▶ ブラッコ・イメージング・ソシエタ・ペル・アチオニの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023179429
(43)【公開日】2023-12-19
(54)【発明の名称】キレート化ＡＡＺＴＡコンジュゲートおよびその錯体
(51)【国際特許分類】
C07K 7/64 20060101AFI20231212BHJP
A61K 51/08 20060101ALI20231212BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20231212BHJP
A61P 5/00 20060101ALI20231212BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231212BHJP
A61K 38/08 20190101ALI20231212BHJP
A61K 33/24 20190101ALI20231212BHJP
A61K 33/244 20190101ALI20231212BHJP
A61K 33/245 20190101ALI20231212BHJP
A61K 33/34 20060101ALI20231212BHJP
A61K 33/38 20060101ALI20231212BHJP
A61K 31/551 20060101ALN20231212BHJP
【ＦＩ】
C07K7/64 ZNA
A61K51/08 200
A61P25/00
A61P5/00
A61P35/00
A61K51/08 100
A61K38/08
A61K33/24
A61K33/244
A61K33/245
A61K33/34
A61K33/38
A61K31/551
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023137271
(22)【出願日】2023-08-25
(62)【分割の表示】P 2021525675の分割
【原出願日】2019-11-12
(31)【優先権主張番号】18205796.8
(32)【優先日】2018-11-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(71)【出願人】
【識別番号】504448162
【氏名又は名称】ブラッコ・イメージング・ソシエタ・ペル・アチオニ
【氏名又は名称原語表記】ＢＲＡＣＣＯ ＩＭＡＧＩＮＧ Ｓ．Ｐ．Ａ．
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100156144
【弁理士】
【氏名又は名称】落合 康
(72)【発明者】
【氏名】バラニャイ，ジョルト
(72)【発明者】
【氏名】ギアーニ，シモーナ
(72)【発明者】
【氏名】マイオッキ，アレッサンドロ
(72)【発明者】
【氏名】ハワラ，イヴァン
(57)【要約】 （修正有）
【課題】SSTR発現に関連する病状を診断および治療するための新規のコンジュゲートおよびその金属錯体を提供する。
【解決手段】キレート剤６－アミノ－６－メチルペルヒドロ－１，４－ジアゼピン四酢酸と［Ｔｙｒ３］オクトレオテート／Ｄ－フェニルアラニル－Ｌ－システイニル－Ｌ－チロシル－Ｄ－トリプトフィル－Ｌ－リシル－Ｌ－スレオニル－Ｌ－システイニル－Ｌ－スレオニン環状ジスルフィド（ＳＳＴＲアゴニスト）との新規なコンジュゲート、およびその金属または放射性同位元素との錯体とする。
【選択図】なし
【解決手段】キレート剤６－アミノ－６－メチルペルヒドロ－１，４－ジアゼピン四酢酸と［Ｔｙｒ３］オクトレオテート／Ｄ－フェニルアラニル－Ｌ－システイニル－Ｌ－チロシル－Ｄ－トリプトフィル－Ｌ－リシル－Ｌ－スレオニル－Ｌ－システイニル－Ｌ－スレオニン環状ジスルフィド（ＳＳＴＲアゴニスト）との新規なコンジュゲート、およびその金属または放射性同位元素との錯体とする。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式（Ｉ）：
で示されるキレート化合物またはその薬学的に許容し得る塩。
【化1】
【請求項2】
請求項１に記載のキレート化合物またはその薬学的に許容される塩と、金属イオンとを含んでなる金属錯体。
【請求項3】
金属イオンが、43Sc、44Sc、44mSc、47Sc、51Cr、52Fe、52Mn、52mMn、55Co、58Co、60Cu、61Cu、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、72As、86Y、88Y、90Y、97Ru、99mTc、103Ru、105Rh、109Pd、111In、111Ag、112Ag、117mSn、140La、141Ce、142Pr、149Pm、149Tb、152Tb、155Tb、153Sm、159Gd、161Tb、165Dy、166Dy、166Ho、167Tm、168Yb、175Yb、177Lu、186Re、188Re、199 Au、203Pb、212Pb、205Bi、206Bi、210Bi、211Bi、212Bi、213Biおよび214Biから選択される金属原子のイオンである、請求項２に記載の金属錯体。
【請求項4】
金属イオンが、43Sc、44mSc、44Sc、52Fe、52Mn、52mMn、60Cu、61Cu、62Cu、64Cu、67Ga、68Ga、72As、86Y、99mTc、111In、152Tb、155Tb、199Auおよび203Pbから選択される金属原子のイオンである、請求項２に記載の金属錯体。
【請求項5】
金属イオンが、47Sc、67Cu、88Y、90Y、97Ru、103Ru、105Rh、109Pd、111Ag、112Ag、117mSn、140La、149Pm、149Tb、153Sm、161Tb、165Dy、166Dy、166Ho、167Tm、168Yb、175Yb、177Lu、186Re、188Re、199Au、205Bi、206Bi、210Bi、211Bi、212Bi、212Pb、213Biおよび214Biから選択される金属原子のイオンである、請求項２に記載の金属錯体。
【請求項6】
金属イオンが、44Sc、47Sc、68Ga、177Lu、212Pbまたは213Biのイオンである、請求項３に記載の金属錯体。
【請求項7】
生理学的に許容される塩が、イオン形態の少なくとも１つのカルボン酸基を有する式Ｉの化合物と、無機または有機カチオンとを含んでなる、請求項１～６のいずれかに記載の化合物。
【請求項8】
生理学的に許容される塩が、イオン形態の少なくとも１つのアミノ基を有する式Ｉの化合物と、無機または有機アニオンとを含んでなる、請求項１～６のいずれかに記載の化合物。
【請求項9】
好ましくはin vivo診断（ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴ）のための、画像診断薬として使用するための請求項４に記載の金属錯体。
【請求項10】
神経内分泌腫瘍の検出に使用するための請求項４に記載の金属錯体。
【請求項11】
好ましくはセラノスティックまたは放射線療法のための、治療薬として使用するための請求項５に記載の金属錯体。
【請求項12】
神経内分泌腫瘍の治療に使用するための請求項５に記載の金属錯体。
【請求項13】
薬学的に許容される添加剤と組み合わせて、請求項１に記載のキレート化合物を含む医薬組成物。
【請求項14】
薬学的に許容される添加剤と組み合わせて、請求項２～１２のいずれかに記載の金属錯体を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、一般に、核医学（ＮＭ）の分野に関する。特に、本発明は、キレート剤６－アミノ－６－メチルペルヒドロ－１，４－ジアゼピン四酢酸と［Ｔｙｒ３］オクトレオテート／Ｄ－フェニルアラニル－Ｌ－システイニル－Ｌ－チロシル－Ｄ－トリプトフィル－Ｌ－リシル－Ｌ－スレオニル－Ｌ－システイニル－Ｌ－スレオニン環状ジスルフィド（ＳＳＴＲアゴニスト）との新規なコンジュゲート、およびその金属または放射性同位元素との錯体に関する。本発明はさらに、そのようなリガンドおよび錯体の調製、ならびに診断薬または治療薬としてのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
本発明の背景
放射性医薬品は、診断および／または治療のために主要な臨床分野で使用される放射性同位元素を含むユニークな医薬製剤である。生物学的用途の場合、金属放射性核種は、安全な投与のためにキレート剤（リガンド）に配位させることが一般的行われている。さらに、放射性金属ベースの放射性医薬品を構築するために通常使用されるリガンドは、選択した標的に対する親和性と選択性を示す、標的に特異的な活性を得るために、標的ベクター（ペプチド、ヌクレオチド、抗体、ナノ粒子など）に共有結合（結合）できる反応性官能基を備えた二官能性キレート剤（ＢＦＣ）である。このようにして、患者に注入するとキレート剤が放射性金属イオンにしっかりと結合し、標的分子は放射性医薬品から放射性金属を失うことなく同位体を送達でき、イメージングまたは治療のために生体内で部位特異的な放射線源を効果的に提供する（Price, Chem. Soc. Rev., 2014, 43, 260）。放射性金属の使用は、比較的半減期の短い１８Ｆまたは１１Ｃを分子骨格内に導入するために必要な長い（多段階の）合成と比較して、診断プローブを調製するための迅速な一段階の錯体化に役立つ。キレート剤は、開鎖／非環式のもの（ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレンジアミン四酢酸））およびそれらの誘導体）と、大環状のもの（ＮＯＴＡ（２－［４，７－ビス（カルボキシメチル）－１，４，７－トリアゾナン－１－イル］酢酸）、ＤＯＴＡ（（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸））およびそれらの誘導体）とに分類される。現在用いられているキレート剤の中で、ＤＯＴＡは放射性金属化学の主力リガンドの１つであり、68Ｇａ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、８６／９０Ｙ、２２５Ａｃ、および４４／４７Ｓｃを含む多くの同位体の、現時点での「ゴールドスタンダード」の１つである。ＤＯＴＡは広く使用されており、核医薬品用の２つの異なる製品であるNETSPOT（登録商標）（Ga－68 DOTATATE）とLUTATHERA（登録商標）（Lu－177 DOTATATE）が既にＦＤＡによって承認され、Advanced Accelerator Applications USA INC（現在 Novartis Company）により販売されている。さまざまな二官能性中間体が市販で入手しやすい等、興味深い利点にもかかわらず、特にＤＯＴＡ錯体の形成速度が非常に遅く、また反応条件が極端なため、その使用は温度許容可能なターゲティング部分に制限される。ＤＯＴＡの大きな制約が世界中の多くの施設が新しいキレート剤の開発を刺激しており、現在、放射性医薬品の分野で高度に研究されている分野の１つである。当分野における技術水準の分析から明らかになった別の欠点は、現在の放射性標識の方法に関連している。温度に感受性の生物学的に活性な部分（例えば、ペプチド、ミニ抗体、抗体など）の放射性標識は、例えば、２段階のプロセスで実施することができる。第１のステップは、高温での放射性金属による二官能性キレートの標識であり、第２のステップは、より低い温度（例えば、周囲温度／室温）での生物学的活性部分と放射性錯体のコンジュゲーションとそれに続く精製である。この２段階のプロセスは、放射能のさらなる喪失を引き起こす可能性がある。これらの困難を克服するため、主に６８Ｇａ用として、「キットタイプ」の標識試薬を製造するための、別のキレート剤が提案されており（例えば、DATA－TOC（例えばNock et al. Dalton Trans. 2017, 46(42), 14584－14590を参照）；またはTHP－TATE（例えば、Ma et al. EJNMMI Research, 2015, 5:52を参照）；またはNODAGA－TATE（例えば、Velikyan, Bioconjugate Chem. 2008, 19, 2, 569－573を参照）；THP－PSMA（例えば、Young, J Nucl Med., 2017, 58(8): 1270-1277を参照））、これらは、室温および生理学的条件に近い状態で、好ましくは１ステップのプロセスで、他の放射性金属ベースの放射線診断／放射線治療剤の調製に使用することができる。
