ｔｈｅ ＴＮＭ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｔｕｍｏｕｒｓ，８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｒｉｅｒｌｅｙ ＪＤ，Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ ＭＫ，Ｗｉｔｔｅｋｉｎｄ ｃ（ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）に従って分類した。以下の解析には代表腫瘍組織である最大割面部分を使用した。
【0041】
３．免疫組織化学
異なる糖鎖構造に付加するシアリルルイスＸを特異的に認識する抗体として、ＣＤ１５ｓ抗体（ＣＳＬＥＸ－１，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ， ＮＪ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗体（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９１；５１：２１９９－２０４）ならびにＨＥＣＡ－４５２抗体を用いて免疫組織化学を実施した。４μｍ厚ホルマリン固定パラフィン包埋組織薄切切片を用意し、ＣＤ１５ｓ抗体、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗体の免疫組織化学には、Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ ｌｉｎｋ ４８（ＤＡＫＯ， Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Sａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用い、ＨＥＣＡ－４５２抗体を用いた免疫組織化学にはＥｎＶｉｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（ＤＡＫＯ）を用いた。免疫組織化学の結果について、陽性細胞の割合と陽性強度により評価した。内部陽性コントロール非腫瘍乳管上皮細胞の陽性強度と同等以上の陽性強度を示すがん細胞が全がん細胞の１０％以上存在するものを陽性と判断した。
異なる糖鎖構造に付加するシアリルルイスＸを特異的に認識する抗体として、ＣＤ１５ｓ抗体（ＣＳＬＥＸ－１，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ， ＮＪ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗体（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９１；５１：２１９９－２０４）ならびにＨＥＣＡ－４５２抗体を用いて免疫組織化学を実施した。４μｍ厚ホルマリン固定パラフィン包埋組織薄切切片を用意し、ＣＤ１５ｓ抗体、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗体の免疫組織化学には、Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ ｌｉｎｋ ４８（ＤＡＫＯ， Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Sａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用い、ＨＥＣＡ－４５２抗体を用いた免疫組織化学にはＥｎＶｉｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（ＤＡＫＯ）を用いた。免疫組織化学の結果について、陽性細胞の割合と陽性強度により評価した。内部陽性コントロール非腫瘍乳管上皮細胞の陽性強度と同等以上の陽性強度を示すがん細胞が全がん細胞の１０％以上存在するものを陽性と判断した。
【0042】
４．免疫学的測定
ＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗原キット（ラナザイム ＳＴ－４３９プレート，日本化薬株式会社）を用いて血清中のＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗原の測定を実施した。ＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗原濃度が１．０ Ｕ／ｍＬ以上を陽性と判断した。また，ラナザイム ＳＴ－４３９プレートの添付文書に記載の陽性判定基準である男性および５０歳以上の女性４．５ Ｕ／ｍＬ以上、５０歳未満の女性７．０ Ｕ／ｍＬ以上で再解析した。なお、抗原濃度の単位 Ｕ／ｍＬは、ＳＴ－４３９をはじめに同定した際の濃度を基準としたものである（大倉久直ほか：各種癌・良性疾患患者血清によるＮＣＣ－ＳＴ－４３９ＥＩＡキットの臨床的検討（１）．癌と化学療法 １４：１９０１－１９０６，１９８７）。
ＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗原キット（ラナザイム ＳＴ－４３９プレート，日本化薬株式会社）を用いて血清中のＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗原の測定を実施した。ＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗原濃度が１．０ Ｕ／ｍＬ以上を陽性と判断した。また，ラナザイム ＳＴ－４３９プレートの添付文書に記載の陽性判定基準である男性および５０歳以上の女性４．５ Ｕ／ｍＬ以上、５０歳未満の女性７．０ Ｕ／ｍＬ以上で再解析した。なお、抗原濃度の単位 Ｕ／ｍＬは、ＳＴ－４３９をはじめに同定した際の濃度を基準としたものである（大倉久直ほか：各種癌・良性疾患患者血清によるＮＣＣ－ＳＴ－４３９ＥＩＡキットの臨床的検討（１）．癌と化学療法 １４：１９０１－１９０６，１９８７）。
