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特開2023-179752ＣＤ４７を活性化する作用物質およびその炎症治療における使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023179752
(43)【公開日】2023-12-19
(54)【発明の名称】ＣＤ４７を活性化する作用物質およびその炎症治療における使用
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20231212BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20231212BHJP
A61K 38/02 20060101ALI20231212BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20231212BHJP
A61K 45/06 20060101ALI20231212BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20231212BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20231212BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20231212BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20231212BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20231212BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20231212BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20231212BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20231212BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231212BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20231212BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20231212BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20231212BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00 ZNA
C07K14/47
A61K38/02
A61K45/00
A61K45/06
A61P3/04
A61P9/10
A61P19/02
A61P25/16
A61P25/28
A61P27/02
A61P29/00
A61P37/06
A61P43/00 121
A61K38/16
C12N15/62 Z
C12N15/12
【審査請求】有
【請求項の数】30
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023180474
(22)【出願日】2023-10-19
(62)【分割の表示】P 2018559205の分割
【原出願日】2017-05-10
(31)【優先権主張番号】16169072.2
(32)【優先日】2016-05-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】17154452.1
(32)【優先日】2017-02-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＴＲＩＴＯＮ
３．ＳＰＡＮ
(71)【出願人】
【識別番号】518170446
【氏名又は名称】ソルボンヌ ウニベルシテ
(71)【出願人】
【識別番号】506316557
【氏名又は名称】サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィック
(71)【出願人】
【識別番号】507002516
【氏名又は名称】アンセルム（アンスティチュート・ナシオナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・メディカル）
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】セヌラウブ，フロライン
(72)【発明者】
【氏名】ハウセット，ミシェル
(72)【発明者】
【氏名】グイロンニーウ，グザビエ
(72)【発明者】
【氏名】サヘル，ホセ－アラン
(72)【発明者】
【氏名】カロヤン，フィリップ
(57)【要約】
【課題】ＣＤ４７を活性化する作用物質、および炎症（特に、加齢黄斑変性などの、慢性的なＭＰ浸潤を特徴とする治療抵抗性低悪性度炎症）の治療におけるその使用、ならびに前記作用物質を含む医薬組成物、医薬およびキットを提供する。
【解決手段】リンカーを介して連結された少なくとも２つのペプチド単量体を含む、多量体ペプチドまたはポリペプチドであって、前記少なくとも２つのペプチド単量体は、ＣＤ４７を活性化する、多量体ペプチドまたはポリペプチドである。
【選択図】なし
【解決手段】リンカーを介して連結された少なくとも２つのペプチド単量体を含む、多量体ペプチドまたはポリペプチドであって、前記少なくとも２つのペプチド単量体は、ＣＤ４７を活性化する、多量体ペプチドまたはポリペプチドである。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
リンカーを介して連結された少なくとも２つのペプチド単量体を含む多量体ペプチドまたはポリペプチドであって、前記少なくとも２つのペプチド単量体がＣＤ４７を活性化する、多量体ペプチドまたはポリペプチド。
【請求項2】
前記少なくとも２つのペプチド単量体が、４Ｎ１Ｋ、ＰＫＨＢ１およびＰＫＴ１６を含む群から選択される、請求項１に記載の多量体ペプチドまたはポリペプチド。
【請求項3】
前記リンカーがペプチドリンカー、好ましくはＧｌｙリッチリンカーである、請求項１または２に記載の多量体ペプチドまたはポリペプチド。
【請求項4】
二量体である、請求項１～３のいずれか１項に記載の多量体ペプチドまたはポリペプチド。
【請求項5】
配列番号７を含む、または配列番号７からなる、請求項１～４のいずれか１項に記載の多量体ペプチドまたはポリペプチド。
【請求項6】
プロテアーゼＨＴＲＡ１に耐性を示すものが、プロテアーゼＨＴＲＡ１に対する耐性である、修飾ＴＳＰ１タンパク質またはそのフラグメント。
【請求項7】
少なくとも１つのＨＴＲＡ１切断配列の少なくとも１個のアミノ酸が、欠失している、置換されている、または付加されている、請求項６に記載の修飾ＴＳＰ１タンパク質。
【請求項8】
配列番号８の２４２～２４３位の残基ＶＴおよび／または配列番号８の２８８～２８９位の残基ＱＶが欠失している、請求項６または７に記載の修飾ＴＳＰ１タンパク質。
【請求項9】
配列番号８の２４２位および／または２８９位の残基Ｖが置換されている、請求項６または７に記載の修飾ＴＳＰ１タンパク質。
【請求項10】
炎症の治療に使用するための作用物質であって、ＣＤ４７を活性化する作用物質。
【請求項11】
ＣＤ４７を直接活性化する、請求項１０に記載の作用物質。
【請求項12】
ＣＤ４７アゴニスト、好ましくはＴＳＰ１ペプチド模倣物である、請求項１１に記載の作用物質。
【請求項13】
請求項６～９のいずれか１項に記載の修飾ＴＳＰ１タンパク質またはそのフラグメントである、請求項１１に記載の作用物質。
【請求項14】
４Ｎ１Ｋ、ＰＫＨＢ１およびＰＫＴ１６を含む群から選択される活性化ペプチドである、請求項１１に記載の作用物質。
【請求項15】
請求項１～５のいずれか１項に記載の多量体ペプチドまたはポリペプチドである、請求項１１に記載の作用物質。
【請求項16】
ＣＤ４７を間接的に活性化する、請求項１０に記載の作用物質。
【請求項17】
ＴＳＰ１活性化因子、ＨＴＲＡ１阻害剤およびＦａｓ活性化因子を含む群から選択される、請求項１６に記載の作用物質。
【請求項18】
前記炎症が、急性炎症または慢性炎症である、１０～１７のいずれか１項に記載の作用物質。
【請求項19】
前記炎症が治療抵抗性炎症、好ましくは治療抵抗性低悪性度慢性炎症である、請求項１０～１８のいずれか１項に記載の作用物質。
【請求項20】
前記炎症が、単核食細胞蓄積に関連する炎症である、請求項１０～１９のいずれか１項に記載の作用物質。
【請求項21】
前記炎症が、加齢黄斑変性；加齢黄斑症；網膜色素変性；パーキンソン病、多発性硬化症またはアルツハイマー病などの神経変性疾患；肥満またはアテローム性動脈硬化症などの代謝障害、および関節症などの加齢関連慢性変性疾患を含む群から選択される、請求項１０～２０のいずれか１項に記載の作用物質。
【請求項22】
前記炎症が、加齢黄斑変性；加齢黄斑症；網膜色素変性；および神経変性疾患を含む群から選択される加齢性疾患である、請求項１０～２１のいずれか１項に記載の作用物質。
【請求項23】
前記炎症が、加齢黄斑変性；加齢黄斑症および網膜色素変性を含む群から選択される眼の炎症である、請求項１０～２２のいずれか１項に記載の作用物質。
【請求項24】
前記炎症が加齢黄斑変性である、請求項１０～２３のいずれか１項に記載の作用物質。
【請求項25】
請求項１０～２４のいずれか１項に記載の作用物質を少なくとも１種含む、組成物。
【請求項26】
ＣＤ４７アゴニストとＦａｓ活性化因子とを含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項27】
炎症、好ましくは加齢黄斑変性の治療に使用するための、ＣＤ４７を活性化する少なくとも１種の作用物質と、少なくとも１種の薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物。
【請求項28】
炎症、好ましくは加齢黄斑変性の治療に使用するための、ＣＤ４７を活性化する少なくとも１種の作用物質を含む医薬。
【請求項29】
好ましくは硝子体内注射により眼内に投与される、または局所眼内投与により適用されることを特徴とする、請求項１０～２４のいずれか１項に記載の作用物質、請求項２７に記載の医薬組成物または請求項２８に記載の医薬。
【請求項30】
請求項１０～２４のいずれか１項に記載の作用物質、請求項２７に記載の医薬組成物または請求項２８に記載の医薬を少なくとも１種含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＣＤ４７を活性化する作用物質に関する。本発明は、加齢黄斑変性などの炎症性の障害および疾患の治療にも関する。
【背景技術】
【0002】
先進国では加齢黄斑変性（ＡＭＤ）が法的盲の原因の第１位となっている。後期ＡＭＤには、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を特徴とする、進行が速い滲出型（「ウェット型」ＡＭＤ）と、地図状萎縮として知られる網膜色素上皮（ＲＰＥ）萎縮および光受容細胞変性を特徴とする、進行が遅い萎縮型（ＧＡまたは後期「ドライ型」ＡＭＤ）の２種類の臨床形態がある。ＡＭＤは「萎縮」型と「ウェット」型に分類されることが多いが、両型とも生得免疫の活性化の増大を背景として発症し、同じ遺伝子多型、例えば補体Ｈ因子（ＣＦＨ）（Ｈａｉｎｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００５，３０８：４１９－４２１；Ｅｄｗａｒｄｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００５，３０８：４２１－４２４）、高温要求性セリンプロテアーゼＡ１（ＨＴＡＲ１）および加齢黄斑症感受性２（ＡＲＭＳＤ２）（Ｄｅｗａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００６，３１４：９８９－９９２；Ｙａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００６，３１４：９９２－９９３）の遺伝子多型などと関連する。
【0003】
単核食細胞（ＭＰ）には、ミクログリア細胞（ＭＣ）、単球（Ｍｏ）およびマクロファージ（Ｍφ）を含む細胞ファミリーが含まれる。生理学的には、ＭＣは網膜内層のみに存在する。網膜色素上皮（ＲＰＥ）と光受容細胞外節（ＰＯＳ）との間に位置する網膜下腔は、白血球抑制ＦａｓＬ（ＣＤ９５Ｌ）を含む免疫抑制性のＲＰＥシグナルを介する免疫特権域である。それでも、視力を脅かす２種類の進行型ＡＭＤでは網膜下腔にＭＰが蓄積する（Ｋｌｅｉｎら，Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２００４，１３７：４８６－４９５）。ＭＰは、脈絡膜血管新生ではＲＰＥと密に接触し、地図状萎縮ではＲＰＥ病巣の周辺に存在する（Ｇｕｐｔａら，Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．２００３，７６：４６３－４７１；Ｓｅｎｎｌａｕｂら，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１３，５：１７７５－１７９３）。ＭＰは、ＣＮＶ（Ｔｓｕｔｓｕｍｉら，Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ．２００３，７４：２５－３２）およびＧＡの光受容細胞変性（Ｃｒｕｚ－Ｇｕｉｌｌｏｔｙら，Ｉｎｔ Ｊ Ｉｎｆｌａｍ．２０１３，２０１３：５０３７２５）の一因であると考えられている。最近、後期ＡＭＤ発症の重要な危険因子である網膜下ＭＰが軟性ドルーゼンの内部および周辺にも存在することが示されている（Ｓｅｎｎｌａｕｂら，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１３，５：１７７５－１７９３；Ｌｅｖｙら，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１５，７：２１１－２２６）。それでも、網膜下免疫抑制の変化とそれによるＡＭＤへのＭＰ蓄積の原因は未だ明らかにされていない。
【0004】
ウェット型ＡＭＤの治療法として、抗新生血管剤の使用および光線力学療法（斑へのレーザー光照射）などが知られている。ウェット型ＡＭＤを治療するための抗新生血管剤としては、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の作用を遮断し、それによりウェット型ＡＭＤ患者の脈絡膜血管新生および視力喪失を引き起こす血管新生（網膜での新たな血管の形成）を遅らせる作用物質が挙げられる。このような「抗ＶＥＧＦ」剤でウェット型ＡＭＤの治療に承認されている、または臨床試験段階にあるものとしては、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（商標））、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（商標））およびアフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ（商標））が挙げられる。治療法の新たな提案が、例えば、ＣＦＨＲ１および／またはＣＦＨＲ３ポリペプチドの投与を開示している国際公開第２００８００８９８６号に記載されている。国際特許出願の国際公開第２０１１１３７３６３号は、５－リポキシゲナーゼ（５－ＬＯ）活性を低下させて加齢黄斑変性を治療することに関するものである。また別の例として、対象にＲｄＣＶＦＬポリヌクレオチドまたはポリペプチドを投与してＡＭＤを治療することに関する国際公開第２０１４０６０５１７号がある。
【0005】
一方、ドライ型ＡＭＤまたは地図状萎縮を治療するための薬物は現在市販されていないが、高用量の抗酸化剤、ルテインおよびゼアキサンチンを含むビタミン補給剤が進行を遅らせることが示唆されている（Ｓｅｄｄｏｎら，Ｅｙｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃａｓｅ－Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ ＪＡＭＡ．１９９４，２７２：１４１３－１４２０）。グルココルチコイド、シクロオキシゲナーゼ阻害剤などの非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）およびシクロスポリンなどの免疫抑制剤などは、様々な様相の炎症を阻害することから「抗炎症」薬と呼ばれることが多い。しかし、それらは炎症全体を阻害するものではない。シクロスポリンは、主として活性化Ｔ細胞において、リンパ球の機能に影響を及ぼす、サイトカイン遺伝子のカルシニューリン誘発性の転写を阻害する（ＭａｔｓｕｄａおよびＫｏｙａｓｕ，２０００）が、同時にＭφ上のＴｏｌｌ様受容体をアップレギュレートする（シクロスポリン）（ＴｅｄｅｓｃｏおよびＨａｒａｇｓｉｍ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．２０１２，ｖｏｌｕｍｅ ２０１２，２３０３８６）。グルココルチコイドは炭水化物、脂肪およびタンパク質の代謝に影響を及ぼし、Ｔ細胞に直接作用することにより遅延型過敏反応を抑制することができることで恐らく最もよく知られている（Ｌｉｕら，Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｓｔｈｍａ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３，９：３０）が、その濃度によってはＭφ機能に反対の作用を示す（Ｌｉｍら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００７，１２２：４７－５３）。ＮＳＡＩＤは、プロスタグランジンの産生を阻害するが、ＭＰを活性化し（Ｇａｇｎｏｎら，Ａｇｅｎｔ Ａｃｔｉｏｎｓ．１９８９，２６：１４１－１４７）、ＭＰ浸潤を持続させ得る（Ｇｉｌｒｏｙら，Ｎａｔ Ｍｅｄ．１９９９，５：６９８－７０１）ロイコトリエンの合成を増大させる（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１９８９，７ Ｓｕｐｐｌ ３：Ｓ１５５－１６１）シクロオキシゲナーゼ阻害剤である。ＭＰ媒介性の網膜下炎症を阻害する効率がこのように欠如していることは、全身ＮＳＡＩＤによる治療などの広く用いられている「抗炎症」治療法がＡＭＤ進行を遅らせなかった理由を説明するであろう。
【0006】
以上のことを考え合わせると、ＡＭＤにおける網膜下でのＭＰ蓄積およびＭＰ活性化の機序を阻害するのに特に適合した「抗炎症」療法が必要とされることがわかる。
【0007】
ＡＭＤは、生得免疫系および最も注目すべきこととしてＭＰの蓄積を主として伴う治療抵抗性および低悪性度の慢性炎症と関連がある（Ｃｏｍｂａｄｉｅｒｅら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００７，１１７：２９２０－２９２８；Ｌｅｖｙら，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１５，７：２１１－２２６）。細胞傷害性Ｔリンパ球、好中球およびＭＰ（Ｃａｓｐｉ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００２，２１：１９７－２０８；Ｋｅｒｒら，Ｐｒｏｇ Ｒｅｔｉｎ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．２００８，２７：５２７－５３５）を特徴とする急速に進行する自己免疫病変とは対照的に、進行が遅いＧＡにおける浸潤白血球は、アテローム性動脈硬化症、神経変性疾患および癌を含む他の長期化する加齢関連疾患と同じく主としてＭＰである（Ｇｒｉｖｅｎｎｉｋｏｖら，Ｃｅｌｌ．２０１０，１４０：８８３－８９９；Ｈｏｔａｍｉｓｌｉｇｉｌ，Ｃｅｌｌ．２０１０，１４０：９００－９１７）。さらに一般的に言えば、炎症とは組織損傷および微生物侵入に対する生物の応答である。理想的には、炎症は迅速かつ効率的に病原体を除去し、再生または瘢痕化のいずれかにより組織損傷を修復する。炎症応答が迅速に制御されなければ、多くの慢性炎症性疾患にみられるように、炎症応答は病原性となり、疾患進行の一因となる。治療抵抗性および低悪性度の慢性炎症は、代謝疾患（肥満、アテローム性動脈硬化症）（Ｈｏｔａｍｉｓｌｉｇｉｌ，Ｃｅｌｌ．２０１０，１４０：９００－９１７）、神経変性疾患（Ｇｌａｓｓら，Ｃｅｌｌ．２０１０，１４０：９１８－９３４）および癌（Ｇｒｉｖｅｎｎｉｋｏｖら，Ｃｅｌｌ．２０１０，１４０：８８３－８９９）などの状況においてみられ、したがって、多くの慢性加齢関連疾患の発病に大きく寄与する。治療抵抗性炎症は、これらの疾患の主因ではないが、好中球および間質マクロファージが産生する殺菌メディエーター（活性酸素種、プロテアーゼおよび炎症性サイトカインなど）が宿主細胞にもかなりの二次的障害を引き起こし、それ自体がより多くの炎症を引き起こし得ることから、そのような発病に大きく寄与する。持続性の主要な問題のために、または炎症、二次的障害および新たな炎症からなるサイクルを抜け出すことができないために、慢性炎症がどの程度持続するのかは明らかでないことが多い。罹患組織では、多くの場合、単球（Ｍｏ）、ミクログリア細胞などの常在性マクロファージ（ｒＭφ）および炎症時に発生する単球由来炎症性マクロファージ（ｉＭφ）を含む細胞ファミリーである単核食細胞（ＭＰ）の存在に関連するが、リンパ球浸潤または適応免疫応答にはほとんど関連しない（ＮａｔｈａｎおよびＤｉｎｇ，Ｃｅｌｌ．２０１０，１４０：８７１－８８２）。
【0008】
したがって、上記の要素の観点からみると、治療抵抗性低悪性度炎症、より具体的には単核食細胞の蓄積に関連する炎症、さらに具体的にはＡＭＤの予防および／または治療のための有効成分を特定することが依然として必要とされている。
【0009】
本発明者らは驚くべきことに、ＴＳＰ１がその受容体ＣＤ４７を介して単核食細胞除去を媒介することを明らかにしたため、この目的は本発明によって達成される。
【0010】
ＣＤ４７は、免疫および血管新生応答に重要な役割を果たしていることが知られている。特にＴＳＰ－１とＣＤ４７との結合は、細胞の遊走および接着、細胞増殖またはアポトーシスを含む複数の基本的な細胞機能に影響を及ぼし、血管新生およびリンパ球除去の調節において役割を果たしている（Ｃｈａｏら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２，２４（２）：２２５－３２）。ＣＤ４７は、骨髄性細胞上に存在する抑制性膜貫通受容体であるシグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）とも相互作用する。ＣＤ４７／ＳＩＲＰα相互作用により二方向のシグナル伝達が起こり、食作用の阻害、細胞間融合の刺激およびＴ細胞活性化を含む異なる細胞間の応答を生じる（Ｂａｒｃｌａｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９，２１（１）：４７－５２）。
【0011】
国際特許出願の国際公開第９９／４０９４０号には、炎症性疾患の予防または治療のための抗ＣＤ４７抗体の使用が開示されている。これと同様に、国際公開第２０１０／７００４７号には、自己免疫障害および炎症障害の治療に薬物として使用するためのＣＤ４７結合ポリペプチドが記載されている。また、国際公開第２０１１／１４３６２４号には、食作用を調節するための抗ＣＤ４７抗体の使用が開示されている。しかし、これらの特許出願による炎症疾患の治療は必然的にＣＤ４７の阻害を伴う。
【0012】
驚くべきことに、本出願者は、ＣＤ４７の活性化は、単核食細胞除去にとって極めて重要であり、ＣＤ４７活性化はそのリガンドであるＴＳＰ１を介することを証明した。さらに本発明者らは、ＨＴＲＡ１がＴＳＰ１を分解し、それによりそのＣＤ４７活性化および単核食細胞除去を阻害することを示した。さらに、本発明者らは驚くべきことに、ＣＤ４７アゴニストとＦａｓアゴニストとの併用療法により、ＨＴＲＡ１誘導性の単核食細胞蓄積を回復させ、それにより炎症を治療することを確立した。
【0013】
したがって、本発明は、ＣＤ４７を活性化する作用物質、ならびに治療抵抗性のＭＰ蓄積および炎症（例えば加齢黄斑変性など）の治療におけるその使用に関する。
【発明の概要】
【0014】
本発明は、炎症の治療に使用するための作用物質であってＣＤ４７を活性化する作用物質に関する。
【0015】
一実施形態では、本発明の炎症の治療に使用するための作用物質は、ＣＤ４７を直接活性化する。一実施形態では、前記作用物質はＣＤ４７アゴニスト、好ましくはＴＳＰ１ペプチド模倣物である。別の実施形態では、前記作用物質は、４Ｎ１Ｋ、ＰＫＨＢ１およびＰＫＴ１６を含む群から選択される活性化ペプチドである。
【0016】
別の実施形態では、本発明の炎症の治療に使用するための作用物質は、ＣＤ４７を間接的に活性化する。一実施形態では、前記作用物質は、ＴＳＰ１活性化因子、ＨＴＲＡ１阻害剤およびＦａｓ活性化因子を含む群から選択される。
