特開 2023-180213 泌尿器科慢性骨盤痛症候群の予防又は治療方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023180213

(43)【公開日】2023-12-20

(54)【発明の名称】泌尿器科慢性骨盤痛症候群の予防又は治療方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 33/244 20190101AFI20231213BHJP

   A61K 9/16 20060101ALI20231213BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20231213BHJP

   A61P 13/00 20060101ALI20231213BHJP

   A61P 13/10 20060101ALI20231213BHJP

   A61P 13/08 20060101ALI20231213BHJP

   A61P 19/00 20060101ALI20231213BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20231213BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20231213BHJP

【ＦＩ】

A61K33/244 ZNA

A61K9/16

A61K9/51

A61P13/00

A61P13/10

A61P13/08

A61P19/00

A61P43/00 111

A61P29/00

【審査請求】未請求

【請求項の数】19

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023067289

(22)【出願日】2023-04-17

(31)【優先権主張番号】17/835,634

(32)【優先日】2022-06-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】507196642

【氏名又は名称】財團法人國家衛生研究院

【氏名又は名称原語表記】ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＨＥＡＬＴＨ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥＳ

【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．３５，Ｋｅｙａｎ Ｒｏａｄ，Ｚｈｕｎａｎ Ｔｏｗｎ，Ｍｉａｏｌｉ Ｃｏｕｎｔｙ，Ｔａｉｗａｎ，３５０５３（ＴＷ）

(71)【出願人】

【識別番号】506292158

【氏名又は名称】国立台湾大学

【氏名又は名称原語表記】Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔａｉｗａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ

【住所又は居所原語表記】Ｎｏ． １， Ｒｏｏｓｅｖｅｌｔ Ｒｄ． Ｓｅｃ．４， Ｄａ‘ａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ

(71)【出願人】

【識別番号】510075893

【氏名又は名称】ナショナル チュン シン ユニバーシティ

(71)【出願人】

【識別番号】502250743

【氏名又は名称】國立成功大學

【氏名又は名称原語表記】ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＣＨＥＮＧ ＫＵＮＧ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100150500

【弁理士】

【氏名又は名称】森本 靖

(72)【発明者】

【氏名】連 偉志

(72)【発明者】

【氏名】林 峯輝

(72)【発明者】

【氏名】王 恵民

(72)【発明者】

【氏名】程 徳勝

(72)【発明者】

【氏名】周 欣然

(72)【発明者】

【氏名】梁 雅鈞

(72)【発明者】

【氏名】王 家義

(72)【発明者】

【氏名】盧 福翊

(72)【発明者】

【氏名】張 恵慈

【テーマコード（参考）】

4C076

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C076AA31

4C076AA65

4C076BB01

4C076BB11

4C076BB13

4C076BB15

4C076BB16

4C076BB21

4C076BB31

4C086AA01

4C086AA02

4C086HA21

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA38

4C086MA41

4C086MA52

4C086MA56

4C086MA63

4C086MA65

4C086MA66

4C086ZA81

4C086ZA96

4C086ZB11

4C086ZC41

(57)【要約】      （修正有）

【課題】対象における泌尿器科慢性骨盤痛症候群（ＵＣＰＰＳ）を予防又は治療するための方法を提供する。
【解決手段】有効量の酸化セリウムナノ粒子（ＣｅＮＰｓ）を対象に投与することを含む、対象における泌尿器科慢性骨盤痛症候群（ＵＣＰＰＳ）を予防又は治療するための方法とする。また、有効量のＣｅＮＰｓ及びその薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を対象に投与することを含む、対象におけるＵＣＰＰＳを予防又は治療するための方法とする。
【選択図】図６

【特許請求の範囲】

【請求項1】

有効量の酸化セリウムナノ粒子（ＣｅＮＰｓ）をそれを必要とする対象に投与することを含む、泌尿器科慢性骨盤痛症候群（ＵＣＰＰＳ）を予防又は治療する方法。

【請求項2】

前記泌尿器科慢性骨盤痛症候群が、疼痛性膀胱症候群、間質性膀胱炎、慢性前立腺炎、慢性骨盤痛症候群、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記酸化セリウムナノ粒子が、前記対象の酸化ストレスを軽減するために前記対象に投与される、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記酸化セリウムナノ粒子が、酸化還元反応により酸化ストレスを低減するための酸化状態Ｃｅ^３＋とＣｅ^４＋の共存を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記酸化セリウムナノ粒子が、前記対象の膀胱におけるヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ－１）の発現を減少させるために前記対象に投与される、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記酸化セリウムナノ粒子が、前記対象における炎症を軽減するために前記対象に投与される、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記酸化セリウムナノ粒子が、前記対象の膀胱の浮腫及び出血を改善するために前記対象に投与される、請求項５に記載の方法。

【請求項8】

前記酸化セリウムナノ粒子が、前記対象の疼痛を緩和するために前記対象に投与される、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記酸化セリウムナノ粒子が、前記対象の頻尿を減少させるために前記対象に投与される、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記酸化セリウムナノ粒子が、約１０ｎｍ～約３５ｎｍの粒子径を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記酸化セリウムナノ粒子が、約２２ｎｍ～約２５ｎｍの平均粒子径を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

前記酸化セリウムナノ粒子の治療有効量が約３ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇである、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

前記酸化セリウムナノ粒子が、週に１～４回、月に１～４回、又は年に１～４回で、前記対象に投与される、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

前記酸化セリウムナノ粒子が、２～４週間ごとに１回で、対象に投与される、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

前記ＣｅＮＰｓが、対象に経口、腹腔内、静脈内、皮内、筋肉内、皮下、又は経皮的に投与される、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

前記対象が哺乳動物である、請求項１に記載の方法。

【請求項17】

前記対象がヒトである、請求項１に記載の方法。

【請求項18】

有効量の酸化セリウムナノ粒子（ＣｅＮＰｓ）及びその薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、泌尿器科慢性骨盤痛症候群（ＵＣＰＰＳ）を予防又は治療する方法。

【請求項19】

泌尿器科慢性骨盤痛症候群（ＵＣＰＰＳ）を予防又は治療するための医薬品の製造における医薬組成物の使用であって、医薬組成物が有効量の酸化セリウムナノ粒子（ＣｅＮＰｓ）及びその薬学的に許容される担体を含む、使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、慢性骨盤痛症候群を予防又は治療する方法に関連し、特に泌尿器科慢性骨盤痛症候群を予防又は治療する方法に関連する。

【背景技術】

【0002】

泌尿器科慢性骨盤痛症候群（ＵＣＰＰＳ）は、慢性下腹部及び骨盤痛、ならびに頻尿と緊急尿を特徴とする衰弱性の慢性内臓疾患である。ＵＣＰＰＳの有病率は、一般人口で約１０％（男性人口で８～１１．５％［１］）である。ＵＣＰＰＳの病因に関する複数の仮説が提案されている。本疾患の発症モードに関しては合意に達していないが、慢性炎症と連続誘導がその進行に不可欠な役割を果たす可能性がある［２］。ＵＣＰＰＳは年間７００億ドルを超える重大な社会経済的影響を及ぼし、ＵＣＰＰＳの治療コストは約５％の複合年間成長率で加速する。ＵＣＰＰＳは、それに関連するヘルスケアコストに加えて、心理社会的健康に悪影響を及ぼし、睡眠障害、不安、うつ病を引き起こす［３］。

