(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023180566
(43)【公開日】2023-12-21
(54)【発明の名称】エルゴチオネイン誘導体の製造方法
(51)【国際特許分類】
C07D 233/84 20060101AFI20231214BHJP
【ＦＩ】
C07D233/84 CSP
【審査請求】未請求
【請求項の数】16
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022093964
(22)【出願日】2022-06-09
(71)【出願人】
【識別番号】000214272
【氏名又は名称】長瀬産業株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100150500
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 靖
(74)【代理人】
【識別番号】100176474
【弁理士】
【氏名又は名称】秋山 信彦
(72)【発明者】
【氏名】小坂 邦男
(72)【発明者】
【氏名】松山 恵介
(57)【要約】 （修正有）
【課題】エルゴチオネイン誘導体を製造するための効率的な方法の提供。
【解決手段】式（ＩＩ）で示される化合物またはその塩から出発し、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を製造する方法である。
【選択図】なし
【解決手段】式（ＩＩ）で示される化合物またはその塩から出発し、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を製造する方法である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記一般式（Ｉ）：
［式中、
Ｒ１はＣ１－Ｃ６アルキレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン－Ｃ１－Ｃ６アルキレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－５～１１員ヘテロアリーレン基；またはＣ１－Ｃ６アルキレン－５～１１員ヘテロアリーレン－Ｃ１－Ｃ６アルキレン基を示し；
Ｒ２は水素原子、またはカルボキシ基もしくはその誘導体を示す］
で示される化合物またはその塩を製造する方法であって、
（工程１）下記式（ＩＩ）：
で示される化合物またはその塩を下記一般式（ＩＩＩ）：
［式中、Ｘ１はハロゲン原子を示す］
で示される化合物と反応させて下記式（ＩＶ）：
で示される化合物またはその塩を製造する工程；
（工程２）式（ＩＶ）で示される化合物またはその塩を下記一般式（Ｖ）：
［式中、Ｘ２はハロゲン原子を示し；その他の記号は前記と同じ意味を示す］
で示される化合物またはその塩と反応させて下記一般式（ＶＩ）：
［式中、記号は前記と同じ意味を示す］
で示される化合物またはその塩を製造する工程；および
（工程３）式（ＶＩ）で示される化合物またはその塩のフェナシル基を脱保護反応に付し、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を製造する工程
を含む、製造方法。
【化1】
Ｒ１はＣ１－Ｃ６アルキレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン－Ｃ１－Ｃ６アルキレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－５～１１員ヘテロアリーレン基；またはＣ１－Ｃ６アルキレン－５～１１員ヘテロアリーレン－Ｃ１－Ｃ６アルキレン基を示し；
Ｒ２は水素原子、またはカルボキシ基もしくはその誘導体を示す］
で示される化合物またはその塩を製造する方法であって、
（工程１）下記式（ＩＩ）：
【化2】
【化3】
で示される化合物と反応させて下記式（ＩＶ）：
【化4】
（工程２）式（ＩＶ）で示される化合物またはその塩を下記一般式（Ｖ）：
【化5】
で示される化合物またはその塩と反応させて下記一般式（ＶＩ）：
【化6】
で示される化合物またはその塩を製造する工程；および
（工程３）式（ＶＩ）で示される化合物またはその塩のフェナシル基を脱保護反応に付し、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を製造する工程
を含む、製造方法。
【請求項2】
Ｒ２がカルボキシ基の誘導体である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項3】
カルボキシ基の誘導体をカルボキシ基に変換する工程をさらに含む、請求項２に記載の製造方法。
【請求項4】
工程１が水を含む溶媒中で実施される、請求項１～３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項5】
工程２が溶媒中、塩基の存在下で実施される、請求項１～３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項6】
塩基が炭酸水素ナトリウムである、請求項５に記載の製造方法。
【請求項7】
Ｒ１がＣ１－Ｃ６アルキレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン基；またはＣ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン－Ｃ１－Ｃ６アルキレン基である、請求項１～３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項8】
Ｒ１がＣ１－Ｃ３アルキレン基；Ｃ１－Ｃ３アルキレン－フェニレン基；またはＣ１－Ｃ３アルキレン－フェニレン－Ｃ１－Ｃ３アルキレン基である、請求項１～３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項9】
Ｘ１およびＸ２がそれぞれ臭素原子である、請求項１～３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項10】
下記一般式（Ｉ）：
［式中、
Ｒ１はＣ１－Ｃ６アルキレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン－Ｃ１－Ｃ６アルキレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－５～１１員ヘテロアリーレン基；またはＣ１－Ｃ６アルキレン－５～１１員ヘテロアリーレン－Ｃ１－Ｃ６アルキレン基を示し；
Ｒ２は水素原子、またはカルボキシ基もしくはその誘導体を示す］
で示される化合物またはその塩。
【化7】
Ｒ１はＣ１－Ｃ６アルキレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン－Ｃ１－Ｃ６アルキレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－５～１１員ヘテロアリーレン基；またはＣ１－Ｃ６アルキレン－５～１１員ヘテロアリーレン－Ｃ１－Ｃ６アルキレン基を示し；
Ｒ２は水素原子、またはカルボキシ基もしくはその誘導体を示す］
で示される化合物またはその塩。
【請求項11】
Ｒ２がカルボキシ基である、請求項１０に記載の化合物またはその塩。
【請求項12】
Ｒ１がＣ１－Ｃ６アルキレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン基；またはＣ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン－Ｃ１－Ｃ６アルキレン基である、請求項１０または１１に記載の化合物またはその塩。
【請求項13】
Ｒ１がＣ１－Ｃ３アルキレン基；Ｃ１－Ｃ３アルキレン－フェニレン基；またはＣ１－Ｃ３アルキレン－フェニレン－Ｃ１－Ｃ３アルキレン基である、請求項１０または１１に記載の化合物またはその塩。
【請求項14】
【化8】
【化9】
【化10】
【請求項15】
請求項１１または１４に記載の化合物またはその塩とタンパク質が結合したコンジュゲート。
【請求項16】
請求項１１または１４に記載の化合物またはその塩と結合したビーズ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、エルゴチオネイン誘導体の製造方法、新規エルゴチオネイン誘導体、およびその用途に関する。
【背景技術】
【0002】
エルゴチオネイン（以下、ＥＧＴとも称する）は以下の構造で示される天然アミノ酸の一種であり、一部の微生物のみが生産することができることが知られている。ＥＧＴは強力な抗酸化作用を有することから、食品、化粧品、および医薬品などの幅広い分野での利用が期待されている（例えば、特許文献１参照）。近年の研究で、ヒトにはＥＧＴを利用するための仕組みが備わっていることが明らかになり、食事から摂取したＥＧＴが脳機能の改善、皮膚、眼、および各種臓器における酸化ストレスから細胞を保護することが示唆されている。
【化1】
【0003】
ＥＧＴの高い生理活性を説明できるメカニズムが解明されれば、ＥＧＴの効果的な利用が促進されることが期待される。しかしながら、これまでに、そのメカニズムは十分に解明されていない。そのメカニズム解明に強力なツールとなる可能性があるのがＥＧＴの誘導体である。例えば、ビーズに結合したＥＧＴ誘導体はＥＧＴ結合性物質のプローブとなり、ＥＧＴに特異的に結合するタンパク質を検出することができる。また、ＥＧＴが誘導体化できれば、ＥＧＴをハプテンとした免疫原作成が可能となる。これにより、抗ＥＧＴ抗体が得られれば、細胞内のどこにＥＧＴが局在しているのかを可視化分析できる可能性がある。
【0004】
しかしながら、（１）ＥＧＴは水がないと溶解せず、（２）ＥＧＴのカルボキシラート基はベタイン構造のため反応性が乏しく、（３）チオイミダゾールの硫黄原子は反応性（求核性）が高いため、この部分を保護しなければ他の反応ができない等、ＥＧＴ誘導体化には多くの課題があり、これまでにＥＧＴの誘導体を製造するための効率的な方法は確立されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特開２００９－１２６８６３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、ＥＧＴの誘導体を製造するための効率的な方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、ＥＧＴの誘導体を製造するための効率的な方法について鋭意研究を重ねた結果、ＥＧＴのチオイミダゾールの硫黄原子をフェナシル基で保護することにより、ＥＧＴのエステル誘導体を効率よく製造することができることを見出し、本発明を完成させた。
【0008】
本発明は、以下を提供する。
［１］
下記一般式（Ｉ）：
［式中、
Ｒ１はＣ１－Ｃ６アルキレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン－Ｃ１－Ｃ６アルキレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－５～１１員ヘテロアリーレン基；またはＣ１－Ｃ６アルキレン－５～１１員ヘテロアリーレン－Ｃ１－Ｃ６アルキレン基を示し；
Ｒ２は水素原子、またはカルボキシ基もしくはその誘導体を示す］
で示される化合物またはその塩を製造する方法であって、
（工程１）下記式（ＩＩ）：
で示される化合物またはその塩を下記一般式（ＩＩＩ）：
［式中、Ｘ１はハロゲン原子を示す］
で示される化合物と反応させて下記式（ＩＶ）：
で示される化合物またはその塩を製造する工程；
（工程２）式（ＩＶ）で示される化合物またはその塩を下記一般式（Ｖ）：
［式中、Ｘ２はハロゲン原子を示し；その他の記号は前記と同じ意味を示す］
で示される化合物またはその塩と反応させて下記一般式（ＶＩ）：
［式中、記号は前記と同じ意味を示す］
で示される化合物またはその塩を製造する工程；および
（工程３）式（ＶＩ）で示される化合物またはその塩のフェナシル基を脱保護反応に付し、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を製造する工程
を含む、製造方法（以下、本発明製造方法とも称する）。
［２］
Ｒ２がカルボキシ基の誘導体である、［１］に記載の製造方法。
［３］
カルボキシ基の誘導体をカルボキシ基に変換する工程をさらに含む、［２］に記載の製造方法。
［４］
工程１が水を含む溶媒中で実施される、［１］～［３］のいずれか１つに記載の製造方法。
［５］
工程２が溶媒中、塩基の存在下で実施される、［１］～［４］のいずれか１つに記載の製造方法。
［６］
塩基が炭酸水素ナトリウムである、［５］に記載の製造方法。
［７］
Ｒ１がＣ１－Ｃ６アルキレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン基；またはＣ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン－Ｃ１－Ｃ６アルキレン基である、［１］～［６］のいずれか１つに記載の製造方法。
［８］
