特開2023-179327肺がんを治療するための併用薬、肺がん治療用医薬組成物および併用薬の適応患者を選択するための情報提供方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023179327
(43)【公開日】2023-12-19
(54)【発明の名称】肺がんを治療するための併用薬、肺がん治療用医薬組成物および併用薬の適応患者を選択するための情報提供方法
(51)【国際特許分類】
A61K 45/06 20060101AFI20231212BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231212BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231212BHJP
A61K 31/4965 20060101ALI20231212BHJP
A61K 31/502 20060101ALI20231212BHJP
A61K 31/4184 20060101ALI20231212BHJP
【ＦＩ】
A61K45/06 ZNA
A61P35/00
A61P43/00 111
A61P43/00 121
A61K31/4965
A61K31/502
A61K31/4184
【審査請求】未請求
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022092598
(22)【出願日】2022-06-07
(71)【出願人】
【識別番号】000125381
【氏名又は名称】学校法人藤田学園
(74)【代理人】
【識別番号】100167689
【弁理士】
【氏名又は名称】松本 征二
(72)【発明者】
【氏名】鈴木 元
(72)【発明者】
【氏名】新美 敦子
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C084AA20
4C084MA02
4C084ZB261
4C084ZB262
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC39
4C086BC48
4C086BC50
4C086BC69
4C086GA07
4C086GA09
4C086GA12
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA05
4C086ZB26
4C086ZC41
4C086ZC75
(57)【要約】 （修正有）
【課題】新たな作用機序による、肺がんを治療するための併用薬、肺がん治療用医薬組成物および併用薬の適応患者を選択するための情報提供方法を提供する。
【解決手段】肺がんを治療するための併用薬であって、該併用薬は、ＰＡＲＰ阻害剤を有効成分として含む第１医薬と、ＡＴＲ阻害剤を有効成分として含む第２医薬と、を含む併用薬。
【選択図】図２
【解決手段】肺がんを治療するための併用薬であって、該併用薬は、ＰＡＲＰ阻害剤を有効成分として含む第１医薬と、ＡＴＲ阻害剤を有効成分として含む第２医薬と、を含む併用薬。
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
肺がんを治療するための併用薬であって、該併用薬は、
ＰＡＲＰ阻害剤を有効成分として含む第１医薬と、
ＡＴＲ阻害剤を有効成分として含む第２医薬と、
を含む
併用薬。
ＰＡＲＰ阻害剤を有効成分として含む第１医薬と、
ＡＴＲ阻害剤を有効成分として含む第２医薬と、
を含む
併用薬。
【請求項2】
ＰＡＲＰ阻害剤が、オラパリブまたはべリパリブである
請求項１に記載の併用薬。
請求項１に記載の併用薬。
【請求項3】
ＡＴＲ阻害剤が、ＶＥ－８２１またはＶＥ－８２２である
請求項１に記載の併用薬。
請求項１に記載の併用薬。
【請求項4】
ＡＴＲ阻害剤が、ＶＥ－８２１またはＶＥ－８２２である
請求項２に記載の併用薬。
請求項２に記載の併用薬。
【請求項5】
プラチナ製剤による治療効果が認められない、または、プラチナ製剤による治療効果が低いもしくは、低いことが予測される患者に処方される
請求項１～４の何れか一項に記載の併用薬。
請求項１～４の何れか一項に記載の併用薬。
【請求項6】
ＰＡＲＰ阻害剤を有効成分として含む肺がん治療用医薬組成物との併用療法に使用するための、ＡＴＲ阻害剤を有効成分として含む肺がん治療用医薬組成物。
【請求項7】
ＡＴＲ阻害剤を有効成分として含む肺がん治療用医薬組成物との併用療法に使用するための、ＰＡＲＰ阻害剤を有効成分として含む肺がん治療用医薬組成物。
【請求項8】
ＰＡＲＰ阻害剤を有効成分として含む第１医薬と、ＡＴＲ阻害剤を有効成分として含む第２医薬と、を含む肺がんを治療するための併用薬の適応患者を選択するための情報提供方法であって、該情報提供方法は、
被検体から肺がん細胞または組織を取得する取得工程と、
取得工程で得られた肺がん細胞中または取得工程で得られた組織に含まれる肺がん細胞中で発現しているＰＯＬＤ４の発現量、またはＲＰＡまたはＣＨＫ１またはＣＨＫ２またはＨ２ＡＸの活性化レベル、またはそれらの組み合わせを測定する工程と、
を含む情報提供方法。
被検体から肺がん細胞または組織を取得する取得工程と、
取得工程で得られた肺がん細胞中または取得工程で得られた組織に含まれる肺がん細胞中で発現しているＰＯＬＤ４の発現量、またはＲＰＡまたはＣＨＫ１またはＣＨＫ２またはＨ２ＡＸの活性化レベル、またはそれらの組み合わせを測定する工程と、
を含む情報提供方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願における開示は、肺がんを治療するための併用薬、肺がん治療用医薬組成物および併用薬の適応患者を選択するための情報提供方法に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、がん治療においては、ドライバー遺伝子変異を有する患者に対する分子標的治療薬（免疫チェックポイント阻害剤を含む）開発により有効な選択肢が増えている。一方、分子標的治療薬適応のない患者、および、耐性が認められた患者には、細胞傷害性抗がん薬（以下抗がん剤）が選択される。
【0003】
プラチナ製剤は最も代表的抗がん剤であり、保険適応がん腫は睾丸腫瘍、膀胱がん、腎盂・尿管腫瘍、前立腺がん、卵巣がん、頭頚部がん、非小細胞肺がん、食道がん、子宮頸がん、神経芽細胞腫、胃がん、小細胞肺がん、骨肉腫、胚細胞腫瘍（精巣腫瘍、卵巣腫瘍、性腺外腫瘍）、悪性胸膜中皮腫、胆道がん、悪性骨肉腫、子宮体がん、再発・難治性悪性リンパ腫、小児性固形腫瘍（横紋筋肉腫、神経芽腫、肝芽腫その他肝原発悪性腫瘍、髄芽腫等）となっている。
【0004】
しかしながら、プラチナ製剤が全ての患者に対して高い治療効果を示すわけではない。例えば、非特許文献１には、肺がん培養細胞において、ＤＮＡ修復たんぱく質であるＰＯＬＤ４の発現が低い場合はプラチナ製剤であるシスプラチンは有用であるが、ＰＯＬＤ４の発現が高いとシスプラチンに耐性を示すことが開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】鈴木元、他１名、平成３０年度新潟大学脳研究所「脳神経病理資源活用の疾患病態共同研究拠点」共同利用・共同研究報告書、「ＤＮＡ 複製因子 ｐｏｌＤ４と発がん」、［令和４年４月１日検索］、インターネット＜https://www.bri.niigata-u.ac.jp/about/prbook/report2018/04_53.suzuki.pdf＞
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