【0017】
一実施形態では、本発明による炎症は急性炎症または慢性炎症である。一実施形態では、作用物質は、治療抵抗性慢性炎症、好ましくは治療抵抗性低悪性度炎症の治療に使用するためのものである。一実施形態では、前記炎症は単核食細胞の蓄積に関連する炎症である。一実施形態では、前記炎症は、加齢黄斑変性；網膜色素変性；パーキンソン病、多発性硬化症またはアルツハイマー病などの神経変性疾患；および肥満またはアテローム性動脈硬化症などの代謝障害を含む群から選択される。特定の実施形態では、前記炎症は加齢黄斑変性である。
【0018】
本発明はさらに、上記の作用物質を少なくとも１種含む組成物に関する。一実施形態では、本発明による組成物は、ＣＤ４７アゴニストとＦａｓ活性化因子とを含む。
【0019】
本発明の別の目的は、炎症（好ましくは加齢黄斑変性）の治療に使用するための、ＣＤ４７を活性化する少なくとも１種の作用物質と、少なくとも１種の薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物である。
【0020】
本発明のさらなる目的は、炎症（好ましくは加齢黄斑変性）の治療に使用するための、ＣＤ４７を活性化する少なくとも１種の作用物質を含む医薬である。
【0021】
一実施形態では、上記の作用物質、医薬組成物または医薬は、好ましくは硝子体内注射により眼内に投与されるか、または局所眼内投与により適用される。
【0022】
本発明は、上記の作用物質、医薬組成物または医薬を少なくとも１種含むキットにも関する。
【0023】
定義
本発明では、下記の用語は以下のような意味を有する：
本発明では、下記の用語は以下のような意味を有する：
【0024】
「アミノ酸」という用語は、２０種類の天然のアミノ酸；多くの場合、翻訳後にｉｎ ｖｉｖｏで修飾された上記のアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリンおよびホスホトレオニン；ならびに、特に限定されないが２－アミノアジピン酸、ヒドロキシリジン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシンおよびオルニチンを含むその他の通常とは異なるアミノ酸を包含するものと理解される。さらに、一実施形態では、「アミノ酸」という用語はＤ－アミノ酸およびＬ－アミノ酸（立体異性体）をともに包含する。
【0025】
「アミノ酸置換」という用語は、ポリペプチド内で１つのアミノ酸が別のアミノ酸に置き換わることを指す。一実施形態では、アミノ酸は、例えば保存的アミノ酸置換のように、構造および／または化学的特性の類似した別のアミノ酸と置き換わっている。「保存的アミノ酸置換」は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性の類似性に基づいて行われ得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられ；極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられ；正荷電（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられ；負荷電（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。非保存的置換は、上記のクラスのうち１つのクラスのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。例えば、アミノ酸置換により、１つのアミノ酸が構造および／または化学的特性の異なる別のアミノ酸の置き換わる、例えば、１つのグループ（例えば、極性）のアミノ酸が異なるグループ（例えば、塩基性）の別のアミノ酸に置き換わることもある。アミノ酸置換は、当該技術分野で周知の遺伝学的方法または化学的方法を用いて生成することができる。遺伝学的方法には、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成などが含まれ得る。遺伝子工学以外の方法、例えば化学修飾などによりアミノ酸の側鎖基を変化させる方法も有用であり得ることが考えられる。
【0026】
「同一性」という用語は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の尺度を指す。一般に、最も高次のマッチが得られるよう配列を整列させる。「同一性」自体は当該技術分野で認められている意味を有し、公開されている技術を用いて算出することができる。例えば、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；ならびにＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１を参照されたい。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の間の同一性を測定する方法がいくつか存在するが、「同一性」という用語は当業者に周知である（ＣａｒｉｌｌｏおよびＬｉｐｔｏｎ，ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ，１９９８，４８：１０７３）。２つの配列間の同一性または類似性を求めるのによく用いられる方法としては、特に限定されないが、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９４；ならびにＣａｒｉｌｌｏおよびＬｉｐｔｏｎ，ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ，１９９８，４８：１０７３に開示されているものが挙げられる。同一性および類似性を求める方法がコンピュータプログラムの形で体系化されている。２つの配列間の同一性および類似性を求めるための好ましいコンピュータプログラムによる方法としては、特に限定されないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，Ｊ Ｍｏｌｅｃ Ｂｉｏｌ，１９９０，２１５：４０３）が挙げられる。最も好ましくは、同一性レベルを求めるのに用いたプログラムは、以下の実施例に用いたＧＡＰプログラムであった。
【0027】
例として、基準ヌクレオチド配列と少なくとも例えば９５％の「同一性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、ポリヌクレオチド配列が基準ヌクレオチド配列のヌクレオチド１００個当たり平均５つまでの点変異を含み得る点を除き、基準配列と同一であると意図される。換言すれば、基準ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、基準配列のヌクレオチドのうち最大５％が欠失しているか、もしくは別のヌクレオチドで置換されていてもよく、または、基準配列内にいくつかのヌクレオチドが基準配列のヌクレオチド全体の最大５％まで挿入されていてもよい。基準配列のこのような変異は、基準ヌクレオチド配列の５’末端もしくは３’末端の位置に、またはこれらの末端位置の間の任意の場所に、基準配列のヌクレオチドの中に個別に散在して、または基準配列内で１つもしくは複数の連続するグループの形で存在し得る。
【0028】
「ペプチド」という用語は、ペプチド結合により互いに結合した５０個未満のアミノ酸からなるアミノ酸の直鎖状ポリマーを指す。本発明のペプチドは、特定の長さの産物に限定されない。この用語は、天然に存在するものおよび天然に存在しないものの両方の、ペプチドの発現後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ならびに当該技術分野で公知のその他の修飾を指すものでない、またこれを除外する。
【0029】
「スペーサーペプチド」とも呼ばれる「ペプチドリンカー」という用語は、２つのペプチドまたはポリペプチドを互いに結合させるのに使用されるペプチドを指す。一実施形態では、本発明のペプチドリンカーは３～５０アミノ酸を含む。ペプチドリンカーは、当該技術分野で公知であるか、本明細書に記載されるものである。本発明の一実施形態では、ペプチドリンカーは「Ｌ」とも呼ばれる。
【0030】
「ポリヌクレオチド」という用語は任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指し、これらは未修飾のＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る。「ポリヌクレオチド」としては、特に限定されないが、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡならびに一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖もしくはより典型的には二本鎖であり得るか、または一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられる。さらに、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。ポリヌクレオチドという用語は、１つまたは複数の修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡおよび安定性またはその他の理由で主鎖が修飾されたＤＮＡまたはＲＮＡも包含する。「修飾」塩基としては、例えば、トリチル化塩基およびまれな塩基、例えばイノシンなどが挙げられる。ＤＮＡおよびＲＮＡには様々な修飾が施されており、このため、「ポリヌクレオチド」は、天然において典型的にみられる化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態のポリヌクレオチドならびにウイルスおよび細胞に特有の化学形態のＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。「ポリヌクレオチド」は、比較的短く、多くの場合オリゴヌクレオチドと呼ばれるポリヌクレオチドも包含する。
【0031】
「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合、すなわちペプチドイソスターによって互いに結合した２個以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を指す。「ポリペプチド」は、通常ペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと呼ばれる短い鎖およびこれより長く、一般にタンパク質と呼ばれる鎖の両方を指す。ポリペプチドは、遺伝子がコードする２０種類のアミノ酸以外のアミノ酸を含み得る。
【0032】
「タンパク質」という用語は、１００個以上のアミノ酸の配列および／または多量体の実体を指す。本発明のタンパク質は特定の長さの産物に限定されない。「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、天然に存在するものおよび天然に存在しないものの両方の、タンパク質の発現後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ならびに当該技術分野で公知のその他の修飾を指すものではない、またはこれを除外する。このような修飾については、基本的なテキストおよびさらに詳細な研究論文ならびに膨大な研究文献に十分に記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含むポリペプチドまたはタンパク質の任意の場所に存在し得る。所与のポリペプチドまたはタンパク質の複数の部位に同じタイプの修飾が同じまたは異なる程度に存在し得ることが理解されよう。また、所与のポリペプチドまたはタンパク質は多数のタイプの修飾を含み得る。ポリペプチドまたはタンパク質は、ユビキチン化の結果として分岐していてよく、また、分岐の有無を問わず環状であってよい。環状、分岐状および分岐環状のポリペプチドまたはタンパク質は、転写後の自然な過程により生じるもの、または合成法により施されるものであり得る。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸塩の形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、転移ＲＮＡを介するタンパク質へのアミノ酸の付加、例えばアルギニン化などおよびユビキチン化が挙げられる。例えば、「Ｐｒｏｔｅｉｎｓ－ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」，第２版，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｗｏｌｔ，Ｆ．，「Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ」，Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｃｏｖａｌｅｎｔ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８３，ｐｇｓ．１－１２；Ｓｅｉｆｔｅｒら，「Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｆａｃｔｏｒｓ」，Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１９９０，１８２：６２６－６４６；Ｒａｔｔａｎら，「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ」，Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，１９９２，６６３：４８－６２を参照されたい。タンパク質はタンパク質全体またはその部分配列であり得る。「単離タンパク質」とは、その天然環境の成分から同定および分離され、かつおよび／または回収されたタンパク質のことである。
【0033】
好ましい実施形態では、単離タンパク質を：
（１）ローリー法により求める場合、タンパク質の８０重量％、８５重量％、９０重量％、９５重量％超、最も好ましくは９６重量％、９７重量％、９８重量％もしくは９９重量％超まで、
（２）スピニングカップ配列決定装置の使用によりＮ末端または内部のアミノ酸配列のうち少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または
（３）還元もしくは非還元条件下、クーマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を用いて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより均質になるまで
精製する。
（１）ローリー法により求める場合、タンパク質の８０重量％、８５重量％、９０重量％、９５重量％超、最も好ましくは９６重量％、９７重量％、９８重量％もしくは９９重量％超まで、
（２）スピニングカップ配列決定装置の使用によりＮ末端または内部のアミノ酸配列のうち少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または
（３）還元もしくは非還元条件下、クーマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を用いて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより均質になるまで
精製する。
【0034】
単離タンパク質は、タンパク質の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないことから、組換え細胞内のｉｎ ｓｉｔｕのタンパク質を包含する。しかし、通常、単離タンパク質は、少なくとも１つの精製段階によって調製される。
【0035】
「機能保存フラグメント」という用語は、特に限定されないが、アミノ酸の、特性（例えば、極性、水素結合能、酸性、塩基性疎水性，芳香族など）の類似したアミノ酸への置換を含む、ペプチドの全体的なコンホメーションおよび機能を変化させずに所与のアミノ酸残基が変化している、本発明のペプチドに由来するペプチドを指す。あるタンパク質において、保存されていると記載されるアミノ酸以外のアミノ酸は異なるものであり得るため、機能が類似した任意の２つのタンパク質の間のタンパク質またはアミノ酸配列の類似性のパーセントは様々なものであり得、例えば、類似性がＭＥＧ ＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づくＣｌｕｓｔｅｒ法などによるアライメント法により求めた場合、７０％～９９％であり得る。「機能保存バリアント」もＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムにより求めた場合、少なくとも２０％、好ましくは４０％、より好ましくは６０％、好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有し、比較される天然または親タンパク質と同じまたは実質的に同じ特性または機能を有するポリペプチドを包含する。
【0036】
「誘導体」という用語は、ポリペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでのコンホメーション、活性、特異性、効果または安定性を修飾するため、別の方法で、すなわち、任意のタイプの分子をポリペプチドに共有結合させることにより、配列のいずれかのアミノ酸への化合物の付加により修飾された本発明のポリペプチドまたはその機能保存バリアントの変形物を指す。
【0037】
「アゴニスト」という用語は、タンパク質と結合し、そのタンパク質の生物学的活性化を刺激し、それにより前記タンパク質の作用を刺激する、天然または合成の化合物を指す。その結果、「ＣＤ４７アゴニスト」は、対象に投与したとき、そうでなければＣＤ４７とその天然のリガンドとの結合により生じる下流のいずれかの生物学的作用を含む患者のＣＤ４７に関連する生物活性の刺激をもたらす、任意の化学実体を含む。このようなＣＤ４７アゴニストとしては、ＣＤ４７発現またはＣＤ４７の下流のいずれかの生物学的作用を刺激し得る任意の作用物質が挙げられる。
【0038】
「免疫グロブリン」という用語は、何らかの重要な特異的免疫反応性を有するかどうかを問わず、２つの重鎖と２つの軽鎖の組合せを有するポリペプチドを包含する。「抗体」という用語は、目的とする抗原（例えば、ＣＤ４７、ＴＳＰ１、ＨＴＲＡ１またはＦａｓ）に対する有意な既知の特異的免疫反応活性を有する、２つの重鎖と２つの軽鎖の組合せを指す。抗体および免疫グロブリンは、間に鎖間共有結合を有するかどうかを問わず、軽鎖と重鎖とを含む。脊椎動物系の基本的な免疫グロブリン構造は比較的よく理解されている。「免疫グロブリン」という総称は、生化学的に識別することが可能な５種類の異なるクラスの抗体を含む。５種類のクラスの抗体はいずれも本発明の範囲内に含まれ、以下の記述は一般に、ＩｇＧクラスの免疫グロブリン分子に関するものである。ＩｇＧに関して、免疫グロブリンは、分子量が約２３，０００ダルトンの同一の軽鎖ポリペプチド２つと、分子量が５３，０００～７０，０００ダルトンの同一の重鎖２つとを含む。この４つの鎖はジスルフィド結合により「Ｙ字」立体配置で結合しており、軽鎖が「Ｙ字」の口の部分を始点として可変領域全体を通して続く重鎖を挟んでいる。抗体の軽鎖はカッパまたはラムダ（［κ］、［λ］）に分類される。重鎖の各クラスはカッパまたはラムダ軽鎖と結合し得る。一般に、軽鎖と重鎖は互いに共有結合しており、２つの重鎖の「尾部」領域は、共有ジスルフィド結合により、または免疫グロブリンがハイブリドーマ、Ｂ細胞もしくは遺伝子操作した宿主細胞により作製されたものである場合は非共有結合により、互いに結合している。重鎖では、アミノ酸配列は、Ｙ字立体配置の分岐末端のＮ末端から各鎖の底部のＣ末端まで続いている。当業者には、重鎖がいくつかのサブクラス（例えば、γ１～γ４）を有するガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）に分類されることが理解されよう。抗体の「クラス」をＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧまたはＩｇＥに決めるのは、それぞれこの鎖の性質である。免疫グロブリンのサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１などは十分に特徴付けられており、機能的特化を付与することが知られている。これらの各クラスおよびアイソタイプの修飾型は、本開示を踏まえれば当業者に容易に認識されるものであり、したがって、本発明の範囲内に含まれる。上記の通り、抗体の可変領域によって、抗体が抗原上のエピトープを選択的に認識し、これと特異的に結合することが可能となる。つまり、抗体のＶＬドメインとＶＨドメインが一緒になって可変領域を形成し、この可変領域により三次元の抗原結合部位が定められる。この抗体四次構造は、Ｙ字の各腕の末端に存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗原結合部位は、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖それぞれの３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって定められる。
【0039】
「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、わずかに存在し得る天然の変異を除いて同一である集団から得られた抗体を指す。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一の抗原性部位に対するものである。さらに、様々な決定基（エピトープ）に対する様々な抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体はそれぞれ抗原上の１つの決定基に対するものである。モノクローナル抗体はその特異性に加えて、他の抗体が混入せずに合成され得る点で有利である。「モノクローナル」という修飾語は、任意の特定の方法による抗体の作製を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に有用なモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ法により調製してもよく、または細菌、真核動物もしくは植物の細胞に組換えＤＮＡ法を用いて作製してもよい（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。また、「モノクローナル抗体」は、例えばＣｌａｃｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１－５９７（１９９１）に記載されている技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。
【0040】
「ポリクローナル抗体」という用語は、特異的抗原に対して反応し、それぞれが異なるエピトープを識別する免疫グロブリン分子の集合体を指す。したがって、モノクローナル抗体とは対照的に、ポリクローナル抗体は単一の細胞株に由来するものではない。
【0041】
「抗体フラグメント」という用語は、インタクトまたは完全な抗体または抗体鎖より少ないアミノ酸残基を含む、抗体の部分または領域を指す。「抗原結合フラグメント」という用語は、抗原と結合するか、または抗原結合（すなわち、ＣＤ４７との特異的結合）に関してインタクト抗体（すなわち、それが由来するインタクト抗体）と競合する、免疫グロブリンまたは抗体のポリペプチドフラグメントを指す。本明細書で使用される抗体分子の「抗体フラグメント」という用語は、抗体の抗原結合フラグメント、例えば、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、一本鎖抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、単一ドメイン抗体フラグメント（Ｄａｂ）、一腕（一価）抗体、ダイアボディ、トライアボディ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲの組合せ、可変領域、テトラボディ、二機能性ハイブリッド抗体、フレームワーク領域、定常領域、またはそのような抗原結合フラグメントの組合せ、アセンブリもしくはコンジュゲーションにより形成される任意の抗原結合分子を包含する。フラグメントは、例えば、インタクトもしくは完全な抗体もしくは抗体鎖の化学処理もしくは酵素処理、または組換え手段により得ることができる。
【0042】
