知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ フンダシオン インスティテュート デ インベスティガシオン サニタリア デ サンティアゴ デ コンポステーラ （フィディス）の特許一覧 ▶ セルビソ ガレゴ デ サウーデの特許一覧
特開2023-179455ＴＡＳ１Ｒ３タンパク質を発現する腫瘍に関する治療目的、診断目的及び／又は予後診断目的のマーカーとしてのＴＡＳ１Ｒ３タンパク質の使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023179455
(43)【公開日】2023-12-19
(54)【発明の名称】ＴＡＳ１Ｒ３タンパク質を発現する腫瘍に関する治療目的、診断目的及び／又は予後診断目的のマーカーとしてのＴＡＳ１Ｒ３タンパク質の使用
(51)【国際特許分類】
G01N 33/574 20060101AFI20231212BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20231212BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20231212BHJP
A61K 47/54 20170101ALI20231212BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231212BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20231212BHJP
A61K 49/00 20060101ALI20231212BHJP
C07K 14/705 20060101ALN20231212BHJP
【ＦＩ】
G01N33/574 A
G01N33/53 D ZNA
G01N33/53 Y
A61K47/64
A61K47/54
A61P35/00
A61K39/395 T
A61K39/395 E
A61K49/00
C07K14/705
【審査請求】有
【請求項の数】16
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023145020
(22)【出願日】2023-09-07
(62)【分割の表示】P 2020559029の分割
【原出願日】2019-01-15
(31)【優先権主張番号】18382013.3
(32)【優先日】2018-01-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】520258105
【氏名又は名称】フンダシオン インスティテュート デ インベスティガシオン サニタリア デ サンティアゴ デ コンポステーラ （フィディス）
(71)【出願人】
【識別番号】520258116
【氏名又は名称】セルビソ ガレゴ デ サウーデ
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】デ ラ フエンテ フレイレ マリア
(72)【発明者】
【氏名】ロペス ロペス ラファエル
(72)【発明者】
【氏名】アロンソ ノセロ マルタ
(72)【発明者】
【氏名】バスケス リオス アビ フディ
(57)【要約】 （修正有）
【解決手段】癌の診断、モニタリング及び療法における適用のためのバイオマーカーとしてＴＡＳ１Ｒ３受容体を使用する。
【効果】ＴＡＳ１Ｒ３が、疾患の診断のために有用であり、それに関連した情報を提供することで進化をモニタリングし、治療を選択し、選択的に治療分子を誘導することを可能にするバイオマーカーであることを実証した。この受容体に対する療法を特定することが可能であること、原発性腫瘍細胞、播種性腫瘍細胞及び転移性腫瘍細胞における細胞内蓄積が非常に効率的に観察されるコンジュゲート及びナノ粒子等の薬物制御放出系を誘導することが可能であることも確かめた。循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）におけるＴＡＳ１Ｒ３の存在も実証された。循環腫瘍細胞は転移の生成における重要な要因と見なされ、その早期段階での検出は転移の早期検出因子としての役割を果たし、疾患のモニタリング及び薬物への応答の評価においても有用である。
【選択図】なし
【効果】ＴＡＳ１Ｒ３が、疾患の診断のために有用であり、それに関連した情報を提供することで進化をモニタリングし、治療を選択し、選択的に治療分子を誘導することを可能にするバイオマーカーであることを実証した。この受容体に対する療法を特定することが可能であること、原発性腫瘍細胞、播種性腫瘍細胞及び転移性腫瘍細胞における細胞内蓄積が非常に効率的に観察されるコンジュゲート及びナノ粒子等の薬物制御放出系を誘導することが可能であることも確かめた。循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）におけるＴＡＳ１Ｒ３の存在も実証された。循環腫瘍細胞は転移の生成における重要な要因と見なされ、その早期段階での検出は転移の早期検出因子としての役割を果たし、疾患のモニタリング及び薬物への応答の評価においても有用である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
腫瘍バイオマーカーとしてのＴＡＳ１Ｒ３膜細胞受容体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用。
【請求項2】
患者における腫瘍の存在、新生物の存在又は転移の存在をｉｎ ｖｉｔｒｏで診断する方法であって、以下の工程：
ａ）前記患者から単離された少なくとも１つの生体試料から出発して、前記生体試料の細胞におけるＴＡＳ１Ｒ３の発現レベルを測定する工程と、
ｃ）前記発現レベルを、健康な個体又は健康な器官若しくは組織の一部の生体試料又は腫瘍の存在を有しない生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値と比較する工程と、
を含み、健康な個体又は健康な器官若しくは組織の一部の生体試料又は腫瘍の存在を有しない生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値と比較して増加した発現レベルが、患者における腫瘍の存在、新生物の存在又は転移の存在の指標である、方法。
ａ）前記患者から単離された少なくとも１つの生体試料から出発して、前記生体試料の細胞におけるＴＡＳ１Ｒ３の発現レベルを測定する工程と、
ｃ）前記発現レベルを、健康な個体又は健康な器官若しくは組織の一部の生体試料又は腫瘍の存在を有しない生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値と比較する工程と、
を含み、健康な個体又は健康な器官若しくは組織の一部の生体試料又は腫瘍の存在を有しない生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値と比較して増加した発現レベルが、患者における腫瘍の存在、新生物の存在又は転移の存在の指標である、方法。
【請求項3】
患者における腫瘍の存在、新生物の存在又は転移の存在に見舞われている患者の臨床経過をｉｎ ｖｉｔｒｏで予後診断する方法であって、以下の工程：
ａ）前記患者から単離された少なくとも１つの生体試料から出発して、前記生体試料の細胞におけるＴＡＳ１Ｒ３の発現を測定する工程と、
ｃ）前記発現レベルと、項目ａ）の生体試料を得た時点よりも早い時点で得られた同じ患者からの生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値とを比較する工程と、
を含み、項目ａ）の生体試料を得た時点よりも早い時点で得られた生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値と比較して増加した発現レベルが、患者の消極的な臨床的進化の指標である、方法。
ａ）前記患者から単離された少なくとも１つの生体試料から出発して、前記生体試料の細胞におけるＴＡＳ１Ｒ３の発現を測定する工程と、
ｃ）前記発現レベルと、項目ａ）の生体試料を得た時点よりも早い時点で得られた同じ患者からの生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値とを比較する工程と、
を含み、項目ａ）の生体試料を得た時点よりも早い時点で得られた生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値と比較して増加した発現レベルが、患者の消極的な臨床的進化の指標である、方法。
【請求項4】
腫瘍の存在、新生物の存在又は転移の存在に見舞われている患者の臨床経過をｉｎ ｖｉｔｒｏでモニタリングする方法であって、以下の工程：
ａ）前記患者から単離された少なくとも１つの生体試料から出発して、前記生体試料の細胞におけるＴＡＳ１Ｒ３の発現を測定する工程と、
ｃ）前記発現レベルと、項目ａ）の生体試料を得た時点よりも早い時点で得られた同じ患者からの生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値とを比較する工程と、
を含み、項目ａ）の生体試料を得た時点よりも早い時点で得られた同じ患者からの生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値と比較して増加した発現レベルが、患者の消極的な臨床的進化の指標である、方法。
ａ）前記患者から単離された少なくとも１つの生体試料から出発して、前記生体試料の細胞におけるＴＡＳ１Ｒ３の発現を測定する工程と、
ｃ）前記発現レベルと、項目ａ）の生体試料を得た時点よりも早い時点で得られた同じ患者からの生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値とを比較する工程と、
を含み、項目ａ）の生体試料を得た時点よりも早い時点で得られた同じ患者からの生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値と比較して増加した発現レベルが、患者の消極的な臨床的進化の指標である、方法。
【請求項5】
腫瘍の存在、新生物の存在又は転移の存在に見舞われている患者の治療に対する応答をモニタリングする方法であって、以下の工程：
ａ）前記患者から単離された少なくとも１つの生体試料から出発して、前記生体試料の細胞におけるＴＡＳ１Ｒ３の発現を測定する工程と、
ｃ）前記発現レベルと、項目ａ）の生体試料を得た時点よりも早い時点で得られた同じ患者からの生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値とを比較する工程と、
を含み、項目ａ）の生体試料を得た時点よりも早い時点で得られた同じ患者からの生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値と比較して増加した発現レベルが、治療に対する応答の欠如の指標である、方法。
ａ）前記患者から単離された少なくとも１つの生体試料から出発して、前記生体試料の細胞におけるＴＡＳ１Ｒ３の発現を測定する工程と、
ｃ）前記発現レベルと、項目ａ）の生体試料を得た時点よりも早い時点で得られた同じ患者からの生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値とを比較する工程と、
を含み、項目ａ）の生体試料を得た時点よりも早い時点で得られた同じ患者からの生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値と比較して増加した発現レベルが、治療に対する応答の欠如の指標である、方法。
【請求項6】
前記生体試料の細胞におけるＴＡＳ１Ｒ３の発現の測定は、ＴＡＳ１Ｒ３受容体に選択
的に結合することができるＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、又はダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ及び／又はヒト化抗体からなる群に属するアプタマー、抗体又はそのフラグメントを用いて行われる、請求項２～５のいずれか一項に記載の方法。
的に結合することができるＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、又はダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ及び／又はヒト化抗体からなる群に属するアプタマー、抗体又はそのフラグメントを用いて行われる、請求項２～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記アプタマー、前記抗体若しくはそのフラグメント、又は前記ダイアボディ、前記トリアボディ、前記テトラボディ及び／又は前記ヒト化抗体は、配列番号１又は配列番号２の配列のいずれかに選択的に結合することができる、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記存在する腫瘍は固形腫瘍である、又は前記患者は、乳癌、黒色腫、ブドウ膜黒色腫、膵臓癌、肺癌、前立腺癌、胃癌、頭頸部癌、肉腫、神経膠芽腫、神経芽腫、結腸及び直腸の癌、頭頸部の癌、腎臓癌及び膀胱癌並びに肝癌からなる群より選択される疾患を患っている、請求項２～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記受容体のリガンド、好ましくはコンジュゲート又は免疫毒素の形のリガンドの使用により腫瘍細胞に向かって療法薬を誘導するための分子マーカー／腫瘍バイオマーカーとして使用される、細胞膜受容体ＴＡＳ１Ｒ３。
【請求項10】
前記受容体のリガンド、好ましくは放射性医薬品とのコンジュゲートの形のリガンドの使用によりｉｎ ｖｉｖｏ診断するための分子マーカー／腫瘍バイオマーカーとして使用される、細胞膜受容体ＴＡＳ１Ｒ３。
【請求項11】
腫瘍細胞に対する療法で使用される又はｉｎ ｖｉｖｏ診断での腫瘍バイオマーカーとして使用される、
ａ）ＴＡＳ１Ｒ３受容体と相互作用又は結合することができる特異的な標的剤と、
ｂ）細胞毒性剤、放射性同位体、ナノ構造物又はナノエマルジョンと、
を含むコンジュゲート。
ａ）ＴＡＳ１Ｒ３受容体と相互作用又は結合することができる特異的な標的剤と、
ｂ）細胞毒性剤、放射性同位体、ナノ構造物又はナノエマルジョンと、
を含むコンジュゲート。
【請求項12】
前記ＴＡＳ１Ｒ３受容体と相互作用又は結合することができる標的剤は、単糖及び二糖、スクラロース、シクラメート、ネオエスペリジン、ジヒドロカルコン等の人工甘味料、ラクチゾール等の甘味阻害剤、ブラゼイン等のタンパク質、抗体又は抗体のフラグメント、ペプチド、アプタマー又は小分子からなる群より選択される、請求項１１に記載のコンジュゲート。
【請求項13】
前記標的剤は、アプタマー、抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖからなる群より選択される抗体のフラグメント、又はダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ及び／又はヒト化抗体からなる群より選択され、ここで、前記標的剤は、配列番号１又は配列番号２の配列のいずれかに選択的に結合することができる、請求項１１に記載のコンジュゲート。
【請求項14】
ａ）ブラゼイン及びラクチゾールからなる群より選択される特異的な標的剤と、
ｂ）細胞毒性剤、放射性同位体、ナノ構造物又はナノエマルジョンと、
を含む、コンジュゲート。
ｂ）細胞毒性剤、放射性同位体、ナノ構造物又はナノエマルジョンと、
を含む、コンジュゲート。
【請求項15】
固形腫瘍、好ましくは、以下の群：乳癌、黒色腫、ブドウ膜黒色腫、膵臓癌、肺癌、前立腺癌、胃癌、頭頸部癌、肉腫、神経膠芽腫、神経芽腫、結腸及び直腸の癌、頭頸部の癌、腎臓癌及び膀胱癌並びに肝癌から選択される腫瘍の治療又はｉｎ ｖｉｖｏ診断のために使用される、請求項１１～１３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、上皮腫瘍及び他のヒトの病状における新しいマーカー及び分子標的としてのＴＡＳ１Ｒ３タンパク質の使用を示す。特に、通常ＴＡＳ１Ｒ３タンパク質を発現する腫瘍に関する治療目的、診断目的及び／又は予後診断目的のマーカーとしてのＴＡＳ１Ｒ３タンパク質及びその発現産物の検出の使用が本発明の重要部分である。