【0043】
５．ホルモン受容体解析
乳癌診療ガイドライン（科学的根拠に基づく 乳癌診療ガイドライン４．検診・診断 ２００８年版、日本乳癌学会編、金原出版、東京）に従って、ホルモン受容体（ＥＲ、ＰｇＲ）の解析を行った。免疫組織化学的染色によりＥＲ、ＰｇＲの染色を行った。一次抗体として抗ＥＲ抗体（ｃｌｏｎｅ １Ｄ５；ＤＡＫＯ）、抗ＰｇＲ抗体（ｃｌｏｎｅ ＰｇＲ６３６；ＤＡＫＯ）を用い、メーカー指定のプロトコールに則って染色を行った。腫瘍組織における陽性細胞の割合を判定し、１０％以上をホルモン受容体陽性と判定した。
乳癌診療ガイドライン（科学的根拠に基づく 乳癌診療ガイドライン４．検診・診断 ２００８年版、日本乳癌学会編、金原出版、東京）に従って、ホルモン受容体（ＥＲ、ＰｇＲ）の解析を行った。免疫組織化学的染色によりＥＲ、ＰｇＲの染色を行った。一次抗体として抗ＥＲ抗体（ｃｌｏｎｅ １Ｄ５；ＤＡＫＯ）、抗ＰｇＲ抗体（ｃｌｏｎｅ ＰｇＲ６３６；ＤＡＫＯ）を用い、メーカー指定のプロトコールに則って染色を行った。腫瘍組織における陽性細胞の割合を判定し、１０％以上をホルモン受容体陽性と判定した。
【0044】
６．ＨＥＲ２解析
ハーセプチン適正使用選択のためのＨＥＲ２検査ガイド第３版（ＡＳＣＯ／ＣＡＰ ＨＥＲ２検査ガイドラインに準拠）（トラスツズマブ病理部会作成）にしたがって解析した。はじめに免疫組織化学的染色により評価を行い、境界域の症例についてはＦＩＳＨ法による評価を加えた。免疫組織化学法は、抗ＨＥＲ２抗体（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ， ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ ＩＩ， ＤＡＫＯ）を一次抗体として用い、メーカー指定のプロトコールに則って染色を行った。判定は浸潤巣を対象として行い、スコア０、１＋は陰性、スコア３＋は陽性と判定した。スコア２＋の境界域症例についてはＦＩＳＨ法を行い、増幅がみられた症例（ＨＥＲ２／ＣＥＰ１７シグナル比２．０以上）を陽性と判定した。ＦＩＳＨプローブとしてパスビジョンＨＥＲ２ ＤＮＡプローブキットを用いた。
ハーセプチン適正使用選択のためのＨＥＲ２検査ガイド第３版（ＡＳＣＯ／ＣＡＰ ＨＥＲ２検査ガイドラインに準拠）（トラスツズマブ病理部会作成）にしたがって解析した。はじめに免疫組織化学的染色により評価を行い、境界域の症例についてはＦＩＳＨ法による評価を加えた。免疫組織化学法は、抗ＨＥＲ２抗体（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ， ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ ＩＩ， ＤＡＫＯ）を一次抗体として用い、メーカー指定のプロトコールに則って染色を行った。判定は浸潤巣を対象として行い、スコア０、１＋は陰性、スコア３＋は陽性と判定した。スコア２＋の境界域症例についてはＦＩＳＨ法を行い、増幅がみられた症例（ＨＥＲ２／ＣＥＰ１７シグナル比２．０以上）を陽性と判定した。ＦＩＳＨプローブとしてパスビジョンＨＥＲ２ ＤＮＡプローブキットを用いた。
【0045】
７．統計学的解析
各因子の解析にはｔ検定、カイ２乗検定を、生存解析はＫａｐｌａｎ―Ｍｅｉｅｒ生存解析、Ｃｏｘ比例ハザードモデルを用いて検討し、ｌｏｇ－ｒａｎｋ試験を用いて解析した。解析ソフトはＪＭＰｖｅｒ．１１（ＳＡＳ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｒｙ，ＮＣ， Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用した。解析においてｐ値＜０．０５の場合に有意差有り，ｐ値＜０．１０の場合に有意傾向有りと判定した。
各因子の解析にはｔ検定、カイ２乗検定を、生存解析はＫａｐｌａｎ―Ｍｅｉｅｒ生存解析、Ｃｏｘ比例ハザードモデルを用いて検討し、ｌｏｇ－ｒａｎｋ試験を用いて解析した。解析ソフトはＪＭＰｖｅｒ．１１（ＳＡＳ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｒｙ，ＮＣ， Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用した。解析においてｐ値＜０．０５の場合に有意差有り，ｐ値＜０．１０の場合に有意傾向有りと判定した。
【0046】
８．倫理事項
本研究は国立がん研究センター研究倫理審査委員会による承認を得たものである（研究課題番号２０１８－１１９）。研究に参加したすべての被験者からインフォームド・コンセントを得た。また全ての研究はヘルシンキ宣言の原則に沿って行われた。
本研究は国立がん研究センター研究倫理審査委員会による承認を得たものである（研究課題番号２０１８－１１９）。研究に参加したすべての被験者からインフォームド・コンセントを得た。また全ての研究はヘルシンキ宣言の原則に沿って行われた。
【0047】
９．結果
９－１ 臨床病理学的因子
対象患者３３６症例の臨床病理学的情報を表１に示した。患者の年齢は、２５歳から９５歳であり、中央値は５５．５歳であった。組織型は、非浸潤性乳管癌が３５例（１０．４％）、浸潤性乳管癌通常型が２４８例（７３．８％）、浸潤性乳管癌特殊型が５３例（１５．８％）であった。核グレードは、１及び２が２１６例（６４．３％）、３が１２０例（３５．７％）であった。脈管侵襲は、なしが２２１例（６５．８％）、ありが１１５例（３４．２％）であった。ホルモンレセプターは、陽性が２４８例（８１．６％）、陰性が５６例（１８．４％）であった。バイオマーカー亜型分類は、ＨＲ＋／ＨＥＲ２－：２５０例（７４．４％）、ＨＲ＋／ＨＥＲ２＋：２４例（７．１％）、ＨＲ－／ＨＥＲ２＋：２２例（６．５％）、ＨＲ－／ＨＥＲ２－：４０例（１１．９％）であった。リンパ節転移は、なしが２３９例（７１．１％），ありが９７例（２８．９％）であった。ステージは、０：３５例（１０．４％）、１：１４３例（４２．６％）、２：９９例（２９．５％）、３：５９例（１７．６％）であった。化学療法は、なしが２０９例（６２．２％）、術前化学療法ありが４４例（１３．１％）、術後補助化学療法ありが８３例（２４．７％）であった。ホルモン治療は、なしが９９例（２９．５％）、ありが２３７例（７０．５％）であった。放射線治療は、なしが１３８例（４１．１％）、ありが１９８例（５８．９％）であった。