Ｒ１がＣ１－Ｃ３アルキレン基；Ｃ１－Ｃ３アルキレン－フェニレン基；またはＣ１－Ｃ３アルキレン－フェニレン－Ｃ１－Ｃ３アルキレン基である、［１］～［７］のいずれか１つに記載の製造方法。
［９］
Ｘ１およびＸ２がそれぞれ臭素原子である、［１］～［８］のいずれか１つに記載の製造方法。
［１０］
下記一般式（Ｉ）：
［式中、
Ｒ１はＣ１－Ｃ６アルキレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン－Ｃ１－Ｃ６アルキレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－５～１１員ヘテロアリーレン基；またはＣ１－Ｃ６アルキレン－５～１１員ヘテロアリーレン－Ｃ１－Ｃ６アルキレン基を示し；
Ｒ２は水素原子、またはカルボキシ基もしくはその誘導体を示す］
で示される化合物（以下、本発明化合物とも称する）またはその塩。
［１１］
Ｒ２がカルボキシ基である、［１０］に記載の化合物またはその塩。
［１２］
Ｒ１がＣ１－Ｃ６アルキレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン基；またはＣ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン－Ｃ１－Ｃ６アルキレン基である、［１０］または［１１］に記載の化合物またはその塩。
［１３］
Ｒ１がＣ１－Ｃ３アルキレン基；Ｃ１－Ｃ３アルキレン－フェニレン基；またはＣ１－Ｃ３アルキレン－フェニレン－Ｃ１－Ｃ３アルキレン基である、［１０］または［１１］に記載の化合物またはその塩。
［１４］
および
からなる群から選択される、［１０］に記載の化合物またはその塩。
［１５］
［１１］または［１４］に記載の化合物またはその塩とタンパク質が結合したコンジュゲート。
［１６］
［１１］または［１４］に記載の化合物またはその塩と結合したビーズ。
［１］
下記一般式（Ｉ）：
【化2】
Ｒ１はＣ１－Ｃ６アルキレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン－Ｃ１－Ｃ６アルキレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－５～１１員ヘテロアリーレン基；またはＣ１－Ｃ６アルキレン－５～１１員ヘテロアリーレン－Ｃ１－Ｃ６アルキレン基を示し；
Ｒ２は水素原子、またはカルボキシ基もしくはその誘導体を示す］
で示される化合物またはその塩を製造する方法であって、
（工程１）下記式（ＩＩ）：
【化3】
【化4】
で示される化合物と反応させて下記式（ＩＶ）：
【化5】
（工程２）式（ＩＶ）で示される化合物またはその塩を下記一般式（Ｖ）：
【化6】
で示される化合物またはその塩と反応させて下記一般式（ＶＩ）：
【化7】
で示される化合物またはその塩を製造する工程；および
（工程３）式（ＶＩ）で示される化合物またはその塩のフェナシル基を脱保護反応に付し、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を製造する工程
を含む、製造方法（以下、本発明製造方法とも称する）。
［２］
Ｒ２がカルボキシ基の誘導体である、［１］に記載の製造方法。
［３］
カルボキシ基の誘導体をカルボキシ基に変換する工程をさらに含む、［２］に記載の製造方法。
［４］
工程１が水を含む溶媒中で実施される、［１］～［３］のいずれか１つに記載の製造方法。
［５］
工程２が溶媒中、塩基の存在下で実施される、［１］～［４］のいずれか１つに記載の製造方法。
［６］
塩基が炭酸水素ナトリウムである、［５］に記載の製造方法。
［７］
Ｒ１がＣ１－Ｃ６アルキレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン基；またはＣ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン－Ｃ１－Ｃ６アルキレン基である、［１］～［６］のいずれか１つに記載の製造方法。
［８］
Ｒ１がＣ１－Ｃ３アルキレン基；Ｃ１－Ｃ３アルキレン－フェニレン基；またはＣ１－Ｃ３アルキレン－フェニレン－Ｃ１－Ｃ３アルキレン基である、［１］～［７］のいずれか１つに記載の製造方法。
［９］
Ｘ１およびＸ２がそれぞれ臭素原子である、［１］～［８］のいずれか１つに記載の製造方法。
［１０］
下記一般式（Ｉ）：
【化8】
Ｒ１はＣ１－Ｃ６アルキレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン－Ｃ１－Ｃ６アルキレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－５～１１員ヘテロアリーレン基；またはＣ１－Ｃ６アルキレン－５～１１員ヘテロアリーレン－Ｃ１－Ｃ６アルキレン基を示し；
Ｒ２は水素原子、またはカルボキシ基もしくはその誘導体を示す］
で示される化合物（以下、本発明化合物とも称する）またはその塩。
［１１］
Ｒ２がカルボキシ基である、［１０］に記載の化合物またはその塩。
［１２］
Ｒ１がＣ１－Ｃ６アルキレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン基；またはＣ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン－Ｃ１－Ｃ６アルキレン基である、［１０］または［１１］に記載の化合物またはその塩。
［１３］
Ｒ１がＣ１－Ｃ３アルキレン基；Ｃ１－Ｃ３アルキレン－フェニレン基；またはＣ１－Ｃ３アルキレン－フェニレン－Ｃ１－Ｃ３アルキレン基である、［１０］または［１１］に記載の化合物またはその塩。
［１４］
【化9】
【化10】
【化11】
［１５］
［１１］または［１４］に記載の化合物またはその塩とタンパク質が結合したコンジュゲート。
［１６］
［１１］または［１４］に記載の化合物またはその塩と結合したビーズ。
【発明の効果】
【0009】
本発明製造方法により、ＥＧＴの誘導体を効率的に製造することができる。また、本発明化合物は、ＥＧＴの高い生理活性を説明できるメカニズムの解明に有用である。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本発明の態様および実施態様について、以下に説明する。なお、本明細書中、「式（Ｉ）で示される化合物」等を便宜上、それぞれ「化合物（Ｉ）」等ともいう。以下に定義または例示される各種の置換基は、任意に選択して組み合わせることができる。また、以下に定義される各態様および実施態様を任意に選択して組み合わせた態様および実施態様も本発明に包含される。
【0011】
本明細書において用いる各用語の定義は以下の通りである。
【0012】
本明細書記載の「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子を意味する。
【0013】
置換基が２以上のハロゲン原子または置換基で置換されている場合、それらのハロゲン原子または置換基は、各々同一でも異なっていてもよい。
【0014】
本明細書記載の「ＣＸ－ＣＹ」との表記は、炭素原子数がＸ～Ｙ個であることを意味する。例えば「Ｃ１－Ｃ６」との表記は、炭素原子数が１～６個であることを意味する。
【0015】
本明細書記載の「鎖式炭化水素基」とは、アルキル基、アルケニル基、またはアルキニル基を表す。
【0016】
本明細書記載の「アルキル基」とは、直鎖状または分岐状の飽和炭化水素基を意味する。アルキル基としては、例えばＣ１－Ｃ６アルキル基が挙げられ、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、１，１－ジメチルプロピル基、１，２－ジメチルプロピル基、１－エチルプロピル基、ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、およびヘキシル基等が挙げられる。
【0017】
本明細書記載の「アルケニル基」とは、前記で定義したアルキル基の鎖中に１個以上の２重結合（－Ｃ＝Ｃ－）を含む直鎖状または分岐状の不飽和炭化水素基を意味する。アルケニル基としては、例えばＣ２－Ｃ６アルケニル基が挙げられ、具体的にはビニル基、１－プロペニル基、２－プロペニル基、１－メチル－１－プロペニル基、１－メチル－２－プロペニル基、１，２－ジメチル－１－プロペニル基、１－エチル－２－プロペニル基、３－ブテニル基、４－ペンテニル基、および５－ヘキセニル基等が挙げられる。
【0018】
本明細書記載の「アルキニル基」とは、前記で定義したアルキル基の鎖中に１個以上の３重結合（－Ｃ≡Ｃ－）を含む直鎖状または分岐状の不飽和炭化水素基を意味する。アルキニル基としては、例えばＣ２－Ｃ６アルキニル基が挙げられ、具体的にはエチニル基、１－プロピニル基、２－プロピニル基、１－メチル－２－プロピニル基、１，１－ジメチル－２－プロピニル基、１－エチル－２－プロピニル基、２－ブチニル基、４－ペンチニル基、および５－ヘキシニル基等が挙げられる。
【0019】
本明細書記載の「アルキレン基」とは、上記「アルキル基」の任意の水素原子１個を除去した二価基を意味する。アルキレン基としては、例えばＣ１－Ｃ６アルキレン基、Ｃ１－Ｃ４アルキレン基、Ｃ１－Ｃ３アルキレン基、およびＣ１－Ｃ２アルキレン基等が挙げられ、具体的にはメチレン基、エチレン基、メチルメチレン基、トリメチレン基、エチルメチレン基、ジメチルメチレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基、およびヘキサメチレン基等が挙げられる。
【0020】
本明細書記載の「アリール基」とは、単環式または二環式の芳香族炭化水素から１個の水素原子を除去した基である。アリール基としては、例えば６～１２員アリール基が挙げられ、具体的にはフェニル基等の単環式アリール基；ならびにナフチル基、テトラヒドロナフチル基、インデニル基、およびインダニル基等の一部飽和されていてもよい二環式アリール基等の６～１１員アリール基等が挙げられる。
【0021】
本明細書記載の「アリーレン基」とは、単環式または二環式の芳香族炭化水素から２個の水素原子を除去した基である。アリーレン基としては、例えば６～１２員アリーレン基が挙げられ、具体的にはフェニレン基等の単環式アリーレン基；ならびにナフチレン基、テトラヒドロナフチレン基、インデニレン基、およびインダニレン基等の一部飽和されていてもよい二環式アリーレン基等の６～１１員アリーレン基等が挙げられる。
【0022】
本明細書記載の「ヘテロアリール基」とは、炭素原子以外に酸素原子、硫黄原子、および窒素原子から選ばれるヘテロ原子を含む単環式または二環式の芳香族複素環から１個の水素原子を除去した基である。ヘテロアリール基としては、例えば５～１１員ヘテロアリール基が挙げられ、具体的にはピロリル基、フリル基、チエニル基、ピラゾリル基、イミダゾリル基、オキサゾリル基、イソオキサゾリル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、チアジアゾリル基、ピリジル基、ピラジニル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基、およびトリアジニル基等の、炭素原子以外に酸素原子、硫黄原子、および窒素原子から選ばれるヘテロ原子を１～４個含む５～６員の単環式のヘテロアリール基；ならびにインドリル基、イソインドリル基、インダゾリル基、テトラヒドロインダゾリル基、ベンゾフラニル基、ジヒドロベンゾフラニル基、ジヒドロイソベンゾフラニル基、ベンゾチオフェニル基、ジヒドロベンゾチオフェニル基、ジヒドロイソベンゾチオフェニル基、ベンゾオキサゾリル基、ジヒドロベンゾオキサゾリル基、ベンゾチアゾリル基、ジヒドロベンゾチアゾリル基、キノリル基、テトラヒドロキノリル基、イソキノリル基、テトラヒドロイソキノリル基、ナフチリジニル基、テトラヒドロナフチリジニル基、キノキサリニル基、テトラヒドロキノキサリニル基、およびキナゾリニル基等の、炭素原子以外に酸素原子、硫黄原子、および窒素原子から選ばれるヘテロ原子を１～４個含む８～１１員の二環式のヘテロアリール基等が挙げられる。
【0023】
本明細書記載の「ヘテロアリーレン基」とは、炭素原子以外に酸素原子、硫黄原子、および窒素原子から選ばれるヘテロ原子を含む単環式または二環式の芳香族複素環から２個の水素原子を除去した基である。ヘテロアリーレン基としては、例えば５～１１員ヘテロアリーレン基が挙げられ、具体的にはピロリレン基、フリレン基、チエニレン基、ピラゾリレン基、イミダゾリレン基、オキサゾリレン基、イソオキサゾリレン基、チアゾリレン基、イソチアゾリレン基、チアジアゾリレン基、ピリジレン基、ピラジニレン基、ピリミジニレン基、ピリダジニレン基、およびトリアジニレン基等の、炭素原子以外に酸素原子、硫黄原子、および窒素原子から選ばれるヘテロ原子を１～４個含む５～６員の単環式のヘテロアリーレン基；ならびにインドリレン基、イソインドリレン基、インダゾリレン基、テトラヒドロインダゾリレン基、ベンゾフラニレン基、ジヒドロベンゾフラニレン基、ジヒドロイソベンゾフラニレン基、ベンゾチオフェニレン基、ジヒドロベンゾチオフェニレン基、ジヒドロイソベンゾチオフェニレン基、ベンゾオキサゾリレン基、ジヒドロベンゾオキサゾリレン基、ベンゾチアゾリレン基、ジヒドロベンゾチアゾリレン基、キノリレン基、テトラヒドロキノリレン基、イソキノリレン基、テトラヒドロイソキノリレン基、ナフチリジニレン基、テトラヒドロナフチリジニレン基、キノキサリニレン基、テトラヒドロキノキサリニレン基、およびキナゾリニレン基等の、炭素原子以外に酸素原子、硫黄原子、および窒素原子から選ばれるヘテロ原子を１～４個含む８～１１員の二環式のヘテロアリーレン基が挙げられる。
