特開 2023-178881 ナノディスクに対する高親和性抗ＭＳＰモノクローナル抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023178881

(43)【公開日】2023-12-18

(54)【発明の名称】ナノディスクに対する高親和性抗ＭＳＰモノクローナル抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/12 20060101AFI20231211BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20231211BHJP

   C07K 17/00 20060101ALI20231211BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20231211BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20231211BHJP

   C12N 15/31 20060101ALN20231211BHJP

【ＦＩ】

C07K16/12

C12P21/08 ZNA

C07K17/00

G01N33/53 D

C12N15/13

C12N15/31

【審査請求】未請求

【請求項の数】9

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022091842

(22)【出願日】2022-06-06

(71)【出願人】

【識別番号】304021831

【氏名又は名称】国立大学法人千葉大学

(74)【代理人】

【識別番号】100120031

【弁理士】

【氏名又は名称】宮嶋 学

(74)【代理人】

【識別番号】100120617

【弁理士】

【氏名又は名称】浅野 真理

(74)【代理人】

【識別番号】100126099

【弁理士】

【氏名又は名称】反町 洋

(72)【発明者】

【氏名】村田 武士

(72)【発明者】

【氏名】小笠原 諭

(72)【発明者】

【氏名】中川 史

【テーマコード（参考）】

4B064

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG26

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC15

4B064CC24

4B064CE02

4B064CE03

4B064CE06

4B064CE12

4B064DA13

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA50

4H045FA74

4H045GA10

4H045GA15

4H045GA26

(57)【要約】      （修正有）

【課題】ナノディスクを構成しているＭＳＰに対して高い親和性を示す抗ＭＳＰ抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【解決手段】膜骨格タンパク質（ＭＳＰ）に対するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、ＭＳＰがナノディスクを構成しているＭＳＰであり、特定のアミノ酸配列に示すアミノ酸配列のうち第８３位のプロリン残基からまでの配列と９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをエピトープとして認識する、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

膜骨格タンパク質（ＭＳＰ）に対するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、ＭＳＰがナノディスクを構成しているＭＳＰであり、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち第８３位のプロリン残基から第９４位のグルタミン酸残基までの配列と９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをエピトープとして認識する、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。

【請求項2】

膜骨格タンパク質（ＭＳＰ）に対するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、ＭＳＰがナノディスクを構成しているＭＳＰであり、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち第８３位のプロリン残基から第９４位のグルタミン酸残基までのアミノ酸配列を含むポリペプチドをエピトープとして認識する、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。

【請求項3】

ＭＳＰが、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するＭＳＰ１Ｄ１、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するＭＳＰ１、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するＭＳＰ１Ｅ３Ｄ１、または配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するＭＳＰ２Ｎ２である、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。

【請求項4】

ナノディスクを構成しているＭＳＰとの相互作用の平衡解離定数（ＫＤ）が７．００ｎＭ以下である、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。

【請求項5】

２０２２年４月２７日に独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）に寄託された、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ－０３６３６を有するハイブリドーマ細胞により産生される、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。

【請求項6】

請求項５に記載のモノクローナル抗体が結合するエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片。

【請求項7】

請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片が固体支持体に固定化されてなる、固定化抗体。

【請求項8】

膜タンパク質と測定対象物の相互作用を評価する方法であって、
（ａ）固体支持体表面に、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片を固定化する工程、
（ｂ）以下の成分を含んでなり、かつ少なくとも以下の成分により構成される、ナノディスクを、工程（ａ）により固定化した固体支持体に接触させる工程、
（ｉ）ＭＳＰ
（ｉｉ）脂質、および
（ｉｉｉ）膜タンパク質、
（ｃ）工程（ｂ）により得られたナノディスクと固体支持体の複合体に測定対象物を接触させる工程、ならびに
（ｄ）膜タンパク質と測定対象物の相互作用を測定する工程
を含んでなる、方法。

【請求項9】

膜タンパク質と相互作用する物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）固体支持体表面に、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片を固定化する工程、
（ｂ）以下の成分を含んでなり、かつ少なくとも以下の成分により構成される、ナノディスクを、工程（ａ）により固定化した固体支持体に接触させる工程、
（ｉ）ＭＳＰ
（ｉｉ）脂質、および
（ｉｉｉ）前記膜タンパク質、
（ｃ）工程（ｂ）により得られたナノディスクと固体支持体の複合体に候補物質を接触させる工程、ならびに、
（ｄ）前記膜タンパク質と相互作用を示した候補物質を、膜タンパク質と相互作用する物質と評価する工程、
を含んでなる、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ナノディスクに対する高親和性抗ＭＳＰモノクローナル抗体に関する。

【背景技術】

【0002】

膜タンパク質とそのリガンドの相互作用に関する研究は、例えば、薬のシーズ探索への活用等が期待されることから、特に創薬の分野において中心的であり、重要な役割を担っている。

【0003】

膜タンパク質は、その活性を通じて、例えば、シナプス伝達調節、酵素触媒作用、シグナル伝達、免疫応答等の制御に関与しており、多くの細胞プロセスにおいて中心的な役割を果たしている。

【0004】

膜タンパク質を研究等に用いるために、従来より、界面活性剤を用いた膜タンパク質の単離・精製が行われていたが、この手法によると界面活性剤の存在により、膜タンパク質を取り囲んでいる界面活性剤と界面活性剤ミセルの間で絶えず交換される動的な環境が形成される。この動的な環境は天然環境とは大きく異なることから、膜タンパク質が同じであっても、その置かれた環境によって異なる性質を示し得る。したがって、界面活性剤の存在下では、生体内の環境を反映した測定の実施が困難であるという問題があった。

【0005】

この問題を解消するため、近年では、膜タンパク質の構造・機能解析を飛躍的に進歩させたモデルであるナノディスクを用いた研究が注目され、盛んに行われている。ナノディスクとはＭＳＰ（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｐｒｏｔｅｉｎ：膜骨格タンパク質）によって脂質二重層と膜タンパク質を取り囲むことで構成される自己組織化粒子である。膜タンパク質によって膜貫通ヘリックスの数が異なるため、それに合わせて異なるサイズのＭＳＰを使う必要があるが、ＭＳＰはその配列をリピートさせた変異体が数多く知られており長さの異なるＭＳＰを必要に応じて調製することが可能であるため、あらゆるサイズの膜タンパク質をナノディスクへ再構成することが可能である。

