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特開2023-178796ニドウイルス目のウイルス由来の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドおよび医薬組成物、並びに、ニドウイルス目のウイルスのスパイクタンパク質の膜融合活性の阻害剤及びウイルスＲＮＡ合成の阻害剤
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023178796
(43)【公開日】2023-12-18
(54)【発明の名称】ニドウイルス目のウイルス由来の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドおよび医薬組成物、並びに、ニドウイルス目のウイルスのスパイクタンパク質の膜融合活性の阻害剤及びウイルスＲＮＡ合成の阻害剤
(51)【国際特許分類】
C07K 14/08 20060101AFI20231211BHJP
C07K 14/165 20060101ALI20231211BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20231211BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20231211BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231211BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20231211BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20231211BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20231211BHJP
C12N 15/50 20060101ALN20231211BHJP
C12N 15/40 20060101ALN20231211BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20231211BHJP
【ＦＩ】
C07K14/08
C07K14/165 ZNA
C12Q1/02
A61P31/14
A61P43/00 111
A61K38/16
G01N33/15 Z
G01N33/50 Z
C12N15/50
C12N15/40
C12N15/113 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】11
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022091704
(22)【出願日】2022-06-06
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）２０２０年度、厚生労働科学研究費補助金 新興・再興感染症及び予防接種政策推進研究事業「新型コロナウイルス感染症等の感染症サーベイランス体制の抜本的拡充に向けた人材育成と感染症疫学的手法の開発研究」研究代表者鈴木基、及び２０２１年度厚生労働科学研究費補助金 新興・再興感染症及び予防接種政策推進研究事業「新型及び季節性インフルエンザに係る流行株の予測等に資するサーベイランス及びゲノム解析に関する研究」研究代表者長谷川秀樹、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】591222245
【氏名又は名称】国立感染症研究所長
(71)【出願人】
【識別番号】504173471
【氏名又は名称】国立大学法人北海道大学
(74)【代理人】
【識別番号】100107870
【弁理士】
【氏名又は名称】野村 健一
(74)【代理人】
【識別番号】100098121
【弁理士】
【氏名又は名称】間山 世津子
(72)【発明者】
【氏名】竹田 誠
(72)【発明者】
【氏名】大倉 喬
(72)【発明者】
【氏名】白戸 憲也
(72)【発明者】
【氏名】前仲 勝実
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G045AA40
2G045DA14
2G045FB02
4B063QA18
4B063QR80
4B063QS28
4B063QS38
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA07
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA20
4C084BA23
4C084CA01
4C084DC50
4C084NA14
4C084ZB331
4C084ZB332
4C084ZC411
4C084ZC412
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA05
4H045BA21
4H045CA01
4H045EA29
4H045FA30
4H045FA33
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
【課題】 ウイルスの薬剤耐性の獲得や変異により、治療効果の低下が生じないニドウイルス目のウイルスに対する新規の抗ウイルス剤（治療薬）を提供すること。
【解決手段】 ニドウイルス目のウイルス由来の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドを含有する、ニドウイルス目のウイルスの治療薬。
【選択図】 図１
【解決手段】 ニドウイルス目のウイルス由来の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドを含有する、ニドウイルス目のウイルスの治療薬。
【選択図】 図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ニドウイルス目のウイルス由来の疎水性αヘリックス領域を有するペプチド。
【請求項2】
前記疎水性αヘリックス領域を有するペプチドが、疎水性アミノ酸からなる請求項１に記載の疎水性αヘリックス領域を有するペプチド。
【請求項3】
前記疎水性アミノ酸が、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、およびトリプトファンから選ばれる少なくとも１種である請求項２に記載の疎水性αヘリックス領域を有するペプチド。
【請求項4】
配列番号１～４のいずれかに示されるアミノ酸配列、または、該アミノ酸配列について、１個、２個もしくは３個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されて形成される改変アミノ酸配列を有する請求項１～３のいずれか１項に記載の疎水性αヘリックス領域を有するペプチド。
【請求項5】
前記ニドウイルス目のウイルスは、アルテリウイルス科、コロナウイルス科、またはオルソコロナウイルス亜科のウイルスである、請求項１～３のいずれか１項に記載の疎水性αヘリックス領域を有するペプチド。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか１項に記載の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドを含有する、ニドウイルスのスパイクタンパク質の膜融合活性阻害剤。
【請求項7】
請求項１～５のいずれか１項に記載の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドを含有する、ウイルスＲＮＡ合成阻害剤。
【請求項8】
請求項１～５のいずれか１項に記載の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドを含有する、医薬組成物。
【請求項9】
ニドウイルス目のウイルス由来の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドの配列情報を用いた、前記疎水性αヘリックス領域の発現の制御による、前記ウイルスのスパイクタンパク質の膜融合活性阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項10】
ニドウイルス目のウイルス由来の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドの配列情報を用いた、前記疎水性αヘリックス領域の発現の制御による、前記ウイルスのＲＮＡ合成阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項11】
ニドウイルス目のウイルス由来の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドの配列情報を用いた、前記疎水性αヘリックス領域の発現の制御による、前記ウイルス産生を制御する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ニドウイルス目のウイルスのスパイクタンパク質の膜融合活性を阻害する活性、または、ウイルスＲＮＡ合成の阻害活性を有する新規のペプチド、およびその利用に関する。
【背景技術】
【0002】
ウイルス性疾患は、有効な抗ウイルス剤が完成した場合であっても、ウイルスが薬剤耐性を獲得することや変異を繰り返すことで、完成した抗ウイルス剤の効果が低くなり、十分な治療が行えないことがある。我々の周りには脅威となるウイルス感染症が多く存在しており、現在も猛威を振るっているニドウイルス目に分類される新型コロナウイルス感染症は、その一例である。そのため、ウイルス性疾患に対して、作用機序や化学的特性の異なる抗ウイルス剤（治療薬）の研究開発が積極的に進められている。
