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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023181589
(43)【公開日】2023-12-25
(54)【発明の名称】レスベラトロールのモノ配糖体の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12P 19/18 20060101AFI20231218BHJP
C12P 7/22 20060101ALI20231218BHJP
C07H 15/203 20060101ALI20231218BHJP
A61K 31/7034 20060101ALI20231218BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20231218BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20231218BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20231218BHJP
A61P 17/10 20060101ALI20231218BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20231218BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20231218BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231218BHJP
C12N 9/10 20060101ALN20231218BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20231218BHJP
C12N 15/54 20060101ALN20231218BHJP
【ＦＩ】
C12P19/18
C12P7/22 ZNA
C07H15/203
A61K31/7034
A61P3/10
A61P3/04
A61P25/28
A61P17/10
A61P9/10
A61P9/00
A61P35/00
C12N9/10
C12N15/31
C12N15/54
【審査請求】未請求
【請求項の数】3
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022094799
(22)【出願日】2022-06-13
(71)【出願人】
【識別番号】504132272
【氏名又は名称】国立大学法人京都大学
(71)【出願人】
【識別番号】504237050
【氏名又は名称】独立行政法人国立高等専門学校機構
(71)【出願人】
【識別番号】000003182
【氏名又は名称】株式会社トクヤマ
(74)【代理人】
【識別番号】100145713
【弁理士】
【氏名又は名称】加藤 竜太
(74)【代理人】
【識別番号】100136939
【弁理士】
【氏名又は名称】岸武 弘樹
(74)【代理人】
【識別番号】100087893
【弁理士】
【氏名又は名称】中馬 典嗣
(72)【発明者】
【氏名】小川 順
(72)【発明者】
【氏名】竹内 道樹
(72)【発明者】
【氏名】上田 誠
(72)【発明者】
【氏名】松浦 圭介
【テーマコード（参考）】
4B050
4B064
4C057
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B050CC03
4B050DD02
4B050EE03
4B050FF01
4B050FF03E
4B050FF15E
4B050HH02
4B050LL01
4B050LL05
4B064AC18
4B064BH03
4B064BH07
4B064CA02
4B064CA19
4B064CA21
4B064CB30
4B064CC06
4B064CE02
4B064CE03
4B064CE12
4B064DA01
4C057AA03
4C057BB02
4C057DD01
4C057JJ23
4C086AA01
4C086EA08
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA52
4C086NA02
4C086NA03
4C086ZA16
4C086ZA36
4C086ZA45
4C086ZA70
4C086ZB26
4C086ZC35
(57)【要約】
【課題】新規なレスベラトロールのモノ配糖体の製造方法を提供する。
【解決手段】本発明に係るレスベラトロールのモノ配糖体の製造方法は、レスベラトロール及び糖類を含む系に、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質等を作用させることを含む。この製造方法によれば、式（１）で表されるレスベラトロール４’－Ｏ－α－グリコシドを得ることができる。式中、Ｒ１は、α位で結合した糖残基を示す。
【選択図】なし
【解決手段】本発明に係るレスベラトロールのモノ配糖体の製造方法は、レスベラトロール及び糖類を含む系に、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質等を作用させることを含む。この製造方法によれば、式（１）で表されるレスベラトロール４’－Ｏ－α－グリコシドを得ることができる。式中、Ｒ１は、α位で結合した糖残基を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
レスベラトロール及び糖類を含む系に下記（ａ）～（ｃ）のいずれかの酵素タンパク質を作用させることを含む、レスベラトロールのモノ配糖体の製造方法。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
（ｃ）前記（ａ）のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
（ｃ）前記（ａ）のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項2】
前記レスベラトロールのモノ配糖体が下記式（１）で表される、請求項１に記載のレスベラトロールのモノ配糖体の製造方法。
［式中、Ｒ１は、α位で結合した糖残基を示す。］
【化1】
【請求項3】
前記糖残基がグルコース残基である、請求項２に記載のレスベラトロールのモノ配糖体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、レスベラトロールのモノ配糖体の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ワインに含まれるポリフェノール化合物であるレスベラトロール（３，５，４’－トリヒドロキシスチルベン）は、フレンチパラドックスに関係する生理学的機能を有するものとして研究されてきた。特に、トランスレスベラトロールは、２型糖尿病、肥満、アルツハイマー病、骨粗鬆症、アテローム性動脈硬化症、心血管疾患、癌等の様々な疾患又は症状の治療に有効であるため、健康補助食品の機能性成分として使用されている。しかし、レスベラトロールは水に難溶性である上、高ｐＨ条件下、高温条件下、及び光条件下での安定性も低いため、バイオアベイラビリティ及び産業用途は限られていた。
【0003】
レスベラトロールの水溶性を高め、また、各種安定性を改善するためには、レスベラトロールを配糖化することが有効である。レスベラトロールの配糖体の製造方法としては、例えば、レスベラトロール及びマルトースを含む系にシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）を作用させる方法が知られている（非特許文献１及び２参照）。この製造方法によれば、レスベラトロールの配糖体として、３－Ｏ－α－グルコシド、３－Ｏ－α－マルトシド、４’－Ｏ－α－グルコシド、及び４’－Ｏ－α－マルトシドを得ることができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Bolton, G.W. et al., Science, 232, 983-985 (1986)
【非特許文献2】Torres, P. et al., Adv. Synth. Catal., 353, 1077-1086 (2011)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
一般に、配糖体の生理機能は、糖の結合位置によって変化し得る。例えば、レスベラトロール４’－Ｏ－α－グルコシドは、レスベラトロール３－Ｏ－α－グルコシドよりも高い抗酸化作用を有することが知られている。しかし、従来、レスベラトロールの４’位を選択的にグリコシル化することは困難であった。
【0006】
そこで、本発明は、新規なレスベラトロールのモノ配糖体の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
上記課題を解決するための具体的な手段には、以下の実施態様が含まれる。
＜１＞ レスベラトロール及び糖類を含む系に下記（ａ）～（ｃ）のいずれかの酵素タンパク質を作用させることを含む、レスベラトロールのモノ配糖体の製造方法。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
（ｃ）前記（ａ）のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
＜１＞ レスベラトロール及び糖類を含む系に下記（ａ）～（ｃ）のいずれかの酵素タンパク質を作用させることを含む、レスベラトロールのモノ配糖体の製造方法。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