上記非特許文献１には、ＰＯＬＤ４（ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｄｅｌｔａ ４）活性とシスプラチン感受性との間に強い相関関係があることから、ＰＯＬＤ４およびそれらを含む遺伝子群（ＰＯＬＤ４モジュール）活性がプラチナ製剤の代表であるシスプラチンの感受性予測に使用できることが記載されている。また、非特許文献１には、シスプラチン抵抗性肺がんにおいても、シスプラチン感受性を向上させる分子標的候補を特定したことが記載されている。
【0007】
抗腫瘍効果を発揮する薬剤としては、細胞障害性物質、抗体、抗体断片、ホルモン療法剤、低分子化合物、免疫チェックポイント阻害薬等が知られている。また、それら薬剤ががん細胞に作用する機序は様々であるにもかかわらず、がん撲滅はできていない。がん治療を促進するためには、新たな作用機序による治療薬の開発が望まれている。
【0008】
本出願における開示は、上記問題点を解決するためになされたものである。本発明者らは鋭意研究を行ったところ、ＰＡＲＰ阻害剤およびＡＴＲ阻害剤を併用することで、ＰＯＬＤ４の発現が高くシスプラチンに耐性を有する肺がん細胞に対して細胞増殖の抑制効果を示すことを新たに見出した。
【0009】
すなわち、本出願における開示の目的は、肺がんを治療するための併用薬、肺がん治療用医薬組成物および併用薬の適応患者を選択するための情報提供方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本出願における開示は、以下に示す肺がんを治療するための併用薬、肺がん治療用医薬組成物および併用薬の適応患者を選択するための情報提供方法に関する。
【0011】
（１）肺がんを治療するための併用薬であって、該併用薬は、
ＰＡＲＰ阻害剤を有効成分として含む第１医薬と、
ＡＴＲ阻害剤を有効成分として含む第２医薬と、
を含む
併用薬。
（２）ＰＡＲＰ阻害剤が、オラパリブまたはべリパリブである
上記（１）に記載の併用薬。
（３）ＡＴＲ阻害剤が、ＶＥ－８２１またはＶＥ－８２２である
上記（１）に記載の併用薬。
（４）ＡＴＲ阻害剤が、ＶＥ－８２１またはＶＥ－８２２である
上記（２）に記載の併用薬。
（５）プラチナ製剤による治療効果が認められない、または、プラチナ製剤による治療効果が低いもしくは、低いことが予測される患者に処方される
上記（１）～（４）の何れか一つに記載の併用薬。
（６）ＰＡＲＰ阻害剤を有効成分として含む肺がん治療用医薬組成物との併用療法に使用するための、ＡＴＲ阻害剤を有効成分として含む肺がん治療用医薬組成物。
（７）ＡＴＲ阻害剤を有効成分として含む肺がん治療用医薬組成物との併用療法に使用するための、ＰＡＲＰ阻害剤を有効成分として含む肺がん治療用医薬組成物。
（８）ＰＡＲＰ阻害剤を有効成分として含む第１医薬と、ＡＴＲ阻害剤を有効成分として含む第２医薬と、を含む肺がんを治療するための併用薬の適応患者を選択するための情報提供方法であって、該情報提供方法は、
被検体から肺がん細胞または組織を取得する取得工程と、
取得工程で得られた肺がん細胞中または取得工程で得られた組織に含まれる肺がん細胞中で発現しているＰＯＬＤ４の発現量、またはＲＰＡまたはＣＨＫ１またはＣＨＫ２またはＨ２ＡＸの活性化レベル、またはそれらの組み合わせを測定する工程と、
を含む情報提供方法。
ＰＡＲＰ阻害剤を有効成分として含む第１医薬と、
ＡＴＲ阻害剤を有効成分として含む第２医薬と、
を含む
併用薬。
（２）ＰＡＲＰ阻害剤が、オラパリブまたはべリパリブである
上記（１）に記載の併用薬。
（３）ＡＴＲ阻害剤が、ＶＥ－８２１またはＶＥ－８２２である
上記（１）に記載の併用薬。
（４）ＡＴＲ阻害剤が、ＶＥ－８２１またはＶＥ－８２２である
上記（２）に記載の併用薬。
（５）プラチナ製剤による治療効果が認められない、または、プラチナ製剤による治療効果が低いもしくは、低いことが予測される患者に処方される
上記（１）～（４）の何れか一つに記載の併用薬。
（６）ＰＡＲＰ阻害剤を有効成分として含む肺がん治療用医薬組成物との併用療法に使用するための、ＡＴＲ阻害剤を有効成分として含む肺がん治療用医薬組成物。
（７）ＡＴＲ阻害剤を有効成分として含む肺がん治療用医薬組成物との併用療法に使用するための、ＰＡＲＰ阻害剤を有効成分として含む肺がん治療用医薬組成物。
（８）ＰＡＲＰ阻害剤を有効成分として含む第１医薬と、ＡＴＲ阻害剤を有効成分として含む第２医薬と、を含む肺がんを治療するための併用薬の適応患者を選択するための情報提供方法であって、該情報提供方法は、
被検体から肺がん細胞または組織を取得する取得工程と、
取得工程で得られた肺がん細胞中または取得工程で得られた組織に含まれる肺がん細胞中で発現しているＰＯＬＤ４の発現量、またはＲＰＡまたはＣＨＫ１またはＣＨＫ２またはＨ２ＡＸの活性化レベル、またはそれらの組み合わせを測定する工程と、
を含む情報提供方法。
【発明の効果】
【0012】
ＰＡＲＰ阻害剤およびＡＴＲ阻害剤を併用することで、プラチナ製剤に耐性を有する肺がん細胞の増殖を抑制できる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】ｓｉＣｔｒｌおよびｓｉＰＯＬＤ４処理したＡ５４９に対し、ＡＴＲ阻害剤（ＶＥ－８２１）と、ＰＡＲＰ阻害剤（オラパリブ）と、を単独投与した結果を示すグラフである。
【図2】ｓｉＣｔｒｌおよびｓｉＰＯＬＤ４処理したＡ５４９に対し、ＡＴＲ阻害剤（ＶＥ－８２１）およびＰＡＲＰ阻害剤（オラパリブ）を併用した結果を示すグラフである。
【図3】ｓｉＣｔｒｌおよびｓｉＰＯＬＤ４処理したＡ５４９に対し、ＡＴＲ阻害剤（ＶＥ－８２２）およびＰＡＲＰ阻害剤（オラパリブ）を併用した結果を示すグラフである。
【図4】ｓｉＣｔｒｌおよびｓｉＰＯＬＤ４処理したＡ５４９に対し、ＡＴＲ阻害剤（ＶＥ－８２１）およびＰＡＲＰ阻害剤（ベリパリブ）を併用した結果を示すグラフである。
【図5】ｓｉＣｔｒｌおよびｓｉＰＯＬＤ４処理したＰＣ－９に対し、ＡＴＲ阻害剤（ＶＥ－８２１）およびＰＡＲＰ阻害剤（オラパリブ）を併用した結果を示すグラフである。
【図6】ｓｉＣｔｒｌおよびｓｉＰＯＬＤ４処理したＰＣ－１０に対し、ＡＴＲ阻害剤（ＶＥ－８２１）およびＰＡＲＰ阻害剤（オラパリブ）を併用した結果を示すグラフである。
【図7】ｓｉＣｔｒｌおよびｓｉＰＯＬＤ４処理したＮＣＩ－Ｈ１９７５に対し、ＡＴＲ阻害剤（ＶＥ－８２１）およびＰＡＲＰ阻害剤（オラパリブ）を併用した結果を示すグラフである。
【図8】Ａ５４９、ＮＣＩ－Ｈ１９７５、ＰＣ－１０、ＰＣ－９のｍＲＮＡ発現量と、ＡＴＲ阻害剤（ＶＥ－８２１）およびＰＡＲＰ阻害剤（オラパリブ）の併用投与の感受性の関係について調べたグラフである。
【図9】ＡＴＲ阻害剤（ＶＥ－８２１）およびＰＡＲＰ阻害剤（オラパリブ）の併用が正常細胞（ＦＢ２２７）へ与える影響について調べたグラフである。
【図10】図面代用写真で、ｓｉＣｔｒｌおよびｓｉＰＯＬＤ４処理したＡ５４９細胞における、ＲＰＡ、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２の活性化レベル（ＲＰＡ、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２のリン酸化レベル）を調べた写真である。
【発明を実施するための形態】
【0014】
以下に、本出願において開示する肺がんを治療するための併用薬（以下、単に「併用薬」と記載することがある。）、肺がん治療用医薬組成物および併用薬の適応患者を選択するための情報提供方法（以下、単に「情報提供方法」と記載することがある。）について説明する。
【0015】
（併用薬の実施形態）