放射性医薬品は、診断および／または治療のために主要な臨床分野で使用される放射性同位元素を含むユニークな医薬製剤である。生物学的用途の場合、金属放射性核種は、安全な投与のためにキレート剤（リガンド）に配位させることが一般的行われている。さらに、放射性金属ベースの放射性医薬品を構築するために通常使用されるリガンドは、選択した標的に対する親和性と選択性を示す、標的に特異的な活性を得るために、標的ベクター（ペプチド、ヌクレオチド、抗体、ナノ粒子など）に共有結合（結合）できる反応性官能基を備えた二官能性キレート剤（ＢＦＣ）である。このようにして、患者に注入するとキレート剤が放射性金属イオンにしっかりと結合し、標的分子は放射性医薬品から放射性金属を失うことなく同位体を送達でき、イメージングまたは治療のために生体内で部位特異的な放射線源を効果的に提供する（Price, Chem. Soc. Rev., 2014, 43, 260）。放射性金属の使用は、比較的半減期の短い１８Ｆまたは１１Ｃを分子骨格内に導入するために必要な長い（多段階の）合成と比較して、診断プローブを調製するための迅速な一段階の錯体化に役立つ。キレート剤は、開鎖／非環式のもの（ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレンジアミン四酢酸））およびそれらの誘導体）と、大環状のもの（ＮＯＴＡ（２－［４，７－ビス（カルボキシメチル）－１，４，７－トリアゾナン－１－イル］酢酸）、ＤＯＴＡ（（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸））およびそれらの誘導体）とに分類される。現在用いられているキレート剤の中で、ＤＯＴＡは放射性金属化学の主力リガンドの１つであり、68Ｇａ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、８６／９０Ｙ、２２５Ａｃ、および４４／４７Ｓｃを含む多くの同位体の、現時点での「ゴールドスタンダード」の１つである。ＤＯＴＡは広く使用されており、核医薬品用の２つの異なる製品であるNETSPOT（登録商標）（Ga－68 DOTATATE）とLUTATHERA（登録商標）（Lu－177 DOTATATE）が既にＦＤＡによって承認され、Advanced Accelerator Applications USA INC（現在 Novartis Company）により販売されている。さまざまな二官能性中間体が市販で入手しやすい等、興味深い利点にもかかわらず、特にＤＯＴＡ錯体の形成速度が非常に遅く、また反応条件が極端なため、その使用は温度許容可能なターゲティング部分に制限される。ＤＯＴＡの大きな制約が世界中の多くの施設が新しいキレート剤の開発を刺激しており、現在、放射性医薬品の分野で高度に研究されている分野の１つである。当分野における技術水準の分析から明らかになった別の欠点は、現在の放射性標識の方法に関連している。温度に感受性の生物学的に活性な部分（例えば、ペプチド、ミニ抗体、抗体など）の放射性標識は、例えば、２段階のプロセスで実施することができる。第１のステップは、高温での放射性金属による二官能性キレートの標識であり、第２のステップは、より低い温度（例えば、周囲温度／室温）での生物学的活性部分と放射性錯体のコンジュゲーションとそれに続く精製である。この２段階のプロセスは、放射能のさらなる喪失を引き起こす可能性がある。これらの困難を克服するため、主に６８Ｇａ用として、「キットタイプ」の標識試薬を製造するための、別のキレート剤が提案されており（例えば、DATA－TOC（例えばNock et al. Dalton Trans. 2017, 46(42), 14584－14590を参照）；またはTHP－TATE（例えば、Ma et al. EJNMMI Research, 2015, 5:52を参照）；またはNODAGA－TATE（例えば、Velikyan, Bioconjugate Chem. 2008, 19, 2, 569－573を参照）；THP－PSMA（例えば、Young, J Nucl Med., 2017, 58(8): 1270-1277を参照））、これらは、室温および生理学的条件に近い状態で、好ましくは１ステップのプロセスで、他の放射性金属ベースの放射線診断／放射線治療剤の調製に使用することができる。
【0003】
AAZTA（６－アミノ－６－メチルペルヒドロ－１，４－ジアゼピン四酢酸）は次式を有する。
【化1】
【0004】
AAZTAおよびAAZTA誘導体は、例えば、国際特許出願WO2003/008390、WO2006/136564、WO2006/002873、WO2013/135750、およびWO2008/071679（BRACCO Imaging SpA）に開示されている。二官能性AAZTA誘導体は多くの論文で開示されている（例えば、Nagy et al, Angew. Chem. Int. Ed., 2017；Sinnes et al, J Nucl Med, 2017；Sinnes et al, J Nucl Med , 2016；Pfister et al., EJNMMI Res., 2015, 5(1):74；Wu Z. et al., Nuclear Medicine and Biology, 43, 6, 2016, 360－371）。
【0005】
AAZTA、DTPA、DOTA、HP－DOA3（２－［４，７－ビス（カルボキシルラトメチル）－１０－（２－ヒドロキシプロピル）－１，４，７、１０－テトラザシクロドデカ－１－イル］アセテート）等のいくつかのキレート剤とのＧｄおよび６８Ｇａの新規なキレートの合成は、有望なＭＲＩおよびＰＥＴ腫瘍イメージングプローブとしてコンフォメーションが最適化されたＲＧＤ配列とのコンジュゲーションとして、Manzoniらによって研究された(Manzoni et al. ChemMedChem, 7, 2012, 1084-1093)。
【0006】
（［Ｔｙｒ３］オクトレオテート／Ｄ－フェニルアラニル－Ｌ－システイニル－Ｌ－チロシル－Ｄ－トリプトフィル－Ｌ－リシル－Ｌ－スレオニル－Ｌ－システイニル－Ｌ－スレオニン環状ジスルフィド（TATE）は、次式で示されるペプチドであり、ソマトスタチン受容体（ＳＳＴＲ）－アゴニストとして知られている。
【化2】
【0007】
SSTRは、胃腸膵臓神経内分泌腫瘍（GEP－NET）、ＣＮＳ、乳癌、肺癌、リンパ管の癌などの多くの悪性腫瘍において高い密度で見られ、腎臓癌、甲状腺髄様癌、前立腺癌、結腸癌では低い密度で見られる。神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）におけるSSTRアゴニストの役割は十分に解明されており、いくつかのＮＥＴにおいて大量のSSTR過剰発現がみられる。SSTRは立証済みのＮＥＴ標的/バイオマーカーである（Kwekkeboom et al, Endocrine－Related Cancer, 2010, 17 R53-R73）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
出願人は、AAZTAリガンドと分子ベクターTATEを含む、ペプチドがコンジュゲートした新規のAAZTA誘導体を見出した。
【課題を解決するための手段】
【0009】
出願人によって観察されたように、新規のプローブAAZTA－TATEの金属錯体は、対応するDOTA-TATEの金属錯体に関して予想外に改善されたin vivo特性を有する。
【0010】
出願人はさらに、AAZTAとTATEを含む本発明のバイオコンジュゲートで調製された金属錯体が、意外にも高い速度論的不活性を有することを観察した。特に、本発明のバイオコンジュゲートリガンドは、対応するAAZTAの非バイオコンジュゲート錯体と比べて、予想外に安定である。
【0011】
この新規のコンジュゲートおよびその金属錯体は、特にSSTR発現に関連する病状を診断および治療するための新しいツールとして適している。
【0012】
発明の要旨
本発明の一態様は、式（Ｉ）：
を有する化合物またはその薬学的に許容し得る塩に関する。
本発明の一態様は、式（Ｉ）：
【化3】
【0013】
本発明はさらに、式（Ｉ）のキレート化合物またはその薬学的に許容される塩と、金属イオンとを含む金属錯体に関する。
【0014】
式（Ｉ）の化合物は、以下から選択される金属原子のイオンと錯体を形成することができる：43Sc、44Sc、44mSc、47Sc、51Cr、52Fe、52Mn、52mMn、55Co、58Co、60Cu、61Cu、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、72As、86Y、88Y、90Y、97Ru、99mTc、103Ru、105Rh、109Pd、111In、111Ag、112Ag、117mSn、140La、141Ce、142Pr、149Pm、149Tb、152Tb、155Tb、153Sm、159Gd、161Tb、165Dy、166Dy、166Ho、167Tm、168Yb、175Yb、177Lu、186Re、188Re、199Au、203Pb、212Pb、205Bi、206Bi、210Bi、211Bi、212Bi、213Biおよび214Bi。
【0015】
金属イオンは、好ましくは、44Sc、47Sc、68Ga、177Lu、212Pbまたは213Biのイオンから選択される。
【0016】
本発明のさらなる態様は、特に神経内分泌腫瘍の診断または治療のための、画像診断薬（例えば、ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴイメージング）または治療薬（例えば、アルファ／ベータ／オージェ）としての本化合物の使用に関する。
【0017】
本発明はさらに、式（Ｉ）の化合物の合成およびその後の選択された金属イオンとの錯体化を含む、式（Ｉ）の化合物の調製方法に関する。一般に、金属イオンが放射性核種である場合、この錯体化は「放射性標識」であるとすることもできる。
【0018】
別の態様によれば、本発明は、特に68Gaまたは44Scで放射性標識された場合、式（Ｉ）の化合物を含むＰＥＴ／ＳＰＥＣＴイメージングに適した放射性医薬組成物、または、好ましくは式（Ｉ）の化合物が213Bi、47Sc、177Lu、212Pbで放射性標識されている場合、治療目的に適した放射性医薬組成物に関する。
【発明を実施するための形態】
【0019】
本発明の詳細な説明
第１の態様では、本発明は、式（Ｉ）：
を有する新規化合物、またはその薬学的に許容し得る塩に関する。
第１の態様では、本発明は、式（Ｉ）：
【化4】
【0020】
以下、上記の式（Ｉ）の化合物を「AAZTA－TATE」とする。
【0021】
AAZTA－TATEの調製は、以下の工程を含む、アミド化学を使用して実行することができる（たとえば、実施例の詳細な説明に従って）：
Ａ．オクタペプチド(TATE)の固相ペプチド合成(Petersen, J. Control. Release, 160, 2012, 254-263)；
Ｂ．６－［ビス［２－（１，１－ジメチルエトキシ）－２－オキソエチル］アミノ］－６－（５－カルボキシペンチル）テトラヒドロ－１Ｈ－１，４－ジアゼピン－１，４（５Ｈ）－二酢酸α、α’－ビス（１，１－ジメチルエチル）エステル（(tBu)4－AAZTA－C4－COOH）によるＮ末端アシル化；
Ｃ．固体支持体からの切断と脱保護；
Ｄ．最終化合物の分取ＨＰＬＣによる精製。
Ａ．オクタペプチド(TATE)の固相ペプチド合成(Petersen, J. Control. Release, 160, 2012, 254-263)；
Ｂ．６－［ビス［２－（１，１－ジメチルエトキシ）－２－オキソエチル］アミノ］－６－（５－カルボキシペンチル）テトラヒドロ－１Ｈ－１，４－ジアゼピン－１，４（５Ｈ）－二酢酸α、α’－ビス（１，１－ジメチルエチル）エステル（(tBu)4－AAZTA－C4－COOH）によるＮ末端アシル化；
Ｃ．固体支持体からの切断と脱保護；
Ｄ．最終化合物の分取ＨＰＬＣによる精製。
【0022】
あるいは、AAZTA－TATEは、チオアミド、エステル、チオエステル、エーテル、チオエーテル、尿素、チオ尿素、トリアゾールなどの官能基を使用することにより、当業者に容易に利用可能な他の化学経路を使用することによって調製することができる。
【0023】
式（Ｉ）の化合物は、金属錯体の形成に適している。例えば、原子番号２０～３１、３９、４２、４３、４４、４９、５７～８３の金属元素、または43Sc、44Sc、44mSc、47Sc、51Cr、52Fe、52Mn、52mMn、55Co、58Co、60Cu、61Cu、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、72As、86Y、88Y、90Y、97Ru、99mTc、103Ru、105Rh、109Pd、111In、 111Ag、112Ag、117mSn、140La、141Ce、142Pr、149Pm、149Tb、152Tb、155Tb、153Sm、159Gd、161Tb、165Dy、166Dy、166Ho、167Tm、168Yb、175Yb、 177Lu、186Re、188Re、199 Au、203Pb、212Pb、205Bi、206Bi、210Bi、211Bi、212Bi、213Biおよび214Biから選択されるそれぞれの放射性同位元素からなる群から選択される金属原子のイオン（略して「金属イオン」）と金属錯体を形成することができる。
【0024】
好ましくは、前記金属イオンは、放射性金属原子のイオンである。本明細書および特許請求の範囲において、放射性金属原子という表現は、金属元素の放射性形態を示し、放射性金属、放射性核種、放射性金属核種および放射性同位体という表現と交換可能に使用される。
【0025】
本発明のさらなる態様は、特に神経内分泌腫瘍の診断または治療のための、画像診断薬（例えば、ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴイメージング）または治療薬（例えば、アルファ／ベータ／オージェ）としての式Ｉの化合物の金属錯体の使用に関する。
【0026】
特に、本発明の特定の金属錯体は、好ましくはin vivo診断（例えば、ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴ）用途のために、画像診断薬として使用することができる。
【0027】
in vivo診断用途に適した金属原子の例は、43Sc、44mSc、44Sc、52Fe、52Mn、52mMn、60Cu、61Cu、62Cu、64Cu、67Ga、68Ga、72As、86Y、99mTc、111In、152Tb、155Tb、199Auおよび203Pbからなる群から選択される。
【0028】
好ましい実施形態では、in vivo診断用途のための前記金属錯体は、神経内分泌腫瘍の検出に使用される。
【0029】
本発明の特定の金属錯体は、治療薬として、好ましくはセラノスティクスまたは放射線治療（例えば、ベータ／アルファ）の用途に使用することができる。
【0030】
治療用途に適した金属原子の例は、47Sc、67Cu、88Y、90Y、97Ru、103Ru、105Rh、109Pd、111Ag、112Ag、117mSn、140La、149Pm、149Tb、153Sm、161Tb、165Dy、166Dy、166Ho、167Tm、168Yb、175Yb、177Lu、186Re、188Re、199Au、205Bi、206Bi、210Bi、211Bi、212Bi、212Pb、213Biおよび214Biからなる群から選択される。
【0031】
好ましい実施形態では、治療用途のための前記金属錯体は、神経内分泌腫瘍の治療に使用される。
【0032】
本発明の特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、遷移金属およびポスト遷移金属（68Ｇａなど）の群から選択される金属イオンと金属錯体を形成する。同様の金属イオンは、51Cr、52Fe、52Mn、52mMn、55Co、58Co、60Cu、61Cu、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、103Ru、105Rh、109Pd、111In、186Re、188Re、203Pb、212Pb、205Bi、206Bi、210Bi、211Bi、212Bi、213Biおよび214Biの核種に由来するイオンである。好ましくは、式（Ｉ）の化合物の錯体の金属イオンは、Ｇａ、ＣｏおよびＣｕからなる群から選択される金属原子のイオンである。
