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特開2023-177319リポキシトーシス誘導剤及びリポキシトーシスの誘導方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023177319
(43)【公開日】2023-12-13
(54)【発明の名称】リポキシトーシス誘導剤及びリポキシトーシスの誘導方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20231206BHJP
C12N 1/00 20060101ALI20231206BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20231206BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071
C12N1/00 F ZNA
C12N15/09 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】2
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023089017
(22)【出願日】2023-05-30
(31)【優先権主張番号】P 2022088748
(32)【優先日】2022-05-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和３年度 国立研究開発法人日本医療研究開発機構「革新的先端研究開発支援事業ユニットタイプ『画期的医薬品等の創出をめざす脂質の生理活性と機能の解明』研究開発領域」、「酸化脂質をターゲットとした疾患メカニズム解明および創薬基盤研究」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】598041566
【氏名又は名称】学校法人北里研究所
(74)【代理人】
【識別番号】100106909
【弁理士】
【氏名又は名称】棚井 澄雄
(74)【代理人】
【識別番号】100188558
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 雅人
(72)【発明者】
【氏名】今井 浩孝
(72)【発明者】
【氏名】砂塚 敏明
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA91X
4B065AB01
4B065BB04
4B065BB40
4B065CA60
(57)【要約】
【課題】リポキシトーシスを特異的に誘導することができる化合物を提供する。
【解決手段】Ｖｉｒａｎｔｍｙｃｉｎ（ＣＡＳ番号：７６４１７－０４－４）、８－アザグアニン（ＣＡＳ番号：１３４－５８－７）、６－チオグアニン（ＣＡＳ番号：１５４－４２－７）、６－メルカプトプリン（ＣＡＳ番号：５０－４４－２）、チミジン（ＣＡＳ番号：５０－８９－５）、ヒドロキシウレア（ＣＡＳ番号：１２７－０７－１）、Ｓａｎｇｉｖａｍｙｃｉｎ（ＣＡＳ番号：１８４１７－８９－５）、Ｃｏｎｃａｎａｍｙｃｉｎ Ａ（ＣＡＳ番号：８０８９０－４７－７）、Ｖｉｒｕｓｔｏｍｙｃｉｎ Ａ（ＣＡＳ番号：８４７７７－８５－５）又はＬｅｐｔｏｓｉｎ Ｃ（ＣＡＳ番号：１５９５１８－７６－０）を有効成分とする、リポキシトーシス誘導剤。
【選択図】なし
【解決手段】Ｖｉｒａｎｔｍｙｃｉｎ（ＣＡＳ番号：７６４１７－０４－４）、８－アザグアニン（ＣＡＳ番号：１３４－５８－７）、６－チオグアニン（ＣＡＳ番号：１５４－４２－７）、６－メルカプトプリン（ＣＡＳ番号：５０－４４－２）、チミジン（ＣＡＳ番号：５０－８９－５）、ヒドロキシウレア（ＣＡＳ番号：１２７－０７－１）、Ｓａｎｇｉｖａｍｙｃｉｎ（ＣＡＳ番号：１８４１７－８９－５）、Ｃｏｎｃａｎａｍｙｃｉｎ Ａ（ＣＡＳ番号：８０８９０－４７－７）、Ｖｉｒｕｓｔｏｍｙｃｉｎ Ａ（ＣＡＳ番号：８４７７７－８５－５）又はＬｅｐｔｏｓｉｎ Ｃ（ＣＡＳ番号：１５９５１８－７６－０）を有効成分とする、リポキシトーシス誘導剤。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｖｉｒａｎｔｍｙｃｉｎ（ＣＡＳ番号：７６４１７－０４－４）、８－アザグアニン（ＣＡＳ番号：１３４－５８－７）、６－チオグアニン（ＣＡＳ番号：１５４－４２－７）、６－メルカプトプリン（ＣＡＳ番号：５０－４４－２）、チミジン（ＣＡＳ番号：５０－８９－５）、ヒドロキシウレア（ＣＡＳ番号：１２７－０７－１）、Ｓａｎｇｉｖａｍｙｃｉｎ（ＣＡＳ番号：１８４１７－８９－５）、Ｃｏｎｃａｎａｍｙｃｉｎ Ａ（ＣＡＳ番号：８０８９０－４７－７）、Ｖｉｒｕｓｔｏｍｙｃｉｎ Ａ（ＣＡＳ番号：８４７７７－８５－５）又はＬｅｐｔｏｓｉｎ Ｃ（ＣＡＳ番号：１５９５１８－７６－０）を有効成分とする、リポキシトーシス誘導剤。
【請求項2】
動物細胞の培地に請求項１に記載のリポキシトーシス誘導剤を添加する工程を含む、前記動物細胞にリポキシトーシスを誘導する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、リポキシトーシス誘導剤及びリポキシトーシスの誘導方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ＧＰｘ４（ＰＨＧＰｘ）は酸化リン脂質を還元する酵素である。発明者らは、以前に、ＧＰｘ４が関与する新たな細胞死である、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性新規細胞死を見出し、リポキシトーシスと命名した。そして、リポキシトーシスの制御遺伝子、抑制剤、検出方法について明らかにしてきた（例えば、特許文献１～７を参照）。
【0003】
リポキシトーシスは、マウス胎児線維芽細胞（Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ＭＥＦ）におけるＧＰｘ４の欠損誘導、又は、組織特異的ＧＰｘ４欠損マウスにおいて誘導することができる。
【0004】
リポキシトーシスのメカニズムの解析は、ＧＰｘ４欠損誘導型ＭＥＦ細胞を用いて明らかにしてきた。この細胞株では、培地にタモキシフェンを添加するとタモキシフェン誘導型ＣＲＥリコンビナーゼが核に移行して、ＬｏｘＰではさまれたＧＰｘ４ゲノム遺伝子を破壊して、細胞内のＧＰｘ４が消失する。その結果、タモキシフェン添加後７２時間でリポキシトーシスが誘導される。
【0005】
近年、ＧＰｘ４が制御する新規細胞死としてフェロトーシス（二価鉄依存的な脂質酸化を介したカスパーゼ非依存性の細胞死）が報告され、注目されている。フェロトーシスは、細胞の培地へのＲＳＬ３（ＣＡＳ番号：１２１９８１０－１６－８）、エラスチン（ＣＡＳ番号：５７１２０３－７８－６）等の添加により、約１６時間で誘導される。また、フェロトーシスは、抗酸化剤であるＦｅｒ－１（フェロスタチンー１、ＣＡＳ番号：３４７１７４－０５－４）、鉄のキレーターであるＤＦＯ（デフェロキサミン、ＣＡＳ番号：１３８－１４－７）等の添加により抑制することができる。ＲＳＬ３やエラスチンは、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ４）活性を低下させるため、従来、フェロトーシスとリポキシトーシスは同じ細胞死であると考えられてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特許第６４３６６５４号公報