先ず、併用薬の実施形態について説明する。併用薬の実施形態は、ＰＡＲＰ阻害剤を有効成分として含む第１医薬と、ＡＴＲ阻害剤を有効成分として含む第２医薬と、を含んでいる。
先ず、併用薬の実施形態について説明する。併用薬の実施形態は、ＰＡＲＰ阻害剤を有効成分として含む第１医薬と、ＡＴＲ阻害剤を有効成分として含む第２医薬と、を含んでいる。
【0016】
第１医薬に含まれるＰＡＲＰ（ｐｏｌｙ ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；ポリアデノシン５’二リン酸リボースポリメラーゼ）阻害剤は、ＤＮＡ修復たんぱく質であるＰＡＲＰを阻害することで、ＤＮＡ修復を妨げがん細胞の細胞死を誘導することで抗腫瘍効果を奏する。細胞の増殖には遺伝情報が刻まれたＤＮＡの複製が必要で、通常ＤＮＡは日々、紫外線などの刺激によって損傷を受けるが、正常な細胞では修復される。ＤＮＡの損傷のタイプが一本鎖切断の場合にはＰＡＲＰが働いて塩基除去修復による修復が行われる。一方、ＤＮＡの損傷タイプが二本鎖切断の場合にはＢＲＣＡ（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｇｅｎｅ：乳がんや卵巣がんなどの発生抑制に関与する遺伝子）などが働いて、相同組換え修復による修復が行われる。卵巣がん患者のおよそ半数にはＢＲＣＡなどが関わる修復経路に異常があり、二本鎖切断の修復を十分に行えないとされる。ＤＮＡ損傷が適切に修復されないと細胞が不安定になり細胞のがん化へつながる可能性が高くなる。
【0017】
ＰＡＲＰ阻害剤は、ＰＡＲＰの機能を阻害できる物質であれば特に制限はない。限定されるものではないが、例えば、以下に例示する阻害剤が挙げられる。なお、阻害剤が有効成分として含有する化合物の構造式はまとめて記載する。阻害剤名の後ろの（）内に記載の数値が、化合物一覧の数値に対応する。
【0018】
Ｏｌａｐａｒｉｂ（ＡＺＤ２２８１）（１）；Ｒｕｃａｐａｒｉｂ（２）；Ｎｉｒａｐａｒｉｂ（ＭＫ－４８２７）（３）；Ｖｅｌｉｐａｒｉｂ（ＡＢＴ－８８８）（４）；Ｔａｌａｚｏｐａｒｉｂ（ＢＭＮ ６７３）（５）；Ｍｉｎｏｃｙｃｌｉｎｅ（６）；Ｃｉｌｏｓｔａｚｏｌ（７）；ＰＪ３４ ＨＣｌ（８）；３－Ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ（９）；ＤＰＱ（１０）；ＸＡＶ－９３９（１１）；Ｉｎｉｐａｒｉｂ （ＢＳＩ－２０１）（１２）；ＡＧ－１４３６１（１３）；Ａ－９６６４９２（１４）；ＵＰＦ １０６９（１５）；ＡＺＤ２４６１（１６）；ＭＥ０３２８（１７）；Ｌｉｃｏｃｈａｌｃｏｎｅ Ｄ（１８）；ＭＮ ６４（１９）；４′，５，７－Ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖｏｎ（２０）；Ｒｕｃａｐａｒｉｂ（ＡＧ－０１４６９９） ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（２１）；ＧｅＡ－６９（２２）；ＢＹＫ２０４１６５（２３）；ＢＧＰ－１５ ２ＨＣｌ（２４）；Ａｔａｍｐａｒｉｂ（ＲＢＮ－２３９７）（２５）；Ｖｅｎａｄａｐａｒｉｂ（ＩＤＸ－１１９７）（２６）；Ｎｉｒａｐａｒｉｂ（ＭＫ－４８２７） ｔｏｓｙｌａｔｅ（２７）；ＮＵ１０２５（２８）；Ｒｕｃａｐａｒｉｂ Ｃａｍｓｙｌａｔｅ（２９）；Ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＮＳＣ ６４６６６６）（３０）；Ｐａｍｉｐａｒｉｂ（ＢＧＢ－２９０）（３１）；Ｆｌｕｚｏｐａｒｉｂ（ＳＨＲ－３１６２）（３２）；Ｇ００７－ＬＫ（３３）；ＮＶＰ－ＴＮＫＳ６５６（３４）；Ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｈｙｄｒａｔｅ（３５）；ＨＩ－ＴＯＰＫ－０３２（３６）；Ｓｔｅｎｏｐａｒｉｂ（Ｅ７４４９）（３７）；４－Ｈｙｄｒｏｘｙｑｕｉｎａｚｏｌｉｎｅ（３８）；ＮＭＳ－Ｐ１１８（３９）；ＷＩＫＩ４（４０）；ＲＢＮ０１２７５９（４１）；ＡＺＤ５３０５（４２）；ＲＫ－２８７１０７（４３）；Ｂｅｎｚａｍｉｄｅ（４４）；ＪＷ５５（４５）；Ｐｉｃｏｌｉｎａｍｉｄｅ（４６）；ＣＥＰ－９７２２（４７）；Ｅ－７０１６（４８）。
【化1】
【0019】
第２医薬に含まれるＡＴＲ阻害剤は、血管拡張性失調症及びＲａｄ３関連たんぱく質（ａｔａｘｉａ－ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ ａｎｄ Ｒａｄ３－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＡＴＲ）を阻害する化合物である。ＡＴＲキナーゼは、細胞ＤＮＡ損傷修復プロセスおよび細胞周期シグナル伝達に関与すると考えられるセリン／スレオニンプロテインキナーゼである。ＡＴＲキナーゼは、ＡＴＭ（「血管拡張性失調症変異」）キナーゼおよび他のたんぱく質とともに作用し、一般的にＤＮＡ損傷応答（「ＤＤＲ」）と呼ばれるＤＮＡ損傷に対する細胞の応答を調節する。ＤＤＲは、修復のための時間を提供する細胞周期チェックポイントを活性化することによって、ＤＮＡ修復を刺激し、生存を促進し、細胞周期の進行を停止させると考えられている。
【0020】
ＡＴＲ阻害剤は、ＡＴＲの機能を阻害できる物質であれば特に制限はない。限定されるものではないが、例えば、以下に例示する阻害剤が挙げられる。なお、阻害剤が有効成分として含有する化合物の構造式はまとめて記載する。阻害剤名の後ろの（）内に記載の数値が、化合物一覧の数値に対応する。
【0021】
ＡＺ２０（４９）；ＶＥ－８２１（５０）；Ｂｅｒｚｏｓｅｒｔｉｂ（ＶＥ－８２２）（５１）；Ｄａｃｔｏｌｉｓｉｂ（ＢＥＺ２３５）（５２）；ＥＴＰ－４６４６４（５３）；ＣＧＫ ７３３（５４）；Ｃｅｒａｌａｓｅｒｔｉｂ（ＡＺＤ６７３８）（５５）；Ｅｌｉｍｕｓｅｒｔｉｂ（ＢＡＹ－１８９５３４４）（５６）；ＨＡＭＮＯ（５７）；ＶＸ－８０３（Ｍ４３４４）（５８）；Ｔｏｒｉｎ ２（５９）；ＥＴＰ－４６４６４（６０）等が挙げられる。
【化2】
【0022】
第１医薬および第２医薬は、局所投与または全身投与することができる。投与形態は特に限定されず、経口投与および非経口投与の何れでもよい。また、第１医薬および第２医薬は、上記有効成分の他に、投与形態に応じて、薬理学的に許容しうる担体を含ませることができる。担体としては、例えば、賦形剤、崩壊剤若しくは崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤若しくは溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、および粘着剤等が挙げられる。
【0023】
第１医薬および第２医薬は、同時に使用してもよいし、時間差を設けて使用してもよい。両医薬について投与スケジュールを独立して設定し、前記スケジュールに従ってそれぞれの医薬を対象に対して投与することもできる。なお、時間差を設ける場合は、併用による効果を損なわない範囲内で、時間差を設定すればよい。両医薬とも投与回数は任意に設定することができ、単回もしくは複数回の投与を行うことができる。
【0024】
第１医薬および第２医薬の投与量は、患者の体重、年齢、疾患の重篤度等に応じて変動するものであり、特に限定するものではない。投与量は、医師が適宜設定すればよい。なお、本出願で開示する併用薬は、がんと診断されたのちに投与することでがんを治療することに加え、例えば、術後や他の抗がん剤で処置した後に、がん再発予防を目的とした更なる処置にも適用することができる。本明細書において「治療」とは、予防も含むことを意味する。
【0025】