【0033】
他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、44Scなどの希土類金属の群から選択される金属原子のイオンと金属錯体を形成する。同様の金属イオンは、43Sc、44mSc、47Sc、86Y、88Y、90Y、140La、141Ce、142Pr、149Pm、149Tb、152Tb、155Tb、153Sm、159Gd、161Tb、165Dy、166Dy、166Ho、167Tm、168Yb、175Yb、177Luの核種に由来するイオンである。好ましくは、式（Ｉ）の化合物の錯体の金属イオンは、Sc、Y、La、Ce、Tb、Sm、Gd、Dy、Ho、Tm、YbおよびLuからなる群から選択される金属原子のイオンである。
【0034】
さらなる実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、213Biなどの軟金属の群から選択される金属イオンと金属錯体を形成する。同様の金属イオンは、103Ru、105Rh、109Pd、186Re、188Re、203Pb、212Pb、205Bi、206Bi、210Bi、211Bi、212Biおよび214Biの核種に由来するイオンである。好ましくは、式（Ｉ）の化合物の錯体の金属イオンは、ＢｉまたはＰｂのイオンである。
【0035】
特に好ましい実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、44Sc、47Sc、68Ga、177Lu、212Pbまたは213Biから選択される金属イオンと錯体を形成する。
【0036】
式（Ｉ）の化合物は、室温で「コールド」または「ホット」金属で正常に標識でき、５分で９０％を超える収率が得られる。本明細書では、特に別段の定めがない限り、「コールド」または「ホット」金属という表現は、それぞれ、非放射性および放射性の金属イオンを指す。
【0037】
有利なことに、AAZTAに結合したペプチドTATEの存在は、標識プロセスに悪影響を及ぼさない。標識は、例えば、様々なモル濃度およびｐＨのＮａＯＡｃ、ＮＨ４ＯＡｃまたはＨＥＰＥＳ緩衝液を含む様々な緩衝媒体中で実施することができる。反応温度は、室温（２０℃）～９５℃、好ましくは２０℃～５０℃の任意の温度である。反応時間は、１～６０分、好ましくは５～１５分の任意の時間である。
【0038】
標識化合物は、ヒト血漿およびＤＴＰＡ溶液中で数時間安定である。例えば、68GaAAZTA－TATEは、ＤＴＰＡ溶液中、ｐＨ４および７．４で２時間安定であり（放射化学的純度（ＲＣＰ）９８％以上）、44ScAAZTA－TATEは両ｐＨで２４時間まで安定である（ＲＣＰ ９５％以上）。
【0039】
有利なことに、比較的少量のリガンドを使用することにより、式（Ｉ）の化合物で高い定量的放射化学的収率（ＲＣＹ）を達成することができる。完全な放射性キレーションのためのリガンドの量がより少ないければ、比放射能が高いトレーサーになる。これにより、腫瘍の取込みが増加し、優れたイメージング（腫瘍部位における受容体密度のより正確な定量化に加えて、非常に低い受容体密度を発現する腫瘍を特定することも可能）と治療がもたらされる。
【0040】
式（Ｉ）の化合物の錯体はさらに、in vitroの実施例に詳細に示されているように、DOTA-TATEとのそれぞれの錯体と比較して、顕著に増強された細胞内在化を示す。
【0041】
意外にも、実施例に詳細に示されているように、出願人は、AAZTA－TATEの金属錯体が、同じ金属とのDOTA-TATEの錯体と比較して、予想外に改善されたin vivo特性を示すことを見出した。例えば、AAZTA－TATEの金属錯体は、DOTA-TATEの金属錯体と比較して、より優れたin vivo蓄積とより優れたin vivoイメージングを示した。
【0042】
さらに、実施例に詳細に示されているように、出願人は、AAZTA－TATEの錯体が、親錯体よりも予想外に高い速度論的不活性を示すことを見出した。
【0043】
本明細書では、リガンドがバイオコンジュゲートAAZTA－TATEであり、金属イオンがＭである式（Ｉ）の化合物の金属錯体があるとすると、「親錯体」という表現は、リガンドが標的分子TATEとコンジュゲートしていないAAZTAであって金属イオンがＭである錯体である、対応する非標的化金属錯体を示す。
【0044】
解離半減期の値の比較（t1／2＝ｌｎ２／ｋｄ、ｋｄは錯体の解離を特徴付ける疑似一次速度定数）は、AAZTA－TATE錯体の速度論的不活性が対応する非標的AAZTA金属錯体よりも高いことを示す。
【0045】
したがって、本発明の実施形態は、AAZTAの対応する非標的金属錯体に対して少なくとも２倍高い速度論的不活性を特徴とする式（Ｉ）の化合物の金属錯体に関する。
【0046】
本発明の好ましい実施形態は、AAZTAの対応する非標的金属錯体に対して少なくとも４倍、好ましくは５倍以上高い速度論的不活性を特徴とする式（Ｉ）の化合物の金属錯体に関する。
【0047】
一般に、高い速度論的不活性は、in vivoでの解離速度が低いことを示し、フリーの金属イオンやフリーのリガンドなどの解離反応の生成物に関連するリスクが低くなる。
【0048】
いくつかの実施形態において、本発明のAAZTA－TATEの金属錯体は、驚くべきことに、AAZTAの対応する親錯体に対して、より高い条件付き安定度定数（conditional stability constant）（ｐＨ＝７．４、［Ｎａ＋］＝０．１５Ｍ、２５℃）を示し、一般に、AAZTAの対応する錯体よりも少なくとも２倍高い。
【0049】
たとえば、錯体Ga（AAZTA－TATE）およびＢｉ（AAZTA－TATE）は、AAZTAのそれぞれの親錯体と比較して、熱力学的特性の関連する増加を示す。
【0050】
AAZTA－TATEとの放射性医薬金属錯体は、リガンドを含むバイアルを含む放射性標識用キットを使用して調製できる（例えば、凍結乾燥形態で、場合により適切な添加剤または賦形剤と組み合わせて）。放射性核種は、放射性核種発生器（例えば、放射性核種およびそれぞれの親放射性金属核種が吸着されるクロマトグラフィーカラムの形態で）から、溶出溶媒を用いてリガンドを含むバイアルに直接溶出することができる。バイアルは、単回投与バイアルか、またはその内容物が異なる注射器に分割される複数回投与バイアルであってよい。
【0051】
さらなる実施形態において、本発明は、式Ｉのキレート化合物またはその薬学的に許容し得る塩を、薬学的に許容し得る添加剤と組み合わせて含有する医薬組成物に関する。
【0052】
別の態様では、本発明は、有効量の式（Ｉ）の化合物の金属錯体またはその薬学的に許容し得る塩を含み、場合により１つ以上の薬学的に許容し得る添加剤を含む放射性医薬組成物に関する。
【0053】
投薬量、剤形、投与様式、薬学的に許容される添加剤（例えば、担体、希釈剤、アジュバント）に関する詳細は、当技術分野で知られている（例えば、Monograph from World Health Organisation: Document QAS/08.262/FINAL, “RADIOPHARMACEUTICALS Final text for addition to The International Pharmacopoeia”, November 2008を参照）。
【0054】
好ましい態様では、式（Ｉ）の金属錯体の放射性医薬組成物は、静脈内投与などの従来の非経口モードによって投与することができる。例えば、本発明の医薬組成物は、非経口投与のための、場合により緩衝化された、等張滅菌水溶液中で適切に処方される。さらに、放射化学的安定剤として、アスコルビン酸、ゲンチシン酸、サリチル酸等の一重項酸素／ラジカルスカベンジャーなどを、最終製品の放射線分解を防ぐために使用することができる。
【0055】
この範囲において、そして別段の定めがない限り、「有効量」という用語は、意図された診断または治療目的を満たすのに十分な、本発明の式（Ｉ）の錯体またはその医薬組成物の任意の量を指す。キレート剤または錯体のモル量は、一般に、診断および／または治療用途ではナノモルのオーダーである（例えば、診断用としては１～５００ｎｍｏｌ、典型的には５～５０ｎｍｏｌ、ベータ治療用としては５０～２５０ｎｍｏｌ）。一般に、診断用途の場合、２～１０ｍＣｉ／患者（Ｃｉ＝キュリー＝３７ギガベクレル（ＧＢｑ））の放射線量で十分であり、アルファ治療の場合は０．２～１００ｍＣｉ／患者で十分であるが、ベータ治療の場合はより高い線量が必要である（例えば１００～３００ｍＣｉ／患者）。
【0056】
リガンド（すなわちAAZTA－TATE）とその金属錯体はいずれも塩の形態で存在し得、特にカルボン酸基とアミノ基（ｐＨに応じて）は、生理学的に適合性のある塩基または酸の好ましいカチオンまたはアニオンで塩にすることができる。
【0057】
したがって、本発明は、薬学的に許容される塩の形態の、式（Ｉ）のキレート化合物およびその金属錯体にも関する。
【0058】
本明細書で使用される「薬学的に許容される塩」という用語は、式Ｉの化合物のカルボキシル基またはアミノ基の少なくとも１つが、イオンの形態（すなわち、－ＣＯＯ-または－ＮＨ３
＋、＝ＮＨ２
＋、≡ＮＨ＋）で存在し、対応する対イオンと相互作用している、本発明の化合物を指す。
【0059】
好ましい薬学的に許容される塩は、金属イオンのキレーションに関与しないAAZTAリガンドのフリーのカルボン酸基が、対応するカチオンによって塩の形態にあるものである。前記フリーのカルボン酸基の実際の数は、例えば、錯体化した金属イオンの配位数および／または化合物を含む溶液のｐＨに依存し得る。
【0060】
あるいは、またはさらに、前記「薬学的に許容される塩」は、TATEのアミン基が対応するアニオンにより塩の形態にある、本発明の化合物の誘導体を含み得る。
【0061】
本発明の錯体またはリガンドの塩を調製するために使用することができる適切なカチオンは、無機および有機ベースのいずれかに由来する無機または有機カチオンであり得る。無機ベースのカチオンの例としては、例えば、アルカリまたはカリウム、ナトリウム、カルシウムまたはマグネシウムなどのアルカリ土類金属のイオンが挙げられる。有機ベースのカチオンの例としては、例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン、モルホリン、グルカミン、Ｎ－メチルグルカミン、Ｎ，Ｎ－ジメチルグルカミンなどの第一級、第二級および第三級アミンのカチオンが挙げられる。
【0062】
同様に、本発明の錯体またはリガンドの塩を調製するために使用することができる適切なアニオンは、無機酸および有機酸のいずれかに由来する無機または有機アニオンのいずれかであり得る。無機酸のアニオンの例としては、ハロ酸のイオン、例えば、塩化物、臭化物またはヨウ化物イオン、ならびに硫酸塩またはリン酸塩などの他の適切なイオンが挙げられる。有機酸のアニオンの例としては、例えば、酢酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩またはシュウ酸塩などの塩基性物質の塩を調製するための、製薬分野において常套的に用いられるものが挙げられる。
【0063】
アミノ酸のカチオンおよび／またはアニオンの例としては、例えば、グリシン、リジン、アルギニン、オルニチン、またはアスパラギン酸およびグルタミン酸のものが挙げられる。
【0064】
このように、それ自体としてまたは生理学的に許容される塩の形態として、そのキレート錯体を包含する式（Ｉ）の化合物の調製は、本発明のさらなる目的である。
【0065】
本発明の金属錯体は、特に神経内分泌腫瘍の同定または治療のために、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴイメージング法における画像診断薬として、または標的治療薬（アルファ／ベータ／オージェ）として有利に使用することができる。
【0066】
以下の実施例は、本発明をさらに説明するのに役立つであろう。
【実施例0067】
実施例１：AAZTA－TATEの合成
９－フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）アミノ酸およびＨ－Ｔｈｒ－（ｔＢｕ）－ＯＨがプリロードされたWangレジンは、IRIS Biotech（Marktredwiz、ドイツ）およびNovabiochem（ダルムシュタット、ドイツ）から購入した。Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、２，４，６－コリジンはSigma Aldrich（ダルムシュタット、ドイツ）から購入した。溶媒はすべてVWR International（Radnor、USA）から購入し、精製することなく使用した。６－［ビス［２－（１，１－ジメチルエトキシ）－２－オキソエチル］アミノ］－６－（５－カルボキシペンチル）テトラヒドロ－１Ｈ－１，４－ジアゼピン－１，４（５Ｈ）－二酢酸α、α’－ビス（１，１－ジメチルエチル）エステル（AAZTA－Ｃ４－ＣＯＯＨテトラtert－ブチルエステル）は、Manzoni et al., ChemMedChem, 7, 2012, 1084－1093（サポート情報）に記載されているように合成した。
９－フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）アミノ酸およびＨ－Ｔｈｒ－（ｔＢｕ）－ＯＨがプリロードされたWangレジンは、IRIS Biotech（Marktredwiz、ドイツ）およびNovabiochem（ダルムシュタット、ドイツ）から購入した。Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、２，４，６－コリジンはSigma Aldrich（ダルムシュタット、ドイツ）から購入した。溶媒はすべてVWR International（Radnor、USA）から購入し、精製することなく使用した。６－［ビス［２－（１，１－ジメチルエトキシ）－２－オキソエチル］アミノ］－６－（５－カルボキシペンチル）テトラヒドロ－１Ｈ－１，４－ジアゼピン－１，４（５Ｈ）－二酢酸α、α’－ビス（１，１－ジメチルエチル）エステル（AAZTA－Ｃ４－ＣＯＯＨテトラtert－ブチルエステル）は、Manzoni et al., ChemMedChem, 7, 2012, 1084－1093（サポート情報）に記載されているように合成した。
【0068】
