特開 2023-181147 動物細胞の培養に用いられる血清代替物又は培地添加物、及びそれを製造する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023181147

(43)【公開日】2023-12-21

(54)【発明の名称】動物細胞の培養に用いられる血清代替物又は培地添加物、及びそれを製造する方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/07 20100101AFI20231214BHJP

【ＦＩ】

C12N5/07

【審査請求】未請求

【請求項の数】13

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023095669

(22)【出願日】2023-06-09

(31)【優先権主張番号】63/350,952

(32)【優先日】2022-06-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和４年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、未来社会創造事業「３次元組織工学による次世代食肉生産技術の創出」委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願

(71)【出願人】

【識別番号】591173198

【氏名又は名称】学校法人東京女子医科大学

(71)【出願人】

【識別番号】899000068

【氏名又は名称】学校法人早稲田大学

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100197169

【弁理士】

【氏名又は名称】柴田 潤二

(72)【発明者】

【氏名】清水 達也

(72)【発明者】

【氏名】原口 裕次

(72)【発明者】

【氏名】山中 久美子

(72)【発明者】

【氏名】秋山 義勝

(72)【発明者】

【氏名】朝日 透

(72)【発明者】

【氏名】ジャイーシャ ゴーシュ

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065BB28

4B065BB40

(57)【要約】

【課題】環境負荷と環境変化への影響のリスクを減らす新規細胞培養系を確立することを目的とする。
【解決手段】本発明は、動物細胞の培養に用いられる血清代替物又は培地添加物を製造する方法であって、藻類の抽出物を有機溶媒で洗浄し、前記有機溶媒に溶解する成分を除去した後の残存成分を得る工程を含む、方法を提供する。また、本発明は、藻類の抽出物から有機溶媒に溶解する成分を除去した成分を含む、動物細胞の培養に用いられる血清代替物又は培地添加物を提供する。
【選択図】図１０

【特許請求の範囲】

【請求項1】

動物細胞の培養に用いられる血清代替物又は培地添加物を製造する方法であって、
藻類の抽出物を有機溶媒で洗浄し、前記有機溶媒に溶解する成分を除去した後の残存成分を得る工程
を含む、方法。

【請求項2】

前記有機溶媒が、炭素数が５～２０の非置換型炭化水素、及び置換基を除く炭素数が１～６の置換型炭化水素からなる群より選ばれる、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記有機溶媒が、メタノール又はエタノールである、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記藻類が、微細藻類である、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記藻類が、緑藻類の微細藻類である、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記藻類が、クロレラ属又はクロロコックム属の微細藻類である、請求項４に記載の方法。

【請求項7】

前記抽出物が、超音波処理によって得られる、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記抽出物が、凍結乾燥された抽出物である、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記抽出物が、加水分解処理により得られる抽出物である、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

請求項１に記載の方法により得られる、動物細胞の培養に用いられる血清代替物又は培地添加物。

【請求項11】

藻類の抽出物から有機溶媒に溶解する成分を除去した後の成分を含む、動物細胞の培養に用いられる血清代替物又は培地添加物。

【請求項12】

請求項１０又は１１のいずれか１項に記載の血清代替物又は培地添加物を用いる、動物細胞の培養方法。

【請求項13】

請求項１０又は１１のいずれか１項に記載の血清代替物又は培地添加物を、血清を実質的に含まない培地に添加して用いる、動物細胞の培養方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、動物細胞の培養に用いられる血清代替物又は培地添加物に関する。また、本発明は、動物細胞の培養に用いられる血清代替物又は培地添加物を製造する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

哺乳類細胞を用いた細胞培養技術は、分子生物学、細胞生物学、生理学、遺伝学、生化学などの基礎学術分野の進展に大きく貢献してきた。さらに、この技術は医学、獣医学、薬学、生体材料工学および農業などの応用科学分野でも用いられており、細胞培養技術は様々な疾患の病因を解明し、その治療法の基礎をもたらしている［非特許文献１］。後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）や新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）症状をはじめとする各種疾患の治療薬開発には、哺乳類培養細胞が産生するバイオ医薬品やワクチンが用いられる［非特許文献２，３］。さらに最近では、「培養肉」の細胞源として培養筋細胞が用いられている［非特許文献４］

【0003】

通常、哺乳類細胞培養には胎児ウシ血清（ＦＢＳ）のような高価な動物血清が必要である。培養系の大部分は、最適な細胞増殖のために動物血清を用いることに大きく依存しているが、動物血清の使用は、細胞培養系が高コストになり、その結果、細胞治療および薬物開発が高コストとなる。

【0004】

血清代替源を開発するために様々な努力がなされている。選択肢が限られているにもかかわらず、組換え増殖因子の産生は無血清のアプローチとしても適用されている。例えば、Escherichia coliが産生する組換え線維芽細胞成長因子が無血清培養に用いられている［非特許文献５，６］。

【0005】

しかしながら、精製および下流工程は複雑であり、ロット間に変動がある［非特許文献７］。また、Ｃ－フィコシアニン、キトサン、カルボキシメチルセルロースからなる多糖類ナノ層が、血清減少培養条件において哺乳類の筋細胞の増幅を改善したが、細胞培養におけるＦＢＳの使用を完全に排除することはできなかった［非特許文献８］。

【0006】

Ｊｉａｎら（２０２０）は、クロレラの水性抽出物が非常に低濃度で細胞増殖を増強することを報告した。血清の完全な非存在下では、７日間にわたる藻類由来の増殖因子は、細胞死を逆転させるのには限られた効果しか示さない［非特許文献９］。一方、様々なシアノバクテリアや微細藻類の栄養学的利点に関する研究や、栄養産業への応用についても一貫した試みがなされている。本発明者らの以前の試験で、Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓの加水分解抽出物は、哺乳類細胞増殖に正に影響する可能性を示した。微細藻類からの栄養抽出物を用いて哺乳類細胞を細胞死からレスキューされ、微細藻類抽出物はグルコース、アミノ酸、ビタミンを含む栄養代替物として利用されていることが示された［特許文献１、非特許文献１０］。Ｃ．ｌｉｔｔｏｒａｌｅとＣ２Ｃ１２マウス細胞を組み合わせることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの三次元組織共培養系を作製した［特許文献２、非特許文献１１］。さらには、微細藻類抽出物は、より安価で持続可能な栄養素および血清サプリメントとして役立つ大きな潜在能力を有する。そこで、いくつかの医薬品・栄養補助企業は、微細藻類からの簡単な抽出処理を用いて、機能性成分を有する新規製品の開発に取り組んでいる［非特許文献１２，１３］。

【0007】

以前はバッチ処理として知られていた溶媒抽出処理は、１９７０年にヨーロッパで開発された。植物種子から油脂を回収するために使用され、使用された最も一般的な溶媒はクロロホルム、メタノールまたはヘキサンであった［非特許文献１４］。しかし、ごく最近、リノール酸含量の高いＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓからの脂質抽出法として超音波処理が効率的であることが証明されている［非特許文献１５］。これは超音波処理が微小流動を誘導し、細胞成分を保護している細胞壁を最終的に破裂させるためである［非特許文献１６］。細胞成分は溶媒と容易に混合され、細胞壁は遠心分離によって分離される。この技術には、抽出時間の短縮、品質と収率の向上、エネルギー消費の低下、ひいては環境に優しいものになるといったいくつかの利点がある［非特許文献１７］。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】国際公開第２０２１／０６６１１３号

【特許文献2】国際公開第２０１６／２０８７４７号

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Lancet. 374 (2009) 1597-1605

【非特許文献2】Nat. Biotechnol. 22 (2004) 1393-1398

【非特許文献3】iScience. 24 (2021) 103120

【非特許文献4】Ann. N. Y. Acad. Sci. 1328 (2014) 29-33

【非特許文献5】Cell Prolif. 46 (2013) 608-627

【非特許文献6】Sci. Rep. 6 (2016) 33948

【非特許文献7】Thromb. Haemost. 100 (2008) 217-223

【非特許文献8】ACS Appl. Mater. Interfaces. 13 (2021) 32193-32204

【非特許文献9】Front Bioeng Biotechnol. 8 (2020) 564667

【非特許文献10】Biotechnol. Prog. (2022) e3239

【非特許文献11】Sci. Rep. 7 (2017) 1-10

【非特許文献12】Microb. Biotechnol. 8 (2015) 190-209

【非特許文献13】Biomed Res. Int. 2015 (2015) 835761

【非特許文献14】AOCS Publishing, 2005, https://doi.org/10.4324/9781003040101

【非特許文献15】Lett. Appl. Microbiol. 53 (2011) 150-154

【非特許文献16】Br. J. Cancer Suppl. 5 (1982) 156-160

【非特許文献17】Sci. Rep. 11 (2021) 20221

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明は、環境負荷と環境変化への影響のリスクを減らす新規細胞培養系を確立することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者らは、上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて研究開発を行ってきた。その結果、藻類の抽出物から有機溶媒に溶解する成分を除去して得られる残留成分は、動物細胞の培養に用いられる新規な血清代替物または培地添加物となり得ることを見出し、本発明を開発するに至った。すなわち、本願発明は以下の態様を含む。

【0012】

［１］ 動物細胞の培養に用いられる血清代替物又は培地添加物を製造する方法であって、
藻類の抽出物を有機溶媒で洗浄し、前記有機溶媒に溶解する成分を除去した後の残存成分を得る工程
を含む、方法。
［２］ 前記有機溶媒が、炭素数が５～２０の非置換型炭化水素、及び置換基を除く炭素数が１～６の置換型炭化水素からなる群より選ばれる、［１］に記載の方法。
［３］ 前記有機溶媒が、メタノール又はエタノールである、［１］に記載の方法。
［４］ 前記藻類が、微細藻類である、［１］～［３］のいずれか１項に記載の方法。
［５］ 前記藻類が、緑藻類の微細藻類である、［１］～［４］のいずれか１項に記載の方法。
［６］ 前記藻類が、クロレラ属又はクロロコックム属の微細藻類である、［４］に記載の方法。
［７］ 前記抽出物が、超音波処理によって得られる、［１］～［６］のいずれか１項に記載の方法。
［８］ 前記抽出物が、凍結乾燥された抽出物である、［１］～［７］のいずれか１項に記載の方法。
［９］ 前記抽出物が、加水分解処理により得られる抽出物である、［１］～［８］のいずれか１項に記載の方法。
［１０］ ［１］～［９］のいずれか１項に記載の方法により得られる、動物細胞の培養に用いられる血清代替物又は培地添加物。