肺がんは、組織型によって、非小細胞肺がんと小細胞肺がんの２つに大きく分けられる。後述する実施例に示すとおり、発生頻度が高い非小細胞肺がんでの効果が期待できる。
【0026】
後述する実施例および比較例に示す通り、ＰＯＬＤ４高発現細胞およびＰＯＬＤ４サイレンシング細胞にＰＡＲＰ阻害剤を単独で投与した場合、ＰＯＬＤ４高発現細胞およびＰＯＬＤ４サイレンシング細胞との間に、ＰＡＲＰ阻害剤感受性に特段の差異は見られなかった。また、ＡＴＲ阻害剤を単独で投与した場合も同様に、ＰＯＬＤ４高発現細胞およびＰＯＬＤ４サイレンシング細胞との間に、ＡＴＲ阻害剤感受性に特段の差異は見られなかった。しかしながら、ＰＡＲＰ阻害剤およびＡＴＲ阻害剤を併用した場合、ＰＯＬＤ４高発現細胞において、濃度依存的に、顕著な細胞増殖の抑制効果が見られた。ＰＯＬＤ４発現経路が活性化している細胞に対して、ＰＡＲＰ阻害剤およびＡＴＲ阻害剤を併用投与することで、従来知られていない機序で細胞に作用していると考えられる。
【0027】
なお、本明細書において「高発現」とは、絶対値を意味するのではなく、プラチナ製剤による治療効果が認められない（治療が有効ではない）程度にＰＯＬＤ４発現経路が活性化していることを意味する。また、本明細書において「プラチナ製剤による治療効果が認められない」とは、プラチナ製剤による治療効果が低い、または、治療効果が低いことが予測されることを意味する。治療効果が低いとは、治療効果がゼロまたは期待される治療効果を下回ることを意味し、患者の治療状況に基づき医師が判断する。治療効果が低いことが予測されるとは、後述する情報提供方法により提供された情報から、例えば、医師が判断すればよい。
【0028】
（肺がん治療用医薬組成物の実施形態）
次に、肺がん治療用医薬組成物の実施形態について説明する。後述する実施例および比較例に示す通り、ＰＡＲＰ阻害剤を有効成分として含む第１医薬、および、ＡＴＲ阻害剤を有効成分として含む第２医薬は、併用することで、顕著な細胞増殖の抑制効果が得られる。したがって、ＰＡＲＰ阻害剤を有効成分として含む肺がん治療用医薬組成物（第１医薬）は、ＡＴＲ阻害剤を有効成分として含む肺がん治療用医薬組成物（第２医薬）との併用療法に使用するための肺がん治療用医薬組成物として提供できる。同様に、ＡＴＲ阻害剤を有効成分として含む肺がん治療用医薬組成物（第２医薬）は、ＰＡＲＰ阻害剤を有効成分として含む肺がん治療用医薬組成物（第１医薬）との併用療法に使用するための肺がん治療用医薬組成物として提供できる。つまり、第１医薬と第２医薬は、併用治療に使用する目的で別々に供与され、使用時に併用してもよい。ＰＡＲＰ阻害剤を有効成分として含む肺がん治療用医薬組成物は、上記第１医薬として記載済みである。また、ＡＴＲ阻害剤を有効成分として含む肺がん治療用医薬組成物は、上記第２医薬として記載済みである。したがって、詳しい記載は省略する。
次に、肺がん治療用医薬組成物の実施形態について説明する。後述する実施例および比較例に示す通り、ＰＡＲＰ阻害剤を有効成分として含む第１医薬、および、ＡＴＲ阻害剤を有効成分として含む第２医薬は、併用することで、顕著な細胞増殖の抑制効果が得られる。したがって、ＰＡＲＰ阻害剤を有効成分として含む肺がん治療用医薬組成物（第１医薬）は、ＡＴＲ阻害剤を有効成分として含む肺がん治療用医薬組成物（第２医薬）との併用療法に使用するための肺がん治療用医薬組成物として提供できる。同様に、ＡＴＲ阻害剤を有効成分として含む肺がん治療用医薬組成物（第２医薬）は、ＰＡＲＰ阻害剤を有効成分として含む肺がん治療用医薬組成物（第１医薬）との併用療法に使用するための肺がん治療用医薬組成物として提供できる。つまり、第１医薬と第２医薬は、併用治療に使用する目的で別々に供与され、使用時に併用してもよい。ＰＡＲＰ阻害剤を有効成分として含む肺がん治療用医薬組成物は、上記第１医薬として記載済みである。また、ＡＴＲ阻害剤を有効成分として含む肺がん治療用医薬組成物は、上記第２医薬として記載済みである。したがって、詳しい記載は省略する。
【0029】
（情報提供方法の実施形態）
次に、情報提供方法の実施形態について説明する。上記のとおり、本出願で開示する併用薬は、ＰＯＬＤ４を高発現している場合に有用である。したがって、（１）被検体から肺がん細胞または組織を取得する取得工程と、（２）取得工程で得られた肺がん細胞中または取得工程で得られた組織に含まれる肺がん細胞中で発現しているＰＯＬＤ４の発現量、またはＲＰＡ（Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）またはＣＨＫ１（Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｋｉｎａｓｅ １）またはＣＨＫ２（Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｋｉｎａｓｅ ２）またはＨ２ＡＸ（ｆｏｒｍ ｏｆ Ｈ２Ａ ｈｉｓｔｏｎｅ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ Ｘ）の活性化レベル、またはそれらの組み合わせを測定する工程と、を実施することで、被検者が併用薬の適応患者であるか否か選択するための情報を提供できる。
次に、情報提供方法の実施形態について説明する。上記のとおり、本出願で開示する併用薬は、ＰＯＬＤ４を高発現している場合に有用である。したがって、（１）被検体から肺がん細胞または組織を取得する取得工程と、（２）取得工程で得られた肺がん細胞中または取得工程で得られた組織に含まれる肺がん細胞中で発現しているＰＯＬＤ４の発現量、またはＲＰＡ（Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）またはＣＨＫ１（Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｋｉｎａｓｅ １）またはＣＨＫ２（Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｋｉｎａｓｅ ２）またはＨ２ＡＸ（ｆｏｒｍ ｏｆ Ｈ２Ａ ｈｉｓｔｏｎｅ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ Ｘ）の活性化レベル、またはそれらの組み合わせを測定する工程と、を実施することで、被検者が併用薬の適応患者であるか否か選択するための情報を提供できる。
【0030】
被検体から肺がん細胞または組織を取得する工程は、公知の方法で実施すればよい。
【0031】
また、発現量または活性化レベルを測定する工程は、ＰＯＬＤ４の発現量、ＲＰＡ、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ｈ２ＡＸの活性化レベルが測定できれば特に制限はない。例えば、ＰＯＬＤ４の発現量は、リアルタイムＰＣＲ等、公知の方法でＰＯＬＤ４のたんぱく質またはｍＲＮＡの発現量を測定すればよい。ところで、ＰＯＬＤ４の発現量の低下は、複製ストレスにより誘導されるＲＰＡ及びＣＨＫ１の活性化レベル（リン酸化レベル）の低下をもたらすことが知られている（必要であれば、鈴木元、他１名、「新規複製ストレス応答因子を介した発がん制御機構の解明」、［令和４年５月１３日検索］、インターネット＜https://www.acrf.or.jp/joseikin/H31/018.pdf＞参照）。また、臨床肺がん検体において、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ｈ２ＡＸが常時活性化していることは既知である（Ｖａｓｓｉｌｉｓ Ｇ． Ｇｏｒｇｏｕｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，“Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｒｅｃａｎｃｅｒｏｕｓ ｌｅｓｉｏｎｓ”，ＮＡＴＵＲＥ，ＶＯＬ ４３４，２００５，ｐ９０７－９１２）。