【特許文献2】特許第６６４６３０２号公報
【特許文献3】特許第６６４６３０３号公報
【特許文献4】特許第６６４６３０４号公報
【特許文献5】特許第６６３７０９２号公報
【特許文献6】特許第６５７３４０８号公報
【特許文献7】特許第７０６２２９２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
しかしながら、発明者らは、フェロトーシスとリポキシトーシスは異なる細胞死であると考え、鋭意研究を行った。本発明は、フェロトーシスとリポキシトーシスが異なる細胞死であることを明らかにし、リポキシトーシスを特異的に誘導することができる化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明は以下の態様を含む。
［１］Ｖｉｒａｎｔｍｙｃｉｎ（ＣＡＳ番号：７６４１７－０４－４）、８－アザグアニン（ＣＡＳ番号：１３４－５８－７）、６－チオグアニン（ＣＡＳ番号：１５４－４２－７）、６－メルカプトプリン（ＣＡＳ番号：５０－４４－２）、チミジン（ＣＡＳ番号：５０－８９－５）、ヒドロキシウレア（ＣＡＳ番号：１２７－０７－１）、Ｓａｎｇｉｖａｍｙｃｉｎ（ＣＡＳ番号：１８４１７－８９－５）、Ｃｏｎｃａｎａｍｙｃｉｎ Ａ（ＣＡＳ番号：８０８９０－４７－７）、Ｖｉｒｕｓｔｏｍｙｃｉｎ Ａ（ＣＡＳ番号：８４７７７－８５－５）又はＬｅｐｔｏｓｉｎ Ｃ（ＣＡＳ番号：１５９５１８－７６－０）を有効成分とする、リポキシトーシス誘導剤。
［２］動物細胞の培地に［１］に記載のリポキシトーシス誘導剤を添加する工程を含む、前記動物細胞にリポキシトーシスを誘導する方法。
［１］Ｖｉｒａｎｔｍｙｃｉｎ（ＣＡＳ番号：７６４１７－０４－４）、８－アザグアニン（ＣＡＳ番号：１３４－５８－７）、６－チオグアニン（ＣＡＳ番号：１５４－４２－７）、６－メルカプトプリン（ＣＡＳ番号：５０－４４－２）、チミジン（ＣＡＳ番号：５０－８９－５）、ヒドロキシウレア（ＣＡＳ番号：１２７－０７－１）、Ｓａｎｇｉｖａｍｙｃｉｎ（ＣＡＳ番号：１８４１７－８９－５）、Ｃｏｎｃａｎａｍｙｃｉｎ Ａ（ＣＡＳ番号：８０８９０－４７－７）、Ｖｉｒｕｓｔｏｍｙｃｉｎ Ａ（ＣＡＳ番号：８４７７７－８５－５）又はＬｅｐｔｏｓｉｎ Ｃ（ＣＡＳ番号：１５９５１８－７６－０）を有効成分とする、リポキシトーシス誘導剤。
［２］動物細胞の培地に［１］に記載のリポキシトーシス誘導剤を添加する工程を含む、前記動物細胞にリポキシトーシスを誘導する方法。
【発明の効果】
【0009】
本発明により、リポキシトーシスを特異的に誘導することができる化合物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【発明を実施するための形態】
【0011】
［リポキシトーシス誘導剤］
一実施形態において、本発明は、Ｖｉｒａｎｔｍｙｃｉｎ、８－アザグアニン、６－チオグアニン、６－メルカプトプリン、チミジン、ヒドロキシウレア、Ｓａｎｇｉｖａｍｙｃｉｎ、Ｃｏｎｃａｎａｍｙｃｉｎ Ａ、Ｖｉｒｕｓｔｏｍｙｃｉｎ Ａ又はＬｅｐｔｏｓｉｎ Ｃを有効成分とする、リポキシトーシス誘導剤を提供する。
一実施形態において、本発明は、Ｖｉｒａｎｔｍｙｃｉｎ、８－アザグアニン、６－チオグアニン、６－メルカプトプリン、チミジン、ヒドロキシウレア、Ｓａｎｇｉｖａｍｙｃｉｎ、Ｃｏｎｃａｎａｍｙｃｉｎ Ａ、Ｖｉｒｕｓｔｏｍｙｃｉｎ Ａ又はＬｅｐｔｏｓｉｎ Ｃを有効成分とする、リポキシトーシス誘導剤を提供する。
【0012】
実施例において後述するように、発明者らは、これらの化合物により誘導される細胞死が、フェロトーシスやアポトーシスとは異なることを明らかにした。更に、発明者らは、これらの化合物により誘導される細胞死が、リポキシトーシス実行因子のノックアウト若しくはノックダウン、又は、リポキシトーシス抑制因子の高発現で抑制できることを明らかにした。
【0013】
リポキシトーシスを誘導できる化合物は今回初めて見出されたものである。これらの化合物は、例えば、細胞死研究用試薬として非常に有用である。
【0014】
［リポキシトーシスを誘導する方法］
一実施形態において、本発明は、動物細胞の培地に、上述したリポキシトーシス誘導剤を添加する工程を含む、前記動物細胞にリポキシトーシスを誘導する方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、動物細胞の培地に、上述したリポキシトーシス誘導剤を添加する工程を含む、前記動物細胞にリポキシトーシスを誘導する方法を提供する。
【0015】
動物細胞としては、哺乳動物由来の細胞が挙げられる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類；ウサギ等のウサギ目；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目；イヌ、ネコ等のネコ目；ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等の霊長類等が挙げられる。
【0016】
リポキシトーシスを誘導するために培地に添加する各化合物の濃度としては、例えば、次の範囲を例示することができる。Ｖｉｒａｎｔｍｙｃｉｎは、０．０５～０．４μｇ／ｍＬ程度が好ましく、好適には約０．１μｇ／ｍＬである。８－アザグアニンは、０．１～０．４μｇ／ｍＬ程度が好ましく、好適には約０．２μｇ／ｍＬである。６－チオグアニンは、０．２～０．８μｇ／ｍＬ程度が好ましく、好適には約０．２μｇ／ｍＬである。６－メルカプトプリンは、０．８～３．２μｇ／ｍＬ程度が好ましく、好適には約１．６μｇ／ｍＬである。チミジンは、５～２０μｇ／ｍＬ程度が好ましく、好適には約１０μｇ／ｍＬである。ヒドロキシウレアは、０．０６２５～０．２５μｇ／ｍＬ程度が好ましく、好適には約０．１２５μｇ／ｍＬである。Ｓａｎｇｉｖａｍｙｃｉｎは、０．０５～０．４μｇ／ｍＬ程度が好ましく、好適には約０．１μｇ／ｍＬである。Ｃｏｎｃａｎａｍｙｃｉｎ Ａは、０．００５～０．０５μｇ／ｍＬ程度が好ましく、好適には約０．０１μｇ／ｍＬである。Ｖｉｒｕｓｔｏｍｙｃｉｎ Ａは、０．００２５～０．０２μｇ／ｍＬ程度が好ましく、好適には約０．００５μｇ／ｍＬである。Ｌｅｐｔｏｓｉｎ Ｃは、０．０５～０．２μｇ／ｍＬ程度が好ましく、好適には約０．１μｇ／ｍＬである。
【0017】