【0013】

［１１］ 藻類の抽出物から有機溶媒に溶解する成分を除去した成分を含む、動物細胞の培養に用いられる血清代替物又は培地添加物。
［１２］ 前記有機溶媒が、炭素数が５～２０の非置換型炭化水素、及び置換基を除く炭素数が１～６の置換型炭化水素からなる群より選ばれる、［１１］に記載の血清代替物又は培地添加物。
［１３］ 前記有機溶媒が、メタノール又はエタノールである、［１１］に記載の血清代替物又は培地添加物。
［１４］ 前記藻類が、微細藻類である、［１１］～［１３］のいずれか１項に記載の血清代替物又は培地添加物。
［１５］ 前記藻類が、クロレラ属の微細藻類である、［１４］に記載の血清代替物又は培地添加物。
［１６］ 前記抽出物が、超音波処理によって得られる、［１１］～［１５］のいずれか１項に記載の血清代替物又は培地添加物。
［１７］ 前記抽出物が、凍結乾燥された抽出物である、［１１］～［１６］のいずれか１項に記載の血清代替物又は培地添加物。
［１８］ 前記抽出物が、加水分解処理により得られる抽出物である、［１１］～［１７］のいずれか１項に記載の血清代替物又は培地添加物。

【0014】

［１９］ ［１１］～［１８］のいずれか１項に記載の血清代替物又は培地添加物を用いる、動物細胞の培養方法。
［２０］ ［１１］～［１８］のいずれか１項に記載の血清代替物又は培地添加物を、血清を実質的に含まない培地に添加して用いる、動物細胞の培養方法。

【発明の効果】

【0015】

本発明の方法によれば、細胞の培養に必要な栄養素を微細藻類から容易に抽出可能であり、安価であり、かつ環境負荷を低減させる新たな細胞培養系を提供することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1A-K】Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓからの水溶性化合物（ＣＷ）の抽出のスキーム（Ａ－Ｋ）、ＣＷの有効性を評価するための生存率アッセイ（Ｌ）、及び、増殖及び免疫蛍光アッセイ（Ｍ）のスキーム。ＤＭＥＭ： Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ’ Ｍｅｄｉｕｍ、 ＦＢＳ：胎仔ウシ血清。 ４０ＣＷ（４０μＬ ＣＷ＋６０μＬ ＤＭＥＭ）；２０ＣＷ（２０μＬ ＣＷ＋８０μＬ ＤＭＥＭ）；１０ＣＷ（１０μＬ ＣＷ＋９０μＬ ＤＭＥＭ）；５ ＣＷ（５μＬ ＣＷ＋９５μＬ ＤＭＥＭ）；２ＣＷ（２μＬ ＣＷ＋９８μＬ ＤＭＥＭ）。

【図1L-M】同上。

【図2】走査型電子顕微鏡下での超音波処理前（Ａ，Ｂ）および処理後（Ｃ，Ｄ）のＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓの形態。Ａ、Ｃ：低倍率（８５０×）； Ｂ、Ｄ：高倍率（４２００×）。

【図3】（Ａ）次の時間プログラムに従ってアセトニトリル（ＡＮ）濃度勾配条件下で逆相クロマトグラフィーカラムを備えたＨＰＬＣシステムを用いて得られたクロマトグラム：最初の５分は１００％溶媒Ｂ、続く５分～２５分は２０％～８０％溶媒Ｂ、２５分から８０％溶媒Ａ。（Ｂ）次の時間プログラムのアセトニトリル（ＡＮ）濃度勾配条件下を有する陰イオン交換クロマトグラフィーカラムを備えたＨＰＬＣシステムを用いて得られたクロマトグラム：最初の５分は８０％溶媒Ａ、続く５分～２５分は８０％～２０％溶媒Ａ、２５分から２０％溶媒Ｂ。

【図4A】（Ａ）Ｄａｙ０に播種した３０００細胞（ｉ）および６０００細胞（ｉｉ）における１０％ ＦＢＳの有無及び様々な濃度のＣＷによるＣ２Ｃ１２細胞の生存率と増殖、並びに（Ｂ）各培地で計数した筋芽細胞数。ＤＭＥＭ： Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ’ Ｍｅｄｉｕｍ； ＦＢＳ：胎仔ウシ血清； ｗ／ｏ ＦＢＳ：ＦＢＳなし； ＣＷ：水溶性化合物。データは平均±標準偏差（ｎ＝３）で表されている。ｐ値が０．０５未満の場合、統計的に有意とみなした。

【図4B】同上。

【図5】１０％ ＦＢＳ有り又は無しでのＣ２Ｃ１２細胞の生存率。Ｄａｙ０に播種した細胞数は６０００個であった。細胞を種々の濃度の超音波処理粗（ＣＲ）抽出物で処理した。ＤＭＥＭ： Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ’ Ｍｅｄｉｕｍ； ＦＢＳ：胎仔ウシ血清； ｗ／ｏ ＦＢＳ：ＦＢＳなし； ＣＲ：超音波処理試料； ２０ＣＲ：２０μＬ ＣＲ＋８０μＬ ＤＭＥＭ； １０ＣＲ：１０μＬ ＣＲ＋９０μＬ ＤＭＥＭ； ５ＣＲ：５μＬ ＣＲ＋９５μＬ ＤＭＥＭ； ２ＣＲ：２μＬ ＣＲ＋９８μＬ ＤＭＥＭ。データは平均値±標準偏差（ｎ＝３）で表されている。

【図6】次の時間プログラムに従ってアセトニトリル勾配下で陰イオン交換クロマトグラフィーカラムを備えたＨＰＬＣシステムで得られたクロマトグラム：最初の５分は８０％溶媒Ａ、続く５分～２５分は８０％～２０％溶媒Ａ、続く２５分から２０％溶媒Ａ。３つの別々の抽出試験（ＣＷ試験１、２および３）後に分析を行い、粗抽出液と比較した。流量は１ｍＬ／ｍｉｎ、ＵＶ検出器は２５４ｎｍに設定した。ＣＷの濃度は注射当り２ｍｇ／ｍＬであった。ＣＷ：水溶性化合物。

【図7】メタノールと水の移動相１：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）におけるＣＷ（濃度：２０ｍｇ／ｍＬ）の滴下をＴＬＣシリカゲル６０ Ｆ_２５４上にスポットし、紫外線（２５４ｎｍ）で視覚化した。また、ニンヒドリンチェックを行い、アミノ酸の存在を確認した。ＣＷ：水溶性化合物。

【図8】超音波処理した試料（Ｃｒｕｄｅ）、メタノールに溶解した試料（Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｓｏｌｕｂｌｅ ｉｎ ｍｅｔｈａｎｏｌ（ＣＭ））および水に溶解した試料（Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｓｏｌｕｂｌｅ ｉｎ ｗａｔｅｒ（ＣＷ））中の栄養素の分析。主要アミノ酸は、３検体すべてにおいて種々の濃度で検出された。データは平均値±標準偏差（ｎ＝３）で表されている。

【図9】Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞のＭｙｏＤ陽性細胞（緑）、アクチンフィラメント（赤）および核（青）の蛍光顕微鏡三重染色画像。ＤＭＥＭ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ’ Ｍｅｄｉｕｍ； ＦＢＳ：胎仔ウシ血清； ｗ／ｏ ＦＢＳ：ＦＢＳなし； ＣＷ：水溶性化合物； ４０ＣＷ：４０μＬ ＣＷを８０μＬ ＤＭＥＭに添加。スケールバー：１００ μｍ。

【図10】各培地で培養したＮＩＨ３Ｔ３細胞の数（ｎ＝３）。３×１０００ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（初期細胞数）でＮＩＨ３Ｔ３細胞を播種し、１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ培地で２４時間培養した後、ＦＢＳ（ＤＭＥＭ（１０％血清入り）培地）とｗ／ｏＦＢＳ（血清なしＤＭＥＭ培地）、２０ＣＷ（２０ｍｇ／ｍＬ濃度のＣＷ溶液（ＤＭＥＭに溶解）を２０ｕＬと８０ｕＬのＤＭＥＭを混合した培地）、４０ＣＷ（２０ｍｇ／ｍＬ濃度のＣＷ溶液（ＤＭＥＭに溶解）を４０μＬと６０μＬのＤＭＥＭを混合した培地）に交換し、さらに７２時間培養した後の細胞接着数を計測した。

【図11】各培地で培養したＣＨＯ細胞の数（ｎ＝３）。３×１０００ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（初期細胞数）でＣＨＯ細胞を播種し、１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ培地で２４時間培養した後、ｗ／ｏＦＢＳ（血清なしＤＭＥＭ培地）、２０ＣＷ（２０ｍｇ／ｍＬ濃度のＣＷ溶液（ＤＭＥＭに溶解）を２０μＬと８０μＬのＤＭＥＭを混合した培地）に交換し、さらに７２時間培養した後の細胞接着数を計測した。

【図12】ＤＭＥＭ（ｗ／ｏ ＦＢＳ）単独または１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭと比較した、様々な濃度のＣＷを添加した（Ａ）３０００ ｃｅｌｌｓ及び（Ｂ）６０００ ｃｅｌｌｓ播種１日目のＣ２Ｃ１２細胞の生存率の確認。ＤＭＥＭ（ｗ／ｏ ＦＢＳ）単独または１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭと比較した、様々な濃度のＣＷを添加した（Ｃ）３０００ ｃｅｌｌｓ及び（Ｄ）６０００ ｃｅｌｌｓ播種１日目の３Ｔ３細胞の生存率の確認。ＤＭＥＭ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ’ Ｍｅｄｉｕｍ； ＦＢＳ：胎仔ウシ血清； ｗ／ｏ ＦＢＳ：ＦＢＳなし； ＣＷ：水溶性化合物。データは平均値±標準偏差で表した（ｎ＝３）。ｐ値は０．０５未満で統計的に有意とみなした。