指定のタンパク質（例えば、ＴＳＰ１抗体またはその抗原結合フラグメント）の前に記載される「～に由来する」という用語は、ポリペプチドの起源を指す。一実施形態では、特定の出発ポリペプチドに由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、ＣＤＲ配列またはそれに関連する配列である。一実施形態では、特定の出発ポリペプチドに由来するアミノ酸配列は連続していない。例えば、一実施形態では、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＣＤＲが１つの出発抗体に由来する。一実施形態では、特定の出発ポリペプチドまたはアミノ酸配列に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、その出発配列の配列と実質的に同一のアミノ酸配列、あるいはその少なくとも３～５個のアミノ酸、５～１０個のアミノ酸、少なくとも１０～２０個のアミノ酸、少なくとも２０～３０個のアミノ酸もしくは少なくとも３０～５０個のアミノ酸からなる領域、またはその起源が出発配列にあることが当業者に特定可能である領域を有する。
【0043】
「ダイアボディ」という用語は、鎖内ではなく鎖間のＶドメイン対が生じ、それにより二価フラグメント、すなわち、２つの抗原結合部位を有するフラグメントが得られるようＶＨドメインとＶＬドメインとの間に短いリンカー（約５～１０残基）を用いてｓＦｖフラグメント（ｓＦｖのパラグラフを参照されたい）を構築することにより調製される小さい抗体フラグメントを指す。二重特異性のダイアボディは、２つの抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖に存在する２つの「交差する」ｓＦｖフラグメントからなるヘテロ二量体である。ダイアボディについては、例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開９３／１１１６１号；およびＨｏｌｌｉｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０：６４４４－６４４８（１９９３）により詳しく記載されている。
【0044】
用語「ペプチボディ」：ペプチボディは、Ｆｃドメイン上に移植した生物学的に活性なペプチドからなる。この方法では、抗体の特定の望ましい特徴、特に、２つのＦｃの二量体化がもたらすアビディティによる見かけの親和性の増大が保持される。
【0045】
「エピトープ」という用語は、作用物質（例えば、抗体もしくは小分子）が結合する、ペプチドもしくはタンパク質（複数可）に存在する特定のアミノ酸配置を指す。エピトープは多くの場合、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面集団からなり、特定の三次元構造的特徴ならびに特定の電荷的特徴を有する。エピトープは、直鎖状であるか、または立体構造的であり得る、すなわち、必ずしも隣接しているわけではない抗原の様々な領域のアミノ酸の配列を２つ以上含むものであり得る。
【0046】
「Ｆｖ」という用語は、完全な抗原認識および結合部位を含む最小の抗体フラグメントのことである。このフラグメントは、緊密に非共有結合した１つの重鎖可変領域ドメインと１つの軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。この２つのドメインのフォールディングから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に抗原結合特異性を付与する６つの超可変（Ｈ鎖およびＬ鎖それぞれに由来する３つのループ）が生じる。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的なＣＤＲを３つのみ含む半分のＦｖ）であっても、結合部位全体より親和性は低いものの、抗原を認識しこれと結合する能力を有する。
【0047】
用語「免疫特異的」、「～に特異的な」または「と特異的に結合する」：本明細書で使用される抗体が検出可能なレベルで、好ましくは約１０４Ｍ－１以上、約１０５Ｍ－１以上、約１０６Ｍ－１以上、約１０７Ｍ－１以上、１０８Ｍ－１以上、１０９Ｍ－１以上または１０１０Ｍ－１以上の親和性定数Ｋａで抗原と反応する場合、それは「免疫特異的」、「～に特異的な」または「と特異的に結合する」と言う。抗体のその同起源の抗原に対する親和性は解離定数Ｋｄで表されることも多く、ある特定の実施形態では、ある抗体が１０－４Ｍ以下、約１０－５Ｍ以下、約１０－６Ｍ以下、１０－７Ｍ以下、１０－８Ｍ以下、５．１０－９Ｍ以下、１０－９Ｍ以下、５．１０－１０Ｍ以下または１０－１０Ｍ以下のＫｄで結合する場合、それは抗原と特異的に結合する。抗体の親和性は、従来の技術、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄ Ｇら、（Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．１９４９、５１：６６０－６７２）に記載されている技術を用いて容易に求めることができる。抗体の抗原、細胞または組織に対する結合特性は一般に、例えば免疫組織化学（ＩＨＣ）および／または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などの免疫蛍光に基づくアッセイを含む免疫検出法を用いて決定および評価され得る。
【0048】
「哺乳動物」という用語は、ヒト、家畜、農業動物および動物園、競技用またはペットの動物を含む任意の哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどを指す。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【0049】
ポリペプチドに関する「合成の」という用語は、天然に存在しないアミノ酸配列を含むポリペプチドを包含する。例えば、非天然のポリペプチドは、修飾形態の天然のポリペプチド（例えば、付加、置換または欠失などの変異を含むもの）またはアミノ酸の直鎖状配列内で、天然では本来結合していない第二のアミノ酸配列（天然に存在するものであるかどうかは問わない）と結合した第一のアミノ酸配列（天然に存在するものであるかどうかは問わない）を含むポリペプチドである。
【0050】
「小分子」という用語は、脂質、単糖、セカンドメッセンジャー、その他の天然物および代謝産物を含む低分子量分子を意味する。小分子はタンパク質などの高分子とは異なるものである。
【0051】
「結合部位」という用語は、目的の標的抗原（例えば、ＣＤ４７、ＴＳＰ１、ＨＴＲＡ１またはＦａｓ）との選択的結合に関与するポリペプチドの領域を含む。結合ドメインまたは結合領域は少なくとも１つの結合部位を含む。例示的な結合ドメインとしては、抗体可変ドメインが挙げられる。本発明の抗体分子は、単一の抗原結合部位または複数（例えば、２つ、３つまたは４つ）の抗原結合部位を含み得る。
【0052】
「ｓｉＲＮＡ」または「低分子干渉ＲＮＡ」という用語は、約１５～約５０塩基対、例えば約２１～約２５塩基対を含み、細胞内で発現する標的遺伝子またはＲＮＡと同一またはほぼ同一のヌクレオチド配列を有する、二本鎖構造を指す。ｓｉＲＮＡは、標準的なワトソン・クリック型塩基対形成相互作用により互いにアニールしたセンスＲＮＡ鎖と相補的アンチセンスＲＮＡ鎖とを含む。センス鎖は、標的ｍｉＲＮＡ分子内に含まれる核酸配列と実質的に同一である核酸配列を含む。標的ｍＲＮＡ内に含まれる標的配列と「実質的に同一である」は、標的配列と約３％以下異なる核酸配列を指す。ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、相補的な２つの一本鎖ＲＮＡ分子を含み得るか、２つの相補的な部分が塩基対を形成し一本鎖「ヘアピン」領域により共有結合した単一の分子を含み得る。ｓｉＲＮＡは、当業者に周知の方法により、化学的もしくは生物学的に作製することができ、または組換えプラスミドもしくはウイルスベクターから発現させることができる。
【0053】
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」（または「ＡＳＯ」）という用語は、標的遺伝子のｍＲＮＡに相補的な配列を有する低分子のデオキシオリゴヌクレオチドを指す。このようなオリゴヌクレオチドは、相補的塩基対形成により標的ｍＲＮＡと結合し、二本鎖ＲＮＡを分解する酵素であるＲＮアーゼＨの結合を誘引し、それにより標的ｍＲＮＡを破壊する。
【0054】
「治療」または「治療すること」という用語は、治療的処置と予防手段または防止手段の両方を指し；目的は炎症を予防する、または速度を低下させる（軽減する）ことである。治療を必要とする者は、既に炎症を有する者および炎症を起こしやすい者または炎症を予防するべき者を含む。対象または哺乳動物は、本発明による作用物質の治療量を投与した後、患者に以下に挙げる１つまたは複数のものの観察可能かつ／または測定可能な減少または非存在、すなわち、炎症に関連する１つまたは複数の症状のある程度の緩和、有病率および死亡率の低下、ならびに生活の質の改善がみられる場合、炎症の「治療」が成功を収めたことになる。治療の成功および疾患の改善を評価する上記のパラメータは、医師がよく知る日常的方法により容易に測定されるものである。
【0055】
「対象」という用語は哺乳動物、好ましくはヒトを指す。一実施形態では、対象は男性である。別の実施形態では、対象は女性である。一実施形態では、対象は「患者」、すなわち、医療を受けるのを待っている、または受けている、または医療処置の対象であった／対象である／対象となる予定である、または炎症の進展に関してモニターされている、温血動物、より好ましくはヒトであり得る。一実施形態では、対象は成人（例えば、１８歳を超える対象）である。別の実施形態では、対象は小児（例えば、１８歳未満の対象）である。一実施形態では、本発明の化合物を、それを必要とするヒト患者に投与する。
【0056】
「治療有効量」という用語は、標的に重大な負の副作用または有害な副作用を引き起こさずに、（１）炎症の発症を遅らせる、もしくは予防する；（２）炎症の１つもしくは複数の症状の進行、増悪もしくは悪化を遅らせる、もしくはそれを停止させる；（３）炎症の症状の改善をもたらす；（４）炎症の重症度もしくは発症頻度を低下させる；または（５）炎症を治癒させること、を目的とする作用物質のレベルまたは量を意味する。予防処置または防止処置には、炎症の発症前に治療有効量を投与し得る。あるいはまたはさらに、治療処置または治療処置の維持のために、炎症の開始後に治療有効量を投与してもよい。
【0057】
「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、動物、好ましくはヒトに投与したときに有害反応、アレルギー反応またはその他の不都合な反応を引き起こさない賦形剤を指す。同用語は、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的に許容される担体または添加剤は、無毒性の固体、半固体もしくは液体の充填剤、希釈剤、封入材料または任意のタイプの製剤助剤を指す。ヒトへの投与には、調製物がＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ｓｔａｎｄａｒｄｓにより要求される無菌性、発熱原性、一般的安全性および純度の基準を満たすべきである。
【0058】
数値の前の「約」という用語は、前記数値より１０％大きいまたは小さいことを意味する。
【発明を実施するための形態】
【0059】
（詳細な説明）
本発明は、互いに連結された少なくとも２つのペプチド単量体を含む多量体ペプチドまたはポリペプチドであって前記少なくとも２つのペプチド単量体がＣＤ４７を活性化する多量体ペプチドまたはポリペプチドに関する。
本発明は、互いに連結された少なくとも２つのペプチド単量体を含む多量体ペプチドまたはポリペプチドであって前記少なくとも２つのペプチド単量体がＣＤ４７を活性化する多量体ペプチドまたはポリペプチドに関する。
【0060】
一実施形態では、本発明の多量体ペプチドまたはポリペプチドは、４Ｎ１Ｋペプチド（配列ＫＲＦＹＶＶＭＷＫＫ、配列番号１）、ＰＫＨＢ１ペプチド（配列（Ｄ）Ｋ－Ｒ－Ｆ－Ｙ－Ｖ－Ｖ－Ｍ－Ｗ－Ｋ－（Ｄ）Ｋ、式Ｉ）および／もしくはＰＫＴ１６ペプチド（配列（Ｄ）Ｋ－（ＮＭｅＲ）－Ｆ－Ｙ－Ｖ－Ｖ－Ｎｌｅ－Ｗ－Ｋ－（Ｄ）Ｋ、式ＩＩ）、またはその機能保存フラグメントのアミノ酸を含む。
【0061】
【化1】
【0062】
一実施形態では、多量体ペプチドまたはポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列およびその機能保存フラグメントから選択される少なくとも５個の連続するアミノ酸を含む。別の実施形態では、実施形態の作用物質、本発明の活性化ポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列および機能保存フラグメントから選択される少なくとも６個、７個、８個、９個または１０個の連続するアミノ酸を含む。
【0063】
一実施形態では、少なくとも２つのペプチド単量体は、同一のものまたは異なるものである。例として、一実施形態では、多量体ペプチドまたはポリペプチドは、２つの４Ｎ１Ｋペプチドを含み得る。さらなる例として、別の実施形態では、多量体ペプチドまたはポリペプチドは、１つの４Ｎ１ＫペプチドとＰＫＴ１６ペプチドとを含み得る。
【0064】
一実施形態では、本発明の多量体ペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも２つの４Ｎ１Ｋペプチドまたはその機能保存フラグメントを含む。一実施形態では、本発明の多量体ペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも２つのＰＫＨＢ１ペプチドまたはその機能保存フラグメントを含む。一実施形態では、本発明の多量体ペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも２つのＰＫＴ１６ペプチドまたはその機能保存フラグメントを含む。
【0065】
一実施形態では、本発明の多量体ペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも１つの４Ｎ１Ｋペプチドと少なくとも１つのＰＫＨＢ１ペプチドまたはその機能保存フラグメントを含む。一実施形態では、本発明の多量体ペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも１つの４Ｎ１Ｋペプチドと少なくとも１つのＰＫＴ１６ペプチドまたはその機能保存フラグメントを含む。一実施形態では、本発明の多量体ペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも１つのＰＫＨＢ１ペプチドと少なくとも１つのＰＫＴ１６ペプチドまたはその機能保存フラグメントを含む。
【0066】
一実施形態では、本発明の多量体ペプチドまたはポリペプチドは、任意の数の反復単位を含む。一実施形態では、本発明の多量体ペプチドまたはポリペプチドは、２～１０個、２～２０個または２～３０個の反復サブユニットを含む。一実施形態では、本発明の多量体ペプチドまたはポリペプチドは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個または１２個の反復サブユニットを含む。したがって、一実施形態では、本発明の多量体ペプチドまたはポリペプチドは、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、十量体、十一量体または十二量体であり得る。
【0067】
特定の実施形態では、本発明の多量体ペプチドまたはポリペプチドは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個または１２個の４Ｎ１Ｋペプチドを含む。したがって、特定の実施形態では、本発明の多量体ペプチドまたはポリペプチドは、４Ｎ１Ｋペプチドの二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、十量体、十一量体または十二量体である。特定の実施形態では、本発明の多量体ペプチドまたはポリペプチドは、４Ｎ１Ｋの二量体である。
【0068】
一実施形態では、本発明のペプチド単量体の結合は、それが多量体ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の生物活性、すなわち、ＣＤ４７の活性化に実質的に干渉しない限り、当該技術分野で公知の任意の方法を用いて行うことができる。
【0069】
一実施形態では、本発明のペプチド単量体を、結合部分を介して結合させてもよい。
【0070】
連結部分の例としては、特に限定されないが、単純な共有結合、柔軟なペプチドリンカー、アルキルリンカー、ジスルフィド架橋またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマーが挙げられる。ペプチドリンカーは、完全に人工的な（例えば、グリシン、セリン、アスパラギン、トレオニンおよびアラニンからなる群より独立に選択されるアミノ酸残基を２～２０個含む）ものまたは天然のタンパク質から取り入れたものであり得る。ジスルフィド架橋形成は、本明細書で以下にさらに記載するように、例えばシステイン残基の付加により達成することができる。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を介する連結は、遊離システインを有する単量体と直鎖状ビス－マレイミドＰＥＧなどの多官能性ＰＥＧとの反応により達成することができる。あるいは、アルデヒド型に酸化させた後の単量体上のグリカンを介して、およびアルデヒド反応性の基を含む多官能性ＰＥＧを用いて、連結を実施することができる。２つの単量体の間の結合の位置の選択には、その結合が、多量体ペプチドまたはポリペプチドがＣＤ４７を活性化する能力に実質的に干渉しないよう考慮するべきである。
【0071】
一実施形態では、連結部分はペプチドリンカーである。
【0072】
一実施形態では、本発明のペプチドリンカーは、長さが３～３０アミノ酸、好ましくは４～２０アミノ酸、より好ましくは５～１５アミノ酸である。一実施形態では、本発明のペプチドリンカーは、少なくとも４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個または１５個のアミノ酸を含む。一実施形態では、本発明のペプチドリンカーは、最大２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個または１２個のアミノ酸を含む。
【0073】
一実施形態では、本発明のペプチドリンカーは、３個、４個、５個、６個、７個、８個または９個のアミノ酸を含む。別の実施形態では、本発明のペプチドリンカーは、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個またはそれ以上のアミノ酸を含む。
【0074】
ペプチドリンカーの例としては、特に限定されないが、ポリＧｌｙリンカーなどのＧｌｙリッチリンカー、Ｓｅｒリッチリンカー、一続きのＧｌｙ残基とＳｅｒ残基（「ＧＳリンカー」とも呼ばれる）を含むリンカー、Ｐｒｏリッチリンカー、ヘリックスリンカーなどが挙げられる。
【0075】
一実施形態では、ペプチドリンカーのアミノ酸は、天然に存在する２０種類のアミノ酸から選択される。好ましい実施形態では、１～２０個のアミノ酸は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓから選択される。より好ましい実施形態では、リンカーは、立体障害のないアミノ酸、例えばＧｌｙ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ［（Ｇｌｙ）２］、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ［（Ｇｌｙ）３］．．．（Ｇｌｙ）２０、Ａｌａ、Ｇｌｙ－Ａｌａ、Ａｌａ－Ｇｌｙ、Ａｌａ－Ａｌａなどで大部分が構成されている。リンカーの他の具体例は、（Ｇｌｙ）３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）４（配列番号２）；（Ｇｌｙ）３ＡｓｎＧｌｙＳｅｒ（Ｇｌｙ）２（配列番号３）（この構造は、グリコシル化部位をグリコシル化することが可能な哺乳動物細胞系で組換えにより産生させると、グリコシル化部位を提供する）；（Ｇｌｙ）３Ｃｙｓ（Ｇｌｙ）４（配列番号４）；およびＧｌｙＰｒｏＡｓｎＧｌｙ（配列番号５）である。
【0076】
好ましい実施形態では、ペプチドリンカーはＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ［（Ｇｌｙ）８、配列番号６］である。別の好ましい実施形態では、ペプチドリンカーはＧｌｙとＡｌａの組合せである。別の好ましい実施形態では、ペプチドリンカーはＧｌｙとＬｙｓの組合せである。
【0077】
一実施形態では、本発明の多量体ペプチドまたはポリペプチドは、ペプチドリンカー、好ましくはＧｌｙリッチリンカーを介して結合した２つの４Ｎ１Ｋペプチドを含む。別の実施形態では、本発明の多量体ペプチドまたはポリペプチドは、ペプチドリンカー、好ましくはＧｌｙリッチリンカーを介して結合した２つのＰＫＨＢ１ペプチドを含む。一実施形態では、本発明の多量体ペプチドまたはポリペプチドは、ペプチドリンカー、好ましくはＧｌｙリッチリンカーを介して結合した２つのＰＫＴ１６ペプチドを含む。
【0078】
特定の実施形態では、本発明の多量体ペプチドまたはポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列を含む、またはこれよりなる。
【0079】
本発明は、本明細書で上に記載した多量体ペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列または核酸配列にも関する。
【0080】
一実施形態では、ポリヌクレオチドまたは核酸はＤＮＡである。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは一本鎖または二本鎖であり得る。
【0081】
本発明の別の目的は、本発明の多量体ペプチドまたはポリペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む、ベクターである。好ましい実施形態では、本発明のベクターは発現ベクターである。
【0082】
本発明のさらなる目的は、本明細書で上に記載した本発明の多量体ペプチドまたはポリペプチドを含む組成物である。
【0083】
本発明の別の目的は、プロテアーゼＨＴＲＡ１に耐性を示す修飾ＴＳＰ１タンパク質（ＨＴＲＡ１耐性修飾ＴＳＰ１）またはそのフラグメントであり、前記修飾ＴＳＰ１タンパク質はＣＤ４７を活性化する。
【0084】
本出願人は、ＨＴＲＡ１がＴＳＰ１を（ｉ）インテグリンα３β１との結合能があることがわかっている部位、（ｉｉ）「２型」ドメインの間にある２つの部位および（ｉｉｉ）それぞれがＣＤ４７受容体と相互作用することが可能であり、その効率の高いＣＤ４７活性化に関与する２つのバリン－バリン－メチオニン（ＶＶＭ）配列の間にある２つの部位で切断することを示す（実施例４を参照されたい）。一方、これと全体的構造が同じで、ＣＤ４７を含むいくつかの同じ細胞表面受容体と相互作用するタンパク質ＴＳＰ２は、プロテアーゼＨＴＲＡ１に耐性を示す。
【0085】
一実施形態では、プロテアーゼＨＴＲＡ１に耐性を示す修飾ＴＳＰ１タンパク質のフラグメントは、修飾ＴＳＰ１タンパク質のアミノ酸を５０～１１００個、１００～１０００個、９００個、８００個、７００個、６００個、５００個または４００個含む。別の実施形態では、本発明のフラグメントは、修飾ＴＳＰ１タンパク質のアミノ酸を１５０～１１００個、１０００個、９００個、８００個、７００個、６００個、５００個または４００個含む。別の実施形態では、本発明のフラグメントは、修飾ＴＳＰ１タンパク質のアミノ酸を２００～１１００個、１０００個、９００個、８００個、７００個、６００個、５００個または４００個含む。別の実施形態では、本発明のフラグメントは、修飾ＴＳＰ１タンパク質のアミノ酸を３００～１１００個、１０００個、９００個、８００個、７００個、６００個、５００個または４００個含む。特定の実施形態では、本発明のフラグメントは、修飾ＴＳＰ１タンパク質のアミノ酸を３６９個含む。
【0086】
一実施形態では、本発明のフラグメントは、修飾ＴＳＰ１タンパク質のＣ末端部分を含む、またはこれよりなる。好ましい実施形態では、本発明のフラグメントは、修飾ＴＳＰ１タンパク質の最後の３６９個のアミノ酸を含む、またはこれよりなる。
【0087】
一実施形態では、修飾ＴＳＰ１タンパク質またはそのフラグメントは、ＣＤ４７との結合能を保持していると同時に、プロテアーゼＨＴＲＡ１に耐性を示す。
【0088】
一実施形態では、本発明のＨＴＲＡ１耐性修飾ＴＳＰ１は、ＨＴＲＡ１切断配列のうち少なくとも１つの配列のアミノ酸が少なくとも１個欠失している、置換されている、または付加されている、修飾ＴＳＰ１タンパク質である。
【0089】
本明細書で使用される「ＨＴＲＡ１切断配列」は、ＴＳＰ１のアミノ酸配列内にあり、プロテアーゼＨＴＲＡ１により切断される配列を意味する。一実施形態では、ＴＳＰ１の少なくとも１つのＨＴＲＡ１切断配列は、配列番号８の２４１～２４４位のＱＶＴＱである。一実施形態では、ＴＳＰ１の少なくとも１つのＨＴＲＡ１切断配列は、配列番号８の２８７～２９０位のＧＱＶＲである。
【0090】
一実施形態では、本発明のＨＴＲＡ１耐性修飾ＴＳＰ１は、ＨＴＲＡ１切断配列のうち少なくとも１つの配列のアミノ酸が少なくとも１個欠失している修飾ＴＳＰ１タンパク質である。
【0091】