【0003】
抗ウイルス剤としては、例えば、ウイルスの感染・増殖を阻止、または抑制させる作用機序を有する天然由来あるいは人為的に作製された抗ウイルス性ペプチドの開発が行われている（特許文献１、２参照）。
【0004】
しかしながら、これらの治療薬もウイルスの薬剤耐性の獲得や変異により治療効果が低くなり、迅速に十分な治療が行えない恐れがあり、新規の有効成分や作用機序を有する治療薬が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特開2021-187810号公報
【特許文献2】特開2020-059662号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
そこで、本発明の課題は、ウイルスの薬剤耐性の獲得や変異により治療効果の低下が生じないニドウイルス目のウイルスに対する新規の抗ウイルス剤（治療薬）を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、これらの課題を解決するために、エンベロープを有するニドウイルス目のウイルスを対象として、ニドウイルス目のウイルスのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内のアミノ酸配列からなるペプチドを用いて、スクリーニングと抗ウイルス性の評価を鋭意検討した。その結果、特定のペプチドが、ウイルスが細胞内への侵入に用いるスパイクタンパク質の膜融合活性を著しく低下させることや、ウイルスＲＮＡの合成阻害活性を有することを見出し、本発明を完成させた。
【0008】
本発明の構成は以下の通りである。
［１］ ニドウイルス目のウイルス由来の疎水性αヘリックス領域を有するペプチド。
［２］ 前記疎水性αヘリックス領域を有するペプチドが、疎水性アミノ酸からなる前記［１］に記載の疎水性αヘリックス領域を有するペプチド。
［３］ 前記疎水性アミノ酸が、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、およびトリプトファンから選ばれる少なくとも１種である前記［２］に記載の疎水性αヘリックス領域を有するペプチド。
［４］ 配列番号１～４のいずれかに示されるアミノ酸配列、または、該アミノ酸配列について、１個、２個もしくは３個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されて形成される改変アミノ酸配列を有する前記［１］～［３］のいずれか１に記載の疎水性αヘリックス領域を有するペプチド。
［５］ 前記ニドウイルス目のウイルスは、アルテリウイルス科、コロナウイルス科 、またはオルソコロナウイルス亜科のウイルスである、前記［１］～[３]のいずれか１に記載の疎水性αヘリックス領域を有するペプチド。
［６］ 前記［１］～[５]のいずれか１に記載の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドを含有する、ニドウイルスのスパイクタンパク質の膜融合活性阻害剤。
［７］ 前記［１］～[５]のいずれか１に記載の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドを含有する、ウイルスＲＮＡ合成阻害剤。
［８］ 前記［１］～[５]のいずれか１に記載の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドを含有する、医薬組成物。
［９］ ニドウイルス目のウイルス由来の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドの配列情報を用いた、前記疎水性αヘリックス領域の発現の制御による、前記ウイルスのスパイクタンパク質の膜融合活性阻害剤のスクリーニング方法。
［１０］ ニドウイルス目のウイルス由来の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドの配列情報を用いた、前記疎水性αヘリックス領域の発現の制御による、前記ウイルスのＲＮＡ合成阻害剤のスクリーニング方法。
［１１］ ニドウイルス目のウイルス由来の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドの配列情報を用いた、前記疎水性αヘリックス領域の発現の制御による、前記ウイルス産生を制御する方法。
［１］ ニドウイルス目のウイルス由来の疎水性αヘリックス領域を有するペプチド。
［２］ 前記疎水性αヘリックス領域を有するペプチドが、疎水性アミノ酸からなる前記［１］に記載の疎水性αヘリックス領域を有するペプチド。
［３］ 前記疎水性アミノ酸が、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、およびトリプトファンから選ばれる少なくとも１種である前記［２］に記載の疎水性αヘリックス領域を有するペプチド。
［４］ 配列番号１～４のいずれかに示されるアミノ酸配列、または、該アミノ酸配列について、１個、２個もしくは３個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されて形成される改変アミノ酸配列を有する前記［１］～［３］のいずれか１に記載の疎水性αヘリックス領域を有するペプチド。
［５］ 前記ニドウイルス目のウイルスは、アルテリウイルス科、コロナウイルス科 、またはオルソコロナウイルス亜科のウイルスである、前記［１］～[３]のいずれか１に記載の疎水性αヘリックス領域を有するペプチド。
［６］ 前記［１］～[５]のいずれか１に記載の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドを含有する、ニドウイルスのスパイクタンパク質の膜融合活性阻害剤。
［７］ 前記［１］～[５]のいずれか１に記載の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドを含有する、ウイルスＲＮＡ合成阻害剤。
［８］ 前記［１］～[５]のいずれか１に記載の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドを含有する、医薬組成物。
［９］ ニドウイルス目のウイルス由来の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドの配列情報を用いた、前記疎水性αヘリックス領域の発現の制御による、前記ウイルスのスパイクタンパク質の膜融合活性阻害剤のスクリーニング方法。
［１０］ ニドウイルス目のウイルス由来の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドの配列情報を用いた、前記疎水性αヘリックス領域の発現の制御による、前記ウイルスのＲＮＡ合成阻害剤のスクリーニング方法。
［１１］ ニドウイルス目のウイルス由来の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドの配列情報を用いた、前記疎水性αヘリックス領域の発現の制御による、前記ウイルス産生を制御する方法。
【発明の効果】
【0009】
本発明の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドは、ニドウイルス目のウイルスの脂質膜と融合することを抑制できる。また、本発明のニドウイルス目のスパイクタンパク質の膜融合活性の阻害剤を用いることで、変異を繰り返したウイルスであっても、細胞内に侵入することを阻害できるため、該阻害剤を含有する予防剤、治療薬等の医薬品は、薬効の低下がみられない。さらに本発明の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドは、ウイルスＲＮＡ合成の阻害活性を有することから、ウイルスＲＮＡ合成の阻害剤等の抗ウイルス剤として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】コロナウイルスのＳＥＭ写真および模式図である。
【図2】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２遺伝子と２ｃペプチドの模式図である。
【図3】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｗｕｈａｎ株、Ｏｍｉｃｒｏｎ株）、近縁コウモリコロナウイルス（ＲａＴＧ１３株、ＢＡＮＡＬ５２株）の「２ｃペプチド」のアミノ酸配列を比較した図である。
【図4】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｗｕｈａｎ株、Ｏｍｉｃｒｏｎ株）、近縁コウモリコロナウイルス（ＲａＴＧ１３株、ＢＡＮＡＬ５２株）の２ｃペプチドの予測構造を比較した図である。
【図5】ＧＦＰとスパイクタンパク質とを発現させることで形成された巨大な合胞体の光学写真である。
【図6】２ｃペプチドとスパイクタンパク質とを発現させることで合胞体の形成が阻害された結果を示す光学写真である。
【図7】２ｃペプチドによる膜融合阻害活性を示す光学写真である。
【図8】２ｃペプチドと麻疹ウイルスＦとＨを発現させることで形成された巨大な合胞体の光学写真である。
【図9】２ｃペプチドとセンダイウイルスＦとＨＮを発現させることで形成された巨大な合胞体の光学写真である。