固定化された線状オクタペプチドHD－Phe－Cys（Acm）－Tyr（tBu）－D－Trp（Boc）－Lys（Boc）－Thr（tBu）－Cys（Acm）－Thr（tBu）－Wangレジンは、標準のFmocプロトコルによって、H－Thr（tBu）－OH（115ｍｇ、0.87 mmol/g）がプリロードされたWangレジン上で自動的に合成した。Fmoc基の切断は、DMF中の２０％ピペリジンによって達成した。線状ペプチドを合成後、樹脂をSPPSマニュアルリアクターに移し、ＤＭＦ（２ｍＬ）中のTl（CF3COO）3（109mg、0.20mmol、2当量）を室温にて７５分間かけて添加することにより、樹脂上でのジスルフィド形成を行った。樹脂をＤＭＦで十分に洗浄し、Ｎ末端を６－［ビス［２－（１，１－ジメチルエトキシ）－２－オキソエチル］アミノ］－６－（５－カルボキシペンチル）テトラヒドロ－１Ｈ－１，４－ジアゼピン－１，４（５Ｈ）－二酢酸α、α’－ビス（１，１－ジメチルエチル）エステル（（tBu）4－AAZTA－C4－COOH）を３．１、２、および２当量（それぞれ、0.31、0.20および0.2mmol；211、134および134mg）で、HATU（０．３１、０．２および０．２ミリモル）および塩基としてのコリジン（６．８、４および４当量）の存在下でトリプルカップリング）でアシル化した。第１のカップリングは、３８ｒｐｍで室温にて一晩実施した。第２および第３のカップリングは、室温にて、３８ｒｐｍで３時間実施した。各カップリング後、樹脂をＤＭＦで十分洗浄した。ペプチドは、TFA/H2O/TIS（95：2.5：2.5）を室温で一晩添加することにより、固体支持体から切断した。最終の精製は、Atlantis prepD（登録商標）C18OBD ５μｍ（１９×１００ｍｍ）カラムを使用した分取ＨＰＬＣで行った。溶離液：（Ａ）Ｈ２Ｏ中の０．１％ＴＦＡ、（Ｂ）ＣＨ３ＣＮ中の０．１％ＴＦＡ。グラジェントプロファイル：２５％のＢで８．６５分間のアイソクラティック、２．８４分間でＢの２５％から４５％への直線グラジェント、１．０１分間で４５％から１００％への直線グラジェント。流速；２０ｍＬ／分。AAZTA－TATEは均質なピークとして分離した。溶媒を真空留去し、生成物を水から凍結乾燥して、白色の固体（２１ｍｇ、収率１４％）を得た。生成物の純度は、上記と同じグラジェントプロファイルと溶媒混合物を使用し、Atlantis DC18 ５μｍ（４．６×１５０ｍｍ）カラムを使用した分析ＨＰＬＣでモニターした。流速：１ｍＬ／分および２３０ｎｍでのＵＶ検出。純度９９％。ESI－MS（m/z）：計算値：C67H91N13O21S2（M＋2H)＋740.33実測値：740.39。
【0069】
実施例２：放射性標識実験
放射性標識実験の一般的条件
反応の放射化学的収率（ＲＣＹ）を決定するため、適切な放射性ＨＰＬＣ法を開発した。実験は、均一な加熱を容易にするために各キャビティに数滴の水を入れて、加熱ブロック（MyBlock、Sigma Aldrich）内の閉じた１．５ｍＬエッペンドルフチューブ内で９５℃（特定の放射性標識を低温で実行しない限り）で実行した。６８Ｇａは、ＩＴＧ 68Ge／68Gaジェネレーターから０．０５Ｍ塩酸で溶出される。溶出液は１ｍＬのフラクションに集める。最大活性を有する画分（それぞれ１００～１２０ＭＢｑ）を、さらに精製することなく標識に使用した。４４Ｓｃは、１２０～１７０ｍｇの天然カルシウム標的（Sigma Aldrich 441872、99.99％）に１６ＭｅＶ Ｇｅ ＰＥＴｔｒａｃｅ ８００サイクロトロンで３０μＡのビーム電流を３０～６０分間照射することによって得た。照射した標的物質を３Ｍの超純度の塩酸に溶解し、７０ｍｇのＤＧＡレジン（Triskem DN－B25－S）、次にDOWEX（Sigma－Aldrich）レジンで以下のプロトコルに従い精製した。樹脂を１ｍＬの使い捨てＳＰＥシリンジに充填し、２ｍＬの、３Ｍ ＨＣｌ、１Ｍ ＨＮＯ３、０．１Ｍ ＨＣｌおよび３Ｍ ＨＣｌで洗浄した。標的溶液をレジンに押し込み、続いて４ｍＬの３Ｍ ＨＣｌで押してカルシウムを除去した。微量の鉄とニッケルを除去するため、樹脂を３ｍＬの３Ｍ ＨＣｌと３ｍＬの１Ｍ ＨＮＯ３で洗浄し、３ｍＬの０．１Ｍ ＨＣｌで溶出した。１０～３０ｍｇのＤＯＷＥＸ樹脂を１ｍＬの３Ｍ ＨＣｌおよび５ｍＬのＨ２Ｏで洗浄した。ＤＧＡからの溶出液の最初の２５０～３００μＬを廃棄し、次の２．７ｍＬをＤＯＷＥＸレジンで濃縮し、１ｍＬのＨ２Ｏで洗浄し、８×３０μＬ １Ｍ ｐＨ＝４ＮＨ４ＯＡｃバッファーで溶出した。最大活性の画分を標識実験に使用する。活性濃度は１～３ＧＢｑ／ｍＬの範囲であった。得られた溶液の標識効率をAAZTA－TATEで試験した。
放射性標識実験の一般的条件
反応の放射化学的収率（ＲＣＹ）を決定するため、適切な放射性ＨＰＬＣ法を開発した。実験は、均一な加熱を容易にするために各キャビティに数滴の水を入れて、加熱ブロック（MyBlock、Sigma Aldrich）内の閉じた１．５ｍＬエッペンドルフチューブ内で９５℃（特定の放射性標識を低温で実行しない限り）で実行した。６８Ｇａは、ＩＴＧ 68Ge／68Gaジェネレーターから０．０５Ｍ塩酸で溶出される。溶出液は１ｍＬのフラクションに集める。最大活性を有する画分（それぞれ１００～１２０ＭＢｑ）を、さらに精製することなく標識に使用した。４４Ｓｃは、１２０～１７０ｍｇの天然カルシウム標的（Sigma Aldrich 441872、99.99％）に１６ＭｅＶ Ｇｅ ＰＥＴｔｒａｃｅ ８００サイクロトロンで３０μＡのビーム電流を３０～６０分間照射することによって得た。照射した標的物質を３Ｍの超純度の塩酸に溶解し、７０ｍｇのＤＧＡレジン（Triskem DN－B25－S）、次にDOWEX（Sigma－Aldrich）レジンで以下のプロトコルに従い精製した。樹脂を１ｍＬの使い捨てＳＰＥシリンジに充填し、２ｍＬの、３Ｍ ＨＣｌ、１Ｍ ＨＮＯ３、０．１Ｍ ＨＣｌおよび３Ｍ ＨＣｌで洗浄した。標的溶液をレジンに押し込み、続いて４ｍＬの３Ｍ ＨＣｌで押してカルシウムを除去した。微量の鉄とニッケルを除去するため、樹脂を３ｍＬの３Ｍ ＨＣｌと３ｍＬの１Ｍ ＨＮＯ３で洗浄し、３ｍＬの０．１Ｍ ＨＣｌで溶出した。１０～３０ｍｇのＤＯＷＥＸ樹脂を１ｍＬの３Ｍ ＨＣｌおよび５ｍＬのＨ２Ｏで洗浄した。ＤＧＡからの溶出液の最初の２５０～３００μＬを廃棄し、次の２．７ｍＬをＤＯＷＥＸレジンで濃縮し、１ｍＬのＨ２Ｏで洗浄し、８×３０μＬ １Ｍ ｐＨ＝４ＮＨ４ＯＡｃバッファーで溶出した。最大活性の画分を標識実験に使用する。活性濃度は１～３ＧＢｑ／ｍＬの範囲であった。得られた溶液の標識効率をAAZTA－TATEで試験した。
【0070】
Ｒａｄｉｏ ＨＰＬＣ条件
使用機器：Waters Acquity IクラスUPLC液体クロマトグラフィー（BSM、FTN、CM、PDAモジュール、20μL MXフローセルを備えたBerthold LB513放射能検出器）。ピーク面積は、各測定シリーズの最初の注入時間を使用して減衰補正（decay correct）される。RCP％値は、補正した面積値から計算される。
ＨＰＬＣ条件：
カラム：Kinetex XBC18 ３．６μｍ、４．６×５０ｍｍ
ＵＶ波長：２１０；２５４ｎｍ
カラム温度：３０℃
68Gaラベリング用の溶離液：
Ａ：０．１％ギ酸
Ｂ：ＡＣＮ：Ｈ２Ｏ（９：１）
44Scラベリング用の溶離液：
Ａ：０．０１Ｍシュウ酸、ｐＨ３
Ｂ：ＡＣＮ：Ｈ２Ｏ（９：１）
使用機器：Waters Acquity IクラスUPLC液体クロマトグラフィー（BSM、FTN、CM、PDAモジュール、20μL MXフローセルを備えたBerthold LB513放射能検出器）。ピーク面積は、各測定シリーズの最初の注入時間を使用して減衰補正（decay correct）される。RCP％値は、補正した面積値から計算される。
ＨＰＬＣ条件：
カラム：Kinetex XBC18 ３．６μｍ、４．６×５０ｍｍ
ＵＶ波長：２１０；２５４ｎｍ
カラム温度：３０℃
68Gaラベリング用の溶離液：
Ａ：０．１％ギ酸
Ｂ：ＡＣＮ：Ｈ２Ｏ（９：１）
44Scラベリング用の溶離液：
Ａ：０．０１Ｍシュウ酸、ｐＨ３
Ｂ：ＡＣＮ：Ｈ２Ｏ（９：１）
【表1】
【0071】
68Gaおよび44Scを使用したAAZTA－TATEの最適な標識条件を決定するために、標識実験を実施した。カラムの活性損失をチェックするために、すべてのサンプルをカラムありとカラムなしで測定した。ギ酸を溶離液として使用した場合、注入された活性を回収し、ガンマカウンターで測定して回収率を決定した。ピーク面積の値は、最初の注入の時間に合わせて減衰補正する。放射化学的純度の値は、補正された値から計算する。
【0072】
標識
予備実験において、AAZTA－TATEは、酢酸アンモニウムおよびHEPESバッファー中、ｐＨ＝４およびｐＨ７、９５℃にて、44Scで５分間標識した。ｐＨ＝４のＨＥＰＥＳバッファーは、０．３μＭペプチドでの定量的標識で最良の結果をもたらした。室温では、AAZTA－TATEを５分で９０％を超える収率で標識することができた。68Ga標識の場合、室温では、より高いペプチド濃度（１μＭ）とより長い反応時間（１５～３０分）を必要としたが；同濃度の前駆体を使用した場合、９５℃で５分後には定量的収率に達することができる。これらの結果に基づいて、９５℃でｐＨ＝４のＨＥＰＥＳバッファーを、in vitroおよびin vivo実験での調製目的で選択した。
予備実験において、AAZTA－TATEは、酢酸アンモニウムおよびHEPESバッファー中、ｐＨ＝４およびｐＨ７、９５℃にて、44Scで５分間標識した。ｐＨ＝４のＨＥＰＥＳバッファーは、０．３μＭペプチドでの定量的標識で最良の結果をもたらした。室温では、AAZTA－TATEを５分で９０％を超える収率で標識することができた。68Ga標識の場合、室温では、より高いペプチド濃度（１μＭ）とより長い反応時間（１５～３０分）を必要としたが；同濃度の前駆体を使用した場合、９５℃で５分後には定量的収率に達することができる。これらの結果に基づいて、９５℃でｐＨ＝４のＨＥＰＥＳバッファーを、in vitroおよびin vivo実験での調製目的で選択した。
【0073】
AAZTA－TATEとDOTA-TATEの両方で最も高い比放射能と定量的ＲＣＰ％を得ることを目的として、in vivo実験用の44Scによる標識を実施した。したがって、44Sc－AAZTA－TATE標識の場合で得られた比放射能は、通常８５～１１０ＧＢｑ／μｍｏｌの範囲で変化したが、DOTA-TATEの場合、比放射能は８～２０ＧＢｑ／μｍｏｌの範囲で変化した。結果は、DOTA-TATEの代わりにAAZTA－TATEを使用することで達成できるラベリング性能の優位性を示している。
【0074】
品質管理
スカンジウム標識は、シュウ酸塩－アセトニトリルグラジェントを使用したKinetexカラムのＨＰＬＣで、活性低下の兆候なくモニターされた。予備実験では、保持力の低い幅広いピークとして溶出されるガリウムとAAZTAのシュウ酸塩との混合錯体の形成が観察された。Ｇａ３＋は固体表面に吸着されるため、生成物溶液または反応混合物サンプルのフリーの68Ga３＋含有量は、キレート剤の存在なしでは定量できない。DTPA溶液（０．０１Ｍ）を添加すると、活性損失が減少することが分かった。ＨＰＬＣ溶出物を回収し、ガンマカウンターで測定することにより、本方法をチェックした。
スカンジウム標識は、シュウ酸塩－アセトニトリルグラジェントを使用したKinetexカラムのＨＰＬＣで、活性低下の兆候なくモニターされた。予備実験では、保持力の低い幅広いピークとして溶出されるガリウムとAAZTAのシュウ酸塩との混合錯体の形成が観察された。Ｇａ３＋は固体表面に吸着されるため、生成物溶液または反応混合物サンプルのフリーの68Ga３＋含有量は、キレート剤の存在なしでは定量できない。DTPA溶液（０．０１Ｍ）を添加すると、活性損失が減少することが分かった。ＨＰＬＣ溶出物を回収し、ガンマカウンターで測定することにより、本方法をチェックした。
【0075】
標識化合物の安定性
標識化合物の安定性をヒト血漿およびDTPA溶液中で測定した。68GaAAZTA－TATEは、DTPA溶液中、ｐＨ４および７．４で２時間安定であった（ＲＣＰ９８％）。44ScAAZTA－TATEは、両方のｐＨで２４時間で約９５％の放射化学的純度に達した。
標識化合物の安定性をヒト血漿およびDTPA溶液中で測定した。68GaAAZTA－TATEは、DTPA溶液中、ｐＨ４および７．４で２時間安定であった（ＲＣＰ９８％）。44ScAAZTA－TATEは、両方のｐＨで２４時間で約９５％の放射化学的純度に達した。
【0076】
各時点でキレート剤から放出される放射性金属の量を決定するために、さらに血漿安定性実験を実施した。標識化合物は、68Gaの場合は２時間、44Scの場合は２４時間、ヒト血漿を含む密閉シリンジ内で３７℃にてインキュベートした。フリーのＧａ３＋は血漿タンパク質に吸着され、ＨＰＬＣ分析の前にサンプルから除去する必要があり、68Ga３＋の損失を引き起こす。血漿沈殿物の洗浄は効果的ではなかったため、溶液中のＧａ３＋を安定化するために、タンパク質沈殿の前に血漿サンプルにＤＴＰＡを添加した。各時点で、５０μＬのサンプルを採取し、５０μＬの１０ｍＭ ｐＨ＝４ ＤＴＰＡ溶液と混合し、３７℃で１０分間静置した。サンプルを２５μＬの冷５０％エタノールと混合した。７５μＬの冷アセトニトリルを加え、サンプルを９０００ＲＰＭで１０分間遠心分離した。上清から５０μＬのサンプルを採取し、ＨＰＬＣに注入した。
【0077】
両方の放射性標識化合物の血漿安定性をTable 2に示す。
結果は、68GaAAZTA－TATEが高いＲＣＰ％（２時間の血漿インキュベーション後で約９５％）を示したことを示している。一方、44ScAAZTA－TATEの場合、結果は、２４時間のインキュベーション後のＲＣＰ％が約９６％であることを示している。
結論として、結果は、本発明の化合物が、放射性標識後の高い定量的ＲＣＰを特徴とし、血漿中で長時間安定であることを示している。
【表2】
結果は、68GaAAZTA－TATEが高いＲＣＰ％（２時間の血漿インキュベーション後で約９５％）を示したことを示している。一方、44ScAAZTA－TATEの場合、結果は、２４時間のインキュベーション後のＲＣＰ％が約９６％であることを示している。
結論として、結果は、本発明の化合物が、放射性標識後の高い定量的ＲＣＰを特徴とし、血漿中で長時間安定であることを示している。
【0078】
実施例３：in vitro細胞実験
セルカルチャー
