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特開2023-179400抗メソテリン抗体、抗ＣＤ３抗体又は抗ＥＧＦＲ抗体を含む融合タンパク質、それを含む二重特異性又は三重特異性抗体、及びその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023179400
(43)【公開日】2023-12-19
(54)【発明の名称】抗メソテリン抗体、抗ＣＤ３抗体又は抗ＥＧＦＲ抗体を含む融合タンパク質、それを含む二重特異性又は三重特異性抗体、及びその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20231212BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20231212BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20231212BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20231212BHJP
A61K 47/65 20170101ALI20231212BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20231212BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231212BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20231212BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20231212BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00 ZNA
C07K16/18
C07K16/46
A61K47/68
A61K47/65
A61K39/395 N
A61P35/00
C12N15/13
C12N15/62 Z
【審査請求】有
【請求項の数】23
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023122273
(22)【出願日】2023-07-27
(62)【分割の表示】P 2021551780の分割
【原出願日】2019-12-16
(31)【優先権主張番号】62/826,442
(32)【優先日】2019-03-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】506379781
【氏名又は名称】グリーン・クロス・コーポレイション
【氏名又は名称原語表記】ＧＲＥＥＮ ＣＲＯＳＳ ＣＯＲＰ．
(71)【出願人】
【識別番号】504385351
【氏名又は名称】モガム・インスティテュート・フォー・バイオメディカル・リサーチ
【氏名又は名称原語表記】ＭＯＧＡＭ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＦＯＲ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100123995
【弁理士】
【氏名又は名称】野田 雅一
(74)【代理人】
【識別番号】100200540
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 祐子
(72)【発明者】
【氏名】リム， ヤンミ
(72)【発明者】
【氏名】リー， シナイ
(72)【発明者】
【氏名】ウォン， ジョンファ
(72)【発明者】
【氏名】パク， ヨン‐ヤ
(72)【発明者】
【氏名】ユン， エリン
(72)【発明者】
【氏名】リー， スア
(72)【発明者】
【氏名】リム， オクジェ
(72)【発明者】
【氏名】リム， ソジュン
(72)【発明者】
【氏名】キム， ムンキョン
(57)【要約】 （修正有）
【課題】抗メソテリン抗体、抗ＣＤ３抗体又は抗ＥＧＦＲ抗体の断片を含む融合タンパク質、メソテリン及びＣＤ３に特異的な二重特異性抗体、メソテリン、ＣＤ３及びＥＧＦＲに特異的な三重特異性抗体、及びその使用を提供する。
【解決手段】本発明に記載の特定の配列を有する二重特異性又は三重特異性抗体は、高収率且つ高純度で調製することができ、優れた殺腫瘍効果及び増殖抑制効果を有するため、癌治療に有効に利用することができる。
【選択図】なし
【解決手段】本発明に記載の特定の配列を有する二重特異性又は三重特異性抗体は、高収率且つ高純度で調製することができ、優れた殺腫瘍効果及び増殖抑制効果を有するため、癌治療に有効に利用することができる。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
構造式１：
［構造式１］
Ｎ’－Ａ－Ｂ－Ｌ１－Ｃ－Ｄ－Ｌ２－Ｅ－Ｆ－Ｌ３－Ｇ－Ｈ－Ｌ４－Ｉ－Ｃ’
（式中、Ｎ’は、融合タンパク質のＮ末端であり、
Ｃ’は、融合タンパク質のＣ末端であり、
Ａは、メソテリンと特異的に結合する抗体の軽鎖可変ドメインであり、前記ドメインは配列番号２５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２６の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２７の軽鎖ＣＤＲ３を含み、
Ｂは、前記抗体の軽鎖定常ドメインであり、
Ｃは、メソテリンと特異的に結合する前記抗体の重鎖可変ドメインであり、前記ドメインは配列番号２８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３０の重鎖ＣＤＲ３を含み、
Ｄは、前記抗体の重鎖定常ドメイン中のＣＨ１ドメインであり、
Ｅは、ＣＤ３と特異的に結合する抗体の軽鎖可変ドメインであり、前記ドメインは配列番号３１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ３を含み、
Ｆは、前記抗体の軽鎖定常ドメインであり、
Ｇは、ＣＤ３と特異的に結合する前記抗体の重鎖可変ドメインであり、前記ドメインは配列番号３４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３５の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３６の重鎖ＣＤＲ３を含み、
Ｈは、前記抗体の重鎖定常ドメイン中のＣＨ１ドメインであり、
Ｉは、Ｆｃ領域又はそのバリアントであり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４のそれぞれは、ペプチドリンカーである）
を有する第１の融合タンパク質。
［構造式１］
Ｎ’－Ａ－Ｂ－Ｌ１－Ｃ－Ｄ－Ｌ２－Ｅ－Ｆ－Ｌ３－Ｇ－Ｈ－Ｌ４－Ｉ－Ｃ’
（式中、Ｎ’は、融合タンパク質のＮ末端であり、
Ｃ’は、融合タンパク質のＣ末端であり、
Ａは、メソテリンと特異的に結合する抗体の軽鎖可変ドメインであり、前記ドメインは配列番号２５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２６の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２７の軽鎖ＣＤＲ３を含み、
Ｂは、前記抗体の軽鎖定常ドメインであり、
Ｃは、メソテリンと特異的に結合する前記抗体の重鎖可変ドメインであり、前記ドメインは配列番号２８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３０の重鎖ＣＤＲ３を含み、
Ｄは、前記抗体の重鎖定常ドメイン中のＣＨ１ドメインであり、
Ｅは、ＣＤ３と特異的に結合する抗体の軽鎖可変ドメインであり、前記ドメインは配列番号３１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ３を含み、
Ｆは、前記抗体の軽鎖定常ドメインであり、
Ｇは、ＣＤ３と特異的に結合する前記抗体の重鎖可変ドメインであり、前記ドメインは配列番号３４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３５の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３６の重鎖ＣＤＲ３を含み、
Ｈは、前記抗体の重鎖定常ドメイン中のＣＨ１ドメインであり、
Ｉは、Ｆｃ領域又はそのバリアントであり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４のそれぞれは、ペプチドリンカーである）
を有する第１の融合タンパク質。
【請求項2】
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４のそれぞれが、１～５０アミノ酸からなるペプチドリンカーである、請求項１に記載の第１の融合タンパク質。
【請求項3】
Ｌ１及びＬ３のそれぞれが、配列番号４３のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーである、請求項１に記載の第１の融合タンパク質。
【請求項4】
Ｌ２が配列番号４４のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーである、請求項１に記載の第１の融合タンパク質。
【請求項5】
Ｌ４が配列番号４５のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーである、請求項１に記載の第１の融合タンパク質。
【請求項6】
配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の第１の融合タンパク質。
【請求項7】
構造式２：
［構造式２］
Ｎ’－Ａ－Ｂ－Ｌ１－Ｃ－Ｄ－Ｌ５－Ｊ－Ｃ’
（式中、Ｎ’は、融合タンパク質のＮ末端であり、
Ｃ’は、融合タンパク質のＣ末端であり、
Ａは、メソテリンと特異的に結合する抗体の軽鎖可変ドメインであり、前記ドメインは配列番号２５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２６の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２７の軽鎖ＣＤＲ３を含み、
Ｂは、前記抗体の軽鎖定常ドメインであり、
Ｃは、メソテリンと特異的に結合する前記抗体の重鎖可変ドメインであり、前記ドメインは配列番号２８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３０の重鎖ＣＤＲ３を含み、
Ｄは、前記抗体の重鎖定常ドメイン中のＣＨ１ドメインであり、
Ｊは、Ｆｃ領域又はその断片であり、
Ｌ１及びＬ５のそれぞれは、ペプチドリンカーである）
を有する第２の融合タンパク質。
［構造式２］
Ｎ’－Ａ－Ｂ－Ｌ１－Ｃ－Ｄ－Ｌ５－Ｊ－Ｃ’
（式中、Ｎ’は、融合タンパク質のＮ末端であり、
Ｃ’は、融合タンパク質のＣ末端であり、
Ａは、メソテリンと特異的に結合する抗体の軽鎖可変ドメインであり、前記ドメインは配列番号２５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２６の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２７の軽鎖ＣＤＲ３を含み、
Ｂは、前記抗体の軽鎖定常ドメインであり、
Ｃは、メソテリンと特異的に結合する前記抗体の重鎖可変ドメインであり、前記ドメインは配列番号２８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３０の重鎖ＣＤＲ３を含み、
Ｄは、前記抗体の重鎖定常ドメイン中のＣＨ１ドメインであり、
Ｊは、Ｆｃ領域又はその断片であり、
Ｌ１及びＬ５のそれぞれは、ペプチドリンカーである）
を有する第２の融合タンパク質。
【請求項8】
Ｌ１及びＬ５のそれぞれが、１～５０アミノ酸からなるペプチドリンカーである、請求項７に記載の第２の融合タンパク質。
【請求項9】
Ｌ１が配列番号４３のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーである、請求項７に記載の第２の融合タンパク質。
【請求項10】
Ｌ５が配列番号４５のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーである、請求項７に記載の第２の融合タンパク質。
【請求項11】
配列番号３のアミノ酸配列からなる、請求項７に記載の第２の融合タンパク質。
【請求項12】
構造式３：
［構造式３］
Ｎ’－Ｋ－Ｍ－Ｌ６－Ｎ－Ｏ－Ｌ７－Ｐ－Ｃ’
（式中、Ｎ’は、融合タンパク質のＮ末端であり、
Ｃ’は、融合タンパク質のＣ末端であり、
Ｋは、ＥＧＦＲと特異的に結合する抗体の軽鎖可変ドメインであり、前記ドメインは配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３９の軽鎖ＣＤＲ３を含み、
Ｍは、前記抗体の軽鎖定常ドメインであり、
Ｎは、ＥＧＦＲと特異的に結合する前記抗体の重鎖可変ドメインであり、前記ドメインは配列番号４０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４２の重鎖ＣＤＲ３を含み、
Ｏは、前記抗体の重鎖定常ドメイン中のＣＨ１ドメインであり、
Ｐは、Ｆｃ領域又はその断片であり、
Ｌ６及びＬ７のそれぞれは、ペプチドリンカーである）
を有する第３の融合タンパク質。
［構造式３］
Ｎ’－Ｋ－Ｍ－Ｌ６－Ｎ－Ｏ－Ｌ７－Ｐ－Ｃ’
（式中、Ｎ’は、融合タンパク質のＮ末端であり、
Ｃ’は、融合タンパク質のＣ末端であり、
Ｋは、ＥＧＦＲと特異的に結合する抗体の軽鎖可変ドメインであり、前記ドメインは配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３９の軽鎖ＣＤＲ３を含み、
Ｍは、前記抗体の軽鎖定常ドメインであり、
Ｎは、ＥＧＦＲと特異的に結合する前記抗体の重鎖可変ドメインであり、前記ドメインは配列番号４０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４２の重鎖ＣＤＲ３を含み、
Ｏは、前記抗体の重鎖定常ドメイン中のＣＨ１ドメインであり、
Ｐは、Ｆｃ領域又はその断片であり、
Ｌ６及びＬ７のそれぞれは、ペプチドリンカーである）
を有する第３の融合タンパク質。
【請求項13】
Ｌ６及びＬ７のそれぞれが、１～５０アミノ酸からなるペプチドリンカーである、請求項１２に記載の第３の融合タンパク質。
【請求項14】