９－１ 臨床病理学的因子
対象患者３３６症例の臨床病理学的情報を表１に示した。患者の年齢は、２５歳から９５歳であり、中央値は５５．５歳であった。組織型は、非浸潤性乳管癌が３５例（１０．４％）、浸潤性乳管癌通常型が２４８例（７３．８％）、浸潤性乳管癌特殊型が５３例（１５．８％）であった。核グレードは、１及び２が２１６例（６４．３％）、３が１２０例（３５．７％）であった。脈管侵襲は、なしが２２１例（６５．８％）、ありが１１５例（３４．２％）であった。ホルモンレセプターは、陽性が２４８例（８１．６％）、陰性が５６例（１８．４％）であった。バイオマーカー亜型分類は、ＨＲ＋／ＨＥＲ２－：２５０例（７４．４％）、ＨＲ＋／ＨＥＲ２＋：２４例（７．１％）、ＨＲ－／ＨＥＲ２＋：２２例（６．５％）、ＨＲ－／ＨＥＲ２－：４０例（１１．９％）であった。リンパ節転移は、なしが２３９例（７１．１％），ありが９７例（２８．９％）であった。ステージは、０：３５例（１０．４％）、１：１４３例（４２．６％）、２：９９例（２９．５％）、３：５９例（１７．６％）であった。化学療法は、なしが２０９例（６２．２％）、術前化学療法ありが４４例（１３．１％）、術後補助化学療法ありが８３例（２４．７％）であった。ホルモン治療は、なしが９９例（２９．５％）、ありが２３７例（７０．５％）であった。放射線治療は、なしが１３８例（４１．１％）、ありが１９８例（５８．９％）であった。
【0048】
【表1】
【0049】
［実施例１］
９－２．免疫組織化学
表２に免疫染色化学の結果を示す。ＣＤ１５ｓは陽性：１３３例（４４％）、陰性１７１例（５６％）であり、ＨＥＣＡ－４５２は陽性：１９８例（６５％）、陰性１０６例（３５％）であり、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９は陽性：８８例（２９％）、陰性２１６例（７１％）であった。各抗体の認識糖鎖構造を図１に示す。シアリルルイスＸを認識するＨＥＣＡ－４５２抗体は、シアリルルイスＡにも反応する。ＣＤ１５ｓ抗体は、亜末端のフコース残基を含むシアリルルイスＸに反応する。ＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗体は、コア２Ｏ結合型糖鎖構造上のシアリルルイスＸに反応する。
９－２．免疫組織化学
表２に免疫染色化学の結果を示す。ＣＤ１５ｓは陽性：１３３例（４４％）、陰性１７１例（５６％）であり、ＨＥＣＡ－４５２は陽性：１９８例（６５％）、陰性１０６例（３５％）であり、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９は陽性：８８例（２９％）、陰性２１６例（７１％）であった。各抗体の認識糖鎖構造を図１に示す。シアリルルイスＸを認識するＨＥＣＡ－４５２抗体は、シアリルルイスＡにも反応する。ＣＤ１５ｓ抗体は、亜末端のフコース残基を含むシアリルルイスＸに反応する。ＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗体は、コア２Ｏ結合型糖鎖構造上のシアリルルイスＸに反応する。
【0050】
免疫染色でＮＣＣ－ＳＴ－４３９が陽性となった例を図２に示す。ＮＣＣ－ＳＴ－４３９は乳がん細胞の細胞質・細胞膜に発現し、同一症例でも発現の強弱、有無にｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙがしばしば認められた。
【0051】
ホルモンレセプター陽性患者でＣＤ１５ｓの発現が「陽性」に分類されたのは、１０３例（４２％）、「陰性」に分類されたのは、１４５例（５８％）であった。ホルモンレセプター陰性患者でＣＤ１５ｓの発現が「陽性」に分類されたのは、３０例（５４％）、「陰性」に分類されたのは、２６例（４６％）であった。
【0052】
ホルモンレセプター陽性患者でＨＥＣＡ－４５２の発現が「陽性」に分類されたのは、１４８例（６０％）、「陰性」に分類されたのは、１００例（４０％）であった。ホルモンレセプター陰性患者でＨＥＣＡ－４５２の発現が「陽性」に分類されたのは、４９例（８７％）、「陰性」に分類されたのは、７例（１３％）であった。
【0053】
ホルモンレセプター陽性患者でＮＣＣ－ＳＴ－４３９の発現が「陽性」に分類されたのは、７４例（３０％）、「陰性」に分類されたのは、１７４例（７０％）であった。ホルモンレセプター陰性患者でＮＣＣ－ＳＴ－４３９の発現が「陽性」に分類されたのは、１４例（２５％）、「陰性」に分類されたのは、４２例（７５％）であった。
【0054】
バイオマーカー亜型分類で患者群を分けるとＨＲ＋／ＨＥＲ２－患者でＣＤ１５ｓの発現が「陽性」に分類されたのは、９５例（４２％）、「陰性」に分類されたのは、１３１例（５８％）であった。ＨＲ＋／ＨＥＲ２＋患者でＣＤ１５ｓの発現が「陽性」に分類されたのは、９例（３９％）、「陰性」に分類されたのは、１４例（６１％）であった。ＨＲ－／ＨＥＲ２－患者でＣＤ１５ｓの発現が「陽性」に分類されたのは、１８例（４９％）、「陰性」に分類されたのは、１９例（５１％）であった。ＨＲ－／ＨＥＲ２＋患者でＣＤ１５ｓの発現が「陽性」に分類されたのは、１２例（６３％）、「陰性」に分類されたのは、７例（３７％）であった。
【0055】