一実施形態では、本発明のＨＴＲＡ１耐性修飾ＴＳＰ１は、配列番号８の２４２～２４３位の残基ＶＴが欠失している修飾ＴＳＰ１タンパク質である。一実施形態では、本発明のＨＴＲＡ１耐性修飾ＴＳＰ１は、配列番号８の２８８～２８９位の残基ＱＶが欠失している修飾ＴＳＰ１タンパク質である。一実施形態では、本発明のＨＴＲＡ１耐性修飾ＴＳＰ１は、配列番号８の２４２～２４３位の残基ＶＴおよび２８８～２８９位の残基ＱＶが欠失している修飾ＴＳＰ１タンパク質である。
【0092】
一実施形態では、本発明のＨＴＲＡ１耐性修飾ＴＳＰ１またはそのフラグメントのアミノ酸配列は、配列番号９と少なくとも７５％同一の配列を含む。一実施形態では、本発明のＨＴＲＡ１耐性修飾ＴＳＰ１またはそのフラグメントのアミノ酸配列は、配列番号９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一の配列を含む。一実施形態では、本発明のＨＴＲＡ１耐性修飾ＴＳＰ１またはそのフラグメントは、配列番号９を含む、またはこれよりなるアミノ酸配列を有する。一実施形態では、本発明のＨＴＲＡ１耐性修飾ＴＳＰ１は、配列番号９のアミノ酸配列を有するＣ末端部分を有する。一実施形態では、本発明のＨＴＲＡ１耐性修飾ＴＳＰ１フラグメントは、配列番号９よりなるアミノ酸配列を有する。
【0093】
一実施形態では、本発明のＨＴＲＡ１耐性修飾ＴＳＰ１は、ＨＴＲＡ１切断配列のうち少なくとも１つの配列のアミノ酸が少なくとも１個置換されている修飾ＴＳＰ１タンパク質である。
【0094】
一実施形態では、本発明のＨＴＲＡ１耐性修飾ＴＳＰ１は、配列番号８の２４２位の残基Ｖが置換されている修飾ＴＳＰ１タンパク質である。一実施形態では、本発明のＨＴＲＡ１耐性修飾ＴＳＰ１は、配列番号８の２８９位の残基Ｖが置換されている修飾ＴＳＰ１タンパク質である。一実施形態では、本発明のＨＴＲＡ１耐性修飾ＴＳＰ１は、配列番号８の残基Ｖ２４２およびＶ２８９が置換されている修飾ＴＳＰ１タンパク質である。
【0095】
一実施形態では、置換は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、ＷおよびＹを含むか、これよりなる群から選択される、アミノ酸置換である。特定の実施形態では、置換はアミノ酸Ｎである。一実施形態では、ＨＴＲＡ１耐性修飾ＴＳＰ１またはそのフラグメントは、置換Ｖ２４２Ｎ（配列番号８による位置）を含む修飾ＴＳＰ１タンパク質である。別の実施形態では、ＨＴＲＡ１耐性修飾ＴＳＰ１またはそのフラグメントは、置換Ｖ２８９Ｎ（配列番号８による位置）を含む修飾ＴＳＰ１タンパク質である。別の実施形態では、ＨＴＲＡ１耐性修飾ＴＳＰ１またはそのフラグメントは、置換Ｖ２４２ＮおよびＶ２８９Ｎ（配列番号８による位置）を含む修飾ＴＳＰ１タンパク質である。
【0096】
一実施形態では、ＨＴＲＡ１耐性修飾ＴＳＰ１またはそのフラグメントのアミノ酸配列は、配列番号１１と少なくとも７５％同一の配列を含む。一実施形態では、ＨＴＲＡ１耐性修飾ＴＳＰ１またはそのフラグメントのアミノ酸配列は、配列番号１１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一の配列を含む。一実施形態では、ＨＴＲＡ１耐性修飾ＴＳＰ１またはそのフラグメントは、配列番号１１を含む、またはこれよりなるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、本発明のＨＴＲＡ１耐性修飾ＴＳＰ１は、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣ末端部分を有する。一実施形態では、本発明のＨＴＲＡ１耐性修飾ＴＳＰ１フラグメントは、配列番号１１よりなるアミノ酸配列を有する。
【0097】
一実施形態では、ＨＴＲＡ１耐性修飾ＴＳＰ１またはそのフラグメントのアミノ酸配列は、少なくとも１つのシステイン置換をさらに含む。一実施形態では、少なくとも１つの置換されたシステインは、Ｃ３、Ｃ１５、Ｃ３４、Ｃ３５、Ｃ５５、Ｃ７３、Ｃ９３、Ｃ１０９、Ｃ１２９、Ｃ１４５、Ｃ１９１およびＣ３６６（配列番号８による位置）を含む群から選択される。一実施形態では、少なくとも１つの置換されたシステインはＣ３４（配列番号８による位置）である。別の実施形態では、少なくとも１つの置換されたシステインはＣ１９１（配列番号８による位置）である。一実施形態では、ＨＴＲＡ１耐性修飾ＴＳＰ１またはそのフラグメントのアミノ酸配列は、２つのシステイン置換をさらに含む。一実施形態では、２つの置換されたシステインはＣ３４およびＣ１９１（配列番号８による位置）である。
【0098】
一実施形態では、本発明のＨＴＲＡ１耐性修飾ＴＳＰ１またはそのフラグメントのアミノ酸配列は、配列番号１０と少なくとも７５％同一の配列を含む。一実施形態では、本発明のＨＴＲＡ１耐性修飾ＴＳＰ１またはそのフラグメントのアミノ酸配列は、配列番号１０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一の配列を含む。一実施形態では、本発明のＨＴＲＡ１耐性修飾ＴＳＰ１またはそのフラグメントは、配列番号１０を含む、またはこれよりなるアミノ酸配列を有する。一実施形態では、本発明のＨＴＲＡ１耐性修飾ＴＳＰ１は、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣ末端部分を有する。一実施形態では、本発明のＨＴＲＡ１耐性修飾ＴＳＰ１フラグメントは、配列番号１０よりなるアミノ酸配列を有する。
【0099】
一実施形態では、ＨＴＲＡ１耐性修飾ＴＳＰ１またはそのフラグメントのアミノ酸配列は、配列番号１２と少なくとも７５％同一の配列を含む。一実施形態では、ＨＴＲＡ１耐性修飾ＴＳＰ１またはそのフラグメントのアミノ酸配列は、配列番号１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一の配列を含む。一実施形態では、ＨＴＲＡ１耐性修飾ＴＳＰ１またはそのフラグメントは、配列番号１２を含む、またはこれよりなるアミノ酸配列を有する。一実施形態では、本発明のＨＴＲＡ１耐性修飾ＴＳＰ１は、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣ末端部分を有する。一実施形態では、ＨＴＲＡ１耐性修飾ＴＳＰ１フラグメントは、配列番号１２よりなるアミノ酸配列を有する。
【0100】
一実施形態では、ＨＴＲＡ１耐性修飾ＴＳＰ１またはそのフラグメントは、ＨＴＲＡ１切断配列がＴＳＰ２のＨＴＲＡ１耐性配列に置き換わった修飾ＴＳＰ１タンパク質またはそのフラグメントである。
【0101】
一実施形態では、ＨＴＲＡ１耐性修飾ＴＳＰ１のアミノ酸配列は、配列番号１３と少なくとも７５％同一の配列を含む。一実施形態では、ＨＴＲＡ１耐性修飾ＴＳＰ１のアミノ酸配列は、配列番号１３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一の配列を含む。一実施形態では、そのＨＴＲＡ１耐性修飾ＴＳＰ１は、配列番号１３を含む、またはこれよりなるアミノ酸配列を有する。
【0102】
一実施形態では、本発明のＨＴＲＡ１耐性派生ＴＳＰ２は、（ｉ）ＴＳＰ２のアミノ酸配列と（ｉｉ）ＴＳＰ１尾部のアミノ酸配列とを含み、ＴＳＰ１尾部がＴＳＰ１の２番目のＶＶＭ配列を含む、キメラＴＳＰ２／ＴＳＰ１組換えタンパク質である。一実施形態では、２番目のＶＶＭ配列を含むＴＳＰ１尾部のアミノ酸配列は、キメラＴＳＰ２／ＴＳＰ１組換えタンパク質のＮ末端に位置する。
【0103】
一実施形態では、本発明のＨＴＲＡ１耐性派生ＴＳＰ２は、配列番号１４と少なくとも７５％同一の配列を含む。一実施形態では、本発明のＨＴＲＡ１耐性派生ＴＳＰ２は、配列番号１４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一の配列を含む。一実施形態では、本発明のＨＴＲＡ１耐性派生ＴＳＰ２は、配列番号１４を含む、またはこれよりなるアミノ酸配列を有する。
【0104】
本発明は、本明細書で上に記載したプロテアーゼＨＴＲＡ１に耐性を示す修飾ＴＳＰ１タンパク質またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列または核酸配列にも関する。
【0105】
一実施形態では、ポリヌクレオチドまたは核酸はＤＮＡである。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは一本鎖または二本鎖であり得る。
【0106】
本発明の別の目的は、本発明によるプロテアーゼＨＴＲＡ１に耐性を示す修飾ＴＳＰ１タンパク質またはそのフラグメントをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む、ベクターである。好ましい実施形態では、本発明のベクターは発現ベクターである。
【0107】
本発明のさらなる目的は、上述されるプロテアーゼＨＴＲＡ１に耐性を示す修飾ＴＳＰ１タンパク質もしくはそのフラグメントまたはポリヌクレオチドを含む、組成物である。
【0108】
一実施形態では、本発明の多量体ペプチドもしくはポリペプチドまたは本発明によるプロテアーゼＨＴＲＡ１に耐性を示す修飾ＴＳＰ１タンパク質もしくはそのフラグメントは、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の体内での安定性を高める、または細胞内への浸透能を高める修飾を有する。
【0109】
このような修飾としては、特に限定されないが、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、特に限定されないがＣＨ２－ＮＨ、ＣＨ２－Ｓ、ＣＨ２－Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ－ＮＨ、ＣＨ２－Ｏ、ＣＨ２－ＣＨ２、Ｓ＝Ｃ－ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨまたはＣＦ＝ＣＨを含むペプチド結合修飾、主鎖修飾および残基修飾が挙げられる。ペプチド模倣化合物を調製する方法は当該技術分野で周知であり、例えば、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃ．Ａ．Ｒａｍｓｄｅｎ Ｇｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １７．２，Ｆ．Ｃｈｏｐｌｉｎ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）に明記されている。
【0110】
一実施形態では、ペプチド内のペプチド結合（－ＣＯ－ＮＨ－）は、例えば、Ｎ－メチル化結合（－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＯ－）、エステル結合（－Ｃ（Ｒ）Ｈ－Ｃ－Ｏ－Ｏ－Ｃ（Ｒ）－Ｎ－）、ケトメチレン結合（－ＣＯ－ＣＨ２－）、ａ－アザ結合（－ＮＨ－Ｎ（Ｒ）－ＣＯ－）（Ｒは任意のアルキル、例えばメチル）、カルバ結合（－ＣＨ２－ＮＨ－）、ヒドロキシエチレン結合（－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－）、チオアミド結合（－ＣＳ－ＮＨ－）、オレフィン二重結合（－ＣＨ＝ＣＨ－）、逆アミド結合（－ＮＨ－ＣＯ－）、ペプチド誘導体（－Ｎ（Ｒ）－ＣＨ２－ＣＯ－）（Ｒは、炭素原子上に天然に存在する「通常の」側鎖である）により置換されていてよい。
【0111】
一実施形態では、これらの修飾は、ペプチド鎖に沿ったいずれかの結合に、場合によっては同時に複数（２つ～３つ）の結合に存在し得る。
【0112】
一実施形態では、合成の非天然の酸、例えばフェニルグリシン、ＴＩＣ、ナフチレラニン（ｎａｐｈｔｈｙｌｅｌａｎｉｎｅ）（Ｎｏｌ）、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体またはｏ－メチル－Ｔｙｒなどを天然の芳香族アミノ酸であるＴｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅに置き換えてもよい。
【0113】
一実施形態では、本発明のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質はさらに、直鎖状または環状であり得る。「環状」は、分子の少なくとも２つの離れた部分、すなわち非連続部分が互いに結合していることを意味する。例えば、分子のアミノ末端とカルボキシ末端が共有結合して環状分子を形成し得る。あるいは、分子が（例えば、リンカー内に）２つ以上のＣｙｓ残基を含み、ジスルフィド結合形成を介して環状化し得る。さらに、２つ以上のタンデムペプチド二量体が結合して二量体の二量体を形成し得ることが考えられる。したがって、例えば、Ｃｙｓ残基を含むタンデム二量体が、別のこのような二量体のＣｙｓと分子間ジスルフィド結合を形成し得る。
【0114】
一実施形態では、本発明のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は担体分子、例えば、直鎖状ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリリジン、デキストランなど）、分岐鎖ポリマー；脂質；コレステロール基（ステロイドなど）；または炭水化物もしくはオリゴ糖などと共有結合または非共有結合していてもよい。
【0115】
これ以外に考えられる担体としては、ポリオキシエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールなどの１つまたは複数の水溶性ポリマーの付加が挙げられる。当該技術分野で公知のまた別の有用なポリマーとしては、モノメトキシ－ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロースまたはその他の炭水化物系ポリマー、ポリ－（Ｎ－ビニルピロリドン）－ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）およびポリビニルアルコールならびにこれらのポリマーの混合物が挙げられる。
【0116】
好ましい実施形態では、担体はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。一実施形態では、ＰＥＧ基は、任意の好都合な分子量であり得、また直鎖状または分岐状であり得る。一実施形態では、ＰＥＧの平均分子量は、約２ｋＤａ～約１００ｋＤａ、より好ましくは約５ｋＤａ～約５０ｋＤａ、最も好ましくは約５ｋＤａ～約１０ｋＤａの範囲になる。
【0117】
一実施形態では、ＰＥＧ基は、アシル化、還元的アルキル化、マイケル付加、チオールアルキル化、またはＰＥＧ部分上の反応基（例えば、アルデヒド基、アミノ基、エステル基、チオール基、ｃｔ－ハロアセチル基、マレイミド基またはヒドラジノ基）を介する標的化合物上の反応基（例えば、アルデヒド基、アミノ基、エステル基、チオール基、ａ－ハロアセチル基、マレイミド基またはヒドラジノ基）への他の化学選択的コンジュゲーション／ライゲーション法を介して本発明の化合物に結合する。
【0118】
一実施形態では、タンパク質内のグリコシル化部位であることがわかっている部位に炭水化物（オリゴ糖）基を結合させる。一般に、配列Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒの一部である場合、セリン（Ｓｅｒ）またはトレオニン（Ｔｈｒ）残基にはＯ結合オリゴ糖を結合させ、アスパラギン（Ａｓｎ）残基にはＮ結合オリゴ糖を結合させ、この場合、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸であり得る。Ｘは、プロリンを除く１９種類の天然に存在するアミノ酸のうちの１つであるのが好ましい。Ｎ結合オリゴ糖およびＯ結合オリゴ糖ならびに各タイプにみられる糖残基の構造は異なっている。両者に共通してみられる糖のタイプの１つがＮ－アセチルノイラミン酸（シアル酸と呼ばれる）である。シアル酸は通常、Ｎ結合オリゴ糖およびＯ結合オリゴ糖の両方の末端残基であり、その負電荷によりグリコシル化化合物に酸性の特性を付与し得る。このような部位（１つまたは複数）が本発明の化合物のリンカーに組み込まれていてよく、ポリペプチド化合物が（例えば、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳなどの哺乳動物細胞内で）組換えにより産生される過程で細胞によりグリコシル化されるのが好ましい。しかし、このような部位を、当該技術分野で公知の合成法または半合成法によりさらにグリコシル化してもよい。
【0119】
一実施形態では、上記のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をさらに、１つまたは複数のＦｃポリペプチドに直接またはリンカー基を介して融合させてもよい。
【0120】
一実施形態では、上記化合物のＦｃ配列は、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ－１重鎖（Ｅｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：４０７１－４０７９（１９８２）を参照されたい）または当該技術分野で公知の他の任意のＦｃ配列（例えば、特に限定されないがＩｇＧ－２、ＩｇＧ－３およびＩｇＧ－４またはその他の免疫グロブリンを含む他のＩｇＧクラス）から選択され得る。
【0121】
抗体のＦｃ領域は、ジスルフィド結合または非共有結合によって結合し二量体型または多量体型になり得る単量体ポリペプチドのセグメントで構成されていることはよく知られている。天然のＦｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、関与する抗体のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡｌ、ＩｇＧＡ２）に応じて１～４つの範囲内にある。本明細書で使用される「Ｆｃ」という用語は、単量体型、二量体型および多量体型のＦｃ分子の総称である。Ｆｃ単量体は、適切なＣｙｓ残基が存在する場合、ジスルフィド結合形成を介する二量体化を防止する特定の条件が存在しない限り自発的に二量体化することに留意するべきである。
【0122】
一実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期が対照Ｆｃポリペプチドより長い任意のバリアントであり得る。Ｆｃポリペプチドのバリアントの例としては、特に限定されないが、わずかに酸性のｐＨで対照Ｆｃポリペプチドより高い親和性でＦｃＲｎと結合するＦｃポリペプチド、生理的ｐＨで対照Ｆｃポリペプチドと同等以下の親和性でＦｃＲｎと結合するＦｃポリペプチド、ループ５、８および／または１０の内部に、またはこれに隣接して３～２０個のアミノ酸の挿入を含むＦｃポリペプチドなどが挙げられる。
【0123】
一実施形態では、本発明のタンパク質は、１つまたは複数のＦｃ基とさらに融合した上記の多量体ペプチドを少なくとも１つ含む。好ましい実施形態では、本発明のタンパク質は、ペプチドリンカー、好ましくはＧｌｙリッチリンカーを介して連結された２つの４Ｎ１Ｋペプチドを含み１つまたは複数のＦｃ基とさらに融合した多量体ペプチドを少なくとも１つ含む。
【0124】
特定の実施形態では、本発明のタンパク質は、ペプチドリンカーを介して連結された２つの４Ｎ１Ｋペプチドを含み、その２つの４Ｎ１ＫペプチドがそれぞれＦｃポリペプチドとさらに融合されている、多量体ペプチドを２つ含む。
【0125】
本出願人は本明細書で、ＣＤ４７－／－マウスが、Ｔｓｐ１－／－マウスと同様に加齢、光およびレーザーにより誘導される網膜下単核食細胞蓄積を生じるが、ＣＤ３６－／－は生じないことを示す（実施例１を参照されたい）。野生型レシピエントの網膜下腔に養子移植したＴｓｐ１－／－ミクログリア細胞およびＣＤ４７－／－ミクログリア細胞は、野生型ミクログリア細胞と比較して除去に対する有意な抵抗を示し、組換えＴＳＰ１は、野生型ミクログリア細胞の除去を極めて有意に促進し、Ｔｓｐ１－／－ミクログリア細胞の表現型を正常に戻したが、ＣＤ４７－／－ミクログリア細胞には何ら効果を示さず、ＴＳＰ１とＣＤ４７の相互作用がミクログリア細胞除去を媒介することが確認された（実施例１を参照されたい）。本出願人は、ＨＴＲＡ１が単球マクロファージ分化の初期に盛んに発現することおよびＳＮＰ ｒｓ１１２００６３８がＨＴＲＡ１発現を有意に増大させることも示す（実施例２を参照されたい）。本出願人は、ＨＴＲＡ１がＴＳＰ１を５つの異なる部位でタンパク質分解し、そのうち２つの部位は、効率的なＣＤ４７活性化に必要な２つのバリン－バリン－メチオニン部位の間に位置することを示す（実施例３および４を参照されたい）。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、組換えＨＴＲＡ１が、ＲＰＥ細胞と共培養した単核食細胞の生存および活性化ペプチドによるＣＤ４７の活性化を有意に増大させ（実施例５を参照されたい）、２つのＣＤ４７結合部位を含む活性化ペプチドにより、それがさらに効率的になり（実施例６を参照されたい）、またはＴＳＰ－１によるＣＤ４７およびＭｅｇａ ＦａｓＬによるＦＡＳの同時活性化がこの効果を逆転させた（実施例５を参照されたい）。本出願人は、ｉｎ ｖｉｖｏで、易炎症性Ｃｘ３ｃｒ１欠損マウスにレーザーで網膜下炎症を誘導した後、組換えＴＳＰ－１またはＣＤ４７活性化ペプチドの硝子体内注射により網膜下単核単球の除去が効率的に促進されたことを示す（実施例６を参照されたい）。さらに、組換えＴＳＰ－１またはＣＤ４７活性化ペプチドは、無菌性腹膜炎モデルの炎症性マクロファージ除去を効率的に促進した（実施例６を参照されたい）。まとめると、本発明者らは、（ｉ）ＣＤ４７活性化および（ｉｉ）ＣＤ４７とＦＡＳの活性化の組合せにより、単核食細胞が効率的に除去されることを示す。
【0126】
したがって、本発明は、炎症の治療に使用するための作用物質であってＣＤ４７を活性化する作用物質に関する。一実施形態では、ＣＤ４７を活性化する作用物質は、炎症を治療するために使用される（または治療するのに使用するためのものである）。
【0127】
本発明の意味の範囲内では、「活性化する」という用語は、作用物質が標的タンパク質の生物活性を直接的または間接的に活性化することが可能であることを意味する。特定の実施形態では、ＣＤ４７を活性化する作用物質とは、ＣＤ４７を直接的または間接的に活性化させる際にＣＤ４７の生物活性を活性化することが可能な作用物質のことである。
【0128】
一実施形態では、本発明の作用物質はＣＤ４７を直接活性化する。ＣＤ４７を直接活性化する作用物質の例としては、特に限定されないが、ＣＤ４７のアゴニスト、活性化抗体、活性化ペプチド、活性化ポリペプチド、活性化タンパク質、ペプチボディなどが挙げられる。
【0129】
本明細書で使用される「ＣＤ４７のアゴニスト」という用語は、受容体ＣＤ４７と結合し、それを活性化してその生物活性を生じることが可能なタンパク質およびペプチドを意味する。
【0130】
一実施形態では、ＣＤ４７のアゴニストは、その天然のリガンドであるＴＳＰ－１、ＣＤ４７と結合し、ＣＤ４７活性化による下流の生物学的効果、すなわち細胞内の単核食細胞の除去を誘発するＴＳＰ１の能力を保持しているＴＳＰ１バリアント、ＴＳＰ１フラグメントまたはＴＳＰ１ペプチド模倣物である。
【0131】
一実施形態では、ＴＳＰ１のバリアント、フラグメントまたはペプチド模倣物は、本明細書で上に明記したプロテアーゼＨＴＲＡ１に耐性を示す修飾ＴＳＰ１タンパク質（ＨＴＲＡ１耐性修飾ＴＳＰ１）またはそのフラグメントである。
【0132】
別の実施形態では、ＴＳＰ１のバリアント、フラグメントまたはペプチド模倣物は、本明細書で上に明記した、ＣＤ４７と結合する能力を保持していると同時にプロテアーゼＨＴＲＡ１に耐性を示す派生ＴＳＰ２タンパク質（ＨＴＲＡ１耐性派生ＴＳＰ２）である。
【0133】
別の実施形態では、ＣＤ４７のアゴニストは、その天然のリガンドであるＳＩＲＰα、ＳＩＲＰαバリアント、ＳＩＲＰαフラグメントまたはＳＩＲＰαペプチド模倣物である。
【0134】
一実施形態では、ＣＤ４７のアゴニストは活性化抗体である。活性化抗体の例としては、特に限定されないが、抗体Ａｄ２２（Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９，１６２（１２）：７０３１－４０）、抗体１Ｆ７（Ｍａｎｎａら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００５，２８０：２９６３７－２９６４４）および抗体ＭＡＢＬ（Ｕｎｏら，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ．２００７，１７（５）：１１８９－１１９４）が挙げられる。
【0135】
別の実施形態では、ＣＤ４７のアゴニストは活性化ペプチドである。活性化ペプチドの例としては、特に限定されないが、４Ｎ１Ｋペプチド（配列番号１）；ＰＫＨＢ１ペプチド（式Ｉ）；およびＰＫＴ１６ペプチド（式ＩＩ）が挙げられる。
【0136】
一実施形態では、本発明の活性化ペプチドは、長さが５～１５アミノ酸、６～１４アミノ酸、７～１３アミノ酸、８～１２アミノ酸または９～１１アミノ酸である。別の実施形態では、本発明の活性化ペプチドは、長さが５～１４アミノ酸、５～１３アミノ酸、５～１２アミノ酸、５～１１アミノ酸または５～１０アミノ酸である。別の実施形態では、本発明の活性化ペプチドは、長さが６～１５アミノ酸、７～１５アミノ酸、８～１５アミノ酸、９～１５アミノ酸または１０～１５アミノ酸である。