Ｌ６が配列番号４３のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーである、請求項１２に記載の第３の融合タンパク質。
【請求項15】
Ｌ７が配列番号４５のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーである、請求項１２に記載の第３の融合タンパク質。
【請求項16】
配列番号５のアミノ酸配列からなる、請求項１２に記載の第３の融合タンパク質。
【請求項17】
請求項１に記載の第１の融合タンパク質、及び
請求項７に記載の第２の融合タンパク質、
を含む二重特異性抗体。
請求項７に記載の第２の融合タンパク質、
を含む二重特異性抗体。
【請求項18】
ノブ修飾が前記第１の融合タンパク質のＩに含まれ、ホール修飾が前記第２の融合タンパク質のＪに含まれる；又は、ホール修飾が前記第１の融合タンパク質のＩに含まれ、ノブ修飾が前記第２の融合タンパク質のＪに含まれる、請求項１７に記載の二重特異性抗体。
【請求項19】
請求項１に記載の第１の融合タンパク質、及び
請求項１２に記載の第３の融合タンパク質、
を含む三重特異性抗体。
請求項１２に記載の第３の融合タンパク質、
を含む三重特異性抗体。
【請求項20】
ノブ修飾が前記第１の融合タンパク質のＩに含まれ、ホール修飾が前記第３の融合タンパク質のＰに含まれる；又は、ホール修飾が前記第１の融合タンパク質のＩに含まれ、ノブ修飾が前記第３の融合タンパク質のＰに含まれる、請求項１９に記載の三重特異性抗体。
【請求項21】
癌を治療するための医薬組成物であって、有効成分として、
請求項１に記載の第１の融合タンパク質、
請求項７に記載の第２の融合タンパク質、
請求項１２に記載の第３の融合タンパク質、
請求項１７に記載の二重特異性抗体、又は
請求項１９に記載の三重特異性抗体、
を含む医薬組成物。
請求項１に記載の第１の融合タンパク質、
請求項７に記載の第２の融合タンパク質、
請求項１２に記載の第３の融合タンパク質、
請求項１７に記載の二重特異性抗体、又は
請求項１９に記載の三重特異性抗体、
を含む医薬組成物。
【請求項22】
癌の治療を必要とする個体における癌を治療するための医薬品の製造のための以下のタンパク質又は抗体の使用であって、
請求項１に記載の第１の融合タンパク質、
請求項７に記載の第２の融合タンパク質、
請求項１２に記載の第３の融合タンパク質、
請求項１７に記載の二重特異性抗体、又は
請求項１９に記載の三重特異性抗体、
の使用。
請求項１に記載の第１の融合タンパク質、
請求項７に記載の第２の融合タンパク質、
請求項１２に記載の第３の融合タンパク質、
請求項１７に記載の二重特異性抗体、又は
請求項１９に記載の三重特異性抗体、
の使用。
【請求項23】
個体における癌を治療する方法であって、
治療有効量の請求項２１に記載の医薬組成物を、個体に投与するステップ
を含む方法。
治療有効量の請求項２１に記載の医薬組成物を、個体に投与するステップ
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗メソテリン抗体、抗ＣＤ３抗体又は抗ＥＧＦＲ抗体を含む融合タンパク質、並びにメソテリン及びＣＤ３に特異的な二重特異性抗体、メソテリン、ＣＤ３及びＥＧＦＲに特異的な三重特異性抗体、並びにその使用に関する。
【0002】
［背景技術］
抗癌剤治療において、第１の癌免疫療法としてのモノクローナル抗体は、固形癌だけでなく血液癌にも優れた効果を示しているが、まだ限界がある。このことについて、抗体のＦｃ領域を操作して、抗体の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）効果を高める技術や、１つの抗体で複数の標的にアクセスできるように、二重特異性又は三重特異性抗体を開発する技術が導入されている。
抗癌剤治療において、第１の癌免疫療法としてのモノクローナル抗体は、固形癌だけでなく血液癌にも優れた効果を示しているが、まだ限界がある。このことについて、抗体のＦｃ領域を操作して、抗体の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）効果を高める技術や、１つの抗体で複数の標的にアクセスできるように、二重特異性又は三重特異性抗体を開発する技術が導入されている。
【0003】
二重特異性抗体は、２つの異なる抗体と同時に結合することができる抗体であり、Ｔ細胞などの免疫細胞が、癌細胞などの特定の標的細胞にのみ毒性を持ち、他の正常な細胞には毒性を持たないように操作することができる。このような二重特異性抗体は、副作用を最小限に抑えつつ、最大限の癌治療効果を発揮することができる。したがって、いくつかの二重特異性抗体の方式が開発され、Ｔ細胞を介した免疫療法への適合性が報告されている。
【0004】
しかし、二重特異性抗体を製造する過程で共発現させると、異なる特異性を持つ抗体の重鎖と軽鎖が誤対合し、機能しない副産物が多数発生するという問題がある。
【0005】
したがって、この問題を解決するために、臨床的に十分な量と純度で、所望の多特異性抗体コンストラクトを製造する技術の開発が求められている。
【0006】
［発明の開示］
［技術的課題］
既存の二重特異性抗体の問題点を解決するために鋭意研究を行った結果、本発明者らは、抗体の重鎖と軽鎖がリンカーを介して連結され、単鎖として含まれている融合タンパク質、及びそれを含む二重特異性又は三重特異性抗体を開発した。並びに本発明者らは、これらの融合タンパク質及び抗体が、誤対合の問題を解決し、腫瘍細胞に対する高い殺傷効果を有することを見出して、本発明を完成させた。
［技術的課題］
既存の二重特異性抗体の問題点を解決するために鋭意研究を行った結果、本発明者らは、抗体の重鎖と軽鎖がリンカーを介して連結され、単鎖として含まれている融合タンパク質、及びそれを含む二重特異性又は三重特異性抗体を開発した。並びに本発明者らは、これらの融合タンパク質及び抗体が、誤対合の問題を解決し、腫瘍細胞に対する高い殺傷効果を有することを見出して、本発明を完成させた。
【0007】
その結果、本発明の目的は、抗メソテリン抗体、抗ＣＤ３抗体、又は抗ＥＧＦＲ抗体を含む融合タンパク質、及びそれを含む二重特異性又は三重特異性抗体、及びそれを用いた癌の治療方法を提供することである。
【0008】
［課題を解決するための手段］
上述の課題を解決するために、本発明の一態様では、メソテリンと特異的に結合する抗体とＣＤ３に特異的に結合する抗体を含む、単鎖の形態の第１の融合タンパク質が提供される。
上述の課題を解決するために、本発明の一態様では、メソテリンと特異的に結合する抗体とＣＤ３に特異的に結合する抗体を含む、単鎖の形態の第１の融合タンパク質が提供される。
【0009】
本発明の別の態様では、メソテリンと特異的に結合する抗体を含む、単鎖の形態の第２の融合タンパク質が提供される。
【0010】
さらに本発明の別の態様では、ＥＧＦＲと特異的に結合する抗体を含む、単鎖の形態の第３の融合タンパク質が提供される。
【0011】
本発明のなおさらなる別の態様では、第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質を含む、二重特異性抗体が提供される。
【0012】
本発明のなおさらなる別の態様では、第１の融合タンパク質と第３の融合タンパク質を含む、三重特異性抗体が提供される。
【0013】
本発明のなおさらなる別の態様では、融合タンパク質、二重特異性抗体、又は三重特異性抗体を有効成分として含む、癌を治療するための医薬組成物が提供される。
【0014】
本発明のなおさらなる別の態様では、融合タンパク質、二重特異性抗体、又は三重特異性抗体の使用が提供される。
【0015】
本発明のなおさらなる別の態様では、治療有効量の癌を治療するための医薬組成物を個体に投与するステップを含む、癌の治療方法が提供される。
【0016】
［発明の効果］
本発明の融合タンパク質及びそれを含む二重特異性抗体又は三重特異性抗体は、高収率且つ高純度で製造することができ、優れた殺腫瘍効果及び増殖抑制効果を有するため、癌治療に有効に利用することができる。
本発明の融合タンパク質及びそれを含む二重特異性抗体又は三重特異性抗体は、高収率且つ高純度で製造することができ、優れた殺腫瘍効果及び増殖抑制効果を有するため、癌治療に有効に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図7】図７は、ＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５又はセツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５のＨ２２６癌細胞株に対する結合能を、蛍光励起セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いて測定して得られた結果を示す図である。
【図10】図１０は、ＰＢＭＣとＨ２２６癌細胞株の混合物（ＰＢＭＣ：標的細胞＝１０：１の比率）を、ＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５又はセツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５で処理し、次いで２４時間後の細胞死を観察して得られた結果を示す図である。
【図11】図１１は、ＰＢＭＣとＡｓＰＣ－１癌細胞株の混合物（ＰＢＭＣ：標的細胞＝１０：１の比率）を、ＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５又はセツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５で処理し、次いで２４時間後の細胞死を観察して得られた結果を示す図である。
【図12】図１２は、ＰＢＭＣとＨ２２６癌細胞株の混合物（ＰＢＭＣ：標的細胞＝１０：１の比率）を、ＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５又はセツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５で処理し、次いで４８時間後の細胞死を観察して得られた結果を示す図である。
【図13】図１３は、ＰＢＭＣとＡｓＰＣ－１癌細胞株の混合物（ＰＢＭＣ：標的細胞＝１０：１の比率）を、ＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５又はセツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５で処理し、次いで４８時間後の細胞死を観察して得られた結果を示す図である。
【図14】図１４は、ＰＢＭＣとＨ２２６癌細胞株の混合物（ＰＢＭＣ：標的細胞＝２０：１の比率）を、ＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５又はセツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５で処理し、次いで４８時間後の細胞死を観察して得られた結果を示す図である。
【図15】図１５は、ＰＢＭＣとＡｓＰＣ－１癌細胞株の混合物（ＰＢＭＣ：標的細胞＝２０：１の比率）を、ＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５又はセツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５で処理し、次いで４８時間後の細胞死を観察して得られた結果を示す図である。
【図16】図１６は、Ｔ細胞とＨ２２６癌細胞株の混合物（Ｔ細胞：標的細胞＝５：１の比率）を、ＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５又はセツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５で処理し、次いで２４時間後の細胞死を観察して得られた結果を示す図である。
【図17】図１７は、Ｔ細胞とＨ２２６癌細胞株の混合物（Ｔ細胞：標的細胞＝５：１の比率）を、ＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５又はセツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５で処理し、次いで４８時間後の細胞死を観察して得られた結果を示す図である。
【図18】図１８は、Ｔ細胞とＨ２２６癌細胞株の混合物（Ｔ細胞：標的細胞＝１０：１の比率）を、ＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５又はセツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５で処理し、次いで２４時間後の細胞死を観察して得られた結果を示す図である。
【図19】図１９は、Ｔ細胞とＨ２２６癌細胞株の混合物（Ｔ細胞：標的細胞＝１０：１の比率）を、ＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５又はセツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５で処理し、次いで４８時間後の細胞死を観察して得られた結果を示す図である。
【図21】図２１は、Ｈ２２６異種移植片を有するＮＯＧマウスモデルにおいて、ＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５及びセツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５の抗癌作用を確認するため、腫瘍抑制効果（％）という観点からＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５及びセツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５を対照と比較した結果を示す図である。
【図22】図２２は、Ｈ２２６異種移植片を有するＮＯＧマウスモデルにおいて、ＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５及びセツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５の抗癌作用を確認するため、腫瘍組織への免疫Ｔ細胞の浸潤を観察した結果を示す図である。