（ｃ）前記（ａ）のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
【0008】
＜２＞ 前記レスベラトロールのモノ配糖体が下記式（１）で表される、＜１＞に記載のレスベラトロールのモノ配糖体の製造方法。
［式中、Ｒ１は、α位で結合した糖残基を示す。］
【化1】
【0009】
＜３＞ 前記糖残基がグルコース残基である、＜２＞に記載のレスベラトロールのモノ配糖体の製造方法。
【発明の効果】
【0010】
本発明によれば、新規なレスベラトロールのモノ配糖体の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1A】Ｈｉｓタグ融合ＲｐＧのＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示す図である。レーン１は、プラスミド（pET-21b/His-tag-RpG I）が導入された大腸菌（Rosetta 2 (DE3)）から精製したＨｉｓタグ融合ＲｐＧ Ｉを示し、レーン２は、プラスミド（pET-21b/His-tag-RpG II）が導入された大腸菌（Rosetta 2 (DE3)）から精製したＨｉｓタグ融合ＲｐＧ ＩＩを示し、レーンＭは、タンパク質ラダーを示す。
【図1B】シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）の反応混合物又は精製したＨｉｓタグ融合ＲｐＧの反応混合物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。上段はＣＧＴａｓｅの反応混合物を示し、中段はＲｐＧ Ｉの反応混合物を示し、下段はＲｐＧ ＩＩの反応混合物を示す。Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、及びＰ５はそれぞれ、レスベラトロール、３－Ｏ－α－グルコシド、３－Ｏ－α－マルトシド、４’－Ｏ－α－グルコシド、及び４’－Ｏ－α－マルトシドに対応する。
【図2A】ＲｐＧ Ｉの酵素活性におけるｐＨの影響を示す図である。黒丸、黒三角、黒四角はそれぞれ、クエン酸ナトリウム緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、及びリン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ）を示し、白丸、白三角、白四角はそれぞれ、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、重炭酸ナトリウム緩衝液、及びリン酸ナトリウム緩衝液を示す。各値は３回の独立した実験の平均値±標準偏差を示す。
【図2B】ＲｐＧ Ｉの酵素活性のｐＨ安定性を示す図である。黒丸、黒三角、黒四角はそれぞれ、クエン酸ナトリウム緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、及びリン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ）を示し、白丸、白三角、白四角はそれぞれ、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、重炭酸ナトリウム緩衝液、及びリン酸ナトリウム緩衝液を示す。残存活性は、ＫＰＢ（ｐＨ７．０）による処理前の酵素活性に対する割合（％）を意味する。各値は３回の独立した実験の平均値±標準偏差を示す。
【図2C】ＲｐＧ Ｉの酵素活性における温度の影響を示す図である。各値は３回の実験の平均値±標準偏差を示す。
【図2D】ＲｐＧ Ｉの酵素活性の温度安定性を示す図である。残存活性は、処理前の４℃での酵素活性に対する割合（％）を意味する。各値は３回の独立した実験の平均値±標準偏差で示す。
【図3A】ＲｐＧ Ｉによるレスベラトロールのグルコシル化活性におけるＬｉ＋の影響を示す図である。灰色のバー及び黒色のバーはそれぞれ、４’－Ｏ－α－グルコシド及び３－Ｏ－α－グルコシドを示す。各値は３回の独立した実験の平均値を示し、エラーバーは４’－Ｏ－α－グルコシドの標準偏差を示す。
【図3B】ＲｐＧ Ｉによるレスベラトロールのグルコシル化活性におけるＫ＋の影響を示す図である。灰色のバー及び黒色のバーはそれぞれ、４’－Ｏ－α－グルコシド及び３－Ｏ－α－グルコシドを示す。各値は３回の独立した実験の平均値を示し、エラーバーは４’－Ｏ－α－グルコシドの標準偏差を示す。
【図4】ＲｐＧ Ｉによるレスベラトロールのグルコシル化の時間変化を示す図である。ＲｐＧ Ｉによるレスベラトロールのグリコシル化は、４００ｍＭのＬｉ＋を含む４０℃の２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中で実施した。黒丸、黒三角、及び黒四角はそれぞれ、４’－Ｏ－α－グルコシド、３－Ｏ－α－グルコシド、及び４’－Ｏ－α－マルトシドの濃度を示す。各値はピセイドの検量線を使用して計算したものであり、３回の独立した実験の平均値±標準偏差を示す。
【図5A】標準物質又は精製したＨｉｓタグ融合ＲｐＧの反応混合物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。上段はカフェイン酸の標準物質を示し、中段はＲｐＧ Ｉの反応混合物を示し、下段はＲｐＧ ＩＩの反応混合物を示す。
【図5B】標準物質又は精製したＨｉｓタグ融合ＲｐＧの反応混合物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。上段はフェルラ酸の標準物質を示し、中段はＲｐＧ Ｉの反応混合物を示し、下段はＲｐＧ ＩＩの反応混合物を示す。
【図5C】標準物質又は精製したＨｉｓタグ融合ＲｐＧの反応混合物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。上段は６－ジンゲロールの標準物質を示し、中段はＲｐＧ Ｉの反応混合物を示し、下段はＲｐＧ ＩＩの反応混合物を示す。
【図5D】標準物質又は精製したＨｉｓタグ融合ＲｐＧの反応混合物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。上段はダイゼインの標準物質を示し、中段はＲｐＧ Ｉの反応混合物を示し、下段はＲｐＧ ＩＩの反応混合物を示す。
【図5E】標準物質又は精製したＨｉｓタグ融合ＲｐＧの反応混合物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。上段は（Ｓ）－エクオールの標準物質を示し、中段はＲｐＧ Ｉの反応混合物を示し、下段はＲｐＧ ＩＩの反応混合物を示す。
【図5F】標準物質又は精製したＨｉｓタグ融合ＲｐＧの反応混合物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。上段はゲニステインの標準物質を示し、中段はＲｐＧ Ｉの反応混合物を示し、下段はＲｐＧ ＩＩの反応混合物を示す。
【図5G】標準物質又は精製したＨｉｓタグ融合ＲｐＧの反応混合物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。上段はナリンゲニンの標準物質を示し、中段はＲｐＧ Ｉの反応混合物を示し、下段はＲｐＧ ＩＩの反応混合物を示す。
【発明を実施するための形態】
【0012】
以下、本発明を適用した具体的な実施形態について説明する。
本明細書において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値を含む範囲を示す。
本明細書において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値を含む範囲を示す。
【0013】
本実施形態に係るクルクミノイドのモノ配糖体の製造方法は、クルクミノイド及び糖類を含む系に下記（ａ）～（ｃ）のいずれかの酵素タンパク質を作用させることを含む。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
（ｃ）上記（ａ）のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
（ｃ）上記（ａ）のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
【0014】
上記（ａ）のタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質である。このタンパク質は、根粒菌（Rhizobium pusense）が産生するα－グルコシダーゼとして公知のタンパク質である（GenBank accession protein ID: SDE36953）。本明細書では、上記（ａ）のタンパク質をＲｐＧ Ｉとも記載する。
【0015】
上記（ｂ）のタンパク質は、上記（ａ）のアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質である。アミノ酸残基が置換、欠失、又は付加される位置は、グリコシルトランスフェラーゼ活性が維持される限り特に制限されない。また、置換、欠失、又は付加されるアミノ酸残基の数は、グリコシルトランスフェラーゼ活性が維持される限り特に制限されない。置換、欠失、又は付加されるアミノ酸残基の数は、例えば、１～５５個であってもよく、１～４５個であってもよく、１～３５個であってもよく、１～２５個であってもよく、１～１５個であってもよく、１～５個であってもよい。
【0016】
