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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023179488
(43)【公開日】2023-12-19
(54)【発明の名称】組換えコラーゲンの水酸化を調節する酵母株及び方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/81 20060101AFI20231212BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20231212BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20231212BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20231212BHJP
【ＦＩ】
C12N15/81 Z
C12N1/19 ZNA
C12P21/02 C
C12N15/12
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023150398
(22)【出願日】2023-09-15
(62)【分割の表示】P 2018141979の分割
【原出願日】2018-07-30
(31)【優先権主張番号】62/539,213
(32)【優先日】2017-07-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】517239441
【氏名又は名称】モダン メドウ，インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100093676
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 純子
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100149010
【弁理士】
【氏名又は名称】星川 亮
(72)【発明者】
【氏名】ダイ，リシン
(72)【発明者】
【氏名】ボーデン，ジュリア
(72)【発明者】
【氏名】ネルソン，ジェフェリー
(72)【発明者】
【氏名】ルーブリング－ジャス，クリスティン
(57)【要約】 （修正有）
【課題】遺伝子組換え酵母株、及び組換えまたは人工コラーゲンを含有するバイオファブリケートレザーまたは皮革様特性を有する物質を製造するために用いる組換えコラーゲンの製造方法を提供する。
【解決手段】非水酸化コラーゲンまたは水酸化コラーゲンをより多量に産生するように遺伝子改変した酵母株を提供する。他の実施形態は、コラーゲンまたはヒドロキシラーゼをコードするコドン改変核酸配列、コラーゲン及びヒドロキシラーゼ（複数可）をコードする「オールインワンベクター」などのベクター、及び組換えコラーゲンの産生方法及び使用方法を含む。別の実施形態では、本発明は、水酸化及び非水酸化コラーゲンの製造に有用な酵母宿主内のキメラＤＮＡ配列を提供する。
【選択図】なし
【解決手段】非水酸化コラーゲンまたは水酸化コラーゲンをより多量に産生するように遺伝子改変した酵母株を提供する。他の実施形態は、コラーゲンまたはヒドロキシラーゼをコードするコドン改変核酸配列、コラーゲン及びヒドロキシラーゼ（複数可）をコードする「オールインワンベクター」などのベクター、及び組換えコラーゲンの産生方法及び使用方法を含む。別の実施形態では、本発明は、水酸化及び非水酸化コラーゲンの製造に有用な酵母宿主内のキメラＤＮＡ配列を提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
非水酸化コラーゲンを産生する遺伝子改変酵母株であって：
（ｉ）酵母株；ならびに
（ｉｉ）コラーゲンのＤＮＡ配列；コラーゲンプロモーターのＤＮＡ配列；コラーゲン
ターミネーターのＤＮＡ配列；選択マーカーのＤＮＡ配列、前記選択マーカー用のプロモ
ーターのＤＮＡ配列；前記選択マーカー用のターミネーターのＤＮＡ配列；細菌用のもの
及び酵母用のものから選択される複製起点のＤＮＡ配列；及び前記酵母のゲノムと相同性
を有するＤＮＡ配列を含むベクター
を含み、前記ベクターが前記酵母株に挿入されている、前記遺伝子改変酵母株。
（ｉ）酵母株；ならびに
（ｉｉ）コラーゲンのＤＮＡ配列；コラーゲンプロモーターのＤＮＡ配列；コラーゲン
ターミネーターのＤＮＡ配列；選択マーカーのＤＮＡ配列、前記選択マーカー用のプロモ
ーターのＤＮＡ配列；前記選択マーカー用のターミネーターのＤＮＡ配列；細菌用のもの
及び酵母用のものから選択される複製起点のＤＮＡ配列；及び前記酵母のゲノムと相同性
を有するＤＮＡ配列を含むベクター
を含み、前記ベクターが前記酵母株に挿入されている、前記遺伝子改変酵母株。
【請求項2】
前記酵母株が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来の
ものからなる群から選択される、請求項１に記載の酵母株。
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来の
ものからなる群から選択される、請求項１に記載の酵母株。
【請求項3】
前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ
、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン、及びそれらの組み合
わせからなる群から選択される、請求項１に記載の酵母株。
、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン、及びそれらの組み合
わせからなる群から選択される、請求項１に記載の酵母株。
【請求項4】
前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、天然コラーゲンＤＮＡ、改変（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ
）コラーゲンＤＮＡ及びコドン改変コラーゲンＤＮＡから選択される、請求項３に記載の
酵母株。
）コラーゲンＤＮＡ及びコドン改変コラーゲンＤＮＡから選択される、請求項３に記載の
酵母株。
【請求項5】
前記プロモーターのＤＮＡ配列が、ＡＯＸ１メタノール誘導性プロモーターのＤＮＡ、
ｐＤＦ抑制解除プロモーターのＤＮＡ、ｐＣＡＴ抑制解除プロモーターのＤＮＡ、Ｄａｓ
１－Ｄａｓ２メタノール誘導性二方向性プロモーターのＤＮＡ、ｐＨＴＸ１構成的二方向
性プロモーターのＤＮＡ、ｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮ
Ａ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の酵母株。
ｐＤＦ抑制解除プロモーターのＤＮＡ、ｐＣＡＴ抑制解除プロモーターのＤＮＡ、Ｄａｓ
１－Ｄａｓ２メタノール誘導性二方向性プロモーターのＤＮＡ、ｐＨＴＸ１構成的二方向
性プロモーターのＤＮＡ、ｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮ
Ａ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の酵母株。
【請求項6】
前記選択マーカーのＤＮＡ配列が、抗生物質耐性のＤＮＡ及び栄養要求性マーカーのＤ
ＮＡからなる群から選択される、請求項１に記載の酵母株。
ＮＡからなる群から選択される、請求項１に記載の酵母株。
【請求項7】
前記抗生物質耐性マーカーが、ハイグロマイシン耐性、ゼオシン耐性、ジェネテシン耐
性及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６に記載の酵母株。
性及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６に記載の酵母株。
【請求項8】
前記ベクターを、電気穿孔法、化学的形質転換、及び接合からなる群から選択される方
法によって前記酵母に挿入する、請求項１に記載の酵母株。
法によって前記酵母に挿入する、請求項１に記載の酵母株。
【請求項9】
非水酸化コラーゲンの製造方法であって：
（ｉ）請求項１の酵母株を提供し；及び
（ｉｉ）コラーゲンを産生するのに十分な期間、培地中で前記株を増殖させることを含
む、前記製造方法。
（ｉ）請求項１の酵母株を提供し；及び
（ｉｉ）コラーゲンを産生するのに十分な期間、培地中で前記株を増殖させることを含
む、前記製造方法。
【請求項10】
前記酵母株が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来の
ものからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来の
ものからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記培地が、緩衝グリセロール複合培地（ＢＭＧＹ）、緩衝メタノール複合培地（ＢＭ
ＭＹ）、及び酵母抽出ペプトンデキストロース（ＹＰＤ）からなる群から選択される、請
求項９に記載の方法。
ＭＹ）、及び酵母抽出ペプトンデキストロース（ＹＰＤ）からなる群から選択される、請
求項９に記載の方法。
【請求項12】
前記期間が、２４時間～７２時間である、請求項９に記載の方法。
【請求項13】
前記酵母が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のも
のからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のも
のからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項14】
前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ
、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン及びそれらの組み合わ
せからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン及びそれらの組み合わ
せからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項15】
前記プロモーターのＤＮＡ配列が、前記ｐＨＴＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮ
Ａ及び前記ｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群か
ら選択される、請求項９に記載の方法。
Ａ及び前記ｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群か
ら選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項16】
前記選択マーカーのＤＮＡ配列が、前記抗生物質耐性ＤＮＡのＤＮＡ及び前記栄養要求
性マーカーのＤＮＡからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
性マーカーのＤＮＡからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項17】
水酸化コラーゲンを産生する遺伝子改変酵母株であって：
（ｉ）酵母株；
（ｉｉ）コラーゲンのＤＮＡ配列；コラーゲンプロモーターのＤＮＡ配列；ターミネー
ターのＤＮＡ配列；選択マーカーのＤＮＡ配列；前記選択マーカー用のプロモーターのＤ
ＮＡ配列；前記選択マーカー用のターミネーターのＤＮＡ配列；細菌及び／または酵母の
複製起点のＤＮＡ配列；前記酵母のゲノムと相同性を有するＤＮＡ配列を含むベクターで
あって；前記ベクターが前記酵母株に挿入されている、前記ベクター；ならびに
（ｉｉｉ）Ｐ４ＨＡ１のＤＮＡ配列；Ｐ４ＨＢのＤＮＡ配列；及びプロモーター用の少
なくとも１つのＤＮＡ配列を含む第二のベクターであって；前記ベクターが前記酵母株に
挿入されている、前記第二のベクター
を含む、前記遺伝子改変酵母株。
（ｉ）酵母株；
（ｉｉ）コラーゲンのＤＮＡ配列；コラーゲンプロモーターのＤＮＡ配列；ターミネー
ターのＤＮＡ配列；選択マーカーのＤＮＡ配列；前記選択マーカー用のプロモーターのＤ
ＮＡ配列；前記選択マーカー用のターミネーターのＤＮＡ配列；細菌及び／または酵母の
複製起点のＤＮＡ配列；前記酵母のゲノムと相同性を有するＤＮＡ配列を含むベクターで
あって；前記ベクターが前記酵母株に挿入されている、前記ベクター；ならびに
（ｉｉｉ）Ｐ４ＨＡ１のＤＮＡ配列；Ｐ４ＨＢのＤＮＡ配列；及びプロモーター用の少
なくとも１つのＤＮＡ配列を含む第二のベクターであって；前記ベクターが前記酵母株に
挿入されている、前記第二のベクター
を含む、前記遺伝子改変酵母株。
【請求項18】
前記酵母株が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来の
ものからなる群から選択される、請求項１７に記載の酵母株。
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来の
ものからなる群から選択される、請求項１７に記載の酵母株。
【請求項19】
前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ
、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン及びそれらの組み合わ
せからなる群から選択される、請求項１７に記載の酵母株。
、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン及びそれらの組み合わ
せからなる群から選択される、請求項１７に記載の酵母株。
【請求項20】
前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、天然コラーゲンＤＮＡ、改変（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ
）コラーゲンＤＮＡ及び改変（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）コラーゲンＤＮＡから選択される、請
求項１７に記載の酵母株。
）コラーゲンＤＮＡ及び改変（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）コラーゲンＤＮＡから選択される、請
求項１７に記載の酵母株。
【請求項21】
前記プロモーターのＤＮＡ配列が、前記ＡＯＸ１メタノール誘導性プロモーターのＤＮ
Ａ、前記ｐＤＦ抑制解除プロモーターのＤＮＡ、前記ｐＣＡＴ抑制解除プロモーターのＤ
ＮＡ、前記Ｄａｓ１－Ｄａｓ２メタノール誘導性二方向性プロモーターのＤＮＡ、前記ｐ
ＨＴＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ、前記ｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二
方向性プロモーターのＤＮＡ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求
項１７に記載の酵母株。
Ａ、前記ｐＤＦ抑制解除プロモーターのＤＮＡ、前記ｐＣＡＴ抑制解除プロモーターのＤ
ＮＡ、前記Ｄａｓ１－Ｄａｓ２メタノール誘導性二方向性プロモーターのＤＮＡ、前記ｐ
ＨＴＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ、前記ｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二
方向性プロモーターのＤＮＡ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求
項１７に記載の酵母株。
【請求項22】
前記プロモーターのＤＮＡ配列が、前記ｐＨＴＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮ
Ａ及び前記ｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群か
ら選択される、請求項１７に記載の酵母株。
Ａ及び前記ｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群か
ら選択される、請求項１７に記載の酵母株。
【請求項23】
前記選択マーカーの前記ＤＮＡ配列が、前記抗生物質耐性ＤＮＡのＤＮＡ及び前記栄養
要求性マーカーのＤＮＡからなる群から選択される、請求項１７に記載の酵母株。
要求性マーカーのＤＮＡからなる群から選択される、請求項１７に記載の酵母株。
【請求項24】
前記選択マーカーが、ハイグロマイシン耐性、ゼオシン耐性、ジェネテシン耐性及びそ
れらの組み合わせからなる群から選択される抗生物質耐性の選択マーカーである、請求項
２３に記載の酵母株。
れらの組み合わせからなる群から選択される抗生物質耐性の選択マーカーである、請求項
２３に記載の酵母株。
【請求項25】
前記ベクターを、電気穿孔法、化学的形質転換、及び接合からなる群から選択される方
法によって前記酵母に挿入する、請求項１７に記載の酵母株。
法によって前記酵母に挿入する、請求項１７に記載の酵母株。
【請求項26】
水酸化コラーゲンの製造方法であって：
（ｉ）請求項１７の酵母株を提供し；及び
（ｉｉ）コラーゲンを産生するのに十分な期間、培地中で前記株を増殖させることを含
む、前記製造方法。
（ｉ）請求項１７の酵母株を提供し；及び
（ｉｉ）コラーゲンを産生するのに十分な期間、培地中で前記株を増殖させることを含
む、前記製造方法。
【請求項27】
前記酵母株が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｈａｎｓ
ｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組
み合わせ由来のものからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
ｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組
み合わせ由来のものからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記培地が、ＢＭＧＹ、ＢＭＭＹ、及びＹＰＤからなる群から選択される、請求項２６
に記載の方法。
に記載の方法。
【請求項29】
前記期間が、２４時間～７２時間である、請求項２６に記載の方法。
【請求項30】
前記酵母が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｈａｎｓｅ
ｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み
合わせ由来のものからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
ｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み
合わせ由来のものからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項31】
前記コラーゲンのＤＮＡが、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キ
リン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン及びそれらの組み合わせか
らなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
リン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン及びそれらの組み合わせか
らなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項32】
前記プロモーターのＤＮＡが、前記ｐＴＨＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及
び前記ｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選
択される、請求項２６に記載の方法。
び前記ｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選
択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項33】
前記選択マーカーのＤＮＡが、前記抗生物質耐性ＤＮＡのＤＮＡ及び前記栄養要求性マ
ーカーのＤＮＡからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
ーカーのＤＮＡからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項34】
（ｉ）プロモーター及びターミネーターを含む、コラーゲン産生に必要なＤＮＡ；
（ｉｉ）プロモーター及びターミネーターを含む、Ｐ４ＨＡ１及びＰ４ＨＢからなる群
から選択される水酸化酵素のＤＮＡ；
（ｉｉｉ）プロモーター及びターミネーターを含む、選択マーカーのＤＮＡ；
（ｉｖ）酵母及び細菌の複製起点のＤＮＡ；
（ｖ）ゲノムに組み込むために前記酵母のゲノムに対して相同性を有するＤＮＡ；なら
びに
（ｖｉ）モジュラー式クローニングを可能にする、上記のＤＮＡ内の５’、３’、及び
それらの組み合わせからなる群から選択される位置の制限酵素部位
を有する、オールインワンベクター。
（ｉｉ）プロモーター及びターミネーターを含む、Ｐ４ＨＡ１及びＰ４ＨＢからなる群
から選択される水酸化酵素のＤＮＡ；
（ｉｉｉ）プロモーター及びターミネーターを含む、選択マーカーのＤＮＡ；
（ｉｖ）酵母及び細菌の複製起点のＤＮＡ；
（ｖ）ゲノムに組み込むために前記酵母のゲノムに対して相同性を有するＤＮＡ；なら
びに
（ｖｉ）モジュラー式クローニングを可能にする、上記のＤＮＡ内の５’、３’、及び
それらの組み合わせからなる群から選択される位置の制限酵素部位
を有する、オールインワンベクター。
【請求項35】
コラーゲン産生に必要な前記ＤＮＡ配列が、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダ
イル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン、及びそれ
らの組み合わせからなる群から選択される、請求項３４に記載のオールインワンベクター
。
イル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン、及びそれ
らの組み合わせからなる群から選択される、請求項３４に記載のオールインワンベクター
。
【請求項36】
前記プロモーターのＤＮＡ配列が、前記ｐＴＨＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮ
Ａ及び前記ｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群か
ら選択される、請求項３４に記載のオールインワンベクター。
Ａ及び前記ｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群か
ら選択される、請求項３４に記載のオールインワンベクター。
【請求項37】
前記選択マーカーのＤＮＡ配列が、前記抗生物質耐性のＤＮＡ及び前記栄養要求性マー
カーのＤＮＡである、請求項３４に記載のオールインワンベクター。
カーのＤＮＡである、請求項３４に記載のオールインワンベクター。
【請求項38】
前記選択マーカーが、ハイグロマイシン、ゼオシン、ジェネテシン及びそれらの組み合
わせからなる群から選択される抗生物質に対する抗生物質耐性の選択マーカーである、請
求項３７に記載のオールインワンベクター。
わせからなる群から選択される抗生物質に対する抗生物質耐性の選択マーカーである、請
求項３７に記載のオールインワンベクター。
【請求項39】
最適化したＤＮＡを、キメラコラーゲンＤＮＡの全長に基づいて１０～４０％または６
０～９０％含む、キメラコラーゲンＤＮＡ配列。
０～９０％含む、キメラコラーゲンＤＮＡ配列。
【請求項40】
前記最適化したＤＮＡが、Ｃ末端から始まる、請求項３９に記載のキメラコラーゲンＤ
ＮＡ配列。
ＮＡ配列。
【請求項41】
前記最適化したＤＮＡが、Ｎ末端から始まる、請求項３９に記載のキメラコラーゲンＤ
ＮＡ配列。
ＮＡ配列。
【請求項42】
請求項３９に記載のキメラコラーゲンのＤＮＡ配列；
コラーゲンプロモーターのＤＮＡ配列；
ターミネーターのＤＮＡ配列；選択マーカーのＤＮＡ配列；
前記選択マーカー用のプロモーターのＤＮＡ配列；
前記選択マーカー用のターミネーターのＤＮＡ配列；
細菌及び／または酵母の複製起点のＤＮＡ配列；及び
前記酵母のゲノムと相同性を有するＤＮＡ配列
を含むベクターを保有する、コラーゲン産生酵母株。
コラーゲンプロモーターのＤＮＡ配列；
ターミネーターのＤＮＡ配列；選択マーカーのＤＮＡ配列；
前記選択マーカー用のプロモーターのＤＮＡ配列；
前記選択マーカー用のターミネーターのＤＮＡ配列；
細菌及び／または酵母の複製起点のＤＮＡ配列；及び
前記酵母のゲノムと相同性を有するＤＮＡ配列
を含むベクターを保有する、コラーゲン産生酵母株。
【請求項43】
前記プロモーターのＤＮＡが、前記ｐＴＨＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及
び前記ｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選
択される、請求項４２に記載の酵母株。
び前記ｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選
択される、請求項４２に記載の酵母株。
【請求項44】
前記選択マーカーのＤＮＡが、前記少なくとも１つの抗生物質耐性をコードするＤＮＡ
及び少なくとも１つの栄養要求性マーカーをコードするＤＮＡからなる群から選択される
、請求項４２に記載の酵母株。
及び少なくとも１つの栄養要求性マーカーをコードするＤＮＡからなる群から選択される
、請求項４２に記載の酵母株。
【請求項45】
水酸化コラーゲンの製造方法であって：
（ｉ）請求項４２のコラーゲン産生酵母株を提供し；及び
（ｉｉ）コラーゲンを産生するのに十分な期間、培地中で前記株を増殖させることを含
む、前記製造方法。
（ｉ）請求項４２のコラーゲン産生酵母株を提供し；及び
（ｉｉ）コラーゲンを産生するのに十分な期間、培地中で前記株を増殖させることを含
む、前記製造方法。
【請求項46】
前記酵母株が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来の
ものからなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来の
ものからなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項47】
前記培地が、緩衝グリセロール複合培地、緩衝メタノール複合培地、及び酵母抽出ペプ
トンデキストロースからなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
トンデキストロースからなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項48】
前記期間が、２４時間～７２時間の範囲である、請求項４５に記載の方法。
【請求項49】
前記酵母株が、前記ｐＴＨＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及び前記ｐＧＣＷ
１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択されるプロモ
ーターを含む、請求項４５に記載の方法。
１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択されるプロモ
ーターを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項50】
前記酵母株が、抗生物質耐性をコードするＤＮＡ及び栄養要求性マーカーをコードする
ＤＮＡからなる群から選択される少なくとも１つの選択マーカーを含む、請求項４５に記
載の方法。
ＤＮＡからなる群から選択される少なくとも１つの選択マーカーを含む、請求項４５に記
載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１７年７月３１日に出願された米国仮出願第６２／５３９，２１３号の
優先権を主張し、前記文献はその全体を参照として本明細書に援用される。
本出願は、２０１７年７月３１日に出願された米国仮出願第６２／５３９，２１３号の
優先権を主張し、前記文献はその全体を参照として本明細書に援用される。
【0002】
本出願は、タイトル名Ｂｉｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｃｏｎｔａｉ
ｎｉｎｇ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｆｉｂｒｉｌｓの米国特許出願第１５／４３３，５６６号
及びタイトル名Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｍａｋｉｎｇ ａ Ｂｉｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ
Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｆｉｂｒｉｌｓの第１
５／４３３，６５０号に関連し、これらの文献は参照として本明細書に援用される。
ｎｉｎｇ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｆｉｂｒｉｌｓの米国特許出願第１５／４３３，５６６号
及びタイトル名Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｍａｋｉｎｇ ａ Ｂｉｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ
Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｆｉｂｒｉｌｓの第１
５／４３３，６５０号に関連し、これらの文献は参照として本明細書に援用される。
【0003】
発明の分野
本発明は、遺伝子組換え酵母株、及び組換えまたは人工コラーゲンを含有するバイオフ
ァブリケートレザーまたは皮革様特性を有する物質を製造するために用いる組換えコラー
ゲンの製造方法に関する。酵母株を改変し、酵母株が、特定の組換えコラーゲン水酸化度
を選択することによって組換えコラーゲンの構造的及び質感上の特性を調節できるように
する。これにより、例えば様々な異なる動物試験を行っていない及び環境保護的なバイオ
ファブリケートレザー及び同様の素材に組み込むために、特定の最終用途に組換えコラー
ゲンの特性を適合させることが可能になる。
本発明は、遺伝子組換え酵母株、及び組換えまたは人工コラーゲンを含有するバイオフ
ァブリケートレザーまたは皮革様特性を有する物質を製造するために用いる組換えコラー
ゲンの製造方法に関する。酵母株を改変し、酵母株が、特定の組換えコラーゲン水酸化度
を選択することによって組換えコラーゲンの構造的及び質感上の特性を調節できるように
する。これにより、例えば様々な異なる動物試験を行っていない及び環境保護的なバイオ
ファブリケートレザー及び同様の素材に組み込むために、特定の最終用途に組換えコラー
ゲンの特性を適合させることが可能になる。
【0004】
関連技術の説明
皮革は、家具の室内装飾品、衣類、靴、荷物、ハンドバッグ及びアクセサリー、ならび
に自動車用途など、広範囲の用途に使用されている。皮革の世界貿易推定額は、年間およ
そ１０００億ドルであり（Ｆｕｔｕｒｅ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｗｏｒｌｄ Ｌ
ｅａｔｈｅｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｒａｄｅ， Ｕｎｉｔ
ｅｄ Ｎａｔｉｏｎｓ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｏｒｇａｎｉ
ｚａｔｉｏｎ、ウィーン、２０１０）、皮革製品の需要は継続してますます高まっている
。皮革を製造する経済的、環境的、社会的コストの観点から、この需要を満たす新規方法
が必要とされている。皮革製品の生産者及びユーザーは、技術的及び審美的トレンドに追
いつくために、優れた強度、均一性、加工性及び天然成分を組み込んだファッショナブル
かつ魅力的な審美的特性を示す新規素材を探求している。
皮革は、家具の室内装飾品、衣類、靴、荷物、ハンドバッグ及びアクセサリー、ならび
に自動車用途など、広範囲の用途に使用されている。皮革の世界貿易推定額は、年間およ
そ１０００億ドルであり（Ｆｕｔｕｒｅ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｗｏｒｌｄ Ｌ
ｅａｔｈｅｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｒａｄｅ， Ｕｎｉｔ
ｅｄ Ｎａｔｉｏｎｓ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｏｒｇａｎｉ
ｚａｔｉｏｎ、ウィーン、２０１０）、皮革製品の需要は継続してますます高まっている
。皮革を製造する経済的、環境的、社会的コストの観点から、この需要を満たす新規方法
が必要とされている。皮革製品の生産者及びユーザーは、技術的及び審美的トレンドに追
いつくために、優れた強度、均一性、加工性及び天然成分を組み込んだファッショナブル
かつ魅力的な審美的特性を示す新規素材を探求している。
【0005】
人口増加と地球環境を考慮すると、皮革様の審美性を備え、機能性が向上した代替素材
が必要となるだろう。皮革は、動物の皮であり、ほぼすべてがコラーゲンからなる。バイ
オファブリケートレザー素材に組込み可能な新規コラーゲン供給源が必要である。
が必要となるだろう。皮革は、動物の皮であり、ほぼすべてがコラーゲンからなる。バイ
オファブリケートレザー素材に組込み可能な新規コラーゲン供給源が必要である。
【0006】
組換え発現コラーゲンを用いたバイオファブリケートレザーの製造は、多様な商業的用
途に必要とされる形態及び量のコラーゲンを効率的に製造する方法が必要であることをは
じめとして、多くの課題に直面している。いくつかの用途では、より柔らかくより浸透性
の高いコラーゲン成分が望ましく；他の用途では、より硬く、より耐久性が高く丈夫なコ
ラーゲン成分が必要である。
途に必要とされる形態及び量のコラーゲンを効率的に製造する方法が必要であることをは
じめとして、多くの課題に直面している。いくつかの用途では、より柔らかくより浸透性
の高いコラーゲン成分が望ましく；他の用途では、より硬く、より耐久性が高く丈夫なコ
ラーゲン成分が必要である。
【0007】
いくつかのコラーゲン及びコラーゲン様タンパク質の組換え発現が公知であり；Ｂｅｌ
ｌ，ＥＰ１２３２１８２Ｂ１，Ｂｏｖｉｎｅ ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ
ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｇｅｌａｔｉｎ；Ｏｌｓｅｎ
，ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，４２８，９７８号，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｌａｔｉｎ ａｎｄ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｔｒ
ｉｐｌｅ ｈｅｌｉｃａｌ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃｅｌ
ｌｓ；ＶａｎＨｅｅｒｄｅ，ｅｔ ａｌ．，米国特許第８，１８８，２３０号，Ｍｅｔｈ
ｏｄ ｆｏｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｏｎ ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ－ｌｉｋｅ ｐｏｌｙｐ
ｅｐｔｉｄｅｓを参照されたく、これらの開示は参照として本明細書に援用される。こう
した組換えコラーゲンは、皮革製品またはバイオファブリケートレザー製品を製造するた
めには使用されてこなかった。
ｌ，ＥＰ１２３２１８２Ｂ１，Ｂｏｖｉｎｅ ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ
ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｇｅｌａｔｉｎ；Ｏｌｓｅｎ
，ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，４２８，９７８号，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｌａｔｉｎ ａｎｄ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｔｒ
ｉｐｌｅ ｈｅｌｉｃａｌ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃｅｌ
ｌｓ；ＶａｎＨｅｅｒｄｅ，ｅｔ ａｌ．，米国特許第８，１８８，２３０号，Ｍｅｔｈ
ｏｄ ｆｏｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｏｎ ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ－ｌｉｋｅ ｐｏｌｙｐ
ｅｐｔｉｄｅｓを参照されたく、これらの開示は参照として本明細書に援用される。こう
した組換えコラーゲンは、皮革製品またはバイオファブリケートレザー製品を製造するた
めには使用されてこなかった。
【0008】
酵母でのタンパク質発現に有用なベクターは公知であり；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ
．，Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，Ｃｈａｐｔｅｒ １３ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ａｓｓｏ
ｃ． ＆ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８；Ｇｒａｎｔ ｅｔ ａｌ
．（１９８７），Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ
ｆｏｒ Ｙｅａｓｔ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｅｄ．Ｗ
ｕ ＆ Ｇｒｏｓｓｍａｎ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．１５３：５１６－５４４；
Ｇｌｏｖｅｒ（１９８６）ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．ＩＩ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ
，Ｗａｓｈ．，Ｄ．Ｃ．，Ｃｈ．３；Ｂｉｔｔｅｒ（１９８７），Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏ
ｕｓ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｙｅａｓｔ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ｂｅｒｇｅｒ ＆ Ｋｉｍｍｅｌ，Ａｃａｄ．Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．１５２：６７３－６８４；及びＴｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｅｄｓ．Ｓｔｒａｔ
ｈｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｖｏｌ
ｓ．Ｉ ａｎｄ ＩＩ（１９８２）を参照されたく、これらの開示は参照として本明細書
に援用される。酵母発現ベクターは、例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔ
ｉｆｉｃ（ｗｗｗ．＿ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ）；ＡＴＵＭ（ｈｔｔｐｓ：／
／ｗｗｗ．＿ａｔｕｍ．ｂｉｏ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ－ｖｅｃｔｏ
ｒｓ／ｙｅａｓｔ）；またはＩＢＡ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．＿ｉｂａ－ｌｉｆｅｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｃｌｏｎｉｎｇ－ｙｅａｓｔ－ｖｅｃｔｏｒｓ．ｈｔｍｌ）のカ
タログに記載されているように、市販されている（それぞれ、最終アクセス日は２０１８
年７月１６日であり、これらを参照として援用する）。
．，Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，Ｃｈａｐｔｅｒ １３ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ａｓｓｏ
ｃ． ＆ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８；Ｇｒａｎｔ ｅｔ ａｌ
．（１９８７），Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ
ｆｏｒ Ｙｅａｓｔ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｅｄ．Ｗ
ｕ ＆ Ｇｒｏｓｓｍａｎ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．１５３：５１６－５４４；
Ｇｌｏｖｅｒ（１９８６）ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．ＩＩ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ
，Ｗａｓｈ．，Ｄ．Ｃ．，Ｃｈ．３；Ｂｉｔｔｅｒ（１９８７），Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏ
ｕｓ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｙｅａｓｔ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ｂｅｒｇｅｒ ＆ Ｋｉｍｍｅｌ，Ａｃａｄ．Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．１５２：６７３－６８４；及びＴｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｅｄｓ．Ｓｔｒａｔ
ｈｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｖｏｌ
ｓ．Ｉ ａｎｄ ＩＩ（１９８２）を参照されたく、これらの開示は参照として本明細書
に援用される。酵母発現ベクターは、例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔ
ｉｆｉｃ（ｗｗｗ．＿ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ）；ＡＴＵＭ（ｈｔｔｐｓ：／
／ｗｗｗ．＿ａｔｕｍ．ｂｉｏ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ－ｖｅｃｔｏ
ｒｓ／ｙｅａｓｔ）；またはＩＢＡ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．＿ｉｂａ－ｌｉｆｅｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｃｌｏｎｉｎｇ－ｙｅａｓｔ－ｖｅｃｔｏｒｓ．ｈｔｍｌ）のカ
タログに記載されているように、市販されている（それぞれ、最終アクセス日は２０１８
年７月１６日であり、これらを参照として援用する）。
【0009】
Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓは、ヒトインターフェロンγなどの生体治療用タンパ
ク質を組換え発現するために使用されている酵母種である（Ｒａｚａｇｈｉ，ｅｔ ａｌ
．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ４５：５２－６０（２０１７）参照）。この酵母種は、Ｉ
ＩＩ型コラーゲン及びプロリル－４－ヒドロキシラーゼを発現するために使用されている
（Ｖｕｏｒｅｌａ， ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１６：６７０２－６７１２（１９９
７）参照）。コラーゲン及びプロリル－４－ヒドロキシラーゼもまた、コラーゲン性物質
を産生するためにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現されている（Ｐｉｎｋａｓ
，ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．６（４）：３２０－３２４（２０１１）
参照）。
ク質を組換え発現するために使用されている酵母種である（Ｒａｚａｇｈｉ，ｅｔ ａｌ
．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ４５：５２－６０（２０１７）参照）。この酵母種は、Ｉ
ＩＩ型コラーゲン及びプロリル－４－ヒドロキシラーゼを発現するために使用されている
（Ｖｕｏｒｅｌａ， ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１６：６７０２－６７１２（１９９
７）参照）。コラーゲン及びプロリル－４－ヒドロキシラーゼもまた、コラーゲン性物質
を産生するためにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で発現されている（Ｐｉｎｋａｓ
，ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．６（４）：３２０－３２４（２０１１）
参照）。
【0010】
コドン改変を用いて、選択した水酸化度を有するトロポコラーゲンを提供し、したがっ
て、生物工学による皮革の製造に使用するための、ある範囲の異なるコラーゲン素材を提
供することは、従前には検討されてこなかった。
て、生物工学による皮革の製造に使用するための、ある範囲の異なるコラーゲン素材を提
供することは、従前には検討されてこなかった。
【0011】
本発明者らは、選択した水酸化度を特徴とする様々な形態のコラーゲンを豊富に発現可
能な組換え酵母を設計することにより、これらの課題に取り組むことを試みた。
能な組換え酵母を設計することにより、これらの課題に取り組むことを試みた。
【0012】
発明の概要
本発明の一態様は、コラーゲンを効率的に発現させ、発現するコラーゲン中のリジン残
基及びプロリン残基の水酸化度を調節するように改変した組換え酵母株に関する。本発明
のこの態様は、コラーゲン中のリジン、プロリン、またはリジンとプロリン残基の数に基
づいて、選択した水酸化度のリジン、プロリン、またはリジンとプロリン残基を有する組
換えコラーゲンを発現することができる組換え酵母を提供する。コラーゲンの水酸化度は
、コラーゲン三重らせんまたはトロポコラーゲンの弛緩度または緊密度、ならびに組換え
コラーゲンで作製したバイオファブリケートレザーなどの製品の機能的及び審美的特性と
相関する。
本発明の一態様は、コラーゲンを効率的に発現させ、発現するコラーゲン中のリジン残
基及びプロリン残基の水酸化度を調節するように改変した組換え酵母株に関する。本発明
のこの態様は、コラーゲン中のリジン、プロリン、またはリジンとプロリン残基の数に基
づいて、選択した水酸化度のリジン、プロリン、またはリジンとプロリン残基を有する組
換えコラーゲンを発現することができる組換え酵母を提供する。コラーゲンの水酸化度は
、コラーゲン三重らせんまたはトロポコラーゲンの弛緩度または緊密度、ならびに組換え
コラーゲンで作製したバイオファブリケートレザーなどの製品の機能的及び審美的特性と
相関する。
【0013】
本発明の他の実施形態は、コラーゲンまたはヒドロキシラーゼをコードするコドン改変
核酸配列、コラーゲン及びヒドロキシラーゼ（複数可）をコードする「オールインワンベ
クター」などのベクター、及び組換えコラーゲンの産生方法及び使用方法を含む。別の実
施形態では、本発明は、水酸化及び非水酸化コラーゲンの製造に有用な酵母宿主内のキメ
ラＤＮＡ配列を提供する。
核酸配列、コラーゲン及びヒドロキシラーゼ（複数可）をコードする「オールインワンベ
クター」などのベクター、及び組換えコラーゲンの産生方法及び使用方法を含む。別の実
施形態では、本発明は、水酸化及び非水酸化コラーゲンの製造に有用な酵母宿主内のキメ
ラＤＮＡ配列を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】非水酸化コラーゲンを産生するように設計したＭＭＶ－６３ベクターの図を示す。
【図2】非水酸化コラーゲンを産生するように設計したＭＭＶ－７７ベクターの図を示す。
【図3】非水酸化コラーゲンを産生するように設計されたＭＭＶ－１２９ベクターの図を示す。
【図4】非水酸化コラーゲンを産生するように設計されたＭＭＶ－１３０ベクターの図を示す。
【図5】水酸化コラーゲンを産生するように設計されたＭＭＶ－７８ベクターの図を示す。
【図6】水酸化コラーゲンを産生するように設計されたＭＭＶ－９４ベクターの図を示す。
【図7】水酸化コラーゲンを産生するように設計されたＭＭＶ－１５６ベクターの図を示す。
【図8】水酸化コラーゲンを産生するように設計されたＭＭＶ－１９１ベクターの図を示す。
【図9】非水酸化または水酸化コラーゲンを産生するように設計されたオールインワンベクターＭＭＶ－２０８を示す。
【図10】ＭＭＶ－８４ベクターの図を示す。
【図11】ＭＭＶ－１５０ベクターの図を示す。
【図12】ＭＭＶ－１４０ベクターの図を示す。
【図13】ＭＭＶ－１３２ベクターの図を示す。
【図14】ＭＭＶ－１９３ベクターの図を示す。
【図15】ＭＭＶ－１９４ベクターの図を示す。
【図16】ＭＭＶ－１９５ベクターの図を示す。
【図17】ＭＭＶ－１９７ベクターの図を示す。
【図18】ＭＭＶ－１９８ベクターの図を示す。
【図19】ＭＭＶ－１９９ベクターの図を示す。
【図20】ＭＭＶ－２００ベクターの図を示す。
【図21】ＭＭＶ－１２８ベクターの図を示す。
【図22】Ｃｏｌ３Ａ１キメラ分子を記載する。
【0015】
発明の詳細な説明
本明細書に例示するように、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓを用いて、異なる水酸化
度を有する組換えＩＩＩ型ウシコラーゲンを発現させた。組換えコラーゲンの水酸化は、
ウシプロリル－４－ヒドロキシラーゼの、それぞれα及びβサブユニットをコードするウ
シＰ４ＨＡ及びウシＰ４ＨＢの同時発現によって達成される。しかしながら、本発明は、
ＩＩＩ型コラーゲンの産物及び発現に限定されず、他の種類のコラーゲンのサブユニット
をコードするポリヌクレオチドならびにプロリン残基、リジン残基、またはプロリン残基
とリジン残基の両方を水酸化する酵素で実施することができる。ＩＩＩ型トロポコラーゲ
ンはホモ三量体である。しかしながら、いくつかの実施形態では、コラーゲンは、最初に
２つのプロα１（Ｉ）鎖及び１つのプロα２（Ｉ）鎖から構成されるＩ型コラーゲンなど
の異なるポリペプチド鎖から構成されるヘテロ三量体を形成する。
本明細書に例示するように、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓを用いて、異なる水酸化
度を有する組換えＩＩＩ型ウシコラーゲンを発現させた。組換えコラーゲンの水酸化は、
ウシプロリル－４－ヒドロキシラーゼの、それぞれα及びβサブユニットをコードするウ
シＰ４ＨＡ及びウシＰ４ＨＢの同時発現によって達成される。しかしながら、本発明は、
ＩＩＩ型コラーゲンの産物及び発現に限定されず、他の種類のコラーゲンのサブユニット
をコードするポリヌクレオチドならびにプロリン残基、リジン残基、またはプロリン残基
とリジン残基の両方を水酸化する酵素で実施することができる。ＩＩＩ型トロポコラーゲ
ンはホモ三量体である。しかしながら、いくつかの実施形態では、コラーゲンは、最初に
２つのプロα１（Ｉ）鎖及び１つのプロα２（Ｉ）鎖から構成されるＩ型コラーゲンなど
の異なるポリペプチド鎖から構成されるヘテロ三量体を形成する。
【0016】
コラーゲン。コラーゲンは皮革の主成分である。皮膚、または動物の皮は、繊維状タン
パク質であるコラーゲンを相当量含有する。コラーゲンは、少なくとも２８の異なるコラ
ーゲン型のファミリーの総称であり；動物の皮膚は一般的にはＩ型コラーゲンであるが、
ＩＩＩ型コラーゲンを含有する皮革の形成に他の型のコラーゲンを使用することができる
。用語「コラーゲン」は、未処理（例えば、プロコラーゲン）ならびに三重らせん構造を
有する翻訳後修飾及びタンパク質分解を受けたコラーゲンを包含する。
パク質であるコラーゲンを相当量含有する。コラーゲンは、少なくとも２８の異なるコラ
ーゲン型のファミリーの総称であり；動物の皮膚は一般的にはＩ型コラーゲンであるが、
ＩＩＩ型コラーゲンを含有する皮革の形成に他の型のコラーゲンを使用することができる
。用語「コラーゲン」は、未処理（例えば、プロコラーゲン）ならびに三重らせん構造を
有する翻訳後修飾及びタンパク質分解を受けたコラーゲンを包含する。
【0017】
コラーゲンは、アミノ酸トリプレットの反復である－（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）ｎ－を特徴と
し、コラーゲン中のアミノ酸残基のおよそ３分の１はグリシンである。Ｘは多くの場合プ
ロリンであり、Ｙは多くの場合ヒドロキシプロリンであるが、最大４００の可能なＧｌｙ
－Ｘ－Ｙトリプレットが存在し得る。異なる動物が異なるアミノ酸組成を有するコラーゲ
ンを産生し、コラーゲン上に異なる特性を付与し、異なる特性または外観を有するレザー
を産生することができる。
し、コラーゲン中のアミノ酸残基のおよそ３分の１はグリシンである。Ｘは多くの場合プ
ロリンであり、Ｙは多くの場合ヒドロキシプロリンであるが、最大４００の可能なＧｌｙ
－Ｘ－Ｙトリプレットが存在し得る。異なる動物が異なるアミノ酸組成を有するコラーゲ
ンを産生し、コラーゲン上に異なる特性を付与し、異なる特性または外観を有するレザー
を産生することができる。
【0018】
コラーゲンの構造は、長さの異なる３つの絡み合ったペプチド鎖からなり得る。コラー
ゲン三重らせん（または単量体）は、約１，０５０アミノ酸長のα鎖から生成される場合
があり、その結果、三重らせんはおよそ３００ｎｍの長さの棒状の形態をとっており、直
径はおよそ１．５ｎｍである。
ゲン三重らせん（または単量体）は、約１，０５０アミノ酸長のα鎖から生成される場合
があり、その結果、三重らせんはおよそ３００ｎｍの長さの棒状の形態をとっており、直
径はおよそ１．５ｎｍである。
【0019】
コラーゲン繊維は、動物の皮の種類に応じて、ある範囲の直径を有し得る。Ｉ型コラー
ゲンに加えて、皮膚（皮）には、ＩＩＩ型コラーゲン（レティキュリン）、ＩＶ型コラー
ゲン、及びＶＩＩ型コラーゲンを含む他の型のコラーゲンも含まれ得る。
ゲンに加えて、皮膚（皮）には、ＩＩＩ型コラーゲン（レティキュリン）、ＩＶ型コラー
ゲン、及びＶＩＩ型コラーゲンを含む他の型のコラーゲンも含まれ得る。
【0020】
哺乳類の体には様々な型のコラーゲンが存在する。例えば、Ｉ型コラーゲンは、皮膚及
び動物の皮の主成分であるだけでなく、軟骨、腱、血管結紮部、器官、筋肉、及び骨の有
機部分にも存在する。動物の皮膚または皮に加えて、哺乳類の体の様々な領域からコラー
ゲンを単離する試みが成果を収めている。数十年前、研究者らは、中性ｐＨでは、酸可溶
化コラーゲンが、天然組織において観察されるものと同じ横縞模様から構成されるフィブ
リルに自己集合したことを見出した；Ｓｃｈｍｉｔｔ Ｆ．Ｏ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｃｏｍｐ
Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９４２；２０：１１。これにより、組織工学及び様々な生物医学的
用途においてコラーゲンが使用されるようになった。より近年においては、組換え技術を
用いて細菌及び酵母からコラーゲンが回収されるようになった。
び動物の皮の主成分であるだけでなく、軟骨、腱、血管結紮部、器官、筋肉、及び骨の有
機部分にも存在する。動物の皮膚または皮に加えて、哺乳類の体の様々な領域からコラー
ゲンを単離する試みが成果を収めている。数十年前、研究者らは、中性ｐＨでは、酸可溶
化コラーゲンが、天然組織において観察されるものと同じ横縞模様から構成されるフィブ
リルに自己集合したことを見出した；Ｓｃｈｍｉｔｔ Ｆ．Ｏ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｃｏｍｐ
Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９４２；２０：１１。これにより、組織工学及び様々な生物医学的
用途においてコラーゲンが使用されるようになった。より近年においては、組換え技術を
用いて細菌及び酵母からコラーゲンが回収されるようになった。
【0021】
水素結合、ファンデルワールス相互作用、双極子間力、分極力、疎水性相互作用、及び
多くの場合に酵素反応によって触媒される共有結合などの静電相互作用を含む物理的及び
化学的相互作用の組合せによって、コラーゲンが形成及び安定化される。ウシ、ヒツジ、
ブタ、ニワトリ、及びヒトを含む脊椎動物のコラーゲンにおいて、様々な異なるコラーゲ
ン型が同定されている。
多くの場合に酵素反応によって触媒される共有結合などの静電相互作用を含む物理的及び
化学的相互作用の組合せによって、コラーゲンが形成及び安定化される。ウシ、ヒツジ、
ブタ、ニワトリ、及びヒトを含む脊椎動物のコラーゲンにおいて、様々な異なるコラーゲ
ン型が同定されている。
【0022】
本発明は、１つ以上の型のコラーゲンをコードするポリヌクレオチドで実施してもよい
。通常、コラーゲン型はローマ数字で番号付けし、各コラーゲン型で見出される鎖はアラ
ビア数字で識別される。天然に存在するコラーゲンの様々な異なる型の構造及び生物学的
機能の詳細な説明は、当該技術分野で利用可能であり；例えば、Ａｙａｄ ｅｔ ａｌ．
（１９９８）Ｔｈｅ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏ
ｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｂｕｒｇｅｓｏｎ，Ｒ
Ｅ．，ａｎｄ Ｎｉｍｍｉ（１９９２）“Ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅｓ：Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ”ｉ
ｎ Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．２８２：２５０－２７２；Ｋｉｅｌｔｙ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ
ａｌ．（１９９３）“Ｔｈｅ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｆａｍｉｌｙ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，
Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ａｎｄ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｅｘｔｒａｃｅ
ｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ，”Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｄ Ｉｔｓ
Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，
Ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ，Ｒｏｙｃｅ，Ｐ．Ｍ． ａｎｄ Ｂ．Ｓｔｅ
ｉｎｍａｎｎ ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，ＮＹ，ｐｐ．１０３－１４７；及びＰ
ｒｏｃｋｏｐ，Ｄ．Ｊ－ ａｎｄ Ｋ．Ｉ．Ｋｉｖｉｒｉｋｋｏ（１９９５）“Ｃｏｌｌ
ａｇｅｎｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｄｉｓｅａｓｅｓ，ａｎｄ Ｐｏｔ
ｅｎｔｉａｌｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，”Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６
４：４０３－４３４．）参照。
。通常、コラーゲン型はローマ数字で番号付けし、各コラーゲン型で見出される鎖はアラ
ビア数字で識別される。天然に存在するコラーゲンの様々な異なる型の構造及び生物学的
機能の詳細な説明は、当該技術分野で利用可能であり；例えば、Ａｙａｄ ｅｔ ａｌ．
（１９９８）Ｔｈｅ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏ
ｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｂｕｒｇｅｓｏｎ，Ｒ
Ｅ．，ａｎｄ Ｎｉｍｍｉ（１９９２）“Ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅｓ：Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ”ｉ
ｎ Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．２８２：２５０－２７２；Ｋｉｅｌｔｙ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ
ａｌ．（１９９３）“Ｔｈｅ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｆａｍｉｌｙ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，
Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ａｎｄ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｅｘｔｒａｃｅ
ｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ，”Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｄ Ｉｔｓ
Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，
Ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ，Ｒｏｙｃｅ，Ｐ．Ｍ． ａｎｄ Ｂ．Ｓｔｅ
ｉｎｍａｎｎ ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，ＮＹ，ｐｐ．１０３－１４７；及びＰ
ｒｏｃｋｏｐ，Ｄ．Ｊ－ ａｎｄ Ｋ．Ｉ．Ｋｉｖｉｒｉｋｋｏ（１９９５）“Ｃｏｌｌ
ａｇｅｎｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｄｉｓｅａｓｅｓ，ａｎｄ Ｐｏｔ
ｅｎｔｉａｌｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，”Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６
４：４０３－４３４．）参照。
【0023】
Ｉ型コラーゲンは、生物の総コラーゲンのおよそ８０～９０％を含有する骨及び皮膚の
主要な線維性コラーゲンである。Ｉ型コラーゲンは、多細胞生物の細胞外マトリックスに
存在する主要な構造高分子であり、全タンパク質の質量のおよそ２０％を含有する。Ｉ型
コラーゲンは、ＣＯＬ１Ａ１及びＣＯＬ１Ａ２遺伝子によってそれぞれコードされる２つ
のα１（Ｉ）鎖及び１つのα２（Ｉ）鎖を有するヘテロ三量体分子である。ｉｎ ｖｉｖ
ｏにおいては、Ｉ型コラーゲンのフィブリル、繊維、及び繊維束の組み立てが発生中に起
こり、組織に機械的支持を提供する一方で、細胞運動性及び栄養素輸送を可能にする。他
のコラーゲン型は、Ｉ型コラーゲンほど豊富ではなく、異なる分布パターンを示す。例え
ば、ＩＩ型コラーゲンは、軟骨及び硝子体液中で優勢なコラーゲンであり、一方、ＩＩＩ
型コラーゲンは、血管内においては高レベルに、皮膚においては低レベルに見出される。
主要な線維性コラーゲンである。Ｉ型コラーゲンは、多細胞生物の細胞外マトリックスに
存在する主要な構造高分子であり、全タンパク質の質量のおよそ２０％を含有する。Ｉ型
コラーゲンは、ＣＯＬ１Ａ１及びＣＯＬ１Ａ２遺伝子によってそれぞれコードされる２つ
のα１（Ｉ）鎖及び１つのα２（Ｉ）鎖を有するヘテロ三量体分子である。ｉｎ ｖｉｖ
ｏにおいては、Ｉ型コラーゲンのフィブリル、繊維、及び繊維束の組み立てが発生中に起
こり、組織に機械的支持を提供する一方で、細胞運動性及び栄養素輸送を可能にする。他
のコラーゲン型は、Ｉ型コラーゲンほど豊富ではなく、異なる分布パターンを示す。例え
ば、ＩＩ型コラーゲンは、軟骨及び硝子体液中で優勢なコラーゲンであり、一方、ＩＩＩ
型コラーゲンは、血管内においては高レベルに、皮膚においては低レベルに見出される。
【0024】
ＩＩ型コラーゲンは、ＣＯＬ２Ａ１遺伝子によってコードされる３つの同一のａｌ（Ｉ
Ｉ）鎖を有するホモ三量体コラーゲンである。精製ＩＩ型コラーゲンは、例えば、Ｍｉｌ
ｌｅｒ ａｎｄ Ｒｈｏｄｅｓ（１９８２）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ ８２：３３－６４に記載されている手順により、当該分野で公知の方法により、組織
から調製してもよい。
Ｉ）鎖を有するホモ三量体コラーゲンである。精製ＩＩ型コラーゲンは、例えば、Ｍｉｌ
ｌｅｒ ａｎｄ Ｒｈｏｄｅｓ（１９８２）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ ８２：３３－６４に記載されている手順により、当該分野で公知の方法により、組織
から調製してもよい。
【0025】
ＩＩＩ型コラーゲンは、皮膚及び血管組織に認められる主要な線維性コラーゲンである
。ＩＩＩ型コラーゲンは、ＣＯＬ３Ａ１遺伝子によってコードされる３つの同一のα１（
ＩＩＩ）鎖を含むホモ三量体コラーゲンである。ＩＩＩ型コラーゲンを組織から精製する
方法は、例えば、Ｂｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １
３：５２４３－５２４８；及び上記のＭｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｒｈｏｄｅｓに見出すこと
ができ、本発明の方法によって発現させるコラーゲンと併用してもよい。
。ＩＩＩ型コラーゲンは、ＣＯＬ３Ａ１遺伝子によってコードされる３つの同一のα１（
ＩＩＩ）鎖を含むホモ三量体コラーゲンである。ＩＩＩ型コラーゲンを組織から精製する
方法は、例えば、Ｂｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １
３：５２４３－５２４８；及び上記のＭｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｒｈｏｄｅｓに見出すこと
ができ、本発明の方法によって発現させるコラーゲンと併用してもよい。
【0026】
ＩＶ型コラーゲンは、基底膜においてフィブリルよりもむしろシートの形態で見出され
る。最も一般的には、ＩＶ型コラーゲンは２つのα１（ＩＶ）鎖及び１つのα２（ＩＶ）
鎖を有する。特定の鎖を有するＩＶ型コラーゲンは組織特異的である。ＩＶ型コラーゲン
は、例えば、Ｆｕｒｕｔｏ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１４４：４１－６１，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓに記載の手
順を用いて精製してもよい。
る。最も一般的には、ＩＶ型コラーゲンは２つのα１（ＩＶ）鎖及び１つのα２（ＩＶ）
鎖を有する。特定の鎖を有するＩＶ型コラーゲンは組織特異的である。ＩＶ型コラーゲン
は、例えば、Ｆｕｒｕｔｏ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１４４：４１－６１，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓに記載の手
順を用いて精製してもよい。
【0027】
Ｖ型コラーゲンは、主として、骨、腱、角膜、皮膚、及び血管に見出される線維状コラ
ーゲンである。Ｖ型コラーゲンは、ホモ三量体及びヘテロ三量体の両方の形態で存在する
。Ｖ型コラーゲンの一形態は、２つのα１（Ｖ）鎖及び１つのα２（Ｖ）鎖のヘテロ三量
体である。Ｖ型コラーゲンの別の形態は、α１（Ｖ）、α２（Ｖ）及びα３（Ｖ）鎖のヘ
テロ三量体である。Ｖ型コラーゲンのさらなる形態は、α１（Ｖ）のホモ三量体である。
天然源からＶ型コラーゲンを単離する方法は、例えば、Ｅｌｓｔｏｗ ａｎｄ Ｗｅｉｓ
ｓ（１９８３）Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｒｅｌ．Ｒｅｓ．３：１８１－１９３，及びＡｂｅｄ
ｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．２：４９３－５０２に見出すこ
とができる。
ーゲンである。Ｖ型コラーゲンは、ホモ三量体及びヘテロ三量体の両方の形態で存在する
。Ｖ型コラーゲンの一形態は、２つのα１（Ｖ）鎖及び１つのα２（Ｖ）鎖のヘテロ三量
体である。Ｖ型コラーゲンの別の形態は、α１（Ｖ）、α２（Ｖ）及びα３（Ｖ）鎖のヘ
テロ三量体である。Ｖ型コラーゲンのさらなる形態は、α１（Ｖ）のホモ三量体である。
天然源からＶ型コラーゲンを単離する方法は、例えば、Ｅｌｓｔｏｗ ａｎｄ Ｗｅｉｓ
ｓ（１９８３）Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｒｅｌ．Ｒｅｓ．３：１８１－１９３，及びＡｂｅｄ
ｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．２：４９３－５０２に見出すこ
とができる。
【0028】
ＶＩ型コラーゲンは、小さな三重らせん領域及び２つの大きな非コラーゲン性残余部分
を有する。ＶＩ型コラーゲンは、α１（ＶＩ）、α２（ＶＩ）、及びα３（ＶＩ）鎖を有
するヘテロ三量体である。ＶＩ型コラーゲンは、多くの結合組織に認められる。天然源か
らのＶＩ型コラーゲンの精製方法の説明は、例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２４８：３７３－３８１，及びＫｉｅｌｔｙ ｅｔ ａｌ．（１９９
１）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．９９：７９７－８０７に見出すことができる。
を有する。ＶＩ型コラーゲンは、α１（ＶＩ）、α２（ＶＩ）、及びα３（ＶＩ）鎖を有
するヘテロ三量体である。ＶＩ型コラーゲンは、多くの結合組織に認められる。天然源か
らのＶＩ型コラーゲンの精製方法の説明は、例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２４８：３７３－３８１，及びＫｉｅｌｔｙ ｅｔ ａｌ．（１９９
１）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．９９：７９７－８０７に見出すことができる。
【0029】
ＶＩＩ型コラーゲンは、特定の上皮組織に見出される原線維性コラーゲンである。ＶＩ
Ｉ型コラーゲンは、３つのα１（ＶＩＩ）鎖のホモ三量体分子である。組織からＶＩＩ型
コラーゲンを精製する方法の説明は、例えば、Ｌｕｎｓｔｒｕｍ ｅｔ ａｌ．（１９８
６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：９０４２－９０４８，及びＢｅｎｔｚ ｅｔ ａ
ｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：３１６８－３
１７２に見出すことができる。ＶＩＩＩ型コラーゲンは、角膜のデスメ膜に見出すことが
できる。ＶＩＩＩ型コラーゲンは、２つのα１（ＶＩＩＩ）鎖及び１つのα２（ＶＩＩＩ
）鎖を有するヘテロ三量体であるが、他の鎖組成も報告されている。天然由来のＶＩＩＩ
型コラーゲンの精製方法は、例えば、Ｂｅｎｙａ ａｎｄ Ｐａｄｉｌｌａ（１９８６）
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：４１６０－４１６９，及びＫａｐｏｏｒ ｅｔ ａｌ
．（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５：３９３０－３９３７に見出すことがで
きる。
Ｉ型コラーゲンは、３つのα１（ＶＩＩ）鎖のホモ三量体分子である。組織からＶＩＩ型
コラーゲンを精製する方法の説明は、例えば、Ｌｕｎｓｔｒｕｍ ｅｔ ａｌ．（１９８
６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：９０４２－９０４８，及びＢｅｎｔｚ ｅｔ ａ
ｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：３１６８－３
１７２に見出すことができる。ＶＩＩＩ型コラーゲンは、角膜のデスメ膜に見出すことが
できる。ＶＩＩＩ型コラーゲンは、２つのα１（ＶＩＩＩ）鎖及び１つのα２（ＶＩＩＩ
）鎖を有するヘテロ三量体であるが、他の鎖組成も報告されている。天然由来のＶＩＩＩ
型コラーゲンの精製方法は、例えば、Ｂｅｎｙａ ａｎｄ Ｐａｄｉｌｌａ（１９８６）
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：４１６０－４１６９，及びＫａｐｏｏｒ ｅｔ ａｌ
．（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５：３９３０－３９３７に見出すことがで
きる。
【0030】
ＩＸ型コラーゲンは、軟骨及び硝子体液中に見出される繊維付随性コラーゲンである。
ＩＸ型コラーゲンは、α１（ＩＸ）、α２（ＩＸ）、及びα３（ＩＸ）鎖を有するヘテロ
三量体分子である。ＩＸ型コラーゲンは、非三重らせんドメインによって分離されたいく
つかの三重らせんドメインを有する、ＦＡＣＩＴ（断続性三重らせんを有する線維付随性
コラーゲン）コラーゲンとして分類されている。ＩＸ型コラーゲンを精製するための手順
は、例えば、Ｄｕａｎｃｅ，ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２２１：８
８５－８８９；Ａｙａｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２６２：７５
３－７６１；及びＧｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｔｈｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ
Ｔｉｓｓｕｅ Ｄａｍａｇｅ，Ｇｌａｕｅｒｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ
Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ｐｐ．３－２８に見出
すことができる。
ＩＸ型コラーゲンは、α１（ＩＸ）、α２（ＩＸ）、及びα３（ＩＸ）鎖を有するヘテロ
三量体分子である。ＩＸ型コラーゲンは、非三重らせんドメインによって分離されたいく
つかの三重らせんドメインを有する、ＦＡＣＩＴ（断続性三重らせんを有する線維付随性
コラーゲン）コラーゲンとして分類されている。ＩＸ型コラーゲンを精製するための手順
は、例えば、Ｄｕａｎｃｅ，ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２２１：８
８５－８８９；Ａｙａｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２６２：７５
３－７６１；及びＧｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｔｈｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ
Ｔｉｓｓｕｅ Ｄａｍａｇｅ，Ｇｌａｕｅｒｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ
Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ｐｐ．３－２８に見出
すことができる。
【0031】
Ｘ型コラーゲンは、α１（Ｘ）鎖のホモ三量体化合物である。Ｘ型コラーゲンは、例え
ば、成長板中に見出される肥大軟骨から単離されている；例えば、Ａｐｔｅ ｅｔ ａｌ
．（１９９２）Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０６（１）：２１７－２４参照。
ば、成長板中に見出される肥大軟骨から単離されている；例えば、Ａｐｔｅ ｅｔ ａｌ
．（１９９２）Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０６（１）：２１７－２４参照。
【0032】
ＸＩ型コラーゲンは、ＩＩ型及びＩＸ型コラーゲンに関連する軟骨組織、及び体内の他
の場所に見出すことができる。ＸＩ型コラーゲンは、α１（ＸＩ）、α２（ＸＩ）、及び
α３（ＸＩ）鎖を有するヘテロ三量体分子である。ＸＩ型コラーゲンを精製する方法は、
例えば、上記のＧｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．において見出すことができる。