【0003】

内臓痛は、虚血、炎症、及び中空器官の壁の過剰活動によって引き起こされる。これは、膀胱疼痛症候群や慢性膵炎などの治療抵抗性疼痛を含む多くの状態の特徴であり、生活の質の大幅な低下に与える。これまで、ＵＣＰＰＳを含む内臓痛のメカニズムは、体性痛のメカニズムと比較してまだ十分に解明されておらず、慢性内臓の痛みの状態は、通常効率的に緩和することは困難である。

【0004】

理学療法、薬理学的管理および神経遮断を含む非侵襲的又は低侵襲的な療法は、ＵＣＰＰＳの治療に使用される。ただし、それらの有効性は治療期間に限定されている。たとえば、エルミロン（登録商標）（Ｅｌｍｉｒｏｎ）としても知られるペントサンポリ硫酸ナトリウム（ＰＰＳ）は、ＵＣＰＰＳに対してＦＤＡが承認した経口薬であすが、それは抗凝血剤であるため、打撲や出血のリスクを高める可能性がある。さらに、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）は、ＵＣＰＰＳの治療に短期的な効果しかないので、頻繁に（例えば、１日３回以上）投与する必要があり、腎臓損傷やアレルギーなどの副作用につながる可能性がある。そのため、このタイプの治療法は、米国泌尿器科学会によって、長期間の経口投与を必要とし、有効性が低いため、第二選択療法（ｓｅｃｏｎｄ－ｌｉｎｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）としてリストされている。ヒアルロン酸（ＨＡ）は、その優れた生体適合性により、膀胱内注入によるＵＣＰＰＳの治療に使用されている。しかし、排尿はＨＡの損失を加速するため、患者は毎月の灌流を必要とし、治療コストが増加し、生活の質に悪影響を及ぼす。

【0005】

したがって、前述の欠点を克服できるＵＣＰＰＳの代替治療方法及び予防方法に対する医学的なニーズはまだ満たされていない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｃｌｅｍｅｎｓ， Ｊ．Ｑ．， ｅｔ ａｌ．， Ｕｒｏｌｏｇｉｃ ｃｈｒｏｎｉｃ ｐｅｌｖｉｃ ｐａｉｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ： ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＭＡＰＰ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ． Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ． Ｕｒｏｌｏｇｙ， ２０１９． １６（３）： ｐ． １８７－２００．

【非特許文献2】Ｎｕｎｅｚ－Ｂａｄｉｎｅｚ， Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｏｓｉｓ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｃｙｓｔｉｔｉｓ／ｂｌａｄｄｅｒ ｐａｉｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ： ａｎ Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ－ＰａｉｎＣａｒｅ ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅｉｒ ｖａｌｕｅ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ ｐｅｌｖｉｃ ｐａｉｎ． ＰＡＩＮ， ２０２１． １６２（９）： ｐ． ２３４９－２３６５．

【非特許文献3】Ｌａｉ， Ｈ．Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｗｈｏｌｅ Ｂｏｄｙ Ｐａｉｎ ｉｎ Ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｐｅｌｖｉｃ Ｐａｉｎ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ ａｔ Ｂａｓｅｌｉｎｅ： Ａ ＭＡＰＰ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｓｔｕｄｙ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｕｒｏｌｏｇｙ， ２０１７． １９８（３）： ｐ． ６２２－６３１．

【非特許文献4】Ｚｈａｎｇ， Ｆ．， Ｑ． Ｊｉｎ， ａｎｄ Ｓ．－Ｗ． Ｃｈａｎ， Ｃｅｒｉａ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ： Ｓｉｚｅ， ｓｉｚｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ， ａｎｄ ｓｈａｐｅ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ， ２００４． ９５（８）： ｐ． ４３１９－４３２６．

【非特許文献5】Ｗａｌｃｚａｋ， Ｍ．Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｒｏｓｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ／ｍｅｔａｌ ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ ｗｉｔｈ ＸＰＳ： ｍｉｎｉｍｉｚｉｎｇ ｐｏｓｔ ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ． ＪｏＶＥ （Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）， ２０１７（１２１）： ｐ． ｅ５５１６３．

【非特許文献6】Ｔｅｎｇ， Ｙ．－Ｎ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ Ｔｒｉｇｇｅｒｓ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｂｙ Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｃｅｎｔｒｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｉｌｉａ ｉｎ Ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃａｌ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ． Ｃｅｌｌｓ， ２０２１． １０（６）： ｐ． １４６６．

【非特許文献7】Ｄｉｘｏｎ， Ｗ．Ｊ．， Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ， １９８０． ２０： ｐ． ４４１－６２．

【非特許文献8】ｄｅ Ｏｌｉｖｅｉｒａ， Ｍ．Ｇ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｒ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ ＴＬＲ４ ｃｏｎｆｅｒｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｏｕｓｅ ｃｙｓｔｉｔｉｓ． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ， ２０１８． ３１５（３）： ｐ． Ｆ４６０－ｆ４６８．

【非特許文献9】Ｗｅｇｎｅｒ， Ｋ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｖｏｉｄ ｓｐｏｔ ａｓｓａｙ ｐｒｏｃｅｄｕｒａｌ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｏｄｅｎｔ ｖｏｉｄｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｕｒｉｎｅ ｓｐｏｔｓ． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ， ２０１８． ３１５（４）： ｐ． Ｆ１０６７－ｆ１０８０．

【非特許文献10】Ｃａｙａｎ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｂｌａｄｄｅｒ ａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｇｒａｆｔ ｉｎ ａ ｒａｔ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｙｓｔｉｔｉｓ ｍｏｄｅｌ： ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ． Ｊ Ｕｒｏｌ， ２００２． １６８（２）： ｐ． ７９８－８０４．

【発明の概要】

【0007】

当技術分野における上記の問題に鑑み、本開示は、有効量の酸化セリウムナノ粒子（ＣｅＮＰｓ）をそれを必要とする対象に投与することを含む、泌尿器科慢性骨盤痛症候群（ＵＣＰＰＳ）を予防又は治療する方法を提供する。本開示の少なくとも１つの実施形態において、前記対象は哺乳類、例えばヒトである。いくつかの実施形態において、ＣｅＮＰｓの投与は、ＵＣＰＰＳに罹患している対象の痛みを和らげ及び／又は尿中頻度を減らすことができる。