任意のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換する場合、通常、置換前後でアミノ酸側鎖の性質が保存されていることが好ましい。アミノ酸側鎖の性質によってアミノ酸を分類する場合、例えば、親水性アミノ酸（Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ）；疎水性アミノ酸（Ａ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｍ、Ｃ、Ｐ）；酸性アミノ酸（Ｄ、Ｅ）；塩基性アミノ酸（Ｋ、Ｒ、Ｈ）；脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ａ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ）；芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｆ、Ｙ、Ｗ）；硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｍ、Ｃ）；等に分類することができる（括弧内のアルファベットはアミノ酸の一文字表記を示す）。
【0017】
上記（ｃ）のタンパク質は、上記（ａ）のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質である。上記（ａ）のアミノ酸配列との配列同一性は、９２％以上であってもよく、９４％以上であってもよく、９６％以上であってもよく、９８％以上であってもよい。
【0018】
なお、「配列同一性」とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントした場合の配列間の一致性を意味し、例えば、ＢＬＡＳＴプログラム（www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/cgi）を使用して算出することができる。
【0019】
上記（ａ）～（ｃ）の酵素タンパク質は、当該タンパク質を発現可能な形質転換体を用いて、公知の手法により製造することができる。
【0020】
グリコシルドナーである糖類としては、特に制限されないが、α－１，４－グリコシド結合を有するものが好ましく、マルトースがより好ましい。
【0021】
レスベラトロール及び糖類を含む系に上記（ａ）～（ｃ）のいずれかの酵素タンパク質を作用させる条件は特に制限されない。レスベラトロールのモノ配糖体の収率を向上させる観点から、ｐＨはｐＨ５～１１の範囲が好ましく、温度は３０～６０℃の範囲が好ましい。
【0022】
本実施形態に係るクルクミノイドのモノ配糖体の製造方法によれば、下記式（１）で表されるレスベラトロール４’－Ｏ－α－グリコシドを高選択的に製造することができる。
【0023】
【化2】
【0024】
上記式（１）中、Ｒ１で示される糖残基は、糖のヘミアセタール性（アノマー性）のヒドロキシ基を除いた残部を意味する。糖残基としては、例えば、グルコースの残基が挙げられる。
【0025】
なお、上記（ａ）～（ｃ）のいずれかの酵素タンパク質によれば、レスベラトロールに限らず、他のアグリコン（例えば、カフェイン酸、フェルラ酸、６－ジンゲロール、ナリンゲニン等）についても、高い位置選択性で配糖体を製造することができる。
【実施例0026】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0027】
＜方法＞
［α－グルコシダーゼのクローニング］
Rhizobium pusense JCM 16209T株が有する２種類のα－グルコシダーゼ遺伝子（ＲｐＧ Ｉ遺伝子及びＲｐＧ ＩＩ遺伝子）をＧｅｎｂａｎｋから購入し、ＲｐＧ Ｉ遺伝子（GenBank accession protein ID: SDE36953）については配列番号２、３のプライマーを用いて、ＲｐＧ ＩＩ遺伝子（GenBank accession protein ID: SDE53578）については配列番号４、５のプライマーを用いて、それぞれＰＣＲ増幅した。これらのプライマーは、Ｈｉｓタグ融合α－グルコシダーゼを発現するように設計された。
（ＲｐＧ Ｉ遺伝子）
フォワードプライマー：５’－ＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＣＧＣＴＴＣＧＧＴＧＡＣＴＴＣ－３’（配列番号２）
リバースプライマー：５’－ＣＧＧＡＴＣＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＣＧＧＣＧＴＡＡＣＧＧＧＣＧＡＡＧＡ－３’（配列番号３）
（ＲｐＧ ＩＩ遺伝子）
５’－ＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＧＴＴＡＴＣＣＣＡＴＧＣＣＣＣ－３’（配列番号４）
５’－ＣＧＧＡＴＣＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＣＴＴＣＡＡＴＧＣＴＣＣＣＧＣＡＡＡ－３’（配列番号５）
［α－グルコシダーゼのクローニング］
Rhizobium pusense JCM 16209T株が有する２種類のα－グルコシダーゼ遺伝子（ＲｐＧ Ｉ遺伝子及びＲｐＧ ＩＩ遺伝子）をＧｅｎｂａｎｋから購入し、ＲｐＧ Ｉ遺伝子（GenBank accession protein ID: SDE36953）については配列番号２、３のプライマーを用いて、ＲｐＧ ＩＩ遺伝子（GenBank accession protein ID: SDE53578）については配列番号４、５のプライマーを用いて、それぞれＰＣＲ増幅した。これらのプライマーは、Ｈｉｓタグ融合α－グルコシダーゼを発現するように設計された。
（ＲｐＧ Ｉ遺伝子）
フォワードプライマー：５’－ＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＣＧＣＴＴＣＧＧＴＧＡＣＴＴＣ－３’（配列番号２）
リバースプライマー：５’－ＣＧＧＡＴＣＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＣＧＧＣＧＴＡＡＣＧＧＧＣＧＡＡＧＡ－３’（配列番号３）
（ＲｐＧ ＩＩ遺伝子）
５’－ＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＧＴＴＡＴＣＣＣＡＴＧＣＣＣＣ－３’（配列番号４）
５’－ＣＧＧＡＴＣＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＣＴＴＣＡＡＴＧＣＴＣＣＣＧＣＡＡＡ－３’（配列番号５）
【0028】
ＰＣＲは、PrimeSTAR GXL DNAポリメラーゼ（Takara Bio）を使用し、９８℃で１０秒間、６０℃で１５秒間、６８℃で１．７分間のサイクルを３５サイクル行う条件とした。大腸菌用の発現ベクターpET-21bを制限酵素Ｎｄｅ Ｉ及びＸｈｏ Ｉで処理し、ゲル電気泳動で精製した後、ＰＣＲ産物と混合し、クローニングキット（In-Fusion HD Cloning Kit；Takara Bio）を使用して融合させた。そして、得られたプラスミド（pET-21b/His-tag-RpG I及びpET-21b/His-tag-RpG II）を大腸菌（Rosetta 2 (DE3)；Merck）に形質転換した。
【0029】
［組換えＲｐＧの発現及び精製］
組換え大腸菌を、５０μｇ／ｍＬ アンピシリン及び３４μｇ／ｍＬ クロラムフェニコールを含有するＬＢ培地（５００ｍＬ）に播種し、培養液のＯＤ６００が０．６に達するまで、３７℃、９５ストローク／分の条件で約３時間、振盪培養した。遺伝子発現は、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を終濃度１ｍｍｏｌ／Ｌで添加することによって誘導した。さらに、組換え大腸菌を１６℃で１日間、培養した。遺伝子誘導された細胞を遠心分離により回収し、０．８５％ ＮａＣｌで２回洗浄し、使用時まで２０℃で保存した。
組換え大腸菌を、５０μｇ／ｍＬ アンピシリン及び３４μｇ／ｍＬ クロラムフェニコールを含有するＬＢ培地（５００ｍＬ）に播種し、培養液のＯＤ６００が０．６に達するまで、３７℃、９５ストローク／分の条件で約３時間、振盪培養した。遺伝子発現は、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を終濃度１ｍｍｏｌ／Ｌで添加することによって誘導した。さらに、組換え大腸菌を１６℃で１日間、培養した。遺伝子誘導された細胞を遠心分離により回収し、０．８５％ ＮａＣｌで２回洗浄し、使用時まで２０℃で保存した。
【0030】
凍結細胞（５ｇ、湿重量）を１０ｍＬの結合バッファーに懸濁し、超音波破砕した（５分×４回）。なお、結合バッファーとしては、５ｍｍｏｌ／Ｌ イミダゾールを含有する２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ；ｐＨ７．０）を使用した。１４４００×ｇで１時間、１０００００×ｇで９０分間遠心分離することにより細胞片を除去し、上清を無細胞抽出物（ＣＦＥ）として使用した。ＣＦＥは、孔径０．４５μｍのメンブレンフィルター（Millex-HPF HV；Merck）を使用して濾過した。酵素は、HisTrapTM HP（カラム容量５ｍＬ；Cytiva）を備えた高速タンパク質液体クロマトグラフィーシステム（AKTAexplorer；Cytiva）を使用してＣＦＥから精製した。カラムを結合バッファーで平衡化し、吸着したＲｐＧを５００ｍｍｏｌ／Ｌ イミダゾールを含有する溶出バッファー（２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＰＢ、ｐＨ７．０）を使用して溶出した。ＲｐＧを含む画分を収集して脱塩し、Vivaspin Turbo 15（Sartorius）を使用して濃縮した。その後、バッファーを２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＰＢ（ｐＨ７．０）と交換した。最後に、ＲｐＧを含有する溶液を等量のグリセロールと混合し、使用時まで－２０℃で保存した。最後に、Vivaspin Turbo 15を使用して酵素溶液を２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＰＢ（ｐＨ７．０）に置き換え、グリコシルアクセプターとして機能する可能性のあるグリセロールを除去した。全ての操作は４℃で実行した。