【背景技術】
【0002】
腫瘍性疾患の化学療法では、過去３０年間で大きな進展があった。これには、新しい化学療法剤の開発、より詳細には、薬物の併用投与のためのレジメンの開発における幾らかの進展が含まれる。細胞レベル及び組織レベルでの腫瘍性プロセス並びに基本的な抗腫瘍剤の作用機序がかなり理解されたことで、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、急性白血病、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、ホジキン病及びバーキットリンパ腫を含む多くの腫瘍性疾患の化学療法における進歩を獲得することもできた。しかしながら、腫瘍学の分野での、特に化学療法におけるこれまでの進展にもかかわらず、最も一般的な形態のヒト癌の多くは、現在の化学療法的治療に依然として耐性である。
【0003】
この意味で、あらゆる腫瘍学的治療レジメンにおいてそれが有効であるためには、「全細胞消滅」の概念が重要である。この概念は、効果的な治療レジメンを実現するために、外科的アプローチ若しくは化学療法的アプローチのいずれか又はその両方を通じて、全てのいわゆる「クローン原性」悪性細胞、すなわち、制御不能に成長することで、除去可能であった任意の腫瘍塊に置き換わる能力を有する細胞の全細胞消滅が起こらねばならないという考えである。全細胞除去を実現する治療剤及びレジメンを開発することが最終的に必要とされるため、或る特定の腫瘍型は、他の腫瘍型よりも療法に対してより感受性が高かった。例えば、軟部組織腫瘍（例えば、リンパ腫）並びに血液及び造血器官の腫瘍（例えば、白血病）は、一般的に、癌腫等の固形腫瘍よりも化学療法により十分に応答している。化学療法に対する軟部腫瘍の感受性に関する１つの理由は、化学療法介入におけるリンパ腫及び白血病細胞へのより高い物理的アクセス可能性である。平たく言えば、殆どの化学療法剤は、固形腫瘍塊の全ての細胞に到達する方が、軟部腫瘍に到達するよりもはるかに困難であり、したがって、固形腫瘍の場合に、全細胞破壊を実現することははるかに困難である。これに関して、そのような腫瘍、つまり固形腫瘍を治療するためには、化学療法剤の用量が著しく増加し、副作用が引き起こされることから、一般的に療法の全体的な有効性は制限される。
【0004】
したがって、固形腫瘍を治療することができる満足のいく抗腫瘍剤を開発する方略には、腫瘍細胞を選択的に殺傷する一方で、正常組織に対して、あるとしても比較的少ない有害作用しか及ぼさない作用物質の設計が必要とされる。腫瘍性組織と正常組織との間には質的な違いが殆どないため、この目的を達成することは困難であった。このため、近年では、化学療法及び診断の両方のために、免疫学的標的として用いることができる腫瘍特異的な「マーカー抗原」を特定する試みに多くの努力が充てられている。この意味で、本発明は、原発性腫瘍及び播種性細胞の両方の腫瘍細胞の細胞膜における発現が異なる新しいバイオマーカーを提供することによってこの側面に対処している。さらに、このバイオマーカーの発現は、腫瘍細胞のより侵襲性が高い腫瘍形成能力に関連しており、この発現は、特に栄養が存在しない条件下で増加するため、このバイオマーカーを癌の診断／予後診断のために使用することができる。最後に、そのバイオマーカーは膜受容体であるので、細胞増殖並びに細胞の移動能力、侵入能力及び播種能力を停止させる標的療法薬、例えば小分子、ペプチド又はアンタゴニスト等のリガンドを設計することが可能である。そのた
め、過去には、固形腫瘍の癌細胞を選択的に標的化するために免疫毒素が使用されてきた。免疫毒素は、特異的な標的剤、典型的には腫瘍に対する抗体又はそのフラグメントと、毒素部分等の細胞毒性剤とのコンジュゲートである。標的剤は、標的抗原を有する細胞に毒素を誘導して、そのような細胞を殺傷するように設計されている。一方で、脱グリコシル化リシンＡ鎖を使用する免疫毒素等の「第２世代」の免疫毒素は、免疫毒素の肝臓への取り込みを防ぎ、肝毒性を軽減するように開発され（非特許文献１）、より高いｉｎ ｖｉｖｏ安定性を免疫毒素に与えるために新しい架橋を伴う免疫毒素が開発された（非特許文献２）。免疫毒素は、マウス（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）だけでなくヒト（非特許文献５）においてもリンパ腫及び白血病の治療に有効であることが示された。したがって、本発明は、免疫毒素の合成のために有用な、本発明のバイオマーカーに対する特異的な標的剤を提供する。
め、過去には、固形腫瘍の癌細胞を選択的に標的化するために免疫毒素が使用されてきた。免疫毒素は、特異的な標的剤、典型的には腫瘍に対する抗体又はそのフラグメントと、毒素部分等の細胞毒性剤とのコンジュゲートである。標的剤は、標的抗原を有する細胞に毒素を誘導して、そのような細胞を殺傷するように設計されている。一方で、脱グリコシル化リシンＡ鎖を使用する免疫毒素等の「第２世代」の免疫毒素は、免疫毒素の肝臓への取り込みを防ぎ、肝毒性を軽減するように開発され（非特許文献１）、より高いｉｎ ｖｉｖｏ安定性を免疫毒素に与えるために新しい架橋を伴う免疫毒素が開発された（非特許文献２）。免疫毒素は、マウス（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）だけでなくヒト（非特許文献５）においてもリンパ腫及び白血病の治療に有効であることが示された。したがって、本発明は、免疫毒素の合成のために有用な、本発明のバイオマーカーに対する特異的な標的剤を提供する。
【0005】
さらに、本発明で詳述されるバイオマーカー等の新しいバイオマーカーの特定は、診断目的及び予後診断目的の両方ための個別化医療の開発だけでなく、標的療法の選択及び治療のモニタリングのためにも極めて有用である。個別化医療は、各腫瘍が特有のものであり、時間とともに動的変化するという前提に基づくため、常に最良の治療アプローチを決定することができるツールがあることが重要である。個別化医療の分野では、リキッドバイオプシーがその決定的な役割のため際立っている。今日では、腫瘍は、細胞の増殖機序及び生存機序に影響を及ぼす遺伝子改変が出現するだけでなく、それらの分子組成が複雑かつ不均一であることに起因することが知られている。一方で、癌が診断されたら、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質のプロファイルを分析することによって、原発性腫瘍か又はその転移であるかを特徴付けねばならない。同じ腫瘍内にも腫瘍の進化及び様々な療法に対する耐性を示す種々の腫瘍クローンが共存するため、「動的腫瘍」という用語が作られた。動的腫瘍は、時間の経過に伴って変動を受けやすく、最も有効な治療方略を選択するには、各時点での優勢なクローンを突き止めることが重要である。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の診断は、通常、感度が良いが特異的な技術ではないＣＴスキャンによって行われるが、それには侵襲的手順（生検）による追加の追跡調査が必要とされるため、臨床診療には画像診断に添えられた情報を提供する新しいバイオマーカーだけでなく、生検のような侵襲的手順を適用する必要なく情報を提供することができるバイオマーカーも必要とされる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Blakey et al., 1987a; b
【非特許文献2】Thorpe et al., 1988
【非特許文献3】Ghetie et al., 1991
【非特許文献4】Griffin et al., 1988a; b
【非特許文献5】Vitetta et al., 1991
【発明の概要】
【0007】
本発明において、癌の診断、モニタリング及び療法における適用のためのバイオマーカーとしてのＴＡＳ１Ｒ３受容体の使用が初めて記載されている。この意味で、本発明の著者らは、ＴＡＳ１Ｒ３が、腫瘍学において興味深く、疾患の診断のために有用であり、それに関連した情報を提供することで進化をモニタリングし、治療を選択し、選択的に治療分子を誘導することを可能にするバイオマーカーであることを実証した。この受容体に対する療法を特定することが可能であること、そして原発性腫瘍細胞、播種性腫瘍細胞及び転移性腫瘍細胞における細胞内蓄積が非常に効率的に観察されるコンジュゲート及びナノ粒子等の薬物制御放出系を誘導することが可能であることも確かめられた。一方で、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）におけるＴＡＳ１Ｒ３の存在も実証された。循環腫瘍細胞は、原発性腫瘍によって血流に放出された腫瘍細胞であり、転移の生成における重要な要因と見なさ
れているため、その早期段階での検出は転移の早期検出因子としての役割を果たし、疾患のモニタリング及び薬物への応答の評価においても有用である。
れているため、その早期段階での検出は転移の早期検出因子としての役割を果たし、疾患のモニタリング及び薬物への応答の評価においても有用である。
【0008】
総合的に言えば、この発見により、腫瘍細胞に向かう、特にＣＴＣ（循環腫瘍細胞）及び原発性腫瘍細胞、播種性腫瘍細胞又は転移性腫瘍細胞に向かう薬理学的媒介物及び／又は診断用媒介物として使用するために、ＴＡＳ１Ｒ３受容体に対するリガンドとして作用する化合物、好ましくは、ＴＡＳ１Ｒ３受容体に結合することができる抗体、抗体フラグメント、アプタマー、ペプチド、又は低分子量疎水性分子若しくはラクチゾール等の低分子量親水性分子からなる群より選択されるリガンドによる任意の種類の分子の機能付与（functionalization：官能化）だけでなく、リガンド－薬物コンジュゲート又はリガンド
－放射性同位体コンジュゲート、又は反応性基で機能付与されたリガンドにもつながる。
－放射性同位体コンジュゲート、又は反応性基で機能付与されたリガンドにもつながる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】ＣＴＣの生物学を解釈するための差次的発現のためのインジェヌイティパスウェイアナリシス（ＩＰＡ）ソフトウェアを使用したバイオインフォマティクス解析を示す図である。上の画像：主要なネットワーク、分子機能及び細胞機能と共に、主要なカノニカルパスウェイ及び対応するｐ値。下の画像：ＣＴＣの発現プロファイルによる、細胞移動経路、脂質代謝及び炭水化物についての相互作用ネットワーク。
【図2】健康なドナー（ｎ＝１６）のコントロール群と比較した、転移性非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者（ｎ＝４２）から分離された循環腫瘍細胞におけるＴＡＳ１Ｒ３発現の検証を示す図である。
【図3】非腫瘍コントロール組織（ｎ＝６）に対する転移性肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者由来の腫瘍組織におけるＴＡＳ１Ｒ３発現を示す図である。
【図4】Ｕ８７系統の値を基準にした、結腸腫瘍（ＳＷ６２０及びＳＷ４８０）、肺腫瘍（Ａ５４９及びＨ１７５５）、神経膠芽腫（Ｕ８７及びＵ１１８）及び膵臓腫瘍（ＭｉａＰａＣａ２）の種々の腫瘍型の異なる細胞系統におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体（ｍＲＮＡ）の相対的発現（Ｐ値＝０．０００１）を示す図である。
【図5】様々な起源の腫瘍細胞のパネルにおける免疫蛍光法によるＴＡＳ１Ｒ３発現の研究（核の周りのより明るい点状のシグナル）を示す図である（Ａ）。免疫蛍光法により、原発性腫瘍から分離された結腸細胞（ＳＷ４８０）に対して、転移性起源の結腸細胞（ＳＷ６２０）において対象のタンパク質であるＴＡＳ１Ｒ３がより多く発現（明るいシグナル）していることが明らかとなる（Ｂ）。細胞核はＤＡＰＩで染色されている。
【図6】高グルコース濃度及び低グルコース濃度を有する培地で培養されたＳＷ６２０細胞におけるＴＡＳ１Ｒ３発現を示す図である。ＲＴ－ＰＣＲ（Ａ）。ウエスタンブロットによるタンパク質発現のデンシトメトリー分析（Ｂ）。
【図7】高グルコース濃度及び低グルコース濃度を有する培地で培養されたＳＷ６２０細胞系統の細胞増殖（Ａ）アッセイ及びコロニー形成（Ｂ）アッセイ（データは、１５日間培養を続けた４００個の播種細胞の数に相当する）を示す図である。
【図8】コントロール（低グルコース濃度を有する培地で培養されたＳＷ６２０）と比較した、細胞をラクチゾールと９日間接触させた場合の受容体のＲＴ－ＰＣＲを示す図である（Ａ）。低グルコース濃度を有する培地においてラクチゾールの濃度を増加させて（０．４４ｍｇ／ｍＬ～７ｍｇ／ｍＬ）７２時間培養されたＳＷ６２０細胞の細胞増殖を示す図である（Ｂ）。１５日間の培養後の、コントロールＳＷ６２０細胞又は３．５ｍｇ／ｍＬの濃度でラクチゾールリガンドと接触させたＳＷ６２０細胞のコロニー形成を示す図である（Ｃ）。ラクチゾールで処理されたＳＷ６２０細胞（３．５ｍｇ／ｍＬで７２時間、矢印は染色を認めることができる細胞を示す）における、細胞老化の指標となるβ－ガラクトシダーゼ染色を示す図である（Ｄ）。種々のグルコース濃度（高及び低）及びラクチゾール（３．５ｍｇ／ｍｌ）に９日間曝露した場合のＳＷ６２０細胞における腫瘍進行に関与する種々のタンパク質の発現を示すウエスタンブロットを示す図である（Ｅ）。種々の受容体リガンド（グルコース、シクラメート、ブラゼイン及びラクチゾール）を補充したＤＭＥＭ培地で培養されたＳＷ６２０細胞の細胞増殖（ｐ値＜０．０００１）を示す図である（Ｆ）。
【図9】４時間インキュベートされた、ＤｉＲで標識されたラクチゾールで機能付与されたスフィンゴミエリンナノエマルジョン（Ｏ：ＳＭ：Ｌａｃｔ １：０．１：０．１）の、より高いＴＡＳ１Ｒ３の発現を有するＳＷ６２０（低グルコース濃度で培養された）又はより低いＴＡＳ１Ｒ３の発現を有するＳＷ６２０（高グルコース濃度で培養された）における内部移行を示す図である。機能付与ナノエマルジョンを受容体の発現がより高い細胞と一緒にインキュベートした場合に、蛍光の強度はより大きくなる。細胞核はＤＡＰＩで染色されており、最も明るいシグナルは、ナノエマルジョン内に封入されたＤｉＤに起因する。
【図10】オレイン酸とスフィンゴミエリンとの白色のナノエマルジョン（ＮＥ）及びラクチゾールで機能付与されたオレイン酸とスフィンゴミエリンとのナノエマルジョン（Ｆ－ＮＥ）又は抗腫瘍薬のエトポシドを封入したナノエマルジョンで処理した後の、４８日間のインキュベート後の結腸腫瘍細胞（ＳＷ６２０）の細胞生存率（ＭＴＴアッセイ）（ｐ値、＊＊＊＊＝０．０００１、＊＊＊＝０．００１）を示す図である。
【図11】ヒト抗ＴＡＳ１Ｒ３ポリクローナル抗体（参照ｓｃ５０３５３、SCBT社）で機能付与された蛍光量子ドット（赤）の内部移行を示す図である。量子ドットは３７℃で１時間インキュベートされた。ＴＡＳ１Ｒ３受容体の標識（緑色）は、量子ドットとの共局在を調べるために行われた。細胞核はＤＡＰＩで染色されている。
【図12】ＴＡＳ１Ｒ３受容体及びそのリガンドの図である。
【図13】ＣＴＣの検出及び遺伝子発現プロファイルを示す図である。進行期の非小細胞肺癌患者から免疫技術によって分離されたＣＴＣの遺伝子発現プロファイルのためのワークフロー図である。患者（ｎ＝１０）とコントロール（ｎ＝４）との間で発現が異なる遺伝子（ＣＴＣの特定の遺伝子）の階層的グループ化を示す図である。患者の群とコントロールの群との間の遺伝子発現の違いを示すマイクロアレイの有意性分析（マイクロアレイの有意性分析（ＳＡＭ））の結果のグラフを示す図である。強調表示された点は、コントロール群と比較して患者の群の方で発現レベルが増加した統計学的に有意な遺伝子に対応し、それは転移性肺癌のＣＴＣの集団を特徴付けているとみなされる。
【図14】カプラン・マイヤー曲線を示す図である。該カプラン・マイヤー曲線は、４２人の非小細胞肺癌患者のＣＴＣ試料における高レベル又は低レベル／中レベルのＴＡＳ１Ｒ３の存在に基づく全生存期間に関連している。患者の全生存（ＯＳ）時間は、化学療法手順の開始から患者の死亡まで間の経過時間として定められた。ＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現値が低い患者ほど生存期間が長くなることが観察された（値≧－７．５、カットオフポイントはＴＡＳ１Ｒ３の発現値の平均に設定された）。データ分析は、統計分析パッケージＳＰＳＳを使用して実施した。