【図23】図２３は、ＡｓＰＣ－１異種移植片を有するＮＯＧマウスモデルにおいて、ＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５及びセツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５の抗癌作用を確認するため、腫瘍サイズ（ｍｍ３）を観察した結果を示す図である。
【図24】図２４は、ＡｓＰＣ－１異種移植片を有するＮＯＧマウスモデルにおいて、ＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５及びセツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５の抗癌作用を確認するため、腫瘍抑制効果（％）という観点からＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５及びセツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５を対照と比較した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【0018】
本発明の一態様では、構造式１
［構造式１］
Ｎ’－Ａ－Ｂ－Ｌ１－Ｃ－Ｄ－Ｌ２－Ｅ－Ｆ－Ｌ３－Ｇ－Ｈ－Ｌ４－Ｉ－Ｃ’
（式中、Ｎ’は融合タンパク質のＮ末端であり、
Ｃ’は融合タンパク質のＣ末端であり、
Ａは、メソテリンと特異的に結合する抗体の軽鎖可変ドメインであり、ドメインは配列番号２５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２６の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２７の軽鎖ＣＤＲ３を含み、
Ｂは、抗体の軽鎖定常ドメインであり、
Ｃは、メソテリンと特異的に結合する抗体の重鎖可変ドメインであり、ドメインは配列番号２８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３０の重鎖ＣＤＲ３を含み、
Ｄは、抗体の重鎖定常ドメイン中のＣＨ１ドメインであり、
Ｅは、ＣＤ３と特異的に結合する抗体の軽鎖可変ドメインであり、ドメインは配列番号３１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ３を含み、
Ｆは、抗体の軽鎖定常ドメインであり、
ＧはＣＤ３と特異的に結合する抗体の重鎖可変ドメインであり、ドメインは配列番号３４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３５の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３６の重鎖ＣＤＲ３を含み、
Ｈは、抗体の重鎖定常ドメイン中のＣＨ１ドメインであり、
Ｉは、Ｆｃ領域又はそのバリアントであり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４のそれぞれは、ペプチドリンカーである）
を有する第１の融合タンパク質が提供される。
［構造式１］
Ｎ’－Ａ－Ｂ－Ｌ１－Ｃ－Ｄ－Ｌ２－Ｅ－Ｆ－Ｌ３－Ｇ－Ｈ－Ｌ４－Ｉ－Ｃ’
（式中、Ｎ’は融合タンパク質のＮ末端であり、
Ｃ’は融合タンパク質のＣ末端であり、
Ａは、メソテリンと特異的に結合する抗体の軽鎖可変ドメインであり、ドメインは配列番号２５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２６の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２７の軽鎖ＣＤＲ３を含み、
Ｂは、抗体の軽鎖定常ドメインであり、
Ｃは、メソテリンと特異的に結合する抗体の重鎖可変ドメインであり、ドメインは配列番号２８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３０の重鎖ＣＤＲ３を含み、
Ｄは、抗体の重鎖定常ドメイン中のＣＨ１ドメインであり、
Ｅは、ＣＤ３と特異的に結合する抗体の軽鎖可変ドメインであり、ドメインは配列番号３１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ３を含み、
Ｆは、抗体の軽鎖定常ドメインであり、
ＧはＣＤ３と特異的に結合する抗体の重鎖可変ドメインであり、ドメインは配列番号３４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３５の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３６の重鎖ＣＤＲ３を含み、
Ｈは、抗体の重鎖定常ドメイン中のＣＨ１ドメインであり、
Ｉは、Ｆｃ領域又はそのバリアントであり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４のそれぞれは、ペプチドリンカーである）
を有する第１の融合タンパク質が提供される。
【0019】
本発明では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４のそれぞれは、１～５０アミノ酸からなるペプチドリンカーであってもよい。
【0020】
本発明では、Ｌ１及びＬ３は配列番号４３のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーであってもよい。
【0021】
本発明では、Ｌ２は配列番号４４のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーであってもよい。
【0022】
本発明では、Ｌ４は配列番号４５のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーであってもよい。
【0023】
本発明では、Ｌ４は抗体のヒンジ領域であってもよい。
【0024】
本発明では、Ａは、メソテリンと特異的に結合する抗体の軽鎖可変ドメインであってもよく、ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列からなるか、又は配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列からなる。
【0025】
本発明では、Ｂは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＥ抗体（好ましくはメソテリンと特異的に結合する抗体）の軽鎖定常ドメインであってもよく、ドメインは、配列番号４６のアミノ酸配列からなるか、又は配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列からなる。
【0026】
本発明では、Ｃは、メソテリンと特異的に結合する抗体の重鎖可変ドメインであってもよく、ドメインは、配列番号９のアミノ酸配列からなるか、又は配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列からなる。
【0027】
本発明では、Ｄは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＥ抗体（好ましくはメソテリンと特異的に結合する抗体）の重鎖定常ドメイン中のＣＨ１ドメインであってもよく、ドメインは、配列番号４７のアミノ酸配列からなるか、又は配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列からなる。
【0028】
本発明では、Ｅは、ＣＤ３と特異的に結合する抗体の軽鎖可変ドメインであってもよく、ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列からなるか、又は配列番号１３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列からなる。
【0029】
本発明では、Ｆは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＥ抗体（好ましくはＣＤ３と特異的に結合する抗体）の軽鎖定常ドメインであってもよく、ドメインは、配列番号４６のアミノ酸配列からなるか、又は配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列からなる。
【0030】
本発明では、Ｇは、ＣＤ３と特異的に結合する抗体の重鎖可変ドメインであってもよく、ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列からなるか、又は配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列からなる。
【0031】
本発明では、Ｈは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＥ抗体（好ましくはＣＤ３と特異的に結合する抗体）の重鎖定常ドメイン中のＣＨ１ドメインであってもよく、ドメインは、配列番号４７のアミノ酸配列からなるか、又は配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列からなる。
【0032】
本発明では、Ｉは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＥ抗体のＦｃ領域又はそのバリアントであってもよく、領域又はバリアントは、配列番号４８のアミノ酸配列からなるか、又は配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列からなる。さらに、Ｉは、抗体の重鎖定常ドメイン中のＣＨ３ドメインの一部のアミノ酸における置換によって得られてもよい。すなわち、配列番号４８のアミノ酸配列が置換を受けて（Ｙ１１９Ｃ、Ｋ１３０Ｅ、及びＫ１７９Ｗ）、抗体の重鎖定常ドメイン中のＣＨ３ドメインにノブ構造が形成されてもよく、配列番号４８のアミノ酸配列が置換を受けて（Ｑ１１７Ｒ、Ｓ１２４Ｃ、Ｄ１６９Ｖ、及びＦ１７５Ｔ）、そこにホール構造が形成されてもよい。
【0033】
本発明では、第１の融合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列からなってもよく、又は、配列番号１のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列からなってもよい。
【0034】
本発明の一態様では、構造式２
［構造式２］
Ｎ’－Ａ－Ｂ－Ｌ１－Ｃ－Ｄ－Ｌ５－Ｊ－Ｃ’
（式中、Ｎ’は融合タンパク質のＮ末端であり、
Ｃ’は融合タンパク質のＣ末端であり、
Ａは、メソテリンと特異的に結合する抗体の軽鎖可変ドメインであり、ドメインは配列番号２５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２６の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２７の軽鎖ＣＤＲ３を含み、
Ｂは、抗体の軽鎖定常ドメインであり、
Ｃは、メソテリンと特異的に結合する抗体の重鎖可変ドメインであり、ドメインは配列番号２８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３０の重鎖ＣＤＲ３を含み、
Ｄは、抗体の重鎖定常ドメイン中のＣＨ１ドメインであり、
Ｊは、Ｆｃ領域又はその断片であり、
Ｌ１及びＬ５のそれぞれは、ペプチドリンカーである）
を有する第２の融合タンパク質が提供される。
［構造式２］
Ｎ’－Ａ－Ｂ－Ｌ１－Ｃ－Ｄ－Ｌ５－Ｊ－Ｃ’
（式中、Ｎ’は融合タンパク質のＮ末端であり、
Ｃ’は融合タンパク質のＣ末端であり、
Ａは、メソテリンと特異的に結合する抗体の軽鎖可変ドメインであり、ドメインは配列番号２５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２６の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２７の軽鎖ＣＤＲ３を含み、
Ｂは、抗体の軽鎖定常ドメインであり、
Ｃは、メソテリンと特異的に結合する抗体の重鎖可変ドメインであり、ドメインは配列番号２８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３０の重鎖ＣＤＲ３を含み、
Ｄは、抗体の重鎖定常ドメイン中のＣＨ１ドメインであり、
Ｊは、Ｆｃ領域又はその断片であり、
Ｌ１及びＬ５のそれぞれは、ペプチドリンカーである）
を有する第２の融合タンパク質が提供される。
【0035】
本発明では、Ｌ１及びＬ５のそれぞれは、１～５０アミノ酸からなるペプチドリンカーであってもよい。
【0036】
本発明では、Ｌ１は配列番号４３のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーであってもよい。
【0037】
本発明では、Ｌ５は配列番号４５のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーであってもよい。
【0038】
本発明では、Ｌ５は抗体のヒンジ領域であってもよい。
【0039】
本発明では、第２の融合タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列からなってもよく、又は、配列番号３のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列からなってもよい。
【0040】
Ｊは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＥ抗体のＦｃ領域又はそのバリアントであってもよく、領域又はバリアントは、配列番号４８のアミノ酸配列からなるか、又は配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列からなる。さらに、Ｊは、抗体の重鎖定常ドメイン中のＣＨ３ドメインの一部のアミノ酸における置換によって得られてもよい。すなわち、配列番号４８のアミノ酸配列が置換を受けて（Ｙ１１９Ｃ、Ｋ１３０Ｅ、及びＫ１７９Ｗ）、抗体の重鎖定常ドメイン中のＣＨ３ドメインにノブ構造が形成されてもよく、配列番号４８のアミノ酸配列が置換を受けて（Ｑ１１７Ｒ、Ｓ１２４Ｃ、Ｄ１６９Ｖ、及びＦ１７５Ｔ）、そこにホール構造が形成されてもよい。
【0041】
本発明の一態様では、構造式３
［構造式３］
Ｎ’－Ｋ－Ｍ－Ｌ６－Ｎ－Ｏ－Ｌ７－Ｐ－Ｃ’
（式中、Ｎ’は融合タンパク質のＮ末端であり、
Ｃ’は融合タンパク質のＣ末端であり、
Ｋは、ＥＧＦＲと特異的に結合する抗体の軽鎖可変ドメインであり、ドメインは配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３９の軽鎖ＣＤＲ３を含み、