【0031】
［Ｈｉｓタグ融合ＲｐＧの酵素アッセイ］
０．２ｍｇ／ｍＬ ＲｐＧ、メタノールに懸濁した５ｍｍｏｌ／Ｌ アグリコン、１ｍｏｌ／Ｌ マルトース、及び２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）からなる混合液（０．５ｍＬ）を遮光下、１２００ストローク／分で振盪させながら４０℃で３０分間インキュベートした。５０μＬの１Ｎ ＨＣｌを添加することにより反応を停止させた。得られた溶液を４℃、２００００×ｇの条件で５分間、遠心分離し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）を使用して上清を分析した。特に明記しない限り、α－グルコシダーゼ活性は、グルコシドの量を測定することによって評価した。
０．２ｍｇ／ｍＬ ＲｐＧ、メタノールに懸濁した５ｍｍｏｌ／Ｌ アグリコン、１ｍｏｌ／Ｌ マルトース、及び２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）からなる混合液（０．５ｍＬ）を遮光下、１２００ストローク／分で振盪させながら４０℃で３０分間インキュベートした。５０μＬの１Ｎ ＨＣｌを添加することにより反応を停止させた。得られた溶液を４℃、２００００×ｇの条件で５分間、遠心分離し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）を使用して上清を分析した。特に明記しない限り、α－グルコシダーゼ活性は、グルコシドの量を測定することによって評価した。
【0032】
［ＲｐＧ Ｉのグリコシル化活性におけるｐＨ及び温度の影響］
精製された組換えＲｐＧ Ｉの至適温度及び至適ｐＨを決定するために、２０℃から６０℃まで１０℃刻みで、種々のｐＨのバッファー（２０ｍｍｏｌ／Ｌ）を使用して酵素アッセイを実施した。バッファーとしては、クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．５、３．０、及び３．５）、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５、４．０、４．５、５．０、及び５．５）、ＫＰＢ（ｐＨ６．５、７．０、７．５、及び８．０）、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５、８．０、８．５、及び９．０）、重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５、１０．０、１０．５、及び１１．０）、及びリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１．５、１２．０、及び１２．５）を使用した。
精製された組換えＲｐＧ Ｉの至適温度及び至適ｐＨを決定するために、２０℃から６０℃まで１０℃刻みで、種々のｐＨのバッファー（２０ｍｍｏｌ／Ｌ）を使用して酵素アッセイを実施した。バッファーとしては、クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．５、３．０、及び３．５）、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５、４．０、４．５、５．０、及び５．５）、ＫＰＢ（ｐＨ６．５、７．０、７．５、及び８．０）、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５、８．０、８．５、及び９．０）、重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５、１０．０、１０．５、及び１１．０）、及びリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１．５、１２．０、及び１２．５）を使用した。
【0033】
ｐＨ安定性を評価するために、酵素溶液を氷上で３０分間、上述した種々のｐＨのバッファー（５０ｍｍｏｌ／Ｌ）を使用してプレインキュベートした。また、熱安定性を評価するために、酵素溶液を４℃（氷上）、又は２０℃から８０℃まで１０℃刻みで、２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＰＢ（ｐＨ７．０）を使用してプレインキュベートした。酵素活性は、２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０、至適ｐＨでの実験を除く）中、５０℃（至適温度での実験を除く）で３０分間アッセイした。
【0034】
［ＲｐＧ Ｉのグリコシル化活性における一価陽イオンの影響］
ＲｐＧ Ｉのグリコシル化活性における一価陽イオン（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）の影響を、２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中、４０℃で３０分間評価した。さらに、Ｌｉ＋（５、１０、５０、１００、２００、４００、６００、８００、及び１０００ｍｍｏｌ／Ｌ）及びＫ＋（５、１０、５０、１００、２００、及び４００ｍｍｏｌ／Ｌ）の種々の濃度の影響も評価した。
ＲｐＧ Ｉのグリコシル化活性における一価陽イオン（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）の影響を、２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中、４０℃で３０分間評価した。さらに、Ｌｉ＋（５、１０、５０、１００、２００、４００、６００、８００、及び１０００ｍｍｏｌ／Ｌ）及びＫ＋（５、１０、５０、１００、２００、及び４００ｍｍｏｌ／Ｌ）の種々の濃度の影響も評価した。
【0035】
［ＲｐＧのグリコシル化活性におけるオリゴ糖の影響］
０．２ｍｇ／ｍＬ ＲｐＧ、メタノールに懸濁した５ｍｍｏｌ／Ｌ レスベラトロール、１ｍｏｌ／Ｌ オリゴ糖（マルトース、スクロース、トレハロース、ラクトース、及びセロビオース）、及び２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）からなる混合液（０．５ｍＬ）を、遮光下、１２００ストローク／分で振盪させながら４０℃で３０分間インキュベートした。５０μＬの１Ｎ ＨＣｌを添加することにより反応を停止させた。得られた溶液を４℃、２００００×ｇの条件で５分間、遠心分離し、COSMOSILカラム及びSPD-M40Aフォトダイオードアレイ検出器を備えたＨＰＬＣを使用して上清を分析した。さらに、アグリコンを含有しない場合のマルトースに対するＲｐＧ Ｉ及びＲｐＧ ＩＩの加水分解活性と、ＲｐＧ Ｉに対する４００ｍｍｏｌ／ＬのＬｉ＋の影響とを、ULTRONカラムを備えたＨＰＬＣを使用し、放出される遊離グルコースの濃度を推定することによって検討した。
０．２ｍｇ／ｍＬ ＲｐＧ、メタノールに懸濁した５ｍｍｏｌ／Ｌ レスベラトロール、１ｍｏｌ／Ｌ オリゴ糖（マルトース、スクロース、トレハロース、ラクトース、及びセロビオース）、及び２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）からなる混合液（０．５ｍＬ）を、遮光下、１２００ストローク／分で振盪させながら４０℃で３０分間インキュベートした。５０μＬの１Ｎ ＨＣｌを添加することにより反応を停止させた。得られた溶液を４℃、２００００×ｇの条件で５分間、遠心分離し、COSMOSILカラム及びSPD-M40Aフォトダイオードアレイ検出器を備えたＨＰＬＣを使用して上清を分析した。さらに、アグリコンを含有しない場合のマルトースに対するＲｐＧ Ｉ及びＲｐＧ ＩＩの加水分解活性と、ＲｐＧ Ｉに対する４００ｍｍｏｌ／ＬのＬｉ＋の影響とを、ULTRONカラムを備えたＨＰＬＣを使用し、放出される遊離グルコースの濃度を推定することによって検討した。
【0036】
［グリコシルアクセプターとしての種々のアグリコンに対するグリコシル化活性の特異性］
０．２ｍｇ／ｍＬ ＲｐＧ、メタノールに懸濁した５ｍｍｏｌ／Ｌ アグリコン、１ｍｏｌ／Ｌ マルトース、及び２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）からなる混合液（０．５ｍＬ）を遮光下、１２００ストローク／分で振盪させながら４０℃で３０分間インキュベートした。５０μＬの１Ｎ ＨＣｌを添加することにより反応を停止させた。得られた溶液を４℃、２００００×ｇの条件で５分間、遠心分離し、SPD-M40Aフォトダイオードアレイ検出器を備えたＨＰＬＣ、及びＬＣ－ＭＳを使用して上清を分析した。さらに、カフェイン酸、ナリンゲニン、及びレスベラトロールの各グルコシドを反応混合物から精製し、核磁気共鳴装置（ＮＭＲ）を使用して構造解析し、グルコース結合位置を特定した。
０．２ｍｇ／ｍＬ ＲｐＧ、メタノールに懸濁した５ｍｍｏｌ／Ｌ アグリコン、１ｍｏｌ／Ｌ マルトース、及び２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）からなる混合液（０．５ｍＬ）を遮光下、１２００ストローク／分で振盪させながら４０℃で３０分間インキュベートした。５０μＬの１Ｎ ＨＣｌを添加することにより反応を停止させた。得られた溶液を４℃、２００００×ｇの条件で５分間、遠心分離し、SPD-M40Aフォトダイオードアレイ検出器を備えたＨＰＬＣ、及びＬＣ－ＭＳを使用して上清を分析した。さらに、カフェイン酸、ナリンゲニン、及びレスベラトロールの各グルコシドを反応混合物から精製し、核磁気共鳴装置（ＮＭＲ）を使用して構造解析し、グルコース結合位置を特定した。