【発明を実施するための形態】
【0010】
定義
本発明では、「ＴＡＳ１Ｒ３受容体」は、味蕾においてだけでなく、肝臓及び膵臓等の他の組織並びに腫瘍細胞においても発現される味覚Ｇタンパク質共役型膜貫通受容体として理解される。この受容体には、ＨＧＮＣ：１５６６１（ＮＣＢＩ Ｖｅｇａ：ＯＴＴＨＵＭＧ０００００００３０７１）、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：８３７５６、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１６９９６２、ＯＭＩＭ：６０５８６５、ｏ ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ７ＲＴＸ０等の多くの参照が存在する。該受容体は、ＴＡＳ１Ｒ１受容体又はＴＡＳ１Ｒ２とヘテロ二量体を形成し、種々のアミノ酸、グルコース等によって活性化される甘味又はうま味の検出器として機能することが分かっている。ＴＡＳ１Ｒ３受容体及びそのリガンドの図に関する図１２を参照。
本発明では、「ＴＡＳ１Ｒ３受容体」は、味蕾においてだけでなく、肝臓及び膵臓等の他の組織並びに腫瘍細胞においても発現される味覚Ｇタンパク質共役型膜貫通受容体として理解される。この受容体には、ＨＧＮＣ：１５６６１（ＮＣＢＩ Ｖｅｇａ：ＯＴＴＨＵＭＧ０００００００３０７１）、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：８３７５６、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１６９９６２、ＯＭＩＭ：６０５８６５、ｏ ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ７ＲＴＸ０等の多くの参照が存在する。該受容体は、ＴＡＳ１Ｒ１受容体又はＴＡＳ１Ｒ２とヘテロ二量体を形成し、種々のアミノ酸、グルコース等によって活性化される甘味又はうま味の検出器として機能することが分かっている。ＴＡＳ１Ｒ３受容体及びそのリガンドの図に関する図１２を参照。
【0011】
本発明では、ＴＡＳ１Ｒ３受容体のためのリガンドは、単糖及び二糖、スクラロース、シクラメート、ネオエスペリジン、ジヒドロカルコン及び誘導体等の人工甘味料、ラクチ
ゾール及び誘導体等の甘味阻害剤、ブラゼイン等のタンパク質又はその断片、並びに抗体、抗体のフラグメント、ペプチド、アプタマー、小分子、タンパク質等の選択系によって特に設計された他の分子等のＴＡＳ１Ｒ３受容体と相互作用することができる分子であると理解される。
ゾール及び誘導体等の甘味阻害剤、ブラゼイン等のタンパク質又はその断片、並びに抗体、抗体のフラグメント、ペプチド、アプタマー、小分子、タンパク質等の選択系によって特に設計された他の分子等のＴＡＳ１Ｒ３受容体と相互作用することができる分子であると理解される。
【0012】
本発明では、「リガンドとのコンジュゲート」は、リガンド及び治療活性を有する分子（薬物、放射性医薬品等）又は診断用分子（放射性同位体、キレート剤、ガドリニウム、蛍光体等）を含む化学的コンジュゲートである。
【0013】
本発明では、「反応性基で機能付与されたリガンド」は、化学反応若しくは生化学反応においてその後に使用され得る又は他の分子のその後の結合若しくは選択的相互作用のための反応性基が存在するように化学修飾されたリガンドを意味する。
【0014】
本明細書で使用される場合に、「患者から単離された生体試料」という用語は、生体腫瘍試料を指すか又は定型的な臨床プロトコルで診断に使用するための定型的な外科的手順によって摘出された腫瘍組織を含む。さらに、この用語は、腫瘍組織又は循環腫瘍細胞又は腫瘍によって放出された物質を含む任意の組織又は血液、血清若しくは血漿から単離された生体試料を包含すると理解される。
【0015】
本明細書で使用される場合に、「組織病変」という用語は、組織内に腫瘍細胞が存在することを指す。
【0016】
本明細書で使用される場合に、「ＴＡＳ１Ｒ３発現の測定」という用語は、上記タンパク質又はＲＮＡ等のその発現産物のいずれかの発現を評価することができるプライマー、抗体又は任意の他のシステムに関連する。
【0017】
本明細書で使用される場合に、「患者」という用語は、好ましくはヒトを指す。しかしながら、患者は、非霊長類哺乳動物（例えば、ウマ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウシ又はブタ）及び霊長類哺乳動物（例えば、サル）を含む哺乳動物を指し得る。
【0018】
本明細書で使用される場合に、「分子マーカー／腫瘍バイオマーカー」という用語は、癌の生体マーカー、すなわち、腫瘍又はその存在に密接に関連する間質細胞によって産生され、腫瘍細胞によって冒された腫瘍病変の状態についての臨床的に関心が持たれる情報を提供する１つ以上の物質を指す。また「分子マーカー／腫瘍バイオマーカー」とは、癌の生体マーカー、すなわち、腫瘍又はその存在に密接に関連する間質細胞によって産生され、受容体リガンド、好ましくはコンジュゲートの形のリガンドの使用によって上記細胞に向けて療法薬を誘導する可能性をもたらす１つ以上の物質を意味する。
【0019】
ＴＡＳ１Ｒ３発現レベルの測定は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＯＮＡ、イムノブロッティング、免疫蛍光法又は免疫組織化学、フローサイトメトリー及びアプタヒストケミストリー（aptahistochemistry）等の免疫学的技術によって行われ得る。イムノブロッティングは、変性条件下でのゲル電気泳動によって事前に分離され、特異的抗体及び現像系（例えば化学発光）と一緒にインキュベートすることによって、一般的にニトロセルロース膜上に固定化されたタンパク質の検出に基づく。免疫蛍光分析では、発現の分析のための標的タンパク質に特異的な抗体の使用が必要とされる。ＥＬＩＳＡ及びＥＬＯＮＡは、酵素で標識された抗原、抗体又はアプタマーの使用に基づくため、標的抗原と標識抗体との間で形成されたコンジュゲートは、酵素的に活性な複合体の形成をもたらす。構成要素の１つ（抗原又は標識抗体又はアプタマー）が支持体上に固定化されているので、抗原－抗体／アプタマー複合体は支持体上に固定化され、こうして、酵素によって、例えば分光光度法又は蛍光光度法により検出可能な産物に変換される基質を添加することによって検出す
ることができる。
ることができる。
【0020】
免疫学的方法を使用する場合に、標的タンパク質の量を検出するために高い親和性で標的タンパク質に結合することが知られている抗体又はアプタマー等の任意の試薬を使用することができる。しかしながら、抗体、例えばポリクローナル血清、ハイブリドーマ上清又はモノクローナル抗体、抗体のフラグメント、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ及びヒト化抗体の使用が好ましい。一方で、タンパク質発現レベルの測定は、現在の技術水準においてよく知られる免疫組織化学的技術によって行うことができる。免疫組織化学及び／又は適切な組織化学による測定を行うために、試料は新鮮な試料、凍結された試料又はパラフィン包埋試料及びホルマリン型の保護剤を使用して固定された試料であってもよい。免疫組織化学的測定のためには、ＴＡＳ１Ｒ３に特異的な抗体又はアプタマーで試料を染色し、染色された細胞の度数及び染色強度が測定される。典型的に、試料には、染色された細胞の度数（０から４の間で変化する値）及び染色された各細胞での強度の度数（０から４の間で変化する値）に基づいて計算される全体の発現の指標となる値が割り当てられる。発現値を試料に割り当てるための典型的な基準は、例えば、Handbook of Immunohistochemistry and In Situ Hybridization in Human Carcinomas, M. Hayat E d., 2004, Academic Pressにお
いて詳細に記載されている。さらに、免疫組織化学により、癌組織に存在するどの細胞型が、マーカー発現のレベルに変化を示す細胞であるかを特定することが可能となる。好ましくは、免疫組織化学的検出は、ポジティブマーカー及びネガティブマーカーとして機能する細胞試料と並行して行われ、参照として、分析されている腫瘍と同じ起源の健康な組織を使用することができる。バックグラウンドコントロールを使用することも一般的である。
いて詳細に記載されている。さらに、免疫組織化学により、癌組織に存在するどの細胞型が、マーカー発現のレベルに変化を示す細胞であるかを特定することが可能となる。好ましくは、免疫組織化学的検出は、ポジティブマーカー及びネガティブマーカーとして機能する細胞試料と並行して行われ、参照として、分析されている腫瘍と同じ起源の健康な組織を使用することができる。バックグラウンドコントロールを使用することも一般的である。
【0021】
多数の試料が分析されるべきである場合（例えば、同じ患者からの幾つかの試料又は異なる患者からの試料が分析されるべきである場合）に、マトリックス形式及び／又は自動化された手順の使用が可能である。一実施形態では、種々の技術を使用して得ることができる組織マイクロアレイ（組織マイクロアレイすなわちＴＭＡ）の使用が可能である。マイクロアレイの一部である試料を、免疫組織化学、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ、ＲＮＡ分析又はＤＮＡ分析、形態検査、及び上記のいずれかの組合せを含む種々の様式で分析することができる。組織マイクロアレイを処理する方法は、例えばKonenen, J. et al.（Nat. Med. 1987, 4: 844-7）に記載されている。組織マイクロアレイは、パラフィンに包埋された組織試料からの直径０．６ｍｍ～２ｍｍの円柱状コアから調製され、単一のレシピエントブロック中に再び包埋される。こうして、多数の試料からの組織を、単一のパラフィンブロック中に挿入することができる。ＴＡＳ１Ｒ３の発現レベルの測定は、癌被験体からの生検試料における腫瘍組織のコレクションで測定されたＴＡＳ１Ｒ３発現レベルの中央値に対応する参照値と相関させる必要がある。上記参照試料は、典型的には、被験体の集団からの等量の試料を混ぜ合わせることにより得られる。一般に、典型的な参照試料は、臨床的に十分に記録に残されており、疾患が通常の方法（直腸指診、便中の潜血検査、Ｓ状結腸鏡検査、大腸内視鏡検査、生検、癌胎児性抗原等の腫瘍マーカーの測定、超音波、ＣＴ、核磁気共鳴、陽電子放出断層撮影）の１つによって十分に特徴付けられている被験体から得られる。そのような試料では、バイオマーカーの通常の（参照の）濃度は、例えば参照集団全体の平均濃度を得ることによって測定することができる。マーカーの参照濃度を測定する場合に、幾つかの検討事項が考慮に入れられる。そのような検討事項には、関係する試料の種類（例えば、組織又はＣＳＦ）、患者の年齢、体重、性別、全身健康状態等が含まれる。例えば、少なくとも２体、少なくとも１０体、少なくとも１００体ないし、好ましくは１０００体を超える被験体の同量の群が参照群として採用され、好ましくは、例えば様々な年齢カテゴリーの上記検討事項に従って分類される。参照レベルが導き出される元の試料のコレクションは、好ましくは、研究対象の患者と同じ型の癌に罹患している被験体から構成される。
【0022】
この中央値又は閾値が設定されたら、この中央値を有する患者の腫瘍組織中で発現されるこのマーカーのレベルを比較し、こうして「増加」又は「減少」した発現レベルに割り当てることができる。被験者間のばらつき（例えば、年齢、人種等に関連する側面）のため、ＴＡＳ１Ｒ３発現の絶対的な参照値を確立することは（実際には不可能ではないにしても）非常に困難である。したがって、特定の実施形態では、「増加」又は「減少」したＴＡＳ１Ｒ３の発現についての参照値は、疾患が上述の方法の１つによって十分に記録に残されている被験体における１つ以上の単離された試料においてＴＡＳ１Ｒ３発現レベルを試験することを含む慣例的な手段によってパーセンタイルを計算することによって決定される。次いで、「減少」したＡＰＴＸのレベルを、好ましくは、ＴＡＳ１Ｒ３発現レベルが正常な集団における５０パーセンタイル以下である試料、例えば正常な集団における６０パーセンタイル以下、正常な集団における７０パーセンタイル以下、正常な集団における８０パーセンタイル以下、正常な集団における９０パーセンタイル以下、正常な集団における９５パーセンタイル以下であることを含む発現レベルの試料に割り当てることができる。次いで、「増加」したＴＡＳ１Ｒ３のレベルを、好ましくは、ＴＡＳ１Ｒ３発現レベルが正常な集団における５０パーセンタイル以上である試料、例えば正常な集団における６０パーセンタイル以上、正常な集団における７０パーセンタイル以上、正常な集団における８０パーセンタイル以上、正常な集団における９０パーセンタイル以上、正常な集団における９５パーセンタイル以上であることを含む発現レベルの試料に割り当てることができる。本明細書で使用される「増加したＴＡＳ１Ｒ３の発現レベル」という用語は、参照試料に見られるよりも高いＴＡＳ１Ｒ３のレベルを指す。特に、発現レベルが、参照試料に対して、患者から単離された試料に対して、少なくとも１．１倍、１．５倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍又はそれ以上である場合に、試料は、増加したＴＡＳ１Ｒ３発現レベルを有するとみなすことができる。
【0023】
発明の詳細な説明
本発明の著者らは、ＣＴＣ（循環腫瘍細胞）（実施例１を参照）及び腫瘍において、新しい受容体であるＴＡＳ１Ｒ３（味覚の受容体）を特定し、その受容体の発現がグルコースの存在に応じて変化し、原発性腫瘍細胞、播種性腫瘍細胞又は転移性腫瘍細胞の存在に関連していることを突き止めた。
本発明の著者らは、ＣＴＣ（循環腫瘍細胞）（実施例１を参照）及び腫瘍において、新しい受容体であるＴＡＳ１Ｒ３（味覚の受容体）を特定し、その受容体の発現がグルコースの存在に応じて変化し、原発性腫瘍細胞、播種性腫瘍細胞又は転移性腫瘍細胞の存在に関連していることを突き止めた。
【0024】
この意味で、図２～図５から分かるように、健康なドナーのコントロール群（ｎ＝１６）と比較して、転移性肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者（ｎ＝４２）から分離された循環腫瘍細胞では、ＴＡＳ１Ｒ３の発現がより高いこと（図２）、非腫瘍コントロール組織（ｎ＝６）に対して、転移性肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者の腫瘍組織におけるＴＡＳ１Ｒ３の発現がより高いこと（図３）、そして種々の腫瘍型の異なる細胞系統、すなわち結腸腫瘍（ＳＷ６２０及びＳＷ４８０）、肺腫瘍（Ａ５４９及びＨ１７５５）、神経膠芽腫（Ｕ８７及びＵ１１８）及び膵臓腫瘍（ＭｉａＰａＣａ２）においてＴＡＳ１Ｒ３受容体が発現すること（図４）が検証された。同様に、ＴＡＳ１Ｒ３の発現を、原発性腫瘍の分離された結腸細胞（ＳＷ４８０）と比較して、種々の起源の腫瘍細胞のパネル、特に転移性起源由来の結腸細胞（ＳＷ６２０）において免疫蛍光法によって研究した。
【0025】
これらのデータは、図２及び図３が非腫瘍コントロール組織に対する腫瘍細胞における発現レベルの明確な違いを示していることを考慮して、このバイオマーカーの診断能力を裏付けていると共に、より低いレベルのＴＡＳ１Ｒ３受容体発現を伴う患者においてより良好な全生存期間を示す図１４の結果に基づいて、その予後診断能力を裏付けている。
【0026】
したがって、本発明は、組織又は血液、血清若しくは血漿の試料等の生体試料における原発性腫瘍細胞、播種性腫瘍細胞又は転移性腫瘍細胞の存在を検出することができる新し
