知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニアの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023179527
(43)【公開日】2023-12-19
(54)【発明の名称】視機能を強化するための組成物及び方法
(51)【国際特許分類】
A61K 38/17 20060101AFI20231212BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20231212BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20231212BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231212BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20231212BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20231212BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20231212BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20231212BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20231212BHJP
【ＦＩ】
A61K38/17 ZNA
A61K48/00
A61P27/02
A61P43/00 105
C12N15/12
C12N15/86 Z
C12N15/11 Z
C12N15/864 100Z
C12N5/10
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023156032
(22)【出願日】2023-09-21
(62)【分割の表示】P 2020523314の分割
【原出願日】2018-11-13
(31)【優先権主張番号】62/585,237
(32)【優先日】2017-11-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/589,476
(32)【優先日】2017-11-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/641,783
(32)【優先日】2018-03-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ｉＰａｄ
(71)【出願人】
【識別番号】506115514
【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(72)【発明者】
【氏名】イサコフ エフド ワイ．
(57)【要約】 （修正有）
【課題】眼疾患治療のための改良された光遺伝学的アプローチを提供する。
【解決手段】本開示は、中波長錐体オプシン（ＭＷ－オプシン）、長波長錐体オプシン（ＬＷ－オプシン）及び短波長錐体オプシン（ＳＷ－オプシン）のうちの１つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を個体に投与する工程を含む、個体における視機能を回復または強化する方法を提供する。ＭＷ－オプシン、ＬＷ－オプシン及びＳＷ－オプシンのうちの１つまたは複数を個体の網膜細胞に発現させ、それによって視機能を回復または強化する。
【選択図】図１
【解決手段】本開示は、中波長錐体オプシン（ＭＷ－オプシン）、長波長錐体オプシン（ＬＷ－オプシン）及び短波長錐体オプシン（ＳＷ－オプシン）のうちの１つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を個体に投与する工程を含む、個体における視機能を回復または強化する方法を提供する。ＭＷ－オプシン、ＬＷ－オプシン及びＳＷ－オプシンのうちの１つまたは複数を個体の網膜細胞に発現させ、それによって視機能を回復または強化する。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
個体における視機能を回復または強化する方法であって、
中波長オプシン（ＭＷ－オプシン）及び／または長波長オプシン（ＬＷ－オプシン）及び／または短波長オプシン（ＳＷ－オプシン）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を前記個体へ投与する工程を含み、
前記投与工程が、前記個体の網膜細胞における前記ＭＷ－オプシン及び／または前記ＬＷ－オプシン及び／または前記ＳＷ－オプシンの発現ならびに視機能の回復または強化を提供する、
前記方法。
中波長オプシン（ＭＷ－オプシン）及び／または長波長オプシン（ＬＷ－オプシン）及び／または短波長オプシン（ＳＷ－オプシン）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を前記個体へ投与する工程を含み、
前記投与工程が、前記個体の網膜細胞における前記ＭＷ－オプシン及び／または前記ＬＷ－オプシン及び／または前記ＳＷ－オプシンの発現ならびに視機能の回復または強化を提供する、
前記方法。
【請求項2】
前記ＭＷ－オプシンが、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記ＬＷ－オプシンが、配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び
前記ＳＷ－オプシンが、配列番号５に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載の方法。
前記ＬＷ－オプシンが、配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び
前記ＳＷ－オプシンが、配列番号５に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＳＷ－オプシンが、配列番号５に記載のヒトＳＷ－オプシンのアミノ酸配列に対して少なくとも８７％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号６に記載のマウスＳＷ－オプシンのアミノ酸配列に対して少なくとも８７％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
（ｉ）配列番号５に記載のヒトＳＷ－オプシンのアミノ酸配列に対して少なくとも８７％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＳＷ－オプシンをコードするヌクレオチド配列を含む、第１の核酸と、
（ｉｉ）配列番号６に記載のマウスＳＷ－オプシンのアミノ酸配列に対して少なくとも８７％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＳＷ－オプシンをコードするヌクレオチド配列を含む、第２の核酸とを、
前記個体へ投与する工程を含む、請求項１に記載の方法。
（ｉｉ）配列番号６に記載のマウスＳＷ－オプシンのアミノ酸配列に対して少なくとも８７％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＳＷ－オプシンをコードするヌクレオチド配列を含む、第２の核酸とを、
前記個体へ投与する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記ＳＷ－オプシンが、マウスＳＷ－オプシンの細胞内ドメイン及びヒトＳＷ－オプシンの膜貫通ドメインを含むキメラＳＷ－オプシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記キメラＳＷ－オプシンが、配列番号７に記載のキメラＳＷ－オプシンのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記網膜細胞における前記ＭＷ－オプシン及び／または前記ＬＷ－オプシン及び／または前記ＳＷ－オプシンの発現が、前記個体によるパターン化された視覚及び像認識を提供する、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
前記像認識が静止像またはパターンの像認識である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記像認識が移動像またはパターンの像認識である、請求項７に記載の方法。
【請求項10】
前記網膜細胞における前記ＭＷ－オプシン及び／または前記ＬＷ－オプシン及び／または前記ＳＷ－オプシンの発現が、約１０－４Ｗ／ｃｍ２～約１Ｗ／ｃｍ２の光強度における像認識を提供する、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記網膜細胞における前記ＭＷ－オプシン及び／または前記ＬＷ－オプシン及び／または前記ＳＷ－オプシンの発現が、網膜細胞にチャネルロドプシンポリペプチドを発現している個体による像認識の提供に必要な光強度の少なくとも１０倍低い光強度における像認識を提供する、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記網膜細胞における前記ＭＷ－オプシン及び／または前記ＬＷ－オプシン及び／または前記ＳＷ－オプシンの発現が、ロドプシンポリペプチドによって網膜細胞に与えられた反応速度の少なくとも２倍速い反応速度を提供する、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
前記核酸が組換え発現ベクターである、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
前記組換え発現ベクターが組換えウイルスベクターである、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記組換えウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターである、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記ヌクレオチド配列が、網膜細胞において機能する転写調節因子に作動可能に連結されている、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
前記転写調節因子が網膜細胞特異的プロモーターである、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記プロモーターが、シナプシンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ｇｒｍ６プロモーター、Ｐｌｅｉａｄｅｓプロモーター、ＣｈＡＴプロモーター、Ｖ－ｇｌｕｔプロモーター、ＧＡＤプロモーター、ＰＶプロモーター、ソマトスタチン（ＳＳＴ）プロモーター、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）プロモーター、ＶＩＰプロモーター、赤錐体オプシンプロモーター、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼプロモーター、卵黄状黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）遺伝子プロモーター、または光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）遺伝子プロモーターである、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記投与工程が眼球内注射を介する、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項20】
前記投与工程が硝子体内注射を介する、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
前記投与工程が網膜下注射を介する、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
前記個体が、網膜色素変性症、黄斑変性、網膜分離症及びレーバー先天性黒内障ならびに糖尿病網膜症から選択される眼疾患を有する、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項23】
前記個体が、外傷または頭部損傷による網膜剥離または光受容体の喪失を経験している、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項24】
前記核酸がナノ粒子と複合体を形成する、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項25】
中波長オプシン（ＭＷ－オプシン）及び／または長波長オプシン（ＬＷ－オプシン）及び／または短波長オプシン（ＳＷ－オプシン）をコードするヌクレオチド配列を含む、組換えウイルスベクター。
【請求項26】
アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項２５に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項27】
前記ＭＷ－オプシンが、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記ＬＷ－オプシンが、配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び
前記ＳＷ－オプシンが、配列番号５～７のうちの１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８７％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項２５または２６に記載の組換えウイルスベクター。
前記ＬＷ－オプシンが、配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び
前記ＳＷ－オプシンが、配列番号５～７のうちの１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８７％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項２５または２６に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項28】
前記ヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、請求項２５～２７のいずれか１項に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項29】
前記プロモーターが、シナプシンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ｇｒｍ６プロモーター、Ｐｌｅｉａｄｅｓプロモーター、ＣｈＡＴプロモーター、Ｖ－ｇｌｕｔプロモーター、ＧＡＤプロモーター、ＰＶプロモーター、ソマトスタチン（ＳＳＴ）プロモーター、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）プロモーター、ＶＩＰプロモーター、赤錐体オプシンプロモーター、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼプロモーター、卵黄状黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）遺伝子プロモーター、または光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）遺伝子プロモーターである、請求項２８に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項30】
野生型ＡＡＶカプシドと比較して向上した網膜細胞の感染性を付与しかつ／または向上した内境界膜を通過する能力を付与する変異体カプシドポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶベクターである、請求項２５～２９のいずれか１項に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項31】
（ａ）請求項２５～３０のいずれか１項に記載の組換えウイルスベクターと、
（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤と
を含む、医薬組成物。
（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤と
を含む、医薬組成物。
【請求項32】
個体における視機能を回復または強化する方法であって、
請求項２５～３０のいずれか１項に記載の組換えウイルスベクターまたは請求項３１に記載の医薬組成物を前記個体に投与する工程を含み、
前記投与工程が、前記個体の網膜細胞における前記ＭＷ－オプシン及び／または前記ＬＷ－オプシン及び／または前記ＳＷ－オプシンの発現ならびに視機能の回復または強化を提供する、
前記方法。
請求項２５～３０のいずれか１項に記載の組換えウイルスベクターまたは請求項３１に記載の医薬組成物を前記個体に投与する工程を含み、
前記投与工程が、前記個体の網膜細胞における前記ＭＷ－オプシン及び／または前記ＬＷ－オプシン及び／または前記ＳＷ－オプシンの発現ならびに視機能の回復または強化を提供する、
前記方法。
【請求項33】
配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８７％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むマウスＳＷ－オプシンの細胞内部分と、
配列番号５に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８７％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むヒトＳＷ－オプシンの膜貫通部分と
を含む、キメラＳＷ－オプシン。
配列番号５に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８７％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むヒトＳＷ－オプシンの膜貫通部分と
を含む、キメラＳＷ－オプシン。
【請求項34】
配列番号７に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載のキメラＳＷ－オプシン。
【請求項35】
請求項３３または請求項３４に記載のキメラＳＷ－オプシンをコードするヌクレオチド配列を含む、組換え発現ベクター。
【請求項36】
（ａ）請求項３５に記載の組換え発現ベクターと、
（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤と
を含む、組成物。
（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤と
を含む、組成物。
【請求項37】
１つまたは複数の錐体オプシンをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の組換え核酸ベクターを含む組成物であって、
前記１つまたは複数のヌクレオチド配列が、それを必要とする対象の眼内で発現されると、前記対象が、空間的パターン弁別試験において垂直線を含む像と水平線を含む像とを区別できる、
前記組成物。
前記１つまたは複数のヌクレオチド配列が、それを必要とする対象の眼内で発現されると、前記対象が、空間的パターン弁別試験において垂直線を含む像と水平線を含む像とを区別できる、
前記組成物。
【請求項38】
１つまたは複数の錐体オプシンをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の組換え核酸ベクターを含む組成物であって、
前記１つまたは複数のヌクレオチド配列が、それを必要とする対象の眼内で発現されると、前記対象が、空間的パターン弁別試験において静止線を含む像と移動線を含む像とを区別できる、
前記組成物。
前記１つまたは複数のヌクレオチド配列が、それを必要とする対象の眼内で発現されると、前記対象が、空間的パターン弁別試験において静止線を含む像と移動線を含む像とを区別できる、
前記組成物。
【請求項39】
１つまたは複数の錐体オプシンをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の組換え核酸ベクターを含む組成物であって、
前記１つまたは複数のヌクレオチド配列が、それを必要とする対象の眼内で発現されると、前記対象が、時間的光パターン試験においてフラッシュ光と定常光とを区別できる、
前記組成物。
前記１つまたは複数のヌクレオチド配列が、それを必要とする対象の眼内で発現されると、前記対象が、時間的光パターン試験においてフラッシュ光と定常光とを区別できる、
前記組成物。
【請求項40】
１つまたは複数の錐体オプシンをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の組換え核酸ベクターを含む組成物であって、
前記１つまたは複数のヌクレオチド配列が、それを必要とする対象の眼内で発現されると、前記対象が、像認識試験において約１０－４Ｗ／ｃｍ２～約１０Ｗ／ｃｍ２の光強度における像を認識できる、
前記組成物。
前記１つまたは複数のヌクレオチド配列が、それを必要とする対象の眼内で発現されると、前記対象が、像認識試験において約１０－４Ｗ／ｃｍ２～約１０Ｗ／ｃｍ２の光強度における像を認識できる、
前記組成物。
【請求項41】
１つまたは複数の錐体オプシンをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の組換え核酸ベクターを含む組成物であって、
前記１つまたは複数のヌクレオチド配列が、それを必要とする対象の眼内で発現されると、前記対象が、光回避試験において白色光を有する区域と白色光のない区域とを区別できる、
前記組成物。
前記１つまたは複数のヌクレオチド配列が、それを必要とする対象の眼内で発現されると、前記対象が、光回避試験において白色光を有する区域と白色光のない区域とを区別できる、
前記組成物。
【請求項42】
前記１つまたは複数の錐体オプシンが、
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＭＷ－オプシン、
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＷ－オプシン、
（ｃ）配列番号５に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＳＷ－オプシン、ならびに
（ｄ）（ｉ）配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８７％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むマウスＳＷ－オプシンの細胞内部分、及び
（ｉｉ）配列番号５に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８７％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むヒトＳＷ－オプシンの膜貫通部分
を含むキメラＳＷ－オプシン
からなる群から選択される、請求項３７～４１のいずれか１項に記載の組成物。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＭＷ－オプシン、
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＷ－オプシン、
（ｃ）配列番号５に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＳＷ－オプシン、ならびに
（ｄ）（ｉ）配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８７％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むマウスＳＷ－オプシンの細胞内部分、及び
（ｉｉ）配列番号５に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８７％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むヒトＳＷ－オプシンの膜貫通部分
を含むキメラＳＷ－オプシン
からなる群から選択される、請求項３７～４１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項43】
前記１つまたは複数の組換え核酸ベクターが、２つの異なる錐体オプシンをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、請求項３７～４１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項44】
前記１つまたは複数の組換え核酸ベクターが、３つの異なる錐体オプシンをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、請求項３７～４１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項45】
前記１つまたは複数の組換え核酸ベクターが、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターである、請求項３７～４４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項46】
前記１つまたは複数の組換え核酸ベクターが組換えアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項３７～４４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項47】
前記組換えＡＡＶベクターが、野生型ＡＡＶカプシドと比較して向上した網膜細胞の感染性を付与しかつ／または向上した内境界膜を通過する能力を付与する変異体カプシドポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項４６に記載の組成物。
【請求項48】
前記１つまたは複数のヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、請求項３７～４７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項49】
前記プロモーターが、シナプシンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ｇｒｍ６プロモーター、Ｐｌｅｉａｄｅｓプロモーター、ＣｈＡＴプロモーター、Ｖ－ｇｌｕｔプロモーター、ＧＡＤプロモーター、ＰＶプロモーター、ソマトスタチン（ＳＳＴ）プロモーター、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）プロモーター、ＶＩＰプロモーター、赤錐体オプシンプロモーター、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼプロモーター、卵黄状黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）遺伝子プロモーター、または光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）遺伝子プロモーターである、請求項４８に記載の組成物。
【請求項50】
前記対象が、網膜色素変性症、黄斑変性、網膜分離症及びレーバー先天性黒内障ならびに糖尿病網膜症から選択される眼疾患を有する、請求項３７～４９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項51】
前記対象が、外傷または頭部損傷による網膜剥離または光受容体の喪失を経験している、請求項３７～４９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項52】
薬学的に許容可能な賦形剤を含む、請求項３７～５１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項53】
前記薬学的に許容可能な賦形剤が生理食塩水を含む、請求項５２に記載の組成物。
【請求項54】
無菌である、請求項３７～５３のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
相互参照
本出願は、２０１７年１１月１３日出願の米国仮特許出願第６２／５８５，２３７号、２０１７年１１月２１日出願の米国仮特許出願第６２／５８９，４７６号及び２０１８年３月１２日出願の米国仮特許出願第６２／６４１，７８３号の利益を主張し、各出願は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１７年１１月１３日出願の米国仮特許出願第６２／５８５，２３７号、２０１７年１１月２１日出願の米国仮特許出願第６２／５８９，４７６号及び２０１８年３月１２日出願の米国仮特許出願第６２／６４１，７８３号の利益を主張し、各出願は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
本発明は、国立衛生研究所により付与されたＥＹ０１８２４１の下、政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所により付与されたＥＹ０１８２４１の下、政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【0003】
序論
遺伝性及び加齢性の網膜変性疾患は、桿体光受容体及び錐体光受容体の進行性の喪失を引き起こし、完全な失明をもたらす。視覚に必要な光感知細胞の喪失にもかかわらず、網膜内の下流の神経細胞は機能状態で生存しており、光遺伝学的治療の標的を提供している。これまで、光遺伝学的アプローチは、ａ）微生物オプシン及び化学修飾した哺乳類受容体における非常に低い光感受性、ｂ）網膜オプシンにおける非常に遅い反応速度、ならびにｃ）非常に幅広い範囲の周囲光レベルにわたり高感度である生来の視覚を提供する適応機構の欠如を含む、ある種の制限に直面してきた。
遺伝性及び加齢性の網膜変性疾患は、桿体光受容体及び錐体光受容体の進行性の喪失を引き起こし、完全な失明をもたらす。視覚に必要な光感知細胞の喪失にもかかわらず、網膜内の下流の神経細胞は機能状態で生存しており、光遺伝学的治療の標的を提供している。これまで、光遺伝学的アプローチは、ａ）微生物オプシン及び化学修飾した哺乳類受容体における非常に低い光感受性、ｂ）網膜オプシンにおける非常に遅い反応速度、ならびにｃ）非常に幅広い範囲の周囲光レベルにわたり高感度である生来の視覚を提供する適応機構の欠如を含む、ある種の制限に直面してきた。
【0004】
当該技術分野において、眼疾患治療のための改良された光遺伝学的アプローチが必要とされている。
【発明の概要】
【0005】
概要
本開示は、個体における視機能を回復または強化する方法を提供し、方法は、中波長錐体オプシン（ＭＷ－オプシン）、長波長錐体オプシン（ＬＷ－オプシン）及び短波長錐体オプシン（ＳＷ－オプシン）のうちの１つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を個体に投与する工程を含む。ＭＷ－オプシン、ＬＷ－オプシン及びＳＷ－オプシンのうちの１つまたは複数を個体の網膜細胞に発現させ、それによって視機能を回復または強化する。
本開示は、個体における視機能を回復または強化する方法を提供し、方法は、中波長錐体オプシン（ＭＷ－オプシン）、長波長錐体オプシン（ＬＷ－オプシン）及び短波長錐体オプシン（ＳＷ－オプシン）のうちの１つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を個体に投与する工程を含む。ＭＷ－オプシン、ＬＷ－オプシン及びＳＷ－オプシンのうちの１つまたは複数を個体の網膜細胞に発現させ、それによって視機能を回復または強化する。
【図面の簡単な説明】
【0006】
【図1】ＭＷ－オプシンまたはロドプシンの光による活性化がＧＩＲＫチャネルを作動させ、外部高カリウムにおいて負の保持電位で、内向き光電流を生成することを示す。
【図2】桿体及び錐体が変性したｒｄ１マウスから単離した網膜におけるタンパク質発現及び光応答を示す。図２ａ～図２ｄは網膜細胞におけるＭＷ－オプシン発現を示し、図２ｅ～図２ｇはＭＷ－オプシンによって媒介される光誘発応答を示す。
【図3】盲目のｒｄ１マウスから単離した網膜細胞内のＭＷ－オプシンまたはロドプシンの光応答のタイミング、大きさ及び高感度を示す。
【図4】図４ａ～４ｃは、ｒｄ１マウスの網膜細胞内のＭＷ－オプシン及びロドプシンによって媒介される明暗を区別する同等の能力を立証する行動試験を示し、図４ｄ～４ｅは、しかしながら、動物におけるフラッシュと定常光の区別はＭＷ－オプシンのみによって可能となることを示し、図４ｆ～４ｇは、動物における様々な空間的光パターン間の区別はＭＷ－オプシンのみによって可能となることを示す。図４ｈ～４ｉは、ＭＷ－オプシンはまた、静止像としてまたは動いている状態で呈示される、間隔の異なる平行線間における野生型レベルの線の区別も補助することを示す。
【図6】ＭＷ－オプシン、ＬＷ－オプシン及びＳＷ－オプシンによる、１ｃｍの間隔の平行線対６ｃｍの間隔の平行線を区別する能力の回復を立証する行動試験を示す。
【図7】正常視覚と比較した、盲目網膜における光遺伝学系の閾値応答を示す。
【図8】ＭＷ－オプシンによって媒介される強度依存的反応速度の応答を示す。
【図9】光回避及び学習したパターンの弁別行動を示す。
【図10】切除した網膜及び行動マウスにおける明順応を示す。
【図11】光回避及び学習した視覚誘導行動の統計学的有意性を示す表１を提供する。
【図12A】ヒトＳＷ－オプシンのアミノ酸配列のアライメント（配列番号５）及びマウスＳＷ－オプシンのアライメント（配列番号６）ならびにまたヒト／マウスキメラＳＷ－オプシンのアミノ酸配列の一例（配列番号７）を提供する。ヒトＳＷ－オプシン及びヒト／マウスキメラＳＷ－オプシンの膜貫通（ＴＭ）ドメインを下線で示し、マウスＳＷ－オプシン及びヒト／マウスキメラＳＷ－オプシンの細胞内ドメインを二重下線で示す。
【図12B】ヒトＳＷ－オプシンのアミノ酸配列のアライメント（配列番号５）及びマウスＳＷ－オプシンのアライメント（配列番号６）ならびにまたヒト／マウスキメラＳＷ－オプシンのアミノ酸配列の一例（配列番号７）を提供する。ヒトＳＷ－オプシン及びヒト／マウスキメラＳＷ－オプシンの膜貫通（ＴＭ）ドメインを下線で示し、マウスＳＷ－オプシン及びヒト／マウスキメラＳＷ－オプシンの細胞内ドメインを二重下線で示す。
【図13】ＭＷ－オプシンによる視覚誘導探索行動の回復を示す。
【図14】ｒｄ１マウスの網膜におけるＭＷ－オプシンの発現を示す。
【図15】ｒｄ１マウスの網膜におけるロドプシンの発現を示す。
【図16】ｒｄ１網膜におけるＭＷ－オプシンの形質導入効率を示す。
【図17】ＭＷ－オプシン発現ｒｄ１網膜における光応答の遅い成分の特性評価を示す。
【図18】ＭＷ－オプシン発現ｒｄ１マウスの単離した網膜におけるコントラスト検出を示す。
【図19】ＭＷ－オプシン発現ｒｄ１マウスのＶ１におけるｉｎ ｖｉｖｏ光応答を示す。
【図20】ＭＷ－オプシン発現ｒｄ１マウスのｉｎ ｖｉｖｏコントラスト検出を示す。
【図21】ＭＷ－オプシン発現ｒｄ１マウスのｉｎ ｖｉｖｏにおけるＶ１応答の時間的特性を示す。
【図22】弁別課題における位置嗜好性を示す。
【発明を実施するための形態】
【0007】
定義
本明細書において、「網膜細胞」という用語は、網膜を構成する任意の細胞型、例えば、網膜神経節細胞、アマクリン細胞、水平細胞、双極細胞ならびに桿体及び錐体を含む光受容体細胞などを指し得る。
本明細書において、「網膜細胞」という用語は、網膜を構成する任意の細胞型、例えば、網膜神経節細胞、アマクリン細胞、水平細胞、双極細胞ならびに桿体及び錐体を含む光受容体細胞などを指し得る。
【0008】
「作動的に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」または「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、遺伝要素の並置を指し、これらの要素は、予測される様式でそれらが機能することが可能となる関係にある。例えば、プロモーターは、そのプロモーターがコード配列の転写開始を助ける場合、そのコード領域に作動的に連結されている。この機能的関係が維持される限り、プロモーターとコード領域との間に介在残基が存在してもよい。
【0009】
「発現ベクター」は、目的ポリペプチドをコードする領域を含むベクターであり、対象とする標的細胞におけるタンパク質の発現を生じさせるために使用される。発現ベクターは、標的におけるタンパク質の発現を促進するためにコード領域に作動的に連結された制御因子も含む。制御因子と、発現のために制御因子が作動可能に連結される１つまたは複数の遺伝子との組み合わせは、「発現カセット」と称されることもあり、その多くは当該技術分野で既知であり、かつ入手可能であるか、または当該技術分野で入手可能な構成要素から容易に構築され得る。
【0010】
本明細書で使用する場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などの用語は、所望の薬理学的作用及び／または生理学的作用を得ることを指す。こうした作用は、その疾患もしくは症状を完全にもしくは部分的に予防するという観点から予防的であり得、及び／または疾患及び／またはその疾患に起因する有害な影響を部分的にもしくは完全に治癒させるという観点から治療的であり得る。本明細書で使用する場合、「治療」は、哺乳類、具体的にはヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、（ａ）疾患にかかりやすいか、またはその疾患にかかる危険性を有し得るが、まだその疾患を有すると診断されていない対象における疾患の発症を予防すること、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、その発現を阻止すること、（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち疾患の退行をもたらすこと、及び（ｄ）疾患に起因して喪失した機能を置換することを含む。
【0011】
「個体」、「宿主」、「対象」、及び「患者」という用語は、本明細書で互換的に使用され、ヒト及び非ヒト霊長類（サル及びヒトを含む）、哺乳類の競技用動物（例えば、ウマ、ラクダなど）、哺乳類の家畜（例えば、ヒツジ、ヤギ、雌ウシなど）、哺乳類のペット（イヌ、ネコなど）、ならびにげっ歯類（例えば、マウス、ラットなど）を含むがこれらに限定されない哺乳類を指す。場合によっては、個体はヒトである。
【0012】
本発明をさらに説明する前に、本発明は記載される特定の実施形態に限定されず、したがって、言うまでもなく変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定するものとしては意図されないことも理解されたい。
【0013】
値の範囲が与えられる場合、文脈上別途明確に示されない限り、その範囲の上限値と下限値との間に存在する、下限値の１０分の１の単位までの各介在値と、その記載範囲の任意の他の記載値または介在値とが本発明に包含されると理解される。これらのより小さい範囲の上限値及び下限値は、そのより小さい範囲内に独立して含まれてもよく、また、記載範囲における任意の具体的な除外限度に従って、これらのより小さい範囲の上限値及び下限値も本発明に包含される。記載範囲が１つまたは両方の限界値を含む場合、それらの含まれる限界値の片方または両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。
【0014】
他に特段の定めのない限り、本明細書中で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載の方法及び材料と同様もしくは同等の任意の方法及び材料を、本発明の実施または試験において使用することもできるが、好ましい方法及び材料をこれより説明する。本明細書で言及するすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれ、それらの刊行物の引用に関連した方法及び／または材料を開示し説明する。
【0015】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、文脈上別途明確に示されない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「ＭＷ－オプシンポリペプチド（ａｎ ＭＷ－ｏｐｓｉｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」への言及は、複数のそのようなポリペプチドを含み、「網膜の（ｔｈｅ ｒｅｔｉｎａｌ）」への言及は、１つまたは複数の網膜細胞及び当業者に既知のそれらの等価物などへの言及を含む。特許請求の範囲は、任意のあらゆる要素を除外するように作成されてもよいことにさらに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の記載に関連する「単に」、「のみ」などの排他的用語の使用、または「否定的な」制限の使用のための先行する基準として機能することが意図される。