したがって、活性化レベルを測定する工程では、ＰＯＬＤ４により誘導される、ＲＰＡ、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ｈ２ＡＸの活性化レベルを測定してもよい。ＲＰＡ、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ｈ２ＡＸの活性化レベルが高くなるほど、ＲＰＡ、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ｈ２ＡＸがリン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ）する。ＲＰＡ、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ｈ２ＡＸが、それぞれリン酸化した、ｐＲＰＡ、ｐＣＨＫ１、ｐＣＨＫ２、γＨ２ＡＸはたんぱく質であることから、例えば、抗体を用いたＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ等の方法によりｐＲＰＡ、ｐＣＨＫ１、ｐＣＨＫ２、γＨ２ＡＸの発現量を測定することで、ＲＰＡ、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ｈ２ＡＸの活性化レベルを測定できる。なお、上記ＮＡＴＵＲＥの「ｐＴＣＨＫ２」は、「ｐＣＨＫ２」と同じ意味である。また、本技術分野において、「ｐＲＰＡ」、「ｐＣＨＫ１」は、それぞれ、「ｐＳＲＰＡ」、「ｐＳＣＨＫ１」と記載されることもある。
【0032】
情報提供方法により提供された情報は、併用薬の適応患者を選択するための情報として利用できる。患者にとって併用薬が有用であるか否かの判断は、提供された情報に基づき、医師が判断すればよい。
【0033】
以下に実施例を掲げ、本出願で開示する実施形態を具体的に説明するが、この実施例は単に実施形態の説明のためのものである。本出願で開示する技術的範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。
【実施例0034】
先ず、使用した細胞株、薬剤、ｓｉＲＮＡによるＰＯＬＤ４の発現抑制（サイレンシング）手順を以下に記載する。
（１）細胞株
非小細胞肺がん細胞株として、Ａ５４９（肺非小細胞がん）、ＮＣＩ－Ｈ１９７５（肺非小細胞がん）、ＰＣ－９（肺非小細胞がん）、ＰＣ－１０（肺非小細胞がん）を用いた。なお、細胞は研究開発に先立って、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎにより細胞認証したものを使用した（Ｃｅｌｌ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｐｏｒｔ（ＫＢＮ０５４６）およびＣｅｌｌ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｐｏｒｔ（ＫＢＮ０６１３））。なお、Ａ５４９のＡＴＣＣ番号は「ＣＣＬ－１８５TM」、ＮＣＩ－Ｈ１９７５のＡＴＣＣ番号は「ＣＲＬ－５９０８TM」である。また、ＰＣ－９のＲＩＫＥＮ ＢＲＣの番号は「ＲＣＢ４４５５」、ＰＣ－１０のＣｅｌｌｏｓａｕｒｕｓ（Ｅｘｐａｓｙ）の番号は「ＣＶＣＬ＿７０８８」である。正常細胞株として用いたＦＢ２２７（線維芽細胞）は発明者が樹立した（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｏｌ Ｍｅｄ，２４：１１９４９－１１９５９，２０２０）。各細胞株は全て５％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ１６４０液体培地（Ｍｅｒｃｋ，Ｒ８７５８）にて培養した。
（１）細胞株
非小細胞肺がん細胞株として、Ａ５４９（肺非小細胞がん）、ＮＣＩ－Ｈ１９７５（肺非小細胞がん）、ＰＣ－９（肺非小細胞がん）、ＰＣ－１０（肺非小細胞がん）を用いた。なお、細胞は研究開発に先立って、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎにより細胞認証したものを使用した（Ｃｅｌｌ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｐｏｒｔ（ＫＢＮ０５４６）およびＣｅｌｌ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｐｏｒｔ（ＫＢＮ０６１３））。なお、Ａ５４９のＡＴＣＣ番号は「ＣＣＬ－１８５TM」、ＮＣＩ－Ｈ１９７５のＡＴＣＣ番号は「ＣＲＬ－５９０８TM」である。また、ＰＣ－９のＲＩＫＥＮ ＢＲＣの番号は「ＲＣＢ４４５５」、ＰＣ－１０のＣｅｌｌｏｓａｕｒｕｓ（Ｅｘｐａｓｙ）の番号は「ＣＶＣＬ＿７０８８」である。正常細胞株として用いたＦＢ２２７（線維芽細胞）は発明者が樹立した（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｏｌ Ｍｅｄ，２４：１１９４９－１１９５９，２０２０）。各細胞株は全て５％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ１６４０液体培地（Ｍｅｒｃｋ，Ｒ８７５８）にて培養した。
【0035】
（２）薬剤
細胞の生存率測定には、ＰＡＲＰ１およびＰＡＲＰ２阻害剤であるオラパリブ（ＣｈｅｍＳｃｅｎｅ，ＣＳ－００７５）およびべリパリブ（Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｂｉｏｔｅｃｋ，Ｓ１００４）、並びに、ＡＴＲ阻害剤であるＶＥ－８２１（ＣｈｅｍＳｃｅｎｅ，ＣＳ－０２３８）およびＶＥ－８２２（Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｂｉｏｔｅｃｋ，Ｓ７１０２）を用いた。
細胞の生存率測定には、ＰＡＲＰ１およびＰＡＲＰ２阻害剤であるオラパリブ（ＣｈｅｍＳｃｅｎｅ，ＣＳ－００７５）およびべリパリブ（Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｂｉｏｔｅｃｋ，Ｓ１００４）、並びに、ＡＴＲ阻害剤であるＶＥ－８２１（ＣｈｅｍＳｃｅｎｅ，ＣＳ－０２３８）およびＶＥ－８２２（Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｂｉｏｔｅｃｋ，Ｓ７１０２）を用いた。
【0036】
（３）ｓｉＲＮＡによるＰＯＬＤ４の発現抑制
ＰＯＬＤ４サイレンシングのための細胞へのｓｉＲＮＡ導入にはＮｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。機器説明書に従ってｓｉＲＮＡの終濃度２０ｎＭでエレクトロポレーションを行い、７２時間培養後に実験に用いた。
サイレンシングの対照実験のためのｓｉＣｔｒｌ（ＳＩＣ００２－１０）、および、ＰＯＬＤ４サイレンシングのためのｓｉＰＯＬＤ４（ＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿００１２２６７１）は、Ｍｅｒｃｋより購入した。なお、以下の実験および図において、ＰＯＬＤ４サイレンシング処理した細胞（ＰＯＬＤ４の発現が抑制された細胞）を「ｓｉＰＯＬＤ４」、サイレンシングの対照実験のためのｓｉＣｔｒｌ処理した細胞（ＰＯＬＤ４高発現）を「ＣＴＲＬ」と記載することがある。