【0006】

ナノディスクを使用することで、生体内における膜タンパク質が置かれた環境を模倣可能である。また、ナノディスクへ再構成された膜タンパク質は一般的に界面活性剤で精製されたタンパク質よりも安定であり、界面活性剤を含まない方法で調製可能である。このナノディスク技術によって、ＳＰＲ法（表面プラズモン共鳴法）やＢＬＩ法（バイオレイヤー干渉法）等による分子間相互作用の測定が可能になった。

【0007】

ＳＰＲ法やＢＬＩ法によると、膜タンパク質に対するリガンドの結合様式を特徴づけることが可能である。ＳＰＲ法やＢＬＩ法による、ナノディスクへ再構成された膜タンパク質の対リガンドの評価は、一般にナノディスクを測定機器におけるセンサーチップ表面に固定化することにより行われる。

【0008】

センサーチップへの固定化としては、一般的に、タグを媒介して抗タグ抗体を用いた固定化、ヒスチジンタグに対してＮｉ－ＮＴＡを用いた固定化、ビオチン－アビジンを用いた固定化、抗膜タンパク抗体を用いた固定化等が知られている（非特許文献１）が、それらはコストや汎用性等において欠点を有している。

【0009】

タグを媒介する固定化は膜タンパク質の固定に配向性をもたらすため、膜タンパク質の細胞外領域または細胞内領域と低分子との結合を阻害する可能性があるという問題がある。

【0010】

Ｎｉ－ＮＴＡを用いた固定化はヒスチジンタグ（Ｈｉｓ－ｔａｇ）を介して固定化できる簡便な手法であるが、非特異結合が多い、親和性が低く結合が不安定であるという問題がある。

【0011】

センサーチップ表面に固定化するために、ＥＤＣ／ＮＨＳ処理によるアミンカップリング反応を用いて、膜タンパク質／ＭＳＰ内のリジン残基と共有結合させるといった手法も知られているが、この手法にはセンサーチップの再生が不可能になるという問題や、膜タンパク質内のリガンド結合に関与する残基に影響する可能性があるという問題がある。

【0012】

ビオチン－アビジンを用いた固定化は特異性が高く、ナノディスクを強力に捕捉できるが、ビオチン化に工数を要するという問題に加えて、センサーチップの再生が不可能であり実験ごとに新しいセンサーチップを購入して使用する必要があることから、測定に莫大なコストがかかるという問題もある。

【0013】

膜タンパク抗体を用いた固定化は、特異的かつ強固にナノディスクを補足することが可能で、再生も容易であるが、それぞれの膜タンパク質に対する抗体を作製する必要があることから多数の膜タンパク質を標的とすると、測定に莫大な時間やコストがかかるという問題がある。

【0014】

一方で、ナノディスクに対する抗体を用いた固定化であれば、標的となる膜タンパク質によらず様々なナノディスクの固定化が可能であるという利点があり、抗体を用いるためセンサーチップの再生も容易であり、ハイスループットな測定を可能にするという利点もある。したがって、ナノディスクを構成するＭＳＰに対する抗体を用いることにより、従来より簡便かつ効率的に膜タンパク質の分子間相互作用を解析できる可能性がある。そのため、ＭＳＰに対して高い親和性を示す抗体、特にナノディスクを構成しているＭＳＰに対して高い親和性を示す抗体が求められている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0015】

【非特許文献1】https://doi.org/10.1002/0471140864.ps2913s81

【発明の概要】

【0016】

本発明者らは、特定のアミノ酸配列を含むポリペプチドをエピトープとして認識するモノクローナル抗体が、ナノディスクを構成しているＭＳＰに対して高い親和性を示すことを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。

【0017】

したがって、本発明は、ナノディスクを構成しているＭＳＰに対して高い親和性を示す抗ＭＳＰ抗体またはその抗原結合断片を提供する。

【0018】

本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）膜骨格タンパク質（ＭＳＰ）に対するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、ＭＳＰがナノディスクを構成しているＭＳＰであり、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち第８３位のプロリン残基から第９４位のグルタミン酸残基までの配列と９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをエピトープとして認識する、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
（２）膜骨格タンパク質（ＭＳＰ）に対するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、ＭＳＰがナノディスクを構成しているＭＳＰであり、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち第８３位のプロリン残基から第９４位のグルタミン酸残基までのアミノ酸配列を含むポリペプチドをエピトープとして認識する、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
（３）ＭＳＰが、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するＭＳＰ１Ｄ１、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するＭＳＰ１、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するＭＳＰ１Ｅ３Ｄ１、または配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するＭＳＰ２Ｎ２である、（１）または（２）に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
（４）ナノディスクを構成しているＭＳＰとの相互作用の平衡解離定数（ＫＤ）が７．００ｎＭ以下である、（１）～（３）のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
（５）２０２２年４月２７日に独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）に寄託された、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ－０３６３６を有するハイブリドーマ細胞により産生される、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
（６）（５）に記載のモノクローナル抗体が結合するエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片。
（７）（１）～（６）のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片が固体支持体に固定化されてなる、固定化抗体。
（８）膜タンパク質と測定対象物の相互作用を評価する方法であって、
（ａ）固体支持体表面に、（１）～（６）のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を固定化する工程、
（ｂ）以下の成分を含んでなり、かつ少なくとも以下の成分により構成される、ナノディスクを、工程（ａ）により固定化した固体支持体に接触させる工程、
（ｉ）ＭＳＰ
（ｉｉ）脂質、および
（ｉｉｉ）膜タンパク質、
（ｃ）工程（ｂ）により得られたナノディスクと固体支持体の複合体に測定対象物を接触させる工程、ならびに
（ｄ）膜タンパク質と測定対象物の相互作用を測定する工程
を含んでなる、方法。
（９）膜タンパク質と相互作用する物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）固体支持体表面に、（１）～（６）のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を固定化する工程、
（ｂ）以下の成分を含んでなり、かつ少なくとも以下の成分により構成される、ナノディスクを、工程（ａ）により固定化した固体支持体に接触させる工程、
（ｉ）ＭＳＰ
（ｉｉ）脂質、および
（ｉｉｉ）前記膜タンパク質、
（ｃ）工程（ｂ）により得られたナノディスクと固体支持体の複合体に候補物質を接触させる工程、ならびに、
（ｄ）前記膜タンパク質と相互作用を示した候補物質を、膜タンパク質と相互作用する物質と評価する工程、
を含んでなる、方法。