Ｍは、抗体の軽鎖定常ドメインであり、
Ｎは、ＥＧＦＲと特異的に結合する抗体の重鎖可変ドメインであり、ドメインは配列番号４０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４２の重鎖ＣＤＲ３を含み、
Ｏは、抗体の重鎖定常ドメイン中のＣＨ１であり、
Ｐは、Ｆｃ領域又はその断片であり、
Ｌ６及びＬ７のそれぞれは、ペプチドリンカーである）
を有する第３の融合タンパク質が提供される。
［構造式３］
Ｎ’－Ｋ－Ｍ－Ｌ６－Ｎ－Ｏ－Ｌ７－Ｐ－Ｃ’
（式中、Ｎ’は融合タンパク質のＮ末端であり、
Ｃ’は融合タンパク質のＣ末端であり、
Ｋは、ＥＧＦＲと特異的に結合する抗体の軽鎖可変ドメインであり、ドメインは配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３９の軽鎖ＣＤＲ３を含み、
Ｍは、抗体の軽鎖定常ドメインであり、
Ｎは、ＥＧＦＲと特異的に結合する抗体の重鎖可変ドメインであり、ドメインは配列番号４０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４２の重鎖ＣＤＲ３を含み、
Ｏは、抗体の重鎖定常ドメイン中のＣＨ１であり、
Ｐは、Ｆｃ領域又はその断片であり、
Ｌ６及びＬ７のそれぞれは、ペプチドリンカーである）
を有する第３の融合タンパク質が提供される。
【0042】
本発明では、Ｌ６及びＬ７のそれぞれは、１～５０アミノ酸からなるペプチドリンカーであってもよい。
【0043】
本発明では、Ｌ６は配列番号４３のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーであってもよい。
【0044】
本発明では、Ｌ７は配列番号４５のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーであってもよい。
【0045】
本発明では、Ｌ７は抗体のヒンジ領域であってもよい。
【0046】
本発明では、第３の融合タンパク質は配列番号５のアミノ酸配列からなってもよい。
【0047】
本発明では、Ｋは、ＥＧＦＲと特異的に結合する抗体の軽鎖可変ドメインであってもよく、ドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列からなるか、又は配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列からなる。
【0048】
本発明では、Ｍは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＥ抗体（好ましくはＥＧＦＲと特異的に結合する抗体）の軽鎖定常ドメインであってもよく、ドメインは、配列番号４６のアミノ酸配列からなるか、又は配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列からなる。
【0049】
本発明では、Ｎは、ＥＧＦＲと特異的に結合する抗体の重鎖可変ドメインであってもよく、ドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列からなるか、又は配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列からなる。
【0050】
本発明では、Ｏは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＥ抗体（好ましくはＥＧＦＲと特異的に結合する抗体）の重鎖定常ドメイン中のＣＨ１ドメインであってもよく、ドメインは、配列番号４７のアミノ酸配列からなるか、又は配列番号４７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列からなる。
【0051】
Ｊは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＥ抗体のＦｃ領域又はそのバリアントであってもよく、領域又はバリアントは、配列番号４８のアミノ酸配列からなるか、又は配列番号４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列からなる。さらに、Ｉは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＥ抗体の重鎖定常ドメイン中のＣＨ３ドメインの一部のアミノ酸における置換によって得られてもよい。すなわち、配列番号４８のアミノ酸配列が置換を受けて（Ｙ１１９Ｃ、Ｋ１３０Ｅ、及びＫ１７９Ｗ）、抗体の重鎖定常ドメイン中のＣＨ３ドメインにノブ構造が形成されてもよく、配列番号４８のアミノ酸配列が置換を受けて（Ｑ１１７Ｒ、Ｓ１２４Ｃ、Ｄ１６９Ｖ、及びＦ１７５Ｔ）、そこにホール構造が形成されてもよい。
【0052】
本発明では、第３の融合タンパク質は、配列番号５のアミノ酸配列からなってもよく、又は、配列番号５のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列からなってもよい。
【0053】
本明細書では、用語「メソテリン（ＭＳＬＮ）」とは、動物、好ましくはヒト及びサルに存在する野生型ＭＳＬＮ、及びそのバリアント、アイソタイプ、パラログを含むことを意味する。さらに、「ヒトＭＳＬＮ」とは、ヒト由来のＭＳＬＮを指す。メソテリンは、正常な中皮細胞上に存在する４０ｋＤａの細胞表面糖タンパク質であり、中皮腫、卵巣腺癌、膵臓腺癌など、いくつかのヒトの腫瘍で過剰発現している。メソテリンは、インターロイキン３の存在下で巨核球コロニー形成活性を発揮することが示されている。メソテリンは腫瘍分化抗原であり、中皮などの正常な成人組織には低レベルで存在するが、中皮腫、卵巣癌、膵臓癌、子宮頸部、頭頸部、外陰部、肺、食道の扁平上皮癌、肺腺癌、子宮内膜癌、二相性滑膜肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、及び胃腺癌など多種多様なヒト腫瘍では異常に過剰発現している。
【0054】
本明細書では、用語「ＣＤ３」とは、動物、好ましくはヒト及びサルに存在する野生型ＣＤ３、及びそのバリアント、アイソタイプ、パラログを含むことを意味する。また、「ヒトＣＤ３」とは、ヒト由来のＣＤ３を指す。Ｔ細胞の表面に存在する抗原分子であるＣＤ３は、Ｔ細胞抗原受容体と結合することにより、シグナル伝達系として機能し、それによりＴ細胞を活性化する。
【0055】
本明細書では、用語「ＥＧＦＲ」は、上皮増殖因子受容体である膜タンパク質を指し、ＥｒｂＢ－１又はＨＥＲ１とも呼ばれる。さらに、「ヒトＥＧＦＲ」とは、ヒト由来のＥＧＦＲを指す。
【0056】
本明細書では、用語「抗体」は、特定の抗原と免疫学的に反応する免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、すなわち、抗原を特異的に認識する受容体として作用するタンパク質分子を指す。抗体は、全抗体と抗体断片を包含する概念として用いられる。
【0057】
本明細書では、用語「重鎖」は、完全長の重鎖とその断片の両方を含むことを意味し、完全長の重鎖は、抗原に対する特異性を付与するのに十分な可変ドメイン（ＶＨ）と３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）を含む。
【0058】
本明細書では、用語「軽鎖」は、完全長の軽鎖とその断片の両方を含むことを意味し、完全長の軽鎖は、抗原に対する特異性を付与するのに十分な可変ドメイン（ＶＬ）と定常ドメイン（ＣＬ）を含む。
【0059】
本明細書では、用語「ＣＤＲ」は、抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）の一部である相補性決定領域を指す。
【0060】
本明細書では、用語「Ｆｃ」は、免疫グロブリンのＣ末端領域を指し、この領域は、重鎖定常ドメインのうちＣＨ２とＣＨ３のみからなる機能的構造単位の１つである。Ｆｃは抗原と結合する能力を持たない。しかし、Ｆｃは補体結合活性などを示し、一定のアミノ酸配列を持つ。
【0061】
本明細書では、用語「ヒンジ領域」は、重鎖のＣＨ１とＣＨ２との間に存在するペプチドを指す。ヒンジ領域は、１つ又は複製のシステイン残基が存在する柔軟性の高い構造を持ち、２つの重鎖がジスルフィド結合（複数可）によって互いに連結されている。
【0062】
本発明では、ヒンジ領域は、１～３個のシステイン残基、例えば、１、２、又は３個のシステイン残基を含んでいてもよい。
【0063】
さらに、本発明では、上記の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。
【0064】
本発明では、第１の融合タンパク質をコードするＤＮＡは、配列番号２のヌクレオチド配列からなってもよく、又は、配列番号２のヌクレオチド配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するヌクレオチド配列からなってもよい。
【0065】
本発明では、第２の融合タンパク質をコードするＤＮＡは、配列番号４のヌクレオチド配列からなってもよく、又は、配列番号４のヌクレオチド配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するヌクレオチド配列からなってもよい。
【0066】
本発明では、第３の融合タンパク質をコードするＤＮＡは、配列番号６のヌクレオチド配列からなってもよく、又は、配列番号６のヌクレオチド配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するヌクレオチド配列からなってもよい。
【0067】
さらに、本発明では、上記の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、発現ベクターが提供される。
【0068】
さらに、本発明では、発現ベクターの導入によりトランスフェクトされた宿主細胞が提供される。
【0069】
さらに、本発明では、宿主細胞を培養するステップを含む、融合タンパク質の製造方法が提供される。
【0070】
本発明の別の態様では、第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質を含む、二重特異性抗体が提供される。
【0071】
本明細書では、用語「二重特異性抗体」は、２つの異なる抗原を認識するように操作された単一の抗体を指す。
【0072】
本発明の二重特異性抗体は、抗ＭＳＬＮ抗体と抗ＣＤ３抗体を同時に含んでいるため、ＭＳＬＮを発現している癌細胞やＴ細胞と特異的に結合することができ、免疫細胞の活性化を誘導することでＭＳＬＮを発現している癌細胞は増殖抑制される又は死滅する。
【0073】
本発明では、第１の融合タンパク質の第２の融合タンパク質への結合により単一の抗体、すなわち二重特異性抗体を提供するために、各融合タンパク質は、重鎖定常ドメインの一部のアミノ酸残基で置換を受けてもよい。すなわち、第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質のＦｃ領域は、ジスルフィド結合又はノブイントゥホール構造（ノブイントゥホール構造が好ましい）を介して互いに連結され、二重特異性抗体を形成してもよい。
【0074】
本明細書では、用語「ノブイントゥホール構造」は、２つの異なるＩｇ重鎖のそれぞれのＣＨ３ドメインに変異を誘発して、一方のＩｇ重鎖ＣＨ３ドメインにノブ構造を、他方のＩｇ重鎖ＣＨ３ドメインにホール構造を誘発し、２つのドメインがヘテロ二量体を形成することによって得られる構造を指す。
【0075】
一般的には、ノブ構造を形成するアミノ酸残基では、大きな側鎖を有する疎水性アミノ酸残基が小さな側鎖を有する疎水性アミノ酸残基で置換され、ホール構造を形成するアミノ酸残基では、小さな側鎖を有する疎水性アミノ酸残基が大きな側鎖を有する疎水性アミノ酸残基で置換されている。しかし、本発明はこれに限定されるものではない。このように、それぞれの抗体がノブ構造とホール構造を形成するように誘導されている場合には、ホモダイマーよりもヘテロダイマーの方が容易に形成されることがある。
【0076】
本発明では、二重特異性抗体は、第１の融合タンパク質のＩにおけるノブ修飾と、第２の融合タンパク質のＪにおけるホール修飾とを含んでいてもよい。或いは、二重特異性抗体は、第１の融合タンパク質のＩにおけるホール修飾と、第２の融合タンパク質のＪにおけるノブ修飾とを含んでいてもよい。
【0077】
本発明では、二重特異性抗体は、２＋１ ＩｇＧの形態であってもよく、抗ＭＳＬＮ断片又は抗ＣＤ３ Ｆａｂ断片を構成する重鎖と軽鎖を、それぞれの断片が単鎖として発現するように互いにリンカーで連結すること、及び単鎖である抗ＭＳＬＮ断片と抗ＣＤ３Ｆａｂ断片を互いにペプチドリンカーで連結することによって得られる２つの単鎖からなっていてもよい。
【0078】
本発明の別の態様では、第１の融合タンパク質と第３の融合タンパク質を含む、三重特異性抗体が提供される。
【0079】
本明細書では、用語「三重特異性抗体」は、３つの異なる抗原を認識するように操作された単一の抗体を指す。
【0080】
本発明の三重特異性抗体は、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＭＳＬＮ抗体、及び抗ＣＤ３抗体を同時に含んでいるため、ＥＧＦＲ又はＭＳＬＮを発現している癌細胞やＴ細胞と特異的に結合することができ、免疫細胞の活性化を誘導することでＥＧＦＲ又はＭＳＬＮを発現している癌細胞は増殖抑制される又は死滅する。
【0081】
本発明では、第１の融合タンパク質の第３の融合タンパク質への結合により単一の抗体、すなわち三重特異性抗体を提供するために、各融合タンパク質は、重鎖定常ドメインの一部のアミノ酸残基で置換を受けてもよい。すなわち、第１の融合タンパク質と第３の融合タンパク質のＦｃ領域は、ジスルフィド結合又はノブイントゥホール構造（ノブイントゥホール構造が好ましい）を介して互いに連結され、三重特異性抗体を形成してもよい。
【0082】
本発明では、三重特異性抗体は、第１の融合タンパク質のＩにおけるノブ修飾と、第３の融合タンパク質のＰにおけるホール修飾とを含んでいてもよい。或いは、三重特異性抗体は、第１の融合タンパク質のＩにおけるホール修飾と、第３の融合タンパク質のＰにおけるノブ修飾とを含んでいてもよい。
【0083】
本発明では、三重特異性抗体は、２＋１ ＩｇＧの形態であってもよく、抗ＥＧＦＲ Ｆａｂ断片を構成する重鎖と軽鎖を、断片が単鎖として発現するように互いにリンカーで連結すること、抗ＭＳＬＮ又は抗ＣＤ３ Ｆａｂ断片を構成する重鎖と軽鎖を、それぞれの断片が単鎖として発現するように互いにリンカーで連結すること、及び単鎖である抗ＭＳＬＮ断片と抗ＣＤ３ Ｆａｂ断片を互いにペプチドリンカーで連結することによって得られる２つの単鎖からなっていてもよい。