【0008】

酸化セリウム（ＣｅＯ_２）ナノ粒子（ＣｅＮＰｓ）は、長期的な効果、低コスト、有害な副作用の少なさ、独特の根本的な作用メカニズムなどのＵＣＰＰＳの治療に関していくつかの有望な利点がある。具体的には、ＣｅＮＰｓには、酸化状態のＣＥ^３＋とＣＥ^４＋の共存と、これらの状態間の可逆的な酸化還元スイッチにより、独特の抗酸化特性及び／又は触媒特性を持っている。より具体的には、ＣｅＯ_２のバルク結晶は主にＣＥ^４＋で構成されているが、ＣｅＯ_２のサイズがナノ寸法に縮小されると、ＣＥ^３＋の相対量は大幅に増加し、より高い触媒効果が得られる。したがって、本開示の少なくとも１つの実施形態において、ＣｅＮＰｓは活性酸素種（ＲＯＳ）及び／又は活性窒素種（ＲＮＳ）を分解し、自由ラジカルを除去し、自発的な酸化還元反応によって組織内に長期間にわたって活性を維持することにより、並外れた抗酸化特性を示し得る。いくつかの実施形態において、ＣｅＮＰｓは、その顕著な抗酸化特性により、酸化ストレスに関連するＵＣＰＰＳを予防または治療することができる。いくつかの実施形態において、対象の膀胱におけるヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ－１）の発現の減少は、ＵＣＰＰＳが対象の膀胱における酸化ストレスを減少させる可能性があることを示す。

【0009】

本開示の少なくとも１つの実施形態において、ＣｅＮＰｓは対象の炎症を軽減するために対象に投与される。いくつかの実施形態において、ＣｅＮＰｓの投与は、対象の膀胱におけるＩＲＦ７、ＩＲＦ９、セルピン（Ｓｅｒｐｉｎ）Ｂ２、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ－６、及び／又はＴＮＦαを含むがこれらに限定されない、炎症誘発性因子又は炎症因子を減少させる可能性がある。たとえば、ＩＬ－６、ＴＮＦα、セルピンＢ２、ＣＸＣＬ１０、ヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ－１）の少なくとも１つである。いくつかの実施形態において、ＣｅＮＰｓは、対象の膀胱の浮腫と出血を改善するために対象に投与される。

【0010】

本開示の少なくとも１つの実施形態において、ＣｅＮＰｓの粒子径は、約１０ｎｍ～約３５ｎｍである。いくつかの実施形態において、ＣｅＮＰｓの粒子径は、約１０ｎｍ～約３０ｎｍ、例えば、約１５ｎｍ～約２５ｎｍ、約２０ｎｍ～約２５ｎｍ、又は約２２ｎｍ～約２５ｎｍであるが、本開示はこれらに限定されない。

【0011】

本開示の少なくとも１つの実施形態において、ＣｅＮＰｓの平均粒子径は、約２２ｎｍ～約２５ｎｍである。いくつかの実施形態において、ＣｅＮＰｓの平均粒子径は、約２２ｎｍ～約２４ｎｍ、例えば、約２２．５ｎｍ～約２３．５ｎｍ、及び約２２．５ｎｍ～約２３ｎｍである。本開示の１つの実施形態において、ＣｅＮＰｓの平均粒子径は、約２２．５ｎｍ、約２２．５１ｎｍ、約２２．５２ｎｍ、約２２．５３ｎｍ、約２２．５４ｎｍ、約２２．５５ｎｍ、約２２．５６ｎｍ、約２２．６ｎｍ、約２２．７ｎｍ、約２２．８ｎｍ、約２２．９ｎｍ、および約２３．０ｎｍであるが、本開示はこれらに限定されない。

【0012】

本開示の少なくとも１つの実施形態において、ＣｅＮＰｓの有効量は、約３ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態において、ＣｅＮＰｓの有効量は、約１０ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約１０ｍｇ／ｋｇ～約９０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ～約８０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ～約７０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ～約７０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ～約４０ｍｇ／ｋｇ、および約２５ｍｇ／ｋｇ～約３５ｍｇ／ｋｇであるが、本開示はこれらに限定されない。

【0013】

本開示の少なくとも１つの実施形態において、ＣｅＮＰｓは、週に１～４回、月に１～４回、又は年に１～４回で、対象に投与される。いくつかの好ましい実施形態において、ＣｅＮＰｓは、２～４週間ごとに１回、例えば３週間ごとに１回で、対象に投与される。

【0014】

本開示の少なくとも１つの実施形態において、ＣｅＮＰｓは対象に経口、腹腔内、静脈内、皮内、筋肉内、皮下、又は経皮的に投与される。いくつかの好ましい実施形態において、ＣｅＮＰｓは対象に腹腔内又は静脈内に投与される。

【0015】

本開示は、有効量な前記のＣｅＮＰｓおよびその薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、ＵＣＰＰＳを予防又は治療する方法も提供する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は経口、腹腔内、静脈内、皮内、筋肉内、皮下、又は経皮的に投与される。

【0016】

本開示は、ＵＣＰＰＳを予防又は治療するための医薬品の製造における医薬組成物の使用をさらに提供し、当該医薬組成物は、有効量の前記のＣｅＮＰｓ及びその薬学的に許容される担体を含む。

【図面の簡単な説明】

【0017】

特許又は特許出願のファイルには、少なくとも１つのカラー図面が含まれる。カラー図面を含むこの特許又は特許出願のコピーは、要求および必要な手数料の支払いに応じて、特許庁によって提供される。
本開示は、添付の図面と併せて以下の実施形態の説明を参照することにより、より完全に理解することができる。

【図1】図１Ａ～図１Ｄは、ＣｅＮＰｓの特性評価を示す。図１Ａは、酸化セリウムナノ粒子（ＣｅＮＰｓ）の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）イメージングである。ＣｅＮＰｓは２００，０００×倍率で観察された（スケールバー：２００ｎｍ）。図１Ｂは、ＣｅＮＰｓの流体力学的サイズ分布を示す。図１Ｃは、８００，０００×倍率でのＣｅＮＰｓの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）イメージングである（スケールバー：２ｎｍ）。図１Ｄは、ＣＥＮＰのＸＰＳスペクトルがセリウムの結合エネルギー領域を明らかにしたことを示す。矢印で示される２番目、３番目、８番目のピークはＣｅ^３＋であり、矢印で示される１番目、４番目から７番目のピークはＣｅ^４＋である。