動物細胞の培地に上述したリポキシトーシス誘導剤を添加した後、４０～６０時間、典型的には約４８時間でリポキシトーシスによる細胞死が誘導される。細胞死の検出は適宜の方法で行うことができ、例えば、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）アッセイ、ＭＴＴ等のテトラゾリウム（Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）化合物による細胞生存アッセイ、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）による細胞死核染色法、顕微鏡での付着細胞数の観察等が挙げられる。
【実施例0018】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0019】
［実験例１］
（ＡＢＨＤ２はリポキシトーシスとフェロトーシスを見分ける鍵分子である）
ＡＢＨＤ２は発明者らが同定したリポキシトーシスの実行因子の一つである（例えば、特許文献４を参照）。ＡＢＨＤ２はその構造から、脂質代謝酵素であると考えられているが、リポキシトーシスにおけるＡＢＨＤ２の基質は不明である。
（ＡＢＨＤ２はリポキシトーシスとフェロトーシスを見分ける鍵分子である）
ＡＢＨＤ２は発明者らが同定したリポキシトーシスの実行因子の一つである（例えば、特許文献４を参照）。ＡＢＨＤ２はその構造から、脂質代謝酵素であると考えられているが、リポキシトーシスにおけるＡＢＨＤ２の基質は不明である。
【0020】
《タモキシフェン誘導型ＧＰｘ４欠損ＭＥＦ細胞株の樹立》
リポキシトーシスのメカニズムを明らかにするために、タモキシフェン誘導型ＧＰｘ４欠損ＭＥＦ細胞株を樹立した。この細胞は、タモキシフェンを培地に加えると２４時間以内にＣｒｅ－ｌｏｘＰシステムによりＧＰｘ４ゲノム遺伝子が欠失する。
リポキシトーシスのメカニズムを明らかにするために、タモキシフェン誘導型ＧＰｘ４欠損ＭＥＦ細胞株を樹立した。この細胞は、タモキシフェンを培地に加えると２４時間以内にＣｒｅ－ｌｏｘＰシステムによりＧＰｘ４ゲノム遺伝子が欠失する。
【0021】
具体的には、ＧＰｘ４遺伝子ノックアウトマウス（ＰＨＧＰｘ－／－）に、ｌｏｘＰ配列に挟まれたＧＰｘ４遺伝子（ｌｏｘＰ－ＧＰｘ４）を遺伝子導入（Ｔｇ）した、Ｔｇ（ｌｏｘＰ－ＧＰｘ４）：ＧＰｘ４－／－マウスと、ＧＰｘ４＋／－マウスを交配させた。続いて、遺伝子型がＴｇ（ｌｏｘＰ－ＧＰｘ４）：ＧＰｘ４－／－である１３．５日胚から、マウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）を調製した。続いて、得られた細胞にＳＶ４０ウイルスのＴ抗原遺伝子を遺伝子導入することにより不死化した。続いて、得られた細胞にタモキシフェン誘導型ＣｒｅＥＲＴ２遺伝子を導入した。これにより、タモキシフェン誘導型ＧＰｘ４欠損ＭＥＦ細胞株が得られた。
【0022】
なお、ＣｒｅＥＲＴ２とは、エストロゲン受容体と融合タンパク質にしたＣｒｅ（ＣｒｅＥＲ）を、エストロゲンに反応せず、タモキシフェンに反応するように変異させたものである。タモキシフェン誘導型ＧＰｘ４欠損ＭＥＦ細胞株の培地にタモキシフェンを添加すると、ＣｒｅＥＲ２のエストロゲン受容体部分にタモキシフェンが結合し、エストロゲン受容体の核移行シグナルが露出する。その結果、ＣｒｅＥＲ２が核内へ移行し、ｌｏｘＰで挟まれたＧＰｘ４ゲノム遺伝子が破壊される。添加するタモキシフェンの濃度は終濃度１μＭ程度でよい。
【0023】
《ＡＢＨＤ２をノックダウンしたタモキシフェン誘導型ＧＰｘ４欠損ＭＥＦ細胞を用いた検討》
レトロウイルス感染系を用いてタモキシフェン誘導型ＧＰｘ４欠損ＭＥＦ細胞にＡＢＨＤ２特異的ｓｈＲＮＡをコードする遺伝子を導入し、ＡＢＨＤ２をノックダウンした細胞（以下、「ＡＢＨＤ２ ＫＤ」細胞という場合がある。）を作製した。ＡＢＨＤ２特異的ｓｈＲＮＡをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１に示す。
レトロウイルス感染系を用いてタモキシフェン誘導型ＧＰｘ４欠損ＭＥＦ細胞にＡＢＨＤ２特異的ｓｈＲＮＡをコードする遺伝子を導入し、ＡＢＨＤ２をノックダウンした細胞（以下、「ＡＢＨＤ２ ＫＤ」細胞という場合がある。）を作製した。ＡＢＨＤ２特異的ｓｈＲＮＡをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１に示す。
【0024】
続いて、ＡＢＨＤ２ ＫＤ細胞の培地にタモキシフェンを添加してリポキシトーシスを誘導し、経時的に細胞生存率を測定した。細胞生存率は市販のキットを使用してＬＤＨアッセイにより測定した。また、比較のために、ＡＢＨＤ２ ＫＤ細胞に、ＡＢＨＤ２を発現できるｃＤＮＡを再導入した細胞（以下、「ＡＢＨＤ２ ＫＤ＋ＡＢＨＤ２ ｃＤＮＡ」細胞という場合がある。）、タモキシフェン誘導型ＧＰｘ４欠損ＭＥＦ細胞（Ｍｏｃｋ）も同様に処理した。
【0025】
図１は、タモキシフェン添加後の細胞生存率を測定した結果を示すグラフである。図１中、「Ｔａｍ」はタモキシフェンを示す。その結果、ＡＢＨＤ２をノックダウンすると、リポキシトーシスが抑制されることが明らかとなった。また、ＡＢＨＤ２ノックダウン細胞にＡＢＨＤ２を発現できるｃＤＮＡを再導入した細胞では、タモキシフェン添加によりリポキシトーシスが誘導された。
【0026】
続いて、ＡＢＨＤ２ ＫＤ細胞にＲＳＬ３を添加してフェロトーシスを誘導し、２４時間後に細胞生存率を測定した。ＡＢＨＤ２ ＫＤ＋ＡＢＨＤ２ ｃＤＮＡ細胞、タモキシフェン誘導型ＧＰｘ４欠損ＭＥＦ細胞（Ｍｏｃｋ）も同様に処理した。
【0027】
図２は、ＲＳＬ３の添加から２４時間後の細胞生存率を測定した結果を示すグラフである。その結果、ＡＢＨＤ２をノックダウンしても、ＲＳＬ３の添加により誘導したフェロトーシスを抑制できないことが明らかとなった。
【0028】
続いて、タモキシフェン誘導型ＧＰｘ４欠損ＭＥＦ細胞に、ＡＢＨＤ２のリパーゼ活性の阻害剤であるＫＴ－１９５（ＣＡＳ番号：１４０２６１２－５８－１）又はピロフェノン（ＣＡＳ番号：３４１９７３－０６－６）を添加し、更にタモキシフェンの添加によりリポキシトーシスを誘導した。続いて、７２時間後に細胞生存率を測定した。
【0029】
図３は、タモキシフェンの添加から２４時間後の細胞生存率を測定した結果を示すグラフである。図３中、「Ｔａｍ」はタモキシフェンを示す。その結果、ＫＴ－１９５又はピロフェノンの添加により、リポキシトーシスが抑制されることが明らかとなった。
【0030】
続いて、タモキシフェン誘導型ＧＰｘ４欠損ＭＥＦ細胞に、ＡＢＨＤ２のリパーゼ活性の阻害剤であるＫＴ－１９５又はピロフェノンを添加し、更にＲＳＬ３の添加によりフェロトーシスを誘導した。続いて、２４時間後に細胞生存率を測定した。
【0031】
図４は、ＲＳＬ３の添加から２４時間後の細胞生存率を測定した結果を示すグラフである。その結果、ＫＴ－１９５又はピロフェノンを添加しても、ＲＳＬ３の添加により誘導したフェロトーシスを抑制できないことが明らかとなった。
【0032】
以上の結果から、ＡＢＨＤ２はリポキシトーシスとフェロトーシスを見分ける鍵分子であることが明らかとなった。図５は、リポキシトーシスとフェロトーシスの違いをまとめた図である。
【0033】
［実験例２］