【0137】
一実施形態では、本発明の活性化ペプチドは配列番号１のアミノ酸を含む。一実施形態では、本発明の活性化ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列および機能保存フラグメントから選択される少なくとも５個の連続するアミノ酸を含む。特定のＣＤ４７では、ＴＳＰ１活性化因子、ＨＴＲＡ１阻害剤およびＦａｓ活性化因子を含む群から選択される。
【0138】
別の実施形態では、実施形態の作用物質である本発明の活性化ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列および機能保存フラグメントから選択される少なくとも６個、７個、８個、９個または１０個の連続するアミノ酸を含む。好ましい実施形態では、本発明の活性化ペプチドは配列番号１のアミノ酸よりなる。
【0139】
一実施形態では、本発明の活性化ペプチドは、４Ｎ１Ｋ、ＰＫＨＢ１、ＰＫＴ１６およびその機能保存フラグメントを含む群から選択される。一実施形態では、本発明の活性化ペプチドは、ＰＫＨＢ１、ＰＫＴ１６またはその機能保存フラグメントである。一実施形態では、本発明の活性化ペプチドはＰＫＨＢ１またはその機能保存フラグメントである。別の実施形態では、本発明の活性化ペプチドはＰＫＴ１６またはその機能保存フラグメントである。
【0140】
一実施形態では、ＣＤ４７のアゴニストは、本明細書で上に明記した多量体ペプチドまたはポリペプチドである。一実施形態では、ＣＤ４７のアゴニストは、少なくとも１つの４Ｎ１Ｋペプチドを含む多量体ペプチドまたはポリペプチドである。一実施形態では、多量体ペプチドまたはポリペプチドは、好ましくは４Ｎ１Ｋペプチドの２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個または１２個の反復サブユニットを含む。特定の実施形態では、ＣＤ４７のアゴニストは、配列番号７のアミノ酸配列を含む、またはこれよりなる多量体ペプチドである。別の実施形態では、本発明の作用物質は、ＣＤ４７を間接的に活性化する。一実施形態では、本発明を間接的に活性化する本発明の作用物質は、ＨＴＲＡ１阻害剤である。ＨＴＲＡ１阻害剤の例としては、特に限定されないが、ＨＴＲＡ１に対する抗体、そのバリアントまたはフラグメント、ＨＴＲＡ１遺伝子および／またはＨＴＲＡ１遺伝子の転写産物に対するｓｉＲＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）が挙げられる。
【0141】
別の実施形態では、本発明の作用物質はＦａｓ活性化因子である。Ｆａｓ活性化因子の例としては、特に限定されないが、Ｆａｓと結合しＤＩＳＣの形成を活性化することが可能なタンパク質およびペプチドならびにＦａｓと結合し、対応する細胞のアポトーシスを誘発するＦａｓＬの能力を保持しているＦａｓＬのバリアント、フラグメントまたはペプチド模倣物が挙げられる。
【0142】
特定の実施形態では、本発明のＦａｓ活性化因子としては、好ましくはＦａｓＬリガンドまたはその任意の機能的フラグメントもしくは誘導体が挙げられる。一実施形態では、本発明に使用するＦａｓ活性化因子はＦａｓ受容体アゴニストである。
【0143】
特定の実施形態では、本発明のＦａｓ活性化因子としては、好ましくはＦａｓ受容体アゴニストであるＡＰＯ０１０（ＴｏｐｏＴａｒｇｅｔ社、コペンハーゲン、デンマーク）が挙げられ、ＡＰＯ０１０は、ヒトアディポネクチンの二量体形成コラーゲンドメインと融合した３つのヒトＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）細胞外ドメインからなり、潜在的にアポトーシス促進活性および抗悪性腫瘍活性を有する組換え可溶性六量体融合タンパク質である。Ｆａｓ受容体アゴニストであるＡＰＯ０１０は、感受性腫瘍細胞集団のＦａｓ受容体を活性化してカスパーゼ依存性アポトーシスを生じさせる（Ｖｅｒｂｒｕｇｇｅら，２００９）。特定の実施形態では、本発明のＦａｓ活性化因子としては、好ましくはＦａｓアゴニストであるＭｅｇａ ＦａｓＬ（ＡｄｉｐｏＧｅｎ社）が挙げられる。さらに、本発明のほかのＦａｓ活性化因子としては、好ましくは米国特許第６，００１，９６２号および米国特許第６，８４６，６３７号に開示されているＦａｓアゴニストペプチドが挙げられる。
【0144】
一実施形態では、本発明の作用物質は予防薬および／または治療薬である。特定の実施形態では、本発明の作用物質は治療薬である。
【0145】
本発明の意味の範囲内では、「炎症」は、Ｄｏｒｌａｎｄ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙで「組織の傷害または破壊により誘発され、その傷害を与える物質と受傷組織の両方を破壊、希薄化または隔離する局所的な保護応答」と定義されている通りの意味である。炎症は、毛細血管系の開窓、血液要素の間質腔内への漏出および炎症組織内への白血球の遊走を特徴とする。肉眼レベルでは、炎症は通常、紅斑、浮腫、痛覚過敏（圧痛）および疼痛といったよく知られた臨床徴候が伴う。
【0146】
一実施形態では、本発明による作用物質は炎症の治療に使用するためであり、前記炎症は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜色素変性、パーキンソン病、多発性硬化症、アルツハイマー病、肥満、アテローム性動脈硬化症、アレルギー、強直性脊椎炎、関節炎（変形性関節症、関節リウマチまたは乾癬性関節炎）、喘息、移植片対宿主病、腹膜炎、クローン病、大腸炎、皮膚炎、憩室炎、線維筋痛症、肝炎、過敏性腸症候群、全身性紅斑性狼瘡、腎炎および潰瘍性大腸炎を含む群から選択される。
【0147】
一実施形態では、本発明の炎症は急性炎症である。別の実施形態では、本発明の炎症は慢性炎症である。
【0148】
一実施形態では、本発明の炎症は治療抵抗性炎症である。一実施形態では、本発明の炎症は低悪性度慢性炎症である。一実施形態では、本発明の炎症は治療抵抗性低悪性度炎症である。
【0149】
一実施形態では、本発明の炎症は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）および加齢黄斑症（ＡＲＭ）などの加齢関連疾患；肥満およびアテローム性動脈硬化症などの代謝疾患；神経変性疾患ならびに癌を含む群から選択される治療抵抗性低悪性度炎症である。一実施形態では、本発明の治療抵抗性低悪性度炎症は加齢黄斑変性（ＡＭＤ）である。
【0150】
一実施形態では、本発明の予防薬および／または治療薬は、単核食細胞蓄積に関連する炎症の治療に使用するためのものである。
【0151】
単核食細胞（ＭＰ）は、ミクログリア細胞（ＭＣ）、単球（Ｍｏ）およびマクロファージ（Ｍφ）を含む細胞ファミリーを含む。単核食細胞蓄積に関連する炎症としては、特に限定されないが、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、加齢黄斑症（ＡＲＭ）または網膜色素変性などの網膜炎症；パーキンソン病、多発性硬化症またはアルツハイマー病などの神経変性疾患；肥満またはアテローム性動脈硬化症などの代謝障害；アレルギー；強直性脊椎炎；変形性関節症、関節リウマチまたは乾癬性関節炎などの関節炎；喘息、移植片対宿主病；腹膜炎、クローン病；大腸炎；皮膚炎；憩室炎；線維筋痛症；肝炎；過敏性腸症候群；全身性紅斑性狼瘡；腎炎；および潰瘍性大腸炎が挙げられる。一実施形態では、本発明による炎症は腹膜炎である。
【0152】
一実施形態では、本発明による炎症は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜色素変性または加齢黄斑症などの網膜炎症；パーキンソン病、多発性硬化症またはアルツハイマー病などの神経変性疾患；肥満またはアテローム性動脈硬化症などの代謝障害を含む群から選択される。
【0153】
一実施形態では、本発明による炎症は、ＡＭＤ、加齢黄斑症、網膜色素変性、アテローム性動脈硬化症およびパーキンソン病、多発性硬化症またはアルツハイマー病などの神経変性疾患を含む群から選択される加齢性疾患である。
【0154】
一実施形態では、本発明の炎症性疾患は癌でも腫瘍でもない。
【0155】
網膜は、再生能が極めて低いため免疫病原性の損傷を特に受けやすいが、特に、直接感染（強膜、眼瞼）のみならず、血液が媒介する細菌侵入（血液－組織バリア）からも保護されている。さらに、この組織は、炎症を介する傷害からそれを保護するのに寄与する「免疫特権」の部位である。免疫特権に関与する因子としては、ＤＣおよび抗原提示細胞がリンパ節まで遊走するためのリンパ排液系（例えば、眼球および脳）の欠如、エフェクター細胞が組織（角膜、網膜下腔）に浸潤するための血管の欠如ならびに免疫寛容を誘導する局所的に産生される因子が挙げられる。重要なのは、この特権が、免疫特権をもたない組織と比較して、活性化閾値を高く設定する網膜における緊張性の抑制性シグナル、および特に浸潤炎症細胞の効率的な除去（免疫抑制性の微小環境）によっても媒介されることである（Ｓｔｒｅｉｌｅｉｎら，Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓ．２００２，４２：４８７－４９５）。そのようにして、潜在的な抗原提示細胞およびエフェクター細胞（リンパ球、マクロファージ）を、それらが細胞傷害性を生じる前にそれを中和することができる。
【0156】
一実施形態では、本発明による炎症は非自己免疫性炎症である。自己免疫性炎症性疾患の例としては、特に限定されないが、腎臓、肝臓および肺の炎症、アテローム性動脈硬化症およびメタボリック症候群、ベーチェット病および子宮内膜症が挙げられる。
【0157】
一実施形態では、本発明による炎症は自己免疫性炎症である。自己免疫性炎症性疾患の例としては、特に限定されないが、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、セリアックスプルー病、強皮症、乾癬、炎症性腸疾患およびシェーグレン症候群が挙げられる。
【0158】
一実施形態では、本発明による炎症は眼の炎症である。本明細書で使用される眼の炎症疾患とは、眼または周辺組織の任意の部分に起こる炎症のことである。したがって、眼内または視神経、血管、筋肉もしくは眼周辺のその他の組織に炎症が発生し、その結果生じる疾患が眼の炎症疾患である。
【0159】
一実施形態では、眼の炎症は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜色素変性、加齢黄斑症（ＡＲＭ）、ブドウ膜炎、強膜炎、上強膜炎、視神経炎、角膜炎、眼窩偽腫瘍、網膜血管炎および慢性結膜炎を含む、またはこれよりなる群から選択される。
【0160】
一実施形態では、本発明による炎症は眼の炎症ではない。
【0161】
一実施形態では、本発明による炎症は網膜炎症である。
【0162】
本発明の意味の範囲内では、「網膜炎症」は、単核食細胞が媒介する網膜下腔の炎症を意味する。一実施形態では、本発明の網膜炎症は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、加齢黄斑症および網膜色素変性を含む。
【0163】
一実施形態では、本発明の作用物質は、加齢黄斑変性の治療に使用するためのものである。特定の実施形態では、加齢黄斑変性は萎縮型（またはドライ型）ＡＭＤおよび血管新生型（またはウェット型）ＡＭＤを含む。
【0164】
一実施形態では、本発明の予防薬および／または治療薬は、萎縮型ＡＭＤの治療に使用するためのものである。別の実施形態では、本発明の予防薬および／または治療薬は、血管新生型ＡＭＤの治療に使用するためのものである。
【0165】
一実施形態では、本発明によるＡＭＤは初期段階のものである。初期段階は、黄斑の内部および周辺に、色素沈着（色素上皮の異常）に関連して、ドルーゼンと呼ばれる細胞外沈着物が蓄積することを特徴とする。
【0166】
別の実施形態では、本発明によるＡＭＤは後期段階のものである。後期段階は、片側または両側の合併症を特徴とする。後期段階のＡＭＤは萎縮型ＡＭＤまたはウェット型ＡＭＤであり得る。特定の実施形態では、ＡＭＤは後期段階のドライ型ＡＭＤ（地図状ＡＭＤとも呼ばれる）である。
【0167】
一実施形態では、本発明の作用物質は、加齢黄斑症（ＡＲＭ）の治療に使用するためのものである。一実施形態では、ＡＲＭは初期ＡＲＭである。別の実施形態では、ＡＲＭは後期ＡＲＭである。
【0168】
一実施形態では、本発明の作用物質は、網膜色素変性の治療に使用するためのものである。
【0169】
一実施形態では、対象は炎症、好ましくは単核食細胞蓄積に関連する炎症に罹患している。特定の実施形態では、対象は網膜炎症に罹患している。好ましい実施形態では、対象は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、加齢黄斑症（ＡＲＭ）または網膜色素変性に罹患している。
【0170】
一実施形態では、対象は初期段階のＡＭＤに罹患している。別の実施形態では、対象は後期段階のＡＭＤに罹患している。一実施形態では、対象は脈絡膜血管新生型ＡＭＤ（「ウェット型」ＡＭＤ）に罹患している。別の実施形態では、対象は地図状萎縮型（「ドライ型」ＡＭＤ）に罹患している。
【0171】
一実施形態では、対象は初期段階のＡＲＭに罹患している。別の実施形態では、対象は後期段階のＡＲＭに罹患している。
【0172】
別の実施形態では、対象は炎症を発症しやすい、すなわち単核食細胞蓄積を生じやすい。特定の実施形態では、対象は網膜炎症を発症するリスクがある。好ましい実施形態では、対象は、ＡＭＤ、ＡＲＭまたは網膜色素変性を発症するリスクがある。
【0173】
ＡＭＤおよびＡＲＭを発症するリスクの例としては、特に限定されないが、遺伝、生活習慣、例えば喫煙、日光曝露または食事バランス不良など、年齢、血中コレステロール濃度過剰、高血圧などが挙げられる。
【0174】
一実施形態では、本発明の対象は高齢者である。本明細書で使用される「高齢者」という用語は、少なくとも５０歳、少なくとも５５歳、６０歳、６５歳、７０歳、７５歳、８０歳、８５歳または９０歳の対象を意味する。
【0175】
特定の実施形態では、対象は、ヒト染色体１０ｑ２６上のＨＴＲＡ１プロモーター内に位置するＳＮＰ ｒｓ１１２００６３８の存在によりＡＭＤを発症するリスクがある。日本人および白人の集団では、ＳＮＰ ｒｓ１１２００６３８は、滲出型加齢黄斑変性のリスクの１０倍増加に関連している。最もリスクの高い遺伝子型は（Ａ；Ａ）である。
【0176】
一実施形態では、対象は、炎症、好ましくはＡＭＤ、ＡＲＭまたは網膜色素変性に対する別の治療法による治療を未だ受けたことがない。別の実施形態では、対象は、炎症、好ましくはＡＭＤ、ＡＲＭまたは網膜色素変性に対する別の治療法による治療を既に受けたことがある。
【0177】
本発明は、本明細書で上に記載したＣＤ４７を活性化する作用物質を少なくとも１種含む組成物にも関する。一実施形態では、本発明の組成物は、炎症の治療に使用するためのＣＤ４７を活性化する作用物質を少なくとも１種含む。
【0178】
一実施形態では、組成物は、炎症を治療するために使用される（または治療するのに使用するためのものである）。
【0179】
一実施形態では、本発明の組成物は、ＣＤ４７を直接活性化する少なくとも１種の作用物質とＣＤ４７を間接的に活性化する少なくとも１種の作用物質とを含む。特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＣＤ４７を活性化する作用物質とＦａｓを活性化する作用物質とを含む。
【0180】
本発明の別の目的は、本明細書で上に記載した少なくとも１種の本発明の作用物質と、少なくとも１つの薬学的に許容される添加剤と、を含む医薬組成物である。
【0181】
これらの組成物に使用され得る薬学的に許容される添加剤としては、特に限定されないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えばプロタミン硫酸塩、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩など、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム）、ポリエチレングリコール、ポリアクリラート、ロウ、ポリエチレン－ポリオキシプロピレン－ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられる。
【0182】
本発明はさらに、本発明の作用物質、組成物または医薬組成物を少なくとも１種含む医薬に関する。
【0183】
一実施形態では、本発明の組成物、医薬組成物または医薬は、炎症、好ましくはＡＭＤを治療するために使用される（または治療に使用するためのものである）。
【0184】
好ましくは、本発明の組成物、医薬組成物または医薬は、治療有効量の本発明の作用物質を含む。
【0185】
一実施形態では、本発明の組成物、医薬組成物または医薬は、追加の予防薬および／または治療薬をさらに含む。一実施形態では、前記追加の予防薬および／または治療薬は、炎症、特にＡＭＤを治療するための別の作用物質である。
【0186】
本発明の化合物、本発明の組成物、医薬組成物および医薬の１日の総使用量は、妥当な医学的判断の範囲内で主治医により決定されることが理解されよう。任意の特定の患者に対する具体的な治療有効量レベルは、治療する障害および障害の重症度；用いる特定の化合物の活性；用いる特定の組成物、患者の年齢、体重、全般的健康状態、性別および食事；投与の時間、投与の経路および用いる特定の化合物の排泄速度；治療の実施期間；用いる特定の化合物と併用して、または同時に使用する薬物；ならびに医学分野で周知のこれらと同様の因子を含む様々な因子に依存する。例えば、所望の治療効果を得るのに必要なレベルより低いレベルの化合物の用量から開始し、所望の効果が得られるまで徐々に用量を増大させることは、当業者の技能範囲内に十分に含まれることである。しかし、製品の１日用量は、成人１人当たり１日約１０～約１００００ｍｇ、好ましくは１００～約５０００ｍｇ、より好ましくは成人１人当たり１日約２００～約２０００ｍｇの広範囲にわたって変化し得る。好ましくは、組成物は、治療する患者に対する用量を症状に合わせて調整するため、１０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２５０ｍｇ、５００ｍｇ、１０００ｍｇおよび２，０００ｍｇの有効成分を含有する。医薬は通常、約１０～約１００００ｍｇの有効成分、好ましくは５～約５０００ｍｇ、より好ましくは約１０～約２０００ｍｇの有効成分を含有する。有効量の薬物は通常、体重１ｋｇに対し１日当たり０．０１ｍｇ～約１００ｍｇ、好ましくは体重１ｋｇに対し１日当たり約０．０５ｍｇ～４０ｍｇ、より好ましくは体重１ｋｇに対し１日当たり約０．１ｍｇ～２０ｍｇ、より好ましくは体重１ｋｇに対し１日当たり約０．２ｍｇ～１ｍｇの投与量レベルで提供される。
【0187】
一実施形態では、治療有効量は、本発明の組成物、医薬組成物または医薬の約１０～約１００００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１００～約５０００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは、本発明の組成物、医薬組成物または医薬の約２００～約２０００ｍｇ／ｍｌの範囲内にある。
【0188】
一実施形態では、治療有効量は、本発明の組成物、医薬組成物または医薬の約１０～約１００００ｍｇ／ｇ、好ましくは１００～約５０００ｍｇ／ｇ、より好ましくは、本発明の組成物、医薬組成物または医薬の約２００～約２０００ｍｇ／ｇの範囲内にある。
【0189】
一実施形態では、治療有効量は、本発明の組成物、医薬組成物または医薬の約１０～約１００００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５～約５０００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約１０～約２０００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは、本発明の組成物、医薬組成物または医薬の約２０～約１０００ｍｇ／ｍｌの範囲内にある。
【0190】
一実施形態では、治療有効量は、本発明の組成物、医薬組成物または医薬の約１０～約１００００ｍｇ／ｇ、好ましくは５～約５０００ｍｇ／ｇ、より好ましくは約１０～約２０００ｍｇ／ｇ、より好ましくは、本発明の組成物、医薬組成物または医薬の約２０～約１０００ｍｇ／ｇの範囲内にある。
【0191】
本発明の一実施形態では、予防薬および／または治療薬は、ＣＤ４７活性化因子を約５ｍｇ／ｍＬ～約５００ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ～約１０ｍｇ／ｍＬの濃度で含む。
【0192】
本発明の一実施形態では、予防薬および／または治療薬は、ＣＤ４７活性化因子を約０．１μＭ～約１０００μＭ、好ましくは約１μＭ～約７５０μＭ、より好ましくは約５μｍ～約６００μＭ、さらにより好ましくは約１０μＭ～約５００μＭの濃度で含む。
【0193】
本発明の別の実施形態では、予防薬および／または治療薬は、ＣＤ４７活性化因子を約１μｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬの濃度で含む。
【0194】
本発明の別の実施形態では、予防薬および／または治療薬は、ＣＤ４７活性化因子をヒト眼内液１ｍＬ当たり約１～約１０μｇ、好ましくはヒト眼内液１ｍＬ当たり約５μｇの眼内濃度で含む。
【0195】
対象への投与に使用するためには、組成物を対象への投与用に製剤化する。本発明の組成物は、経口、非経口、局所、吸入スプレーにより、直腸に、鼻に、頬側に、膣に、または埋込みリザーバーを介して投与され得る。本明細書で使用される投与という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、眼内、関節内、滑液内、胸骨内、髄腔内、肝内、病巣内および頭蓋内への注射または注入技術を含む。
【0196】
一実施形態では、本発明の組成物、医薬組成物または医薬は、経口投与に適した形態である。
【0197】
経口投与に適した形態の例としては、特に限定されないが、錠剤、口腔内分散剤／口腔内分散錠剤、発泡錠、粉末剤、顆粒剤、丸剤（糖衣丸剤を含む）、糖衣錠剤、カプセル剤（軟ゼラチンカプセル剤を含む）、シロップ剤、液剤、ゲル剤またはその他の飲用液剤、懸濁剤、スラリー剤、リポソーム形態などが挙げられる。
【0198】
一実施形態では、本発明の組成物、医薬組成物または医薬は、経口投与に適した製剤用に１つまたは複数の薬学的に許容される担体を含む。
【0199】
一実施形態では、本発明の本発明の組成物、医薬組成物または医薬は、局所投与に適した形態である。
【0200】
局所投与に適した形態の例としては、特に限定されないが、液体、ペーストまたは固体の組成物、より具体的には水溶液剤、滴剤、点眼剤、点眼剤、分散液剤、スプレー剤、マイクロカプセル、マイクロ粒子、ナノ粒子、ポリマーパッチまたは放出制御パッチの形態のものが挙げられる。好ましい実施形態では、本発明の本発明の組成物、医薬組成物または医薬は点眼剤の形態である。
【0201】
一実施形態では、本発明の組成物、医薬組成物または医薬は、注射、例えば、眼内、筋肉内、皮下、真皮内、経皮または静脈内への注射または注入などに適した形態である。
【0202】
注射に適した形態の例としては、特に限定されないが、液剤、例えば、無菌水溶液剤、分散液剤、乳剤、懸濁剤、使用前に液体を加えて液剤または懸濁剤を調製するのに使用するのに適した固体形態、例えば粉末、リポソーム形態などが挙げられる。
【0203】
無菌注射用形態の本発明の組成物は、水性懸濁剤または油性懸濁剤であり得る。これらの懸濁剤は、当該技術分野で公知の技術により、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を用いて製剤化し得る。無菌注射用製剤は、非経口投与に許容される無毒性の希釈剤または溶媒を用いた無菌注射溶液または無菌注射懸濁液であってもよい。使用され得る許容される媒体および溶媒には、水、リンガー溶液および等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、従来の方法では、無菌不揮発性油を溶媒または懸濁媒として用いる。この目的のために、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激性不揮発性油を用いてもよい。注射剤の調製には、オレイン酸などの脂肪酸およびそのグリセリド誘導体が有用であり、天然の薬学的に許容される油、例えば特にポリオキシエチル化型のオリーブ油またはヒマシ油なども同じく有用である。これらの油性液剤または懸濁剤は、長鎖アルコール希釈剤または分散剤、例えばカルボキシメチルセルロースまたは乳剤および懸濁剤を含む薬学的に許容される剤形の製剤化によく用いられるこれと同様の分散剤なども含有し得る。製剤化の目的のために、その他のよく用いられる界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ、Ｓｐａｎおよびその他の乳化剤など、または薬学的に許容される固体、液体もしくはその他の剤形の製造によく用いられるバイオアベイラビリティエンハンサーも使用してもよい。