【図13】（Ａ）各条件で示した各培地におけるＣ２Ｃ１２筋芽細胞の数をカウントすることにより、細胞増殖率を算出した。データは、平均値±標準偏差で表した（ｎ＝３）。ｐ値は０．０５未満で統計的に有意とみなした。（Ｂ）Ｈｏｅｃｈｓｔ（青色）で染色したＣ２Ｃ１２筋芽細胞の細胞核の蛍光顕微鏡像。（Ｃ）各条件下で示した各培地における３Ｔ３線維芽細胞数をカウントすることにより細胞増殖率を算出した。データは、平均値±標準偏差で表した（ｎ＝３）。ｐ値は０．０５未満で統計的に有意とみなした。（Ｄ）Ｈｏｅｃｈｓｔ（青色）で染色した３Ｔ３線維芽細胞の細胞核の蛍光顕微鏡像。ＤＭＥＭ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ’ Ｍｅｄｉｕｍ； ＦＢＳ：胎仔ウシ血清； ｗ／ｏ ＦＢＳ：ＦＢＳなし； ＣＷ：水溶性化合物（２０ｍｇ／ｍＬ）。スケールバー：１００μｍ。

【図14】各培地でカウントされたＣＨＯ細胞数は、各条件下での細胞増殖を示す。培地；ｗ／ｏ ＦＢＳ：ＦＢＳなし（１６ｍＬ ＤＭＥＭ＋４ｍＬ 塩水）； ＣＷ：水溶性化合物（１６ｍＬ ＤＭＥＭ＋４ｍＬ ＣＷ）。データは平均値±標準偏差で表す（ｎ＝３）。スケールバー：１００μｍ。

【図15】ＣＨＯ細胞は、正確な細胞懸濁培養条件下で４回継代した。（Ａ）各条件下での細胞増殖を示す各培地でカウントされたＣＨＯ細胞の数。培地； ＦＢＳ；牛胎仔ウシ血清（１６ｍＬ ＤＭＥＭ＋２ｍＬ ＦＢＳ＋２ｍＬ 塩溶液）； ｗ／ｏ ＦＢＳ：ＦＢＳなし（１６ｍＬ ＤＭＥＭ＋４ｍＬ 塩溶液）； ２０ＣＷ：水溶性化合物（１６ｍＬ ＤＭＥＭ＋４ｍＬ ＣＷ（２０ｍｇ／ｍＬ））。全ての培養条件において、等量の１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充した。Ｐ４では、ｗ／ｏ ＦＢＳの細胞が回収できないため、０ ｃｅｌｌｓ／ｍＬとした。（Ｂ）細胞集団倍加数（ＮＣＰＤ）は、各継代後に算出した。データは平均値±標準偏差で表した（ｎ＝３）。ｐ値が０．０５未満は統計的に有意とみなした。

【発明を実施するための形態】

【0017】

以下、本発明の実施形態について、必要に応じて図面を参照にしながら説明する。実施形態の構成は例示であり、本発明の構成は、実施形態の具体的構成に限定されない。なお、本明細書で引用されている全ての文献は、その全内容が参照により本明細書に援用される。

【0018】

本明細書において、「約」との用語は、それが付された数値の±１０％、好ましくは±５％、より好ましくは±３％、さらに好ましくは±１％の範囲の数値が含まれることを意味する。

【0019】

一実施態様において、本発明は、動物細胞の培養に用いられる血清代替物又は培地添加物を製造する方法であって、
藻類の抽出物を有機溶媒で洗浄し、前記有機溶媒に溶解する成分を除去した後の残存成分を得る工程、を含む、方法を提供する。

【0020】

また、一実施態様において、本発明は、藻類の抽出物から有機溶媒に溶解する成分を除去した後の成分を含む、動物細胞の培養に用いられる血清代替物又は培地添加物を提供する。

【0021】

本発明により提供される血清代替物又は培地添加物は、動物細胞の培養に用いられる新規な血清代替物または培地添加物となり得る。従来、動物細胞をインビトロで培養する場合、血清又は無血清培養の添加因子を添加した動物細胞用培地を用いる必要がある。しかしながら、本願発明によって提供される血清代替物又は培地添加物は、従来の培養で添加して用いられる血清（例えば、胎児ウシ血清など）と近い又は同等の効果を発揮するという驚くべき知見を発見したことにより完成させたものである。

【0022】

本発明により提供される血清代替物又は培地添加物は、従来の動物細胞の培養において用いられる血清もしくは無血清培養の添加因子を代替する、又はそれらの効果を増強もしくは補強するために用いられ得る。特に、従来の動物細胞の培養で用いられる血清（例えば、胎児ウシ血清(FBS)など）はロット毎に品質が異なり、また高価であることから、それらを用いて安定的かつ大量に動物細胞を培養するためにはコストが増大するという課題を抱えていた。本発明により提供される血清代替物又は培地添加物は、原料が安価な藻類であることから、一定の品質を保ちながら安価にかつ大量に供給可能であることから、これらの課題の解決に寄与し得る。

【0023】

本明細書において「血清」とは、血液が凝固した時、上澄みにできる淡黄色の液体成分のことをいい、増殖因子などの細胞の増殖に必要な因子が含まれている。その由来は、ヒト、ウシの胎児、ウシの新生児、馬、ニワトリ、ウサギ等であってもよく、特に限定されない。本発明によって提供される血清代替物又は培地添加物は、血清を実質的に含まない培地に添加して用いた場合によっても、血清が含まれていた場合と近い又は同等の細胞増殖効果を発揮し得る。

【0024】

本明細書において「無血清培養の添加因子」とは、無血清培地において、血清の代わりに、一般に添加される細胞を増殖（成長）させる因子をいい、例えば、インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、アルブミン、メルカプトエタノール、プロスタグランジンなど、目的の細胞に合わせて無血清培地に添加されるものをいう。本発明によって提供される血清代替物又は培地添加物は、これらの無血清培養の添加因子が含まれていなくても、無血清培養の添加因子が含まれていた場合と近い又は同等の細胞増殖効果を発揮し得る。

【0025】

本明細書において、「実質的に含まない」とは、該当する物質がほとんど含まれていないことを意味しているが、該当する物質が全く含まれていないことを意味するのではなく、例えば、血清であれば、１％（ｖ／ｖ）未満（例えば、１％（ｖ／ｖ）未満、０．５％（ｖ／ｖ）未満、又は０．１％（ｖ／ｖ）未満）含まれるものであってもよく、無血清培養の添加因子であれば、１μｇ／Ｌ未満（例えば、１μｇ／Ｌ未満、０．５μｇ／Ｌ未満、０．１μｇ／未満）含まれるものであってもよい。

【0026】

本明細書において、「藻類」とは、光合成により酸素を産生する生物のうち、主に地上に生息するコケ植物、シダ植物、種子植物を除いたものの総称をいう。藻類は光合成に必要な環境が整えば、酸素、栄養分（例えば、グルコース、アミノ酸）を自ら作り出すことができ、増殖することができる。

【0027】

一実施態様において、本発明の用いられる藻類は、「単細胞藻類（「微細藻類」ともいう。）であってもよい。本明細書において、「単細胞藻類」とは、藻類の中でも、個体が単一の細胞からなる藻類をいい、複数の単細胞藻類個体が集まり、群体を形成する単細胞藻類も含む。例えば、クロロフィルａ及びｂを葉緑体の主要色素とする緑藻類、クロロフィルｄを主要色素とする単細胞性の藍藻類（シアノバクテリア）、クロロフィルａ及びフィコビリンタンパク質を主要色素とする単細胞性の紅藻類が単細胞藻類の例として挙げられる。さらに詳しく例を挙げると、例えば、緑藻類では、緑藻綱ボルボックス目のクラミドモナス属であるクラミドモナス・レインハルドティ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）（和名：コナミドリムシ）；ボルボックス目のボルボックス属であるボルボックス・カルテリ（Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉ）（和名：オオヒゲマワリ）；ドナリエラ目のドナリエラ属であるドナリエラ・サリナ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａ）（和名：ドナリエラ）；クロロコックム目のクロロコックム属であるクロロコックム・リットラレ（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ ｌｉｔｔｏｒａｌｅ）；ヨコワミドロ目のアミミドロ属であるヒドロディクティオン・レティキュラツム（Ｈｙｄｒｏｄｉｃｔｙｏｎ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）（和名：アミミドロ）、クンショウモ属であるペディアストラム・デュプレックス（Ｐｅｄｉａｓｔｒｕｍ ｄｕｐｌｅｘ）（和名：クンショウモ）、イカダモ属であるセネデスムス・ディモルファウス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ）（和名：イカダモ）；トレボウキシア藻綱クロレラ目のクロレラ属であるクロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓｋ）（和名：クロレラ）；ユーグレナ植物門ユーグレナ藻綱ユーグレナ目のミドリムシ属であるユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）及びユーグレナ プロキシマ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｐｒｏｘｉｍａ）（和名：ミドリムシ）などが挙げられる。例えば、単細胞性の藍藻類では、シアノバクテリア門のアカリオクロリス・マリナ（Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ）、スピルリナ・サブサルサ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｓｕｂｓａｌｓａ）、アルスロスピラ・プラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）などが挙げられる。例えば、単細胞性の紅藻類では、紅藻植物門イデユコゴメ綱イデユコゴメ目のシアニジウム カルダリウム（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ ｃａｌｄａｒｉｕｍ）（和名：イデユコゴメ）又は紅藻植物門イデユコゴメ綱イデユコゴメ目のガルディエリア パルティータ（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ ｐａｒｔｉｔａ）などが挙げられる。例えば、単細胞性の車軸藻類では、緑色植物門の車軸藻網クレブソルミディウム目のスティココックス属（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）が挙げられる。また、単細胞性のアオサ藻網の藻類であるフィラメントス－ウルボフィテ（Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ－ｕｌｖｏｐｈｙｔｅ）が挙げられる。本発明に用いられる藻類は、上記で挙げられた藻類の遺伝子操作が行われた遺伝子組換え体であってもよく、上記の藻類に限定されない。

【0028】

本発明に用いられる藻類は、天然の藻類を用いても良く、公知の培養法によって増殖させた藻類を用いても良い。

【0029】

一実施態様において、本発明の用いられる藻類は、緑藻類の微細藻類であってもよい。

【0030】

一実施態様において、本発明の用いられる藻類はクロレラ属の微細藻類であってもよく、例えば、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ（Ｃ．ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）やＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ（Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）などのクロレラ属の微細藻類を用いることができる。

【0031】

一実施態様において、本発明の用いられる藻類はクロロコックム目の微細藻類であってもよく、例えば、クロロコックム・リットラレ（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ ｌｉｔｔｏｒａｌｅ）などのクロロコックム属の微細藻類を用いることができる。