い予後診断／診断用の腫瘍バイオマーカーに関する。また、本発明は、組織又は血清若しくは血漿の血液試料等の生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３発現レベルを検出して、上記組織又は生体試料における原発性、播種性又は転移性のいずれかの腫瘍細胞の病変又は存在を診断することに関する。上記情報はまた予後診断的価値も有する。それというのも、転移性腫瘍細胞の同定又は組織又は血清若しくは血漿の血液試料等の生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３のレベル及び／又は濃度と、健康な個体又は健康な器官若しくは組織の一部からの生体試料又は腫瘍病変を有しない生体試料における又は参照値からのＴＡＳ１Ｒ３受容体のレベル及び／又は濃度との比較により、癌に罹患している患者の全生存（ＯＳ）期間についての情報等の個体の予後診断において有用な情報を提供するからである。この意味で、ＴＡＳ１Ｒ３の発現の測定及びＴＡＳ１Ｒ３を発現する細胞型の特定によって、腫瘍細胞により冒された組織の病変を予測することが可能となる。さらに、ＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベルにより、転移性腫瘍細胞が示唆する病変の可能性を予測することができるため、明らかな予後診断的価値が得られる。
い予後診断／診断用の腫瘍バイオマーカーに関する。また、本発明は、組織又は血清若しくは血漿の血液試料等の生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３発現レベルを検出して、上記組織又は生体試料における原発性、播種性又は転移性のいずれかの腫瘍細胞の病変又は存在を診断することに関する。上記情報はまた予後診断的価値も有する。それというのも、転移性腫瘍細胞の同定又は組織又は血清若しくは血漿の血液試料等の生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３のレベル及び／又は濃度と、健康な個体又は健康な器官若しくは組織の一部からの生体試料又は腫瘍病変を有しない生体試料における又は参照値からのＴＡＳ１Ｒ３受容体のレベル及び／又は濃度との比較により、癌に罹患している患者の全生存（ＯＳ）期間についての情報等の個体の予後診断において有用な情報を提供するからである。この意味で、ＴＡＳ１Ｒ３の発現の測定及びＴＡＳ１Ｒ３を発現する細胞型の特定によって、腫瘍細胞により冒された組織の病変を予測することが可能となる。さらに、ＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベルにより、転移性腫瘍細胞が示唆する病変の可能性を予測することができるため、明らかな予後診断的価値が得られる。
【0027】
したがって、本発明の第１の態様は、患者における腫瘍の病変又は存在（腫瘍性又は転移性の病変又は存在）を予測する又はｉｎ ｖｉｔｒｏで診断する方法であって、以下の工程：
ａ）患者から単離された少なくとも１つの生体試料、好ましくは血液、血清若しくは血漿の試料又は組織の試料、好ましくは固定された試料、より好ましくはパラフィンに固定及び包埋された試料から始める工程と、
ｂ）細胞型特定技術によって、組織又は血清若しくは血漿の血液試料等の生体試料の細胞におけるＴＡＳ１Ｒ３の発現レベルを測定する工程と、
ｃ）上記発現レベルと、健康な個体又は健康な器官若しくは組織の一部の生体試料又は腫瘍病変を有しない生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値とを比較する工程と、
を含み、健康な個体又は健康な器官若しくは組織の一部の生体試料又は腫瘍病変を有しない生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値と比較して増加した発現レベルが、患者における腫瘍の病変又は存在（腫瘍性又は転移性の病変又は存在）の指標であることを特徴とする、方法に関する。
ａ）患者から単離された少なくとも１つの生体試料、好ましくは血液、血清若しくは血漿の試料又は組織の試料、好ましくは固定された試料、より好ましくはパラフィンに固定及び包埋された試料から始める工程と、
ｂ）細胞型特定技術によって、組織又は血清若しくは血漿の血液試料等の生体試料の細胞におけるＴＡＳ１Ｒ３の発現レベルを測定する工程と、
ｃ）上記発現レベルと、健康な個体又は健康な器官若しくは組織の一部の生体試料又は腫瘍病変を有しない生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値とを比較する工程と、
を含み、健康な個体又は健康な器官若しくは組織の一部の生体試料又は腫瘍病変を有しない生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値と比較して増加した発現レベルが、患者における腫瘍の病変又は存在（腫瘍性又は転移性の病変又は存在）の指標であることを特徴とする、方法に関する。
【0028】
さらに、第２の態様では、本発明は、腫瘍の病変又は存在（腫瘍性又は転移性の病変又は存在）に見舞われている患者の臨床経過をｉｎ ｖｉｔｒｏで予後診断する方法であって、以下の工程：
ａ）患者から単離された少なくとも１つの生体試料、好ましくは血液、血清若しくは血漿の試料又は腫瘍組織の試料、好ましくは固定された試料、より好ましくはパラフィン中に包み込まれ固定された試料から始める工程と、
ｂ）細胞型特定技術によって、組織又は血清若しくは血漿の血液試料等の生体試料の細胞におけるＴＡＳ１Ｒ３の発現を測定する工程と、
ｃ）上記発現レベルと、項目ａ）の生体試料よりも早い時点で得られた同じ患者からの生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値とを比較する工程と、
を含み、項目ａ）の生体試料よりも早い時点で得られた同じ患者からの生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値と比較して増加した発現レベルが、患者の消極的な臨床的進化の指標であることを特徴とする、方法に関する。
ａ）患者から単離された少なくとも１つの生体試料、好ましくは血液、血清若しくは血漿の試料又は腫瘍組織の試料、好ましくは固定された試料、より好ましくはパラフィン中に包み込まれ固定された試料から始める工程と、
ｂ）細胞型特定技術によって、組織又は血清若しくは血漿の血液試料等の生体試料の細胞におけるＴＡＳ１Ｒ３の発現を測定する工程と、
ｃ）上記発現レベルと、項目ａ）の生体試料よりも早い時点で得られた同じ患者からの生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値とを比較する工程と、
を含み、項目ａ）の生体試料よりも早い時点で得られた同じ患者からの生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値と比較して増加した発現レベルが、患者の消極的な臨床的進化の指標であることを特徴とする、方法に関する。
【0029】
患者の消極的な臨床的進化は、好ましくは、５年未満、好ましくは３年未満の推定全生存期間として理解される。
【0030】
さらに、第３の態様では、本発明は、腫瘍の病変又は存在（腫瘍性又は転移性の病変又は存在）に見舞われている患者の臨床的進化のｉｎ ｖｉｔｒｏでモニタリングする方法であって、以下の工程：
ａ）患者から単離された少なくとも１つの生体試料、好ましくは血液、血清若しくは血漿の試料又は腫瘍組織の試料、好ましくは固定された試料、より好ましくはパラフィン中に包み込まれ固定された試料から始める工程と、
ｂ）細胞型特定技術によって、組織又は血液、血清若しくは血漿の試料等の生体試料の細胞におけるＴＡＳ１Ｒ３の発現を測定する工程と、
ｃ）上記発現レベルと、項目ａ）の生体試料よりも早い時点で得られた同じ患者からの生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値とを比較する工程と、
を含み、項目ａ）の生体試料よりも早い時点で得られた同じ患者からの生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値と比較して増加した発現レベルが、患者の消極的な臨床的進化の指標であることを特徴とする、方法に関する。
ａ）患者から単離された少なくとも１つの生体試料、好ましくは血液、血清若しくは血漿の試料又は腫瘍組織の試料、好ましくは固定された試料、より好ましくはパラフィン中に包み込まれ固定された試料から始める工程と、
ｂ）細胞型特定技術によって、組織又は血液、血清若しくは血漿の試料等の生体試料の細胞におけるＴＡＳ１Ｒ３の発現を測定する工程と、
ｃ）上記発現レベルと、項目ａ）の生体試料よりも早い時点で得られた同じ患者からの生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値とを比較する工程と、
を含み、項目ａ）の生体試料よりも早い時点で得られた同じ患者からの生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値と比較して増加した発現レベルが、患者の消極的な臨床的進化の指標であることを特徴とする、方法に関する。
【0031】
さらに、第４の態様では、本発明は、腫瘍の病変又は存在（腫瘍性又は転移性の病変又は存在）に見舞われている患者のｉｎ ｖｉｔｒｏ治療に対する応答をモニタリングする方法であって、以下の工程：
ａ）患者から単離された少なくとも１つの生体試料、好ましくは血液、血清若しくは血漿の試料又は腫瘍組織の試料、好ましくは固定された試料、より好ましくはパラフィンに固定及び包埋された試料から始める工程と、
ｂ）細胞型特定技術によって、組織又は血清若しくは血漿の血液試料等の生体試料の細胞におけるＴＡＳ１Ｒ３の発現を測定する工程と、
ｃ）上記発現レベルと、項目ａ）の生体試料よりも早い時点で得られた同じ患者の生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値とを比較する工程と、
を含み、項目ａ）の生体試料よりも早い時点で得られた同じ患者からの生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値と比較して増加した発現レベルが、患者の治療に対する応答の欠如の指標であることを特徴とする、方法に関する。
ａ）患者から単離された少なくとも１つの生体試料、好ましくは血液、血清若しくは血漿の試料又は腫瘍組織の試料、好ましくは固定された試料、より好ましくはパラフィンに固定及び包埋された試料から始める工程と、
ｂ）細胞型特定技術によって、組織又は血清若しくは血漿の血液試料等の生体試料の細胞におけるＴＡＳ１Ｒ３の発現を測定する工程と、
ｃ）上記発現レベルと、項目ａ）の生体試料よりも早い時点で得られた同じ患者の生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値とを比較する工程と、
を含み、項目ａ）の生体試料よりも早い時点で得られた同じ患者からの生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値と比較して増加した発現レベルが、患者の治療に対する応答の欠如の指標であることを特徴とする、方法に関する。
【0032】
「定義」の節で既に述べたように、本明細書で使用される場合に、「ＴＡＳ１Ｒ３の発現の測定」という用語は、上記タンパク質、例えばアプタマーの発現を評価することができる抗体又は任意の他の系を指す。ＴＡＳ１Ｒ３発現レベルの測定に有用な抗体又はアプタマーを得るために、ヒトＴＡＳ１Ｒ３タンパク質の配列分析を行った。これらのデータから、免疫学的観点から最も適切な配列（Ｎ末端の細胞外領域に存在する）は、以下の通りであると予測することができた：
アセチル－ＬＳＱＱＬＲＭＫＧＤＹＶＬＧＧＣ－アミド（配列番号１）
アセチル－ＥＲＬＫＩＲＷＨＴＳＤＮＱＫＰＶＳＲＣ－アミド（配列番号２）
アセチル－ＬＳＱＱＬＲＭＫＧＤＹＶＬＧＧＣ－アミド（配列番号１）
アセチル－ＥＲＬＫＩＲＷＨＴＳＤＮＱＫＰＶＳＲＣ－アミド（配列番号２）
【0033】
これらのデータに基づいて、異種発現系である大腸菌を使用してペプチドを合成した（アセチル－ＬＳＱＱＬＲＭＫＧＤＹＶＬＧＧＣ－アミド）。得られたタンパク質を、最終純度９０％～９５％で均質になるまで精製して、２ｍｇをＫＬＨとコンジュゲートさせ、３ｍｇをＢＳＡとコンジュゲートさせた。ゲノムコンストラクトの設計は、文献（Maitrepierre et al., 2012）に基づいて行った。同様に、タンパク質の完全性を維持するため
に、保存バッファー配合物の研究を行った（最終配合での界面活性剤及び多糖類の使用を制限する）。得られたバッチをラベル付きの滅菌バイアル中に分注し、使用するまで－８０℃で保存した。４用量及び２用量の５０μｇのペプチドでマウスを数回免疫化した後に、出血を力価測定して、該ペプチドに対する応答の増加を評価した。それらの結果は、マウスが該ペプチドに対して或る程度の応答を生ずるが、非常に低い値で生産の達成を妨げることを示している。
に、保存バッファー配合物の研究を行った（最終配合での界面活性剤及び多糖類の使用を制限する）。得られたバッチをラベル付きの滅菌バイアル中に分注し、使用するまで－８０℃で保存した。４用量及び２用量の５０μｇのペプチドでマウスを数回免疫化した後に、出血を力価測定して、該ペプチドに対する応答の増加を評価した。それらの結果は、マウスが該ペプチドに対して或る程度の応答を生ずるが、非常に低い値で生産の達成を妨げることを示している。
【0034】
したがって、本発明の第１の態様から第４の態様の好ましい実施形態では、組織又は血清若しくは血漿の血液試料等の生体試料の細胞におけるＴＡＳ１Ｒ３の発現の測定は、配列番号１又は配列番号２に結合することができる抗体若しくはそのフラグメント又はアプタマーを用いて行われる。
【0035】
本発明の第１の態様から第４の態様の好ましい実施形態では、本発明は、上記方法の消極的な予測値が８０％より大きく、より好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％より大きいことを特徴とする。すなわち、患者の生体試料中の細胞においてＴＡＳ１Ｒ３の発現が検出されない場合に、上記試料は腫瘍に冒されていないことを意味する。
【0036】
本明細書で使用される場合に、「消極的な予測値」という用語は、疾患（腫瘍細胞によって冒される組織病変）を有しない中の消極的な試験結果を有する場合のパーセンテージを指す。
【0037】
別の好ましい実施形態では、本発明は、患者が固形腫瘍を患っており、好ましくは、以下の群：乳癌、黒色腫、ブドウ膜黒色腫、膵臓癌、肺癌、前立腺癌、胃癌、頭頸部癌、肉腫、神経膠芽腫、神経芽腫、結腸及び直腸の癌、頭頸部の癌、腎臓癌及び膀胱癌並びに肝癌の中から選択される疾患を患っていることを特徴とする。
【0038】
別の好ましい実施形態では、本発明は、工程ｂ）で規定される細胞型特定技術が、以下の群：免疫組織化学、免疫蛍光法、アプタヒストケミストリー及びフローサイトメトリーの中から選択されることを特徴とする。好ましくは、工程ｂ）で規定される細胞型特定のための技術は免疫組織化学であり、より好ましくは、免疫組織化学は、以下の工程：
ｉ）試料を前処理する工程と、
ｉｉ）免疫染色する工程と、
ｉｉｉ）対比染色する工程と、
ｉｖ）免疫染色分析する工程と、
を含む。
ｉ）試料を前処理する工程と、
ｉｉ）免疫染色する工程と、
ｉｉｉ）対比染色する工程と、
ｉｖ）免疫染色分析する工程と、
を含む。
【0039】
別の好ましい実施形態では、本発明は、工程ａ）で規定された組織から既に得られた試料が、以下の群：固定された組織試料、新鮮な組織試料及び凍結された組織又は血液、血清若しくは血漿の試料の中から選択されることを特徴とする。好ましくは、該試料は、固定された組織試料又は血液、血清若しくは血漿の試料である。
【0040】
別の好ましい実施形態では、本発明は、患者が哺乳動物であることを特徴とする。好ましくは、哺乳動物は、以下の群：ヒト、霊長類及び非霊長類から選択される。より好ましくは、患者はヒトである。
【0041】
本発明はまた、本発明の第５の態様では、好ましくは上記の方法において腫瘍バイオマーカーとして使用されるＴＡＳ１Ｒ３に関する。
【0042】
本発明はまた、上記の方法で使用されるキットに関する。
【0043】
本発明の実施形態は、新鮮な組織、固定された組織又は凍結された組織において、フローサイトメトリー、免疫組織化学、免疫蛍光法又は当業者に知られる細胞型の特定を可能にする任意の他の技術によって行われ得る。
【0044】
一方で、ナノ粒子、薬物又は放射性同位体等の分子の選択的な誘導のためのこの受容体の多大な可能性のため、上記受容体と相互作用する内因性でないため競合現象が起こらない分子の存在を本発明者らが知っていることを考慮に入れると、本発明者らは、受容体の幾つかのリガンド、特に幾つかの甘味料を選択することで、それに対する療法薬を設計することが可能であるという仮説を検証した。本発明者らはまた、上記リガンドでナノ構造物を機能付与することで、ＴＡＳ１Ｒ３を発現する腫瘍、例えば原発性腫瘍又は播種性腫