の場所に見出すことができる。ＸＩ型コラーゲンは、α１（ＸＩ）、α２（ＸＩ）、及び
α３（ＸＩ）鎖を有するヘテロ三量体分子である。ＸＩ型コラーゲンを精製する方法は、
例えば、上記のＧｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．において見出すことができる。
【0033】
ＸＩＩ型コラーゲンは、主にＩ型コラーゲンと関連して見出されるＦＡＣＩＴコラーゲ
ンである。ＸＩＩ型コラーゲンは、３つのα１（ＸＩＩ）鎖を有するホモ三量体分子であ
る。ＸＩＩ型コラーゲン及びその変異体の精製方法は、例えば、Ｄｕｂｌｅｔ ｅｔ ａ
ｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１３１５０－１３１５６；Ｌｕｎｓ
ｔｒｕｍ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２００８７－２
００９２；及びＷａｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：
２００９３－２００９９に見出すことができる。
ンである。ＸＩＩ型コラーゲンは、３つのα１（ＸＩＩ）鎖を有するホモ三量体分子であ
る。ＸＩＩ型コラーゲン及びその変異体の精製方法は、例えば、Ｄｕｂｌｅｔ ｅｔ ａ
ｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１３１５０－１３１５６；Ｌｕｎｓ
ｔｒｕｍ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２００８７－２
００９２；及びＷａｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：
２００９３－２００９９に見出すことができる。
【0034】
ＸＩＩＩ型は、例えば、皮膚、腸、骨、軟骨、及び横紋筋に見出される非原線維性コラ
ーゲンである。ＸＩＩＩ型コラーゲンの詳細な説明は、例えば、Ｊｕｖｏｎｅｎ ｅｔ
ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２４７００－２４７０７に見出し
得る。
ーゲンである。ＸＩＩＩ型コラーゲンの詳細な説明は、例えば、Ｊｕｖｏｎｅｎ ｅｔ
ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２４７００－２４７０７に見出し
得る。
【0035】
ＸＩＶ型は、α１（ＸＩＶ）鎖を有するホモ三量体分子として特徴付けられるＦＡＣＩ
Ｔコラーゲンである。ＸＩＶ型コラーゲンの単離方法は、例えば、Ａｕｂｅｒｔ－Ｆｏｕ
ｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１５７５９－１
５７６４、及び上記のＷａｔｔ ｅｔ ａｌ．に見出すことができる。
Ｔコラーゲンである。ＸＩＶ型コラーゲンの単離方法は、例えば、Ａｕｂｅｒｔ－Ｆｏｕ
ｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１５７５９－１
５７６４、及び上記のＷａｔｔ ｅｔ ａｌ．に見出すことができる。
【0036】
ＸＶ型コラーゲンは、構造上、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンに相同である。天然型ＸＶコラ
ーゲンの構造及び単離に関する情報は、例えば、Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０１４４－１０１４８；Ｈｕ
ｅｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １４：２２０－２２４；Ｋｉ
ｖｉｒｉｋｋｏ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：４７７３
－４７７９；及びＭｕｒａｇａｋｉ，Ｊ．（１９９４）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：４
０４２－４０４６に見出すことができる。
ーゲンの構造及び単離に関する情報は、例えば、Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０１４４－１０１４８；Ｈｕ
ｅｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １４：２２０－２２４；Ｋｉ
ｖｉｒｉｋｋｏ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：４７７３
－４７７９；及びＭｕｒａｇａｋｉ，Ｊ．（１９９４）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：４
０４２－４０４６に見出すことができる。
【0037】
ＸＶＩ型コラーゲンは、例えば、皮膚、肺線維芽細胞、及びケラチノサイトにおいて見
出される繊維付随性コラーゲンである。ＸＶＩ型コラーゲンの構造及びＸＶＩ型コラーゲ
ンをコードする遺伝子に関する情報は、例えば、Ｐａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６５６５－６５６９；及びＹａｍａ
ｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１２：８５６－８６３に
見出すことができる。
出される繊維付随性コラーゲンである。ＸＶＩ型コラーゲンの構造及びＸＶＩ型コラーゲ
ンをコードする遺伝子に関する情報は、例えば、Ｐａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６５６５－６５６９；及びＹａｍａ
ｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１２：８５６－８６３に
見出すことができる。
【0038】
ＸＶＩＩ型コラーゲンは、水疱性類天疱瘡抗原でも知られている、半接着斑膜貫通型コ
ラーゲンである。ＸＶＩＩ型コラーゲンの構造及びＸＶＩＩ型コラーゲンをコードする遺
伝子に関する情報は、例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２６８（１２）：８８２５－８８３４；及びＭｃＧｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９９５
）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１１（１）：８３－８６に見出すことができる。
ラーゲンである。ＸＶＩＩ型コラーゲンの構造及びＸＶＩＩ型コラーゲンをコードする遺
伝子に関する情報は、例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２６８（１２）：８８２５－８８３４；及びＭｃＧｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９９５
）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１１（１）：８３－８６に見出すことができる。
【0039】
ＸＶＩＩＩ型コラーゲンは、ＸＶ型コラーゲンと構造が類似しており、肝臓から単離す
ることができる。天然源由来のＸＶＩＩＩ型コラーゲンの構造及び単離の説明は、例えば
、Ｒｅｈｎ ａｎｄ Ｐｉｈｌａｊａｎｉｅｍｉ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：４２３４－４２３８；Ｏｈ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：４２２９－４２３３；Ｒｅｈｎ
ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１３９２４－１３９３５；
及びＯｈ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １９：４９４－４９９に見出す
ことができる。
ることができる。天然源由来のＸＶＩＩＩ型コラーゲンの構造及び単離の説明は、例えば
、Ｒｅｈｎ ａｎｄ Ｐｉｈｌａｊａｎｉｅｍｉ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：４２３４－４２３８；Ｏｈ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：４２２９－４２３３；Ｒｅｈｎ
ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１３９２４－１３９３５；
及びＯｈ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １９：４９４－４９９に見出す
ことができる。
【0040】
ＸＩＸ型コラーゲンは、ＦＡＣＩＴコラーゲンファミリーの別のメンバーであると考え
られており、横紋筋肉腫細胞から単離されたｍＲＮＡにおいて見出されている。ＸＩＸ型
コラーゲンの構造及び単離の説明は、例えば、Ｉｎｏｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９９
５）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７：１３７－１４６；Ｙｏｓｈｉｏｋａ ｅｔ ａｌ．（
１９９２）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １３：８８４－８８６；及びＭｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９：１８５４９－１８５５７（１９９４）に見出すことが
できる。
られており、横紋筋肉腫細胞から単離されたｍＲＮＡにおいて見出されている。ＸＩＸ型
コラーゲンの構造及び単離の説明は、例えば、Ｉｎｏｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９９
５）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７：１３７－１４６；Ｙｏｓｈｉｏｋａ ｅｔ ａｌ．（
１９９２）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １３：８８４－８８６；及びＭｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９：１８５４９－１８５５７（１９９４）に見出すことが
できる。
【0041】
ＸＸ型コラーゲンは、ＦＡＣＩＴコラーゲンファミリーの新規に見出されたメンバーで
あり、ニワトリ角膜において同定されている；例えば、Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．（１
９９９）ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ １３：Ａ１１１９；及びＧｏｒｄｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．（１９９８），ＩＯＶＳ ３９：Ｓ１１２８参照。
あり、ニワトリ角膜において同定されている；例えば、Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．（１
９９９）ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ １３：Ａ１１１９；及びＧｏｒｄｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．（１９９８），ＩＯＶＳ ３９：Ｓ１１２８参照。
【0042】
本発明の方法を用いて１種類以上のコラーゲンを発現させ、発現したコラーゲンを、あ
るゆる目的のために参照として援用する上記引用文献に記載されているように、さらに処
理または精製してもよい。
るゆる目的のために参照として援用する上記引用文献に記載されているように、さらに処
理または精製してもよい。
【0043】
用語「コラーゲン」とは、上記のコラーゲン型Ｉ～ＸＸを含む公知のコラーゲン型のい
ずれか１つ、ならびに天然、合成、半合成、または組換え型の任意の他のコラーゲンを指
す。これには、本明細書に記載されるすべてのコラーゲン、修飾コラーゲン及びコラーゲ
ン様タンパク質が含まれる。本用語はまた、モチーフ（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）ｎ（ｎは整数）
を有するプロコラーゲン及びコラーゲン様タンパク質またはコラーゲン性タンパク質を包
含する。本用語は、コラーゲン及びコラーゲン様タンパク質の分子、コラーゲン分子の三
量体、コラーゲンのフィブリル、ならびにコラーゲンフィブリルの繊維を包含する。本用
語はまた、フィブリル化することができる、化学的、酵素的、または組換え改変した（ｍ
ｏｄｉｆｉｅｄ）コラーゲンまたはコラーゲン様分子、ならびにコラーゲンの断片、コラ
ーゲン様分子及びナノファイバーに集合可能なコラーゲン分子を指す。天然または改変し
た（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）組換えコラーゲン分子は、一般的に、本明細書に記載される
反復－（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）ｎ－配列を有する。
ずれか１つ、ならびに天然、合成、半合成、または組換え型の任意の他のコラーゲンを指
す。これには、本明細書に記載されるすべてのコラーゲン、修飾コラーゲン及びコラーゲ
ン様タンパク質が含まれる。本用語はまた、モチーフ（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）ｎ（ｎは整数）
を有するプロコラーゲン及びコラーゲン様タンパク質またはコラーゲン性タンパク質を包
含する。本用語は、コラーゲン及びコラーゲン様タンパク質の分子、コラーゲン分子の三
量体、コラーゲンのフィブリル、ならびにコラーゲンフィブリルの繊維を包含する。本用
語はまた、フィブリル化することができる、化学的、酵素的、または組換え改変した（ｍ
ｏｄｉｆｉｅｄ）コラーゲンまたはコラーゲン様分子、ならびにコラーゲンの断片、コラ
ーゲン様分子及びナノファイバーに集合可能なコラーゲン分子を指す。天然または改変し
た（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）組換えコラーゲン分子は、一般的に、本明細書に記載される
反復－（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）ｎ－配列を有する。
【0044】
コラーゲン中のプロリン及びリジン残基の水酸化。コラーゲンのポリペプチドの主な翻
訳後修飾は、４－ヒドロキシプロリン、３－ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）及び／または
ヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）を生成するためのプロリン及び／またはリジン残基の水酸化
、及びヒドロキシリジル残基のグリコシル化である。これらの修飾は、３つのヒドロキシ
ラーゼ、すなわちプロリル４－ヒドロキシラーゼ、プロリル３－ヒドロキシラーゼ、及び
リシルヒドロキシラーゼ、ならびに２つのグリコシルトランスフェラーゼによって触媒さ
れる。ｉｎ ｖｉｖｏでは、これらの反応は、ポリペプチドが三重らせんコラーゲン構造
を形成するまで起こり、この構造は、さらなる修飾を阻害する。
訳後修飾は、４－ヒドロキシプロリン、３－ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）及び／または
ヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）を生成するためのプロリン及び／またはリジン残基の水酸化
、及びヒドロキシリジル残基のグリコシル化である。これらの修飾は、３つのヒドロキシ
ラーゼ、すなわちプロリル４－ヒドロキシラーゼ、プロリル３－ヒドロキシラーゼ、及び
リシルヒドロキシラーゼ、ならびに２つのグリコシルトランスフェラーゼによって触媒さ
れる。ｉｎ ｖｉｖｏでは、これらの反応は、ポリペプチドが三重らせんコラーゲン構造
を形成するまで起こり、この構造は、さらなる修飾を阻害する。
【0045】
プロリル－４－ヒドロキシラーゼ。本酵素は、プロリン残基から（２Ｓ，４Ｒ）－４－
ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）への水酸化を触媒する。Ｇｏｒｒｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｃ
ｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４５（２）：（２０１０）（参照として援用する）。以下
の実施例は、Ｐ４ＨＡ（配列番号５４）及びＰ４ＨＢ（配列番号５２）によってコードさ
れる四量体ウシプロリル－４－ヒドロキシラーゼ（２α及び２β鎖）を使用するが、アイ
ソフォーム、オーソログ、変異体、断片及び非ウシ起源由来プロリル－４－ヒドロキシラ
ーゼもまた、それらが酵母宿主細胞中でヒドロキシラーゼ活性を保持する限り、使用して
もよい。Ｐ４ＨＡ１は、http://_www.omim.org/entry/176710に、Ｐ４ＨＢ１及びＰ４Ｈ
Ｂ１は、http://www.omim.org/entry/176790にさらに記載されており、いずれも参照とし
て援用する。
ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）への水酸化を触媒する。Ｇｏｒｒｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｃ
ｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４５（２）：（２０１０）（参照として援用する）。以下
の実施例は、Ｐ４ＨＡ（配列番号５４）及びＰ４ＨＢ（配列番号５２）によってコードさ
れる四量体ウシプロリル－４－ヒドロキシラーゼ（２α及び２β鎖）を使用するが、アイ
ソフォーム、オーソログ、変異体、断片及び非ウシ起源由来プロリル－４－ヒドロキシラ
ーゼもまた、それらが酵母宿主細胞中でヒドロキシラーゼ活性を保持する限り、使用して
もよい。Ｐ４ＨＡ１は、http://_www.omim.org/entry/176710に、Ｐ４ＨＢ１及びＰ４Ｈ
Ｂ１は、http://www.omim.org/entry/176790にさらに記載されており、いずれも参照とし
て援用する。
【0046】
プロリル３－ヒドロキシラーゼ。本酵素は、プロリン残基の水酸化を触媒する。プロリ
ル３－ヒドロキシラーゼ１前駆体［Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ］は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ
＿００１０９６７６１．１またはＮＭ＿００１１０３２９１．１（配列番号４８）に記載
されている。さらなる説明については、Ｖｒａｎｋａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２７９：２３６１５－２３６２１（２００４）またはhhttp://_www.omim.org/en
try/610339（最終アクセス日２０１７年７月１４日）に記載されており、これらを参照に
より援用する。本酵素は、その天然形態で使用してもよい。しかしながら、アイソフォー
ム、オーソログ、変異体、断片及び非ウシ起源由来プロリル－３－ヒドロキシラーゼもま
た、酵母宿主細胞内でヒドロキシラーゼ活性を保持する限り、使用してもよい。
ル３－ヒドロキシラーゼ１前駆体［Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ］は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ
＿００１０９６７６１．１またはＮＭ＿００１１０３２９１．１（配列番号４８）に記載
されている。さらなる説明については、Ｖｒａｎｋａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２７９：２３６１５－２３６２１（２００４）またはhhttp://_www.omim.org/en
try/610339（最終アクセス日２０１７年７月１４日）に記載されており、これらを参照に
より援用する。本酵素は、その天然形態で使用してもよい。しかしながら、アイソフォー
ム、オーソログ、変異体、断片及び非ウシ起源由来プロリル－３－ヒドロキシラーゼもま
た、酵母宿主細胞内でヒドロキシラーゼ活性を保持する限り、使用してもよい。
【0047】
リジルヒドロキシラーゼ。リジルヒドロキシラーゼ（ＥＣ１．１４．１１．４）は、Ｘ
－ｌｙｓ－ｇｌｙ配列中のリジン残基の水酸化によって、コラーゲン及びコラーゲン様ア
ミノ酸配列を有する他のタンパク質中のヒドロキシリジンの形成を触媒する。この酵素は
、約８５ｋＤの分子量を有するサブユニットからなるホモ二量体である。リジルヒドロキ
シラーゼの一次構造とプロリル－４－ヒドロキシラーゼの２つのタイプのサブユニット（
１７６７１０，１７６７９０）との間には、これらの２つのコラーゲンヒドロキシラーゼ
間の動力学的特性に著しい類似性があるにもかかわらず、有意な相同性は見出されなかっ
た。リジルヒドロキシラーゼ反応において形成されるヒドロキシリジン残基は、２つの重
要な機能を有する：第一に、それらのヒドロキシ基は、単糖類ガラクトースまたは二糖類
グルコシルガラクトースのいずれかの炭水化物ユニットの結合部位として機能し；第二に
、それらは分子間コラーゲン架橋を安定化させる。
－ｌｙｓ－ｇｌｙ配列中のリジン残基の水酸化によって、コラーゲン及びコラーゲン様ア
ミノ酸配列を有する他のタンパク質中のヒドロキシリジンの形成を触媒する。この酵素は
、約８５ｋＤの分子量を有するサブユニットからなるホモ二量体である。リジルヒドロキ
シラーゼの一次構造とプロリル－４－ヒドロキシラーゼの２つのタイプのサブユニット（
１７６７１０，１７６７９０）との間には、これらの２つのコラーゲンヒドロキシラーゼ
間の動力学的特性に著しい類似性があるにもかかわらず、有意な相同性は見出されなかっ
た。リジルヒドロキシラーゼ反応において形成されるヒドロキシリジン残基は、２つの重
要な機能を有する：第一に、それらのヒドロキシ基は、単糖類ガラクトースまたは二糖類
グルコシルガラクトースのいずれかの炭水化物ユニットの結合部位として機能し；第二に
、それらは分子間コラーゲン架橋を安定化させる。
【0048】
ＰＬＯＤ１プロコラーゲン－リジン，２－オキソグルタル酸５－ジオキシゲナーゼ１［
Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ（ウシ）］は、遺伝子ＩＤ：２８１４０９（２０１７年５月２５日
更新）に記載されており、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/281409（最後アクセス日
２０１７年７月１４日）を参照として援用する。別の例は、配列番号５０に記載されてお
り、これはＢｏｓ ｔａｕｒｕｓリジルオキシダーゼ（ＬＯＸ）を記載したものである。
この酵素は、その天然形態で使用してもよい。しかしながら、アイソフォーム、オーソロ
グ、変異体、断片及び非ウシ起源由来リジルヒドロキシラーゼもまた、それらが酵母宿主
細胞中でヒドロキシラーゼ活性を保持する限り、使用してもよい。
Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ（ウシ）］は、遺伝子ＩＤ：２８１４０９（２０１７年５月２５日
更新）に記載されており、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/281409（最後アクセス日
２０１７年７月１４日）を参照として援用する。別の例は、配列番号５０に記載されてお
り、これはＢｏｓ ｔａｕｒｕｓリジルオキシダーゼ（ＬＯＸ）を記載したものである。
この酵素は、その天然形態で使用してもよい。しかしながら、アイソフォーム、オーソロ
グ、変異体、断片及び非ウシ起源由来リジルヒドロキシラーゼもまた、それらが酵母宿主
細胞中でヒドロキシラーゼ活性を保持する限り、使用してもよい。
【0049】
組換えコラーゲン中のプロリン残基の水酸化度のアッセイ。組換えコラーゲン中のプロ
リン残基の水酸化度は、Ｃｈａｎ，ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
１２：５１ （２０１２）（参照として援用する）に記載される液体クロマトグラフィ
ー質量分析法を含む公知の方法によってアッセイしてもよい。
リン残基の水酸化度は、Ｃｈａｎ，ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
１２：５１ （２０１２）（参照として援用する）に記載される液体クロマトグラフィ
ー質量分析法を含む公知の方法によってアッセイしてもよい。
【0050】
組換えコラーゲン中のリジン残基の水酸化度のアッセイ。リジン水酸化及びコラーゲン
の架橋は、Ｙａｍａｕｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．４４６，ｐａｇｅｓ ９５－１０８．；Ｈｕｍａｎａ Ｐ
ｒｅｓｓ（２００８）（参照として援用する）に記載されている。組換えコラーゲン中の
リジン残基の水酸化度は、Ｈａｕｓｍａｎｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈ
ｙｓｉｃａ Ａｃｔａ（ＢＢＡ）－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １３３（３）
：５９１－５９３（１９６７）（参照として援用する）に記載される方法を含む公知の方
法によってアッセイしてもよい。
の架橋は、Ｙａｍａｕｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．４４６，ｐａｇｅｓ ９５－１０８．；Ｈｕｍａｎａ Ｐ
ｒｅｓｓ（２００８）（参照として援用する）に記載されている。組換えコラーゲン中の
リジン残基の水酸化度は、Ｈａｕｓｍａｎｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈ
ｙｓｉｃａ Ａｃｔａ（ＢＢＡ）－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １３３（３）
：５９１－５９３（１９６７）（参照として援用する）に記載される方法を含む公知の方
法によってアッセイしてもよい。
【0051】
コラーゲンの融点。コラーゲン中のプロリン、リジン、またはプロリン及びリジン残基
の水酸化度は、水酸化アミノ酸残基を既知の含有量で含む対照コラーゲンと比較したヒド
ロゲルなどの水和コラーゲンの融解温度によって評価してもよい。コラーゲンの融解温度
は、２５～４０℃の範囲であり、通常、より高度に水酸化したコラーゲンはより高い融解
温度を有する。この範囲は、２５、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、
３５、３６、３７、３８、３９及び４０を含むすべての中間的な部分範囲及び値を含む。
の水酸化度は、水酸化アミノ酸残基を既知の含有量で含む対照コラーゲンと比較したヒド
ロゲルなどの水和コラーゲンの融解温度によって評価してもよい。コラーゲンの融解温度
は、２５～４０℃の範囲であり、通常、より高度に水酸化したコラーゲンはより高い融解
温度を有する。この範囲は、２５、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、
３５、３６、３７、３８、３９及び４０を含むすべての中間的な部分範囲及び値を含む。
【0052】
コドン改変。このプロセスは、コラーゲンをコードするポリヌクレオチド配列、例えば
、天然に見出されるコラーゲンＤＮＡ配列などを改変して、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒ
ｉｓなどの酵母で発現する組換えコラーゲンの量を改変するか、組換え酵母が分泌する組
換えコラーゲンの量を改変するか、組換え酵母中の組換えコラーゲンの発現速度を改変す
るか、または組換えコラーゲン中のリジンまたはプロリン残基の水酸化度を改変すること
を含む。コドン改変はまた、同様の目的のためのヒドロキシラーゼなどの他のタンパク質
に適用するか、または特定の細胞内もしくは細胞外区画にヒドロキシラーゼを標的化、例
えば、組換えコラーゲン分子としてプロリンヒドロキシラーゼを同じ区画、例えば小胞体
に標的化してもよい。
、天然に見出されるコラーゲンＤＮＡ配列などを改変して、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒ
ｉｓなどの酵母で発現する組換えコラーゲンの量を改変するか、組換え酵母が分泌する組
換えコラーゲンの量を改変するか、組換え酵母中の組換えコラーゲンの発現速度を改変す
るか、または組換えコラーゲン中のリジンまたはプロリン残基の水酸化度を改変すること
を含む。コドン改変はまた、同様の目的のためのヒドロキシラーゼなどの他のタンパク質
に適用するか、または特定の細胞内もしくは細胞外区画にヒドロキシラーゼを標的化、例
えば、組換えコラーゲン分子としてプロリンヒドロキシラーゼを同じ区画、例えば小胞体
に標的化してもよい。
【0053】
コドン選択は、ＲＮＡ二次構造への影響、転写及び遺伝子発現への影響、翻訳伸長速度
への影響、及び／またはタンパク質フォールディングへの影響に基づいて行ってもよい。
への影響、及び／またはタンパク質フォールディングへの影響に基づいて行ってもよい。
【0054】
コラーゲンまたはヒドロキシラーゼをコードするコドンは、組換えコラーゲンもしくは
ヒドロキシラーゼをコードするｍＲＮＡの二次構造を減少もしくは増加させるように改変
してもよく、または冗長コドンを、酵母中のすべてのタンパク質コード配列に基づいて（
例えば、コドンサンプリング）酵母宿主細胞が平均的に最も頻繁に使用するか、酵母中の
すべてのタンパク質コード配列に基づいて（例えば、コドンサンプリング）、酵母宿主細
胞が平均的に最も頻繁に使用しないコドンに、または酵母宿主細胞が豊富に発現するタン
パク質に現れるか、もしくは酵母宿主細胞が分泌するタンパク質に現れる冗長コドンに置
換する（例えば、その遺伝子を、高度に発現する遺伝子または発現宿主からの分泌性タン
パク質をコードする遺伝子「のよう」にさせる高いコドン適合指数に基づくコドン選択）
ように改変してもよい。
ヒドロキシラーゼをコードするｍＲＮＡの二次構造を減少もしくは増加させるように改変
してもよく、または冗長コドンを、酵母中のすべてのタンパク質コード配列に基づいて（
例えば、コドンサンプリング）酵母宿主細胞が平均的に最も頻繁に使用するか、酵母中の
すべてのタンパク質コード配列に基づいて（例えば、コドンサンプリング）、酵母宿主細
胞が平均的に最も頻繁に使用しないコドンに、または酵母宿主細胞が豊富に発現するタン
パク質に現れるか、もしくは酵母宿主細胞が分泌するタンパク質に現れる冗長コドンに置
換する（例えば、その遺伝子を、高度に発現する遺伝子または発現宿主からの分泌性タン
パク質をコードする遺伝子「のよう」にさせる高いコドン適合指数に基づくコドン選択）
ように改変してもよい。
【0055】
コドン改変は、タンパク質をコードする配列の全部または一部、例えば、コード配列の
１０％の部分の、第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九または第十の
部分、またはそれらの組み合わせの少なくとも１つに適用してもよい。これはまた、特定
のアミノ酸をコードするコドン、または冗長コドンによってコードされるアミノ酸のすべ
てではないが一部をコードするコドンに選択的に適用してもよい。例えば、ロイシン及び
フェニルアラニンのコドンのみを上記のようにコドン改変してもよい。２つ以上のコドン
によってコードされるアミノ酸は、コドン表に記載されており、これは当該技術分野で周
知であり、https://en.wikipedia.org/wiki/DNA_codon_table（最終アクセス日２０１７
年７月１３日）を参照として援用する。
１０％の部分の、第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九または第十の
部分、またはそれらの組み合わせの少なくとも１つに適用してもよい。これはまた、特定
のアミノ酸をコードするコドン、または冗長コドンによってコードされるアミノ酸のすべ
てではないが一部をコードするコドンに選択的に適用してもよい。例えば、ロイシン及び
フェニルアラニンのコドンのみを上記のようにコドン改変してもよい。２つ以上のコドン
によってコードされるアミノ酸は、コドン表に記載されており、これは当該技術分野で周
知であり、https://en.wikipedia.org/wiki/DNA_codon_table（最終アクセス日２０１７
年７月１３日）を参照として援用する。
【0056】
コドン改変には、https://www.atum.bio/services/genegps（最終アクセス日２０１７
年７月１３日）、https://www.idtdna.com/CodonOpt；https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pm
c/articles/PMC1523223/、またはhttps://en.wikipedia.org/wiki/DNA2.0Algorithm（そ
れぞれを参照として援用する）に記載される、いわゆるコドン最適化法が含まれる。
年７月１３日）、https://www.idtdna.com/CodonOpt；https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pm
c/articles/PMC1523223/、またはhttps://en.wikipedia.org/wiki/DNA2.0Algorithm（そ
れぞれを参照として援用する）に記載される、いわゆるコドン最適化法が含まれる。
【0057】
コドン改変はまた、ｍＲＮＡ二次構造の形成を可能にするか、または二次構造を最小化
または排除するようにコドンを選択することを含む。この一例は、リボソーム結合部位も
しくは開始コドンにおける、またはその周辺における強い二次構造に、二次構造を排除、
減少または弱めるようにコドン選択を行うことである。
または排除するようにコドンを選択することを含む。この一例は、リボソーム結合部位も
しくは開始コドンにおける、またはその周辺における強い二次構造に、二次構造を排除、
減少または弱めるようにコドン選択を行うことである。
【0058】
コラーゲン断片。組換えコラーゲン分子には、トロポコラーゲン（三量体コラーゲン）
を形成することができる天然コラーゲン分子のアミノ酸配列の断片、または天然のコラー
ゲンアミノ酸配列（もしくはそのフィブリル形成領域もしくは実質的に［Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ
］ｎを含むセグメント）と少なくとも７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、もし
くは９９％同一もしくは類似のアミノ酸配列、例えば、登録番号ＮＰ＿００１０２９２１
１．１（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/77404252、最終アクセス日２０１７年
２月９日）、ＮＰ＿７７６９４５．１（https://_www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/278062
57、最終アクセス日２０１７年２月９日）及びＮＰ＿００１０７０２９９．１ （https:
//_www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/116003881、最終アクセス日２０１７年２月９日）（
参照として援用する）に記載されるＣｏｌ１Ａ１、Ｃｏｌ１Ａ２、及びＣｏｌ３Ａ１のア
ミノ酸配列を有する改変コラーゲン分子もしくはトランケート型コラーゲン分子が含まれ
得る。
を形成することができる天然コラーゲン分子のアミノ酸配列の断片、または天然のコラー
ゲンアミノ酸配列（もしくはそのフィブリル形成領域もしくは実質的に［Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ
］ｎを含むセグメント）と少なくとも７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、もし
くは９９％同一もしくは類似のアミノ酸配列、例えば、登録番号ＮＰ＿００１０２９２１
１．１（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/77404252、最終アクセス日２０１７年
２月９日）、ＮＰ＿７７６９４５．１（https://_www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/278062
57、最終アクセス日２０１７年２月９日）及びＮＰ＿００１０７０２９９．１ （https:
//_www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/116003881、最終アクセス日２０１７年２月９日）（
参照として援用する）に記載されるＣｏｌ１Ａ１、Ｃｏｌ１Ａ２、及びＣｏｌ３Ａ１のア
ミノ酸配列を有する改変コラーゲン分子もしくはトランケート型コラーゲン分子が含まれ
得る。
【0059】
コラーゲンまたはヒドロキシラーゼをコードする遺伝子を短縮または改変して、配列を
付加または除去してもよい。そのような改変を施して、ポリヌクレオチドまたはベクター
のサイズをカスタマイズするか、発現させたタンパク質を小胞体または他の細胞内もしく
は細胞外区画に標的化するか、またはコードするタンパク質の長さを調節してもよい。例
えば、本発明者らは、プレ配列のみを含む構築物は、多くの場合、プレプロ配列全体を含
む構築物よりも良好に機能することを見出した。同様に、プレ配列をＰ４ＨＢに融合させ
て、コラーゲンが局在化するＥＲにＰ４ＨＢを局在化させた。
付加または除去してもよい。そのような改変を施して、ポリヌクレオチドまたはベクター
のサイズをカスタマイズするか、発現させたタンパク質を小胞体または他の細胞内もしく
は細胞外区画に標的化するか、またはコードするタンパク質の長さを調節してもよい。例
えば、本発明者らは、プレ配列のみを含む構築物は、多くの場合、プレプロ配列全体を含
む構築物よりも良好に機能することを見出した。同様に、プレ配列をＰ４ＨＢに融合させ
て、コラーゲンが局在化するＥＲにＰ４ＨＢを局在化させた。
【0060】
コラーゲン及びヒドロキシラーゼのコード配列の改変。コラーゲンもしくはヒドロキシ
ラーゼ、または他のタンパク質のポリヌクレオチドコード配列を、公知のアミノ酸配列に
少なくとも７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、または１００％同一または類似
し、未改変分子の本質的な特性、例えば、トロポコラーゲンを形成する能力、またはコラ
ーゲン中のプロリンもしくはリジン残基を水酸化する能力を保持するタンパク質をコード
するように改変してもよい。コラーゲン分子中のグリコシル化部位を、除去または付加し
てもよい。改変を施して、コラーゲン収量または酵母宿主細胞によるその分泌を促進する