【0016】
明確にするために別個の実施形態の文脈において説明される本発明のある特徴を、単一の実施形態における組み合わせで提供してもよいことが理解される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈において説明される本発明の様々な特徴を、別々に、または任意の好適な副組み合わせで提供してもよい。本発明に関連する実施形態のすべての組み合わせは、本発明によって明確に包含され、ありとあらゆる組み合わせが個別にかつ明示的に開示されたかのように、本明細書に開示される。さらに、様々な実施形態及びそれらの要素のすべての副組み合わせも本発明によって明確に包含され、ありとあらゆるそのような副組み合わせが個別にかつ明示的に本明細書に開示されたかのように、本明細書に開示される。
【0017】
本明細書で論じられる刊行物は、単に、本出願の出願日より前にそれらの開示が提供されているにすぎない。本明細書におけるいかなる内容も、本発明が先行発明により、そのような刊行物に先行する権利を有さないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の刊行日とは異なる場合があり、個別に確認する必要があり得る。
【0018】
詳細な説明
本開示は、個体における視機能を回復または強化する方法を提供し、方法は、中波長錐体オプシン（ＭＷ－オプシン）、長波長錐体オプシン（ＬＷ－オプシン）及び短波長錐体オプシン（ＳＷ－オプシン）のうちの１つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を個体に投与する工程を含む。ＭＷ－オプシン、ＬＷ－オプシン及びＳＷ－オプシンのうちの１つまたは複数を個体の網膜細胞に発現させ、それによって視機能を回復または強化する。
本開示は、個体における視機能を回復または強化する方法を提供し、方法は、中波長錐体オプシン（ＭＷ－オプシン）、長波長錐体オプシン（ＬＷ－オプシン）及び短波長錐体オプシン（ＳＷ－オプシン）のうちの１つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を個体に投与する工程を含む。ＭＷ－オプシン、ＬＷ－オプシン及びＳＷ－オプシンのうちの１つまたは複数を個体の網膜細胞に発現させ、それによって視機能を回復または強化する。
【0019】
ＭＷ－オプシンポリペプチドは、下記のヒトＭＷ－オプシンのアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【0020】
ＭＷ－オプシンポリペプチドは、下記のマウスＭＷ－オプシンのアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【0021】
ロドプシンポリペプチドは、下記のロドプシンのアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【0022】
チャネルロドプシンポリペプチドは、下記のチャネルロドプシンのアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【0023】
ＬＷ－オプシンは、下記のヒトＬＷ－オプシンのアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【0024】
ＬＷ－オプシンは、下記のマウスＬＷ－オプシンのアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【0025】
ＳＷ－オプシンポリペプチドは、下記のヒトＳＷ－オプシンのアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【0026】
場合によっては、ヒトＳＷ－オプシン（配列番号５）に対して少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＳＷ－オプシンは、可視領域の光に応答し、興奮性活動を示す。
【0027】
ＳＷ－オプシンポリペプチドは、下記のマウスＳＷ－オプシンのアミノ酸配列に対して少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
場合によっては、マウスＳＷ－オプシン（配列番号６）に対して少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＳＷ－オプシンは、紫外領域の光に応答し、抑制性活動を示す。
【0028】
場合によっては、ヒトＳＷ－オプシン及びマウスＳＷ－オプシンの双方が個体の網膜細胞内で生成される。場合によっては、ヒトＳＷ－オプシン及びマウスＳＷ－オプシン（ただしＬＷ－オプシンまたはＭＷ－オプシンではない）の双方が個体の網膜細胞内で生成される。場合によっては、ヒトＳＷ－オプシン及びマウスＳＷ－オプシンの双方、ならびにＬＷ－オプシン（ただしＭＷ－オプシンではない）が個体の網膜細胞内で生成される。場合によっては、ヒトＳＷ－オプシン及びマウスＳＷ－オプシンの双方、ならびにＭＷ－オプシン（ただしＬＷ－オプシンではない）が個体の網膜細胞内で生成される。場合によっては、ヒトＳＷ－オプシン及びマウスＳＷ－オプシンの双方、ならびにＬＷ－オプシン及びＭＷ－オプシンが個体の網膜細胞内で生成される。例えば、場合によっては、ヒトＳＷ－オプシン（配列番号５）に対して少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＳＷ－オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の組換え発現ベクターと、マウスＳＷ－オプシン（配列番号６）に対して少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＳＷ－オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む別の第１の組換え発現ベクターとを、網膜細胞へと導入する。
【0029】
場合によっては、ＭＷ－オプシン及びＬＷ－オプシン（ただしＳＷ－オプシンではない）の双方が個体の網膜細胞内で生成される。場合によっては、ＭＷ－オプシン及びＳＷ－オプシン（ただしＬＷ－オプシンではない）の双方が個体の網膜細胞内で生成される。場合によっては、ＭＷ－オプシン、ＬＷ－オプシン及びＳＷ－オプシンが個体の網膜細胞内で発現される。
【0030】
場合によっては、好適なオプシンはキメラオプシンであり、例えば、第１の種に由来するアミノ酸配列（複数可）及び第２の種に由来するアミノ酸配列（複数可）を含むオプシンである。例えば、場合によっては、キメラオプシンはマウスＳＷ－オプシンの細胞内部分及びヒトＳＷ－オプシンの膜貫通部分を含む。好適なキメラＳＷ－オプシンの例を図１２Ａ～１２Ｂに示す。
【0031】
場合によっては、好適なキメラＳＷ－オプシンは、下記のアミノ酸配列を有する図１２Ａ～１２Ｂに示すキメラＳＷ－オプシンのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0032】
ＭＷ－オプシン及び／またはＬＷ－オプシン及び／またはＳＷ－オプシンは、異種オプシン、例えば、藻類オプシン、古細菌オプシンまたはそれらの変異体などの非哺乳類オプシンと組み合わせて使用することができる。好適な異種オプシンとしては、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のチャネルロドプシン ＣｈＲ２（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ ４４６：６３３；ＧｅｎＢａｎｋ ＡＢＯ６４３８６．１）、ステップ関数型オプシン（ＳＦＯ）タンパク質（Ｂｅｒｎｄｔ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２：２２９）または安定化ステップ関数型オプシン（ＳＳＦＯ）タンパク質（ＷＯ２０１０／０５６９７０；Ｙｉｚｈａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ ４７７：１７１）、Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉ由来の陽イオンチャネル（ＶＣｈＲ１－ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：９６１９５７０；米国特許第９，２４９，２００号）、Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉのＶＣｈＲ１タンパク質とＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のＣｈＲ１タンパク質とに由来するＣ１Ｖ１キメラタンパク質（米国特許第９，１７５，０９５号）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のＣｈＲ１タンパク質とＣｈＲ２タンパク質とに由来するＣ１Ｃ２キメラタンパク質（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．９６：１８０３）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来の脱分極性光応答性ポリペプチドの赤色シフトした変異体（そのような光応答性ポリペプチドは「ＲｅａＣｈＲ」と称される）（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６：１４９９）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｎｏｃｔｉｇａｍａ由来のＣｎＣｈＲ２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＨＨ０２１３９）、Ｃｈｌｏｒｏｍｏｎａｓ ｓｕｂｄｉｖｉｓａのＣｓＣｈＲ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＨＨ０２１４４；Ｋｌａｐｏｅｔｋｅ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １１：３３８）タンパク質に由来するＣｓＣｈｒｉｍｓｏｎキメラタンパク質、Ｓｔｉｇｅｏｃｌｏｎｉｕｍ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｍに由来するＳｈＣｈＲ１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＨＨ０２１０６）、「ＣｈＥＴＡ」オプシン（Ｇｕｎａｙｄｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３：３８７）、「ＳｗｉＣｈＲ」タンパク質（ＷＯ２０１５／１４８９７４）、「ｂＲｅａＣｈｅｓ」タンパク質（ＷＯ／２０１７／０４８８０８）及びこれらに類するものなどの脱分極性オプシンが挙げられる。他の好適な脱分極性オプシンは当該技術分野において既知である。例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｃｅｌｌ １４７：１４４６、Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：１２１３、Ｂｅｒｎｄｔ ａｎｄ Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ（２０１５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４９：５９０などを参照のこと。
【0033】
個体の網膜細胞におけるＭＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドの発現は、個体によるパターン化された視覚及び像認識を提供する。像認識は静止像及び／または移動像の像認識であり得る。
【0034】
個体の網膜細胞におけるＭＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドの発現は、約１０－４Ｗ／ｃｍ２～約１０Ｗ／ｃｍ２の光強度における像認識を提供する。例えば、場合によっては、個体の網膜細胞におけるＭＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドの発現は、約１０－２Ｗ／ｃｍ２～約１０－４Ｗ／ｃｍ２、約１０－４Ｗ／ｃｍ２～約１Ｗ／ｃｍ２、約１０－４Ｗ／ｃｍ２～約１０－１Ｗ／ｃｍ２または約１０－４Ｗ／ｃｍ２～約５×１０－１Ｗ／ｃｍ２の光強度における像認識を提供する。場合によっては、個体の網膜細胞におけるＭＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドの発現は、約１０－４Ｗ／ｃｍ２～約１０－３Ｗ／ｃｍ２、約１０－３Ｗ／ｃｍ２～約１０－２Ｗ／ｃｍ２、約１０－２Ｗ／ｃｍ２～約１０－１Ｗ／ｃｍ２または約１０－１Ｗ／ｃｍ２～約１Ｗ／ｃｍ２の光強度における像認識を提供する。場合によっては、個体の網膜細胞におけるＭＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドの発現は、２Ｗ／ｃｍ２まで、３Ｗ／ｃｍ２まで、４Ｗ／ｃｍ２まで、５Ｗ／ｃｍ２まで、または１０Ｗ／ｃｍ２までの光強度における像認識を提供する。個体の網膜細胞におけるＭＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドの発現は、５Ｗ／ｃｍ２未満、４Ｗ／ｃｍ２未満、３Ｗ／ｃｍ２未満または２Ｗ／ｃｍ２未満の光強度における像認識を提供する。
【0035】
個体の網膜細胞におけるＭＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドの発現は、網膜細胞にチャネルロドプシンポリペプチド（例えば、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド）を発現している個体による像認識の提供に必要な光強度の少なくとも１０倍低い光強度における個体による像認識を提供する。例えば、個体の網膜細胞におけるＭＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドの発現は、網膜細胞にチャネルロドプシンポリペプチドを発現している個体による像認識の提供に必要な光強度の少なくとも１０倍低い、少なくとも２５倍低い、少なくとも５０倍低い、少なくとも１００倍低い、少なくとも１５０倍低い、少なくとも２００倍低い、少なくとも３００倍低い、少なくとも４００倍低いまたは少なくとも５００倍低い光強度における個体による像認識を提供する。
【0036】
網膜細胞におけるＭＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドの発現は、ロドプシンポリペプチド（例えば、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド）によって網膜細胞に与えられた反応速度の少なくとも２倍速い反応速度を提供する。例えば、網膜細胞におけるＭＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドの発現は、ロドプシンポリペプチドによって網膜細胞に与えられた反応速度の少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍または１００倍超速い反応速度を提供する。
【0037】
本開示の方法は、ＭＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を個体の眼に送達する工程を含む。場合によっては、ヌクレオチド配列は哺乳類細胞で機能する転写調節因子に作動可能に連結されている。場合によっては、ヌクレオチド配列は網膜細胞における発現をもたらす転写調節因子、例えば、網膜細胞において選択的な発現をもたらす転写調節因子に作動可能に連結されている。場合によっては、ヌクレオチド配列は網膜細胞における発現をもたらすプロモーター、例えば、網膜細胞において選択的な発現をもたらすプロモーターに作動可能に連結されている。場合によっては、ヌクレオチド配列は、一般的に真核細胞または哺乳類細胞における発現をもたらすプロモーターに作動可能に連結されている。
【0038】
好適なプロモーターとしては、ＣＡＧプロモーター（Ｍｉｙａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ ７９：２６９）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、代謝型グルタミン酸受容体６（ｇｒｍ６）プロモーター（Ｃｒｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＥＭＢＯ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６：１１７５）、Ｐｌｅｉａｄｅｓプロモーター（Ｐｏｒｔａｌｅｓ－Ｃａｓａｍａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０７：１６５８９）、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）プロモーター（Ｍｉｓａｗａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２０３９２）、小胞グルタミン酸輸送体（Ｖ－ｇｌｕｔ）プロモーター（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１３７７：１）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）プロモーター（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１１４４：１９；Ｒｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１８：２７）、コレシストキニン（ＣＣＫ）プロモーター（Ｒｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１８：２７）、パルブアルブミン（ＰＶ）プロモーター、ソマトスタチン（ＳＳＴ）プロモーター、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）プロモーター、及び血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。好適なプロモーターとしては、赤錐体オプシンプロモーター、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼプロモーター、及びＧｌｕＲプロモーター（例えば、ｇｒｍ６とも称されるＧｌｕＲ６プロモーター）が挙げられるが、これらに限定されない。好適なプロモーターとしては、卵黄状黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）遺伝子プロモーター、及び光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）遺伝子プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。使用に好適なものにはまた、Ｌ７プロモーター（Ｏｂｅｒｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：２２３）、ｔｈｙ－１プロモーター、リカバリンプロモーター（Ｗｉｅｃｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｈｏｗａｒｄ（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．２６：２５）；カルビンディンプロモーター；及びベータアクチンプロモーターがある。好適なプロモーターには、合成の（非天然由来の）プロモーター／エンハンサーの組み合わせを含む。
【0039】
場合によっては、ＭＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、組換え発現ベクター中に存在する。好適な発現ベクターとしては、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、場合によっては、ＭＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、組換えレンチウイルスベクター、組換えＨＳＶベクター、組換えアデノウイルスベクター、組換えレトロウイルスベクターまたは組換えＡＡＶベクターである。
【0040】
場合によっては、ＭＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（例えば、組換え発現ベクター）は、ナノ粒子と複合体を形成する。
【0041】
場合によっては、ＭＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである。場合によっては、ｒＡＡＶベクターは変異体ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、この変異体ＡＡＶカプシドタンパク質は、網膜細胞の感染性及び／または眼の内境界膜（ＩＬＭ）を通過する能力を付与する。例えば、Ｄａｙ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．８０１：６８７、Ｂｏｙｅ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．９０：４２１５、Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ ａｎｄ Ａｕｒｉｃｃｈｉｏ（２０１２）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １９：１６２、Ｋｌｉｍｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．（２００９）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ４：ｅ７４６７、米国特許公開第２０１２／０１６４１０６号及び米国特許公開第２０１６／００１７２９５号を参照のこと。
【0042】
網膜細胞には、網膜神経節細胞、アマクリン細胞、水平細胞、双極細胞ならびに桿体及び錐体を含む光受容体細胞が含まれる。
【0043】
場合によっては、本開示の方法は、ａ）ＭＷ－オプシン及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（例えば、組換え発現ベクター）とｂ）薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物を、それを必要とする個体に投与する工程を含む。
【0044】
ＭＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（例えば、組換え発現ベクター）を含む医薬組成物は、単独でまたは他の補助的な活性剤と組み合わせて患者に投与され得る。医薬組成物は、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、研和、乳化、カプセル化、封入、及び凍結乾燥を含むがこれらに限定されない、あらゆる種々のプロセスを使用して製造され得る。医薬組成物は、滅菌溶液、懸濁液、乳濁液、凍結乾燥物、錠剤、丸剤、小丸薬、カプセル、散剤、シロップ、エリキシル剤または投与に適した任意の他の剤形を含むがこれらに限定されない、あらゆる種々の形態をとることができる。
【0045】
ＭＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（例えば、組換え発現ベクター）を含む医薬組成物は、活性成分の薬学的に許容可能な組成物への加工を容易にする薬学的に許容可能な担体（複数可）を任意に含むことができる。本明細書で使用する場合、「薬理学的に許容可能な担体」という用語は、投与した際に実質的に長期にわたる悪影響または永続的な悪影響のない任意の担体を指し、「薬理学的に許容可能な溶媒、安定剤、希釈剤、助剤または賦形剤」などの用語を包含する。通常、そのような担体は活性化合物（例えば、本開示の核酸）と混合するか、または活性化合物を希釈もしくは封入することができ、担体は、固体、半固体または液体の作用物質であってよい。活性成分は可溶性であってよく、または所望の担体もしくは希釈剤中の懸濁液として送達され得ることが理解される。任意の種々の薬学的に許容可能な担体を使用することができ、担体には、例えば、蒸留水、脱イオン水、生理食塩水などの水性媒体；溶媒；分散媒；コーティング剤；抗菌剤及び抗真菌剤；等張剤及び吸収遅延剤；または任意の他の不活性成分が含まれるが、これらに限定されない。薬理学的に許容可能な担体の選択は、投与方法に依存し得る。あらゆる薬理学的に許容可能な担体は、活性成分と不適合である場合を除いて、薬理学的に許容可能な組成物におけるその使用が企図される。そのような薬学的担体の特定用途の非限定的な例は、“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ”（Ｈｏｗａｒｄ Ｃ． Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，７ｔｈ ｅｄ．１９９９）、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”（Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄ．， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０ｔｈ ２０００）、“Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”Ｊｏｅｌ Ｇ．Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，１０．ｓｕｐ．ｔｈ ｅｄ．２００１）、及び“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ”（Ｒａｙｍｏｎｄ Ｃ．Ｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．，ＡＰｈＡ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ ２００３）に見ることができる。
【0046】
医薬組成物には、緩衝剤、防腐剤、等張化剤、塩、抗酸化剤、生理的物質、薬理学的物質、充填剤、乳化剤、湿潤剤、甘味剤または矯味剤などを含むがこれらに限定されない他の薬学的に許容可能な成分を、非限定的に任意に含むことができる。ｐＨを調整するための種々の緩衝剤及び方法を、得られる調製物が薬学的に許容可能であることを条件として、医薬組成物の調製に使用することができる。そのような緩衝剤には、酢酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液、中性緩衝食塩水、リン酸塩緩衝食塩水及びホウ酸塩緩衝液が含まれるがこれらに限定されない。必要に応じて、酸または塩基を組成物のｐＨ調整に使用できることが理解される。薬学的に許容可能な抗酸化剤には、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、アセチルシステイン、ブチル化ヒドロキシアニソール、及びブチル化ヒドロキシトルエンが含まれるが、これらに限定されない。有用な防腐剤には、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、チメロサール、酢酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀及び安定化オキシクロロ組成物、例えばＰＵＲＩＴＥ（商標）が含まれるが、これらに限定されない。医薬組成物への含有に適した等張化剤には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどの塩、マンニトールまたはグリセリン及び他の薬学的に許容可能な等張化剤が含まれるが、これらに限定されない。これら及び薬理学の分野において既知の他の物質が、医薬組成物に含まれ得ることが理解される。
【0047】
薬学的に許容可能な担体として機能し得る物質のいくつかの例としては、（１）ラクトース、グルコース、及びスクロースなどの糖類、（２）トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプンなどのデンプン、（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロースなどのセルロースならびにその誘導体、（４）粉末トラガカント、（５）麦芽、（６）ゼラチン、（７）タルク、（８）カカオバター及び坐剤用ワックスなどの賦形剤、（９）ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及び大豆油などの油、（１０）プロピレングリコールなどのグリコール、（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコールなどのポリオール、（１２）オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル、（１３）寒天、（１４）水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤、（１５）アルギン酸、（１６）パイロジェンフリー水、（１７）等張食塩水、（１８）リンガー液、（１９）エチルアルコール、（２０）ｐＨ緩衝液、（２１）ポリエステル、ポリカーボネート及び／またはポリ無水物、ならびに（２２）医薬製剤に用いられる他の非毒性適合性物質が挙げられる。
【0048】
場合によっては、ＭＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（例えば、組換え発現ベクター）は、１つまたは複数の生体適合性ポリマーとともに配合される。好適な生体適合性ポリマーとしては、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ハロゲン化ポリビニル、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン及びそれらのコポリマー、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、アクリル酸及びメタクリル酸エステルのポリマー、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、セルロースアセテート、セルロースプロピオネート、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートフタレート、カルボキシメチルセルロース、セルローストリアセテート、セルロース硫酸ナトリウム塩、ポリメチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）＼ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリビニルアセテート、ポリ塩化ビニル ポリスチレン、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルチン、ポリ無水物、ポリアクリル酸、アルギン酸塩、キトサン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）ならびに前述の任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【0049】
場合によっては、ＭＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（例えば、組換え発現ベクター）は、リポソーム中に配合される。例えば、米国特許公開第２０１７／０１１９６６６号を参照のこと。場合によっては、ＭＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（例えば、組換え発現ベクター）は、ナノ粒子中に配合される。ナノ粒子としては、例えばポリアルキルシアノアクリレートナノ粒子、ポリ（乳酸）を含むナノ粒子、ポリ（乳酸－グリコール酸）共重合体（ＰＬＧＡ）ナノ粒子を含むナノ粒子などが挙げられる。場合によっては、ＭＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（例えば、組換え発現ベクター）は、ハイドロゲル中に配合される。好適なハイドロゲルの成分としては、シルク（例えば、米国特許公開第２０１７／０１７３１６１号を参照のこと）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド－コーグリコシド）（ＰＬＧＡ）、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ホスファジン）、ポリ（リン酸エステル）、ポリカプロラクトン、ゼラチン、コラーゲン、セルロース、ヒアルロナン、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、トリブロックコポリマー、ポリリジン、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（ビニルピロリドン）、ヒアルロン酸、アクリレート化ヒアルロン酸、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0050】
場合によっては、ＭＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（例えば、組換え発現ベクター）を含む組成物は、緩衝生理食塩水中に存在する。場合によっては、ＭＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルス発現ベクターを含む組成物は、緩衝生理食塩水中に約５０μＬ～約１０００μＬの容量で約１０８～約１０１５ウイルスゲノム（ｖｇ）の量で存在する。例えば、場合によっては、ＭＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルス発現ベクターを含む組成物は、緩衝生理食塩水中に、約５０μＬ～約７５μＬ、約７５μＬ～約１００μＬ、約１００μＬ～約１５０μＬ、約１５０μＬ～約２００μＬ、約２００μＬ～約３００μＬ、約３００μＬ～約４００μＬ、約４００μＬ～約５００μＬ、約５００μＬ～約６００μＬ、約６００μＬ～約７００μＬ、約８００μＬ～９００μＬまたは約９００μＬ～約１０００μＬの容量で、約１０８ｖｇ～約１０９ｖｇ、約１０９ｖｇ～約１０１０ｖｇ、約１０１０ｖｇ～約１０１１ｖｇ、約１０１１ｖｇ～約１０１２ｖｇ、約１０１２ｖｇ～約１０１３ｖｇ、約１０１３ｖｇ～約１０１４ｖｇ、または約１０１４ｖｇ～約１０１５ｖｇの量で存在する。場合によっては、ＭＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（例えば、組換え発現ベクター）を含む組成物は、非イオン性界面活性剤を約０．００１％の濃度で含む緩衝生理食塩水中に存在する。好適な非イオン性界面活性剤としては、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（登録商標）が挙げられる。場合によっては、ＭＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルス発現ベクターを含む組成物は、緩衝生理食塩水中に、約５０μＬ～約７５μＬ、約７５μＬ～約１００μＬ、約１００μＬ～約１５０μＬ、約１５０μＬ～約２００μＬ、約２００μＬ～約３００μＬ、約３００μＬ～約４００μＬ、約４００μＬ～約５００μＬ、約５００μＬ～約６００μＬ、約６００μＬ～約７００μＬ、約８００μＬ～９００μＬまたは約９００μＬ～約１０００μＬの容量で、約１０８ｖｇ～約１０９ｖｇ、約１０９ｖｇ～約１０１０ｖｇ、約１０１０ｖｇ～約１０１１ｖｇ、約１０１１ｖｇ～約１０１２ｖｇ、約１０１２ｖｇ～約１０１３ｖｇ、約１０１３ｖｇ～約１０１４ｖｇ、または約１０１４ｖｇ～約１０１５ｖｇの量で存在し、緩衝生理食塩水には、非イオン性界面活性剤が約０．００１％の濃度で含まれる。生理食塩水は、０．９％のＮａＣｌを含み得る。
【0051】
ＭＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（例えば、組換えウイルスベクターなどの組換え発現ベクター）は、任意の種々の投与経路によって、それを必要とする個体に投与することができる。好適な投与経路としては、例えば、眼周囲、眼球内、硝子体内、結膜下、眼球後、強膜内、及び眼房内が挙げられる。場合によっては、ＭＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（例えば、組換え発現ベクター）は、硝子体内注射によって送達される。場合によっては、ＭＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（例えば、組換え発現ベクター）は、眼球内に送達される。場合によっては、ＭＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（例えば、組換え発現ベクター）は、網膜下注射を介して送達される。
【0052】
場合によっては、本開示の方法は、ＭＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（例えば、組換えウイルスベクターなどの組換え発現ベクター）を含む組成物の単回投与（１眼につき）を、それを必要とする個体に投与する工程を含む。
【0053】
場合によっては、ＭＷ－オプシン及び／またはＬＷ－オプシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（例えば、組換え発現ベクター）の複数用量を個体に投与する。投与頻度は、あらゆる種々の要因、例えば症状の重症度などに応じて変更することができる。例えば、場合によっては、ＭＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（例えば、組換え発現ベクター）を、月１回、月２回、月３回、隔週（ｑｏｗ）、週１回（ｑｗ）、週２回（ｂｉｗ）、週３回（ｔｉｗ）、週４回、週５回、週６回、隔日（ｑｏｄ）、毎日（ｑｄ）、１日２回（ｑｉｄ）または１日３回（ｔｉｄ）投与する。
【0054】
ＭＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（例えば、組換え発現ベクター）は、約１日～約１年または１年を超える期間にわたり、個体に投与することができる。例えば、ＭＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（例えば、組換え発現ベクター）は、１週間～２週間、２週間～１ヶ月、１ヶ月～４ヶ月、４ヶ月～６ヶ月、６ヶ月～１年、または１年を超える期間、個体に投与することができる。
【0055】
ヌクレオチド配列を含む核酸が、ＭＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルス発現ベクターである場合、この組換えウイルス発現ベクターを、１用量あたり約１０８ｖｇ～約１０９ｖｇ、約１０９ｖｇ～約１０１０ｖｇ、約１０１０ｖｇ～約１０１１ｖｇ、約１０１１ｖｇ～約１０１２ｖｇ、約１０１２ｖｇ～約１０１３ｖｇ、約１０１３ｖｇ～約１０１４ｖｇ、または約１０１４ｖｇ～約１０１５ｖｇの量で投与することができる。
【0056】
ＭＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（例えば、組換え発現ベクター）を、核酸を投与する前の視機能と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍または１０倍超、個体における視機能を向上させるのに有効な量で投与する。視機能のための試験は当該技術分野において既知であり、任意の既知の試験を視機能の評価に適用することができる。
【0057】
本開示の方法による治療に適切な個体には、桿体光受容体及び錐体光受容体の喪失により視機能が低下した個体が含まれる。場合によっては、個体は、網膜色素変性症、網膜分離症またはレーバー先天性黒内障などの遺伝性の網膜変性疾患を有する。場合によっては、個体は網膜色素変性症、黄斑変性、加齢黄斑変性、網膜分離症及びレーバー先天性黒内障ならびに糖尿病網膜症から選択される眼疾患（例えば、遺伝性眼疾患）を有する。本開示の方法による治療に適切な個体には、生来の光感受性を喪失しそれにより視覚を損傷しているものの、網膜回路の後方の神経細胞（例えば、脳へ出力する双極細胞またはアマクリン介在ニューロンまたは神経節細胞）が温存されており、かつ錐体オプシン（複数可）の導入により光に対し直接的に感受性となり得る、網膜変性状態を有する個体を含む。
【0058】
