特開2023-181738ポリペプチド、外来遺伝子発現方法、導入キャリア及びキット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023181738
(43)【公開日】2023-12-25
(54)【発明の名称】ポリペプチド、外来遺伝子発現方法、導入キャリア及びキット
(51)【国際特許分類】
C12N 15/63 20060101AFI20231218BHJP
C07K 14/025 20060101ALI20231218BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231218BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20231218BHJP
C12N 15/37 20060101ALN20231218BHJP
C12N 15/88 20060101ALN20231218BHJP
【ＦＩ】
C12N15/63 Z
C07K14/025
C12N5/10
C12P21/02 C
C12N15/37 ZNA
C12N15/88 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】27
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022095044
(22)【出願日】2022-06-13
(71)【出願人】
【識別番号】000003078
【氏名又は名称】株式会社東芝
(74)【代理人】
【識別番号】110001737
【氏名又は名称】弁理士法人スズエ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】赤星 英一
(72)【発明者】
【氏名】石原 美津子
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B064DA10
4B065AA94X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA05
4B065CA24
4B065CA41
4B065CA44
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA01
4H045EA01
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
【課題】 非分裂細胞での外来遺伝子発現量を向上することが可能な、ポリペプチド、外来遺伝子発現方法、導入キャリア及びキットを提供する。
【解決手段】 実施形態によれば、ＨＳＣ７０結合ドメインと、ｐＲｂ結合ドメインと、核移行シグナルドメインとを含み、細胞周期を停止状態（Ｇ０期）からＤＮＡ合成準備期（Ｇ１期）へと移行させるポリペプチドが提供される。
【選択図】図１
【解決手段】 実施形態によれば、ＨＳＣ７０結合ドメインと、ｐＲｂ結合ドメインと、核移行シグナルドメインとを含み、細胞周期を停止状態（Ｇ０期）からＤＮＡ合成準備期（Ｇ１期）へと移行させるポリペプチドが提供される。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＨＳＣ７０結合ドメインと、ｐＲｂ結合ドメインと、核移行シグナルドメインとを含むポリペプチド。
【請求項2】
前記ＨＳＣ７０結合ドメインのアミノ酸配列は、シミアンウイルス４０、ＪＣウイルス及びＢＫウイルスからなる群から選択される何れかのウイルスのラージＴ抗原タンパク質のＨＳＣ結合ドメインのアミノ酸配列、又は、ＤｎａＪ様タンパク質のＨＳＣ結合ドメインのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項3】
前記ＨＳＣ７０結合ドメインのアミノ酸配列は、前記群から選択される少なくとも何れか１つのウイルスのラージＴ抗原タンパク質のＨＳＣ７０結合ドメインのアミノ酸配列の反復配列を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項4】
前記ＨＳＣ７０結合ドメインのアミノ酸配列は、下記表１に示すアミノ酸配列（配列番号１）である、請求項２に記載のポリペプチド。
【表1】
【請求項5】
前記ｐＲｂ結合ドメインのアミノ酸配列が、シミアンウイルス４０、ＪＣウイルス及びＢＫウイルスからなる群から選択される、何れかの１つのウイルスのラージＴ抗原タンパク質のｐＲｂ結合ドメインのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項6】
前記ｐＲｂ結合ドメインのアミノ酸配列が、前記群から選択される少なくとも何れか１つのウイルスのラージＴ抗原タンパク質のｐＲｂ結合ドメインのアミノ酸配列の反復配列を含む、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項7】