【0024】
本明細書記載の「Ｃ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン基」とは、上記のＣ１－Ｃ６アルキレン基と上記の６～１２員アリーレン基が結合した基である。Ｃ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン基としては、上記のＣ１－Ｃ６アルキレン基の定義で例示した基と６～１２員アリーレン基の定義で例示した基の任意の組み合わせで作成される基が挙げられ、例えばＣ１－Ｃ３アルキレン－フェニレン基等が挙げられる。
【0025】
本明細書記載の「Ｃ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン－Ｃ１－Ｃ６アルキレン基」とは、上記のＣ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン基と上記のＣ１－Ｃ６アルキレン基が結合した基である。Ｃ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン－Ｃ１－Ｃ６アルキレン基としては、上記のＣ１－Ｃ６アルキレン基の定義で例示した基と６～１２員アリーレン基の定義で例示した基の任意の組み合わせで作成される基が挙げられ、例えばＣ１－Ｃ３アルキレン－フェニレン－Ｃ１－Ｃ３アルキレン基等が挙げられる。この場合、フェニレン基上の２つのアルキレン基は互いにオルト位、メタ位、およびパラ位のいずれの位置関係であってもよいが、パラ位が好ましい。
【0026】
本明細書記載の「Ｃ１－Ｃ６アルキレン－５～１１員ヘテロアリーレン基」とは、上記のＣ１－Ｃ６アルキレン基と上記の５～１１員ヘテロアリーレン基が結合した基である。Ｃ１－Ｃ６アルキレン－５～１１員ヘテロアリーレン基としては、上記のＣ１－Ｃ６アルキレン基の定義で例示した基と５～１１員ヘテロアリーレンの定義で例示した基の任意の組み合わせで作成される基が挙げられ、例えばＣ１－Ｃ３アルキレン－ピリジレン基等が挙げられる。
【0027】
本明細書記載の「Ｃ１－Ｃ６アルキレン－５～１１員ヘテロアリーレン－Ｃ１－Ｃ６アルキレン基」とは、上記のＣ１－Ｃ６アルキレン－５～１１員ヘテロアリーレン基と上記のＣ１－Ｃ６アルキレン基が結合した基である。Ｃ１－Ｃ６アルキレン－５～１１員ヘテロアリーレン－Ｃ１－Ｃ６アルキレン基としては、上記のＣ１－Ｃ６アルキレン基の定義で例示した基と５～１１員ヘテロアリーレンの定義で例示した基の任意の組み合わせで作成される基が挙げられ、例えばＣ１－Ｃ３アルキレン－ピリジレン－Ｃ１－Ｃ３アルキレン基等が挙げられる。
【0028】
本明細書記載の「－Ｒ１－Ｒ２」で示される部分構造において、Ｒ２が水素原子である場合は、Ｒ１の末端のアルキレン基、アリーレン基、およびヘテロアリーレン基は当該水素原子と結合して、それぞれ対応するアルキル基、アリール基、およびヘテロアリール基となる。
【0029】
本明細書記載のカルボキシ基の誘導体とは、カルボキシ基が反応して生成する任意の化学種である。カルボキシ基の誘導体としてはアシル基、エステル基、およびアミド基等が挙げられ、例えばＣ（Ｏ）Ｒ３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ４、およびＣ（Ｏ）ＮＲ５Ｒ６（ここで、Ｒ３は鎖式炭化水素基を示し、Ｒ４は鎖式炭化水素基またはフェナシル基を示し、Ｒ５およびＲ６は、同一または相異なり、鎖式炭化水素基または水素原子を表す）で示される基等が挙げられ、Ｃ（Ｏ）ＯＲ４またはＣ（Ｏ）ＮＲ５Ｒ６で示される基が好ましく、Ｃ（Ｏ）ＯＲ４で示される基がより好ましい。
【0030】
本明細書記載の各化合物は、互変異性体の形態またはこれらの混合物で存在し得る。本明細書記載の各化合物は、エナンチオマーもしくはジアステレオマー等の立体異性体の形態、またはこれらの混合物で存在し得る。本明細書記載の各化合物は、互変異性体や立体異性体の混合物またはそれぞれ純粋な若しくは実質的に純粋な異性体を包含する。
【0031】
本明細書記載の各化合物がジアステレオマーまたはエナンチオマーの形態で存在する場合、これらを当該技術分野で慣用の方法、例えばクロマトグラフィーおよび分別結晶法等で分離することができる。
【0032】
本明細書記載の各化合物は、同位元素（例えば、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ等）等で標識された化合物及び重水素変換体を包含する。
【0033】
本明細書記載の各化合物は、遊離の形で存在してもよく、また塩の形で存在してもよい。塩としては、リチウム、ナトリウム、およびカリウム等のアルカリ金属塩；マグネシウムおよびカルシウム等の第２族金属塩；アルミニウムまたは亜鉛との塩；アンモニア、コリン、ジエタノールアミン、リジン、エチレンジアミン、ｔｅｒｔ－ブチルアミン、ｔｅｒｔ－オクチルアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、Ｎ－メチル－グルコサミン、トリエタノールアミン、およびデヒドロアビエチルアミン等のアミンとの塩；塩化水素、臭化水素、ヨウ化水素、硫酸、硝酸、およびリン酸等の無機酸との塩；ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、グルタル酸、アジピン酸、マンデル酸、パントテン酸、メチル硫酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、およびｐ－トルエンスルホン酸等の有機酸との塩；またはアスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、およびリジン等のアミノ酸等との塩が挙げられる。
【0034】
さらに、本明細書記載の各化合物またはその塩は、その分子内塩や付加物、それらの溶媒和物、または水和物等の形態で存在してもよい。
【0035】
以下、本発明製造方法の各工程について説明する。
【0036】
（工程１）
［式中、記号は前記と同じ意味を表す］
本発明製造方法における工程１では、化合物（ＩＩ）またはその塩を化合物（ＩＩＩ）と反応させて化合物（ＩＶ）またはその塩を製造する反応が実施される。
化合物（ＩＩ）は分子内塩を形成していてもよい。また、化合物（ＩＶ）は分子内塩を形成していてもよく、また末端のカルボキシ基がプロトン化されてＣＯＯＨの形態で存在し、四級アンモニウムカチオンがＸ１－と塩を形成していてもよい。
化合物（ＩＩ）またはその塩および化合物（ＩＩＩ）は、市販の化合物であるか、または既知の方法を用いて製造することができる。
反応は、通常溶媒中で行われる。反応に用いられる溶媒としては、例えばメタノールおよびエタノール等のアルコール類；アセトニトリル等のニトリル類；テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の非プロトン性極性溶媒；水；ならびにこれらの２種類以上の混合物が挙げられ、水を含む溶媒が好ましく、水と非プロトン性極性溶媒の混合溶媒がより好ましく、水とＤＭＦの混合溶媒がさらに好ましい。
反応には、化合物（ＩＩ）またはその塩１モルに対して、化合物（ＩＩＩ）が通常１～３モルの割合、好ましくは１～２モルの割合で用いられる。
反応温度は、通常－２０～８０℃の範囲である。反応時間は通常１分～２４時間の範囲である。
工程１の１つの実施態様では、化合物（ＩＩ）またはその塩は下記式（ＩＩ’）：
で示される化合物またはその塩であり、化合物（ＩＶ）またはその塩は下記式（ＩＶ’）：
で示される化合物またはその塩である。
【化12】
本発明製造方法における工程１では、化合物（ＩＩ）またはその塩を化合物（ＩＩＩ）と反応させて化合物（ＩＶ）またはその塩を製造する反応が実施される。
化合物（ＩＩ）は分子内塩を形成していてもよい。また、化合物（ＩＶ）は分子内塩を形成していてもよく、また末端のカルボキシ基がプロトン化されてＣＯＯＨの形態で存在し、四級アンモニウムカチオンがＸ１－と塩を形成していてもよい。
化合物（ＩＩ）またはその塩および化合物（ＩＩＩ）は、市販の化合物であるか、または既知の方法を用いて製造することができる。
反応は、通常溶媒中で行われる。反応に用いられる溶媒としては、例えばメタノールおよびエタノール等のアルコール類；アセトニトリル等のニトリル類；テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の非プロトン性極性溶媒；水；ならびにこれらの２種類以上の混合物が挙げられ、水を含む溶媒が好ましく、水と非プロトン性極性溶媒の混合溶媒がより好ましく、水とＤＭＦの混合溶媒がさらに好ましい。
反応には、化合物（ＩＩ）またはその塩１モルに対して、化合物（ＩＩＩ）が通常１～３モルの割合、好ましくは１～２モルの割合で用いられる。
反応温度は、通常－２０～８０℃の範囲である。反応時間は通常１分～２４時間の範囲である。
工程１の１つの実施態様では、化合物（ＩＩ）またはその塩は下記式（ＩＩ’）：
【化13】
【化14】
【0037】
（工程２）
本発明製造方法における工程２では、化合物（ＩＶ）またはその塩を化合物（Ｖ）またはその塩と反応させて化合物（ＶＩ）またはその塩を製造する反応が実施される。
［式中、記号は前記と同じ意味を表す］
化合物（ＶＩ）は分子内塩を形成していてもよく、また四級アンモニウムカチオンがＸ１－またはＸ２－と塩を形成していてもよい。
化合物（Ｖ）またはその塩は、市販の化合物であるか、または既知の方法を用いて製造することができる。
反応は、通常溶媒中で行われる。反応に用いられる溶媒としては、例えばメタノールおよびエタノール等のアルコール類；アセトニトリル等のニトリル類；テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の非プロトン性極性溶媒；水；ならびにこれらの２種類以上の混合物が挙げられ、非プロトン性極性溶媒が好ましく、ＤＭＦがより好ましい。
反応には、化合物（ＩＶ）またはその塩１モルに対して、化合物（Ｖ）が通常１～１０モルの割合、好ましくは１～５モルの割合で用いられる。
反応には、通常塩基が用いられる。反応に用いられる塩基としては、例えば炭酸ナトリウムおよび炭酸カリウム等のアルカリ金属炭酸塩；ならびに炭酸水素ナトリウムおよび炭酸水素カリウム等のアルカリ金属炭酸水素塩が挙げられ、アルカリ金属炭酸水素塩が好ましく、炭酸水素ナトリウムがより好ましい。反応に塩基が用いられる場合、化合物（ＩＶ）またはその塩１モルに対して、塩基が通常１～１０モルの割合、好ましくは１～５モルの割合で用いられる。
反応温度は、通常０～１００℃の範囲である。反応時間は通常０．１～４８時間の範囲である。
工程２の１つの実施態様では、化合物（ＩＶ）またはその塩は上記化合物（ＩＶ’）またはその塩であり、化合物（ＶＩ）またはその塩は下記一般式（ＶＩ’）：
［式中、記号は前記と同じ意味を表す］
で示される化合物またはその塩である。
本発明製造方法における工程２では、化合物（ＩＶ）またはその塩を化合物（Ｖ）またはその塩と反応させて化合物（ＶＩ）またはその塩を製造する反応が実施される。
【化15】
化合物（ＶＩ）は分子内塩を形成していてもよく、また四級アンモニウムカチオンがＸ１－またはＸ２－と塩を形成していてもよい。
化合物（Ｖ）またはその塩は、市販の化合物であるか、または既知の方法を用いて製造することができる。
反応は、通常溶媒中で行われる。反応に用いられる溶媒としては、例えばメタノールおよびエタノール等のアルコール類；アセトニトリル等のニトリル類；テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の非プロトン性極性溶媒；水；ならびにこれらの２種類以上の混合物が挙げられ、非プロトン性極性溶媒が好ましく、ＤＭＦがより好ましい。
反応には、化合物（ＩＶ）またはその塩１モルに対して、化合物（Ｖ）が通常１～１０モルの割合、好ましくは１～５モルの割合で用いられる。
反応には、通常塩基が用いられる。反応に用いられる塩基としては、例えば炭酸ナトリウムおよび炭酸カリウム等のアルカリ金属炭酸塩；ならびに炭酸水素ナトリウムおよび炭酸水素カリウム等のアルカリ金属炭酸水素塩が挙げられ、アルカリ金属炭酸水素塩が好ましく、炭酸水素ナトリウムがより好ましい。反応に塩基が用いられる場合、化合物（ＩＶ）またはその塩１モルに対して、塩基が通常１～１０モルの割合、好ましくは１～５モルの割合で用いられる。
反応温度は、通常０～１００℃の範囲である。反応時間は通常０．１～４８時間の範囲である。
工程２の１つの実施態様では、化合物（ＩＶ）またはその塩は上記化合物（ＩＶ’）またはその塩であり、化合物（ＶＩ）またはその塩は下記一般式（ＶＩ’）：
【化16】
で示される化合物またはその塩である。
【0038】
（工程３）