【0019】

本発明によれば、ナノディスクを構成しているＭＳＰに対して高い親和性を示す抗ＭＳＰ抗体またはその抗原結合断片を提供することが可能である。また、本発明の抗ＭＳＰ抗体またはその抗原結合断片が固体支持体に固定化された、固定化抗体を提供することも可能である。加えて、本発明の抗ＭＳＰ抗体またはその抗原結合断片を用いた、膜タンパク質と測定対象物の相互作用を評価する方法を提供することも可能である。さらに、本発明の抗ＭＳＰ抗体またはその抗原結合断片を用いた、膜タンパク質と相互作用する物質をスクリーニングする方法を提供することも可能である。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】図１は、ＭＳＰタンパク質（ＭＳＰ１Ｄ１、ＭＳＰ１、ＭＳＰ１Ｅ３Ｄ１、およびＭＳＰ２Ｎ２）の２次構造を表す。

【図2】図２は、抗ＭＳＰタンパク質モノクローナル抗体の各クローンの、エピトープの各部位に対する親和性についての評価した結果を表す。

【図3】図３は、抗ＭＳＰタンパク質モノクローナル抗体の各クローンのエピトープの最小単位について評価した結果を表す。

【図4】図４は、抗ＭＳＰタンパク質モノクローナル抗体の各クローンのエピトープの最小単位について評価した結果を表す。

【図5】図５は、抗ＭＳＰタンパク質モノクローナル抗体を用いた、各膜タンパク質とそのリガンドの分子間相互作用の評価結果を表す。

【発明の具体的説明】

【0021】

本発明によれば、膜骨格タンパク質（ＭＳＰ）に対するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片が提供される。このＭＳＰはナノディスクを構成しているＭＳＰである。本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち第８３位のプロリン残基から第９４位のグルタミン酸残基までの配列と９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをエピトープとして認識するものとされる。

【0022】

本発明の好ましい実施態様によれば、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち第８３位のプロリン残基から第９４位のグルタミン酸残基までのアミノ酸配列を含むポリペプチドをエピトープとして認識するものとされる。

【0023】

本発明のモノクローナル抗体は、公知の方法により得ることができる。このような方法としては、限定されるわけではないが、例えば、ＭＳＰ抗原タンパク質またはＭＳＰタンパク質の部分ペプチドを用いて非ヒト哺乳動物を免疫し、免疫させた非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞（例えば、Ｂ細胞）を採取し、この抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させ、ハイブリドーマ（融合細胞株）を作製し、このハイブリドーマから産生される抗体を採取することにより、目的のモノクローナル抗体を得る方法等が挙げられる。なお、本明細書において単にＭＳＰと記載されている場合、特に断りがない限り、ＭＳＰタンパク質のことを指す。

【0024】

本発明のモノクローナル抗体を得るため、ＭＳＰの全長タンパク質を免疫抗原として用いることができる。ＭＳＰの全長タンパク質は、限定されるわけではないが、公知の方法により得てもよい。このような方法としては、限定されるわけではないが、例えば、大腸菌等を用いて目的とするＭＳＰを細胞内で発現させ、精製すること等により得ることができ、また、市販品を用いても良い。また、本発明のモノクローナル抗体を得るため、ＭＳＰの部分ペプチドを合成し免疫抗原として用いても良い。免疫抗原として用いるＭＳＰタンパク質としては、限定されるわけではないが、好ましくはＭＳＰ１Ｄ１である。また、免疫抗原として用いるＭＳＰタンパク質は、抗原として使用可能な範囲であれば、アビジンタグ（Ａｖｉ－タグ）やヒスチジンタク（Ｈｉｓ－タグ）を付加する等の修飾がなされていてもよい。

【0025】

本発明のモノクローナル抗体を得るため、免疫する非ヒト哺乳動物の種類は、限定されるわけではないが、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ヤギ等が挙げられ、好ましくはマウスである。また、免疫する非ヒト哺乳動物は自己免疫疾患動物であってもよい。免疫は、限定されるわけではないが、例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋中、足蹠皮下等に注入することにより行ってもよい。免疫の間隔は、限定されるわけではないが、数日から数週間間隔、好ましくは１～２週間間隔で、１～１０回程度免疫を行ってもよい。

【0026】

本発明のモノクローナル抗体を得るための抗体産生細胞は、特に限定されるわけではないが、免疫した非ヒト哺乳動物の脾臓細胞等または所属リンパ節等から調製してもよく、好ましくは脾臓細胞から調製する。採取した細胞集団から特に抗体産生細胞の分離操作を行わなくてもよいが、好ましくは細胞集団の中から抗体産生細胞のみを分離する。

【0027】

上記の抗体産生細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とを融合させることにより、本発明のモノクローナル抗体を産生しながら半永久的に増え続ける細胞（ハイブリドーマ）を作製することができる。この融合は、公知の細胞融合方法により行ってもよく、限定されるわけではないが、例えば、細胞融合促進剤存在下での融合、電気刺激（例えば、エレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いた融合等により行うことができる。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞としては、マウス等の動物の一般に入手可能な細胞株を使用することができる。使用する細胞株としては、限定されるわけではないが、ＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む培地）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものを用いてもよい。ミエローマ細胞としては、限定されるわけではないが、例えばＳＰ２／０、Ｐ３Ｕ１、ＮＳＩ、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８．６５３等が挙げられ、好ましくはＰ３Ｕ１である。