ＰＯＬＤ４サイレンシングのための細胞へのｓｉＲＮＡ導入にはＮｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。機器説明書に従ってｓｉＲＮＡの終濃度２０ｎＭでエレクトロポレーションを行い、７２時間培養後に実験に用いた。
サイレンシングの対照実験のためのｓｉＣｔｒｌ（ＳＩＣ００２－１０）、および、ＰＯＬＤ４サイレンシングのためのｓｉＰＯＬＤ４（ＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿００１２２６７１）は、Ｍｅｒｃｋより購入した。なお、以下の実験および図において、ＰＯＬＤ４サイレンシング処理した細胞（ＰＯＬＤ４の発現が抑制された細胞）を「ｓｉＰＯＬＤ４」、サイレンシングの対照実験のためのｓｉＣｔｒｌ処理した細胞（ＰＯＬＤ４高発現）を「ＣＴＲＬ」と記載することがある。
【0037】
［コロニーフォーメーションアッセイによる生存率測定］
＜ＡＴＲ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤の単独投与（比較例１）＞
ｓｉＣｔｒｌおよびｓｉＰＯＬＤ４処理したＡ５４９（肺非小細胞がん細胞）に対し、ＡＴＲ阻害剤（ＶＥ－８２１）と、ＰＡＲＰ阻害剤（オラパリブ）と、を単独投与した時の効果について確認した。処理細胞に対してＶＥ－８２１を終濃度０μＭ、０．２μＭ、０．５μＭとなるよう調整した培地を用いてそれぞれ６ウェルプレートに播種した。また、処理細胞に対してオラパリブを終濃度０μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭとなるよう調整した培地を用いてそれぞれ６ウェルプレートに播種した。３６時間培養後に薬剤添加培地を除き、リン酸緩衝生理食塩水にて３回洗浄後に通常培地に置換して７～１４日間培養した。その後、培地を染色液（０．０２５％クリスタルバイオレット、２５％メタノール）に置換して室温で１５分間反応させてコロニーを染色し、流水にて洗浄・風乾後にコロニー数の測定を行った。図１に結果を示す。図１から明らかなように、ＡＴＲ阻害剤と、ＰＡＲＰ阻害剤と、を単独で投与した場合、ＣＴＲＬおよびｓｉＰＯＬＤ４との間に特段の差異は見られなかった。
＜ＡＴＲ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤の単独投与（比較例１）＞
ｓｉＣｔｒｌおよびｓｉＰＯＬＤ４処理したＡ５４９（肺非小細胞がん細胞）に対し、ＡＴＲ阻害剤（ＶＥ－８２１）と、ＰＡＲＰ阻害剤（オラパリブ）と、を単独投与した時の効果について確認した。処理細胞に対してＶＥ－８２１を終濃度０μＭ、０．２μＭ、０．５μＭとなるよう調整した培地を用いてそれぞれ６ウェルプレートに播種した。また、処理細胞に対してオラパリブを終濃度０μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭとなるよう調整した培地を用いてそれぞれ６ウェルプレートに播種した。３６時間培養後に薬剤添加培地を除き、リン酸緩衝生理食塩水にて３回洗浄後に通常培地に置換して７～１４日間培養した。その後、培地を染色液（０．０２５％クリスタルバイオレット、２５％メタノール）に置換して室温で１５分間反応させてコロニーを染色し、流水にて洗浄・風乾後にコロニー数の測定を行った。図１に結果を示す。図１から明らかなように、ＡＴＲ阻害剤と、ＰＡＲＰ阻害剤と、を単独で投与した場合、ＣＴＲＬおよびｓｉＰＯＬＤ４との間に特段の差異は見られなかった。
【0038】
＜ＡＴＲ阻害剤およびＰＡＲＰ阻害剤の併用投与＞
次に、ＡＴＲ阻害剤およびＰＡＲＰ阻害剤の種類を変えながら併用投与、更に、異なる細胞株を用いた実験を行った。
次に、ＡＴＲ阻害剤およびＰＡＲＰ阻害剤の種類を変えながら併用投与、更に、異なる細胞株を用いた実験を行った。
【0039】
（実施例１）
上記比較例１に記載のＣＴＲＬおよびｓｉＰＯＬＤ４に対し、ＡＴＲ阻害剤（ＶＥ－８２１）を終濃度０μＭ、０．２μＭ、０．５μＭとなるよう調整した培地を用いてそれぞれ６ウェルプレートに播種した後、各ウェルにＰＡＲＰ阻害剤（オラパリブ）を終濃度０μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭとなるよう添加した以外は、比較例１と同様の手順でコロニー数の測定を行った。図２に結果を示す。図２から明らかなように、ＡＴＲ阻害剤（ＶＥ－８２１）およびＰＡＲＰ阻害剤（オラパリブ）を併用した場合、濃度依存的に、ｓｉＰＯＬＤ４と比較してＰＯＬＤ４高発現株であるＣＴＲＬの細胞増殖が顕著に抑制された。比較例１では、ＡＴＲ阻害剤（ＶＥ－８２１）と、ＰＡＲＰ阻害剤（オラパリブ）と、を単独で用いた場合には、ｓｉＰＯＬＤ４とＣＴＲＬの間に特段の差異は見られなかったことから、ＡＴＲ阻害剤（ＶＥ－８２１）およびＰＡＲＰ阻害剤（オラパリブ）の併用がＰＯＬＤ４発現経路に新たな機序に基づき作用したことで、細胞増殖が抑制されたと推測できる。
上記比較例１に記載のＣＴＲＬおよびｓｉＰＯＬＤ４に対し、ＡＴＲ阻害剤（ＶＥ－８２１）を終濃度０μＭ、０．２μＭ、０．５μＭとなるよう調整した培地を用いてそれぞれ６ウェルプレートに播種した後、各ウェルにＰＡＲＰ阻害剤（オラパリブ）を終濃度０μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭとなるよう添加した以外は、比較例１と同様の手順でコロニー数の測定を行った。図２に結果を示す。図２から明らかなように、ＡＴＲ阻害剤（ＶＥ－８２１）およびＰＡＲＰ阻害剤（オラパリブ）を併用した場合、濃度依存的に、ｓｉＰＯＬＤ４と比較してＰＯＬＤ４高発現株であるＣＴＲＬの細胞増殖が顕著に抑制された。比較例１では、ＡＴＲ阻害剤（ＶＥ－８２１）と、ＰＡＲＰ阻害剤（オラパリブ）と、を単独で用いた場合には、ｓｉＰＯＬＤ４とＣＴＲＬの間に特段の差異は見られなかったことから、ＡＴＲ阻害剤（ＶＥ－８２１）およびＰＡＲＰ阻害剤（オラパリブ）の併用がＰＯＬＤ４発現経路に新たな機序に基づき作用したことで、細胞増殖が抑制されたと推測できる。
【0040】
（実施例２）
実施例１のＡＴＲ阻害剤であるＶＥ－８２１に替え、ＶＥ－８２２を用いた。ＶＥ－８２２を終濃度０μＭ、０．０５μＭとなるよう調整した培地を用いてそれぞれ６ウェルプレートに播種した後、ＰＡＲＰ阻害剤（オラパリブ）を終濃度０μＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭとなるよう添加した以外は、実施例１と同様の手順で実験を行った。図３に結果を示す。図３から明らかなように、ＡＴＲ阻害剤として、ＶＥ－８２１に替えＶＥ－８２２を用いた場合でも、実施例１と同様の効果が得られることを確認した。
実施例１のＡＴＲ阻害剤であるＶＥ－８２１に替え、ＶＥ－８２２を用いた。ＶＥ－８２２を終濃度０μＭ、０．０５μＭとなるよう調整した培地を用いてそれぞれ６ウェルプレートに播種した後、ＰＡＲＰ阻害剤（オラパリブ）を終濃度０μＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭとなるよう添加した以外は、実施例１と同様の手順で実験を行った。図３に結果を示す。図３から明らかなように、ＡＴＲ阻害剤として、ＶＥ－８２１に替えＶＥ－８２２を用いた場合でも、実施例１と同様の効果が得られることを確認した。
【0041】
（実施例３）