【0204】
特定の実施形態では、本発明の組成物、医薬組成物または医薬は、眼内投与、好ましくは眼内注射に適した形態である。
【0205】
本発明の意味の範囲内では、「眼内投与」は、作用物質を眼の内部に直接注射することを意味し、ここでは、眼の内部は眼球内に位置する任意の領域を意味し、一般には、特に限定されないが、眼球内にみられる任意の機能的（例えば、視覚に関するもの）もしくは構造組織または眼球の内部の一部分または全体の内側を覆う組織もしくは細胞層がこれに含まれる。このような領域の具体例としては、前眼房、後眼房、硝子体腔、脈絡膜、黄斑および網膜ならびに後眼部の領域または部位に血管を形成している、またはこれを神経支配している血管および神経が挙げられる。一実施形態では、眼の内部は、後眼房、硝子体腔、脈絡膜、黄斑および網膜ならびに後眼部の領域または部位に血管を形成している、またはこれを神経支配している血管および神経を含む後眼部を意味する。この実施形態では、眼内投与は後眼部内、好ましくは硝子体内への投与を指し、眼内投与は、好ましくは硝子体内注射である。
【0206】
一実施形態では、本発明の組成物、医薬組成物または医薬は、注射に適した製剤用に１つまたは複数の薬学的に許容される担体を含む。
【0207】
一実施形態では、本発明の組成物、医薬組成物または医薬を必要とする対象に少なくとも１日１回投与する。例えば、本発明の組成物、医薬組成物または医薬を１日１回、１日２回または１日３回投与してもよい。好ましい実施形態では、本発明の組成物、医薬組成物または医薬を必要とする対象に１日１回投与する。
【0208】
別の実施形態では、本発明の組成物、医薬組成物または医薬を必要とする対象に少なくとも週に１回投与する。例えば、本発明の組成物、医薬組成物または医薬を週１回、週２回、週３回、週回または最大週７回投与してもよい。
【0209】
別の実施形態では、本発明の組成物、医薬組成物または医薬を必要とする対象に月１回、月２回、２か月に１回、２か月もしくは３か月に１回、年２回または年１回投与する。
【0210】
本発明はさらに、それを必要とする対象において炎症を治療する方法であって、前記対象に治療有効量の本発明の作用物質を投与することを含む方法に関する。
【0211】
一実施形態では、本発明の方法は、単核食細胞蓄積に関連する炎症を治療するためのものである。好ましい実施形態では、本発明の方法は加齢黄斑変性を治療するためのものである。
【0212】
一実施形態では、本発明の組成物、医薬組成物または医薬を対象に投与する。
【0213】
本発明の別の目的は、それを必要とする対象においてＣＤ４７活性を阻害する方法であって、対象に有効量の本発明の作用物質を投与することを含む方法である。
【0214】
本発明の別の目的は、それを必要とする対象において単核食細胞蓄積を除去する方法であって、前記対象に上述の予防薬および／または治療薬を治療有効量投与することを含む方法である。
【0215】
本発明の別の目的は、それを必要とする対象において単核食細胞蓄積を除去し、それにより単核食細胞蓄積に関連する炎症を治療する方法であって、前記対象に上述の予防薬および／または治療薬を治療有効量投与することを含む方法である。
【0216】
本発明は、本発明による作用物質、医薬組成物または医薬を少なくとも１種含むキットにも関する。
【0217】
一実施形態では、本発明のキットは、必要とする対象に作用物質、医薬組成物または医薬を投与する手段をさらに含む。
【0218】
一実施形態では、本発明のキットは、前記対象に作用物質、医薬組成物または医薬を投与するための指示書をさらに含む。
【0219】
一実施形態では、本発明のキットは、第一のパーツが本発明によるＣＤ４７を活性化する作用物質を少なくとも１種含み、第二のパーツが本発明によるＣＤ４７を活性化する少なくとももう１種の作用物質を含む、パーツキットである。特定の実施形態では、本発明のキットは、第一のパーツが、本発明によるＣＤ４７を直接活性化する少なくとも１種の作用物質と本発明によるＣＤ４７を間接的に活性化する少なくとも１種の作用物質とを含むパーツキットである。好ましい実施形態では、本発明のキットは、第一のパーツが、本発明によるＣＤ４７を活性化する作用物質と本発明によるＦａｓを活性化する作用物質とを含むパーツキットである。
【0220】
別の実施形態では、本発明のキットは２つのパーツを含み、第一のパーツは、本発明による作用物質、医薬組成物または医薬を少なくとも１種含み、第二のパーツは、追加の予防薬および／または治療薬を含む。一実施形態では、前記追加の予防薬および／または治療薬は、炎症、特にＡＭＤを治療するための別の作用物質である。
【0221】
一実施形態では、本発明のパーツキットの構成要素を別個に、逐次的に、同時に、並行して、または経時的に交互に投与し得る。
【0222】
一実施形態では、本発明のキットは、炎症を治療するために使用される（または治療するのに使用するためのものである）。
【0223】
一実施形態では、追加の予防薬および／または治療薬を含むパーツキットのパーツは、少なくとも１種の本発明の作用物質、医薬組成物または医薬と同じ投与経路に適した形態である。別の実施形態では、追加の予防薬および／または治療薬を含むパーツキットのパーツは、少なくとも１種の本発明の作用物質、医薬組成物または医薬とは別の投与経路に適した形態である。
【図面の簡単な説明】
【0224】
【図1】ＴＳＰ１による、ＣＤ４７を介して媒介される単核食細胞除去を示す一連のヒストグラムである。（Ａ）２～３か月齢および１２か月齢のＣ５７ＢＬ６／Ｊ野生型マウス、Ｔｓｐ１－／－マウス、Ｃｄ４７－／－マウスおよびＣｄ３６－／－マウスの網膜下ＩＢＡ－１＋単核単球の定量化（１グループ当たりｎ＝６～９、一元配置ＡＮＯＶＡ／ボンフェローニ検定、２～３か月齢群の系統と比較して＊ｐ＜０．０００１）。（Ｂ）４５００ルクスの一定の緑色光に４日間曝露した後の２～３か月齢のＣ５７ＢＬ６／Ｊ野生型マウス、Ｔｓｐ１－／－マウス、Ｃｄ４７－／－マウスおよびＣｄ３６－／－マウスの網膜下ＩＢＡ－１＋単核単球の定量化（ｎ＝６～１２／グループ、Ａｎｏｖａ／ダネット、対照群と比較して＊ｐ＜０．０００１）。（Ｃ）表記の系統の３か月齢マウスのレーザー損傷から７日後にＣＤ１０２＋ＣＮＶまで０～５００μｍの距離でカウントしたＲＰＥ上の網膜下ＩＢＡ－１＋単核単球の定量化（ｎ＝９～２１／グループ、Ａｎｏｖａ／ダネット、対照群と比較して＊ｐ＜０，０００１）。（Ｄ）組換えＴＳＰ１を有する、または有さないＣ５７ＢＬ６／Ｊ野生型マウスに養子移植してから２４時間後の表記の系統のＣＦＳＥ＋ミクログリア細胞の定量化（１０μｇ／ｍｌ、ｎ＝８～１６／グループ；一元配置ＡＮＯＶＡ／ボンフェローニ検定、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ ＣＳＦＥ＋ミクログリア細胞と比較して＊ｐ＜０．０００１；ＴＳＰ１を有さない同じ系統のＣＳＦＥ＋ミクログリア細胞と比較して＄ｐ＜０．０００１）。
【図2】白血球のＳＮＰ ｒｓ１１２００６３８およびＨＴＲＡ１発現を示す一連のグラフである。（Ａ）Ｉｎ ｖｉｔｒｏで表記の時間培養後のＨｔｒａ１ ｍＲＮＡの定量的ＲＴ－ＰＣＲをヒト健常ドナー血液から単離した単球のＲｐｓ２６ ｍＲＮＡに対して正規化したもの（３つの調製物でほぼ同じ結果が得られた）。（Ｂ）ヒト健常ドナー血液のリンパ球、単球および培養２４時間後の単球のＲｐｓ２６ ｍＲＮＡに対して正規化したＨｔｒａ１ ｍＲＮＡの定量的ＲＴ－ＰＣＲ（３つの調製物でほぼ同じ結果が得られた）。（Ｃ）ｒｓ１１２００６３８がホモ接合型のウェット型ＡＭＤの患者ならびに年齢をマッチさせた遺伝子多型のない対照被験者の単球を２４時間培養後の、新鮮な血液に由来するリンパ球および単球のＲｐｓ２６ ｍＲＮＡに対して正規化したＨｔｒａ１ ｍＲＮＡの定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ｎを散布図で示す；マン・ホイットニー：新鮮なリンパ球＊ｐ＝０．００１２；新鮮なＰＢＭＣ＊ｐ＝０．０３５３；２４時間後のＰＢＭＣ＊ｐ＝０．０３１２）。ＰＢＭＣ：末梢血単球。
【図3】ＨＴＲＡ１が媒介するＴＳＰ１分解を示す図である。（Ａ）組換えＴＳＰ１、および組換えＨＴＲＡ１と３７℃で共インキュベートした組換えＴＳＰ１のクーマシー染色およびウエスタンブロット。（Ｂ）組換えＴＳＰ２、および組換えＨＴＲＡ１と３７℃で共インキュベートした組換えＴＳＰ２のクーマシー染色およびウエスタンブロット。（Ｃ）および（Ｄ）（ｎ＝９～３９／グループ；マン・ホイットニー＊ｐ＝０．００１３、ＰＢＳを注射したＴｓｐ１－／－マウス対ＴＳＰ１を注射したＴｓｐ１－／－マウス；＄ｐ＝０．００１４、ＴＳＰ１を注射したＴｓｐ１－／－マウス対ｒＨＴＲＡ１消化ｒＴＳＰ１を注射したＴｓｐ１－／－マウス）の硝子体内注射を実施した野生型マウスおよびＴｓｐ１－／－マウスの３か月齢マウスのレーザー損傷から７日後の（Ｃ）ＣＤ１０２＋ＣＮＶまで０～５００μｍの距離でカウントしたＲＰＥ上の網膜下ＩＢＡ－１＋単核単球数および（Ｄ）ＣＤ１０２＋ＣＮＶの面積の定量化。
【図4】網膜下免疫抑制のモデルである網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）と共培養した単球（Ｍｏ）の生存を示す一連のヒストグラムである：（ｉ）ＨＴＲＡ－１はＲＰＥ関連免疫抑制を妨害する。；（ｉｉ）ＣＤ４７アゴニストのＴＳＰ１およびＦＡＳアゴニストのＭｅｇａＦａｓＬで同時に処理することにより、ＨＴＲＡ１を除去した後に免疫抑制が回復する；（ｉｉｉ）ＣＤ４７アゴニストペプチドによりＨＴＲＡ－１の存在下でもＨＴＲＡ－１による免疫抑制妨害が回復する。（Ａ）ＨＴＲＡ－１の存在下および非存在下でのＭｏ単一培養（実線）およびＭｏ／ＲＰＥ共培養（点線）の様々な時点後のＣＦＳＥ＋Ｍｏ（右パネル）およびＯＴＸ－２陽性ＲＰＥ細胞（左パネル）の数。；（Ｂ）ＨＴＲＡ－１と２４時間共培養し、次いで対照と２４時間またはＴＳＰ－１およびＭｅｇａＦａｓＬと２４時間共培養した後のＣＦＳＥ＋Ｍｏの数（ｎ＝３；Ａｎｏｖａ／ダネット＊ｐ＝０．００１８）。；（Ｃ）２４時間にわたるＨＴＲＡ－１との共培養および対照ペプチド４ＮＧＧまたはＣＤ４７刺激ペプチドＰＫＴ１６による同時刺激の後のＣＦＳＥ＋Ｍｏの数（ｎ＝３；ＡＮＯＶＡダネット＊ｐ＝０，０２８６）。（Ｄ）４８時間にわたるＨＴＲＡ－１との共培養および表記の濃度の対照ペプチド４ＮＧＧまたはＣＤ４７刺激ペプチド４ＮＫ１もしくはＰＫＴ１６による同時刺激の後のＰＵ１＋Ｍｏの数（ｎ＝８；ペプチドを加えていない対照ＨＴＲＡ１と比較したＡＮＯＶＡダネット＊ｐ＜０，０００１）。（Ｅ）４８時間にわたるＨＴＲＡ－１との共培養および表記の濃度の対照ペプチド４ＮＧＧまたはＣＤ４７刺激ペプチド４ＮＫ１もしくは４Ｎ１Ｋ－ＧＧＧＧＧＧＧＧ－４Ｎ１Ｋ二ペプチドによる同時刺激の後のＰＵ１＋Ｍｏの数（ｎ＝８；ペプチドを加えていない対照ＨＴＲＡ１と比較したＡＮＯＶＡダネット＊ｐ＜０，０００１）。
【図5】レーザー損傷Ｃｘ３ｃｒ１ＧＦＰ／ＧＦＰマウスでの網膜下単核食細胞の除去を示す一連のヒストグラムである。第４日および第７日にＰＢＳ、組換えヒトＴＳＰ－１（１０μｇ／ｍｌ）、４ＮＧＧ対照ペプチドまたはＰＫＨＢ１ ＣＤ４７活性化ペプチド（２００μＭ）を２μｌ注射した２か月齢Ｃｘ３ｃｒ１ＧＦＰ／ＧＦＰマウスのレーザー損傷１０日後にＣＤ１０２＋ＣＮＶから０～５００μｍの距離でカウントしたＲＰＥ上の網膜下ＩＢＡ－１＋ＭＰの定量化（ｎ＝２０～２５回の照射、マン・ホイットニー＊ｐ＜０，０００１）。
【図6】ＷＴ Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ（上右）およびＣｄ４７－／－マウス（下右）にチオグリコラートを注射してから１日後に新たに回収したＭｏ由来Ｍφ上の近接ライゲーションアッセイで検出されたＣＤ１１ｂ－ＣＤ４７複合体（矢印で示した白い点）の共焦点顕微鏡像を示す一連の写真である。陰性対照は腹膜炎を誘導していないＷＴ Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウス（左）に対応する。核染色にはヘキストを用いた（灰色；陰性：一次抗体は省いた；実験を３回反復し、類似の結果が得られた）。ｎｅｇＣＴＬ＝陰性対照、スケールバー＝１０μｍ。
【図7】第１日にＷＴ Ｃ５７ＢＬ６／ＪマウスにＰＢＳもしくはｒＴＳＰ－１（マン・ホイットニー＄ｐ＝０．００４８）；または対照ペプチド４ＮＧＧもしくはＣＤ４７活性化ペプチドＰＫＨＢ１（マン・ホイットニー＄ｐ＝０．００８７）を注射した後の第２日の同マウスの滲出液中のＣＤ１１５＋Ｆ４／８０＋ＩＣＡＭ－２ｌｏＭｏ由来Ｍφの定量化を示す一連のヒストグラムである。
【実施例0225】
以下の実施例を参照することにより本発明がさらに理解されるであろう。これらの実施例は本発明の具体的な実施形態のうち代表的なものを意図するものであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【0226】
材料および方法
ウエスタンブロット、逆転写およびリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応ならびにＥＬＩＳＡ
既に記載されている（Ｈｏｕｓｓｉｅｒら，ＰＬｏＳ Ｍｅｄ．２００８，５：ｅ３９）通りに、モノクローナル抗ＴＳＰ１抗体（Ａｂｃａｍ社）を用いてＷＢ解析を実施した。ＲＴ－ＰＣＲプライマーをＴａｑｍａｎ、照会：Ｈｓ０１０１６１５１＿ｍ１から注文した。
ウエスタンブロット、逆転写およびリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応ならびにＥＬＩＳＡ
既に記載されている（Ｈｏｕｓｓｉｅｒら，ＰＬｏＳ Ｍｅｄ．２００８，５：ｅ３９）通りに、モノクローナル抗ＴＳＰ１抗体（Ａｂｃａｍ社）を用いてＷＢ解析を実施した。ＲＴ－ＰＣＲプライマーをＴａｑｍａｎ、照会：Ｈｓ０１０１６１５１＿ｍ１から注文した。
【0227】
ミクログリア細胞調製物
ＰＢＳ灌流マウスからミクログリア細胞を調製した。Ｎｅｕｒａｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｐａｐａｉｎ（ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて脳または網膜を分離した後、７０μｍでろ過した細胞懸濁物を洗浄し、７５％等張Ｐｅｒｃｏｌｌ（Ｐｅｒｃｏｌｌ Ｐｌｕｓ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に再懸濁させ、２５％ＰｅｒｃｏｌｌおよびＰＢＳを重層した。細胞を４℃、１０００ｇで３０分間遠心分離した。７５％と２５％の境界面にあるリングを収集し、ＰＢＳで洗浄し、遠心分離した。
ＰＢＳ灌流マウスからミクログリア細胞を調製した。Ｎｅｕｒａｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｐａｐａｉｎ（ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて脳または網膜を分離した後、７０μｍでろ過した細胞懸濁物を洗浄し、７５％等張Ｐｅｒｃｏｌｌ（Ｐｅｒｃｏｌｌ Ｐｌｕｓ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に再懸濁させ、２５％ＰｅｒｃｏｌｌおよびＰＢＳを重層した。細胞を４℃、１０００ｇで３０分間遠心分離した。７５％と２５％の境界面にあるリングを収集し、ＰＢＳで洗浄し、遠心分離した。
【0228】
ＲＰＥ－Ｍｏ共培養
単球
ヘルシンキ宣言に従い、国立キャンズ・ヴァン病院眼科センター（パリ、フランス）倫理委員会による承認（第９１３５７２号）を受けたヒト単球発現に関する試験の書面および説明による同意を志願者から得た。健常被験者のヘパリン処置静脈血からＦｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ層（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）での１段階の遠心分離によりＰＢＭＣを単離し、ＣＤ１６ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いずにＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌで選別した。マウス腹膜マクロファージ、骨髄由来単球および光受容細胞外節（ＰＯＳ）の単離（いずれも無血清Ｘ－Ｖｉｖｏ １５培地中）を、既に記載されている（Ｓｅｎｎｌａｕｂら，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１３，５：１７７５－１７９３）通りに実施した。共培養実験に関して、単核単球を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））を用いて染色した後３回洗浄するか、またはＰＵ１免疫組織化学でＲＰＥにＭＰ特異的転写因子が発現していないことにより同定した。
単球
ヘルシンキ宣言に従い、国立キャンズ・ヴァン病院眼科センター（パリ、フランス）倫理委員会による承認（第９１３５７２号）を受けたヒト単球発現に関する試験の書面および説明による同意を志願者から得た。健常被験者のヘパリン処置静脈血からＦｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ層（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）での１段階の遠心分離によりＰＢＭＣを単離し、ＣＤ１６ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いずにＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌで選別した。マウス腹膜マクロファージ、骨髄由来単球および光受容細胞外節（ＰＯＳ）の単離（いずれも無血清Ｘ－Ｖｉｖｏ １５培地中）を、既に記載されている（Ｓｅｎｎｌａｕｂら，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１３，５：１７７５－１７９３）通りに実施した。共培養実験に関して、単核単球を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））を用いて染色した後３回洗浄するか、またはＰＵ１免疫組織化学でＲＰＥにＭＰ特異的転写因子が発現していないことにより同定した。
【0229】
初代ＲＰＥ培養
食肉処理場から眼球摘出後２～３時間の新鮮なブタ眼球を入手した。眼球から周辺組織を取り除き、消毒液（Ｐｕｒｓｅｐｔ（登録商標））に短時間浸漬した。前眼部の水晶体、硝子体および硝子体を除去した。後眼部をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で２回洗浄し、次いで０．２５％トリプシンの存在下、３７℃でインキュベートしてＲＰＥ細胞を剥離させた。１時間のインキュベーション後、トリプシン溶液を除去し、非動化した２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、抗生物質（１％ペニシリン／ストレプトマイシン）の存在下で細胞を回復させた。細胞を数回洗浄し、次いで培養皿中、３７℃でインキュベートした。培養３日後、この細胞を０．２５％トリプシンと再びインキュベートし、洗浄し、４８ウェル培養プレート（Ｇｒｅｎｉｅｒ（登録商標））に１５０，０００細胞／培養ウェルの密度（３００，０００細胞／Ｌまたは５００μＬ／ウェル）で播種した。３７℃で４日間インキュベートした後、細胞がコンフルエンスに達し、最適な細胞特性（色素沈着が十分な扁平細胞）が得られた。この初代細胞培養物の加齢を避けるため、全ての実験を培養プレートに播種後第５日～第７日の間に実施した。
食肉処理場から眼球摘出後２～３時間の新鮮なブタ眼球を入手した。眼球から周辺組織を取り除き、消毒液（Ｐｕｒｓｅｐｔ（登録商標））に短時間浸漬した。前眼部の水晶体、硝子体および硝子体を除去した。後眼部をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で２回洗浄し、次いで０．２５％トリプシンの存在下、３７℃でインキュベートしてＲＰＥ細胞を剥離させた。１時間のインキュベーション後、トリプシン溶液を除去し、非動化した２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、抗生物質（１％ペニシリン／ストレプトマイシン）の存在下で細胞を回復させた。細胞を数回洗浄し、次いで培養皿中、３７℃でインキュベートした。培養３日後、この細胞を０．２５％トリプシンと再びインキュベートし、洗浄し、４８ウェル培養プレート（Ｇｒｅｎｉｅｒ（登録商標））に１５０，０００細胞／培養ウェルの密度（３００，０００細胞／Ｌまたは５００μＬ／ウェル）で播種した。３７℃で４日間インキュベートした後、細胞がコンフルエンスに達し、最適な細胞特性（色素沈着が十分な扁平細胞）が得られた。この初代細胞培養物の加齢を避けるため、全ての実験を培養プレートに播種後第５日～第７日の間に実施した。
【0230】
モノンサイト（ｍｏｎｏｎｃｙｔｅｓ）ＲＰＥ共培養
ＦＣＳを含まないＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシンのみ）で共培養する前日、ＲＰＥ細胞の培地を交換した。単球を４８ウェルプレートにＲＰＥ細胞の存在下または非存在下、２００，０００細胞／培養ウェルの濃度で播いた。
ＦＣＳを含まないＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシンのみ）で共培養する前日、ＲＰＥ細胞の培地を交換した。単球を４８ウェルプレートにＲＰＥ細胞の存在下または非存在下、２００，０００細胞／培養ウェルの濃度で播いた。
【0231】
共培養ウェルの一部を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のリポ多糖（ＬＰＳ）１ｎｇ／ｍｌまたは組換えＨＴＲＡ１（Ｒ＆Ｄ社、５μｇ／ｍｌ）と接触させて、全身の炎症性の活性化（ＬＰＳ）またはＡＭＤと同じ微小環境（ＨＴＲＡ１の増大）を模倣した（上を参照されたい）。３７℃で２４時間インキュベートした後、細胞を４％パラホルムアルデヒド（ＰＡＦ）で４℃にて３０分間固定した。
【0232】
免疫組織化学
ＰＢＳ－０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－クエン酸０．１％の溶液で４％ＰＡＦを洗浄した後、ＲＰＥ細胞を透過処理した。非特異的免疫原部位をＰＢＳ－０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－５％ウマ血清でブロックした。１時間後、ブロッキング溶液を除去し、細胞をＰＢＳ ｔｒｉｔｏｎ０．１％および１％ウマ血清で希釈した一次抗体（ポリクローナルウサギ抗ヒトＰＵ．１、１／２００、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社；ポリクローナルヤギ抗ヒトＯＴＸ２、１／５００、Ｒ＆Ｄ社）の存在下に置き、４℃で１２時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、蛍光色素と結合させＰＢＳ－０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－１％ウマ血清で希釈した二次抗体をＤＡＰＩ（核染色）とともに加え、周囲温度で１時間放置した後、ＰＢＳで数回洗浄した。
ＰＢＳ－０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－クエン酸０．１％の溶液で４％ＰＡＦを洗浄した後、ＲＰＥ細胞を透過処理した。非特異的免疫原部位をＰＢＳ－０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－５％ウマ血清でブロックした。１時間後、ブロッキング溶液を除去し、細胞をＰＢＳ ｔｒｉｔｏｎ０．１％および１％ウマ血清で希釈した一次抗体（ポリクローナルウサギ抗ヒトＰＵ．１、１／２００、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社；ポリクローナルヤギ抗ヒトＯＴＸ２、１／５００、Ｒ＆Ｄ社）の存在下に置き、４℃で１２時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、蛍光色素と結合させＰＢＳ－０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－１％ウマ血清で希釈した二次抗体をＤＡＰＩ（核染色）とともに加え、周囲温度で１時間放置した後、ＰＢＳで数回洗浄した。
【0233】
反転蛍光顕微鏡（Ａｒｒａｙｓｃａｎ（登録商標））による読取りおよび自動定量化
１ウェル当たり２５視野をＡｒｒａｙｓｃａｎ（登録商標）により解析し、次いで、各培養条件の細胞数をコンピュータプロトコルにより直接カウントした。核はいずれもＤＡＰＩで標識され、単球が緑色の４８８ｎｍ（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥ）で、または／およびＲＰＥ細胞が遠赤色の６４７ｎｍ（抗ＯＴＸ２一次抗体による認識）で示された。複数のプレートの定量化をプールしたグラフについては（図４Ｄおよび４Ｅ）、結果をＨＴＲＡ１処理条件に対して正規化したＰＵ．１またはＯＴＸ２陽性細胞の数の百分率で表した。