【図2】図２Ａ～図２Ｄは、インビトロでヒト尿路上皮Ｔ２４細胞を使用したＣｅＮＰｓテストを示す。図２ａは、Ｔ２４細胞を濃度が０、１２．５、２５、３７．５、５０、７５及び１００μＭである４－ＨＣで４時間（ｈｏｕｒ）処理したことを示す。細胞生存率は、ＷＳＴ－１アッセイ（ＭＫ４００、タカラ、マウンテンビュー、カリフォルニア州、米国）を利用して調べた。濃度が３７．５μＭである４－ＨＣで、Ｔ２４細胞の細胞生存率は約５０％に減少した（ｎ＝３）。図２Ｂは、４－ＨＣによるＴ２４生存率の損失が酸化セリウムナノ粒子（ＣｅＮＰｓ）処理によって救われたことを示す（ｎ＝３）。図２Ｃは、Ｔ２４細胞のジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（ＤＣＦＤＡ）アッセイを示す。各群の蛍光顕微鏡画像：（１）対照群；（２）４－ＨＣのみ群：３７．５μＭの４－ＨＣを４時間添加して、細胞酸化ストレスを誘導した；（３）ＣｅＮＰｓ処理群：３７．５μＭの４－ＨＣで４時間誘導する前に、５μｇ／ｍＬのＣｅＮＰｓが２４時間適用された；（４）ＣｅＮＰｓのみ群：５μｇ／ｍＬのＣｅＮＰｓのみが２４時間適用された。図２Ｄは、ＩＬ－６及びＴＮＦαが４－ＨＣによって有意に向上されたことを示す。（１）対照群；（２）４－ＨＣ群：３７．５μＭの４－ＨＣを４時間添加して、細胞酸化ストレスを誘導した；（３）ＣｅＮＰｓ＋４－ＨＣ群：３７．５μＭの４－ＨＣで４時間誘導する前に、５μｇ／ｍＬのＣｅＮＰｓが２４時間適用された；（４）ＣｅＮＰｓ群：５μｇ／ｍＬのＣｅＮＰｓのみが２４時間適用された。数値は平均±ＳＤで表される。データは、Ｔｕｋｅｙの多重比較テストと一元配置分散分析によって分析された。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。ｎ．ｓ．：統計的差異なし（ｎ＝３）。

【図3】図３Ａ～図３Ｃは、それぞれ機械的感受性試験及び排尿スポットアッセイの結果を示す。対照群、ＣＹＰ群、及びＣｅＮＰｓ前処理群の痛み閾値を図３Ａに示す。対照群、ＣＹＰ群、及びＣｅＮＰｓ前処理群における個々の排尿スポットの数の定量化を図３Ｂに示す。数値は、平均±標準誤差で表される。データは、Ｔｕｋｅｙのポストホックテストと一元配置分散分析によって比較された。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。Ｐ＞０．０５：有意差なし（ｎ．ｓ．）、ｎ＝３。図３Ｃは、対照群、ＣＹＰ群、及びＣｅＮＰｓ前処理群における代表的な排尿パターンを示す。排尿スポットは＊で識別される。

【図4】図４Ａ～図４Ｃは、ＣＹＰ誘発性膀胱炎のマウス膀胱の組織学的変化とＣｅＮＰｓ前処理の保護効果を示す。図４Ａは、グロス及びヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を示す。矢印は尿路上皮下領域を示す。図４Ｂは、浮腫スコアのチャートである。シクロホスファミド（ＣＹＰ）誘発性膀胱炎の動物からの尿袋（Ｕｒｉｎａｒｙ ｂｌａｄｄｅｒ）は、対照群（ＣＴＬ）及び酸化セリウムナノ粒子（ＣｅＮＰｓ）前処理群と比較して、血管肥大と尿路上皮下の厚さの増加を示す。図４Ｃは、高出力場と走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）の画像である。ＣＹＰ群の膀胱だけが、白い矢印で示される不完全な粘膜と裸の尿路上皮細胞を示す。ＣＹＰ群では、露出した尿路上細胞（矢印）が観察された。対照群及びＣｅＮＰｓ前処理群では、完全な細胞膜構造（矢印）が特定された。数値は平均±ＳＥで表される。データは、Ｔｕｋｅｙの多重比較テストと一元配置分散分析を使用して分析された。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。Ｐ＞０．０５：統計的差異なし（ｎ．ｓ．）（ｎ＝３）。

【図5】図５は、対照群（ＣＴＬ）、シクロホスファミド群（ＣＹＰ）、及び酸化セリウムナノ粒子（ＣｅＮＰｓ）前処理群の膀胱におけるセルピンＢ２、ＣＸＣＬ１０、及びヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ－１）の相対量を示す。数値は平均±ＳＥで表される。データは、Ｔｕｋｅｙの多重比較テストと一元配置分散分析を使用して分析された。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。Ｐ＞０．０５：統計的差異なし（ｎ．ｓ．）（ｎ＝３）。

【図6】図６は、対照群（ＣＴＬ）、シクロホスファミド群（ＣＹＰ）、酸化セリウムナノ粒子（ＣｅＮＰｓ）前処理群、及びＣｅＮＰｓ後処理群の膀胱におけるヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ－１）の相対量を示す。

【図7】図７は、対照群（ＣＴＬ）、シクロホスファミド群（ＣＹＰ）、酸化セリウムナノ粒子（ＣｅＮＰｓ）前処理群の膀胱におけるセルピンＢ２、ＣＸＣＬ１０、ＩＲＦ７、ＩＲＦ９ＩＬ－６、及びＴＮＦαの相対量を示す。数値は平均±ＳＤで表される。データは、Ｔｕｋｅｙの多重比較テストと一元配置分散分析によって分析された。＊＊＊Ｐ＜０．００１、（ｎ＝３）。

【発明を実施するための形態】

【0018】

以下の実施例は、本開示を説明するために使用される。当業者は、本明細書の発明に基づき、本発明の他の利点と効果を容易に想到できる。また、本発明は、異なる実施例で説明されているように、実施又は適用することもできる。本発明を実行するための次の実施例を、その範囲を逸脱することなく、異なる態様や応用に応じて調整又は変更することができる。

【0019】

本明細書で使用される場合、単数形式「一（ａ）」、「一（ａｎ）」、及び「当該（ｔｈｅ）」は、明示的かつ明白に1つの参照語に限定されない限り、複数の指示対象が含まれる。「又は」という用語は、文脈が明確に特に示されない限り、「及び／又は」と互換的に使用される。

【0020】

本明細書で使用される場合、語句「少なくとも１つ」とはは、１つ以上の要素のリストに関して、要素のリスト内の任意の１つ以上の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解するべきであるが、要素のリスト内にリストされている各要素を少なくとも１つ含むということは必ずしもそうではなく、要素のリストにある要素の組み合わせも除外しない。また、この定義により、「少なくとも１つ」という語句が指す要素のリスト内で特定される要素以外の要素が、特定された要素に関連するかどうかにもかかわらず、任意に存在することも可能である。したがって、非制限的な例として、「ＡとＢの少なくとも１つ」（又は同等に「Ａ又はＢの少なくとも１つ」、又は同等に「Ａ及び／又はＢの少なくとも１つ」）とは、一実施形態において、少なくとも１つのＡを必要に応じて含み、Ｂは存在なし（また、必要に応じてＢ以外の要素を含む）ことを示し、別の実施形態において、少なくとも１つのＢを必要に応じて含み、Ａは存在なし（また、必要に応じてＡ以外の要素を含む）ことを示し、さらに別の実施形態において、少なくとも１つのＡを必要に応じて含み、かつ少なくとも１つのＢを必要に応じて含み、（また、必要に応じては他の要素を含む）ことを示す。