瘍細胞、例えばＣＴＣ（循環腫瘍細胞）及び転移性細胞に向けてそれらを誘導した。本発明者らはまた、ラクチゾール等の幾つかのリガンド又は該リガンドで機能付与されたナノ構造物が、腫瘍の毒性及び増殖に関して治療効果をもたらし得ることも確認した。
瘍細胞、例えばＣＴＣ（循環腫瘍細胞）及び転移性細胞に向けてそれらを誘導した。本発明者らはまた、ラクチゾール等の幾つかのリガンド又は該リガンドで機能付与されたナノ構造物が、腫瘍の毒性及び増殖に関して治療効果をもたらし得ることも確認した。
【0045】
上記の機能付与を実施するために、表２に記載されるリガンドを取得し、それらのリガンドを、共有結合によって疎水性部（例えば、ＬＡＣＴ－Ｃ１６）に連結させた又はインキュベートによって事前に形成されたナノエマルジョン（例えば、ＢＲＡ）上に連結させた。使用されたペプチドの配列及び得られたナノエマルジョンの物理化学的特性を以下で説明する（表２）。
【0046】
【表1】
【0047】
事前の機能付与が行われると、該受容体を発現する細胞（腫瘍細胞）における、ＴＡＳ１Ｒ３に対するリガンドで機能付与されたこれらのナノエマルジョンの高い内部移行能力が確認された。例えば、ラクチゾールで機能付与されたナノエマルジョンの場合に、ナノエマルジョン内に封入されたＤｉＤシグナルは、他の機能付与されていないナノエマルジョンよりも大きかった。さらに、腫瘍細胞が標的受容体をより低い強度で発現した場合に（この場合に、より高いグルコース含有量を有する培地中で培養されたＳＷ６２０細胞におけるＴＡＳ１Ｒ３（低発現、実施例２））、シグナルの強度が減少する（実施例４）ことが確認された。
【0048】
したがって、本発明は、腫瘍細胞の細胞膜、特に播種性腫瘍細胞及び転移性腫瘍細胞の膜において発現されるＴＡＳ１Ｒ３に対するリガンドによるナノシステムの機能付与により、そのナノシステムが強力な治療能力を有する単位となることを実証している。特に、上記ナノシステムは、併用療法の開発のための媒介物として使用され得る。さらに、量子ドット等のナノエマルジョン以外の構造物を機能付与する上記可能性は、本発明の実施例５に記載されている。この発見は、ナノ粒子、ミセル又はリポソーム等の任意の種類のナノシステムについて推定することができる。すなわち、この受容体に対するリガンドは、任意の種類のナノシステムの機能付与に用いられる選択的な媒介物として機能し得る。さらに、この発見は、この受容体に対するリガンドを含む任意のリガンド－薬物コンジュゲート及び／又はリガンド－放射性同位体等の任意の種類の系について推定することができ、上記薬物又は放射性同位体を機能付与する選択的な細胞内媒介物として機能し得る。
【0049】
【表2】
【0050】
したがって、本発明は、リガンドを有する任意の種類のナノ構造物、リポソーム、薬物又は放射性同位体が本発明の受容体に対して機能付与されると、該受容体を発現するこれらの細胞に向かう上記構造物の輸送、特に原発性腫瘍細胞、播種性腫瘍細胞又は転移性腫瘍細胞に向かう輸送が観察されることを実証している。
【0051】
したがって、本発明の第６の態様は、受容体リガンド、好ましくはコンジュゲート又は免疫毒素の形のリガンドの使用により腫瘍細胞に対して療法薬を誘導するための分子マーカー／腫瘍バイオマーカーとしてのＴＡＳ１Ｒ３受容体の使用に関する。免疫毒素は、特異的な標的剤、典型的には腫瘍に対する抗体又はそのフラグメントと、毒素部分等の細胞毒性剤とのコンジュゲートである。標的剤は、標的抗原を有する細胞に毒素を誘導して、そのような細胞を殺傷するように設計されている。
【0052】
したがって、本発明は、本発明の第７の態様では、
特異的な標的剤、典型的には、ＴＡＳ１Ｒ３受容体と相互作用することができる分子、例えば、単糖及び二糖、スクラロース、シクラメート、ネオエスペリジン、ジヒドロカルコン及び誘導体等の人工甘味料、ラクチゾール及び誘導体等の甘味阻害剤、ブラゼイン等のタンパク質、並びに抗体、抗体のフラグメント、ペプチド、アプタマー、小分子、タンパク質等の選択系によって特に設計された他の分子と、
細胞毒性剤、例えば細胞毒性剤又は抗腫瘍薬、放射性同位体、ナノ構造物又はナノエマルジョンと、
のコンジュゲートを提供する。
特異的な標的剤、典型的には、ＴＡＳ１Ｒ３受容体と相互作用することができる分子、例えば、単糖及び二糖、スクラロース、シクラメート、ネオエスペリジン、ジヒドロカルコン及び誘導体等の人工甘味料、ラクチゾール及び誘導体等の甘味阻害剤、ブラゼイン等のタンパク質、並びに抗体、抗体のフラグメント、ペプチド、アプタマー、小分子、タンパク質等の選択系によって特に設計された他の分子と、
細胞毒性剤、例えば細胞毒性剤又は抗腫瘍薬、放射性同位体、ナノ構造物又はナノエマルジョンと、
のコンジュゲートを提供する。
【0053】
本発明の第７の態様の好ましい実施形態では、標的剤は、配列番号１又は配列番号２に結合することができる抗体若しくはそのフラグメント又はペプチド又はアプタマーである。
【0054】
本発明の第８の態様は、治療又はｉｎ ｖｉｖｏ診断で使用される、好ましくは、癌のｉｎ ｖｉｖｏ治療又は診断で使用される、より好ましくは、固形腫瘍、好ましくは、以下の群：乳癌、黒色腫、ブドウ膜黒色腫、膵臓癌、肺癌、前立腺癌、胃癌、頭頸部癌、肉腫、神経膠芽腫、神経芽腫、結腸及び直腸の癌、頭頸部癌、腎臓癌及び膀胱癌並びに肝癌又は播種性細胞若しくは転移性細胞の中から選択される腫瘍の治療又はｉｎ ｖｉｖｏ診断で使用される、本発明の第７の態様のコンジュゲートに関する。
【0055】
発明の詳細な説明及び特許請求の範囲全体を通して、「含む」という語句及びその別形は、他の技術的特徴、添加物、構成要素又は工程を除外することを意図しない。当業者には、本発明の他の課題、利点及び特徴は、一部は発明の詳細な説明から、そして一部は本発明の実際の実施から明らかになるであろう。以下の図面及び実施例は、例示として提供されるものであって、本発明を限定するものとは意図されない。
【実施例0056】
実施例１．腫瘍細胞におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現
転移性肺癌患者のＣＴＣ（循環腫瘍細胞）におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の遺伝子発現の分析を、末梢血試料（患者＝１０、コントロールｎ＝４）から、その分離のために磁性粒子（ＥｐＣＡＭベースのＣＥＬＬｅｃｔｉｏｎ（商標）Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）キット）を使用して、図１３に示される図に従って行った。試料からＲＮＡを抽出した後に、それらのＲＮＡを遺伝子発現アレイにおいてハイブリダイズさせた。シグナルを取り込み、処理することで、患者におけるコントロールと比べて発現が異なる遺伝子のリストを得たところ、その中にＴＡＳ１Ｒ３受容体があった。要約すると、ＣＴＣのトータルＲＮＡを増幅し、相補的ＤＮＡを遺伝子発現マイクロアレイ（Agilent社）においてハイブリダイズさせ、生データを処理することで、品質の基
準を満たす２３９２個の点（７．０１％）が得られた。平均シグナルは６０８８９ユニットであり、患者群及びコントロール群について、それぞれ７６５９７ユニット及び１６９７９ユニットであった。正規化後に、少なくとも８人の患者及び２人のコントロールにおいて、２１１を超える発現を有する１８１０個のプローブを後続の分析のために考慮した。進行性非小細胞肺癌患者から分離されたＣＴＣの集団を特徴付ける遺伝子を、ソフトウェアＭｅＶ ｖ４．７（Ｍｕｌｔｉｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｖｉｅｗｅｒ）（ＴＭ４ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ）を適用することにより特定した。厳しい基準で候補遺伝子を選択するために２つのクラスのマイクロアレイデータ分析（ＳＡＭ）アルゴリズムを使用して有意性を得た。偽発見率（ＦＤＲ）＝０の中央値についてのデルタパラメーターが３．３であると仮定すると、進行ＮＳＣＬＣ患者のＣＴＣの集団を明確に特徴付ける１．５より大きいｌｏｇ２比を有する５２９個のプローブのみを考慮して、２４６１個の遺伝子のリストが示された。有意に発現されたこれらの遺伝子で、ＭｅＶを使用して階層的グループ化（ＨＣＬ）を実施した。距離メトリックとして、ピアソン相関を選択し、ＭｅＶオプションにおいて絶対距離及び完全リンクグループ化パラメーターを使用した。
転移性肺癌患者のＣＴＣ（循環腫瘍細胞）におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の遺伝子発現の分析を、末梢血試料（患者＝１０、コントロールｎ＝４）から、その分離のために磁性粒子（ＥｐＣＡＭベースのＣＥＬＬｅｃｔｉｏｎ（商標）Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）キット）を使用して、図１３に示される図に従って行った。試料からＲＮＡを抽出した後に、それらのＲＮＡを遺伝子発現アレイにおいてハイブリダイズさせた。シグナルを取り込み、処理することで、患者におけるコントロールと比べて発現が異なる遺伝子のリストを得たところ、その中にＴＡＳ１Ｒ３受容体があった。要約すると、ＣＴＣのトータルＲＮＡを増幅し、相補的ＤＮＡを遺伝子発現マイクロアレイ（Agilent社）においてハイブリダイズさせ、生データを処理することで、品質の基
準を満たす２３９２個の点（７．０１％）が得られた。平均シグナルは６０８８９ユニットであり、患者群及びコントロール群について、それぞれ７６５９７ユニット及び１６９７９ユニットであった。正規化後に、少なくとも８人の患者及び２人のコントロールにおいて、２１１を超える発現を有する１８１０個のプローブを後続の分析のために考慮した。進行性非小細胞肺癌患者から分離されたＣＴＣの集団を特徴付ける遺伝子を、ソフトウェアＭｅＶ ｖ４．７（Ｍｕｌｔｉｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｖｉｅｗｅｒ）（ＴＭ４ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ）を適用することにより特定した。厳しい基準で候補遺伝子を選択するために２つのクラスのマイクロアレイデータ分析（ＳＡＭ）アルゴリズムを使用して有意性を得た。偽発見率（ＦＤＲ）＝０の中央値についてのデルタパラメーターが３．３であると仮定すると、進行ＮＳＣＬＣ患者のＣＴＣの集団を明確に特徴付ける１．５より大きいｌｏｇ２比を有する５２９個のプローブのみを考慮して、２４６１個の遺伝子のリストが示された。有意に発現されたこれらの遺伝子で、ＭｅＶを使用して階層的グループ化（ＨＣＬ）を実施した。距離メトリックとして、ピアソン相関を選択し、ＭｅＶオプションにおいて絶対距離及び完全リンクグループ化パラメーターを使用した。
【0057】
差次的発現のゲノム分析も行った。図１に示されるように、遺伝子セットを最初にインジェヌイティパスウェイ（ＩＰＡ）ソフトウェアで分析して、遺伝子ネットワークを生成し、転移性肺癌患者のＣＴＣを特徴付けるシグナル伝達経路の概要を得た。５２９個の有意な遺伝子のうち、３４９個はアノテーションされた遺伝子であったため、ＩＰＡによって識別した。腫瘍細胞の活動的な播種性亜集団と一貫して、ＣＴＣの特定の遺伝子のセットによって表される主な分子機能及び細胞機能は、細胞運動、細胞死、シグナル伝達及び
細胞間相互作用、分子輸送並びに脂質代謝に関連し、それらは主としてＧタンパク質に共役した受容体のシグナル伝達及び補体系の経路によって調整される。遺伝子のリストを、１）接着、細胞運動及び遊走に関連する機能に関してだけでなく、その後に、２）細胞表面上の位置に関してもフィルタリングした。得られた分子はＮｏｃｔｈ１及びＴＡＳ１Ｒ３であった。
細胞間相互作用、分子輸送並びに脂質代謝に関連し、それらは主としてＧタンパク質に共役した受容体のシグナル伝達及び補体系の経路によって調整される。遺伝子のリストを、１）接着、細胞運動及び遊走に関連する機能に関してだけでなく、その後に、２）細胞表面上の位置に関してもフィルタリングした。得られた分子はＮｏｃｔｈ１及びＴＡＳ１Ｒ３であった。
【0058】
次いで、本発明者らは、患者及びコントロールの独立したコホートにおける候補遺伝子の発現の検証を進めた。定量的ＰＣＲを使用して、この受容体の発現レベルが患者において有意に高いことが確認された（図２）。発現値を、非特異的分離マーカーとしてのＣＤ４５（造血細胞マーカー）で正規化した。さらに、この受容体の発現の補足的な検証を、パラフィン包埋された健康な組織及び腫瘍組織の試料で行った（図３）。これを行うために、本発明者らは、パラフィン包埋された試料用の特定の抽出キット（ＲＮｅａｓｙ ＦＦＰＥキット、QIAGEN社）を使用して、それぞれ１４ミクロンの５つのパラフィン切片からＲＮＡ抽出を行った。その濃度を知るために、Ｎａｎｏｄｒｏｐ機器（Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００Ｃ、Thermoscientific社）を使用した。これらのデータを用いて、各試料におけるＲＮＡ濃度の正規化を行い、合計２μｇをヌクレアーゼフリー水で１０μＬの最終容量にした。次いで、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（Appliesbiosystems社）を使用し、ＲＮＡからｃＤＮＡへ
の経過のためにサーマルサイクラー（ｐｅｑ ＳＴＡＲ ９６ＨＰＬ、VWR（商標）社）
を使用した。ｃＤＮＡを取得したら、ＴＡＳ１Ｒ３に特異的なプローブと共にＴａｑｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘと一緒に混合を行った。ＧＡＰＤＨをコントロール又はハウスキーピングとして使用し、ポリメラーゼ連鎖反応をＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓ－Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（AppliedBiosystems（商標）
社）において実施した。
の経過のためにサーマルサイクラー（ｐｅｑ ＳＴＡＲ ９６ＨＰＬ、VWR（商標）社）
を使用した。ｃＤＮＡを取得したら、ＴＡＳ１Ｒ３に特異的なプローブと共にＴａｑｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘと一緒に混合を行った。ＧＡＰＤＨをコントロール又はハウスキーピングとして使用し、ポリメラーゼ連鎖反応をＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓ－Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（AppliedBiosystems（商標）
社）において実施した。
【0059】
マーカーの予後診断値に関する情報を取得するために、ＳＰＳＳ統計パッケージを使用してカプラン・マイヤー生存分析を実施した（図１４）。この方法を適用するために、観測された全ての生存時間を最短から最長の順に並べ、各生存時間について起こった死亡及び中途打ち切りの数を注記する。各期間について生存の確率を計算し、カプラン・マイヤー関数は「経時的に累積された個体の生存確率」である。ＴＡＳ１Ｒ３の発現値がカット－７．５より低いＣＴＣを伴う患者の全生存期間（月単位で測定）は、より高いＴＡＳＲ１３の発現値を有するＣＴＣを伴う患者（暗い線）と比べてより優れている（明るい線）（０．０９のｐ値）。
【0060】
細胞培養物における発現の評価に関しては、ＡＴＣＣ（アメリカ培養細胞系統保存機関）から入手した幾つかの型の細胞系統を使用した（図４）。リンパ節由来の転移性結腸細胞（ＳＷ６２０、ＣＣＬ－２２７）、結腸直腸腺癌上皮細胞（ＳＷ４８０、ＣＣＬ－２２８）、肺癌上皮細胞（Ａ５４９、ＣＣＬ－１８５）及び肝臓由来の転移性肺細胞（Ｈ１７５５、ＣＲＬ－５８９２）、膵臓癌細胞（ＭＩＡ ＰａＣａ－２、ＣＲＬ－１４２０）及び膠芽腫細胞（Ｕ１１８、ＨＴＢ－１５及びＵ８７ＭＧ、ＨＴＢ－１４）を使用した。ＳＷ６２０系統、ＳＷ４８０系統、Ａ５４９系統、Ｕ１１８系統及びＵ８７ＭＧ系統を、ＤＭＥＭ ＨＧ培地（ダルベッコ改変イーグル培地－高グルコース、Sigma-Aldrich社）中