バイオマーカー亜型分類で患者群を分けるとＨＲ＋／ＨＥＲ２－患者でＨＥＣＡ－４５２の発現が「陽性」に分類されたのは、１３４例（６０％）、「陰性」に分類されたのは、９１例（４０％）であった。ＨＲ＋／ＨＥＲ２＋患者でＨＥＣＡ－４５２の発現が「陽性」に分類されたのは、１４例（６１％）、「陰性」に分類されたのは、９例（３９％）であった。ＨＲ－／ＨＥＲ２－患者でＨＥＣＡ－４５２の発現が「陽性」に分類されたのは、３２例（８６％）、「陰性」に分類されたのは、５例（１４％）であった。ＨＲ－／ＨＥＲ２＋患者でＨＥＣＡ－４５２の発現が「陽性」に分類されたのは、１８例（９５％）、「陰性」に分類されたのは、１例（５％）であった。
【0056】
バイオマーカー亜型分類で患者群を分けるとＨＲ＋／ＨＥＲ２－患者でＮＣＣ－ＳＴ－４３９の発現が「陽性」に分類されたのは、７０例（３１％）、「陰性」に分類されたのは、１５５例（６９％）であった。ＨＲ＋／ＨＥＲ２＋患者でＮＣＣ－ＳＴ－４３９の発現が「陽性」に分類されたのは、４例（１７％）、「陰性」に分類されたのは、１９例（８３％）であった。ＨＲ－／ＨＥＲ２－患者でＮＣＣ－ＳＴ－４３９の発現が「陽性」に分類されたのは、１１例（３０％）、「陰性」に分類されたのは、２６例（７０％）であった。ＨＲ－／ＨＥＲ２＋患者でＮＣＣ－ＳＴ－４３９の発現が「陽性」に分類されたのは、３例（１６％）、「陰性」に分類されたのは、１６例（８３％）であった。
【0057】
【表2】
【0058】
９－３．乳がん細胞（がん組織内）のＮＣＣ－ＳＴ－４３９発現とＲＦＳとの相関
乳がん細胞（がん組織内）のＮＣＣ－ＳＴ－４３９発現の有無と、患者のＲＦＳとの関連性を検討した。
乳がん細胞（がん組織内）のＮＣＣ－ＳＴ－４３９発現の有無と、患者のＲＦＳとの関連性を検討した。
【0059】
全浸潤癌症例を対象としたＮＣＣ－ＳＴ－４３９陽性患者群及びＮＣＣ－ＳＴ－４３９陰性患者群のＫａｐｌａｎ―Ｍｅｉｅｒ生存曲線を図３に示す。統計解析の結果、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９陽性症例では陰性群に比して有意に短かった（ｐ＝０．００５）。
【0060】
ホルモンレセプター陽性・陰性群のそれぞれを対象としたＮＣＣ－ＳＴ－４３９陽性患者群及びＮＣＣ－ＳＴ－４３９陰性患者群のＫａｐｌａｎ―Ｍｅｉｅｒ生存曲線を図４に示す。左のパネルはホルモンレセプター陽性群、右のパネルはホルモンレセプター陰性群を示したものである。統計解析の結果、ホルモンレセプター陰性群ではＮＣＣ－ＳＴ－４３９陽性症例は早期から再発し、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９陰性群に比して有意に短かった（ｐ＝０．００２）。
【0061】
バイオマーカー亜型分類のそれぞれを対象としたＮＣＣ－ＳＴ－４３９陽性患者群及びＮＣＣ－ＳＴ－４３９陰性患者群のＫａｐｌａｎ―Ｍｅｉｅｒ生存曲線を図５に示す。左上のパネルはＨＲ＋／ＨＥＲ２－症例、左下のパネルはＨＲ＋／ＨＥＲ２＋症例、右上のパネルはＨＲ－／ＨＥＲ２＋症例、右下のパネルはＨＲ－／ＨＥＲ２－症例を示したものである。統計解析の結果、ＨＲ－／ＨＥＲ２＋群及びＨＲ－／ＨＥＲ２－群両症例において、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９陽性群は陰性群に比して有意に短かった（ｐ＝０．０２６及びｐ＝０．０２２）。
【0062】
９－４．乳がん細胞（がん組織内）の他の糖鎖抗原発現とＲＦＳとの相関
乳がん細胞（がん組織内）の他の糖鎖抗原発現の有無と、患者のＲＦＳとの関連性を検討した。
乳がん細胞（がん組織内）の他の糖鎖抗原発現の有無と、患者のＲＦＳとの関連性を検討した。
【0063】
全浸潤癌症例を対象とした各糖鎖抗原陽性患者群及び各糖鎖抗原陰性患者群のＫａｐｌａｎ―Ｍｅｉｅｒ生存曲線を図６に示す。パネルは上からＣＤ１５ｓ、ＨＥＣＡ－４５２を示したものである。統計解析の結果、ＣＤ１５ｓ陽性乳がん症例は陰性群に比して有意に短かった（ｐ＝０．０３７）。ＨＥＣＡ－４５２陽性乳がん症例は陰性群に比して有意に短い傾向にあった（ｐ＝０．０６０）。ＮＣＣ－ＳＴ－４３９（前記 ９－３）と併せて、シアリルルイスＸ発現乳がんはＲＦＳが短いと考えられる。
【0064】
［実施例２］
９－５．免疫学的測定（陽性判定基準：１．０ Ｕ／ｍＬ以上）
表３に免疫学的測定（陽性判定基準：１．０ Ｕ／ｍＬ以上）の結果を示す。全浸潤癌症例を対象とした血清中のＮＣＣ－ＳＴ－４３９は陽性：１６９例（５６％）、陰性１３４例（４４％）であった。
９－５．免疫学的測定（陽性判定基準：１．０ Ｕ／ｍＬ以上）
表３に免疫学的測定（陽性判定基準：１．０ Ｕ／ｍＬ以上）の結果を示す。全浸潤癌症例を対象とした血清中のＮＣＣ－ＳＴ－４３９は陽性：１６９例（５６％）、陰性１３４例（４４％）であった。
【0065】
ホルモンレセプター陽性患者でＮＣＣ－ＳＴ－４３９の発現が「陽性」に分類されたのは、１３６例（５５％）、「陰性」に分類されたのは、１１２例（４５％）であった。ホルモンレセプター陰性患者でＮＣＣ－ＳＴ－４３９の発現が「陽性」に分類されたのは、３３例（６０％）、「陰性」に分類されたのは、２２例（４０％）であった。
【0066】
バイオマーカー亜型分類で患者群を分けるとＨＲ＋／ＨＥＲ２－患者でＮＣＣ－ＳＴ－４３９の発現が「陽性」に分類されたのは、１２５例（５６％）、「陰性」に分類されたのは、１００例（４４％）であった。ＨＲ＋／ＨＥＲ２＋患者でＮＣＣ－ＳＴ－４３９の発現が「陽性」に分類されたのは、１１例（４８％）、「陰性」に分類されたのは、１２例（５２％）であった。ＨＲ－／ＨＥＲ２－患者でＮＣＣ－ＳＴ－４３９の発現が「陽性」に分類されたのは、２３例（６２％）、「陰性」に分類されたのは、１４例（３８％）であった。ＨＲ－／ＨＥＲ２＋患者でＮＣＣ－ＳＴ－４３９の発現が「陽性」に分類されたのは、１０例（５６％）、「陰性」に分類されたのは、８例（４４％）であった。
【0067】
【表3】
【0068】
９－６．血清中のＮＣＣ－ＳＴ－４３９発現とＲＦＳとの相関（陽性判定基準：１．０ Ｕ／ｍＬ以上）