本開示の方法による治療に適切な個体には、遺伝学的な（ｇｅｎｅｔｉｃ）または遺伝性の（ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ）基礎のない、外傷性または急性の網膜損傷を有する個体を含む。例えば、場合によっては、個体は爆創（例えば、軍事戦において）などの鈍的外傷の結果として生じる網膜剥離、または頭部への衝撃（例えば、頭部に衝撃を与える自動車事故もしくは他の事故の過程において）の結果として生じる網膜剥離を経験している。いくつかの例では、光受容体は下層のＲＰＥからの外傷性網膜剥離によって失われているが、内側の網膜神経細胞はインタクトである。本開示の方法による治療に適切な個体には、急性光障害、レーザー曝露または化学毒性によって光受容体を喪失している個体を含む。
【0059】
組成物
本開示は、１つまたは複数の錐体オプシンをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の組換え核酸ベクターを含む組成物を提供する。組成物がそれを必要とする個体に投与されるとき、１つまたは複数の錐体オプシンをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列が、１つまたは複数の錐体オプシンが対象の眼内で生成されるようにそれを必要とする対象の眼内で発現し、１つまたは複数の有益な臨床結果がもたらされる。例えば、組成物がそれを必要とする個体の眼に投与されるとき、１つまたは複数の錐体オプシンをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列が、１つまたは複数の錐体オプシンが対象の眼内で生成されるようにそれを必要とする対象の眼内で発現し、１つまたは複数の有益な臨床結果がもたらされる。１つまたは複数の錐体オプシンをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列が、１つまたは複数の錐体オプシンが対象の眼内で生成されるようにそれを必要とする対象の眼内で発現するとき、１つまたは複数の有益な臨床結果がもたらされる。有益な臨床結果には以下が含まれる。１）対象は、空間的パターン弁別試験において垂直線を含む像と水平線を含む像とを区別できる、２）対象は、空間的パターン弁別試験において静止線を含む像と移動線を含む像とを区別できる、３）対象は、時間的光パターン試験においてフラッシュ光と定常光とを区別できる、４）対象は、像認識試験において約１０－４Ｗ／ｃｍ２～約１０Ｗ／ｃｍ２の光強度における像を認識できる、及び５）対象は、光回避試験において白色光を有する区域と白色光のない区域とを区別できる。
本開示は、１つまたは複数の錐体オプシンをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の組換え核酸ベクターを含む組成物を提供する。組成物がそれを必要とする個体に投与されるとき、１つまたは複数の錐体オプシンをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列が、１つまたは複数の錐体オプシンが対象の眼内で生成されるようにそれを必要とする対象の眼内で発現し、１つまたは複数の有益な臨床結果がもたらされる。例えば、組成物がそれを必要とする個体の眼に投与されるとき、１つまたは複数の錐体オプシンをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列が、１つまたは複数の錐体オプシンが対象の眼内で生成されるようにそれを必要とする対象の眼内で発現し、１つまたは複数の有益な臨床結果がもたらされる。１つまたは複数の錐体オプシンをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列が、１つまたは複数の錐体オプシンが対象の眼内で生成されるようにそれを必要とする対象の眼内で発現するとき、１つまたは複数の有益な臨床結果がもたらされる。有益な臨床結果には以下が含まれる。１）対象は、空間的パターン弁別試験において垂直線を含む像と水平線を含む像とを区別できる、２）対象は、空間的パターン弁別試験において静止線を含む像と移動線を含む像とを区別できる、３）対象は、時間的光パターン試験においてフラッシュ光と定常光とを区別できる、４）対象は、像認識試験において約１０－４Ｗ／ｃｍ２～約１０Ｗ／ｃｍ２の光強度における像を認識できる、及び５）対象は、光回避試験において白色光を有する区域と白色光のない区域とを区別できる。
【0060】
組成物が１つまたは複数の上記の有益な臨床結果をもたらすか否かは、当該技術分野において既知の試験によって決定できる。例えば、Ｌｅｉｎｏｎｅｎ ａｎｄ Ｔａｎｉｌａ（２０１７） Ｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｉｉ： Ｓ０１６６－４３２８（１７）３０８７０－７、Ｃａｐｏｒａｌｅ ｅｔ ａｌ．（２０１１）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １９，１２１２－９、Ｇａｕｂ ｅｔ ａｌ．（２０１４） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１１， Ｅ５５７４－８３、Ｇａｕｂ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２３：１５６２、及び Ｂｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．８：１８６２を参照のこと。
【0061】
１つもしくは複数の錐体オプシンをコードする１つもしくは複数のヌクレオチド配列を含む１つもしくは複数の組換え核酸ベクターを含む本開示の組成物であって、ｉ）組成物がそれを必要とする個体に投与されるとき、またはｉｉ）１つもしくは複数のヌクレオチド配列がそれを必要とする対象の眼内で発現するように（１つもしくは複数のオプシンが対象の眼内で生成されるように）、組成物がそれを必要とする個体の眼に投与されるとき、対象は、空間的パターン弁別試験において垂直線を含む像と水平線を含む像とを区別できる、組成物。１つまたは複数の錐体オプシンをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の組換え核酸ベクターを含む本開示の組成物であって、１つまたは複数のヌクレオチド配列が、（１つまたは複数のオプシンが対象の眼内で生成されるように）それを必要とする対象の眼内で発現されると、対象は、空間的パターン弁別試験において垂直線を含む像と水平線を含む像とを区別できる、組成物。
【0062】
１つもしくは複数の錐体オプシンをコードする１つもしくは複数のヌクレオチド配列を含む１つもしくは複数の組換え核酸ベクターを含む本開示の組成物であって、ｉ）組成物がそれを必要とする個体に投与されるとき、またはｉｉ）１つもしくは複数のヌクレオチド配列がそれを必要とする対象の眼内で発現するように（１つもしくは複数のオプシンが対象の眼内で生成されるように）、組成物がそれを必要とする個体の眼に投与されるとき、対象は、空間的パターン弁別試験において静止線を含む像と移動線を含む像とを区別できる、組成物。本開示は、１つまたは複数の錐体オプシンをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の組換え核酸ベクターを含む組成物を提供し、該１つまたは複数のヌクレオチド配列が、（１つまたは複数のオプシンが対象の眼内で生成されるように）それを必要とする対象の眼内で発現されると、対象は、空間的パターン弁別試験において静止線を含む像と移動線を含む像とを区別できる。
【0063】
１つもしくは複数の錐体オプシンをコードする１つもしくは複数のヌクレオチド配列を含む１つもしくは複数の組換え核酸ベクターを含む本開示の組成物であって、ｉ）組成物がそれを必要とする個体に投与されるとき、またはｉｉ）１つもしくは複数のヌクレオチド配列がそれを必要とする対象の眼内で発現するように（１つもしくは複数のオプシンが対象の眼内で生成されるように）、組成物がそれを必要とする個体の眼に投与されるとき、対象は、時間的光パターン試験においてフラッシュ光と定常光とを区別できる、組成物。本開示は、１つまたは複数の錐体オプシンをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の組換え核酸ベクターを含む組成物を提供し、該１つまたは複数のヌクレオチド配列が、（１つまたは複数のオプシンが対象の眼内で生成されるように）それを必要とする対象の眼内で発現されると、対象は、時間的光パターン試験においてフラッシュ光と定常光とを区別できる。
【0064】
１つもしくは複数の錐体オプシンをコードする１つもしくは複数のヌクレオチド配列を含む１つもしくは複数の組換え核酸ベクターを含む本開示の組成物であって、ｉ）組成物がそれを必要とする個体に投与されるとき、またはｉｉ）１つもしくは複数のヌクレオチド配列がそれを必要とする対象の眼内で発現するように（１つもしくは複数のオプシンが対象の眼内で生成されるように）、組成物がそれを必要とする個体の眼に投与されるとき、対象は、像認識試験において約１０－４Ｗ／ｃｍ２～約１０Ｗ／ｃｍ２の光強度における像を認識できる、組成物。本開示は、１つまたは複数の錐体オプシンをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の組換え核酸ベクターを含む組成物を提供し、該１つまたは複数のヌクレオチド配列が、（１つまたは複数のオプシンが対象の眼内で生成されるように）それを必要とする対象の眼内で発現されると、対象は、約１０－４Ｗ／ｃｍ２～約１０Ｗ／ｃｍ２の光強度（例えば、約１０－４Ｗ／ｃｍ２～約１０－３Ｗ／ｃｍ２、約１０－３Ｗ／ｃｍ２～約１０－２Ｗ／ｃｍ２、約１０－２Ｗ／ｃｍ２～約１０－１Ｗ／ｃｍ２、または約１０－１Ｗ／ｃｍ２～約１Ｗ／ｃｍ２の光強度）における像を認識できる。場合によっては、個体の網膜細胞におけるＭＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドの発現は、像認識試験において、２Ｗ／ｃｍ２まで、３Ｗ／ｃｍ２まで、４Ｗ／ｃｍ２まで、５Ｗ／ｃｍ２まで、または１０Ｗ／ｃｍ２までの光強度における像認識を提供する。
【0065】
１つもしくは複数の錐体オプシンをコードする１つもしくは複数のヌクレオチド配列を含む１つもしくは複数の組換え核酸ベクターを含む本開示の組成物であって、ｉ）組成物がそれを必要とする個体に投与されるとき、またはｉｉ）１つもしくは複数のヌクレオチド配列がそれを必要とする対象の眼内で発現するように（１つもしくは複数のオプシンが対象の眼内で生成されるように）、組成物がそれを必要とする個体の眼に投与されるとき、対象は、光回避試験において白色光を有する区域と白色光のない区域とを区別できる、組成物。本開示は、１つまたは複数の錐体オプシンをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の組換え核酸ベクターを含む組成物を提供し、該１つまたは複数のヌクレオチド配列が、（１つまたは複数のオプシンが対象の眼内で生成されるように）それを必要とする対象の眼内で発現されると、対象は、光回避試験において白色光を有する区域と白色光のない区域とを区別できる。
【0066】
本開示の組成物中に存在する１つまたは複数の組換え核酸によってコードされ得る錐体オプシンは上述されており、例えば、ＭＷ－オプシン、ＬＷ－オプシン、ＳＷ－オプシン、キメラオプシンなどが挙げられる。
【0067】
場合によっては、本開示の組成物中に存在する１つまたは複数の組換え核酸によってコードされる１つまたは複数の錐体オプシンは、以下からなる群：ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＭＷ－オプシン、ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＷ－オプシン、ｃ）配列番号５に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＳＷ－オプシン、ならびにｄ）ｉ）配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むマウスＳＷ－オプシンの細胞内部分、及びｉｉ）配列番号５に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むヒトＳＷ－オプシンの膜貫通部分を含むキメラＳＷ－オプシンから選択される。
【0068】
場合によっては、本開示の組成物は、単一の錐体オプシンをコードするヌクレオチド配列を含む組換え核酸を含む。場合によっては、本開示の組成物中に存在する１つまたは複数の組換え核酸ベクターは、異なる２つの錐体オプシンをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む。例えば、場合によっては、本開示の組成物中に存在する１つまたは複数の組換え核酸ベクターは、ＭＷ－オプシン及びＬＷ－オプシンをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む。別の例として、場合によっては、本開示の組成物中に存在する１つまたは複数の組換え核酸ベクターは、ＭＷ－オプシン及びＳＷ－オプシンをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む。別の例として、場合によっては、本開示の組成物中に存在する１つまたは複数の組換え核酸ベクターは、ＬＷ－オプシン及びＳＷ－オプシンをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む。２つの異なる錐体オプシンは、単一の組換え核酸上にコードされ得る。２つの異なる錐体オプシンは、２つの別個の組換え核酸上にコードされ得る。
【0069】
場合によっては、本開示の組成物中に存在する１つまたは複数の組換え核酸ベクターは、異なる３つの錐体オプシンをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む。例えば、場合によっては、本開示の組成物中に存在する１つまたは複数の組換え核酸ベクターは、ＭＷ－オプシン、ＳＷ－オプシン及びＬＷ－オプシンをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む。３つの異なる錐体オプシンは、単一の組換え核酸上にコードされ得る。３つの異なる錐体オプシンは、３つの別個の組換え核酸上にコードされ得る。
【0070】
好適な組換え核酸ベクターとしては、組換えアデノ随伴ウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクター、組換え単純ヘルペスウイルスベクター及び組換えレトロウイルスベクターが挙げられる。場合によっては、１つまたは複数の組換え核酸ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルスベクターである。いくつかの例では、組換えＡＡＶベクターは、野生型ＡＡＶカプシドと比較して向上した網膜細胞の感染性を付与しかつ／または向上した内境界膜を通過する能力を付与する変異体カプシドポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【0071】
錐体オプシンをコードするヌクレオチド配列は、１つまたは複数の転写調節因子に作動可能に連結され得る。例えば、錐体オプシンをコードするヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結され得る。好適なプロモーターの例としては、シナプシンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ｇｒｍ６プロモーター、Ｐｌｅｉａｄｅｓプロモーター、ＣｈＡＴプロモーター、Ｖ－ｇｌｕｔプロモーター、ＧＡＤプロモーター、ＰＶプロモーター、ソマトスタチン（ＳＳＴ）プロモーター、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）プロモーター、ＶＩＰプロモーター、赤錐体オプシンプロモーター、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼプロモーター、卵黄状黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）遺伝子プロモーター、及び光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）遺伝子プロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。
【0072】
本開示の組成物は、組成物を必要とする個体に投与される。いくつかの例では、組成物は直接個体の眼にまたは眼内に、例えば、視覚障害により影響を受けている眼に投与される。場合によっては、対象は網膜色素変性症、黄斑変性、網膜分離症及びレーバー先天性黒内障ならびに糖尿病網膜症から選択される眼疾患を有する。場合によっては、対象は外傷または頭部損傷による網膜剥離または光受容体の喪失を経験している。場合によっては、対象は、生来の光感受性を喪失しそれにより視覚を損傷しているものの、網膜回路の後方の神経細胞（例えば、脳へ出力する双極細胞またはアマクリン介在ニューロンまたは神経節細胞）が温存されており、かつ錐体オプシン（複数可）の導入により光に対し直接的に感受性となり得る、網膜変性状態を有する。
【0073】
本開示の組成物には、１つまたは複数の組換え核酸に加えて、薬学的に許容可能な賦形剤を含むことができる。好適な薬学的に許容可能な賦形剤は当該技術分野において既知であり、本開示の他の部分に記載されている。場合によっては、本開示の組成物はヒト対象への投与に適しており、例えば、場合によっては組成物は無菌であり、発熱物質、汚染物質及びこれらに類するものは含まれていない。
【0074】
組換えウイルスベクター
本開示は、ＭＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルスベクターを提供する。好適なウイルス発現ベクターとしては、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、場合によっては、ＭＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルスベクターは、組換えレンチウイルスベクター、組換えＨＳＶベクター、組換えアデノウイルスベクター、組換えレトロウイルスベクターまたは組換えＡＡＶベクターである。
本開示は、ＭＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルスベクターを提供する。好適なウイルス発現ベクターとしては、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、場合によっては、ＭＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルスベクターは、組換えレンチウイルスベクター、組換えＨＳＶベクター、組換えアデノウイルスベクター、組換えレトロウイルスベクターまたは組換えＡＡＶベクターである。
【0075】
場合によっては、ＭＷ－オプシン及び／またはＬＷ－オプシン及び／またはＳＷ－オプシンをコードするヌクレオチド配列は、網膜細胞における発現をもたらすプロモーターに作動可能に連結されている。場合によっては、ヌクレオチド配列は、一般的に真核細胞または哺乳類細胞における発現をもたらすプロモーターに作動可能に連結されている。
【0076】
好適なプロモーターとしては、ＣＡＧプロモーター（Ｍｉｙａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ ７９：２６９）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、代謝型グルタミン酸受容体６（ｇｒｍ６）プロモーター（Ｃｒｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＥＭＢＯ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６：１１７５）、Ｐｌｅｉａｄｅｓプロモーター（Ｐｏｒｔａｌｅｓ－Ｃａｓａｍａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０７：１６５８９）、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）プロモーター（Ｍｉｓａｗａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２０３９２）、小胞グルタミン酸輸送体（Ｖ－ｇｌｕｔ）プロモーター（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１１） Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１３７７：１）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）プロモーター（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１１４４：１９；Ｒｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１８：２７）、コレシストキニン（ＣＣＫ）プロモーター（Ｒｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１８：２７）、パルブアルブミン（ＰＶ）プロモーター、ソマトスタチン（ＳＳＴ）プロモーター、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）プロモーター、及び血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。好適なプロモーターとしては、赤錐体オプシンプロモーター、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼプロモーター、及びＧｌｕＲプロモーター（例えば、ＧｌｕＲ６プロモーター）が挙げられるが、これらに限定されない。好適なプロモーターとしては、卵黄状黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）遺伝子プロモーター、及び光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）遺伝子プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。使用に好適なものにはまた、Ｌ７プロモーター（Ｏｂｅｒｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：２２３）、ｔｈｙ－１プロモーター、リカバリンプロモーター（Ｗｉｅｃｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｈｏｗａｒｄ（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．２６：２５）；カルビンディンプロモーター；及びベータアクチンプロモーターがある。
【0077】
場合によっては、本開示の組換えウイルスベクターは、ＭＷ－オプシン、ＬＷ－オプシン及びＳＷ－オプシンをコードするヌクレオチド配列を含む。場合によっては、ＭＷ－オプシン、ＬＷ－オプシン及びＳＷ－オプシンをコードするヌクレオチド配列は、単一のプロモーターに作動可能に連結されている。場合によっては、組換えウイルスベクターは、ＭＷ－オプシンをコードするヌクレオチド配列とＬＷ－オプシンをコードするヌクレオチド配列との間、及びＬＷ－オプシンをコードするヌクレオチド配列とＳＷ－オプシンをコードするヌクレオチド配列との間に、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む。
【0078】
場合によっては、ＭＷ－オプシン及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルスベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである。場合によっては、ｒＡＡＶベクターは、ｉ）ＭＷ－オプシン及び／またはＬＷ－オプシンポリペプチド及び／またはＳＷ－オプシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ならびにｉｉ）変異体ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、この変異体ＡＡＶカプシドタンパク質は、親野生型ＡＡＶと比較して網膜細胞の感染性及び／または向上した眼の内境界膜（ＩＬＭ）を通過する能力を付与する。例えば、Ｄａｙ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．８０１：６８７、Ｂｏｙｅ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．９０：４２１５、Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ ａｎｄ Ａｕｒｉｃｃｈｉｏ（２０１２）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １９：１６２、Ｋｌｉｍｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．（２００９）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ４：ｅ７４６７、米国特許公開第２０１２／０１６４１０６号及び米国特許公開第２０１６／００１７２９５号を参照のこと。
【0079】
例えば、変異体ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ６カプシドのアミノ酸４５１または他のＡＡＶ血清型の対応する位置にアミノ酸置換を含み得る。場合によっては、ＡＡＶ６カプシドのアミノ酸４５１または他のＡＡＶ血清型の対応する位置のアミノ酸置換は、アスパラギンからアスパラギン酸への置換である。別の例として、変異体ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ６カプシドのアミノ酸５３２または他のＡＡＶ血清型の対応する位置にアミノ酸置換を含み得る。場合によっては、ＡＡＶ６カプシドのアミノ酸５３２または他のＡＡＶ血清型の対応する位置のアミノ酸置換は、アスパラギン酸からアスパラギンへの置換である。
【0080】
ＡＡＶ６カプシドは下記のアミノ酸配列を有し得る。
Ａｓｎ－４５１及びＡｓｐ－５３２を下線付きの太字で示す。
【0081】
場合によっては、ＡＡＶカプシドタンパク質は下記のアミノ酸配列を含む。
【0082】
本開示は、ＭＷ－オプシン及び／またはＬＷ－オプシン及び／またはＳＷ－オプシンを網膜細胞に送達する方法を提供し、方法は、本開示の組換えウイルスベクター（または組換えウイルスベクターを含むウイルス粒子）を個体の眼に投与する工程を含む。組換えウイルスベクター（または組換えウイルスベクターを含むウイルス粒子）の投与後、ＭＷ－オプシンが網膜細胞内で生成される。
【0083】
本開示は、個体における視機能を強化または回復する方法を提供し、方法は、本開示の組換えウイルスベクター（または組換えウイルスベクターを含むウイルス粒子）を個体の眼に投与する工程を含む。組換えウイルスベクター（または組換えウイルスベクターを含むウイルス粒子）の投与後、ＭＷ－オプシン及び／またはＬＷ－オプシン及び／またはＳＷ－オプシンが網膜細胞内で生成される。網膜細胞におけるＭＷ－オプシン及び／またはＬＷ－オプシン及び／またはＳＷ－オプシンの生成は、個体の視機能の強化または回復をもたらす。
【0084】
本開示は、ａ）本開示の組換えウイルスベクターまたは組換えウイルスベクターを含むウイルス粒子とｂ）薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。好適な薬学的に許容可能な賦形剤は上述されている。
【0085】
本開示は、ＭＷ－オプシン及び／またはＬＷ－オプシン及び／またはＳＷ－オプシンを網膜細胞に送達する方法を提供し、方法は、組換えウイルスベクター（または組換えウイルスベクターを含むウイルス粒子）を含む医薬組成物を個体の眼に投与する工程を含む。組換えウイルスベクター（または組換えウイルスベクターを含むウイルス粒子）の投与後、ＭＷ－オプシン及び／またはＬＷ－オプシン及び／またはＳＷ－オプシンが網膜細胞内で生成される。
【0086】
本開示は、個体における視機能を強化または回復する方法を提供し、方法は、本開示の組換えウイルスベクター（または組換えウイルスベクターを含むウイルス粒子）を含む医薬組成物を個体の眼に投与する工程を含む。組換えウイルスベクター（または組換えウイルスベクターを含むウイルス粒子）の投与後、ＭＷ－オプシン及び／またはＬＷ－オプシン及び／またはＳＷ－オプシンが網膜細胞内で生成される。網膜細胞におけるＭＷ－オプシン及び／またはＬＷ－オプシン及び／またはＳＷ－オプシンの生成は、個体の視機能の強化または回復をもたらす。
【0087】
本開示の組換え発現ベクター（または組換えウイルスベクターを含むウイルス粒子）は、任意の種々の投与経路によって、それを必要とする個体に投与することができる。好適な投与経路としては、例えば、眼周囲、眼球内、硝子体内、結膜下、眼球後、強膜内、及び眼房内が挙げられる。場合によっては、本開示の組換え発現ベクター（または組換えウイルスベクターを含むウイルス粒子）は、硝子体内注射によって送達される。場合によっては、本開示の組換え発現ベクター（または組換えウイルスベクターを含むウイルス粒子）は、眼球内に送達される。場合によっては、本開示の組換え発現ベクター（または組換えウイルスベクターを含むウイルス粒子）は、網膜下注射を介して送達される。
【0088】
本開示の方法による治療に適切な個体には、桿体光受容体及び錐体光受容体の喪失により視機能が低下した個体が含まれる。場合によっては、個体は遺伝性の網膜変性疾患を有する。場合によっては、個体は網膜色素変性症、黄斑変性、網膜分離症及びレーバー先天性黒内障ならびに糖尿病網膜症から選択される眼疾患を有する。場合によっては、個体は加齢性の網膜変性疾患を有する。場合によっては、個体は加齢黄斑変性を有する。
【0089】
本開示の非限定的な態様の例
上述した本発明の対象の態様は、実施形態を含めて、単独で、または１つもしくは複数の他の態様もしくは実施形態と組み合わせて有益であり得る。上述した説明を限定するものではないが、本開示のある特定の非限定的な態様を１～５４の番号を付して以下に提供する。本開示を読めば当業者には明らかであるように、個別に番号を付した態様はそれぞれ、先行または後続の個別に番号を付した態様のいずれかとともに使用しても、組み合わせてもよい。これは、態様のすべてのそのような組み合わせに対する支持を提供することを意図するものであり、以下に明示的に提供される態様の組み合わせに限定するものではない。
上述した本発明の対象の態様は、実施形態を含めて、単独で、または１つもしくは複数の他の態様もしくは実施形態と組み合わせて有益であり得る。上述した説明を限定するものではないが、本開示のある特定の非限定的な態様を１～５４の番号を付して以下に提供する。本開示を読めば当業者には明らかであるように、個別に番号を付した態様はそれぞれ、先行または後続の個別に番号を付した態様のいずれかとともに使用しても、組み合わせてもよい。これは、態様のすべてのそのような組み合わせに対する支持を提供することを意図するものであり、以下に明示的に提供される態様の組み合わせに限定するものではない。
【0090】
態様１．個体における視機能を回復または強化する方法であって、中波長オプシン（ＭＷ－オプシン）及び／または長波長オプシン（ＬＷ－オプシン）及び／または短波長オプシン（ＳＷ－オプシン）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を前記個体へ投与する工程を含み、前記投与工程が、前記個体の網膜細胞における前記ＭＷ－オプシン及び／または前記ＬＷ－オプシン及び／または前記ＳＷ－オプシンの発現ならびに視機能の回復または強化を提供する、前記方法。
【0091】
態様２．前記ＭＷ－オプシンが、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＬＷ－オプシンが、配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び前記ＳＷ－オプシンが、配列番号５に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様１に記載の方法。
【0092】
態様３．前記ＳＷ－オプシンが、配列番号５に記載のヒトＳＷ－オプシンのアミノ酸配列に対して少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号６に記載のマウスＳＷ－オプシンのアミノ酸配列に対して少なくとも８７％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様１に記載の方法。
【0093】
態様４．ｉ）配列番号５に記載のヒトＳＷ－オプシンのアミノ酸配列に対して少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＳＷ－オプシンをコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸と、ｉｉ）配列番号６に記載のマウスＳＷ－オプシンのアミノ酸配列に対して少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＳＷ－オプシンをコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸とを、前記個体へ投与する工程を含む、態様１に記載の方法。
【0094】
態様５．前記ＳＷ－オプシンが、マウスＳＷ－オプシンの細胞内ドメイン及びヒトＳＷ－オプシンの膜貫通ドメインを含むキメラＳＷ－オプシンである、態様１に記載の方法。
【0095】
態様６．前記キメラＳＷ－オプシンが、配列番号７に記載のキメラＳＷ－オプシンのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様５に記載の方法。
【0096】
態様７．前記網膜細胞における前記ＭＷ－オプシン及び／または前記ＬＷ－オプシン及び／または前記ＳＷ－オプシンの発現が、前記個体によるパターン化された視覚及び像認識を提供する、態様１～６のいずれか１つに記載の方法。
【0097】
態様８．前記像認識が静止像またはパターンの像認識である、態様７に記載の方法。
【0098】
態様９．前記像認識が移動像またはパターンの像認識である、態様７に記載の方法。
【0099】
態様１０．前記網膜細胞における前記ＭＷ－オプシン及び／または前記ＬＷ－オプシン及び／または前記ＳＷ－オプシンの発現が、約１０－４Ｗ／ｃｍ２～約１Ｗ／ｃｍ２の光強度における像認識を提供する、態様１～９のいずれか１つに記載の方法。
【0100】
態様１１．前記網膜細胞における前記ＭＷ－オプシン及び／または前記ＬＷ－オプシン及び／または前記ＳＷ－オプシンの発現が、網膜細胞にチャネルロドプシンポリペプチドを発現している個体による像認識の提供に必要な光強度の少なくとも１０倍低い光強度における像認識を提供する、態様１～９のいずれか１つに記載の方法。
【0101】
態様１２．前記網膜細胞における前記ＭＷ－オプシン及び／または前記ＬＷ－オプシン及び／または前記ＳＷ－オプシンの発現が、ロドプシンポリペプチドによって網膜細胞に与えられた反応速度の少なくとも２倍速い反応速度を提供する、態様１～９のいずれか１つに記載の方法。
【0102】
態様１３．前記核酸が組換え発現ベクターである、態様１～１２のいずれか１つに記載の方法。
【0103】
態様１４．前記組換え発現ベクターが組換えウイルスベクターである、態様１３に記載の方法。
【0104】
態様１５．前記組換えウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターである、態様１４に記載の方法。
【0105】
態様１６．前記ヌクレオチド配列が、網膜細胞において機能する転写調節因子に作動可能に連結されている、態様１～１５のいずれか１つに記載の方法。
【0106】
態様１７．前記転写調節因子が網膜細胞特異的プロモーターである、態様１６に記載の方法。
【0107】
態様１８．前記プロモーターが、シナプシンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ｇｒｍ６プロモーター、Ｐｌｅｉａｄｅｓプロモーター、ＣｈＡＴプロモーター、Ｖ－ｇｌｕｔプロモーター、ＧＡＤプロモーター、ＰＶプロモーター、ソマトスタチン（ＳＳＴ）プロモーター、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）プロモーター、ＶＩＰプロモーター、赤錐体オプシンプロモーター、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼプロモーター、卵黄状黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）遺伝子プロモーター、または光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）遺伝子プロモーターである、態様１７に記載の方法。
【0108】
態様１９．前記投与工程が眼球内注射を介する、態様１～１８のいずれか１つに記載の方法。
【0109】
態様２０．前記投与工程が硝子体内注射を介する、態様１～１８のいずれか１つに記載の方法。
【0110】
態様２１．前記投与工程が網膜下注射を介する、態様１～１８のいずれか１つに記載の方法。
【0111】
態様２２．前記個体が、網膜色素変性症、黄斑変性、網膜分離症及びレーバー先天性黒内障ならびに糖尿病網膜症から選択される眼疾患を有する、態様１～２１のいずれか１つに記載の方法。
【0112】
態様２３．前記個体が、外傷または頭部損傷による網膜剥離または光受容体の喪失を経験している、態様１～２１のいずれか１つに記載の方法。
【0113】
態様２４．前記核酸がナノ粒子と複合体を形成する、態様１～２３のいずれか１つに記載の方法。
【0114】
態様２５．中波長オプシン（ＭＷ－オプシン）及び／または長波長オプシン（ＬＷ－オプシン）及び／または短波長オプシン（ＳＷ－オプシン）をコードするヌクレオチド配列を含む、組換えウイルスベクター。
【0115】
態様２６．アデノ随伴ウイルスベクターである、態様２５に記載の組換えウイルスベクター。
【0116】
態様２７．前記ＭＷ－オプシンが、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＬＷ－オプシンが、配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び前記ＳＷ－オプシンが、配列番号５～７のうちの１つに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様２５または２６に記載の組換えウイルスベクター。
【0117】
態様２８．前記ヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、態様２５～２７のいずれか１つに記載の組換えウイルスベクター。
【0118】
態様２９．前記プロモーターが、シナプシンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ｇｒｍ６プロモーター、Ｐｌｅｉａｄｅｓプロモーター、ＣｈＡＴプロモーター、Ｖ－ｇｌｕｔプロモーター、ＧＡＤプロモーター、ＰＶプロモーター、ソマトスタチン（ＳＳＴ）プロモーター、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）プロモーター、ＶＩＰプロモーター、赤錐体オプシンプロモーター、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼプロモーター、卵黄状黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）遺伝子プロモーター、または光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）遺伝子プロモーターである、態様２８に記載の組換えウイルスベクター。
【0119】
態様３０．野生型ＡＡＶカプシドと比較して向上した網膜細胞の感染性を付与しかつ／または向上した内境界膜を通過する能力を付与する変異体カプシドポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶベクターである、態様２５～２９のいずれか１つに記載の組換えウイルスベクター。
【0120】
態様３１．ａ）態様２５～３０のいずれか１つに記載の組換えウイルスベクターと、ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤とを含む、医薬組成物。
【0121】
態様３２．個体における視機能を回復または強化する方法であって、態様２５～３０のいずれか１つに記載の組換えウイルスベクターまたは態様３１に記載の医薬組成物を前記個体に投与する工程を含み、前記投与工程が、前記個体の網膜細胞における前記ＭＷ－オプシン及び／または前記ＬＷ－オプシン及び／または前記ＳＷ－オプシンの発現ならびに視機能の回復または強化を提供する、前記方法。
【0122】
態様３３．配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むマウスＳＷ－オプシンの細胞内部分と、配列番号５に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むヒトＳＷ－オプシンの膜貫通部分とを含む、キメラＳＷ－オプシン。