本発明製造方法における工程３では、化合物（ＶＩ）またはその塩のフェナシル基を脱保護反応に付し、化合物（Ｉ）またはその塩を製造する反応が実施される。
［式中、記号は前記と同じ意味を表す］
化合物（Ｉ）は分子内塩を形成していてもよく、また四級アンモニウムカチオンがアニオンと塩を形成していてもよい。
化合物（ＶＩ）またはその塩を亜鉛粉末および酸または塩化アンモニウムの存在下で反応させることにより、化合物（ＶＩ）またはその塩のフェナシル基を脱保護し、化合物（Ｉ）またはその塩を製造することができる。
酸としては、酢酸または塩酸が挙げられる。
反応は、通常溶媒中で行われる。反応に用いられる溶媒としては、例えば水を含有したＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドまたは水を含有した酢酸が挙げられ、水を含有した酢酸が好ましい。
反応には、化合物（ＶＩ）またはその塩１モルに対して、亜鉛粉末が通常１～２０モルの割合、好ましくは１～１５モルの割合で用いられ、酸または塩化アンモニウムが通常１～１０００モルの割合、好ましくは２～２００モルの割合で用いられる。
反応温度は、通常０～１００℃の範囲である。反応時間は通常０．１～４８時間の範囲である。
反応終了後、適宜中和および精製等の後処理操作を行うことにより、化合物（Ｉ）またはその塩を製造することができる。
本発明の１つの実施態様では、化合物（ＶＩ）またはその塩のＲ２がカルボキシ基の誘導体であり、本工程によって当該カルボキシ基の誘導体が脱保護され、化合物（Ｉ）またはその塩のＲ２がカルボキシ基に変換される。
また、工程３の１つの実施態様では、化合物（ＶＩ）またはその塩は上記化合物（ＶＩ’）またはその塩であり、化合物（Ｉ）またはその塩は下記一般式（Ｉ’）：
［式中、記号は前記と同じ意味を表す］
で示される化合物またはその塩である。
本発明製造方法における工程３では、化合物（ＶＩ）またはその塩のフェナシル基を脱保護反応に付し、化合物（Ｉ）またはその塩を製造する反応が実施される。
【化17】
化合物（Ｉ）は分子内塩を形成していてもよく、また四級アンモニウムカチオンがアニオンと塩を形成していてもよい。
化合物（ＶＩ）またはその塩を亜鉛粉末および酸または塩化アンモニウムの存在下で反応させることにより、化合物（ＶＩ）またはその塩のフェナシル基を脱保護し、化合物（Ｉ）またはその塩を製造することができる。
酸としては、酢酸または塩酸が挙げられる。
反応は、通常溶媒中で行われる。反応に用いられる溶媒としては、例えば水を含有したＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドまたは水を含有した酢酸が挙げられ、水を含有した酢酸が好ましい。
反応には、化合物（ＶＩ）またはその塩１モルに対して、亜鉛粉末が通常１～２０モルの割合、好ましくは１～１５モルの割合で用いられ、酸または塩化アンモニウムが通常１～１０００モルの割合、好ましくは２～２００モルの割合で用いられる。
反応温度は、通常０～１００℃の範囲である。反応時間は通常０．１～４８時間の範囲である。
反応終了後、適宜中和および精製等の後処理操作を行うことにより、化合物（Ｉ）またはその塩を製造することができる。
本発明の１つの実施態様では、化合物（ＶＩ）またはその塩のＲ２がカルボキシ基の誘導体であり、本工程によって当該カルボキシ基の誘導体が脱保護され、化合物（Ｉ）またはその塩のＲ２がカルボキシ基に変換される。
また、工程３の１つの実施態様では、化合物（ＶＩ）またはその塩は上記化合物（ＶＩ’）またはその塩であり、化合物（Ｉ）またはその塩は下記一般式（Ｉ’）：
【化18】
で示される化合物またはその塩である。
【0039】
（カルボキシ基の誘導体からカルボキシ基への変換工程）
工程１～３に加え、Ｒ２がエステルまたはアミドである場合、当該エステルまたはアミドをカルボキシ基へ変換する別の工程をさらに実施してもよい。当該工程は、工程２と工程３の間に実施してもよく、工程３の後に実施してもよい。
例えば、化合物（ＶＩ）またはその塩、あるいは化合物（Ｉ）またはその塩を、溶媒中、酸の存在下で反応させることにより、Ｒ２に存在するエステル基をカルボキシ基に変換することができる。
反応に用いられる溶媒としては、例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド；テトラヒドロフラン；メタノール、エタノール、およびｎ－ブタノール等のアルコール類；水；ならびにこれらの２種類以上の混合物が挙げられる。
酸としては、塩酸、リン酸、およびトリフルオロ酢酸などが挙げられる。
反応には、化合物（ＶＩ）またはその塩、あるいは化合物（Ｉ）またはその塩１モルに対して、酸が通常１～１０モルの割合、好ましくは２～５モルの割合で用いられる。
反応温度は、通常０～１００℃の範囲である。反応時間は通常０．１～４８時間の範囲である。
本工程の１つの実施態様では、化合物（ＶＩ）またはその塩は上記化合物（ＶＩ’）またはその塩であり、化合物（Ｉ）またはその塩は上記化合物（Ｉ’）またはその塩である。
工程１～３に加え、Ｒ２がエステルまたはアミドである場合、当該エステルまたはアミドをカルボキシ基へ変換する別の工程をさらに実施してもよい。当該工程は、工程２と工程３の間に実施してもよく、工程３の後に実施してもよい。
例えば、化合物（ＶＩ）またはその塩、あるいは化合物（Ｉ）またはその塩を、溶媒中、酸の存在下で反応させることにより、Ｒ２に存在するエステル基をカルボキシ基に変換することができる。
反応に用いられる溶媒としては、例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド；テトラヒドロフラン；メタノール、エタノール、およびｎ－ブタノール等のアルコール類；水；ならびにこれらの２種類以上の混合物が挙げられる。
酸としては、塩酸、リン酸、およびトリフルオロ酢酸などが挙げられる。
反応には、化合物（ＶＩ）またはその塩、あるいは化合物（Ｉ）またはその塩１モルに対して、酸が通常１～１０モルの割合、好ましくは２～５モルの割合で用いられる。
反応温度は、通常０～１００℃の範囲である。反応時間は通常０．１～４８時間の範囲である。
本工程の１つの実施態様では、化合物（ＶＩ）またはその塩は上記化合物（ＶＩ’）またはその塩であり、化合物（Ｉ）またはその塩は上記化合物（Ｉ’）またはその塩である。
【0040】
本発明製造方法で製造された化合物は、タンパク質と結合してコンジュゲートを形成することができ、またビーズと結合することができる。
タンパク質としては、例えばエチレンジアミンで修飾した牛血清アルブミン（ｃＢＳＡ）（カチオニック牛血清アルブミンとも称する）や卵白アルブミン（ＯＶＡ）を挙げることができる。
ビーズとしては、例えばアミノ基で修飾されたナノ磁性ビーズ等を挙げることができる。
タンパク質としては、例えばエチレンジアミンで修飾した牛血清アルブミン（ｃＢＳＡ）（カチオニック牛血清アルブミンとも称する）や卵白アルブミン（ＯＶＡ）を挙げることができる。
ビーズとしては、例えばアミノ基で修飾されたナノ磁性ビーズ等を挙げることができる。
【0041】
以下に、本発明の実施態様を記載する。なお、以下の各実施態様を任意に選択して組み合わせた実施態様も本発明に包含される。
【0042】
本発明製造方法
［実施態様Ａ１］
Ｒ１がＣ１－Ｃ６アルキレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン－Ｃ１－Ｃ６アルキレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－５～１１員ヘテロアリーレン基；またはＣ１－Ｃ６アルキレン－５～１１員ヘテロアリーレン－Ｃ１－Ｃ６アルキレン基を示す、本発明製造方法。
［実施態様Ａ２］
Ｒ１がＣ１－Ｃ６アルキレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン基；またはＣ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン－Ｃ１－Ｃ６アルキレン基である、本発明製造方法。
［実施態様Ａ３］
Ｒ１がＣ１－Ｃ４アルキレン基；Ｃ１－Ｃ４アルキレン－６～１２員アリーレン基；またはＣ１－Ｃ４アルキレン－６～１２員アリーレン－Ｃ１－Ｃ４アルキレン基である、本発明製造方法。
［実施態様Ａ４］
Ｒ１がＣ１－Ｃ３アルキレン基；Ｃ１－Ｃ３アルキレン－フェニレン基；またはＣ１－Ｃ３アルキレン－フェニレン－Ｃ１－Ｃ３アルキレン基である、本発明製造方法。
［実施態様Ａ５］
Ｒ２におけるカルボキシ基の誘導体がアシル基、エステル基、またはアミド基である、実施態様Ａ１～Ａ４のいずれか１つに記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ６］
Ｒ２におけるカルボキシ基の誘導体がＣ（Ｏ）Ｒ３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ４、およびＣ（Ｏ）ＮＲ５Ｒ６であり、Ｒ３が鎖式炭化水素基であり、Ｒ４が鎖式炭化水素基またはフェナシル基であり、Ｒ５およびＲ６が、同一または相異なり、鎖式炭化水素基または水素原子である、実施態様Ａ１～Ａ４のいずれか１つに記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ７］
Ｒ２がカルボキシ基の誘導体である、実施態様Ａ１～Ａ６のいずれか１つに記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ８］
化合物（Ｉ）またはその塩が下記一般式（Ｉ’）：
［式中、記号は前記と同じ意味を表す］
で示される化合物またはその塩であり、化合物（ＩＩ）またはその塩が下記式（ＩＩ’）：
で示される化合物またはその塩であり、化合物（ＩＶ）またはその塩が下記式（ＩＶ’）：
で示される化合物またはその塩であり、化合物（ＶＩ）またはその塩が下記一般式（ＶＩ’）：
［式中、記号は前記と同じ意味を表す］
で示される化合物またはその塩である、実施態様Ａ１～Ａ７のいずれか１つに記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ９］
カルボキシ基の誘導体をカルボキシ基に変換する工程をさらに含む、実施態様Ａ１～Ａ８のいずれか１つに記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ１０］
カルボキシ基の誘導体をカルボキシ基に変換する工程が酸の存在下で実施される、実施態様Ａ９に記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ１１］
酸が塩酸、リン酸、またはトリフルオロ酢酸である、実施態様Ａ１０に記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ１２］
カルボキシ基の誘導体をカルボキシ基に変換する工程によって製造される化合物またはその塩が、
および
からなる群から選択される化合物またはその塩である、実施態様Ａ９～１１のいずれか１つに記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ１３］
Ｒ２が水素原子である、実施態様Ａ１～Ａ４のいずれか１つに記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ１４］
工程１が水を含む溶媒中で実施される、実施態様Ａ１～Ａ１３のいずれか１つに記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ１５］
工程１が水と非プロトン性極性溶媒の混合溶媒中で実施される、実施態様Ａ１～Ａ１３のいずれか１つに記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ１６］
非プロトン性極性溶媒がＤＭＦである、実施態様Ａ１５に記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ１７］
Ｘ１が臭素原子である、実施態様Ａ１～Ａ１６のいずれか１つに記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ１８］
工程２が溶媒中、塩基の存在下で実施される、実施態様Ａ１～Ａ１７のいずれか１つに記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ１９］
溶媒が非プロトン性極性溶媒である、実施態様Ａ１８に記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ２０］
非プロトン性極性溶媒がＤＭＦである、実施態様Ａ１９に記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ２１］
塩基がアルカリ金属炭酸水素塩である、実施態様Ａ１８～Ａ２０のいずれか１つに記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ２２］
アルカリ金属炭酸水素塩が炭酸水素ナトリウムである、実施態様Ａ２１に記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ２３］