で維持し、Ｈ１７５５系統を、ＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ（商標）、LifeTecnologies社）中で維持し、両者ともウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ（商標）、LifeTecnologies社）が１０％まで補充され、抗生物質（ペニシリン及びストレプトマイシン、Sigma-Aldrich社）が１％まで補充されている。ＴＡＳ１Ｒ３の発現の定量的分析のために、培養物
中の全ての細胞系統から抽出されたＲＮＡから出発して、逆転写酵素を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行った（ＲＴ－ＰＣＲ）。最初に、細胞を定型的にトリプシン処理した後に、ノイバウエルチャンバーを使用してそれらの細胞を計数することで、各系統から５００万個の細胞を分離して、同等の細胞数から開始することができた。ＲＮＡ抽出を、抽出キ
ット（ＧｅｎｅＪＥＴ ＲＮＡ精製キット、ThermoScientic社）を使用して実施し、分析を前段落で説明されたのと同様に実施した。手順が終了したら、データを分析した。発現の結果は図４及び図５に示されている。リンパ節から分離された転移性癌細胞系統（ＳＷ６２０）は、同じ患者の原発性腫瘍の分離された系統ＳＷ４８０と比較して、より大きなその発現を示す。これらの違いは肺腺癌細胞を参照した場合には観察されず、その際、両者の系統は、その起源（肝臓中の転移性肺Ｈ１７５５細胞及び肺癌由来のＡ５４９細胞）にかかわらず、同様の発現レベルを示す。膵臓腺癌細胞系統であるＭｉａＰａＣａ－２は、他の細胞系統（ＳＷ６２０を除く）よりも僅かに高い発現レベルを示す。一方で、神経膠腫系統（Ｕ８７ＭＧ及びＵ１１８）は、該受容体をより少ない程度でしか発現しない。
で維持し、Ｈ１７５５系統を、ＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ（商標）、LifeTecnologies社）中で維持し、両者ともウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ（商標）、LifeTecnologies社）が１０％まで補充され、抗生物質（ペニシリン及びストレプトマイシン、Sigma-Aldrich社）が１％まで補充されている。ＴＡＳ１Ｒ３の発現の定量的分析のために、培養物
中の全ての細胞系統から抽出されたＲＮＡから出発して、逆転写酵素を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行った（ＲＴ－ＰＣＲ）。最初に、細胞を定型的にトリプシン処理した後に、ノイバウエルチャンバーを使用してそれらの細胞を計数することで、各系統から５００万個の細胞を分離して、同等の細胞数から開始することができた。ＲＮＡ抽出を、抽出キ
ット（ＧｅｎｅＪＥＴ ＲＮＡ精製キット、ThermoScientic社）を使用して実施し、分析を前段落で説明されたのと同様に実施した。手順が終了したら、データを分析した。発現の結果は図４及び図５に示されている。リンパ節から分離された転移性癌細胞系統（ＳＷ６２０）は、同じ患者の原発性腫瘍の分離された系統ＳＷ４８０と比較して、より大きなその発現を示す。これらの違いは肺腺癌細胞を参照した場合には観察されず、その際、両者の系統は、その起源（肝臓中の転移性肺Ｈ１７５５細胞及び肺癌由来のＡ５４９細胞）にかかわらず、同様の発現レベルを示す。膵臓腺癌細胞系統であるＭｉａＰａＣａ－２は、他の細胞系統（ＳＷ６２０を除く）よりも僅かに高い発現レベルを示す。一方で、神経膠腫系統（Ｕ８７ＭＧ及びＵ１１８）は、該受容体をより少ない程度でしか発現しない。
【0061】
図５に示される免疫蛍光研究に関して、研究対象の細胞を、試験が行われる１日前に、８ウェルのマイクロチャンバー（ＰＬＣ３０１０８、SPL LifeSciences社）に播種した。２４時間後に、培養培地を吸引により除去し、１×ＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドを用いて室温で１５分間細胞の固定を続けた。それらの細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄した後に、該細胞を０．２％のｔｒｉｔｏｎ １００Ｘを用いて室温で１０分間透過処理した。ｔｒｉｔｏｎを洗い流した後に、一次抗体の抗ヒト（ウサギ）（MBiosource社）を０．２％ＢＳＡ（１×ＰＢＳ中に１：１０００希釈で溶解）中でインキュベートし、プレートを室温で１時間インキュベートした。次いで、一次抗体を洗浄し、蛍光体（抗体に応じてＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４８８又は５９４）で標識された抗ウサギ二次抗体（ａｂ１５００７７又は１１１－５８５－１４４ Jackson Immunoresearch社）（１×ＰＢＳ中０．２％ＢＳＡにおいて１：５００希釈）を適用した。同時に、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（ThermoFisher（商標）社）（１：１０００希釈）を加え、１時間インキュベートすることで、考えられる光劣化から蛍光体を保護した。インキュベート時間が経過したら、撹拌しながら再度１×ＰＢＳで３回洗浄した後に、マイクロチャンバーの壁を取り外し、Ｍｏｗｉｏｌ封入剤（Calbiochem社）を適用し、試料上にカバースリップを置いた。それを暗所から遮って室温で一晩放置して乾燥させ、翌日、共焦点顕微鏡（共焦点レーザー顕微鏡Ｌｅｉｃａ ＳＰ８（商標））で観察するまで－２０℃で貯蔵した。図５Ａから分かるように、腫瘍起源の殆どの細胞系統は検出可能なレベルの蛍光を有している。結腸系統ＳＷ４８０（原発性）とＳＷ６２０（神経節転移性）（５Ｂ）との間の強度を比較した場合に、ＳＷ６２０細胞系統においてより大きな強度を観察することができるため、この試験で得られた結果は、ＲＴ－ＰＣＲのデータと相関している。
【0062】
タンパク質の定性的研究のために、ＳＷ６２０細胞系統から単離されたタンパク質からウエスタンブロットを実施し、結果を図６（Ｂ）に示す。高グルコース濃度を有する培地（ダルベッコ改変イーグル培地－高グルコース、Sigma-Aldrich社）及び低グルコース濃
度を有する培地（ダルベッコ改変イーグル培地－低グルコース、Sigma-Aldrich社）中で
細胞を培養し、それらを通常の頻度で変えた。細胞をトリプシン処理し、ノイバウエルチャンバーを使用して計数を行ったところ、全ての系統の同様の数の細胞（５００万個）を有していた。次に、それを室温で５分間１５０×ｇで遠心分離し（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ
ＳＬ １６Ｒ、ローターＴＸ－４００、ThermoScientific（商標）社）、培地を吸引し、得られたペレットを１×ＰＢＳ中で再懸濁し、引き続き１回目と同じ条件下で新たな遠心分離を実施して、１×ＰＢＳを吸引し、ペレットをできるだけ分離されたままにするようにした。次いで、このペレットを完全な１×ＲＩＰＡ（８μＬのフッ化ナトリウム（ＮａＦ）、１．６μｌのオルトバナジン酸ナトリウム（Ｎａ３ＯＶ４）、２μＬのプロテアーゼ阻害剤（ＰＩＣ）、２μＬのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）及び１８６．４μｌの１×ＲＩＰＡ）中に再懸濁し、氷上で２０分間インキュベートした後に、１０分間超音波処理して、その後に、１３８００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離し（Ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５４１５Ｒ、ローターＦ４５２４１１ Eppendorf（商標）
社）、試料から上清を収集した。各試料の総タンパク質を、ブラッドフォード法（システイン、シスチン、トリプトファン、チロシン等の特定のアミノ酸によって、そしてまたペ
プチド鎖によっても影響されるアルカリ条件での二価カチオン銅から一価カチオン銅への変換法；二価カチオン銅の量はこれらの成分の量に依存し、分光光度法で測定される）によって、市販のキットＤＣ－Ａｓｓａｙ（BIO-RAD（商標）社）を使用し、ウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ、Sigma-Aldrich社）で検量線を確立して定量化した。試料の吸光度を、
ＶｅｒｓａＭａｘ ＥＬＩＳＡ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Molecular Devices（商標）社）プレートリーダーにて７５０ナノメートルで測定した。電気泳動のため
に、濃縮ゲル、４％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミド）及びＳＤＳ－ＰＡＧＥの１０％分離ゲルからなる厚さ１．５ｍｍの垂直ゲルを調製した。同時に、総量２０μｇのタンパク質、６×ローディングバッファー（Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８、ＳＤＳ、グリセロール、ブロモフェノールブルー及びβ－メルカプトエタノール）及び各試料のタンパク質濃度に応じた容量の水を用いて試料を調製した。試料をサーモブロック内にて９５℃で５分間変性させた後に、試料をＭｉｎｉ－Ｐｒｏｔｅａｎ ＩＩ（Bio-Rad社）キュベットに入れられたゲルのウェルにロードし、試料がゲルセパレーターの
限界に達するまで５０Ｖの電流を印加し、その後にこの電圧を１２０Ｖに増加させ、推定時間は１時間３０分（先頭がゲルから出るまで）であった。ゲルは常にランニングバッファー中に取り囲まれていた。次いで、タンパク質を０．４５μｍのニトロセルロース膜（Bio-Rad社）に転写し、その際、電気泳動ゲルをこの膜と接触させ、トランスファーバッ
ファー中で１００Ｖの電圧を１時間３０分間印加した。その過程の後に、タンパク質の存在を観察するために、上記膜をポンソーレッド溶液で浸漬させた。引き続き、膜を１×ＴＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水＋Ｔｗｅｅｎ２０）中の５％のミルクで、撹拌しながら室温で１時間ブロッキングした。この時間後に、膜を特別なプラスチックバッグに入れた後に、膜をそのタンパク質に特異的な一次抗体（商社Santa Cruzの濃度及び希釈で）と一緒にインキュベートし、それを撹拌しながら４℃で一晩保持した。翌日、膜を取り出し、撹拌しながら１×ＴＴＢＳで１０分間３回洗浄した後に、膜を別のプラスチックバッグに戻して、二次抗体（抗マウス又は抗ウサギ、BD-Jackson社）（１×ＴＴＢＳ中で１：５０００希釈）と一緒にインキュベートして、膜を撹拌しながら室温で１時間保持した。二次抗体とのインキュベートの終わりに、室温で撹拌しながら１×ＴＴＢＳで１０分間の３回の洗浄を再び行った。最後に、Ｐｉｅｒｃｅ ＥＣＬ試薬（化学発光の増強）ウエスタンブロッティング基質（Thermo Fisher社）１：１を膜に適用し、その現像を進めた。膜をＥ
ＣＬと一緒に暗所で露光カセット（revelation cassette）に導入し、その上にオートラ
ジオグラフィーフィルム（Mamorray社）を様々な露光時間でＣｕｒｉｘ ６０自動現像機（AGFA（商標）社）を使用して配置した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して取得したデータを、フィルムをスキャンした後に相対化した。
度を有する培地（ダルベッコ改変イーグル培地－低グルコース、Sigma-Aldrich社）中で
細胞を培養し、それらを通常の頻度で変えた。細胞をトリプシン処理し、ノイバウエルチャンバーを使用して計数を行ったところ、全ての系統の同様の数の細胞（５００万個）を有していた。次に、それを室温で５分間１５０×ｇで遠心分離し（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ
ＳＬ １６Ｒ、ローターＴＸ－４００、ThermoScientific（商標）社）、培地を吸引し、得られたペレットを１×ＰＢＳ中で再懸濁し、引き続き１回目と同じ条件下で新たな遠心分離を実施して、１×ＰＢＳを吸引し、ペレットをできるだけ分離されたままにするようにした。次いで、このペレットを完全な１×ＲＩＰＡ（８μＬのフッ化ナトリウム（ＮａＦ）、１．６μｌのオルトバナジン酸ナトリウム（Ｎａ３ＯＶ４）、２μＬのプロテアーゼ阻害剤（ＰＩＣ）、２μＬのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）及び１８６．４μｌの１×ＲＩＰＡ）中に再懸濁し、氷上で２０分間インキュベートした後に、１０分間超音波処理して、その後に、１３８００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離し（Ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５４１５Ｒ、ローターＦ４５２４１１ Eppendorf（商標）
社）、試料から上清を収集した。各試料の総タンパク質を、ブラッドフォード法（システイン、シスチン、トリプトファン、チロシン等の特定のアミノ酸によって、そしてまたペ
プチド鎖によっても影響されるアルカリ条件での二価カチオン銅から一価カチオン銅への変換法；二価カチオン銅の量はこれらの成分の量に依存し、分光光度法で測定される）によって、市販のキットＤＣ－Ａｓｓａｙ（BIO-RAD（商標）社）を使用し、ウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ、Sigma-Aldrich社）で検量線を確立して定量化した。試料の吸光度を、
ＶｅｒｓａＭａｘ ＥＬＩＳＡ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Molecular Devices（商標）社）プレートリーダーにて７５０ナノメートルで測定した。電気泳動のため
に、濃縮ゲル、４％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミド）及びＳＤＳ－ＰＡＧＥの１０％分離ゲルからなる厚さ１．５ｍｍの垂直ゲルを調製した。同時に、総量２０μｇのタンパク質、６×ローディングバッファー（Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８、ＳＤＳ、グリセロール、ブロモフェノールブルー及びβ－メルカプトエタノール）及び各試料のタンパク質濃度に応じた容量の水を用いて試料を調製した。試料をサーモブロック内にて９５℃で５分間変性させた後に、試料をＭｉｎｉ－Ｐｒｏｔｅａｎ ＩＩ（Bio-Rad社）キュベットに入れられたゲルのウェルにロードし、試料がゲルセパレーターの
限界に達するまで５０Ｖの電流を印加し、その後にこの電圧を１２０Ｖに増加させ、推定時間は１時間３０分（先頭がゲルから出るまで）であった。ゲルは常にランニングバッファー中に取り囲まれていた。次いで、タンパク質を０．４５μｍのニトロセルロース膜（Bio-Rad社）に転写し、その際、電気泳動ゲルをこの膜と接触させ、トランスファーバッ
ファー中で１００Ｖの電圧を１時間３０分間印加した。その過程の後に、タンパク質の存在を観察するために、上記膜をポンソーレッド溶液で浸漬させた。引き続き、膜を１×ＴＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水＋Ｔｗｅｅｎ２０）中の５％のミルクで、撹拌しながら室温で１時間ブロッキングした。この時間後に、膜を特別なプラスチックバッグに入れた後に、膜をそのタンパク質に特異的な一次抗体（商社Santa Cruzの濃度及び希釈で）と一緒にインキュベートし、それを撹拌しながら４℃で一晩保持した。翌日、膜を取り出し、撹拌しながら１×ＴＴＢＳで１０分間３回洗浄した後に、膜を別のプラスチックバッグに戻して、二次抗体（抗マウス又は抗ウサギ、BD-Jackson社）（１×ＴＴＢＳ中で１：５０００希釈）と一緒にインキュベートして、膜を撹拌しながら室温で１時間保持した。二次抗体とのインキュベートの終わりに、室温で撹拌しながら１×ＴＴＢＳで１０分間の３回の洗浄を再び行った。最後に、Ｐｉｅｒｃｅ ＥＣＬ試薬（化学発光の増強）ウエスタンブロッティング基質（Thermo Fisher社）１：１を膜に適用し、その現像を進めた。膜をＥ