AR42J（（ATCC（登録商標）CRL－1492TM）ソマトスタチン受容体ポジティブラット膵外分泌腫瘍）およびヒトA2780（受容体ネガティブヒト卵巣癌）細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）から購入した。LNCaP細胞は、１０％ウシ胎児血清（FBS、GIBCO Life Technologies）および１％抗生物質および抗真菌物質溶液（Sigma－Aldrich）を添加したRPMI－1640培地（GIBCO Life Technologies）で培養した。A2780細胞は、１０％ＦＢＳおよび１％抗生物質および抗真菌物質溶液を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、GIBCO Life Technologies）で培養した。すべての細胞株は５％ＣＯ２、３７℃で培養した。in vitro実験では、細胞を８５％コンフルエンスで使用し、細胞の生存率は、トリパンブルー排除試験での評価では常に９５％より高かった。
セルカルチャー
AR42J（（ATCC（登録商標）CRL－1492TM）ソマトスタチン受容体ポジティブラット膵外分泌腫瘍）およびヒトA2780（受容体ネガティブヒト卵巣癌）細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）から購入した。LNCaP細胞は、１０％ウシ胎児血清（FBS、GIBCO Life Technologies）および１％抗生物質および抗真菌物質溶液（Sigma－Aldrich）を添加したRPMI－1640培地（GIBCO Life Technologies）で培養した。A2780細胞は、１０％ＦＢＳおよび１％抗生物質および抗真菌物質溶液を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、GIBCO Life Technologies）で培養した。すべての細胞株は５％ＣＯ２、３７℃で培養した。in vitro実験では、細胞を８５％コンフルエンスで使用し、細胞の生存率は、トリパンブルー排除試験での評価では常に９５％より高かった。
【0079】
細胞取込み実験
AR42JおよびA2780細胞をトリプシン処理して遠心分離し、ＤＭＥＭに再懸濁し、１×１０６ｍＬ-1の細胞濃度で試験管に分注した。試験管を０．３７ＭＢｑの６８Ｇａまたは４４Ｓｃ標識DOTAまたはAAZTA－TATEの存在下で３７℃にて１５、３０、６０および９０分間インキュベートした。インキュベーション後、時間サンプルを氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、６８Ｇａ感受性エネルギーウィンドウ内で１分間、校正済みガンマカウンター（Perkin Elmer Wizardガンマカウンター）を使用して放射能を測定した。崩壊補正された放射性トレーサーの取込みは、カウント／（分★（１０６細胞））（ｃｐｍ）として表した。取込みは、細胞に添加された放射性トレーサーの総放射能のパーセンテージとして表した（％ＩＤ／１０６細胞）。各実験を３回行ない、表示されたデータは少なくとも３回の独立した実験の平均（±ＳＤ）を表している。
AR42JおよびA2780細胞をトリプシン処理して遠心分離し、ＤＭＥＭに再懸濁し、１×１０６ｍＬ-1の細胞濃度で試験管に分注した。試験管を０．３７ＭＢｑの６８Ｇａまたは４４Ｓｃ標識DOTAまたはAAZTA－TATEの存在下で３７℃にて１５、３０、６０および９０分間インキュベートした。インキュベーション後、時間サンプルを氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、６８Ｇａ感受性エネルギーウィンドウ内で１分間、校正済みガンマカウンター（Perkin Elmer Wizardガンマカウンター）を使用して放射能を測定した。崩壊補正された放射性トレーサーの取込みは、カウント／（分★（１０６細胞））（ｃｐｍ）として表した。取込みは、細胞に添加された放射性トレーサーの総放射能のパーセンテージとして表した（％ＩＤ／１０６細胞）。各実験を３回行ない、表示されたデータは少なくとも３回の独立した実験の平均（±ＳＤ）を表している。
【0080】
in vitro飽和結合実験
in vitro飽和結合実験のために、メラニン性ＡＲ４２Ｊ細胞を使用した。細胞を２４ウェルプレート（ウェルあたり５×１０４）で２４時間培養した。細胞培養培地（ＤＭＥＭ）中異なる濃度の44Sc－または68Ga－AAZTA－TATEを各ウェルに２００μＬの容量で添加した。３０、９０分のインキュベーション時間（３７℃のＣＯ２インキュベーター内）後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、グリシン（０．２Ｍ）で２回洗浄し、ＮａＯＨ（１Ｍ）で３７℃にて１０分間溶解した。
in vitro飽和結合実験のために、メラニン性ＡＲ４２Ｊ細胞を使用した。細胞を２４ウェルプレート（ウェルあたり５×１０４）で２４時間培養した。細胞培養培地（ＤＭＥＭ）中異なる濃度の44Sc－または68Ga－AAZTA－TATEを各ウェルに２００μＬの容量で添加した。３０、９０分のインキュベーション時間（３７℃のＣＯ２インキュベーター内）後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、グリシン（０．２Ｍ）で２回洗浄し、ＮａＯＨ（１Ｍ）で３７℃にて１０分間溶解した。
【0081】
リガンド－受容体相互作用を測定するために、２つの異なるin vitro細胞実験（内在化と飽和結合）を実施した。
【0082】
３ａ．
44
Sc－AAZTA－TATEと
44
Sc－DOTA-TATEの細胞取込み実験
内在化実験は、受容体を介した放射性リガンドの細胞への取込みを測定する。この目的のために、ＡＲ４２ＪおよびＡ２７８０細胞をトリプシン処理して遠心分離し、ＤＭＥＭに再懸濁し、１×１０６ｍＬ-1の細胞濃度で試験管に分注した。チューブを０．３７ＭＢｑの44Sc標識DOTA-またはAAZTA－TATEの存在下で３７℃にて１５、３０、６０および９０分間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、放射能を、較正されたガンマカウンター（Perkin Elmer Wizardガンマカウンター）で測定した。崩壊補正された放射性トレーサーの取込みは、カウント／（分★（１０６細胞））（ｃｐｍ）として表した。取込みは、細胞に添加された放射性トレーサーの総放射能のパーセンテージとして表した（％ＩＤ／１０６細胞）。各実験を３回行ない、表示されたデータは少なくとも３回の独立した実験の平均（±ＳＤ）を表している。結果は、ＡＲ４２Ｊとコントロール細胞株Ａ２７８０での分析されたトレーサー（細胞に添加された放射性トレーサーの総放射能のパーセンテージとして表される、44Sc－AAZTA－TATEまたは44Sc－DOTA-TATE、％ID／106細胞）の取込みの比率として報告される。
内在化実験は、受容体を介した放射性リガンドの細胞への取込みを測定する。この目的のために、ＡＲ４２ＪおよびＡ２７８０細胞をトリプシン処理して遠心分離し、ＤＭＥＭに再懸濁し、１×１０６ｍＬ-1の細胞濃度で試験管に分注した。チューブを０．３７ＭＢｑの44Sc標識DOTA-またはAAZTA－TATEの存在下で３７℃にて１５、３０、６０および９０分間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、放射能を、較正されたガンマカウンター（Perkin Elmer Wizardガンマカウンター）で測定した。崩壊補正された放射性トレーサーの取込みは、カウント／（分★（１０６細胞））（ｃｐｍ）として表した。取込みは、細胞に添加された放射性トレーサーの総放射能のパーセンテージとして表した（％ＩＤ／１０６細胞）。各実験を３回行ない、表示されたデータは少なくとも３回の独立した実験の平均（±ＳＤ）を表している。結果は、ＡＲ４２Ｊとコントロール細胞株Ａ２７８０での分析されたトレーサー（細胞に添加された放射性トレーサーの総放射能のパーセンテージとして表される、44Sc－AAZTA－TATEまたは44Sc－DOTA-TATE、％ID／106細胞）の取込みの比率として報告される。
【0083】
Table 3に示された結果は、44Sc－DOTA-TATEと比較して、錯体44Sc－AAZTA－TATEの顕著に増強された内在化を示した。
【表3】
【0084】
３ｂ．in vitro飽和結合実験
in vitro飽和結合実験は、放射性リガンド濃度の増大により平衡状態での放射性標識リガンドの特異的な受容体媒介取込みを測定する。
in vitro飽和結合実験ではメラニン性ＡＲ４２Ｊ細胞を使用した。細胞を２４ウェルプレート（ウェルあたり５×１０４）で２４時間培養した。セルカルチャー培地（ＤＭＥＭ）中異なる濃度の44Sc－AAZTA－TATEおよび44Sc－DOTA-TATEを各ウェルに200μLの容量で添加した。３０、９０分のインキュベーション時間（３７℃のＣＯ２インキュベーター内）後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、グリシン（０．２Ｍ）で２回洗浄し、ＮａＯＨ（１Ｍ）で３７℃にて１０分間溶解した。
放射性リガンドの濃度に対して特異的結合をプロットする飽和曲線を作成した。両リガンドは良好な内在化を示し、特に錯体44Sc－AAZTA－TATEの飽和曲線では、結合種がより高い量でプラトーに達する（Table 4aおよびTable 4b）。
in vitro飽和結合実験は、放射性リガンド濃度の増大により平衡状態での放射性標識リガンドの特異的な受容体媒介取込みを測定する。
in vitro飽和結合実験ではメラニン性ＡＲ４２Ｊ細胞を使用した。細胞を２４ウェルプレート（ウェルあたり５×１０４）で２４時間培養した。セルカルチャー培地（ＤＭＥＭ）中異なる濃度の44Sc－AAZTA－TATEおよび44Sc－DOTA-TATEを各ウェルに200μLの容量で添加した。３０、９０分のインキュベーション時間（３７℃のＣＯ２インキュベーター内）後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、グリシン（０．２Ｍ）で２回洗浄し、ＮａＯＨ（１Ｍ）で３７℃にて１０分間溶解した。
放射性リガンドの濃度に対して特異的結合をプロットする飽和曲線を作成した。両リガンドは良好な内在化を示し、特に錯体44Sc－AAZTA－TATEの飽和曲線では、結合種がより高い量でプラトーに達する（Table 4aおよびTable 4b）。
【表4】
【0085】
実施例４：in vivoイメージングの結果
ＡＲ４２Ｊでのin vivo取込み（ＰＥＴ／ＭＲＩイメージング）
in vivo実験は、腫瘍細胞（腫瘍体積125±10mm3）を皮下注射した１２±１日後に実施した。in vivoイメージング実験は、ＡＲ４２Ｊ膵臓腫瘍を有する雄のCB17 SCIDマウス（n＝5）に44Sc－または68Ga－AAZTA－TATE（注射した放射能の範囲：１４～２２ＭＢｑ）または44Sc－DOTA-TATE（注射した放射能の範囲：１７～２２ＭＢｑ）を外側尾静脈から静脈内注射した。44Sc－AAZTA－TATEを注入する前に、過剰量のAAZTA－TATEを注入してブロッキング実験を行った（ｎ＝３）。in vivo速度論的スキャン（０～９０分）、次いで２．５時間目に２０分間の静的スキャンを実行した。イメージング実験中、専用の小動物麻酔装置を使用して、マウスを３～１．５％のイソフルラン（Forane）で麻酔した。臓器および組織の解剖学的局在を決定するために、前臨床nanoScanPET／MRIシステム（Mediso Ltd.、ハンガリー）を使用して、全身のＴ１強調ＭＲＩスキャンを実行した（3D GRE EXT multi－FOV；TR/TE 15/2 ms；フェーズ：100；FOV 55 mm；NEX：2）。ＰＥＴボリュームは、three-dimensional Ordered Subsets Expectation Maximization（3DOSEM）アルゴリズム（Tera－Tomo、Mediso Ltd.、ハンガリー）を使用して再構築した。ＰＥＴおよびＭＲＩ画像は、nanoScan PET／MRI装置の取得ソフトウェア（Nucline）によって自動的に同時記録した。再構成された画像は、InterViewTM FUSION（Mediso Ltd.、ハンガリー）画像分析ソフトウェアを使用して分析した。楕円体の３次元関心領域（VOI）は、目視検査によって組織または臓器の放射能のエッジの周りを手動で描画した。放射性トレーサーの取込みは、標準化された取込値（ＳＵＶ）で表した。ＳＵＶは次のように計算した：ＳＵＶ＝［ＶＯＩ放射能（Ｂｑ／ｍｌ）］／［注入した放射能（Ｂｑ）／動物の体重（ｇ）］（密度を１ｇ／ｍＬと仮定）。
ＡＲ４２Ｊでのin vivo取込み（ＰＥＴ／ＭＲＩイメージング）
in vivo実験は、腫瘍細胞（腫瘍体積125±10mm3）を皮下注射した１２±１日後に実施した。in vivoイメージング実験は、ＡＲ４２Ｊ膵臓腫瘍を有する雄のCB17 SCIDマウス（n＝5）に44Sc－または68Ga－AAZTA－TATE（注射した放射能の範囲：１４～２２ＭＢｑ）または44Sc－DOTA-TATE（注射した放射能の範囲：１７～２２ＭＢｑ）を外側尾静脈から静脈内注射した。44Sc－AAZTA－TATEを注入する前に、過剰量のAAZTA－TATEを注入してブロッキング実験を行った（ｎ＝３）。in vivo速度論的スキャン（０～９０分）、次いで２．５時間目に２０分間の静的スキャンを実行した。イメージング実験中、専用の小動物麻酔装置を使用して、マウスを３～１．５％のイソフルラン（Forane）で麻酔した。臓器および組織の解剖学的局在を決定するために、前臨床nanoScanPET／MRIシステム（Mediso Ltd.、ハンガリー）を使用して、全身のＴ１強調ＭＲＩスキャンを実行した（3D GRE EXT multi－FOV；TR/TE 15/2 ms；フェーズ：100；FOV 55 mm；NEX：2）。ＰＥＴボリュームは、three-dimensional Ordered Subsets Expectation Maximization（3DOSEM）アルゴリズム（Tera－Tomo、Mediso Ltd.、ハンガリー）を使用して再構築した。ＰＥＴおよびＭＲＩ画像は、nanoScan PET／MRI装置の取得ソフトウェア（Nucline）によって自動的に同時記録した。再構成された画像は、InterViewTM FUSION（Mediso Ltd.、ハンガリー）画像分析ソフトウェアを使用して分析した。楕円体の３次元関心領域（VOI）は、目視検査によって組織または臓器の放射能のエッジの周りを手動で描画した。放射性トレーサーの取込みは、標準化された取込値（ＳＵＶ）で表した。ＳＵＶは次のように計算した：ＳＵＶ＝［ＶＯＩ放射能（Ｂｑ／ｍｌ）］／［注入した放射能（Ｂｑ）／動物の体重（ｇ）］（密度を１ｇ／ｍＬと仮定）。