Ｘ２が臭素原子である、実施態様Ａ１～Ａ２２のいずれか１つに記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ２４］
Ｘ１およびＸ２がそれぞれ臭素原子である、実施態様Ａ１～Ａ２３のいずれか１つに記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ２５］
工程３が亜鉛粉末および酸または塩化アンモニウムの存在下で実施される、実施態様Ａ１～Ａ２４のいずれか１つに記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ２６］
酸が塩酸または酢酸である、実施態様Ａ２５に記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ１］
Ｒ１がＣ１－Ｃ６アルキレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン－Ｃ１－Ｃ６アルキレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－５～１１員ヘテロアリーレン基；またはＣ１－Ｃ６アルキレン－５～１１員ヘテロアリーレン－Ｃ１－Ｃ６アルキレン基を示す、本発明製造方法。
［実施態様Ａ２］
Ｒ１がＣ１－Ｃ６アルキレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン基；またはＣ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン－Ｃ１－Ｃ６アルキレン基である、本発明製造方法。
［実施態様Ａ３］
Ｒ１がＣ１－Ｃ４アルキレン基；Ｃ１－Ｃ４アルキレン－６～１２員アリーレン基；またはＣ１－Ｃ４アルキレン－６～１２員アリーレン－Ｃ１－Ｃ４アルキレン基である、本発明製造方法。
［実施態様Ａ４］
Ｒ１がＣ１－Ｃ３アルキレン基；Ｃ１－Ｃ３アルキレン－フェニレン基；またはＣ１－Ｃ３アルキレン－フェニレン－Ｃ１－Ｃ３アルキレン基である、本発明製造方法。
［実施態様Ａ５］
Ｒ２におけるカルボキシ基の誘導体がアシル基、エステル基、またはアミド基である、実施態様Ａ１～Ａ４のいずれか１つに記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ６］
Ｒ２におけるカルボキシ基の誘導体がＣ（Ｏ）Ｒ３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ４、およびＣ（Ｏ）ＮＲ５Ｒ６であり、Ｒ３が鎖式炭化水素基であり、Ｒ４が鎖式炭化水素基またはフェナシル基であり、Ｒ５およびＲ６が、同一または相異なり、鎖式炭化水素基または水素原子である、実施態様Ａ１～Ａ４のいずれか１つに記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ７］
Ｒ２がカルボキシ基の誘導体である、実施態様Ａ１～Ａ６のいずれか１つに記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ８］
化合物（Ｉ）またはその塩が下記一般式（Ｉ’）：
【化19】
で示される化合物またはその塩であり、化合物（ＩＩ）またはその塩が下記式（ＩＩ’）：
【化20】
【化21】
【化22】
で示される化合物またはその塩である、実施態様Ａ１～Ａ７のいずれか１つに記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ９］
カルボキシ基の誘導体をカルボキシ基に変換する工程をさらに含む、実施態様Ａ１～Ａ８のいずれか１つに記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ１０］
カルボキシ基の誘導体をカルボキシ基に変換する工程が酸の存在下で実施される、実施態様Ａ９に記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ１１］
酸が塩酸、リン酸、またはトリフルオロ酢酸である、実施態様Ａ１０に記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ１２］
カルボキシ基の誘導体をカルボキシ基に変換する工程によって製造される化合物またはその塩が、
【化23】
【化24】
【化25】
［実施態様Ａ１３］
Ｒ２が水素原子である、実施態様Ａ１～Ａ４のいずれか１つに記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ１４］
工程１が水を含む溶媒中で実施される、実施態様Ａ１～Ａ１３のいずれか１つに記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ１５］
工程１が水と非プロトン性極性溶媒の混合溶媒中で実施される、実施態様Ａ１～Ａ１３のいずれか１つに記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ１６］
非プロトン性極性溶媒がＤＭＦである、実施態様Ａ１５に記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ１７］
Ｘ１が臭素原子である、実施態様Ａ１～Ａ１６のいずれか１つに記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ１８］
工程２が溶媒中、塩基の存在下で実施される、実施態様Ａ１～Ａ１７のいずれか１つに記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ１９］
溶媒が非プロトン性極性溶媒である、実施態様Ａ１８に記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ２０］
非プロトン性極性溶媒がＤＭＦである、実施態様Ａ１９に記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ２１］
塩基がアルカリ金属炭酸水素塩である、実施態様Ａ１８～Ａ２０のいずれか１つに記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ２２］
アルカリ金属炭酸水素塩が炭酸水素ナトリウムである、実施態様Ａ２１に記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ２３］
Ｘ２が臭素原子である、実施態様Ａ１～Ａ２２のいずれか１つに記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ２４］
Ｘ１およびＸ２がそれぞれ臭素原子である、実施態様Ａ１～Ａ２３のいずれか１つに記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ２５］
工程３が亜鉛粉末および酸または塩化アンモニウムの存在下で実施される、実施態様Ａ１～Ａ２４のいずれか１つに記載の本発明製造方法。
［実施態様Ａ２６］
酸が塩酸または酢酸である、実施態様Ａ２５に記載の本発明製造方法。
【0043】
本発明化合物
［実施態様Ｂ１］
Ｒ１がＣ１－Ｃ６アルキレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン－Ｃ１－Ｃ６アルキレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－５～１１員ヘテロアリーレン基；またはＣ１－Ｃ６アルキレン－５～１１員ヘテロアリーレン－Ｃ１－Ｃ６アルキレン基を示す、本発明化合物またはその塩。
［実施態様Ｂ２］
Ｒ１がＣ１－Ｃ６アルキレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン基；またはＣ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン－Ｃ１－Ｃ６アルキレン基である、本発明化合物またはその塩。
［実施態様Ｂ３］
Ｒ１がＣ１－Ｃ４アルキレン基；Ｃ１－Ｃ４アルキレン－６～１２員アリーレン基；またはＣ１－Ｃ４アルキレン－６～１２員アリーレン－Ｃ１－Ｃ４アルキレン基である、本発明化合物またはその塩。
［実施態様Ｂ４］
Ｒ１がＣ１－Ｃ３アルキレン基；Ｃ１－Ｃ３アルキレン－フェニレン基；またはＣ１－Ｃ３アルキレン－フェニレン－Ｃ１－Ｃ３アルキレン基である、本発明化合物またはその塩。
［実施態様Ｂ５］
Ｒ２におけるカルボキシ基の誘導体がアシル基、エステル基、またはアミド基である、実施態様Ｂ１～Ｂ４のいずれか１つに記載の本発明化合物またはその塩。
［実施態様Ｂ６］
Ｒ２におけるカルボキシ基の誘導体がＣ（Ｏ）Ｒ３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ４、およびＣ（Ｏ）ＮＲ５Ｒ６であり、Ｒ３が鎖式炭化水素基であり、Ｒ４が鎖式炭化水素基またはフェナシル基であり、Ｒ５およびＲ６が、同一または相異なり、鎖式炭化水素基または水素原子である、実施態様Ｂ１～Ｂ４のいずれか１つに記載の本発明化合物またはその塩。
［実施態様Ｂ７］
Ｒ２がカルボキシ基である、実施態様Ｂ１～Ｂ４のいずれか１つに記載の本発明化合物またはその塩。
［実施態様Ｂ８］
下記一般式（Ｉ’）：
［式中、記号は前記と同じ意味を表す］
で示される化合物またはその塩である、実施態様Ｂ１～Ｂ７のいずれか１つに記載の本発明化合物またはその塩。
［実施態様Ｂ９］
および
からなる群から選択される、実施態様Ｂ１に記載の本発明化合物またはその塩。
［実施態様Ｂ１０］
Ｒ２が水素原子である、実施態様Ｂ１～Ｂ４のいずれか１つに記載の本発明化合物またはその塩。
［実施態様Ｂ１］
Ｒ１がＣ１－Ｃ６アルキレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン－Ｃ１－Ｃ６アルキレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－５～１１員ヘテロアリーレン基；またはＣ１－Ｃ６アルキレン－５～１１員ヘテロアリーレン－Ｃ１－Ｃ６アルキレン基を示す、本発明化合物またはその塩。
［実施態様Ｂ２］
Ｒ１がＣ１－Ｃ６アルキレン基；Ｃ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン基；またはＣ１－Ｃ６アルキレン－６～１２員アリーレン－Ｃ１－Ｃ６アルキレン基である、本発明化合物またはその塩。
［実施態様Ｂ３］
Ｒ１がＣ１－Ｃ４アルキレン基；Ｃ１－Ｃ４アルキレン－６～１２員アリーレン基；またはＣ１－Ｃ４アルキレン－６～１２員アリーレン－Ｃ１－Ｃ４アルキレン基である、本発明化合物またはその塩。
［実施態様Ｂ４］
Ｒ１がＣ１－Ｃ３アルキレン基；Ｃ１－Ｃ３アルキレン－フェニレン基；またはＣ１－Ｃ３アルキレン－フェニレン－Ｃ１－Ｃ３アルキレン基である、本発明化合物またはその塩。
［実施態様Ｂ５］
Ｒ２におけるカルボキシ基の誘導体がアシル基、エステル基、またはアミド基である、実施態様Ｂ１～Ｂ４のいずれか１つに記載の本発明化合物またはその塩。
［実施態様Ｂ６］
Ｒ２におけるカルボキシ基の誘導体がＣ（Ｏ）Ｒ３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ４、およびＣ（Ｏ）ＮＲ５Ｒ６であり、Ｒ３が鎖式炭化水素基であり、Ｒ４が鎖式炭化水素基またはフェナシル基であり、Ｒ５およびＲ６が、同一または相異なり、鎖式炭化水素基または水素原子である、実施態様Ｂ１～Ｂ４のいずれか１つに記載の本発明化合物またはその塩。
［実施態様Ｂ７］
Ｒ２がカルボキシ基である、実施態様Ｂ１～Ｂ４のいずれか１つに記載の本発明化合物またはその塩。
［実施態様Ｂ８］
下記一般式（Ｉ’）：
【化26】
で示される化合物またはその塩である、実施態様Ｂ１～Ｂ７のいずれか１つに記載の本発明化合物またはその塩。
［実施態様Ｂ９］
【化27】
【化28】
【化29】
［実施態様Ｂ１０］
Ｒ２が水素原子である、実施態様Ｂ１～Ｂ４のいずれか１つに記載の本発明化合物またはその塩。
【0044】
本発明化合物の用途
［実施態様Ｃ１］
実施態様Ｂ７またはＢ９に記載の本発明化合物またはその塩とタンパク質が結合したコンジュゲート。
［実施態様Ｃ２］
タンパク質がエチレンジアミンで修飾した牛血清アルブミン（ｃＢＳＡ）または卵白アルブミン（ＯＶＡ）である、実施態様Ｃ１に記載のコンジュゲート。
［実施態様Ｃ３］
実施態様Ｂ７またはＢ９に記載の本発明化合物またはその塩と結合したビーズ。
［実施態様Ｃ４］
ビーズがアミノ基で修飾されたナノ磁性ビーズである、実施態様Ｃ３に記載のビーズ。
［実施態様Ｃ１］
実施態様Ｂ７またはＢ９に記載の本発明化合物またはその塩とタンパク質が結合したコンジュゲート。
［実施態様Ｃ２］
タンパク質がエチレンジアミンで修飾した牛血清アルブミン（ｃＢＳＡ）または卵白アルブミン（ＯＶＡ）である、実施態様Ｃ１に記載のコンジュゲート。
［実施態様Ｃ３］
実施態様Ｂ７またはＢ９に記載の本発明化合物またはその塩と結合したビーズ。
［実施態様Ｃ４］
ビーズがアミノ基で修飾されたナノ磁性ビーズである、実施態様Ｃ３に記載のビーズ。
【実施例0045】