（ライブラリのスクリーニング）
ライブラリのスクリーニングにより、リポキシトーシス誘導剤を探索した。具体的には、北里大学大村智記念研究所の大村天然化合物ライブラリを用いて、野生型細胞（ＷＴ）に添加すると細胞死が起き、ＡＢＨＤ２ノックダウン細胞（ＡＢＨＤ２ ＫＤ）に添加すると細胞死が抑制される化合物をスクリーニングした。このような化合物はリポキシトーシス誘導剤の候補と考えられる。野生型細胞（ＷＴ）としては、タモキシフェン誘導型ＧＰｘ４欠損ＭＥＦ細胞を使用した。
（ライブラリのスクリーニング）
ライブラリのスクリーニングにより、リポキシトーシス誘導剤を探索した。具体的には、北里大学大村智記念研究所の大村天然化合物ライブラリを用いて、野生型細胞（ＷＴ）に添加すると細胞死が起き、ＡＢＨＤ２ノックダウン細胞（ＡＢＨＤ２ ＫＤ）に添加すると細胞死が抑制される化合物をスクリーニングした。このような化合物はリポキシトーシス誘導剤の候補と考えられる。野生型細胞（ＷＴ）としては、タモキシフェン誘導型ＧＰｘ４欠損ＭＥＦ細胞を使用した。
【0034】
その結果、Ｖｉｒａｎｔｍｙｃｉｎ（ＣＡＳ番号：７６４１７－０４－４）、８－アザグアニン（ＣＡＳ番号：１３４－５８－７）、Ｓａｎｇｉｖａｍｙｃｉｎ（ＣＡＳ番号：１８４１７－８９－５）、Ｃｏｎｃａｎａｍｙｃｉｎ Ａ（ＣＡＳ番号：８０８９０－４７－７）、Ｖｉｒｕｓｔｏｍｙｃｉｎ Ａ（ＣＡＳ番号：８４７７７－８５－５）、Ｌｅｐｔｏｓｉｎ Ｃが、リポキシトーシス誘導剤の候補としてヒットした。
【0035】
［実験例３］
（スクリーニングにより得られた化合物の検証１）
実験例２におけるスクリーニングにより得られた各化合物が、野生型細胞（ＷＴ）に添加すると細胞死が起き、ＡＢＨＤ２ノックダウン細胞（ＡＢＨＤ２ ＫＤ）に添加すると細胞死が抑制される化合物であることを確認した。
（スクリーニングにより得られた化合物の検証１）
実験例２におけるスクリーニングにより得られた各化合物が、野生型細胞（ＷＴ）に添加すると細胞死が起き、ＡＢＨＤ２ノックダウン細胞（ＡＢＨＤ２ ＫＤ）に添加すると細胞死が抑制される化合物であることを確認した。
【0036】
図６（ａ）～（ｆ）は、各化合物を様々な濃度で野生型細胞（ＷＴ）及びＡＢＨＤ２ノックダウン細胞（ＡＢＨＤ２ ＫＤ）に添加してから４８時間後の細胞生存率を示すグラフである。細胞生存率は市販のキットを使用してＬＤＨアッセイにより測定した。
【0037】
その結果、これらの化合物を、野生型細胞（ＷＴ）に添加すると細胞死が起き、ＡＢＨＤ２ノックダウン細胞（ＡＢＨＤ２ ＫＤ）に添加すると細胞死が抑制される化合物であることが確認された。この結果は、これらの化合物がリポキシトーシス誘導剤であることを支持するものである。
【0038】
［実験例４］
（スクリーニングにより得られた化合物の検証２）
実験例３に示すように、実験例２におけるスクリーニングにより得られた各化合物を、野生型細胞（ＷＴ）に添加すると、４８時間後に細胞死が生じる。本実験例では、この細胞死を、ＡＢＨＤ２阻害剤の添加により抑制できることを確認した。ＡＢＨＤ２阻害剤としては、ＫＴ－１９５、ピロフェノン、化合物１８３を使用した。化合物１８３は、Baggelaar M. P., et al., ABHD2 Inhibitor Identified by Activity-Based Protein Profiling Reduces Acrosome Reaction, ACS Chem. Biol. 14, 2295-2304, 2019. を参考にして合成して使用した。
（スクリーニングにより得られた化合物の検証２）
実験例３に示すように、実験例２におけるスクリーニングにより得られた各化合物を、野生型細胞（ＷＴ）に添加すると、４８時間後に細胞死が生じる。本実験例では、この細胞死を、ＡＢＨＤ２阻害剤の添加により抑制できることを確認した。ＡＢＨＤ２阻害剤としては、ＫＴ－１９５、ピロフェノン、化合物１８３を使用した。化合物１８３は、Baggelaar M. P., et al., ABHD2 Inhibitor Identified by Activity-Based Protein Profiling Reduces Acrosome Reaction, ACS Chem. Biol. 14, 2295-2304, 2019. を参考にして合成して使用した。
【0039】
図７（ａ）は、野生型細胞（ＷＴ）の培地に、０．０２５μｇ／ｍＬのＶｉｒｕｓｔｏｍｙｃｉｎ Ａ及び様々な濃度のＫＴ－１９５を添加し、４８時間後の細胞死率を測定した結果を示すグラフである。細胞死率は以下の式（１）により求めた。細胞生存率は市販のキットを使用してＬＤＨアッセイにより測定した。
細胞死率（％）＝１００－細胞生存率（％）…（１）
細胞死率（％）＝１００－細胞生存率（％）…（１）
【0040】
図７（ａ）中、「試薬＋」はＶｉｒｕｓｔｏｍｙｃｉｎ Ａを添加した結果であることを示し、「試薬－」はＶｉｒｕｓｔｏｍｙｃｉｎ Ａを添加しなかった結果であることを示す。
【0041】
図７（ｂ）は、野生型細胞（ＷＴ）の培地に、０．０２５μｇ／ｍＬのＶｉｒｕｓｔｏｍｙｃｉｎ Ａ及び様々な濃度のピロフェノンを添加し、４８時間後の細胞死率を測定した結果を示すグラフである。図７（ｂ）中、「試薬＋」はＶｉｒｕｓｔｏｍｙｃｉｎ Ａを添加した結果であることを示し、「試薬－」はＶｉｒｕｓｔｏｍｙｃｉｎ Ａを添加しなかった結果であることを示す。
【0042】
その結果、ＡＢＨＤ２阻害剤の添加により、Ｖｉｒｕｓｔｏｍｙｃｉｎ Ａの添加により生じる細胞死を抑制できることが確認された。
【0043】
図８（ａ）は、野生型細胞（ＷＴ）の培地に、０．０１μｇ／ｍＬのＣｏｎｃａｎａｍｙｃｉｎ Ａ及び様々な濃度のＫＴ－１９５を添加し、４８時間後の細胞死率を測定した結果を示すグラフである。図８（ａ）中、「試薬＋」はＣｏｎｃａｎａｍｙｃｉｎ Ａを添加した結果であることを示し、「試薬－」はＣｏｎｃａｎａｍｙｃｉｎ Ａを添加しなかった結果であることを示す。
【0044】
図８（ｂ）は、野生型細胞（ＷＴ）の培地に、０．０１μｇ／ｍＬのＣｏｎｃａｎａｍｙｃｉｎ Ａ及び様々な濃度のピロフェノンを添加し、４８時間後の細胞死率を測定した結果を示すグラフである。図８（ｂ）中、「試薬＋」はＣｏｎｃａｎａｍｙｃｉｎ Ａを添加した結果であることを示し、「試薬－」はＣｏｎｃａｎａｍｙｃｉｎ Ａを添加しなかった結果であることを示す。
【0045】
その結果、ＡＢＨＤ２阻害剤の添加により、Ｃｏｎｃａｎａｍｙｃｉｎ Ａの添加により生じる細胞死を抑制できることが確認された。
【0046】
図９（ａ）は、野生型細胞（ＷＴ）の培地に、０．２μｇ／ｍＬの８－アザグアニン及び様々な濃度のＫＴ－１９５を添加し、４８時間後の細胞死率を測定した結果を示すグラフである。
【0047】
図９（ｂ）は、野生型細胞（ＷＴ）の培地に、０．２μｇ／ｍＬの８－アザグアニン及び様々な濃度のピロフェノンを添加し、４８時間後の細胞死率を測定した結果を示すグラフである。
【0048】
その結果、ＡＢＨＤ２阻害剤の添加により、８－アザグアニンの添加により生じる細胞死を抑制できることが確認された。