か、またはその構造的、機能的もしくは審美的特性を変化させてもよい。改変したコラー
ゲンまたはヒドロキシラーゼコード配列もまた、本明細書に記載のようにコドン改変して
もよい。
ラーゼ、または他のタンパク質のポリヌクレオチドコード配列を、公知のアミノ酸配列に
少なくとも７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、または１００％同一または類似
し、未改変分子の本質的な特性、例えば、トロポコラーゲンを形成する能力、またはコラ
ーゲン中のプロリンもしくはリジン残基を水酸化する能力を保持するタンパク質をコード
するように改変してもよい。コラーゲン分子中のグリコシル化部位を、除去または付加し
てもよい。改変を施して、コラーゲン収量または酵母宿主細胞によるその分泌を促進する
か、またはその構造的、機能的もしくは審美的特性を変化させてもよい。改変したコラー
ゲンまたはヒドロキシラーゼコード配列もまた、本明細書に記載のようにコドン改変して
もよい。
【0061】
用語「天然コラーゲン」、「天然ポリペプチド」または「天然ポリヌクレオチド」とは
、例えば、アミノ酸残基の欠失、付加もしくは置換を伴わないか、またはポリヌクレオチ
ドに関しては、例えば、コドン改変による変更のような、ヌクレオチドの欠失、挿入また
は置換による天然配列の改変を伴わない、自然界に見出されるポリペプチドまたはポリヌ
クレオチド配列を指す。本明細書中に記載されるコラーゲン及び酵素のタイプには、それ
らの天然の形態ならびに天然コラーゲンまたは酵素の生物学的活性を保持する改変形態が
含まれる。改変形態のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、対応する天然配列に対して
、特定の程度の配列同一性または類似性を有することに基づいて同定してもよい。改変ポ
リヌクレオチド配列はまた、例えば、図１～２０に図示するように、本明細書に記載する
ベクターのいずれか、またはこれらのベクターを構成するポリヌクレオチドエレメントの
いずれかと７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の配列同一
性または類似性を有する配列を有する。
、例えば、アミノ酸残基の欠失、付加もしくは置換を伴わないか、またはポリヌクレオチ
ドに関しては、例えば、コドン改変による変更のような、ヌクレオチドの欠失、挿入また
は置換による天然配列の改変を伴わない、自然界に見出されるポリペプチドまたはポリヌ
クレオチド配列を指す。本明細書中に記載されるコラーゲン及び酵素のタイプには、それ
らの天然の形態ならびに天然コラーゲンまたは酵素の生物学的活性を保持する改変形態が
含まれる。改変形態のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、対応する天然配列に対して
、特定の程度の配列同一性または類似性を有することに基づいて同定してもよい。改変ポ
リヌクレオチド配列はまた、例えば、図１～２０に図示するように、本明細書に記載する
ベクターのいずれか、またはこれらのベクターを構成するポリヌクレオチドエレメントの
いずれかと７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の配列同一
性または類似性を有する配列を有する。
【0062】
ＢＬＡＳＴＮを使用して、参照ポリヌクレオチド、例えば、コラーゲンをコードするポ
リヌクレオチド、本明細書に記載する１つ以上のヒドロキシラーゼ、またはシグナル、リ
ーダーもしくは分泌ペプチドまたは本明細書に開示する任意の他のタンパク質に対し、少
なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、
９７．５％、９８％、９９％または＜１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配
列を同定してもよい。類似性が非常に高い配列を見出すために改変した代表的なＢＬＡＳ
ＴＮ設定は、期待閾値１０及びワードサイズ２８、クエリー範囲での最大マッチ０、マッ
チ／ミスマッチスコア１／－２、ならびに線形のギャップコストを使用する。低複雑度領
域は、フィルタリングまたはマスクしてもよい。標準ヌクレオチドＢＬＡＳＴのデフォル
ト設定は、https://_blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=Bla
stSearch&LINK_LOC=blasthome（最終アクセス日２０１７年７月１３日）に記載されると
ともに、これを参照として援用する。
リヌクレオチド、本明細書に記載する１つ以上のヒドロキシラーゼ、またはシグナル、リ
ーダーもしくは分泌ペプチドまたは本明細書に開示する任意の他のタンパク質に対し、少
なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、
９７．５％、９８％、９９％または＜１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配
列を同定してもよい。類似性が非常に高い配列を見出すために改変した代表的なＢＬＡＳ
ＴＮ設定は、期待閾値１０及びワードサイズ２８、クエリー範囲での最大マッチ０、マッ
チ／ミスマッチスコア１／－２、ならびに線形のギャップコストを使用する。低複雑度領
域は、フィルタリングまたはマスクしてもよい。標準ヌクレオチドＢＬＡＳＴのデフォル
ト設定は、https://_blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=Bla
stSearch&LINK_LOC=blasthome（最終アクセス日２０１７年７月１３日）に記載されると
ともに、これを参照として援用する。
【0063】
ＢＬＡＳＴＰを用いて、参照アミノ酸配列、例えばコラーゲンのアミノ酸配列に対し、
少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２．５％、９５％
、９７．５％、９８％、９９％または＜１００％の配列同一性、または類似性を有するア
ミノ酸配列を、ＢＬＯＳＵＭ４５、ＢＬＯＳＵＭ６２またはＢＬＯＳＵＭ８０などの類似
性マトリックスを用いて同定することができ、その場合、ＢＬＯＳＵＭ４５は密接に関連
する配列に、ＢＬＯＳＵＭ６２は中範囲の配列に、及びＢＬＯＳＵＭ８０はより関連性の
低い配列に対して使用することができる。別段の指示がない限り、類似性スコアはＢＬＯ
ＳＵＭ６２の使用に基づくものとする。ＢＬＡＳＴＰを使用する場合、類似性の割合はＢ
ＬＡＳＴＰ陽性スコアに基づき、配列同一性の割合はＢＬＡＳＴＰ同一性スコアに基づく
。ＢＬＡＳＴＰ「同一性」は、同一の高スコア配列ペアにおける全残基の数及び割合を示
し；ＢＬＡＳＴＰ「陽性」は、アラインメントスコアが正の値を有し、互いに類似してい
る残基の数及び割合を示す。本明細書中に開示するアミノ酸配列との、これらの同一性も
しくは類似性の程度、または同一性もしくは類似性の任意の中間の程度を有するアミノ酸
配列は、本開示によって意図され、包含される。代表的なＢＬＡＳＴＰ設定は、期待閾値
１０、ワードサイズ３、マトリックスとしてＢＬＯＳＵＭ６２、及びギャップペナルティ
１１（存在）及び１（エクステンション）ならびに条件付き組成スコアマトリックス補正
を使用する。ＢＬＡＳＴＰのその他のデフォルト設定については、https://blast.ncbi.n
lm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome（最
終アクセス日２０１７年７月１３日）に記載されるとともに、これを利用可能な開示に参
照として援用する。
少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２．５％、９５％
、９７．５％、９８％、９９％または＜１００％の配列同一性、または類似性を有するア
ミノ酸配列を、ＢＬＯＳＵＭ４５、ＢＬＯＳＵＭ６２またはＢＬＯＳＵＭ８０などの類似
性マトリックスを用いて同定することができ、その場合、ＢＬＯＳＵＭ４５は密接に関連
する配列に、ＢＬＯＳＵＭ６２は中範囲の配列に、及びＢＬＯＳＵＭ８０はより関連性の
低い配列に対して使用することができる。別段の指示がない限り、類似性スコアはＢＬＯ
ＳＵＭ６２の使用に基づくものとする。ＢＬＡＳＴＰを使用する場合、類似性の割合はＢ
ＬＡＳＴＰ陽性スコアに基づき、配列同一性の割合はＢＬＡＳＴＰ同一性スコアに基づく
。ＢＬＡＳＴＰ「同一性」は、同一の高スコア配列ペアにおける全残基の数及び割合を示
し；ＢＬＡＳＴＰ「陽性」は、アラインメントスコアが正の値を有し、互いに類似してい
る残基の数及び割合を示す。本明細書中に開示するアミノ酸配列との、これらの同一性も
しくは類似性の程度、または同一性もしくは類似性の任意の中間の程度を有するアミノ酸
配列は、本開示によって意図され、包含される。代表的なＢＬＡＳＴＰ設定は、期待閾値
１０、ワードサイズ３、マトリックスとしてＢＬＯＳＵＭ６２、及びギャップペナルティ
１１（存在）及び１（エクステンション）ならびに条件付き組成スコアマトリックス補正
を使用する。ＢＬＡＳＴＰのその他のデフォルト設定については、https://blast.ncbi.n
lm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome（最
終アクセス日２０１７年７月１３日）に記載されるとともに、これを利用可能な開示に参
照として援用する。
【0064】
本明細書に開示するポリペプチドに対して用いる用語「その誘導体」、「改変した配列
」または「類似体」とは、生物学的に活性な分子のアミノ酸配列に対し、少なくとも７０
、８０、９０、９５、または９９％同一であるか類似であるアミノ酸配列を有するポリペ
プチドを指す。いくつかの実施形態では、誘導体は、天然の配列または以前に改変した配
列のアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％
、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％
、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。誘導体は、天然の分子または以前に改変
した分子のアミノ酸配列に対する付加、欠失、置換、またはそれらの組み合わせを含み得
る。例えば、天然のコラーゲン配列に比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１
０またはそれ以上のプロリンまたはリジン残基を、誘導体に組み込むか、または欠失させ
てもよい。そのような選択を行って、組換えトロポコラーゲンまたはフィブリル化コラー
ゲンの弛緩度または緊密度を改変してもよい。
」または「類似体」とは、生物学的に活性な分子のアミノ酸配列に対し、少なくとも７０
、８０、９０、９５、または９９％同一であるか類似であるアミノ酸配列を有するポリペ
プチドを指す。いくつかの実施形態では、誘導体は、天然の配列または以前に改変した配
列のアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％
、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％
、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。誘導体は、天然の分子または以前に改変
した分子のアミノ酸配列に対する付加、欠失、置換、またはそれらの組み合わせを含み得
る。例えば、天然のコラーゲン配列に比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１
０またはそれ以上のプロリンまたはリジン残基を、誘導体に組み込むか、または欠失させ
てもよい。そのような選択を行って、組換えトロポコラーゲンまたはフィブリル化コラー
ゲンの弛緩度または緊密度を改変してもよい。
【0065】
誘導体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１～１５、１６～２０、２
１～２５、または２６～３０個のアミノ酸残基の付加、置換、または欠失を有する変異ポ
リペプチドを含み得る。付加または置換には、非天然アミノ酸または修飾アミノ酸の使用
も含まれる。誘導体には、ポリペプチドに対する化学修飾、例えば、システイン残基間の
架橋または水酸化もしくはグリコシル化残基も含まれ得る。誘導体には、本明細書に開示
するコラーゲン及び酵素を含むすべてのポリペプチドの誘導体が含まれる。一般的に、誘
導体は、未修飾の親分子の少なくとも１つの生物学的活性を有し、したがって、酵素誘導
体は、通常、親酵素の酵素活性を有し、コラーゲン誘導体は、親コラーゲンの少なくとも
１つの構造的、化学的または生物学的特性を有するであろう。
１～２５、または２６～３０個のアミノ酸残基の付加、置換、または欠失を有する変異ポ
リペプチドを含み得る。付加または置換には、非天然アミノ酸または修飾アミノ酸の使用
も含まれる。誘導体には、ポリペプチドに対する化学修飾、例えば、システイン残基間の
架橋または水酸化もしくはグリコシル化残基も含まれ得る。誘導体には、本明細書に開示
するコラーゲン及び酵素を含むすべてのポリペプチドの誘導体が含まれる。一般的に、誘
導体は、未修飾の親分子の少なくとも１つの生物学的活性を有し、したがって、酵素誘導
体は、通常、親酵素の酵素活性を有し、コラーゲン誘導体は、親コラーゲンの少なくとも
１つの構造的、化学的または生物学的特性を有するであろう。
【0066】
バイオファブリケートレザー。本明細書に記載する方法によってフィブリル化及び架橋
することができる任意の型のコラーゲン、トランケート型コラーゲン、未修飾または翻訳
後修飾、またはアミノ酸配列改変コラーゲンを用いて、バイオファブリケート素材または
バイオファブリケートレザーを製造することができる。バイオファブリケートレザーは、
実質的に均質なコラーゲン、例えばＩ型またはＩＩＩ型コラーゲンのみを含有してもよく
、または２、３、４またはそれ以上の異なる種類のコラーゲンの混合物を含有してもよい
。いくつかの実施形態では、組換えコラーゲン、例えばバイオファブリケートレザーの成
分は、そのリジン、プロリン、またはリジン及びプロリン残基が水酸化されていない。他
の実施形態では、組換えコラーゲン中のリジン、プロリン、またはリジン及びプロリン残
基の少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０
、８０、９０、９５％または１００％（または部分範囲の任意の中間値）が水酸化される
。
することができる任意の型のコラーゲン、トランケート型コラーゲン、未修飾または翻訳
後修飾、またはアミノ酸配列改変コラーゲンを用いて、バイオファブリケート素材または
バイオファブリケートレザーを製造することができる。バイオファブリケートレザーは、
実質的に均質なコラーゲン、例えばＩ型またはＩＩＩ型コラーゲンのみを含有してもよく
、または２、３、４またはそれ以上の異なる種類のコラーゲンの混合物を含有してもよい
。いくつかの実施形態では、組換えコラーゲン、例えばバイオファブリケートレザーの成
分は、そのリジン、プロリン、またはリジン及びプロリン残基が水酸化されていない。他
の実施形態では、組換えコラーゲン中のリジン、プロリン、またはリジン及びプロリン残
基の少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０
、８０、９０、９５％または１００％（または部分範囲の任意の中間値）が水酸化される
。
【0067】
酵母株。本発明は、コラーゲンを産生するために酵母を利用する。好適な酵母としては
、Ｐｉｃｈｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせの酵母
が挙げられるが、これらに限定されない。酵母は、改変または交雑してもよい。交雑酵母
は、同じ種の異なる株、同じ属の異なる種、または異なる属の株の混合育種によって産生
される。本発明に従って使用し得るいくつかの酵母株として、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏ
ｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｄｅｓｅｒｔ
ｉｃｏｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｃｅｐｈａｌｏｃｅｒｅａｎａ、Ｐｉｃｈｉａ ｅｒｅｍｏ
ｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｙａｎｍａｒｅｎｓｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ａｎｏｍａｌａ
、Ｐｉｃｈｉａ ｎａｋａｓｅｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｉａｍｅｎｓｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ
ｈｅｅｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｂａｒｋｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｎｏｒｖｅｇｅｎｓｉｓ
、Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｅ
ｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｕｂｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａ、Ｐｉｃｈｉａ ｅｘｉｇｕａ、Ｐｉ
ｃｈｉａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、及びＰｉｃｈｉａ ｃａｃｔｏｐｈｉｌａが挙げ
られる。
、Ｐｉｃｈｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせの酵母
が挙げられるが、これらに限定されない。酵母は、改変または交雑してもよい。交雑酵母
は、同じ種の異なる株、同じ属の異なる種、または異なる属の株の混合育種によって産生
される。本発明に従って使用し得るいくつかの酵母株として、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏ
ｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｄｅｓｅｒｔ
ｉｃｏｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｃｅｐｈａｌｏｃｅｒｅａｎａ、Ｐｉｃｈｉａ ｅｒｅｍｏ
ｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｙａｎｍａｒｅｎｓｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ａｎｏｍａｌａ
、Ｐｉｃｈｉａ ｎａｋａｓｅｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｉａｍｅｎｓｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ
ｈｅｅｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｂａｒｋｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｎｏｒｖｅｇｅｎｓｉｓ
、Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｅ
ｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｕｂｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａ、Ｐｉｃｈｉａ ｅｘｉｇｕａ、Ｐｉ
ｃｈｉａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、及びＰｉｃｈｉａ ｃａｃｔｏｐｈｉｌａが挙げ
られる。
【0068】
一実施形態では、本発明は、コラーゲン及び／またはヒドロキシラーゼ（複数可）をコ
ードするコドン改変ポリヌクレオチドを発現するように改変した（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ
）Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ株を対象とする。有用なＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒ
ｉｓ宿主株として、ＢＧ１０（野生型）（ＰＰＳ－９０１０株）；ＰＰＳ－９０１０のメ
タノール資化遅延型誘導体であるＢＧ１１，ａｏｘ１Δ（ＭｕｔＳ）（ＰＰＳ－９０１１
株）、及びプロテアーゼ欠損株であるＢＧ１６，ｐｅｐ４Δ，ｐｒｂ４Δ（ＰＰＳ－９０
１６株）が挙げられる。これらの株は公的に入手可能であり、https://www._atum.bio/pr
oducts/cell-strainsのＡＴＵＭから入手してもよい。
ードするコドン改変ポリヌクレオチドを発現するように改変した（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ
）Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ株を対象とする。有用なＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒ
ｉｓ宿主株として、ＢＧ１０（野生型）（ＰＰＳ－９０１０株）；ＰＰＳ－９０１０のメ
タノール資化遅延型誘導体であるＢＧ１１，ａｏｘ１Δ（ＭｕｔＳ）（ＰＰＳ－９０１１
株）、及びプロテアーゼ欠損株であるＢＧ１６，ｐｅｐ４Δ，ｐｒｂ４Δ（ＰＰＳ－９０
１６株）が挙げられる。これらの株は公的に入手可能であり、https://www._atum.bio/pr
oducts/cell-strainsのＡＴＵＭから入手してもよい。
【0069】
酵母のポリペプチド分泌配列。いくつかの実施形態では、酵母宿主細胞によってコード
されるポリペプチドを、酵母からのその分泌を促進するポリペプチド配列に融合する。例
えば、ベクターは、分泌ペプチドをコードする配列に融合したコラーゲンのコード配列を
含むキメラ遺伝子をコードし得る。この目的のために使用し得る分泌配列として、Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ α接合因子プレプロ配列、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ α接合
因子プレ配列、ＰＨＯ１分泌シグナル、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来α－ア
ミラーゼシグナル配列、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ由来グルコアミラーゼ
シグナル配列、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ由来血清アルブミンシグナル配列、Ｋｌｕｙｖ
ｅｒｏｍｃｙｅｓ ｍａｘｉａｎｕｓ由来イヌリナーゼシグナル配列、Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来インベルターゼシグナル配列、Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来キラータンパク質シグナル配列及びＧａｌｌｕｓ
ｇａｌｌｕｓ由来リゾチームシグナル配列が挙げられる。当該分野で公知の他の分泌配
列もまた、使用してもよい。
されるポリペプチドを、酵母からのその分泌を促進するポリペプチド配列に融合する。例
えば、ベクターは、分泌ペプチドをコードする配列に融合したコラーゲンのコード配列を
含むキメラ遺伝子をコードし得る。この目的のために使用し得る分泌配列として、Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ α接合因子プレプロ配列、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ α接合
因子プレ配列、ＰＨＯ１分泌シグナル、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来α－ア
ミラーゼシグナル配列、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ由来グルコアミラーゼ
シグナル配列、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ由来血清アルブミンシグナル配列、Ｋｌｕｙｖ
ｅｒｏｍｃｙｅｓ ｍａｘｉａｎｕｓ由来イヌリナーゼシグナル配列、Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来インベルターゼシグナル配列、Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来キラータンパク質シグナル配列及びＧａｌｌｕｓ
ｇａｌｌｕｓ由来リゾチームシグナル配列が挙げられる。当該分野で公知の他の分泌配
列もまた、使用してもよい。
【0070】
酵母プロモーター及びターミネーター。いくつかの実施形態では、コラーゲンまたはヒ
ドロキシラーゼをコードするｍＲＮＡのプロモーター転写用のベクターに、以下の１つ以
上の酵母プロモーターを組み込んでもよい。プロモーターは、当該技術分野で公知であり
、ｐＡＯＸ１、ｐＤａｓ１、ｐＤａｓ２、ｐＰＭＰ２０、ｐＣＡＴ、ｐＤＦ、ｐＧＡＰ、
ｐＦＤＨ１、ｐＦＬＤ１、ｐＴＡＬ１、ｐＦＢＡ２、ｐＡＯＸ２、ｐＲＫＩ１、ｐＲＰＥ
２、ｐＰＥＸ５、ｐＤＡＫ１、ｐＦＧＨ１、ｐＡＤＨ２、ｐＴＰＩ１、ｐＦＢＰ１、ｐＴ
ＡＬ１、ｐＰＦＫ１、ｐＧＰＭ１、及びｐＧＣＷ１４が挙げられる。
ドロキシラーゼをコードするｍＲＮＡのプロモーター転写用のベクターに、以下の１つ以
上の酵母プロモーターを組み込んでもよい。プロモーターは、当該技術分野で公知であり
、ｐＡＯＸ１、ｐＤａｓ１、ｐＤａｓ２、ｐＰＭＰ２０、ｐＣＡＴ、ｐＤＦ、ｐＧＡＰ、
ｐＦＤＨ１、ｐＦＬＤ１、ｐＴＡＬ１、ｐＦＢＡ２、ｐＡＯＸ２、ｐＲＫＩ１、ｐＲＰＥ
２、ｐＰＥＸ５、ｐＤＡＫ１、ｐＦＧＨ１、ｐＡＤＨ２、ｐＴＰＩ１、ｐＦＢＰ１、ｐＴ
ＡＬ１、ｐＰＦＫ１、ｐＧＰＭ１、及びｐＧＣＷ１４が挙げられる。
【0071】
いくつかの実施形態では、コラーゲンまたはヒドロキシラーゼをコードするｍＲＮＡの
転写を終結させるために、酵母ターミネーター配列をベクターに組み込む。ターミネータ
ーとして、ＡＯＸ１ ＴＴ、Ｄａｓ１ ＴＴ、Ｄａｓ２ ＴＴ、ＡＯＤ ＴＴ、ＰＭＰ
ＴＴ、Ｃａｔ１ ＴＴ、ＴＰＩ ＴＴ、ＦＤＨ１ ＴＴ、ＴＥＦ１ ＴＴ、ＦＬＤ１ Ｔ
Ｔ、ＧＣＷ１４ ＴＴ、ＦＢＡ２ ＴＴ、ＡＤＨ２ ＴＴ、ＦＢＰ１ ＴＴ、及びＧＡＰ
ＴＴが挙げられるが、これらに限定されない。
転写を終結させるために、酵母ターミネーター配列をベクターに組み込む。ターミネータ
ーとして、ＡＯＸ１ ＴＴ、Ｄａｓ１ ＴＴ、Ｄａｓ２ ＴＴ、ＡＯＤ ＴＴ、ＰＭＰ
ＴＴ、Ｃａｔ１ ＴＴ、ＴＰＩ ＴＴ、ＦＤＨ１ ＴＴ、ＴＥＦ１ ＴＴ、ＦＬＤ１ Ｔ
Ｔ、ＧＣＷ１４ ＴＴ、ＦＢＡ２ ＴＴ、ＡＤＨ２ ＴＴ、ＦＢＰ１ ＴＴ、及びＧＡＰ
ＴＴが挙げられるが、これらに限定されない。
【0072】
ペプシン以外のペプチダーゼ。ペプシンを使用して、Ｎ末端及びＣ末端配列を除去する
ことによって、コラーゲンからトロポコラーゲンへプロセシングしてもよい。コラゲナー
ゼ、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、フィカイン、及びブロメラインを含むがこ
れらに限定されない他のプロテアーゼも、この目的のために使用してもよい。本明細書中
で使用する場合、「安定なコラーゲン」とは、特定の濃度のペプシンまたは他のプロテア
ーゼへの曝露後に、コラーゲンの初期濃度の少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、
７５、８０、８５、９０、９５または１００％（または任意の中間値もしくは部分範囲）
が依然として存在することを意味する。好ましくは、安定なコラーゲンの少なくとも７５
％が、同じ条件下で同じ時間、処理した不安定なコラーゲンに比べて、ペプシンまたは別
のプロテアーゼによる処理後に残存する。翻訳後修飾の前に、コラーゲンは水酸化されて
おらず、高濃度ペプシン（例えば、ペプシン：タンパク質比が１：２００以上）の存在下
で分解する。
ことによって、コラーゲンからトロポコラーゲンへプロセシングしてもよい。コラゲナー
ゼ、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、フィカイン、及びブロメラインを含むがこ
れらに限定されない他のプロテアーゼも、この目的のために使用してもよい。本明細書中
で使用する場合、「安定なコラーゲン」とは、特定の濃度のペプシンまたは他のプロテア
ーゼへの曝露後に、コラーゲンの初期濃度の少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、
７５、８０、８５、９０、９５または１００％（または任意の中間値もしくは部分範囲）
が依然として存在することを意味する。好ましくは、安定なコラーゲンの少なくとも７５
％が、同じ条件下で同じ時間、処理した不安定なコラーゲンに比べて、ペプシンまたは別
のプロテアーゼによる処理後に残存する。翻訳後修飾の前に、コラーゲンは水酸化されて
おらず、高濃度ペプシン（例えば、ペプシン：タンパク質比が１：２００以上）の存在下
で分解する。
【0073】
翻訳後修飾した後、コラーゲンをペプシンまたは別のプロテアーゼと接触させて、コラ
ーゲンのＮ末端及びＣ末端プロペプチドを切断し、コラーゲンをフィブリル化することが
できる。水酸化コラーゲンは、非水酸化コラーゲンに比べてより良好な熱安定性を有し、
高濃度ペプシン、例えばペプシン：総タンパク質比１：２５、１：２０、１：１５、１：
１０、１：５～１：１（または任意の中間値）のペプシンによる消化に耐性である。した
がって、組換えコラーゲンの早発性のタンパク質分解を避けるために、水酸化コラーゲン
を提供することが有用である。
ーゲンのＮ末端及びＣ末端プロペプチドを切断し、コラーゲンをフィブリル化することが
できる。水酸化コラーゲンは、非水酸化コラーゲンに比べてより良好な熱安定性を有し、
高濃度ペプシン、例えばペプシン：総タンパク質比１：２５、１：２０、１：１５、１：
１０、１：５～１：１（または任意の中間値）のペプシンによる消化に耐性である。した
がって、組換えコラーゲンの早発性のタンパク質分解を避けるために、水酸化コラーゲン
を提供することが有用である。
【0074】
別の発現系。コラーゲンはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ以外の他の種類の酵母細胞
内で発現させることができ、例えば、別の酵母、メチロトローフ酵母または他の生物内で
発現させてもよい。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、多数の発現
ベクターのいずれかとともに使用することができる。一般的に使用される発現ベクターは
、外来遺伝子を効率的に転写するために、酵母内での増殖のための２Ｐ複製起点及びＥ．
ｃｏｌｉのＣｏｌ Ｅ１起点を有するシャトルベクターである。そのような２Ｐプラスミ
ドに基づくベクターの一般的な例はｐＷＹＧ４であり、このベクターは、２Ｐ ＯＲＩ－
ＳＴＢエレメント、ＧＡＬ１－１０プロモーター、及び２Ｐ Ｄ遺伝子ターミネーターを
有する。このベクターでは、発現させるポリペプチドの遺伝子を挿入するとともにＡＴＧ
開始コドンを提供するためにＮｃｏｌクローニング部位を用いる。
内で発現させることができ、例えば、別の酵母、メチロトローフ酵母または他の生物内で
発現させてもよい。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、多数の発現
ベクターのいずれかとともに使用することができる。一般的に使用される発現ベクターは
、外来遺伝子を効率的に転写するために、酵母内での増殖のための２Ｐ複製起点及びＥ．
ｃｏｌｉのＣｏｌ Ｅ１起点を有するシャトルベクターである。そのような２Ｐプラスミ
ドに基づくベクターの一般的な例はｐＷＹＧ４であり、このベクターは、２Ｐ ＯＲＩ－
ＳＴＢエレメント、ＧＡＬ１－１０プロモーター、及び２Ｐ Ｄ遺伝子ターミネーターを
有する。このベクターでは、発現させるポリペプチドの遺伝子を挿入するとともにＡＴＧ
開始コドンを提供するためにＮｃｏｌクローニング部位を用いる。
【0075】
別の発現ベクターはｐＷＹＧ７Ｌであり、このベクターは、インタクトな２αＯＲＩ、
ＳＴＢ、ＲＥＰ１及びＲＥＰ２、ならびにＧＡＬ１－１０プロモーターを有し、ＦＬＰタ
ーミネーターを使用する。このベクターでは、コードされるポリヌクレオチドを、その５
’末端をＢａｍＨＩまたはＮｃｏｌ部位に合わせてポリリンカーに挿入する。細胞壁を除
去してカルシウム及びポリエチレングリコールによる処理の際にＤＮＡを取り込むスフェ
ロプラストを生成するか、またはインタクトな細胞をリチウムイオンで処理することによ
り、挿入されたポリヌクレオチドを含むベクターをＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに形質転換
する。
ＳＴＢ、ＲＥＰ１及びＲＥＰ２、ならびにＧＡＬ１－１０プロモーターを有し、ＦＬＰタ
ーミネーターを使用する。このベクターでは、コードされるポリヌクレオチドを、その５
’末端をＢａｍＨＩまたはＮｃｏｌ部位に合わせてポリリンカーに挿入する。細胞壁を除
去してカルシウム及びポリエチレングリコールによる処理の際にＤＮＡを取り込むスフェ
ロプラストを生成するか、またはインタクトな細胞をリチウムイオンで処理することによ
り、挿入されたポリヌクレオチドを含むベクターをＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに形質転換
する。
【0076】
あるいは、電気穿孔法によってＤＮＡを導入することができる。例えば、ＬＥＵ２、Ｔ
ＲＰ１、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、またはＬＥＵ２－Ｄなどの選択マーカー遺伝子とともに、
ロイシン、トリプトファン、ウラシル、またはヒスチジンに対して栄養要求性である宿主
酵母細胞を用いて、形質転換体を選択することができる。
ＲＰ１、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、またはＬＥＵ２－Ｄなどの選択マーカー遺伝子とともに、
ロイシン、トリプトファン、ウラシル、またはヒスチジンに対して栄養要求性である宿主
酵母細胞を用いて、形質転換体を選択することができる。
【0077】
Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓなどのメチロトローフ酵母には多数のメタノール応答
性遺伝子が存在し、それぞれの発現は、プロモーターとも呼ばれるメタノール応答調節領
域によって調節される。そのようなメタノール応答性プロモーターのいずれも、本発明の
実施に使用するのに適している。特定の調節領域の例として、ＡＯＸ１プロモーター、Ａ
ＯＸ２プロモーター、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＤＡＳ）、Ｐ４０プロモーター
、及びＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ由来のカタラーゼ遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。
性遺伝子が存在し、それぞれの発現は、プロモーターとも呼ばれるメタノール応答調節領
域によって調節される。そのようなメタノール応答性プロモーターのいずれも、本発明の
実施に使用するのに適している。特定の調節領域の例として、ＡＯＸ１プロモーター、Ａ
ＯＸ２プロモーター、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＤＡＳ）、Ｐ４０プロモーター
、及びＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ由来のカタラーゼ遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。
【0078】
メチロトローフ酵母Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａもまた、使用してもよ
い。メタノールでの増殖は、メタノール代謝の重要な酵素、例えばＭＯＸ（メタノールオ
キシダーゼ）、ＤＡＳ（ジヒドロキシアセトンシンターゼ）、及びＦＭＨＤ（ギ酸脱水素
酵素）の誘発をもたらす。これらの酵素は、全細胞タンパク質の最大３０～４０％を構成
し得る。ＭＯＸ、ＤＡＳ及びＦＭＤＨ産生をコードする遺伝子は、メタノール上での増殖
によって誘導され、グルコース上での増殖によって抑制される強力なプロモーターによっ
て調節される。これらのプロモーターのいずれかまたは３つすべてを用いて、Ｈ．ｐｏｌ
ｙｍｏｒｐｈａにおいて異種遺伝子を高レベルに発現させてもよい。したがって、一態様
では、動物コラーゲンまたはその断片もしくは変異体をコードするポリヌクレオチドを、
誘導性Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａプロモーターの調節下で発現ベクターにクローニングす
る。産物の分泌を所望する場合、そのポリヌクレオチドに、酵母内での分泌用シグナル配
列をコードするポリヌクレオチドをインフレームで融合する。さらなる実施形態では、発
現ベクターに、好ましくは、栄養要求性マーカー遺伝子、例えばＵＲＡ３またはＬＥＵ２
を含ませ、これを用いて栄養要求性宿主の欠損を補完してもよい。
い。メタノールでの増殖は、メタノール代謝の重要な酵素、例えばＭＯＸ（メタノールオ
キシダーゼ）、ＤＡＳ（ジヒドロキシアセトンシンターゼ）、及びＦＭＨＤ（ギ酸脱水素
酵素）の誘発をもたらす。これらの酵素は、全細胞タンパク質の最大３０～４０％を構成
し得る。ＭＯＸ、ＤＡＳ及びＦＭＤＨ産生をコードする遺伝子は、メタノール上での増殖
によって誘導され、グルコース上での増殖によって抑制される強力なプロモーターによっ
て調節される。これらのプロモーターのいずれかまたは３つすべてを用いて、Ｈ．ｐｏｌ
ｙｍｏｒｐｈａにおいて異種遺伝子を高レベルに発現させてもよい。したがって、一態様
では、動物コラーゲンまたはその断片もしくは変異体をコードするポリヌクレオチドを、
誘導性Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａプロモーターの調節下で発現ベクターにクローニングす
る。産物の分泌を所望する場合、そのポリヌクレオチドに、酵母内での分泌用シグナル配
列をコードするポリヌクレオチドをインフレームで融合する。さらなる実施形態では、発
現ベクターに、好ましくは、栄養要求性マーカー遺伝子、例えばＵＲＡ３またはＬＥＵ２
を含ませ、これを用いて栄養要求性宿主の欠損を補完してもよい。
【0079】
次いで、発現ベクターを使用して、当業者に公知の技術を用いてＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐ
ｈａ宿主細胞を形質転換する。Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ形質転換の有用な特徴は、最大