【0123】
態様３４．配列番号７に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様３３に記載のキメラＳＷ－オプシン。
【0124】
態様３５．態様３３または態様３４に記載のキメラＳＷ－オプシンをコードするヌクレオチド配列を含む、組換え発現ベクター。
【0125】
態様３６．ａ）態様３５に記載の組換え発現ベクターと、ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤とを含む、組成物。
【0126】
態様３７．１つまたは複数の錐体オプシンをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の組換え核酸ベクターを含む組成物であって、前記１つまたは複数のヌクレオチド配列が、それを必要とする対象の眼内で発現されると、前記対象が、空間的パターン弁別試験において垂直線を含む像と水平線を含む像とを区別できる、前記組成物。
【0127】
態様３８．１つまたは複数の錐体オプシンをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の組換え核酸ベクターを含む組成物であって、前記１つまたは複数のヌクレオチド配列が、それを必要とする対象の眼内で発現されると、前記対象が、空間的パターン弁別試験において静止線を含む像と移動線を含む像とを区別できる、前記組成物。
【0128】
態様３９．１つまたは複数の錐体オプシンをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の組換え核酸ベクターを含む組成物であって、前記１つまたは複数のヌクレオチド配列が、それを必要とする対象の眼内で発現されると、前記対象が、時間的光パターン試験においてフラッシュ光と定常光とを区別できる、前記組成物。
【0129】
態様４０．１つまたは複数の錐体オプシンをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の組換え核酸ベクターを含む組成物であって、前記１つまたは複数のヌクレオチド配列が、それを必要とする対象の眼内で発現されると、前記対象が、像認識試験において約１０－４Ｗ／ｃｍ２～約１０Ｗ／ｃｍ２の光強度における像を認識できる、前記組成物。
【0130】
態様４１．１つまたは複数の錐体オプシンをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の組換え核酸ベクターを含む組成物であって、前記１つまたは複数のヌクレオチド配列が、それを必要とする対象の眼内で発現されると、前記対象が、光回避試験において白色光を有する区域と白色光のない区域とを区別できる、前記組成物。
【0131】
態様４２．前記１つまたは複数の錐体オプシンが、ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＭＷ－オプシン、ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＷ－オプシン、ｃ）配列番号５に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＳＷ－オプシン、ならびにｄ）ｉ）配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８７％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むマウスＳＷ－オプシンの細胞内部分、及びｉｉ）配列番号５に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８７％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むヒトＳＷ－オプシンの膜貫通部分を含むキメラＳＷ－オプシンからなる群から選択される、態様３７～４１のいずれか１つに記載の組成物。
【0132】
態様４３．前記１つまたは複数の組換え核酸ベクターが、２つの異なる錐体オプシンをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、態様３７～４１のいずれか１つに記載の組成物。
【0133】
態様４４．前記１つまたは複数の組換え核酸ベクターが、３つの異なる錐体オプシンをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、態様３７～４１のいずれか１つに記載の組成物。
【0134】
態様４５．前記１つまたは複数の組換え核酸ベクターが、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターである、態様３７～４４のいずれか１つに記載の組成物。
【0135】
態様４６．前記１つまたは複数の組換え核酸ベクターが組換えアデノ随伴ウイルスベクターである、態様３７～４４のいずれか１つに記載の組成物。
【0136】
態様４７．前記組換えＡＡＶベクターが、野生型ＡＡＶカプシドと比較して向上した網膜細胞の感染性を付与しかつ／または向上した内境界膜を通過する能力を付与する変異体カプシドポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、態様４６に記載の組成物。
【0137】
態様４８．前記１つまたは複数のヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、態様３７～４７のいずれか１つに記載の組成物。
【0138】
態様４９．前記プロモーターが、シナプシンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ｇｒｍ６プロモーター、Ｐｌｅｉａｄｅｓプロモーター、ＣｈＡＴプロモーター、Ｖ－ｇｌｕｔプロモーター、ＧＡＤプロモーター、ＰＶプロモーター、ソマトスタチン（ＳＳＴ）プロモーター、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）プロモーター、ＶＩＰプロモーター、赤錐体オプシンプロモーター、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼプロモーター、卵黄状黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）遺伝子プロモーター、または光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）遺伝子プロモーターである、態様４８に記載の組成物。
【0139】
態様５０．前記対象が、網膜色素変性症、黄斑変性、網膜分離症及びレーバー先天性黒内障ならびに糖尿病網膜症から選択される眼疾患を有する、態様３７～４９のいずれか１つに記載の組成物。
【0140】
態様５１．前記対象が、外傷または頭部損傷による網膜剥離または光受容体の喪失を経験している、態様３７～４９のいずれか１つに記載の組成物。
【0141】
態様５２．薬学的に許容可能な賦形剤を含む、態様３７～５１のいずれか１つに記載の組成物。
【0142】
態様５３．前記薬学的に許容可能な賦形剤が生理食塩水を含む、態様５２に記載の組成物。
【0143】
態様５４．無菌である、態様３７～５３のいずれか１つに記載の組成物。
【実施例0144】
以下の実施例は、当業者に本発明の製造方法及び使用方法の完全な開示及び説明を提供するために提示するものであり、本発明者らが考える発明の範囲を限定することを意図するものではなく、また、以下の実験が実施したすべてまたは唯一の実験であることを表すことを意図するものでもない。使用する数字（例えば、量、温度など）に対して、正確さを確保するための努力がなされているが、いくらかの実験誤差及び偏差は考慮されるべきである。別段の記載がない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧または大気圧付近である。標準的な略語、例えば、ｂｐ、塩基対（複数可）；ｋｂ、キロベース（複数可）；ｐｌ、ピコリットル（複数可）；ｓまたはｓｅｃ、秒（複数可）；ｍｉｎ、分（複数可）；ｈまたはｈｒ、時間（複数可）；ａａ、アミノ酸（複数可）；ｋｂ、キロベース（複数可）；ｂｐ、塩基対（複数可）；ｎｔ、ヌクレオチド（複数可）；ｉ．ｍ．、筋肉内の（筋肉内に）；ｉ．ｐ．、腹腔内の（腹腔内に）；ｓ．ｃ．、皮下の（皮下に）などを使用する場合がある。
【0145】
実施例１：ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの網膜細胞におけるＭＷ－オプシン発現の効果
遺伝性及び加齢性の網膜変性疾患は、桿体光受容体及び錐体光受容体の進行性の喪失を引き起こし、完全な失明をもたらす。視覚に必要な光感知細胞の喪失にもかかわらず、網膜内の下流の神経細胞は機能状態で生存しており、光遺伝学的治療の標的を提供している。これまで、光遺伝学的アプローチは、微生物オプシンにおける非常に低い光感受性及び網膜オプシンにおける非常に遅い反応速度という２つの主要な制限に直面してきた。以下に提示するデータは、脊椎動物の中波長錐体オプシン（ＭＷ－オプシン）が、これらの制限を克服し、低光量下におけるパターン化された視覚を補助することを示す。盲目のｒｄ１マウスの網膜神経節細胞（ＲＧＣ）におけるＭＷ－オプシンの発現は、反応速度が速く光に対する感受性が極めて高い一過性のＯＮ型光応答を導く。ＭＷ－オプシンは、野生型動物で見られるものと同様の光感受性、微生物オプシンで必要とされるレベルよりも３桁小さいレベル及びロドプシンと同等のレベルを有する光回避を回復させる。ＭＷ－オプシンによって、ｒｄ１動物は、空間的パターンが動いている場合であっても、異なる時間的光パターン間の区別と異なる空間的光パターン間の区別の双方が可能となる。対照的に、ＲＧＣにロドプシンを有するｒｄ１動物は、時間的弁別と空間的弁別の双方が不可能である。顕著なことに、ＭＷ－オプシンの光応答は約１０００倍の範囲にわたる周囲光に適応する。このように、ＭＷ－オプシンは速度、感度及び適応性を兼ね備えており、現実的な光強度の下で、調節可能なパターン化された視覚を回復させる。ＬＷ－オプシン及びＳＷ－オプシンもまた、静的な視覚パターンの間の視覚弁別を補助することから、錐体オプシンは個別に生来の単色の視覚を回復させることができ、組み合わせると色覚を回復させ得ることが示唆される。
遺伝性及び加齢性の網膜変性疾患は、桿体光受容体及び錐体光受容体の進行性の喪失を引き起こし、完全な失明をもたらす。視覚に必要な光感知細胞の喪失にもかかわらず、網膜内の下流の神経細胞は機能状態で生存しており、光遺伝学的治療の標的を提供している。これまで、光遺伝学的アプローチは、微生物オプシンにおける非常に低い光感受性及び網膜オプシンにおける非常に遅い反応速度という２つの主要な制限に直面してきた。以下に提示するデータは、脊椎動物の中波長錐体オプシン（ＭＷ－オプシン）が、これらの制限を克服し、低光量下におけるパターン化された視覚を補助することを示す。盲目のｒｄ１マウスの網膜神経節細胞（ＲＧＣ）におけるＭＷ－オプシンの発現は、反応速度が速く光に対する感受性が極めて高い一過性のＯＮ型光応答を導く。ＭＷ－オプシンは、野生型動物で見られるものと同様の光感受性、微生物オプシンで必要とされるレベルよりも３桁小さいレベル及びロドプシンと同等のレベルを有する光回避を回復させる。ＭＷ－オプシンによって、ｒｄ１動物は、空間的パターンが動いている場合であっても、異なる時間的光パターン間の区別と異なる空間的光パターン間の区別の双方が可能となる。対照的に、ＲＧＣにロドプシンを有するｒｄ１動物は、時間的弁別と空間的弁別の双方が不可能である。顕著なことに、ＭＷ－オプシンの光応答は約１０００倍の範囲にわたる周囲光に適応する。このように、ＭＷ－オプシンは速度、感度及び適応性を兼ね備えており、現実的な光強度の下で、調節可能なパターン化された視覚を回復させる。ＬＷ－オプシン及びＳＷ－オプシンもまた、静的な視覚パターンの間の視覚弁別を補助することから、錐体オプシンは個別に生来の単色の視覚を回復させることができ、組み合わせると色覚を回復させ得ることが示唆される。
【0146】
材料及び方法
動物及びＡＡＶ
カリフォルニア大学の動物管理使用委員会（Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）による明示の承認の下で、マウス実験を実施した。野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）及びｒｄ１マウス（Ｃ３Ｈ）をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙより購入し、食餌及び水は自由摂取として１２時間の明／暗サイクルで収容した。脊椎動物の中波長錐体オプシンまたはロドプシンをコードするｃＤＮＡを、Ｃ末端に黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）遺伝子を結合させて、ヒトシナプシンプロモーター（ｈｓｙｎ－１）の制御下の構築したウイルスカセットへと挿入した。遺伝子及びプロモーターを逆位末端反復領域に隣接させ、ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を伴うポリアデニル化シグナル配列（ｐｏｌｙＡ）によって安定化させて、ＡＡＶ ２／２－４ＹＦカプシドにパッケージングした。ＡＡＶの力価を、逆位反復ドメインの標準に対するｑＰＣＲによって測定し、１０１０～１０１２のウイルスゲノムの含有が報告された。ＡＡＶを既に記載されている通りに作製した１５。鋭利な３０ゲージの針を使用して網膜鋸状縁後部に設けられた切開部を介した、非鋭利な３２ゲージのハミルトンシリンジを使用したマイクロインジェクションによって、ベクターをｒｄ１マウスの眼の硝子体へ２μｌの量で送達した。ｒＡＡＶの注入を出生後３０日目～６０日目に実施し、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏの実験を出生後９０日目～１６０日目に実施した。マウスをケタミン（７２ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（６４ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与により麻酔した。眼をプロパラカイン（０．５％）で麻酔し、瞳孔をフェニレフリン（２．５％）及びトロピカミド（１％）で散大させた。
動物及びＡＡＶ
カリフォルニア大学の動物管理使用委員会（Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）による明示の承認の下で、マウス実験を実施した。野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）及びｒｄ１マウス（Ｃ３Ｈ）をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙより購入し、食餌及び水は自由摂取として１２時間の明／暗サイクルで収容した。脊椎動物の中波長錐体オプシンまたはロドプシンをコードするｃＤＮＡを、Ｃ末端に黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）遺伝子を結合させて、ヒトシナプシンプロモーター（ｈｓｙｎ－１）の制御下の構築したウイルスカセットへと挿入した。遺伝子及びプロモーターを逆位末端反復領域に隣接させ、ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を伴うポリアデニル化シグナル配列（ｐｏｌｙＡ）によって安定化させて、ＡＡＶ ２／２－４ＹＦカプシドにパッケージングした。ＡＡＶの力価を、逆位反復ドメインの標準に対するｑＰＣＲによって測定し、１０１０～１０１２のウイルスゲノムの含有が報告された。ＡＡＶを既に記載されている通りに作製した１５。鋭利な３０ゲージの針を使用して網膜鋸状縁後部に設けられた切開部を介した、非鋭利な３２ゲージのハミルトンシリンジを使用したマイクロインジェクションによって、ベクターをｒｄ１マウスの眼の硝子体へ２μｌの量で送達した。ｒＡＡＶの注入を出生後３０日目～６０日目に実施し、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏの実験を出生後９０日目～１６０日目に実施した。マウスをケタミン（７２ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（６４ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与により麻酔した。眼をプロパラカイン（０．５％）で麻酔し、瞳孔をフェニレフリン（２．５％）及びトロピカミド（１％）で散大させた。
【0147】
電気生理及び光刺激
ＨＥＫ細胞の記録を既に記載されている通りに実施した１５，５１，５２。簡単に述べると、外部高カリウム溶液（５０ｍＭ）中で細胞をホールセルモードでクランプし、ＶＨ＝－８０ｍＶで保持して、カリウムに内向きの駆動力を提供した。５～１０秒の光パルスを低強度（１ｍＷ ｃｍ－２）で、５３５ｎｍ（ＭＷ－オプシンに対して）または５００ｎｍで（ロドプシンに対して）与えた。
ＨＥＫ細胞の記録を既に記載されている通りに実施した１５，５１，５２。簡単に述べると、外部高カリウム溶液（５０ｍＭ）中で細胞をホールセルモードでクランプし、ＶＨ＝－８０ｍＶで保持して、カリウムに内向きの駆動力を提供した。５～１０秒の光パルスを低強度（１ｍＷ ｃｍ－２）で、５３５ｎｍ（ＭＷ－オプシンに対して）または５００ｎｍで（ロドプシンに対して）与えた。
【0148】
ＭＥＡ記録を、野生型（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）マウスならびに未処置及び処置したｒｄ１マウスにおいて、出生後９０日超で実施した。ＡＡＶ注入の６～１０週間後、薄暗い赤色光の下で実験用の網膜を眼から切除し、４μｍの細胞膜上にマウントし、インキュベーター（３５℃）に３０分間載置して、外因性発色団の９－ｃｉｓレチナールで灌流した。６０チャネルのＭＥＡシステムの記録チャンバー（ｐＭＥＡ １００／３０ｉＲ－Ｔｐｒ、Ｍｕｌｔｉ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）内に、Ａｍｅｓ記録培地（３２℃）の常時灌流下で、神経節細胞側を下にして網膜組織を載置した５３。Ｍｕｌｔｉ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｓｙｓｔｅｍｓのハープウエイト（（ｈａｒｐ ｗｅｉｇｈｔ）、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓのスライスグリッド（Ｓｌｉｃｅ ｇｒｉｄｓ））を網膜の上に載置して移動を防ぎ、ポンプ（ＣＶＰを備えた穿孔ＭＥＡ１０６０システム、Ｍｕｌｔｉ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて網膜に減圧を適用することで、電極と組織との接触が改善され、網膜全体にわたり変動のない信号対雑音比がもたらされた。さらに、外因性発色団９－ｃｉｓ－レチナールの乾燥結晶を、暗条件下で１００％エタノールにμｌで溶解させた。次に、溶解したレチナールを氷上で１００μｌのマトリゲルに添加し、発色団の連続的な補給を提供するため、網膜のすぐ上のハープ（ｈａｒｐ）の最上部に添加した。さらに、９－ｃｉｓ－レチナールを記録溶液に溶解させ、記録チャンバー内に常時灌流させた。ＭＥＡ法に関するさらなる詳細は、既にＧａｕｂ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）１５に詳述されている。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける照射は、ＭＷ－オプシンに対する５３５／５０ｎｍバンドパスフィルタまたはロドプシンに対する５１０／８９ｎｍバンドパスフィルタを用いた３００Ｗの水銀アークランプ（ＤＧ－４、Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によるものであった。光強度を、光源のデューティ比を変更することによって、または中性濃度フィルタを用いることによって調整し、光強度は０．０３８μＷ ｃｍ－２～３８．２ｍＷ／ｃｍ２の範囲であった。パワーメーター（Ｔｈｏｒｌａｂｓ）による直接光測定を用いて、種々の環境における自然光強度との相対比較を得た。白色光のスペクトル成分を、Ｆｏｕｒｉｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ａｎａｌｙｚｅｒソフトウェアを備えたＣＣＤ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｏｒｌａｂｓ）を用いて測定した。
【0149】
ＭＥＡデータの取得及び分析
ＭＥＡ上の網膜の活動を、ＭＣ＿ｒａｃｋソフトウェア（Ｍｕｌｔｉ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて２５ｋＨｚでサンプリングし、１００～２，０００Ｈｚの間でフィルタリングして記録した。電圧トレースをオフラインのスパイクトレインに変換し、各電極で記録されたスパイクをＯｆｆｌｉｎｅ Ｓｏｒｔｅｒ（Ｐｌｅｘｏｎ、６４ビット）を用いた主成分分析を介して「細胞」と定義される単一ユニットにソーティングし、各電極は一般に１～３個の細胞を識別している状態であった。単一ユニットのスパイククラスターをＭＡＴＬＡＢ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ）へエクスポートし、カスタムソフトウェアを用いて分析しグラフ化した。すべての発火頻度を、別段の定めがない限り、３～１０回の光応答サイクルを平均したトレースより抽出し、それらの詳細を図面の説明に示す。細胞全体及び網膜全体にわたる応答を、Ｔｏｃｈｉｔｓｋｙ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）３７及びＧａｕｂ ｅｔ ａｌ．（２０１４）４７にて採用された光応答指数（Ｌｉｇｈｔ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｉｎｄｅｘ、ＬＲＩ）を用いて正規化した（ＬＲＩ＝（明所におけるピーク発火頻度－暗所における平均発火頻度）／明所におけるピーク発火頻度＋暗所における平均発火頻度）。網膜内の条件（光感受性、明順応及び暗順応の感度ならびにフラッシュ持続時間に対する応答依存性）が変化した実験下では、それらの応答をベースラインから最大応答のピークへと正規化し、チャネルをすべての記録パラメータにわたりトラッキングした。すべてのカーブフィッティング及び動態分析は、Ｃｌａｍｐｆｉｔ １０．６（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で実施した。ＬＲＩがＬＲＩ＞０．１またはＬＲＩ＜－０．１の条件を満たす場合、細胞を「レスポンダー」と定義した。ＦＷＨＭを決定する前に、個々の細胞のトレースを内挿し平滑化を適用するカスタムＭＡＴＬＡＢ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ）分析ソフトウェアを用いて、ベースラインからピーク半値における応答幅を確定した。強度－応答関係は単一のボルツマンに適合しており、適合度を０と１の間に正規化した。
ＭＥＡ上の網膜の活動を、ＭＣ＿ｒａｃｋソフトウェア（Ｍｕｌｔｉ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて２５ｋＨｚでサンプリングし、１００～２，０００Ｈｚの間でフィルタリングして記録した。電圧トレースをオフラインのスパイクトレインに変換し、各電極で記録されたスパイクをＯｆｆｌｉｎｅ Ｓｏｒｔｅｒ（Ｐｌｅｘｏｎ、６４ビット）を用いた主成分分析を介して「細胞」と定義される単一ユニットにソーティングし、各電極は一般に１～３個の細胞を識別している状態であった。単一ユニットのスパイククラスターをＭＡＴＬＡＢ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ）へエクスポートし、カスタムソフトウェアを用いて分析しグラフ化した。すべての発火頻度を、別段の定めがない限り、３～１０回の光応答サイクルを平均したトレースより抽出し、それらの詳細を図面の説明に示す。細胞全体及び網膜全体にわたる応答を、Ｔｏｃｈｉｔｓｋｙ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）３７及びＧａｕｂ ｅｔ ａｌ．（２０１４）４７にて採用された光応答指数（Ｌｉｇｈｔ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｉｎｄｅｘ、ＬＲＩ）を用いて正規化した（ＬＲＩ＝（明所におけるピーク発火頻度－暗所における平均発火頻度）／明所におけるピーク発火頻度＋暗所における平均発火頻度）。網膜内の条件（光感受性、明順応及び暗順応の感度ならびにフラッシュ持続時間に対する応答依存性）が変化した実験下では、それらの応答をベースラインから最大応答のピークへと正規化し、チャネルをすべての記録パラメータにわたりトラッキングした。すべてのカーブフィッティング及び動態分析は、Ｃｌａｍｐｆｉｔ １０．６（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で実施した。ＬＲＩがＬＲＩ＞０．１またはＬＲＩ＜－０．１の条件を満たす場合、細胞を「レスポンダー」と定義した。ＦＷＨＭを決定する前に、個々の細胞のトレースを内挿し平滑化を適用するカスタムＭＡＴＬＡＢ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ）分析ソフトウェアを用いて、ベースラインからピーク半値における応答幅を確定した。強度－応答関係は単一のボルツマンに適合しており、適合度を０と１の間に正規化した。
【0150】
光遺伝学的プローブの光感受性の比較
生来のヒトの視覚感度は、暗所視下（薄暗い、１０４～１０１１光子ｃｍ－２ｓ－１）から明所視下（明るい、１０１０～１０１７光子ｃｍ－２ｓ－１）までの幅広い範囲に及び、これにより、動的な照明条件下において知覚することができる。ＭＷ－オプシンの感度を、他の光遺伝学系における感度及び正常視覚における感度に関連付けるため実験を実施した。実験では、ポータブルパワーメーター（Ｔｈｏｒｌａｂｓ）を用いて屋外及び屋内の種々の条件下で測定した自然光強度を、実験パラダイムと、ＡＡＶ遺伝子導入を介して光遺伝学的プローブを送達したｒｄ１マウスから単離した網膜外植片における、機能的最大値のピークまたはピーク近傍の単色光波長を用いた文献中に報告されている光感受性の閾値（測定可能な最小光応答）と比較した（図７）。
生来のヒトの視覚感度は、暗所視下（薄暗い、１０４～１０１１光子ｃｍ－２ｓ－１）から明所視下（明るい、１０１０～１０１７光子ｃｍ－２ｓ－１）までの幅広い範囲に及び、これにより、動的な照明条件下において知覚することができる。ＭＷ－オプシンの感度を、他の光遺伝学系における感度及び正常視覚における感度に関連付けるため実験を実施した。実験では、ポータブルパワーメーター（Ｔｈｏｒｌａｂｓ）を用いて屋外及び屋内の種々の条件下で測定した自然光強度を、実験パラダイムと、ＡＡＶ遺伝子導入を介して光遺伝学的プローブを送達したｒｄ１マウスから単離した網膜外植片における、機能的最大値のピークまたはピーク近傍の単色光波長を用いた文献中に報告されている光感受性の閾値（測定可能な最小光応答）と比較した（図７）。
【0151】
Ｉｎ ｖｉｖｏ脳記録のための電気生理及び光刺激
Ｉｎ ｖｉｖｏ記録を、Ｖｅｉｔ ｅｔ．ａｌ．（２０１７）５８によって既に記載されている通りに実施した。マウスをイソフルラン（蒸気濃度２．５％）で麻酔した。頭皮を除去し、筋膜を後退させ、頭蓋骨を２７ゲージの針を用いて軽くエッチングした。Ｖｅｔｂｏｎｄを頭蓋骨表面に塗布後、特注のステンレス鋼ヘッドプレートを歯科用セメント（Ｍｅｔａｂｏｎｄ）を用いて頭蓋骨に固定した。少なくとも２日間、マウスを手術から回復させた。次いで、マウスを２～５日間、自由回転式の回転トレッドミル上で頭部固定に馴化させた。記録当日に、イソフルラン（２％）でマウスに短時間の麻酔を行い、Ｖ１上の頭蓋骨を薄くし、微細針を用いて一次視覚野の上を小さく（＜２５０μｍ）開頭した。２５ミクロン間隔の１６チャネル直線型電極アレイ（ＮｅｕｒｏＮｅｘｕｓ、Ａ１ｘ１６－５ｍｍ－２５－１７７－Ａ１６）を、マイクロマニピュレータ（Ｓｅｎｓａｐｅｘ）及び実体顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）を用いて脳へと導入した。電気的活動を増幅して３０ｋＨｚでデジタル化し（Ｓｐｉｋｅ Ｇａｄｇｅｔｓ）、コンピュータのハードドライブに保存した。各電気接点の皮質深さを、脳表面に対する底面の接点をゼロにすることにより決定した。電極を脳表面に対してほぼ垂直に挿入した。
Ｉｎ ｖｉｖｏ記録を、Ｖｅｉｔ ｅｔ．ａｌ．（２０１７）５８によって既に記載されている通りに実施した。マウスをイソフルラン（蒸気濃度２．５％）で麻酔した。頭皮を除去し、筋膜を後退させ、頭蓋骨を２７ゲージの針を用いて軽くエッチングした。Ｖｅｔｂｏｎｄを頭蓋骨表面に塗布後、特注のステンレス鋼ヘッドプレートを歯科用セメント（Ｍｅｔａｂｏｎｄ）を用いて頭蓋骨に固定した。少なくとも２日間、マウスを手術から回復させた。次いで、マウスを２～５日間、自由回転式の回転トレッドミル上で頭部固定に馴化させた。記録当日に、イソフルラン（２％）でマウスに短時間の麻酔を行い、Ｖ１上の頭蓋骨を薄くし、微細針を用いて一次視覚野の上を小さく（＜２５０μｍ）開頭した。２５ミクロン間隔の１６チャネル直線型電極アレイ（ＮｅｕｒｏＮｅｘｕｓ、Ａ１ｘ１６－５ｍｍ－２５－１７７－Ａ１６）を、マイクロマニピュレータ（Ｓｅｎｓａｐｅｘ）及び実体顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）を用いて脳へと導入した。電気的活動を増幅して３０ｋＨｚでデジタル化し（Ｓｐｉｋｅ Ｇａｄｇｅｔｓ）、コンピュータのハードドライブに保存した。各電気接点の皮質深さを、脳表面に対する底面の接点をゼロにすることにより決定した。電極を脳表面に対してほぼ垂直に挿入した。
【0152】
視覚刺激をＡｐｐｌｅ Ｍａｃ Ｍｉｎｉ上で動作するＰｓｙｃｈｏｐｈｙｓｉｃｓ Ｔｏｏｌｂｏｘ５９を用いて生成し、ガンマ補正した２３インチのＥｉｚｏ ＦＯＲＩＳ ＦＳ２３３３ ＬＣＤディスプレイ上にリフレッシュレート６０－Ｈｚで表示させた。モニタの中心をマウスの右目から１５ｃｍに置き、およそ１０８度×６１度の視角をカバーした。すべての記録ブロックの前に、マウスを７～１０分間暗順応させた。２つの異なる刺激パラダイムを使用した。１）コントラスト：４つの異なる輝度レベル（最大輝度の１５％、２５％、５０％及び１００％）の０．５Ｈｚで５００ｍｓのフルスクリーンフラッシュをマウスに呈示し、それを異なるランダムな順序で１０回繰り返した。２）フリッカー：０．０１６７Ｈｚ（１分に１回）で２０回の５００ｍｓのフルスクリーンフラッシュ（最大輝度１１６μＷｃｍ－２）または０．５Ｈｚ、１Ｈｚ、２Ｈｚ及び４Ｈｚで１００回のフラッシュを、異なるブロックでマウスに呈示した。
【0153】
Ｉｎ ｖｉｖｏ皮質記録データの取得及び分析
８００～７０００Ｈｚの間の生信号をフィルタリングすることにより、スパイク活動を抽出した。ＵｌｔｒａＭｅｇａ Ｓｏｒｔパッケージ６０を使用してスパイクの検出を実施した。検出したスパイク波形を、ＭＣｌｕｓｔパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｒｅｄｉｓｈｌａｂ．ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．ｕｍｎ．ｅｄｕ／ＭＣｌｕｓｔ／ＭＣｌｕｓｔ．ｈｔｍｌ）を用いてソーティングした。最初に、波形をＫｌｕｓｔａＫｗｉｋを用いて自動的にクラスタリングして、次いで、後続の分析に関する基準に合致するように手動で補正した。２％を超える個々の波形が２ｍｓの不応期から逸脱しているユニットを、マルチユニットに分類した。各ユニットの深さを、ユニットの最大振幅のソーティングした波形を示す、アレイ上の電極の算出した深さに基づいて割り当てた。発火頻度を、図２０ｂに関しては視覚刺激の発生の２５０ｍｓ後に始まる２秒のウィンドウ中のスパイクをカウントすることにより算出し、図２１ｃに関しては刺激の発生直後に始まる５秒のウィンドウ中のスパイクをカウントすることにより算出した。刺激前後時間ヒストグラム（ＰＳＴＨ）のためのトレースを、スパイク応答を２０ｍｓ（図１９）、５０ｍｓ（図２０）または２５ｍｓ（図２１）のいずれかのビンへとビニングして、得られたトレースを移動平均フィルタを用いて平滑化することによって生成した。図２１に関しては、変調振幅を、０．５Ｈｚ、１Ｈｚ、２Ｈｚ及び４Ｈｚのフリッカーに対してそれぞれ２秒、１秒、０．５秒または０．２５秒のウィンドウで２５ｍｓでビニングした試験の平均スパイク応答によって算出した。対応するベースライン変調振幅を、最初の視覚刺激の発生前（暗順応期間中）からの同じ長さのウィンドウの同じ数を平均した試験により生成した。局所フィールド電位を、３０ｋＨｚでサンプリングされた生信号を２００Ｈｚ以下でローパスフィルタリングし、その後、１ｋＨｚまでダウンサンプリングすることにより抽出した。
８００～７０００Ｈｚの間の生信号をフィルタリングすることにより、スパイク活動を抽出した。ＵｌｔｒａＭｅｇａ Ｓｏｒｔパッケージ６０を使用してスパイクの検出を実施した。検出したスパイク波形を、ＭＣｌｕｓｔパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｒｅｄｉｓｈｌａｂ．ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．ｕｍｎ．ｅｄｕ／ＭＣｌｕｓｔ／ＭＣｌｕｓｔ．ｈｔｍｌ）を用いてソーティングした。最初に、波形をＫｌｕｓｔａＫｗｉｋを用いて自動的にクラスタリングして、次いで、後続の分析に関する基準に合致するように手動で補正した。２％を超える個々の波形が２ｍｓの不応期から逸脱しているユニットを、マルチユニットに分類した。各ユニットの深さを、ユニットの最大振幅のソーティングした波形を示す、アレイ上の電極の算出した深さに基づいて割り当てた。発火頻度を、図２０ｂに関しては視覚刺激の発生の２５０ｍｓ後に始まる２秒のウィンドウ中のスパイクをカウントすることにより算出し、図２１ｃに関しては刺激の発生直後に始まる５秒のウィンドウ中のスパイクをカウントすることにより算出した。刺激前後時間ヒストグラム（ＰＳＴＨ）のためのトレースを、スパイク応答を２０ｍｓ（図１９）、５０ｍｓ（図２０）または２５ｍｓ（図２１）のいずれかのビンへとビニングして、得られたトレースを移動平均フィルタを用いて平滑化することによって生成した。図２１に関しては、変調振幅を、０．５Ｈｚ、１Ｈｚ、２Ｈｚ及び４Ｈｚのフリッカーに対してそれぞれ２秒、１秒、０．５秒または０．２５秒のウィンドウで２５ｍｓでビニングした試験の平均スパイク応答によって算出した。対応するベースライン変調振幅を、最初の視覚刺激の発生前（暗順応期間中）からの同じ長さのウィンドウの同じ数を平均した試験により生成した。局所フィールド電位を、３０ｋＨｚでサンプリングされた生信号を２００Ｈｚ以下でローパスフィルタリングし、その後、１ｋＨｚまでダウンサンプリングすることにより抽出した。
【0154】
統計情報
ＭＥＡ記録の統計学的有意性を評価するため、適用可能な場合に、ノンパラメトリックなマン・ホイットニーの両側Ｕ検定を適用した。学習した暗所回避行動及び学習したパターンの弁別行動に関して、２つの方法で有意性を決定した。（１）適用可能な場合、行動成績の有意性をボンフェローニ補正した独立スチューデントの両側ｔ検定を用いて算出した。有意性を、成功した行動の割合をコンピュータ処理することによっても決定した（２）。対照群の平均値と１標準偏差との合計より大きいことを成功と定義し、失敗は、この基準に達しないあらゆる値であった。次いで、各条件に対して成功率を算出した。次に、条件間の差異における有意性を決定するためペアワイズ分割表を作図し、まず、ピアソンのカイ二乗両側検定を実施した。小標本を含む条件を補正するために、フィッシャーの直接確率片側検定も実施した。図１１（表１）。
ＭＥＡ記録の統計学的有意性を評価するため、適用可能な場合に、ノンパラメトリックなマン・ホイットニーの両側Ｕ検定を適用した。学習した暗所回避行動及び学習したパターンの弁別行動に関して、２つの方法で有意性を決定した。（１）適用可能な場合、行動成績の有意性をボンフェローニ補正した独立スチューデントの両側ｔ検定を用いて算出した。有意性を、成功した行動の割合をコンピュータ処理することによっても決定した（２）。対照群の平均値と１標準偏差との合計より大きいことを成功と定義し、失敗は、この基準に達しないあらゆる値であった。次いで、各条件に対して成功率を算出した。次に、条件間の差異における有意性を決定するためペアワイズ分割表を作図し、まず、ピアソンのカイ二乗両側検定を実施した。小標本を含む条件を補正するために、フィッシャーの直接確率片側検定も実施した。図１１（表１）。
【0155】
組織の調製及び免疫組織化学的検査
ＡＡＶ２／２－ｈｓｙｎ－ＭＷ－ｃｏｎｅｏｐｓｉｎ－ＹＦＰの治療後４～６週を超えたマウスを屠殺し、眼を４％パラホルムアルデヒド（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ）で３０分固定した。網膜を取り去りＰＢＳで完全に洗浄し、ＤＡＰＩ（細胞核染色、青色）含有のＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）媒体を用いてスライド上にフラットマウントした。網膜切片用に、全組織標本をアガロース（Ｓｉｇｍａ）に包埋し、ビブラトーム（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、中速度、最大振動、厚さ１８０μｍで横方向に切断した。網膜凍結切片または全組織標本の免疫組織化学的検査に使用した網膜組織を処理して、共焦点顕微鏡法（Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５；Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって検査した。
ＡＡＶ２／２－ｈｓｙｎ－ＭＷ－ｃｏｎｅｏｐｓｉｎ－ＹＦＰの治療後４～６週を超えたマウスを屠殺し、眼を４％パラホルムアルデヒド（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ）で３０分固定した。網膜を取り去りＰＢＳで完全に洗浄し、ＤＡＰＩ（細胞核染色、青色）含有のＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）媒体を用いてスライド上にフラットマウントした。網膜切片用に、全組織標本をアガロース（Ｓｉｇｍａ）に包埋し、ビブラトーム（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、中速度、最大振動、厚さ１８０μｍで横方向に切断した。網膜凍結切片または全組織標本の免疫組織化学的検査に使用した網膜組織を処理して、共焦点顕微鏡法（Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５；Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって検査した。
【0156】
受動的回避－オープンフィールド試験
オープンフィールド試験を既に記載されている通りに実施した１６，４７。簡単に述べると、２区画（明所と暗所）のシャトルボックス（Ｃｏｕｌｂｏｕｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって、２つの区画を連結している小開口部を介してマウスを自由に移動させることができる。明区画を区画上方のＬＣＤパネルで照明した。白色光ならびに５３５ｎｍの波長及び４６０ｎｍの波長を、約１００μＷ ｃｍ－２（白色光）ならびに０．５～２５μＷ ｃｍ－２（青色及び緑色光）の強度で使用して、床一面に均一に分布させた。１日目－マウスを試験ボックス内へと移動させ、４５分間、それらのマウスの同腹仔とともに新しい環境に馴化させた。マウスをホームケージへ戻し、次いで個々に試験を行った。２日目－マウスを明区画へ配置し、別の区画があることに気づかせるために最大で３分間与えた。マウスが暗区画へと横断したときに１５分間の実験を開始し、明区画で過ごした時間を記録した。開口部を１度だけ通り、すべての時間、暗区画に留まったマウスを失格とした。順応実験のため、マウスを事前に白色光（１ｍＷ ｃｍ－２）または暗所曝露条件に１時間曝露させ、次いで、直ちにオープンフィールド試験を実施した。シャトルボックス上のＩＲセンサーによって動物の挙動を追跡した。両方の側で過ごした時間を、Ｇｒａｐｈｉｃ Ｓｔａｔｅ及びＧｒａｐｈｉｃ Ｓｔａｔｅ ＲＴプログラム（Ｃｏｕｌｂｏｕｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて収集し分析した。