実施例１のＰＡＲＰ阻害剤であるオラパリブに替え、ベリパリブを用いた。ＡＴＲ阻害剤（ＶＥ－８２１）を終濃度０μＭ、１μＭとなるよう調整した培地を用いてそれぞれ６ウェルプレートに播種した後、ＰＡＲＰ阻害剤（ベリパリブ）を終濃度０μＭ、１０μＭ、２０μＭ、５０μＭとなるよう添加した以外は、実施例１と同様の手順で実験を行った。図４に結果を示す。図４から明らかなように、ＰＡＲＰ阻害剤として、オラパリブに替えベリパリブを用いた場合でも、実施例１と同様の効果が得られることを確認した。
実施例１のＰＡＲＰ阻害剤であるオラパリブに替え、ベリパリブを用いた。ＡＴＲ阻害剤（ＶＥ－８２１）を終濃度０μＭ、１μＭとなるよう調整した培地を用いてそれぞれ６ウェルプレートに播種した後、ＰＡＲＰ阻害剤（ベリパリブ）を終濃度０μＭ、１０μＭ、２０μＭ、５０μＭとなるよう添加した以外は、実施例１と同様の手順で実験を行った。図４に結果を示す。図４から明らかなように、ＰＡＲＰ阻害剤として、オラパリブに替えベリパリブを用いた場合でも、実施例１と同様の効果が得られることを確認した。
【0042】
（実施例４～６）
実施例１のＡ５４９（肺非小細胞がん）に替え、ＰＣ－９（肺非小細胞がん；実施例４）、ＰＣ－１０（肺非小細胞がん；実施例５）、ＮＣＩ－Ｈ１９７５（肺非小細胞がん；実施例６）を用いた。なお、ＮＣＩ－Ｈ１９７５（肺非小細胞がん；実施例６）細胞については、ＡＴＲ阻害剤（ＶＥ－８２１）を終濃度０μＭ、１μＭ、２μＭとなるよう調整した培地を用いてそれぞれ６ウェルプレートに播種し、ＰＡＲＰ阻害剤（オラパリブ）を終濃度０μＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭとなるよう添加した以外は、実施例１と同様の手順で実験を行った。図５にＰＣ－９（実施例４）、図６にＰＣ－１０（実施例５）、図７にＮＣＩ－Ｈ１９７５（実施例６）の結果を示す。図５～図７に示す結果から明らかなように、Ａ５４９以外の肺非小細胞がん細胞ＮＣＩ－Ｈ１９７５においても、ＡＴＲ阻害剤（ＶＥ－８２１）およびＰＡＲＰ阻害剤（オラパリブ）の併用は、ＰＯＬＤ４ ｍＲＮＡ発現量依存的に細胞の増殖を協調的に抑制できる効果が観察された。一方、Ａ５４９、ＮＣＩ－Ｈ１９７５に比してＰＯＬＤ４発現量の低いＰＣ－９（実施例４）、ＰＣ－１０（実施例５）については、ｓｉＰＯＬＤ４とＣＴＲＬの間に顕著な差異は見られなかった。
実施例１のＡ５４９（肺非小細胞がん）に替え、ＰＣ－９（肺非小細胞がん；実施例４）、ＰＣ－１０（肺非小細胞がん；実施例５）、ＮＣＩ－Ｈ１９７５（肺非小細胞がん；実施例６）を用いた。なお、ＮＣＩ－Ｈ１９７５（肺非小細胞がん；実施例６）細胞については、ＡＴＲ阻害剤（ＶＥ－８２１）を終濃度０μＭ、１μＭ、２μＭとなるよう調整した培地を用いてそれぞれ６ウェルプレートに播種し、ＰＡＲＰ阻害剤（オラパリブ）を終濃度０μＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭとなるよう添加した以外は、実施例１と同様の手順で実験を行った。図５にＰＣ－９（実施例４）、図６にＰＣ－１０（実施例５）、図７にＮＣＩ－Ｈ１９７５（実施例６）の結果を示す。図５～図７に示す結果から明らかなように、Ａ５４９以外の肺非小細胞がん細胞ＮＣＩ－Ｈ１９７５においても、ＡＴＲ阻害剤（ＶＥ－８２１）およびＰＡＲＰ阻害剤（オラパリブ）の併用は、ＰＯＬＤ４ ｍＲＮＡ発現量依存的に細胞の増殖を協調的に抑制できる効果が観察された。一方、Ａ５４９、ＮＣＩ－Ｈ１９７５に比してＰＯＬＤ４発現量の低いＰＣ－９（実施例４）、ＰＣ－１０（実施例５）については、ｓｉＰＯＬＤ４とＣＴＲＬの間に顕著な差異は見られなかった。
【0043】
［ＰＯＬＤ４発現量と、ＡＴＲ阻害剤およびＰＡＲＰ阻害剤の併用投与の感受性について］
（実施例７）
次に、複数種類の細胞を用い、ＲＴ－ｑＰＣＲによるＰＯＬＤ４ ｍＲＮＡ定量によるｍＲＮＡ発現量と、ＡＴＲ阻害剤およびＰＡＲＰ阻害剤の併用投与の感受性の関係について調べた。実施例７では、Ａ５４９（肺非小細胞がん）、ＮＣＩ－Ｈ１９７５（肺非小細胞がん）、ＰＣ－１０（肺非小細胞がん）、ＰＣ－９（肺非小細胞がん）をそのまま用いた。細胞ＲＮＡは、ｍｉＲＮｅａｓｙ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，１０３８７０３）を用いて抽出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＶＩＬＯ（登録商標） ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， １１７５４０５０）を用いてＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，２０４１４３）およびＲｏｔｏｒ Ｇｅｎｅ ３０００ ｓｙｓｔｅｍ（Ｑｉａｇｅｎ）によりリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＯＬＤ４のプライマーはｐｏｌＤ４Ｆ１（配列番号１：５’－ＡＣＡＧＡＡＧＣＧＡＧＡＧＣＣＣＡＴＴＧ）、ｐｏｌＤ４Ｒ１（配列番号２：５’－ＧＡＴＧＧＡＧＧＡＧＴＴＧＡＧＣＣＴＣＴＧＡ）を、内在性コントロールである１８Ｓのプライマーは１８Ｓ ＦＷＤ（配列番号３：５’－ＡＡＴＣＡＧＧＧＴＴＣＧＡＴＴＣＣＧＧＡ）、１８Ｓ ＲＶ（配列番号４：５’－ＣＣＡＡＧＡＴＣＣＡＡＣＴＡＣＧＡＧＣＴ）を用いた。ＰＯＬＤ４と１８ＳのＣｔ値から、細胞間のΔΔＣｔ値を求めることでＰＯＬＤ４の相対的発現量を定量した。ＡＴＲ阻害剤（ＶＥ－８２１）を終濃度０．５μＭとなるよう調整した培地を用いてそれぞれ６ウェルプレートに播種した後、ＰＡＲＰ阻害剤（オラパリブ）を終濃度が０μＭ～１０μＭとなるように濃度を変えながら添加することでオラパリブの半数阻害濃度（ＩＣ５０）を調べ、ＩＣ５０のＰＯＬＤ４のｍＲＮＡを測定した。図８に結果を示す。相関係数Ｒは０．９５であり、ＰＯＬＤ４の経路活性が高い細胞（Ａ５４９およびＮＣＩ－Ｈ１９７５）は低い細胞（ＰＣ－１０、ＰＣ－９）に比べて、ＡＴＲ阻害剤およびＰＡＲＰ阻害剤の併用投与の感受性が高いことを確認した。
（実施例７）
次に、複数種類の細胞を用い、ＲＴ－ｑＰＣＲによるＰＯＬＤ４ ｍＲＮＡ定量によるｍＲＮＡ発現量と、ＡＴＲ阻害剤およびＰＡＲＰ阻害剤の併用投与の感受性の関係について調べた。実施例７では、Ａ５４９（肺非小細胞がん）、ＮＣＩ－Ｈ１９７５（肺非小細胞がん）、ＰＣ－１０（肺非小細胞がん）、ＰＣ－９（肺非小細胞がん）をそのまま用いた。細胞ＲＮＡは、ｍｉＲＮｅａｓｙ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，１０３８７０３）を用いて抽出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＶＩＬＯ（登録商標） ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， １１７５４０５０）を用いてＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，２０４１４３）およびＲｏｔｏｒ Ｇｅｎｅ ３０００ ｓｙｓｔｅｍ（Ｑｉａｇｅｎ）によりリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＯＬＤ４のプライマーはｐｏｌＤ４Ｆ１（配列番号１：５’－ＡＣＡＧＡＡＧＣＧＡＧＡＧＣＣＣＡＴＴＧ）、ｐｏｌＤ４Ｒ１（配列番号２：５’－ＧＡＴＧＧＡＧＧＡＧＴＴＧＡＧＣＣＴＣＴＧＡ）を、内在性コントロールである１８Ｓのプライマーは１８Ｓ ＦＷＤ（配列番号３：５’－ＡＡＴＣＡＧＧＧＴＴＣＧＡＴＴＣＣＧＧＡ）、１８Ｓ ＲＶ（配列番号４：５’－ＣＣＡＡＧＡＴＣＣＡＡＣＴＡＣＧＡＧＣＴ）を用いた。ＰＯＬＤ４と１８ＳのＣｔ値から、細胞間のΔΔＣｔ値を求めることでＰＯＬＤ４の相対的発現量を定量した。ＡＴＲ阻害剤（ＶＥ－８２１）を終濃度０．５μＭとなるよう調整した培地を用いてそれぞれ６ウェルプレートに播種した後、ＰＡＲＰ阻害剤（オラパリブ）を終濃度が０μＭ～１０μＭとなるように濃度を変えながら添加することでオラパリブの半数阻害濃度（ＩＣ５０）を調べ、ＩＣ５０のＰＯＬＤ４のｍＲＮＡを測定した。図８に結果を示す。相関係数Ｒは０．９５であり、ＰＯＬＤ４の経路活性が高い細胞（Ａ５４９およびＮＣＩ－Ｈ１９７５）は低い細胞（ＰＣ－１０、ＰＣ－９）に比べて、ＡＴＲ阻害剤およびＰＡＲＰ阻害剤の併用投与の感受性が高いことを確認した。