【0049】
図１０（ａ）は、野生型細胞（ＷＴ）の培地に、０．０５μｇ／ｍＬのＶｉｒａｎｔｍｙｃｉｎ及び様々な濃度のＫＴ－１９５を添加し、４８時間後の細胞死率を測定した結果を示すグラフである。
【0050】
図１０（ｂ）は、野生型細胞（ＷＴ）の培地に、０．０５μｇ／ｍＬのＳａｎｇｉｖａｍｙｃｉｎ及び様々な濃度のピロフェノンを添加し、４８時間後の細胞死率を測定した結果を示すグラフである。
【0051】
図１０（ｃ）は、野生型細胞（ＷＴ）の培地に、０．０１μｇ／ｍＬのＬｅｐｔｏｓｉｎ Ｃ及び様々な濃度の化合物１８３を添加し、４８時間後の細胞死率を測定した結果を示すグラフである。図１０（ｃ）中、「試薬＋」はＬｅｐｔｏｓｉｎ Ｃを添加した結果であることを示し、「試薬－」はＬｅｐｔｏｓｉｎ Ｃを添加しなかった結果であることを示す。
【0052】
その結果、ＡＢＨＤ２阻害剤の添加により、Ｖｉｒａｎｔｍｙｃｉｎ、Ｓａｎｇｉｖａｍｙｃｉｎ又はＬｅｐｔｏｓｉｎ Ｃの添加により生じる細胞死を抑制できることが確認された。
【0053】
以上の結果は、これらの化合物がリポキシトーシス誘導剤であることを更に支持するものである。
【0054】
［実験例５］
（スクリーニングにより得られた化合物の検証３）
実験例３に示すように、実験例２におけるスクリーニングにより得られた各化合物を、野生型細胞（ＷＴ）に添加すると、４８時間後に細胞死が生じる。本実験例では、この細胞死がアポトーシスでないことを確認した。具体的には、上記の細胞死を、アポトーシス阻害剤（Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ）の添加によっては抑制できないことを確認した。
（スクリーニングにより得られた化合物の検証３）
実験例３に示すように、実験例２におけるスクリーニングにより得られた各化合物を、野生型細胞（ＷＴ）に添加すると、４８時間後に細胞死が生じる。本実験例では、この細胞死がアポトーシスでないことを確認した。具体的には、上記の細胞死を、アポトーシス阻害剤（Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ）の添加によっては抑制できないことを確認した。
【0055】
図１１（ａ）～（ｆ）は、野生型細胞（ＷＴ）の培地に、各化合物及び様々な濃度のＺ－ＶＡＤ－ＦＭＫを添加し、４８時間後の細胞生存率を測定した結果を示すグラフである。Ｃｏｎｃａｎａｍｙｃｉｎ Ａは、０．０１μｇ／ｍＬの濃度で添加した。Ｖｉｒｕｓｔｏｍｙｃｉｎ Ａは、０．０２５μｇ／ｍＬの濃度で添加した。Ｌｅｐｔｏｓｉｎ Ｃは、０．０１μｇ／ｍＬの濃度で添加した。８－アザグアニンは、０．２μｇ／ｍＬの濃度で添加した。Ｓａｎｇｉｖａｍｙｃｉｎは、０．０５μｇ／ｍＬの濃度で添加した。Ｖｉｒａｎｔｍｙｃｉｎは、０．０５μｇ／ｍＬの濃度で添加した。
【0056】
その結果、各化合物により誘導される細胞死が、アポトーシス阻害剤の添加によっては抑制できないことが明らかとなった。すなわち、各化合物により誘導される細胞死がアポトーシスではないことが明らかとなった。この結果は、これらの化合物がリポキシトーシス誘導剤であることを更に支持するものである。
【0057】
［実験例６］
（スクリーニングにより得られた化合物の検証４）
実験例３に示すように、実験例２におけるスクリーニングにより得られた各化合物を、野生型細胞（ＷＴ）に添加すると、４８時間後に細胞死が生じる。本実験例では、この細胞死がフェロトーシスでないことを確認した。具体的には、上記の細胞死を、フェロトーシス阻害剤（ＤＦＯ、デフェロキサミン）の添加によっては抑制できないことを確認した。
（スクリーニングにより得られた化合物の検証４）
実験例３に示すように、実験例２におけるスクリーニングにより得られた各化合物を、野生型細胞（ＷＴ）に添加すると、４８時間後に細胞死が生じる。本実験例では、この細胞死がフェロトーシスでないことを確認した。具体的には、上記の細胞死を、フェロトーシス阻害剤（ＤＦＯ、デフェロキサミン）の添加によっては抑制できないことを確認した。
【0058】
図１２（ａ）～（ｆ）は、野生型細胞（ＷＴ）の培地に、各化合物及び様々な濃度のＤＦＯを添加し、４８時間後の細胞生存率を測定した結果を示すグラフである。Ｃｏｎｃａｎａｍｙｃｉｎ Ａは、０．０１μｇ／ｍＬの濃度で添加した。Ｖｉｒｕｓｔｏｍｙｃｉｎ Ａは、０．０２５μｇ／ｍＬの濃度で添加した。Ｌｅｐｔｏｓｉｎ Ｃは、０．０１μｇ／ｍＬの濃度で添加した。８－アザグアニンは、０．２μｇ／ｍＬの濃度で添加した。Ｓａｎｇｉｖａｍｙｃｉｎは、０．０５μｇ／ｍＬの濃度で添加した。Ｖｉｒａｎｔｍｙｃｉｎは、０．０５μｇ／ｍＬの濃度で添加した。
【0059】
その結果、各化合物により誘導される細胞死が、フェロトーシス阻害剤の添加によっては抑制できないことが明らかとなった。すなわち、各化合物により誘導される細胞死がフェロトーシスではないことが明らかとなった。この結果は、これらの化合物がリポキシトーシス誘導剤であることを更に支持するものである。
【0060】
［実験例７］
（スクリーニングにより得られた化合物の検証５）
実験例３に示すように、実験例２におけるスクリーニングにより得られた各化合物を、野生型細胞（ＷＴ）に添加すると、４８時間後に細胞死が生じる。本実験例では、この細胞死を、脂質酸化を抑制するＴｒｏｌｏｘ（ビタミンＥ誘導体、ＣＡＳ番号：５３１８８－０７－１）の添加により抑制できることを確認した。
（スクリーニングにより得られた化合物の検証５）
実験例３に示すように、実験例２におけるスクリーニングにより得られた各化合物を、野生型細胞（ＷＴ）に添加すると、４８時間後に細胞死が生じる。本実験例では、この細胞死を、脂質酸化を抑制するＴｒｏｌｏｘ（ビタミンＥ誘導体、ＣＡＳ番号：５３１８８－０７－１）の添加により抑制できることを確認した。
【0061】
図１３（ａ）～（ｆ）は、野生型細胞（ＷＴ）の培地に、各化合物及び様々な濃度のＴｒｏｌｏｘを添加し、４８時間後の細胞死率を測定した結果を示すグラフである。Ｃｏｎｃａｎａｍｙｃｉｎ Ａは、０．０１μｇ／ｍＬの濃度で添加した。Ｖｉｒｕｓｔｏｍｙｃｉｎ Ａは、０．０２５μｇ／ｍＬの濃度で添加した。Ｌｅｐｔｏｓｉｎ Ｃは、０．０１μｇ／ｍＬの濃度で添加した。８－アザグアニンは、０．２μｇ／ｍＬの濃度で添加した。Ｓａｎｇｉｖａｍｙｃｉｎは、０．０５μｇ／ｍＬの濃度で添加した。Ｖｉｒａｎｔｍｙｃｉｎは、０．０５μｇ／ｍＬの濃度で添加した。
【0062】
その結果、各化合物により誘導される細胞死が、Ｔｒｏｌｏｘの添加により濃度依存的に抑制されることが明らかとなった。この結果は、各化合物により誘導される細胞死が、脂質酸化を介した細胞死であることを示す。この結果は、これらの化合物がリポキシトーシス誘導剤であることを更に支持するものである。
【0063】
［実験例８］
（スクリーニングにより得られた化合物の検証６）
実験例３に示すように、実験例２におけるスクリーニングにより得られた各化合物を、野生型細胞（ＷＴ）に添加すると、４８時間後に細胞死が生じる。本実験例では、この細胞死を、脂質酸化を抑制するＦｅｒｒｏｓｔａｔｉｎ－１（抗酸化剤、ＣＡＳ番号：３４７１７４－０５－４）の添加により抑制できることを確認した。