オープンフィールド試験を既に記載されている通りに実施した１６，４７。簡単に述べると、２区画（明所と暗所）のシャトルボックス（Ｃｏｕｌｂｏｕｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって、２つの区画を連結している小開口部を介してマウスを自由に移動させることができる。明区画を区画上方のＬＣＤパネルで照明した。白色光ならびに５３５ｎｍの波長及び４６０ｎｍの波長を、約１００μＷ ｃｍ－２（白色光）ならびに０．５～２５μＷ ｃｍ－２（青色及び緑色光）の強度で使用して、床一面に均一に分布させた。１日目－マウスを試験ボックス内へと移動させ、４５分間、それらのマウスの同腹仔とともに新しい環境に馴化させた。マウスをホームケージへ戻し、次いで個々に試験を行った。２日目－マウスを明区画へ配置し、別の区画があることに気づかせるために最大で３分間与えた。マウスが暗区画へと横断したときに１５分間の実験を開始し、明区画で過ごした時間を記録した。開口部を１度だけ通り、すべての時間、暗区画に留まったマウスを失格とした。順応実験のため、マウスを事前に白色光（１ｍＷ ｃｍ－２）または暗所曝露条件に１時間曝露させ、次いで、直ちにオープンフィールド試験を実施した。シャトルボックス上のＩＲセンサーによって動物の挙動を追跡した。両方の側で過ごした時間を、Ｇｒａｐｈｉｃ Ｓｔａｔｅ及びＧｒａｐｈｉｃ Ｓｔａｔｅ ＲＴプログラム（Ｃｏｕｌｂｏｕｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて収集し分析した。
【0157】
視覚的合図による恐怖条件付けパラダイム
ＬＥＤスクリーンを天井に取り付けたＣｏｕｌｂｏｕｒｎショックチャンバー、すなわちテストケージを備えたＣｏｕｌｂｏｕｒｎ Ｈａｂｉｔｅｓｔチャンバー（Ｃｏｕｌｂｏｕｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＰＡ）を使用して、恐怖条件付け実験を実施した。１日目に、動物を動物のホームケージ内にある試験室へ入れ、次に、個々に３０分間、清潔なＣｏｕｌｂｏｕｒｎショックチャンバーに順応させた。２～３日目に、動物を、チャンバー（暗所）への５分の馴化とその後の１５分間にわたる０．７ｍＡでの３回のショック試験からなる、ペアリングしたまたはペアリングしていない、光を合図とした恐怖条件付けに供した。ペアリングした試験では、ＬＣＤ上の定常またはフラッシュ（２Ｈｚ）のいずれかからの移行が、ショック間の間隔（１０秒間）を伴う２秒の短時間のフットショックと同時に生じた。ペアリングしていない試験では、動物は同様にショックを受けたが、刺激の移行とは無関係であった。これらの短期間の低電流ショックはごくわずかな嫌悪刺激をもたらし、パターン化した光と関連付けられた恐怖記憶を生成した。４日目に、ボックスの底部をショックグレーティングからプラスチックに交換した。マウスを５分間チャンバーに馴化させて、２日目及び３日目と同様であるがショックのない光刺激プロトコルに供した。ショックを予期したすくみ行動をＣｏｕｌｂｏｕｒｎのＦｒｅｅｚｅＦｒａｍｅソフトウェアによって記録し、刺激前に収集された移動行動に対して正規化した。次に、恐怖応答が刺激の移行に条件付けられたものか否かを決定するために、ペアリング群と非ペアリング群との間で成績を比較した。
ＬＥＤスクリーンを天井に取り付けたＣｏｕｌｂｏｕｒｎショックチャンバー、すなわちテストケージを備えたＣｏｕｌｂｏｕｒｎ Ｈａｂｉｔｅｓｔチャンバー（Ｃｏｕｌｂｏｕｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＰＡ）を使用して、恐怖条件付け実験を実施した。１日目に、動物を動物のホームケージ内にある試験室へ入れ、次に、個々に３０分間、清潔なＣｏｕｌｂｏｕｒｎショックチャンバーに順応させた。２～３日目に、動物を、チャンバー（暗所）への５分の馴化とその後の１５分間にわたる０．７ｍＡでの３回のショック試験からなる、ペアリングしたまたはペアリングしていない、光を合図とした恐怖条件付けに供した。ペアリングした試験では、ＬＣＤ上の定常またはフラッシュ（２Ｈｚ）のいずれかからの移行が、ショック間の間隔（１０秒間）を伴う２秒の短時間のフットショックと同時に生じた。ペアリングしていない試験では、動物は同様にショックを受けたが、刺激の移行とは無関係であった。これらの短期間の低電流ショックはごくわずかな嫌悪刺激をもたらし、パターン化した光と関連付けられた恐怖記憶を生成した。４日目に、ボックスの底部をショックグレーティングからプラスチックに交換した。マウスを５分間チャンバーに馴化させて、２日目及び３日目と同様であるがショックのない光刺激プロトコルに供した。ショックを予期したすくみ行動をＣｏｕｌｂｏｕｒｎのＦｒｅｅｚｅＦｒａｍｅソフトウェアによって記録し、刺激前に収集された移動行動に対して正規化した。次に、恐怖応答が刺激の移行に条件付けられたものか否かを決定するために、ペアリング群と非ペアリング群との間で成績を比較した。
【0158】
能動的回避の改変プロトコル
Ｃｏｕｌｂｏｕｒｎシャトルボックス（Ｈ１０－１１Ｍ－ＳＣ）、Ｃｏｕｌｂｏｕｒｎ Ｈａｂｉｔｅｓｔ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｃｕｂｉｃｌｅ（Ｈ１０－２４）ならびにＧｒａｐｈｉｃ Ｓｔａｔｅ及びＧｒａｐｈｉｃ Ｓｔａｔｅ ＲＴソフトウェア（Ｃｏｕｌｂｏｕｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＰＡ）を使用して、回避プロトコルを実施した。１日目、動物を３０分間、ホームケージ内の暗くした処置室に順応させ、次に、動物が恐怖を感じなくなりシャトルボックスのそれぞれの側でほぼ同じ時間を過ごす（探索行動）まで、暗くしたシャトルボックスに個々に順応させた。２～３日目に、ｉＰａｄのスクリーンをシャトルケージの壁に取り付け、同一の形状、サイズ、光強度である２つの異なる画像を表示させた。各試行は、動物が配置された場所からシャトルボックスの反対側へと移動したときに開始した。各試行は１５分間であった。嫌悪画像の側では、動物が「安全な」側へ戻るまで５秒間隔の０．７ｍＡのフットショックとペアリングした。嫌悪的な側へ６０秒より長く残留していた動物はすべてケージから出し、これらの試行を破棄した。４日目に、パターンではなく位置に対するバイアスを回避するため、（嫌悪的な画面が以前の「安全な」側にあるように）光のパターンを逆転させた。さらに、ケージの底部をショックグレーティングからプラスチックに交換した。これにより、訓練日に関係する唯一の関連が光刺激であることが確実になる。再度、動物を１５分間試行させて、それぞれの側で過ごした時間を記録した。明順応実験に関しては、想起段階の前に１時間の明順応段階（６５Ｗの白色電球）または暗順応段階のいずれかがある４日目を除いて、同様のプロトコルに従った。異なる光強度への順応を試験するために、ｉＰａｄのスクリーンを暗くまたは明るくした。視覚を弁別する光角の算出を、行動シャトルケージ（１５．２４×３６ｃｍ）、決定点（ディバイダー）からの距離、ＬＣＤパネル（１８．８５ｃｍ）の中心位置のパラメータ及び光学的（物理学的）角方程式を用いた刺激パターン（平行線間の距離が１～６ｃｍ）のパラメータを用いて実施した。視角＝Ｖ＝２ｔａｎ－１（（Ｄ／２）／（Ｌ））＝１８度＝０．３３～０．４９ラジアン。視角１度あたりの周期＝１／Ｖ、約０．０５６ｃｐｄ。これは、他の研究で報告されている視覚的損傷のない野生型マウス（約０．３～０．５ｃｐｄ）における成績より約９倍低い３９，５４，５５，５６。
Ｃｏｕｌｂｏｕｒｎシャトルボックス（Ｈ１０－１１Ｍ－ＳＣ）、Ｃｏｕｌｂｏｕｒｎ Ｈａｂｉｔｅｓｔ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｃｕｂｉｃｌｅ（Ｈ１０－２４）ならびにＧｒａｐｈｉｃ Ｓｔａｔｅ及びＧｒａｐｈｉｃ Ｓｔａｔｅ ＲＴソフトウェア（Ｃｏｕｌｂｏｕｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＰＡ）を使用して、回避プロトコルを実施した。１日目、動物を３０分間、ホームケージ内の暗くした処置室に順応させ、次に、動物が恐怖を感じなくなりシャトルボックスのそれぞれの側でほぼ同じ時間を過ごす（探索行動）まで、暗くしたシャトルボックスに個々に順応させた。２～３日目に、ｉＰａｄのスクリーンをシャトルケージの壁に取り付け、同一の形状、サイズ、光強度である２つの異なる画像を表示させた。各試行は、動物が配置された場所からシャトルボックスの反対側へと移動したときに開始した。各試行は１５分間であった。嫌悪画像の側では、動物が「安全な」側へ戻るまで５秒間隔の０．７ｍＡのフットショックとペアリングした。嫌悪的な側へ６０秒より長く残留していた動物はすべてケージから出し、これらの試行を破棄した。４日目に、パターンではなく位置に対するバイアスを回避するため、（嫌悪的な画面が以前の「安全な」側にあるように）光のパターンを逆転させた。さらに、ケージの底部をショックグレーティングからプラスチックに交換した。これにより、訓練日に関係する唯一の関連が光刺激であることが確実になる。再度、動物を１５分間試行させて、それぞれの側で過ごした時間を記録した。明順応実験に関しては、想起段階の前に１時間の明順応段階（６５Ｗの白色電球）または暗順応段階のいずれかがある４日目を除いて、同様のプロトコルに従った。異なる光強度への順応を試験するために、ｉＰａｄのスクリーンを暗くまたは明るくした。視覚を弁別する光角の算出を、行動シャトルケージ（１５．２４×３６ｃｍ）、決定点（ディバイダー）からの距離、ＬＣＤパネル（１８．８５ｃｍ）の中心位置のパラメータ及び光学的（物理学的）角方程式を用いた刺激パターン（平行線間の距離が１～６ｃｍ）のパラメータを用いて実施した。視角＝Ｖ＝２ｔａｎ－１（（Ｄ／２）／（Ｌ））＝１８度＝０．３３～０．４９ラジアン。視角１度あたりの周期＝１／Ｖ、約０．０５６ｃｐｄ。これは、他の研究で報告されている視覚的損傷のない野生型マウス（約０．３～０．５ｃｐｄ）における成績より約９倍低い３９，５４，５５，５６。
【0159】
探索行動分析のため、２つの対象物を５０ｃｍ×５０ｃｍのオープンフィールドボックスに配置した。動物を空のボックスに配置して、１０分間にわたって自由に探索させた。翌日、２つの新規対象物をボックスに入れ、動物を再びボックスの壁に沿って配置し１０分間にわたって自由に探索させ、その間、アリーナを連続的に撮影した。Ｎｏｌｄｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ ＸＴ ｖ１３．５を使用して、各対象物に到達するまでの潜時及び対象物を探索するまでの潜時、移動速度（ｃｍ／秒）ならびに移動した距離（ｃｍ）について、映像を分析した。
【0160】
結果
ＨＥＫ２９３細胞におけるＭＷ－オプシンの特性評価
近年の研究により、桿体の外節に見いだされる脊椎動物ロドプシンは、培養細胞におけるＧｉ／ｏシグナル伝達を制御するために低光強度の下で異所的に使用され得るが２５、繰り返される刺激により減弱しかつ不活性化が遅いことが立証されている２４，２６。遅い反応速度はロドプシンが盲目網膜のＯＮ型双極細胞に発現している場合にも見られ１４，１５、観察者及び周囲の対象物の動きのために、ロドプシンが自然な状況での視覚を補助できない場合があるという懸念が生じている。他の脊椎動物オプシンが、ロドプシンの高感度を有しながらも反応速度がより速いか否かが問われた。メラノプシン及び網膜外オプシンは、網膜の非光受容体細胞を含む様々な細胞型における光受容体細胞外で測定されているが、そのすべてがロドプシンと同様に遅いか、またはロドプシンよりも遅いことが判明した１４～１６，２７～２９。哺乳類の錐体光受容体細胞由来のオプシンを選択したが、これは、これらの錐体における不活性化が、桿体におけるロドプシンの不活性化よりも迅速であることが理由である３０。錐体オプシンのうち、可視スペクトルの中央で機能するＭＷ－オプシンを選択した。ＭＷ－オプシンまたはロドプシンのいずれかを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で、ホモ四量体を形成するＧタンパク質共役型内向き整流性カリウムチャネルの一種であり、Ｇαｉ共役型受容体の活性化に続いてＧβγによって活性化されるＧＩＲＫ１（Ｆ１３７Ｓ）とともに発現させた３１（図１）。９－ｃｉｓ－レチナール（天然の発色団１１－ｃｉｓ－レチナールの機能的に安定なアナログ）の存在下、ＭＷ－オプシン発現細胞及びロドプシン発現細胞の双方は、外部高カリウムにおいて負の保持電位で、５３５ｎｍ（ＭＷ－オプシンに対して）または５００ｎｍ（ロドプシンに対して）で、低強度（１ｍＷ ｃｍ－２）の光フラッシュによって誘発される大きな内向き光電流を示した（図１ａ、ｂ）。照射後、ＭＷ－オプシンによって誘発された電流は、ロドプシンによって誘発された電流の約８倍速く減衰しかつより完全に回復し、これによって、短波長錐体オプシン及び長波長錐体オプシンのための異種細胞にて既に示されているように２４、繰り返される一連の照射にわたって再生可能な応答をもたらした（図１ａ、ｃ）。このことは、迅速なスピードは錐体に特化されたものではなく、ＭＷ－オプシンのシグナル伝達に固有のものであり得ることを示唆した。次に、ＭＷ－オプシンを非光受容体網膜神経細胞中で試験した。
ＨＥＫ２９３細胞におけるＭＷ－オプシンの特性評価
近年の研究により、桿体の外節に見いだされる脊椎動物ロドプシンは、培養細胞におけるＧｉ／ｏシグナル伝達を制御するために低光強度の下で異所的に使用され得るが２５、繰り返される刺激により減弱しかつ不活性化が遅いことが立証されている２４，２６。遅い反応速度はロドプシンが盲目網膜のＯＮ型双極細胞に発現している場合にも見られ１４，１５、観察者及び周囲の対象物の動きのために、ロドプシンが自然な状況での視覚を補助できない場合があるという懸念が生じている。他の脊椎動物オプシンが、ロドプシンの高感度を有しながらも反応速度がより速いか否かが問われた。メラノプシン及び網膜外オプシンは、網膜の非光受容体細胞を含む様々な細胞型における光受容体細胞外で測定されているが、そのすべてがロドプシンと同様に遅いか、またはロドプシンよりも遅いことが判明した１４～１６，２７～２９。哺乳類の錐体光受容体細胞由来のオプシンを選択したが、これは、これらの錐体における不活性化が、桿体におけるロドプシンの不活性化よりも迅速であることが理由である３０。錐体オプシンのうち、可視スペクトルの中央で機能するＭＷ－オプシンを選択した。ＭＷ－オプシンまたはロドプシンのいずれかを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で、ホモ四量体を形成するＧタンパク質共役型内向き整流性カリウムチャネルの一種であり、Ｇαｉ共役型受容体の活性化に続いてＧβγによって活性化されるＧＩＲＫ１（Ｆ１３７Ｓ）とともに発現させた３１（図１）。９－ｃｉｓ－レチナール（天然の発色団１１－ｃｉｓ－レチナールの機能的に安定なアナログ）の存在下、ＭＷ－オプシン発現細胞及びロドプシン発現細胞の双方は、外部高カリウムにおいて負の保持電位で、５３５ｎｍ（ＭＷ－オプシンに対して）または５００ｎｍ（ロドプシンに対して）で、低強度（１ｍＷ ｃｍ－２）の光フラッシュによって誘発される大きな内向き光電流を示した（図１ａ、ｂ）。照射後、ＭＷ－オプシンによって誘発された電流は、ロドプシンによって誘発された電流の約８倍速く減衰しかつより完全に回復し、これによって、短波長錐体オプシン及び長波長錐体オプシンのための異種細胞にて既に示されているように２４、繰り返される一連の照射にわたって再生可能な応答をもたらした（図１ａ、ｃ）。このことは、迅速なスピードは錐体に特化されたものではなく、ＭＷ－オプシンのシグナル伝達に固有のものであり得ることを示唆した。次に、ＭＷ－オプシンを非光受容体網膜神経細胞中で試験した。
【0161】
図１ａ～１ｃ．ＨＥＫ２９３細胞におけるＧＩＲＫチャネルのＭＷ－オプシン及びロドプシンの活性化。（ａ、ｂ）ＶＨ＝－８０ｍＶで５０ｍＭ［Ｋ＋］ｅｘｔにおいてホールセルパッチ法で測定した、５３５ｎｍ（ＭＷ－オプシンに対して）または５００ｎｍ（ロドプシンに対して）で低強度（１ｍＷ ｃｍ－２）の光パルスに応答した（ａ）ロドプシンまたは（ｂ）ＭＷ－オプシンの光刺激によるホモ四量体ＧＩＲＫ（Ｆ１３７Ｓ）チャネルの活性化の代表的なトレース。（ｃ）ロドプシン（青色）及びＭＷ－オプシン（緑色）の光応答の減衰（Ｔａｕ ＯＦＦ）。値は平均値±ＳＥＭである。ｎ＝６細胞（ロドプシン）、ｎ＝８細胞（ＭＷ－オプシン）。
【0162】
ＭＷ－オプシンは盲目網膜に速くかつ高感度な光応答を回復させる
ＭＷ－オプシンを、ＰＤＥ－６－β遺伝子が変異しており桿体光受容体細胞及び錐体光受容体細胞の進行性の喪失が生じているｒｄ１マウスの網膜において試験した。ヒトシナプシンプロモーター（ｈＳｙｎ－１）の制御下にあり、発現を追跡するための黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）Ｃ末端タグを有するＭＷ－オプシンをＡＡＶ２／２（４ＹＦ）にパッケージングし、出生後４５日目に硝子体内に注入した（図２ａ、ｂ）。４～８週間後、網膜を単離した。発現は網膜全体に認められ、遺伝子導入率は４５％±１９％（ＳＤ）であり、ＲＧＣ層に限定され、かつＯＮ型及びＯＦＦ型ＲＧＣ双方の細胞体及び樹状突起に限局していた（図２ｃ、ｄ及び１４）。明確な発現プロファイルが以前に示されたターゲティング３２と一致し、同一パラメータ下のロドプシンの発現と類似していた（図１５）。多電極アレイ（ＭＥＡ）上に、ＲＧＣ層と電極とを接触させて網膜を載置し、光誘発性活動の試験を行った。本質的に光感受性であるＲＧＣに特有の緩慢な応答を示したわずかなＲＧＣを例外として５７、３ヶ月齢以上の動物における完全な光受容体変性によって３３、対照のｒｄ１同腹仔の網膜において光誘発応答は検出されなかった（図２ｅ）。対照的に、ＭＷ－オプシンをコードするＡＡＶを注入した動物の網膜は、大きく速い一過性の成分と、小さく（約３０％の大きさ）遅い成分からなる活動電位の発火において力強い光誘発的な増加を示した（図２ｆ、ｇ、３ａ、１６、及び１７）。１１－ｃｉｓの供給源である網膜色素上皮の除去後、予想通り、繰り返される一連の光刺激によって光応答は減弱した。この減弱は、９－ｃｉｓ－レチナール（１１－ｃｉｓ－レチナールの安定なアナログ）を記録溶液へ添加することによって軽減された（図２ｇ）。
ＭＷ－オプシンを、ＰＤＥ－６－β遺伝子が変異しており桿体光受容体細胞及び錐体光受容体細胞の進行性の喪失が生じているｒｄ１マウスの網膜において試験した。ヒトシナプシンプロモーター（ｈＳｙｎ－１）の制御下にあり、発現を追跡するための黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）Ｃ末端タグを有するＭＷ－オプシンをＡＡＶ２／２（４ＹＦ）にパッケージングし、出生後４５日目に硝子体内に注入した（図２ａ、ｂ）。４～８週間後、網膜を単離した。発現は網膜全体に認められ、遺伝子導入率は４５％±１９％（ＳＤ）であり、ＲＧＣ層に限定され、かつＯＮ型及びＯＦＦ型ＲＧＣ双方の細胞体及び樹状突起に限局していた（図２ｃ、ｄ及び１４）。明確な発現プロファイルが以前に示されたターゲティング３２と一致し、同一パラメータ下のロドプシンの発現と類似していた（図１５）。多電極アレイ（ＭＥＡ）上に、ＲＧＣ層と電極とを接触させて網膜を載置し、光誘発性活動の試験を行った。本質的に光感受性であるＲＧＣに特有の緩慢な応答を示したわずかなＲＧＣを例外として５７、３ヶ月齢以上の動物における完全な光受容体変性によって３３、対照のｒｄ１同腹仔の網膜において光誘発応答は検出されなかった（図２ｅ）。対照的に、ＭＷ－オプシンをコードするＡＡＶを注入した動物の網膜は、大きく速い一過性の成分と、小さく（約３０％の大きさ）遅い成分からなる活動電位の発火において力強い光誘発的な増加を示した（図２ｆ、ｇ、３ａ、１６、及び１７）。１１－ｃｉｓの供給源である網膜色素上皮の除去後、予想通り、繰り返される一連の光刺激によって光応答は減弱した。この減弱は、９－ｃｉｓ－レチナール（１１－ｃｉｓ－レチナールの安定なアナログ）を記録溶液へ添加することによって軽減された（図２ｇ）。
【0163】
図２ａ～２ｇ．ｒｄ１マウスの網膜のＲＧＣにおけるＭＷ－オプシンの発現及び機能。（ａ）ウイルスＤＮＡ発現カセット。逆位末端反復（ＩＴＲ）領域に隣接し、ｈｓｙｎ－１プロモーターの制御下にあるＹＦＰ（緑色）を有するＭＷ－オプシンを、ポリアデニル化シグナル配列（ｐｏｌｙＡ）及びウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）によって安定化させた。（ｂ）標的ＲＧＣをハイライト（緑色）したｒｄ１マウスの変性網膜の模式図。ＯＮＬ：外顆粒層。ＩＰＬ：内網状層。光受容体変性を薄灰色で示す。（ｃ、ｄ）ＡＡＶ２／２－ｈＳｙｎ－ＭＷ－ｏｐｓｉｎ－ＹＦＰの硝子体内注入の４週間後のｒｄ１マウス網膜のＭＷ－オプシン発現における、フラットマウント（ｃ）及び横断スライス（ｄ）の共焦点画像の正面像。ＭＷ－オプシンのＣ末端に融合したＹＦＰ（緑色）の画像は、核のＤＡＰＩ染色（ｄ、青色）に関連するＲＧＣ層における網膜全体の分布（ｃ）を示す。スケール：６０μｍ（ｃ）及び２０μｍ（ｄ）。（ｅ、ｆ）非注入の対照ｒｄ１マウス網膜のＭＥＡ記録（ｅ）及びＭＷ－オプシン発現ｒｄ１マウス網膜のＭＥＡ記録（ｆ）。（上部）各ＲＧＣのスパイクによるラスタープロット（ｅ：ｎ＝７５細胞、ｆ：ｎ＝８４ユニット）。（下部）刺激前後時間ヒストグラム（ＰＳＴＨ）。光刺激プロトコル：３０秒の暗間隔によって隔てられた持続時間１秒の光パルスを４回（λ＝５３５ｎｍ、緑色バー）。（ｇ）ＭＷ－オプシン非発現ｒｄ１網膜（灰色）及びＭＷ－オプシン発現ｒｄ１網膜（緑色）の正規化光応答指数（ＬＲＩ）（灰色：Ｎ＝３網膜、ｎ＝１９０細胞；緑色：Ｎ＝６網膜、ｎ＝２７３細胞）。９－ｃｉｓレチナールなし（薄緑色：Ｎ＝３網膜、ｎ＝１０６細胞）及び９－ｃｉｓレチナールあり（深緑色：Ｎ＝３網膜、ｎ＝１６７細胞）の１回目及び５回目の光フラッシュのＬＲＩ。光強度：３．３８ｍＷ ｃｍ－２。波長：λ＝５３５ｎｍ（ＭＷ－オプシン）、値は平均値±ＳＥＭである。すべての細胞はソーティングしたユニットを指す。統計学的有意性はマン・ホイットニーのＵ検定（＊ｐ≦０．００１）を用いて評価した。
【0164】
図１４ａ～１４ｂ．ＭＷ－オプシンはｒｄ１マウス網膜で発現する。ＡＡＶ２／２－ｈＳｙｎ－ＭＷ－ｏｐｓｉｎ－ＹＦＰの硝子体内注射後４～６週のｒｄ１マウス網膜のＲＧＣにおける、ＭＷ－オプシン－ＹＦＰのフラットマウント（ａ）及びスライス（ｂ）の共焦点画像。ＹＦＰ蛍光（緑色）及び核のＤＡＰＩ染色（青色）。ＩＮＬ＝内顆粒層、ＲＧＣ＝網膜神経節細胞層。スケール：４０μｍ（ａ）及び２０μｍ（ｂ）。
【0165】
図１５ａ～１５ｂ．ロドプシンはｒｄ１マウス網膜で発現する。ＡＡＶ２／２－ｈＳｙｎ－ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ－ＹＦＰの硝子体内注射後４～６週のｒｄ１マウス網膜のＲＧＣにおける、ロドプシン－ＹＦＰのフラットマウント（ａ）及びスライス（ｂ）の共焦点画像。ＹＦＰ蛍光（緑色）及び核のＤＡＰＩ染色（青色）。ＩＮＬ＝内顆粒層、ＲＧＣ＝網膜神経節細胞層。スケール：４０μｍ（ａ）及び２０μｍ（ｂ）。
【0166】
図１６ａ～１６ｄ．ｒｄ１網膜におけるＭＷ－オプシンの形質導入効率。（ａ）ＭＥＡ記録において光応答性を示したＭＷ－オプシン発現ｒｄ１マウスの網膜で確認されたチャネルの平均パーセント。光応答性は、Ｔｏｃｈｉｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（２０１４）３７、Ｇａｕｂ．ｅｔ ａｌ（２０１４）４７及びＢｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．（２０１７）６２で確立されているパラメータである、光応答指数（ＬＲＩ）＞０．１で定義した。（ＬＲＩ＝（明所におけるピーク発火頻度－暗所における平均発火頻度）／明所におけるピーク発火頻度＋暗所における平均発火頻度）。（ｂ）網膜全体の応答の正規化した平均値。（ａ、ｂ）Ｎ＝８ ｒｄ１網膜、Ｎ＝５ 野生型網膜。（ｃ）ＭＷ－オプシンｒｄ１（ｎ＝３７０細胞、Ｎ＝３網膜）及び野生型（ｎ＝２３７細胞、Ｎ＝３網膜）における相互相関の平均値。光パルスの１秒前から２秒後におけるすべての光感受性ユニットの相互相関。（ｄ）ＭＷ－オプシン（ｎ＝３７０細胞、Ｎ＝３網膜）及び野生型網膜（ｎ＝２３７細胞、Ｎ＝３網膜）の、同一網膜内の光感受性ユニットにおける相関値分布。
【0167】
図１７ａ～１７ｄ．ＭＷ－オプシン発現ｒｄ１網膜における光応答の遅い成分の特性評価。（ａ）ＭＷ－オプシン発現ｒｄ１における平均的なＲＧＣ集団の応答の代表的なトレース（λ＝５１０ｎｍ、パルス持続時間１秒、３０秒間隔で平均５回のフラッシュ）は、光応答の速い一過性の成分及び遅い成分を示す（灰色はＳＥＭを示す）。（ｂ）光応答の速い一過性の成分（緑色）と遅い成分（スチールグレー）のＬＲＩ及びそれらの比率（黒色、速い／遅い）の比較（ｎ＝１２２チャネル、Ｎ＝３網膜）。（ｃ）遅い成分の反応速度：ピークまでの時間（Ｔ－ｐｅａｋ）及び減衰の時定数（Ｔａｕ ｄｅｃａｙ）。（ｄ）暗順応（左）及び明順応（右）条件下における、速い成分（緑色）及び遅い成分（スチールグレー）のＬＲＩ。
【0168】
網膜オプシンの潜在的な利点の１つは、それらの通常の細胞環境において光に対して高感度であることである。ＯＮ－ＢＣ及びＲＧＣ内のロドプシンならびにＲＧＣ内のメラノプシンに示されるように１４～１７、ロドプシン及びメラノプシンは、網膜内を含む異所に発現させた場合、極めて高い感受性のままである２５。これと合致して、ｒｄ１マウス網膜のＲＧＣにおけるＭＷ－オプシンは、ロドプシンと区別がつかない程度に光に対して高感度であった（図３ｂ、ｃ）。この感度はチャネルロドプシン８，１３またはハロロドプシン１１，１２の感度より約１０００倍高く、かつ通常の屋内光強度の範囲内である（図７）。ＭＷ－オプシンは、感度についてはロドプシンと同様であるが、光パルスの開始時において立ち上がりが約３．５倍速くかつピークまでの時間が約４倍短く、光パルスの終了後は約７倍速く減衰し（図３ｄ、ｅ）、これにより、片振幅で２．６１±０．２１秒持続するロドプシンのインパルス応答よりも約１０倍短い、片振幅で２７０±２１ｍｓ持続するインパルス応答をもたらす反応速度を示した。Ｔａｕ ＯＮ、ピークまでの時間、Ｔａｕ ＯＦＦは光強度の減少によって中程度に変化し、スピードにおいてロドプシンに対する優位性を維持した（図８ａ～ｃ）１４，１５。ＭＷ－オプシン発現ｒｄ１網膜のＲＧＣにおける応答の立ち上がり及び減衰の反応速度は、野生型網膜で見られるＲＧＣよりも長い潜時を有することを除き、野生型網膜で見られるＲＧＣの一過性ＯＮ応答の反応速度と類似していた（図３ｅ及び８ｄ、ｅ）。ＭＷ－オプシンの応答の反応速度の速さ及び感度は、ＭＷ－オプシンが短時間の光フラッシュに応答するであろうことを示唆した。実際、わずか２５ｍｓの短い照射パルスで、依然として、野生型網膜で見られたものと同様である３４最大ピーク応答の約６０％に達する応答を誘発した（図３ｆ、ｇ）。
【0169】
切除した網膜及び一次視覚野におけるコントラスト感度を、フルフィールドのグレースケール段階に対する応答を測定することによって、ｉｎ ｖｉｖｏで試験した。切除したＭＷ－オプシン発現ｒｄ１網膜において、わずか２５％の輝度の変化に応じてＲＧＣの活動が変化し（図１８ａ、ｂ）、コントラスト感度は野生型網膜のコントラスト感度に近似したが同等ではなかった（図１８ｃ）。ＲＧＣにＭＷ－オプシンを発現しているｒｄ１動物における相補的なｉｎ ｖｉｖｏ実験において、実験には、覚醒状態でフリーランしている動物の一次視覚野の層にわたる単一ユニット応答及び視覚誘発電位の計測（図１９）ならびに標準的なコンピュータモニタを用いた同様のコントラスト感度の観察が含まれた（図２０）。皮質応答は、少なくとも４Ｈｚまでの周波数のフラッシュの後に生じた（図２１）。ＲＧＣ内のＭＷ－オプシンにより付与された光応答の感度及び反応速度によって、ＲＧＣ内のＭＷ－オプシンが視覚誘導行動を補助し得ることが示唆された。
【0170】
図３ａ～３ｇ．ＲＧＣにＭＷ－オプシンを有する単離したｒｄ１マウス網膜の光応答。（ａ）（上部）ｒｄ１マウス網膜のＲＧＣにおける、ＭＷ－オプシン発現ＲＧＣ集団（緑色）またはロドプシン発現ＲＧＣ集団（青色）の、１秒間の光フラッシュに対する応答の平均値。（下部）ＲＧＣに発現しているＭＷ－オプシン（ｎ＝８８細胞）に対して５３５ｎｍ、及びＲＧＣに発現しているロドプシン（ｎ＝５４細胞）に対して５１０ｎｍの持続時間１秒の光フラッシュ５回に対する、ｒｄ１マウス網膜におけるＲＧＣの応答の平均値のラスタープロット。（ｂ、ｃ）ｒｄ１マウス網膜のＲＧＣにおける、ＭＷ－オプシン（Ｎ＝２網膜、ｎ＝１２７細胞）及びロドプシン（Ｎ＝２網膜、ｎ＝９５細胞）の光感受性。最高強度における最大値に対して正規化したピーク発火頻度。（ｄ、ｅ）光応答の経時変化。（ｅ）ＭＷ－オプシン（ｄ；ｅ、緑色、Ｎ＝３網膜、ｎ＝９５細胞）及びロドプシン（ｅ、青色、Ｎ＝２網膜、ｎ＝６７細胞）の、照射開始から最大励起までの時間（ピークまでの時間：３５５±２１ｍｓ）、励起段階（Ｔａｕ ＯＮ：１１２±２５ｍｓ）及び減衰（Ｔａｕ ＯＦＦ：２６０±３１ｍｓ）に対する指数関数フィットならびに半値全幅（ＦＷＨＭ：１８３±８５ｍｓ）を含む集団の平均トレース。（ｆ、ｇ）ＭＷ－オプシンの光応答のフラッシュ持続時間に対する依存性。（ｆ）代表的な網膜の光応答（ｎ＝１１７細胞）：集団の平均発火頻度（上部）及びユニット応答のラスタープロット（下部）。（ｈ）異なる刺激持続時間に対する正規化したピーク応答（Ｎ＝２網膜、ｎ＝１８３細胞）。特に明記しない限り、光強度は３．８２×１０－１ｍＷ ｃｍ－２である。波長：λ＝５３５ｎｍ（ＭＷ－オプシン）または５１０ｎｍ（ロドプシン）。Ｎ＝網膜の数、ｎ＝細胞／ユニットの数。すべての細胞はソーティングしたユニットを指す。値は平均±ＳＥＭである。統計学的有意性はマン・ホイットニーのＵ検定（＊ｐ≦０．００１）を用いて評価した。
【0171】
図７．正常視覚と比較した、盲目網膜における光遺伝学系の閾値応答。生来の視覚の閾値感度（上部）と、光受容体細胞の変性後、網膜中の生存神経細胞の定義された組に導入した種々の光遺伝学系の閾値感度（下部）との比較。哺乳類のＭＷ－オプシン（緑色）、ロドプシン（青色）及びメラノプシン（シアン）は、微生物のチャネルロドプシン２及びハロロドプシンより約１０００倍感受性が高い。代替的な光遺伝学的アプローチの閾値は、Ｂｉ ｅｔ ａｌ．（２００６）８、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ （２００９）１２，Ｓｅｎｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．（２０１６）１３、Ｄｏｒｏｕｄｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１）４５、Ｇａｕｂ ｅｔ ａｌ．（２０１４）４７、Ｃｒｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ（２０１４）６５、Ｂｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．（２０１７）６６、Ｄｅ Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１７）１７によるものである。（８）Ｂｉ ｅｔ ａｌ．（２００６） ＲＧＣにおける感度限界が２．２×１０１５光子ｃｍ－２ｓ－１ 約１ｍＷ ｃｍ－２である、ｒｄ１マウスにおいて４６０ｎｍで刺激してＡＡＶ２－ＣＡＧプロモーターを用いて発現させたチャネルロドプシン。（１２）Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ（２００９） ＲＧＣにおける感度限界が５．８×１０１６光子ｃｍ－２ｓ－１ 約２０ｍＷ ｃｍ－２である、ｒｄ１マウスにおいて５５５～５７５ｎｍのバンドパスで刺激してＡＡＶ２－ＣＭＶプロモーターを用いて発現させたハロロドプシン。（１３）Ｓｅｎｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．（２０１６） ＲＧＣにおける感度限界が２．５×１０１５光子ｃｍ－２ｓ－１ 約１ｍＷ ｃｍ－２である、ｒｄ１マウスにおいて５９５ｎｍで刺激してＡＡＶ２－ｈＳｙｎプロモーターを用いて発現させた赤色シフトチャネルロドプシン。（４５）Ｄｏｒｏｕｄｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１） ＯＮ－ＢＣにおける感度限界が４×１０１６光子ｃｍ－２ｓ－１ 約１７ｍＷ ｃｍ－２である、ｒｄ１０マウスにおいて４５０～４９０ｎｍのバンドパスで刺激してＡＡＶ８－Ｙ７３３Ｆプロモーター及びＳＶ－４０プロモーターを用いて発現させたチャネルロドプシン。（４７）Ｇａｕｂ ｅｔ ａｌ．（２０１４） ＲＧＣ及びＯＮ－ＢＣにおける感度限界が７．１×１０１４光子ｃｍ－２ｓ－１ 約０．３ｍＷ ｃｍ－２である、ｒｄ１マウスにおいて４４５／２０ｎｍで刺激してＡＡＶ２－ｈＳｙｎプロモーター及びＡＡＶ２－４ｘＧｒｍ６プロモーターを用いて発現させたＬｉＧｌｕＲ－ＭＡＧ４６０。（６５）Ｃｒｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ （２０１４） ＯＮ－ＢＣにおける感度限界が１×１０１６光子ｃｍ－２ｓ－１ 約５ｍＷ ｃｍ－２である、ｒｄ１マウスを刺激してＡＡＶ２／８ＢＰ２プロモーター及び４ｘＧＲＭ６プロモーターを用いて発現させたチャネルロドプシン。（６６）Ｂｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．（２０１７） ＲＧＣにおける感度限界が１×１０１４光子ｃｍ－２ｓ－１ 約０．５ｍＷ ｃｍ－２である、ｒｄ１マウスにおいて４４５／５０ｎｍで刺激してＡＡＶ２－ｈＳｙｎプロモーターを用いて発現させたＳＮＡＧ－ＭＧｌｕＲ２。（１７）Ｄｅ Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１７） ＲＧＣにおけるメラノプシンの感度限界が１．２０×１０１２光子ｃｍ－２ｓ－１ 約０．５μＷｃｍ－２であり、ｒｄ１マウスにおいて、４８０／２０ｎｍで刺激してＡＡＶ２／８（Ｙ７３３Ｆ）及びＣＭＶエンハンサー／ＣＢＡプロモーターを用いて発現させた。
【0172】
図８ａ～ｅ．ＭＷ－オプシンの光応答の強度依存的反応速度。（ａ～ｃ）ＭＷ－オプシン発現ｒｄ１網膜におけるＴａｕ ＯＮ（ａ）、Ｔａｕ ＯＦＦ（ｂ）及びピークまでの時間（Ｔ－ｐｅａｋ）（ｃ）の光強度の依存性（秒）。ｎ＝１１１細胞、Ｎ＝３網膜。すべての細胞はソーティングしたユニットを指す。値は平均値であり、エラーバーはＳＥＭである。波長：λ＝５３５ｎｍ。（ｄ～ｅ）ＭＷ－オプシン発現ｒｄ１（ｄ、λ＝５１０ｎｍ、ｎ＝１１７細胞）及び野生型（ｅ、白色光、ｎ＝５０細胞）の、灰色のＳＥＭを伴うＲＧＣ集団の応答の平均値（上部）及び持続時間１秒の５回の光フラッシュを平均化したラスタープロット（下部）。
【0173】
図１８ａ～１８ｃ．ＭＷ－オプシン発現ｒｄ１マウスの単離した網膜におけるコントラスト検出。例示のＭＷ－オプシン発現ｒｄ１マウスから単離した網膜の、異なる強度における暗色からフルフィールドのグレースケールまでの段階に対する応答のＭＥＡ記録（１４チャネルの平均）（ａ）。（ｂ、ｃ）ＭＷ－オプシン発現ｒｄ１マウス（Ｎ＝２網膜）（ｂ）及び野生型マウス（Ｎ＝２網膜）（ｃ）に対するコントラスト変化に応じたＲＧＣの発火頻度の正規化した変化。１００％の光＝２５μＷ ｃｍ－２。
【0174】
図１９ａ～１９ｅ．ＭＷ－オプシン発現ｒｄ１マウスのＶ１におけるｉｎ ｖｉｖｏ光応答。（ａ）ランニングホイール上の頭部固定マウスの模式図。片眼の視野内に位置する標準的なコンピュータモニタに刺激を呈示した。（ｂ）５００ｍｓの光パルスに対する応答。上部、Ｖ１のＩＶ層からの代表的な視覚誘発電位（２０回の応答の平均、陰影部分は平均±ＳＥＭを示す）。下部、視覚野の深部にわたる直線型電極アレイの１６個すべての電極からの、各ユニットの応答のヒートマップ（２０回の応答の平均）。（ｃ）３匹のＭＷ－オプシン発現ｒｄ１マウス中３９ユニットの、光誘発性の発火頻度対ベースライン発火頻度の散布図。（ｄ）光フラッシュに応答する代表的なユニットのＰＳＴＨ（５０ｍｓでビニング）。（ｅ）３匹のマウス中の３９ユニットを刺激後の神経細胞発火の変化率のプロット。
【0175】
図２０ａ～２０ｄ．ＭＷ－オプシン発現ｒｄ１マウスのｉｎ ｖｉｖｏコントラスト検出。（ａ）覚醒状態でフリーランしているＭＷ－オプシン発現ｒｄ１マウスにおける視覚野の記録の図。動物の視野内に置かれたコンピュータモニタ上に呈示されるランダム化されたコントラスト変化。（ｂ）Ｖ１のＩＶ層で記録された、フルフィールドのコントラスト段階に応じた平均発火頻度（持続時間５００ｍｓ）。挿入図は２０ｍｓでビニングしたＰＳＴＨを示す。１００％の光＝１１５μＷｃｍ－２。
【0176】
図２１ａ～２１ｃ．ＭＷ－オプシン発現ｒｄ１マウスのｉｎ ｖｉｖｏにおけるＶ１応答の時間的特性。（ａ～ｃ）１００サイクルにわたる１Ｈｚ、２Ｈｚ及び４Ｈｚのフルフィールドのフリッカー刺激によって誘発された視覚野における神経細胞発火の変化。
【0177】
ＭＷ－オプシンは生来の光回避を回復させる
ＭＷ－オプシンが、単離したｒｄ１網膜において低強度で大きな光応答を生成することが観察されたため、インタクトな動物を用いて視覚的行動を補助するＭＷ－オプシンの能力の評価を行った。視力のあるマウスは、生得的に照明された領域を回避するが、これは捕獲を逃れることと関係した生存メカニズムである３５。この行動は、ｒｄ１マウスモデルにおいて光受容体の変性後、失われる９，１６。この行動が復活し得るか否かを確認するために、ＲＧＣにＭＷ－オプシンを有するｒｄ１マウスを、隣接した明区画及び暗区画からなる行動ボックス内で試験した（図４ａ）。各区画で過ごした時間の割合を記録し、未処置のｒｄ１マウス及び野生型マウス（図４、図９ａ～ｃ、図１１）と比較し、各群の回避に成功した割合も同様に比較した（図９ａ～ｃ及び図１１（表１））。明区画を屋内のオフィスの照明（１００μＷ ｃｍ－２）に相当する低強度の白色灯で照明した。未処置ｒｄ１動物は視覚による区画の区別が不可能であるが、未処置ｒｄ１動物は約４０～５０％の時間を暗区画で過ごした。これはリリースした位置に対する馴染みのため、明区画に有利という確立されたバイアスと一致する（方法を参照のこと）（図４ｂ）。対照的に、ロドプシンまたはＭＷ－オプシンのいずれかを発現しているｒｄ１マウスは、正常な視力の野生型動物と同様の暗区画への強い嗜好性を示した（図４ｂ及び図９ａ）。次に、同一の行動パラダイムを用いて、白色光を青色光（４６０±２２ｎｍ）または緑色光（５３４±２５ｎｍ）に交換し、強度をＭＷ－オプシン及びロドプシンに対する単離した網膜の強度－応答曲線の下端まで減少させた（１μＷ ｃｍ－２、図３ｂ）。緑色光の下では、ＭＷ－オプシン発現動物とロドプシン発現動物の双方が光回避を示したが（図４ｃ左及び図９ｂ）、しかしながら青色光の下では、ロドプシン発現動物のみが光回避を示した（図４ｃ右及び図９ｃ）。この単色の感受性の表れは、ＭＷ－オプシンの作用スペクトルと一致する３６。
ＭＷ－オプシンが、単離したｒｄ１網膜において低強度で大きな光応答を生成することが観察されたため、インタクトな動物を用いて視覚的行動を補助するＭＷ－オプシンの能力の評価を行った。視力のあるマウスは、生得的に照明された領域を回避するが、これは捕獲を逃れることと関係した生存メカニズムである３５。この行動は、ｒｄ１マウスモデルにおいて光受容体の変性後、失われる９，１６。この行動が復活し得るか否かを確認するために、ＲＧＣにＭＷ－オプシンを有するｒｄ１マウスを、隣接した明区画及び暗区画からなる行動ボックス内で試験した（図４ａ）。各区画で過ごした時間の割合を記録し、未処置のｒｄ１マウス及び野生型マウス（図４、図９ａ～ｃ、図１１）と比較し、各群の回避に成功した割合も同様に比較した（図９ａ～ｃ及び図１１（表１））。明区画を屋内のオフィスの照明（１００μＷ ｃｍ－２）に相当する低強度の白色灯で照明した。未処置ｒｄ１動物は視覚による区画の区別が不可能であるが、未処置ｒｄ１動物は約４０～５０％の時間を暗区画で過ごした。これはリリースした位置に対する馴染みのため、明区画に有利という確立されたバイアスと一致する（方法を参照のこと）（図４ｂ）。対照的に、ロドプシンまたはＭＷ－オプシンのいずれかを発現しているｒｄ１マウスは、正常な視力の野生型動物と同様の暗区画への強い嗜好性を示した（図４ｂ及び図９ａ）。次に、同一の行動パラダイムを用いて、白色光を青色光（４６０±２２ｎｍ）または緑色光（５３４±２５ｎｍ）に交換し、強度をＭＷ－オプシン及びロドプシンに対する単離した網膜の強度－応答曲線の下端まで減少させた（１μＷ ｃｍ－２、図３ｂ）。緑色光の下では、ＭＷ－オプシン発現動物とロドプシン発現動物の双方が光回避を示したが（図４ｃ左及び図９ｂ）、しかしながら青色光の下では、ロドプシン発現動物のみが光回避を示した（図４ｃ右及び図９ｃ）。この単色の感受性の表れは、ＭＷ－オプシンの作用スペクトルと一致する３６。
【0178】
図９ａ～９ｇ．光回避及び学習したパターンの弁別行動。（ａ～ｃ）ＲＧＣにロドプシンを発現しているｒｄ１（青色、ｎ＝６マウス）またはＭＷ－オプシンを発現しているｒｄ１（緑色、ｎ＝５）及び野生型マウス（白色、ｎ＝５マウス）に対して、（ａ）白色光（１００μＷ ｃｍ－２）、（ｂ）２５μＷ ｃｍ－２ 緑色光（５３５ｎｍ）または（ｃ）２５μＷ ｃｍ－２ 青色光（４７０ｎｍ）のいずれかを照明したときの明区画の回避に成功した割合（回避に成功した試験の割合）。適用可能な場合、統計学的有意性をピアソンのカイ二乗両側検定及びフィッシャーの直接確率片側検定によって評価した（図１１）。回避がｒｄ１未処置対照マウスの平均値＋Ｓ．Ｄ．よりも大きい場合、成功と定義した（方法を参照のこと）。（ｄ）パターン弁別実験の模式図。１日目にマウスを馴化させ、２日目及び３日目に、いずれかのチャンバーにランダムにペアリングした特定の光パターン（刺激Ａ／Ｂ）と関連した電気ショックに曝露させ、４日目に、位置バイアスを回避するため光パターンを逆にしてショックなしで、（各チャンバーで過ごした時間の）試験を行った。（ｅ～ｇ）ｒｄ１未処置対照と比較した、ショックとペアリングしたパターンの弁別に成功した割合（成功した回避試験の割合）。（ｅ）水平平行バー対垂直平行バー。１ｃｍの間隔対６ｃｍの間隔の静止平行バーの弁別（ｆ）または移動平行バーの弁別（ｇ）。ｅ、ｆ及びｇはそれぞれ、ｒｄ１ ロドプシン（青色；（ｅ）ｎ＝８、（ｆ）ｎ＝６マウス）、ｒｄ１ ＭＷ－オプシン（（ｅ）ｎ＝１７、（ｆ）ｎ＝１１、（ｇ）ｎ＝６マウス）及び野生型（（ｅ）ｎ＝５、（ｆ）ｎ＝６、（ｇ）ｎ＝９マウス）である（２５μＷ ｃｍ－２）。適用可能な場合、統計学的有意性をピアソンのカイ二乗両側検定及びフィッシャーの直接確率片側検定によって評価した（図１１）。回避がｒｄ１未処置対照マウスの平均値＋Ｓ．Ｄ．よりも大きい場合、成功と定義した。