【0037】
［ＨＰＬＣ分析］
全てのアグリコン及びグリコシドの定量分析は、COSMOSIL 5C18 PAQカラム（４．６×１５０ｍｍ；Nacalai tesque）又はULTRON PS-80Hカラム（８．０×３００ｍｍ；Shinwa Chemical Industries）を備えたＨＰＬＣシステム（Shimadzu）を使用して実施した。COSMOSILカラムを使用した場合、グラジエント溶出には５．７×１０－２％（ｖ／ｖ） 酢酸（溶離液Ａ）及びアセトニトリル（溶離液Ｂ）を使用した。流量は１．０ｍＬ／分とした。グラジエント条件は次のとおりである。０～５分：溶離液Ｂ １０％、５～１６分：溶離液Ｂ １０～８０％の直線勾配、１６～１７分：溶離液Ｂ ８０～１００の直線勾配、１７～２２分：溶離液Ｂ １００％、２２～２３分：溶離液Ｂ １００～１０％の直線勾配、２３～２７分：溶離液Ｂ １０％。オートサンプラーのインジェクターニードルは、サンプル注入後の不溶性成分の凝固を防ぐためにメタノールで洗浄した。溶出液のモニターには、SPD-M10A、M20A、又はM40Aフォトダイオードアレイ検出器（Shimadzu）を使用した。ULTRONカラムを使用した場合、移動相はMilli-Q水とし、流量は１．０ｍＬ／分とした。溶出液のモニターには、屈折率検出器（RID-10A；Shimadzu）を使用した。
全てのアグリコン及びグリコシドの定量分析は、COSMOSIL 5C18 PAQカラム（４．６×１５０ｍｍ；Nacalai tesque）又はULTRON PS-80Hカラム（８．０×３００ｍｍ；Shinwa Chemical Industries）を備えたＨＰＬＣシステム（Shimadzu）を使用して実施した。COSMOSILカラムを使用した場合、グラジエント溶出には５．７×１０－２％（ｖ／ｖ） 酢酸（溶離液Ａ）及びアセトニトリル（溶離液Ｂ）を使用した。流量は１．０ｍＬ／分とした。グラジエント条件は次のとおりである。０～５分：溶離液Ｂ １０％、５～１６分：溶離液Ｂ １０～８０％の直線勾配、１６～１７分：溶離液Ｂ ８０～１００の直線勾配、１７～２２分：溶離液Ｂ １００％、２２～２３分：溶離液Ｂ １００～１０％の直線勾配、２３～２７分：溶離液Ｂ １０％。オートサンプラーのインジェクターニードルは、サンプル注入後の不溶性成分の凝固を防ぐためにメタノールで洗浄した。溶出液のモニターには、SPD-M10A、M20A、又はM40Aフォトダイオードアレイ検出器（Shimadzu）を使用した。ULTRONカラムを使用した場合、移動相はMilli-Q水とし、流量は１．０ｍＬ／分とした。溶出液のモニターには、屈折率検出器（RID-10A；Shimadzu）を使用した。
【0038】
［ＬＣ－ＭＳ分析］
COSMOSIL 5C18 PAQカラム（４．６×１５０ｍｍ；Nacalai tesque）を備えたＬＣ－ＭＳシステム（Shimadzu）を使用し、５．７×１０－２％（ｖ／ｖ） 酢酸（溶離液Ａ）及びアセトニトリル（溶離液Ｂ）を用いてグラジエント溶出を行った。流量は０．２ｍＬ／分とした。グラジエント条件は次のとおりである。０～１５分：溶離液Ｂ １０％、１５～３７分：溶離液Ｂ １０～１００％の直線勾配、３７～５７分：溶離液Ｂ １００％、５７～５９分：溶離液Ｂ １００～１０％の直線勾配、５９～７０分：溶離液Ｂ １０％。オートサンプラーのインジェクターニードルは、サンプル注入後にメタノールで洗浄した。溶出液のモニターには、SPD-M20Aフォトダイオードアレイ検出器（Shimadzu）及びLCMS-2020（Shimadzu）を使用した。検出は、ネガティブモードエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を利用して実施した。ＭＳ条件は次のとおりである。インターフェース温度：３５０℃、脱溶媒和ライン（ＤＬ）温度：２５０℃、ネブライザーガス流量：１．５Ｌ／分、ヒートブロック温度：２００℃、ドライガス流量：１０Ｌ／分。
COSMOSIL 5C18 PAQカラム（４．６×１５０ｍｍ；Nacalai tesque）を備えたＬＣ－ＭＳシステム（Shimadzu）を使用し、５．７×１０－２％（ｖ／ｖ） 酢酸（溶離液Ａ）及びアセトニトリル（溶離液Ｂ）を用いてグラジエント溶出を行った。流量は０．２ｍＬ／分とした。グラジエント条件は次のとおりである。０～１５分：溶離液Ｂ １０％、１５～３７分：溶離液Ｂ １０～１００％の直線勾配、３７～５７分：溶離液Ｂ １００％、５７～５９分：溶離液Ｂ １００～１０％の直線勾配、５９～７０分：溶離液Ｂ １０％。オートサンプラーのインジェクターニードルは、サンプル注入後にメタノールで洗浄した。溶出液のモニターには、SPD-M20Aフォトダイオードアレイ検出器（Shimadzu）及びLCMS-2020（Shimadzu）を使用した。検出は、ネガティブモードエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を利用して実施した。ＭＳ条件は次のとおりである。インターフェース温度：３５０℃、脱溶媒和ライン（ＤＬ）温度：２５０℃、ネブライザーガス流量：１．５Ｌ／分、ヒートブロック温度：２００℃、ドライガス流量：１０Ｌ／分。
【0039】
［ＮＭＲ分析のためのグルコシドの精製］
レスベラトロール４’－Ｏ－α－グルコシド、ＣａＵＫ１（カフェイン酸グルコシド）、ＣａＵＫ２（カフェイン酸グルコシド）、及びＮＵＫ２（ナリンゲニングルコシド）は、COSMOSIL 5C18 PAQカラム（２０×２５０ｍｍ；Nacalai tesque）を備えたＨＰＬＣシステム（Shimadzu）を使用して精製した。アイソクラティック溶出には、５．７×１０－２％（ｖ／ｖ） 酢酸（溶離液Ａ）及びアセトニトリル（溶離液Ｂ）の混合液を使用した。レスベラトロール４’－Ｏ－α－グルコシドの場合には溶離液Ｂの濃度を２０％とし、ＣａＵＫ１及びＣａＵＫ２の場合には溶離液Ｂの濃度を８％とし、ＮＵＫ２の場合には溶離液Ｂの濃度を３０％とした。溶出液のモニターには、SPD-M10Aフォトダイオードアレイ検出器（Shimadzu）を使用した。
レスベラトロール４’－Ｏ－α－グルコシド、ＣａＵＫ１（カフェイン酸グルコシド）、ＣａＵＫ２（カフェイン酸グルコシド）、及びＮＵＫ２（ナリンゲニングルコシド）は、COSMOSIL 5C18 PAQカラム（２０×２５０ｍｍ；Nacalai tesque）を備えたＨＰＬＣシステム（Shimadzu）を使用して精製した。アイソクラティック溶出には、５．７×１０－２％（ｖ／ｖ） 酢酸（溶離液Ａ）及びアセトニトリル（溶離液Ｂ）の混合液を使用した。レスベラトロール４’－Ｏ－α－グルコシドの場合には溶離液Ｂの濃度を２０％とし、ＣａＵＫ１及びＣａＵＫ２の場合には溶離液Ｂの濃度を８％とし、ＮＵＫ２の場合には溶離液Ｂの濃度を３０％とした。溶出液のモニターには、SPD-M10Aフォトダイオードアレイ検出器（Shimadzu）を使用した。
【0040】
［ＮＭＲ分析］
精製後の生成物をＮＭＲ装置（５００ＭＨｚ、Avance 500；Bruker）で分析し、１Ｈ－ＮＭＲ測定及び二量子フィルター１Ｈ－１Ｈシフト相関二次元ＮＭＲ測定（ＤＱＦ－ＣＯＳＹ）で確認した。化学シフトは、溶媒シグナルに関連して割り当てた。 溶媒としては、メタノール－ｄを使用した。サンプルチューブの直径は５ｍｍとした。
精製後の生成物をＮＭＲ装置（５００ＭＨｚ、Avance 500；Bruker）で分析し、１Ｈ－ＮＭＲ測定及び二量子フィルター１Ｈ－１Ｈシフト相関二次元ＮＭＲ測定（ＤＱＦ－ＣＯＳＹ）で確認した。化学シフトは、溶媒シグナルに関連して割り当てた。 溶媒としては、メタノール－ｄを使用した。サンプルチューブの直径は５ｍｍとした。
【0041】
＜結果＞
［組換えＨｉｓタグ融合ＲｐＧの精製及び反応］
Ｈｉｓタグ融合ＲｐＧ Ｉ及びＨｉｓタグ融合ＲｐＧ ＩＩを発現する組換え大腸菌を培養し、回収して破砕し、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーに供して、Ｈｉｓタグ融合ＲｐＧ Ｉ及びＨｉｓタグ融合ＲｐＧ ＩＩを精製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果から、Ｈｉｓタグ融合ＲｐＧ Ｉ及びＨｉｓタグ融合ＲｐＧ ＩＩは、いずれも分子量が約６０ｋＤａであることが確認された（図１Ａ）。
［組換えＨｉｓタグ融合ＲｐＧの精製及び反応］
Ｈｉｓタグ融合ＲｐＧ Ｉ及びＨｉｓタグ融合ＲｐＧ ＩＩを発現する組換え大腸菌を培養し、回収して破砕し、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーに供して、Ｈｉｓタグ融合ＲｐＧ Ｉ及びＨｉｓタグ融合ＲｐＧ ＩＩを精製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果から、Ｈｉｓタグ融合ＲｐＧ Ｉ及びＨｉｓタグ融合ＲｐＧ ＩＩは、いずれも分子量が約６０ｋＤａであることが確認された（図１Ａ）。
【0042】