【図10】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ遺伝子のＨＡＨＰ（２ｃ、２ｄ、２ｅ、２ｆ、および２ｇペプチド）のＳ遺伝子上の位置を示した図である。
【図11】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ遺伝子のＨＡＨＰ（２ｃ、２ｄ、２ｅ、２ｆ、および２ｇペプチド）のアミノ酸配列である。
【図12】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ遺伝子の２ｃ以外のペプチドの膜融合阻害活性を示す光学写真である。
【図13】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ遺伝子の２ｇペプチドの膜融合阻害活性を示す光学写真である。
【図14】ＭＥＲＳ－ＣｏＶ Ｓ遺伝子のＨＡＨＰ（ＭＥＲＳ－２ｃ、－２ｄ、－２ｅ、－２ｆ、－２ｇ、２ｈペプチド）のＳ遺伝子上の位置を示す図である。
【図15】ＭＥＲＳ－ＣｏＶ Ｓ遺伝子のＨＡＨＰ（ＭＥＲＳ－２ｃ、－２ｄ、－２ｅ、－２ｆ、－２ｇ、２ｈペプチド）のアミノ酸配列を示す図である。
【図16】ＭＥＲＳ－ＣｏＶのスパイクタンパク質を用いた膜融合阻害活性実験の結果を示す光学写真である。
【図17】膜融合阻害活性のあるＭＥＲＳ－２ｃ、－２ｄ、－２ｅ、－２ｆおよびＭＥＲＳ－ＣｏＶ－Ｓとの免疫染色像の光学写真である。
【図18】ＭＥＲＳ－ＣｏＶ－ＨＡＨＰが麻疹ウイルスの膜融合を阻害しないことを示す光学写真である。
【図19】ＭＥＲＳ－ＣｏＶ－ＨＡＨＰがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の膜融合を阻害することを示す光学写真である。
【図20】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＨＡＨＰ（２ｃ， ２ｇ）によるＭＥＲＳ－ＣｏＶの膜融合阻害を示す光学写真である。
【図21】脂質二重膜のＯｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅと相互作用する領域のアミノ酸配列を示す模式図である。
【図22】レプリコン細胞内にＲＮＡ複製（合成）過程に生じるｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）のドットが検出され、ＲＮＡ合成が確認できた結果を示す光学写真である。
【図23】レプリコン細胞内にＲＮＡ複製（合成）過程に生じるｄｓＲＮＡのドットが検出されず、ＲＮＡ合成が阻害された結果を示す光学写真である。
【図24】２ｃ以外（２ｅ，２ｆ，２ｇ）には、ＤＭＶへの取り込みや、ＲＮＡ合成阻害活性が認められなかった結果を示す光学写真である。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本明細書において、ペプチドとは、複数のペプチド結合を有するアミノ酸のポリマーをいう。また、本明細書において、アミノ酸残基とは、ペプチド鎖のＮ末端アミノ酸およびＣ末端アミノ酸を包含する。
本明細書において、疎水性αヘリックス領域とは、疎水性アミノ酸残基（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、およびトリプトファン）に富み、その疎水性αヘリックス領域分子表面に親水性アミノ酸、分子内側に疎水性アミノ酸残基が配列されるらせん構造の領域をいう。膜貫通領域予測ツール等を用いると、Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ ＆ Ｃｈａｒｇｅ ｐｌｏｔのスコアピークがある領域が疎水性αヘリックス領域と特定される。
本明細書において、疎水性αヘリックス領域とは、疎水性アミノ酸残基（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、およびトリプトファン）に富み、その疎水性αヘリックス領域分子表面に親水性アミノ酸、分子内側に疎水性アミノ酸残基が配列されるらせん構造の領域をいう。膜貫通領域予測ツール等を用いると、Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ ＆ Ｃｈａｒｇｅ ｐｌｏｔのスコアピークがある領域が疎水性αヘリックス領域と特定される。
【0012】
本発明の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドは、ニドウイルス目のウイルス由来のペプチドである。本発明の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドは、ペプチド分子として、疎水性を示すペプチド鎖であれば、特に限定されないが、アミノ酸残基数が２０以上、３００未満の疎水性アミノ酸からなるペプチド鎖であることが好ましく、アミノ酸残基数が２０以上、１５０以下の疎水性アミノ酸からなるペプチド鎖であることがより好ましい。
【0013】
ニドウイルス目（Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ）は、エンベロープを有するウイルスであり、アルテリウイルス科（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）、およびオルソコロナウイルス亜科（Ｏｒｔｈｏｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｎａｅ）に分類される。
【0014】
例えば、コロナウイルスは、ウイルス学的には、ニドウイルス目・コロナウイルス亜科・コロナウイルス科に分類される。脂質二重膜のエンベロープの中にヌクレオカプシドタンパク質に巻き付いたプラス鎖の一本鎖ＲＮＡのゲノムがあり、エンベロープ表面には、スパイクタンパク質、エンベロープタンパク質、膜タンパク質が配置されている（図１右図。左図は、コロナウイルスのＳＥＭ写真）。
ウイルスゲノムの大きさは、ＲＮＡウイルスの中では最大サイズの３０ｋｂである。遺伝学的特徴からα、β、γ、δのグループに分類される。ＨＣｏＶ－２２９ＥとＨＣｏＶ－ＮＬ６３はαコロナウイルスに、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１はβコロナウイルスに分類されている。
ウイルスゲノムの大きさは、ＲＮＡウイルスの中では最大サイズの３０ｋｂである。遺伝学的特徴からα、β、γ、δのグループに分類される。ＨＣｏＶ－２２９ＥとＨＣｏＶ－ＮＬ６３はαコロナウイルスに、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１はβコロナウイルスに分類されている。
【0015】
本発明の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドは、ニドウイルス目のウイルスのスパイクタンパク質と特異的に相互作用し、スパイクタンパク質と細胞膜との膜融合を阻害することから、ニドウイルス目のウイルスの膜融合活性の阻害剤として用いることができる。さらに本発明の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドを含有することで、ニドウイルス目のウイルス感染の予防薬や治療薬として利用することができる。
また、本発明の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドは、ウイルスＲＮＡの合成阻害活性を有することから、ウイルスＲＮＡ合成の阻害剤等の抗ウイルス剤として用いることができる。
また、本発明の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドは、ウイルスＲＮＡの合成阻害活性を有することから、ウイルスＲＮＡ合成の阻害剤等の抗ウイルス剤として用いることができる。
【0016】
本発明の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドは、ニドウイルス目のウイルスのゲノム上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と重複したフレーム（読み枠）に多数コードされている。ニドウイルス目のウイルスのゲノムのフレーム（読み枠）を＋１シフトした部分には、既知の主要ウイルスタンパク質がコードされている。またフレームを＋２シフトした部分および＋３シフトした部分に疎水性αヘリックス領域を有するペプチドがコードされており、特にフレームを＋２シフトした部分に、疎水性αヘリックス領域を有するペプチドが多数コードされている。
【0017】
本発明において、αヘリックス領域を有するとは、ペプチド鎖が右巻き螺旋構造をとる領域を有することをいい、通常、螺旋構造は、一巻き３．６個のアミノ酸単位からなり、４番目毎のアミノ酸単位のＮ－ＨとＣ＝Ｏが水素結合することで非常に安定となる。
【0018】
本発明に用いられる疎水性アミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、およびトリプトファンから選ばれる少なくとも１種である。αヘリックスを形成しやすい点から、アラニン、ロイシン、及びメチオニンが好ましい。また、プロリンは疎水性アミノ酸であるが、本発明のペプチドに含まれてもよいが、側鎖が主鎖と環状構造を形成しており、この環状構造が螺旋の回転を妨げることから、プロリンがある部分にはαヘリックスが形成されない。
【0019】
本発明の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドは、疎水性アミノ酸のみから構成されていてもよいが、本発明の効果を著しく低下しない範囲内であれば、親水性アミノ酸を含有させてもよい。