１ウェル当たり２５視野をＡｒｒａｙｓｃａｎ（登録商標）により解析し、次いで、各培養条件の細胞数をコンピュータプロトコルにより直接カウントした。核はいずれもＤＡＰＩで標識され、単球が緑色の４８８ｎｍ（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥ）で、または／およびＲＰＥ細胞が遠赤色の６４７ｎｍ（抗ＯＴＸ２一次抗体による認識）で示された。複数のプレートの定量化をプールしたグラフについては（図４Ｄおよび４Ｅ）、結果をＨＴＲＡ１処理条件に対して正規化したＰＵ．１またはＯＴＸ２陽性細胞の数の百分率で表した。
【0234】
消化ＴＳＰ１＋液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）＋スペクトル解析
トリプシン消化
５０ｍＭ炭酸水素アンモニウムに溶かした５ｍＭジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｒｅｉｔｏｌ）（ＡｍＢｉｃ）と３７℃で３０分間インキュベートすることによりタンパク質を還元し、次いで、５０ｍＭ ＡｍＢｉｃに溶かした１５ｍＭヨードアセトアミドと室温で３０分間インキュベートすることによりアルキル化した。トリプシン消化を５０ｍＭ ＡｍＢｉｃ中、３７℃、タンパク質／酵素比２５／１で一晩実施した。
トリプシン消化
５０ｍＭ炭酸水素アンモニウムに溶かした５ｍＭジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｒｅｉｔｏｌ）（ＡｍＢｉｃ）と３７℃で３０分間インキュベートすることによりタンパク質を還元し、次いで、５０ｍＭ ＡｍＢｉｃに溶かした１５ｍＭヨードアセトアミドと室温で３０分間インキュベートすることによりアルキル化した。トリプシン消化を５０ｍＭ ＡｍＢｉｃ中、３７℃、タンパク質／酵素比２５／１で一晩実施した。
【0235】
マススペクトロメトリー解析
ペプチド混合物に最終濃度が０．１％となるようにギ酸を添加し、ＨＣＴｕｌｔｒａイントラップ（Ｂｒｕｋｅｒ社）と連動したＵ３０００ ｎａｎｏＬＣ（Ｔｈｅｒｍｏ社）で解析した。ペプチドを、プレカラムＲＰ－Ｃ１８（５ｍｍ、３００μｍ ｉ．ｄ．、１００Å、Ｔｈｅｒｍｏ社）で移動相Ａ（２％ＡＣＮ／０．１％ギ酸）を用いて流速２０μＬ／分で５分間、濃縮および脱塩し、次いで、分析カラムＲＰ－Ｃ１８（１５ｃｍ、７５μｍ ｉ．ｄ．、１００Å、Ｄｉｏｎｅｘ社）で流速３００ｎＬ／分にて分離した。溶離勾配として、２％～１０％の溶媒Ｂ（９５％ＡＣＮ／０．１％ギ酸）を１０分間、次いで１０％～３５％のＢを６０分間、３５％～５０％のＢを１０分間流した。イオントラップを、衝突誘起解離（ＣＩＤ）による断片化のために各ＭＳスペクトルから８つの前駆体イオンを選択してポジティブモードで使用した。キャピラリー電圧を２ｋＶに設定し、フルスキャンスペクトルを取得し、１００～２８００ｍ／ｚのＭＳＭＳスペクトルを一価イオン排除、ダイナミックエクスクルージョン３０秒間および単離幅４Ｄａで取得した。ＩＣＣスマートターゲットを２５００００に設定し、ターゲット質量を６２２ｍ／ｚに設定した。
ペプチド混合物に最終濃度が０．１％となるようにギ酸を添加し、ＨＣＴｕｌｔｒａイントラップ（Ｂｒｕｋｅｒ社）と連動したＵ３０００ ｎａｎｏＬＣ（Ｔｈｅｒｍｏ社）で解析した。ペプチドを、プレカラムＲＰ－Ｃ１８（５ｍｍ、３００μｍ ｉ．ｄ．、１００Å、Ｔｈｅｒｍｏ社）で移動相Ａ（２％ＡＣＮ／０．１％ギ酸）を用いて流速２０μＬ／分で５分間、濃縮および脱塩し、次いで、分析カラムＲＰ－Ｃ１８（１５ｃｍ、７５μｍ ｉ．ｄ．、１００Å、Ｄｉｏｎｅｘ社）で流速３００ｎＬ／分にて分離した。溶離勾配として、２％～１０％の溶媒Ｂ（９５％ＡＣＮ／０．１％ギ酸）を１０分間、次いで１０％～３５％のＢを６０分間、３５％～５０％のＢを１０分間流した。イオントラップを、衝突誘起解離（ＣＩＤ）による断片化のために各ＭＳスペクトルから８つの前駆体イオンを選択してポジティブモードで使用した。キャピラリー電圧を２ｋＶに設定し、フルスキャンスペクトルを取得し、１００～２８００ｍ／ｚのＭＳＭＳスペクトルを一価イオン排除、ダイナミックエクスクルージョン３０秒間および単離幅４Ｄａで取得した。ＩＣＣスマートターゲットを２５００００に設定し、ターゲット質量を６２２ｍ／ｚに設定した。
【0236】
トリプシンペプチドはまた、ポジティブリフレクトロンモードのＡｕｔｏｆｌｅｘスピード（Ｂｒｕｋｅｒ社）でα－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸をマトリックス（８５％ＣＡＮ、０．１％ＴＦＡ、１０ｍＭリン酸アンモニウム中０．９ｍｇ／ｍＬのＣＨＣＡ）として使用し、質量範囲７００～４０００ｍ／ｚでＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳによっても解析した。
【0237】
タンパク質同定
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳデータの解析には、Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ３．４（Ｂｒｕｋｅｒ社）を用いて生データを処理した。シグナル強度閾値１０００００（ＡＵ）およびスペクトルデコンボリューションを用いて、最大５０００の化合物についてＭｇｆファイルを作成した。ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース（０１／０４／２０１５）、Ｈｏｍｏｓ ｓａｐｉｅｎｓ ｔａｘｏｎｏｍｙ（登録数２０２０３）にＭａｓｃｏｔを用いてＰｒｏｔｅｉｎＳｃａｐｅ ２．１（Ｂｒｕｋｅｒ社）でタンパク質同定を実施した。トリプシンを、切れ残り２の酵素として選択した。Ｃｙｓのカルバミドメチル化を固定修飾、Ｍｅｔの酸化を可変修飾としてそれぞれ設定し；ＭＳ許容誤差およびＭＳ／ＭＳ許容誤差を０．５Ｄａに設定した。ペプチドのバリデーションにはｐ値＜０．０５であることが必要であった。さらに、酵素としてセミトリプシンを使用し、同じパラメータを用いて解析を実施した。
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳデータの解析には、Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ３．４（Ｂｒｕｋｅｒ社）を用いて生データを処理した。シグナル強度閾値１０００００（ＡＵ）およびスペクトルデコンボリューションを用いて、最大５０００の化合物についてＭｇｆファイルを作成した。ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース（０１／０４／２０１５）、Ｈｏｍｏｓ ｓａｐｉｅｎｓ ｔａｘｏｎｏｍｙ（登録数２０２０３）にＭａｓｃｏｔを用いてＰｒｏｔｅｉｎＳｃａｐｅ ２．１（Ｂｒｕｋｅｒ社）でタンパク質同定を実施した。トリプシンを、切れ残り２の酵素として選択した。Ｃｙｓのカルバミドメチル化を固定修飾、Ｍｅｔの酸化を可変修飾としてそれぞれ設定し；ＭＳ許容誤差およびＭＳ／ＭＳ許容誤差を０．５Ｄａに設定した。ペプチドのバリデーションにはｐ値＜０．０５であることが必要であった。さらに、酵素としてセミトリプシンを使用し、同じパラメータを用いて解析を実施した。
【0238】
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦデータについてはＢｉｏＴｏｏｌｓ ３．２（Ｂｒｕｋｅｒ社）およびＭａｓｃｏｔを用いてＰＭＦ解析を実行し、パラメータには以下のもの：ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース（０１／０４／１５）、Ｈｏｍｏｓ ｓａｐｉｅｎｓ ｔａｘｏｎｏｍｙ（登録数２０２０３）；酵素としてトリプシンまたはセミトリプシン；切れ残り１；固定修飾としてＣｙｓのカルバミドメチル化、可変修飾としてＭｅｔの酸化；ＭＳ許容誤差６０ｐｐｍを用い、タンパク質のバリデーションにはｐ値＜０．０５であることが必要であった。
【0239】
動物
Ｔｓｐ１－／－マウス、ＣＤ４７－／－マウス、ＣＤ３６－／－－マウスおよびＣｘ３ｃｒ１ＧＦＰ／ＧＦＰマウスは購入したものである（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）。マウスは全て、Ｃｒｂ１ｒｄ８、Ｐｄｅ６ｂｒｄ１およびＧｎａｔ２ｃｐｆｌ３変異が陰性（Ｔｓｐ１－／－）であったが、または陰性となるように戻し交配した。マウスを動物施設内で特定の病原微生物が存在しない条件下、１２／１２時間の明／暗（１００～５００ルクス）周期で飼育し、水および通常の飼料を自由摂取させた。実験のプロトコルおよび手順はいずれも、地元の動物管理倫理委員会「Ｃｏｍｉｔｅ ｄ’ｅｔｈｉｑｕｅ ｅｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｉｍａｌｅ Ｃｈａｒｌｅｓ Ｄａｒｗｉｎ」による承認（第Ｃｅ５／２０１０／０１１号、第Ｃｅ５／２０１０／０４４号、第Ｃｅ５／２０１１／０３３号）を受けた。
Ｔｓｐ１－／－マウス、ＣＤ４７－／－マウス、ＣＤ３６－／－－マウスおよびＣｘ３ｃｒ１ＧＦＰ／ＧＦＰマウスは購入したものである（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）。マウスは全て、Ｃｒｂ１ｒｄ８、Ｐｄｅ６ｂｒｄ１およびＧｎａｔ２ｃｐｆｌ３変異が陰性（Ｔｓｐ１－／－）であったが、または陰性となるように戻し交配した。マウスを動物施設内で特定の病原微生物が存在しない条件下、１２／１２時間の明／暗（１００～５００ルクス）周期で飼育し、水および通常の飼料を自由摂取させた。実験のプロトコルおよび手順はいずれも、地元の動物管理倫理委員会「Ｃｏｍｉｔｅ ｄ’ｅｔｈｉｑｕｅ ｅｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｉｍａｌｅ Ｃｈａｒｌｅｓ Ｄａｒｗｉｎ」による承認（第Ｃｅ５／２０１０／０１１号、第Ｃｅ５／２０１０／０４４号、第Ｃｅ５／２０１１／０３３号）を受けた。
【0240】
ＰＫＴ１６の合成
固相／液相混合法を用いてＰＫＴ１６を合成した。簡潔に述べれば、２－クロロトリチルクロリド樹脂を予め完全無水ＣＨ２Ｃｌ２中で２時間膨張させた。Ｆｍｏｃ－Ａａ－ＯＨ（０．３２ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ）中、ジイソプロピエチルアミン（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）（ＤＩＰＥＡ、４ｅｑ．）の存在下で２－ＣＴＣ樹脂（４００ｍｇ、充填量＝１．６ｍｍｏｌ／ｇ）とカップリングさせた。ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＤＩＰＥＡ（７：２：１）の混合物、次いでＭｅＯＨで洗浄することにより、樹脂上の未反応部位をキャップした。Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０％のピペリジンを用いてＦｍｏｃ基を除去した後、Ｆｍｏｃ脱保護のために２０％ピペリジン／ＤＭＦ、活性化のために２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート／１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ）、塩基としてＤＩＰＥＡおよび溶媒としてＮ－メチル－２－ピロリジノン（ＮＭＰ）を用い、標準的なＦｍｏｃ保護アミノ酸（Ｂａｃｈｅｍ社、スイス）により鎖伸長を実施した。直鎖状ペプチド鎖の組立てが完了したとき、樹脂を収縮させるため、最終洗浄段階としてさらにＭｅＯＨ洗浄を実施した（１×１分、１×１５分）。
固相／液相混合法を用いてＰＫＴ１６を合成した。簡潔に述べれば、２－クロロトリチルクロリド樹脂を予め完全無水ＣＨ２Ｃｌ２中で２時間膨張させた。Ｆｍｏｃ－Ａａ－ＯＨ（０．３２ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ）中、ジイソプロピエチルアミン（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）（ＤＩＰＥＡ、４ｅｑ．）の存在下で２－ＣＴＣ樹脂（４００ｍｇ、充填量＝１．６ｍｍｏｌ／ｇ）とカップリングさせた。ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＤＩＰＥＡ（７：２：１）の混合物、次いでＭｅＯＨで洗浄することにより、樹脂上の未反応部位をキャップした。Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０％のピペリジンを用いてＦｍｏｃ基を除去した後、Ｆｍｏｃ脱保護のために２０％ピペリジン／ＤＭＦ、活性化のために２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート／１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ）、塩基としてＤＩＰＥＡおよび溶媒としてＮ－メチル－２－ピロリジノン（ＮＭＰ）を用い、標準的なＦｍｏｃ保護アミノ酸（Ｂａｃｈｅｍ社、スイス）により鎖伸長を実施した。直鎖状ペプチド鎖の組立てが完了したとき、樹脂を収縮させるため、最終洗浄段階としてさらにＭｅＯＨ洗浄を実施した（１×１分、１×１５分）。
【0241】
ＨＦＩＰ／ＣＨ２Ｃｌ２カクテル（１：４、ｖ／ｖ）で２回、それぞれ１５分間処理することにより、樹脂からペプチドを切断した。反応混合物をろ過し、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２およびＭｅＯＨで順次洗い流した。ろ液をプールし、次いで減圧下で溶媒を蒸発させた。最後に、ドライアイスで冷やしたＥｔＯ２を用いて粗直鎖状ペプチドを３回沈殿させ、遠心分離（３×５分、７８００ｒｐｍ）および乾燥（窒素流下）の後、回収した。粗物質をＨＰＬＣにより精製した。
【0242】
レーザー損傷モデル
手術用顕微鏡に装着した５３２ｎｍ眼科用レーザー（Ｖｉｔｒａ Ｌａｓｅｒ、５３２ｎｍ、４５０ｍＷ、５０ミリ秒および２５０μｍ）でレーザー凝固を実施した。ガラスキャピラリー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）および微量注入器を用いて、２μｌのＨＴＲＡ１および／またはＴＳＰ１の硝子体内注射を実施した。注射溶液２μｌは、５０μｇ／ｍｌＴＳＰ１およびＨＴＲＡ１を含み、この濃度は、各タンパク質が眼内体積で約１０分の１に希釈されると仮定した眼内濃度５μｇ／ｍｌに相当する。一連の実験では、光刺激後およびレーザー損傷後に加齢に伴い過度の網膜下炎症を発症するＣｘ３ｃｒ１ＧＦＰ／ＧＦＰマウス（Ｃｏｍｂａｄｉｅｒｅら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００７，１１７：２９２０－２９２８；Ｌｅｖｙら，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１５，７：２１１－２２６）にレーザー損傷を実施した。損傷後第４日（ＭＰ浸潤が最大になるとき）および第７日に、ＰＢＳ、組換えＴＳＰ１（１０μｇ／ｍｌ）、４ＮＧＧ対照ペプチドまたはＣＤ４７活性化ペプチドＰＫＴ１６（２００μＭ）のいずれかの１００μＭ溶液を２μｌの体積で注射し、第１０日、フラットマウントしたＲＰＥ／脈絡膜フラットマウントで網膜下炎症を評価した。
手術用顕微鏡に装着した５３２ｎｍ眼科用レーザー（Ｖｉｔｒａ Ｌａｓｅｒ、５３２ｎｍ、４５０ｍＷ、５０ミリ秒および２５０μｍ）でレーザー凝固を実施した。ガラスキャピラリー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）および微量注入器を用いて、２μｌのＨＴＲＡ１および／またはＴＳＰ１の硝子体内注射を実施した。注射溶液２μｌは、５０μｇ／ｍｌＴＳＰ１およびＨＴＲＡ１を含み、この濃度は、各タンパク質が眼内体積で約１０分の１に希釈されると仮定した眼内濃度５μｇ／ｍｌに相当する。一連の実験では、光刺激後およびレーザー損傷後に加齢に伴い過度の網膜下炎症を発症するＣｘ３ｃｒ１ＧＦＰ／ＧＦＰマウス（Ｃｏｍｂａｄｉｅｒｅら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００７，１１７：２９２０－２９２８；Ｌｅｖｙら，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１５，７：２１１－２２６）にレーザー損傷を実施した。損傷後第４日（ＭＰ浸潤が最大になるとき）および第７日に、ＰＢＳ、組換えＴＳＰ１（１０μｇ／ｍｌ）、４ＮＧＧ対照ペプチドまたはＣＤ４７活性化ペプチドＰＫＴ１６（２００μＭ）のいずれかの１００μＭ溶液を２μｌの体積で注射し、第１０日、フラットマウントしたＲＰＥ／脈絡膜フラットマウントで網膜下炎症を評価した。
【0243】
光刺激モデル
既に記載されている（Ｓｅｎｎｌａｕｂら，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１３，５：１７７５－１７９３）通りに、２～３か月齢のマウスを６時間暗順応させ、瞳孔を散大させ、緑色ＬＥＤ光に４日間曝露し（午前２時開始、４５００ルクス、ＪＰ Ｖｅｚｏｎ ｅｑｕｉｐｅｍｅｎｔｓ社）、次いで１２時間／１２時間周期の通常の施設条件下で飼育した。光曝露終了時または１０日後（第１４日）にＭＰカウントを評価した。
既に記載されている（Ｓｅｎｎｌａｕｂら，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１３，５：１７７５－１７９３）通りに、２～３か月齢のマウスを６時間暗順応させ、瞳孔を散大させ、緑色ＬＥＤ光に４日間曝露し（午前２時開始、４５００ルクス、ＪＰ Ｖｅｚｏｎ ｅｑｕｉｐｅｍｅｎｔｓ社）、次いで１２時間／１２時間周期の通常の施設条件下で飼育した。光曝露終了時または１０日後（第１４日）にＭＰカウントを評価した。
【0244】
単核食細胞定量化のための脈絡膜および網膜のフラットマウント
眼球を摘出し、４％ＰＦＡで３０分間固定し、輪部で切開し；角膜および水晶体を廃棄した。網膜をＲＰＥ／脈絡膜／強膜から慎重に剥がした。網膜および脈絡膜を抗ＩＢＡ－１（Ｗａｋｏ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）、次いで二次抗体の抗ウサギＡｌｅｘａ ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）とインキュベートし、ヘキスト染色を実施した。脈絡膜および網膜をフラットマウントし、蛍光顕微鏡ＤＭ５５００Ｂ（Ｌｅｉｃａ社）で観察した。ＲＰＥ／脈絡膜フラットマウント全体および網膜の外節側のＩＢＡ－１＋細胞をカウントした。
眼球を摘出し、４％ＰＦＡで３０分間固定し、輪部で切開し；角膜および水晶体を廃棄した。網膜をＲＰＥ／脈絡膜／強膜から慎重に剥がした。網膜および脈絡膜を抗ＩＢＡ－１（Ｗａｋｏ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）、次いで二次抗体の抗ウサギＡｌｅｘａ ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）とインキュベートし、ヘキスト染色を実施した。脈絡膜および網膜をフラットマウントし、蛍光顕微鏡ＤＭ５５００Ｂ（Ｌｅｉｃａ社）で観察した。ＲＰＥ／脈絡膜フラットマウント全体および網膜の外節側のＩＢＡ－１＋細胞をカウントした。
【0245】
網膜下養子ＭＰ移植および除去
Ｌｅｖｙら（ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１５，７：２１１－２２６）に従い、図のマウス系統の脳ミクログリアを上記の通りに選別し、１０μＭ ＣＦＳＥ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で標識し、洗浄し、ＰＢＳに再懸濁させた。麻酔をかけた１０～１４週齢の野生型マウスの網膜下腔にガラスマイクロキャピラリー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）および微量注入器を用いて細胞１２０００個（４μＬ）を注射した。眼圧上昇を回避し、４μＬの溶液で網膜が剥離するよう網膜下注射の前にガラスキャピラリーで孔を開けた。眼底検査により網膜下注射を確認した。特定の実験では、細胞に組換えヒトＴＳＰ１（１０μｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を同時に注射し、２４時間後に眼球を摘出し、４％ＰＦＡで３０分間固定し、ＤＡＰＩで標識した。出血のみられる眼球は廃棄した。フラットマウントで網膜下腔内の網膜のＲＰＥ側およびＲＰＥの頂端側のＣＦＳＥ＋細胞を定量化した。
Ｌｅｖｙら（ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１５，７：２１１－２２６）に従い、図のマウス系統の脳ミクログリアを上記の通りに選別し、１０μＭ ＣＦＳＥ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で標識し、洗浄し、ＰＢＳに再懸濁させた。麻酔をかけた１０～１４週齢の野生型マウスの網膜下腔にガラスマイクロキャピラリー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）および微量注入器を用いて細胞１２０００個（４μＬ）を注射した。眼圧上昇を回避し、４μＬの溶液で網膜が剥離するよう網膜下注射の前にガラスキャピラリーで孔を開けた。眼底検査により網膜下注射を確認した。特定の実験では、細胞に組換えヒトＴＳＰ１（１０μｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を同時に注射し、２４時間後に眼球を摘出し、４％ＰＦＡで３０分間固定し、ＤＡＰＩで標識した。出血のみられる眼球は廃棄した。フラットマウントで網膜下腔内の網膜のＲＰＥ側およびＲＰＥの頂端側のＣＦＳＥ＋細胞を定量化した。
【0246】
チオグリコラート誘導性腹膜炎およびフローサイトメトリー
１０週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスおよびＣｄ４７－／－マウスに３％チオグリコラート（Ｔ９０３２、Ｓｉｇｍａ社）０．５ｍｌをｉ．ｐ．注射することによりマウス腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）を誘発した。１日後、氷冷ＰＢＳで腹膜を洗い流すことによりＰＥＣを単離した。製造業者のプロトコルに従い磁気ソーティング（ＥａｓｙＳｅｐ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔ、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）によりＭφを陰性選択し、Ｘ－ＶＩＶＯ １５培地（Ｌｏｎｚａ社）に再懸濁させ、Ｌａｂ－Ｔｅｋ（登録商標）Ｃｈａｍｂｅｒ Ｓｌｉｄｅ（商標）（Ｎｕｎｃ（登録商標））に播いた。
１０週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスおよびＣｄ４７－／－マウスに３％チオグリコラート（Ｔ９０３２、Ｓｉｇｍａ社）０．５ｍｌをｉ．ｐ．注射することによりマウス腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）を誘発した。１日後、氷冷ＰＢＳで腹膜を洗い流すことによりＰＥＣを単離した。製造業者のプロトコルに従い磁気ソーティング（ＥａｓｙＳｅｐ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔ、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）によりＭφを陰性選択し、Ｘ－ＶＩＶＯ １５培地（Ｌｏｎｚａ社）に再懸濁させ、Ｌａｂ－Ｔｅｋ（登録商標）Ｃｈａｍｂｅｒ Ｓｌｉｄｅ（商標）（Ｎｕｎｃ（登録商標））に播いた。
【0247】
５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で２時間経過した後、細胞をＰＢＳですすぎ、４％パラホルムアルデヒド溶液で１０分間固定し、すすぎ、細胞をＴｒｉｔｏｎの０．１％ＰＢＳ溶液中で１０分間インキュベートすることにより透過処理した。Ｄｕｏｌｉｎｋ（登録商標）ＰＬＡアッセイを製造業者の指示（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）通りに実施した。簡潔に述べれば、ウサギ抗ＣＤ１１ｂ（ａｂ７５４７６、Ａｂｃａｍ社；１：１０００）およびヤギ抗ＣＤ４７（ＡＦ１８６６、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社；１：１０００）を４℃で一晩インキュベートした。そののち、抗ウサギおよび抗マウスオリゴヌクレオチド標識二次抗体（ＰＬＡ Ｐｒｏｂｅｓ社）をインキュベートし、次いで、リガーゼおよびポリメラーゼ反応によりシグナルを増幅した。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦＬＵＯＶＩＥＷ ＦＶ１０００共焦点レーザー走査顕微鏡で画像を撮影した。