Thermoanaerobacter sp.やBacillus macerans等の微生物に由来するシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）によれば、レスベラトロール配糖体（３－Ｏ－α－グルコシド、３－Ｏ－α－マルトシド、４’－Ｏ－α－グルコシド、及び４’－Ｏ－α－マルトシド）が得られることが知られている（Bolton, G.W. et al., Science, 232, 983-985 (1986); Torres, P. et al., Adv. Synth. Catal., 353, 1077-1086 (2011)）。そこで、ＣＧＴａｓｅの反応混合物を標準物質として使用して、ＲｐＧによって生成されたレスベラトロールグルコシドのグルコース結合位置及び重合度を確認した（図１Ｂ）。ＣＧＴａｓｅの反応混合物のＨＰＬＣ分析では、クロマトグラムの１０．７８分、１１．３０分、１１．９０分、１２．１６分、及び１３．８３分の位置に連続的にピークが現れ、それぞれ、ピークＰ５（４’－Ｏ－α－マルトシド）、ピークＰ４（４’－Ｏ－α－グルコシド）、ピークＰ３（３－Ｏ－α－マルトシド）、ピークＰ２（３－Ｏ－α－グルコシド）、及びピークＰ１（レスベラトロール）に対応していた。これらのピークを、ＲｐＧ Ｉ及びＲｐＧ ＩＩの反応サンプルで確認されるピークと比較することで、ＲｐＧ Ｉがレスベラトロールに対して高いグリコシル化活性を有していることが分かった。ＲｐＧ Ｉによって生成された４’－Ｏ－α－グルコシド、３－Ｏ－α－グルコシド、及び４’－Ｏ－α－マルトシドの割合は、それぞれ９８．３％、１．６％、及び０．１％であった。一方、ＲｐＧ ＩＩは非常に低い活性を示し、ＨＰＬＣクロマトグラムのピーク面積から計算した４’位選択性は６５．６％であった。
【0043】
［ＲｐＧ Ｉのグリコシル化活性におけるｐＨ及び温度の影響］
グリコシルドナーとしてマルトースを使用したときのレスベラトロールに対するＲｐＧ Ｉのグリコシル化活性におけるｐＨ及び温度の影響を、ｐＨ２．５からｐＨ１２．５まで、及び２０℃から６０℃までの範囲で調べた。４’－Ｏ－α－グルコシドを生成する最大の活性は、ｐＨ８．０（ＫＰＢを使用）、かつ５０℃のときに観察された（図２Ａ、図２Ｃ）。グリコシル化活性は４０℃まで安定していたが、５０℃を超える温度では急速に失われた（図２Ｄ）。ｐＨ安定性試験では、酵素はｐＨ３．５からｐＨ１１．０までの間で最大の活性を維持した（図２Ｂ）。位置選択性に関しては、反応温度での違いは観察されず、４’位選択性は９８．６％以上に保たれた。しかし、反応ｐＨの低下に従って４’位選択性は低下し、ｐＨ３．５（クエン酸ナトリウム緩衝液を使用）で最終的に９１．１％となった。逆に、反応ｐＨが上昇すると４’位選択性も高まり、最終的にｐＨ９．５で９９．７％に達したが、いくつかの副生成物が検出された。これは、アルカリ性条件下でレスベラトロールが不安定であるためと推測される（Zupancic, S. et al., Eur. J. Pharm. Biopharm., 93, 196-204 (2015)）。
グリコシルドナーとしてマルトースを使用したときのレスベラトロールに対するＲｐＧ Ｉのグリコシル化活性におけるｐＨ及び温度の影響を、ｐＨ２．５からｐＨ１２．５まで、及び２０℃から６０℃までの範囲で調べた。４’－Ｏ－α－グルコシドを生成する最大の活性は、ｐＨ８．０（ＫＰＢを使用）、かつ５０℃のときに観察された（図２Ａ、図２Ｃ）。グリコシル化活性は４０℃まで安定していたが、５０℃を超える温度では急速に失われた（図２Ｄ）。ｐＨ安定性試験では、酵素はｐＨ３．５からｐＨ１１．０までの間で最大の活性を維持した（図２Ｂ）。位置選択性に関しては、反応温度での違いは観察されず、４’位選択性は９８．６％以上に保たれた。しかし、反応ｐＨの低下に従って４’位選択性は低下し、ｐＨ３．５（クエン酸ナトリウム緩衝液を使用）で最終的に９１．１％となった。逆に、反応ｐＨが上昇すると４’位選択性も高まり、最終的にｐＨ９．５で９９．７％に達したが、いくつかの副生成物が検出された。これは、アルカリ性条件下でレスベラトロールが不安定であるためと推測される（Zupancic, S. et al., Eur. J. Pharm. Biopharm., 93, 196-204 (2015)）。
【0044】
［ＲｐＧ Ｉのグリコシル化活性における一価陽イオンの影響］
糖質加水分解酵素（ＧＨ）の配列に基づく分類によれば、細菌のα－グルコシダーゼはＧＨファミリー１３（ＧＨ１３）に分類される。過去の研究では、Halomonas sp. H11株及びEnsifer adhaerens NBRC 100388T株のα－グルコシダーゼ活性はＮＨ４ ＋及びＫ＋によって亢進することが知られている（Ojima, T. et al., Appl. Environ. Microbiol., 78, 1836-1845 (2012); Suzuki, T. et al., Biocatal. Agric. Biotechnol., 30, 101837 (2012)）。そこで、０．２ｍｇ／ｍＬ ＲｐＧ Ｉの活性に対する種々の一価陽イオン（１０ｍＭ）の影響も評価した。一価陽イオンの塩としては、ＣｓＣｌ、ＬｉＣｌ、ＲｂＣｌ、ＮＨ４Ｃｌ、ＮａＣｌ、及びＫＣｌを使用した。２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＰＢ（ｐＨ８．０）を至適バッファーとして使用した場合（図２Ａ参照）、活性は全ての陽イオンによって僅かに抑制された（表１）。但し、２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を使用した場合、ＲｐＧ Ｉ活性はＣｓ＋及びＬｉ＋によって１３５％に亢進した（表２）。
糖質加水分解酵素（ＧＨ）の配列に基づく分類によれば、細菌のα－グルコシダーゼはＧＨファミリー１３（ＧＨ１３）に分類される。過去の研究では、Halomonas sp. H11株及びEnsifer adhaerens NBRC 100388T株のα－グルコシダーゼ活性はＮＨ４ ＋及びＫ＋によって亢進することが知られている（Ojima, T. et al., Appl. Environ. Microbiol., 78, 1836-1845 (2012); Suzuki, T. et al., Biocatal. Agric. Biotechnol., 30, 101837 (2012)）。そこで、０．２ｍｇ／ｍＬ ＲｐＧ Ｉの活性に対する種々の一価陽イオン（１０ｍＭ）の影響も評価した。一価陽イオンの塩としては、ＣｓＣｌ、ＬｉＣｌ、ＲｂＣｌ、ＮＨ４Ｃｌ、ＮａＣｌ、及びＫＣｌを使用した。２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＰＢ（ｐＨ８．０）を至適バッファーとして使用した場合（図２Ａ参照）、活性は全ての陽イオンによって僅かに抑制された（表１）。但し、２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を使用した場合、ＲｐＧ Ｉ活性はＣｓ＋及びＬｉ＋によって１３５％に亢進した（表２）。
【0045】
【表1】
【0046】
【表2】
【0047】
さらに、種々の濃度のＬｉ＋（５、１０、５０、１００、２００、４００、６００、８００、及び１０００ｍｍｏｌ／Ｌ）及びＫ＋（５、１０、５０、１００、２００、及び４００ｍｍｏｌ／Ｌ）による影響を評価した（図３Ａ、図３Ｂ）。Ｌｉ塩及びＫ塩としては、ＬｉＣｌ及びＫＣｌを使用した。４’－Ｏ－α－グルコシドの量は、４００ｍｍｏｌ／ＬのＬｉ＋濃度まで濃度依存的に増加して最大２．５倍に達し、それよりも高濃度では減少した。対照的に、３－Ｏ－α－グルコシドの量は、１ｍｏｌ／ＬのＬｉ＋濃度まで濃度依存的に増加した。Ｋ＋では活性が僅かに抑制された。４’位選択性は、１００ｍｍｏｌ／ＬのＬｉ＋濃度まで濃度依存的に増加して最大９９．１％に達し、それよりも高濃度では最小９６．０％まで低下した。
【0048】
なお、Ｌｉ＋の効果は、ＲｐＧ Ｉ、ＲｐＧ ＩＩ、及びアグリコンの種類によって異なっていた。このことは、ＧＨ１３に有効な陽イオンは、酵素構造、グリコシルドナー、グリコシルアクセプター、及び反応条件の組み合わせによって異なることを示している。
【0049】
［ＲｐＧ Ｉのグリコシル化活性におけるオリゴ糖の影響］
レスベラトロール４’－Ｏ－α－グルコシドの濃度を測定することにより、種々のオリゴ糖を使用してＲｐＧ Ｉのグリコシル化活性を評価した（表３）。活性が最も高かったのは、グリコシルドナーとしてマルトースを使用した場合であり、次がスクロースを使用した場合であった。トレハロースを使用した場合の活性は比較的低く、ラクトース及びセロビオースを使用した場合にはレスベラトロール４’－Ｏ－α－グルコシドが検出されなかった。マルトース、スクロース、及びトレハロースを使用した場合、４’選択性はそれぞれ９８．３％、９２．７％、及び９４．６％であり、オリゴ糖の種類によってグリコシル化の位置選択性が異なることを示している。
レスベラトロール４’－Ｏ－α－グルコシドの濃度を測定することにより、種々のオリゴ糖を使用してＲｐＧ Ｉのグリコシル化活性を評価した（表３）。活性が最も高かったのは、グリコシルドナーとしてマルトースを使用した場合であり、次がスクロースを使用した場合であった。トレハロースを使用した場合の活性は比較的低く、ラクトース及びセロビオースを使用した場合にはレスベラトロール４’－Ｏ－α－グルコシドが検出されなかった。マルトース、スクロース、及びトレハロースを使用した場合、４’選択性はそれぞれ９８．３％、９２．７％、及び９４．６％であり、オリゴ糖の種類によってグリコシル化の位置選択性が異なることを示している。
【0050】
【表3】
【0051】
さらに、アグリコンを含有しない場合のマルトースに対するＲｐＧ Ｉ及びＲｐＧ ＩＩの加水分解活性を、ULTRONカラムを備えたＨＰＬＣを使用し、放出される遊離グルコースの濃度を測定することによって比較した。その結果、ＲｐＧ Ｉの活性は、ＲｐＧ ＩＩの活性、及びＬｉ＋を含む場合のＲｐＧ Ｉの活性に比べて、それぞれ約８倍及び約４倍であった（表４）。このことから、Ｌｉ＋は、酵素を活性化することに加えて加水分解活性を抑制することにより、ＲｐＧ Ｉのグリコシル化活性を増強することが示唆された。
【0052】
【表4】
【0053】
［至適条件下でＲｐＧ Ｉを使用したレスベラトロールグルコシドの酵素的合成］