血清中のＮＣＣ－ＳＴ－４３９発現の有無と、患者のＲＦＳとの関連性を検討した。
血清中のＮＣＣ－ＳＴ－４３９発現の有無と、患者のＲＦＳとの関連性を検討した。
【0069】
全浸潤癌症例を対象とした血清中のＮＣＣ－ＳＴ－４３９陽性患者群及びＮＣＣ－ＳＴ－４３９陰性患者群のＫａｐｌａｎ―Ｍｅｉｅｒ生存曲線を図７に示す。統計解析の結果、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９陽性乳がん症例は陰性群に比して有意に短い傾向にあった（ｐ＝０．０６６）。
【0070】
ホルモンレセプター陽性・陰性群のそれぞれを対象とした血清中のＮＣＣ－ＳＴ－４３９陽性患者群及びＮＣＣ－ＳＴ－４３９陰性患者群のＫａｐｌａｎ―Ｍｅｉｅｒ生存曲線を図８に示す。左のパネルはホルモンレセプター陽性群、右のパネルはホルモンレセプター陰性群を示したものである。統計解析の結果、ホルモンレセプター陰性群ではＮＣＣ－ＳＴ－４３９陽性症例は早期から再発し、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９陰性群に比して有意に短かった（ｐ＝０．０３３）。
【0071】
バイオマーカー亜型分類のそれぞれを対象とした血清中のＮＣＣ－ＳＴ－４３９陽性患者群及びＮＣＣ－ＳＴ－４３９陰性患者群のＫａｐｌａｎ―Ｍｅｉｅｒ生存曲線を図９に示す。左上のパネルはＨＲ＋／ＨＥＲ２－症例、左下のパネルはＨＲ＋／ＨＥＲ２＋症例、右上のパネルはＨＲ－／ＨＥＲ２＋症例、右下のパネルはＨＲ－／ＨＥＲ２－症例を示したものである。統計解析の結果、ＨＲ－／ＨＥＲ２－群において、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９陽性群は陰性群に比して、ＲＦＳが有意に短かった（ｐ＝０．０３９）。
【0072】
［実施例３］
９－７．免疫学的測定（陽性判定基準：男性および５０歳以上の女性４．５ Ｕ／ｍＬ以上、５０歳未満の女性７．０ Ｕ／ｍＬ以上）
表４に免疫学的測定（陽性判定基準：男性および５０歳以上の女性４．５ Ｕ／ｍＬ以上、５０歳未満の女性７．０ Ｕ／ｍＬ以上）の結果を示す。全浸潤癌症例を対象とした血清中のＮＣＣ－ＳＴ－４３９は陽性：２９例（１０％）、陰性２７４例（９０％）であった。
９－７．免疫学的測定（陽性判定基準：男性および５０歳以上の女性４．５ Ｕ／ｍＬ以上、５０歳未満の女性７．０ Ｕ／ｍＬ以上）
表４に免疫学的測定（陽性判定基準：男性および５０歳以上の女性４．５ Ｕ／ｍＬ以上、５０歳未満の女性７．０ Ｕ／ｍＬ以上）の結果を示す。全浸潤癌症例を対象とした血清中のＮＣＣ－ＳＴ－４３９は陽性：２９例（１０％）、陰性２７４例（９０％）であった。
【0073】
ホルモンレセプター陽性患者でＮＣＣ－ＳＴ－４３９の発現が「陽性」に分類されたのは、２４例（１０％）、「陰性」に分類されたのは、２２４例（９０％）であった。ホルモンレセプター陰性患者でＮＣＣ－ＳＴ－４３９の発現が「陽性」に分類されたのは、５例（９％）、「陰性」に分類されたのは、５０例（９１％）であった。
【0074】
バイオマーカー亜型分類で患者群を分けるとＨＲ＋／ＨＥＲ２－患者でＮＣＣ－ＳＴ－４３９の発現が「陽性」に分類されたのは、２４例（１１％）、「陰性」に分類されたのは、２０１例（８９％）であった。ＨＲ＋／ＨＥＲ２＋患者でＮＣＣ－ＳＴ－４３９の発現が「陽性」に分類されたのは、０例（０％）、「陰性」に分類されたのは、２３例（１００％）であった。ＨＲ－／ＨＥＲ２－患者でＮＣＣ－ＳＴ－４３９の発現が「陽性」に分類されたのは、４例（１１％）、「陰性」に分類されたのは、３３例（８９％）であった。ＨＲ－／ＨＥＲ２＋患者でＮＣＣ－ＳＴ－４３９の発現が「陽性」に分類されたのは、１例（６％）、「陰性」に分類されたのは、１７例（９４％）であった。
【0075】
【表4】
【0076】
９－８．血清中のＮＣＣ－ＳＴ－４３９発現とＲＦＳとの相関（陽性判定基準：男性および５０歳以上の女性４．５ Ｕ／ｍＬ以上、５０歳未満の女性７．０ Ｕ／ｍＬ以上）
血清中のＮＣＣ－ＳＴ－４３９発現の有無と、患者のＲＦＳとの関連性を検討した。
血清中のＮＣＣ－ＳＴ－４３９発現の有無と、患者のＲＦＳとの関連性を検討した。
【0077】
全浸潤癌症例を対象とした血清中のＮＣＣ－ＳＴ－４３９陽性患者群及びＮＣＣ－ＳＴ－４３９陰性患者群のＫａｐｌａｎ―Ｍｅｉｅｒ生存曲線を図１０に示す。統計解析の結果、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９陽性症例では陰性群に比して有意に短かった（ｐ＜０．００１）。
【0078】
ホルモンレセプター陽性・陰性群のそれぞれを対象とした血清中のＮＣＣ－ＳＴ－４３９陽性患者群及びＮＣＣ－ＳＴ－４３９陰性患者群のＫａｐｌａｎ―Ｍｅｉｅｒ生存曲線を図１１に示す。左のパネルはホルモンレセプター陽性群、右のパネルはホルモンレセプター陰性群を示したものである。統計解析の結果、ホルモンレセプター陰性群ではＮＣＣ－ＳＴ－４３９陽性症例は早期から再発し、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９陰性群に比して有意に短かった（ｐ＜０．００１）。ホルモンレセプター陽性群ではＮＣＣ－ＳＴ－４３９陽性乳がん症例は陰性群に比して有意に短い傾向にあった（ｐ＝０．０８２）。
【0079】
バイオマーカー亜型分類のそれぞれを対象とした血清中のＮＣＣ－ＳＴ－４３９陽性患者群及びＮＣＣ－ＳＴ－４３９陰性患者群のＫａｐｌａｎ―Ｍｅｉｅｒ生存曲線を図１２に示す。左上のパネルはＨＲ＋／ＨＥＲ２－症例、左下のパネルはＨＲ＋／ＨＥＲ２＋症例、右上のパネルはＨＲ－／ＨＥＲ２＋症例、右下のパネルはＨＲ－／ＨＥＲ２－症例を示したものである。統計解析の結果、ＨＲ－／ＨＥＲ２＋群及びＨＲ－／ＨＥＲ２－群両症例において、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９陽性群は陰性群に比して有意に短かった（ｐ＜０．００１及びｐ＜０．００１）。ＨＲ＋／ＨＥＲ２－症例において、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９陽性乳がん症例は陰性群に比して有意に短い傾向にあった（ｐ＝０．０８７）。