【0021】

本明細書で使用される場合、用語「含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（及び「含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｅ)」や「含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ)」などの含有の任意の形式）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（及び「有する（ｈａｖｅ）」や「有する（ｈａｓ）」などの有しの任意の形式）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」や「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」などの含みの任意の形式）、「備える（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（及び「備える（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」や「備える（ｃｏｎｔａｉｎ）」などの備えの任意の形式）は包括的又はオープンエンドであり、追加の列挙されていない要素または方法のステップを除外しない。たとえば、物体を「含有」すると記述する場合、特に指定されていない限り、他の要素、構造、領域、部品、装置、システム、ステップ、又は連結などが含まれる場合があり、他の制限を除外すべきではない。

【0022】

用語「約」又は「およそ」とは、当業者によって決定された特定の値に対する許容誤差範囲内であることを意味し、これは、値がどのように測定または決定されるか、つまり測定システムの制限に部分的に依存する。例えば、「約」は、当技術分野の慣例により、１又は１を超える標準偏差内を意味してもよい。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、最大１０％、最大５％、又は最大１％の範囲を意味してもよい。あるいは、特に生物学的システム又はプロセスに関して、この用語は、値の５倍以内又は２倍以内などの桁内を意味することができる。出願及び特許請求の範囲に特定の値が記載されている場合、特に明記しない限り、「約」という用語は、特定の値の許容誤差範囲内を意味すると想定されるべきである。

【0023】

本明細書で使用される数値範囲は包括的かつ組み合わせ可能であり、本明細書の数値範囲内に入る任意の数値は、その次範囲を導き出すための最大値又は最小値と見なすことができる。たとえば、数値範囲「１０ｎｍ～３５ｎｍ」は、最小値１０ｎｍから最大値３５ｎｍの間の任意の次範囲、例えば、１０ｎｍ～２０ｎｍ、２５ｎｍ～３５ｎｍ、２２ｎｍ～２３ｎｍの次範囲を含むことを理解すべきである。さらに、ここで使用される複数の数値は最大値と最小値として任意に選択して数値範囲を導き出すことができる。たとえば、１０ｎｍ～２５ｎｍ、１０ｎｍ～３５ｎｍ、及び２５ｎｍ～３５ｎｍの数値範囲は、１０ｎｍ、２５ｎｍ、及び３５ｎｍの数値から導き出すことができる。

【0024】

本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」とは、薬学的に許容される材料、組成物、又はビークルを指し、例えば、希釈剤、崩壊剤、懸濁剤、湿潤剤、香料、増粘剤、充填剤、防腐剤、結合剤、潤滑剤、流動促進剤、および界面活性剤があり、有効成分（例えば、本明細書で使用されるＣｅＮＰｓ）の生物活性又は特性を損なわず、かつ比較的無毒である。すなわち、ビークルは、対象に投与される場合望ましくない生物学的効果を引き起こすことがなく、又はそれが含まれている医療組成の構成要素と有害な方法で相互作用することがない。

【0025】

本明細書で使用される場合、用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、及び「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、望ましい薬理学的及び／又は生理学的効果の獲得、例えば、障害、疾患、または状態、あるいは障害、疾患、または状態に関連する１つ以上の症状を軽減又は除去し、あるいは障害、疾患、または状態自体の（複数の）原因を軽減又は除去することを指す。その効果は、疾患やその症状を完全に又は部分的に予防するという点で予防的であってもよく、疾患あるいは当該疾患又はその症状に起因する副作用を完全に又は部分的に治癒、軽減、緩和、改良、又は改善するという点で治療的であってもよい。

【0026】

本明細書で使用される場合、用語「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防している（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」、及び「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」とは、障害、疾患、又は状態、及び／又はそれに関連する症状の発症を遅らせる及び／又は排除する方法、対象が障害、疾患、又は状態を罹患することを防止する方法、又は、対象が障害、疾患、又は状態を罹患するリスクを軽減する方法を指す。

【0027】

本明細書で使用される場合、用語「対象」とは、ヒトなどの哺乳類を指すが、家畜（例えば、イヌ、ネコなど）、農場動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）又は実験動物（例えば、サル、齧歯動物、ネズミ、ウサギ、モルモットなど）などの他の動物を指してもよい。用語「患者」とは、疾患や状態に疑われ、又は疾患や状態に罹患している「対象」を指す。ここで、「それを必要とする対象」又は「それを必要とする患者」とは、疾患または障害と診断された、そのリスクがある、又は有する、有することが予め決定されている、又はその疑いがある対象又は患者として言及される。

【0028】

本明細書で使用される場合、語句「有効量」とは、それを必要とする対象に所望の予防又は治療効果（例えば、ＵＣＰＰＳに罹患している対象における酸化ストレスまたは炎症の軽減）を付与するために必要な活性薬剤の量を指す。本開示の少なくとも１つの実施形態において、ＣｅＮＰｓの有効量は、約３ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約１０ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ～約９０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ～約８０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ～約７０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ～約６０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ～約４０ｍｇ／ｋｇ、および約２５ｍｇ／ｋｇ～約３５ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態において、ＣｅＮＰｓの有効量は、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２１ｍｇ／ｋｇ、２２ｍｇ／ｋｇ、２３ｍｇ／ｋｇ、２４ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、２６ｍｇ／ｋｇ、２７ｍｇ／ｋｇ、２８ｍｇ／ｋｇ、２９ｍｇ／ｋｇ及び３０ｍｇ／ｋｇから選択された下限を有し、１００ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、３４ｍｇ／ｋｇ、３３ｍｇ／ｋｇ、３２ｍｇ／ｋｇ、３１ｍｇ／ｋｇ及び３０ｍｇ／ｋｇから選択された上限を有する。

【0029】

本開示の少なくとも１つの実施形態において、ＣｅＮＰｓの粒子径は約１０ｎｍ～約３５ｎｍである。本開示のいくつかの実施形態において、ＣｅＮＰｓの粒子径は、約１０ｎｍ～約３０ｎｍ、例えば約１５ｎｍ～約２５ｎｍ、約２０ｎｍ～約２５ｎｍ、および約２２ｎｍ～約２５ｎｍである。別の実施形態において、ＣｅＮＰｓの粒子径は、１０ｎｍ、１５ｎｍ、２０ｎｍ、２２ｎｍ、２２．４ｎｍ、２２．４７ｎｍ、２２．４８ｎｍ、２２．４９ｎｍ、２２．５０ｎｍ、２２．５１ｎｍ、２２．５２ｎｍ、及び２２．５３ｎｍから選択された下限を有し、及び３５ｎｍ、３０ｎｍ、２５ｎｍ、２２．７０ｎｍ、２２．６０ｎｍ、２２．５９ｎｍ、２２．５８ｎｍ、２２．５７ｎｍ、２２．５６ｎｍ、２２．５５ｎｍ、２２．５４ｎｍ及び２２．５３ｎｍから選択された上限を有する。