４００ｍＭのＬｉ＋を含む４０℃の２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液中、０．２ｍｇ／ｍＬのＲｐＧ Ｉを使用して、５ｍｍｏｌ／Ｌ レスベラトロールのグリコシル化の時間経過を測定した（図４）。レスベラトロール４’－Ｏ－α－グルコシドの最大モル収率は３０分の時点で４１．６％に達し、生成物の濃度は２．０８ｍｍｏｌ／Ｌであった。この時点以降、加水分解反応が支配的になった。対照的に、３－Ｏ－α－グルコシド及び４’－Ｏ－α－マルトシドは時間依存的に合成され、それに応じて４’－Ｏ－α－グルコシドの割合が減少した。
４００ｍＭのＬｉ＋を含む４０℃の２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液中、０．２ｍｇ／ｍＬのＲｐＧ Ｉを使用して、５ｍｍｏｌ／Ｌ レスベラトロールのグリコシル化の時間経過を測定した（図４）。レスベラトロール４’－Ｏ－α－グルコシドの最大モル収率は３０分の時点で４１．６％に達し、生成物の濃度は２．０８ｍｍｏｌ／Ｌであった。この時点以降、加水分解反応が支配的になった。対照的に、３－Ｏ－α－グルコシド及び４’－Ｏ－α－マルトシドは時間依存的に合成され、それに応じて４’－Ｏ－α－グルコシドの割合が減少した。
【0054】
［種々のアグリコンに対するＲｐＧの基質特異性］
ＲｐＧの基質特異性を評価するため、各ポリフェノール化合物を含む反応混合物を調製し、ＨＰＬＣで分析して生成物を特定した（図５Ａ～図５Ｇ）。反応混合物中に各アグリコンと同様の吸収スペクトルを有する未知のピーク（ＵＫ）が検出されたことから、ＲｐＧ Ｉは、評価した全てアグリコン（レスベラトロール、カフェイン酸、フェルラ酸、６－ジンゲロール、ダイゼイン、（Ｓ）－エクオール、ゲニステイン、及びナリンゲニン）に対してグリコシル化活性を有しているようであった。一方、ＲｐＧ ＩＩは、評価した全てのアグリコンに対して殆ど活性を示さず、位置選択性を正確に評価することはできなかった。
ＲｐＧの基質特異性を評価するため、各ポリフェノール化合物を含む反応混合物を調製し、ＨＰＬＣで分析して生成物を特定した（図５Ａ～図５Ｇ）。反応混合物中に各アグリコンと同様の吸収スペクトルを有する未知のピーク（ＵＫ）が検出されたことから、ＲｐＧ Ｉは、評価した全てアグリコン（レスベラトロール、カフェイン酸、フェルラ酸、６－ジンゲロール、ダイゼイン、（Ｓ）－エクオール、ゲニステイン、及びナリンゲニン）に対してグリコシル化活性を有しているようであった。一方、ＲｐＧ ＩＩは、評価した全てのアグリコンに対して殆ど活性を示さず、位置選択性を正確に評価することはできなかった。
【0055】
［ＲｐＧ Ｉの反応混合物のＬＣ－ＭＳ分析］
ＬＣ－ＭＳでＲｐＧ Ｉの反応混合物を分析し、ＭＳスペクトルを参照してそれらがグルコシドであることを確認した（図示せず）。その結果、ＣａＵＫ１（カフェイン酸グルコシド）、ＣａＵＫ２（カフェイン酸グルコシド）、ＦＵＫ１（フェルラ酸グルコシド）、６ＧＵＫ２（６－ジンゲロールグルコシド）、ＤＵＫ１（ダイゼイングルコシド）、ＤＵＫ２（ダイゼイングルコシド）、ＥＵＫ２（（Ｓ）－エクオールグルコシド）、ＧＵＫ１（ゲニステイングルコシド）、ＧＵＫ２（ゲニステイングルコシド）、ＮＵＫ１（ナリンゲニングルコシド）、及びＮＵＫ２（ナリンゲニングルコシド）は、単一のグルコース分子が各アグリコンに転移することによって形成されたモノグルコシドであることが分かった。対照的に、６ＧＵＫ１（６－ジンゲロールグルコシド）及びＥＵＫ１（（Ｓ）－エクオールグルコシド）は、ジグルコシドに対応していた。
ＬＣ－ＭＳでＲｐＧ Ｉの反応混合物を分析し、ＭＳスペクトルを参照してそれらがグルコシドであることを確認した（図示せず）。その結果、ＣａＵＫ１（カフェイン酸グルコシド）、ＣａＵＫ２（カフェイン酸グルコシド）、ＦＵＫ１（フェルラ酸グルコシド）、６ＧＵＫ２（６－ジンゲロールグルコシド）、ＤＵＫ１（ダイゼイングルコシド）、ＤＵＫ２（ダイゼイングルコシド）、ＥＵＫ２（（Ｓ）－エクオールグルコシド）、ＧＵＫ１（ゲニステイングルコシド）、ＧＵＫ２（ゲニステイングルコシド）、ＮＵＫ１（ナリンゲニングルコシド）、及びＮＵＫ２（ナリンゲニングルコシド）は、単一のグルコース分子が各アグリコンに転移することによって形成されたモノグルコシドであることが分かった。対照的に、６ＧＵＫ１（６－ジンゲロールグルコシド）及びＥＵＫ１（（Ｓ）－エクオールグルコシド）は、ジグルコシドに対応していた。
【0056】
［α－グルコシド又はβ－グルコシドの標準物質を使用したグルコース結合位置の決定及び推定］
ＬＣ－ＭＳ分析の結果、６－ジンゲロール及び（Ｓ）－エクオールに対するＲｐＧ Ｉの位置選択性が１００％であることが分かった。本発明者らは、６－ジンゲロールについて、微生物由来のグリコシルトランスフェラーゼによって５－Ｏ－α－グルコシルジンゲロールが生成されることを報告している（Matsumoto, R. et al., J. Mol. Catal. B Enzym., 133, S200-S203 (2016)）。そこで、精製した５－Ｏ－α－グルコシルジンゲロールを標準物質として使用して、６ＧＵＫ２のグルコース結合位置を決定した。その結果、６ＧＵＫ２が５－Ｏ－α－グルコシルジンゲロールであり、ＲｐＧ Ｉが高い位置選択性でジンゲロールの第２級アルコールをグリコシル化したことが分かった（図５Ｃ参照）。
ＬＣ－ＭＳ分析の結果、６－ジンゲロール及び（Ｓ）－エクオールに対するＲｐＧ Ｉの位置選択性が１００％であることが分かった。本発明者らは、６－ジンゲロールについて、微生物由来のグリコシルトランスフェラーゼによって５－Ｏ－α－グルコシルジンゲロールが生成されることを報告している（Matsumoto, R. et al., J. Mol. Catal. B Enzym., 133, S200-S203 (2016)）。そこで、精製した５－Ｏ－α－グルコシルジンゲロールを標準物質として使用して、６ＧＵＫ２のグルコース結合位置を決定した。その結果、６ＧＵＫ２が５－Ｏ－α－グルコシルジンゲロールであり、ＲｐＧ Ｉが高い位置選択性でジンゲロールの第２級アルコールをグリコシル化したことが分かった（図５Ｃ参照）。
【0057】
アノマー異性体であるα－グルコシド及びβ－グルコシドは、同様の極性を有し、ＨＰＬＣでの保持時間が近似しているものの、α－グルコシドの方がβ－グルコシドよりも僅かに早く溶出する。そこで、ダイゼイン７－Ｏ－β－グルコシド（ダイジン）、ゲニステイン４’－Ｏ－β－グルコシド（ソフォリコシド）、及びゲニステイン７－Ｏ－β－グルコシド（ゲニスチン）を標準物質として使用して、ダイゼイン及びゲニステインのグルコース結合位置を推定した。その結果、ＤＵＫ１及びダイジンの保持時間は一致していた。このため、ＤＵＫ１及びＤＵＫ２はそれぞれ、７－Ｏ－α－グルコシド及び４’－Ｏ－α－グルコシドであると推定された（図５Ｄ参照）。また、ＧＵＫ１及びＧＵＫ２の保持時間はそれぞれ、ゲニスチン及びソフォリコシドの保持時間と一致していた。このため、ＧＵＫ１及びＧＵＫ２はそれぞれ、７－Ｏ－α－グルコシド及び４’－Ｏ－α－グルコシドであると推定された（図５Ｆ参照）。
【0058】
［ＮＭＲを使用したグルコシドの構造解析］
ＲｐＧ Ｉの位置選択性についてさらに知見を得るために、レスベラトロール４’－Ｏ－α－グルコシド、ＣａＵＫ１、ＣａＵＫ２、及びＮＵＫ２を反応混合物から精製し、ＮＭＲ分析を行った。アグリコン及びグルコシドの１Ｈ－ＮＭＲデータによれば、グリコシル化位置周辺の化学シフト値は低磁場側へシフトする。このシフトを参照することにより、グルコース結合位置を特定した。その結果、レスベラトロール４’－Ｏ－α－グルコシドの化学構造を確認した。また、ＣａＵＫ１、ＣａＵＫ２、及びＮＵＫ２はそれぞれ、カフェイン酸４－Ｏ－α－グルコシド、カフェイン酸３－Ｏ－α－グルコシド、及びナリンゲニン４’－Ｏ－α－グルコシドであると同定された。レスベラトロール４’－Ｏ－α－グルコシド、ＣａＵＫ１、ＣａＵＫ２、及びＮＵＫ２の１Ｈ－ＮＭＲデータを以下に示す。
ＲｐＧ Ｉの位置選択性についてさらに知見を得るために、レスベラトロール４’－Ｏ－α－グルコシド、ＣａＵＫ１、ＣａＵＫ２、及びＮＵＫ２を反応混合物から精製し、ＮＭＲ分析を行った。アグリコン及びグルコシドの１Ｈ－ＮＭＲデータによれば、グリコシル化位置周辺の化学シフト値は低磁場側へシフトする。このシフトを参照することにより、グルコース結合位置を特定した。その結果、レスベラトロール４’－Ｏ－α－グルコシドの化学構造を確認した。また、ＣａＵＫ１、ＣａＵＫ２、及びＮＵＫ２はそれぞれ、カフェイン酸４－Ｏ－α－グルコシド、カフェイン酸３－Ｏ－α－グルコシド、及びナリンゲニン４’－Ｏ－α－グルコシドであると同定された。レスベラトロール４’－Ｏ－α－グルコシド、ＣａＵＫ１、ＣａＵＫ２、及びＮＵＫ２の１Ｈ－ＮＭＲデータを以下に示す。
【0059】
【化3】
【0060】
レスベラトロール４’－Ｏ－α－グルコシド
1H NMR dH (CD3OD): 7.46 (2H, d, J=8.7 Hz, H-f, H-i), 7.16 (2H, d, J=8.8 Hz, H-g, H-h), 7.00 (1H, d, J=16,3 Hz, H-d or H-e), 6.88 (1H, d, J=16,3 Hz, H-d or H-e), 6.46 (2H, s, H-a, H-c), 6.17 (1H, s, H-b), 5.50 (1H, d, J=3.7 Hz, H-j), 3.86 (1H, dd, J=9.3, 9.4 Hz, H-n), 3.73 (2H, d, J=14.1 Hz, H-l), 3.65-3.68 (1H, m, H-k), 3.58 (1H, dd, J=9.7, 3.6 Hz, H-o), 3.44 (1H, dd, J=9.3, 9.6 Hz, H-m).