１００コピーの発現ベクターがゲノムへ自発的に組み込まれることである。ほとんどの場
合、組み込まれたポリヌクレオチドは、ヘッドトゥーテール配置を示す多量体を形成する
。組み込まれた外来ポリヌクレオチドは、非選択的条件下でさえ、いくつかの組換え株に
おいて有糸分裂的に安定であることが示されている。この高コピー数での組み込み現象は
、このシステムの高い生産能力にさらに寄与するものである。
ｈａ宿主細胞を形質転換する。Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ形質転換の有用な特徴は、最大
１００コピーの発現ベクターがゲノムへ自発的に組み込まれることである。ほとんどの場
合、組み込まれたポリヌクレオチドは、ヘッドトゥーテール配置を示す多量体を形成する
。組み込まれた外来ポリヌクレオチドは、非選択的条件下でさえ、いくつかの組換え株に
おいて有糸分裂的に安定であることが示されている。この高コピー数での組み込み現象は
、このシステムの高い生産能力にさらに寄与するものである。
【0080】
外来ＤＮＡを酵母ゲノムに挿入するか、またはエピソームを維持してコラーゲンを産生
する。コラーゲンのＤＮＡ配列を、ベクターを介して酵母に導入する。外来ＤＮＡは、任
意の非酵母宿主ＤＮＡであり、例えば、哺乳類、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅ
ｇａｎｓ及び細菌由来のものが挙げられるが、これらに限定されない。酵母内でのコラー
ゲン産生に適切な哺乳類ＤＮＡとして、ウシ、ウマ、ブタ、カンガルー、ゾウ、サイ、カ
バ、クジラ、イルカ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、ヤギ、及びヒツジ（子ヒツジ
）が挙げられるが、これらに限定されない。コラーゲン産生のための他のＤＮＡとして、
爬虫類（例えば、ワニ、クロコダイル、カメ、イグアナ、トカゲ、ヘビ）、鳥類（例えば
、ダチョウ、エミュー、モア）、恐竜、両生類、及び魚類（例えば、ティラピア、バス、
サケ、マス、サメ、ウナギコラーゲン）及びそれらの組み合わせが挙げられる。
する。コラーゲンのＤＮＡ配列を、ベクターを介して酵母に導入する。外来ＤＮＡは、任
意の非酵母宿主ＤＮＡであり、例えば、哺乳類、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅ
ｇａｎｓ及び細菌由来のものが挙げられるが、これらに限定されない。酵母内でのコラー
ゲン産生に適切な哺乳類ＤＮＡとして、ウシ、ウマ、ブタ、カンガルー、ゾウ、サイ、カ
バ、クジラ、イルカ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、ヤギ、及びヒツジ（子ヒツジ
）が挙げられるが、これらに限定されない。コラーゲン産生のための他のＤＮＡとして、
爬虫類（例えば、ワニ、クロコダイル、カメ、イグアナ、トカゲ、ヘビ）、鳥類（例えば
、ダチョウ、エミュー、モア）、恐竜、両生類、及び魚類（例えば、ティラピア、バス、
サケ、マス、サメ、ウナギコラーゲン）及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【0081】
ＤＮＡをベクター上に挿入するが、適切なベクターとして、ｐＨＴＸ１－ＢｉＤｉ－Ｐ
４ＨＡ－Ｐｒｅ－Ｐ４ＨＢ ｈｙｇｒｏ、ｐＨＴＸ１－ＢｉＤｉ－Ｐ４ＨＡ－ＰＨＯ１－
Ｐ４ＨＢ ｈｙｇｒｏ、ｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１－ＢｉＤｉ－Ｐ４ＨＡ－Ｐｒｅｐｒｏ
－Ｐ４ＨＢ Ｇ４１８、ｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１－ＢｉＤｉ－Ｐ４ＨＡ－ＰＨＯ１－Ｐ
４ＨＢ Ｈｙｇｒｏ、ｐＤＦ－Ｃｏｌ３Ａ１ 改変ゼオシン、ｐＣＡＴ－Ｃｏｌ３Ａ１
改変ゼオシン、ｐＤＦ－Ｃｏｌ３Ａ１ 改変ゼオシン及びＡＯＸ１ランディングパッド、
ｐＨＴＸ１－ＢｉＤｉ－Ｐ４ＨＡ－Ｐｒｅ－Ｐｒｏ－Ｐ４ＨＢ ｈｙｇｒｏが挙げられる
が、これらに限定されない。ベクターは、通常、ＤＮＡを直鎖状化するための少なくとも
１つの制限酵素部位を含んでいた。
４ＨＡ－Ｐｒｅ－Ｐ４ＨＢ ｈｙｇｒｏ、ｐＨＴＸ１－ＢｉＤｉ－Ｐ４ＨＡ－ＰＨＯ１－
Ｐ４ＨＢ ｈｙｇｒｏ、ｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１－ＢｉＤｉ－Ｐ４ＨＡ－Ｐｒｅｐｒｏ
－Ｐ４ＨＢ Ｇ４１８、ｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１－ＢｉＤｉ－Ｐ４ＨＡ－ＰＨＯ１－Ｐ
４ＨＢ Ｈｙｇｒｏ、ｐＤＦ－Ｃｏｌ３Ａ１ 改変ゼオシン、ｐＣＡＴ－Ｃｏｌ３Ａ１
改変ゼオシン、ｐＤＦ－Ｃｏｌ３Ａ１ 改変ゼオシン及びＡＯＸ１ランディングパッド、
ｐＨＴＸ１－ＢｉＤｉ－Ｐ４ＨＡ－Ｐｒｅ－Ｐｒｏ－Ｐ４ＨＢ ｈｙｇｒｏが挙げられる
が、これらに限定されない。ベクターは、通常、ＤＮＡを直鎖状化するための少なくとも
１つの制限酵素部位を含んでいた。
【0082】
選択プロモーターは、組換えタンパク質の産生を向上させる場合があり、これをコラー
ゲンまたはヒドロキシレートをコードする配列を有するベクターに含めてもよい。本発明
での使用に適したプロモーターとして、ＡＯＸ１メタノール誘導プロモーター、ｐＤＦ抑
制解除プロモーター、ｐＣＡＴ抑制解除プロモーター、Ｄａｓ１－Ｄａｓ２メタノール誘
導性二方向性プロモーター、ｐＨＴＸ１構成的二方向性プロモーター、ｐＧＣＷ１４－ｐ
ＧＡＰ１構成的二方向性プロモーター及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに
限定されない。適切なメタノール誘導性プロモーターとして、ＡＯＸ２、Ｄａｓ１、Ｄａ
ｓ２、ｐＤＦ、ｐＣＡＴ、ｐＰＭＰ２０、ｐＦＤＨ１、ｐＦＬＤ１、ｐＴＡＬ２、ｐＦＢ
Ａ２、ｐＰＥＸ５、ｐＤＡＫ１、ｐＦＧＨ１、ｐＲＫＩ１、ｐＲＥＰ２及びそれらの組み
合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
ゲンまたはヒドロキシレートをコードする配列を有するベクターに含めてもよい。本発明
での使用に適したプロモーターとして、ＡＯＸ１メタノール誘導プロモーター、ｐＤＦ抑
制解除プロモーター、ｐＣＡＴ抑制解除プロモーター、Ｄａｓ１－Ｄａｓ２メタノール誘
導性二方向性プロモーター、ｐＨＴＸ１構成的二方向性プロモーター、ｐＧＣＷ１４－ｐ
ＧＡＰ１構成的二方向性プロモーター及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに
限定されない。適切なメタノール誘導性プロモーターとして、ＡＯＸ２、Ｄａｓ１、Ｄａ
ｓ２、ｐＤＦ、ｐＣＡＴ、ｐＰＭＰ２０、ｐＦＤＨ１、ｐＦＬＤ１、ｐＴＡＬ２、ｐＦＢ
Ａ２、ｐＰＥＸ５、ｐＤＡＫ１、ｐＦＧＨ１、ｐＲＫＩ１、ｐＲＥＰ２及びそれらの組み
合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【0083】
オールインワンベクターを含む本発明によるベクターでは、酵母に組み込んだベクター
中で利用する各オープンリーディングフレームの末端にターミネーターを配置してもよい
。ターミネーターのＤＮＡ配列をベクターに挿入する。ベクターを複製するためには、複
製を開始するための複製起点が必要である。複製起点のＤＮＡ配列をベクターに挿入する
。酵母ゲノムとの相同性を有する１つ以上のＤＮＡ配列をベクターに組み込んで、酵母ゲ
ノムへの組換え及び組み込みを促進するか、または酵母細胞に形質転換したベクターを安
定化することができる。
中で利用する各オープンリーディングフレームの末端にターミネーターを配置してもよい
。ターミネーターのＤＮＡ配列をベクターに挿入する。ベクターを複製するためには、複
製を開始するための複製起点が必要である。複製起点のＤＮＡ配列をベクターに挿入する
。酵母ゲノムとの相同性を有する１つ以上のＤＮＡ配列をベクターに組み込んで、酵母ゲ
ノムへの組換え及び組み込みを促進するか、または酵母細胞に形質転換したベクターを安
定化することができる。
【0084】
本発明によるベクターはまた、通常、形質転換に成功した酵母細胞を選択するために使
用する少なくとも１つの選択マーカーを含む。マーカーは、抗生物質耐性に関連している
場合があり、マーカーはまた、特定のアミノ酸（栄養要求性マーカー）の存在下または非
存在下での増殖能力に関連している場合がある。適切な栄養要求性マーカーには、ＡＤＥ
、ＨＩＳ、ＵＲＡ、ＬＥＵ、ＬＹＳ、ＴＲＰ及びそれらの組み合わせが含まれていたが、
これらに限定されない。組換えベクターを含む酵母細胞の選択を提供するために、選択マ
ーカー用の少なくとも１つのＤＮＡ配列をベクターに組み込む。
用する少なくとも１つの選択マーカーを含む。マーカーは、抗生物質耐性に関連している
場合があり、マーカーはまた、特定のアミノ酸（栄養要求性マーカー）の存在下または非
存在下での増殖能力に関連している場合がある。適切な栄養要求性マーカーには、ＡＤＥ
、ＨＩＳ、ＵＲＡ、ＬＥＵ、ＬＹＳ、ＴＲＰ及びそれらの組み合わせが含まれていたが、
これらに限定されない。組換えベクターを含む酵母細胞の選択を提供するために、選択マ
ーカー用の少なくとも１つのＤＮＡ配列をベクターに組み込む。
【0085】
本発明のいくつかの実施形態では、組換え酵母で発現するコラーゲンもしくはコラーゲ
ン様タンパク質中のリジン及びプロリンなどのアミノ酸残基は、水酸化されていない場合
があるか、または対応する天然もしくは未修飾コラーゲンもしくはコラーゲン様タンパク
質に比べて水酸化度が低いか、もしくは高い場合がある。他の実施形態では、コラーゲン
またはコラーゲン様タンパク質のアミノ酸残基は、グリコシル化されていない場合がある
か、または対応する天然もしくは未修飾コラーゲンもしくはコラーゲン様タンパク質に比
べてグリコシル化度が低いか、もしくは高い場合がある。
ン様タンパク質中のリジン及びプロリンなどのアミノ酸残基は、水酸化されていない場合
があるか、または対応する天然もしくは未修飾コラーゲンもしくはコラーゲン様タンパク
質に比べて水酸化度が低いか、もしくは高い場合がある。他の実施形態では、コラーゲン
またはコラーゲン様タンパク質のアミノ酸残基は、グリコシル化されていない場合がある
か、または対応する天然もしくは未修飾コラーゲンもしくはコラーゲン様タンパク質に比
べてグリコシル化度が低いか、もしくは高い場合がある。
【0086】
水酸化コラーゲンは、非水酸化または過少水酸化コラーゲン（＜３２℃）よりも高い融
解温度（＞３７℃）を有し、また、非水酸化または過少水酸化コラーゲンに比べて良好に
フィブリル化し、素材としての使用に関してより強力でより耐久性の高い構造を形成する
。コラーゲン調製物の融解温度を利用してその水酸化度を評価してもよく、融解温度は、
例えば、３０～４０℃の範囲、ならびにすべての中間値、例えば、３０、３１、３２、３
３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、及び４０℃であり得る。過少水酸化コラーゲ
ンは、靴やバッグなどの高耐久性の物品には適さないゼリーまたはゼラチン様素材のみを
形成し得るが、より軟質性の、またはより吸収性の製品に配合することができる。
解温度（＞３７℃）を有し、また、非水酸化または過少水酸化コラーゲンに比べて良好に
フィブリル化し、素材としての使用に関してより強力でより耐久性の高い構造を形成する
。コラーゲン調製物の融解温度を利用してその水酸化度を評価してもよく、融解温度は、
例えば、３０～４０℃の範囲、ならびにすべての中間値、例えば、３０、３１、３２、３
３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、及び４０℃であり得る。過少水酸化コラーゲ
ンは、靴やバッグなどの高耐久性の物品には適さないゼリーまたはゼラチン様素材のみを
形成し得るが、より軟質性の、またはより吸収性の製品に配合することができる。
【0087】
コラーゲン組成物中のコラーゲンは均質であってもよく、１００％ウシＩ型コラーゲン
または１００％ＩＩＩ型ウシコラーゲンなどの単一タイプのコラーゲン分子を含有しても
よく、または異なる種類のコラーゲン分子もしくはコラーゲン様分子、例えば、ウシＩ型
及びＩＩＩ型分子の混合物を含有してもよい。そのような混合物は、個々のコラーゲンま
たはコラーゲン様タンパク質の成分の＞０％、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７
０、８０、９０、９５、９９または＜１００％（または任意の中間値もしくは部分範囲）
を含み得る。この範囲にはすべての中間値が含まれる。例えば、コラーゲン組成物は、３
０％のＩ型コラーゲンと７０％のＩＩＩ型コラーゲンを含有してもよく、または３３．３
％のＩ型コラーゲン、３３．３％のＩＩ型コラーゲン、及び３３．３％のＩＩＩ型コラー
ゲンを含有してもよく、その場合、コラーゲンの割合は、組成物中のコラーゲンの全質量
またはコラーゲン分子の分子の割合に基づく。
または１００％ＩＩＩ型ウシコラーゲンなどの単一タイプのコラーゲン分子を含有しても
よく、または異なる種類のコラーゲン分子もしくはコラーゲン様分子、例えば、ウシＩ型
及びＩＩＩ型分子の混合物を含有してもよい。そのような混合物は、個々のコラーゲンま
たはコラーゲン様タンパク質の成分の＞０％、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７
０、８０、９０、９５、９９または＜１００％（または任意の中間値もしくは部分範囲）
を含み得る。この範囲にはすべての中間値が含まれる。例えば、コラーゲン組成物は、３
０％のＩ型コラーゲンと７０％のＩＩＩ型コラーゲンを含有してもよく、または３３．３
％のＩ型コラーゲン、３３．３％のＩＩ型コラーゲン、及び３３．３％のＩＩＩ型コラー
ゲンを含有してもよく、その場合、コラーゲンの割合は、組成物中のコラーゲンの全質量
またはコラーゲン分子の分子の割合に基づく。
【0088】
上記の改変した（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）酵母細胞を利用して、コラーゲンを産生する
ことができる。そのために、細胞を発酵室内の培地に入れ、１２時間～１週間の範囲の期
間、調節されたｐＨ条件下で溶存酸素及び炭素源を供給する。適切な培地として、限定す
るものではないが、緩衝グリセロール複合培地（ＢＭＧＹ）、緩衝メタノール複合培地（
ＢＭＭＹ）、及び酵母抽出ペプトンデキストロース（ＹＰＤ）が挙げられる。酵母細胞内
でコラーゲンを産生することから、コラーゲンを単離するために、分泌性酵母株を使用す
るか、酵母細胞を溶解してコラーゲンを遊離させる必要がある。その後、遠心分離、沈殿
、濾過、クロマトグラフィーなどの従来技術によってコラーゲンを精製してもよい。
ことができる。そのために、細胞を発酵室内の培地に入れ、１２時間～１週間の範囲の期
間、調節されたｐＨ条件下で溶存酸素及び炭素源を供給する。適切な培地として、限定す
るものではないが、緩衝グリセロール複合培地（ＢＭＧＹ）、緩衝メタノール複合培地（
ＢＭＭＹ）、及び酵母抽出ペプトンデキストロース（ＹＰＤ）が挙げられる。酵母細胞内
でコラーゲンを産生することから、コラーゲンを単離するために、分泌性酵母株を使用す
るか、酵母細胞を溶解してコラーゲンを遊離させる必要がある。その後、遠心分離、沈殿
、濾過、クロマトグラフィーなどの従来技術によってコラーゲンを精製してもよい。
【0089】
別の実施形態では、本発明は、水酸化及び非水酸化コラーゲンの製造に有用な酵母宿主
中のキメラＤＮＡ配列を提供する。キメラＤＮＡ配列は、未改変ＤＮＡ配列と改変ＤＮＡ
配列を組み合わせることによって生成する。様々な塩基対の位置で未改変ＤＮＡ配列を切
断してもよい。改変ＤＮＡ配列もまた、対応する塩基対の位置で切断してもよい。未改変
の切断と修飾の切断を、前方から後方へ、及び後方から前方へ組み合わせてもよい。キメ
ラＤＮＡ配列を、プロモーター、ベクター、ターミネーター及び上記の選択マーカーと組
み合わせて宿主に挿入し、水酸化及び非水酸化コラーゲンを産生することができる酵母を
生成してもよい。
中のキメラＤＮＡ配列を提供する。キメラＤＮＡ配列は、未改変ＤＮＡ配列と改変ＤＮＡ
配列を組み合わせることによって生成する。様々な塩基対の位置で未改変ＤＮＡ配列を切
断してもよい。改変ＤＮＡ配列もまた、対応する塩基対の位置で切断してもよい。未改変
の切断と修飾の切断を、前方から後方へ、及び後方から前方へ組み合わせてもよい。キメ
ラＤＮＡ配列を、プロモーター、ベクター、ターミネーター及び上記の選択マーカーと組
み合わせて宿主に挿入し、水酸化及び非水酸化コラーゲンを産生することができる酵母を
生成してもよい。
【0090】
最適化及び非最適化ＤＮＡの割合を、配列の全長に基づいて計算してもよい。キメラ株
は、Ｎ末端での最適化ＤＮＡとＣ末端での非最適化ＤＮＡとの組み合わせであってもよい
。最適化ＤＮＡの割合は、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、
９０～９９％の範囲（または任意の中間値もしくは部分範囲）であってもよく、例えば、
１０～４０％及び６０～９０％の範囲であってもよい。あるいは、キメラ株は、Ｎ末端の
非最適化ＤＮＡとＣ末端の最適化ＤＮＡとの組み合わせであってもよい。非最適化ＤＮＡ
の割合は、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０～９９％の
範囲（または任意の中間値もしくは部分範囲）であってもよく、例えば、１０～４０％及
び６０～９０％の範囲であってもよい。例えば、１３３１位で切断した１４８６塩基対を
有するＤＮＡ配列は、０～１３３１の最適化ＤＮＡ及び１３３２～１４８６の非最適化Ｄ
ＮＡを提供し、そのキメラは９０％が最適化されている。最適化されたポリヌクレオチド
配列は、コラーゲン分子内のＣ末端、Ｎ末端、または他の場所でコラーゲンのセグメント
をコードしてもよく、例えば、コラーゲン分子の最初の１０、２０、３０、４０、５０、
６０、７０、８０、もしくは９０％を、またはコラーゲン分子の最後の１０、２０、３０
、４０、５０、６０、７０、８０、もしくは９０％をコードしてもよい。
は、Ｎ末端での最適化ＤＮＡとＣ末端での非最適化ＤＮＡとの組み合わせであってもよい
。最適化ＤＮＡの割合は、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、
９０～９９％の範囲（または任意の中間値もしくは部分範囲）であってもよく、例えば、
１０～４０％及び６０～９０％の範囲であってもよい。あるいは、キメラ株は、Ｎ末端の
非最適化ＤＮＡとＣ末端の最適化ＤＮＡとの組み合わせであってもよい。非最適化ＤＮＡ
の割合は、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０～９９％の
範囲（または任意の中間値もしくは部分範囲）であってもよく、例えば、１０～４０％及
び６０～９０％の範囲であってもよい。例えば、１３３１位で切断した１４８６塩基対を
有するＤＮＡ配列は、０～１３３１の最適化ＤＮＡ及び１３３２～１４８６の非最適化Ｄ
ＮＡを提供し、そのキメラは９０％が最適化されている。最適化されたポリヌクレオチド
配列は、コラーゲン分子内のＣ末端、Ｎ末端、または他の場所でコラーゲンのセグメント
をコードしてもよく、例えば、コラーゲン分子の最初の１０、２０、３０、４０、５０、
６０、７０、８０、もしくは９０％を、またはコラーゲン分子の最後の１０、２０、３０
、４０、５０、６０、７０、８０、もしくは９０％をコードしてもよい。
【0091】
あるいは、キメラ株は、ともに融合した最適化及び非最適化ＤＮＡの２つ、３つまたは
４つ以上のセクションから構成されてもよい。例えば、１，５００塩基対を有するＤＮＡ
配列は、０～５００までの最適化ＤＮＡセクション、５０１～１，０００までの非最適化
ＤＮＡセクション、及び１００１～１５００までの最適化ＤＮＡセクションを有していて
もよい。
４つ以上のセクションから構成されてもよい。例えば、１，５００塩基対を有するＤＮＡ
配列は、０～５００までの最適化ＤＮＡセクション、５０１～１，０００までの非最適化
ＤＮＡセクション、及び１００１～１５００までの最適化ＤＮＡセクションを有していて
もよい。
【0092】
本明細書に開示するコラーゲンにより、バイオファブリケートレザーを製造することが
できる。コラーゲンをバイオファブリケートレザーに変換する方法は、同時係属中の特許
出願である米国特許出願第１５／４３３５６６号、第１５／４３３６５０号、第１５／４
３３６３２号、第１５／４３３６９３号、第１５／４３３７７７号、第１５／４３３６７
５号、第１５／４３３６７６号及び第１５／４３３８７７号に記載されており、それらの
開示内容は参照として本明細書に援用される。
できる。コラーゲンをバイオファブリケートレザーに変換する方法は、同時係属中の特許
出願である米国特許出願第１５／４３３５６６号、第１５／４３３６５０号、第１５／４
３３６３２号、第１５／４３３６９３号、第１５／４３３７７７号、第１５／４３３６７
５号、第１５／４３３６７６号及び第１５／４３３８７７号に記載されており、それらの
開示内容は参照として本明細書に援用される。
【0093】
発明の実施形態
本発明の非限定的な実施形態として、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
ウシコラーゲン、例えばＩ型もしくはＩＩＩ型コラーゲン、またはコラーゲン変異体も
しくは誘導体をコードするポリヌクレオチド、ならびにコードされたコラーゲン中のプロ
リン、リジン、またはリジン及びプロリン残基を水酸化する少なくとも１つの酵素をコー
ドするポリヌクレオチド。いくつかの実施形態では、天然コラーゲンもしくはヒドロキシ
ラーゼポリヌクレオチド配列の全部もしくは一部について、ポリヌクレオチドをコドン改
変するか、または酵母プロモーター配列などの発現調節エレメントを組み込んで宿主酵母
細胞内でのコラーゲンまたはヒドロキシラーゼの発現を促進する。酵母内で発現する場合
、改変したポリヌクレオチドは、同一の条件下で発現させた同じコラーゲン配列をコード
する未改変ポリペプチドに比べて、コラーゲンの発現を１０、２０、２５、３０、３５、
４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００または＞１００重量％高め得る。
本発明の非限定的な実施形態として、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
ウシコラーゲン、例えばＩ型もしくはＩＩＩ型コラーゲン、またはコラーゲン変異体も
しくは誘導体をコードするポリヌクレオチド、ならびにコードされたコラーゲン中のプロ
リン、リジン、またはリジン及びプロリン残基を水酸化する少なくとも１つの酵素をコー
ドするポリヌクレオチド。いくつかの実施形態では、天然コラーゲンもしくはヒドロキシ
ラーゼポリヌクレオチド配列の全部もしくは一部について、ポリヌクレオチドをコドン改
変するか、または酵母プロモーター配列などの発現調節エレメントを組み込んで宿主酵母
細胞内でのコラーゲンまたはヒドロキシラーゼの発現を促進する。酵母内で発現する場合
、改変したポリヌクレオチドは、同一の条件下で発現させた同じコラーゲン配列をコード
する未改変ポリペプチドに比べて、コラーゲンの発現を１０、２０、２５、３０、３５、
４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００または＞１００重量％高め得る。
【0094】
いくつかの実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３
、１４、１５倍またはそれ以上のコラーゲンまたはヒドロキシラーゼタンパク質の発現を
達成し得る。いくつかの実施形態では、ＩＩＩ型コラーゲンまたはコラーゲン変異体を発
現させ、その場合、変異体は、配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも７０、７５、８０
、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％同一のアミノ酸配列を有す
る。他の実施形態では、ウシコラーゲンは、Ｉ型ウシコラーゲン、またはα１（Ｉ）鎖及
びα２（Ｉ）鎖の両方をコードするか、または天然のＩ型コラーゲン鎖と少なくとも７０
、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％同一である１
つ以上のコラーゲン鎖をコードするコラーゲン変異体である。
、１４、１５倍またはそれ以上のコラーゲンまたはヒドロキシラーゼタンパク質の発現を
達成し得る。いくつかの実施形態では、ＩＩＩ型コラーゲンまたはコラーゲン変異体を発
現させ、その場合、変異体は、配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも７０、７５、８０
、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％同一のアミノ酸配列を有す
る。他の実施形態では、ウシコラーゲンは、Ｉ型ウシコラーゲン、またはα１（Ｉ）鎖及
びα２（Ｉ）鎖の両方をコードするか、または天然のＩ型コラーゲン鎖と少なくとも７０
、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％同一である１
つ以上のコラーゲン鎖をコードするコラーゲン変異体である。
【0095】
上記のウシコラーゲンをコードするポリヌクレオチドは、プロリル４－ヒドロキシラー
ゼのＰ４ＨＡ及びＰ４ＨＢサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列もしくはセグ
メント、またはそれらと少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、
９８、９９または１００％同一である酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含み得る
。他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、プロリル－３－ヒドロキシラーゼ、リジルヒ
ドロキシラーゼ、及び／またはリジルオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列も
しくはセグメント、またはそれらと少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９
６、９７、９８、９９または１００％同一である酵素をコードするポリヌクレオチド配列
を含み得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２のＩＩＩ型ウシコラーゲ
ンアミノ酸配列と少なくとも７５～９９％同一であるポリペプチド、及びそれぞれ配列番
号５４及び５２と少なくとも７５～９９％同一であるＰ４ＨＡ及びＰ４ＨＢサブユニット
を有するヒドロキシラーゼをコードするセグメントをコードし得る。
ゼのＰ４ＨＡ及びＰ４ＨＢサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列もしくはセグ
メント、またはそれらと少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、
９８、９９または１００％同一である酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含み得る
。他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、プロリル－３－ヒドロキシラーゼ、リジルヒ
ドロキシラーゼ、及び／またはリジルオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列も
しくはセグメント、またはそれらと少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９
６、９７、９８、９９または１００％同一である酵素をコードするポリヌクレオチド配列
を含み得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２のＩＩＩ型ウシコラーゲ
ンアミノ酸配列と少なくとも７５～９９％同一であるポリペプチド、及びそれぞれ配列番
号５４及び５２と少なくとも７５～９９％同一であるＰ４ＨＡ及びＰ４ＨＢサブユニット
を有するヒドロキシラーゼをコードするセグメントをコードし得る。
【0096】
本発明のポリヌクレオチド配列は、酵母で機能するポリペプチド分泌配列をさらにコー
ドしてもよく、それは、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲンまたは本明細書に記載の他
のいくつかのコラーゲンであってもよいコラーゲンをコードするポリヌクレオチド配列に
、通常、隣接して配置される。
ドしてもよく、それは、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲンまたは本明細書に記載の他
のいくつかのコラーゲンであってもよいコラーゲンをコードするポリヌクレオチド配列に
、通常、隣接して配置される。
【0097】
本発明のポリヌクレオチド配列に、さらに、コラーゲン、またはヒドロキシラーゼなど
の酵素の発現を促進または調節するプロモーターまたは他の配列を含めてもよく、例えば
、ＡＯＸ１メタノール誘導性プロモーター、ＤＮ ｐＤＦ抑制解除プロモーター、ｐＣＡ
Ｔ抑制解除プロモーター、Ｄａｓ１－Ｄａｓ２メタノール誘導性二方向性プロモーター、
ｐＨＴＸ１構成的二方向性プロモーター、ｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロ
モーター、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含めてもよい。
の酵素の発現を促進または調節するプロモーターまたは他の配列を含めてもよく、例えば
、ＡＯＸ１メタノール誘導性プロモーター、ＤＮ ｐＤＦ抑制解除プロモーター、ｐＣＡ
Ｔ抑制解除プロモーター、Ｄａｓ１－Ｄａｓ２メタノール誘導性二方向性プロモーター、
ｐＨＴＸ１構成的二方向性プロモーター、ｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロ
モーター、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含めてもよい。
【0098】
本発明のポリヌクレオチドにはまた、配列番号２３及び２４によってそれぞれコードさ
れるようなαファクタープレ配列またはαファクタープレプロ配列などの他の要素を含め
てもよい。いくつかの実施形態では、そのような配列を、酵素、例えば、Ｐ４ＨＡ（配列
番号５４）もしくはＰ４ＨＢ（配列番号５２）などの本明細書に記載するヒドロキシラー
ゼまたは他の酵素を発現するポリヌクレオチド配列か、またはそれらと少なくとも７５、
８０、９０、もしくは９５～１００％同一である変異型酵素に作動可能に連結してもよい
。
れるようなαファクタープレ配列またはαファクタープレプロ配列などの他の要素を含め
てもよい。いくつかの実施形態では、そのような配列を、酵素、例えば、Ｐ４ＨＡ（配列
番号５４）もしくはＰ４ＨＢ（配列番号５２）などの本明細書に記載するヒドロキシラー
ゼまたは他の酵素を発現するポリヌクレオチド配列か、またはそれらと少なくとも７５、
８０、９０、もしくは９５～１００％同一である変異型酵素に作動可能に連結してもよい
。
【0099】
上記に開示したポリヌクレオチド配列を有するベクターは、本発明のさらなる実施形態
を表す。これらには、本明細書に開示する任意のポリヌクレオチド配列、例えば、コラー
ゲン、トランケート型コラーゲン、コラーゲン変異体、及び酵素、例えば、本明細書に記
載するヒドロキシラーゼまたは他の酵素をコードするキメラポリヌクレオチド配列を有す
るベクターが含まれる。いくつかの実施形態では、コラーゲンをコードする配列及びヒド
ロキシラーゼまたは他の酵素をコードする配列は、同じベクター上に存在し；他の実施形
態では異なるベクター上に存在し得る。
を表す。これらには、本明細書に開示する任意のポリヌクレオチド配列、例えば、コラー
ゲン、トランケート型コラーゲン、コラーゲン変異体、及び酵素、例えば、本明細書に記
載するヒドロキシラーゼまたは他の酵素をコードするキメラポリヌクレオチド配列を有す
るベクターが含まれる。いくつかの実施形態では、コラーゲンをコードする配列及びヒド
ロキシラーゼまたは他の酵素をコードする配列は、同じベクター上に存在し；他の実施形
態では異なるベクター上に存在し得る。
【0100】
本発明はまた、本明細書に記載するベクターを保有する宿主細胞、例えば酵母宿主細胞
を企図する。いくつかの実施形態では、これらのベクターを、非酵母細胞、例えば細菌宿
主細胞などで産生し、その後に、コラーゲンまたは水酸化コラーゲンを発現させる酵母宿
主細胞、例えばＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｕｓ宿主細胞に形質転換してもよい。
を企図する。いくつかの実施形態では、これらのベクターを、非酵母細胞、例えば細菌宿
主細胞などで産生し、その後に、コラーゲンまたは水酸化コラーゲンを発現させる酵母宿
主細胞、例えばＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｕｓ宿主細胞に形質転換してもよい。
【0101】
本発明の別の態様は、プロリン残基の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１
０％未満が水酸化された組換えコラーゲンの製造方法に関する。本方法は、コラーゲンを
産生するのに適した時間及び条件下で、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｕｓまたは他の適切
な酵母宿主細胞（または真核生物宿主細胞）を培養し、コラーゲンを回収することを含み
；前記ベクターは、プロリン残基の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０％以下を
水酸化する量もしくは形態のプロリル－４－ヒドロキシラーゼを発現するように構成され
ている。本発明の別の実施形態は、プロリン残基の１、２、３、４、５、６、７、８、９
、１０％未満が水酸化された組換えＩＩＩ型コラーゲンの製造方法であって、ＩＩＩ型コ
ラーゲンを産生するのに適した時間及び条件下で、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｕｓまた
は他の適切な酵母宿主細胞を培養し、コラーゲンを回収することを含み；前記ベクターは
、プロリン残基の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０％以下を水酸化する量のプ
ロリル－４－ヒドロキシラーゼを発現するように構成される。コラーゲン及びヒドロキシ
ラーゼの両方をコードするオールインワンベクターは、例えば、ヒドロキシラーゼに誘導
性または温度感受性プロモーターを用いることによって機能性ヒドロキシラーゼがほとん
どまたはまったく発現しないように構成してもよい。
０％未満が水酸化された組換えコラーゲンの製造方法に関する。本方法は、コラーゲンを
産生するのに適した時間及び条件下で、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｕｓまたは他の適切
な酵母宿主細胞（または真核生物宿主細胞）を培養し、コラーゲンを回収することを含み
；前記ベクターは、プロリン残基の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０％以下を
水酸化する量もしくは形態のプロリル－４－ヒドロキシラーゼを発現するように構成され
ている。本発明の別の実施形態は、プロリン残基の１、２、３、４、５、６、７、８、９
、１０％未満が水酸化された組換えＩＩＩ型コラーゲンの製造方法であって、ＩＩＩ型コ
ラーゲンを産生するのに適した時間及び条件下で、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｕｓまた
は他の適切な酵母宿主細胞を培養し、コラーゲンを回収することを含み；前記ベクターは
、プロリン残基の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０％以下を水酸化する量のプ
ロリル－４－ヒドロキシラーゼを発現するように構成される。コラーゲン及びヒドロキシ
ラーゼの両方をコードするオールインワンベクターは、例えば、ヒドロキシラーゼに誘導
性または温度感受性プロモーターを用いることによって機能性ヒドロキシラーゼがほとん
どまたはまったく発現しないように構成してもよい。
【0102】
本発明のさらなる実施形態は、本明細書に記載するベクターを保有するＰｉｃｈｉａ
ｐａｓｔｏｒｕｓまたは他の適切な酵母宿主細胞を、コラーゲンを産生するのに適した時
間及び条件下で培養し、コラーゲンを回収することによって、プロリン残基の＞１０、１
５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５または＞９５％を水
酸化した組換えコラーゲンを製造する方法であり；前記ベクターは、コラーゲン中のプロ
リン残基の＞１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もし
くは＞９０％またはそれ以上を水酸化する量または形態のプロリル－４－ヒドロキシラー
ゼを発現するように構成される。培養時間及び条件ならびにヒドロキシラーゼの量または
活性を用いて、水酸化の量を調節してもよい。本発明の別の実施形態は、プロリン残基の
５０、６０、７０、８０、９０、９５、または＞９５％を水酸化した組換えＩＩＩ型コラ
ーゲンの製造方法であって、本発明によるベクターを保有するＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏ
ｒｕｓ宿主細胞を、ＩＩＩ型コラーゲンを産生するのに適した時間及び条件下で培養し、
ＩＩＩ型コラーゲンを回収することを含み；前記ベクターは、プロリン残基の５０、６０
、７０、８０、９０もしくは＞９０％またはそれ以上を水酸化する量または形態のプロリ
ル－４－ヒドロキシラーゼを発現するように構成される。培養時間及び条件ならびにヒド
ロキシラーゼの量または活性を用いて、水酸化の量を調節してもよい。
ｐａｓｔｏｒｕｓまたは他の適切な酵母宿主細胞を、コラーゲンを産生するのに適した時
間及び条件下で培養し、コラーゲンを回収することによって、プロリン残基の＞１０、１
５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５または＞９５％を水
酸化した組換えコラーゲンを製造する方法であり；前記ベクターは、コラーゲン中のプロ
リン残基の＞１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もし
くは＞９０％またはそれ以上を水酸化する量または形態のプロリル－４－ヒドロキシラー
ゼを発現するように構成される。培養時間及び条件ならびにヒドロキシラーゼの量または
活性を用いて、水酸化の量を調節してもよい。本発明の別の実施形態は、プロリン残基の
５０、６０、７０、８０、９０、９５、または＞９５％を水酸化した組換えＩＩＩ型コラ
ーゲンの製造方法であって、本発明によるベクターを保有するＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏ
ｒｕｓ宿主細胞を、ＩＩＩ型コラーゲンを産生するのに適した時間及び条件下で培養し、