【0020】
親水性アミノ酸としては、極性非電荷側鎖アミノ酸、極性電荷側鎖アミノ酸（酸性）、および極性電荷側鎖アミノ酸（塩基性）が利用できる。極性非電荷側鎖アミノ酸としては、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、およびシステインが挙げられる。極性電荷側鎖アミノ酸（塩基性）としては、アルギニン、ヒスチジン、およびリジンが挙げられる。極性電荷側鎖アミノ酸（酸性）としては、アスパラギン酸、およびグルタミン酸が挙げられる。αヘリックスを形成しやすい点から、親水性アミノ酸としては、グルタミン、グルタミン酸、リジン、アルギニン、及びヒスチジンが好ましい。
【0021】
本発明の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドとしては、配列番号１～４のいずれかに示すアミノ酸配列、または、該アミノ酸配列について、１個、２個または３個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されて形成される改変アミノ酸配列を有するペプチドが利用できる。加えて、表１～１１のいずれかに示すアミノ酸配列を有するペプチドも利用できる可能性がある。
【0022】
【表1】
【0023】
【表2】
【0024】
【表3】
【0025】
【表4】
【0026】
【表5】
【0027】
【表6】
【0028】
【表7】
【0029】
【表8】
【0030】
【表9】
【0031】
【表10】
【0032】
【表11】
【0033】
本発明の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドは、固相合成法、液相合成法などの公知の化学合成法で製造することができる。アミノ基の保護基としてＢｏｃ（ｔ－ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）またはＦｍｏｃ（９－ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）を適用した固相合成法が特に好ましい。本発明の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドは、市販のペプチド合成機を用いた固相合成法により、所望するアミノ酸配列のペプチド鎖を合成することができる。
【0034】
また、本発明の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドは、遺伝子工学的手法によって生合成することができる。すなわち、所望する疎水性αヘリックス領域を有するペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（ＡＴＧ開始コドンを含む。）のポリヌクレオチドを合成する。そして、合成したポリヌクレオチドと前記アミノ酸配列を宿主細胞内で発現させるための種々の調節エレメント（プロモーター、リボゾーム結合部位、ターミネーター、エンハンサー、発現レベルを制御する種々のシスエレメントを包含する。）とからなる発現用遺伝子構築物を有する組換えベクターを、宿主細胞に応じて構築する。
【0035】
一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞に導入し、最適な条件で宿主細胞または宿主細胞を含む組織や個体を培養することで、目的とするペプチドを細胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞（分泌された場合は培地中）からペプチドを単離し、必要に応じてリフォールディング、精製等を行うことによって、目的の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドを得ることができる。
【0036】
また、本発明の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドは、無細胞タンパク質合成システムによっても合成することができる。
【0037】
ウイルスのアミノ酸配列を元に、膜タンパク質であるかどうかの判別や、膜貫通領域を予測するツールとして、ＳＯＳＵＩまたはＴＭＨＭＭを使用して膜タンパク質の膜貫通領域を予測した。
・ＳＯＳＵＩ １．１１
ＳＯＳＵＩは、アミノ酸配列の疎水性や電荷性等の物理化学的性質に基づき、水溶性の膜タンパク質の識別、膜貫通へリックスの存在予測、膜貫通へリックス位置の識別の予測するためのプログラムである。
・ＴＭＨＭＭ ２．０
ＴＭＨＭＭは、膜タンパク質の膜貫通ヘリックスを予測するためのプログラムである。
・ＳＯＳＵＩ １．１１
ＳＯＳＵＩは、アミノ酸配列の疎水性や電荷性等の物理化学的性質に基づき、水溶性の膜タンパク質の識別、膜貫通へリックスの存在予測、膜貫通へリックス位置の識別の予測するためのプログラムである。
・ＴＭＨＭＭ ２．０
ＴＭＨＭＭは、膜タンパク質の膜貫通ヘリックスを予測するためのプログラムである。
【0038】
Ａｌｐｈａｆｏｌｄ２を使用して立体構造を予測した。
・Ａｌｐｈａｆｏｌｄ２
ＡｌｐｈａＦｏｌｄ（登録商標）２は ＤｅｅｐＭｉｎｄ社が開発したタンパク質立体構造予測プログラムである。
・Ａｌｐｈａｆｏｌｄ２
ＡｌｐｈａＦｏｌｄ（登録商標）２は ＤｅｅｐＭｉｎｄ社が開発したタンパク質立体構造予測プログラムである。
【0039】
本発明の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドの配列情報を用いて、前記疎水性αヘリックス領域の発現の制御による、ニドウイルス目のスパイクタンパク質の膜融合活性阻害剤のスクリーニングを行うことが可能である。
【0040】
本発明の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドの配列情報を用いて、前記疎水性αヘリックス領域の発現の制御による、ニドウイルス目のウイルスのＲＮＡ合成阻害剤のスクリーニングを行うことが可能である。
【0041】
本発明の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドの配列情報を用いて、前記疎水性αヘリックス領域の発現の制御による、ニドウイルス目のウイルス産生を制御することが可能である。
【実施例0042】
以下に、実施例を用いて本発明を詳細に説明する。しかし本発明は、以下の実施例に記載された内容に限定されるものではない。
【0043】
＜ニドウイルス目のウイルス＞
・新型コロナウイルスの臨床株２種（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｗｕｈａｎ株）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｏｍｉｃｒｏｎ株）
＜ＴＭＰＲＳＳ２恒常発現アフリカミドリザル腎臓上皮細胞＞
・ＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞（ＪＣＲＢ細胞バンクより細胞番号ＪＣＲＢ１８１９として細胞分譲することができる。）
・新型コロナウイルスの臨床株２種（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｗｕｈａｎ株）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｏｍｉｃｒｏｎ株）
＜ＴＭＰＲＳＳ２恒常発現アフリカミドリザル腎臓上皮細胞＞
・ＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞（ＪＣＲＢ細胞バンクより細胞番号ＪＣＲＢ１８１９として細胞分譲することができる。）
【0044】
＜フレーム＋１、＋２、＋３＞
・フレーム＋１は、開始コドンからフレームを＋１シフトしたことを示す。同様にフレーム＋２は、開始コドンからフレームを＋２シフトしたことを示し、フレーム＋３は、開始コドンからフレームを＋３シフトしたことを示す。
・フレーム＋１は、開始コドンからフレームを＋１シフトしたことを示す。同様にフレーム＋２は、開始コドンからフレームを＋２シフトしたことを示し、フレーム＋３は、開始コドンからフレームを＋３シフトしたことを示す。
【0045】
[実施例１～４]
＜コロナウイルスの全ゲノム配列解析＞
上記新型コロナウイルスの臨床株２種は、ＴＭＰＲＳＳ２恒常発現アフリカミドリザル腎臓上皮細胞を用いて分離し、汎用の方法で全ゲノム配列解析を行ない、国際塩基配列データベースに登録した（Ｗｕｈａｎ：ＧＩＳＡＩＤ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿４０８６６７、Ｏｍｉｃｒｏｎ：ＧＩＳＡＩＤ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿７４１８０１７）。
＜コロナウイルスの全ゲノム配列解析＞
上記新型コロナウイルスの臨床株２種は、ＴＭＰＲＳＳ２恒常発現アフリカミドリザル腎臓上皮細胞を用いて分離し、汎用の方法で全ゲノム配列解析を行ない、国際塩基配列データベースに登録した（Ｗｕｈａｎ：ＧＩＳＡＩＤ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿４０８６６７、Ｏｍｉｃｒｏｎ：ＧＩＳＡＩＤ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿７４１８０１７）。
【0046】
＜ゲノム配列解析による疎水性αヘリックス領域を有するペプチドのコードの特定＞