（スクリーニングにより得られた化合物の検証６）
実験例３に示すように、実験例２におけるスクリーニングにより得られた各化合物を、野生型細胞（ＷＴ）に添加すると、４８時間後に細胞死が生じる。本実験例では、この細胞死を、脂質酸化を抑制するＦｅｒｒｏｓｔａｔｉｎ－１（抗酸化剤、ＣＡＳ番号：３４７１７４－０５－４）の添加により抑制できることを確認した。
【0064】
図１４（ａ）～（ｄ）は、野生型細胞（ＷＴ）の培地に、各化合物及び様々な濃度のＦｅｒｒｏｓｔａｔｉｎ－１を添加し、４８時間後の細胞死率を測定した結果を示すグラフである。Ｌｅｐｔｏｓｉｎ Ｃは、０．０１μｇ／ｍＬの濃度で添加した。８－アザグアニンは、０．２μｇ／ｍＬの濃度で添加した。Ｓａｎｇｉｖａｍｙｃｉｎは、０．０５μｇ／ｍＬの濃度で添加した。Ｖｉｒａｎｔｍｙｃｉｎは、０．０５μｇ／ｍＬの濃度で添加した。
【0065】
その結果、各化合物により誘導される細胞死が、Ｆｅｒｒｏｓｔａｔｉｎ－１の添加により濃度依存的に抑制されることが明らかとなった。この結果は、各化合物により誘導される細胞死が、脂質酸化を介した細胞死であることを支持する。この結果は、これらの化合物がリポキシトーシス誘導剤であることを更に支持するものである。
【0066】
［実験例９］
（スクリーニングにより得られた化合物の検証７）
実験例３に示すように、実験例２におけるスクリーニングにより得られた各化合物を、野生型細胞（ＷＴ）に添加すると、４８時間後に細胞死が生じる。本実験例では、この細胞死を、発明者らが同定したリポキシトーシス実行因子のノックアウト若しくはノックダウン、又は、リポキシトーシス抑制因子の高発現により、抑制できることを確認した。
（スクリーニングにより得られた化合物の検証７）
実験例３に示すように、実験例２におけるスクリーニングにより得られた各化合物を、野生型細胞（ＷＴ）に添加すると、４８時間後に細胞死が生じる。本実験例では、この細胞死を、発明者らが同定したリポキシトーシス実行因子のノックアウト若しくはノックダウン、又は、リポキシトーシス抑制因子の高発現により、抑制できることを確認した。
【0067】
図１５は、一例として、８－アザグアニンを細胞に添加することにより、リポキシトーシスの誘導を行った場合の経路を示す図である。この経路において、リポキシトーシスの実行因子として、脂質酸化に関連する因子である、Ｃｙｐ４ｘ１、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇが関与している。また、リポキシトーシスの抑制因子として、ＳＭＳ２が関与している。また、リポキシトーシスの実行因子として、脂質酸化の下流且つＥＲＫの上流で、Ｃ８７４３６、ＡＢＨＤ２、Ｒｂｘ１、ＵＢＥ２Ｄ１が関与している。そして、８－アザグアニンの添加から４８時間後にリポキシトーシスによる細胞死が生じる。
【0068】
リポキシトーシス実行因子のノックダウンの効果を検討するために、Ｃｙｐ４ｘ１ノックアウト細胞、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇノックダウン細胞（以下、「Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ ＫＤ」細胞という場合がある。）、Ｃ８７４３６ノックダウン細胞（以下、「Ｃ８７４３６ ＫＤ」細胞という場合がある。）、ＡＢＨＤ２ ＫＤ細胞、Ｒｂｘ１ノックダウン細胞（以下、「Ｒｂｘ１ ＫＤ」細胞という場合がある。）、ＵＢＥ２Ｄ１ノックダウン細胞（以下、「ＵＢＥ２Ｄ１ ＫＤ」細胞という場合がある。）、ＳＭＳ２過剰発現細胞を使用した。
【0069】
Ｃｙｐ４ｘ１ノックアウト細胞はゲノム編集により作製した。具体的には、まず、ｐｘ３３０ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ）に、マウスｃｙｐ４ｘ１遺伝子の標的配列に対するｇＲＮＡをコードする配列（ggctggagactcgttgggcgcgg、配列番号２）を挿入したプラスミドを作製した。続いて、作製したプラスミドを、タモキシフェン誘導型ＧＰｘ４欠損ＭＥＦにエレクトロポレーション法にて導入した。
【0070】
続いて、クローン化した細胞におけるＣＹＰ４Ｘ１の発現を、抗ＣＹＰ４Ｘ１抗体を用いたウエスタンブロット法により確認した。また、Ｃｙｐ４ｘ１ゲノムに変異が入っていることをシークエンス解析により確認した。そして、ＣＹＰ４Ｘ１の発現が消失しており、且つ、Ｃｙｐ４ｘ１ゲノムに変異が入っていたクローンを選別し、Ｃｙｐ４ｘ１ノックアウト細胞を得た。
【0071】
また、各ノックダウン細胞は、レトロウイルス感染系を用いて、ＭＥＦ細胞に、それぞれの遺伝子に特異的なｓｈＲＮＡをコードする遺伝子を導入して作製した。Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ特異的ｓｈＲＮＡをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号３に示す。また、Ｃ８７４３６特異的ｓｈＲＮＡをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号４に示す。また、ＡＢＨＤ２特異的ｓｈＲＮＡをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１に示す。また、Ｒｂｘ１特異的ｓｈＲＮＡをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号５に示す。また、ＵＢＥ２Ｄ１特異的ｓｈＲＮＡをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号６に示す。
【0072】
ＳＭＳ２過剰発現細胞は、ＭＥＦ細胞に、ＳＭＳ２遺伝子の発現プラスミドを導入して作製した。ＳＭＳ２遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号７に示す。
【0073】
図１６は、各細胞の培地に、各化合物を添加し、４８時間後の細胞生存率を測定した結果を示すグラフである。Ｃｏｎｃａｎａｍｙｃｉｎ Ａは、０．０１μｇ／ｍＬの濃度で添加した。Ｖｉｒｕｓｔｏｍｙｃｉｎ Ａは、０．０２５μｇ／ｍＬの濃度で添加した。Ｌｅｐｔｏｓｉｎ Ｃは、０．０１μｇ／ｍＬの濃度で添加した。８－アザグアニンは、０．２μｇ／ｍＬの濃度で添加した。Ｓａｎｇｉｖａｍｙｃｉｎは、０．０５μｇ／ｍＬの濃度で添加した。Ｖｉｒａｎｔｍｙｃｉｎは、０．０５μｇ／ｍＬの濃度で添加した。
【0074】
その結果、各化合物により誘導される細胞死が、リポキシトーシス実行因子のノックアウト若しくはノックダウン、又は、リポキシトーシス抑制因子の高発現により、抑制できることが明らかとなった。この結果は、これらの化合物がリポキシトーシス誘導剤であることを更に支持するものである。
【0075】
［実験例１０］
（スクリーニングにより得られた化合物の類似化合物の検証）