【0032】

一実施態様において、本発明を提供するために用いられる藻類の抽出物は、藻類を超音波処理することによって得られるものであってもよい。超音波処理の方法は、公知の方法及び超音波破砕装置を用いることによって実施すればよく、藻類を破砕し、藻類の体内に存在する成分を体外へ放出させるのに必要かつ十分な条件で処置を行えばよい。用いられる藻類の種類や量などによって、実施される超音波処理の条件（周波数、出力、時間など）は調整されるためにその条件は限定されないが、例えば、１０ｋＨｚ～１０００ｋＨｚ、１０～１００ｋＨｚ、又は１５～８０ｋＨｚであってもよく、例えば約２０ｋＨｚ、約３０ｋＨｚ、約４０ｋＨｚ、約５０ｋＨｚ、約６０ｋＨｚ、約７０ｋＨｚ、約８０ｋＨｚであってもよい。超音波照射の出力は、例えば、５０～６００Ｗ、１００～４００Ｗ、１５０～３００Ｗであってもよい。超音波処理の時間は、例えば、２０秒～１００分、１分～６０分、または２分～３０分であってもよく、例えば約１０分であってもよい。超音波処理を実施するために用いられる溶媒は、水を含むものであれば用いることができる。超音波処理した藻類は、その後遠心分離が行われ、その上清を藻類の抽出物としてもよい。

【0033】

一実施態様において、本発明を提供するために用いられる藻類の抽出物は、凍結乾燥された抽出物であってもよい。凍結乾燥は、公知の凍結乾燥法、例えば市販の凍結乾燥機を用いることにより実施することができる。凍結乾燥処理は、藻類に対して上記の超音波処理の前に実施してもよく、超音波処理後、遠心分離を行った後の上清に対して実施してもよく、超音波処理の前及び後の両方で実施してもよい（例えば、図１Ａ－Ｋ参照）。

【0034】

一実施態様において、本発明を提供するために用いられる藻類の抽出物は、加水分解処理により得られる抽出物であってもよい。藻類を加水分解処理する方法は、例えば、液体酸を用いた方法（例えば、国際公開第２０２１／０６６１１３号）や固体酸を用いた方法（例えば、国際公開第２０２２／２７０５９８号）などを実施する方法であってもよい。一般に、タンパク質や多糖などの生体高分子は、加熱下（例えば、約６０℃～約２００℃、好ましくは約８０℃～約１８０℃、より好ましくは約７０℃～約１５０℃、さらに好ましくは約９５℃～約１３５℃）で加水分解され、オリゴマーやモノマー（タンパク質においてはペプチドやアミノ酸、多糖においてはオリゴ糖、単糖）を生じる。従って、加水分解処理は、約６０℃～約２００℃、好ましくは約８０℃～約１８０℃、より好ましくは約７０℃～約１５０℃、さらに好ましくは約９５℃～約１３５℃で実施されてもよい。また、加水分解処理の時間は、用いられる藻類の種類、量、又は濃度、あるいは反応溶液のｐＨ、温度などの条件によって調整することができ、例えば、約３０分～約４８時間、約１時間～約３６時間、約２時間～約２４時間、約２．５時間～約１２時間、約２．５時間～約７時間実施されてもよい。

【0035】

また、上記の加水分解処理は、加圧下で実施されてもよい。本明細書において、「加圧下」とは、大気圧、すなわち１気圧よりも高い気圧条件をいい、例えば、１．１気圧以上、１．５気圧以上、１．８気圧以上、又は２気圧以上で実施されてもよい。例えば、１．１～３００気圧、１．５～２００気圧、１．８～１００気圧、２～５０気圧、例えば２～２０気圧であってもよい。加圧条件は、任意の装置や方法によって実施されてもよく、例えば、オートクレーブを用いることによって加圧条件を実現することができる。

【0036】

一実施態様において、本発明を提供するために用いられる藻類の抽出物は、上記の超音波処理、凍結乾燥処理、又は加水分解処理、あるいはこれらを組み合わせた処理により得られる抽出物であってもよい。

【0037】

本願発明により提供される血清代替物または培地添加物は、上記の藻類の抽出物を有機溶媒で洗浄し、前記有機溶媒に溶解する成分を除去した後の残存成分を得る工程を経ることで提供され得る。

【0038】

本発明に用いることができる有機溶媒は、常温常圧下（本明細書では、２０℃１気圧下とする）で液体の有機化合物であり、植物（特に藻類）からの脂溶性成分の抽出に通常用いられるものを適用し得る。そのような有機溶媒の例としては、非置換型又は置換型の炭化水素が挙げられる。本発明における非置換型炭化水素とは、アルカン、アルケン、アルキン、シクロアルカン、及び芳香族炭化水素等を指し、これらの化合物の水素原子の一部が置換基で置換されたものが置換型炭化水素である。

【0039】

前記置換型炭化水素における好適な置換基の例としては、ハロ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アセチル基、シアノ基、アルキル基、及びアルコキシ基等が挙げられる。前記アルキル基及びアルコキシ基は炭素数が１～３であることが好ましい。また、置換型炭化水素１分子に占める置換基の数は、１～３であってよい。

【0040】

一実施態様において、本発明に用いられる有機溶媒は、炭素数が５～２０の非置換型炭化水素（例えば、炭素数が５～１０の非置換型炭化水素）、及び置換基を除く炭素数が１～６の置換型炭化水素からなる群より選ばれる１以上の炭化水素を、有機溶媒として好適に用いることができる。当該炭化水素の具体例としては、ｎ－ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、塩化メチレン、二塩化エチレン、酢酸エチル、クロロホルム、アセトニトリル、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、エタノール、メタノール等が挙げられる。なお、エタノールについては、体積比にして３０％以下であれば水を含んでいてもよい。

【0041】

上記のうち、炭素数６の非置換型炭化水素（ｎ－ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン）及び炭素数１～４の低級アルコール（１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、エタノール、メタノール）が好ましく、メタノール又はエタノールがより好ましい。また、本発明には、上記有機溶媒を単独又は混合して用いてもよい。

【0042】

一実施態様において、本発明は、上記の方法により提供される血清代替物又は培地添加物を用いる、動物細胞の培養方法を提供する。動物細胞の培養に用いられる血清代替物又は培地添加物の濃度は限定されるものではないが、例えば、培地の全容量に対して、０．１～９９％（ｖ／ｖ）、１～８０％（ｖ／ｖ）、２～５０％（ｖ／ｖ）、３～３０％（ｖ／ｖ）、又は５～２５％（ｖ／ｖ）含まれるものであってもよい。

【0043】

本発明の動物細胞の培養方法において、血清代替物又は培地添加物を添加する培地は、培養する細胞の種類によって適宜選択すればよいが、緩衝作用を有する媒体が好ましく、例えば、リン酸緩衝液、イーグル培地、ダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地、グラスゴー最小必須培地、グレース昆虫培地、ハム培地、イスコフ改良イーグル培地、ＲＰＭＩ－１６４０培地、Ｌ－１５培地、マッコイ５Ａ培地などであってもよく、これらの培地において、血清及び／又は無血清培養の添加因子を実質的に含まないものであってもよい。また、グルコース、ビタミン類及び／又はタンパク質構成アミノ酸（例えば、Ｌ－グルタミン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－シスチン、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、及びＬ－バリンからなる群から選択される１以上のアミノ酸）を実質的に含まないものであってもよい。培地は、液体培地であってもよく、固形培地であってもよい。

【0044】

本明細書において、動物細胞とは、脊椎動物（哺乳類（「哺乳動物」ともいう。）、鳥類、両生類、爬虫類または魚類）の細胞、または無脊椎動物（例えば、ホヤ、節足動物（甲殻類（例えば、エビ、カニなど）、昆虫類など）、棘皮動物（ウニ、ナマコ、ヒトデなど）、軟体動物（例えば、貝、イカ、タコなど）など）の細胞を含む意味で用いられる。一実施態様において、本発明を適用し得る動物細胞は、脊椎動物（例えば、ヒト、サル、ウシ、クジラ、クマ、シカ、ウマ、ブタ、イノシシ、ヒツジ、ウサギ、ラット、マウス、ハムスター、ヤギ、イヌまたはネコなどの哺乳動物、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、カモ、キジなどの鳥類、カエル、サンショウウオ、イモリなどの両生類、ワニ、トカゲ、ヘビ、カメ、スッポンなどの爬虫類、マグロ、サケ、マス、コイ、サメ、ウナギ、フグなどの魚類）の細胞、無脊椎動物（例えば、ホヤ、節足動物（甲殻類（例えば、エビ、カニなど）、昆虫類など）、棘皮動物（ウニ、ナマコ、ヒトデなど）、軟体動物（例えば、貝、イカ、タコなど）など）の細胞、あるいはそれら由来の初代細胞、株化細胞、多能性幹細胞（例えば、ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞、Ｍｕｓｅ細胞、ｉＰＳ細胞）、または組織幹細胞（例えば、間葉系幹細胞）あるいはそれらから分化誘導された細胞であってもよい。また、動物細胞の生体組織における由来は、例えば、筋肉系（例えば、筋芽細胞）、皮膚系（例えば、線維芽細胞、ケラチノサイト）、肝臓系（例えば、肝実質細胞）、腎臓系（例えば、腎細胞（例えば、ＨＥＫ２９３））、心臓系（例えば、心筋細胞）、消化器系（例えば、口腔粘膜細胞、腸管上皮細胞、壁細胞）、造血系（例えば、造血幹細胞）、生殖組織系（例えば、卵巣細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）、精細胞、子宮上皮細胞）、粘膜系（例えば、上皮細胞）、骨組織系（例えば、骨芽細胞、軟骨細胞）などであってもよく、これら以外の組織に由来するものであってもよい。

【実施例0045】

以下、実施例を引用して本発明をより詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されない。

【0046】

＜実施例１＞
１－１． 材料及び実験方法

【0047】

抽出プロセスおよび抽出物を用いた生物学的アッセイを図１に模式的に示した。

【0048】

１－１．（１） 微細藻類の培養

【0049】

淡水緑色微細藻類、Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ （ＮＩＥＳ－２１７０、国立環境研究所、茨城、日本）を既報のように培養した［１０］。７日間培養後、採取した藻類を凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ ＦＤＵ－１２００、東京理化学会、日本）を用いて凍結乾燥した（図１Ｂ）。凍結乾燥したＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓをその後の実験に用いた。