得られた新型コロナウイルスの臨床株２種（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｗｕｈａｎ株）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｏｍｉｃｒｏｎ株）の全ゲノム配列の解析の結果と、データベースに登録されている近縁コウモリコロナウイルスの２種（ＲａＴＧ１３株、ＢＡＮＡＬ５２株）のデータの全ゲノム配列から、選択した読み枠のタンパク質構造予測を行った。
その結果、主要なウイルスタンパク質のＯＲＦと重複した読み枠に、疎水性の短いαヘリックス領域を有するペプチドが多数コードされていることがわかった（図３）。
得られた新型コロナウイルスの臨床株２種（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｗｕｈａｎ株）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｏｍｉｃｒｏｎ株）の全ゲノム配列の解析の結果と、データベースに登録されている近縁コウモリコロナウイルスの２種（ＲａＴＧ１３株、ＢＡＮＡＬ５２株）のデータの全ゲノム配列から、選択した読み枠のタンパク質構造予測を行った。
その結果、主要なウイルスタンパク質のＯＲＦと重複した読み枠に、疎水性の短いαヘリックス領域を有するペプチドが多数コードされていることがわかった（図３）。
【0047】
図２において、フレーム＋３中のボックスは、２０アミノ酸以上のすべてのＯＲＦを示す。斜線で示したボックスは、それぞれＳＯＳＵＩ１．１１によって予測された一次および二次膜貫通のαへリックスを示す。フレーム+２に示された灰色のボックスは、主要なウイルスタンパク質であるスパイクタンパク質を示す。
【0048】
図３において、Ｗｕｈａｎは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、Ｏｍｉｃｒｏｎは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＲａＴＧ１３は、近縁コウモリコロナウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ ｗｉｔｈ ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ ＭＮ９９６５３２．２、ＢＡＮＡＬ５は、近縁コウモリコロナウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ ｗｉｔｈ ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ ＭＺ９３７０００）である。
【0049】
上記の通り、疎水性αヘリックス領域を有するペプチドをコードすることが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む他のコロナウイルスにも共通していることがわかった。同様の短い疎水性αヘリックス領域を有するペプチドは、ニドウイルス目のウイルスゲノムに共通して観察された（ｄａｔａ ｎｏｔ ｓｈｏｗｎ）。トランスクリプトーム解析（１）から、これらのペプチドの多くは非正規ｓｇＲＮＡの最初のＯＲＦにコードされており、したがって翻訳可能であった。
【0050】
このような重複読み枠にコードされる短いペプチドの中でも、Ｓ遺伝子に観察される最初のＯＲＦ（図２の最も左側にある斜線の四角。２ｂまたはｉＯＲＦ１と呼ぶ。）から合成される３９アミノ酸長のペプチドを発現させ、宿主Ｔ細胞免疫によって検出させた。
【0051】
[実施例５]
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ遺伝子の塩基位置２１９３３～２２１９６（図２の２ｃ）にコードされる比較的長いペプチド（８７アミノ酸、配列番号１）を使用した。
このペプチドは、ごく僅かではあるが非正規ｓｇＲＮＡを用いて翻訳される可能性が示されており、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ遺伝子がコードするものの中で最も大きく、そして、近縁のコウモリコロナウイルスで保存されている（図３）。
ＳＯＳＵＩ１．１１とＴＭＨＭＭ２．０の両プログラムは、２ｃが３つの膜貫通αヘリックスを有することを予測した（図２）。また、Ａｌｐｈａｆｏｌｄ（登録商標）２による立体構造予測もこの結果を支持した（図４）。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ遺伝子の塩基位置２１９３３～２２１９６（図２の２ｃ）にコードされる比較的長いペプチド（８７アミノ酸、配列番号１）を使用した。
このペプチドは、ごく僅かではあるが非正規ｓｇＲＮＡを用いて翻訳される可能性が示されており、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ遺伝子がコードするものの中で最も大きく、そして、近縁のコウモリコロナウイルスで保存されている（図３）。
ＳＯＳＵＩ１．１１とＴＭＨＭＭ２．０の両プログラムは、２ｃが３つの膜貫通αヘリックスを有することを予測した（図２）。また、Ａｌｐｈａｆｏｌｄ（登録商標）２による立体構造予測もこの結果を支持した（図４）。
【0052】
＜膜融合阻害効果＞
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－２ｃペプチドによる膜融合阻害実験
コドン最適化をしたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｗｕｈａｎ株由来Ｓｐｉｋｅタンパク質遺伝子（Ｓ遺伝子と略記する場合あり。）をクローニングした（ｐＣＡＧＧＳ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓと命名）。同様に、ｐＣＡＧＧＳプラスミドに緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子（ｐＣＡＧＧＳ－ＧＦＰと命名）、およびＨＡエピトープタグをＮ末端側に付加したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｅｌｔａ株由来２ｃペプチド遺伝子（ｐＣＡＧＧＳ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－２ｃと命名）をそれぞれ哺乳細胞発現プラスミドｐＣＡＧＧＳにクローニングした。麻しんウイルスのＦ遺伝子（ｐＣＡ７－ＩＣＦと命名）およびＨ遺伝子（ｐＣＡ７－ＩＣＨと命名）は、哺乳細胞発現プラスミドであるｐＣＡＧＧＳの派生物であるｐＣＡ７にそれぞれクローニングした。
ＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞を６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度になるように調製し、カバーガラスを入れた６ウェルプレートに播種した。３７℃、５％ＣＯ２条件下にてオーバーナイトで培養した。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ １００μｌに対し、０．１μｇのｐＣＡＧＧＳ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓおよび２μｇのｐＣＡＧＧＳ－ＧＦＰあるいは２μｇのｐＣＡＧＧＳ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－２ｃをそれぞれ加え、別々に調製した。同様にＯｐｔｉ－ＭＥＭ １００μｌに対し、２μｇのｐＣＡ７－ＩＣＦ、２μｇのｐＣＡ７－ＩＣＨおよび２μｇのｐＣＡＧＧＳ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－２ｃを混和した。リポフェクション試薬であるＴｒａｎｓＩＴ－ＬＴ１を３μｌそれぞれ添加し、１５分間室温でインキュベートした。１５分後、ＤＮＡ－リポフェクション試薬の複合体を細胞へ滴下し、３７℃、５％ＣＯ２条件下にて２日間培養した。
スパイクタンパク質発現による細胞の膜融合（合胞体）を倒立顕微鏡で確認した後、ＰＢＳで細胞を洗浄し、１０％ホルマリン溶液を加えて室温にて１０分間細胞を固定した。ＰＢＳで洗浄後、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００含有ＰＢＳを加えて、１０分間透過処理を行った。ＰＢＳで洗浄して、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅで室温にて３０分間ブロッキングした。細胞内に発現しているスパイクタンパク質、２ｃペプチド、麻しんウイルスＦタンパク質をウサギ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－スパイクタンパク質ポリクローナル抗体（１：３００）、抗マウスＨＡモノクローナル抗体（１：１００）あるいは抗ウサギＨＡポリクローナル抗体（１：１００）、マウス抗麻しんＦモノクローナル抗体（１：３００）でそれぞれ一次抗体として反応させた後、マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８あるいはウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４蛍光標識二次抗体で染色した。二次抗体反応後、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍを用いて核を染色して、封入した。乾燥後、共焦点レーザー顕微鏡で蛍光観察した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－２ｃペプチドによる膜融合阻害実験