以下に、実施例および試験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、これらの例示は本発明をよりよく理解するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【0046】
まず、本発明製造方法によって本発明化合物を製造する具体例を実施例として示す。
【0047】
実施例１
（Ｓ）－１－（４－カルボラトベンジルオキシ）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－１－オキソ－３－（２－チオキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパンアミニウムの製造
（Ｓ）－１－（４－カルボラトベンジルオキシ）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－１－オキソ－３－（２－チオキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパンアミニウムの製造
【化30】
【0048】
（１）（Ｓ）－臭化１－カルボキシ－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－２－（２－フェナシルチオ－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）エタンアミニウムの製造
Ｌ－ＥＧＴ（テトラエドロン社）（１２００ｍｇ）を水（１０ｍＬ）に溶解し、氷冷した。フェナシルブロミド（東京化成工業）（１０９０ｍｇ）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３５ｍＬ）に溶解した溶液を上記のＥＧＴ溶液に撹拌しながら滴下した。反応液を遠心エバポレーター（ＴＯＭＹ社製 ＣＣ－１０５）でエバポレートし、淡黄色の粘稠油状の標記化合物を得た。得られた標記化合物を重水に溶解し、ＮＭＲ（Ｂｒｕｋｅｒ Ａｓｃｅｎｄ４００）で測定した。リファレンスにはＤＳＳｄ６（フジフィルム）を用いた。ＤＳＳｄ６のプロトンもしくはメチル基のCを０ｐｐｍとした場合の結果を以下に示す。
1H NMR (D2O): 3.31(s, 9H), 3.34-3.41 (m, 2H), 3.94 (d, 1H, J=11.6 Hz), 4.82 (s, 2H), 7.33 (s, 1H), 7.58 (t, 2H, J=7.5 Hz), 7.74 (t, 1H, J=7.3 Hz), 7.96 (d, 2H, J=7.5 Hz)。
13C NMR (D2O): 25.7, 44.1, 55.0, 79.4, 122.7, 131.4, 131.8, 131.9, 137.0, 137.6, 141,7, 172.3, 198.8。
【化31】
1H NMR (D2O): 3.31(s, 9H), 3.34-3.41 (m, 2H), 3.94 (d, 1H, J=11.6 Hz), 4.82 (s, 2H), 7.33 (s, 1H), 7.58 (t, 2H, J=7.5 Hz), 7.74 (t, 1H, J=7.3 Hz), 7.96 (d, 2H, J=7.5 Hz)。
13C NMR (D2O): 25.7, 44.1, 55.0, 79.4, 122.7, 131.4, 131.8, 131.9, 137.0, 137.6, 141,7, 172.3, 198.8。
【0049】
（２）（Ｓ）－臭化１－（４－メトキシカルボニルベンジルオキシ）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－１－オキソ－２－（２－フェナシルチオ－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパンアミニウムの製造
（１）で得られた（Ｓ）－臭化１－カルボキシ－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－２－（２－フェナシルチオ－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）エタンアミニウムをＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（４０ｍＬ）に溶解し、重曹（１０００ｍｇ）とメチル４－（ブロモメチル）ベンゾエート（１２２０ｍｇ）（東京化成工業）を添加した。撹拌しながら室温で２４時間インキュベートした後、ろ過した。ろ液をペースト状になるまで濃縮した後、水（４０ｍＬ）に溶解した。トルエンを４０ｍＬ加え、分液処理を行い、水相を回収した。塩化ナトリウム（１０ｇ）（ナカライテスク社製）とｎ－ブチルアルコール（４０ｍＬ）を加え、分液した。得られた有機相を飽和食塩水で２回洗浄した。有機相をエバポレートし、淡黄色の粘稠油状の標記化合物を得た。
【化32】
【0050】
（３）（Ｓ）－塩化１－（４－カルボキシベンジルオキシ）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－１－オキソ－３－（２－チオキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパン－２－アミニウムの製造
（２）で得られた（Ｓ）－臭化１－（４－メトキシカルボニルベンジルオキシ）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－１－オキソ－２－（２－フェナシルチオ－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパンアミニウムにＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）と６Ｍの塩酸（１０ｍＬ）を加え、５０℃で４日間インキュベートすることで加水分解し、標記化合物の塩酸溶液を得た。
【化33】
【0051】
（４）（Ｓ）－１－（４－カルボラトベンジルオキシ）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－１－オキソ－３－（２－チオキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパンアミニウムの製造
（３）で得られた（Ｓ）－塩化１－（４－カルボキシベンジルオキシ）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－１－オキソ－３－（２－チオキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパン－２－アミニウムの塩酸溶液（１２ｍＬ）に亜鉛粉末を１５００ｍｇ加え、室温で撹拌しながら１０分間反応させた後、ろ過した。ろ液に５Ｍの水酸化ナトリウムを滴下し、ｐＨ２に調整した。それを濃縮した後、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（４ｍＬ）と水（６ｍＬ）を加え溶解した。その溶液をＯＤＳ分取カラム装置（山善社製、ＵｌｔｒａＰａｃ、ＹＦＬＣ ＡＩ－５８０）にかけ、溶離液としてメタノールと水の混合液を用い、カラム精製をおこなった。得られた分画を濃縮した後、凍結乾燥し、標記化合物の白色粉末１２７１ｍｇを得た。
得られた標記化合物を重水に溶解し、ＮＭＲ（Ｂｒｕｋｅｒ Ａｓｃｅｎｄ４００）で測定した。リファレンスにはＤＳＳｄ６（フジフィルム）を用いた。ＤＳＳｄ６のプロトンもしくはメチル基のＣを０ｐｐｍとした場合の結果を以下に示す。
1H NMR (D2O): 3.27-3.34 (m, 2H), 3.35 (s, 9H), 3.40 (dd, J=14.0, 3.7 Hz, 1H), 4.45 (dd, J=12.3, 3.7 Hz, 1H), 5.02 (d, J=12.1, 1H), 5.32 (d, J=12.1 Hz, 1H), 6.33 (s, 1H), 7.19 (d, J=7.7 Hz, 2H), 7.82 (d, J=7.7 Hz, 2H)。13C NMR (D2O): 25.3, 55.4, 71.0, 75.2, 118.6, 124.1, 131.4, 132.3, 136.7, 140.6, 159.7, 169.1, 175.7。
【化34】
得られた標記化合物を重水に溶解し、ＮＭＲ（Ｂｒｕｋｅｒ Ａｓｃｅｎｄ４００）で測定した。リファレンスにはＤＳＳｄ６（フジフィルム）を用いた。ＤＳＳｄ６のプロトンもしくはメチル基のＣを０ｐｐｍとした場合の結果を以下に示す。
1H NMR (D2O): 3.27-3.34 (m, 2H), 3.35 (s, 9H), 3.40 (dd, J=14.0, 3.7 Hz, 1H), 4.45 (dd, J=12.3, 3.7 Hz, 1H), 5.02 (d, J=12.1, 1H), 5.32 (d, J=12.1 Hz, 1H), 6.33 (s, 1H), 7.19 (d, J=7.7 Hz, 2H), 7.82 (d, J=7.7 Hz, 2H)。13C NMR (D2O): 25.3, 55.4, 71.0, 75.2, 118.6, 124.1, 131.4, 132.3, 136.7, 140.6, 159.7, 169.1, 175.7。
【0052】
実施例２
（Ｓ）－１－（４－カルボラトメチルベンジルオキシ）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－１－オキソ－３－（２－チオキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパン－２－アミニウムの製造
（Ｓ）－１－（４－カルボラトメチルベンジルオキシ）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－１－オキソ－３－（２－チオキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパン－２－アミニウムの製造
【化35】
【0053】
（１）（Ｓ）－臭化－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－１－（４－フェナシルオキシカルボニルメチルベンジルオキシ）－３－（２－フェナシルチオ－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパン－２－アミニウムの製造
実施例１（１）で得られた（Ｓ）－臭化１－カルボキシ－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－２－（２－フェナシルチオ－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）エタンアミニウムをＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（４０ｍＬ）に溶解し、重曹（１４００ｍｇ）とフェナシル４－（ブロモメチル）フェニルアセテート（１８３０ｍｇ）（東京化成工業）を添加した。撹拌しながら室温で２４時間インキュベートした後、ろ過した。ろ液をペースト状になるまでエバポレーターで濃縮した後、水（４０ｍＬ）に溶解した。トルエン（４０ｍＬ）を加え、分液処理し、水相を回収した。塩化ナトリウム（１０ｇ）（ナカライテスク社製）とｎ－ブチルアルコール（４０ｍＬ）を加え、分液した。得られた有機相を飽和食塩水で２回洗浄した。有機相をエバポレートし、淡黄色の粘稠油状の標記化合物を得た。
【化36】
【0054】
（２）（Ｓ）－１－（４－カルボラトメチルベンジルオキシ）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－１－オキソ－３－（２－チオキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパン－２－アミニウムの製造
（１）で得られた（Ｓ）－臭化－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－１－（４－フェナシルオキシカルボニルメチルベンジルオキシ）－３－（２－フェナシルチオ－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパン－２－アミニウムに９０％酢酸を２０ｍＬ、および亜鉛粉末２０００ｍｇを加え、室温で４時間インキュベートし、ろ過した。ろ液に６Ｍの塩酸を加え、ｐＨ２に調整した。それを４ｍＬにまで濃縮した後、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）と水１ｍＬを加えた。その溶液をＯＤＳ分取カラム装置（山善社製、ＵｌｔｒａＰａｃ、ＹＦＬＣ ＡＩ－５８０）にかけ、溶離液としてメタノールと水の混合液を用い、カラム精製をおこなった。得られた分画を濃縮した後、凍結乾燥し、標記化合物の白色粉末１００１ｍｇを得た。
得られた標記化合物を重水に溶解し、ＮＭＲ（Ｂｒｕｋｅｒ Ａｓｃｅｎｄ４００）で測定した。リファレンスにはＤＳＳｄ６（フジフィルム）を用いた。ＤＳＳｄ６のプロトンもしくはメチル基のＣを０ｐｐｍとした場合の結果を以下に示す。