【0084】
本発明のさらに別の態様では、活性成分として第１の融合タンパク質、第２の融合タンパク質、第３の融合タンパク質、二重特異性抗体、又は三重特異性抗体を含む、癌を治療するための医薬組成物、及び治療有効量の医薬組成物を個体に投与するステップを含む、個体における癌治療の方法が提供される。
【0085】
医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含んでいてもよい。薬学的に許容される担体としては、結合剤、流動促進剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定剤、懸濁化剤、色素、香料などが挙げられ、経口投与の場合には、これらを使用してもよく、緩衝剤、保存剤、鎮痛剤、可溶化剤、等張化剤、安定剤などを注射用混合物に使用してもよく、基剤、賦形剤、滑沢剤、保存剤などを局所投与用に使用してもよい。
【0086】
医薬組成物の調製は、上述のように薬学的に許容される担体と混合されることにより、様々な方法で調製することができる。例えば、経口投与のために、医薬組成物は、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハなどの形態で製剤化することができる。注射用に、医薬組成物は、単位用量のアンプルや多用量の形態で製剤化することができる。
【0087】
医薬組成物は、癌細胞若しくはその転移を治療するため、又は癌の増殖を抑制するために、薬学的有効量を投与することができる。有効量は、癌の種類、患者の年齢、体重、症状の性質と重症度、現在の治療法の種類、治療回数、剤形、投与経路などの様々な要因によって異なることがあり、対応する分野の専門家が容易に決定することができる。
【0088】
医薬組成物は、上述の薬理学的又は生理学的成分と一緒に又は順次に投与されてもよく、さらに従来の治療薬と組み合わせて投与されてもよく、その場合、医薬組成物は従来の治療薬と順次又は同時に投与されてもよい。このような投与は、単回又は複数回の投与であってもよい。上記の要素をすべて考慮すると、最小量であり、副作用なしに最大の効果を得ることができる量を投与することが重要であり、そのような量は当業者が容易に決定することができる。
【0089】
本発明では、癌は、限定されることなく、当技術分野で知られている任意の癌を含むことができる。
【0090】
本発明のなおさらなる別の態様では、第１の融合タンパク質、第２の融合タンパク質、第３の融合タンパク質、二重特異性抗体、又は三重特異性抗体の、癌の治療を必要とする個体の癌を治療するための医薬品の製造のための使用が提供される。
【0091】
［発明の形態］
以下、本発明の理解を助けるために、好ましい実施例を提供する。しかし、以下の実施例は、本発明の理解を容易にするために与えられたものに過ぎず、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。
以下、本発明の理解を助けるために、好ましい実施例を提供する。しかし、以下の実施例は、本発明の理解を容易にするために与えられたものに過ぎず、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。
【0092】
実施例１ 抗ＭＳＬＮ／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び抗ＥＧＦＲ／抗ＭＳＬＮ／抗ＣＤ３三重特異性抗体の製造
実施例１．１ ＭＳＬＮ、ＣＤ３、又はＥＧＦＲ特異的抗体の製造
ＭＳＬＮに特異的な抗体を選択するために、マウスに組換えヒトＭＳＬＮを免疫した後、そこからＢ細胞を抽出し、様々な抗体遺伝子をクローニングした。ファージディスプレイを用いて、これらの遺伝子を用いて抗体ライブラリーを作製し、組換えヒトＭＳＬＮと結合する抗体をクローニングした。最後に、抗体のヒト化を行い、配列番号１のアミノ酸配列からなるＨＭＩ３２３クローンが得られ、このアミノ酸配列は配列番号４のヌクレオチド配列からなる遺伝子によってコードされている。
実施例１．１ ＭＳＬＮ、ＣＤ３、又はＥＧＦＲ特異的抗体の製造
ＭＳＬＮに特異的な抗体を選択するために、マウスに組換えヒトＭＳＬＮを免疫した後、そこからＢ細胞を抽出し、様々な抗体遺伝子をクローニングした。ファージディスプレイを用いて、これらの遺伝子を用いて抗体ライブラリーを作製し、組換えヒトＭＳＬＮと結合する抗体をクローニングした。最後に、抗体のヒト化を行い、配列番号１のアミノ酸配列からなるＨＭＩ３２３クローンが得られ、このアミノ酸配列は配列番号４のヌクレオチド配列からなる遺伝子によってコードされている。
【0093】
ヒト及びサルのＣＤ３に特異的な抗体を選択するために、マウスＳＰ３４抗体をヒト化し、ＣＤ３に様々な親和性で結合する抗体を選択した。これらのうち、配列番号２１のアミノ酸配列からなるクローンＡ０７、配列番号１１のアミノ酸配列からなるクローンＡ１５、及び配列番号２３のアミノ酸配列からなるクローンＥ１５が得られ、これらのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２２、１２、及び２４のヌクレオチド配列からなる遺伝子によってコードされている。
【0094】
ＥＧＦＲ特異的抗体には、大腸癌の治療薬であるセツキシマブを使用した。配列番号５のアミノ酸配列からなる抗体が得られ、このアミノ酸配列は配列番号６のヌクレオチド配列からなる遺伝子によってコードされている。
【0095】
実施例１．２ 抗体発現用ベクターのトランスフェクション
実施例１．２．１ 抗体発現用ベクターの構築
図１に示すように、抗ＭＳＬＮ抗体（ＨＭＩ３２３）と、抗ＭＳＬＮ Ｆａｂ（ＨＭＩ３２３）に抗ＣＤ３ Ｆａｂ（Ａ１５）を連結して得られた抗体との共発現を行い、ノブイントゥホール構造を有する二重特異性抗体（ＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５）が発現するように、以下のようにベクターを構築した。
実施例１．２．１ 抗体発現用ベクターの構築
図１に示すように、抗ＭＳＬＮ抗体（ＨＭＩ３２３）と、抗ＭＳＬＮ Ｆａｂ（ＨＭＩ３２３）に抗ＣＤ３ Ｆａｂ（Ａ１５）を連結して得られた抗体との共発現を行い、ノブイントゥホール構造を有する二重特異性抗体（ＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５）が発現するように、以下のようにベクターを構築した。
【0096】
Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎＨＤ（Ｔａｋａｒａ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、抗ＭＳＬＮ（ＨＭＩ３２３）抗体配列のＤＮＡ（配列番号４）、又は抗ＭＳＬＮ Ｆａｂ（ＨＭＩ３２３）に抗ＣＤ３ Ｆａｂ（Ａ１５）を連結して得られた抗体配列のＤＮＡ（配列番号２）を各ｐＣＩベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）に挿入した後、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コンピテントセルを用いて、４２℃で４５秒間の熱ショック形質転換を行った。形質転換体を、カルベニシリンを含むＬＢプレートに蒔き、３７℃のインキュベーターで１４時間培養した。培養後、プレート上で培養した形質転換体コロニーを２ｍｌのカルベニシリン含有ＬＢ培地に接種し、３７℃の振盪インキュベーター内で１６時間培養した。次いで、培養した形質転換体からプラスミドを抽出し、そのシークエンシングは、抗体発現のための遺伝子がベクターにクローニングされていたこと示した。
【0097】
図２に示すように、抗ＥＧＦＲ抗体（セツキシマブ）と、抗ＭＳＬＮ Ｆａｂ（ＨＭＩ３２３）に抗ＣＤ３ Ｆａｂ（Ａ１５）を連結して得られた抗体との共発現を行い、ノブイントゥホール構造を有する三重特異性抗体（セツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５）が発現するように、以下のようにベクターを構築した。
【0098】
Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎＨＤ（Ｔａｋａｒａ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、抗ＥＧＦＲ（セツキシマブ）抗体配列のＤＮＡ（配列番号６）、又は抗ＭＳＬＮ Ｆａｂ（ＨＭＩ３２３）に抗ＣＤ３ Ｆａｂ（Ａ１５）を連結して得られた抗体配列のＤＮＡ（配列番号２）を各ｐＣＩベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）に挿入した後、大腸菌コンピテントセルを用いて、４２℃で４５秒間の熱ショック形質転換を行った。形質転換体を、カルベニシリンを含むＬＢプレートに蒔き、３７℃のインキュベーターで１４時間培養した。培養後、プレート上で培養した形質転換体コロニーを２ｍｌのカルベニシリン含有ＬＢ培地に接種し、３７℃の振盪インキュベーター内で１６時間培養した。次いで、培養した形質転換体からプラスミドを抽出し、そのシークエンシングは、抗体発現のための遺伝子がベクターにクローニングされていたことを示した。
【0099】
実施例１．２．２ 抗体発現用ベクターの宿主細胞へのトランスフェクション
２４時間前に、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を２．０×１０６細胞／ｍｌの密度で、Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて１２５±１０ｒｐｍ、３７℃、８％ＣＯ２の振盪インキュベーターで継代培養した。トランスフェクション時に、細胞数と細胞生存率を測定し、９５％以上の細胞生存率を示すかどうかを確認した。５００ｍＬの培養フラスコに５×１０８個の細胞を分注し、次いでＥｘｐｉ２９３（商標）発現培地を加えて最終容量を１７０ｍＬ（２００ｍＬを基準）に調整した。
２４時間前に、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を２．０×１０６細胞／ｍｌの密度で、Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて１２５±１０ｒｐｍ、３７℃、８％ＣＯ２の振盪インキュベーターで継代培養した。トランスフェクション時に、細胞数と細胞生存率を測定し、９５％以上の細胞生存率を示すかどうかを確認した。５００ｍＬの培養フラスコに５×１０８個の細胞を分注し、次いでＥｘｐｉ２９３（商標）発現培地を加えて最終容量を１７０ｍＬ（２００ｍＬを基準）に調整した。
【0100】
Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ（商標）培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、２００μｇの抗体発現ベクターを合計１，５００μｌになるように混合し、室温で５分間培養した。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ（商標）培地を用いて、トランスフェクション試薬（ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標） ２９３ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）５４０μｌを合計１，５００μｌになるように混合し、室温で５分間培養した。ベクターとトランスフェクション試薬をそれぞれ含むＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ（商標）培地を穏やかに混合し、室温で２０分間反応させた。次いで、得られたものをＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞を含むフラスコに入れた。
【0101】
培養は、３７℃、８％ＣＯ２の振盪インキュベーター内で１２５±１０ｒｐｍで１６～２０時間行った。次いで、そこに１ｍｌのトランスフェクションエンハンサーＩ（ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標） ２９３ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｉ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及び１０ｍｌのトランスフェクションエンハンサーＩＩ（ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標） ２９３ Ｅｎｈａｎｃｅｒ ＩＩ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、５日間培養を行って候補抗体を得た。
【0102】
実施例２ 抗ＭＳＬＮ／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び抗ＥＧＦＲ／抗ＭＳＬＮ／抗ＣＤ３三重特異性抗体の精製
実施例２．１ アフィニティークロマトグラフィーを使用した精製
プロテインＡと抗体の特異的な相互作用を利用した抗体のみを分離する実験として、培養液を４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、０．２２μｍのボトルトップフィルターで濾過し、細胞片を除去した上清を調製した。次いで、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を５ｍｌ充填したカラムを、ＡＫＴＡ ＰｒｉｍｅＰｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に接続して使用した。その後、結合緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）による洗浄を行い、次いで上清を５ｍｌ／分の速度で装填した。調製した上清をすべて装填した後、同じ速度で結合緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）による洗浄を行い、非特異的結合を除去した。
実施例２．１ アフィニティークロマトグラフィーを使用した精製