コドン最適化をしたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｗｕｈａｎ株由来Ｓｐｉｋｅタンパク質遺伝子（Ｓ遺伝子と略記する場合あり。）をクローニングした（ｐＣＡＧＧＳ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓと命名）。同様に、ｐＣＡＧＧＳプラスミドに緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子（ｐＣＡＧＧＳ－ＧＦＰと命名）、およびＨＡエピトープタグをＮ末端側に付加したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｅｌｔａ株由来２ｃペプチド遺伝子（ｐＣＡＧＧＳ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－２ｃと命名）をそれぞれ哺乳細胞発現プラスミドｐＣＡＧＧＳにクローニングした。麻しんウイルスのＦ遺伝子（ｐＣＡ７－ＩＣＦと命名）およびＨ遺伝子（ｐＣＡ７－ＩＣＨと命名）は、哺乳細胞発現プラスミドであるｐＣＡＧＧＳの派生物であるｐＣＡ７にそれぞれクローニングした。
ＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞を６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度になるように調製し、カバーガラスを入れた６ウェルプレートに播種した。３７℃、５％ＣＯ２条件下にてオーバーナイトで培養した。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ １００μｌに対し、０．１μｇのｐＣＡＧＧＳ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓおよび２μｇのｐＣＡＧＧＳ－ＧＦＰあるいは２μｇのｐＣＡＧＧＳ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－２ｃをそれぞれ加え、別々に調製した。同様にＯｐｔｉ－ＭＥＭ １００μｌに対し、２μｇのｐＣＡ７－ＩＣＦ、２μｇのｐＣＡ７－ＩＣＨおよび２μｇのｐＣＡＧＧＳ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－２ｃを混和した。リポフェクション試薬であるＴｒａｎｓＩＴ－ＬＴ１を３μｌそれぞれ添加し、１５分間室温でインキュベートした。１５分後、ＤＮＡ－リポフェクション試薬の複合体を細胞へ滴下し、３７℃、５％ＣＯ２条件下にて２日間培養した。
スパイクタンパク質発現による細胞の膜融合（合胞体）を倒立顕微鏡で確認した後、ＰＢＳで細胞を洗浄し、１０％ホルマリン溶液を加えて室温にて１０分間細胞を固定した。ＰＢＳで洗浄後、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００含有ＰＢＳを加えて、１０分間透過処理を行った。ＰＢＳで洗浄して、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅで室温にて３０分間ブロッキングした。細胞内に発現しているスパイクタンパク質、２ｃペプチド、麻しんウイルスＦタンパク質をウサギ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－スパイクタンパク質ポリクローナル抗体（１：３００）、抗マウスＨＡモノクローナル抗体（１：１００）あるいは抗ウサギＨＡポリクローナル抗体（１：１００）、マウス抗麻しんＦモノクローナル抗体（１：３００）でそれぞれ一次抗体として反応させた後、マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８あるいはウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４蛍光標識二次抗体で染色した。二次抗体反応後、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍを用いて核を染色して、封入した。乾燥後、共焦点レーザー顕微鏡で蛍光観察した。
【0053】
［比較例１］
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質をＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞に発現させると、スパイクタンパク質の膜融合活性によって、細胞同士が融合し、多数の核を持った大きな細胞（多核巨細胞、または合胞体という。）が形成された。スパイクタンパク質を、膜融合活性に対する阻害能のない緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）と一緒に発現させると、緑色の蛍光を持つ多核巨細胞が観察できた（図５）。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質をＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞に発現させると、スパイクタンパク質の膜融合活性によって、細胞同士が融合し、多数の核を持った大きな細胞（多核巨細胞、または合胞体という。）が形成された。スパイクタンパク質を、膜融合活性に対する阻害能のない緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）と一緒に発現させると、緑色の蛍光を持つ多核巨細胞が観察できた（図５）。
【0054】
［実施例６］
これに対して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質と２ｃのペプチドとをＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞内で発現させると、スパイクタンパク質と２ｃのペプチドとが相互作用し、スパイクタンパク質による膜融合活性を強く阻害するために、多核巨細胞のサイズが顕著に小さくなっていた（図６）。
これに対して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質と２ｃのペプチドとをＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞内で発現させると、スパイクタンパク質と２ｃのペプチドとが相互作用し、スパイクタンパク質による膜融合活性を強く阻害するために、多核巨細胞のサイズが顕著に小さくなっていた（図６）。
【0055】
［実施例７～１２］
初期に流行した武漢（Ｗｕｈａｎ）株に加えて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の様々な変異株（アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ、オミクロン株）のスパイクタンパク質を用いて、同様の解析を行った。その結果、２ｃのペプチドがいずれのスパイクタンパク質による膜融合阻害活性を阻害することが観察できた（図７）。
初期に流行した武漢（Ｗｕｈａｎ）株に加えて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の様々な変異株（アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ、オミクロン株）のスパイクタンパク質を用いて、同様の解析を行った。その結果、２ｃのペプチドがいずれのスパイクタンパク質による膜融合阻害活性を阻害することが観察できた（図７）。
【0056】
[比較例２]
類似の解析を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の代わりに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とは無関係の麻疹ウイルス（図８）やセンダイウイルス（図９）の膜融合タンパク（Ｆタンパク）を用いて行った。その結果、２ｃペプチドによる膜融合阻害活性は全く見られないため、ＧＦＰを発現させた場合と同様に、大きな多核巨細胞が観察された。
すなわち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の２ｃペプチドが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の膜融合を特異的に阻害する活性があることが示された。
類似の解析を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の代わりに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とは無関係の麻疹ウイルス（図８）やセンダイウイルス（図９）の膜融合タンパク（Ｆタンパク）を用いて行った。その結果、２ｃペプチドによる膜融合阻害活性は全く見られないため、ＧＦＰを発現させた場合と同様に、大きな多核巨細胞が観察された。
すなわち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の２ｃペプチドが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の膜融合を特異的に阻害する活性があることが示された。