【0248】
統計解析
Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ ６（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）をデータ解析およびグラフ表示に用いた。数値はいずれも平均＋／－ＳＥＭで報告する。実験計画に応じて平均値間の一元配置ＡＮＯＶＡ、次いでボンフェローニの事後検定（多重比較）またはマン・ホイットニーのＵ検定（２グループ間比較）により統計解析を実施した。ｎ値およびＰ値は図の説明文に示す。
Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ ６（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）をデータ解析およびグラフ表示に用いた。数値はいずれも平均＋／－ＳＥＭで報告する。実験計画に応じて平均値間の一元配置ＡＮＯＶＡ、次いでボンフェローニの事後検定（多重比較）またはマン・ホイットニーのＵ検定（２グループ間比較）により統計解析を実施した。ｎ値およびＰ値は図の説明文に示す。
【0249】
実施例１：ＴＳＰ１はＣＤ４７を介してＭＰ除去を媒介する
Ｔｓｐ１－／－マウスには、実験的に誘導した脈絡網膜炎、光誘導損傷およびレーザー誘導損傷後に網膜下炎症の増大および長期化がみられることから、ＴＳＰ１は網膜下単核単球除去に関与する（Ｗａｎｇら，Ａｒｃｈ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２０１２，１３０：６１５－６２０；Ｎｇら，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２００９，５０：５４７２－５４７８；Ｃｈｅｎら，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２０１２，１８０：２３５－２４５）。この作用を媒介するＴＳＰ１受容体は明らかにされていない。２～３か月齢および１２か月齢のマウスの網膜およびＲＰＥ／脈絡膜のフラットマウントにおいて網膜下ＩＢＡ－１＋単核単球を定量化したところ、同じ条件で飼育した野生型個体と比較して、Ｔｓｐ１－／－マウスおよびＣｄ４７－／－マウスには加齢による網膜下単核単球の有意な増加がみられたが、Ｃｄ３６－／－マウスにはみられなかった（図１Ａ、マウスは全て、Ｃｒｂ１ｒｄ８遺伝子を排除するように戻し交配し、ほかにケージを覆うものがない状態で、ケージレベルで１００～５００ルクス、１２時間ずつの明／暗周期の下で育てた）。
Ｔｓｐ１－／－マウスには、実験的に誘導した脈絡網膜炎、光誘導損傷およびレーザー誘導損傷後に網膜下炎症の増大および長期化がみられることから、ＴＳＰ１は網膜下単核単球除去に関与する（Ｗａｎｇら，Ａｒｃｈ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２０１２，１３０：６１５－６２０；Ｎｇら，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２００９，５０：５４７２－５４７８；Ｃｈｅｎら，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２０１２，１８０：２３５－２４５）。この作用を媒介するＴＳＰ１受容体は明らかにされていない。２～３か月齢および１２か月齢のマウスの網膜およびＲＰＥ／脈絡膜のフラットマウントにおいて網膜下ＩＢＡ－１＋単核単球を定量化したところ、同じ条件で飼育した野生型個体と比較して、Ｔｓｐ１－／－マウスおよびＣｄ４７－／－マウスには加齢による網膜下単核単球の有意な増加がみられたが、Ｃｄ３６－／－マウスにはみられなかった（図１Ａ、マウスは全て、Ｃｒｂ１ｒｄ８遺伝子を排除するように戻し交配し、ほかにケージを覆うものがない状態で、ケージレベルで１００～５００ルクス、１２時間ずつの明／暗周期の下で育てた）。
【0250】
同様に、４日間の光刺激後、Ｔｓｐ１－／－マウスおよびＣｄ４７－／－マウスでは、網膜下単核単球が有意に多く蓄積し、通常の光条件下に戻してさらに１０日経過した後も単核単球が蓄積し続けた（図１Ｂ、本明細書において用いた本発明者らの光刺激モデルの強度は、易炎症性Ｃｘ３ｃｒ１ＧＦＰ／ＧＦＰマウスには網膜下炎症を誘導するが、ＷＴマウスには誘導しないよう調整したものである（Ｓｅｎｎｌａｕｂら，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１３，５：１７７５－１７９３））。さらに、レーザー照射から７日後、Ｔｓｐ１－／－マウスおよびＣｄ４７－／－マウスでは、網膜下ＩＢＡ－１＋単核単球が有意に多かった（図１Ｃ）。
【0251】
これらの結果から、ＴＳＰ１がその受容体ＣＤ４７を介して網膜下ＭＰ除去に関与することが示唆された。
【0252】
野生型マウス、Ｔｓｐ１－／－マウスまたはＣｄ４７－／－マウスのＣＦＳＥ標識脳ミクログリア細胞を野生型レシピエントの網膜下に注射した養子移植実験。２４時間後のフラットマウントの網膜下ミクログリア細胞集団の評価から、Ｔｓｐ１－／－ミクログリア細胞およびＣｄ４７－／－ミクログリア細胞が野生型ミクログリア細胞と比較して有意に除去に抵抗性であることが示された（図１Ｄ）。組換えＴＳＰ１の同時注射により、野生型ミクログリア細胞の除去が極めて有意に促進され、Ｔｓｐ１－／－ミクログリア細胞の表現型が正常に戻ったが、Ｃｄ４７－／－ミクログリア細胞には何ら効果はみられず、このことから、ＴＳＰ１とＣＤ４７の相互作用がミクログリア細胞除去を媒介することが確認された（図１Ｄ）。
【0253】
まとめると、これらのデータは、ＴＳＰ１欠損個体およびＣＤ４７欠損個体がともに加齢、光およびレーザーにより誘導される網膜下単核ファーゴサイト（ｐｈａｒｇｏｃｙｔｅ）蓄積を生じることから、ＴＳＰ１はそのＣＤ４７受容体を介して網膜下ミクログリア細胞を除去し、この相互作用が生理学的に重要であることを示している。興味深いことに、ＣＤ３６－／－は網膜下単核ファーゴサイト（ｐｈａｒｇｏｃｙｔｅ）蓄積というＴｓｐ１－／－表現型を共有していなかったことから、本発明者らのデータは、この機序にはＣＤ３６もＴＧＦβ（ＣＤ３６の不在下では活性化されない）もあまり関与していないことを示唆している。
【0254】
実施例２：ＡＭＤ関連ＳＮＰ ｒｓ１１２００６３８は単球由来マクロファージのＨＴＲＡ１発現を有意に増大させる
遺伝子に関連する多数の研究から、染色体１０ｑ２６はＡＭＤに関連する領域の主要な候補であることがわかっている。リスクハプロタイプは、高温要求性Ａセリンペプチダーゼ１（ＨＴＲＡ１）プロモーターの保存されたＣｐＧアイランド（ＤＮＡメチル化部位）のＣＧパターンを破壊するＳＮＰ ｒｓ１１２００６３８を含む（Ｙａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００６，３１４：９９２－９９３）。このＳＮＰは、リンパ球でのＨＴＲＡ１転写のエピジェネティックな阻害を取り除くことがわかっている（Ｙａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００６，３１４：９９２－９９３）。ＨＴＲＡ１を発現することができるマクロファージ（Ｈｏｕら，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ．２０１３，６５：２８３５－２８４６）とは対照的に、リンパ球はＡＭＤ患者の網膜にはあまり存在しない。単球由来マクロファージのＨＴＲＡ１発現を評価するため、最初に、健常ドナーから新たに精製し様々な長さの時間培養したＣＤ１４＋末梢血単球（ＰＢＭＣ）でのＨＴＲＡ１発現を解析した。ＨＴＲＡ１のＲＴ－ＰＣＲ解析から、単球からマクロファージへの分化の初期にＨＴＲＡ１が迅速かつ有意に誘導され、それが少なくとも１６８時間にわたって高レベルで持続することがわかった（７日間；図２Ａ）。ＲＴ－ＰＣＲ解析では、新鮮なＰＢＭＣにはＨｔｒａ１ ｍＲＮＡが新鮮な血液リンパ球の１０倍発現し、この発現は、２４時間のＰＢＭＣ培養の後にさらにその１０倍増加することが明らかになった（図２Ｂ）。ｒｓ１１２００６３８がホモ接合型のウェット型ＡＭＤの患者および年齢をマッチさせた遺伝子多型のない対照被験者の定量的ＲＴ－ＰＣＲにより、ｒｓ１１２００６３８がリンパ球において有意に高いＨｔｒａ１ ｍＲＮＡレベルと関係があるのみならず、さらに重要なことに、ＰＢＭＣおよび初期ＰＢＭＣ由来マクロファージが、ＡＭＤでは多量のＨｔｒａ１を発現し、蓄積することから、ＰＢＭＣおよび初期ＰＢＭＣ由来マクロファージでも有意に高いＨｔｒａ１ ｍＲＮＡレベルに関連することが確認された（図２Ｃ）。
遺伝子に関連する多数の研究から、染色体１０ｑ２６はＡＭＤに関連する領域の主要な候補であることがわかっている。リスクハプロタイプは、高温要求性Ａセリンペプチダーゼ１（ＨＴＲＡ１）プロモーターの保存されたＣｐＧアイランド（ＤＮＡメチル化部位）のＣＧパターンを破壊するＳＮＰ ｒｓ１１２００６３８を含む（Ｙａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００６，３１４：９９２－９９３）。このＳＮＰは、リンパ球でのＨＴＲＡ１転写のエピジェネティックな阻害を取り除くことがわかっている（Ｙａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００６，３１４：９９２－９９３）。ＨＴＲＡ１を発現することができるマクロファージ（Ｈｏｕら，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ．２０１３，６５：２８３５－２８４６）とは対照的に、リンパ球はＡＭＤ患者の網膜にはあまり存在しない。単球由来マクロファージのＨＴＲＡ１発現を評価するため、最初に、健常ドナーから新たに精製し様々な長さの時間培養したＣＤ１４＋末梢血単球（ＰＢＭＣ）でのＨＴＲＡ１発現を解析した。ＨＴＲＡ１のＲＴ－ＰＣＲ解析から、単球からマクロファージへの分化の初期にＨＴＲＡ１が迅速かつ有意に誘導され、それが少なくとも１６８時間にわたって高レベルで持続することがわかった（７日間；図２Ａ）。ＲＴ－ＰＣＲ解析では、新鮮なＰＢＭＣにはＨｔｒａ１ ｍＲＮＡが新鮮な血液リンパ球の１０倍発現し、この発現は、２４時間のＰＢＭＣ培養の後にさらにその１０倍増加することが明らかになった（図２Ｂ）。ｒｓ１１２００６３８がホモ接合型のウェット型ＡＭＤの患者および年齢をマッチさせた遺伝子多型のない対照被験者の定量的ＲＴ－ＰＣＲにより、ｒｓ１１２００６３８がリンパ球において有意に高いＨｔｒａ１ ｍＲＮＡレベルと関係があるのみならず、さらに重要なことに、ＰＢＭＣおよび初期ＰＢＭＣ由来マクロファージが、ＡＭＤでは多量のＨｔｒａ１を発現し、蓄積することから、ＰＢＭＣおよび初期ＰＢＭＣ由来マクロファージでも有意に高いＨｔｒａ１ ｍＲＮＡレベルに関連することが確認された（図２Ｃ）。
【0255】
まとめると、以上のデータから、ｒｓ１１２００６３８は、リンパ球でのＨｔｒａ１転写増大に関連し、その観察結果は、本発明者らがＡＭＤにおいて蓄積し、病原性の役割を演じることを示した単核単球にも及ぶことが確認される。
【0256】
実施例３：ＨＴＲＡ１はＴＳＰ１を分解する
ＨＴＲＡ１はどちらかといえば非選択性のプロテアーゼであり、複数種のタンパク質を分解することがわかっている（Ａｎら，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２０１０，５１：３３７９－３３８６）。興味深いことに、組換えＨＴＲＡ１（ｒＨＴＲＡ１）と３７℃で２４時間共インキュベートした組換えＴＳＰ１（ｒＴＳＰ１）の電気泳動ゲルのクーマシー染色から、ＨＴＲＡ１がＴＳＰ１を分解することが明らかになった（図３Ａ）。タンパク質のウエスタンブロット解析では、共インキュベートした条件下で完全な大きさのＴＳＰ１が消失し、これより小さいバンドが複数現れることが確認された（図３Ａ）。組換えＴＳＰ２／ｒＨＴＲＡ１と共インキュベートしたタンパク質の電気泳動ゲルのクーマシー染色では、そのような分解はみられなかった（図３Ｂ）。次に、ｉｎ ｖｉｖｏのレーザー誘導網膜下炎症におけるｒＴＳＰ１およびＨＴＲＡ１消化ＴＳＰ１の機能性を解析した。第３日にＰＢＳ、ｒＨＴＲＡ１、ｒＴＳＰ１およびｒＨＴＲＡ１消化ｒＴＳＰ１を硝子体内注射した野生型マウスおよびＴｓｐ１－／－マウスの第７日のレーザー誘導網膜下炎症の定量化により、（ｉ）野生型マウスではｒＨＴＲＡ１が網膜下炎症を悪化させるが、Ｔｓｐ１－／－マウスでは悪化させないこと、および（ｉｉ）ｒＴＳＰ１は、この炎症を有意に減少させるが、ｒＨＴＲＡ１消化ｒＴＳＰ１は減少させないことが明らかになった（図３Ｃ）。その結果、脈絡膜フラットマウントでＣＤ１０２＋ＣＮＶによって覆われた表面として第７日に測定した関連する脈絡膜血管新生にも同様の差がみられた（図３Ｄ）。
ＨＴＲＡ１はどちらかといえば非選択性のプロテアーゼであり、複数種のタンパク質を分解することがわかっている（Ａｎら，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２０１０，５１：３３７９－３３８６）。興味深いことに、組換えＨＴＲＡ１（ｒＨＴＲＡ１）と３７℃で２４時間共インキュベートした組換えＴＳＰ１（ｒＴＳＰ１）の電気泳動ゲルのクーマシー染色から、ＨＴＲＡ１がＴＳＰ１を分解することが明らかになった（図３Ａ）。タンパク質のウエスタンブロット解析では、共インキュベートした条件下で完全な大きさのＴＳＰ１が消失し、これより小さいバンドが複数現れることが確認された（図３Ａ）。組換えＴＳＰ２／ｒＨＴＲＡ１と共インキュベートしたタンパク質の電気泳動ゲルのクーマシー染色では、そのような分解はみられなかった（図３Ｂ）。次に、ｉｎ ｖｉｖｏのレーザー誘導網膜下炎症におけるｒＴＳＰ１およびＨＴＲＡ１消化ＴＳＰ１の機能性を解析した。第３日にＰＢＳ、ｒＨＴＲＡ１、ｒＴＳＰ１およびｒＨＴＲＡ１消化ｒＴＳＰ１を硝子体内注射した野生型マウスおよびＴｓｐ１－／－マウスの第７日のレーザー誘導網膜下炎症の定量化により、（ｉ）野生型マウスではｒＨＴＲＡ１が網膜下炎症を悪化させるが、Ｔｓｐ１－／－マウスでは悪化させないこと、および（ｉｉ）ｒＴＳＰ１は、この炎症を有意に減少させるが、ｒＨＴＲＡ１消化ｒＴＳＰ１は減少させないことが明らかになった（図３Ｃ）。その結果、脈絡膜フラットマウントでＣＤ１０２＋ＣＮＶによって覆われた表面として第７日に測定した関連する脈絡膜血管新生にも同様の差がみられた（図３Ｄ）。
【0257】
まとめると、これらの結果は、ＨＴＲＡ１がＴＳＰ１を消化し、その結果、ｉｎ ｖｉｖｏのレーザー誘導炎症におけるＴＳＰ１の抗炎症作用に関する機能を完全に喪失することを示している。
【0258】
実施例４：ＨＴＲＡ１はＣＤ４７を活性化する２つのＶＶＭ部位の間でＴＳＰ１を切断する
ＴＳＰ１のＨＴＲＡ１切断部位を明らかにするため、ＴＳＰ１の消化後フラグメントを液体クロマトグラフィー－タンデムマススペクトロメトリーに供した。この解析から、ＨＴＲＡ１はＴＳＰ１を（ｉ）インテグリンα３β１との結合能があることがわかっている部位で、（ｉｉ）「２型」ドメインの間にある２つの部位で、および（ｉｉｉ）それぞれがＣＤ４７受容体と相互作用することが可能であり、その効率の高いＣＤ４７活性化に関与する２つのバリン－バリン－メチオニン（ＶＶＭ）配列の間にある２つの部位で切断することが明らかになった。ＴＳＰ１のＣＤ３６またはＬＡＰ結合ドメインは直接影響を受けなかった。
ＴＳＰ１のＨＴＲＡ１切断部位を明らかにするため、ＴＳＰ１の消化後フラグメントを液体クロマトグラフィー－タンデムマススペクトロメトリーに供した。この解析から、ＨＴＲＡ１はＴＳＰ１を（ｉ）インテグリンα３β１との結合能があることがわかっている部位で、（ｉｉ）「２型」ドメインの間にある２つの部位で、および（ｉｉｉ）それぞれがＣＤ４７受容体と相互作用することが可能であり、その効率の高いＣＤ４７活性化に関与する２つのバリン－バリン－メチオニン（ＶＶＭ）配列の間にある２つの部位で切断することが明らかになった。ＴＳＰ１のＣＤ３６またはＬＡＰ結合ドメインは直接影響を受けなかった。
【0259】
これらの結果およびＴＳＰ１がＣＤ４７を介して免疫抑制能を展開するという観察結果（図１）は、ＨＴＲＡ１による切断がＴＳＰ１の２つのＶＶＭ部位を切り離すことから、ＨＴＲＡ１はＣＤ４７を少なくとも部分的に不活性することを示唆している。実際、ＴＳＰ１の半最大有効濃度（ＥＣ５０）は、１つのＶＶＭ部位のみを含むＣＤ４７活性化ペプチドまたはＴＳＰ２のＥＣ５０よりはるかに低い。
【0260】
実施例５：ＣＤ４７の活性化はｉｎ ｖｉｔｒｏの網膜下免疫抑制に対するＨＴＲＡ１の作用を逆転させる
網膜下免疫抑制に対するＨＴＲＡ１の作用を評価するため、ＣＦＳＥ標識ヒト単球とブタＲＰＥの共培養モデルを開発した。このモデルでは、網膜下腔への単核単球のｉｎ ｖｉｖｏ養子移植（Ｌｅｖｙら，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１５，７：２１１－２２６）と同様に、ＣＦＳＥ＋単球の少なくとも５０％が２４時間以内に迅速に除去されるが、ＲＰＥ細胞数（ＯＴＸ－２＋核のカウントにより示される）は影響を受けない（図４Ａおよび４Ｂ）。共培養物に組換えＨＴＲＡ１（５μｇ／ｍＬ）を添加すると、このＲＰＥの免疫抑制が極めて有意に阻害され、２４時間後のｈＭｏ数は対照条件より３～４倍多かった（共培養対照群と比較してｐ＜０．０００１）。核ＲＰＥマーカー（下を参照されたい）があまり減少しなかったため、共培養物中のＲＰＥ細胞数はＯＴＸ２を用いて自動的にカウントした（Ａｒｒａｙｓｃａｎ）。ｔｒａｎｓｗｅｌｌを用いた実験では、Ｍｏ細胞死を誘導するにはＲＰＥ細胞との間の物理的接触が必要であり、ＨＴＲＡ１の熱不活化によりその作用が消失することが示された（不掲載）。
網膜下免疫抑制に対するＨＴＲＡ１の作用を評価するため、ＣＦＳＥ標識ヒト単球とブタＲＰＥの共培養モデルを開発した。このモデルでは、網膜下腔への単核単球のｉｎ ｖｉｖｏ養子移植（Ｌｅｖｙら，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１５，７：２１１－２２６）と同様に、ＣＦＳＥ＋単球の少なくとも５０％が２４時間以内に迅速に除去されるが、ＲＰＥ細胞数（ＯＴＸ－２＋核のカウントにより示される）は影響を受けない（図４Ａおよび４Ｂ）。共培養物に組換えＨＴＲＡ１（５μｇ／ｍＬ）を添加すると、このＲＰＥの免疫抑制が極めて有意に阻害され、２４時間後のｈＭｏ数は対照条件より３～４倍多かった（共培養対照群と比較してｐ＜０．０００１）。核ＲＰＥマーカー（下を参照されたい）があまり減少しなかったため、共培養物中のＲＰＥ細胞数はＯＴＸ２を用いて自動的にカウントした（Ａｒｒａｙｓｃａｎ）。ｔｒａｎｓｗｅｌｌを用いた実験では、Ｍｏ細胞死を誘導するにはＲＰＥ細胞との間の物理的接触が必要であり、ＨＴＲＡ１の熱不活化によりその作用が消失することが示された（不掲載）。
【0261】
ＡＭＤにおいて観察される網膜下微小環境を模倣するため、共培養物を組換えＨＴＲＡ１（５μｇ／ｍＬ）の存在下に曝露した。プロテアーゼの存在によりＲＰＥの免疫抑制作用が有意に阻害され（おそらくＴＳＰ１の不活性化による）、単球の生存能が有意に増大した（図４Ａ、左パネル）。ＨＴＲＡ１は、ＲＰＥ細胞の生存能に影響を及ぼさなかった（図４Ａ、右パネル）。ＨＴＲＡ１誘導性ＴＳＰ１不活性化および免疫抑制の阻害を逆転させる試みで、培地および共培養物をＰＢＳまたはＴＳＰ１（ＣＤ４７を活性化するため）とＭｅｇａＦａｓｌ（ＦＡＳのゴニスト）の混合物のいずれかによってさらに２４時間処理した。４８時間後、ＰＢＳで処理したＨＴＲＡ１曝露共培養物のＭｏカウント数は、４８時間の対照条件と比較して有意に高い状態で維持された。しかし、ＦＡＳとＣＤ４７アゴニストＴＳＰ１を組み合わせて処理した場合、相当数のＭｏが除去され、その数に４８時間後の対照培養物との有意差は認めらなかった（図４Ｂ）。次に、本発明者らは、ＣＤ４７活性化ペプチドＰＫＴ１６がＨＴＲＡ１共培養条件下でＭｏ除去を促進することができるかどうかを試験した。ＣＤ４７活性化ペプチドＰＫＴ１６（１００μＭ）または４ＮＧＧ対照ペプチドをＨＴＲＡ１処理共培養物に直接加えた。ＣＦＳＥ＋単球の定量化では、４ＮＧＧは単球数に対して有意な効果を示さなかったが、ＰＫＴ１６はＨＴＲＡ１誘導性の単球生存能増大を完全に逆転させたことが明らかである（図４Ｃの左パネル）。ＯＴＸ２＋核の数が変化しなかったことから、４ＮＧＧまたはＰＫＴ１６のＲＰＥ細胞に対する毒性は全く認められなかった（図４Ｂの右パネル）。さらに、用量反応実験では、４Ｎ１ＫおよびＰＫＴ１６は４ＮＮＧとは異なり、４８時間後のＨＴＲＡ１活性化共培養物中のＭｏ数（これらの実験では、ＣＦＳＥ染色を回避するＰＵ１免疫組織化学法により認識される）を用量依存性に減少させることが明らかになった（図４Ｄ）。さらに、ＨＴＲＡ１活性化共培養物を様々な濃度（０μＭ、４μＭ、２０μＭおよび５０μＭ）の対照ペプチド４ＮＧＧ、ＣＤ４７活性化ペプチド４Ｎ１Ｋまたは４Ｎ１Ｋ－ＧＧＧＧＧＧＧＧ－４Ｎ１Ｋペプチド（名称ｄ４Ｎ１Ｋ、Ｇｅｎｅｐｅｐ社）とインキュベートした。４８時間の培養後の定量化により、加水分解されていないＴＳＰ１と類似した、２つのＣＤ４７受容体と結合するｄ４Ｎ１Ｋは、共培養モデルでのＭｏ除去の誘導に有意により有効であることが示された（図４Ｅ）。
【0262】
実施例６：ＣＤ４７の活性化はレーザー誘導易炎症性Ｃｘ３ｃｒ１ＧＦＰ／ＧＦＰマウスの網膜下単核食細胞除去をｉｎ ｖｉｖｏで促進する。
Ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＤ４７活性化の効果を評価するため、光刺激後およびレーザー損傷後に加齢に伴い過度の網膜下炎症を発症するＣｘ３ｃｒ１ＧＦＰ／ＧＦＰマウス（Ｃｏｍｂａｄｉｅｒｅら，ＪＣＩ．２００７；Ｌｅｖｙら，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１５）にレーザー損傷を実施した。損傷後第４日（ＭＰ浸潤が最大になるとき）および第７日に、ＰＢＳ、ＴＳＰ１、対照ペプチド４ＮＧＧまたはＣＤ４７活性化ペプチドＰＫＴ１６の溶液（１００μＭ）を２μｌの体積で注射し、第１０日、フラットマウントにしたＲＰＥ／脈絡膜フラットマウントで網膜下炎症を評価した。
Ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＤ４７活性化の効果を評価するため、光刺激後およびレーザー損傷後に加齢に伴い過度の網膜下炎症を発症するＣｘ３ｃｒ１ＧＦＰ／ＧＦＰマウス（Ｃｏｍｂａｄｉｅｒｅら，ＪＣＩ．２００７；Ｌｅｖｙら，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１５）にレーザー損傷を実施した。損傷後第４日（ＭＰ浸潤が最大になるとき）および第７日に、ＰＢＳ、ＴＳＰ１、対照ペプチド４ＮＧＧまたはＣＤ４７活性化ペプチドＰＫＴ１６の溶液（１００μＭ）を２μｌの体積で注射し、第１０日、フラットマウントにしたＲＰＥ／脈絡膜フラットマウントで網膜下炎症を評価した。
【0263】
結果から、ＴＳＰ１またはＰＫＴ１６を注射した場合、レーザー照射後１０日までに、レーザー照射に隣接するＲＰＥに観察された網膜下ＩＢＡ－１＋ＭＰがＰＢＳまたは対照ペプチド４ＮＧＧと比較して有意に効率的に除去されたことが示される（図５）。
【0264】
実施例７：ＣＤ４７活性化は腹膜炎時のｒｅｃＭφ除去を促進する
ＣＤ４７が他の病的状況下で炎症解消に影響を及ぼすかどうかを試験するため、ともに異なる速度論でアポトーシス促進性の除去を受ける初期の好中球蓄積とそれに続く動員された単球由来炎症性マクロファージ（ｒｅｃＭφ）を特徴とする急性チオグリコラート誘導腹膜炎のモデルを用いた（Ｇａｕｔｉｅｒら，Ｂｌｏｏｄ．２０１３，１２２：２７１４－２７２２）。
ＣＤ４７が他の病的状況下で炎症解消に影響を及ぼすかどうかを試験するため、ともに異なる速度論でアポトーシス促進性の除去を受ける初期の好中球蓄積とそれに続く動員された単球由来炎症性マクロファージ（ｒｅｃＭφ）を特徴とする急性チオグリコラート誘導腹膜炎のモデルを用いた（Ｇａｕｔｉｅｒら，Ｂｌｏｏｄ．２０１３，１２２：２７１４－２７２２）。
【0265】
近接ライゲーションアッセイにより、腹膜炎誘導後第１日に回収したＷＴ ｒｅｃＭφに多数の特異的ＣＤ１１ｂ／ＣＤ４７複合体が明らかとなった（図６、上右、矢印により示される白い点）。対照として、ＣＤ４７－／－マウスにはこの複合体は観察されない（図６、下右）。
【0266】
実験から、第１日に組換えＴＳＰ１またはＣＤ４７特異的活性化ペプチドＰＫＨＢ１を単回腹腔内注射することにより、第２日に観察されるようにｒｅｃＭφの除去が有意に促進されたこともわかる（図７）。
【0267】
以上の結果から、ＣＤ１１ｂとＣＤ４７の複合体が腹腔ｒｅｃＭφ上に存在し、またＣＤ４７活性化が腹膜炎時のｒｅｃＭφ除去を促進することがわかる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-11-15
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】