【0028】

細胞融合処理後の細胞から本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選別することができる。ハイブリドーマを選別する方法は、公知の方法により行ってもよく、限定されるわけではないが、例えば、細胞融合処理後の細胞を一定期間、例えば、ＨＡＴ培地等の適切な培地で培養して、コロニーを形成させ、そのコロニー陽性培養プレートの各ウェルの培養上清を採取して、ナノディスクを構成しているＭＳＰに対する抗体価を確認することにより行ってもよい。ナノディスクを構成しているＭＳＰに対する抗体価の確認方法としては、限定されるわけではないが、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）や放射性免疫測定法（ＲＩＡ）等が挙げられ、好ましくはＥＬＩＳＡである。

【0029】

選別された、ウェルにおける細胞に対して、単一の細胞にするためにクローニングを行ってもよい。クローニングは、公知の方法により行ってもよく、限定されるわけではないが、例えば、細胞懸濁液を適当な培地（例えば、１０～２０％のＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地）で適当に希釈後、培養プレートの各ウェルに細胞を播き（培養プレートの各ウェルに入れる細胞の数は、１つのウェルに入る細胞が１個である確率が高くするため、好ましくは各ウェルに１個入るように細胞を播く）、一定期間（例えば、７～１０日。この間に、好ましくはシングルコロニーであることを確認する）後にコロニー陽性ウェルの培養上清を回収し、回収した培養上清の抗体価を確認することにより行ってもよく、ナノディスクを構成しているＭＳＰに対して高い親和性を示す抗体を産生する細胞を選択してもよく、さらに選択したウェルの細胞をある程度増やしてハイブリドーマ株を樹立してもよい。また、クローニングは必要に応じて数回行ってもよい。これらの操作により得られる好ましいハイブリドーマとしては、例えば、２０２２年４月２７日に独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）に寄託された、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ－０３６３６を有するハイブリドーマが挙げられる。このハイブリドーマは、ｂｉＮＤ５と呼ばれる抗ＭＳＰモノクローナル抗体を産生する。

【0030】

樹立したハイブリドーマ株からは、適切な方法により、本発明のモノクローナル抗体を精製および採取することができる。これは、公知の方法により行ってもよく、限定されるわけではないが、例えば、血清の濃度を抑えた培地で培養した培養上清から抗体を調製する方法、市販の無血清培地で培養した培養上清から抗体を調製する方法、動物の腹腔内にハイブリドーマを注入して、腹水を採取し、その腹水から抗体を調製する方法等により行ってもよい。

【0031】

樹立したハイブリドーマ株の培養方法としては、限定されるわけではないが、例えば、培養フラスコを用いる方法、スピナーフラスコを用いる方法、シェーカーフラスコを用いる方法、バイオリアクターを使用する方法等が挙げられる。

【0032】

本発明のモノクローナル抗体の精製は、公知の方法で行ってもよく、限定されるわけではないが、例えば、ＭＳＰアフィニティカラムで精製する方法、イオン交換クロマトグラフィーで精製する方法、プロテインＡまたはＧ等のイムノグロブリン結合性タンパク質のアフィニティカラムで精製する方法等が挙げられる。これら公知の方法を適宜選択し、または組み合わせることにより本発明のモノクローナル抗体を精製することができる。

【0033】

本発明のモノクローナル抗体により認識されるエピトープ（抗原決定基）は、本発明のモノクローナル抗体が、ナノディスクを構成しているＭＳＰに対して高い親和性を示すときに認識しているＭＳＰポリペプチドの一部であり、具体的には、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち第８３位のプロリン残基から第９４位のグルタミン酸残基までの配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは１００％の相同性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチドである。ここで、相同性を示すとは、元のアミノ酸配列と比較した場合に、アミノ酸配列が同じであることを意味し、例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列と９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチドとは、配列番号１に示すアミノ酸配列と９０％以上同じアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。このようなアミノ酸配列同士の相同性は、公知の相同性検索プログラム、例えばＢＬＡＳＴ等、により、デフォルトのパラメータを使用して決定することができる。

【0034】

つまり、本発明のモノクローナル抗体は、上記ハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体そのものに限られず、上記ハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体が認識するエピトープに結合する限り、本発明のモノクローナル抗体に含まれる。ここでいう「エピトープ」とは、具体的には、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち第８３位のプロリン残基から第９４位のグルタミン酸残基までの配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは１００％の相同性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチドである。

【0035】

本発明のモノクローナル抗体と、ナノディスクを構成しているＭＳＰの相互作用の平衡解離定数（ＫＤ）は、限定されるわけではないが、好ましくは７．００ｎＭ以下であり、より好ましくは５．５０ｎＭ以下である。

【0036】

本発明のモノクローナル抗体と、ナノディスクを構成していないフリー体のＭＳＰ１Ｄ１の相互作用の平衡解離定数（ＫＤ）は、限定されるわけではないが、好ましくは１５００ｎＭ以下であり、より好ましくは１０００ｎＭ以下である。

【0037】

本発明におけるナノディスクは、限定されるわけではないが、少なくとも以下の成分、ＭＳＰ、脂質、および膜タンパク質により構成される。ナノディスクは、膜タンパク質を含めず、ＭＳＰおよび脂質により構成することも可能だが、本明細書ではこのようなナノディスクを空のナノディスクと称呼する。前記脂質としては、限定されるわけではないが、例えば、リン脂質、脂質二重膜天然物由来抽出脂質、合成脂質、およびこれらの混合物等が挙げられる。

【0038】

本発明におけるナノディスクを構成するＭＳＰは、限定されるわけではないが、好ましくは、ＭＳＰ１Ｄ１、ＭＳＰ１、ＭＳＰ１Ｅ３Ｄ１、またはＭＳＰ２Ｎ２であり、ＭＳＰ１Ｄ１は配列番号１で表されるアミノ酸配列を、ＭＳＰ１は配列番号２で表されるアミノ酸配列を、ＭＳＰ１Ｅ３Ｄ１は配列番号３で表されるアミノ酸配列を、ＭＳＰ２Ｎ２は配列番号４で表されるアミノ酸配列を、それぞれ有することが好ましい。また、各ＭＳＰの２次構造は図１に示す通りである。