ＩＩＩ型コラーゲンを回収することを含み；前記ベクターは、プロリン残基の５０、６０
、７０、８０、９０もしくは＞９０％またはそれ以上を水酸化する量または形態のプロリ
ル－４－ヒドロキシラーゼを発現するように構成される。培養時間及び条件ならびにヒド
ロキシラーゼの量または活性を用いて、水酸化の量を調節してもよい。
【0103】
本発明の別の実施形態は、プロリン残基の５０、６０、７０、８０、９０、９５もしく
は＞９５％またはそれ以上を水酸化した組換えコラーゲンの製造方法に関し、本方法は、
本発明のベクターを保有するＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｕｓまたは他の適切な酵母宿主
細胞を、コラーゲンを産生するのに適した時間及び条件下で培養し、コラーゲンを回収す
ることを含み；前記ベクターは、プロリン残基の５０、６０、７０、８０、９０、９５、
もしくは＞９５％またはそれ以上を水酸化する量のプロリル－４－ヒドロキシラーゼを発
現するように構成される。培養時間及び条件ならびにヒドロキシラーゼの量または活性を
用いて、水酸化の量を調節してもよい。
は＞９５％またはそれ以上を水酸化した組換えコラーゲンの製造方法に関し、本方法は、
本発明のベクターを保有するＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｕｓまたは他の適切な酵母宿主
細胞を、コラーゲンを産生するのに適した時間及び条件下で培養し、コラーゲンを回収す
ることを含み；前記ベクターは、プロリン残基の５０、６０、７０、８０、９０、９５、
もしくは＞９５％またはそれ以上を水酸化する量のプロリル－４－ヒドロキシラーゼを発
現するように構成される。培養時間及び条件ならびにヒドロキシラーゼの量または活性を
用いて、水酸化の量を調節してもよい。
【0104】
本発明の別の実施形態は、プロリン残基の５０、６０、７０、８０、９０、９５、また
は＞９５％を水酸化した組換え型ＩＩＩ型コラーゲンの製造方法に関し、本方法は、本発
明のベクターを保有するＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｕｓまたは他の酵母宿主細胞を、コ
ラーゲンを産生するのに適した時間及び条件下で培養し、コラーゲンを回収することを含
み；前記ベクターは、プロリン残基の５０、６０、７０、８０、９０、９５、または＞９
５％を水酸化する量のプロリル－４－ヒドロキシラーゼを発現するように構成される。培
養時間及び条件ならびにヒドロキシラーゼの量または活性を用いて、水酸化の量を調節し
てもよい。
は＞９５％を水酸化した組換え型ＩＩＩ型コラーゲンの製造方法に関し、本方法は、本発
明のベクターを保有するＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｕｓまたは他の酵母宿主細胞を、コ
ラーゲンを産生するのに適した時間及び条件下で培養し、コラーゲンを回収することを含
み；前記ベクターは、プロリン残基の５０、６０、７０、８０、９０、９５、または＞９
５％を水酸化する量のプロリル－４－ヒドロキシラーゼを発現するように構成される。培
養時間及び条件ならびにヒドロキシラーゼの量または活性を用いて、水酸化の量を調節し
てもよい。
【0105】
本発明の別の実施形態は、プロリン残基の７５、８０、９０、９５、または＞９５％を
水酸化した組換えコラーゲンの製造方法に関し、本発明のベクターを保有するＰｉｃｈｉ
ａ ｐａｓｔｏｒｕｓまたは他の酵母宿主細胞を、コラーゲンを産生するのに適した時間
及び条件下で培養し、コラーゲンを回収することを含み；前記ベクターは、プロリン残基
の７５、８０、９０、９５、または＞９５％を水酸化する量のプロリル－４－ヒドロキシ
ラーゼを発現するように構成される。
水酸化した組換えコラーゲンの製造方法に関し、本発明のベクターを保有するＰｉｃｈｉ
ａ ｐａｓｔｏｒｕｓまたは他の酵母宿主細胞を、コラーゲンを産生するのに適した時間
及び条件下で培養し、コラーゲンを回収することを含み；前記ベクターは、プロリン残基
の７５、８０、９０、９５、または＞９５％を水酸化する量のプロリル－４－ヒドロキシ
ラーゼを発現するように構成される。
【0106】
本発明のさらなる実施形態は、プロリン残基の７５、８０、９０、９５、または＞９５
％を水酸化した組換えＩＩＩ型コラーゲンの製造方法であって、本方法は、本発明のベク
ターを保有するＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｕｓまたは他の酵母宿主細胞を、コラーゲン
を産生するのに適した時間及び条件下で培養し、コラーゲンを回収することを含み；前記
ベクターは、プロリン残基の７５、８０、９０、９５、もしくは＞９５％またはそれ以上
を水酸化する量のプロリル－４－ヒドロキシラーゼを発現するように構成される。
％を水酸化した組換えＩＩＩ型コラーゲンの製造方法であって、本方法は、本発明のベク
ターを保有するＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｕｓまたは他の酵母宿主細胞を、コラーゲン
を産生するのに適した時間及び条件下で培養し、コラーゲンを回収することを含み；前記
ベクターは、プロリン残基の７５、８０、９０、９５、もしくは＞９５％またはそれ以上
を水酸化する量のプロリル－４－ヒドロキシラーゼを発現するように構成される。
【0107】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載の方法のいずれか１つによって作製した組換
えコラーゲンである。そのような組換えコラーゲンは、プロリンまたはリジン残基のいず
れも水酸化されていなくてもよく、またはプロリン残基、リジン残基、もしくはプロリン
及びリジン残基の＞０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５
、もしくは１００％が水酸化されていてもよい。
えコラーゲンである。そのような組換えコラーゲンは、プロリンまたはリジン残基のいず
れも水酸化されていなくてもよく、またはプロリン残基、リジン残基、もしくはプロリン
及びリジン残基の＞０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５
、もしくは１００％が水酸化されていてもよい。
【0108】
本発明のさらなる実施形態は、本明細書に記載する組換えコラーゲンを含むか、または
本明細書に記載する方法によって作製する、バイオファブリケートレザーまたは他の素材
である。
本明細書に記載する方法によって作製する、バイオファブリケートレザーまたは他の素材
である。
【0109】
別の実施形態では、本発明は、水酸化及び非水酸化コラーゲンの製造に有用な酵母宿主
細胞中のキメラＤＮＡ配列を提供する。キメラＤＮＡ配列は、未改変ＤＮＡ配列と改変Ｄ
ＮＡ配列を組み合わせることによって生成する。様々な塩基対の位置で未改変ＤＮＡ配列
を切断してもよい。改変ＤＮＡ配列もまた、対応する塩基対の位置で切断してもよい。未
改変の切断と修飾の切断を、前方から後方へ、及び後方から前方へ組み合わせてもよい。
キメラＤＮＡ配列を、プロモーター、ベクター、ターミネーター及び上記の選択マーカー
と組み合わせて宿主に挿入し、水酸化及び非水酸化コラーゲンを産生することができる酵
母を生成してもよい。
細胞中のキメラＤＮＡ配列を提供する。キメラＤＮＡ配列は、未改変ＤＮＡ配列と改変Ｄ
ＮＡ配列を組み合わせることによって生成する。様々な塩基対の位置で未改変ＤＮＡ配列
を切断してもよい。改変ＤＮＡ配列もまた、対応する塩基対の位置で切断してもよい。未
改変の切断と修飾の切断を、前方から後方へ、及び後方から前方へ組み合わせてもよい。
キメラＤＮＡ配列を、プロモーター、ベクター、ターミネーター及び上記の選択マーカー
と組み合わせて宿主に挿入し、水酸化及び非水酸化コラーゲンを産生することができる酵
母を生成してもよい。
【0110】
本発明の他の実施形態には、以下が含まれるが、これらに限定されない：
非水酸化コラーゲンを産生するための遺伝子改変酵母株であって、（ｉ）酵母株；及び
（ｉｉ）コラーゲンのＤＮＡ配列；コラーゲンプロモーターのＤＮＡ配列；コラーゲンタ
ーミネーターのＤＮＡ配列；選択マーカーのＤＮＡ配列、選択マーカー用のプロモーター
のＤＮＡ配列；選択マーカー用のターミネーターのＤＮＡ配列；細菌用のもの、及び酵母
用のものから選択される複製起点のＤＮＡ配列；及び酵母ゲノムに対して相同性を有する
ＤＮＡ配列を有するベクターを含み、ベクターは酵母株に挿入されている、前記遺伝子改
変酵母株。本実施形態では、酵母株は、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈ
ａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれ
らの組み合わせ由来のものからなる群から選択してもよい。上記の実施形態では、ベクタ
ーは、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、
アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択され
るコラーゲンのＤＮＡ配列を有し得る。本実施形態では、コラーゲンのＤＮＡ配列は、天
然コラーゲンＤＮＡ、改変（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）コラーゲンＤＮＡ、及びコドン改変
コラーゲンＤＮＡから選択してもよい。
非水酸化コラーゲンを産生するための遺伝子改変酵母株であって、（ｉ）酵母株；及び
（ｉｉ）コラーゲンのＤＮＡ配列；コラーゲンプロモーターのＤＮＡ配列；コラーゲンタ
ーミネーターのＤＮＡ配列；選択マーカーのＤＮＡ配列、選択マーカー用のプロモーター
のＤＮＡ配列；選択マーカー用のターミネーターのＤＮＡ配列；細菌用のもの、及び酵母
用のものから選択される複製起点のＤＮＡ配列；及び酵母ゲノムに対して相同性を有する
ＤＮＡ配列を有するベクターを含み、ベクターは酵母株に挿入されている、前記遺伝子改
変酵母株。本実施形態では、酵母株は、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈ
ａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれ
らの組み合わせ由来のものからなる群から選択してもよい。上記の実施形態では、ベクタ
ーは、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、
アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択され
るコラーゲンのＤＮＡ配列を有し得る。本実施形態では、コラーゲンのＤＮＡ配列は、天
然コラーゲンＤＮＡ、改変（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）コラーゲンＤＮＡ、及びコドン改変
コラーゲンＤＮＡから選択してもよい。
【0111】
本実施形態では、プロモーターのＤＮＡ配列は、ＡＯＸ１メタノール誘導性プロモータ
ーのＤＮＡ、ｐＤＦ抑制解除プロモーターのＤＮＡ、ｐＣＡＴ抑制解除プロモーターのＤ
ＮＡ、Ｄａｓ１－Ｄａｓ２メタノール誘導性二方向性プロモーターのＤＮＡ、ｐＨＴＸ１
構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ、ｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモ
ーターのＤＮＡ及びそれらの組み合わせからなる群から選択することができる。本実施形
態における選択マーカーは、抗生物質耐性用のＤＮＡ及び栄養要求性マーカー用のＤＮＡ
からなる群から選択してもよく、例えば、抗生物質耐性は、ハイグロマイシン、ゼオシン
、ジェネテシン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される抗生物質に対しての耐
性である。
ーのＤＮＡ、ｐＤＦ抑制解除プロモーターのＤＮＡ、ｐＣＡＴ抑制解除プロモーターのＤ
ＮＡ、Ｄａｓ１－Ｄａｓ２メタノール誘導性二方向性プロモーターのＤＮＡ、ｐＨＴＸ１
構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ、ｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモ
ーターのＤＮＡ及びそれらの組み合わせからなる群から選択することができる。本実施形
態における選択マーカーは、抗生物質耐性用のＤＮＡ及び栄養要求性マーカー用のＤＮＡ
からなる群から選択してもよく、例えば、抗生物質耐性は、ハイグロマイシン、ゼオシン
、ジェネテシン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される抗生物質に対しての耐
性である。
【0112】
上記の実施形態に記載する酵母株に、電気穿孔法、化学的形質転換、及び接合からなる
群から選択される方法によって酵母に挿入したベクターを保有させてもよい。
群から選択される方法によって酵母に挿入したベクターを保有させてもよい。
【0113】
本発明の別の実施形態は、非水酸化コラーゲンの製造方法に関し、本方法は、（ｉ）上
記の実施形態に記載する酵母株を提供し；（ｉｉ）その株を、コラーゲンを産生するのに
十分な時間、培地中で増殖させることを含む。本方法では、酵母を、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋ
ｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択してもよく、
及び／または培地を、緩衝グリセロール複合培地（ＢＭＧＹ）、緩衝メタノール複合培地
（ＢＭＭＹ）、及び酵母抽出ペプトンデキストロース（ＹＰＤ）からなる群から選択して
もよい。酵母株を、２４、４８、もしくは７２の範囲または任意の中間時間の期間、培養
または育成してもよい。本方法では、酵母株は、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコ
ダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン及びそれ
らの組み合わせからなる群から選択されるコラーゲンのＤＮＡ配列を発現し得る。本方法
では、酵母株におけるプロモーターのＤＮＡ配列は、ｐＨＴＸ１構成的二方向性プロモー
ターのＤＮＡ及びｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからな
る群から選択してもよく；及び／または選択マーカーは、抗生物質耐性ＤＮＡ用のＤＮＡ
及び栄養要求性マーカー用のＤＮＡからなる群から選択してもよい。
記の実施形態に記載する酵母株を提供し；（ｉｉ）その株を、コラーゲンを産生するのに
十分な時間、培地中で増殖させることを含む。本方法では、酵母を、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋ
ｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択してもよく、
及び／または培地を、緩衝グリセロール複合培地（ＢＭＧＹ）、緩衝メタノール複合培地
（ＢＭＭＹ）、及び酵母抽出ペプトンデキストロース（ＹＰＤ）からなる群から選択して
もよい。酵母株を、２４、４８、もしくは７２の範囲または任意の中間時間の期間、培養
または育成してもよい。本方法では、酵母株は、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコ
ダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン及びそれ
らの組み合わせからなる群から選択されるコラーゲンのＤＮＡ配列を発現し得る。本方法
では、酵母株におけるプロモーターのＤＮＡ配列は、ｐＨＴＸ１構成的二方向性プロモー
ターのＤＮＡ及びｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからな
る群から選択してもよく；及び／または選択マーカーは、抗生物質耐性ＤＮＡ用のＤＮＡ
及び栄養要求性マーカー用のＤＮＡからなる群から選択してもよい。
【0114】
本発明の別の実施形態は、水酸化コラーゲンを産生する遺伝子改変酵母株であって、（
ｉ）酵母株及び（ｉｉ）コラーゲンのＤＮＡ配列；コラーゲンプロモーターのＤＮＡ配列
；ターミネーターのＤＮＡ配列；選択マーカーのＤＮＡ配列、選択マーカーのプロモータ
ーのＤＮＡ配列；選択マーカーのターミネーターのＤＮＡ配列；細菌及び／または酵母の
複製起点のＤＮＡ配列；酵母ゲノムと相同性を有するＤＮＡ配列を有するベクターであっ
て；ベクターは酵母株に挿入されている、前記ベクター；ならびに（ｉｉｉ）Ｐ４ＨＡ１
のＤＮＡ配列；Ｐ４ＨＢのＤＮＡ配列；及びプロモーターの少なくとも１つのＤＮＡ配列
を有する第二のベクターを有し、ベクターは酵母株に挿入されている、前記第二のベクタ
ーを含む、前記遺伝子改変酵母株である。本実施形態では、酵母株を、Ｃａｎｄｉｄａ、
Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択してもよく
；及び／または酵母株は、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン
、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン及びそれらの組み合わせからな
る群から選択されるコラーゲンのＤＮＡ配列を発現し得る。本方法のいくつかの実施形態
では、コラーゲンのＤＮＡ配列は、天然のコラーゲンＤＮＡ、改変（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅ
ｄ）コラーゲンＤＮＡ及び改変（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）コラーゲンＤＮＡから選択され；及
び／またはプロモーターのＤＮＡ配列は、ＡＯＸ１メタノール誘導性プロモーターのＤＮ
Ａ、ｐＤＦ抑制解除プロモーターのＤＮＡ、ｐＣＡＴ抑制解除プロモーターのＤＮＡ、Ｄ
ａｓ１－Ｄａｓ２メタノール誘導性二方向性プロモーターのＤＮＡ、ｐＨＴＸ１構成的二
方向性プロモーターのＤＮＡ、ｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターの
ＤＮＡ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。酵母株において、プロモー
ターのＤＮＡ配列は、ｐＨＴＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及びｐＧＣＷ１４
－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択することができ；
及び／または選択マーカーのＤＮＡ配列は、抗生物質耐性ＤＮＡ用のＤＮＡ及び栄養要求
性マーカー用のＤＮＡからなる群から選択することができる。抗生物質耐性遺伝子または
ＤＮＡのいくつかの例として、ハイグロマイシン、ゼオシン、ジェネテシン及びそれらの
組み合わせからなる群から選択される抗生物質に対する耐性が挙げられるが、他の公知の
抗生物質耐性遺伝子もまた使用してよい。ベクターを、電気穿孔法、化学的形質転換、及
び接合からなる群から選択される方法によって酵母株に挿入してもよい。
ｉ）酵母株及び（ｉｉ）コラーゲンのＤＮＡ配列；コラーゲンプロモーターのＤＮＡ配列
；ターミネーターのＤＮＡ配列；選択マーカーのＤＮＡ配列、選択マーカーのプロモータ
ーのＤＮＡ配列；選択マーカーのターミネーターのＤＮＡ配列；細菌及び／または酵母の
複製起点のＤＮＡ配列；酵母ゲノムと相同性を有するＤＮＡ配列を有するベクターであっ
て；ベクターは酵母株に挿入されている、前記ベクター；ならびに（ｉｉｉ）Ｐ４ＨＡ１
のＤＮＡ配列；Ｐ４ＨＢのＤＮＡ配列；及びプロモーターの少なくとも１つのＤＮＡ配列
を有する第二のベクターを有し、ベクターは酵母株に挿入されている、前記第二のベクタ
ーを含む、前記遺伝子改変酵母株である。本実施形態では、酵母株を、Ｃａｎｄｉｄａ、
Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択してもよく
；及び／または酵母株は、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン
、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン及びそれらの組み合わせからな
る群から選択されるコラーゲンのＤＮＡ配列を発現し得る。本方法のいくつかの実施形態
では、コラーゲンのＤＮＡ配列は、天然のコラーゲンＤＮＡ、改変（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅ
ｄ）コラーゲンＤＮＡ及び改変（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）コラーゲンＤＮＡから選択され；及
び／またはプロモーターのＤＮＡ配列は、ＡＯＸ１メタノール誘導性プロモーターのＤＮ
Ａ、ｐＤＦ抑制解除プロモーターのＤＮＡ、ｐＣＡＴ抑制解除プロモーターのＤＮＡ、Ｄ
ａｓ１－Ｄａｓ２メタノール誘導性二方向性プロモーターのＤＮＡ、ｐＨＴＸ１構成的二
方向性プロモーターのＤＮＡ、ｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターの
ＤＮＡ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。酵母株において、プロモー
ターのＤＮＡ配列は、ｐＨＴＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及びｐＧＣＷ１４
－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択することができ；
及び／または選択マーカーのＤＮＡ配列は、抗生物質耐性ＤＮＡ用のＤＮＡ及び栄養要求
性マーカー用のＤＮＡからなる群から選択することができる。抗生物質耐性遺伝子または
ＤＮＡのいくつかの例として、ハイグロマイシン、ゼオシン、ジェネテシン及びそれらの
組み合わせからなる群から選択される抗生物質に対する耐性が挙げられるが、他の公知の
抗生物質耐性遺伝子もまた使用してよい。ベクターを、電気穿孔法、化学的形質転換、及
び接合からなる群から選択される方法によって酵母株に挿入してもよい。
【0115】
本発明の別の実施形態は、（ｉ）本明細書に記載する酵母株を提供し、（ｉｉ）その株
を、コラーゲンを産生するのに十分な期間、培地中で増殖させることを含む、水酸化コラ
ーゲンの製造方法である。酵母株は、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｐｉ
ｃｈｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択することができ；酵母株で発
現するコラーゲンＤＮＡは、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリ
ン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲンまたはそれらの組み合わせを
コードするＤＮＡからなる群から選択してもよく；及び／または培地は、ＢＭＧＹ、ＢＭ
ＭＹ、及びＹＰＤからなる群から選択される。酵母株は、約２４、４８または７２時間の
範囲の期間、培養または育成してもよい。いくつかの実施形態では、プロモーターのＤＮ
Ａは、ｐＴＨＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及びｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構
成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択され；及び／または選択マーカー
用のＤＮＡは、抗生物質耐性ＤＮＡ用のＤＮＡ及び栄養要求性マーカー用のＤＮＡからな
る群から選択される。
を、コラーゲンを産生するのに十分な期間、培地中で増殖させることを含む、水酸化コラ
ーゲンの製造方法である。酵母株は、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｐｉ
ｃｈｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択することができ；酵母株で発
現するコラーゲンＤＮＡは、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリ
ン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲンまたはそれらの組み合わせを
コードするＤＮＡからなる群から選択してもよく；及び／または培地は、ＢＭＧＹ、ＢＭ
ＭＹ、及びＹＰＤからなる群から選択される。酵母株は、約２４、４８または７２時間の
範囲の期間、培養または育成してもよい。いくつかの実施形態では、プロモーターのＤＮ
Ａは、ｐＴＨＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及びｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構
成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択され；及び／または選択マーカー
用のＤＮＡは、抗生物質耐性ＤＮＡ用のＤＮＡ及び栄養要求性マーカー用のＤＮＡからな
る群から選択される。
【0116】
本発明の別の実施形態は、（ｉ）発現した場合にコラーゲンを産生するＤＮＡ、プロモ
ーター、及びターミネーター；（ｉｉ）プロモーター及びターミネーターを含む、Ｐ４Ｈ
Ａ１及びＰ４ＨＢからなる群から選択される１つ以上の水酸化酵素の少なくとも１つのＤ
ＮＡ；（ｉｉｉ）プロモーター及びターミネーターを含む、選択マーカー用の少なくとも
１つのＤＮＡ；（ｉｖ）酵母及び細菌用の複製起点の少なくとも１つのＤＮＡ；（ｖ）ゲ
ノムへの組込みのために酵母ゲノムと相同性を有する１つ以上のＤＮＡ；ならびに（ｉｖ
）上記のＤＮＡ内の５’、３’、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される位置
にモジュラー式のクローニングを可能にする１つ以上の制限酵素部位を含む、オールイン
ワンベクターに関する。いくつかの実施形態では、オールインワンベクターは、発現した
場合に、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ
、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択さ
れるコラーゲンを産生する１つ以上のＤＮＡ配列を有する。
ーター、及びターミネーター；（ｉｉ）プロモーター及びターミネーターを含む、Ｐ４Ｈ
Ａ１及びＰ４ＨＢからなる群から選択される１つ以上の水酸化酵素の少なくとも１つのＤ
ＮＡ；（ｉｉｉ）プロモーター及びターミネーターを含む、選択マーカー用の少なくとも
１つのＤＮＡ；（ｉｖ）酵母及び細菌用の複製起点の少なくとも１つのＤＮＡ；（ｖ）ゲ
ノムへの組込みのために酵母ゲノムと相同性を有する１つ以上のＤＮＡ；ならびに（ｉｖ
）上記のＤＮＡ内の５’、３’、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される位置
にモジュラー式のクローニングを可能にする１つ以上の制限酵素部位を含む、オールイン
ワンベクターに関する。いくつかの実施形態では、オールインワンベクターは、発現した
場合に、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ
、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択さ
れるコラーゲンを産生する１つ以上のＤＮＡ配列を有する。
【0117】
オールインワンベクターは、ｐＴＨＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及びｐＧ
ＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択されるプ
ロモーターを有してもよく；抗生物質耐性及び／または栄養要求性マーカーなどの選択マ
ーカーの１つ以上のＤＮＡ配列を含み得る。抗生物質耐性マーカーとして、ハイグロマイ
シン、ゼオシン、ジェネテシン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される抗生物
質に対する耐性が挙げられる。
ＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択されるプ
ロモーターを有してもよく；抗生物質耐性及び／または栄養要求性マーカーなどの選択マ
ーカーの１つ以上のＤＮＡ配列を含み得る。抗生物質耐性マーカーとして、ハイグロマイ
シン、ゼオシン、ジェネテシン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される抗生物
質に対する耐性が挙げられる。
【0118】
本発明の別の実施形態は、キメラコラーゲンＤＮＡの全長に基づいて１０、２０、３０
～４０％または６０、７０、８０～９０％の最適化されたＤＮＡを含むキメラコラーゲン
ＤＮＡ配列に関する。本キメラコラーゲンＤＮＡ配列では、最適化されたＤＮＡをＣ末端
から始めることができ、または最適化されたＤＮＡをＮ末端から始めることができる。
～４０％または６０、７０、８０～９０％の最適化されたＤＮＡを含むキメラコラーゲン
ＤＮＡ配列に関する。本キメラコラーゲンＤＮＡ配列では、最適化されたＤＮＡをＣ末端
から始めることができ、または最適化されたＤＮＡをＮ末端から始めることができる。
【0119】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載するキメラコラーゲンのＤＮＡ配列；コラー
ゲンプロモーターのＤＮＡ配列；ターミネーターのＤＮＡ配列；選択マーカーのＤＮＡ配
列；選択マーカーのプロモーターのＤＮＡ配列；選択マーカーのターミネーターのＤＮＡ
配列；細菌及び／または酵母用の複製起点のＤＮＡ配列；及び酵母ゲノムとの相同性を有
するＤＮＡ配列を有するベクターを保有するコラーゲン産生酵母株に関する。本実施形態
において、酵母株は、ｐＴＨＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及びｐＧＣＷ１４
－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択されるプロモータ
ーのＤＮＡを含み得る。酵母株は、少なくとも１つの抗生物質耐性をコードするＤＮＡ及
び少なくとも１つの栄養要求性マーカーをコードするＤＮＡからなる群から選択される選
択マーカーを含み得る。
ゲンプロモーターのＤＮＡ配列；ターミネーターのＤＮＡ配列；選択マーカーのＤＮＡ配
列；選択マーカーのプロモーターのＤＮＡ配列；選択マーカーのターミネーターのＤＮＡ
配列；細菌及び／または酵母用の複製起点のＤＮＡ配列；及び酵母ゲノムとの相同性を有
するＤＮＡ配列を有するベクターを保有するコラーゲン産生酵母株に関する。本実施形態
において、酵母株は、ｐＴＨＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及びｐＧＣＷ１４
－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択されるプロモータ
ーのＤＮＡを含み得る。酵母株は、少なくとも１つの抗生物質耐性をコードするＤＮＡ及
び少なくとも１つの栄養要求性マーカーをコードするＤＮＡからなる群から選択される選
択マーカーを含み得る。
【0120】
本発明の別の実施形態は、（ｉ）本明細書に記載する酵母株を提供し；（ｉｉ）その株
を、コラーゲンを産生するのに十分な時間、培地中で増殖させることを含む、水酸化コラ
ーゲンの製造方法に関する。本実施形態では、酵母株を、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａ
ｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択することができ；培地は
、緩衝グリセロール複合培地、緩衝メタノール複合培地、及び酵母抽出ペプトンデキスト
ロースからなる群から選択してもよく；培養または育成時間は、２４、４８または７２時
間の範囲であり得る。本方法のいくつかの実施形態では、酵母株は、ｐＴＨＸ１構成的二
方向性プロモーターのＤＮＡ及びｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーター
のＤＮＡからなる群から選択されるプロモーターを含む。本方法の他の実施形態では、酵
母株は、抗生物質耐性をコードするＤＮＡ及び栄養要求性マーカーをコードするＤＮＡか
らなる群から選択される少なくとも１つの選択マーカーを含む。
を、コラーゲンを産生するのに十分な時間、培地中で増殖させることを含む、水酸化コラ
ーゲンの製造方法に関する。本実施形態では、酵母株を、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａ
ｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択することができ；培地は
、緩衝グリセロール複合培地、緩衝メタノール複合培地、及び酵母抽出ペプトンデキスト
ロースからなる群から選択してもよく；培養または育成時間は、２４、４８または７２時
間の範囲であり得る。本方法のいくつかの実施形態では、酵母株は、ｐＴＨＸ１構成的二
方向性プロモーターのＤＮＡ及びｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーター
のＤＮＡからなる群から選択されるプロモーターを含む。本方法の他の実施形態では、酵
母株は、抗生物質耐性をコードするＤＮＡ及び栄養要求性マーカーをコードするＤＮＡか
らなる群から選択される少なくとも１つの選択マーカーを含む。
【実施例0121】
以下の非限定的な実施例は、本発明の例示である。本発明の範囲は、これらの実施例に
記載する詳細に限定されない。
記載する詳細に限定されない。
【0122】
実施例１
Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＢＧ１０（野生型）はＡＴＵＭ（以前のＤＮＡ２．
０）から入手した。コラーゲン配列を含むＭＭＶ６３（配列番号１１）（「配列番号９」
）ＤＮＡ配列及びベクターを野生型Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓに挿入し、ＰＰ２８
株を生成した。ＭＭＶ６３をＰｍｅＩで消化し、ＰＰ１（野生型Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔ
ｏｒｉｓ株）に形質転換してＰＰ２８を生成した。ベクターＭＭＶ６３を図１に示す。
Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＢＧ１０（野生型）はＡＴＵＭ（以前のＤＮＡ２．
０）から入手した。コラーゲン配列を含むＭＭＶ６３（配列番号１１）（「配列番号９」
）ＤＮＡ配列及びベクターを野生型Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓに挿入し、ＰＰ２８
株を生成した。ＭＭＶ６３をＰｍｅＩで消化し、ＰＰ１（野生型Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔ
ｏｒｉｓ株）に形質転換してＰＰ２８を生成した。ベクターＭＭＶ６３を図１に示す。
【0123】
天然型ＩＩＩウシコラーゲンをコードするＤＮＡを配列決定し（配列番号１）、配列を
、ポリメラーゼ連鎖反応「ＰＣＲ」プロトコールにより増幅して直鎖状ＤＮＡ配列を作製
した。
、ポリメラーゼ連鎖反応「ＰＣＲ」プロトコールにより増幅して直鎖状ＤＮＡ配列を作製
した。
【0124】
Ｐｉｃｈｉａ電気穿孔法プロトコール（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘ
ｃｅｌｌ（商標）Ｔｏｔａｌ Ｓｙｓｔｅｍ＃１６５２６６０）を用いてＤＮＡ２．０由
来の野生型Ｐｉｃｈｉａ酵母細胞（ＰＰ１）にＤＮＡを形質転換した。酵母細胞をＰ４Ｈ
Ａ／Ｂ同時発現プラスミドで形質転換し、形質転換体（例えば、クローン＃４）をＨｙｇ
ｒｏプレート（２００ｕｇ／ｍｌ）上で選択した。
ｃｅｌｌ（商標）Ｔｏｔａｌ Ｓｙｓｔｅｍ＃１６５２６６０）を用いてＤＮＡ２．０由
来の野生型Ｐｉｃｈｉａ酵母細胞（ＰＰ１）にＤＮＡを形質転換した。酵母細胞をＰ４Ｈ
Ａ／Ｂ同時発現プラスミドで形質転換し、形質転換体（例えば、クローン＃４）をＨｙｇ
ｒｏプレート（２００ｕｇ／ｍｌ）上で選択した。
【0125】
クローン＃４の単一コロニーを１００ｍｌのＹＰＤ培地に播種し、２１５ｒｐｍで振盪
しながら３０℃で一晩増殖させた。翌日、培養物のＯＤ６００が約３．５（約３～５×１
０７細胞／ＯＤ６００）に達した時点で、新鮮なＹＰＤでＯＤ６００が約１．７になるよ
うに希釈し、２１５ｒｐｍで振盪しながら３０℃でさらに１時間増殖させた。
しながら３０℃で一晩増殖させた。翌日、培養物のＯＤ６００が約３．５（約３～５×１
０７細胞／ＯＤ６００）に達した時点で、新鮮なＹＰＤでＯＤ６００が約１．７になるよ
うに希釈し、２１５ｒｐｍで振盪しながら３０℃でさらに１時間増殖させた。
【0126】
次いで、細胞を３，５００ｇで５分間遠心分離し；水で１回洗浄し、１０ｍｌの、１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＬｉＡｃ、１０ｍＭ ＤＴＴ（新
鮮なものを添加）、及び０．６Ｍソルビトール中に再懸濁した。
ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＬｉＡｃ、１０ｍＭ ＤＴＴ（新
鮮なものを添加）、及び０．６Ｍソルビトール中に再懸濁した。
【0127】
各形質転換について、８×１０８個の細胞のアリコートを、８ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＬｉＡｃ、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．６Ｍソルビ
トールに入れ、室温で３０分間インキュベートした。
ｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＬｉＡｃ、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．６Ｍソルビ
トールに入れ、室温で３０分間インキュベートした。
【0128】
細胞を５０００ｇで５分間スピンダウンし、１．５ｍｌの氷冷した１Ｍソルビトールで
３回洗浄し、８０ｕｌの氷冷した１Ｍソルビトール中に再懸濁した。
３回洗浄し、８０ｕｌの氷冷した１Ｍソルビトール中に再懸濁した。
【0129】
様々な量（約５ｕｇ）の直鎖状化ＤＮＡを細胞に添加し、ピペッティングにより混合し
た。
た。
【0130】
細胞及びＤＮＡ混合物（８０～１００ｕｌ）を０．２ｃｍキュベットに加え、Ｐｉｃｈ
ｉａのプロトコールに従って１５００ｖ、２５ｕＦ、及び２００Ωでパルスした。
ｉａのプロトコールに従って１５００ｖ、２５ｕＦ、及び２００Ωでパルスした。
【0131】
次いで、それらを直ちにＹＰＤ及び１Ｍソルビトール（１：１）の１ｍｌ混合物に移し
、３０℃で＞２時間インキュベートした。