プロテインＡと抗体の特異的な相互作用を利用した抗体のみを分離する実験として、培養液を４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、０．２２μｍのボトルトップフィルターで濾過し、細胞片を除去した上清を調製した。次いで、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を５ｍｌ充填したカラムを、ＡＫＴＡ ＰｒｉｍｅＰｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に接続して使用した。その後、結合緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）による洗浄を行い、次いで上清を５ｍｌ／分の速度で装填した。調製した上清をすべて装填した後、同じ速度で結合緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）による洗浄を行い、非特異的結合を除去した。
【0103】
洗浄後、ＩｇＧ溶出緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）を流しながら、ＵＶ２８０ｎｍの値が上昇した部分を５ｍｌの結合緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）が入った試験管に５ｍｌずつ分取し、溶出液を直ちに中和した。中和した溶出液を、Ｚｅｂａスピン脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＰＢＳとの緩衝液交換を行った。
実施例２．２ サイズ排除クロマトグラフィーを使用した精製（ＳＥＣ）
分離した抗体のうち、２００ｋＤａの標的抗体のみをサイズによる分離精製法で分離する実験として、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＳＥＣカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、ＡＫＴＡ ｐｕｒｅ １５０Ｌ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に接続して使用した。ＰＢＳとの緩衝液交換を行った抗体サンプルをサンプルループに充填し、ＡＫＴＡ ｐｕｒｅ １５０Ｌ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に接続した。次いで、１ｍｌ／分の流速条件で工程を行い、ピークパターンに応じて溶出サンプルを１ｍｌずつ分取した。分取した溶出液をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）、Ｎｏｖｅｘ ４～１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｇｅｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に供し、次いでクーマシーブルーで染色して確認した。２００ｋＤａの高純度標的抗体のみをプールした。
実施例２．２ サイズ排除クロマトグラフィーを使用した精製（ＳＥＣ）
分離した抗体のうち、２００ｋＤａの標的抗体のみをサイズによる分離精製法で分離する実験として、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＳＥＣカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、ＡＫＴＡ ｐｕｒｅ １５０Ｌ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に接続して使用した。ＰＢＳとの緩衝液交換を行った抗体サンプルをサンプルループに充填し、ＡＫＴＡ ｐｕｒｅ １５０Ｌ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に接続した。次いで、１ｍｌ／分の流速条件で工程を行い、ピークパターンに応じて溶出サンプルを１ｍｌずつ分取した。分取した溶出液をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）、Ｎｏｖｅｘ ４～１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｇｅｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に供し、次いでクーマシーブルーで染色して確認した。２００ｋＤａの高純度標的抗体のみをプールした。
【0104】
そうすることで、表１に示す結果が得られた。
【0105】
【表1】
【0106】
実施例３ ＭＳＬＮ、ＣＤ３、及びＥＧＦＲに対する抗体の親和性の測定
Ｏｃｔｅｔシステムを用いて、二重特異性抗体（ＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５）と三重特異性抗体（セツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５）の、それぞれヒトＭＳＬＮ、ヒトＣＤ３、及びヒトＥＧＦＲに対する親和性を測定した。
Ｏｃｔｅｔシステムを用いて、二重特異性抗体（ＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５）と三重特異性抗体（セツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５）の、それぞれヒトＭＳＬＮ、ヒトＣＤ３、及びヒトＥＧＦＲに対する親和性を測定した。
【0107】
具体的には、組換えヒトＭＳＬＮ、ＣＤ３、及びＥＧＦＲを１×キネティック緩衝液で２０μｇ／ｍｌに調製し、９６ウェルプレートに２００μｌ／ウェルでプレーティングした。プレーティングしたＭＳＬＮ、ＣＤ３、及びＥＧＦＲを、アミノプロピルシラン（ＡＰＳ）センサー（カタログ番号１８－５０４５、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）に固定化した。二重特異性抗体（ＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５）と三重特異性抗体（セツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５）を、１０×キネティック緩衝液で１００、５０、２５、１２．５、６．２５ｎＭに調製し、２００μｌ／ウェルの濃度でプレーティングした。各抗体とセンサーに固定化した組換えヒトＭＳＬＮ（表２）、ヒトＣＤ３（表３）、ヒトＥＧＦＲ（表４）のそれぞれとの相互作用を解析し、抗原－抗体親和性を算出した。結果をそれぞれ表２～４に示す。
【0108】
【表2】
【0109】
【表3】
【0110】
【表4】
【0111】
表２～４に示す測定結果から、二重特異性抗体（ＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５）及び三重特異性抗体（セツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５）は、ヒトＭＳＬＮ、ヒトＣＤ３、及びヒトＥＧＦＲに対して優れた親和性を示すことがわかった。
【0112】
実施例４ ＭＳＬＮ、ＥＧＦＲ、及びＣＤ３を発現する細胞に対する抗体の親和性の解析
フローサイトメトリーを用いて、二重特異性抗体（ＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５）又は三重特異性抗体（セツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５）が特定の細胞株に対して親和性を示すかどうかを確認した。
フローサイトメトリーを用いて、二重特異性抗体（ＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５）又は三重特異性抗体（セツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５）が特定の細胞株に対して親和性を示すかどうかを確認した。
【0113】
具体的には、１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＢＳ／シース緩衝液）を入れた試験管を用意し、これに３種類の細胞株、すなわちＭＳＬＮとＥＧＦＲを過剰発現しているＨ２２６癌細胞株（ＡＴＣＣ（登録商標）、ＣＲＬ－５８２６（商標））、ＭＳＬＮとＥＧＦＲを過剰発現しているＡｓＰＣ－１癌細胞株（ＡＴＣＣ（登録商標）、ＣＲＬ－１６８２（商標））、ＣＤ３を発現しているＪｕｒｋａｔ Ｅ６－１ Ｔ細胞株（ＡＴＣＣ（登録商標）、ＴＩＢ－１５２（商標））をそれぞれ０．５×１０６細胞の濃度で添加し、次いで各試験管を１μｇの一次抗体（ＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５又はセツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５）で処理した。次いで、１時間半光を遮断し、４℃でインキュベーションを行った。その後、２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液をそこに加えた。４℃、２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離を行い、次いで、上清を除去した。
【0114】
次に、１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中、各試験管を、一次抗体と特異的に結合可能な０．２μｇの蛍光標識二次抗体（ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ）で処理した。次いで、３０分間光を遮断し、４℃でインキュベーションを行った。その後、２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液をそこに加え、４℃、２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離を行い、次いで、上清を除去してサンプルを得た。
【0115】
細胞が懸濁するように、２００μｌのＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ（商標）をサンプルに添加し、ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（商標）で解析を行った。特定の細胞に対する結合親和性のＥＣ５０値を下記の表５に示す。
【0116】
【表5】
【0117】
図７～９に示す解析の結果から、二重特異性抗体（ＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５）及び三重特異性抗体（セツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５）の両方が、３種類の細胞株に結合することがわかった。無関係な対照として用いた陰性対照抗体は、３種類の細胞株のいずれにも結合しなかった。
【0118】
実施例５ ＰＢＭＣの存在下での腫瘍細胞株に対する抗体の殺細胞効果の評価
実施例５．１ 標的細胞株の構築
２種類のＭＳＬＮ＋腫瘍細胞（Ｈ２２６、ＡｓＰＣ－１）にＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標） ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＥＦ－１αプロモーター、ピューロマイシン選択）を形質導入し、ピューロマイシンで処理することで、ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄを形質導入した腫瘍細胞株である標的細胞株を最終的に構築した。
実施例５．１ 標的細胞株の構築
２種類のＭＳＬＮ＋腫瘍細胞（Ｈ２２６、ＡｓＰＣ－１）にＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標） ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＥＦ－１αプロモーター、ピューロマイシン選択）を形質導入し、ピューロマイシンで処理することで、ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄを形質導入した腫瘍細胞株である標的細胞株を最終的に構築した。
【0119】
実施例５．２ 標的細胞株の調製
１×トリプシン－ＥＤＴＡ溶液で細胞を回収し、４℃、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離を行った。その後、上清を除去し、ｃＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ、Ａ１０４９１－０１＋１０％ＦＢＳ＋５５μＭ β－ＭＥ）で再懸濁した。次いで、細胞数を定量化した。それぞれの細胞株の懸濁液を調製し、９６ウェルプレートに１０，０００細胞／ウェルで添加し、プレートを３７℃のＣＯ２インキュベーターで１日インキュベートし、標的細胞株を調製した。
１×トリプシン－ＥＤＴＡ溶液で細胞を回収し、４℃、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離を行った。その後、上清を除去し、ｃＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ、Ａ１０４９１－０１＋１０％ＦＢＳ＋５５μＭ β－ＭＥ）で再懸濁した。次いで、細胞数を定量化した。それぞれの細胞株の懸濁液を調製し、９６ウェルプレートに１０，０００細胞／ウェルで添加し、プレートを３７℃のＣＯ２インキュベーターで１日インキュベートし、標的細胞株を調製した。
【0120】
実施例５．３ 末梢血単核細胞の調製
凍結保存した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を３７℃のウォーターバスで急速に解凍し、次いで５０ｍｌの円錐試験管に移した。そこに解凍用培地（ＲＰＭＩ、１１８７５－０９３＋１０％ＦＢＳ＋５５μＭ β－ＭＥ）を滴下し、振盪しながら混合した。次いで、４℃、１，２００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行って上清を除去し、ｃＲＰＭＩで再懸濁した。次いで、細胞数を定量化した。