【0050】

１－１．（２） Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓからの水溶性化合物（ＣＷ）の抽出

【0051】

凍結乾燥したＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ ２ｇを２０ｍＬのＭｉｌｌ Ｑ（１００ｇ／Ｌ濃度）に懸濁し（図１Ｃ）、懸濁液を氷冷した水浴装置（バイオラプター）（コスモ・バイオ、東京、日本）で１０分間超音波処理（６０ｋＨｚ、２００ Ｗ）した（図１Ｄ）。次にこの懸濁液を４℃で１０分間遠心分離（１５，２００×ｇ）した（図１Ｅ）。上清（図１Ｇ）を０．２２μｍシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、米国）で濾過した。濾過した上清を凍結乾燥し、粉末として得た（図１Ｈ）。粉末（約０．１４ｇ）をメタノール（５．０ｍＬ）に一部溶解した（図１Ｉ）。得られた沈殿物をろ紙（５Ａ、１５０ｍｍ、アドバンテック東洋、東京、日本）で濾過し、室温で乾燥した（収量は約０．１０ｇ）。得られた乾燥沈殿物の正味収率は、藻類粉末の初期重量と比較して５％であった。その後、Ｍｉｌｌ Ｑ水（２０ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、ＣＷ（水溶性化合物）（図１Ｋ）と名付け、さらなる分析に用いた。

【0052】

１－１．（３） 走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）

【0053】

Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓを凍結乾燥し、粉末状にして得た（図１Ｂ）。ここでも超音波処理後に得られた沈殿物（図１Ｆ）を凍結乾燥法を用いて粉末状に変換し、超音波処理前後の藻類粉末の比較分析を行った。超音波処理の有り及び無しの凍結乾燥したＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓを、ＳＥＭ試料に利用可能な円形アルミニウムステージ上の炭素フィルムテープ上に置いた。金（ＩＢ－３、イオンコーター（金ターゲット）、ＥＩＫＯ、東京、日本）により５ｍＡで１０秒間コーティングし、走査型電子顕微鏡（ＶＥ－９８０００ＳＲＬ、キーエンス、大阪、日本）の内部に置いた。試料を真空条件下で観察した。ＶＥシリーズのＯｂｓｅｒｖａｔｉｏｎソフトウェアで後の画像を撮影した。

【0054】

１－１．（４） ＣＷのＨＰＬＣ分析

【0055】

ＣＷ溶液は、逆相クロマトグラフィーカラム（カプセルＰＡＫ Ｃ１８ ＭＧ ＩＩカラム（長さ：４．６ｍｍ、Ｉ．Ｄ．１５０ｍｍ）大阪ソーダ株式会社、日本）または陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（カプセルＰａｋ ＮＨ２ ＵＧ８０（Ｓ５）カラム（長さ：４．６ｍｍ、Ｉ．Ｄ．：１５０ｍｍ）、大阪ソーダ株式会社、日本）を備えたＨＰＬＣシステム（島津製作所、京都、日本）により分析した。４０℃に保ちながら、流速１．０ｍＬ／分で２５４ｎｍ（ＳＰＤ－２０Ａ ＵＶ／ＶＩＳ検出器）で溶出化合物をモニターした。溶媒Ａ（８０％アセトニトリル溶液）と溶媒Ｂ（２０％アセトニトリル溶液）を移動相として使用するＯＤＳカラムには、アセトニトリル－水混合物による次の勾配溶出を採用した：最初の５分では１００％の溶媒Ｂ、続く５分～２５分は１００％から０％までの勾配溶媒Ｂ、そして追加の２５分からの５分間は０％の溶媒Ｂ（溶媒Ａの１００％）を一定の流速、１ｍＬ／分で用いた。溶媒Ｂ（２０％アセトニトリル溶液）と溶媒Ａ（８０％アセトニトリル溶液）で設計したＮＨ２ ＵＧ８０（Ｓ５）カラムの勾配溶出は、次の時間プログラムで実施した：最初の５分では１００％溶媒Ａ、続く５分～２５分では２０％－８０％溶媒Ａ、そして次の２５分からの５分間では０％溶媒Ａを１ｍＬ／分の流速で用いた（ＣＴＯ－２０ＡＣ、島津製作所）。ＣＷの濃度は２ｍｇ／ｍＬ、注入量は２０μＬであった。結果は、装備されたソフトウェア（Ｌａｂ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、島津製作所）で分析した。

【0056】

１－１．（５） 細胞培養および細胞増殖分析

【0057】

Ｃ２Ｃ１２マウス細胞（ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ－１７７２（商標））を、１０％ ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ、米国）および１％ ペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、米国）を補充したＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）中で、組織培養ポリスチレンディッシュ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｔｏｋｙｏ、東京、日本）上で、５％ ＣＯ_２を加えた加湿雰囲気中３７℃にて培養した。Ｄａｙ２の培地交換（図１Ｌ、Ｍ）に先立ち、ＣＷ有／無ＤＭＥＭを作製した。ＣＷの濃度、２０ｍｇ／ｍＬを１００％と考え、４０μＬのＣＷと６０μＬのＤＭＥＭ（細胞培養培地の総容量は１００μＬ）を混合して４０ＣＷを調製した。同様に、２０μＬのＣＷおよび８０μＬのＤＭＥＭを混合することによって２０ＣＷを調製し、１０μＬのＣＷおよび９０μＬのＤＭＥＭを混合することによって１０ＣＷを調製し、５μＬのＣＷおよび９５μＬのＤＭＥＭを混合することによって５ＣＷを調製し、１００μＬの細胞培養培地について２μＬのＣＷおよび９８μＬのＤＭＥＭを混合することによって２ＣＷを調製した。

【0058】

細胞増殖は、１）市販のキット（ＸＴＴアッセイ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、クロムウェル、ＣＴ、米国）および２）トリパンブルー排除アッセイを用いて分析した。

【0059】

１）ＸＴＴアッセイ：Ｃ２Ｃ１２細胞を９６ウェルプレート（ＡＧＣテクノグラス、静岡、日本）に３×１０^３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌまたは６×１０^３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種し、１０％ ＦＢＳと１％ ＰＳを添加したＤＭＥＭで一晩培養し、プレート上の細胞を接着させた（図１Ｌ）。２４時間後、培地を廃棄し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ； Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で２回洗浄した。続いて、種々の濃度で混合した藻類抽出物を含む／含まないＤＭＥＭ中で細胞をさらに４８時間培養した。培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄した。１０％ ＦＢＳおよび１％ Ｐ／Ｓ（１００μＬ）を添加したＤＭＥＭに続いてＸＴＴ試薬（５０μＬ）およびＡｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１μＬ）を添加した。３７℃で２時間インキュベートした後、細胞生存率をＮｉｖｏ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）を用いて分析した。吸光度は４５０／６５０ｎｍで測定し、各ウェル（ｎ＝４）の細胞生存率を評価するために、細胞を有しないブランクの吸光度を差し引いて最終値を求めた。

【0060】

２）トリパンブルー排除試験：Ｃ２Ｃ１２細胞（５×１０^４細胞／シャーレ）を直径３５ｍｍのポリスチレンディッシュ（Ｇｒｅｉｎｅｒ、東京、日本）に播種し、１０％ ＦＢＳおよび１％ ＰＳを添加したＤＭＥＭで２４時間培養した（図１Ｍ）。次に培地を廃棄し、細胞をＰＢＳ（２ｍＬ）で２回洗浄した。その後、細胞を１０％ ＦＢＳを添加したＤＭＥＭまたは４０ＣＷおよび２０ＣＷを添加／無添加のＤＭＥＭ中で、２４時間培養した。その後、培地を除去し、細胞をＰＢＳトリスで洗浄し、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えて増殖細胞を回収した。細胞懸濁液を４℃で遠心分離（３００×ｇ、５分）し、細胞ペレットをＤＭＥＭに懸濁した。トリパンブルー染色液（ナラカイテスク、京都、日本）を細胞懸濁液のアリコート（ｖｏｌ：ｖｏｌ ＝ １：１）に加え、複合顕微鏡のステージに置いた血球計算板に加えた。非染色細胞を生細胞として計数した。細胞濃度と培地量に基づいて生存細胞数を算出した（ｎ＝３～５）。

【0061】

１－１．（６） データ解析

【0062】

すべての統計データは平均±標準偏差で表されている。データは、Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ及び多重比較のためのｐｏｓｔｈｏｃ Ｄｕｎｎｅｔｔ試験を用いて統計学的に分析した。すべてのデータを、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標） ６４ビット、バージョン８．４．３．（２０２０）のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８で分析した。

【0063】

１－２． 補足的方法：

【0064】

１－２．（１） 微細藻類の培養

【0065】

淡水緑色微細藻Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ（ＮＩＥＳ－２１７０、国立環境研究所、茨城、日本）を、Ｇａｍｂｏｒｇ’ｓ Ｂ５ ｍｅｄｉｕｍ（富士フィルム和光純薬、大阪、日本）とハイポネックス（１ｇ／Ｌ、ハイポネックスジャパン、大阪、日本）の混合培地を用いて、約２５℃、連続光（タイテック、埼玉、日本、光合成光子束密度：約１００μｍｏｌ／ｍ^２／ｓ）下にて、１－Ｌ培地ボトル（Ａｓ Ｏｎｅ、大阪、日本）で培養した。藻類培養はＣＯ_２供給装置（ＧＭ４０００、東海ヒット、静岡、日本）を用いて５％ ＣＯ_２で５０ｍＬ／分で換気し、攪拌機（６０ｒｐｍ、Ａｓ Ｏｎｅ）を用いて攪拌した（図１Ａ）。７日間培養後、藻類を採取し、遠心分離により濃縮し、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ ＦＤＵ－１２００、東京理化器械、日本）を用いて凍結乾燥した（図１Ｂ）。凍結乾燥したＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓをその後の実験に用いた。