【0086】
注射後２．５時間での癌を有する動物（ｎ＝５／群、ｎ＝３／ブロッキング実験）を使用したin vivo ＰＥＴ－ＭＲＩ取込み実験のＳＵＶ平均値をTable 5に示す。
44ScAAZTA－TATEのin vivoの結果は、腫瘍組織に対する本化合物の高い取込みを示している。実際に、ＳＵＶの平均値（2.74±0.95）は、44ScDOTA-TATEの平均値（1.01±0.47）と比較して顕著に高い。さらに、AAZTA－TATEのブロッキング実験は、腫瘍取込みおよびｓｓｔ受容体発現腫瘍における44Sc AAZTA－TATEの蓄積が、非常に特異的であることを示した。
結論として、結果は、本発明の化合物が、対応するDOTAの化合物よりも、腫瘍組織でのより高い取込みによって特徴付けられることを示した。また、ブロッキング実験では、本発明の化合物の腫瘍取込みが非常に特異的であることが確認された。
【表5】
44ScAAZTA－TATEのin vivoの結果は、腫瘍組織に対する本化合物の高い取込みを示している。実際に、ＳＵＶの平均値（2.74±0.95）は、44ScDOTA-TATEの平均値（1.01±0.47）と比較して顕著に高い。さらに、AAZTA－TATEのブロッキング実験は、腫瘍取込みおよびｓｓｔ受容体発現腫瘍における44Sc AAZTA－TATEの蓄積が、非常に特異的であることを示した。
結論として、結果は、本発明の化合物が、対応するDOTAの化合物よりも、腫瘍組織でのより高い取込みによって特徴付けられることを示した。また、ブロッキング実験では、本発明の化合物の腫瘍取込みが非常に特異的であることが確認された。
【0087】
実施例５：化合物Ga－AAZTA－TATEの安定性および速度論的不活性の評価
５ａ．Ga－AAZTA－TATE錯体の平衡実験
Ga－AAZTA－TATE錯体の熱力学的特性を、条件付き安定度定数（ｌｏｇＫｃｏｎｄ＝ｌｏｇＫｔｈｅｒｍ／（１＋αＨ）、ここで、αＨ＝Ｋ１ Ｈ［Ｈ＋］＋Ｋ１ ＨＫ２ Ｈ［Ｈ＋］２＋．．．＋Ｋ１ ＨＫ２ Ｈ．．．Ｋｎ Ｈ［Ｈ＋］ｎおよびＫ１ Ｈ、Ｋ２ Ｈ、．．．Ｋｎ Ｈは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液中のｐＨ＝７．０でのフリーのリガンドのプロトン化定数である）によって特徴付けた。Ga（AAZTA）錯体の平衡特性に基づいて、Ga（AAZTA）OH種は生理学的条件で優勢である（式（１）、Baranyai, Eur. J. Inorg. Chem., 2013, 147－162）。Ga（AAZTA）OH種の条件付き安定度定数は、（ｌｏｇＫｃｏｎｄ＝ｌｏｇＫｔｈｅｒｍ／（［ＯＨ-］（１＋αＨ））で示される。類似性に従い、Ga（AAZTA－TATE）OH錯体も生理学的条件で優勢であると推測できる。
（式中、L＝AAZTA、AAZTA－TATE）
Ga（AAZTA－TATE）OH錯体の条件付き安定度定数は、Chang, J. Chinese. Chem. Soc. 1999, 46, 519－528に記載されているように、０．１５ＭのＮａＣｌ溶液中ｐＨ＝７．０および２５℃で、Ｇａ３＋に対するAAZTA－TATEとAAZTAの競合反応を調べるキャピラリーゾーン電気泳動（Hewlett－Packard HP3Dキャピラリー電気泳動システム）によって決定した。これらの実験では、Ga3+とAAZTA－TATEの濃度を２５．０μＭとし、AAZTAの濃度を２５．０～１５０．０μＭの間で変えた（６×１ｍＬサンプル）。濃ＮａＯＨまたはＨＣｌを段階的に加えることにより、ｐＨを７．０に調整した。平衡に達するために、サンプルを５０℃で３日間、次に２５℃で２週間保持した（平衡に達するのに必要な時間はキャピラリー電気泳動で決定した）。Ga（AAZTA－TATE）OH錯体の量は減少し、フリーの[AAZTA－TATE]は、Ga3+－イオンに対するAAZTA－TATEとAAZTAの競合反応に従って、[HxAAZTA]の増加とともに増加する（式（２））。
（式中、ｘ＝１および２）。AAZTAの総濃度（[AAZTA]tot＝[HxAAZTA]＋[Ga（AAZTA）OH]）を考慮して、キャピラリーゾーン電気泳動実験のデータからKGaTATE値を０．４９（６）と計算した。[Ga（AAZTA）OH]の安定度定数（logKthermGa（AAZTA）OH＝１６．５７、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２５℃、Baranyai, Eur. J. Inorg. Chem., 2013, 147－162）を考慮することにより、AAZTAリガンドのプロトン化定数（logＫ１
Ｈ＝9.98、logＫ２
Ｈ＝6.52、logK3
H＝3.76、logK４
H＝２．２１、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２５℃、Baranyai, Eur. J. Inorg. Chem., 2013, 147－162）、Ga（AAZTA）OHの条件付き安定度定数は、０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液中、ｐＨ＝７．０および２５℃でlogKcond
Ga（AAZTA）OH＝20.1であることがわかった。KGaTATE平衡定数（KGaTATE＝0.49）とGa（AAZTA）OHの条件付き安定度定数（logKcond
Ga（AAZTA）OH＝20.1）を考慮することにより、Ga（AAZTA－TATE）OH錯体の条件付き安定度定数（logKcond
Ga（AAZTA－TATE）OH＝logKcond
Ga（AAZTA）OH－logKGaTATE）は、logKcond
Ga（AAZTA－TATE）OH＝20.5であることが分かった。これらのエビデンスに基づくと、Ga（AAZTA－TATE）OH錯体の条件付き安定度定数は、Ga（AAZTA）OH錯体の条件付き安定度定数よりも約0.4logK単位高くなっている。
５ａ．Ga－AAZTA－TATE錯体の平衡実験
Ga－AAZTA－TATE錯体の熱力学的特性を、条件付き安定度定数（ｌｏｇＫｃｏｎｄ＝ｌｏｇＫｔｈｅｒｍ／（１＋αＨ）、ここで、αＨ＝Ｋ１ Ｈ［Ｈ＋］＋Ｋ１ ＨＫ２ Ｈ［Ｈ＋］２＋．．．＋Ｋ１ ＨＫ２ Ｈ．．．Ｋｎ Ｈ［Ｈ＋］ｎおよびＫ１ Ｈ、Ｋ２ Ｈ、．．．Ｋｎ Ｈは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液中のｐＨ＝７．０でのフリーのリガンドのプロトン化定数である）によって特徴付けた。Ga（AAZTA）錯体の平衡特性に基づいて、Ga（AAZTA）OH種は生理学的条件で優勢である（式（１）、Baranyai, Eur. J. Inorg. Chem., 2013, 147－162）。Ga（AAZTA）OH種の条件付き安定度定数は、（ｌｏｇＫｃｏｎｄ＝ｌｏｇＫｔｈｅｒｍ／（［ＯＨ-］（１＋αＨ））で示される。類似性に従い、Ga（AAZTA－TATE）OH錯体も生理学的条件で優勢であると推測できる。
【数1】
Ga（AAZTA－TATE）OH錯体の条件付き安定度定数は、Chang, J. Chinese. Chem. Soc. 1999, 46, 519－528に記載されているように、０．１５ＭのＮａＣｌ溶液中ｐＨ＝７．０および２５℃で、Ｇａ３＋に対するAAZTA－TATEとAAZTAの競合反応を調べるキャピラリーゾーン電気泳動（Hewlett－Packard HP3Dキャピラリー電気泳動システム）によって決定した。これらの実験では、Ga3+とAAZTA－TATEの濃度を２５．０μＭとし、AAZTAの濃度を２５．０～１５０．０μＭの間で変えた（６×１ｍＬサンプル）。濃ＮａＯＨまたはＨＣｌを段階的に加えることにより、ｐＨを７．０に調整した。平衡に達するために、サンプルを５０℃で３日間、次に２５℃で２週間保持した（平衡に達するのに必要な時間はキャピラリー電気泳動で決定した）。Ga（AAZTA－TATE）OH錯体の量は減少し、フリーの[AAZTA－TATE]は、Ga3+－イオンに対するAAZTA－TATEとAAZTAの競合反応に従って、[HxAAZTA]の増加とともに増加する（式（２））。
【数2】
【0088】
５ｂ．Ga（AAZTA－TATE）OH錯体とヒト血清トランスフェリンとのトランスキレーション反応の速度論的実験
Ga（AAZTA－TATE）OHとヒト血清アポトランスフェリン（sTf、Sigma）のリガンド交換反応は、２４６ｎｍおよびｐＨ＝７．４にて、１．０ｃｍセルを用いるAgilent 8453 UV－Vis分光光度計を使用し、Baranyai, Eur. J. Inorg. Chem., 2013, 147－162に開示されている疑似一次速度論的条件（[Ga（AAZTA－TATE）OH]＝50μM、[Trf]＝8および16μM）を保証するため、Ga（AAZTA－TATE）OH過剰の存在下でのGa－トランスフェリン錯体の形成により、分光光度法（式（３））により実験した。ヒト血清トランスフェリン溶液の濃度は、モル吸光係数ε280＝91200cm-1M-1（Takahashi, J. Biochem. 1989, 106, 858－863）を使用して280nmでの吸光度から決定した。温度は２５℃に維持し、サンプルのイオン強度と炭酸水素塩濃度（NaClの場合は0.15M、NaHCO￥3の場合0.025M）を一定に保った。
[Ga（AAZTA－TATE）OH]＝50μMおよび[sTf]＝8および16μMで得られたGa（AAZTA－TATE）OHとsTf間のトランスキレーション反応の速度は、それぞれ7.86×10-11および8.17×10-11mol／dm-3s-1である。。これらの速度論的データは、[sTf]がGa（AAZTA－TATE）OHの解離速度に実質的に影響を及ぼさないことを明確に示している。反応速度（d[Ga（sTf）]／dt＝kd[Ga（AAZTA－TATE）]t＝7.86×10-11および8.17×10-11mol/dm-3s-1）を考慮して、Ga（AAZTA－TATE）OHとsTfの間のトランスキレーション反応を特徴付けるkd疑似一次速度定数を計算した。Table 6に、Ga（AAZTA－TATE）OHとsTfの間のトランスキレーション反応のkd疑似一次速度定数と半減期の値（t1／2＝ln2／kd）を示し、Ga（AAZTA）OH]とsTfの間のリガンド交換反応と比較した。
Ga（AAZTA－TATE）OHとsTf間のトランスキレート反応のkdの平均値は1.60×10－6s-1であり、生理学的条件（ｐＨ＝7.4、0.025M NaHCO￥3、0.15M NaCl）付近でのGa（AAZTA）OHとsTf間のトランスキレート反応の平均値（8.0×10－6s-1）よりも約５．４小さいことが分かった。このkd値を考慮すれば、Ga（AAZTA－TATE）OHとsTf間のトランスキレーション反応の半減期（t1／2＝ln2／kd）は、Ga（AAZTA）OHとsTfのリガンド交換反応で得られたt1／2値の半減期よりも約５．４倍長い。
Ga（AAZTA－TATE）OHとヒト血清アポトランスフェリン（sTf、Sigma）のリガンド交換反応は、２４６ｎｍおよびｐＨ＝７．４にて、１．０ｃｍセルを用いるAgilent 8453 UV－Vis分光光度計を使用し、Baranyai, Eur. J. Inorg. Chem., 2013, 147－162に開示されている疑似一次速度論的条件（[Ga（AAZTA－TATE）OH]＝50μM、[Trf]＝8および16μM）を保証するため、Ga（AAZTA－TATE）OH過剰の存在下でのGa－トランスフェリン錯体の形成により、分光光度法（式（３））により実験した。ヒト血清トランスフェリン溶液の濃度は、モル吸光係数ε280＝91200cm-1M-1（Takahashi, J. Biochem. 1989, 106, 858－863）を使用して280nmでの吸光度から決定した。温度は２５℃に維持し、サンプルのイオン強度と炭酸水素塩濃度（NaClの場合は0.15M、NaHCO￥3の場合0.025M）を一定に保った。
【数3】
[Ga（AAZTA－TATE）OH]＝50μMおよび[sTf]＝8および16μMで得られたGa（AAZTA－TATE）OHとsTf間のトランスキレーション反応の速度は、それぞれ7.86×10-11および8.17×10-11mol／dm-3s-1である。。これらの速度論的データは、[sTf]がGa（AAZTA－TATE）OHの解離速度に実質的に影響を及ぼさないことを明確に示している。反応速度（d[Ga（sTf）]／dt＝kd[Ga（AAZTA－TATE）]t＝7.86×10-11および8.17×10-11mol/dm-3s-1）を考慮して、Ga（AAZTA－TATE）OHとsTfの間のトランスキレーション反応を特徴付けるkd疑似一次速度定数を計算した。Table 6に、Ga（AAZTA－TATE）OHとsTfの間のトランスキレーション反応のkd疑似一次速度定数と半減期の値（t1／2＝ln2／kd）を示し、Ga（AAZTA）OH]とsTfの間のリガンド交換反応と比較した。
【表6】
Ga（AAZTA－TATE）OHとsTf間のトランスキレート反応のkdの平均値は1.60×10－6s-1であり、生理学的条件（ｐＨ＝7.4、0.025M NaHCO￥3、0.15M NaCl）付近でのGa（AAZTA）OHとsTf間のトランスキレート反応の平均値（8.0×10－6s-1）よりも約５．４小さいことが分かった。このkd値を考慮すれば、Ga（AAZTA－TATE）OHとsTf間のトランスキレーション反応の半減期（t1／2＝ln2／kd）は、Ga（AAZTA）OHとsTfのリガンド交換反応で得られたt1／2値の半減期よりも約５．４倍長い。
【0089】
実施例６：Sc（AAZTA－TATE）の安定性と速度論的不活性の評価
６ａ．平衡実験