リポキシトーシス誘導剤であることが同定された、８－アザグアニンの類似化合物について、野生型細胞（ＷＴ）に添加すると細胞死が起き、ＡＢＨＤ２ ＫＤ細胞に添加すると細胞死が抑制されるか否かを検討した。８－アザグアニンの類似化合物としては、６－チオグアニン、６－メルカプトプリン、チミジン、ヒドロキシウレアを使用した。
（スクリーニングにより得られた化合物の類似化合物の検証）
リポキシトーシス誘導剤であることが同定された、８－アザグアニンの類似化合物について、野生型細胞（ＷＴ）に添加すると細胞死が起き、ＡＢＨＤ２ ＫＤ細胞に添加すると細胞死が抑制されるか否かを検討した。８－アザグアニンの類似化合物としては、６－チオグアニン、６－メルカプトプリン、チミジン、ヒドロキシウレアを使用した。
【0076】
図１７（ａ）～（ｅ）は、野生型細胞（ＷＴ）及びＡＢＨＤ２ ＫＤ細胞の培地に、各化合物を様々な濃度で添加し、４８時間後の細胞生存率を測定した結果を示すグラフである。その結果、６－チオグアニン、６－メルカプトプリン、チミジン、ヒドロキシウレアもリポキシトーシス誘導剤であることが確認された。
【0077】
［実験例１１］
（スクリーニングにより得られた化合物の検証８）
実験例３に示すように、実験例２におけるスクリーニングにより得られた各化合物を、野生型細胞（ＷＴ）に添加すると、４８時間後に細胞死が生じる。本実験例では、この細胞死が、脂質ラジカルの生成を介しているのか否かを検討した。上記の細胞死がリポキシトーシスであれば、脂質ラジカルの生成を介しているはずである。
（スクリーニングにより得られた化合物の検証８）
実験例３に示すように、実験例２におけるスクリーニングにより得られた各化合物を、野生型細胞（ＷＴ）に添加すると、４８時間後に細胞死が生じる。本実験例では、この細胞死が、脂質ラジカルの生成を介しているのか否かを検討した。上記の細胞死がリポキシトーシスであれば、脂質ラジカルの生成を介しているはずである。
【0078】
脂質ラジカルの生成は、ＮＢＤ－ＰＥＮ（ＣＡＳ番号：１９５５５０５－５４－０、商品名「ＬｉｐｉＲＡＤＩＣＡＬ Ｇｒｅｅｎ」、フナコシ株式会社）を用いて検出した。ＮＢＤ－ＰＥＮは、脂質ラジカルとラジカル－ラジカルカップリングにより共有結合を形成すると緑色蛍光を示す化合物である。
【0079】
ＭＥＦ細胞を、１００ｍｍディッシュ１枚あたり８×１０５個となるように播種した。翌日、８－アザグアニン（終濃度０．８μｇ／ｍＬ）、Ｓａｎｇｉｖａｍｙｃｉｎ（終濃度０．８μｇ／ｍＬ）、Ｖｉｒａｎｔｍｙｃｉｎ（終濃度０．０５μｇ／ｍＬ）、Ｌｅｐｔｏｓｉｎ Ｃ（終濃度０．１μｇ／ｍＬ）、Ｃｏｎｃａｎａｍｙｃｉｎ Ａ（終濃度０．００１２５μｇ／ｍＬ）、Ｖｉｒｕｓｔｏｍｙｃｉｎ Ａ（終濃度０．００１μｇ／ｍＬ）をそれぞれ添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した。
【0080】
続いて、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、１μＭ ＮＢＤ－ＰＥＮ ＰＢＳ溶液を３ｍＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で３０分間染色した。続いて、スクレーパーを用いて細胞を回収し、４℃、１５００ｒｐｍ、３分間遠心し、上清を除去した後、冷ＰＢＳを３ｍＬ入れて懸濁した。続いて、細胞懸濁液を７０μｍナイロンメッシュ（ファルコン社）に通してサンプルチューブへ入れ、フローサイトメーター（製品名「ＭｏＦｌｏＴＭ ＸＤＰ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ」、ベックマン・コールター社）を用いて、ＮＢＤ－ＰＥＮの蛍光を解析した。
【0081】
図１８は、各化合物を添加してから２４時間後のフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。その結果、いずれの化合物を添加した場合においても、２４時間後に脂質ラジカルの生成が確認された。なお、リポキシトーシスにより細胞死は４８時間後に生じる。この結果は、これらの化合物がリポキシトーシス誘導剤であることを更に支持するものである。
【0082】
［実験例１２］
（スクリーニングにより得られた化合物の検証９）
リポキシトーシス誘導剤である８－アザグアニンによる脂質ラジカル生成が、フェロトーシスの阻害剤であるＤＦＯ（デフェロキサミン）の添加により抑制されるか否かを検討した。また、比較のために、フェロトーシス誘導剤であるＲＳＬ３の添加による脂質ラジカル生成が、フェロトーシス阻害剤であるＤＦＯの添加により抑制されるか否かも検討した。
（スクリーニングにより得られた化合物の検証９）
リポキシトーシス誘導剤である８－アザグアニンによる脂質ラジカル生成が、フェロトーシスの阻害剤であるＤＦＯ（デフェロキサミン）の添加により抑制されるか否かを検討した。また、比較のために、フェロトーシス誘導剤であるＲＳＬ３の添加による脂質ラジカル生成が、フェロトーシス阻害剤であるＤＦＯの添加により抑制されるか否かも検討した。
【0083】
タモキシフェン誘導型ＧＰｘ４欠損ＭＥＦ細胞を、１００ｍｍディッシュ１枚あたり１×１０５個となるように播種した。翌日、タモキシフェン（終濃度１μＭ）を添加した。また、タモキシフェンを添加しなかった細胞、タモキシフェンと共にＤＦＯ（終濃度１００μＭ）を添加した細胞も用意した。続いて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した。
【0084】
また、ＭＥＦ細胞を、１００ｍｍディッシュ１枚あたり８×１０５個となるように播種した。翌日、８－アザグアニン（終濃度０．８μｇ／ｍＬ）を添加した。また、８－アザグアニンを添加しなかった細胞、８－アザグアニンと共にＤＦＯ（終濃度１００μＭ）を添加した細胞も用意した。続いて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した。
【0085】
また、ＭＥＦ細胞を、１００ｍｍディッシュ１枚あたり８×１０５個となるように播種した。翌日、ＲＳＬ３（終濃度１μＭ）を添加した。また、ＲＳＬ３を添加しなかった細胞、ＲＳＬ３と共にＤＦＯ（終濃度１００μＭ）を添加した細胞も用意した。続いて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で３時間培養した。
【0086】
続いて、実験例１１と同様にして、各細胞をＮＢＤ－ＰＥＮで染色し、フローサイトメーター（製品名「ＭｏＦｌｏＴＭ ＸＤＰ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ」、ベックマン・コールター社）を用いて、ＮＢＤ－ＰＥＮの蛍光を解析した。
【0087】
図１９上段は、フローサイトメトリーの結果を示すグラフである。図１９下段はフローサイトメトリーの結果に基づいて作成したグラフである。その結果、８－アザグアニンによる脂質ラジカル生成が、ＤＦＯを添加しても抑制されないことが明らかとなった。また、ＧＰｘ４欠損により誘導される脂質ラジカル生成も、ＤＦＯの添加によっては抑制されないことが示された。一方、ＲＳＬ３の添加による脂質ラジカル生成は、ＤＦＯの添加により抑制された。