【0039】

本発明のモノクローナル抗体の抗原結合断片とは、本発明のモノクローナル抗体の一部分の領域を意味し、限定されるわけではないが、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄｉａｂｏｄｙ（ｄｉｂｏｄｉｅｓ）、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ）等が挙げられる。上記抗原結合断片は、限定されるわけではないが、例えば、本発明のモノクローナル抗体を目的に応じて各種タンパク質分解酵素で切断すること、本発明のモノクローナル抗体のＶ_ＨおよびＶ_ＬをコードするｃＤＮＡから遺伝子組換え体を作製すること等により、得ることができる。本発明のモノクローナル抗体の抗原結合断片は、本発明のモノクローナル抗体が結合する抗原（特にエピトープ）と同じ抗原に結合するものである。

【0040】

上記の、Ｆａｂは、例えば、抗体分子をパパインで処理することにより、Ｆ（ａｂ’）２は、例えば、抗体分子をペプシンで処理することによりそれぞれ得ることができる。また、上記のＦａｂ’は、例えば、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することで得ることができる。

【0041】

上記のｓｃＦｖは、例えば、抗体のＶ_ＨおよびＶ_ＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、前記発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることで得ることができる。

【0042】

上記のｄｉａｂｏｄｙは、例えば、抗体のＶ_ＨおよびＶ_ＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ペプチドリンカーのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるようにｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、前記発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることで得ることができる。

【0043】

上記のｄｓＦｖは、例えば、抗体のＶ_ＨおよびＶ_ＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、前記発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることで得ることができる。

【0044】

本発明のモノクローナル抗体は、組換え手段により調製され、発現される遺伝子組換え抗体または抗原結合断片とすることもでき、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体としてもよい。本発明におけるこれらの抗体は、限定されるわけではないが、公知の方法にしたがって調製してもよく、例えば、重鎖および軽鎖の組換え発現によって調製してもよい。

【0045】

また、本発明においては、ハイブリドーマまたは前記ハイブリドーマから抽出したＤＮＡまたはＲＮＡ等を原料として、公知の方法にしたがってキメラ抗体、ヒト型化抗体、ヒト化抗体を調製してもよい。

【0046】

ＳＰＲ法やＢＬＩ法等の分子間相互作用測定方法においては、まず、分子間相互作用に関与する一方の分子、例えばレセプター（受容体）として機能している膜タンパク質を、各測定方法に対応した測定部材（センサーチップ）の表面に固定化する。そして、分子間相互作用に関与するもう一方の分子、例えば前記レセプターとして機能している膜タンパク質に対応するリガンド（低分子化合物、タンパク質のホルモン等）、前記受容体に結合してリガンドとの結合能を阻害するための抗体、またはそのような機能を果たす候補物質を、前記固定化させた分子と接触させて、相互作用により特異的に結合させるようにする。このときに起きる変化が測定部材に与える影響の大きさによって、分子間の相互作用を定量し、評価することができる。

【0047】

したがって、本発明の抗ＭＳＰ抗体を、例えば、上記の測定部材（センサーチップ）の表面に固定化し、所望の膜タンパク質が構成されたナノディスクを前記の固定化した抗ＭＳＰ抗体に捕捉させ、さらに、前記膜タンパク質と相互作用する分子を添加し、このときに起きる変化が測定部材に与える影響を定量することにより、前記膜タンパク質とそのリガンド等の相互作用を評価、または前記膜タンパク質と相互作用する物質をスクリーニングすることが可能である。本発明の抗ＭＳＰ抗体を用いた、これらの評価方法やスクリーニングの方法は、標的となる膜タンパク質によらない様々なナノディスクの固定化を可能とし、また、測定部材（センサーチップ）の再生も容易でハイスループットな測定を可能とするため、従来と比較して、より簡便に、かつ低コストで前記測定やスクリーニングを実施することが可能となる。

【0048】

したがって、本発明の他の態様によれば、本発明の抗体またはその抗原結合断片を固体支持体に固定化した固定化抗体が提供される。

【0049】

本発明における固体支持体とは、限定されるわけではないが、例えば、測定部材（センサーチップ）等が挙げられる。本発明の抗体またはその抗原結合断片を固体支持体に固定化する方法は、限定されるわけではないが、公知の方法にしたがって行ってもよい。

【0050】

また、本発明の他の態様によれば、膜タンパク質と測定対象物の相互作用を評価する方法が提供され、前記方法は、（ａ）固体支持体表面に、本発明の抗体またはその抗原結合断片を固定化する工程、（ｂ）以下の成分を含んでなり、かつ少なくとも以下の成分により構成される、ナノディスクを、工程（ａ）により固定化した固体支持体に接触させる工程、（ｉ）ＭＳＰ、（ｉｉ）脂質、および（ｉｉｉ）膜タンパク質、（ｃ）工程（ｂ）により得られたナノディスクと固体支持体の複合体に測定対象物を接触させる工程、ならびに（ｄ）膜タンパク質と測定対象物の相互作用を測定する工程、を含んでなることを特徴とする。

【0051】

さらに、本発明の他の態様によれば、膜タンパク質と相互作用する物質をスクリーニングする方法が提供され、前記方法は、（ａ）固体支持体表面に、本発明の抗体またはその抗原結合断片を固定化する工程、（ｂ）以下の成分を含んでなり、かつ少なくとも以下の成分により構成される、ナノディスクを、工程（ａ）により固定化した固体支持体に接触させる工程、（ｉ）ＭＳＰ、（ｉｉ）脂質、および（ｉｉｉ）前記膜タンパク質、（ｃ）工程（ｂ）により得られたナノディスクと固体支持体の複合体に候補物質を接触させる工程、ならびに、（ｄ）前記膜タンパク質と相互作用を示した候補物質を、膜タンパク質と相互作用する物質と評価する工程、を含んでなることを特徴とする。