【0030】

本開示の少なくとも１つの実施形態において、ＣｅＮＰｓの平均粒子径は約２２ｎｍ～約２５ｎｍである。本開示の１つの実施形態において、ＣｅＮＰｓの平均粒子径は、約２２ｎｍ～約２４ｎｍ、例えば約２２．５ｎｍ～約２３．５ｎｍ、および約２２．５ｎｍ～約２３ｎｍである。本開示の１つの実施形態において、ＣｅＮＰｓの平均粒子径は、約２２．５ｎｍ、約２２．５１ｎｍ、約２２．５２ｎｍ、約２２．５３ｎｍ、約２２．５４ｎｍ、約２２．５５ｎｍ、約２２．５６ｎｍ、約２２．６ｎｍ、約２２．７ｎｍ、約２２．８ｎｍ、約２２．９ｎｍ、および約２３．０ｎｍである。

【0031】

本開示の１つの実施形態において、ＩＣＲマウスにＣｅＮＰｓを週に１～２回で治療することで、ヒトの治療期間を模擬し（ＩＣＲマウスにおける１週間の用量は、ヒトにおける３か月ごとの用量に相当し得る）、実験データは、ＣｅＮＰｓの投与がＵＣＰＰＳの予防又は治療に対して長期的な治療効果があることを示している。いくつかの好ましい実施形態において、ＣｅＮＰｓは２～４週間ごとに１回、３週間ごとに１回で、対象に投与される。

【0032】

以下の実施例は、当業者に完全な発明と、本発明のアッセイ、スクリーニング、および治療方法をどのように作成および使用するかについての説明を提供するために提示されており、本発明の範囲を発明者が自分たちの発明と見なすものに限定する意図がない。

【0033】

実施例

【0034】

ＣｅＮＰｓの合成と特性評価

【0035】

ＣｅＮＰｓは、以前に説明されているように、次の条件で合成された［４］：０．０３７５ｍｏｌ／ＬのＣｅ（ＮＯ_３）_３・６Ｈ_２Ｏ（９９．５％、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、ウォード・ヒル、マサチューセッツ州、米国）及び０．５ｍｏｌ／Ｌのヘキサメチレンテトラミン（ＨＭＴＡ）（９９．９％、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）の等量溶液を混合し、室温（２２±１℃）で２４時間攪拌した。次に、溶液を９，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して、ＣｅＮＰｓ沈積物を取得した。沈積物を脱イオン水とエタノール（９５％、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）で２回洗浄した。

【0036】

ＣｅＮＰｓの形態と粒子径は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）（日立Ｓ－４８００電界放射型走査電子顕微鏡とエネルギー分散型Ｘ線分光計ＱＵＡＮＴＡＸ Ａｎｎｕｌａｒ ＸＦｌａｓｈ(登録商標）ＱＵＡＤ ＦＱ５０６０、日立、東京、日本）を使用し、１０ｋＶの動作電圧で測定した。ＣｅＮＰｓのＳＥＭ画像（ｎ＝１０）をＮａｎｏ Ｍｅａｓｕｒｅ １．２．５ソフトウェア（国立成功大学、台南、台湾）で分析し、ＣｅＮＰｓの平均粒子径を算出した。ＳＥＭによる形態分析には、付属のアクセサリーＥＤＸ（ＱＵＡＮＴＡＸ ａｎｎｕｌａｒＸｆｌａｓｈ(登録商標）、ＱＵＡＤ ＦＱ５０６０）を使用して、サンプルの元素組成を分析した。ＣｅＮＰｓのＳＥＭ画像は、２００，０００×倍率で観察された（スケールバー２００ｎｍ）。

【0037】

ＣｅＮＰｓの結晶粒子径と平面間間隔は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を使用して分析された。ＣｅＮＰｓを９５％エタノールに分散させ、超音波で１０分間分散させた後、銅グリッド上に２～１０μＬ滴下させ、空気乾燥させた。ナノ粒子の結晶粒子径分布は、ＴＥＭを使用して研究された（Ｊｅｏｌ ２０１０Ｆ、Ｊｅｏｌ、東京、日本）。結晶の平面間間隔、結晶粒子径（ｎ＝１０）、及び選択された領域電子回折パターンは、ＤｉｇｉｔａｌＭｉｃｒｏｇｒａｐｈ ３ソフトウェア（Ｇａｔａｎ Ｉｎｃ．、プレザントン、カリフォルニア州、米国）を使用して測定かつ分析した。

【0038】

ＣｅＮＰｓの流体力学的サイズは、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏｚｓ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ウスターシャー、英国）及び動的光散乱法（ＤＬＳ）を使用して特性評価した。散乱光の強度は、入射ビームに対して９０°で検出された。合成されたＣｅＮＰｓの異なる溶媒への分散性を確認するために、ＣｅＮＰｓを二重蒸留水に分散させ、１０分間超音波分散させ、２５℃で測定した（ｎ＝３）。取得したデータは、メーカー提供のフリーソフトウェア（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒソフトウェア）を使用して分析された。

【0039】

ＣｅＮＰｓの表面は、ＡｌＫα線源を使用するＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）（シータプローブ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州、米国）で特性評価して、セリウムの酸化状態を特定し、ＣＥ^３＋／ＣＥ^４＋比を定量化した。取得したデータは、ＸＰＳＰＥＡＫ４１ソフトウェア［５］に入力して、ピークフィッティングを処理した。

【0040】

ＣｅＮＰｓの特性評価

【0041】

Ｎａｎｏ Ｍｅａｓｕｒｅｒソフトウェアを使用することで、平均粒子径は２２．５３ｎｍ（ｎ＝１０）であることがわかった（図１Ａ）。二重蒸留水中のＣｅＮＰｓの流体力学的サイズ分布は９３．２ｎｍであり、ＰｄＩは０．２５であった（図１Ｂ）。ＣｅＮＰｓの高解像度ＴＥＭ画像は、（１１１）及び（２００）結晶面に関連する格子フリンジとｄ間隔を示し、それはＣｅＮＰｓの形態と同等であった（図１Ｃ）。ＸＰＳでは、それぞれの結合エネルギーで、Ｃｅ^３＋（図１Ｄの矢印で示される２、３、８番目のピーク）とＣｅ^４＋（図１Ｄの矢印で示される１、４～７番目のピーク）に対応する化学結合ピークを示した。８７５ｅＶと８９５ｅＶの間のピークはＣｅ３ｄ_５／２に対応し、８９５ｅＶと９１０ｅＶの間のピークはＣｅ３ｄ_３／２の縮退準位（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｌｅｖｅｌ）に対応する。８７５．１００、９００．６５０、及び９０９．０００ｅＶに位置するデコンボリューションピークは、Ｃｅ^３＋の酸化状態に対応する。８８１．２４０、８９０．９００、８９３．４００、８９７．３００、及び９１５．５５０ｅで観測されたデコンボリューションピークは、セリウムイオンのＣｅ^４＋状態に起因する可能性がある。