凍結保存した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を３７℃のウォーターバスで急速に解凍し、次いで５０ｍｌの円錐試験管に移した。そこに解凍用培地（ＲＰＭＩ、１１８７５－０９３＋１０％ＦＢＳ＋５５μＭ β－ＭＥ）を滴下し、振盪しながら混合した。次いで、４℃、１，２００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行って上清を除去し、ｃＲＰＭＩで再懸濁した。次いで、細胞数を定量化した。
【0121】
実施例５．４ 末梢血単核細胞と抗体のプレーティング
標的細胞をウェルにプレーティングした。２４時間後、二重特異性抗体（ＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５）と三重特異性抗体（セツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５）のそれぞれをｃＲＰＭＩで希釈し、次いで２０ｎＭから始めて１／５に希釈した（０．２６ｐＭ～２０ｎＭの濃度範囲で）。次いで、ＰＢＭＣ：標的細胞＝２０：１又は１０：１の割合でＰＢＭＣを調製し、ｃＲＰＭＩに懸濁した後、ウェルに添加した。
標的細胞をウェルにプレーティングした。２４時間後、二重特異性抗体（ＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５）と三重特異性抗体（セツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５）のそれぞれをｃＲＰＭＩで希釈し、次いで２０ｎＭから始めて１／５に希釈した（０．２６ｐＭ～２０ｎＭの濃度範囲で）。次いで、ＰＢＭＣ：標的細胞＝２０：１又は１０：１の割合でＰＢＭＣを調製し、ｃＲＰＭＩに懸濁した後、ウェルに添加した。
【0122】
実施例５．５ ＩｎｃｕＣｙｔｅＳ３を使用したリアルタイムでの細胞測定と解析
明視野及び赤色蛍光は、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で２日間インキュベーションを行いながら、ＩｎｃｕＣｙｔｅＳ３を使用して２４時間後及び４８時間後に１０倍で測定した。ＭＳＬＮ発現腫瘍細胞に対する抗体によるＰＢＭＣを介した殺細胞のＩＣ５０値は下記の表６に示す通りであり、ＭＳＬＮ発現腫瘍細胞に対する抗体によるＰＢＭＣを介した殺細胞の最大効果（％）は下記の表７の通りである。
明視野及び赤色蛍光は、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で２日間インキュベーションを行いながら、ＩｎｃｕＣｙｔｅＳ３を使用して２４時間後及び４８時間後に１０倍で測定した。ＭＳＬＮ発現腫瘍細胞に対する抗体によるＰＢＭＣを介した殺細胞のＩＣ５０値は下記の表６に示す通りであり、ＭＳＬＮ発現腫瘍細胞に対する抗体によるＰＢＭＣを介した殺細胞の最大効果（％）は下記の表７の通りである。
【0123】
【表6】
【0124】
【表7】
【0125】
図１０～１５に示す評価の結果から、２種類のＭＳＬＮ及びＥＧＦＲを発現する癌細胞株（Ｈ２２６、ＡｓＰＣ－１）に対する二重特異性抗体（ＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５）及び三重特異性抗体（セツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５）の殺細胞効果は、ＰＢＭＣ：標的細胞＝２０：１又は１０：１の条件で、用量依存的に示されることが確認された。さらに、無関係な抗体とＣＤ３抗体を連結した二重特異性抗体（無関係／ＣＤ３）は、細胞死を誘導しなかった。
【0126】
実施例６ Ｔ細胞の存在下でのＭＳＬＮ＋腫瘍細胞株に対する抗体の殺細胞効果の評価
実施例６．１ 標的細胞株の構築
２種類のＭＳＬＮ＋腫瘍細胞（Ｈ２２６、ＡｓＰＣ－１）にＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＥＦ－１αプロモーター、ピューロマイシン選択）を形質導入し、ピューロマイシンで処理することで、ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄを形質導入した腫瘍細胞株である標的細胞株を最終的に構築した。
実施例６．１ 標的細胞株の構築
２種類のＭＳＬＮ＋腫瘍細胞（Ｈ２２６、ＡｓＰＣ－１）にＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＥＦ－１αプロモーター、ピューロマイシン選択）を形質導入し、ピューロマイシンで処理することで、ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄを形質導入した腫瘍細胞株である標的細胞株を最終的に構築した。
【0127】
実施例６．２ 標的細胞株の調製
１×トリプシン－ＥＤＴＡ溶液で細胞を回収し、４℃、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離を行った。その後、上清を除去し、ｃＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ、Ａ１０４９１－０１＋１０％ＦＢＳ＋５５μＭ β－ＭＥ）で再懸濁した。次いで、細胞数を定量化した。それぞれの細胞株の懸濁液を調製し、９６ウェルプレートに１０，０００細胞／ウェルで添加し、プレートを３７℃のＣＯ２インキュベーターで１日インキュベートし、標的細胞株を調製した。
１×トリプシン－ＥＤＴＡ溶液で細胞を回収し、４℃、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離を行った。その後、上清を除去し、ｃＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ、Ａ１０４９１－０１＋１０％ＦＢＳ＋５５μＭ β－ＭＥ）で再懸濁した。次いで、細胞数を定量化した。それぞれの細胞株の懸濁液を調製し、９６ウェルプレートに１０，０００細胞／ウェルで添加し、プレートを３７℃のＣＯ２インキュベーターで１日インキュベートし、標的細胞株を調製した。
【0128】
実施例６．３ 増殖したＴ細胞の調製
凍結保存した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を３７℃のウォーターバスで急速に解凍し、次いで５０ｍｌの円錐試験管に移した。そこに解凍用培地（ＲＰＭＩ、１１８７５－０９３＋１０％ＦＢＳ＋５５μＭ β－ＭＥ）を滴下し、振盪しながら混合した。次いで、４℃、１，２００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行って上清を除去し、ＭＡＣＳ培地（ＰＢＳ＋０．５％ＦＢＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁した。そこに細胞数に応じてＣＤ３マイクロビーズを加え、４℃で１５分間染色を行った。ＬＳカラムを使用してＣＤ３ Ｔ細胞のみを単離した。単離したＣＤ３ Ｔ細胞をＸ－ＶＩＶＯに懸濁した。次いで、そこにαＣＤ３／２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）、ＩＬ－２（２００Ｕ／ｍｌ、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標））、及びヒト血漿（５％）を加え、３７℃のインキュベーターでインキュベーションを行った。インキュベーション開始から４日後と７日後に細胞数を計測し、細胞濃度が１×１０６細胞／ｍｌになるようにＸ－ＶＩＶＯ、ＩＬ－２、及びヒト血漿を追加添加した。
凍結保存した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を３７℃のウォーターバスで急速に解凍し、次いで５０ｍｌの円錐試験管に移した。そこに解凍用培地（ＲＰＭＩ、１１８７５－０９３＋１０％ＦＢＳ＋５５μＭ β－ＭＥ）を滴下し、振盪しながら混合した。次いで、４℃、１，２００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行って上清を除去し、ＭＡＣＳ培地（ＰＢＳ＋０．５％ＦＢＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁した。そこに細胞数に応じてＣＤ３マイクロビーズを加え、４℃で１５分間染色を行った。ＬＳカラムを使用してＣＤ３ Ｔ細胞のみを単離した。単離したＣＤ３ Ｔ細胞をＸ－ＶＩＶＯに懸濁した。次いで、そこにαＣＤ３／２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）、ＩＬ－２（２００Ｕ／ｍｌ、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標））、及びヒト血漿（５％）を加え、３７℃のインキュベーターでインキュベーションを行った。インキュベーション開始から４日後と７日後に細胞数を計測し、細胞濃度が１×１０６細胞／ｍｌになるようにＸ－ＶＩＶＯ、ＩＬ－２、及びヒト血漿を追加添加した。
【0129】
実施例６．４ Ｔ細胞と抗体のプレーティング
標的細胞をウェルにプレーティングした。２４時間後、二重特異性抗体（ＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５）と三重特異性抗体（セツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５）のそれぞれをｃＲＰＭＩで希釈し、次いで２０ｎＭから始めて１／５に希釈した（０．２６ｐＭ～２０ｎＭの濃度範囲で）。次いで、Ｔ細胞：標的細胞＝１０：１又は５：１の割合で増殖したＴ細胞を最終的に調製し、ｃＲＰＭＩに懸濁した後、ウェルに添加した。
標的細胞をウェルにプレーティングした。２４時間後、二重特異性抗体（ＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５）と三重特異性抗体（セツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５）のそれぞれをｃＲＰＭＩで希釈し、次いで２０ｎＭから始めて１／５に希釈した（０．２６ｐＭ～２０ｎＭの濃度範囲で）。次いで、Ｔ細胞：標的細胞＝１０：１又は５：１の割合で増殖したＴ細胞を最終的に調製し、ｃＲＰＭＩに懸濁した後、ウェルに添加した。
【0130】
実施例６．５ ＩｎｃｕＣｙｔｅＳ３を使用したリアルタイムでの細胞測定と解析
明視野及び赤色蛍光は、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で２日間インキュベーションを行いながら、ＩｎｃｕＣｙｔｅＳ３（Ｅｓｓｅｎｂｉｏ）を使用して２４時間後及び４８時間後に１０倍で測定した。ＭＳＬＮ発現腫瘍細胞に対する抗体によるＴ細胞を介した殺細胞のＩＣ５０値は下記の表８に示す通りであり、ＭＳＬＮ発現腫瘍細胞に対する抗体によるＴ細胞を介した殺細胞の最大効果（％）は下記の表９の通りである。
明視野及び赤色蛍光は、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で２日間インキュベーションを行いながら、ＩｎｃｕＣｙｔｅＳ３（Ｅｓｓｅｎｂｉｏ）を使用して２４時間後及び４８時間後に１０倍で測定した。ＭＳＬＮ発現腫瘍細胞に対する抗体によるＴ細胞を介した殺細胞のＩＣ５０値は下記の表８に示す通りであり、ＭＳＬＮ発現腫瘍細胞に対する抗体によるＴ細胞を介した殺細胞の最大効果（％）は下記の表９の通りである。
【0131】
【表8】
【0132】
【表9】
【0133】
図１６～１９に示す評価の結果から、２種類のＭＳＬＮ及びＥＧＦＲを発現する癌細胞株（Ｈ２２６、ＡｓＰＣ－１）に対する二重特異性抗体（ＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５）及び三重特異性抗体（セツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５）の殺細胞効果は、Ｔ細胞：標的細胞＝１０：１又は５：１の条件で、用量依存的に示されることが確認された。さらに、無関係な抗体とＣＤ３抗体を連結した二重特異性抗体（無関係／ＣＤ３）は、細胞死を誘導しなかった。
【0134】
実施例７ マウスにおける抗体の腫瘍増殖抑制効果の解析
Ｔ細胞誘導抗体として開発中の二重特異性抗体（ＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５）と三重特異性抗体（セツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５）の腫瘍増殖抑制効果を確認するために、これらの抗体を腫瘍移植モデルマウスに投与した。
Ｔ細胞誘導抗体として開発中の二重特異性抗体（ＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５）と三重特異性抗体（セツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５）の腫瘍増殖抑制効果を確認するために、これらの抗体を腫瘍移植モデルマウスに投与した。
【0135】
実施例７．１ 細胞株異種移植モデルの確立
動物飼育室に搬入されたマウスに、実験開始前に約１週間の馴化期間を設けた。Ｈ２２６腫瘍細胞株（１×１０７／２００μＬ ＰＢＳ）又はＡｓＰＣ－１腫瘍細胞株（５×１０６／２００μＬ ＰＢＳ）を、マウスの腋窩に皮下注射した。腫瘍細胞注射後５日目に、精製及び活性化したヒトＴ細胞を、Ｔ細胞：腫瘍細胞＝２：１の割合で腹腔内に注射した。腫瘍細胞注射後７日目に、マウスを４群（各群５匹）に分けて、統計解析を行った。その結果、各群間で腫瘍サイズに有意差がないことが確認された。
動物飼育室に搬入されたマウスに、実験開始前に約１週間の馴化期間を設けた。Ｈ２２６腫瘍細胞株（１×１０７／２００μＬ ＰＢＳ）又はＡｓＰＣ－１腫瘍細胞株（５×１０６／２００μＬ ＰＢＳ）を、マウスの腋窩に皮下注射した。腫瘍細胞注射後５日目に、精製及び活性化したヒトＴ細胞を、Ｔ細胞：腫瘍細胞＝２：１の割合で腹腔内に注射した。腫瘍細胞注射後７日目に、マウスを４群（各群５匹）に分けて、統計解析を行った。その結果、各群間で腫瘍サイズに有意差がないことが確認された。
【0136】
実施例７．２ 抗体の投与
Ｔ細胞注射後２日目から、ＰＢＳ又は抗体（ＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５又はセツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５）を３ｍｇ／ｋｇの濃度で週２回（合計４回）腹腔内投与した。