1H NMR (D2O): 3.23-3.35 (m, 2H), 3.32 (s, 9H), 3.62 (s, 2H), 4.46 (dd, J=12.0, 4.3 Hz, 1H), 5.00 (d, J=11.4 Hz, 1H), 5.43 (d, J=11.4 Hz, 1H), 6.19 (s, 1H), 7.23 (d, J=7.6 Hz, 2H), 7.31 (d, J=7.6 Hz, 2H)。13C NMR (D2O): 25.2, 46.3, 55.3, 71.6, 75.1, 118.7, 123.5, 132.5, 132.5, 134.9, 140.6, 159.1, 169.2, 183.0。
【化37】
得られた標記化合物を重水に溶解し、ＮＭＲ（Ｂｒｕｋｅｒ Ａｓｃｅｎｄ４００）で測定した。リファレンスにはＤＳＳｄ６（フジフィルム）を用いた。ＤＳＳｄ６のプロトンもしくはメチル基のＣを０ｐｐｍとした場合の結果を以下に示す。
1H NMR (D2O): 3.23-3.35 (m, 2H), 3.32 (s, 9H), 3.62 (s, 2H), 4.46 (dd, J=12.0, 4.3 Hz, 1H), 5.00 (d, J=11.4 Hz, 1H), 5.43 (d, J=11.4 Hz, 1H), 6.19 (s, 1H), 7.23 (d, J=7.6 Hz, 2H), 7.31 (d, J=7.6 Hz, 2H)。13C NMR (D2O): 25.2, 46.3, 55.3, 71.6, 75.1, 118.7, 123.5, 132.5, 132.5, 134.9, 140.6, 159.1, 169.2, 183.0。
【0055】
実施例３
（Ｓ）－４－（３－（２－チオキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）－２－（トリメチルアンモニオ）プロパノイルオキシ）ブタノエートの製造
（Ｓ）－４－（３－（２－チオキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）－２－（トリメチルアンモニオ）プロパノイルオキシ）ブタノエートの製造
【化38】
【0056】
（１）（Ｓ）－臭化１－（３－ｔ－ブトキシカルボニルプロピル）オキシ－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－１－オキソ－３－（２－フェナシルチオ－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパン－２－アミニウムの製造
実施例１（１）で得られた（Ｓ）－臭化１－カルボキシ－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－２－（２－フェナシルチオ－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）エタンアミニウムをＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（４０ｍＬ）に溶解し、重曹（１４００ｍｇ）とｔｅｒｔ－ブチル４－ブロモブタノエート（４７５０ｍｇ）（東京化成工業）を添加した。撹拌しながら５０℃で２４時間インキュベートした後、ろ過した。ろ液をペースト状になるまで濃縮した後、水（４０ｍＬ）に溶解した。トルエン（４０ｍＬ）を加え、分液処理し、水相を回収した。塩化ナトリウム（１０ｇ）（ナカライテスク社製）とｎ－ブチルアルコール（４４ｍＬ）を加え、分液した。得られた有機相を飽和食塩水で２回洗浄した。有機相をエバポレートし、淡黄色の粘稠油状の標記化合物を得た。
【化39】
【0057】
（２）酢酸１－（３－ｔ－ブトキシカルボニルプロピル）オキシ－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－１－オキソ－３－（２－チオキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパン－２－アミニウムの製造
（１）で得られた（Ｓ）－臭化１－（３－ｔ－ブトキシカルボニルプロピル）オキシ－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－１－オキソ－３－（２－フェナシルチオ－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパン－２－アミニウムを９０％酢酸（１２ｍＬ）に溶解し、亜鉛粉末２０００ｍｇを添加した。５０℃で３０分間インキュベートした後、ろ過した。そのろ液をＯＤＳ分取カラム装置（山善社製、ＵｌｔｒａＰａｃ、ＹＦＬＣ ＡＩ－５８０）にかけ、溶離液としてメタノールと水を用いカラム精製をおこなった。得られた分画を濃縮し、淡黄色の粘稠油状の標記化合物を得た。
【化40】
【0058】
（３）（Ｓ）－４－（３－（２－チオキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）－２－（トリメチルアンモニオ）プロパノイルオキシ）ブタノエートの製造
（２）で得られた（Ｓ）－酢酸１－（３－ｔ－ブトキシカルボニルプロピル）オキシ－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－１－オキソ－３－（２－チオキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパン－２－アミニウムに水（１６ｍＬ）を加え、溶解した。６Ｍの塩酸でｐＨ１に調製し、室温で２４時間インキュベートした。５Ｍの水酸化ナトリウムを添加し、ｐＨ５に調整した。凍結乾燥し、標記化合物（２５９０ｍｇ：塩化ナトリウム１１５０ｍｇを含む）を得た。
得られた標記化合物を重水に溶解し、ＮＭＲ（Ｂｒｕｋｅｒ Ａｓｃｅｎｄ４００）で測定した。リファレンスにはＤＳＳｄ６（フジフィルム）を用いた。ＤＳＳｄ６のプロトンもしくはメチル基のＣを０ｐｐｍとした場合の結果を以下に示す。
1H NMR (D2O): 1.69-1.83 (m, 2H), 2.10 (t, J=7.3 Hz, 2H), 3.31 (s, 9H), 3.29-3.35 (m, 1H), 3.45 (dd, J=14.2, 4.0 Hz, 1H), 4.15 (t, J=6.2 Hz, 2H), 4.50 (dd, J=11.9, 4.0 Hz, 1H), 6.85 (s, 1H)。13C NMR (D2O): 25.2, 27.0, 36.0, 55.4, 70.0, 75.6, 118.8, 124.8, 159.5, 169.4, 184.0。
【化41】
得られた標記化合物を重水に溶解し、ＮＭＲ（Ｂｒｕｋｅｒ Ａｓｃｅｎｄ４００）で測定した。リファレンスにはＤＳＳｄ６（フジフィルム）を用いた。ＤＳＳｄ６のプロトンもしくはメチル基のＣを０ｐｐｍとした場合の結果を以下に示す。
1H NMR (D2O): 1.69-1.83 (m, 2H), 2.10 (t, J=7.3 Hz, 2H), 3.31 (s, 9H), 3.29-3.35 (m, 1H), 3.45 (dd, J=14.2, 4.0 Hz, 1H), 4.15 (t, J=6.2 Hz, 2H), 4.50 (dd, J=11.9, 4.0 Hz, 1H), 6.85 (s, 1H)。13C NMR (D2O): 25.2, 27.0, 36.0, 55.4, 70.0, 75.6, 118.8, 124.8, 159.5, 169.4, 184.0。
【0059】
（高分解能質量分析）
以下に液体クロマトグラフィー高分解能質量分析（ＬＣ－ＨＲＭＳ）の方法および結果を示す。
（ＬＣ－ＨＲＭＳ分析条件）
装置：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ６２２４ ＴＯＦ ＬＣ／ＭＳ（アジレントテクノロジー社製）。
カラム：μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ ５μＣ１８ １００Ａ、３．９Ｘ１５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ社）。
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ。
温度：４０℃。
溶離液：（Ａ）０．１％ギ酸水溶液、（Ｂ）アセトニトリル、グラジエント条件：０％Ｂ（０分）から１００％Ｂ（２０分）。
イオン化条件：ＥＳＩ キャピラリー電圧 ３５００Ｖ フラグメンター電圧 １００Ｖ。
以下に液体クロマトグラフィー高分解能質量分析（ＬＣ－ＨＲＭＳ）の方法および結果を示す。
（ＬＣ－ＨＲＭＳ分析条件）
装置：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ６２２４ ＴＯＦ ＬＣ／ＭＳ（アジレントテクノロジー社製）。
カラム：μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ ５μＣ１８ １００Ａ、３．９Ｘ１５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ社）。
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ。
温度：４０℃。
溶離液：（Ａ）０．１％ギ酸水溶液、（Ｂ）アセトニトリル、グラジエント条件：０％Ｂ（０分）から１００％Ｂ（２０分）。
イオン化条件：ＥＳＩ キャピラリー電圧 ３５００Ｖ フラグメンター電圧 １００Ｖ。
【0060】
（結果）
Ｌ－ＥＧＴ：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ９Ｈ１６Ｎ３O２Ｓ 計算値２３０．０９５８；実測値 ２３０．０９５６ 保持時間３．０分付近
（Ｓ）－臭化１－カルボキシ－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－２－（２－フェナシルチオ－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）エタンアミニウムのカチオン部分：［Ｍ］＋ Ｃ１７Ｈ２２Ｎ３Ｏ３Ｓ 計算値３４８．１３７６；実測値３４８．１３７７ 保持時間７．５分付近
（Ｓ）－臭化１－（４－メトキシカルボニルベンジルオキシ）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－１－オキソ－２－（２－フェナシルチオ－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパンアミニウムのカチオン部分：［Ｍ］＋ Ｃ２６Ｈ３０Ｎ３Ｏ５Ｓ 計算値４９６．１９０１；実測値４９６．１９０２ 保持時間１１．５分付近
（Ｓ）－塩化１－（４－カルボキシベンジルオキシ）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－１－オキソ－３－（２－チオキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパン－２－アミニウムのカチオン部分：［Ｍ］＋ Ｃ２５Ｈ２８Ｎ３Ｏ５Ｓ 計算値４８２．１７４４；実測値４８２．１７４６ 保持時間９．５分付近
（Ｓ）－１－（４－カルボラトベンジルオキシ）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－１－オキソ－３－（２－チオキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパンアミニウム：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１７Ｈ２２Ｎ３Ｏ４Ｓ 計算値３６４．１３２６；実測値３６４．１３２８ 保持時間７．７分付近
（Ｓ）－臭化－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－１－（４－フェナシルオキシカルボニルメチルベンジルオキシ）－３－（２－フェナシルチオ－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパン－２－アミニウム：［Ｍ］＋ Ｃ３４Ｈ３６Ｎ３Ｏ６Ｓ 計算値６１４．２３１９；実測値６１４．２３２１ 保持時間１２．６分付近
（Ｓ）－１－（４－カルボラトメチルベンジルオキシ）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－１－オキソ－３－（２－チオキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパン－２－アミニウム：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１８Ｈ２４Ｎ３Ｏ４Ｓ 計算値３７８．１４８２；実測値３７８．１４８５ 保持時間８．２分付近
（Ｓ）－臭化１－（３－ｔ－ブトキシカルボニルプロピル）オキシ－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－１－オキソ－３－（２－フェナシルチオ－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパン－２－アミニウムのカチオン部分：［Ｍ］＋ Ｃ２５Ｈ３６Ｎ３Ｏ５Ｓ 計算値４９０．２３７０；実測値４９０．２３６９ 保持時間１０．９分付近