【0066】

１－２．（２） 免疫蛍光染色

【0067】

Ｃ２Ｃ１２細胞を５×１０^４細胞／ディッシュの密度で非コーティングポリスチレンディッシュ（３５ｍｍディッシュ）に播種し、１０％ ＦＢＳおよび１％ ＰＳを添加したＤＭＥＭ中で２４時間培養した。培地を廃棄し、細胞をＰＢＳ（２ｍＬ）で２回洗浄した。次いで、細胞を４０ＣＷ有り／無しで培養した。細胞培養はさらに２４時間培養した。その後、培地を除去し、培養皿をＰＢＳで3回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、武藤化学株式会社、東京、日本）で３０分間固定した。ＰＦＡを除去し、細胞培養皿をＰＢＳで３回洗浄した。次に、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で１０分間処理することにより細胞を透過化した。溶液を除去し、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、２％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）でブロッキングした。ＭｙｏＤ染色は、マウスモノクローナル抗体（ＭｙｏＤ（Ｇ－１）ＳＣ－３７７４６０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を２％ ＢＳＡ含有するＰＢＳで１：５００の希釈で添加し、シェーカー機上に置いた４℃で一晩インキュベートした。二次抗体については、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、２％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中で１：１０００の希釈で添加し、室温（約２５℃）で１時間インキュベートした。アクチンフィラメントは、ＰＢＳで１：５００（ｖｏｌ／ｖｏｌ）希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８ ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって染色し、核を、ＰＢＳで１：５００（ｖｏｌ／ｖｏｌ）希釈したＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８溶液（同仁化学研究所、熊本、日本）を用いて室温で１５分間染色した。

【0068】

蛍光溶液を最終的に除去し、ＰＢＳ溶液で３回洗浄した。蛍光画像はソフトウェア（ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ＢＲ、ニコン）を装備した蛍光顕微鏡（ＥＬＩＰＳＥ ＴＳ２、Ｎｉｋｏｎ、東京、日本）を用いて撮影した。

【0069】

１－３． 結果と考察：

【0070】

１－３．（１） ＳＥＭイメージングを用いて解析したＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓに対する超音波処理の影響

【0071】

藻類細胞の形態に及ぼす超音波処理の影響をＳＥＭで評価した（図２）。図２Ａと２Ｂは、超音波処理前の藻類粉末の細胞壁の構造を表す。凍結乾燥したＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓの均一で球形の形態（直径６μｍ程度）が観察された。真空条件下での凍結乾燥により、細胞壁表面にへこみやひだが出現した。この結果は過去の報告［１７］と一致していた。対照的に、細胞膜の多く（図２Ｃ）は１０分間の超音波処理後に損傷を受けていた。超音波処理は、おそらく破裂した藻類細胞壁に由来するいくつかのミクロサイズの断片を生成した。また、水処理が藻類の細胞膜に深刻な損傷を与え、その構造を崩壊させる可能性も示唆されている［１７］。

【0072】

次に、より低倍率で得られた画像の比較（図２Ａおよび２Ｃ）から、少数の藻類細胞が１０分間で超音波処理により完全に崩壊したことが示唆された。

【0073】

１－３．（２） Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓからのＣＲとＣＷの抽出

【0074】

超音波処理したＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来の遠心した粗抽出物（図１Ｇ）をＣ２Ｃ１２細胞培養系に適用した。細胞増殖特性は抽出物の存在下では低かったが（図５）、ＣＲには増殖促進因子が存在するに違いないと考えた［１０］。このことが、粗抽出物を精製する動機となった（図１Ｈ及び１Ｋ）。

【0075】

水性抽出物には、クロロフィル、脂質分子などの疎水性成分と、細胞増殖活性の原因となる可能性のある水溶性ビタミン、アミノ酸などの親水性化合物が一定の比率で含まれている［１０］。従来の抽出法では、Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓから脂質やクロロフィルなどの疎水性成分の抽出に適したメタノール、クロロホルム、ヘキサンなどの有機溶媒を用いていることが示唆されたため［１６］、凍結乾燥したＣＲ（図１Ｈ）をメタノールに溶解した（図１Ｉ）。粗抽出物はほとんど沈殿物として残ったままであったが（図１Ｋ）、メタノール溶媒は緑色に変色した（図１Ｊ）。緑色の上清はクロロフィルと脂質分子の溶解を示している可能性がある（図１Ｊ）［１８］。

【0076】

メタノール処理は粗抽出物から疎水性化合物を抽出できた。沈殿物の溶解アッセイにより、大気条件下で乾燥した沈殿物はメタノールやアセトンなどの有機溶媒にはほとんど溶解しないことが確認された。代わりに、水に容易に溶解し、さらなる実験のためのＣＷとして使用した。後に、ＣＲ、ＣＷおよびＣＭの栄養分析は、アルギニン、アスパラギン酸、オルニチンおよびリジンのような親水性アミノ酸が、ＣＭよりもＣＷに高い濃度で存在することを明らかにした。これらの結果から、親水性化合物はこの方法を利用することによって疎水性化合物から分離されることが示唆された（図６）。さらに、後述するようにＣＷが示す顕著な細胞増殖特性を考慮すると、メタノール処理は、図５で観察されるような粗サンプルの純度を確かに高めている。

【0077】

１－３．（３） ＨＰＬＣを用いたＣＲ及びＣＷ試料の分析

【0078】

以前の報告では、Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓから抽出された疎水性化合物を分析には従来ＯＤＳカラムが用いられてきた［１９］。ＣＲ（図１Ｇ）およびＣＷ（図１Ｋ）をＨＰＬＣシステムで分析した。ＯＤＳカラム上のＣＲのクロマトグラムは、最初の５分以内に、強度は低い、いくつかのピークを示した（データは示していない）。同様に、ＣＷは疎水性カラム上に保持されなかった（図３Ａ）。大きなピークは約１．５分で出現し、疎水性成分はＣＷとＣＲでは少なかったことを示している。したがって、陰イオン交換クロマトグラフィーカラムを用いてＣＷをＨＰＬＣで分析した。また、勾配アセトニトリル溶出を用いた。３．８４分前に一組のピークが検出されたが、５分後以降アセトニトリル濃度が低下すると、特に５分から１２分の間にいくつかのピークが現れた。したがって、陰イオン交換カラムはＣＷの分析に適していることがわかった。＃１、＃２、＃３、＃４、＃５及び＃６で示される丸を持つピークは、３つの異なるバッチから抽出したＣＷで繰り返し出現した。抽出法の再現性を確認した（図６）。ＣＷはＴＬＣ上にもスポットされた（図７）。２つのスポット（１つは原点付近、もう１つは拡大したスポット付近）は、ＵＶおよびニンヒドリン試薬でそれぞれ陽性に検出された（拡大スポットのＲｆ値：０．７４）。この分析は、ＣＷ中にアミノ基を有する化合物が存在することを示す栄養素試験（図８）と一致している。

【0079】

また、これまでの研究から、Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓはバランスのとれたアミノ酸プロファイルを有しており、そのアミノ酸濃度に応じて単一のタンパク質源となる可能性もあることが示唆されている［２０］。本発明者らの分析は、同様にＣＷ中のアミノ酸成分の存在を示唆した。

【0080】

１－３．（４） ＣＷによる哺乳類細胞の培養

【0081】

培養したＣ２Ｃ１２細胞に対するＣＷの影響を、ＸＴＴアッセイ方法を用いて調べた。哺乳動物細胞増殖に必要な最適濃度を決定するために、より低い細胞数を選択し、比較した（最初の細胞数：３ｘ１０^３細胞／ウェル、６ｘ１０^３細胞／ウェル）（図４Ａ（ｉ）及び（ｉｉ））（図１Ｌ）。ＤＭＥＭを陰性対照とし、ＦＢＳを添加したＤＭＥＭを陽性対照とした。図．４Ａ（ｉ）の場合、２０ＣＷ（２０μＬ ＣＷ＋８０μＬ ＤＭＥＭ）を添加した細胞の生存率はＤＭＥＭと比較して比較的高かったが、ＦＢＳを添加したＤＭＥＭよりも低かった。Ｆｉｇ．４Ａ（ｉ）とは対照的に、播種細胞の個数を２倍にすると、細胞の生存率は非常に高くなった（図４Ａ（ｉｉ））。２０ＣＷの添加は、陽性対照と同等の細胞増殖を増強させた。一元配置ＡＮＯＶＡ分析はまた、２０ＣＷとｗ／ｏ ＦＢＳとの間に統計的有意性を示したが、２ＣＷとｗ／ｏ ＦＢＳとの間には有意性を示さなかった。

【0082】

生存する筋芽細胞数を算出するために、より大きな細胞培養表面積を有するＴＣＰＳ上にＣ２Ｃ１２細胞を播種し、培養した（最初の細胞数：５ｘ１０^４ ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈ）（図１Ｍ）。図４Ｂに示すように、接着細胞数は、ＦＢＳ ＞ ４０ＣＷ ＞ ２０ＣＷ ≧ ｗ／ｏ ＦＢＳの順番で多くなった。４０ＣＷ（４０μＬ ＣＷ ＋６０μＬ ＤＭＥＭ）を添加したＣ２Ｃ１２細胞は、ＦＢＳの添加なしで正の増殖率を示した。この結果は、上記の細胞生存率アッセイと一致し、またＣＷが筋芽細胞の増殖率に正に作用するという事実を強調している。このグラフは、ｗ／ｏ ＦＢＳと４０ＣＷを添加した筋芽細胞間の細胞数と一元配置分散分析で統計的有意性を示している。Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞もＭｙｏＤとアクチン染色陽性を示した（図９）ことから、ＣＷを添加した筋芽細胞はＭｙｏＤ発現を維持し、アクチンストレスファイバーを発達させる健常な筋芽細胞の増殖を支持することが確認された。我々は、ＣＷに影響される筋形成のシグナル伝達経路転写制御をさらに検討し、研究する予定である［２１］。さらに、この知見は、水溶性の藻類抽出物が、いかなる血清補給の助剤なしに、単独で細胞増殖を誘導する何らかの成長促進因子を含むという事実を確認した。

【0083】

本試験では、哺乳類細胞をより短期間しか培養しなかったが、筋芽細胞を水溶性抽出液の存在下でのみ、より長期間培養する予定である。したがって、本発明者らは、哺乳類の筋細胞を培養するための微細藻類からの血清代替物と、哺乳類の筋芽細胞を含む様々な細胞型に適用できる簡単で費用効率の高い抽出法を開発することを目的とする。

【0084】

１－３．（５） 結論

【0085】

本試験は、超音波処理、凍結乾燥およびメタノール処理手順を用いて、水溶性成分であるＣＷが微細藻類から粉末として首尾よく抽出され、分離されることを示している。加えて、このＣＷは、より高い細胞増殖率を示し、マウス筋芽細胞を増殖させるための血清代替物として使用できる。本発明者らの知る限り、細胞培養を満足に増殖できる微細藻類抽出物に関する報告はない。本発明者らの粉末抽出物は、細胞培養培地中のその濃度を調整するために容易に取り扱うことができ、長期保存に有用であった。簡単に述べると、抽出プロセスは簡単で費用効果が高く、無血清細胞培養システム、組織工学、ならびに人工肉の培養において大きな利点がある。環境負荷を大幅に低減するだけでなく、動物由来増殖血清を微細藻類抽出物に置き換えることも可能になるだろう。