【0179】
ＭＷ－オプシンは時間的光パターンの検出を補助する
ＭＷ－オプシンが、単離したｒｄ１網膜においてロドプシンよりも速い光応答を誘発することが観察されたため、これが異なる時間的光パターンを区別する上位の能力に転換されるか否かが問われた。視覚的合図による恐怖条件付けパラダイムを用いて、フラッシュを定常光と区別する動物の能力を試験した。野生型マウスまたはＲＧＣにＭＷ－オプシンもしくはロドプシンのいずれかを発現しているｒｄ１マウスを、低強度（１００μＷ ｃｍ－２）のＬＣＤスクリーンが定常光とフラッシュ光（２Ｈｚ）を切り替える単一区画からなる行動装置へ配置した。各動物において、定常光またはフラッシュ光のいずれかを、弱いフットショックと終始ペアリングした。これを２日間、１日１試験実施し（図４ｄ）、３日目に、以前実施されたように１５，２７，３７、すくみ時間を恐怖との関連の測定に使用し、フットショックなしで呈示した光の合図を用いて動物を試験した。時間的光パターンの切り替え後、すくみ時間を１０秒間にわたり測定した。視覚合図とショックとをペアリングした動物（ペアリング群）の測定値を、訓練用ショックがランダム化された（すなわち、刺激の１つと定常的にはペアリングされていない）動物群（非ペアリング群）の測定値と比較した。未処置のｒｄ１マウスにおけるすくみ時間は、ペアリング及び非ペアリングの条件間で相違がなく、動物が視覚合図を見ることができないという予想に一致した（図４ｅ、灰色）。対照的に、ＲＧＣにＭＷ－オプシンを発現しているｒｄ１マウスは、野生型動物で観察されたように、ペアリング条件下でより多くのすくみを示した（図４ｅ、緑色及び白色）。顕著なことに、ＲＧＣにロドプシンを発現しているｒｄ１マウスは、ペアリング及び非ペアリングの条件間で相違がなかった（図４ｅ、青色）。このことは、ＭＷ－錐体オプシンを発現している盲目マウスと異なり、ロドプシンマウスは２Ｈｚのフラッシュ光と定常光との区別ができないことを示唆しており、これはＭＥＡで観察された遅い光応答反応速度（図３ｅ）と一致する。
ＭＷ－オプシンが、単離したｒｄ１網膜においてロドプシンよりも速い光応答を誘発することが観察されたため、これが異なる時間的光パターンを区別する上位の能力に転換されるか否かが問われた。視覚的合図による恐怖条件付けパラダイムを用いて、フラッシュを定常光と区別する動物の能力を試験した。野生型マウスまたはＲＧＣにＭＷ－オプシンもしくはロドプシンのいずれかを発現しているｒｄ１マウスを、低強度（１００μＷ ｃｍ－２）のＬＣＤスクリーンが定常光とフラッシュ光（２Ｈｚ）を切り替える単一区画からなる行動装置へ配置した。各動物において、定常光またはフラッシュ光のいずれかを、弱いフットショックと終始ペアリングした。これを２日間、１日１試験実施し（図４ｄ）、３日目に、以前実施されたように１５，２７，３７、すくみ時間を恐怖との関連の測定に使用し、フットショックなしで呈示した光の合図を用いて動物を試験した。時間的光パターンの切り替え後、すくみ時間を１０秒間にわたり測定した。視覚合図とショックとをペアリングした動物（ペアリング群）の測定値を、訓練用ショックがランダム化された（すなわち、刺激の１つと定常的にはペアリングされていない）動物群（非ペアリング群）の測定値と比較した。未処置のｒｄ１マウスにおけるすくみ時間は、ペアリング及び非ペアリングの条件間で相違がなく、動物が視覚合図を見ることができないという予想に一致した（図４ｅ、灰色）。対照的に、ＲＧＣにＭＷ－オプシンを発現しているｒｄ１マウスは、野生型動物で観察されたように、ペアリング条件下でより多くのすくみを示した（図４ｅ、緑色及び白色）。顕著なことに、ＲＧＣにロドプシンを発現しているｒｄ１マウスは、ペアリング及び非ペアリングの条件間で相違がなかった（図４ｅ、青色）。このことは、ＭＷ－錐体オプシンを発現している盲目マウスと異なり、ロドプシンマウスは２Ｈｚのフラッシュ光と定常光との区別ができないことを示唆しており、これはＭＥＡで観察された遅い光応答反応速度（図３ｅ）と一致する。
【0180】
ＭＷ－オプシンは空間的パターン弁別を回復させる
次に、ＲＧＣ内のＭＷ－オプシンによって、ｒｄ１マウスが光の空間的パターンを検出することが可能となるかどうかを確認した。２つの隣接した区画を有し、それぞれ壁に取り付けられた低強度のＬＣＤタブレット（ｉＰａｄ）を備えた行動チャンバー（図４ｆ）を使用した。各タブレットに一対の平行線を表示した。ある例では、線は垂直方向を向き（｜｜）、もう一方の線は水平方向を向いていた（＝）。波長は、ＭＷ－オプシンに対しては５３５（５２０～５６０）ｎｍを中心とし、ロドプシンに対しては４９７（４８０～５２０）ｎｍを中心とした（図９ｄ）。まず、表示装置の電源を切った状態で、マウスに区画に馴化するための時間を与えた（１日目）。２日間の訓練期間中、嫌悪的なフットショックを、垂直方向の線または水平方向の線のいずれかとペアリングした。嫌悪的な合図をランダムに割り当て、その動物に対して終始維持した。４日目に、位置バイアスを回避するために刺激の位置を切り替えて、条件回避を試験した（図９ｄ）。ＲＧＣにＭＷ－オプシンを有するｒｄ１動物は、未処置のｒｄ１対照動物で見られたものよりも有意に大きくかつ野生型マウスで見られたものと同様の嫌悪的な視覚合図の回避を示すことが判明した（図４ｇ及び図９ｅ）。対照的に、ＲＧＣにロドプシンを有するｒｄ１動物は、未処置のｒｄ１対照動物と相違がなく、かつ盲目動物で見られる位置バイアスの明確な例である、嫌悪的な刺激へのわずかな嗜好性を示した。これらの観察結果は、ＭＷ－オプシンは空間的光パターンを弁別する能力を回復させるが、ロドプシンはこの能力を回復させないことを示す。
次に、ＲＧＣ内のＭＷ－オプシンによって、ｒｄ１マウスが光の空間的パターンを検出することが可能となるかどうかを確認した。２つの隣接した区画を有し、それぞれ壁に取り付けられた低強度のＬＣＤタブレット（ｉＰａｄ）を備えた行動チャンバー（図４ｆ）を使用した。各タブレットに一対の平行線を表示した。ある例では、線は垂直方向を向き（｜｜）、もう一方の線は水平方向を向いていた（＝）。波長は、ＭＷ－オプシンに対しては５３５（５２０～５６０）ｎｍを中心とし、ロドプシンに対しては４９７（４８０～５２０）ｎｍを中心とした（図９ｄ）。まず、表示装置の電源を切った状態で、マウスに区画に馴化するための時間を与えた（１日目）。２日間の訓練期間中、嫌悪的なフットショックを、垂直方向の線または水平方向の線のいずれかとペアリングした。嫌悪的な合図をランダムに割り当て、その動物に対して終始維持した。４日目に、位置バイアスを回避するために刺激の位置を切り替えて、条件回避を試験した（図９ｄ）。ＲＧＣにＭＷ－オプシンを有するｒｄ１動物は、未処置のｒｄ１対照動物で見られたものよりも有意に大きくかつ野生型マウスで見られたものと同様の嫌悪的な視覚合図の回避を示すことが判明した（図４ｇ及び図９ｅ）。対照的に、ＲＧＣにロドプシンを有するｒｄ１動物は、未処置のｒｄ１対照動物と相違がなく、かつ盲目動物で見られる位置バイアスの明確な例である、嫌悪的な刺激へのわずかな嗜好性を示した。これらの観察結果は、ＭＷ－オプシンは空間的光パターンを弁別する能力を回復させるが、ロドプシンはこの能力を回復させないことを示す。
【0181】
ＭＷ－オプシンが空間的パターン弁別を補助することが観察されたため、ヒト及び動物における視力検査に採用された視覚課題である、方向が同じで間隔が異なる線間の差をマウスが区別できるか否かが問われた３８，３９。平行な垂直線を１ｃｍまたは６ｃｍのいずれかの間隔で離した。上記のように、２日目及び３日目の訓練期間中、嫌悪的なフットショックを刺激の１つとランダムにペアリングして、４日目に回避の指標として想起試験を行った。ＭＷ－オプシン発現ｒｄ１マウスは、野生型マウスで見られるものと同様の非嫌悪的刺激への嗜好性を示す動作により２つのパターンを区別でき、他方、ロドプシン発現動物は未処置のｒｄ１マウスと同様であることが判明した（図４ｈ、図９ｆ及び図２２）。ＭＷ－オプシンは、平行線が動いている場合（１ｃｍ／秒）も線の区別を補助した（図４ｉ及び９ｇ）。
【0182】
問題は、ＭＷ－オプシンの「リフレッシュ」レートが、線パターンが動いている場合にそのパターンの弁別を補助するに足る速度か否かであった。このことを試験するために、同様の近接した線の弁別課題を実施し、今回は毎秒５ｃｍ移動する平行線を使用した。ＭＷ－オプシン発現ｒｄ１マウスは、非嫌悪的刺激とペアリングした移動しているパターンへの嗜好性を示し、野生型マウスがとった行動と同様の行動をとることが判明した（図４ｉ及び図９ｇ）。これらの結果は、ＲＧＣ内のＭＷ－オプシンが、ＬＣＤスクリーンの屋内の低光強度において静止している空間的パターンと移動している空間的パターンの双方の弁別を補助することを示す。
【0183】
図４ａ～４ｉ．ＲＧＣにＭＷ－オプシンまたはロドプシンを発現しているｒｄ１マウスにおける、光回避及び学習した視覚誘導行動。（ａ）光回避試験用の明／暗ボックスの模式図。（ｂ、ｃ）ｒｄ１対照（灰色、ｎ＝４マウス）、ＲＧＣにロドプシンを発現しているｒｄ１（青色、ｎ＝６マウス）またはＭＷ－オプシンを発現しているｒｄ１（緑色、ｎ＝５）及び野生型マウス（白色、ｎ＝５マウス）に対して、（ｂ）白色光（１００μＷ ｃｍ－２）、（ｃ）２５μＷ ｃｍ－２ 青色光（４７０ｎｍ）（右）または緑色光（５３５ｎｍ）（左）のいずれかを照明した場合の暗区画で過ごした時間の割合（回避の割合）。（ｄ）恐怖条件付け実験のすくみ応答の模式図。（ｅ）時間的パターン刺激の弁別に関する恐怖応答の定量化。定常から２Ｈｚの周波数の刺激（１００μＷ ｃｍ－２）への照明の移行を、対照ｒｄ１、ロドプシン、ＭＷ－オプシン及び野生型マウス（ｎ＝４、６、１２、１０（ペアリング）、ｎ＝７，８、７、１２（非ペアリング））に対する電気ショックとペアリングしたまたはペアリングしていない場合のベースラインを上回るすくみ時間を示す。（ｆ）パターン弁別実験の模式図。１日目にマウスを馴化させ、次いでｉＰａｄに映し出した特定の光パターンと関連した電気ショックに曝露させ、いずれかのチャンバーにランダムにペアリングした（条件付け、２日目及び３日目）。４日目に、位置バイアスを回避するため光パターンを逆にしてショックなしで想起試験（各チャンバーで過ごした時間）を行った（図８ｄを参照のこと）。（ｇ～ｉ）学習したパターンの弁別。ショックとペアリングされたパターンを回避して過ごした時間。（ｇ）水平平行バー対垂直平行バー。（ｈ）１ｃｍの間隔対６ｃｍの間隔の静止平行バー（ｈ）または移動平行バー（ｉ）の弁別。ｇ、ｈ及びｉはそれぞれ、ｒｄ１対照（ｎ＝８、５、１６マウス）、ｒｄ１ロドプシン（青色、ｎ＝８マウス）、ｒｄ１ ＭＷ－オプシン（ｎ＝１７、１１、６マウス）及び野生型（ｎ＝５、６、９マウス）である（２５μＷ ｃｍ－２）。（注：これらの実験の成功の割合は図９ａ～ｃに示す）。光強度＝２５～１００μＷ ｃｍ－２；波長：λ＝５３５ｎｍ（ＭＷ－オプシン）、５１０ｎｍ（ロドプシン）または白色光（ＭＷ－オプシン）。ｎ＝マウスの数。統計学的有意性を、ボンフェローニ補正したスチューデントの両側ｔ検定によって評価した（＊ｐ＜０．０１）。
【0184】
図２２ａ～２２ｂ．弁別課題における位置嗜好性。（ａ）スクリーン近傍で過ごした時間に対する２つのチャンバー間の中央の仕切り近傍で過ごした時間の割合を測定するために、各区画を半分に分割している仮想の仕切りを示す、弁別課題に使用するアリーナの図。（ｂ）嫌悪的な側のスクリーン及び非嫌悪的な側のスクリーンに最も近い区域で過ごした時間に対する、中央の仕切り近傍区域で過ごした時間の比率により、中央の仕切り近傍区域に対する嗜好性が明らかとなる。値は平均値であり、エラーバーはＳＥＭである。
【0185】
ＭＷ－オプシンは明順応を生じさせる
視覚の基本的特性は、幅広い範囲の周囲光強度にわたり対象物を区別する能力である。この順応は、光受容体細胞におけるいくつかの異なる機序によって媒介される。問題は、順応におけるある局面がＭＷ－オプシンを有するＲＧＣに導入されるか否かであった。ＲＧＣにＭＷ－オプシンを発現している網膜を切除し、ＭＥＡ上に載置し、９－ｃｉｓ－レチナールで灌流した。まず、網膜を１５分間完全な暗闇の中に維持し（暗順応させ）、次に、長い間隔（６０秒）で強度の範囲にわたって一連の短い（１秒）緑色光フラッシュ（５３５±２５ｎｍ）で試験した。次に、１０分間、光を中等度の屋内光レベルに適合させて（１００μＷ ｃｍ－２の白色光で明順応させて）、一連の光パルスを繰り返した。
視覚の基本的特性は、幅広い範囲の周囲光強度にわたり対象物を区別する能力である。この順応は、光受容体細胞におけるいくつかの異なる機序によって媒介される。問題は、順応におけるある局面がＭＷ－オプシンを有するＲＧＣに導入されるか否かであった。ＲＧＣにＭＷ－オプシンを発現している網膜を切除し、ＭＥＡ上に載置し、９－ｃｉｓ－レチナールで灌流した。まず、網膜を１５分間完全な暗闇の中に維持し（暗順応させ）、次に、長い間隔（６０秒）で強度の範囲にわたって一連の短い（１秒）緑色光フラッシュ（５３５±２５ｎｍ）で試験した。次に、１０分間、光を中等度の屋内光レベルに適合させて（１００μＷ ｃｍ－２の白色光で明順応させて）、一連の光パルスを繰り返した。
【0186】
光応答の反応速度を試験した。暗順応させた網膜における明るいフラッシュに対する応答が明順応条件下の同一の網膜の約１２倍遅く減衰した（３．１４±０．６３秒、ｎ＝１７１、Ｎ＝３）１例を除いて、上記に示されているように、明順応させた網膜と暗順応させた網膜の双方で光応答は迅速に減衰した（図５ａ及び図１０ａ、ｂ）。インタクトな光受容体によって駆動される光応答は同様の挙動を示し、これは後続の刺激のための脱感作の役割を果たしており４０，４１、ヒトにおいては、一時的に視覚が不鮮明となる明るいフラッシュの後の「残像」の元となると考えられている４２。この独特な特性のため、この暗順応させた網膜の最も明るい光フラッシュへの応答は強度－応答分析から除外した。
【0187】
強度－応答曲線は、暗順応させた網膜は高い光感受性を有し約０．５μＷ ｃｍ－２で応答するが、一方で明順応させた網膜ははるかに感受性が低く、応答までに約１００μＷ ｃｍ－２を必要とすることを示した（図５ｂ、ｃ及び図１０ｃ、ｄ）。この順応により強度曲線が約３桁移動した（７８０±８２、Ｎ＝３）（図５ｂ、ｃ）。この順応の顕著な特徴は、既に天然の錐体光受容体で示されているように４３，４４、暗順応させた網膜と明順応させた網膜における最大光応答が同様であることであった（図５ｃ）。
【0188】
ＲＧＣ内のＭＷ－オプシンによって媒介される光応答が、単離した網膜における明順応を生じさせることが観察されたことから、これが行動している動物において視覚的に有用な明順応に転換されるか否かが問われた。ＲＧＣ内のＭＷ－オプシン媒介性光応答を、光回避行動との関係において試験した。試験に先だって、ＲＧＣにＭＷ－オプシンを発現しているｒｄ１マウスを１時間、完全な暗闇の中（暗順応）または屋内照明下（白色光、１ｍＷ ｃｍ－２／５３５ｎｍの光成分、５０μＷ ｃｍ－２）のいずれかに維持した（図５ｄ）。次に、それらのマウスを、明ボックスに１μＷ ｃｍ－２（屋内光）または１００μＷ ｃｍ－２（屋外光）のいずれかの緑色光（５３５ｎｍ）の照明を備えた２チャンバー式の明／暗ボックス中で、直ちに光回避行動について試験した。明順応させたＭＷ－オプシン発現ｒｄ１マウスは、試験光がそれらのマウスに明順応させた光レベルよりも明るい（５３５ｎｍ、１００μＷ ｃｍ－２）場合、強い光回避を示した（図５ｅ）。試験光がそれらのマウスに明順応させた光レベルよりも暗い（５３５ｎｍ、１μＷ ｃｍ－２）場合、この光回避は減少した（図５ｅ及び図１０ｅ）。対照的に、１μＷ ｃｍ－２の暗い試験光は、暗順応させた動物において高いレベルの光回避をもたらし、行動に関連した明順応を示した。
【0189】
問題は、光回避行動に対する明順応の効果が、学習した視覚像の弁別課題におけるパターン弁別にも作用するか否かであった。上記のように（図４）、弱いフットショックを、２つの隣接したチャンバー内のＬＣＤスクリーン上に異なる間隔で呈示される２つの平行線の表示のうちの１つとペアリングすることにより、マウスを３日間の訓練期間にわたって条件付けした（図４ｈ及び９ｄ）。４日目に、再度視覚刺激のみを用いてマウスを試験したが、今回は試験直前にマウスを１時間の暗順応（光なし）または１時間、４時間もしくは８時間の明順応（白色光）のいずれかに供した。明順応後の想起の間の線パターンの強度は、０．２５μＷ ｃｍ－２または１０μＷ ｃｍ－２のいずれかであった。ＲＧＣにＭＷ－オプシンを発現している暗順応させたｒｄ１マウスは、屋内の低い強度（０．２５μＷ ｃｍ－２）で呈示されようと屋内の中等度の強度（１０μＷ ｃｍ－２）で呈示されようと、線パターンを区別できかつ嫌悪的合図を回避できることが判明した（図５ｆ及び図１０ｆ）。対照的に、明順応させた動物はより明るい試験線パターンにおいてのみ成功し、１時間、４時間及び８時間明順応させた群の間の成績は同一であった（図５ｆ及び１０ｇ）。この結果は、ＭＷ－オプシンによって媒介される空間的パターン弁別が、自然光の強度の範囲にわたり適応可能であることを示す。
【0190】
ＭＷ－オプシンは新規対象物の探索を回復させる
上記の実験は、ＭＷ－オプシンによって、照明された表示を用いて幅広い範囲の光強度にわたるパターン弁別が可能となることを示す。問題は、周囲の偶発的な光が三次元の物体を照明する自然環境においてそれがどのように機能するかであった。この問題に取り組むために、実験には、新規対象物の弁別試験及び探索行動試験に一般に使用されるオープンフィールドのアリーナを採用した６２，６３。マウスは生得的に開放空間を回避し、自身の周囲の壁のすぐ近くに留まる。新規刺激によって、それらの安全な場所からの探索性の移動が誘発され得る。探索中、マウスは複数の感覚モダリティを用いるが、視覚が空間的ナビゲーションに極めて重要であることが示されている６４。アリーナは２つの別個の新規対象物を含有する立方体から構成されていた。動物が壁に沿って歩くにせよ他の目的物を探索するにせよ、偶然遭遇する確率が低くなるように、マウスを対象物から十分遠く離れたアリーナの壁を背にして配置し、対象物同士は十分間隔を空けた。ｒｄ１未処置マウス、ｒｄ１偽注射マウス、ロドプシン発現ｒｄ１マウスまたはＭＷ－オプシン発現ｒｄ１マウス、ならびに野生型動物を撮影した。それらの動物の挙動を、動物をアリーナに配置した最初の１０分間、追跡した（図１３ａ～ｄ）。野生型動物は、盲目ｒｄ１動物の１．５７倍遠くに移動しかつ１．５５倍速い平均速度で動き、既知の探索行動の視覚的要素と一致することが判明した。顕著なことに、野生型動物と同様に、ＭＷ－オプシン発現ｒｄ１動物はそれらの未処置のｒｄ１同腹仔よりもより遠くに（１．３９倍）かつより速く（１．３７倍）移動し（図１３ｅ、ｆ）、ＭＷ－オプシンが正常な新規対象物の探索を補助することが示唆された。このことをさらに分析するために、遠方の視覚に依存する可能性が非常に高い探索行動の局面、すなわち新規対象物を探索するまでの潜時ならびに対象物までの移動における速度及び移動距離に実験の焦点を合わせた。偽注射ｒｄ１マウス及びロドプシン発現ｒｄ１マウスは未処置ｒｄ１動物と同様に行動したが、ＭＷ－オプシンのマウスは未処置のｒｄ１マウスと比較して、第１の対象物及び第２の対象物にそれぞれ３．８８倍及び３．６２倍短い時間で到達し（図１３ｇ、ｈ）、第１の対象物及び第２の対象物へとそれぞれ２．１倍及び１．８３倍速い速度で移動し（図１３ｉ、ｊ）かつ第１の対象物及び第２の対象物までの距離がそれぞれ０．６９倍及び０．６４倍である短い経路を採用した（図１３ｋ、ｌ）。これらの各指標において、ＭＷ－オプシン発現ｒｄ１マウスは野生型動物の指標と同等のレベルに達した（図１３ｅ～ｇ）。これらの結果は、ＲＧＣのＭＷ－オプシンが、既に盲目である動物に周囲光下の対象物の自然な視覚を提供することを示唆する。
上記の実験は、ＭＷ－オプシンによって、照明された表示を用いて幅広い範囲の光強度にわたるパターン弁別が可能となることを示す。問題は、周囲の偶発的な光が三次元の物体を照明する自然環境においてそれがどのように機能するかであった。この問題に取り組むために、実験には、新規対象物の弁別試験及び探索行動試験に一般に使用されるオープンフィールドのアリーナを採用した６２，６３。マウスは生得的に開放空間を回避し、自身の周囲の壁のすぐ近くに留まる。新規刺激によって、それらの安全な場所からの探索性の移動が誘発され得る。探索中、マウスは複数の感覚モダリティを用いるが、視覚が空間的ナビゲーションに極めて重要であることが示されている６４。アリーナは２つの別個の新規対象物を含有する立方体から構成されていた。動物が壁に沿って歩くにせよ他の目的物を探索するにせよ、偶然遭遇する確率が低くなるように、マウスを対象物から十分遠く離れたアリーナの壁を背にして配置し、対象物同士は十分間隔を空けた。ｒｄ１未処置マウス、ｒｄ１偽注射マウス、ロドプシン発現ｒｄ１マウスまたはＭＷ－オプシン発現ｒｄ１マウス、ならびに野生型動物を撮影した。それらの動物の挙動を、動物をアリーナに配置した最初の１０分間、追跡した（図１３ａ～ｄ）。野生型動物は、盲目ｒｄ１動物の１．５７倍遠くに移動しかつ１．５５倍速い平均速度で動き、既知の探索行動の視覚的要素と一致することが判明した。顕著なことに、野生型動物と同様に、ＭＷ－オプシン発現ｒｄ１動物はそれらの未処置のｒｄ１同腹仔よりもより遠くに（１．３９倍）かつより速く（１．３７倍）移動し（図１３ｅ、ｆ）、ＭＷ－オプシンが正常な新規対象物の探索を補助することが示唆された。このことをさらに分析するために、遠方の視覚に依存する可能性が非常に高い探索行動の局面、すなわち新規対象物を探索するまでの潜時ならびに対象物までの移動における速度及び移動距離に実験の焦点を合わせた。偽注射ｒｄ１マウス及びロドプシン発現ｒｄ１マウスは未処置ｒｄ１動物と同様に行動したが、ＭＷ－オプシンのマウスは未処置のｒｄ１マウスと比較して、第１の対象物及び第２の対象物にそれぞれ３．８８倍及び３．６２倍短い時間で到達し（図１３ｇ、ｈ）、第１の対象物及び第２の対象物へとそれぞれ２．１倍及び１．８３倍速い速度で移動し（図１３ｉ、ｊ）かつ第１の対象物及び第２の対象物までの距離がそれぞれ０．６９倍及び０．６４倍である短い経路を採用した（図１３ｋ、ｌ）。これらの各指標において、ＭＷ－オプシン発現ｒｄ１マウスは野生型動物の指標と同等のレベルに達した（図１３ｅ～ｇ）。これらの結果は、ＲＧＣのＭＷ－オプシンが、既に盲目である動物に周囲光下の対象物の自然な視覚を提供することを示唆する。
【0191】
図５ａ～５ｆ．ＭＷ－オプシンによって媒介されるＲＧＣの活動における明順応及び視覚誘導行動。（ａ～ｃ）暗順応させた網膜と明順応させた網膜との感受性の差を示す、ｒｄ１マウス網膜のＲＧＣ内のＭＷ－オプシンによって媒介される、単離した網膜におけるＲＧＣの光応答のＭＥＡ記録。（ａ）明順応条件に対する暗順応条件におけるフラッシュ強度の関数としての光応答の減衰（Ｔａｕ ＯＦＦ）（Ｎ＝３網膜、ｎ＝１７１細胞）。（ｂ）最初に暗順応させて（塗りつぶし記号）、次いで明順応させた（白抜き記号）代表的な網膜の強度－応答曲線の例（ｎ＝５７細胞）。白色光への順応である。ＣｈＲ２の最小値はＢｉ ｅｔ ａｌ．（２００６）８及びＳｅｎｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．（２０１６）１３によるものである。（ｃ）最初に暗順応させて次いで明順応させた、同一の網膜における３回のフラッシュの強度の平均（エラーバーはＳＥＭである）正規化光応答指数（ＬＲＩ）（Ｎ＝３網膜、ｎ＝１７１細胞）。（ｄ～ｆ）視覚誘導課題における明順応を示す行動。（ｄ）生得的な回避行動または学習したパターンの弁別行動の試験前における暗順応または明順応の模式図。（ｅ）１時間の暗順応（ｎ＝１１マウス）または明順応（白色光；１ｍＷ ｃｍ－２／５３５ｎｍのスペクトル成分；５０μＷ ｃｍ－２；ｎ＝１２、１３マウス）後、屋外光（１００μＷ ｃｍ－２）または屋内光（１μＷ ｃｍ－２）の下で暗区画で過ごした時間の割合（回避の割合）。（ｆ）１時間の暗順応（ｎ＝８、８マウス）または明順応（白色光；１ｍＷ ｃｍ－２／５３５ｎｍのスペクトル成分；５０μＷ ｃｍ－２；ｎ＝７、７マウス）後、低い光レベル（０．２５μＷ ｃｍ－２）または屋内の光レベル（１０μＷ ｃｍ－２）で呈示された、１ｃｍの間隔を空けた平行バー対６ｃｍの間隔を空けた平行バーの学習したパターンの弁別。点線は未処置のｒｄ１対照マウスにおける成績の平均を示す。光強度：３．８２×１０－１ｍＷ ｃｍ－２、波長：λ＝５３５ｎｍ。すべての細胞はソーティングしたユニットを指す。値は平均±ＳＥＭである。統計学的有意性はマン・ホイットニーのＵ検定（＊ｐ≦０．０１）を用いて評価した。ボンフェローニ補正したスチューデントの両側ｔ検定：＊ｐ＜０．０５。
【0192】
図１０ａ～１０ｇ．切除した網膜及びマウスの視覚的行動における明順応。（ａ～ｄ）ＭＷ－オプシン発現網膜における平均的なＲＧＣ集団の応答の代表的なトレース（ｎ＝５７）。暗順応（ａ、ｃ）または明順応（ｂ、ｄ）後の、３．８２ｘ１０１ｍＷ ｃｍ－２（ａ、ｂ）または３．８２ｘ１０－３ ｍＷ ｃｍ－２（ｃ、ｄ）の５００ｍｓの光フラッシュに対する応答。（ｅ）１時間の明順応（白色光；１ｍＷ ｃｍ－２／５３５ｎｍのスペクトル成分；５０μＷ ｃｍ－２）後、屋内光（１μＷ ｃｍ－２、ｎ＝１２マウス）及び屋外光（１００μＷ ｃｍ－２、ｎ＝１３マウス）の下で回避に成功したマウスの割合と比較した、１時間の暗順応（ｎ＝１１マウス）後の、屋内光（１μＷ ｃｍ－２）の下での明区画の回避（成功した回避試験の割合）。（ｆ）１時間の暗順応（０．２５μＷ ｃｍ－２でｎ＝８マウス、１０μＷ ｃｍ－２でｎ＝８マウス）または明順応（０．２５μＷ ｃｍ－２でｎ＝７マウス、１０μＷ ｃｍ－２でｎ＝７マウス）後、低い光レベル（０．２５μＷ ｃｍ－２）または屋内の光レベル（１０μＷ ｃｍ－２）で呈示された、１ｃｍの間隔を空けた平行バー対６ｃｍの間隔を空けた平行バーの弁別に成功した割合。（ｇ）順応させていないｒｄ１対照と比較した、１時間、４時間または８時間の明順応（ｎ＝７、４、４）後に、屋内（１０μＷ ｃｍ－２）の光レベルで呈示された、１ｃｍの間隔を空けた平行バー対６ｃｍの間隔を空けた平行バーの学習したパターンの弁別。
【0193】
図１１（表１）．光回避及び学習した視覚誘導行動の統計学的有意性。条件行動の回避能力に関して成功率を算出した（図４、５及び図９、１０）。次に、条件間の差異における有意性を決定するためペアワイズ分割表を作図し、まず、ピアソンのカイ二乗両側検定を実施した。小標本を含む条件を補正するために、フィッシャーの直接確率片側検定も実施した。
【0194】
参考文献
【0195】
本発明をその特定の実施形態を参照して説明してきたが、本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更を実施してもよく、等価物と置き換えてもよいことを当業者は理解されたい。さらに、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、１つまたは複数のプロセス段階が本発明の目的、趣旨、及び範囲に適合するように、多くの改変を実施することができる。そのような改変はすべて、本明細書に添付される特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【0196】
配列情報
SEQUENCE LISTING
<110> The Regents of the University of California
<120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR ENHANCING VISUAL FUNCTION
<150> US 62/585,237
<151> 2017-11-13
<150> US 62/589,476
<151> 2017-11-21
<150> US 62/641,783
<151> 2018-03-12
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 364
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Ala Gln Gln Trp Ser Leu Gln Arg Leu Ala Gly Arg His Pro Gln
1 5 10 15
Asp Ser Tyr Glu Asp Ser Thr Gln Ser Ser Ile Phe Thr Tyr Thr Asn
20 25 30
Ser Asn Ser Thr Arg Gly Pro Phe Glu Gly Pro Asn Tyr His Ile Ala
35 40 45
Pro Arg Trp Val Tyr His Leu Thr Ser Val Trp Met Ile Phe Val Val
50 55 60
Ile Ala Ser Val Phe Thr Asn Gly Leu Val Leu Ala Ala Thr Met Lys
65 70 75 80
Phe Lys Lys Leu Arg His Pro Leu Asn Trp Ile Leu Val Asn Leu Ala
85 90 95
Val Ala Asp Leu Ala Glu Thr Val Ile Ala Ser Thr Ile Ser Val Val
100 105 110
Asn Gln Val Tyr Gly Tyr Phe Val Leu Gly His Pro Met Cys Val Leu
115 120 125
Glu Gly Tyr Thr Val Ser Leu Cys Gly Ile Thr Gly Leu Trp Ser Leu
130 135 140
Ala Ile Ile Ser Trp Glu Arg Trp Met Val Val Cys Lys Pro Phe Gly
145 150 155 160
Asn Val Arg Phe Asp Ala Lys Leu Ala Ile Val Gly Ile Ala Phe Ser
165 170 175
Trp Ile Trp Ala Ala Val Trp Thr Ala Pro Pro Ile Phe Gly Trp Ser
180 185 190
Arg Tyr Trp Pro His Gly Leu Lys Thr Ser Cys Gly Pro Asp Val Phe
195 200 205
Ser Gly Ser Ser Tyr Pro Gly Val Gln Ser Tyr Met Ile Val Leu Met
210 215 220
Val Thr Cys Cys Ile Thr Pro Leu Ser Ile Ile Val Leu Cys Tyr Leu
225 230 235 240
Gln Val Trp Leu Ala Ile Arg Ala Val Ala Lys Gln Gln Lys Glu Ser
245 250 255
Glu Ser Thr Gln Lys Ala Glu Lys Glu Val Thr Arg Met Val Val Val
260 265 270
Met Val Leu Ala Phe Cys Phe Cys Trp Gly Pro Tyr Ala Phe Phe Ala
275 280 285
Cys Phe Ala Ala Ala Asn Pro Gly Tyr Pro Phe His Pro Leu Met Ala
290 295 300
Ala Leu Pro Ala Phe Phe Ala Lys Ser Ala Thr Ile Tyr Asn Pro Val
305 310 315 320
Ile Tyr Val Phe Met Asn Arg Gln Phe Arg Asn Cys Ile Leu Gln Leu
325 330 335
Phe Gly Lys Lys Val Asp Asp Gly Ser Glu Leu Ser Ser Ala Ser Lys
340 345 350
Thr Glu Val Ser Ser Val Ser Ser Val Ser Pro Ala
355 360
<210> 2
<211> 348
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Asn Gly Thr Glu Gly Pro Asn Phe Tyr Val Pro Phe Ser Asn Ala
1 5 10 15
Thr Gly Val Val Arg Ser Pro Phe Glu Tyr Pro Gln Tyr Tyr Leu Ala
20 25 30
Glu Pro Trp Gln Phe Ser Met Leu Ala Ala Tyr Met Phe Leu Leu Ile
35 40 45
Val Leu Gly Phe Pro Ile Asn Phe Leu Thr Leu Tyr Val Thr Val Gln
50 55 60
His Lys Lys Leu Arg Thr Pro Leu Asn Tyr Ile Leu Leu Asn Leu Ala
65 70 75 80
Val Ala Asp Leu Phe Met Val Leu Gly Gly Phe Thr Ser Thr Leu Tyr
85 90 95
Thr Ser Leu His Gly Tyr Phe Val Phe Gly Pro Thr Gly Cys Asn Leu
100 105 110
Glu Gly Phe Phe Ala Thr Leu Gly Gly Glu Ile Ala Leu Trp Ser Leu
115 120 125
Val Val Leu Ala Ile Glu Arg Tyr Val Val Val Cys Lys Pro Met Ser
130 135 140
Asn Phe Arg Phe Gly Glu Asn His Ala Ile Met Gly Val Ala Phe Thr
145 150 155 160
Trp Val Met Ala Leu Ala Cys Ala Ala Pro Pro Leu Ala Gly Trp Ser
165 170 175
Arg Tyr Ile Pro Glu Gly Leu Gln Cys Ser Cys Gly Ile Asp Tyr Tyr
180 185 190
Thr Leu Lys Pro Glu Val Asn Asn Glu Ser Phe Val Ile Tyr Met Phe
195 200 205
Val Val His Phe Thr Ile Pro Met Ile Ile Ile Phe Phe Cys Tyr Gly
210 215 220
Gln Leu Val Phe Thr Val Lys Glu Ala Ala Ala Gln Gln Gln Glu Ser
225 230 235 240
Ala Thr Thr Gln Lys Ala Glu Lys Glu Val Thr Arg Met Val Ile Ile
245 250 255
Met Val Ile Ala Phe Leu Ile Cys Trp Val Pro Tyr Ala Ser Val Ala
260 265 270
Phe Tyr Ile Phe Thr His Gln Gly Ser Asn Phe Gly Pro Ile Phe Met
275 280 285
Thr Ile Pro Ala Phe Phe Ala Lys Ser Ala Ala Ile Tyr Asn Pro Val
290 295 300
Ile Tyr Ile Met Met Asn Lys Gln Phe Arg Asn Cys Met Leu Thr Thr
305 310 315 320
Ile Cys Cys Gly Lys Asn Pro Leu Gly Asp Asp Glu Ala Ser Ala Thr
325 330 335
Val Ser Lys Thr Glu Thr Ser Gln Val Ala Pro Ala
340 345
<210> 3
<211> 310
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence
<400> 3
Met Asp Tyr Gly Gly Ala Leu Ser Ala Val Gly Arg Glu Leu Leu Phe
1 5 10 15
Val Thr Asn Pro Val Val Val Asn Gly Ser Val Leu Val Pro Glu Asp
20 25 30
Gln Cys Tyr Cys Ala Gly Trp Ile Glu Ser Arg Gly Thr Asn Gly Ala
35 40 45
Gln Thr Ala Ser Asn Val Leu Gln Trp Leu Ala Ala Gly Phe Ser Ile
50 55 60
Leu Leu Leu Met Phe Tyr Ala Tyr Gln Thr Trp Lys Ser Thr Cys Gly
65 70 75 80
Trp Glu Glu Ile Tyr Val Cys Ala Ile Glu Met Val Lys Val Ile Leu
85 90 95
Glu Phe Phe Phe Glu Phe Lys Asn Pro Ser Met Leu Tyr Leu Ala Thr
100 105 110
Gly His Arg Val Gln Trp Leu Arg Tyr Ala Glu Trp Leu Leu Thr Cys
115 120 125
Pro Val Ile Leu Ile His Leu Ser Asn Leu Thr Gly Leu Ser Asn Asp
130 135 140
Tyr Ser Arg Arg Thr Met Gly Leu Leu Val Ser Asp Ile Gly Thr Ile
145 150 155 160
Val Trp Gly Ala Thr Ser Ala Met Ala Thr Gly Tyr Val Lys Val Ile
165 170 175
Phe Phe Cys Leu Gly Leu Cys Tyr Gly Ala Asn Thr Phe Phe His Ala
180 185 190
Ala Lys Ala Tyr Ile Glu Gly Tyr His Thr Val Pro Lys Gly Arg Cys
195 200 205
Arg Gln Val Val Thr Gly Met Ala Trp Leu Phe Phe Val Ser Trp Gly
210 215 220
Met Phe Pro Ile Leu Phe Ile Leu Gly Pro Glu Gly Phe Gly Val Leu
225 230 235 240
Ser Val Tyr Gly Ser Thr Val Gly His Thr Ile Ile Asp Leu Met Ser
245 250 255
Lys Asn Cys Trp Gly Leu Leu Gly His Tyr Leu Arg Val Leu Ile His
260 265 270
Glu His Ile Leu Ile His Gly Asp Ile Arg Lys Thr Thr Lys Leu Asn
275 280 285
Ile Gly Gly Thr Glu Ile Glu Val Glu Thr Leu Val Glu Asp Glu Ala
290 295 300
Glu Ala Gly Ala Val Pro
305 310
<210> 4
<211> 364
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Met Ala Gln Gln Trp Ser Leu Gln Arg Leu Ala Gly Arg His Pro Gln
1 5 10 15
Asp Ser Tyr Glu Asp Ser Thr Gln Ser Ser Ile Phe Thr Tyr Thr Asn
20 25 30
Ser Asn Ser Thr Arg Gly Pro Phe Glu Gly Pro Asn Tyr His Ile Ala
35 40 45
Pro Arg Trp Val Tyr His Leu Thr Ser Val Trp Met Ile Phe Val Val
50 55 60
Thr Ala Ser Val Phe Thr Asn Gly Leu Val Leu Ala Ala Thr Met Lys
65 70 75 80
Phe Lys Lys Leu Arg His Pro Leu Asn Trp Ile Leu Val Asn Leu Ala
85 90 95
Val Ala Asp Leu Ala Glu Thr Val Ile Ala Ser Thr Ile Ser Ile Val
100 105 110
Asn Gln Val Ser Gly Tyr Phe Val Leu Gly His Pro Met Cys Val Leu
115 120 125
Glu Gly Tyr Thr Val Ser Leu Cys Gly Ile Thr Gly Leu Trp Ser Leu
130 135 140
Ala Ile Ile Ser Trp Glu Arg Trp Met Val Val Cys Lys Pro Phe Gly
145 150 155 160
Asn Val Arg Phe Asp Ala Lys Leu Ala Ile Val Gly Ile Ala Phe Ser