（Ｓ）－酢酸１－（３－ｔ－ブトキシカルボニルプロピル）オキシ－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－１－オキソ－３－（２－チオキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパン－２－アミニウムのカチオン部分：［Ｍ］＋ Ｃ１７Ｈ３０Ｎ３Ｏ４Ｓ 計算値３７２．１９５２；実測値３７２．１９５０ 保持時間８．７分付近
（Ｓ）－４－（３－（２－チオキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）－２－（トリメチルアンモニオ）プロパノイルオキシ）ブタノエート：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１３Ｈ２２Ｎ３Ｏ４Ｓ 計算値３１６．１３２６；実測値３１６．１３３５ 保持時間４．１分付近
Ｌ－ＥＧＴ：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ９Ｈ１６Ｎ３O２Ｓ 計算値２３０．０９５８；実測値 ２３０．０９５６ 保持時間３．０分付近
（Ｓ）－臭化１－カルボキシ－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－２－（２－フェナシルチオ－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）エタンアミニウムのカチオン部分：［Ｍ］＋ Ｃ１７Ｈ２２Ｎ３Ｏ３Ｓ 計算値３４８．１３７６；実測値３４８．１３７７ 保持時間７．５分付近
（Ｓ）－臭化１－（４－メトキシカルボニルベンジルオキシ）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－１－オキソ－２－（２－フェナシルチオ－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパンアミニウムのカチオン部分：［Ｍ］＋ Ｃ２６Ｈ３０Ｎ３Ｏ５Ｓ 計算値４９６．１９０１；実測値４９６．１９０２ 保持時間１１．５分付近
（Ｓ）－塩化１－（４－カルボキシベンジルオキシ）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－１－オキソ－３－（２－チオキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパン－２－アミニウムのカチオン部分：［Ｍ］＋ Ｃ２５Ｈ２８Ｎ３Ｏ５Ｓ 計算値４８２．１７４４；実測値４８２．１７４６ 保持時間９．５分付近
（Ｓ）－１－（４－カルボラトベンジルオキシ）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－１－オキソ－３－（２－チオキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパンアミニウム：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１７Ｈ２２Ｎ３Ｏ４Ｓ 計算値３６４．１３２６；実測値３６４．１３２８ 保持時間７．７分付近
（Ｓ）－臭化－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－１－（４－フェナシルオキシカルボニルメチルベンジルオキシ）－３－（２－フェナシルチオ－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパン－２－アミニウム：［Ｍ］＋ Ｃ３４Ｈ３６Ｎ３Ｏ６Ｓ 計算値６１４．２３１９；実測値６１４．２３２１ 保持時間１２．６分付近
（Ｓ）－１－（４－カルボラトメチルベンジルオキシ）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－１－オキソ－３－（２－チオキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパン－２－アミニウム：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１８Ｈ２４Ｎ３Ｏ４Ｓ 計算値３７８．１４８２；実測値３７８．１４８５ 保持時間８．２分付近
（Ｓ）－臭化１－（３－ｔ－ブトキシカルボニルプロピル）オキシ－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－１－オキソ－３－（２－フェナシルチオ－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパン－２－アミニウムのカチオン部分：［Ｍ］＋ Ｃ２５Ｈ３６Ｎ３Ｏ５Ｓ 計算値４９０．２３７０；実測値４９０．２３６９ 保持時間１０．９分付近
（Ｓ）－酢酸１－（３－ｔ－ブトキシカルボニルプロピル）オキシ－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－１－オキソ－３－（２－チオキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパン－２－アミニウムのカチオン部分：［Ｍ］＋ Ｃ１７Ｈ３０Ｎ３Ｏ４Ｓ 計算値３７２．１９５２；実測値３７２．１９５０ 保持時間８．７分付近
（Ｓ）－４－（３－（２－チオキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）－２－（トリメチルアンモニオ）プロパノイルオキシ）ブタノエート：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１３Ｈ２２Ｎ３Ｏ４Ｓ 計算値３１６．１３２６；実測値３１６．１３３５ 保持時間４．１分付近
【0061】
次に、本発明化合物の用途について試験例を用いて示す。
【0062】
試験例１
本発明化合物とタンパク質とのカップリング試験（コンジュゲートの作成）
試験方法
ＥＧＴおよび実施例１～３で製造した各化合物（ＥＧＴ誘導体）をそれぞれ２－モルホリノエタンスルホン酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ４．５）に溶解し、２０ｍＭになるように調製した。そこに卵白アルブミン（ナカライテスク）もしくはカチオニック牛血清アルブミン（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）の１０ｍｇ／ｍＬ溶液を１ｍＬずつ添加し、混合した。直ちに１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（東京化成工業）を６０ｍｇずつ添加し、混合し、室温で２４時間インキュベートした。その反応液を透析膜に入れ、リン酸緩衝生理食塩水１Ｌに対して３回透析処理をおこなった。透析膜内の液を回収し、そこにブタ肝臓エステラーゼ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）のリン酸緩衝生理食塩水溶液を１５０Ｕ／ｍＬになるように添加し、３７℃で一週間インキュベートした。それを高速液体クロマトグラフィーにかけ、エステラーゼで加水分解されて遊離したＥＧＴ量を測定することで、各アルブミンに結合したＥＧＴおよびＥＧＴ誘導体の分子数を確認した。
本発明化合物とタンパク質とのカップリング試験（コンジュゲートの作成）
試験方法
ＥＧＴおよび実施例１～３で製造した各化合物（ＥＧＴ誘導体）をそれぞれ２－モルホリノエタンスルホン酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ４．５）に溶解し、２０ｍＭになるように調製した。そこに卵白アルブミン（ナカライテスク）もしくはカチオニック牛血清アルブミン（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）の１０ｍｇ／ｍＬ溶液を１ｍＬずつ添加し、混合した。直ちに１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（東京化成工業）を６０ｍｇずつ添加し、混合し、室温で２４時間インキュベートした。その反応液を透析膜に入れ、リン酸緩衝生理食塩水１Ｌに対して３回透析処理をおこなった。透析膜内の液を回収し、そこにブタ肝臓エステラーゼ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）のリン酸緩衝生理食塩水溶液を１５０Ｕ／ｍＬになるように添加し、３７℃で一週間インキュベートした。それを高速液体クロマトグラフィーにかけ、エステラーゼで加水分解されて遊離したＥＧＴ量を測定することで、各アルブミンに結合したＥＧＴおよびＥＧＴ誘導体の分子数を確認した。
【0063】
結果
ＥＧＴには各タンパク質は全く結合しなかった。一方、実施例１のＥＧＴ誘導体は、２１分子／カチオニック牛血清アルブミン、５．７分子／卵白アルブミンの割合で結合した。実施例２のＥＧＴ誘導体は、４．５分子／カチオニック牛血清アルブミン、２．７分子／卵白アルブミンの割合で結合した。実施例３のＥＧＴ誘導体は、３．３分子／卵白アルブミンの割合で結合していることが確認された。
すなわち、本発明化合物（ＥＧＴ誘導体）は、タンパク質と結合してコンジュゲートを形成することが確認できた。
ＥＧＴには各タンパク質は全く結合しなかった。一方、実施例１のＥＧＴ誘導体は、２１分子／カチオニック牛血清アルブミン、５．７分子／卵白アルブミンの割合で結合した。実施例２のＥＧＴ誘導体は、４．５分子／カチオニック牛血清アルブミン、２．７分子／卵白アルブミンの割合で結合した。実施例３のＥＧＴ誘導体は、３．３分子／卵白アルブミンの割合で結合していることが確認された。
すなわち、本発明化合物（ＥＧＴ誘導体）は、タンパク質と結合してコンジュゲートを形成することが確認できた。
【0064】
試験例２
本発明化合物とビーズとのカップリング試験
試験方法
実施例３で製造した化合物（ＥＧＴ誘導体）の４２０ｍＭの水溶液（０．２４ｍＬ）とＦＧ－ＮＨ２ナノ磁性ビーズ（多摩川精機）（１２ｍｇ）を１ｍＬの２－モルホリノエタンスルホン酸緩衝液（２００ｍＭ、ｐＨ４．５）に懸濁した液を混合した。１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（東京化成工業）を１５０ｍｇ添加混合し、室温で激しく撹拌しながら１８時間インキュベートした。２ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水で４回洗浄した。それを０．６ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁した。その懸濁液を０．１ｍＬに小分けし、そこにブタ肝臓エステラーゼ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）のリン酸緩衝生理食塩水溶液を１５０Ｕ／ｍＬになるように添加し、３７℃で一週間インキュベートした。それを高速液体クロマトグラフィーにかけ、エステラーゼで加水分解されて遊離したＥＧＴ量を測定することで、ナノ磁性ビーズに結合したＥＧＴ誘導体の分子数を確認した。
本発明化合物とビーズとのカップリング試験
試験方法
実施例３で製造した化合物（ＥＧＴ誘導体）の４２０ｍＭの水溶液（０．２４ｍＬ）とＦＧ－ＮＨ２ナノ磁性ビーズ（多摩川精機）（１２ｍｇ）を１ｍＬの２－モルホリノエタンスルホン酸緩衝液（２００ｍＭ、ｐＨ４．５）に懸濁した液を混合した。１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（東京化成工業）を１５０ｍｇ添加混合し、室温で激しく撹拌しながら１８時間インキュベートした。２ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水で４回洗浄した。それを０．６ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁した。その懸濁液を０．１ｍＬに小分けし、そこにブタ肝臓エステラーゼ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）のリン酸緩衝生理食塩水溶液を１５０Ｕ／ｍＬになるように添加し、３７℃で一週間インキュベートした。それを高速液体クロマトグラフィーにかけ、エステラーゼで加水分解されて遊離したＥＧＴ量を測定することで、ナノ磁性ビーズに結合したＥＧＴ誘導体の分子数を確認した。
【0065】
結果
実施例３のＥＧＴ誘導体は、ＦＧ－ＮＨ２ナノ磁性ビーズのアミノ基に１０モル％結合していることが確認された。
すなわち、本発明化合物（ＥＧＴ誘導体）は、ビーズと結合することが確認できた。
実施例３のＥＧＴ誘導体は、ＦＧ－ＮＨ２ナノ磁性ビーズのアミノ基に１０モル％結合していることが確認された。
すなわち、本発明化合物（ＥＧＴ誘導体）は、ビーズと結合することが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【0066】
本発明製造方法により、ＥＧＴ誘導体を効率的に製造することができる。また、本発明化合物は、ＥＧＴの高い生理活性を説明できるメカニズムの解明に有用である。