1H NMR dH (CD3OD): 7.46 (2H, d, J=8.7 Hz, H-f, H-i), 7.16 (2H, d, J=8.8 Hz, H-g, H-h), 7.00 (1H, d, J=16,3 Hz, H-d or H-e), 6.88 (1H, d, J=16,3 Hz, H-d or H-e), 6.46 (2H, s, H-a, H-c), 6.17 (1H, s, H-b), 5.50 (1H, d, J=3.7 Hz, H-j), 3.86 (1H, dd, J=9.3, 9.4 Hz, H-n), 3.73 (2H, d, J=14.1 Hz, H-l), 3.65-3.68 (1H, m, H-k), 3.58 (1H, dd, J=9.7, 3.6 Hz, H-o), 3.44 (1H, dd, J=9.3, 9.6 Hz, H-m).
【0061】
【化4】
【0062】
ＣａＵＫ１：カフェイン酸４－Ｏ－α－グルコシド
1H NMR dH (CD3OD): 7.52 (1H, d, J=15.9 Hz, H-e), 7.29 (1H, d, J=8.35 Hz, H-b), 7.10 (1H, s, H-a), 7.02 (1H, d, J=8.0 Hz, H-c), 6.33 (1H, d, J=15.9 Hz, H-d), 5.42 (1H, d, J=3.7 Hz, H-f), 3.88 (1H, dd, J=9.4, 9.6 Hz, H-j), 3.75 (2H, d, J=23.3 Hz, H-h), 3.67-3.70 (1H, m, H-g), 3.60 (1H, dd, J=9.8, 3.8 Hz, H-k), 3.43 (1H, dd, J=9.3, 9.1 Hz, H-i).
1H NMR dH (CD3OD): 7.52 (1H, d, J=15.9 Hz, H-e), 7.29 (1H, d, J=8.35 Hz, H-b), 7.10 (1H, s, H-a), 7.02 (1H, d, J=8.0 Hz, H-c), 6.33 (1H, d, J=15.9 Hz, H-d), 5.42 (1H, d, J=3.7 Hz, H-f), 3.88 (1H, dd, J=9.4, 9.6 Hz, H-j), 3.75 (2H, d, J=23.3 Hz, H-h), 3.67-3.70 (1H, m, H-g), 3.60 (1H, dd, J=9.8, 3.8 Hz, H-k), 3.43 (1H, dd, J=9.3, 9.1 Hz, H-i).
【0063】
【化5】
【0064】
ＣａＵＫ２：カフェイン酸３－Ｏ－α－グルコシド
1H NMR dH (CD3OD): 7.56 (1H, d, J=15.9 Hz, H-e), 7.55 (1H, s, H-a), 7.18 (1H, d, J=8.4 Hz, H-c), 6.87 (1H, d, J=8.4 Hz, H-b), 6.32 (1H, d, J=16.0 Hz, H-d), 5.36 (1H, d, J=7.3 Hz, H-f), 3.87 (1H, dd, J=9.4, 9.6 Hz, H-j), 3.78 (2H, d, J=16.5 Hz, H-h), 3.72-3.77 (1H, m. H-g), 3.61 (1H, dd, J=9.5, 5.8 Hz, H-k), 3.42 (1H, dd, J=9.4, 9.2 Hz, H-i).
1H NMR dH (CD3OD): 7.56 (1H, d, J=15.9 Hz, H-e), 7.55 (1H, s, H-a), 7.18 (1H, d, J=8.4 Hz, H-c), 6.87 (1H, d, J=8.4 Hz, H-b), 6.32 (1H, d, J=16.0 Hz, H-d), 5.36 (1H, d, J=7.3 Hz, H-f), 3.87 (1H, dd, J=9.4, 9.6 Hz, H-j), 3.78 (2H, d, J=16.5 Hz, H-h), 3.72-3.77 (1H, m. H-g), 3.61 (1H, dd, J=9.5, 5.8 Hz, H-k), 3.42 (1H, dd, J=9.4, 9.2 Hz, H-i).
【0065】
【化6】
【0066】
ＮＵＫ２：ナリンゲニン４’－Ｏ－α－グルコシド
1H NMR dH (CD3OD): 7.44 (2H, d, J=8.7 Hz, H-e, H-h), 7.22 (2H, d, J=8.7 Hz, H-f, H-g), 5.91 (1H, s, H-a), 5.89 (1H, s, H-b), 5.52 (1H, d, J=3.6 Hz, H-i), 5.42 (1H, d, J=12.6, 3.1 Hz, H-f-1), 3.86 (1H, dd, J=9.3, 9.3 Hz, H-m), 3.72 (2H, d, J=15.7 Hz, H-k), 3.64-3.66 (1H, m, H-j), 3.58 (1H, dd, J=9.7, 3.5 Hz, H-n), 3.43 (1H, dd, J=9.3, 9.3 Hz, H-l), 3.13 (1H, d, J=12.7 Hz, H-g-1), 3.09 (1H, d, J=12.7 Hz, H-g-2), 2.75 (1H, d, J=17.1, 3.2 Hz, H-f-2).
1H NMR dH (CD3OD): 7.44 (2H, d, J=8.7 Hz, H-e, H-h), 7.22 (2H, d, J=8.7 Hz, H-f, H-g), 5.91 (1H, s, H-a), 5.89 (1H, s, H-b), 5.52 (1H, d, J=3.6 Hz, H-i), 5.42 (1H, d, J=12.6, 3.1 Hz, H-f-1), 3.86 (1H, dd, J=9.3, 9.3 Hz, H-m), 3.72 (2H, d, J=15.7 Hz, H-k), 3.64-3.66 (1H, m, H-j), 3.58 (1H, dd, J=9.7, 3.5 Hz, H-n), 3.43 (1H, dd, J=9.3, 9.3 Hz, H-l), 3.13 (1H, d, J=12.7 Hz, H-g-1), 3.09 (1H, d, J=12.7 Hz, H-g-2), 2.75 (1H, d, J=17.1, 3.2 Hz, H-f-2).
【0067】
［ポリフェノール化合物に対するＲｐＧ Ｉの位置選択性］
最後に、レスベラトロールグルコシドを除く各モノグルコシドについて、ＭＳクロマトグラムのピーク面積から位置選択性を算出した（表５、表６）。ダイゼイン、（Ｓ）－エクオール及びゲニステインの各モノグリセリドについては位置選択性を確認していないため、表６中には、主要なモノグリセリドの割合を示している。この実験では、Rhizobium pusense JCM 16209T株由来のα－グルコシダーゼ（ＲｐＧ Ｉ）が高い４’位選択性（９８．３％）でレスベラトロールをグリコシル化し、レスベラトロール４’－Ｏ－α－グルコシドを生成することが明らかとなった。レスベラトロールの４’位は、フェニル基のパラ位に対応する。種々のポリフェノール化合物について検討した結果、レスベラトロールのパラ位選択的なグリコシル化は、多くのポリフェノール化合物に一般化できることが明らかとなった。実際、カフェイン酸及びナリンゲニンは、いずれも高いパラ位選択性でグリコシル化された。
最後に、レスベラトロールグルコシドを除く各モノグルコシドについて、ＭＳクロマトグラムのピーク面積から位置選択性を算出した（表５、表６）。ダイゼイン、（Ｓ）－エクオール及びゲニステインの各モノグリセリドについては位置選択性を確認していないため、表６中には、主要なモノグリセリドの割合を示している。この実験では、Rhizobium pusense JCM 16209T株由来のα－グルコシダーゼ（ＲｐＧ Ｉ）が高い４’位選択性（９８．３％）でレスベラトロールをグリコシル化し、レスベラトロール４’－Ｏ－α－グルコシドを生成することが明らかとなった。レスベラトロールの４’位は、フェニル基のパラ位に対応する。種々のポリフェノール化合物について検討した結果、レスベラトロールのパラ位選択的なグリコシル化は、多くのポリフェノール化合物に一般化できることが明らかとなった。実際、カフェイン酸及びナリンゲニンは、いずれも高いパラ位選択性でグリコシル化された。
【0068】
【表5】
【0069】
【表6】
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図5G】
【配列表】