【0088】
この結果は、リポキシトーシスによる脂質ラジカル生成がＤＦＯの添加によっては抑制されないことを示す。また、リポキシトーシスがフェロトーシスとは異なる細胞死であることを更に支持するものである。
【0089】
［実験例１３］
（スクリーニングにより得られた化合物の検証１０）
リポキシトーシス誘導剤である８－アザグアニンによる脂質ラジカル生成が、ビタミンＥ誘導体であるＴｒｏｌｏｘの添加により抑制されるか否かを検討した。また、比較のために、フェロトーシス誘導剤であるＲＳＬ３の添加による脂質ラジカル生成が、Ｔｒｏｌｏｘの添加により抑制されるか否かも検討した。
（スクリーニングにより得られた化合物の検証１０）
リポキシトーシス誘導剤である８－アザグアニンによる脂質ラジカル生成が、ビタミンＥ誘導体であるＴｒｏｌｏｘの添加により抑制されるか否かを検討した。また、比較のために、フェロトーシス誘導剤であるＲＳＬ３の添加による脂質ラジカル生成が、Ｔｒｏｌｏｘの添加により抑制されるか否かも検討した。
【0090】
タモキシフェン誘導型ＧＰｘ４欠損ＭＥＦ細胞を、１００ｍｍディッシュ１枚あたり１×１０５個となるように播種した。翌日、タモキシフェン（終濃度１μＭ）を添加した。また、タモキシフェンを添加しなかった細胞、タモキシフェンと共にＴｒｏｌｏｘ（終濃度６００μＭ）を添加した細胞も用意した。続いて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した。
【0091】
また、ＭＥＦ細胞を、１００ｍｍディッシュ１枚あたり８×１０５個となるように播種した。翌日、８－アザグアニン（終濃度０．８μｇ／ｍＬ）を添加した。また、８－アザグアニンを添加しなかった細胞、８－アザグアニンと共にＴｒｏｌｏｘ（終濃度６００μＭ）を添加した細胞も用意した。続いて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した。
【0092】
また、ＭＥＦ細胞を、１００ｍｍディッシュ１枚あたり８×１０５個となるように播種した。翌日、ＲＳＬ３（終濃度１μＭ）を添加した。また、ＲＳＬ３を添加しなかった細胞、ＲＳＬ３と共にＴｒｏｌｏｘ（終濃度６００μＭ）を添加した細胞も用意した。続いて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で３時間培養した。
【0093】
続いて、実験例１１と同様にして、各細胞をＮＢＤ－ＰＥＮで染色し、フローサイトメーター（製品名「ＭｏＦｌｏＴＭ ＸＤＰ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ」、ベックマン・コールター社）を用いて、ＮＢＤ－ＰＥＮの蛍光を解析した。
【0094】
図２０上段は、フローサイトメトリーの結果を示すグラフである。図２０下段はフローサイトメトリーの結果に基づいて作成したグラフである。その結果、８－アザグアニンによる脂質ラジカル生成が、Ｔｒｏｌｏｘの添加により抑制されることが明らかとなった。また、ＧＰｘ４欠損により誘導される脂質ラジカル生成も、Ｔｒｏｌｏｘの添加により抑制されることが示された。また、ＲＳＬ３の添加による脂質ラジカル生成も、Ｔｒｏｌｏｘの添加により抑制された。
【0095】
［実験例１４］
（スクリーニングにより得られた化合物の検証１１）
リポキシトーシス誘導剤である８－アザグアニンによる脂質ラジカル生成における、リポキシトーシス関連因子の関与について検討した。具体的には、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇノックダウン細胞（Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ ＫＤ細胞）、Ｃｙｐ４ｘ１ノックアウト細胞（Ｃｙｐ４ｘ１ ＫＯ細胞）、ＳＭＳ２過剰発現細胞（ＳＭＳ２ ＯＥ細胞）に８－アザグアニン（終濃度０．８μｇ／ｍＬ）を添加した。また、比較のために、８－アザグアニン（終濃度０．８μｇ／ｍＬ）を添加したＭＥＦ細胞も用意した。
（スクリーニングにより得られた化合物の検証１１）
リポキシトーシス誘導剤である８－アザグアニンによる脂質ラジカル生成における、リポキシトーシス関連因子の関与について検討した。具体的には、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇノックダウン細胞（Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ ＫＤ細胞）、Ｃｙｐ４ｘ１ノックアウト細胞（Ｃｙｐ４ｘ１ ＫＯ細胞）、ＳＭＳ２過剰発現細胞（ＳＭＳ２ ＯＥ細胞）に８－アザグアニン（終濃度０．８μｇ／ｍＬ）を添加した。また、比較のために、８－アザグアニン（終濃度０．８μｇ／ｍＬ）を添加したＭＥＦ細胞も用意した。
【0096】
続いて、８－アザグアニンの添加から１２時間後、２４時間後、及び３６時間後に、実験例１１と同様にして、各細胞をＮＢＤ－ＰＥＮで染色し、フローサイトメーター（製品名「ＭｏＦｌｏＴＭ ＸＤＰ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ」、ベックマン・コールター社）を用いて、ＮＢＤ－ＰＥＮの蛍光を解析した。
【0097】
図２１は、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ ＫＤ細胞の結果を示すグラフである。比較のために、ＭＥＦ細胞の結果も示す。図２２は、Ｃｙｐ４ｘ１ ＫＯ細胞の結果を示すグラフである。比較のために、ＭＥＦ細胞の結果も示す。図２３は、ＳＭＳ２ ＯＥ細胞の結果を示すグラフである。比較のために、ＭＥＦ細胞の結果も示す。図２１～２３中、「試薬＋」は８－アザグアニンを添加したことを示し、「試薬－」は８－アザグアニンを添加しなかったことを示す。
【0098】
その結果、８－アザグアニンによる脂質ラジカル生成は、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ ＫＤ細胞で完全に抑制されたことが明らかとなった。また、Ｃｙｐ４ｘ１ ＫＯ細胞では、８－アザグアニンによる脂質ラジカル生成が遅延することが示された。また、ＳＭＳ２ ＯＥ細胞では、８－アザグアニンによる脂質ラジカル生成が抑制されたことが明らかとなった。
【0099】
以上の結果から、８－アザグアニンによる脂質ラジカル生成がＣｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇを介して生じていることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【0100】
本発明により、リポキシトーシスを特異的に誘導することができる化合物を提供することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【配列表】