【0042】

ＣＹＰ誘発性膀胱炎マウスにおけるＣｅＮＰｓ治療の評価のタイムライン

【0043】

表１は、生体内でのＣｅＮＰｓの効果をテストするためのタイムラインである。ＩＣＲマウスは、４つの群（対照群、ＣＹＰ群、ＣｅＮＰｓ前処理群、及びＣｅＮＰｓ後処理群）に分けた。各群に８匹のマウスがあった。対照群を除き、ＩＣＲマウスに８０ｍｇ／ｋｇの用量でＣＹＰを腹腔内投与し、７、９、１１、１３日目に膀胱炎を誘導させた。ＣｅＮＰ前処理群では、０日目と４日目に３０ｍｇ／ｋｇのＣｅＮＰをマウスに腹腔内注射した。代わりに、対照群とＣＹＰ群のマウスに０日目と４日目にＰＢＳを注射した。ＣｅＮＰｓ後処理群では、８日目と１３日目に腹腔内注射でマウスに３０ｍｇ／ｋｇのＣｅＮＰｓを投与した。１４日目に、すべてのマウスを犠牲にする前に、機械的感受性試験と排尿スポットアッセイを実施した。ＣＯ_２安楽死の後、マウスの膀胱を採取し、液体窒素で凍結して、さらなる組織学的及び生化学的分析を行った。

【0044】

【表1】

【0045】

実施例１：ヒト尿路上皮Ｔ２４細胞の生存率、ＣｅＮＰｓ治療、及び細胞内ＲＯＳ測定に対する４－ＨＣの影響

【0046】

ヒト尿路上皮Ｔ２４細胞（＃６００６２、ＢＣＲＣ、台湾）は、１．５ｍＭのＬ－グルタミン、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清、及び１％（ｖ／ｖ）ＰＳを有する９０％マッコイ５ａ培地（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州、米国）で培養した。細胞は５％ＣＯ_２を含む加湿インキュベーターで３７℃に維持され［６］、また、細胞の酸化ストレスを誘導するために４－ＨＣを使用した。Ｔ２４細胞を１０^４細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種し、完全に接着するまで２４時間インキュベートした。処理されたＴ２４細胞のウェルでは、さまざまな濃度のＣｅＮＰｓを培地に添加し、さらに２４時間インキュベートした。次に、さまざまな濃度の４－ＨＣ（０、１２．５、２５、３７．５、５０、７５、及び１００μＭ）を培地に添加し、４時間インキュベートした。Ｔ２４細胞の生存率は、４－ヒドロペルオキシシクロホスファミド（４－ＨＣ）処理により低下し、細胞内活性酸素種（ＲＯＳ）の生成が誘導された。３７．５μＭの濃度で、４－ＨＣは細胞生存率を５０％（ＩＣ５０）に低下させ、その後の実験の誘導濃度として選択された（図２Ａ）。４－ＨＣ誘導の前に、異なる濃度のＣｅＮＰｓが適用された。一連の実験の後、５μｇ／ｍＬのＣｅＮＰｓの濃度は、４－ＨＣによって低下した細胞生存率を効果的に変えることができた（図２Ｂ）。

【0047】

４－ＨＣ誘導の細胞酸化ストレス応答に対するＣｅＮＰｓの阻害効果を確認するために、ジクロロジドリフルオレセインジアセテート（ＤＣＦＤＡ）アッセイを使用し、Ｔ２４細胞を４つの条件下で培養した。（１）対照群；（２）３７．５μＭの４－ＨＣに４時間存在して、細胞酸化ストレスを誘導する；（３）３７．５μＭの４－ＨＣでの４時間誘導する前に、５μｇ／ｍＬのＣｅＮＰｓに２４時間存在する；（４）５μｇ／ｍＬのＣｅＮＰｓのみに２４時間存在する。緑色蛍光（ＤＣＦ）の量は、細胞内ＲＯＳ含有量と正の相関がある。ＣｅＮＰｓは、４－ＨＣ誘導の細胞酸化ストレス応答に対する阻害効果があった（図２Ｃ）。

【0048】

総ＲＮＡはＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールバッド、カリフォルニア州、米国）を使用して、細胞から抽出した。ＧＡＰＤＨは内因性対照として利用された。ｃＤＮＡは、ランダムヘキサマーとポリ（ＤＴ）プライマーを使用し、ＳｅｎｓｉＦＡＳＴ ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏｌｉｎｅ、ロンドン、英国）により合成された。ＰＣＲは、ｑＰＣＲシステム（Ｓｔｅｐｏｎｅ（登録商標）ソフトウェアｖ２．２）を使用して実行された。各サンプルは、標的遺伝子と内因性対照の両方について３連で分析された。３連の平均ＣＴ値がさらなる分析に使用された。各サンプルからの標的遺伝子のＣｔ値は、その内因性対照に対して正規化され、２^{－ΔΔＣｔ}法を使用して相対的な遺伝子発現値に変換された。ｑＰＣＲプライマー（５’-３’）を表２に示す。ｑＰＣＲの結果を図２Ｄに示す。ＩＬ－６及びＴＮＦαは４－ＨＣによって有意にアップレギュレートされたが、それらはＣｅＮＰｓ＋４－ＨＣ群でダウンレギュレートされた。ＣｅＮＰｓ群では、細胞は過剰な炎症関連遺伝子の発現を示さず、５μｇ／ｍＬのＣｅＮＰｓを２４時間適用しても細胞に炎症が引き起こさないことを確認した。

【0049】

【表2】

【0050】

実施例２：機械的感受性試験

【0051】

機械的感受性は、Ｓｅｍｍｅｓ－Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎモノフィラメント（ＵｇｏＢａｓｉｌｅ、コメリオ、イタリア）を使用して評価された。マウスは、ステンレス鋼ワイヤーグリッドの床を備えた個々のケージでテストされた。刺激は、膀胱の共通領域である下腹部に限定され、脱感作を防ぐためにこの領域内側で別々の領域で実行された。モノフィラメント刺激に対する陽性反応として、３種類の行動を認めた。１）ジャンプする、２）モノフィラメント刺激領域を直ちに舐めあるいは引っ掻く、又は３）腹部を急激に収縮する。各モノフィラメントは、５秒の刺激間間隔で１～２秒間適用された。「アップアンドダウン（ｕｐ ａｎｄ ｄｏｗｎ）」方法を使用して、５０％の閾値（Ｔ５０）を決定した。最も信頼できる閾値の計算に基づいて、異なるフィラメントを使用した６回の連続した試みが必要であった［７］。式：Ｔ５０＝Ｘｆ＋ｋｄ（Ｘｆは最後に使用したモノフィラメントを表し、ｋはディクソンのテーブル係数を表し、ｄはフィラメント間隔の平均を表す）を適用して、Ｔ５０を決定した。ＣＹＰ誘発性膀胱炎の動物は、痛み閾値の減少を示し（群ごとにｎ＝３、＊Ｐ＜０．０５）、これはＣｅＮＰｓ前処理群で緩和された。（群ごとにｎ＝３、＊Ｐ＜０．０５）（図３Ａ）。