【0057】
[実施例１３]
＜ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ遺伝子の２ｃ以外のペプチドの解析＞
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ遺伝子の他のＨＡＨＰ（２ｄ、２ｅ、２ｆ、および２ｇペプチド）のＳ遺伝子上の位置を図１０に示し、アミノ酸配列を図１１に示した。２ｃペプチドと同様の膜融合阻害活性実験を行ったところ、２ｆならびに２ｇペプチドにもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の膜融合活性を阻害する機能があり、スパイクタンパク質による多核巨細胞の形成が著しく弱められることが確認できた（図１２）。また、２ｇペプチドに関しては、麻疹ウイルスやセンダイウイルスの膜融合活性は抑えないことがわかった。すなわち、２ｃペプチドと同様に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質を特異的に阻害することがわかった（図１３）。
＜ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ遺伝子の２ｃ以外のペプチドの解析＞
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ遺伝子の他のＨＡＨＰ（２ｄ、２ｅ、２ｆ、および２ｇペプチド）のＳ遺伝子上の位置を図１０に示し、アミノ酸配列を図１１に示した。２ｃペプチドと同様の膜融合阻害活性実験を行ったところ、２ｆならびに２ｇペプチドにもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の膜融合活性を阻害する機能があり、スパイクタンパク質による多核巨細胞の形成が著しく弱められることが確認できた（図１２）。また、２ｇペプチドに関しては、麻疹ウイルスやセンダイウイルスの膜融合活性は抑えないことがわかった。すなわち、２ｃペプチドと同様に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質を特異的に阻害することがわかった（図１３）。
【0058】
［実施例１４］
ＭＥＲＳ－ＣｏＶ Ｓ遺伝子のＨＡＨＰ（ＭＥＲＳ－２ｃ、－２ｄ、－２ｅ、－２ｆ、－２ｇ、２ｈペプチド）のＳ遺伝子上の位置）を図１４に、アミノ酸配列を図１５に示す。ＭＥＲＳ－ＣｏＶのスパイクタンパク質を用いた膜融合阻害活性実験を行ったところ、ＭＥＲＳ－２ｃ、－２ｄ、－２ｅ、－２ｆペプチドが、ＭＥＲＳ－ＣｏＶのスパイクタンパク質の膜融合活性を阻害する機能があり、ＭＥＲＳ－ＣｏＶのスパイクタンパク質による多核巨細胞の形成が著しく弱められることが確認できた（図１６）。このうちＭＥＲＳ－２ｃ、－２ｅ、－２ｆペプチドは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ－Ｓと細胞内で共局在しており（図１７）、直接的な相互作用が示唆された。すなわち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＨＡＨＰで観察された膜融合活性の抑制機能は、他のコロナウイルスでも同様であることがわかった。
ＭＥＲＳ－ＣｏＶ Ｓ遺伝子のＨＡＨＰ（ＭＥＲＳ－２ｃ、－２ｄ、－２ｅ、－２ｆ、－２ｇ、２ｈペプチド）のＳ遺伝子上の位置）を図１４に、アミノ酸配列を図１５に示す。ＭＥＲＳ－ＣｏＶのスパイクタンパク質を用いた膜融合阻害活性実験を行ったところ、ＭＥＲＳ－２ｃ、－２ｄ、－２ｅ、－２ｆペプチドが、ＭＥＲＳ－ＣｏＶのスパイクタンパク質の膜融合活性を阻害する機能があり、ＭＥＲＳ－ＣｏＶのスパイクタンパク質による多核巨細胞の形成が著しく弱められることが確認できた（図１６）。このうちＭＥＲＳ－２ｃ、－２ｅ、－２ｆペプチドは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ－Ｓと細胞内で共局在しており（図１７）、直接的な相互作用が示唆された。すなわち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＨＡＨＰで観察された膜融合活性の抑制機能は、他のコロナウイルスでも同様であることがわかった。
【0059】
［比較例３］
一方、ＭＥＲＳ－２ｃ、－２ｄ、－２ｅ、および－２ｆのペプチドは、麻疹ウイルスの膜融合活性を阻害しないことがわかった（図１８）。
一方、ＭＥＲＳ－２ｃ、－２ｄ、－２ｅ、および－２ｆのペプチドは、麻疹ウイルスの膜融合活性を阻害しないことがわかった（図１８）。
【0060】
[実施例１５]
＜ＭＥＲＳ－ＣｏＶ－ＨＡＨＰによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜融合阻害＞
ＭＥＲＳ－ＣｏＶのスパイクタンパク質の膜融合活性を阻害したＭＥＲＳ－ＣｏＶ由来ＨＡＨＰ（ＭＥＲＳ－２ｃ、－２ｄ、－２ｅ、－２ｆペプチド）のうち、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ－Ｓと共局在した３つ（ＭＥＲＳ－２ｃ、－２ｅ、－２ｆペプチド）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質とも相互作用（共局在）し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質による膜融合（多核巨細胞形成）を強く阻害した（図１９）。
＜ＭＥＲＳ－ＣｏＶ－ＨＡＨＰによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜融合阻害＞
ＭＥＲＳ－ＣｏＶのスパイクタンパク質の膜融合活性を阻害したＭＥＲＳ－ＣｏＶ由来ＨＡＨＰ（ＭＥＲＳ－２ｃ、－２ｄ、－２ｅ、－２ｆペプチド）のうち、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ－Ｓと共局在した３つ（ＭＥＲＳ－２ｃ、－２ｅ、－２ｆペプチド）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質とも相互作用（共局在）し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質による膜融合（多核巨細胞形成）を強く阻害した（図１９）。
【0061】
[実施例１６]
＜ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＨＡＨＰによるＭＥＲＳ－ＣｏＶ膜融合阻害＞
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の膜融合活性を阻害したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＨＡＨＰ（２ｃ、２ｆ、２ｇペプチド）のうち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－２ｃ、－２ｇペプチドが、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ－Ｓによる膜融合（多核巨細胞形成）を強く阻害することがわかった（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－２ｆについては未解析）（図１０）。このうちの２ｃは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ－Ｓと細胞内で共局在した（図２０）。
＜ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＨＡＨＰによるＭＥＲＳ－ＣｏＶ膜融合阻害＞
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の膜融合活性を阻害したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＨＡＨＰ（２ｃ、２ｆ、２ｇペプチド）のうち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－２ｃ、－２ｇペプチドが、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ－Ｓによる膜融合（多核巨細胞形成）を強く阻害することがわかった（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－２ｆについては未解析）（図１０）。このうちの２ｃは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ－Ｓと細胞内で共局在した（図２０）。
【0062】
上記の結果から、これらの膜融合阻害ＨＡＨＰは、コロナウイルス全般に対して効果がある可能性が示された。これまでの予測では、ＨＡＨＰは、膜貫通型疎水性アルファヘリックスを有すると考えられ、膜融合阻害はスパイクタンパク質の膜貫通領域に相互作用することによる可能性が高い。コロナウイルスのスパイクタンパク質の膜貫通領域の脂質二重膜のＯｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅと相互作用する領域のアミノ酸配列は高度に保存されていることがアミノ酸配列比較からわかった（図２１）。
【0063】
［実施例１７］
＜ＨＡＨＰの他の機能（ウイルスＲＮＡ合成の阻害＞