【0052】

本発明における測定対象物とは、標的とする膜タンパク質と相互作用することを期待して、前記膜タンパク質に直接的または間接的に作用させる物質のことを指す。本発明における物質とは、限定されるわけではないが、例えば、小分子、低分子化合物、高分子化合物、核酸分子、タンパク質、ペプチド（例えば、抗体またはその断片等）等が挙げられる。

【0053】

本発明における相互作用は、抗体またはその抗原結合断片を固定化するための固体支持体と一体化した反応器を用いて行われてもよく、抗体またはその抗原結合断片を固定化するための固体支持体とは別個に存在する反応器に、固体支持体を添加して行われてもよい。このような反応器としては、限定されるわけではないが、例えば、各種測定装置における測定槽、抗体をレジンに固定化してチューブ内で反応させる場合（例えば、免疫沈降実験）におけるチューブ、レジンを充填したカラムを用いて溶液を分離する場合（例えば、液体クロマトグラフィーによる分離）におけるカラム等が挙げられる。

【実施例0054】

以下の例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。含有量は特記しない限り、質量％で示す。

【0055】

ＭＳＰタンパク質の調製
ＭＳＰタンパク質（ＭＳＰ１、ＭＳＰ１Ｄ１、ＭＳＰ１Ｅ３Ｄ１、および／またはＭＳＰ２Ｎ２）を大腸菌内で発現させるように調製した、大腸菌用発現ベクターｐＥＴ２８を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬに組み入れ、ＭＳＰタンパク質を大腸菌内で発現させた後に回収し、付加してあるｈｉｓタグによってアフィニティー精製することにより、ナノディスク形成用のＭＳＰタンパク質を得た。具体的な手順を以下に示す。

【0056】

付加したＨｉｓタグ、３Ｃプロテアーゼ切断部位、およびＡｖｉタグを含む、ＭＳＰ１、ＭＳＰ１Ｄ１、ＭＳＰ１Ｅ３Ｄ１、および／またはＭＳＰ２Ｎ２を大腸菌内で発現させるように調製したｐＥＴ２８ベクター、を組み入れた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬを用意し、３７℃で、カナマイシンが５０μｇ／ｍｌになるように添加したＴＢ培地において、ＯＤ_６００が２．５～３．０になるまで培養した。

【0057】

培養液に、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（富士フィルム和光純薬社製）を０．５ｍＭになるように添加し、２～３時間、大腸菌内でＭＳＰタンパク質の発現を誘導した。

【0058】

誘導後、大腸菌を回収して細胞ペレットとし、細胞ペレットを４０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、および１ｍＭのＰＭＳＦ（ナカライテスク社製）を含む溶液に再懸濁し、超音波処理により大腸菌の溶解を行った。溶解液における大腸菌の細胞の断片は、３０分、１８０００ｇで遠心分離を行うことにより除去した。

【0059】

溶解液の上清をＮｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（ＧＥヘルスケア社製）に流し、１０カラム容量（ＣＶ）の、４０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含む溶液を流してカラムを洗浄した。

【0060】

次に、１０ＣＶの、４０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのコール酸ナトリウム、１０ｍＭのイミダゾールを含む溶液を流してカラムを洗浄し、さらに、４０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のｎ－ドデシルβ－Ｄ－マルトシド（ＤＤＭ、Ａｎａｔｒａｃｅ社製）、２０ｍＭのイミダゾールを含む溶液を流してカラムを洗浄した。

【0061】

洗浄後、標的であるＭＳＰタンパク質を、４０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＤＤＭ、１００ｍＭのイミダゾールを含む溶液で希釈した。

【0062】

標的であるＭＳＰタンパク質を含む溶液を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １０Ｋ（Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて濃縮し、バッファーを４０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＤＤＭを含む溶液に交換した。

【0063】

３Ｃプロテアーゼで一晩インキュベートすることにより、ＭＳＰタンパク質のＮ末端のｈｉｓタグを切断し、Ｎ末端のｈｉｓタグが切断されていないＭＳＰタンパク質とプロテアーゼをＮｉアフィニティー精製で除去し、２度のＮｉアフィニティー精製後、ナノディスク形成用のＭＳＰタンパク質を得た。

【0064】

ＴＲナノディスクの調製
ＴＲは配列番号５で表されるアミノ酸配列を有する膜タンパク質である。ＴＲナノディスクは、ＴＲ：ＭＳＰ：脂質を１：１０：３５０の比率で混合し、Ｂｉｏ－ｂｅａｄｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）で界面活性剤を除くことにより調製した。ＴＲは公知の文献（例えば、Proteins.2021 Mar; 89(3): 301-310.）に記載の方法に準じて発現させ、精製したものを用いた。ＭＳＰタンパク質は上記に記載した方法により得たものを用いた。脂質は大腸菌から抽出したものを用いた。

【0065】

まず、抽出した大腸菌由来の極性脂質を含む界面活性剤可溶化ＴＲ溶液に、精製したＭＳＰが１：１０：３５０（ＴＲ：ＭＳＰ：脂質）のモル比になるように添加し、混合溶液を得た。

【0066】

この混合溶液を４℃で１時間インキュベートした後、バイオビーズ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）を用いて混合溶液中の界面活性剤を除去し、３０分１５００００ｇで遠心分離することで、可溶化したナノディスクを含む溶液を得た。

【0067】

この溶液の上清をＮｉアフィニティークロマトグラフィーカラムに流して、ＴＲを含むナノディスクを、過剰に存在する、ＴＲを含まない空のナノディスクから分離した溶液を得た。この溶液をＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ３０Ｋ（Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濃縮することにより、ＴＲナノディスクを得た。

【0068】

Ａ２ａＲ（ｗｔ）ナノディスク、ｈＥＲＧナノディスク、Ｐｇｐナノディスクの調製
ヒトアデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ：配列番号６で表されるアミノ酸配列を有する）、ヒトｅｔｈｅｒ－ａ－ｇｏ－ｇｏ関連遺伝子（ｈＥＲＧ）から発現されるタンパク質（配列番号７で表されるアミノ酸配列を有する）、およびｐ－糖タンパク質（Ｐｇｐ：配列番号８で表されるアミノ酸配列を有する）再構成ナノディスクは、公知の文献に記載の方法に準じて調製および精製することにより得た。