【0086】

＜実施例２＞
３×１０００ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（初期細胞数）でＮＩＨ３Ｔ３細胞を播種し１０％血清を含むＤＭＥＭ培地で２４時間培養した後、ＦＢＳ（ＤＭＥＭ（１０％血清入り）培地）とｗ／ｏＦＢＳ（血清なしＤＭＥＭ培地）、２０ＣＷ（２０ｍｇ／ｍＬ濃度のＣＷ溶液（ＤＭＥＭに溶解）を２０ｕＬと８０ｕＬのＤＭＥＭを混合した培地）、４０ＣＷ（２０ｍｇ／ｍＬ濃度のＣＷ溶液（ＤＭＥＭに溶解）を４０ｕＬと６０ｕＬのＤＭＥＭを混合した培地）に交換し、さらに７２時間培養した。その後、細胞接着数を計測した（図１０）。なお、本実施例で使用したＣＷは、実施例１と同様の方法によって調製した。

【0087】

＜実施例３＞
３×１０００ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（初期細胞数）でＣＨＯ細胞を播種し１０％血清を含むＤＭＥＭ培地で２４時間培養した後、ｗ／ｏＦＢＳ（血清なしＤＭＥＭ培地）、２０ＣＷ（２０ｍｇ／ｍＬ濃度のＣＷ溶液（ＤＭＥＭに溶解）を２０ｕＬと８０ｕＬのＤＭＥＭを混合した培地）に交換し、さらに７２時間培養した。その後の細胞接着数を計測した（図１１）。なお、本実施例で使用したＣＷは、実施例１と同様の方法によって調製した。

【0088】

＜実施例４＞
４－１．材料及び実験方法

【0089】

４－１．（１） 微細藻類の培養
海洋性単細胞緑色真核微細藻類Ｃ． ｌｉｔｔｏｒａｌｅ（ＮＢＲＣ １０２７６１）（製品評価技術基盤機構、東京、日本）を、１Ｌ培地ボトル（アズワン、大阪、日本）にダイゴＩＭＫ培地（日本薬品工業株式会社、東京、日本）、ダイゴ人工海水ＳＰ（富士フイルム和光純薬、大阪、日本）とハイポネックス（１ｇ／Ｌ、ハイポネックスジャパン、大阪、日本）を混合した培地で培養した。藻類培養は、ＣＯ_２供給装置（ＧＭ４０００、東海ヒット、静岡、日本）を用いて５％ＣＯ_２を５０ｍＬ／ｍｉｎで通気し、スターラー（６０ｒｐｍ、アズワン、大阪府、日本）を用いて撹拌し、培養環境を連続光（タイテック、埼玉、日本、光合成光量子束密度：約１００μｍｏｌ／ｍ^２／秒）と一定温度（２５℃前後）で保持した。７日間培養後、藻類を回収し、遠心分離法により濃縮した。その後、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ ＦＤＵ－１２００、東京理化器械、東京、日本）を用いて凍結乾燥し、以降の実験にはこの凍結乾燥したＣ． ｌｉｔｔｏｒａｌｅを用いた（図１を参照のこと）。

【0090】

４－１．（２） Ｃ． ｌｉｔｔｏｒａｌｅからの水溶性成分の抽出

【0091】

この実験では、Ｃ． ｌｉｔｔｏｒａｌｅの凍結乾燥粉末２ｇを検討した。この粉末を２０ｍＬのＭｉｌｌ Ｑ（濃度１００ｇ／Ｌ）に懸濁し（図１Ｃ）、この懸濁液を氷冷水浴装置（バイオラプター、コスモ・バイオ、東京、日本）中で１０分間超音波処理（６０Ｈｚ、２００Ｗ）し、続いて４℃で１０分間遠心（１５，２００×ｇ）した（図１Ｅ）。こうして得られた上清を粗抽出物（ＣＲ）とした。これを０．２２μｍのシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、米国）で濾過し、再び凍結乾燥して粉末にした。この粉末状（約０．３ｇ）をメタノール（ＣＭ）（５．０ｍＬ）に一部溶解し（図１Ｉ、Ｊ）、溶解後に得られた沈殿物をろ紙（５Ａ、１５０ｍｍ、アドバンテック東洋、東京、日本）で分離した。これを室温で乾燥させ、得られた乾燥沈殿物の純収量（収量は約０．２０ｇ）は、藻類粉末の初期重量と比較すると１０％であった。その後、Ｍｉｌｌ Ｑ水（２０ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、ＣＷ（水溶性化合物）と名付け、以下の実験工程に使用した（図１を参照のこと）。

【0092】

４－１．（３） 細胞培養と藻類由来培地の調製

【0093】

Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞（ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ－１７７２（商標））３Ｔ３細胞（Ｓｗｉｓｓ ３Ｔ３）およびチャイニーズハムスター卵巣細胞［ＣＨＯ ＤＰ１２細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１２４４５）］は、１０％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ、米国）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、米国）を補充したＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）中で、１０ｃｍ組織培養ポリスチレンディッシュ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｔｏｋｙｏ、東京、日本）上で３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気で培養した。ＣＷの細胞生存率および細胞増殖の影響を解析するために、Ｃ２Ｃ１２細胞および３Ｔ３細胞を２種類の実験に使用した。また、ＣＨＯ細胞は、細胞増殖実験および細胞継代実験を行うために考慮した。

【0094】

藻類由来培地の調製には、すべての培養条件に等量のＤＭＥＭを適用した。ＣＷの濃度は、２０ｍｇ／ｍＬを１００％とした。また、栄養分析試験により、ＣＷの浸透圧は９８～１００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ_２Ｏ程度であることが判明した。すべての培養条件において浸透圧を同じにするため、ネガティブコントロール（ＦＢＳなし）はＤＭＥＭ６０μＬと塩水４０μＬ（ＮａＣｌ水は１００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ_２Ｏ）、ポジティブコントロールはＤＭＥＭ６０μＬとＦＢＳ１０μＬと塩水３０μＬ（細胞培養液全量は１００μＬ）で作製した。同様に、４０ＣＷは、６０μＬのＤＭＥＭと４０μＬのＣＷを混合することによって調製された；２０ＣＷは、６０μＬ ＤＭＥＭ、２０μＬ ＣＷおよび２０μＬ塩水を混合することにより調製し、１０ＣＷは、６０μＬ ＤＭＥＭ、１０μＬ ＣＷおよび３０μＬ塩水を混合することにより調製し、５ＣＷは、６０μＬ ＤＭＥＭ、５μＬ ＣＷおよび３５μＬ塩水を混合することにより調製し、最後に２ＣＷは６０μＬ ＤＭＥＭ、２μＬ ＣＷおよび３８μＬ塩水液を混合することにより調製した。

【0095】

４－１．（４） 細胞生存率の解析

【0096】

市販のキット（ＸＴＴアッセイ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、クロムウェル、ＣＴ、米国）を用いて、２種類の筋肉細胞を考慮した細胞生存率アッセイを実施した。Ｃ２Ｃ１２細胞および３Ｔ３細胞を９６ウェルプレート（ＡＧＣテクノグラス、静岡、日本）に３×１０^３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌまたは６×１０^３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種した。１０％ＦＢＳと１％ＰＳを添加したＤＭＥＭで培養し、プレート上に細胞を接着させた（２４時間）。翌日、培地を捨て、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で２回洗浄し、種々の濃度のＣＷとＤＭＥＭおよび／または塩溶液で置換した。この状態を次の７２時間維持した。培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄した。１０％ＦＢＳおよび１％Ｐ／Ｓを補充したＤＭＥＭ（１００μＬ）を添加し、続いてＸＴＴ試薬（５０μＬ）およびＡｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１μＬ）を添加し、２時間インキュベーション（３７℃）した。細胞生存率は、Ｎｉｖｏ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）を用いて分析した。光学密度は４５０／６５０ｎｍで測定し、各ウェル（ｎ＝３）における細胞生存率を評価するための細胞を含まないブランクの最適密度を差し引いて最終値を求めた。

【0097】

４－１．（５） 蛍光染色による細胞増殖の解析

【0098】

Ｃ２Ｃ１２細胞、３Ｔ３細胞、ＣＨＯ細胞をポリスチレンディッシュ（３５ｍｍディッシュ）に５×１０^４細胞／ｍＬの密度で播種し、１０％ＦＢＳと１％ＰＳを添加したＤＭＥＭで２４時間培養した（総培地：２ｍＬ）（図１Ｍ）。培地を廃棄し、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。その後、４０ＣＷ、２０ＣＷ、ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ単体といった４種類の条件で４８時間培養した。各条件の浸透圧は、細胞生存率アッセイで述べた同様の条件で維持した。その後、培地を除去し、培養皿をＰＢＳで３回洗浄し、パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、武藤薬品工業、東京、日本）で細胞を固定した。３０分後、ＰＦＡを除去し、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。核をＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８溶液（同仁化学研究所、熊本、日本）をＰＢＳで１：５００（ｖｏｌ／ｖｏｌ）に希釈し、室温で１５分間染色した。最後に蛍光液を除去し、ＰＢＳ溶液で３回洗浄した。最後に、ソフトウェア（ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ＢＲ、Ｎｉｋｏｎ）を備えた蛍光顕微鏡（ＥＬＩＰＳＥ ＴＳ２、Ｎｉｋｏｎ、東京、日本）を用いて、５～１０個の蛍光画像（１００μＭ）を撮影した。細胞の核を示すこれらの画像は、後にＩｍａｇｅＪ ａｎａｌｙｚｅｒで解析し、平均して各条件の細胞数を決定した（ＩｍａｇｅＪ．ＪＳ ａｎａｌｙｚｅｒ， ６４－ｂｉｔ Ｊａｖａ（登録商標） ８）。

【0099】

４－１．（６） 懸濁細胞株のサブカルチャー（Ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ）及び継代培養（ｐａｓｓａｇｅ）