、３０℃で＞２時間インキュベートした。
【0132】
細胞を異なる密度でプレーティングした。
【0133】
単一のコロニーを２４ディープウェルプレート中の２ｍＬのＢＭＧＹ培地に播種し、９
００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で少なくとも４８時間増殖させた。得られた細胞を、以
下の手順に従って、細胞溶解、ＳＤＳ－ｐａｇｅ及びペプシンアッセイを用いてコラーゲ
ンについて試験した。
００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で少なくとも４８時間増殖させた。得られた細胞を、以
下の手順に従って、細胞溶解、ＳＤＳ－ｐａｇｅ及びペプシンアッセイを用いてコラーゲ
ンについて試験した。
【0134】
酵母細胞を、Ｑｉａｇｅｎ ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒを用いて３０Ｈｚの速度で連続的
に１分間、１×溶解緩衝液中で溶解した。溶解緩衝液は、２．５ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ
（終濃度５０ｍＭ）；４３８．３ｍｇのＮａＣｌ；終濃度１５０ｍＭ；５ｍｌのグリセロ
ール；終濃度１０％；０．５ｍｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００；終濃度１％；及び４２ｍ
ｌのＭｉｌｌｉｐｕｒｅ水から作製した。
に１分間、１×溶解緩衝液中で溶解した。溶解緩衝液は、２．５ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ
（終濃度５０ｍＭ）；４３８．３ｍｇのＮａＣｌ；終濃度１５０ｍＭ；５ｍｌのグリセロ
ール；終濃度１０％；０．５ｍｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００；終濃度１％；及び４２ｍ
ｌのＭｉｌｌｉｐｕｒｅ水から作製した。
【0135】
溶解した細胞を、卓上遠心分離機で、２，５００ｒｐｍ、１５分間、遠心分離した。上
清を残し、ペレットを捨てた。
清を残し、ペレットを捨てた。
【0136】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ。上清、分子量マーカー、陰性対照及び陽性対照に対し、２－メルカ
プトエタノール存在下でＳＤＳ－ＰＡＧＥを実施した。電気泳動後、ゲルを除去し、クー
マシーブルーで染色し、次いで水中で脱染した。
プトエタノール存在下でＳＤＳ－ＰＡＧＥを実施した。電気泳動後、ゲルを除去し、クー
マシーブルーで染色し、次いで水中で脱染した。
【0137】
ペプシンアッセイ。ペプシンアッセイを以下の手順で実施した：
ペプシン処理の前に、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃのプロトコールに従って各
試料の全タンパク質を得るためのＢＣＡアッセイを実施した。すべての試料について、全
タンパク質量を、０．５ｍｇ／ｍｌまたはそれを上回る最低濃度に正規化した。
１００ｕＬの試料の溶解物をマイクロ遠心チューブに入れた。以下を含有するマスター
ミックスを作製した：３７％ＨＣ１（１００μＬ当たり０．６μＬの酸）、及び
脱イオン水中の１ｍｇ／ｍＬのペプシンストック。添加したペプシンの量は、ペプシン
：全タンパク質の比で１：２５（重量：重量）であった。
ペプシン処理の前に、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃのプロトコールに従って各
試料の全タンパク質を得るためのＢＣＡアッセイを実施した。すべての試料について、全
タンパク質量を、０．５ｍｇ／ｍｌまたはそれを上回る最低濃度に正規化した。
１００ｕＬの試料の溶解物をマイクロ遠心チューブに入れた。以下を含有するマスター
ミックスを作製した：３７％ＨＣ１（１００μＬ当たり０．６μＬの酸）、及び
脱イオン水中の１ｍｇ／ｍＬのペプシンストック。添加したペプシンの量は、ペプシン
：全タンパク質の比で１：２５（重量：重量）であった。
【0138】
ペプシンを添加した後、試料をピペットで３回混合し、ペプシン反応を生じさせるため
に室温で１時間インキュベートした。１時間後、β－メルカプトエタノールを含有するＬ
ＤＳローディングバッファーを１：１容量で各試料に添加し、７０℃で７分間インキュベ
ートした。インキュベーション後、試料を１４，０００ｒｐｍで１分間遠心し、濁りを除
去した。
に室温で１時間インキュベートした。１時間後、β－メルカプトエタノールを含有するＬ
ＤＳローディングバッファーを１：１容量で各試料に添加し、７０℃で７分間インキュベ
ートした。インキュベーション後、試料を１４，０００ｒｐｍで１分間遠心し、濁りを除
去した。
【0139】
次に、試料の上部から１８ｕＬを、ＴＡＥ緩衝液を用いて３～８％ＴＡＥに添加し、１
５０Ｖで１時間１０分の間、ゲル上に流した。下記の表１はその結果を報告する。
５０Ｖで１時間１０分の間、ゲル上に流した。下記の表１はその結果を報告する。
【0140】
実施例２
以下の変更を加えたうえで、実施例１を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した
：Ｐｉｃｈｉａにおける発現を高めるように改変したウシコラーゲン配列（配列番号３）
（「配列２」）を含むＤＮＡ ＭＭＶ７７（配列番号１２）（「配列１０」）配列を酵母
に挿入した。ｐＡＯＸ１プロモーター（配列番号５）（「配列３」）を用いて、コラーゲ
ン配列を発現させた。５００ｕｇ／ｍｌのゼオシンを含有するＹＰＤプレートを用いて、
成功した形質転換体を選択した。得られた株はＰＰ８であった。ベクターＭＭＶ７７を図
２に示す。制限酵素消化は、ＰｍｅＩを用いて行った。株をＢＭＭＹ培地で増殖させ、コ
ラーゲンについて試験した。結果を以下の表１に示す。
以下の変更を加えたうえで、実施例１を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した
：Ｐｉｃｈｉａにおける発現を高めるように改変したウシコラーゲン配列（配列番号３）
（「配列２」）を含むＤＮＡ ＭＭＶ７７（配列番号１２）（「配列１０」）配列を酵母
に挿入した。ｐＡＯＸ１プロモーター（配列番号５）（「配列３」）を用いて、コラーゲ
ン配列を発現させた。５００ｕｇ／ｍｌのゼオシンを含有するＹＰＤプレートを用いて、
成功した形質転換体を選択した。得られた株はＰＰ８であった。ベクターＭＭＶ７７を図
２に示す。制限酵素消化は、ＰｍｅＩを用いて行った。株をＢＭＭＹ培地で増殖させ、コ
ラーゲンについて試験した。結果を以下の表１に示す。
【0141】
実施例３
以下の変更を加えたうえで、実施例１を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した
：Ｐｉｃｈｉａでの発現を高めるように改変したウシコラーゲン配列を含むＤＮＡ ＭＭ
Ｖ－１２９（配列番号１３）（「配列１１」）配列を、酵母に挿入した。ｐＣＡＴプロモ
ーター（配列番号９）（「配列７」）を使用してコラーゲン配列を発現させた。５００ｕ
ｇ／ｍｌのゼオシンを含有するＹＰＤプレートを用いて、成功した形質転換体を選択した
。得られた株はＰＰ１２３であった。ＭＭＶ１２９をＳｗａＩで消化し、ＰＰ１に形質転
換してＰＰ１２３を生成した。ベクターＭＭＶ１２９を図３に示す。株をＢＭＧＹ培地で
増殖させ、コラーゲンについて試験した。結果を以下の表１に示す。
以下の変更を加えたうえで、実施例１を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した
：Ｐｉｃｈｉａでの発現を高めるように改変したウシコラーゲン配列を含むＤＮＡ ＭＭ
Ｖ－１２９（配列番号１３）（「配列１１」）配列を、酵母に挿入した。ｐＣＡＴプロモ
ーター（配列番号９）（「配列７」）を使用してコラーゲン配列を発現させた。５００ｕ
ｇ／ｍｌのゼオシンを含有するＹＰＤプレートを用いて、成功した形質転換体を選択した
。得られた株はＰＰ１２３であった。ＭＭＶ１２９をＳｗａＩで消化し、ＰＰ１に形質転
換してＰＰ１２３を生成した。ベクターＭＭＶ１２９を図３に示す。株をＢＭＧＹ培地で
増殖させ、コラーゲンについて試験した。結果を以下の表１に示す。
【0142】
実施例４
以下の変更を加えたうえで、実施例１を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した
：
Ｐｉｃｈｉａでの発現を高めるように改変したウシＣｏｌ３Ａ１（ＩＩＩ型）コラーゲ
ン配列（配列番号３）（「配列２」）を含む、ＤＮＡ ＭＭＶ－１３０（配列番号１４）
（「配列１２」）配列を酵母に挿入した。配列番号８（「配列６」）に示すｐＤＦプロモ
ーターを使用してコラーゲン配列を発現させた。ＰｍｅＩによって切断されるＡＯＸ１ラ
ンディングパッド（配列番号１０）（「配列８」）を使用してＰｉｃｈｉａゲノムへのベ
クターの部位特異的組込みを促進した。５００ｕｇ／ｍｌのゼオシンを含有するＹＰＤプ
レートを用いて、成功した形質転換体を選択した。得られた株をＰＰ１５３と命名した。
ＭＭＶ１３０をＰｍｅＩで消化し、ＰＰ１に形質転換してＰＰ１５３を生成した。改変ウ
シｃｏｌ３Ａ１配列は、配列番号３（「配列２」）によって与えられる。
以下の変更を加えたうえで、実施例１を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した
：
Ｐｉｃｈｉａでの発現を高めるように改変したウシＣｏｌ３Ａ１（ＩＩＩ型）コラーゲ
ン配列（配列番号３）（「配列２」）を含む、ＤＮＡ ＭＭＶ－１３０（配列番号１４）
（「配列１２」）配列を酵母に挿入した。配列番号８（「配列６」）に示すｐＤＦプロモ
ーターを使用してコラーゲン配列を発現させた。ＰｍｅＩによって切断されるＡＯＸ１ラ
ンディングパッド（配列番号１０）（「配列８」）を使用してＰｉｃｈｉａゲノムへのベ
クターの部位特異的組込みを促進した。５００ｕｇ／ｍｌのゼオシンを含有するＹＰＤプ
レートを用いて、成功した形質転換体を選択した。得られた株をＰＰ１５３と命名した。
ＭＭＶ１３０をＰｍｅＩで消化し、ＰＰ１に形質転換してＰＰ１５３を生成した。改変ウ
シｃｏｌ３Ａ１配列は、配列番号３（「配列２」）によって与えられる。
【0143】
フェノール抽出の代わりにＰｕｒｅＬｉｎｋ ＰＣＲ精製キットを用いて、直鎖状化し
たＤＮＡを回収した。株をＢＭＧＹ培地で増殖させ、コラーゲンについて試験した。結果
を以下の表１に示す。
たＤＮＡを回収した。株をＢＭＧＹ培地で増殖させ、コラーゲンについて試験した。結果
を以下の表１に示す。
【0144】
実施例５
以下の変更を加えたうえで、実施例２を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した
：最適化したウシＰ４ＨＡ（配列番号６）（「配列４」）及びウシＰ４ＨＢ（配列番号７
）（「配列５」）配列を有する１つのＤＮＡベクターＭＭＶ－７８（配列番号１５）（「
配列１３」）を酵母に挿入した。ＭＭＶ７８をＰｍｅＩで消化し、ＰＰ１に形質転換して
ＰＰ８を生成した。Ｐ４ＨＡ及びＰ４ＨＢはいずれも、その内在性シグナルペプチドを含
み、Ｄａｓ１－Ｄａｓ２二方向性プロモーター（配列番号２７）（「配列２４」）によっ
て駆動される。ＤＮＡをＫｐｎＩで消化し、ＰＰ８に形質転換してＰＰ３を生成した。ベ
クターＭＭＶ７８を図５に示す。株をＢＭＭＹ培地で増殖させ、コラーゲン及び水酸化に
ついて試験した。結果を以下の表１に示す。
以下の変更を加えたうえで、実施例２を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した
：最適化したウシＰ４ＨＡ（配列番号６）（「配列４」）及びウシＰ４ＨＢ（配列番号７
）（「配列５」）配列を有する１つのＤＮＡベクターＭＭＶ－７８（配列番号１５）（「
配列１３」）を酵母に挿入した。ＭＭＶ７８をＰｍｅＩで消化し、ＰＰ１に形質転換して
ＰＰ８を生成した。Ｐ４ＨＡ及びＰ４ＨＢはいずれも、その内在性シグナルペプチドを含
み、Ｄａｓ１－Ｄａｓ２二方向性プロモーター（配列番号２７）（「配列２４」）によっ
て駆動される。ＤＮＡをＫｐｎＩで消化し、ＰＰ８に形質転換してＰＰ３を生成した。ベ
クターＭＭＶ７８を図５に示す。株をＢＭＭＹ培地で増殖させ、コラーゲン及び水酸化に
ついて試験した。結果を以下の表１に示す。
【0145】
実施例６
以下の変更を加えたうえで、実施例２を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した
：ウシＰ４ＨＡ配列及びウシＰ４ＨＢ配列の両方を有する１つのＤＮＡベクター、ＭＭＶ
－７８を酵母に挿入した。Ｐ４ＨＡ及びＰ４ＨＢはいずれも、それらの内在性シグナルペ
プチドを含み、Ｄａｓ１－Ｄａｓ２二方向性プロモーターによって駆動した。ＤＮＡをＫ
ｐｎＩで消化し、ＰＰ８に形質転換してＰＰ３を生成した。
以下の変更を加えたうえで、実施例２を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した
：ウシＰ４ＨＡ配列及びウシＰ４ＨＢ配列の両方を有する１つのＤＮＡベクター、ＭＭＶ
－７８を酵母に挿入した。Ｐ４ＨＡ及びＰ４ＨＢはいずれも、それらの内在性シグナルペ
プチドを含み、Ｄａｓ１－Ｄａｓ２二方向性プロモーターによって駆動した。ＤＮＡをＫ
ｐｎＩで消化し、ＰＰ８に形質転換してＰＰ３を生成した。
【0146】
ｐＡＯＸ１プロモーターにより駆動されるＰ４ＨＢを有する別のベクター、ＭＭＶ－９
４（配列番号１６）（「配列１４」）を使用し、また、これを酵母に挿入した。Ｐ４ＨＢ
の内在性シグナルペプチドを、ＰＨＯ１シグナルペプチドで置換した。得られた株はＰＰ
３８であった。ＭＭＶ９４をＡｖｒＩＩで消化し、ＰＰ３に形質転換してＰＰ３８を生成
した。ベクターＭＭＶ９４を図６に示す。株をＢＭＭＹ培地で増殖させ、コラーゲン及び
水酸化について試験した。結果を以下の表１に示す。
４（配列番号１６）（「配列１４」）を使用し、また、これを酵母に挿入した。Ｐ４ＨＢ
の内在性シグナルペプチドを、ＰＨＯ１シグナルペプチドで置換した。得られた株はＰＰ
３８であった。ＭＭＶ９４をＡｖｒＩＩで消化し、ＰＰ３に形質転換してＰＰ３８を生成
した。ベクターＭＭＶ９４を図６に示す。株をＢＭＭＹ培地で増殖させ、コラーゲン及び
水酸化について試験した。結果を以下の表１に示す。
【0147】
実施例７
以下の変更を加えたうえで、実施例４を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した
：ウシＰ４ＨＡ及びウシＰ４ＨＢ配列の両方を含む１つのＤＮＡベクター、ＭＭＶ－１５
６（配列番号１７）（「配列１５」）を酵母に挿入した。Ｐ４ＨＡは、その内在性シグナ
ルペプチドを含み、Ｐ４ＨＢシグナル配列はαファクタープレ（配列番号２３）（「配列
２１」）配列で置換した。両方の遺伝子をｐＨＴＸ１二方向性プロモーター（配列番号２
６）（「配列２５」）によって駆動した。ＭＭＶ１５６をＢａｍＨＩで消化し、ＰＰ１５
３に形質転換してＰＰ１５４を生成した。ベクターＭＭＶ１５６を図７に示す。株をＢＭ
ＧＹ培地で増殖させ、コラーゲン及び水酸化について試験した。結果を以下の表１に示す
。
以下の変更を加えたうえで、実施例４を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した
：ウシＰ４ＨＡ及びウシＰ４ＨＢ配列の両方を含む１つのＤＮＡベクター、ＭＭＶ－１５
６（配列番号１７）（「配列１５」）を酵母に挿入した。Ｐ４ＨＡは、その内在性シグナ
ルペプチドを含み、Ｐ４ＨＢシグナル配列はαファクタープレ（配列番号２３）（「配列
２１」）配列で置換した。両方の遺伝子をｐＨＴＸ１二方向性プロモーター（配列番号２
６）（「配列２５」）によって駆動した。ＭＭＶ１５６をＢａｍＨＩで消化し、ＰＰ１５
３に形質転換してＰＰ１５４を生成した。ベクターＭＭＶ１５６を図７に示す。株をＢＭ
ＧＹ培地で増殖させ、コラーゲン及び水酸化について試験した。結果を以下の表１に示す
。
【0148】
実施例８
以下の変更を加えたうえで、実施例４を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した
：ウシＰ４ＨＡ配列及びウシＰ４ＨＢ配列の両方を有する１つのＤＮＡベクターＭＭＶ－
１５６を酵母に挿入した。Ｐ４ＨＡはその内在性シグナルペプチドを含み、Ｐ４ＨＢシグ
ナル配列はαファクタープレ配列で置換した。両方の遺伝子を、ｐＨＴＸ１二方向プロモ
ーターによって駆動した。ＤＮＡをＳｗａＩで消化し、ＰＰ１５３に形質転換してＰＰ１
５４を生成した。
以下の変更を加えたうえで、実施例４を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した
：ウシＰ４ＨＡ配列及びウシＰ４ＨＢ配列の両方を有する１つのＤＮＡベクターＭＭＶ－
１５６を酵母に挿入した。Ｐ４ＨＡはその内在性シグナルペプチドを含み、Ｐ４ＨＢシグ
ナル配列はαファクタープレ配列で置換した。両方の遺伝子を、ｐＨＴＸ１二方向プロモ
ーターによって駆動した。ＤＮＡをＳｗａＩで消化し、ＰＰ１５３に形質転換してＰＰ１
５４を生成した。
【0149】
Ｐ４ＨＡ及びＰ４ＨＢの両方を含む別のベクター、ＭＭＶ－１９１（配列番号１８）（
「配列１６」）もまた、酵母に挿入した。余剰コピーのＰ４ＨＡは、その内在性シグナル
ペプチドを含み、余剰コピーのＰ４ＨＢのシグナル配列は、αファクタープレプロ（配列
番号２４）（「配列２２」）配列で置換した。余剰コピーのＰ４ＨＡ及びＰ４ＨＢは、ｐ
ＧＣＷ１４－ＧＡＰ１二方向性プロモーター（配列番号２５）（「配列２３」）によって
駆動した。ＭＭＶ１９１をＢａｍＨＩで消化し、ＰＰ１５４に形質転換してＰＰ２６８を
生成した。ベクターＭＭＶ１９１を図８に示す。株をＢＭＧＹ培地で増殖させ、コラーゲ
ン及び水酸化について試験した。結果を以下の表１に示す。
「配列１６」）もまた、酵母に挿入した。余剰コピーのＰ４ＨＡは、その内在性シグナル
ペプチドを含み、余剰コピーのＰ４ＨＢのシグナル配列は、αファクタープレプロ（配列
番号２４）（「配列２２」）配列で置換した。余剰コピーのＰ４ＨＡ及びＰ４ＨＢは、ｐ
ＧＣＷ１４－ＧＡＰ１二方向性プロモーター（配列番号２５）（「配列２３」）によって
駆動した。ＭＭＶ１９１をＢａｍＨＩで消化し、ＰＰ１５４に形質転換してＰＰ２６８を
生成した。ベクターＭＭＶ１９１を図８に示す。株をＢＭＧＹ培地で増殖させ、コラーゲ
ン及び水酸化について試験した。結果を以下の表１に示す。
【0150】
実施例９
実施例１の方法及び手順を利用してオールインワンベクターを作製した。オールインワ
ンベクターは、コラーゲンのＤＮＡならびに付随するプロモーター及びターミネーター、
コラーゲンを水酸化する酵素のＤＮＡならびに付随するプロモーター及びターミネーター
、マーカー発現用のＤＮＡならびに付随するプロモーター及びターミネーター、細菌及び
酵母の複製起点（複数可）のＤＮＡ、及び組み込むために酵母ゲノムに対して相同性を有
するＤＮＡ（複数可）を含む。オールインワンベクターは、５’、３’、または上記の構
成要素内に戦略的に配置された固有の制限酵素部位を有する。コラーゲン発現または他の
ベクター構成要素の改変を所望する場合、選択した構成要素のＤＮＡを、制限酵素で容易
に切除し、ユーザーが選択するクローニング方法を用いて置換することができる。オール
インワンベクターの最も単純なバージョン、ＭＭＶ２０８（配列番号１９）（「配列１７
」）は、ヒドロキシラーゼ酵素のプロモーター（複数可）を除いて、上記のすべての構成
要素を含む。ベクターＭＭＶ２０８は、以下の構成要素を用いて作製する：ＭＭＶ８４（
配列番号２０）（「配列１８」）由来のＡＯＸ相同性、ＭＭＶ１５０（配列番号２１）（
「配列１９」）由来のリボソーム相同性、ＭＭＶ１４０（配列番号２２）（「配列２０」
）由来の細菌及び酵母起源の複製起点、ＭＭＶ１４０由来のゼオシンマーカー、ならびに
ＭＭＶ１２９由来のＣｏｌ３Ａ１。Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔにより、以下の各制限酵素部位を
除去したＰ４ＨＡ及びＢならびに関連するターミネーターの改変バージョンを合成した：
ＡｖｒＩＩ、ＮｏｔＩ、ＰｖｕＩ、ＰｍｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩＩ、ＳｗａＩ、Ｘｂ
ａＩ、ＳｐｅＩ。ベクターをＰＰ１株に形質転換した。
実施例１の方法及び手順を利用してオールインワンベクターを作製した。オールインワ
ンベクターは、コラーゲンのＤＮＡならびに付随するプロモーター及びターミネーター、
コラーゲンを水酸化する酵素のＤＮＡならびに付随するプロモーター及びターミネーター
、マーカー発現用のＤＮＡならびに付随するプロモーター及びターミネーター、細菌及び
酵母の複製起点（複数可）のＤＮＡ、及び組み込むために酵母ゲノムに対して相同性を有
するＤＮＡ（複数可）を含む。オールインワンベクターは、５’、３’、または上記の構
成要素内に戦略的に配置された固有の制限酵素部位を有する。コラーゲン発現または他の
ベクター構成要素の改変を所望する場合、選択した構成要素のＤＮＡを、制限酵素で容易
に切除し、ユーザーが選択するクローニング方法を用いて置換することができる。オール
インワンベクターの最も単純なバージョン、ＭＭＶ２０８（配列番号１９）（「配列１７
」）は、ヒドロキシラーゼ酵素のプロモーター（複数可）を除いて、上記のすべての構成
要素を含む。ベクターＭＭＶ２０８は、以下の構成要素を用いて作製する：ＭＭＶ８４（
配列番号２０）（「配列１８」）由来のＡＯＸ相同性、ＭＭＶ１５０（配列番号２１）（
「配列１９」）由来のリボソーム相同性、ＭＭＶ１４０（配列番号２２）（「配列２０」
）由来の細菌及び酵母起源の複製起点、ＭＭＶ１４０由来のゼオシンマーカー、ならびに
ＭＭＶ１２９由来のＣｏｌ３Ａ１。Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔにより、以下の各制限酵素部位を
除去したＰ４ＨＡ及びＢならびに関連するターミネーターの改変バージョンを合成した：
ＡｖｒＩＩ、ＮｏｔＩ、ＰｖｕＩ、ＰｍｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩＩ、ＳｗａＩ、Ｘｂ
ａＩ、ＳｐｅＩ。ベクターをＰＰ１株に形質転換した。
【0151】
株をＢＭＧＹ培地で増殖させ、コラーゲン及び水酸化について試験した。結果を以下の
表１に示す。
表１に示す。
【0152】
表１は、ｇ／Ｌでのコラーゲン産生量及び水酸化コラーゲンの割合を記載する。コラー
ゲン発現量は、クーマシーブルー色素でゲルを染色し、その結果をコラーゲン含量につい
ての標準曲線と比較することによって定量化した。水酸化コラーゲンの量は、１：２５の
ペプシン処理後の試料バンドと標準バンドとを比較することによって決定した。水酸化コ
ラーゲンは、コラーゲンポリペプチドをさらに処理するのに必要な高濃度ペプシン中で安
定であるため、Ｐｉｃｈｉａによる水酸化コラーゲンの発現には利点がある。
表１
ゲン発現量は、クーマシーブルー色素でゲルを染色し、その結果をコラーゲン含量につい
ての標準曲線と比較することによって定量化した。水酸化コラーゲンの量は、１：２５の
ペプシン処理後の試料バンドと標準バンドとを比較することによって決定した。水酸化コ
ラーゲンは、コラーゲンポリペプチドをさらに処理するのに必要な高濃度ペプシン中で安
定であるため、Ｐｉｃｈｉａによる水酸化コラーゲンの発現には利点がある。
表１
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【0153】
実施例１及び２のデータは、ＩＩＩ型ウシコラーゲン配列のコドン改変により、Ｐｉｃ
ｈｉａで発現するコラーゲンの量が２倍になったことを示す。実施例２及び３のデータの
比較は、ｐＣＡＴプロモーターを用いてＩＩＩ型コラーゲンコード配列の転写を駆動する
ことによって、ＩＩＩ型ウシコラーゲンの発現がさらに５倍増加することを示す。実施例
２及び４のデータの比較は、ｐＤＦプロモーターを用いてＩＩＩ型コラーゲンコード配列
の転写を駆動し、ＡＯＸ１ランディングパッドを提供してＰｉｃｈｉａゲノムＤＮＡへの
ベクターの組み込みを促進することによって、ウシＩＩＩ型コラーゲンの発現が１０～１
５倍増加することを示す。実施例２ならびに５及び６のデータの比較は、プロリンヒドロ
キシラーゼ（Ｐ４ＨＡ＋Ｐ４ＨＢ）のコード配列をＰｉｃｈｉａに形質転換することによ
り、水酸化コラーゲンを産生し、プロリンヒドロキシラーゼの発現をさらに調節すること
によって、水酸化コラーゲンの量を高めることができることを示す。実施例７～９は、コ
ラーゲン発現を５～１５倍増強することができること、ならびに２つのベクターを導入す
ることによって、またはコラーゲン及びヒドロキシラーゼ配列の両方を同じベクターにコ
ードするオールインワンベクターアプローチによって、水酸化コラーゲンの量が増大する
ことを示す。
ｈｉａで発現するコラーゲンの量が２倍になったことを示す。実施例２及び３のデータの
比較は、ｐＣＡＴプロモーターを用いてＩＩＩ型コラーゲンコード配列の転写を駆動する
ことによって、ＩＩＩ型ウシコラーゲンの発現がさらに５倍増加することを示す。実施例
２及び４のデータの比較は、ｐＤＦプロモーターを用いてＩＩＩ型コラーゲンコード配列
の転写を駆動し、ＡＯＸ１ランディングパッドを提供してＰｉｃｈｉａゲノムＤＮＡへの
ベクターの組み込みを促進することによって、ウシＩＩＩ型コラーゲンの発現が１０～１
５倍増加することを示す。実施例２ならびに５及び６のデータの比較は、プロリンヒドロ
キシラーゼ（Ｐ４ＨＡ＋Ｐ４ＨＢ）のコード配列をＰｉｃｈｉａに形質転換することによ
り、水酸化コラーゲンを産生し、プロリンヒドロキシラーゼの発現をさらに調節すること
によって、水酸化コラーゲンの量を高めることができることを示す。実施例７～９は、コ
ラーゲン発現を５～１５倍増強することができること、ならびに２つのベクターを導入す
ることによって、またはコラーゲン及びヒドロキシラーゼ配列の両方を同じベクターにコ
ードするオールインワンベクターアプローチによって、水酸化コラーゲンの量が増大する
ことを示す。
【0154】
実施例１０
実施例１の方法及び手順を利用して、キメラＣｏｌ３Ａ１ベクターを作製した。ベクタ
ーＭＭＶ１３２を、キメラコラーゲンのＤＮＡならびに付随するプロモーターＰＤＦ及び
ターミネーターＡＯＸ１ＴＴ、マーカー発現用のＤＮＡならびに付随するプロモーター及
びターミネーター、細菌及び酵母の複製起点（複数可）のＤＮＡ、ならびに組み込むため
に酵母ゲノムに対して相同性を有するＤＮＡ（複数可）を含むように改変した。ベクター
ＭＭＶ６３は、未改変Ｃｏｌ３Ａ１ドメインの供給源のＤＮＡであった。ベクターＭＭＶ
１２８（図２１）は、改変Ｃｏｌ３Ａ１ドメインの供給源のＤＮＡであった。Ｃｏｌ３Ａ
１ポリペプチドの全長は１４６５アミノ酸（ａａ）である。プラスミドは、天然ウシＤＮ
Ａ配列（未修飾）及びＰｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓコドン改変ＤＮＡ配列を組み込む
ように設計した。Ｃｏｌ３Ａ１の改変配列と未改変配列との間の移行がａａ ７１０、１
，２００、及び１，３３１位になるようにプラスミドを設計した。これらの方法を使用し
て、プラスミドＭＭＶ１９３、ＭＭＶ１９４、ＭＭＶ１９５、ＭＭＶ１９７、ＭＭＶ１９
８、及びＭＭＶ１９９を作製した。得られたプラスミドベクターを、比較のために完全に
最適化したプラスミドＭＭＶ１３０及び完全に最適化していないプラスミドＭＭＶ２００
（図２０）を用いて以下の表２に示す。
表２
実施例１の方法及び手順を利用して、キメラＣｏｌ３Ａ１ベクターを作製した。ベクタ
ーＭＭＶ１３２を、キメラコラーゲンのＤＮＡならびに付随するプロモーターＰＤＦ及び
ターミネーターＡＯＸ１ＴＴ、マーカー発現用のＤＮＡならびに付随するプロモーター及
びターミネーター、細菌及び酵母の複製起点（複数可）のＤＮＡ、ならびに組み込むため
に酵母ゲノムに対して相同性を有するＤＮＡ（複数可）を含むように改変した。ベクター
ＭＭＶ６３は、未改変Ｃｏｌ３Ａ１ドメインの供給源のＤＮＡであった。ベクターＭＭＶ
１２８（図２１）は、改変Ｃｏｌ３Ａ１ドメインの供給源のＤＮＡであった。Ｃｏｌ３Ａ
１ポリペプチドの全長は１４６５アミノ酸（ａａ）である。プラスミドは、天然ウシＤＮ
Ａ配列（未修飾）及びＰｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓコドン改変ＤＮＡ配列を組み込む
ように設計した。Ｃｏｌ３Ａ１の改変配列と未改変配列との間の移行がａａ ７１０、１
，２００、及び１，３３１位になるようにプラスミドを設計した。これらの方法を使用し
て、プラスミドＭＭＶ１９３、ＭＭＶ１９４、ＭＭＶ１９５、ＭＭＶ１９７、ＭＭＶ１９
８、及びＭＭＶ１９９を作製した。得られたプラスミドベクターを、比較のために完全に
最適化したプラスミドＭＭＶ１３０及び完全に最適化していないプラスミドＭＭＶ２００
（図２０）を用いて以下の表２に示す。
表２
【表2】
【0155】
実施例１１
以下の変更を加えたうえで、実施例２を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した
：ＰＰ１及びＰＰ９７が得られた。ＰＰ９７は、２つのプロテアーゼ遺伝子（ＰＥＰ４及
びＰＲＢ１）を宿主株からノックアウトした株であった。Ｐｉｃｈｉａ発現用の改変及び
未改変ウシコラーゲン配列ＤＮＡの異なる組合せを含むＤＮＡ ＭＭＶ１９４、ＭＭＶ１
９５、ＭＭＶ１３０及びＭＭＶ２００配列を酵母に挿入した。ｐＤＦプロモーターを用い
てコラーゲン配列を発現させた。５００ｕｇ／ｍｌのゼオシンを含有するＹＰＤプレート
を用いて、成功した形質転換体を選択した。ベクターに対し、ＳｗａＩを用いて制限酵素
消化を行い、組み込むためにＤＮＡを直鎖状化し、Ｐｍｅ１で消化して２００ｎｇのＤＮ
Ａを形質転換したＭＭＶ１３０を除いて、３～５ｕｇの切断ＤＮＡを形質転換した。得ら
れた株を以下の表３に示す。
表３
以下の変更を加えたうえで、実施例２を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した
：ＰＰ１及びＰＰ９７が得られた。ＰＰ９７は、２つのプロテアーゼ遺伝子（ＰＥＰ４及
びＰＲＢ１）を宿主株からノックアウトした株であった。Ｐｉｃｈｉａ発現用の改変及び
未改変ウシコラーゲン配列ＤＮＡの異なる組合せを含むＤＮＡ ＭＭＶ１９４、ＭＭＶ１
９５、ＭＭＶ１３０及びＭＭＶ２００配列を酵母に挿入した。ｐＤＦプロモーターを用い
てコラーゲン配列を発現させた。５００ｕｇ／ｍｌのゼオシンを含有するＹＰＤプレート
を用いて、成功した形質転換体を選択した。ベクターに対し、ＳｗａＩを用いて制限酵素
消化を行い、組み込むためにＤＮＡを直鎖状化し、Ｐｍｅ１で消化して２００ｎｇのＤＮ
Ａを形質転換したＭＭＶ１３０を除いて、３～５ｕｇの切断ＤＮＡを形質転換した。得ら
れた株を以下の表３に示す。
表３
【表3】
【0156】
実施例１２
以下の変更を加えたうえで、実施例７を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した
：ウシＰ４ＨＡ配列及びウシＰ４ＨＢ配列の両方を有する１つのＤＮＡベクター、ＭＭＶ
－１５６を酵母に挿入した。Ｐ４ＨＡはその内在性シグナルペプチドを含み、Ｐ４ＨＢシ
グナル配列はαファクタープレ配列で置換した。両方の遺伝子を、ｐＨＴＸ１二方向性プ
ロモーターによって駆動した。ＤＮＡをＢａｍＨ１で消化し、形質転換した。株及び形質
転換の情報については、表４を参照されたい。
表４
以下の変更を加えたうえで、実施例７を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した
：ウシＰ４ＨＡ配列及びウシＰ４ＨＢ配列の両方を有する１つのＤＮＡベクター、ＭＭＶ
－１５６を酵母に挿入した。Ｐ４ＨＡはその内在性シグナルペプチドを含み、Ｐ４ＨＢシ
グナル配列はαファクタープレ配列で置換した。両方の遺伝子を、ｐＨＴＸ１二方向性プ
ロモーターによって駆動した。ＤＮＡをＢａｍＨ１で消化し、形質転換した。株及び形質
転換の情報については、表４を参照されたい。
表４
【表4】
【0157】
実施例１３
以下の変更を加えたうえで、実施例８を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した
：溶解緩衝液を、５０ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５％グリセロールで作製
し、ｐＨを酢酸で７．４に調整した。Ｐ４ＨＡ及びＰ４ＨＢの両方を含む別のベクター、
ＭＭＶ－１９１もまた、酵母に挿入した。余剰コピーのＰ４ＨＡは、その内在性シグナル
ペプチドを含み、余剰コピーのＰ４ＨＢのシグナル配列は、αファクタープレプロ配列で
置換した。余剰コピーのＰ４ＨＡ及びＰ４ＨＢを、ｐＧＣＷ１４－ＧＡＰ１二方向性プロ
モーターによって駆動した。ＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、形質転換した。形質転換及び
新規株の情報については、表５を参照されたい。株をＢＭＧＹ培地で増殖させ、コラーゲ
ンについて試験した。
表５
以下の変更を加えたうえで、実施例８を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した
：溶解緩衝液を、５０ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５％グリセロールで作製
し、ｐＨを酢酸で７．４に調整した。Ｐ４ＨＡ及びＰ４ＨＢの両方を含む別のベクター、
ＭＭＶ－１９１もまた、酵母に挿入した。余剰コピーのＰ４ＨＡは、その内在性シグナル
ペプチドを含み、余剰コピーのＰ４ＨＢのシグナル配列は、αファクタープレプロ配列で
置換した。余剰コピーのＰ４ＨＡ及びＰ４ＨＢを、ｐＧＣＷ１４－ＧＡＰ１二方向性プロ
モーターによって駆動した。ＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、形質転換した。形質転換及び
新規株の情報については、表５を参照されたい。株をＢＭＧＹ培地で増殖させ、コラーゲ
ンについて試験した。
表５
【表5】
【0158】
実施例１４
以下の変更を加えたうえで、実施例２を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した
：ウシＰ４ＨＡ配列及びウシＰ４ＨＢ配列の両方を有する１つのＤＮＡベクター、ＭＭＶ
－７８を酵母に挿入した。Ｐ４ＨＡ及びＰ４ＨＢを、Ｄａｓ１－Ｄａｓ２二方向性プロモ
ーターによって駆動する。ＤＮＡをＫｐｎＩで消化し、ＰＰ８に形質転換して、配列番号
３（「配列２」）のコラーゲン配列を保有するＰＰ３を生成した。ｐＡＯＸ１プロモータ
ーにより駆動されるＰ４ＨＢを有する別のベクター、ＭＭＶ－９４（配列番号１６）（「
配列１４」）を使用し、同様に酵母に挿入した。Ｐ４ＨＢの内在性シグナルペプチドを、
ＰＨＯ１シグナルペプチドで置換した。得られた株はＰＰ３８であった。
以下の変更を加えたうえで、実施例２を同じ手順及びプロトコールに従って繰り返した
：ウシＰ４ＨＡ配列及びウシＰ４ＨＢ配列の両方を有する１つのＤＮＡベクター、ＭＭＶ
－７８を酵母に挿入した。Ｐ４ＨＡ及びＰ４ＨＢを、Ｄａｓ１－Ｄａｓ２二方向性プロモ
ーターによって駆動する。ＤＮＡをＫｐｎＩで消化し、ＰＰ８に形質転換して、配列番号
３（「配列２」）のコラーゲン配列を保有するＰＰ３を生成した。ｐＡＯＸ１プロモータ
ーにより駆動されるＰ４ＨＢを有する別のベクター、ＭＭＶ－９４（配列番号１６）（「
配列１４」）を使用し、同様に酵母に挿入した。Ｐ４ＨＢの内在性シグナルペプチドを、
ＰＨＯ１シグナルペプチドで置換した。得られた株はＰＰ３８であった。
【0159】
２４ディープウェルプレートに対し、２ｍｌのＹＰＤを各ウェルに充填し、ＰＰ３８株
の単一コロニーを播種した。コロニーを、９００ｒｐｍの振盪下で２４時間、ＹＰＤ中で
増殖させた。細胞を３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去した。メタノール
フリーの誘導については、上清を２ｍＬのＢＭＧＹ（１％）で置換し、さらに４８時間増
殖させた。メタノール誘導については、メタノールを終濃度０．５％になるように添加し
、細胞を２４時間増殖させた。メタノールを再び添加し、細胞をさらに２４時間増殖させ
た。誘導終了時に、１ｍｌの試料を分析用に取り出した。
の単一コロニーを播種した。コロニーを、９００ｒｐｍの振盪下で２４時間、ＹＰＤ中で
増殖させた。細胞を３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去した。メタノール
フリーの誘導については、上清を２ｍＬのＢＭＧＹ（１％）で置換し、さらに４８時間増
殖させた。メタノール誘導については、メタノールを終濃度０．５％になるように添加し
、細胞を２４時間増殖させた。メタノールを再び添加し、細胞をさらに２４時間増殖させ
た。誘導終了時に、１ｍｌの試料を分析用に取り出した。
【0160】
実施例１に記載したＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びクーマシー染色を用いて、試料をコラーゲン
について試験した。メタノールフリー誘導の試料のバンドは、メタノール誘導の試料のバ
ンドよりも暗く、このことは、メタノールフリー誘導の試料のほうがコラーゲンを高濃度
で発現していたことを示している。
について試験した。メタノールフリー誘導の試料のバンドは、メタノール誘導の試料のバ
ンドよりも暗く、このことは、メタノールフリー誘導の試料のほうがコラーゲンを高濃度
で発現していたことを示している。
【0161】
本明細書中で使用する用語「最適化した」または「最適化する」などは、キメラＤＮＡ
構築物または他の重要なプロセス変数の特徴を慎重に選択することによって実現される値
または特徴を含み、既知の結果有効変数の使用を意味しない。
構築物または他の重要なプロセス変数の特徴を慎重に選択することによって実現される値
または特徴を含み、既知の結果有効変数の使用を意味しない。
【0162】
本明細書中で使用する用語は、単に特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、本
発明を限定することを意図するものではない。
発明を限定することを意図するものではない。
【0163】
本明細書中で使用する見出し（「背景技術」及び「概要」など）及び小見出しは、単に
本発明内のトピックの一般的な編成を意図したものに過ぎず、本発明の開示またはそのい
ずれかの態様を制限することを意図したものではない。特に、「背景技術」に開示する主
題は、新規技術を包含する場合があり、先行技術の引用を構成しない場合がある。「概要
」に開示する主題は、技術またはそのいずれかの実施形態の全範囲の網羅的または完全な
開示ではない。本明細書のセクション内の物質を、便宜上、特定の有用性を有するものと
して分類または議論し、また、所与の組成物中でその物質を使用する場合、その物質が、
必ずまたは単独で、その物質の本明細書中での分類に従って機能する必要があるという推
論をすべきではない。
本発明内のトピックの一般的な編成を意図したものに過ぎず、本発明の開示またはそのい
ずれかの態様を制限することを意図したものではない。特に、「背景技術」に開示する主
題は、新規技術を包含する場合があり、先行技術の引用を構成しない場合がある。「概要
」に開示する主題は、技術またはそのいずれかの実施形態の全範囲の網羅的または完全な
開示ではない。本明細書のセクション内の物質を、便宜上、特定の有用性を有するものと
して分類または議論し、また、所与の組成物中でその物質を使用する場合、その物質が、
必ずまたは単独で、その物質の本明細書中での分類に従って機能する必要があるという推
論をすべきではない。