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のレプリコン細胞（細胞内でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ合成だけが行われている細胞：山梨医大から分与）を用いて、ウイルスＲＮＡの合成を行った。
＜ＨＡＨＰの他の機能（ウイルスＲＮＡ合成の阻害＞
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のレプリコン細胞（細胞内でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ合成だけが行われている細胞：山梨医大から分与）を用いて、ウイルスＲＮＡの合成を行った。
【0064】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の２ｃによるＲＮＡ合成阻害実験を以下の通りに行った。
ＨＡエピトープタグをＮ末端側に付加したＤｅｌｔａ株由来ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－２ｃ、２ｅ、２ｆ、２ｇペプチド遺伝子（ｐＣＡＧＧＳ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－２ｃ、－２ｅ、－２ｆ、－２ｇとそれぞれ命名）を哺乳細胞発現プラスミドｐＣＡＧＧＳにそれぞれクローニングした。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡを合成するレプリコン細胞であるＶｅｒｏＥ６／Ｒｅｐ３細胞を６×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度になるように調製し、カバーガラスを入れた６ウェルプレートに播種した。３７℃、５％ＣＯ２条件下にてオーバーナイトで培養した。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ １００μｌに対し、２μｇのｐＣＡＧＧＳ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－２ｃ、－２ｅ、－２ｆ、－２ｇをそれぞれ加え、別々に調製した。リポフェクション試薬であるＴｒａｎｓＩＴ－ＬＴ１を３μｌそれぞれ添加し、１５分間室温でインキュベートした。１５分後、ＤＮＡ－リポフェクション試薬の複合体を細胞へ滴下し、３７℃、５％ＣＯ２条件下にて２日間培養した。培養後、ＰＢＳで細胞を洗浄し、１０％ホルマリン溶液を加えて室温にて１０分間細胞を固定した。ＰＢＳで洗浄後、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００含有ＰＢＳを加えて、１０分間透過処理を行った。ＰＢＳで洗浄して、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅでブロッキングした。細胞内に発現しているウイルスＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）および各種ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドをマウス抗ｄｓＲＮＡモノクローナル抗体（１：２００）および抗ウサギＨＡポリクローナル抗体（１：１００）でそれぞれ一次抗体として反応させた後、マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４あるいはウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８蛍光標識二次抗体で染色した。二次抗体反応後、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍを用いて核を染色し、封入した。乾燥後、共焦点レーザー顕微鏡で蛍光観察した。
ＨＡエピトープタグをＮ末端側に付加したＤｅｌｔａ株由来ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－２ｃ、２ｅ、２ｆ、２ｇペプチド遺伝子（ｐＣＡＧＧＳ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－２ｃ、－２ｅ、－２ｆ、－２ｇとそれぞれ命名）を哺乳細胞発現プラスミドｐＣＡＧＧＳにそれぞれクローニングした。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡを合成するレプリコン細胞であるＶｅｒｏＥ６／Ｒｅｐ３細胞を６×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度になるように調製し、カバーガラスを入れた６ウェルプレートに播種した。３７℃、５％ＣＯ２条件下にてオーバーナイトで培養した。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ １００μｌに対し、２μｇのｐＣＡＧＧＳ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－２ｃ、－２ｅ、－２ｆ、－２ｇをそれぞれ加え、別々に調製した。リポフェクション試薬であるＴｒａｎｓＩＴ－ＬＴ１を３μｌそれぞれ添加し、１５分間室温でインキュベートした。１５分後、ＤＮＡ－リポフェクション試薬の複合体を細胞へ滴下し、３７℃、５％ＣＯ２条件下にて２日間培養した。培養後、ＰＢＳで細胞を洗浄し、１０％ホルマリン溶液を加えて室温にて１０分間細胞を固定した。ＰＢＳで洗浄後、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００含有ＰＢＳを加えて、１０分間透過処理を行った。ＰＢＳで洗浄して、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅでブロッキングした。細胞内に発現しているウイルスＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）および各種ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドをマウス抗ｄｓＲＮＡモノクローナル抗体（１：２００）および抗ウサギＨＡポリクローナル抗体（１：１００）でそれぞれ一次抗体として反応させた後、マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４あるいはウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８蛍光標識二次抗体で染色した。二次抗体反応後、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍを用いて核を染色し、封入した。乾燥後、共焦点レーザー顕微鏡で蛍光観察した。
【0065】
本レプリコン細胞内に、ＲＮＡ合成小胞（Ｄｏｕｂｌｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｖｅｓｉｃｌｅ ［ＤＭＶ］）が形成され、その中にはＲＮＡ複製（合成）過程に生じるｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）のドットが検出された（図２２）。
【0066】
【産業上の利用可能性】
【0067】
このような重複読み枠内の短いＯＲＦの多くは、従来のコロナウイルス遺伝学では翻訳不可能と考えられていたが、非正規のｓｇＲＮＡを用いて理論的に翻訳され、発現することが可能である。
少なくとも本明細書においては、重複読み枠にあるＯＲＦがコードする短いαヘリックス領域を有する短ペプチドの１つがスパイクタンパク質と特異的に相互作用し、細胞融合を阻害する能力、ウイルスＲＮＡ合成の阻害活性を有することを初めて明らかにした。このデータは、これら多数の疎水性αヘリックス領域を有する短ペプチドが、ウイルスの増殖に役割を果たしている可能性を示唆している。また、コロナウイルス対策として有効な抗ウイルスペプチドを発見するための基礎となる可能性がある。
本発明の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドを用いることで、スパイクタンパク質の膜貫通領域と類似の配列を有するウイルスおよびウイルスゲノムの複製の場としてＤＭＶを利用するウイルスに対しても、広範に膜融合およびウイルスＲＮＡの合成を抑制できる可能性があることから、該ペプチドを含有する予防剤、治療薬の開発の可能性がある。
少なくとも本明細書においては、重複読み枠にあるＯＲＦがコードする短いαヘリックス領域を有する短ペプチドの１つがスパイクタンパク質と特異的に相互作用し、細胞融合を阻害する能力、ウイルスＲＮＡ合成の阻害活性を有することを初めて明らかにした。このデータは、これら多数の疎水性αヘリックス領域を有する短ペプチドが、ウイルスの増殖に役割を果たしている可能性を示唆している。また、コロナウイルス対策として有効な抗ウイルスペプチドを発見するための基礎となる可能性がある。
本発明の疎水性αヘリックス領域を有するペプチドを用いることで、スパイクタンパク質の膜貫通領域と類似の配列を有するウイルスおよびウイルスゲノムの複製の場としてＤＭＶを利用するウイルスに対しても、広範に膜融合およびウイルスＲＮＡの合成を抑制できる可能性があることから、該ペプチドを含有する予防剤、治療薬の開発の可能性がある。
【符号の説明】
【0068】
Ｅ：エンベロープタンパク質
Ｓ：スパイクタンパク質
Ｍ：膜タンパク質
Ｎ：ヌクレオカプシドタンパク質
Ｓ：スパイクタンパク質
Ｍ：膜タンパク質
Ｎ：ヌクレオカプシドタンパク質
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【配列表】