165 170 175
Trp Ile Trp Ala Ala Val Trp Thr Ala Pro Pro Ile Phe Gly Trp Ser
180 185 190
Arg Tyr Trp Pro His Gly Leu Lys Thr Ser Cys Gly Pro Asp Val Phe
195 200 205
Ser Gly Ser Ser Tyr Pro Gly Val Gln Ser Tyr Met Ile Val Leu Met
210 215 220
Val Thr Cys Cys Ile Ile Pro Leu Ala Ile Ile Met Leu Cys Tyr Leu
225 230 235 240
Gln Val Trp Leu Ala Ile Arg Ala Val Ala Lys Gln Gln Lys Glu Ser
245 250 255
Glu Ser Thr Gln Lys Ala Glu Lys Glu Val Thr Arg Met Val Val Val
260 265 270
Met Ile Phe Ala Tyr Cys Val Cys Trp Gly Pro Tyr Thr Phe Phe Ala
275 280 285
Cys Phe Ala Ala Ala Asn Pro Gly Tyr Ala Phe His Pro Leu Met Ala
290 295 300
Ala Leu Pro Ala Tyr Phe Ala Lys Ser Ala Thr Ile Tyr Asn Pro Val
305 310 315 320
Ile Tyr Val Phe Met Asn Arg Gln Phe Arg Asn Cys Ile Leu Gln Leu
325 330 335
Phe Gly Lys Lys Val Asp Asp Gly Ser Glu Leu Ser Ser Ala Ser Lys
340 345 350
Thr Glu Val Ser Ser Val Ser Ser Val Ser Pro Ala
355 360
<210> 5
<211> 348
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Met Arg Lys Met Ser Glu Glu Glu Phe Tyr Leu Phe Lys Asn Ile Ser
1 5 10 15
Ser Val Gly Pro Trp Asp Gly Pro Gln Tyr His Ile Ala Pro Val Trp
20 25 30
Ala Phe Tyr Leu Gln Ala Ala Phe Met Gly Thr Val Phe Leu Ile Gly
35 40 45
Phe Pro Leu Asn Ala Met Val Leu Val Ala Thr Leu Arg Tyr Lys Lys
50 55 60
Leu Arg Gln Pro Leu Asn Tyr Ile Leu Val Asn Val Ser Phe Gly Gly
65 70 75 80
Phe Leu Leu Cys Ile Phe Ser Val Phe Pro Val Phe Val Ala Ser Cys
85 90 95
Asn Gly Tyr Phe Val Phe Gly Arg His Val Cys Ala Leu Glu Gly Phe
100 105 110
Leu Gly Thr Val Ala Gly Leu Val Thr Gly Trp Ser Leu Ala Phe Leu
115 120 125
Ala Phe Glu Arg Tyr Ile Val Ile Cys Lys Pro Phe Gly Asn Phe Arg
130 135 140
Phe Ser Ser Lys His Ala Leu Thr Val Val Leu Ala Thr Trp Thr Ile
145 150 155 160
Gly Ile Gly Val Ser Ile Pro Pro Phe Phe Gly Trp Ser Arg Phe Ile
165 170 175
Pro Glu Gly Leu Gln Cys Ser Cys Gly Pro Asp Trp Tyr Thr Val Gly
180 185 190
Thr Lys Tyr Arg Ser Glu Ser Tyr Thr Trp Phe Leu Phe Ile Phe Cys
195 200 205
Phe Ile Val Pro Leu Ser Leu Ile Cys Phe Ser Tyr Thr Gln Leu Leu
210 215 220
Arg Ala Leu Lys Ala Val Ala Ala Gln Gln Gln Glu Ser Ala Thr Thr
225 230 235 240
Gln Lys Ala Glu Arg Glu Val Ser Arg Met Val Val Val Met Val Gly
245 250 255
Ser Phe Cys Val Cys Tyr Val Pro Tyr Ala Ala Phe Ala Met Tyr Met
260 265 270
Val Asn Asn Arg Asn His Gly Leu Asp Leu Arg Leu Val Thr Ile Pro
275 280 285
Ser Phe Phe Ser Lys Ser Ala Cys Ile Tyr Asn Pro Ile Ile Tyr Cys
290 295 300
Phe Met Asn Lys Gln Phe Gln Ala Cys Ile Met Lys Met Val Cys Gly
305 310 315 320
Lys Ala Met Thr Asp Glu Ser Asp Thr Cys Ser Ser Gln Lys Thr Glu
325 330 335
Val Ser Thr Val Ser Ser Thr Gln Val Gly Pro Asn
340 345
<210> 6
<211> 346
<212> PRT
<213> Mus Musculus
<400> 6
Met Ser Gly Glu Asp Asp Phe Tyr Leu Phe Gln Asn Ile Ser Ser Val
1 5 10 15
Gly Pro Trp Asp Gly Pro Gln Tyr His Leu Ala Pro Val Trp Ala Phe
20 25 30
Arg Leu Gln Ala Ala Phe Met Gly Phe Val Phe Phe Val Gly Thr Pro
35 40 45
Leu Asn Ala Ile Val Leu Val Ala Thr Leu His Tyr Lys Lys Leu Arg
50 55 60
Gln Pro Leu Asn Tyr Ile Leu Val Asn Val Ser Leu Gly Gly Phe Leu
65 70 75 80
Phe Cys Ile Phe Ser Val Phe Thr Val Phe Ile Ala Ser Cys His Gly
85 90 95
Tyr Phe Leu Phe Gly Arg His Val Cys Ala Leu Glu Ala Phe Leu Gly
100 105 110
Ser Val Ala Gly Leu Val Thr Gly Trp Ser Leu Ala Phe Leu Ala Phe
115 120 125
Glu Arg Tyr Val Val Ile Cys Lys Pro Phe Gly Ser Ile Arg Phe Asn
130 135 140
Ser Lys His Ala Leu Met Val Val Leu Ala Thr Trp Ile Ile Gly Ile
145 150 155 160
Gly Val Ser Ile Pro Pro Phe Phe Gly Trp Ser Arg Phe Ile Pro Glu
165 170 175
Gly Leu Gln Cys Ser Cys Gly Pro Asp Trp Tyr Thr Val Gly Thr Lys
180 185 190
Tyr Arg Ser Glu Tyr Tyr Thr Trp Phe Leu Phe Ile Phe Cys Phe Ile
195 200 205
Ile Pro Leu Ser Leu Ile Cys Phe Ser Tyr Ser Gln Leu Leu Arg Thr
210 215 220
Leu Arg Ala Val Ala Ala Gln Gln Gln Glu Ser Ala Thr Thr Gln Lys
225 230 235 240
Ala Glu Arg Glu Val Ser His Met Val Val Val Met Val Gly Ser Phe
245 250 255
Cys Leu Cys Tyr Val Pro Tyr Ala Ala Leu Ala Met Tyr Met Val Asn
260 265 270
Asn Arg Asn His Gly Leu Asp Leu Arg Leu Val Thr Ile Pro Ala Phe
275 280 285
Phe Ser Lys Ser Ser Cys Val Tyr Asn Pro Ile Ile Tyr Cys Phe Met
290 295 300
Asn Lys Gln Phe Arg Ala Cys Ile Leu Glu Met Val Cys Arg Lys Pro
305 310 315 320
Met Ala Asp Glu Ser Asp Val Ser Gly Ser Gln Lys Thr Glu Val Ser
325 330 335
Thr Val Ser Ser Ser Lys Val Gly Pro His
340 345
<210> 7
<211> 343
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence
<400> 7
Glu Asp Asp Phe Tyr Leu Phe Gln Asn Ile Ser Ser Val Gly Pro Trp
1 5 10 15
Asp Gly Pro Gln Tyr His Leu Ala Pro Val Trp Ala Phe Tyr Leu Gln
20 25 30
Ala Ala Phe Met Gly Thr Val Phe Leu Ile Gly Phe Pro Leu Asn Ala
35 40 45
Met Val Leu Val Ala Thr Leu His Tyr Lys Lys Leu Arg Gln Pro Leu
50 55 60
Asn Tyr Ile Leu Val Asn Val Ser Phe Gly Gly Phe Leu Leu Cys Ile
65 70 75 80
Phe Ser Val Phe Pro Val Phe Val Ala Ser Cys Asn Gly Tyr Phe Val
85 90 95
Phe Gly Arg His Val Cys Ala Leu Glu Gly Phe Leu Gly Thr Val Ala
100 105 110
Gly Leu Val Thr Gly Trp Ser Leu Ala Phe Leu Ala Phe Glu Arg Tyr
115 120 125
Val Val Ile Cys Lys Pro Phe Gly Ser Ile Arg Phe Asn Ser Lys His
130 135 140
Ala Leu Thr Val Val Leu Ala Thr Trp Thr Ile Gly Ile Gly Val Ser
145 150 155 160
Ile Pro Pro Phe Phe Gly Trp Ser Arg Phe Ile Pro Glu Gly Leu Gln
165 170 175
Cys Ser Cys Gly Pro Asp Trp Tyr Thr Val Gly Thr Lys Tyr Arg Ser
180 185 190
Glu Ser Tyr Thr Trp Phe Leu Phe Ile Phe Cys Phe Ile Val Pro Leu
195 200 205
Ser Leu Ile Cys Phe Ser Tyr Thr Gln Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala
210 215 220
Val Ala Ala Gln Gln Gln Glu Ser Ala Thr Thr Gln Lys Ala Glu Arg
225 230 235 240
Glu Val Ser His Met Val Val Val Met Val Gly Ser Phe Cys Val Cys
245 250 255
Tyr Val Pro Tyr Ala Ala Phe Ala Met Tyr Met Val Asn Asn Arg Asn
260 265 270
His Gly Leu Asp Leu Arg Leu Val Thr Ile Pro Ser Phe Phe Ser Lys
275 280 285
Ser Ala Cys Ile Tyr Asn Pro Ile Ile Tyr Cys Phe Met Asn Lys Gln
290 295 300
Phe Arg Ala Cys Ile Leu Glu Met Val Cys Arg Lys Pro Met Ala Asp
305 310 315 320
Glu Ser Asp Val Ser Gly Ser Gln Lys Thr Glu Val Ser Thr Val Ser
325 330 335
Ser Ser Lys Val Gly Pro His
340
<210> 8
<211> 359
<212> PRT
<213> Mus Musculus
<400> 8
Met Ala Gln Arg Leu Thr Gly Glu Gln Thr Leu Asp His Tyr Glu Asp
1 5 10 15
Ser Thr His Ala Ser Ile Phe Thr Tyr Thr Asn Ser Asn Ser Thr Lys
20 25 30
Gly Pro Phe Glu Gly Pro Asn Tyr His Ile Ala Pro Arg Trp Val Tyr
35 40 45
His Leu Thr Ser Thr Trp Met Ile Leu Val Val Val Ala Ser Val Phe
50 55 60
Thr Asn Gly Leu Val Leu Ala Ala Thr Met Arg Phe Lys Lys Leu Arg
65 70 75 80
His Pro Leu Asn Trp Ile Leu Val Asn Leu Ala Val Ala Asp Leu Ala
85 90 95
Glu Thr Ile Ile Ala Ser Thr Ile Ser Val Val Asn Gln Ile Tyr Gly
100 105 110
Tyr Phe Val Leu Gly His Pro Leu Cys Val Ile Glu Gly Tyr Ile Val
115 120 125
Ser Leu Cys Gly Ile Thr Gly Leu Trp Ser Leu Ala Ile Ile Ser Trp
130 135 140
Glu Arg Trp Leu Val Val Cys Lys Pro Phe Gly Asn Val Arg Phe Asp
145 150 155 160
Ala Lys Leu Ala Thr Val Gly Ile Val Phe Ser Trp Val Trp Ala Ala
165 170 175
Ile Trp Thr Ala Pro Pro Ile Phe Gly Trp Ser Arg Tyr Trp Pro Tyr
180 185 190
Gly Leu Lys Thr Ser Cys Gly Pro Asp Val Phe Ser Gly Thr Ser Tyr
195 200 205
Pro Gly Val Gln Ser Tyr Met Met Val Leu Met Val Thr Cys Cys Ile
210 215 220
Phe Pro Leu Ser Ile Ile Val Leu Cys Tyr Leu Gln Val Trp Leu Ala
225 230 235 240
Ile Arg Ala Val Ala Lys Gln Gln Lys Glu Ser Glu Ser Thr Gln Lys
245 250 255
Ala Glu Lys Glu Val Thr Arg Met Val Val Val Met Val Phe Ala Tyr
260 265 270
Cys Leu Cys Trp Gly Pro Tyr Thr Phe Phe Ala Cys Phe Ala Thr Ala
275 280 285
His Pro Gly Tyr Ala Phe His Pro Leu Val Ala Ser Leu Pro Ser Tyr
290 295 300
Phe Ala Lys Ser Ala Thr Ile Tyr Asn Pro Ile Ile Tyr Val Phe Met
305 310 315 320
Asn Arg Gln Phe Arg Asn Cys Ile Leu His Leu Phe Gly Lys Lys Val
325 330 335
Asp Asp Ser Ser Glu Leu Ser Ser Thr Ser Lys Thr Glu Val Ser Ser
340 345 350
Val Ser Ser Val Ser Pro Ala
355
<210> 9
<211> 348
<212> PRT
<213> Mus Musculus
<400> 9
Met Asn Gly Thr Glu Gly Pro Asn Phe Tyr Val Pro Phe Ser Asn Val
1 5 10 15
Thr Gly Val Val Arg Ser Pro Phe Glu Gln Pro Gln Tyr Tyr Leu Ala
20 25 30
Glu Pro Trp Gln Phe Ser Met Leu Ala Ala Tyr Met Phe Leu Leu Ile
35 40 45
Val Leu Gly Phe Pro Ile Asn Phe Leu Thr Leu Tyr Val Thr Val Gln
50 55 60
His Lys Lys Leu Arg Thr Pro Leu Asn Tyr Ile Leu Leu Asn Leu Ala
65 70 75 80
Val Ala Asp Leu Phe Met Val Phe Gly Gly Phe Thr Thr Thr Leu Tyr
85 90 95
Thr Ser Leu His Gly Tyr Phe Val Phe Gly Pro Thr Gly Cys Asn Leu
100 105 110
Glu Gly Phe Phe Ala Thr Leu Gly Gly Glu Ile Ala Leu Trp Ser Leu
115 120 125
Val Val Leu Ala Ile Glu Arg Tyr Val Val Val Cys Lys Pro Met Ser
130 135 140
Asn Phe Arg Phe Gly Glu Asn His Ala Ile Met Gly Val Val Phe Thr
145 150 155 160
Trp Ile Met Ala Leu Ala Cys Ala Ala Pro Pro Leu Val Gly Trp Ser
165 170 175
Arg Tyr Ile Pro Glu Gly Met Gln Cys Ser Cys Gly Ile Asp Tyr Tyr
180 185 190
Thr Leu Lys Pro Glu Val Asn Asn Glu Ser Phe Val Ile Tyr Met Phe
195 200 205
Val Val His Phe Thr Ile Pro Met Ile Val Ile Phe Phe Cys Tyr Gly
210 215 220
Gln Leu Val Phe Thr Val Lys Glu Ala Ala Ala Gln Gln Gln Glu Ser
225 230 235 240
Ala Thr Thr Gln Lys Ala Glu Lys Glu Val Thr Arg Met Val Ile Ile
245 250 255
Met Val Ile Phe Phe Leu Ile Cys Trp Leu Pro Tyr Ala Ser Val Ala
260 265 270
Phe Tyr Ile Phe Thr His Gln Gly Ser Asn Phe Gly Pro Ile Phe Met
275 280 285
Thr Leu Pro Ala Phe Phe Ala Lys Ser Ser Ser Ile Tyr Asn Pro Val
290 295 300
Ile Tyr Ile Met Leu Asn Lys Gln Phe Arg Asn Cys Met Leu Thr Thr
305 310 315 320
Leu Cys Cys Gly Lys Asn Pro Leu Gly Asp Asp Asp Ala Ser Ala Thr
325 330 335
Ala Ser Lys Thr Glu Thr Ser Gln Val Ala Pro Ala
340 345
<210> 10
<211> 736
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence
<400> 10
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125
Phe Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly
145 150 155 160
Lys Thr Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro
180 185 190
Ala Thr Pro Ala Ala Val Gly Pro Thr Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly
195 200 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Ala Ser Thr Gly Ala Ser Asn Asp Asn His
260 265 270
Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe
275 280 285
His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn
290 295 300
Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln
305 310 315 320
Val Lys Glu Val Thr Thr Asn Asp Gly Val Thr Thr Ile Ala Asn Asn
325 330 335
Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ser Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro
340 345 350
Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala
355 360 365
Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly
370 375 380
Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro
385 390 395 400
Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe
405 410 415
Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp
420 425 430
Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg
435 440 445
Thr Gln Asn Gln Ser Gly Ser Ala Gln Asn Lys Asp Leu Leu Phe Ser
450 455 460
Arg Gly Ser Pro Ala Gly Met Ser Val Gln Pro Lys Asn Trp Leu Pro
465 470 475 480
Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Lys Thr Asp Asn
485 490 495
Asn Asn Ser Asn Phe Thr Trp Thr Gly Ala Ser Lys Tyr Asn Leu Asn
500 505 510
Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Pro Gly Thr Ala Met Ala Ser His Lys
515 520 525
Asp Asp Lys Asp Lys Phe Phe Pro Met Ser Gly Val Met Ile Phe Gly
530 535 540
Lys Glu Ser Ala Gly Ala Ser Asn Thr Ala Leu Asp Asn Val Met Ile
545 550 555 560
Thr Asp Glu Glu Glu Ile Lys Ala Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Arg
565 570 575
Phe Gly Thr Val Ala Val Asn Leu Gln Ser Ser Ser Thr Asp Pro Ala
580 585 590
Thr Gly Asp Val His Val Met Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln
595 600 605
Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His
610 615 620
Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu
625 630 635 640
Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala
645 650 655
Asn Pro Pro Ala Glu Phe Ser Ala Thr Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr
660 665 670
Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln
675 680 685
Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Tyr Thr Ser Asn
690 695 700
Tyr Ala Lys Ser Ala Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Asn Asn Gly Leu
705 710 715 720
Tyr Thr Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro Leu
725 730 735
<210> 11
<211> 736
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence
<400> 11
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125
Phe Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly
145 150 155 160
Lys Thr Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro
180 185 190
Ala Thr Pro Ala Ala Val Gly Pro Thr Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly
195 200 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Ala Ser Thr Gly Ala Ser Asn Asp Asn His
260 265 270
Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe
275 280 285
His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn
290 295 300
Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Val Gln
305 310 315 320
Val Lys Glu Val Thr Thr Asn Asp Gly Val Thr Thr Ile Ala Asn Asn
325 330 335
Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ser Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro
340 345 350
Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala
355 360 365
Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly
370 375 380
Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro
385 390 395 400
Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe
405 410 415
Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp
420 425 430
Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg
435 440 445
Thr Gln Asp Gln Ser Gly Ser Ala Gln Asn Lys Asp Leu Leu Phe Ser
450 455 460
Arg Gly Ser Pro Ala Gly Met Ser Val Gln Pro Lys Asn Trp Leu Pro
465 470 475 480
Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Lys Thr Asp Asn
485 490 495
Asn Asn Ser Asn Phe Thr Trp Thr Gly Ala Ser Lys Tyr Asn Leu Asn
500 505 510
Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Pro Gly Thr Ala Met Ala Ser His Lys
515 520 525
Asp Asp Lys Asn Lys Phe Phe Pro Met Ser Gly Val Met Ile Phe Gly
530 535 540
Lys Glu Ser Ala Gly Ala Ser Asn Thr Ala Leu Asp Asn Val Met Ile
545 550 555 560
Thr Asp Glu Glu Glu Ile Lys Ala Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Arg
565 570 575
Phe Gly Thr Val Ala Val Asn Leu Gln Ser Ser Ser Thr Asp Pro Ala
580 585 590
Thr Gly Asp Val His Val Met Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln
595 600 605
Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His
610 615 620
Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu
625 630 635 640
Lys Asn Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala
645 650 655
Asn Pro Pro Ala Glu Phe Ser Ala Thr Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr
660 665 670
Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln
675 680 685
Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Tyr Thr Ser Asn
690 695 700
Tyr Ala Lys Ser Ala Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Asn Asn Gly Leu
705 710 715 720
Tyr Thr Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro Leu
725 730 735
SEQUENCE LISTING
<110> The Regents of the University of California
<120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR ENHANCING VISUAL FUNCTION
<150> US 62/585,237
<151> 2017-11-13
<150> US 62/589,476
<151> 2017-11-21
<150> US 62/641,783
<151> 2018-03-12
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 364
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Ala Gln Gln Trp Ser Leu Gln Arg Leu Ala Gly Arg His Pro Gln
1 5 10 15
Asp Ser Tyr Glu Asp Ser Thr Gln Ser Ser Ile Phe Thr Tyr Thr Asn
20 25 30
Ser Asn Ser Thr Arg Gly Pro Phe Glu Gly Pro Asn Tyr His Ile Ala
35 40 45
Pro Arg Trp Val Tyr His Leu Thr Ser Val Trp Met Ile Phe Val Val
50 55 60
Ile Ala Ser Val Phe Thr Asn Gly Leu Val Leu Ala Ala Thr Met Lys
65 70 75 80
Phe Lys Lys Leu Arg His Pro Leu Asn Trp Ile Leu Val Asn Leu Ala
85 90 95
Val Ala Asp Leu Ala Glu Thr Val Ile Ala Ser Thr Ile Ser Val Val
100 105 110
Asn Gln Val Tyr Gly Tyr Phe Val Leu Gly His Pro Met Cys Val Leu
115 120 125
Glu Gly Tyr Thr Val Ser Leu Cys Gly Ile Thr Gly Leu Trp Ser Leu
130 135 140
Ala Ile Ile Ser Trp Glu Arg Trp Met Val Val Cys Lys Pro Phe Gly
145 150 155 160
Asn Val Arg Phe Asp Ala Lys Leu Ala Ile Val Gly Ile Ala Phe Ser
165 170 175
Trp Ile Trp Ala Ala Val Trp Thr Ala Pro Pro Ile Phe Gly Trp Ser
180 185 190
Arg Tyr Trp Pro His Gly Leu Lys Thr Ser Cys Gly Pro Asp Val Phe
195 200 205
Ser Gly Ser Ser Tyr Pro Gly Val Gln Ser Tyr Met Ile Val Leu Met
210 215 220
Val Thr Cys Cys Ile Thr Pro Leu Ser Ile Ile Val Leu Cys Tyr Leu
225 230 235 240
Gln Val Trp Leu Ala Ile Arg Ala Val Ala Lys Gln Gln Lys Glu Ser
245 250 255
Glu Ser Thr Gln Lys Ala Glu Lys Glu Val Thr Arg Met Val Val Val
260 265 270
Met Val Leu Ala Phe Cys Phe Cys Trp Gly Pro Tyr Ala Phe Phe Ala
275 280 285
Cys Phe Ala Ala Ala Asn Pro Gly Tyr Pro Phe His Pro Leu Met Ala
290 295 300
Ala Leu Pro Ala Phe Phe Ala Lys Ser Ala Thr Ile Tyr Asn Pro Val
305 310 315 320
Ile Tyr Val Phe Met Asn Arg Gln Phe Arg Asn Cys Ile Leu Gln Leu
325 330 335
Phe Gly Lys Lys Val Asp Asp Gly Ser Glu Leu Ser Ser Ala Ser Lys
340 345 350
Thr Glu Val Ser Ser Val Ser Ser Val Ser Pro Ala
355 360
<210> 2
<211> 348
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Asn Gly Thr Glu Gly Pro Asn Phe Tyr Val Pro Phe Ser Asn Ala
1 5 10 15
Thr Gly Val Val Arg Ser Pro Phe Glu Tyr Pro Gln Tyr Tyr Leu Ala
20 25 30
Glu Pro Trp Gln Phe Ser Met Leu Ala Ala Tyr Met Phe Leu Leu Ile
35 40 45
Val Leu Gly Phe Pro Ile Asn Phe Leu Thr Leu Tyr Val Thr Val Gln
50 55 60
His Lys Lys Leu Arg Thr Pro Leu Asn Tyr Ile Leu Leu Asn Leu Ala
65 70 75 80
Val Ala Asp Leu Phe Met Val Leu Gly Gly Phe Thr Ser Thr Leu Tyr
85 90 95
Thr Ser Leu His Gly Tyr Phe Val Phe Gly Pro Thr Gly Cys Asn Leu
100 105 110
Glu Gly Phe Phe Ala Thr Leu Gly Gly Glu Ile Ala Leu Trp Ser Leu
115 120 125
Val Val Leu Ala Ile Glu Arg Tyr Val Val Val Cys Lys Pro Met Ser
130 135 140
Asn Phe Arg Phe Gly Glu Asn His Ala Ile Met Gly Val Ala Phe Thr
145 150 155 160
Trp Val Met Ala Leu Ala Cys Ala Ala Pro Pro Leu Ala Gly Trp Ser
165 170 175
Arg Tyr Ile Pro Glu Gly Leu Gln Cys Ser Cys Gly Ile Asp Tyr Tyr
180 185 190
Thr Leu Lys Pro Glu Val Asn Asn Glu Ser Phe Val Ile Tyr Met Phe
195 200 205
Val Val His Phe Thr Ile Pro Met Ile Ile Ile Phe Phe Cys Tyr Gly
210 215 220
Gln Leu Val Phe Thr Val Lys Glu Ala Ala Ala Gln Gln Gln Glu Ser
225 230 235 240
Ala Thr Thr Gln Lys Ala Glu Lys Glu Val Thr Arg Met Val Ile Ile
245 250 255
Met Val Ile Ala Phe Leu Ile Cys Trp Val Pro Tyr Ala Ser Val Ala
260 265 270