【0044】
［ＡＴＲ阻害剤およびＰＡＲＰ阻害剤が正常細胞へ与える影響について］
（実施例８）
次に、ＭＴＴアッセイによる生存率測定方法を用い、ＡＴＲ阻害剤およびＰＡＲＰ阻害剤が正常細胞に与える影響を調べた。細胞にはＡ５４９（肺非小細胞がん細胞）およびＦＢ２２７（正常細胞）を用いた。ＡＴＲ阻害剤（ＶＥ－８２１）を終濃度０Ｍ、０．５μＭとなるように調整した培地を用いてそれぞれ９６ウェルプレートに播種した後、各ウェルにＰＡＲＰ阻害剤（オラパリブ）を終濃度０～２００μＭとなるよう添加した。７２時間培養後にＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（ＤＯＪＩＮＤＯ）を用いて発色させ、マイクロプレートリーダーにて吸光度を測定することで生細胞数を決定した。図９に結果を示す。図９から明らかなように、ＡＴＲ阻害剤およびＰＡＲＰ阻害剤が正常細胞へ与える影響は、がん細胞より低いことを確認した。
（実施例８）
次に、ＭＴＴアッセイによる生存率測定方法を用い、ＡＴＲ阻害剤およびＰＡＲＰ阻害剤が正常細胞に与える影響を調べた。細胞にはＡ５４９（肺非小細胞がん細胞）およびＦＢ２２７（正常細胞）を用いた。ＡＴＲ阻害剤（ＶＥ－８２１）を終濃度０Ｍ、０．５μＭとなるように調整した培地を用いてそれぞれ９６ウェルプレートに播種した後、各ウェルにＰＡＲＰ阻害剤（オラパリブ）を終濃度０～２００μＭとなるよう添加した。７２時間培養後にＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（ＤＯＪＩＮＤＯ）を用いて発色させ、マイクロプレートリーダーにて吸光度を測定することで生細胞数を決定した。図９に結果を示す。図９から明らかなように、ＡＴＲ阻害剤およびＰＡＲＰ阻害剤が正常細胞へ与える影響は、がん細胞より低いことを確認した。
【0045】
［ＲＰＡ、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２の活性化レベルの測定］
（実施例９）
次に、Ａ５４９細胞を用いて、ＲＰＡ、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２の活性化レベルの測定を行った。具体的には、ｓｉＣｔｒｌ及びｓｉＰＯＬＤ４処理したＡ５４９細胞に対し、シスプラチン（ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｗａｋｏ，０３３－２００９１）を終濃度１０μＭとなるように添加した。２４時間培養後にリン酸緩衝生理食塩水にて洗浄し、全細胞溶解液を抽出してＬａｅｍｌｉ法によるＳＤＳ電気泳動を行った。泳動後、たんぱく質はＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写し、抗ＲＰＡ抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ２１７５）、抗ｐＲＰＡ（Ｓ４／Ｓ８）抗体（Ｂｅｔｈｙｌ，Ａ３００－２４５Ａ）、抗ｐＣＨＫ１（Ｓ３４５）抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，２３４８Ｓ）、抗ｐＣＨＫ２（Ｔ６８）抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，２１９７Ｓ）、抗Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ３抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ１７９１）を用いてウエスタンブロッティングを行った。シグナルの検出には、ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ｃｙｔｉｖａ， ＲＰＮ２１０６）及びＬｕｍｉｎｏ Ｇｒａｐｈ Ｉ （ＡＴＴＯ）を用いた。
（実施例９）
次に、Ａ５４９細胞を用いて、ＲＰＡ、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２の活性化レベルの測定を行った。具体的には、ｓｉＣｔｒｌ及びｓｉＰＯＬＤ４処理したＡ５４９細胞に対し、シスプラチン（ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｗａｋｏ，０３３－２００９１）を終濃度１０μＭとなるように添加した。２４時間培養後にリン酸緩衝生理食塩水にて洗浄し、全細胞溶解液を抽出してＬａｅｍｌｉ法によるＳＤＳ電気泳動を行った。泳動後、たんぱく質はＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写し、抗ＲＰＡ抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ２１７５）、抗ｐＲＰＡ（Ｓ４／Ｓ８）抗体（Ｂｅｔｈｙｌ，Ａ３００－２４５Ａ）、抗ｐＣＨＫ１（Ｓ３４５）抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，２３４８Ｓ）、抗ｐＣＨＫ２（Ｔ６８）抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，２１９７Ｓ）、抗Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ３抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ１７９１）を用いてウエスタンブロッティングを行った。シグナルの検出には、ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ｃｙｔｉｖａ， ＲＰＮ２１０６）及びＬｕｍｉｎｏ Ｇｒａｐｈ Ｉ （ＡＴＴＯ）を用いた。
【0046】
図１０に結果を示す。図１０から明らかなように、ＰＯＬＤ４高発現株であるｓｉＣｔｒｌと比較して、ＰＯＬＤ４の発現が抑制されたｓｉＰＯＬＤ４では、ｐＲＰＡ、ｐＣＨＫ１、ｐＣＨＫ２の発現が抑制されたこと、つまり、ＲＰＡ、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２の活性化レベルが抑制されたことを確認した。実施例７に記載のとおり、ＰＯＬＤ４の経路活性が高い細胞ほど、ＡＴＲ阻害剤およびＰＡＲＰ阻害剤の併用投与の感受性が高い。したがって、肺がん細胞中または組織中で発現しているＰＯＬＤ４の発現量、または、ＲＰＡ、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ｈ２ＡＸの活性化レベル、またはそれらの組み合わせの情報は、併用薬の適応患者を選択するための情報として利用できる。
【産業上の利用可能性】
【0047】
ＰＡＲＰ阻害剤およびＡＴＲ阻害剤を併用することで、新たな作用機序による肺がんを治療するための併用薬を提供できる。したがって、肺がんの創薬に有用である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】