【0052】

実施例３：ボイドスポットアッセイ

【0053】

犠牲の日に、マウスはろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ Ｎｏ．１、ＡＷ１００１－００９１７、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州、米国）上の個々の金網底ケージに入れられ、静かな部屋で３時間静置し、食物と水は制限されてった［８］。ろ紙を回収して乾燥させ、３６５ｎｍの紫外線下で、ＦｌｕｏｒＣｈｅｍデジタルイメージングシステム（Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ Ｌｅａｒｄｒｏ、カリフォルニア州、米国）を使用して、画像化した。体積は、スポットの面積をキャリブレーション曲線と比較することによって計算された。ボイドスポットの面積と数はＶｏｉｄ ＷｈｉｚｚａｒｄとＩｍａｇｅＪを使用して画像を分析することにより算出した［９］。ＣＹＰ誘発性膀胱炎の動物では、排尿頻度の増加を示し（群ごとにｎ＝３、＊Ｐ＜０．０５）。３ｃ）、これはＣｅＮＰｓ前処理群で緩和された（群ごとにｎ＝３、＊Ｐ＜０．０５）（図３Ｂおよび３Ｃ）。

【0054】

実施例４：ＣＹＰ誘発性膀胱炎後のマウス膀胱の組織学的変化とＣｅＮＰｓ前処理による保護効果

【0055】

ＣＯ_２安楽死の後、マウスの膀胱を取り出し、液体窒素で凍結した標識チューブに入れ、さらなる組織化学的及び生化学的分析のために－８０℃で保存した。グロスの形態学的変化を評価するために、膀胱断面（厚さ１６μｍ）を標準的なヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）プロトコルを使用して染色した。それらは、改良されたハリスヘマトキシリン（Ｈａｒｒｉｓ Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）溶液に４分間置き、エオシン（Ｅｏｓｉｎ）Ｙ溶液（アルコール）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に１分間置いた。

【0056】

各膀胱は、膀胱のドームを切除し、内側の空洞がはっきりと見えるように切片化した。各スライドに８つの切片を持つ８枚のスライド（すべてＨ＆Ｅ用）が収集された。この切片は、膀胱の最も厚い中央部分を表している。以前の研究では、巨視的なレベルでは、ＣＹＰで処理された動物からの尿袋（Ｕｒｉｎａｒｙ ｂｌａｄｄｅｒ）は、浮腫スコアに基づいて対照群と比較して、尿路上皮下の厚さが増加することが示された［１０］。ＳＥＭでは、サンプルを２．５％リン酸緩衝グルタルアルデヒド（０．１ｍ ｐＨ７．４）で２４時間固定し、１％のＯｓＯ_４で１時間後固定し、段階的アルコールシリーズで脱水し、酢酸アミルに入れ、臨界点乾燥機で液体ＣＯ_２で加圧乾燥し、金粒子で覆った。

【0057】

巨視的なレベルでは、ＣＹＰで処理された動物の尿袋は、対照群と比較してより多くの浮腫と出血を示した。さらに、ＣＹＰで処理された動物では、対照群と比較して、尿路上皮下の厚さの増加が観察された［１０］（図４Ａ及び４Ｂ）。これらのサンプルはＳＥＭを使用して観察された。Ｈ＆Ｅ染色により、ＣＹＰ誘発性膀胱炎を起こした動物の尿袋は、対照群（ＣＴＬ）及びＣｅＮＰｓ前処理群と比較して、尿路上皮膜の完全性が失われ、尿路上皮がほぼ完全に剥離していたことが明らかになった（図４Ｃ）。ＣＹＰ群の膀胱のみが、白っぽい矢印で示される不完全な粘膜と裸の尿路上皮細胞を示している。ＣＹＰ群では、露出した尿路上細胞（矢印）が観察された。対照群及びＣｅＮＰｓ前処理群では、完全な細胞膜構造（矢印）が特定された。

【0058】

実施例５：ウエスタンブロッティングを使用したセルピンＢ２、ＣＸＣＬ１０、及びヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ－１）の発現レベルの分析

【0059】

セルピンＢ２、ＣＸＣＬ１０、及びＨＯ－１の発現は、ウェスタンブロッティングを使用して分析された。一次抗体、抗セルピンＢ２（＃ａｂ２６９２７５、アブカム（Ａｂｃａｍ）、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国）、抗ＣＸＣＬ１０（＃ａｂ９９３８、アブカム）、抗ＨＯ－１（＃ａｂ１３２４８、アブカム）、及び抗β－アクチン（＃２６２７６、ＧｅｎｅＴｅｘ、アーバイン、カリフォルニア州、米国）を１：７，０００希釈で、４℃で一晩インキュベートした。次に、メンブレンを洗浄バッファーで３０分間３回洗浄した後、二次抗ウサギ（＃２１３１１０－０１、ＧｅｎｅＴｅｘ）又は抗マウス（＃２１３１１０－０１、ＧｅｎｅＴｅｘ）ＩｇＧ抗体の１：６，０００希釈液とともに３７℃で１時間インキュベートした。最後に、膜をイモビロンウエスタンケミルミネッセンスＨＲＰ基質（ＷＢＫＬＳ０５００、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ビレリカ、マサチューセッツ州、米国）で洗浄し、ルミネセンスイメージングシステム（モデル：Ｍ３－８０６８；Ｈａｎｓｏｒ、台中、台湾）を使用してタンパク質バンドを分析した。

【0060】

ウエスタンブロットでは、対照群及びＣｅＮＰｓ前処理群で観察された動物と比較して、ＣＹＰで処理された動物の尿袋におけるセルピンｂ２、Ｃｘｃｌ１０、及びＨＯ－１のレベルの増加を示し（図５）、ｑＰＣＲの結果は、対照群およびＣｅＮＰｓ前処理群で観察された動物と比較して、ＣＹＰで処理された動物の膀胱におけるセルピンＢ２、ＣＸＣＬ１０、ＩＲＦ７、ＩＲＦ９、ＩＬ－６、およびＴＮＦαのｍＲＮＡレベルの増加を示す（図７）。同様の結果は、ＣｅＮＰｓ後処理群でも確認できた。ＣｅＮＰｓ後処理群におけるＨＯ－１のレベルは、ＣＹＰ群のレベルよりも有意に低かった（図６）。

【0061】

まとめると、本開示は、それを必要とする対象にＣｅＮＰｓを投与することによって、ＵＣＰＰＳを予防又は治療する方法を提供する。ＣｅＮＰｓの投与は、対象の膀胱における酸化ストレス及び炎症を克服するだけでなく、対象において鎮痛効果及び排尿頻度を減少させる効果ももたらした。さらに、ＵＣＰＰＳの既存の治療法と比較して、本開示の方法は、長期的な効果、低コスト、より少ない有害な副作用、及び最小限の侵襲性を有する。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

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