【0080】
［実施例４］
１．患者の選択
原発性乳がんｃＳｔａｇｅ０―IIIの術前診断にて２０１０年～２０１２年に国立がん研究センター中央病院乳腺外科で根治切除目的に外科切除された、両側性乳がん症例を除く、ホルモンレセプター陰性と診断された連続症例の１４６症例を患者として選択した。臨床病理データは診療録から情報を収集した。
１．患者の選択
原発性乳がんｃＳｔａｇｅ０―IIIの術前診断にて２０１０年～２０１２年に国立がん研究センター中央病院乳腺外科で根治切除目的に外科切除された、両側性乳がん症例を除く、ホルモンレセプター陰性と診断された連続症例の１４６症例を患者として選択した。臨床病理データは診療録から情報を収集した。
【0081】
予後解析は、術前化学療法を実施していない浸潤癌症例（ｎ＝１２４）および臨床的に浸潤癌と判断され術前化学療法実施後に外科切除された症例（ｎ＝２２）の合計１４６症例について実施した。
【0082】
２．病理学的解析
外科切除検体は、病変部を全割して病理学的に解析し、腫瘍は乳癌取り扱い規約第１７版（金原出版、東京）およびＷＨＯ分類（ＷＨＯ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｕｍｏｕｒｓ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｔｕｍｏｕｒｓ，ＷＨＯ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｕｒｓ ｅｄｉｔｏｒｉａｌ ｂｏａｒｄ（ｅｄ．）， ＩＡＲＣ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＵＩＣＣ ＴＮＭ分類８版（Ｔｈｅ ＴＮＭ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｔｕｍｏｕｒｓ，８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｒｉｅｒｌｅｙ ＪＤ，Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ ＭＫ，Ｗｉｔｔｅｋｉｎｄ ｃ（ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）に従って分類した。以下の解析には代表腫瘍組織である最大割面部分を使用した。
外科切除検体は、病変部を全割して病理学的に解析し、腫瘍は乳癌取り扱い規約第１７版（金原出版、東京）およびＷＨＯ分類（ＷＨＯ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｕｍｏｕｒｓ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｔｕｍｏｕｒｓ，ＷＨＯ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｕｒｓ ｅｄｉｔｏｒｉａｌ ｂｏａｒｄ（ｅｄ．）， ＩＡＲＣ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＵＩＣＣ ＴＮＭ分類８版（Ｔｈｅ ＴＮＭ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｔｕｍｏｕｒｓ，８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｒｉｅｒｌｅｙ ＪＤ，Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ ＭＫ，Ｗｉｔｔｅｋｉｎｄ ｃ（ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）に従って分類した。以下の解析には代表腫瘍組織である最大割面部分を使用した。
【0083】
３．免疫組織化学
ＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗体（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９１；５１：２１９９－２０４）を用いて免疫組織化学を実施した。４μｍ厚ホルマリン固定パラフィン包埋組織薄切切片を用意し、Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ ｌｉｎｋ ４８（ＤＡＫＯ， Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Sａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いた。免疫組織化学の結果について、陽性細胞の割合と陽性強度により評価した。内部陽性コントロール非腫瘍乳管上皮細胞の陽性強度と同等以上の陽性強度を示すがん細胞が全がん細胞の１０％以上存在するものを陽性と判断した。
ＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗体（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９１；５１：２１９９－２０４）を用いて免疫組織化学を実施した。４μｍ厚ホルマリン固定パラフィン包埋組織薄切切片を用意し、Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ ｌｉｎｋ ４８（ＤＡＫＯ， Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Sａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いた。免疫組織化学の結果について、陽性細胞の割合と陽性強度により評価した。内部陽性コントロール非腫瘍乳管上皮細胞の陽性強度と同等以上の陽性強度を示すがん細胞が全がん細胞の１０％以上存在するものを陽性と判断した。