【0069】

膜タンパク質を含まない、空のナノディスクの調製
空のナノディスクを調製するために、各膜タンパク質を含むナノディスクの調製に用いられるＭＳＰと脂質を混合し、得られた混合溶液を４℃で１時間ローリングさせた後、バイオビーズを添加し、さらに４℃で１６時間ローリングさせて界面活性剤を除去し、３０分１５００００ｇで遠心分離することで、可溶化したナノディスクを含む溶液を得た。

【0070】

この溶液の上清をＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ３０Ｋ（Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濃縮し、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む溶液で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００Ｉｎｃｒｅａｓｅ１０／３００ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア社製）に流した。ＵＶ検出により最初に溶出したピーク画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより泳動して確認し、空のナノディスクを得た。

【0071】

ＭＳＰに対するモノクローナル抗体（抗ＭＳＰモノクローナル抗体）の調製
抗ＭＳＰモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体の製造方法に関する公知の文献（例えば、KOHLER,G.,MILSTEIN,C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256, 495-497 (1975)）に記載の方法に準じて調製した。ＭＳＰタンパク質はヘリックス配列をリピートした長さの異なる変異体が複数存在するため、どのＭＳＰタンパク質にも反応する抗体を得るために、基本となるＭＳＰ１Ｄ１を、免疫させるＭＳＰタンパク質として選定した。

【0072】

前記方法により調製し、精製したＡｖｉ－ｔａｇを付加したＭＳＰ１Ｄ１を７日おきに５回、自己免疫疾患マウスへ免疫させた。この免疫させたマウスから脾臓細胞を採取し、ミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）と細胞融合し、ハイブリドーマを作成した。ハイブリドーマ培養上清中に産生される抗体のうち、ＥＬＩＳＡ法によりＡｖｉ－ｔａｇを付加したＭＳＰ１Ｄ１に反応するもののみを選別した。

【0073】

抗ＭＳＰモノクローナル抗体のＭＳＰタンパク質に対する親和性評価
前記ハイブリドーマから産生された抗ＭＳＰモノクローナル抗体のいくつかのクローンのＭＳＰタンパク質に対する親和性を、ＢＬＩ法により評価した。

【0074】

各ＭＳＰタンパク質（フリー体）の精製試料に対して、測定用バッファー（４０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＤＤＭを含む溶液）を用いて１０００ｎＭ、５００ｎＭ、２００ｎＭおよび１００ｎＭとなるよう、親和性評価に供する試料を調整した。また、各ＭＳＰタンパク質を用いて構成されたＴＲナノディスクの精製試料に対して、測定用バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ＭのＮａＣｌ）を用いて５００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭおよび５０ｎＭとなるよう、親和性評価に供する試料を調整した。

【0075】

バイオセンサー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ社製）に、前記抗ＭＳＰモノクローナル抗体のいくつかのクローンを固定化した。試料中の各ＭＳＰタンパク質（フリー体）または各ＭＳＰタンパク質を用いて構成されたＴＲナノディスクとモノクローナル抗体の各クローンとの親和性をＢＬＩで測定した。ＢＬＩの測定はＢＬＩｔｚ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ社製）を用い、反応温度２２℃で、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ＭのＮａＣｌを含むバッファーを用いて行った。測定の各工程については、平衡化１２０秒、結合１２０秒、解離１２０秒の条件で行った。測定結果は、ＢＬＩｔｚ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＬＩｔｚ Ｐｒｏ１．２、ＦｏｒｔｅＢｉｏ社製）を用いて、ｇｌｏｂａｌ ｆｉｔｔｉｎｇにより解析した。結果を表１～４に示す。

【0076】

【表1】

【0077】

【表2】

【0078】

【表3】

【0079】

【表4】

【0080】

以上の結果から、いずれのクローンも、ＭＳＰタンパク質のフリー体よりナノディスクに対して高い親和性を示し、６種のクローンの内、クローン８０および９０が良好な親和性を示し、クローン９０がより良好な親和性を示した。

【0081】

抗ＭＳＰモノクローナル抗体のエピトープマッピング
抗ＭＳＰモノクローナル抗体の抗原結合部位の特定を行った。抗ＭＳＰモノクローナル抗体の抗原結合部位の特定は、ハイブリドーマ作製に用いたＭＳＰタンパク質であるＡｖｉ－ｔａｇを付加したＭＳＰ１Ｄ１を用いて行った。

【0082】

まず、ペプチドアレイによるエピトープ検索を行った。ペプチドアレイシートを作成するために、Ａｖｉ－ｔａｇを付加したＭＳＰ１Ｄ１の配列に基づいた２２個のアミノ酸残基からなる６２個のスポットを、公知の文献（例えば、Frank R (1992) Spot synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support. Tetrahedron 48: 9217-9232）に記載の方法に準じて、ＲｅｓＰｅｐ ＳＬ自動ペプチド合成装置（ＩｎｔａｖｉｓＡＧ、Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を用いて、セルロース膜（ＩｎｔａｖｉｓＡＧ、Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）で合成した。６２個のスポットは２２個のアミノ酸残基を３残基ずつずらしていくことで作製した。

【0083】

ペプチド合成の完了後、トリフルオロ酢酸で処理することにより、側鎖保護基を除去した。セルロース膜（メンブレン）を切断し、切断したメンブレンをＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ（ナカライテスク社製）を用いて、１時間室温条件下でブロッキングした。ブロッキング後、抗ＭＳＰモノクローナル抗体を１μｇ／ｍｌになるよう添加し、１時間室温条件下で反応させ、続いて、ＨＲＰ接合ヤギ抗マウスＦｃ特異的ＩｇＧを０．２μｇ／ｍｌになるよう添加し、３０分間室温条件下で反応させた。抗体反応後、ＨＲＰ用発色基質（ＥｚＷｅｓｔＢｌｕｅ、アトー社製）を用いて１０分間酵素反応させ、染色した。その後、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｈｔｔｐｓ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を用いて各スポットの反応強度を分析した。結果を図２に示す。