Sc（AAZTA－TATE）錯体の熱力学的特性は、条件付き安定度定数（logKcond＝logKtherm/（1＋αＨ）、αＨ＝Ｋ１ Ｈ［Ｈ＋］＋Ｋ１ ＨＫ２ Ｈ［Ｈ＋］２＋．．．＋Ｋ１ ＨＫ２ Ｈ．．．Ｋｎ Ｈ［Ｈ＋］ｎおよびＫ１ Ｈ、Ｋ２ Ｈ、．．．Ｋｎ Ｈは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液中のｐＨ＝７．０でのフリーのリガンドのプロトン化定数である）によって特徴づけた。Sc（AAZTA－TATE）錯体のlogKcond値を決定するために、Sc３＋に対するAAZTA－TATEとNTAの競合反応を、反応で形成したSc（NTA）２錯体（δSc＝59.9ppm）の積分を用いて45Sc NMR分光法（9.4TでのBruker Avance III 400分光計）で追跡することにより調べた（式（４）、H3NTA＝ニトリロ三酢酸、ｐＨ＝7.4、２５℃、0.15M NaCl）。
Sc（AAZTA－TATE）の平衡特性評価では、Sc３＋とAAZTA－TATEの濃度が203.3μMと206.2μMで、NTAの濃度を0.0から20.06mMの間で変えた7つのサンプルを調製した（事前に調製した０．１５Ｍ ＮａＣｌ中のSc（NTA）2錯体の溶液にAAZTA－TATEを添加することにより、１ｍＬのサンプルを７つ調製した）。濃ＮａＯＨまたはＨＣｌ溶液を段階的に加えることにより、ｐＨを７．４に調整した。平衡に達するために、サンプルを２５℃で８週間保持した（平衡に達するのに要した時間を45Sc NMR分光法により測定した）。
６ａ．平衡実験
Sc（AAZTA－TATE）錯体の熱力学的特性は、条件付き安定度定数（logKcond＝logKtherm/（1＋αＨ）、αＨ＝Ｋ１ Ｈ［Ｈ＋］＋Ｋ１ ＨＫ２ Ｈ［Ｈ＋］２＋．．．＋Ｋ１ ＨＫ２ Ｈ．．．Ｋｎ Ｈ［Ｈ＋］ｎおよびＫ１ Ｈ、Ｋ２ Ｈ、．．．Ｋｎ Ｈは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液中のｐＨ＝７．０でのフリーのリガンドのプロトン化定数である）によって特徴づけた。Sc（AAZTA－TATE）錯体のlogKcond値を決定するために、Sc３＋に対するAAZTA－TATEとNTAの競合反応を、反応で形成したSc（NTA）２錯体（δSc＝59.9ppm）の積分を用いて45Sc NMR分光法（9.4TでのBruker Avance III 400分光計）で追跡することにより調べた（式（４）、H3NTA＝ニトリロ三酢酸、ｐＨ＝7.4、２５℃、0.15M NaCl）。
【数4】
Sc（AAZTA－TATE）の平衡特性評価では、Sc３＋とAAZTA－TATEの濃度が203.3μMと206.2μMで、NTAの濃度を0.0から20.06mMの間で変えた7つのサンプルを調製した（事前に調製した０．１５Ｍ ＮａＣｌ中のSc（NTA）2錯体の溶液にAAZTA－TATEを添加することにより、１ｍＬのサンプルを７つ調製した）。濃ＮａＯＨまたはＨＣｌ溶液を段階的に加えることにより、ｐＨを７．４に調整した。平衡に達するために、サンプルを２５℃で８週間保持した（平衡に達するのに要した時間を45Sc NMR分光法により測定した）。
【0090】
Sc（AAZTA－TATE）の平衡特性をSc（AAZTA）の平衡特性と比較するため、Sc（AAZTA）の条件付き安定度定数は、Sc３＋に対するAAZTAとNTAの競合反応を、反応で形成したSc（NTA）2錯体（δSc＝59.9ppm）の積分を用いることにより45Sc NMR分光法で追跡することによって決定した（式（５）、ｐＨ＝7.4、２５℃、0.15M NaCl）。
Sc（AAZTA）の平衡特性評価では、Sc３＋とAAZTAの濃度が203.3μMと207.1μMで、NTAの濃度を0.0から20.06mMの間で変えた７つのサンプルを調製した（事前に調製した０．１５Ｍ ＮａＣｌ中のSc（NTA）2錯体の溶液にAAZTAを添加することにより、２ｍＬのサンプルを７つ調製した）。濃ＮａＯＨまたはＨＣｌ溶液を段階的に加えることにより、ｐＨを７．４に調整した。平衡に達するために、サンプルを２５℃で８週間保持した（平衡に達するのに要した時間を45Sc NMR分光法により測定した）。平衡計算については、NTAリガンドのプロトン化定数（NTA：logＫ１ Ｈ＝9.13（1）、logＫ２ Ｈ＝2.63（2）、logK3 H＝1.64（3）；２５℃、0.15M NaCl）およびSc（NTA）およびSc（NTA）2錯体の安定定数（logKSc（NTA）＝14.12（3）、logβSc（NTA）2＝24.08（2）、２５℃、0.15M NaCl）を、pH－電位差測定および45Sc NMR分光法により、文献に記載されているように決定した（Nagy、Angew Chem Int Ed Engl 2017、56、2118－2122）。
【数5】
Sc（AAZTA）の平衡特性評価では、Sc３＋とAAZTAの濃度が203.3μMと207.1μMで、NTAの濃度を0.0から20.06mMの間で変えた７つのサンプルを調製した（事前に調製した０．１５Ｍ ＮａＣｌ中のSc（NTA）2錯体の溶液にAAZTAを添加することにより、２ｍＬのサンプルを７つ調製した）。濃ＮａＯＨまたはＨＣｌ溶液を段階的に加えることにより、ｐＨを７．４に調整した。平衡に達するために、サンプルを２５℃で８週間保持した（平衡に達するのに要した時間を45Sc NMR分光法により測定した）。平衡計算については、NTAリガンドのプロトン化定数（NTA：logＫ１ Ｈ＝9.13（1）、logＫ２ Ｈ＝2.63（2）、logK3 H＝1.64（3）；２５℃、0.15M NaCl）およびSc（NTA）およびSc（NTA）2錯体の安定定数（logKSc（NTA）＝14.12（3）、logβSc（NTA）2＝24.08（2）、２５℃、0.15M NaCl）を、pH－電位差測定および45Sc NMR分光法により、文献に記載されているように決定した（Nagy、Angew Chem Int Ed Engl 2017、56、2118－2122）。
【0091】
Sc（NTA）2錯体の量は、Sc３＋－イオンに対するAAZTA－TATEおよびAAZTAと、NTAとの競合反応に従って[NTA]の増加とともに増加する（式（４）および（５））。Sc３＋－イオンに対するAAZTA－TATEおよびAAZTAとNTAとの競合反応（式（４）および（５））は、ＫScTATEおよびKScAA平衡定数によって特徴付けることができ、これは次式で表すことができる。
【数6】
【数7】
【0092】
NTA（［NTA］tot＝［HxNTA］＋２［Sc(NTA)2］）、Sc3+イオン（［Sc3+］tot＝［Sc(NTA)2］＋［Sc（AAZTA－TATE）］）およびAAZTA－TATE（［AAZTA－TATE］tot＝［Sc（AAZTA－TATE）］＋［HxAAZTA－TATE］）の総濃度を考慮して、ＫScTATE（式（６））の値を、Sc3+－AAZTA－TATE－NTAシステムの45Sc ＮＭＲスペクトルにおけるSc(NTA)2錯体の積分値から計算した（ＫScTATE＝３．４２（９））。我々の実験条件で優勢であるSc(NTA)2の安定度定数（logβc（NTA）2＝24.08、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２５℃）、NTAリガンドのプロトン化定数（logK1
H＝9.13（1）、logK2
H＝2.63（2）、logK3
H＝1.64（3)；２５℃、0.15M NaCl）から、Sc(NTA)2の条件付き安定度定数は、０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液中ｐＨ＝７．４および２５℃でlogKcond
Sc(NTA)2＝20.63であることが分かった。ＫScTATE平衡定数(ＫScTATE＝3.42)とSc(NTA)2の条件付き安定度定数(logKcond
Sc(NTA)2＝20.63)から、Sc（AAZTA－TATE）錯体の条件付き安定度定数(logKcond
Sc（AAZTA－TATE）＝logＫScTATE＋logKcond
Sc(NTA)2)は、０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液中ｐＨ＝７．４および２５℃でlogKcond
Sc（AAZTA－TATE）＝21.2であると分かった。
【0093】
NTA([NTA]tot＝[HxNTA]+2[Sc(NTA)2]）、Sc3+イオン([Sc3+]tot＝[Sc(NTA)2]+[Sc(AAZTA)]）およびAAZTA([AAZTA]tot＝[Sc(AAZTA)]+[HxAAZTA])の総濃度を考慮して、KScAA（式（７））の値を、Sc3+－AAZTA－NTAシステムの45Sc NMRスペクトルにおけるSc(NTA)2錯体の積分値から計算した(KScAA＝70.3（5））。KScAA平衡定数(KScAA＝70.3)とSc(NTA)2の条件付き安定度定数(logKcond
Sc(NTA)2＝20.63)から、Sc(AAZTA)錯体の条件付き安定度定数(logKcond
Sc(AAZTA)＝logKScAA＋logKcond
Sc(NTA)2)は、０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液中ｐＨ＝７．４および２５℃でlogKcond
Sc(AAZTA)＝22.5であると分かった。これらのエビデンスに基づき、Sc（AAZTA－TATE）錯体の条件付き安定度定数は、０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液中ｐＨ＝７．４および２５℃でのSc（AAZTA）錯体の条件付き安定度定数よりも約１logK単位低い。
【0094】
６ｂ．Sc（AAZTA－TATE）とNTAリガンド（NTA＝ニトリロ三酢酸）との間のトランスキレーション反応の速度論的実験
Sc（AAZTA－TATE）とNTA（Sigma）のリガンド交換反応は、ｐＨ＝５．５および２５℃にて45Sc NMR分光法により実験した。Sc（AAZTA－TATE）のトランスキレーションを、上記のように反応中に形成したSc(NTA)2錯体（式（８））の積分を追跡することによってモニターした。
Sc（AAZTA－TATE）とNTA（Sigma）のリガンド交換反応は、ｐＨ＝５．５および２５℃にて45Sc NMR分光法により実験した。Sc（AAZTA－TATE）のトランスキレーションを、上記のように反応中に形成したSc(NTA)2錯体（式（８））の積分を追跡することによってモニターした。
【数8】
【0095】
速度論的実験では、疑似一次速度論的条件を保証するため、2500倍および5000倍過剰のNTAリガンドの存在下でSc（AAZTA－TATE）の濃度が０．２ｍＭである２つのサンプル（２×０．８ｍＬサンプル）を調製した。濃ＮａＯＨまたはＨＣｌを段階的に加えることにより、ｐＨを５．５に調整した。高濃度のNTAが存在するため、ｐＨ値を一定に保つためのバッファーは使用しなかった。Sc（AAZTA－TATE）－NTA反応系の45Sc NMRスペクトルでは、式（８）に記載されるSc（AAZTA－TATE）とNTAのトランスキレーション反応によるSc(NTA)2錯体の積分の増大がもたらされる。疑似一次速度定数（ｋｄ）は、積分（Sc(NTA)2）－時間データセットを式（９）にフィッティングすることにより計算した。
［式中、Ａｔ、Ａ０、Ａｅは、それぞれ、時間ｔ、反応の開始時、終了時での積分値である］
【数9】
【0096】
類似性に基づいて、Sc（AAZTA－TATE）のトランキレーション反応のメカニズムは、親のSc（AAZTA）錯体のメカニズムと非常に類似していると推測できる（Nagy, Angew Chem Int Ed Engl 2017, 56, 2118-2122）。Sc（AAZTA－TATE）のトランスキレーション反応は、律速段階の、Ｈ＋がアシストするSc（AAZTA－TATE）錯体の解離が起こり、フリーのSc3+と、交換されるNTAリガンド間の高速反応がその後に続く。[Sc（AAZTA－TATE）]＝0.2mM、[NTA]＝0.5および1.0M、ｐＨ＝5.50および5.35で得られた、Sc（AAZTA－TATE）とNTAの間のトランスキレーション反応を特徴付ける疑似一次速度定数（ｋｄ）は、それぞれ、（1.7±0.2）×10-7 s-1、（1.8±0.3）×10-7 s-1である。これらの速度論的データは、[NTA]がSc（AAZTA－TATE）の解離速度に実質的に影響を及ぼさないことを明確に示している。
ｐＨ＝5.50と5.35で得られたSc（AAZTA）とSc（AAZTA－TATE）の解離半減期(t１／2＝ｌｎ２／ｋｄ)（Sc(AAZTA)：t１／2＝469および600時間（Nagy, Angew Chem Int Ed Engl 2017, 56, 2118-2122）；Sc（AAZTA－TATE）：t１／2＝1100および1050時間、２５℃）の比較は、Sc（AAZTA－TATE）の速度論的不活性がSc（AAZTA）よりも約２倍高いことを示している。
ｐＨ＝5.50と5.35で得られたSc（AAZTA）とSc（AAZTA－TATE）の解離半減期(t１／2＝ｌｎ２／ｋｄ)（Sc(AAZTA)：t１／2＝469および600時間（Nagy, Angew Chem Int Ed Engl 2017, 56, 2118-2122）；Sc（AAZTA－TATE）：t１／2＝1100および1050時間、２５℃）の比較は、Sc（AAZTA－TATE）の速度論的不活性がSc（AAZTA）よりも約２倍高いことを示している。
【0097】
実施例７：化合物Bi－AAZTA－TATEの安定性および速度論的不活性の評価
７ａ．平衡実験
Bi（AAZTA）の安定度定数は、Bi3+に対するAAZTAとNTAの競合反応（式（１０））を、２１０～３５０ｎｍの波長範囲でＵＶ分光光度法で追跡することにより決定した。Bi3+とNTAの濃度は３０．２μＭと１０ｍＭとし、AAZTAの濃度は0.15MのNaClO4溶液中０～５０μＭの間で変えた（予め調製したBi（NTA）2錯体にAAZTAを添加した６×２ｍＬのサンプル）。濃ＮａＯＨまたはＨＣｌＯ４を段階的に添加することにより、ｐＨを７．４に調整した。平衡に達するために、サンプルを５０℃で１週間、２５℃で２週間保持した（平衡に達するのに必要な時間は分光光度法で測定した）。分光光度測定は、PerkinElmer Lambda 365 UV－Vis分光光度計を使用し、２５℃で１．０ｃｍセルを使用して行った。平衡計算に関して、AAZTAおよびNTAリガンドのプロトン化定数（AAZTA：logＫ１ Ｈ＝10.29、logＫ2 Ｈ＝6.51、logK3 H＝3.86、logK４ H＝1.94、logK5 H＝1.00；NTA：logＫ１ Ｈ＝9.22、logＫ2 Ｈ＝2.98、logK3 H＝1.06；２５℃、0.15M NaClO4）およびBi（NTA）およびBi（NTA）2錯体の安定度定数（logKBi（NTA）＝16.97、logβBi（NTA）2＝26.21、２５℃、0.15M NaClO4）は文献に記載されているように決定されている（Baranyai, Eur. J. Inorg. Chem., 2013, 147-162, KARADAKOV, Talanta, 1970, 17, 883－887）。平衡定数は、プログラムPSEQUAD（L. Zekany and I. Nagypal in PSEQUAD, Vol.（Ed. D. Leggett), Springer US, 1985, pp. 291-353）を使用して計算した。