【0084】
４．免疫学的測定
ＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗原キット（ラナザイム ＳＴ－４３９プレート，日本化薬株式会社）を用いて血清中のＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗原の測定を実施した。ＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗原濃度が４．５ Ｕ／ｍＬ以上（男性および５０歳以上の女性）、７．０ Ｕ／ｍＬ以上（５０歳未満の女性）を陽性と判断した。なお、抗原濃度の単位 Ｕ／ｍＬは、ＳＴ－４３９をはじめに同定した際の濃度を基準としたものである（大倉久直ほか：各種癌・良性疾患患者血清によるＮＣＣ－ＳＴ－４３９ＥＩＡキットの臨床的検討（１）．癌と化学療法 １４：１９０１－１９０６，１９８７）。
ＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗原キット（ラナザイム ＳＴ－４３９プレート，日本化薬株式会社）を用いて血清中のＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗原の測定を実施した。ＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗原濃度が４．５ Ｕ／ｍＬ以上（男性および５０歳以上の女性）、７．０ Ｕ／ｍＬ以上（５０歳未満の女性）を陽性と判断した。なお、抗原濃度の単位 Ｕ／ｍＬは、ＳＴ－４３９をはじめに同定した際の濃度を基準としたものである（大倉久直ほか：各種癌・良性疾患患者血清によるＮＣＣ－ＳＴ－４３９ＥＩＡキットの臨床的検討（１）．癌と化学療法 １４：１９０１－１９０６，１９８７）。
【0085】
５．ホルモン受容体解析
乳癌診療ガイドライン（科学的根拠に基づく 乳癌診療ガイドライン４．検診・診断 ２００８年版、日本乳癌学会編、金原出版、東京）に従って、ホルモン受容体（ＥＲ、ＰｇＲ）の解析を行った。免疫組織化学的染色によりＥＲ、ＰｇＲの染色を行った。一次抗体として抗ＥＲ抗体（ｃｌｏｎｅ １Ｄ５；ＤＡＫＯ）、抗ＰｇＲ抗体（ｃｌｏｎｅ ＰｇＲ６３６；ＤＡＫＯ）を用い、メーカー指定のプロトコールに則って染色を行った。腫瘍組織における陽性細胞の割合を判定し、１０％以上をホルモン受容体陽性と判定した。
乳癌診療ガイドライン（科学的根拠に基づく 乳癌診療ガイドライン４．検診・診断 ２００８年版、日本乳癌学会編、金原出版、東京）に従って、ホルモン受容体（ＥＲ、ＰｇＲ）の解析を行った。免疫組織化学的染色によりＥＲ、ＰｇＲの染色を行った。一次抗体として抗ＥＲ抗体（ｃｌｏｎｅ １Ｄ５；ＤＡＫＯ）、抗ＰｇＲ抗体（ｃｌｏｎｅ ＰｇＲ６３６；ＤＡＫＯ）を用い、メーカー指定のプロトコールに則って染色を行った。腫瘍組織における陽性細胞の割合を判定し、１０％以上をホルモン受容体陽性と判定した。
【0086】
６．ＨＥＲ２解析
ハーセプチン適正使用選択のためのＨＥＲ２検査ガイド第３版（ＡＳＣＯ／ＣＡＰ ＨＥＲ２検査ガイドラインに準拠）（トラスツズマブ病理部会作成）にしたがって解析した。はじめに免疫組織化学的染色により評価を行い、境界域の症例についてはＦＩＳＨ法による評価を加えた。免疫組織化学法は、抗ＨＥＲ２抗体（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ， ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ ＩＩ， ＤＡＫＯ）を一次抗体として用い、メーカー指定のプロトコールに則って染色を行った。判定は浸潤巣を対象として行い、スコア０、１＋は陰性、スコア３＋は陽性と判定した。スコア２＋の境界域症例についてはＦＩＳＨ法を行い、増幅がみられた症例（ＨＥＲ２／ＣＥＰ１７シグナル比２．０以上）を陽性と判定した。ＦＩＳＨプローブとしてパスビジョンＨＥＲ２ ＤＮＡプローブキットを用いた。
ハーセプチン適正使用選択のためのＨＥＲ２検査ガイド第３版（ＡＳＣＯ／ＣＡＰ ＨＥＲ２検査ガイドラインに準拠）（トラスツズマブ病理部会作成）にしたがって解析した。はじめに免疫組織化学的染色により評価を行い、境界域の症例についてはＦＩＳＨ法による評価を加えた。免疫組織化学法は、抗ＨＥＲ２抗体（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ， ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ ＩＩ， ＤＡＫＯ）を一次抗体として用い、メーカー指定のプロトコールに則って染色を行った。判定は浸潤巣を対象として行い、スコア０、１＋は陰性、スコア３＋は陽性と判定した。スコア２＋の境界域症例についてはＦＩＳＨ法を行い、増幅がみられた症例（ＨＥＲ２／ＣＥＰ１７シグナル比２．０以上）を陽性と判定した。ＦＩＳＨプローブとしてパスビジョンＨＥＲ２ ＤＮＡプローブキットを用いた。
【0087】
７．統計学的解析
各因子の解析にはｔ検定、カイ２乗検定を、生存解析はＫａｐｌａｎ―Ｍｅｉｅｒ生存解析、Ｃｏｘ比例ハザードモデルを用いて検討し、ｌｏｇ－ｒａｎｋ試験を用いて解析した。解析ソフトはＳＰＳＳ ｖｅｒ．２７（ＩＢＭ， Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用した。解析においてｐ値＜０．０５の場合に有意差有り，ｐ値＜０．１０の場合に有意傾向有りと判定した。