【0084】

図２の結果、クローン４１はＡｖｉ－ｔａｇの領域、クローン８０はＨ５付近の領域、クローン９０はＨ４付近の領域に対してそれぞれ高い親和性を示した。なお、ＭＳＰ１Ｄ１の各領域のアミノ酸配列は以下表５に示す通りである。

【0085】

【表5】

【0086】

前記モノクローナル抗体が反応した２２残基ペプチドにおいて、１残基ずつアラニンに置換したペプチドを順次合成し、それぞれのペプチドに対する前記モノクローナル抗体の反応性を測定した。結果を図３に示す。

【0087】

また、前記モノクローナル抗体が反応した２２残基ペプチドのＣ末端、Ｎ末端それぞれを削除したペプチドを順次合成し、それぞれのペプチドに対する前記モノクローナル抗体の反応性を測定した。結果を図４に示す。

【0088】

図３および４の結果、クローン４１に対してはＡｖｉ－ｔａｇのアミノ酸配列のうち第５位のアスパラギン残基から第１４位のグルタミン酸残基までの領域が、クローン８０に対しては配列番号１に示すアミノ酸配列のうち第１１５位のアルギニン残基から第１２６位のセリン残基までの領域が、クローン９０に対しては配列番号１に示すアミノ酸配列のうち第８３位のプロリン残基から第９４位のグルタミン酸残基までの領域が、親和性のために特に重要であることが示された。この３つのクローンの内、ナノディスクを構成しているＭＳＰに対して特に良好な親和性を示したクローン９０を「ｂｉＮＤ５」と命名した。

【0089】

抗ＭＳＰモノクローナル抗体およびナノディスクを用いた、膜タンパク質およびそのリガンドの分子間相互作用の評価
抗ＭＳＰモノクローナル抗体を、アミンカップリングにより、ＣＭ５ ｃｈｉｐ（Ｃｙｔｉｖａ社製）上に１２０００～１３０００ＲＵ（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｕｎｉｔｓ）に達するまで固定化した。

【0090】

上記の方法にしたがって、ヒトアデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）、ヒトｅｔｈｅｒ－ａ－ｇｏ－ｇｏ関連遺伝子（ｈＥＲＧ）、およびｐ－糖タンパク質（Ｐｇｐ）を膜タンパク質とするナノディスクを得た。膜タンパク質はいずれもＨＥＫ細胞で発現したもの用いた。Ａ２ａＲを膜タンパク質とするナノディスクは、ＭＳＰタンパク質としてはＭＳＰ１Ｄ１を、脂質としてはＰＯＰＣを用いて、ｈＥＲＧを膜タンパク質とするナノディスクは、ＭＳＰタンパク質としてはＭＳＰ１Ｄ３Ｅ１を、脂質としてはＰＯＰＣ／ＰＯＰＥ／ＰＯＰＡを用いて、Ｐｇｐを膜タンパク質とするナノディスクは、ＭＳＰタンパク質としてはＭＳＰ１Ｄ１を、脂質としては脳の極性脂質を用いて、それぞれ調製した。調製したナノディスクを、ランニングバッファー（Ａ２ａＲナノディスクの場合は２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＤＭＳＯを含む溶液、ｈＥＲＧの場合は２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、３００ｍＭのＫＣｌ、１％のＤＭＳＯを含む溶液、Ｐｇｐの場合は２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、３００ｍＭのＫＣｌ、１％のＤＭＳＯを含む溶液をそれぞれランニングバッファーとした）を用いて、抗ＭＳＰモノクローナル抗体を固定化したＣＭ５ ｃｈｉｐに、Ａ２ａＲナノディスクの場合は１８００ＲＵに達するまで、ｈＥＲＧの場合は１８００ＲＵに達するまで、Ｐｇｐの場合は１０００ＲＵに達するまで、それぞれ捕捉させた。なお、ブランクとしては、膜タンパク質を含まない空のナノディスクを用い、膜タンパク質を含むナノディスクと同様の方法で調製したが、分子量の違いを考慮して、Ａ２ａＲ測定用の空のナノディスクの場合は１３００ＲＵに達するまで、ｈＥＲＧ測定用の空のナノディスクの場合は９００ＲＵに達するまで、それぞれ抗ＭＳＰモノクローナル抗体を固定化したＣＭ５ ｃｈｉｐに捕捉させた。

【0091】

測定装置としてＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＧＥヘルスケア社製）を用い、リガンド（Ａ２ａＲに対しては拮抗剤のＺＭ２４１３８５、ｈＥＲＧに対してはアステミゾール、Ｐｇｐに対しては抗Ｐ－ｇｐモノクローナル抗体（ＵＩＣ－２））を、ナノディスクを捕捉させたＣＭ５ ｃｈｉｐに連続的に添加して結合の様子を測定した後、ランニングバッファーに切り替え、解離の様子を測定した。この操作は５回、リガンドの濃度を変えて（ＺＭ２４１３８５の濃度は３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０ｎＭ、アステミゾールの濃度は０．３１２５、０．６２５、１．２５、２．５、５ｎＭ、ＵＩＣ－２の濃度は３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０ｎＭ）繰り返した。各回の操作完了後にはグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ２．６）を注入し、チップを再生してから、次の回の操作を行った。Ａ２ａＲおよびｈＥＲＧはＳＣＫ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｙｃｌｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓ）、ＰｇｐはＭＣＫ（ｍｕｌｔｉ ｃｙｃｌｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓ）でそれぞれ測定した。

【0092】

得られたセンサーグラムに理論式によるフィッティングを行うことにより、反応速度定数および解離定数を算出した。結合フィッティング（Ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｉｔｔｉｎｇ）は１：１とし、解析はＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅのＣｕｒｖｅ ｆｉｔｔｉｎｇを用いて行った。結果を図５に示す。

【0093】

図５の結果、本発明の抗ＭＳＰモノクローナル抗体を用いることにより、様々な膜タンパク質およびそのリガンドの分子間相互作用が評価できることが示された。

【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4-1】

【図4-2】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【配列表】

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