ＣＬと一緒に暗所で露光カセット（revelation cassette）に導入し、その上にオートラ
ジオグラフィーフィルム（Mamorray社）を様々な露光時間でＣｕｒｉｘ ６０自動現像機（AGFA（商標）社）を使用して配置した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して取得したデータを、フィルムをスキャンした後に相対化した。
【0063】
実施例２．種々のグルコース濃度のレベルを有する培養培地におけるＴＡＳ１Ｒ３の発現
結腸系統ＳＷ６２０におけるＴＡＳ１Ｒ３の発現は、培養培地中のグルコース含有量に応じて変動する（高レベルのグルコースは、低含有量のグルコース中で培養された細胞について図６Ａで観察されたものと比較して、より低い発現を引き起こす）。この結果を、ウエスタンブロットによって更に確認した（図６Ｂ）。さらに、図６から分かるように、ＳＷ６２０結腸細胞をグルコースの不存在下で成長させると、受容体の発現が増加することから、この受容体の発現は細胞代謝に関連付けられる。
結腸系統ＳＷ６２０におけるＴＡＳ１Ｒ３の発現は、培養培地中のグルコース含有量に応じて変動する（高レベルのグルコースは、低含有量のグルコース中で培養された細胞について図６Ａで観察されたものと比較して、より低い発現を引き起こす）。この結果を、ウエスタンブロットによって更に確認した（図６Ｂ）。さらに、図６から分かるように、ＳＷ６２０結腸細胞をグルコースの不存在下で成長させると、受容体の発現が増加することから、この受容体の発現は細胞代謝に関連付けられる。
【0064】
細胞増殖研究を、高グルコース濃度及び低グルコース濃度を有する培地で培養されたＳＷ６２０細胞において行った（図７Ａ）。細胞をトリプシン処理し、同じ数の細胞をプレーティングして、そのトリプシン処理後の０時間、２４時間、７２時間、９６時間及び１６８時間の時点で、このためにノイバウエルチャンバーを使用して細胞を計数した。同様の方法で、細胞増殖研究を、種々の濃度で培養培地に添加された遊離リガンドが存在する培地中で行った（図８）。顕微鏡（Leica社のＤＭＩＬ（商標）顕微鏡）を使用して写真
を撮影し、引き続きそれらをトリプシン処理し、細胞数を計数して、これらの細胞と出発細胞との間で比較し、細胞に対するリガンドの効果を観察した。細胞増殖は、研究条件下
で同等であった。しかしながら、１ウェル当たり２００個の細胞の量から出発して１５日間待機してコロニー形成の研究を行った場合に、低濃度のグルコースを有する培地で培養された細胞は、高グルコース培地中で成長した細胞よりも高いレベルの受容体を発現し、より多くのコロニーを形成することが確認された（図７Ｂ）。コロニー形成の研究のためには、１２ウェルプレートを使用し、高（４５００ｍｇ／Ｌ）含有量及び低（１０００ｍｇ／Ｌ）含有量のグルコースを有する培地中で種々の量の細胞（１ウェル当たり２００個、４００個、６００個及び８００個の細胞）でプレーティングした。コロニーのサイズが顕微鏡を使用しなくても視認することができるようになるまで、これらのプレートを光学顕微鏡によって肉眼で１５日間観察した。次いで、ＰＢＳ中に溶解されたＭＴＴの溶液（５ｍｇ／ｍＬ）をウェル自体に加え、４時間のインキュベート後に、培地を慎重に吸引すると、紫色に染色されたコロニーがウェルの底に残留することとなる。プレートを室温で一晩乾燥させた後にスキャンして、ＯｐｅｎＣＦＵプログラムを使用して各ウェル中のコロニーを計数した。
を撮影し、引き続きそれらをトリプシン処理し、細胞数を計数して、これらの細胞と出発細胞との間で比較し、細胞に対するリガンドの効果を観察した。細胞増殖は、研究条件下
で同等であった。しかしながら、１ウェル当たり２００個の細胞の量から出発して１５日間待機してコロニー形成の研究を行った場合に、低濃度のグルコースを有する培地で培養された細胞は、高グルコース培地中で成長した細胞よりも高いレベルの受容体を発現し、より多くのコロニーを形成することが確認された（図７Ｂ）。コロニー形成の研究のためには、１２ウェルプレートを使用し、高（４５００ｍｇ／Ｌ）含有量及び低（１０００ｍｇ／Ｌ）含有量のグルコースを有する培地中で種々の量の細胞（１ウェル当たり２００個、４００個、６００個及び８００個の細胞）でプレーティングした。コロニーのサイズが顕微鏡を使用しなくても視認することができるようになるまで、これらのプレートを光学顕微鏡によって肉眼で１５日間観察した。次いで、ＰＢＳ中に溶解されたＭＴＴの溶液（５ｍｇ／ｍＬ）をウェル自体に加え、４時間のインキュベート後に、培地を慎重に吸引すると、紫色に染色されたコロニーがウェルの底に残留することとなる。プレートを室温で一晩乾燥させた後にスキャンして、ＯｐｅｎＣＦＵプログラムを使用して各ウェル中のコロニーを計数した。
【0065】
実施例３．新しい抗腫瘍療法薬を開発するための標的としてのＴＡＳ１Ｒ３
ＴＡＳ１Ｒ３受容体のリガンドであるラクチゾールが培養培地中に存在すると、研究対象の受容体の発現に増加が引き起こされる（図８Ａ）。より高い濃度では、リガンドの存在は細胞増殖を妨害するが（図８Ｂ）、実際、細胞老化の誘導に関連付けられた（図８Ｄ）。さらに、ウエスタンブロットによって、ＳＷ６２０の培養培地中にラクチゾール又はグルコース（ＨＧ）等のＴＡＳ１Ｒ３のリガンドが存在すると、ｐ－ＥＲＫ、ｐ－ＡＫＴ又はＩＧＦ－ＩＲ等の腫瘍の進行に関連付けられた経路が活性化されることも分かった（図８Ｅ）。また、ブラゼイン及びシクラメートから誘導されたペプチドであるＴＡＳ１Ｒ３の他のリガンドがどのようにして、濃度及び各分子に応じて多かれ少なかれ増殖を妨げるのかも突き止めた（図８Ｆ）。
ＴＡＳ１Ｒ３受容体のリガンドであるラクチゾールが培養培地中に存在すると、研究対象の受容体の発現に増加が引き起こされる（図８Ａ）。より高い濃度では、リガンドの存在は細胞増殖を妨害するが（図８Ｂ）、実際、細胞老化の誘導に関連付けられた（図８Ｄ）。さらに、ウエスタンブロットによって、ＳＷ６２０の培養培地中にラクチゾール又はグルコース（ＨＧ）等のＴＡＳ１Ｒ３のリガンドが存在すると、ｐ－ＥＲＫ、ｐ－ＡＫＴ又はＩＧＦ－ＩＲ等の腫瘍の進行に関連付けられた経路が活性化されることも分かった（図８Ｅ）。また、ブラゼイン及びシクラメートから誘導されたペプチドであるＴＡＳ１Ｒ３の他のリガンドがどのようにして、濃度及び各分子に応じて多かれ少なかれ増殖を妨げるのかも突き止めた（図８Ｆ）。
【0066】
リガンドと一緒に細胞をインキュベートした後に細胞老化が誘発されるかどうかを調べるために、ＳＷ６２０系統の５０００００個の細胞を６ウェルプレートにおいて低グルコース濃度を有する培地中で培養した。幾つかのウェルにおいて、リガンド（３．５ｍｇ／ｍＬ）を加えた。７２時間後に、ウェルを洗浄し、室温で１５分間固定した（ＰＢＳ中の２％ホルムアルデヒド、０．２％グルタルアルデヒド）。その溶液を除去して、１×ＰＢＳで３回洗浄した後に、１ミリリットルの溶液のために計算された染色液を適用した：２００μＬのクエン酸／リン酸バッファー（ｐＨ６．０）（０．２Ｍの二塩基性リン酸ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）＋０．１Ｍのクエン酸）、３０μＬの５ＭのＮａＣｌ、５０μＬの１００ｍＭのフェリシアン化カリウム（Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］）、５０μＬの１００ｍＭのフェロシアン化カリウム（Ｋ４［Ｆｅ（ＣＮ）６］）、２μＬの１Ｍの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、５０μＬのＸ－ｇａｌ溶液（ジメチルホルムアルデヒド中の２０ｍｇ／ｍＬの５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルβ－Ｄ－ガラクトピラノシド）及び６１８μＬの蒸留水。それをオーブン内にて３７℃で一晩インキュベートし、流れている蒸留水によってウェルを２回洗浄した後に、１×ＰＢＳを適用し、Ｖｅｒｔ．Ａ１顕微鏡（Zeiss（商標）社）下であり得る老化細胞を観察した。老化した細胞に対応する青
色染色が観察される。
色染色が観察される。
【0067】
遊離リガンドを有する培地中でのコロニー形成を試験するために、同じ方法を実施したが、この場合に、細胞を１０００ｍｌ／Ｌのグルコース（低グルコース濃度）で播種し、３．５ｍｇ／ｍＬのリガンドを２４ウェルのそれぞれに加えた。これらの結果は図８Ｃに示される。処理された細胞の場合に、低グルコース濃度（ＬＧ）を有する培地中で成長したコントロールＳＷ６２０細胞とは対照的に、プレート上に形成された代表的なコロニーは観察されなかった。したがって、該リガンドは腫瘍増殖、ひいてはコロニーを形成する能力に影響を与えると言うことができる。
【0068】
この知見は、このリガンドに、ナノ粒子の積極的な誘導のための機能及び薬物としての機能の二重の機能を与え得るので極めて興味深いものである。
【0069】
実施例４．ＴＡＳ１Ｒ３に対する標的療法
ＴＡＳ１Ｒ３に対する種々のリガンドによるナノエマルジョンの機能付与を、以下のように行った。ナノエマルジョンは、オレイン酸及びスフィンゴミエリン（それぞれ５ｍｇ及び５００μｇ）を含む１００μＬのエタノールと一緒にＣ１６～Ｃ１８鎖に共有結合された５００μｇのラクチゾールを、穏やかに磁気撹拌しながら１ｍＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ水（Millipore社 Ｍｉｌｌｉ－Ｑ ｓｙｓｔｅｍ（商標））に加えた後に自発的に得られ
た。Ｇ７１１１Ａポンプ、Ｇ７１２９Ａオートサンプラー及びＧ７１１４Ａ ＵＶ－Ｖｉｓ検出器を備えたＨＰＬＣシステム（１２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ、Agilent社）
と共にＩｎｆｉｎｉｔｙＬａｂ Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０ＥＣ－Ｃ１８カラム（Agilent社、４．６×００ｍｍ、４μｍポアサイズ）を使用した高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）を使用して、ナノエマルジョン中にリガンドが含まれていることを確認した。
ＴＡＳ１Ｒ３に対する種々のリガンドによるナノエマルジョンの機能付与を、以下のように行った。ナノエマルジョンは、オレイン酸及びスフィンゴミエリン（それぞれ５ｍｇ及び５００μｇ）を含む１００μＬのエタノールと一緒にＣ１６～Ｃ１８鎖に共有結合された５００μｇのラクチゾールを、穏やかに磁気撹拌しながら１ｍＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ水（Millipore社 Ｍｉｌｌｉ－Ｑ ｓｙｓｔｅｍ（商標））に加えた後に自発的に得られ
た。Ｇ７１１１Ａポンプ、Ｇ７１２９Ａオートサンプラー及びＧ７１１４Ａ ＵＶ－Ｖｉｓ検出器を備えたＨＰＬＣシステム（１２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ、Agilent社）
と共にＩｎｆｉｎｉｔｙＬａｂ Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０ＥＣ－Ｃ１８カラム（Agilent社、４．６×００ｍｍ、４μｍポアサイズ）を使用した高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）を使用して、ナノエマルジョン中にリガンドが含まれていることを確認した。
【0070】
ナノエマルジョンが対象の受容体を発現する細胞と相互作用する能力に対する機能付与の効果を研究するために、フローサイトメトリー及び共焦点顕微鏡技術を使用した。具体的には、ＳＷ６２０細胞を使用し、共焦点顕微鏡法を使用した。これらの実験のために、８ウェルのマイクロチャンバー（ＰＬＣ３０１０８、SPL LifeSciences社）に１ウェル当たり８００００個の細胞を播種した。２４時間後に細胞を、オレイン酸及びスフィンゴミエリン誘導体から調製された、ニトロベンゾオキサジアゾール（ＮＢＤ）で標識され、更にＤｉＲが封入されたナノエマルジョン（ＯＬＭ；Ｏ：ＳＭ １：０．１）及びラクチゾールで機能付与されたこれらの同じナノエマルジョン（ＯＬＭ－Ｌ；Ｏ：ＳＭ：Ｌａｃｔ
１：０．１：０．１）と一緒に、０．１２ｍｇ／ｍＬのナノエマルジョンのウェル中の最終濃度でインキュベートした。３７℃で４時間インキュベートした後に、細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄し、次いで４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定した後に、ウェルを１×ＰＢＳで２回洗浄し、次いで細胞核をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Thermo Fisher
（商標）社）で染色した。封入剤（Ｍｏｗｉｏｌ、Calbiochem社）を適用し、試料を共焦点顕微鏡（共焦点レーザー顕微鏡Ｌｅｉｃａ ＳＰ８（商標））下で観察した。類似の実験を実施し、この場合に、高濃度又は低濃度のグルコースを有する培地で培養されたため、実施例２に見られるように異なるレベルの受容体の発現を有するＳＷ６２０細胞における、ラクチゾールで機能付与され（Ｏ：ＳＭ：Ｌａｃｔ １：０．１：０．１）、ＤｉＤで標識されたナノエマルジョンのインキュベート後の内部移行を比較した。図９から分かるように、ラクチゾールのためのＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現が低いＳＷ６２０細胞でインキュベートした場合に、ナノエマルジョンによる蛍光強度が実際に減少することが判明した。
１：０．１：０．１）と一緒に、０．１２ｍｇ／ｍＬのナノエマルジョンのウェル中の最終濃度でインキュベートした。３７℃で４時間インキュベートした後に、細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄し、次いで４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定した後に、ウェルを１×ＰＢＳで２回洗浄し、次いで細胞核をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Thermo Fisher
（商標）社）で染色した。封入剤（Ｍｏｗｉｏｌ、Calbiochem社）を適用し、試料を共焦点顕微鏡（共焦点レーザー顕微鏡Ｌｅｉｃａ ＳＰ８（商標））下で観察した。類似の実験を実施し、この場合に、高濃度又は低濃度のグルコースを有する培地で培養されたため、実施例２に見られるように異なるレベルの受容体の発現を有するＳＷ６２０細胞における、ラクチゾールで機能付与され（Ｏ：ＳＭ：Ｌａｃｔ １：０．１：０．１）、ＤｉＤで標識されたナノエマルジョンのインキュベート後の内部移行を比較した。図９から分かるように、ラクチゾールのためのＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現が低いＳＷ６２０細胞でインキュベートした場合に、ナノエマルジョンによる蛍光強度が実際に減少することが判明した。
【0071】
Ｏ：ＳＭ：Ｌａｃｔ １：０．１：０．１（ＮＥ－Ｆ）に、他の成分に対して１重量％でエトポシドを負荷した。９６ウェルプレート中で１ウェル当たり１００００個の細胞を播種した。２４時間の培養後に、濃度の増加順に２０μＬの試験配合物を１１０μＬの培養培地に適用し、ナノシステムが溶解されるビヒクル（大部分の場合に水）を加えているポジティブコントロール及び６％のＴｒｉｔｏｎ １００Ｘの希釈が適用されたネガティブコントロールすなわち全死滅を、コントロールとして設定した。４８時間後に、プレートの培養培地を吸引して、１×ＰＢＳで洗浄し、その後に、ＭＴＴ試薬を１×ＰＢＳ中で５ｍｇ／ｍＬの濃度で、補充を有しないＤＭＥＭ培地中で１：１０に希釈した後に適用し、０．２２μｍフィルターで濾過した。１ウェル当たり１１０μＬを適用した。インキュベーター中で４時間後に、培地をプレートから除去し、１１０μＬの容量の１×ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、９９．７％、AcrosOrganics社）を添加して、ミトコンドリア