各因子の解析にはｔ検定、カイ２乗検定を、生存解析はＫａｐｌａｎ―Ｍｅｉｅｒ生存解析、Ｃｏｘ比例ハザードモデルを用いて検討し、ｌｏｇ－ｒａｎｋ試験を用いて解析した。解析ソフトはＳＰＳＳ ｖｅｒ．２７（ＩＢＭ， Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用した。解析においてｐ値＜０．０５の場合に有意差有り，ｐ値＜０．１０の場合に有意傾向有りと判定した。
【0088】
８．倫理事項
本研究は国立がん研究センター研究倫理審査委員会による承認を得たものである（研究課題番号２０１８－１１９）。研究に参加したすべての被験者からインフォームド・コンセントを得た。また全ての研究はヘルシンキ宣言の原則に沿って行われた。
本研究は国立がん研究センター研究倫理審査委員会による承認を得たものである（研究課題番号２０１８－１１９）。研究に参加したすべての被験者からインフォームド・コンセントを得た。また全ての研究はヘルシンキ宣言の原則に沿って行われた。
【0089】
９．結果
９－１ 臨床病理学的因子
対象患者１４６症例の臨床病理学的情報を表５に示した。患者の年齢は、２９歳から８９歳であり、中央値は５８．５歳であった。組織型は、浸潤性乳管癌通常型が１１４例（７８．１％）、浸潤性乳管癌特殊型が３２例（２１．９％）であった。核グレードは、１及び２が２８例（１９．２％）、３が１１８例（８０．８％）であった。脈管侵襲は、なしが８６例（５８．９％）、ありが６０例（４１．１％）であった。バイオマーカー亜型分類は、ＨＲ－／ＨＥＲ２＋：４７例（３２．２％）、ＨＲ－／ＨＥＲ２－：９９例（６７．８％）であった。術前のステージは、０：６例（４．１％）、１：４１例（２８．１％）、２：８３例（５６．８％）、３：１６例（１１．０％）であった。リンパ節転移は、なしが８７例（５９．６％），ありが５９例（４０．４％）であった。化学療法は、なしが３７例（２５．３％）、術前化学療法ありが２２例（１５．１％）、術後補助化学療法ありが９８例（５９．８％）であった。放射線治療は、なしが５４例（３６．７％）、ありが９０例（６３．３％）であった。
９－１ 臨床病理学的因子
対象患者１４６症例の臨床病理学的情報を表５に示した。患者の年齢は、２９歳から８９歳であり、中央値は５８．５歳であった。組織型は、浸潤性乳管癌通常型が１１４例（７８．１％）、浸潤性乳管癌特殊型が３２例（２１．９％）であった。核グレードは、１及び２が２８例（１９．２％）、３が１１８例（８０．８％）であった。脈管侵襲は、なしが８６例（５８．９％）、ありが６０例（４１．１％）であった。バイオマーカー亜型分類は、ＨＲ－／ＨＥＲ２＋：４７例（３２．２％）、ＨＲ－／ＨＥＲ２－：９９例（６７．８％）であった。術前のステージは、０：６例（４．１％）、１：４１例（２８．１％）、２：８３例（５６．８％）、３：１６例（１１．０％）であった。リンパ節転移は、なしが８７例（５９．６％），ありが５９例（４０．４％）であった。化学療法は、なしが３７例（２５．３％）、術前化学療法ありが２２例（１５．１％）、術後補助化学療法ありが９８例（５９．８％）であった。放射線治療は、なしが５４例（３６．７％）、ありが９０例（６３．３％）であった。
【0090】
【表5】
【0091】
９－２．免疫組織化学
乳がん細胞（がん組織内）におけるＮＣＣ－ＳＴ－４３９陽性患者：５８例（４０％）、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９陰性患者：８８例（６０％）であった。
乳がん細胞（がん組織内）におけるＮＣＣ－ＳＴ－４３９陽性患者：５８例（４０％）、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９陰性患者：８８例（６０％）であった。
【0092】
９－３．免疫学的測定
血清におけるＮＣＣ－ＳＴ－４３９陽性患者：１６例（１１％）、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９陰性患者：１３０例（８９％）であった。
血清におけるＮＣＣ－ＳＴ－４３９陽性患者：１６例（１１％）、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９陰性患者：１３０例（８９％）であった。
【0093】
９－４．乳がん組織中及び血清中のＮＣＣ－ＳＴ－４３９発現とＲＦＳとの相関
乳がん組織中及び血清中のＮＣＣ－ＳＴ－４３９発現の有無と、患者のＲＦＳとの関連性を検討した。
乳がん組織中及び血清中のＮＣＣ－ＳＴ－４３９発現の有無と、患者のＲＦＳとの関連性を検討した。
【0094】
乳がん組織中及び血清中のＮＣＣ－ＳＴ－４３９陽性患者群及びＮＣＣ－ＳＴ－４３９陰性患者群のＫａｐｌａｎ―Ｍｅｉｅｒ生存曲線を図１３に示す。左のパネルは乳がん組織中ＮＣＣ－ＳＴ－４３９の陽性陰性で解析した結果、右のパネルは血清中ＮＣＣ－ＳＴ－４３９の陽性陰性で解析した結果を示したものである。統計解析の結果、乳がん組織中のＮＣＣ－ＳＴ－４３９では、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９陽性症例は早期から再発し、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９陰性群に比して有意に短かった（ｐ＜０．００１）。また、血清中のＮＣＣ－ＳＴ－４３９においてもＮＣＣ－ＳＴ－４３９陽性症例は早期から再発し、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９陰性群に比して有意に短かった（ｐ＝０．０１３）。
【産業上の利用可能性】
【0095】
本発明の検査方法によれば、乳がんの予後不良群（乳がんの再発）を予見（予測）することができるので、化学療法による治療が良いのか、免疫チェックポイント阻害薬などのバイオ医薬品などによる新しい治療法が良いのかなど、治療法の選択をより早期に判断できる。そして、本発明の検査方法を用いることにより患者である治療対象者の負担軽減につながると考えられる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