Phe Tyr Ile Phe Thr His Gln Gly Ser Asn Phe Gly Pro Ile Phe Met
275 280 285
Thr Ile Pro Ala Phe Phe Ala Lys Ser Ala Ala Ile Tyr Asn Pro Val
290 295 300
Ile Tyr Ile Met Met Asn Lys Gln Phe Arg Asn Cys Met Leu Thr Thr
305 310 315 320
Ile Cys Cys Gly Lys Asn Pro Leu Gly Asp Asp Glu Ala Ser Ala Thr
325 330 335
Val Ser Lys Thr Glu Thr Ser Gln Val Ala Pro Ala
340 345
<210> 3
<211> 310
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence
<400> 3
Met Asp Tyr Gly Gly Ala Leu Ser Ala Val Gly Arg Glu Leu Leu Phe
1 5 10 15
Val Thr Asn Pro Val Val Val Asn Gly Ser Val Leu Val Pro Glu Asp
20 25 30
Gln Cys Tyr Cys Ala Gly Trp Ile Glu Ser Arg Gly Thr Asn Gly Ala
35 40 45
Gln Thr Ala Ser Asn Val Leu Gln Trp Leu Ala Ala Gly Phe Ser Ile
50 55 60
Leu Leu Leu Met Phe Tyr Ala Tyr Gln Thr Trp Lys Ser Thr Cys Gly
65 70 75 80
Trp Glu Glu Ile Tyr Val Cys Ala Ile Glu Met Val Lys Val Ile Leu
85 90 95
Glu Phe Phe Phe Glu Phe Lys Asn Pro Ser Met Leu Tyr Leu Ala Thr
100 105 110
Gly His Arg Val Gln Trp Leu Arg Tyr Ala Glu Trp Leu Leu Thr Cys
115 120 125
Pro Val Ile Leu Ile His Leu Ser Asn Leu Thr Gly Leu Ser Asn Asp
130 135 140
Tyr Ser Arg Arg Thr Met Gly Leu Leu Val Ser Asp Ile Gly Thr Ile
145 150 155 160
Val Trp Gly Ala Thr Ser Ala Met Ala Thr Gly Tyr Val Lys Val Ile
165 170 175
Phe Phe Cys Leu Gly Leu Cys Tyr Gly Ala Asn Thr Phe Phe His Ala
180 185 190
Ala Lys Ala Tyr Ile Glu Gly Tyr His Thr Val Pro Lys Gly Arg Cys
195 200 205
Arg Gln Val Val Thr Gly Met Ala Trp Leu Phe Phe Val Ser Trp Gly
210 215 220
Met Phe Pro Ile Leu Phe Ile Leu Gly Pro Glu Gly Phe Gly Val Leu
225 230 235 240
Ser Val Tyr Gly Ser Thr Val Gly His Thr Ile Ile Asp Leu Met Ser
245 250 255
Lys Asn Cys Trp Gly Leu Leu Gly His Tyr Leu Arg Val Leu Ile His
260 265 270
Glu His Ile Leu Ile His Gly Asp Ile Arg Lys Thr Thr Lys Leu Asn
275 280 285
Ile Gly Gly Thr Glu Ile Glu Val Glu Thr Leu Val Glu Asp Glu Ala
290 295 300
Glu Ala Gly Ala Val Pro
305 310
<210> 4
<211> 364
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Met Ala Gln Gln Trp Ser Leu Gln Arg Leu Ala Gly Arg His Pro Gln
1 5 10 15
Asp Ser Tyr Glu Asp Ser Thr Gln Ser Ser Ile Phe Thr Tyr Thr Asn
20 25 30
Ser Asn Ser Thr Arg Gly Pro Phe Glu Gly Pro Asn Tyr His Ile Ala
35 40 45
Pro Arg Trp Val Tyr His Leu Thr Ser Val Trp Met Ile Phe Val Val
50 55 60
Thr Ala Ser Val Phe Thr Asn Gly Leu Val Leu Ala Ala Thr Met Lys
65 70 75 80
Phe Lys Lys Leu Arg His Pro Leu Asn Trp Ile Leu Val Asn Leu Ala
85 90 95
Val Ala Asp Leu Ala Glu Thr Val Ile Ala Ser Thr Ile Ser Ile Val
100 105 110
Asn Gln Val Ser Gly Tyr Phe Val Leu Gly His Pro Met Cys Val Leu
115 120 125
Glu Gly Tyr Thr Val Ser Leu Cys Gly Ile Thr Gly Leu Trp Ser Leu
130 135 140
Ala Ile Ile Ser Trp Glu Arg Trp Met Val Val Cys Lys Pro Phe Gly
145 150 155 160
Asn Val Arg Phe Asp Ala Lys Leu Ala Ile Val Gly Ile Ala Phe Ser
165 170 175
Trp Ile Trp Ala Ala Val Trp Thr Ala Pro Pro Ile Phe Gly Trp Ser
180 185 190
Arg Tyr Trp Pro His Gly Leu Lys Thr Ser Cys Gly Pro Asp Val Phe
195 200 205
Ser Gly Ser Ser Tyr Pro Gly Val Gln Ser Tyr Met Ile Val Leu Met
210 215 220
Val Thr Cys Cys Ile Ile Pro Leu Ala Ile Ile Met Leu Cys Tyr Leu
225 230 235 240
Gln Val Trp Leu Ala Ile Arg Ala Val Ala Lys Gln Gln Lys Glu Ser
245 250 255
Glu Ser Thr Gln Lys Ala Glu Lys Glu Val Thr Arg Met Val Val Val
260 265 270
Met Ile Phe Ala Tyr Cys Val Cys Trp Gly Pro Tyr Thr Phe Phe Ala
275 280 285
Cys Phe Ala Ala Ala Asn Pro Gly Tyr Ala Phe His Pro Leu Met Ala
290 295 300
Ala Leu Pro Ala Tyr Phe Ala Lys Ser Ala Thr Ile Tyr Asn Pro Val
305 310 315 320
Ile Tyr Val Phe Met Asn Arg Gln Phe Arg Asn Cys Ile Leu Gln Leu
325 330 335
Phe Gly Lys Lys Val Asp Asp Gly Ser Glu Leu Ser Ser Ala Ser Lys
340 345 350
Thr Glu Val Ser Ser Val Ser Ser Val Ser Pro Ala
355 360
<210> 5
<211> 348
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Met Arg Lys Met Ser Glu Glu Glu Phe Tyr Leu Phe Lys Asn Ile Ser
1 5 10 15
Ser Val Gly Pro Trp Asp Gly Pro Gln Tyr His Ile Ala Pro Val Trp
20 25 30
Ala Phe Tyr Leu Gln Ala Ala Phe Met Gly Thr Val Phe Leu Ile Gly
35 40 45
Phe Pro Leu Asn Ala Met Val Leu Val Ala Thr Leu Arg Tyr Lys Lys
50 55 60
Leu Arg Gln Pro Leu Asn Tyr Ile Leu Val Asn Val Ser Phe Gly Gly
65 70 75 80
Phe Leu Leu Cys Ile Phe Ser Val Phe Pro Val Phe Val Ala Ser Cys
85 90 95
Asn Gly Tyr Phe Val Phe Gly Arg His Val Cys Ala Leu Glu Gly Phe
100 105 110
Leu Gly Thr Val Ala Gly Leu Val Thr Gly Trp Ser Leu Ala Phe Leu
115 120 125
Ala Phe Glu Arg Tyr Ile Val Ile Cys Lys Pro Phe Gly Asn Phe Arg
130 135 140
Phe Ser Ser Lys His Ala Leu Thr Val Val Leu Ala Thr Trp Thr Ile
145 150 155 160
Gly Ile Gly Val Ser Ile Pro Pro Phe Phe Gly Trp Ser Arg Phe Ile
165 170 175
Pro Glu Gly Leu Gln Cys Ser Cys Gly Pro Asp Trp Tyr Thr Val Gly
180 185 190
Thr Lys Tyr Arg Ser Glu Ser Tyr Thr Trp Phe Leu Phe Ile Phe Cys
195 200 205
Phe Ile Val Pro Leu Ser Leu Ile Cys Phe Ser Tyr Thr Gln Leu Leu
210 215 220
Arg Ala Leu Lys Ala Val Ala Ala Gln Gln Gln Glu Ser Ala Thr Thr
225 230 235 240
Gln Lys Ala Glu Arg Glu Val Ser Arg Met Val Val Val Met Val Gly
245 250 255
Ser Phe Cys Val Cys Tyr Val Pro Tyr Ala Ala Phe Ala Met Tyr Met
260 265 270
Val Asn Asn Arg Asn His Gly Leu Asp Leu Arg Leu Val Thr Ile Pro
275 280 285
Ser Phe Phe Ser Lys Ser Ala Cys Ile Tyr Asn Pro Ile Ile Tyr Cys
290 295 300
Phe Met Asn Lys Gln Phe Gln Ala Cys Ile Met Lys Met Val Cys Gly
305 310 315 320
Lys Ala Met Thr Asp Glu Ser Asp Thr Cys Ser Ser Gln Lys Thr Glu
325 330 335
Val Ser Thr Val Ser Ser Thr Gln Val Gly Pro Asn
340 345
<210> 6
<211> 346
<212> PRT
<213> Mus Musculus
<400> 6
Met Ser Gly Glu Asp Asp Phe Tyr Leu Phe Gln Asn Ile Ser Ser Val
1 5 10 15
Gly Pro Trp Asp Gly Pro Gln Tyr His Leu Ala Pro Val Trp Ala Phe
20 25 30
Arg Leu Gln Ala Ala Phe Met Gly Phe Val Phe Phe Val Gly Thr Pro
35 40 45
Leu Asn Ala Ile Val Leu Val Ala Thr Leu His Tyr Lys Lys Leu Arg
50 55 60
Gln Pro Leu Asn Tyr Ile Leu Val Asn Val Ser Leu Gly Gly Phe Leu
65 70 75 80
Phe Cys Ile Phe Ser Val Phe Thr Val Phe Ile Ala Ser Cys His Gly
85 90 95
Tyr Phe Leu Phe Gly Arg His Val Cys Ala Leu Glu Ala Phe Leu Gly
100 105 110
Ser Val Ala Gly Leu Val Thr Gly Trp Ser Leu Ala Phe Leu Ala Phe
115 120 125
Glu Arg Tyr Val Val Ile Cys Lys Pro Phe Gly Ser Ile Arg Phe Asn
130 135 140
Ser Lys His Ala Leu Met Val Val Leu Ala Thr Trp Ile Ile Gly Ile
145 150 155 160
Gly Val Ser Ile Pro Pro Phe Phe Gly Trp Ser Arg Phe Ile Pro Glu
165 170 175
Gly Leu Gln Cys Ser Cys Gly Pro Asp Trp Tyr Thr Val Gly Thr Lys
180 185 190
Tyr Arg Ser Glu Tyr Tyr Thr Trp Phe Leu Phe Ile Phe Cys Phe Ile
195 200 205
Ile Pro Leu Ser Leu Ile Cys Phe Ser Tyr Ser Gln Leu Leu Arg Thr
210 215 220
Leu Arg Ala Val Ala Ala Gln Gln Gln Glu Ser Ala Thr Thr Gln Lys
225 230 235 240
Ala Glu Arg Glu Val Ser His Met Val Val Val Met Val Gly Ser Phe
245 250 255
Cys Leu Cys Tyr Val Pro Tyr Ala Ala Leu Ala Met Tyr Met Val Asn
260 265 270
Asn Arg Asn His Gly Leu Asp Leu Arg Leu Val Thr Ile Pro Ala Phe
275 280 285
Phe Ser Lys Ser Ser Cys Val Tyr Asn Pro Ile Ile Tyr Cys Phe Met
290 295 300
Asn Lys Gln Phe Arg Ala Cys Ile Leu Glu Met Val Cys Arg Lys Pro
305 310 315 320
Met Ala Asp Glu Ser Asp Val Ser Gly Ser Gln Lys Thr Glu Val Ser
325 330 335
Thr Val Ser Ser Ser Lys Val Gly Pro His
340 345
<210> 7
<211> 343
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence
<400> 7
Glu Asp Asp Phe Tyr Leu Phe Gln Asn Ile Ser Ser Val Gly Pro Trp
1 5 10 15
Asp Gly Pro Gln Tyr His Leu Ala Pro Val Trp Ala Phe Tyr Leu Gln
20 25 30
Ala Ala Phe Met Gly Thr Val Phe Leu Ile Gly Phe Pro Leu Asn Ala
35 40 45
Met Val Leu Val Ala Thr Leu His Tyr Lys Lys Leu Arg Gln Pro Leu
50 55 60
Asn Tyr Ile Leu Val Asn Val Ser Phe Gly Gly Phe Leu Leu Cys Ile
65 70 75 80
Phe Ser Val Phe Pro Val Phe Val Ala Ser Cys Asn Gly Tyr Phe Val
85 90 95
Phe Gly Arg His Val Cys Ala Leu Glu Gly Phe Leu Gly Thr Val Ala
100 105 110
Gly Leu Val Thr Gly Trp Ser Leu Ala Phe Leu Ala Phe Glu Arg Tyr
115 120 125
Val Val Ile Cys Lys Pro Phe Gly Ser Ile Arg Phe Asn Ser Lys His
130 135 140
Ala Leu Thr Val Val Leu Ala Thr Trp Thr Ile Gly Ile Gly Val Ser
145 150 155 160
Ile Pro Pro Phe Phe Gly Trp Ser Arg Phe Ile Pro Glu Gly Leu Gln
165 170 175
Cys Ser Cys Gly Pro Asp Trp Tyr Thr Val Gly Thr Lys Tyr Arg Ser
180 185 190
Glu Ser Tyr Thr Trp Phe Leu Phe Ile Phe Cys Phe Ile Val Pro Leu
195 200 205
Ser Leu Ile Cys Phe Ser Tyr Thr Gln Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala
210 215 220
Val Ala Ala Gln Gln Gln Glu Ser Ala Thr Thr Gln Lys Ala Glu Arg
225 230 235 240
Glu Val Ser His Met Val Val Val Met Val Gly Ser Phe Cys Val Cys
245 250 255
Tyr Val Pro Tyr Ala Ala Phe Ala Met Tyr Met Val Asn Asn Arg Asn
260 265 270
His Gly Leu Asp Leu Arg Leu Val Thr Ile Pro Ser Phe Phe Ser Lys
275 280 285
Ser Ala Cys Ile Tyr Asn Pro Ile Ile Tyr Cys Phe Met Asn Lys Gln
290 295 300
Phe Arg Ala Cys Ile Leu Glu Met Val Cys Arg Lys Pro Met Ala Asp
305 310 315 320
Glu Ser Asp Val Ser Gly Ser Gln Lys Thr Glu Val Ser Thr Val Ser
325 330 335
Ser Ser Lys Val Gly Pro His
340
<210> 8
<211> 359
<212> PRT
<213> Mus Musculus
<400> 8
Met Ala Gln Arg Leu Thr Gly Glu Gln Thr Leu Asp His Tyr Glu Asp
1 5 10 15
Ser Thr His Ala Ser Ile Phe Thr Tyr Thr Asn Ser Asn Ser Thr Lys
20 25 30
Gly Pro Phe Glu Gly Pro Asn Tyr His Ile Ala Pro Arg Trp Val Tyr
35 40 45
His Leu Thr Ser Thr Trp Met Ile Leu Val Val Val Ala Ser Val Phe
50 55 60
Thr Asn Gly Leu Val Leu Ala Ala Thr Met Arg Phe Lys Lys Leu Arg
65 70 75 80
His Pro Leu Asn Trp Ile Leu Val Asn Leu Ala Val Ala Asp Leu Ala
85 90 95
Glu Thr Ile Ile Ala Ser Thr Ile Ser Val Val Asn Gln Ile Tyr Gly
100 105 110
Tyr Phe Val Leu Gly His Pro Leu Cys Val Ile Glu Gly Tyr Ile Val
115 120 125
Ser Leu Cys Gly Ile Thr Gly Leu Trp Ser Leu Ala Ile Ile Ser Trp
130 135 140
Glu Arg Trp Leu Val Val Cys Lys Pro Phe Gly Asn Val Arg Phe Asp
145 150 155 160
Ala Lys Leu Ala Thr Val Gly Ile Val Phe Ser Trp Val Trp Ala Ala
165 170 175
Ile Trp Thr Ala Pro Pro Ile Phe Gly Trp Ser Arg Tyr Trp Pro Tyr
180 185 190
Gly Leu Lys Thr Ser Cys Gly Pro Asp Val Phe Ser Gly Thr Ser Tyr
195 200 205
Pro Gly Val Gln Ser Tyr Met Met Val Leu Met Val Thr Cys Cys Ile
210 215 220
Phe Pro Leu Ser Ile Ile Val Leu Cys Tyr Leu Gln Val Trp Leu Ala
225 230 235 240
Ile Arg Ala Val Ala Lys Gln Gln Lys Glu Ser Glu Ser Thr Gln Lys
245 250 255
Ala Glu Lys Glu Val Thr Arg Met Val Val Val Met Val Phe Ala Tyr
260 265 270
Cys Leu Cys Trp Gly Pro Tyr Thr Phe Phe Ala Cys Phe Ala Thr Ala
275 280 285
His Pro Gly Tyr Ala Phe His Pro Leu Val Ala Ser Leu Pro Ser Tyr
290 295 300
Phe Ala Lys Ser Ala Thr Ile Tyr Asn Pro Ile Ile Tyr Val Phe Met
305 310 315 320
Asn Arg Gln Phe Arg Asn Cys Ile Leu His Leu Phe Gly Lys Lys Val
325 330 335
Asp Asp Ser Ser Glu Leu Ser Ser Thr Ser Lys Thr Glu Val Ser Ser
340 345 350
Val Ser Ser Val Ser Pro Ala
355
<210> 9
<211> 348
<212> PRT
<213> Mus Musculus
<400> 9
Met Asn Gly Thr Glu Gly Pro Asn Phe Tyr Val Pro Phe Ser Asn Val
1 5 10 15
Thr Gly Val Val Arg Ser Pro Phe Glu Gln Pro Gln Tyr Tyr Leu Ala
20 25 30
Glu Pro Trp Gln Phe Ser Met Leu Ala Ala Tyr Met Phe Leu Leu Ile
35 40 45
Val Leu Gly Phe Pro Ile Asn Phe Leu Thr Leu Tyr Val Thr Val Gln
50 55 60
His Lys Lys Leu Arg Thr Pro Leu Asn Tyr Ile Leu Leu Asn Leu Ala
65 70 75 80
Val Ala Asp Leu Phe Met Val Phe Gly Gly Phe Thr Thr Thr Leu Tyr
85 90 95
Thr Ser Leu His Gly Tyr Phe Val Phe Gly Pro Thr Gly Cys Asn Leu
100 105 110
Glu Gly Phe Phe Ala Thr Leu Gly Gly Glu Ile Ala Leu Trp Ser Leu
115 120 125
Val Val Leu Ala Ile Glu Arg Tyr Val Val Val Cys Lys Pro Met Ser
130 135 140
Asn Phe Arg Phe Gly Glu Asn His Ala Ile Met Gly Val Val Phe Thr
145 150 155 160
Trp Ile Met Ala Leu Ala Cys Ala Ala Pro Pro Leu Val Gly Trp Ser
165 170 175
Arg Tyr Ile Pro Glu Gly Met Gln Cys Ser Cys Gly Ile Asp Tyr Tyr
180 185 190
Thr Leu Lys Pro Glu Val Asn Asn Glu Ser Phe Val Ile Tyr Met Phe
195 200 205
Val Val His Phe Thr Ile Pro Met Ile Val Ile Phe Phe Cys Tyr Gly
210 215 220
Gln Leu Val Phe Thr Val Lys Glu Ala Ala Ala Gln Gln Gln Glu Ser
225 230 235 240
Ala Thr Thr Gln Lys Ala Glu Lys Glu Val Thr Arg Met Val Ile Ile
245 250 255
Met Val Ile Phe Phe Leu Ile Cys Trp Leu Pro Tyr Ala Ser Val Ala
260 265 270
Phe Tyr Ile Phe Thr His Gln Gly Ser Asn Phe Gly Pro Ile Phe Met
275 280 285
Thr Leu Pro Ala Phe Phe Ala Lys Ser Ser Ser Ile Tyr Asn Pro Val
290 295 300
Ile Tyr Ile Met Leu Asn Lys Gln Phe Arg Asn Cys Met Leu Thr Thr
305 310 315 320
Leu Cys Cys Gly Lys Asn Pro Leu Gly Asp Asp Asp Ala Ser Ala Thr
325 330 335
Ala Ser Lys Thr Glu Thr Ser Gln Val Ala Pro Ala
340 345
<210> 10
<211> 736
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence
<400> 10
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125
Phe Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly
145 150 155 160
Lys Thr Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro
180 185 190
Ala Thr Pro Ala Ala Val Gly Pro Thr Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly
195 200 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Ala Ser Thr Gly Ala Ser Asn Asp Asn His
260 265 270
Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe
275 280 285
His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn
290 295 300
Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln
305 310 315 320
Val Lys Glu Val Thr Thr Asn Asp Gly Val Thr Thr Ile Ala Asn Asn
325 330 335
Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ser Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro
340 345 350
Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala
355 360 365
Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly
370 375 380
Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro
385 390 395 400
Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe
405 410 415
Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp
420 425 430
Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg
435 440 445
Thr Gln Asn Gln Ser Gly Ser Ala Gln Asn Lys Asp Leu Leu Phe Ser
450 455 460
Arg Gly Ser Pro Ala Gly Met Ser Val Gln Pro Lys Asn Trp Leu Pro
465 470 475 480
Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Lys Thr Asp Asn
485 490 495
Asn Asn Ser Asn Phe Thr Trp Thr Gly Ala Ser Lys Tyr Asn Leu Asn
500 505 510
Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Pro Gly Thr Ala Met Ala Ser His Lys
515 520 525
Asp Asp Lys Asp Lys Phe Phe Pro Met Ser Gly Val Met Ile Phe Gly
530 535 540
Lys Glu Ser Ala Gly Ala Ser Asn Thr Ala Leu Asp Asn Val Met Ile
545 550 555 560
Thr Asp Glu Glu Glu Ile Lys Ala Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Arg
565 570 575
Phe Gly Thr Val Ala Val Asn Leu Gln Ser Ser Ser Thr Asp Pro Ala
580 585 590
Thr Gly Asp Val His Val Met Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln
595 600 605
Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His
610 615 620
Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu
625 630 635 640
Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala
645 650 655
Asn Pro Pro Ala Glu Phe Ser Ala Thr Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr
660 665 670
Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln
675 680 685
Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Tyr Thr Ser Asn
690 695 700
Tyr Ala Lys Ser Ala Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Asn Asn Gly Leu
705 710 715 720
Tyr Thr Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro Leu
725 730 735
<210> 11
<211> 736
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence
<400> 11
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125
Phe Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly
145 150 155 160
Lys Thr Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro
180 185 190
Ala Thr Pro Ala Ala Val Gly Pro Thr Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly
195 200 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Ala Ser Thr Gly Ala Ser Asn Asp Asn His
260 265 270
Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe
275 280 285
His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn
290 295 300
Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Val Gln
305 310 315 320
Val Lys Glu Val Thr Thr Asn Asp Gly Val Thr Thr Ile Ala Asn Asn
325 330 335
Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ser Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro
340 345 350
Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala
355 360 365
Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly
370 375 380
Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro
385 390 395 400
Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe
405 410 415
Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp
420 425 430
Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg
435 440 445
Thr Gln Asp Gln Ser Gly Ser Ala Gln Asn Lys Asp Leu Leu Phe Ser
450 455 460
Arg Gly Ser Pro Ala Gly Met Ser Val Gln Pro Lys Asn Trp Leu Pro
465 470 475 480
Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Lys Thr Asp Asn
485 490 495
Asn Asn Ser Asn Phe Thr Trp Thr Gly Ala Ser Lys Tyr Asn Leu Asn
500 505 510
Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Pro Gly Thr Ala Met Ala Ser His Lys
515 520 525
Asp Asp Lys Asn Lys Phe Phe Pro Met Ser Gly Val Met Ile Phe Gly
530 535 540
Lys Glu Ser Ala Gly Ala Ser Asn Thr Ala Leu Asp Asn Val Met Ile
545 550 555 560
Thr Asp Glu Glu Glu Ile Lys Ala Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Arg
565 570 575
Phe Gly Thr Val Ala Val Asn Leu Gln Ser Ser Ser Thr Asp Pro Ala
580 585 590
Thr Gly Asp Val His Val Met Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln
595 600 605
Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His
610 615 620
Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu
625 630 635 640
Lys Asn Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala
645 650 655
Asn Pro Pro Ala Glu Phe Ser Ala Thr Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr
660 665 670
Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln
675 680 685
Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Tyr Thr Ser Asn
690 695 700
Tyr Ala Lys Ser Ala Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Asn Asn Gly Leu
705 710 715 720
Tyr Thr Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro Leu
725 730 735
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-10-20
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
個体における視機能を回復または強化する方法であって、
中波長オプシン（ＭＷ－オプシン）及び／または長波長オプシン（ＬＷ－オプシン）及び／または短波長オプシン（ＳＷ－オプシン）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を前記個体へ投与する工程を含み、
前記投与工程が、前記個体の網膜細胞における前記ＭＷ－オプシン及び／または前記ＬＷ－オプシン及び／または前記ＳＷ－オプシンの発現ならびに視機能の回復または強化を提供する、
前記方法。
中波長オプシン（ＭＷ－オプシン）及び／または長波長オプシン（ＬＷ－オプシン）及び／または短波長オプシン（ＳＷ－オプシン）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を前記個体へ投与する工程を含み、
前記投与工程が、前記個体の網膜細胞における前記ＭＷ－オプシン及び／または前記ＬＷ－オプシン及び／または前記ＳＷ－オプシンの発現ならびに視機能の回復または強化を提供する、
前記方法。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】