Ｔ細胞注射後２日目から、ＰＢＳ又は抗体（ＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５又はセツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５）を３ｍｇ／ｋｇの濃度で週２回（合計４回）腹腔内投与した。
【0137】
実施例７．３ 腫瘍サイズの測定
群分けした日から終点まで、週に２回、腫瘍サイズ（腫瘍体積（ｍｍ３）＝短軸×長軸×高さ×０．５）を測定した。短軸、長軸、高さの長さは、同じ試験者が定規を用いて測定した。
群分けした日から終点まで、週に２回、腫瘍サイズ（腫瘍体積（ｍｍ３）＝短軸×長軸×高さ×０．５）を測定した。短軸、長軸、高さの長さは、同じ試験者が定規を用いて測定した。
【0138】
実施例７．４ 腫瘍増殖率（ＲＴＶ％）、相対腫瘍増殖率（Ｔ／Ｃ％）、及び腫瘍増殖抑制率（抑制効果）の算出
腫瘍増殖率（相対腫瘍体積（ＲＴＶ）％）は、Ｖ１／Ｖ０法を用いて算出した。Ｖ１は実験効果を測定する時点での体積、Ｖ０は実験開始時点での体積を意味する。各群の相対腫瘍増殖率（Ｔ／Ｃ％）は、各群の平均腫瘍増殖率をＰＢＳ群の平均腫瘍増殖率（測定を行った時点で得られた平均腫瘍増殖率）で除し、得られた値に１００を乗じた値であり、腫瘍増殖抑制率（抑制効果）は１００から相対腫瘍増殖率を減じた値として算出した。統計解析には、実験の種類に応じて一元配置ＡＮＯＶＡ又は二元配置ＡＮＯＶＡを用い、ｐ値が０．０５未満の場合を統計的に有意であると判断した。
腫瘍増殖率（相対腫瘍体積（ＲＴＶ）％）は、Ｖ１／Ｖ０法を用いて算出した。Ｖ１は実験効果を測定する時点での体積、Ｖ０は実験開始時点での体積を意味する。各群の相対腫瘍増殖率（Ｔ／Ｃ％）は、各群の平均腫瘍増殖率をＰＢＳ群の平均腫瘍増殖率（測定を行った時点で得られた平均腫瘍増殖率）で除し、得られた値に１００を乗じた値であり、腫瘍増殖抑制率（抑制効果）は１００から相対腫瘍増殖率を減じた値として算出した。統計解析には、実験の種類に応じて一元配置ＡＮＯＶＡ又は二元配置ＡＮＯＶＡを用い、ｐ値が０．０５未満の場合を統計的に有意であると判断した。
【0139】
実施例７．５ 免疫組織化学
腫瘍が増殖したマウスを抗体（ＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５又はセツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５）で処理してから１週間後、腫瘍サンプルを取り出し、ホルマリンで固定した。その後、サンプルにパラフィンを浸潤させて包埋し、次いでミクロトームでパラフィン切片を得た。パラフィン切片を脱パラフィン化、水和、及び洗浄し、次いでヒトＣＤ３（抗ＣＤ３、Ａｂｃａｍ）又はヒトＣＤ８（抗ＣＤ８、Ａｂｃａｍ）で染色した。組織切片をマイヤーのヘマトキシリン（Ｄａｋｏ）で対比染色し、オリンパスＢＸ５１顕微鏡で観察した。
腫瘍が増殖したマウスを抗体（ＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５又はセツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５）で処理してから１週間後、腫瘍サンプルを取り出し、ホルマリンで固定した。その後、サンプルにパラフィンを浸潤させて包埋し、次いでミクロトームでパラフィン切片を得た。パラフィン切片を脱パラフィン化、水和、及び洗浄し、次いでヒトＣＤ３（抗ＣＤ３、Ａｂｃａｍ）又はヒトＣＤ８（抗ＣＤ８、Ａｂｃａｍ）で染色した。組織切片をマイヤーのヘマトキシリン（Ｄａｋｏ）で対比染色し、オリンパスＢＸ５１顕微鏡で観察した。
【0140】
実施例７．６ 実験の終了及び結果
マウスは頸椎脱臼又はＣＯ２により安楽死させた。その結果、メソテリン過剰発現肺腺癌細胞株Ｈ２２６を異種移植したモデルマウスに対して、セツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５又はＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５抗体を３ｍｇ／ｋｇの濃度で合計４回腹腔内投与した場合、いずれの抗体投与群もＰＢＳ投与群と比較して優れた腫瘍増殖抑制効果を示した（図２０及び２１）。
マウスは頸椎脱臼又はＣＯ２により安楽死させた。その結果、メソテリン過剰発現肺腺癌細胞株Ｈ２２６を異種移植したモデルマウスに対して、セツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５又はＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５抗体を３ｍｇ／ｋｇの濃度で合計４回腹腔内投与した場合、いずれの抗体投与群もＰＢＳ投与群と比較して優れた腫瘍増殖抑制効果を示した（図２０及び２１）。
【0141】
腫瘍組織内への免疫Ｔ細胞の浸潤（暗色に染色）は、抗体（セツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５又はＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５）投与群の方がＰＢＳ群よりも高かったことが、免疫組織化学的染色により示された（図２２）。以下の表１０に示すように、メソテリン、ＥＧＦＲ、ＣＤ３と結合する抗体であるセツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５では腫瘍異種移植後２０日目から、メソテリン及びＣＤ３と結合する抗体であるＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５では腫瘍異種移植後２５日目から、１００％の腫瘍増殖抑制効果が見られた。
【0142】
【表10】
さらに、Ｈ２２６に比べてメソテリンの発現レベルが比較的低い膵臓癌細胞株であるＡｓＰＣ－１を異種移植したマウスモデルに対して、セツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５又はＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５抗体を３ｍｇ／ｋｇの濃度で合計４回腹腔内投与した場合、いずれの抗体投与群もＰＢＳ投与群と比較して優れた腫瘍増殖抑制効果を同様に示した（図２３及び２４）。
【0143】
また、腫瘍組織内への免疫Ｔ細胞の浸潤（暗色に染色）は、抗体（セツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５又はＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５）投与群の方がＰＢＳ群よりも高かったことが、免疫組織化学的染色により示された（図２５）。以下の表１１に示すように、メソテリン、ＥＧＦＲ、ＣＤ３と結合する抗体であるセツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５では腫瘍異種移植後２０日目から、メソテリン及びＣＤ３と結合する抗体であるＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５では腫瘍異種移植後２８日目から、１００％の腫瘍増殖抑制効果が見られた。
【0144】
【表11】
【0145】
実施例８ マウスにおける抗体のＰＫ解析
Ｔ細胞誘導抗体として開発中のセツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５又はＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５の薬物動態（ＰＫ）データを得るために、マウス血清中の抗体のＰＫパラメータを解析した。
Ｔ細胞誘導抗体として開発中のセツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５又はＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５の薬物動態（ＰＫ）データを得るために、マウス血清中の抗体のＰＫパラメータを解析した。
【0146】
実施例８．１ 試験液（マウス血清）の入手
セツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５又はＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５抗体を３ｍｇ／ｋｇの濃度でマウスの尾静脈に注射した。抗体注射後、５分、１時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、１２０時間、１６８時間、２４０時間、３３６時間、５０４時間、及び６７２時間後に後眼窩神経叢からの採血を行った。各群の３匹以上の動物から１００μＬの血液を採取した。血液を室温で約２０～３０分かけて凝固させた後、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、血清を分離した。
セツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５又はＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５抗体を３ｍｇ／ｋｇの濃度でマウスの尾静脈に注射した。抗体注射後、５分、１時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、１２０時間、１６８時間、２４０時間、３３６時間、５０４時間、及び６７２時間後に後眼窩神経叢からの採血を行った。各群の３匹以上の動物から１００μＬの血液を採取した。血液を室温で約２０～３０分かけて凝固させた後、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、血清を分離した。
【0147】
実施例８．２ ＥＬＩＳＡアッセイ
抗ヒトＦａｂ（５０ｎｇ／１００μＬ／ウェル）をプレートに添加し、４℃で一晩反応させた。次いで、残留した溶液を完全に除去した。そこに１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を２００μＬ／ウェルで添加し、室温で１時間反応させた。次いで、残留した溶液を完全に除去した。１％血清／１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を用いて標準溶液（標準抗体）を１μｇ／ｍＬに調整し、次いでそれを用いて１／２に希釈することによって調製した。試験液を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で１００倍に希釈して調製した。
抗ヒトＦａｂ（５０ｎｇ／１００μＬ／ウェル）をプレートに添加し、４℃で一晩反応させた。次いで、残留した溶液を完全に除去した。そこに１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を２００μＬ／ウェルで添加し、室温で１時間反応させた。次いで、残留した溶液を完全に除去した。１％血清／１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を用いて標準溶液（標準抗体）を１μｇ／ｍＬに調整し、次いでそれを用いて１／２に希釈することによって調製した。試験液を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で１００倍に希釈して調製した。
【0148】
調製した標準溶液と試験液を濃度ごとに１００μＬずつ２つのウェルに分注し、室温で１時間反応させた。反応後、ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）溶液を１ウェルあたり３００μＬ分注し、合計３回の洗浄を行った。抗ヒトＦｃ－ＨＲＰを１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ溶液で５０００倍に希釈し、次いでそれを１００μＬずつ各ウェルに分注した。室温で１時間反応させた。反応後、ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）溶液を１ウェルあたり３００μＬ分注し、合計３回の洗浄を行った。実験前にＴＭＢペルオキシダーゼ基質溶液を室温に戻し、それを１００μＬずつ各ウェルに分注した。室温で３０分間反応させた。ＴＭＢ停止溶液を各ウェルに１００μＬずつ分注し、より良く混合するために穏やかに撹拌し、次いで４５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。
【0149】
メソテリン、ＥＧＦＲ、ＣＤ３と結合する抗体であるセツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５、又はメソテリン及びＣＤ３と結合する抗体であるＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５を３ｍｇ／ｋｇの用量でヌードマウスの尾静脈に注射した。次いで、注射から５分、１時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１６８時間、２４０時間、３３６時間、５０４時間、及び６７２時間後に採血を行い、マウス血清中の抗体濃度をＥＬＩＳＡ法により定量化した。結果を図２６及び２７に示す。
【0150】
ＥＬＩＳＡの結果をもとに、ＰＫパラメータを解析した。その結果、セツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５抗体の半減期は約２０７．９４時間、ＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５抗体の半減期は約２０２．５８時間であることが確認された（表１２、及び１３）。これらの半減期は、ＩｇＧ型の一般的な二重特異性抗体の半減期の範囲内である。さらに、曲線下面積（ＡＵＣ）を外挿した値は２０％以下であり、したがって、算出されたＰＫパラメータの信頼性は確保されていた。
【0151】
セツキシマブ／ＨＭＩ３２３－Ａ１５のＰＫパラメータの結果は下記の表１２の通りであり、ＨＭＩ３２３／ＨＭＩ３２３－Ａ１５のＰＫパラメータの結果は表１３の通りである。
【0152】
【表12】
【0153】
【表13】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【配列表】
【外国語明細書】