【0164】
本明細書中で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、そうでないこ
とが文脈上で明確に示されない限り、複数形も含むことが意図される。
とが文脈上で明確に示されない限り、複数形も含むことが意図される。
【0165】
本明細書中で使用する場合、用語「及び／または」は、関連する列挙した項目の１つ以
上の任意の及びすべての組み合わせを含み、「／」と省略してもよい。
上の任意の及びすべての組み合わせを含み、「／」と省略してもよい。
【0166】
「ｗｗｗ」の前にスペースまたはアンダーラインのスペースを挿入することによってリ
ンクを使用不能にし、それは、スペースを除去することによって再活性化し得る。
ンクを使用不能にし、それは、スペースを除去することによって再活性化し得る。
【0167】
実施例で使用するものを含めて、本明細書中及び特許請求の範囲で使用する場合、特に
明記しない限り、すべての数字は、あたかも単語「実質的に」、「約」または「およそ」
が、たとえその単語が明示的に示されていなくても、それらが前置されているかのように
読み取ってよい。大きさ及び／または位置を記載する場合に、語句「約」または「およそ
」を使用して、記載する値及び／または位置が値及び／または位置の合理的な予想範囲内
にあることを示してもよい。例えば、数値は、指定する値（または値の範囲）の±０．１
％、指定する値（または値の範囲）の±１％、指定する値（または値の範囲）の±２％、
指定する値（または値の範囲）の±５％、指定する値（または値の範囲）の±１０％、指
定する値（または値の範囲）の±１５％、指定する値（または値の範囲）の±２０％など
の値を有し得る。本明細書中に列挙する数値範囲は、その範囲内に包含されるすべての部
分範囲を含むことが意図される。
明記しない限り、すべての数字は、あたかも単語「実質的に」、「約」または「およそ」
が、たとえその単語が明示的に示されていなくても、それらが前置されているかのように
読み取ってよい。大きさ及び／または位置を記載する場合に、語句「約」または「およそ
」を使用して、記載する値及び／または位置が値及び／または位置の合理的な予想範囲内
にあることを示してもよい。例えば、数値は、指定する値（または値の範囲）の±０．１
％、指定する値（または値の範囲）の±１％、指定する値（または値の範囲）の±２％、
指定する値（または値の範囲）の±５％、指定する値（または値の範囲）の±１０％、指
定する値（または値の範囲）の±１５％、指定する値（または値の範囲）の±２０％など
の値を有し得る。本明細書中に列挙する数値範囲は、その範囲内に包含されるすべての部
分範囲を含むことが意図される。
【0168】
本明細書中で使用する場合、用語「好ましい」及び「好ましくは」とは、特定の状況下
で特定の利益をもたらす技術の実施形態を指す。しかしながら、同じまたは他の状況下で
、他の実施形態もまた、好ましい場合がある。さらに、１つ以上の好ましい実施形態の列
挙は、他の実施形態が有用ではないことを意図するものではなく、他の実施形態を技術の
範囲から除外することを意図するものでもない。
本明細書中で言及するように、すべての組成割合は、特に明記しない限り、全組成物に
対する重量百分率である。本明細書中で使用する場合、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」
及びその変形は非限定的であることを意図しており、したがって、リスト内の項目の列挙
は、本技術の素材、組成物、装置、及び方法においても有用であり得る他の同様の項目を
除外するものではない。同様に、用語「できる（ｃａｎ）」及び「してもよい（ｍａｙ）
」ならびにその変形は非限定的であることを意図しており、したがって、一実施形態が特
定の要素または特徴を含むことができるか、またはそれらを含んでもよいことについての
列挙は、それらの要素または特徴を含まない本発明の他の実施形態を除外するものではな
い。
で特定の利益をもたらす技術の実施形態を指す。しかしながら、同じまたは他の状況下で
、他の実施形態もまた、好ましい場合がある。さらに、１つ以上の好ましい実施形態の列
挙は、他の実施形態が有用ではないことを意図するものではなく、他の実施形態を技術の
範囲から除外することを意図するものでもない。
本明細書中で言及するように、すべての組成割合は、特に明記しない限り、全組成物に
対する重量百分率である。本明細書中で使用する場合、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」
及びその変形は非限定的であることを意図しており、したがって、リスト内の項目の列挙
は、本技術の素材、組成物、装置、及び方法においても有用であり得る他の同様の項目を
除外するものではない。同様に、用語「できる（ｃａｎ）」及び「してもよい（ｍａｙ）
」ならびにその変形は非限定的であることを意図しており、したがって、一実施形態が特
定の要素または特徴を含むことができるか、またはそれらを含んでもよいことについての
列挙は、それらの要素または特徴を含まない本発明の他の実施形態を除外するものではな
い。
【0169】
用語「第一」及び「第二」は、様々な特徴／要素（工程を含む）を記述するために本明
細書中で使用され得るが、文脈上、そうではないと示されない限り、これらの特徴／要素
はこれらの用語によって限定されるべきではない。これらの用語は、ある特徴／要素を別
の特徴／要素と区別するために使用してもよい。したがって、以降で説明する第一の特徴
／要素を第二の特徴／要素と表現することは可能であり、同様に、以降で説明する第二の
特徴／要素を、本発明の教示から逸脱することなく第一の特徴／要素と表現することも可
能である。
細書中で使用され得るが、文脈上、そうではないと示されない限り、これらの特徴／要素
はこれらの用語によって限定されるべきではない。これらの用語は、ある特徴／要素を別
の特徴／要素と区別するために使用してもよい。したがって、以降で説明する第一の特徴
／要素を第二の特徴／要素と表現することは可能であり、同様に、以降で説明する第二の
特徴／要素を、本発明の教示から逸脱することなく第一の特徴／要素と表現することも可
能である。
【0170】
空間的に相対的な用語、例えば、図面に示される、「下（ｕｎｄｅｒ）」、「下（ｂｅ
ｌｏｗ）」、「下（ｌｏｗｅｒ）」、「上（ｏｖｅｒ）」、「上（ｕｐｐｅｒ）」などは
、ある要素または特徴と他の要素（複数可）または特徴（複数可）との関係性を記載する
うえで、説明を容易にするために、本明細書中において使用してもよい。空間的に相対的
な用語は、図中に描かれている向きに加えて、使用中または動作中の装置の異なる向きを
包含することが意図されていることは理解されよう。例えば、図中の装置が反転している
場合、他の要素または特徴の「下（ｕｎｄｅｒ）」または「下（ｂｅｎｅａｔｈ）」と記
載される要素は、他の要素または特徴の「上（ｏｖｅｒ）」を向くであろう。したがって
、例示的な用語「下（ｕｎｄｅｒ）」は、上（ｏｖｅｒ）及び下（ｕｎｄｅｒ）の向きの
両方を包含し得る。装置は、他の方向を向いていてもよく（９０°または他の向きに回転
していてもよい）、本明細書中で使用する空間的に相対的な記述子は、それに応じて解釈
される。同様に、特段の断りがない限り、用語「上向きに（ｕｐｗａｒｄｌｙ）」、「下
向きに（ｄｏｗｎｗａｒｄｌｙ）」、「垂直」、「水平」などは、単に説明の目的でのみ
使用される。
ｌｏｗ）」、「下（ｌｏｗｅｒ）」、「上（ｏｖｅｒ）」、「上（ｕｐｐｅｒ）」などは
、ある要素または特徴と他の要素（複数可）または特徴（複数可）との関係性を記載する
うえで、説明を容易にするために、本明細書中において使用してもよい。空間的に相対的
な用語は、図中に描かれている向きに加えて、使用中または動作中の装置の異なる向きを
包含することが意図されていることは理解されよう。例えば、図中の装置が反転している
場合、他の要素または特徴の「下（ｕｎｄｅｒ）」または「下（ｂｅｎｅａｔｈ）」と記
載される要素は、他の要素または特徴の「上（ｏｖｅｒ）」を向くであろう。したがって
、例示的な用語「下（ｕｎｄｅｒ）」は、上（ｏｖｅｒ）及び下（ｕｎｄｅｒ）の向きの
両方を包含し得る。装置は、他の方向を向いていてもよく（９０°または他の向きに回転
していてもよい）、本明細書中で使用する空間的に相対的な記述子は、それに応じて解釈
される。同様に、特段の断りがない限り、用語「上向きに（ｕｐｗａｒｄｌｙ）」、「下
向きに（ｄｏｗｎｗａｒｄｌｙ）」、「垂直」、「水平」などは、単に説明の目的でのみ
使用される。
【0171】
特徴または要素が、本明細書中で、別の特徴または要素の「上（ｏｎ）」にあると言及
される場合、それは他の特徴もしくは要素の上に直接存在し得るか、または介在する特徴
及び／または要素が存在する場合もある。対照的に、ある特徴または要素が別の特徴また
は要素の「直上（ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｏｎ）」にあると言及される場合、介在する特徴ま
たは要素は存在しない。また、ある特徴または要素が他の特徴または要素に「接続」、「
付着」または「結合」していると言及される場合、それは他の特徴または要素に直接的に
接続、付着または結合可能であるか、または介在する特徴または要素が存在してもよいこ
とも理解されるであろう。対照的に、ある特徴または要素が別の特徴または要素に「直接
接続」、「直接付着」または「直接結合」していると言及される場合、介在する特徴また
は要素は存在しない。一実施形態に関して記載または図示しているが、そのように記載ま
たは図示した特徴及び要素は、他の実施形態に適用することができる。当業者であれば、
別の特徴に「隣接して」配置された構造または特徴への言及は、隣接する特徴にオーバー
ラップするかまたはその下部に存在する部分を有し得ることも理解されよう。
される場合、それは他の特徴もしくは要素の上に直接存在し得るか、または介在する特徴
及び／または要素が存在する場合もある。対照的に、ある特徴または要素が別の特徴また
は要素の「直上（ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｏｎ）」にあると言及される場合、介在する特徴ま
たは要素は存在しない。また、ある特徴または要素が他の特徴または要素に「接続」、「
付着」または「結合」していると言及される場合、それは他の特徴または要素に直接的に
接続、付着または結合可能であるか、または介在する特徴または要素が存在してもよいこ
とも理解されるであろう。対照的に、ある特徴または要素が別の特徴または要素に「直接
接続」、「直接付着」または「直接結合」していると言及される場合、介在する特徴また
は要素は存在しない。一実施形態に関して記載または図示しているが、そのように記載ま
たは図示した特徴及び要素は、他の実施形態に適用することができる。当業者であれば、
別の特徴に「隣接して」配置された構造または特徴への言及は、隣接する特徴にオーバー
ラップするかまたはその下部に存在する部分を有し得ることも理解されよう。
【0172】
本明細書中で言及するすべての刊行物及び特許出願は、あたかも個々の刊行物または特
許出願が具体的かつ個別に参照として援用されているかのように、その全体を参照として
本明細書に援用し、参照として援用することを示す本明細書の同じ文章、段落、ページま
たは節に記載する開示を特に参照する。本明細書中における参考文献の引用は、それらの
参考文献が先行技術であるか、または本明細書に開示する技術の特許性に関連するもので
あることを認めるものではない。引用する参考文献の内容の議論は、単にその参考文献の
著者の主張の一般的な概要を提供することを意図しているに過ぎず、そのような参考文献
の内容の正確性について承認するものではない。
許出願が具体的かつ個別に参照として援用されているかのように、その全体を参照として
本明細書に援用し、参照として援用することを示す本明細書の同じ文章、段落、ページま
たは節に記載する開示を特に参照する。本明細書中における参考文献の引用は、それらの
参考文献が先行技術であるか、または本明細書に開示する技術の特許性に関連するもので
あることを認めるものではない。引用する参考文献の内容の議論は、単にその参考文献の
著者の主張の一般的な概要を提供することを意図しているに過ぎず、そのような参考文献
の内容の正確性について承認するものではない。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-10-13
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
明細書に記載の発明。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0172】
本明細書中で言及するすべての刊行物及び特許出願は、あたかも個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参照として援用されているかのように、その全体を参照として本明細書に援用し、参照として援用することを示す本明細書の同じ文章、段落、ページまたは節に記載する開示を特に参照する。本明細書中における参考文献の引用は、それらの参考文献が先行技術であるか、または本明細書に開示する技術の特許性に関連するものであることを認めるものではない。引用する参考文献の内容の議論は、単にその参考文献の著者の主張の一般的な概要を提供することを意図しているに過ぎず、そのような参考文献の内容の正確性について承認するものではない。
以下の態様が包含され得る。
［１］ 非水酸化コラーゲンを産生する遺伝子改変酵母株であって：
（ｉ）酵母株；ならびに
（ｉｉ）コラーゲンのＤＮＡ配列；コラーゲンプロモーターのＤＮＡ配列；コラーゲンターミネーターのＤＮＡ配列；選択マーカーのＤＮＡ配列、前記選択マーカー用のプロモーターのＤＮＡ配列；前記選択マーカー用のターミネーターのＤＮＡ配列；細菌用のもの及び酵母用のものから選択される複製起点のＤＮＡ配列；及び前記酵母のゲノムと相同性を有するＤＮＡ配列を含むベクター
を含み、前記ベクターが前記酵母株に挿入されている、前記遺伝子改変酵母株。
［２］ 前記酵母株が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、上記［１］に記載の酵母株。
［３］ 前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記［１］に記載の酵母株。
［４］ 前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、天然コラーゲンＤＮＡ、改変（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）コラーゲンＤＮＡ及びコドン改変コラーゲンＤＮＡから選択される、上記［３］に記載の酵母株。
［５］ 前記プロモーターのＤＮＡ配列が、ＡＯＸ１メタノール誘導性プロモーターのＤＮＡ、ｐＤＦ抑制解除プロモーターのＤＮＡ、ｐＣＡＴ抑制解除プロモーターのＤＮＡ、Ｄａｓ１－Ｄａｓ２メタノール誘導性二方向性プロモーターのＤＮＡ、ｐＨＴＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ、ｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記［１］に記載の酵母株。
［６］ 前記選択マーカーのＤＮＡ配列が、抗生物質耐性のＤＮＡ及び栄養要求性マーカーのＤＮＡからなる群から選択される、上記［１］に記載の酵母株。
［７］ 前記抗生物質耐性マーカーが、ハイグロマイシン耐性、ゼオシン耐性、ジェネテシン耐性及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記［６］に記載の酵母株。
［８］ 前記ベクターを、電気穿孔法、化学的形質転換、及び接合からなる群から選択される方法によって前記酵母に挿入する、上記［１］に記載の酵母株。
［９］ 非水酸化コラーゲンの製造方法であって：
（ｉ）上記［１］の酵母株を提供し；及び
（ｉｉ）コラーゲンを産生するのに十分な期間、培地中で前記株を増殖させることを含む、前記製造方法。
［１０］ 前記酵母株が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、上記［９］に記載の方法。
［１１］ 前記培地が、緩衝グリセロール複合培地（ＢＭＧＹ）、緩衝メタノール複合培地（ＢＭＭＹ）、及び酵母抽出ペプトンデキストロース（ＹＰＤ）からなる群から選択される、上記［９］に記載の方法。
［１２］ 前記期間が、２４時間～７２時間である、上記［９］に記載の方法。
［１３］ 前記酵母が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、上記［９］に記載の方法。
［１４］ 前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記［９］に記載の方法。
［１５］ 前記プロモーターのＤＮＡ配列が、前記ｐＨＴＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及び前記ｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択される、上記［９］に記載の方法。
［１６］ 前記選択マーカーのＤＮＡ配列が、前記抗生物質耐性ＤＮＡのＤＮＡ及び前記栄養要求性マーカーのＤＮＡからなる群から選択される、上記［９］に記載の方法。
［１７］ 水酸化コラーゲンを産生する遺伝子改変酵母株であって：
（ｉ）酵母株；
（ｉｉ）コラーゲンのＤＮＡ配列；コラーゲンプロモーターのＤＮＡ配列；ターミネーターのＤＮＡ配列；選択マーカーのＤＮＡ配列；前記選択マーカー用のプロモーターのＤＮＡ配列；前記選択マーカー用のターミネーターのＤＮＡ配列；細菌及び／または酵母の複製起点のＤＮＡ配列；前記酵母のゲノムと相同性を有するＤＮＡ配列を含むベクターであって；前記ベクターが前記酵母株に挿入されている、前記ベクター；ならびに
（ｉｉｉ）Ｐ４ＨＡ１のＤＮＡ配列；Ｐ４ＨＢのＤＮＡ配列；及びプロモーター用の少なくとも１つのＤＮＡ配列を含む第二のベクターであって；前記ベクターが前記酵母株に挿入されている、前記第二のベクター
を含む、前記遺伝子改変酵母株。
［１８］ 前記酵母株が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、上記［１７］に記載の酵母株。
［１９］ 前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記［１７］に記載の酵母株。
［２０］ 前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、天然コラーゲンＤＮＡ、改変（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）コラーゲンＤＮＡ及び改変（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）コラーゲンＤＮＡから選択される、上記［１７］に記載の酵母株。
［２１］ 前記プロモーターのＤＮＡ配列が、前記ＡＯＸ１メタノール誘導性プロモーターのＤＮＡ、前記ｐＤＦ抑制解除プロモーターのＤＮＡ、前記ｐＣＡＴ抑制解除プロモーターのＤＮＡ、前記Ｄａｓ１－Ｄａｓ２メタノール誘導性二方向性プロモーターのＤＮＡ、前記ｐＨＴＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ、前記ｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記［１７］に記載の酵母株。
［２２］ 前記プロモーターのＤＮＡ配列が、前記ｐＨＴＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及び前記ｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択される、上記［１７］に記載の酵母株。
［２３］ 前記選択マーカーの前記ＤＮＡ配列が、前記抗生物質耐性ＤＮＡのＤＮＡ及び前記栄養要求性マーカーのＤＮＡからなる群から選択される、上記［１７］に記載の酵母株。
［２４］ 前記選択マーカーが、ハイグロマイシン耐性、ゼオシン耐性、ジェネテシン耐性及びそれらの組み合わせからなる群から選択される抗生物質耐性の選択マーカーである、上記［２３］に記載の酵母株。
［２５］ 前記ベクターを、電気穿孔法、化学的形質転換、及び接合からなる群から選択される方法によって前記酵母に挿入する、上記［１７］に記載の酵母株。
［２６］ 水酸化コラーゲンの製造方法であって：
（ｉ）上記［１７］の酵母株を提供し；及び
（ｉｉ）コラーゲンを産生するのに十分な期間、培地中で前記株を増殖させることを含む、前記製造方法。
［２７］ 前記酵母株が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、上記［２６］に記載の方法。
［２８］ 前記培地が、ＢＭＧＹ、ＢＭＭＹ、及びＹＰＤからなる群から選択される、上記［２６］に記載の方法。
［２９］ 前記期間が、２４時間～７２時間である、上記［２６］に記載の方法。
［３０］ 前記酵母が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、上記［２６］に記載の方法。
［３１］ 前記コラーゲンのＤＮＡが、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記［２６］に記載の方法。
［３２］ 前記プロモーターのＤＮＡが、前記ｐＴＨＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及び前記ｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択される、上記［２６］に記載の方法。
［３３］ 前記選択マーカーのＤＮＡが、前記抗生物質耐性ＤＮＡのＤＮＡ及び前記栄養要求性マーカーのＤＮＡからなる群から選択される、上記［２６］に記載の方法。
［３４］ （ｉ）プロモーター及びターミネーターを含む、コラーゲン産生に必要なＤＮＡ；
（ｉｉ）プロモーター及びターミネーターを含む、Ｐ４ＨＡ１及びＰ４ＨＢからなる群から選択される水酸化酵素のＤＮＡ；
（ｉｉｉ）プロモーター及びターミネーターを含む、選択マーカーのＤＮＡ；
（ｉｖ）酵母及び細菌の複製起点のＤＮＡ；
（ｖ）ゲノムに組み込むために前記酵母のゲノムに対して相同性を有するＤＮＡ；ならびに
（ｖｉ）モジュラー式クローニングを可能にする、上記のＤＮＡ内の５’、３’、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される位置の制限酵素部位
を有する、オールインワンベクター。
［３５］ コラーゲン産生に必要な前記ＤＮＡ配列が、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記［３４］に記載のオールインワンベクター。
［３６］ 前記プロモーターのＤＮＡ配列が、前記ｐＴＨＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及び前記ｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択される、上記［３４］に記載のオールインワンベクター。
［３７］ 前記選択マーカーのＤＮＡ配列が、前記抗生物質耐性のＤＮＡ及び前記栄養要求性マーカーのＤＮＡである、上記［３４］に記載のオールインワンベクター。
［３８］ 前記選択マーカーが、ハイグロマイシン、ゼオシン、ジェネテシン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される抗生物質に対する抗生物質耐性の選択マーカーである、上記［３７］に記載のオールインワンベクター。
［３９］ 最適化したＤＮＡを、キメラコラーゲンＤＮＡの全長に基づいて１０～４０％または６０～９０％含む、キメラコラーゲンＤＮＡ配列。
［４０］ 前記最適化したＤＮＡが、Ｃ末端から始まる、上記［３９］に記載のキメラコラーゲンＤＮＡ配列。
［４１］ 前記最適化したＤＮＡが、Ｎ末端から始まる、上記［３９］に記載のキメラコラーゲンＤＮＡ配列。
［４２］ 上記［３９］に記載のキメラコラーゲンのＤＮＡ配列；
コラーゲンプロモーターのＤＮＡ配列；
ターミネーターのＤＮＡ配列；選択マーカーのＤＮＡ配列；
前記選択マーカー用のプロモーターのＤＮＡ配列；
前記選択マーカー用のターミネーターのＤＮＡ配列；
細菌及び／または酵母の複製起点のＤＮＡ配列；及び
前記酵母のゲノムと相同性を有するＤＮＡ配列
を含むベクターを保有する、コラーゲン産生酵母株。
［４３］ 前記プロモーターのＤＮＡが、前記ｐＴＨＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及び前記ｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択される、上記［４２］に記載の酵母株。
［４４］ 前記選択マーカーのＤＮＡが、前記少なくとも１つの抗生物質耐性をコードするＤＮＡ及び少なくとも１つの栄養要求性マーカーをコードするＤＮＡからなる群から選択される、上記［４２］に記載の酵母株。
［４５］ 水酸化コラーゲンの製造方法であって：
（ｉ）上記［４２］のコラーゲン産生酵母株を提供し；及び
（ｉｉ）コラーゲンを産生するのに十分な期間、培地中で前記株を増殖させることを含む、前記製造方法。
［４６］ 前記酵母株が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、上記［４５］に記載の方法。
［４７］ 前記培地が、緩衝グリセロール複合培地、緩衝メタノール複合培地、及び酵母抽出ペプトンデキストロースからなる群から選択される、上記［４５］に記載の方法。
［４８］ 前記期間が、２４時間～７２時間の範囲である、上記［４５］に記載の方法。
［４９］ 前記酵母株が、前記ｐＴＨＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及び前記ｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択されるプロモーターを含む、上記［４５］に記載の方法。
［５０］ 前記酵母株が、抗生物質耐性をコードするＤＮＡ及び栄養要求性マーカーをコードするＤＮＡからなる群から選択される少なくとも１つの選択マーカーを含む、上記［４５］に記載の方法。
以下の態様が包含され得る。
［１］ 非水酸化コラーゲンを産生する遺伝子改変酵母株であって：
（ｉ）酵母株；ならびに
（ｉｉ）コラーゲンのＤＮＡ配列；コラーゲンプロモーターのＤＮＡ配列；コラーゲンターミネーターのＤＮＡ配列；選択マーカーのＤＮＡ配列、前記選択マーカー用のプロモーターのＤＮＡ配列；前記選択マーカー用のターミネーターのＤＮＡ配列；細菌用のもの及び酵母用のものから選択される複製起点のＤＮＡ配列；及び前記酵母のゲノムと相同性を有するＤＮＡ配列を含むベクター
を含み、前記ベクターが前記酵母株に挿入されている、前記遺伝子改変酵母株。
［２］ 前記酵母株が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、上記［１］に記載の酵母株。
［３］ 前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記［１］に記載の酵母株。
［４］ 前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、天然コラーゲンＤＮＡ、改変（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）コラーゲンＤＮＡ及びコドン改変コラーゲンＤＮＡから選択される、上記［３］に記載の酵母株。
［５］ 前記プロモーターのＤＮＡ配列が、ＡＯＸ１メタノール誘導性プロモーターのＤＮＡ、ｐＤＦ抑制解除プロモーターのＤＮＡ、ｐＣＡＴ抑制解除プロモーターのＤＮＡ、Ｄａｓ１－Ｄａｓ２メタノール誘導性二方向性プロモーターのＤＮＡ、ｐＨＴＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ、ｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記［１］に記載の酵母株。
［６］ 前記選択マーカーのＤＮＡ配列が、抗生物質耐性のＤＮＡ及び栄養要求性マーカーのＤＮＡからなる群から選択される、上記［１］に記載の酵母株。
［７］ 前記抗生物質耐性マーカーが、ハイグロマイシン耐性、ゼオシン耐性、ジェネテシン耐性及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記［６］に記載の酵母株。
［８］ 前記ベクターを、電気穿孔法、化学的形質転換、及び接合からなる群から選択される方法によって前記酵母に挿入する、上記［１］に記載の酵母株。
［９］ 非水酸化コラーゲンの製造方法であって：
（ｉ）上記［１］の酵母株を提供し；及び
（ｉｉ）コラーゲンを産生するのに十分な期間、培地中で前記株を増殖させることを含む、前記製造方法。
［１０］ 前記酵母株が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、上記［９］に記載の方法。
［１１］ 前記培地が、緩衝グリセロール複合培地（ＢＭＧＹ）、緩衝メタノール複合培地（ＢＭＭＹ）、及び酵母抽出ペプトンデキストロース（ＹＰＤ）からなる群から選択される、上記［９］に記載の方法。
［１２］ 前記期間が、２４時間～７２時間である、上記［９］に記載の方法。
［１３］ 前記酵母が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、上記［９］に記載の方法。
［１４］ 前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記［９］に記載の方法。
［１５］ 前記プロモーターのＤＮＡ配列が、前記ｐＨＴＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及び前記ｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択される、上記［９］に記載の方法。
［１６］ 前記選択マーカーのＤＮＡ配列が、前記抗生物質耐性ＤＮＡのＤＮＡ及び前記栄養要求性マーカーのＤＮＡからなる群から選択される、上記［９］に記載の方法。
［１７］ 水酸化コラーゲンを産生する遺伝子改変酵母株であって：
（ｉ）酵母株；
（ｉｉ）コラーゲンのＤＮＡ配列；コラーゲンプロモーターのＤＮＡ配列；ターミネーターのＤＮＡ配列；選択マーカーのＤＮＡ配列；前記選択マーカー用のプロモーターのＤＮＡ配列；前記選択マーカー用のターミネーターのＤＮＡ配列；細菌及び／または酵母の複製起点のＤＮＡ配列；前記酵母のゲノムと相同性を有するＤＮＡ配列を含むベクターであって；前記ベクターが前記酵母株に挿入されている、前記ベクター；ならびに
（ｉｉｉ）Ｐ４ＨＡ１のＤＮＡ配列；Ｐ４ＨＢのＤＮＡ配列；及びプロモーター用の少なくとも１つのＤＮＡ配列を含む第二のベクターであって；前記ベクターが前記酵母株に挿入されている、前記第二のベクター
を含む、前記遺伝子改変酵母株。
［１８］ 前記酵母株が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、上記［１７］に記載の酵母株。
［１９］ 前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記［１７］に記載の酵母株。
［２０］ 前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、天然コラーゲンＤＮＡ、改変（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）コラーゲンＤＮＡ及び改変（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）コラーゲンＤＮＡから選択される、上記［１７］に記載の酵母株。
［２１］ 前記プロモーターのＤＮＡ配列が、前記ＡＯＸ１メタノール誘導性プロモーターのＤＮＡ、前記ｐＤＦ抑制解除プロモーターのＤＮＡ、前記ｐＣＡＴ抑制解除プロモーターのＤＮＡ、前記Ｄａｓ１－Ｄａｓ２メタノール誘導性二方向性プロモーターのＤＮＡ、前記ｐＨＴＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ、前記ｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記［１７］に記載の酵母株。
［２２］ 前記プロモーターのＤＮＡ配列が、前記ｐＨＴＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及び前記ｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択される、上記［１７］に記載の酵母株。
［２３］ 前記選択マーカーの前記ＤＮＡ配列が、前記抗生物質耐性ＤＮＡのＤＮＡ及び前記栄養要求性マーカーのＤＮＡからなる群から選択される、上記［１７］に記載の酵母株。
［２４］ 前記選択マーカーが、ハイグロマイシン耐性、ゼオシン耐性、ジェネテシン耐性及びそれらの組み合わせからなる群から選択される抗生物質耐性の選択マーカーである、上記［２３］に記載の酵母株。
［２５］ 前記ベクターを、電気穿孔法、化学的形質転換、及び接合からなる群から選択される方法によって前記酵母に挿入する、上記［１７］に記載の酵母株。
［２６］ 水酸化コラーゲンの製造方法であって：
（ｉ）上記［１７］の酵母株を提供し；及び
（ｉｉ）コラーゲンを産生するのに十分な期間、培地中で前記株を増殖させることを含む、前記製造方法。
［２７］ 前記酵母株が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、上記［２６］に記載の方法。
［２８］ 前記培地が、ＢＭＧＹ、ＢＭＭＹ、及びＹＰＤからなる群から選択される、上記［２６］に記載の方法。
［２９］ 前記期間が、２４時間～７２時間である、上記［２６］に記載の方法。
［３０］ 前記酵母が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、上記［２６］に記載の方法。
［３１］ 前記コラーゲンのＤＮＡが、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記［２６］に記載の方法。
［３２］ 前記プロモーターのＤＮＡが、前記ｐＴＨＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及び前記ｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択される、上記［２６］に記載の方法。
［３３］ 前記選択マーカーのＤＮＡが、前記抗生物質耐性ＤＮＡのＤＮＡ及び前記栄養要求性マーカーのＤＮＡからなる群から選択される、上記［２６］に記載の方法。
［３４］ （ｉ）プロモーター及びターミネーターを含む、コラーゲン産生に必要なＤＮＡ；
（ｉｉ）プロモーター及びターミネーターを含む、Ｐ４ＨＡ１及びＰ４ＨＢからなる群から選択される水酸化酵素のＤＮＡ；
（ｉｉｉ）プロモーター及びターミネーターを含む、選択マーカーのＤＮＡ；
（ｉｖ）酵母及び細菌の複製起点のＤＮＡ；
（ｖ）ゲノムに組み込むために前記酵母のゲノムに対して相同性を有するＤＮＡ；ならびに
（ｖｉ）モジュラー式クローニングを可能にする、上記のＤＮＡ内の５’、３’、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される位置の制限酵素部位
を有する、オールインワンベクター。
［３５］ コラーゲン産生に必要な前記ＤＮＡ配列が、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子ヒツジ、恐竜コラーゲン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記［３４］に記載のオールインワンベクター。
［３６］ 前記プロモーターのＤＮＡ配列が、前記ｐＴＨＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及び前記ｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択される、上記［３４］に記載のオールインワンベクター。
［３７］ 前記選択マーカーのＤＮＡ配列が、前記抗生物質耐性のＤＮＡ及び前記栄養要求性マーカーのＤＮＡである、上記［３４］に記載のオールインワンベクター。
［３８］ 前記選択マーカーが、ハイグロマイシン、ゼオシン、ジェネテシン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される抗生物質に対する抗生物質耐性の選択マーカーである、上記［３７］に記載のオールインワンベクター。
［３９］ 最適化したＤＮＡを、キメラコラーゲンＤＮＡの全長に基づいて１０～４０％または６０～９０％含む、キメラコラーゲンＤＮＡ配列。
［４０］ 前記最適化したＤＮＡが、Ｃ末端から始まる、上記［３９］に記載のキメラコラーゲンＤＮＡ配列。
［４１］ 前記最適化したＤＮＡが、Ｎ末端から始まる、上記［３９］に記載のキメラコラーゲンＤＮＡ配列。
［４２］ 上記［３９］に記載のキメラコラーゲンのＤＮＡ配列；
コラーゲンプロモーターのＤＮＡ配列；
ターミネーターのＤＮＡ配列；選択マーカーのＤＮＡ配列；
前記選択マーカー用のプロモーターのＤＮＡ配列；
前記選択マーカー用のターミネーターのＤＮＡ配列；
細菌及び／または酵母の複製起点のＤＮＡ配列；及び
前記酵母のゲノムと相同性を有するＤＮＡ配列
を含むベクターを保有する、コラーゲン産生酵母株。
［４３］ 前記プロモーターのＤＮＡが、前記ｐＴＨＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及び前記ｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択される、上記［４２］に記載の酵母株。
［４４］ 前記選択マーカーのＤＮＡが、前記少なくとも１つの抗生物質耐性をコードするＤＮＡ及び少なくとも１つの栄養要求性マーカーをコードするＤＮＡからなる群から選択される、上記［４２］に記載の酵母株。
［４５］ 水酸化コラーゲンの製造方法であって：
（ｉ）上記［４２］のコラーゲン産生酵母株を提供し；及び
（ｉｉ）コラーゲンを産生するのに十分な期間、培地中で前記株を増殖させることを含む、前記製造方法。
［４６］ 前記酵母株が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属及びそれらの組み合わせ由来のものからなる群から選択される、上記［４５］に記載の方法。
［４７］ 前記培地が、緩衝グリセロール複合培地、緩衝メタノール複合培地、及び酵母抽出ペプトンデキストロースからなる群から選択される、上記［４５］に記載の方法。
［４８］ 前記期間が、２４時間～７２時間の範囲である、上記［４５］に記載の方法。
［４９］ 前記酵母株が、前記ｐＴＨＸ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡ及び前記ｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的二方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択されるプロモーターを含む、上記［４５］に記載の方法。
［５０］ 前記酵母株が、抗生物質耐性をコードするＤＮＡ及び栄養要求性マーカーをコードするＤＮＡからなる群から選択される少なくとも１つの選択マーカーを含む、上記［４５］に記載の方法。
【外国語明細書】