【0100】

懸濁したＣＨＯ細胞を５０ｍｌ滅菌攪拌フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｔｏｋｙｏ、日本）に２．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度でＤａｙ１に播種した。ＣＨＯ細胞は、ＤＭＥＭ単独、１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ、２０ＣＷ添加ＤＭＥＭで培養した。各条件の塩類溶液で調整した等量のＤＭＥＭに、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、米国）を添加した。培地の総量は２０ｍＬであった。３７℃で４８時間培養し、５０ｒｐｍで絶えず攪拌した。その後、細胞を回収し、遠心分離してＰＢＳで３回洗浄した後、ＤＭＥＭに再懸濁した。トリパンブルー染色液（ナカライテスク、京都、日本）を細胞懸濁液のアリコート（ｖｏｌ；ｖｏｌ＝１：１）に加え、複合顕微鏡のステージ上に置いた血球計数装置で添加した。染色されていない細胞を生細胞として数えた。生存細胞数は、細胞濃度と培地量から算出した（ｎ＝３）。次に、ＣＨＯ細胞の増殖能力を調べるために、細胞集団倍加数（ＮＣＰＤ）を参考文献の式に基づいて計算した[２２]。これらのＣＨＯ細胞を、２．５×１０^４ ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で、再び新鮮な細胞培地に懸濁した。全く同じプロトコールに従って、４回の継代を行い、同じ培養条件で細胞の増殖率を分析した。

【0101】

４－１．（７） データ分析
すべてのデータは、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標） ６４ビット、バージョン８．４．３．（２０２０）のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８で分析した。

【0102】

細胞生存率および細胞増殖のデータは、Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ及び多重比較のためのｐｏｓｔｈｏｃ Ｄｕｎｎｅｔｔ試験を用いて統計的に解析した。懸濁培養におけるＣＨＯ細胞増殖のデータは、Ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ（または混合モデル）および多重比較のためのｐｏｓｔｈｏｃ Ｄｕｎｎｅｔｔ試験を用いて統計的に解析した。すべての統計データは平均値±標準偏差で表され、０．０５未満のｐ値は統計的に有意とみなされた。

【0103】

４－２．結果

【0104】

４－２．（１） 筋芽細胞および線維芽細胞を用いた細胞生存率アッセイ

【0105】

細胞の生存率に及ぼすＣＷの影響は、ＸＴＴアッセイ法を用いて検出した。この研究では、２種類の哺乳類細胞を検討した：Ｃ２Ｃ１２細胞株（図１２Ａ、１２Ｂ）および３Ｔ３細胞株（図１２Ｃ、１２Ｄ）である。この研究では、両細胞株を９６ウェルプレートとＤＭＥＭ中で様々な濃度のＣＷと細胞播種密度（初期細胞数：３×１０^３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、６×１０^３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を使用して培養した。ＤＭＥＭをネガティブコントロールとし、１０ ％ ＦＢＳを添加したＤＭＥＭをポジティブコントロールとした。

【0106】

浸透圧は、細胞培養条件において重要な役割を果たす。そこで、ＤＭＥＭをすべての培養条件に均等に適用し、ＣＷと同じ浸透圧の塩水で調整することで、すべての培養条件のバランスを均等にした（図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄ）。これにより、浸透圧の違いが細胞培養に影響を与える可能性を排除した。哺乳類の細胞培養に必要なＣＷの最適濃度を決定するため、２種類の細胞株を選び、比較した（初期細胞数：３×１０^３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、６×１０^３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。Ｃ２Ｃ１２細胞の場合、図１２Ａおよび図１２Ｂは、それぞれ低細胞密度および高細胞密度におけるＣＷの影響下での細胞生存率のグラフを表している。図１２Ａでは、ネガティブコントロールと比較して、４０ＣＷと２０ＣＷで統計的に有意に高い細胞生存率が観察された。図１２Ｂにおいても、４０ＣＷと２０ＣＷの２つの培養条件において、細胞の生存率が統計的に有意であった。

【0107】

また、動物線維芽細胞または３Ｔ３細胞を様々なＣＷ培地条件で培養し、細胞生存率を調べた。図１２Ｃ（３×１０^３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）では、４０ＣＷ、２０ＣＷ、１０ＣＷ、５ＣＷ、２ＣＷで細胞を培養した。しかし、細胞生存率は、すべての条件において、ネガティブコントロールと比較して統計的有意性を示さなかった。一方、図１２Ｄ（６×１０^３ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）では、４０ＣＷ、２０ＣＷ、１０ＣＷ、５ＣＷ、２ＣＷで培養した細胞が高い細胞生存率を示し、これら５条件はネガティブコントロールと比較して統計的に有意であることがわかった。

【0108】

細胞の種類や播種条件によって統計的有意性は異なるが、これらの比較結果から、ＣＷを添加したＤＭＥＭで培養した動物細胞では、全体として細胞生存率が向上することが示された。また、哺乳類の細胞は、４０ＣＷと２０ＣＷを添加したＤＭＥＭで培養した場合、特に高い細胞生存率を示すことが確認された。

【0109】

したがって、この２つの濃度を今後の研究対象として検討した。血清飢餓は、細胞周期の停止や細胞死を含む多くの細胞内活動を引き起こすことが、これまでの研究で指摘されている［２３］。今回の実験では、ＤＭＥＭのみを添加した哺乳類細胞も、ＣＷを添加した細胞とは異なり、増殖率が低いなど同様の結果を示した。したがって、ＣＷには、細胞の生存率に影響を与える成長促進因子が含まれているはずである。

【0110】

４－２．（２） 筋芽細胞および線維芽細胞の細胞増殖性

【0111】

次に、筋芽細胞、線維芽細胞ともに、ＸＴＴアッセイよりも大規模に細胞増殖率を確認した（それぞれ図１３Ａ、図１３Ｂ、図１３Ｃ、図１３Ｄ）。本試験では、ＤＭＥＭをネガティブコントロール、１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭをポジティブコントロールとした。Ｃ２Ｃ１２細胞および３Ｔ３細胞は、３５ｍｍの細胞培養面を有するＴＣＰＳ上で、培地の総量が２ｍＬとなるよう調整して培養した。これらの実験では、ＸＴＴアッセイと同様に、増殖細胞に対するＣＷの効果を理解するために等量のＤＭＥＭを加え、塩水（ＦＢＳなし、ＦＢＳ、４０ＣＷ及び２０ＣＷ中）を加えて各ディッシュの培地の総量を調整した。図１３Ａの場合、ネガティブコントロールと比較すると、４０ＣＷでは付着細胞数が多くなった。２０ＣＷの場合、ＦＢＳと比較すると数は少ないものの、ネガティブコントロールの２倍以上の付着細胞数を示している。また、ＦＢＳ、２０ＣＷ、４０ＣＷでは、ネガティブコントロールと比較して、統計的有意性が示された。この結果は、ＣＷがＣ２Ｃ１２細胞株の成長促進効果を持つことをさらに強調するものである。

【0112】

同様の結果は、図１３Ｃでも観察された。この場合、３Ｔ３細胞は、３５ｍｍ培養皿に播種し、より大量の培地を用いて培養された。等量のＤＭＥＭを各培養条件に適用し、塩水で調整して、各条件の培地が等量になるようにした。同様に、４０ＣＷの条件でもネガティブコントロールより細胞数が多く、同条件で比較した場合、Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡで統計的に有意であることが示された。また、２０ＣＷでもネガティブコントロールと比較して高い増殖率を示し、統計的に有意であった。したがって、上記の結果から、ＣＷを添加したＤＭＥＭ中で筋芽細胞および線維芽細胞が有意な細胞増殖率を示すことが確認された。

【0113】

ＣＷが様々な培養細胞に及ぼす影響を確認するために、蛍光染色を行った（図１３Ｂおよび図１３Ｄ）。ＣＷを添加した条件下では、筋芽細胞および線維芽細胞が容易に増殖し、４８時間培養後にはほぼコンフルエントになることが生存可能で明るい核染色によって確認された。また、ＦＢＳ添加ＤＭＥＭで増殖した細胞と同様に、正常な形態的特徴を示している。

【0114】

４－２．（３） 無血清条件下での懸濁条件における細胞増殖性

【0115】

ＣＨＯ細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞の略称で、分子生物学で用いられる最も魅力的な哺乳類細胞株の一つである。

【0116】

３５ｍｍ培養皿を用いて、先の実験（４－２．（２））と同様の手順でＣＨＯ細胞の細胞増殖率を調べた（図１４Ａ、１４Ｂ）。この実験でも、４０ＣＷ条件でのＣＨＯ細胞数はＦＢＳ条件での培養細胞数より少ないが、４０ＣＷと２０ＣＷの両方で、ネガティブコントロールと比較して細胞数がかなり多かった。また、Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ分析により、ネガティブコントロールと４０ＣＷおよび２０ＣＷの培養条件との間の統計的有意性が確認された。

【0117】

３５ｍｍ培養皿で高い増殖率を示す結果が得られたため、バイオリアクターでの培養条件に移行することを計画した。ＣＨＯ細胞は浮遊しても増殖するため、培地量をさらに増やし、滅菌済みスピナーフラスコに２０ｍＬの培地を入れて実験を行った。これまでの実験とは異なり、本実験では、細胞の接着に必要な血清支持体を一切使用せずに実施した。さらに、ＣＨＯ細胞を４回継代して、細胞増殖率を分析した。図１５Ａは、３つの条件（ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ、２０ＣＷを添加したＤＭＥＭ、およびＤＭＥＭのみ）の影響下でのＣＨＯ細胞の増殖率を表している。各継代後にＮＣＰＤも測定した（図１５Ｂ）[２２］。平均すると、２０ＣＷの場合、Ｐ１からＰ４まで、細胞の倍加数は４．８１から２．７までであった。これは、ＦＢＳで処理した細胞のＮＣＰＤ値がＰ４終了時に４．９から３．７に減少したこととほぼ一致する。継代数の増加に伴い、ＮＣＰＤは徐々に低下しているが、このことからＣＨＯ細胞の増殖能は確保されていると考えられる。一方、ＤＭＥＭのみで処理した細胞は、３継代以降回復せず、ＮＣＰＤ値を求めることができなかった。また、Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ分析では、各条件をネガティブコントロールに対して測定した場合、統計的に有意であることが示された。

【0118】

この結果は、ＣＷがＣＨＯ細胞の増殖率に影響を与えることを明確に示しており、微細藻類エキスの利用が哺乳類の懸濁培養条件の増殖率にプラスの影響を与えることを示す初めての報告である。

【0119】

上記のすべての基準および対応する出願のすべての開示は、本明細書中に引用によりその全体として組み込まれる。

【0120】

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【図1A-K】

【図1L-M】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】