Bi3+－NTA－AAZTAシステムのＵＶ分光光度法による実験から計算されたBi（AAZTA）の熱力学的安定度定数は、0.15M NaClO4中２５℃でlogKBi(AAZTA)＝26.45（6）である。AAZTAリガンドのプロトン化定数（logK1 H＝10.29、logK2 H＝6.51、logK3 H＝3.86、logK4 H＝1.94、logK5 H＝1.00、0.15M NaClO4中２５℃）およびBi（AAZTA）の安定度定数（logKBi(AAZTA)＝26.45、0.15M NaClO4中２５℃）から、Bi（AAZTA）の条件付き安定度定数は、0.15M NaClO4中ｐＨ＝７．４、２５℃で、logKcond Bi(AAZTA)＝logKBi(AAZTA)/(1+αＨ)＝23.5と計算された（αＨ＝K1 H[Ｈ＋]+K1 HK2 H[Ｈ＋]2+...+K1 HK2 H...Kn H[Ｈ＋]n および K1 H、K2 H、... Kn Hは、0.15M NaClO4溶液中のｐＨ＝７．４でのフリーのリガンドのプロトン化定数である）。
７ａ．平衡実験
Bi（AAZTA）の安定度定数は、Bi3+に対するAAZTAとNTAの競合反応（式（１０））を、２１０～３５０ｎｍの波長範囲でＵＶ分光光度法で追跡することにより決定した。Bi3+とNTAの濃度は３０．２μＭと１０ｍＭとし、AAZTAの濃度は0.15MのNaClO4溶液中０～５０μＭの間で変えた（予め調製したBi（NTA）2錯体にAAZTAを添加した６×２ｍＬのサンプル）。濃ＮａＯＨまたはＨＣｌＯ４を段階的に添加することにより、ｐＨを７．４に調整した。平衡に達するために、サンプルを５０℃で１週間、２５℃で２週間保持した（平衡に達するのに必要な時間は分光光度法で測定した）。分光光度測定は、PerkinElmer Lambda 365 UV－Vis分光光度計を使用し、２５℃で１．０ｃｍセルを使用して行った。平衡計算に関して、AAZTAおよびNTAリガンドのプロトン化定数（AAZTA：logＫ１ Ｈ＝10.29、logＫ2 Ｈ＝6.51、logK3 H＝3.86、logK４ H＝1.94、logK5 H＝1.00；NTA：logＫ１ Ｈ＝9.22、logＫ2 Ｈ＝2.98、logK3 H＝1.06；２５℃、0.15M NaClO4）およびBi（NTA）およびBi（NTA）2錯体の安定度定数（logKBi（NTA）＝16.97、logβBi（NTA）2＝26.21、２５℃、0.15M NaClO4）は文献に記載されているように決定されている（Baranyai, Eur. J. Inorg. Chem., 2013, 147-162, KARADAKOV, Talanta, 1970, 17, 883－887）。平衡定数は、プログラムPSEQUAD（L. Zekany and I. Nagypal in PSEQUAD, Vol.（Ed. D. Leggett), Springer US, 1985, pp. 291-353）を使用して計算した。
【数10】
Bi3+－NTA－AAZTAシステムのＵＶ分光光度法による実験から計算されたBi（AAZTA）の熱力学的安定度定数は、0.15M NaClO4中２５℃でlogKBi(AAZTA)＝26.45（6）である。AAZTAリガンドのプロトン化定数（logK1 H＝10.29、logK2 H＝6.51、logK3 H＝3.86、logK4 H＝1.94、logK5 H＝1.00、0.15M NaClO4中２５℃）およびBi（AAZTA）の安定度定数（logKBi(AAZTA)＝26.45、0.15M NaClO4中２５℃）から、Bi（AAZTA）の条件付き安定度定数は、0.15M NaClO4中ｐＨ＝７．４、２５℃で、logKcond Bi(AAZTA)＝logKBi(AAZTA)/(1+αＨ)＝23.5と計算された（αＨ＝K1 H[Ｈ＋]+K1 HK2 H[Ｈ＋]2+...+K1 HK2 H...Kn H[Ｈ＋]n および K1 H、K2 H、... Kn Hは、0.15M NaClO4溶液中のｐＨ＝７．４でのフリーのリガンドのプロトン化定数である）。
【0098】
さらに、Bi（AAZTA－TATE）錯体の熱力学的特性を、条件付き安定度定数（logKcond＝logKtherm/(1+αH））によって特徴づけた。Bi（AAZTA－TATE）錯体のlogKcond値を決定するために、Bi3+に対するAAZTA－TATEとNTAの競合反応（式（１１））を、Chang, J. Chinese. Chem. Soc. 1999, 46, 519-528（H3NTA＝ニトリロ三酢酸)に開示されるように、ｐＨ＝７．４の0.15M NaClO4溶液中でのキャピラリーゾーン電気泳動（Hewlett-Packard HP3D キャピラリー電気泳動システム）によって実施した。Bi（AAZTA－C4－TATE）の平衡特性評価では、Bi3+とNTAの濃度は３０．２μＭと１５．０ｍＭとし、AAZTA－C4－TATEの濃度は0.15MのNaClO4溶液中で０．０～５０．４μＭの間で変えた（予め調製したBi（NTA）2錯体にAAZTA－C4－TATEを添加した５×１ｍＬのサンプル）。濃ＮａＯＨまたはＨＣｌＯ４を段階的に添加することにより、ｐＨを７．４に調整した。平衡に達するために、サンプルを５０℃で１週間、２５℃で２週間保持した（平衡に達するのに必要な時間はキャピラリー電気泳動で測定した）。
【数11】
【0099】
Bi3+－イオンに対するAAZTA－TATEとNTAの競合反応（式（１１））に従ってAAZTA－TATEの量が増大することにより、Bi（AAZTA－TATE）錯体の量が増加する。NTA（[NTA]tot＝[HxNTA]+2[Bi（NTA）2]）、Bi3+イオン（[Bi3+]tot＝[Bi（NTA）2]+[Bi(AAZTA－TATE)]）およびAAZTA－TATE（[AAZTA－TATE]tot＝[Bi(AAZTA－TATE)]+[HxAAZTA－TATE])の総濃度から、KBiTATE値は５１であることが分かった（９）。Bi（NTA）2の安定度定数とNTAリガンドのプロトン化定数（logK1
H＝9.22、logK2
H＝2.98、logK3
H＝1.06；２５℃、0.15M NaClO4）から、Bi（NTA）2の条件付き安定度定数は、0.15M NaClO4溶液中、ｐＨ＝７．４、２５℃でlogKcond
Bi（NTA）2＝22.5であることが分かった。KBiTATE平衡定数(KGaTATE＝51)とBi（NTA）2の条件付き安定度定数(logKcond
Bi（NTA）2＝22.5)から、Bi（AAZTA－TATE）錯体の条件付き安定度定数(logKcond
Bi(AAZTA－TATE)＝logKBiTATE＋logKcond
Bi（NTA）2)は、0.15M NaClO4中、ｐＨ＝７．４、２５℃でlogKcond
Bi(AAZTA－TATE)＝24.3であることが分かった。
これらのエビデンスに基づき、Bi（AAZTA－TATE）錯体の条件付き安定度定数は、０．１５Ｍ ＮａＣｌ4溶液中ｐＨ＝７．４および２５℃でのBi（AAZTA）錯体の条件付き安定度定数よりも約0.8logK単位高い。
これらのエビデンスに基づき、Bi（AAZTA－TATE）錯体の条件付き安定度定数は、０．１５Ｍ ＮａＣｌ4溶液中ｐＨ＝７．４および２５℃でのBi（AAZTA）錯体の条件付き安定度定数よりも約0.8logK単位高い。
【0100】
７ｂ．Bi（AAZTA－TATE）とAAZTAリガンド、およびBi（AAZTA）とDTPAリガンド間のトランスキレーション反応の速度論的実験
Bi（AAZTA）の速度論的特性は、0.15M NaClO4溶液中、２５℃、２７８ｎｍでのＵＶ分光光度法を使用して、Bi（AAZTA）とDTPAの間のトランスキレーション反応を追跡することによって決定した（Bi（DTPA）の安定度定数は、0.6M NaClO4中２５℃でlogKBi(DTPA)＝29.3である。V. Kornev, A. Troubachev, Russ. J. Inorg. Chem, 1987, 32, 1419）。これらの実験において、Bi（AAZTA）の濃度は０．１ｍＭであり、DTPAを１０倍および２０倍過剰で適用して疑似一次条件を確実にした。濃NaOHまたはＨＣｌＯ４を段階的に添加することにより、ｐＨを8.5、9.0、9.5、10.0、10.5および11.0に調整した。ｐＨ値を一定に保つため、０．０１Ｍ Ｎ－メチル－ピペラジン（ｐＨ＞１０）バッファーを使用した。ｐＨ＞１０ではＯＨ-が高濃度で存在するため、一定のｐＨを維持するためのバッファーは使用しなかった。疑似一次速度定数（ｋｄ）は、Bi(AAZTA)－DTPA系についての吸光度－時間データセットを式（９）にフィッティングすることにより計算した。Bi（AAZTA）錯体の解離速度（ｋｄ）は、[DTPA]と無関係であり、ｐＨの上昇とともに増大する。ｐＨの上昇に伴う（[OH-]の増加に伴う）ｋｄ値の増大は、律速段階のOH-がアシストするBi（AAZTA）錯体の解離（その後、フリーのBi3+と、交換されるDTPAリガンド間の高速反応が続く）の観点から解釈できる。Bi（AAZTA）の解離反応を特徴づけるｋｄ速度定数と半減期（t1/2＝ｌｎ２／ｋｄ）は、ｋｄ＝1.67×10-6 s-1、t1/2＝１１５時間（ｐＨ＝９．０、２５℃、0.15M NaClO4中）である。
Bi（AAZTA）の速度論的特性は、0.15M NaClO4溶液中、２５℃、２７８ｎｍでのＵＶ分光光度法を使用して、Bi（AAZTA）とDTPAの間のトランスキレーション反応を追跡することによって決定した（Bi（DTPA）の安定度定数は、0.6M NaClO4中２５℃でlogKBi(DTPA)＝29.3である。V. Kornev, A. Troubachev, Russ. J. Inorg. Chem, 1987, 32, 1419）。これらの実験において、Bi（AAZTA）の濃度は０．１ｍＭであり、DTPAを１０倍および２０倍過剰で適用して疑似一次条件を確実にした。濃NaOHまたはＨＣｌＯ４を段階的に添加することにより、ｐＨを8.5、9.0、9.5、10.0、10.5および11.0に調整した。ｐＨ値を一定に保つため、０．０１Ｍ Ｎ－メチル－ピペラジン（ｐＨ＞１０）バッファーを使用した。ｐＨ＞１０ではＯＨ-が高濃度で存在するため、一定のｐＨを維持するためのバッファーは使用しなかった。疑似一次速度定数（ｋｄ）は、Bi(AAZTA)－DTPA系についての吸光度－時間データセットを式（９）にフィッティングすることにより計算した。Bi（AAZTA）錯体の解離速度（ｋｄ）は、[DTPA]と無関係であり、ｐＨの上昇とともに増大する。ｐＨの上昇に伴う（[OH-]の増加に伴う）ｋｄ値の増大は、律速段階のOH-がアシストするBi（AAZTA）錯体の解離（その後、フリーのBi3+と、交換されるDTPAリガンド間の高速反応が続く）の観点から解釈できる。Bi（AAZTA）の解離反応を特徴づけるｋｄ速度定数と半減期（t1/2＝ｌｎ２／ｋｄ）は、ｋｄ＝1.67×10-6 s-1、t1/2＝１１５時間（ｐＨ＝９．０、２５℃、0.15M NaClO4中）である。
【0101】
Bi（AAZTA－TATE）錯体の速度論的不活性を調べるために、Bi（AAZTA－TATE）錯体とAAZTAの間のトランスキレーション反応（式（１２））の実験を、キャピラリーゾーン電気泳動（Hewlett-Packard HP3D キャピラリー電気泳動システム）により、疑似一次反応速度条件を保証するため２０倍および４０倍のAAZTA過剰の存在下、0.15M NaClO4中ｐＨ＝９．０、２５℃にて実施した。
【数12】
【0102】
速度論的実験では、疑似一次速度論的条件を保証するため、２０倍および４０倍過剰のAAZTAリガンドの存在下、Bi(AAZTA－TATE)の濃度が５０．１μＭである２つのサンプル（0.15M NaClO4溶液中の２×１ｍＬサンプル）を調製した。濃ＮａＯＨまたはＨＣｌＯ４を段階的に加えることにより、ｐＨを＝９．０に調整した。ｐＨ値を一定に保つため、０．０１Ｍ Ｎ－メチル－ピペラジン（ＮＭＰ）バッファーを使用した。サンプルは２５℃に維持した。Bi（AAZTA－TATE）－AAZTA反応系の電気泳動図では、Bi（AAZTA－TATE）錯体の面積が時間の関数として減少し、これは、式（１２）のBi（AAZTA－TATE）錯体とAAZTAリガンドのトランスキレーション反応を示している。疑似一次速度定数（ｋｄ）は、Bi（AAZTA－TATE）錯体－時間データセットの面積を式（９）にフィッティングすることによって計算した。１．０および２．０ｍＭ AAZTAの存在下で得られた、Bi（AAZTA－TATE）とAAZTA間のトランスキレーション反応を特徴付ける疑似一次速度定数（ｋｄ）は、それぞれ、（1.7±0.1）×10-7 s-1および(2.0±0.2）×10-7 s-1である。これらの速度論的データは、[AAZTA]がBi（AAZTA－TATE）の解離速度に実質的に影響を及ぼさないことを明確に示している。律速段階は、OH-がアシストするBi（AAZTA－TATE）錯体の解離であり、フリーのBi3+と、交換されるAAZTAリガンドとの間の高速反応がその後に続くと考えられる。
【0103】
ｐＨ＝９．０で得られた、Bi（AAZTA）とBi（AAZTA－TATE）の解離半減期(t１／2＝ｌｎ２／ｋｄ)（Bi（AAZTA）：t１／2＝１１５時間；Bi（AAZTA－TATE）：t１／2＝１１８時間、0.15M NaClO4中、ｐＨ＝９．０、２５℃）の比較は、Bi（AAZTA－TATE）の速度論的不活性が、生理学的条件の付近で、Bi（AAZTA）よりも約１０倍高いことを示している。
【手続補正書】
【提出日】2023-09-22
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式（Ｉ）：
で示されるキレート化合物またはその薬学的に許容し得る塩。
【化1】
【外国語明細書】