酵素により生成されたホルマザン結晶を溶解させた。遮光して、プレートを３７℃で１５
分間インキュベートした後に、分光光度計（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＥＸ、ThermoLabsystems（商標）社）において５７０ナノメートルで吸光度を測定し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５プログラムを使用して各配合物のＥＣ５０値を取得した。抗腫瘍薬の封入のために、エトポシドを選択し、１３．７５μｌの４０ｍｇ／ｍＬの溶液（５５０μｇの薬物）を有機相に加えた。全てのナノエマルジョンを、１４０００×ｇ、１５℃で３０分間遠心分離（Ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５４１５Ｒ、ローターＦ４５２４１１ Eppendorf（商標）社）することによって単離して、ナノエマルジョンの一部ではなく全てを
排除した。図１０Ａに示されるように、薬物のナノエマルジョンで処理された細胞の場合に（白色のナノエマルジョンは殆ど活性を示さなかった）、特に機能付与されたナノエマルジョンの場合に、より大きな細胞傷害活性が観察された。
酵素により生成されたホルマザン結晶を溶解させた。遮光して、プレートを３７℃で１５
分間インキュベートした後に、分光光度計（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＥＸ、ThermoLabsystems（商標）社）において５７０ナノメートルで吸光度を測定し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５プログラムを使用して各配合物のＥＣ５０値を取得した。抗腫瘍薬の封入のために、エトポシドを選択し、１３．７５μｌの４０ｍｇ／ｍＬの溶液（５５０μｇの薬物）を有機相に加えた。全てのナノエマルジョンを、１４０００×ｇ、１５℃で３０分間遠心分離（Ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５４１５Ｒ、ローターＦ４５２４１１ Eppendorf（商標）社）することによって単離して、ナノエマルジョンの一部ではなく全てを
排除した。図１０Ａに示されるように、薬物のナノエマルジョンで処理された細胞の場合に（白色のナノエマルジョンは殆ど活性を示さなかった）、特に機能付与されたナノエマルジョンの場合に、より大きな細胞傷害活性が観察された。
【0072】
実施例５．量子ドットによる実験
量子ドットをヒトタンパク質ＴＡＳ１Ｒ３に対する抗体で機能付与した。ＴＡＳ１Ｒ３に対する抗体（参照ｓｃ５０３５３、SCBT社）を、ＳｉｔｅＣｌｉｃｋ（商標）Ｑｄｏｔ（商標）６５５抗体標識キット（参照Ｓ１０４５３、ThermoFisher社）を使用して、供給元の使用説明書に従って、量子ドットにコンジュゲートさせた。最終調製物中の濃度は、指定された波長で光学密度を計測した後に、式Ａ＝εｃＬ（式中、Ａは吸光度であり、εはモル吸光係数であり、ｃはモル濃度であり、Ｌは光路長である）を使用して測定した。量子ドットのサイズ分布を確認し、約４００ｎｍの過半数集団の存在を観察した。
量子ドットをヒトタンパク質ＴＡＳ１Ｒ３に対する抗体で機能付与した。ＴＡＳ１Ｒ３に対する抗体（参照ｓｃ５０３５３、SCBT社）を、ＳｉｔｅＣｌｉｃｋ（商標）Ｑｄｏｔ（商標）６５５抗体標識キット（参照Ｓ１０４５３、ThermoFisher社）を使用して、供給元の使用説明書に従って、量子ドットにコンジュゲートさせた。最終調製物中の濃度は、指定された波長で光学密度を計測した後に、式Ａ＝εｃＬ（式中、Ａは吸光度であり、εはモル吸光係数であり、ｃはモル濃度であり、Ｌは光路長である）を使用して測定した。量子ドットのサイズ分布を確認し、約４００ｎｍの過半数集団の存在を観察した。
【0073】
機能付与された量子ドットと懸濁及び接着した肺腫瘍細胞Ａ５４９との相互作用試験を行った。インキュベートを４℃及び３７℃で４時間行った。インキュベート時間後に、培養培地を除去し、１×ＰＢＳで洗浄した。懸濁液中でインキュベートされた細胞を、それらの付着を可能にし、ＴＡＳ１Ｒ３受容体の免疫蛍光研究を実施するために、事後的に播種した。２４時間後に、培養培地を吸引により除去し、１×ＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドを用いて室温で１５分間細胞の固定を続けた。次いで、抗ヒト一次抗体ＴＡＳ１Ｒ３（ウサギ）（参照ｓｃ５０３５３、SCBT社）を０．２％ＢＳＡ（１×ＰＢＳ中に１：１０００希釈で溶解）中でインキュベートし、プレートを室温で１時間インキュベートした。次いで、一次抗体を洗浄し、蛍光体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８）で標識された抗ウサギ二次抗体（１１１－５４５－１４４ Jackson Immunoresearch社）（１×ＰＢＳ中０．２％ＢＳＡにおいて１：５００に希釈）を適用した。同時に、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（ThermoFisher（商標）社）（１：１０００希釈）を加え、１時間インキュベートすることで、考えられる光劣化から蛍光体を保護した。インキュベート時間が経過したら、撹拌しながら再度１×ＰＢＳで３回洗浄した後に、マイクロチャンバーの壁を取り外し、Ｍｏｗｉｏｌ封入剤（Calbiochem社）を適用し、試料上にカバースリップを置いた。それを暗所から遮って室温で一晩放置して乾燥させ、翌日、共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＳＰ８（商標）共焦点レーザー顕微鏡）下で観察した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図8-3】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-10-10
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
腫瘍バイオマーカーとしてのＴＡＳ１Ｒ３膜細胞受容体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用。
【請求項2】
患者における腫瘍の存在、新生物の存在又は転移の存在をｉｎ ｖｉｔｒｏで診断するための方法であって、以下の工程：
ａ）少なくとも前記患者から単離された生体試料の細胞におけるＴＡＳ１Ｒ３の発現レベルを測定する工程と、
ｃ）前記発現レベルを、健康な個体又は健康な器官若しくは組織の一部の生体試料又は腫瘍の存在を有しない生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値と比較する工程と、
を含み、健康な個体又は健康な器官若しくは組織の一部の生体試料又は腫瘍の存在を有しない生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値と比較して増加した発現レベルが、患者における腫瘍の存在、新生物の存在又は転移の存在の指標である、方法。
ａ）少なくとも前記患者から単離された生体試料の細胞におけるＴＡＳ１Ｒ３の発現レベルを測定する工程と、
ｃ）前記発現レベルを、健康な個体又は健康な器官若しくは組織の一部の生体試料又は腫瘍の存在を有しない生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値と比較する工程と、
を含み、健康な個体又は健康な器官若しくは組織の一部の生体試料又は腫瘍の存在を有しない生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値と比較して増加した発現レベルが、患者における腫瘍の存在、新生物の存在又は転移の存在の指標である、方法。
【請求項3】
患者における腫瘍の存在、新生物の存在又は転移の存在に見舞われている患者の臨床経過をｉｎ ｖｉｔｒｏで予後診断するための方法であって、以下の工程：
ａ）少なくとも前記患者から単離された生体試料の細胞におけるＴＡＳ１Ｒ３の発現を測定する工程と、
ｃ）前記発現レベルと、項目ａ）の生体試料を得た時点よりも早い時点で得られた同じ患者からの生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値とを比較する工程と、
を含み、項目ａ）の生体試料を得た時点よりも早い時点で得られた生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値と比較して増加した発現レベルが、患者の消極的な臨床的進化の指標である、方法。
ａ）少なくとも前記患者から単離された生体試料の細胞におけるＴＡＳ１Ｒ３の発現を測定する工程と、
ｃ）前記発現レベルと、項目ａ）の生体試料を得た時点よりも早い時点で得られた同じ患者からの生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値とを比較する工程と、
を含み、項目ａ）の生体試料を得た時点よりも早い時点で得られた生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値と比較して増加した発現レベルが、患者の消極的な臨床的進化の指標である、方法。
【請求項4】
腫瘍の存在、新生物の存在又は転移の存在に見舞われている患者の臨床経過をｉｎ ｖｉｔｒｏでモニタリングする方法であって、以下の工程：
ａ）少なくとも前記患者から単離された生体試料の細胞におけるＴＡＳ１Ｒ３の発現を測定する工程と、
ｃ）前記発現レベルと、項目ａ）の生体試料を得た時点よりも早い時点で得られた同じ患者からの生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値とを比較する工程と、
を含み、項目ａ）の生体試料を得た時点よりも早い時点で得られた同じ患者からの生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値と比較して増加した発現レベルが、患者の消極的な臨床的進化の指標である、方法。
ａ）少なくとも前記患者から単離された生体試料の細胞におけるＴＡＳ１Ｒ３の発現を測定する工程と、
ｃ）前記発現レベルと、項目ａ）の生体試料を得た時点よりも早い時点で得られた同じ患者からの生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値とを比較する工程と、
を含み、項目ａ）の生体試料を得た時点よりも早い時点で得られた同じ患者からの生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値と比較して増加した発現レベルが、患者の消極的な臨床的進化の指標である、方法。
【請求項5】
腫瘍の存在、新生物の存在又は転移の存在に見舞われている患者の治療に対する応答をモニタリングする方法であって、以下の工程：
ａ）少なくとも前記患者から単離された生体試料の細胞におけるＴＡＳ１Ｒ３の発現を測定する工程と、
ｃ）前記発現レベルと、項目ａ）の生体試料を得た時点よりも早い時点で得られた同じ患者からの生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値とを比較する工程と、
を含み、項目ａ）の生体試料を得た時点よりも早い時点で得られた同じ患者からの生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値と比較して増加した発現レベルが、治療に対する応答の欠如の指標である、方法。
ａ）少なくとも前記患者から単離された生体試料の細胞におけるＴＡＳ１Ｒ３の発現を測定する工程と、
ｃ）前記発現レベルと、項目ａ）の生体試料を得た時点よりも早い時点で得られた同じ患者からの生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値とを比較する工程と、
を含み、項目ａ）の生体試料を得た時点よりも早い時点で得られた同じ患者からの生体試料におけるＴＡＳ１Ｒ３受容体の発現レベル又は参照値と比較して増加した発現レベルが、治療に対する応答の欠如の指標である、方法。
【請求項6】
前記生体試料の細胞におけるＴＡＳ１Ｒ３の発現の測定は、ＴＡＳ１Ｒ３受容体に選択的に結合することができるＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、又はダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ及び／又はヒト化抗体からなる群に属するアプタマー、抗体又はそのフラグメントを用いて行われる、請求項２～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記アプタマー、前記抗体若しくはそのフラグメント、又は前記ダイアボディ、前記トリアボディ、前記テトラボディ及び／又は前記ヒト化抗体は、配列番号１又は配列番号２の配列のいずれかに選択的に結合することができる、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記存在する腫瘍は固形腫瘍である請求項２～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記患者は、乳癌、黒色腫、ブドウ膜黒色腫、膵臓癌、肺癌、前立腺癌、胃癌、頭頸部癌、肉腫、神経膠芽腫、神経芽腫、結腸及び直腸の癌、頭頸部の癌、腎臓癌及び膀胱癌並びに肝癌からなる群より選択される疾患を患っている、請求項２～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
細胞膜受容体ＴＡＳ１Ｒ３を含む検体であって、前記受容体のリガンドの使用により腫瘍細胞に向かって療法薬を誘導するための分子マーカー／腫瘍バイオマーカーとして前記受容体ＴＡＳ１Ｒ３を検出するために使用される、検体。
【請求項11】
細胞膜受容体ＴＡＳ１Ｒ３を含む検体であって、前記受容体のリガンドの使用によりｉｎ ｖｉｖｏ診断するための分子マーカー／腫瘍バイオマーカーとして前記受容体ＴＡＳ１Ｒ３を検出するために使用される、検体。
【請求項12】
腫瘍細胞に対する療法で使用される又はｉｎ ｖｉｖｏ診断での腫瘍バイオマーカーとして使用される、
ａ）ＴＡＳ１Ｒ３受容体と相互作用又は結合することができる特異的な標的剤と、
ｂ）細胞毒性剤、放射性同位体、ナノ構造物又はナノエマルジョンと、
を含むコンジュゲート。
ａ）ＴＡＳ１Ｒ３受容体と相互作用又は結合することができる特異的な標的剤と、
ｂ）細胞毒性剤、放射性同位体、ナノ構造物又はナノエマルジョンと、
を含むコンジュゲート。
【請求項13】
前記ＴＡＳ１Ｒ３受容体と相互作用又は結合することができる標的剤は、単糖及び二糖、スクラロース、シクラメート、ネオエスペリジン、ジヒドロカルコン、ラクチゾール、ブラゼイン、抗体又は抗体のフラグメント、ペプチド、アプタマー又は小分子からなる群より選択される、請求項１２に記載のコンジュゲート。
【請求項14】
前記標的剤は、アプタマー、抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖからなる群より選択される抗体のフラグメント、又はダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ及び／又はヒト化抗体からなる群より選択され、ここで、前記標的剤は、配列番号１又は配列番号２の配列のいずれかに選択的に結合することができる、請求項１２に記載のコンジュゲート。
【請求項15】
ａ）ブラゼイン及びラクチゾールからなる群より選択される特異的な標的剤と、
ｂ）細胞毒性剤、放射性同位体、ナノ構造物又はナノエマルジョンと、
を含む、コンジュゲート。
ｂ）細胞毒性剤、放射性同位体、ナノ構造物又はナノエマルジョンと、
を含む、コンジュゲート。
【請求項16】
固形腫瘍の治療又はｉｎ ｖｉｖｏ診断のために使用される、請求項１２～１５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【外国語明細書】