前記ｐＲｂ結合ドメインのアミノ酸配列は、下記表２に示すアミノ酸配列（配列番号２）である、請求項５に記載のポリペプチド。
【表2】
【請求項8】
前記核移行シグナルドメインは、シミアンウイルス４０のラージＴ抗原タンパク質の核移行シグナル、又は、ＨＩＶウイルスのＴＡＴタンパク質の核移行シグナルを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項9】
前記核移行シグナルドメインは、シミアンウイルス４０のラージＴ抗原タンパク質の核移行シグナルの反復配列、及び／又は、ＨＩＶウイルスのＴＡＴタンパク質の核移行シグナルの反復配列を含む、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項10】
前記核移行シグナルドメインが、下記表３に示すアミノ酸配列（配列番号３）である請求項１に記載のポリペプチド。
【表3】
【請求項11】
前記核移行シグナルドメインが、下記表４に示すアミノ酸配列（配列番号４）である請求項１に記載のポリペプチド。
【表4】
【請求項12】
前記ポリペプチドの塩基配列は、下記表に示すアミノ酸配列（配列番号５）である、請求項１に記載のポリペプチド。
【表5】
【請求項13】
請求項１に記載のポリペプチドであって、非分裂細胞に導入される、ポリペプチド。
【請求項14】
前記非分裂細胞は、筋細胞又は神経細胞である、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項15】
ｐＲｂ結合ドメイン、ＨＳＣ７０結合ドメイン及び核移行シグナルドメインを含むポリペプチドと、
前記ポリペプチドを内包する脂質粒子とを備える導入キャリア。
前記ポリペプチドを内包する脂質粒子とを備える導入キャリア。
【請求項16】
請求項１５に記載の導入キャリアであって、
前記脂質粒子は、細胞に導入するための核酸をさらに内包し、
前記核酸は、前記細胞内で外来遺伝子として発現する塩基配列を含む、導入キャリア。
前記脂質粒子は、細胞に導入するための核酸をさらに内包し、
前記核酸は、前記細胞内で外来遺伝子として発現する塩基配列を含む、導入キャリア。
【請求項17】
前記脂質粒子は、その構成成分として下記式（１－０１）及び／又は（１－０２）に示す脂質化合物を含む、請求項１５又は請求項１６に記載の導入キャリア。
【化1】
【請求項18】
ポリペプチド及び前記ポリペプチドを内包する脂質粒子を備える導入キャリアと、前記導入キャリアの保管安定性を向上させる物質とを具備するキットであって、
前記ポリペプチドは、ｐＲｂ結合ドメイン、ＨＳＣ７０結合ドメイン、及び、核移行シグナルドメインを含む
キット。
前記ポリペプチドは、ｐＲｂ結合ドメイン、ＨＳＣ７０結合ドメイン、及び、核移行シグナルドメインを含む
キット。
【請求項19】
請求項１８に記載のキットであって、
前記脂質粒子は、細胞に導入するための核酸をさらに内包し、
前記核酸は、前記細胞において外来遺伝子として発現する塩基配列を含む、キット。
前記脂質粒子は、細胞に導入するための核酸をさらに内包し、
前記核酸は、前記細胞において外来遺伝子として発現する塩基配列を含む、キット。
【請求項20】
前記脂質粒子は、その構成成分として下記式（１－０１）及び／又は（１－０２）に示す脂質化合物を含む、請求項１８又は請求項１９に記載のキット。
【化2】
【請求項21】
前記外来遺伝子は、前記細胞で産生させるタンパク質をコードする、請求項１９に記載のキット。
【請求項22】
遺伝子治療に用いられる、請求項１８又は１９に記載のキット。
【請求項23】
細胞周期が停止状態（Ｇ０期）である細胞において外来遺伝子を発現させる方法であって、
（Ｓ１）細胞と、ｐＲｂ結合ドメイン、ＨＳＣ７０結合ドメイン及び核移行シグナルドメインを含むポリペプチドと、前記外来遺伝子として発現する塩基配列を含む核酸とを用意すること；
（Ｓ２）前記細胞に前記ポリペプチド及び前記核酸を導入すること；及び
（Ｓ３）前記ポリペプチド及び前記核酸が導入された前記細胞を生育すること
を含む方法。
（Ｓ１）細胞と、ｐＲｂ結合ドメイン、ＨＳＣ７０結合ドメイン及び核移行シグナルドメインを含むポリペプチドと、前記外来遺伝子として発現する塩基配列を含む核酸とを用意すること；
（Ｓ２）前記細胞に前記ポリペプチド及び前記核酸を導入すること；及び
（Ｓ３）前記ポリペプチド及び前記核酸が導入された前記細胞を生育すること
を含む方法。
【請求項24】
前記（Ｓ２）は、前記ポリペプチド及び前記核酸のうち少なくとも一方を内包した脂質粒子を用いて行われる、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記脂質粒子が、その構成成分として下記式（１－０１）及び／又は下記式（１－０２）に示す脂質化合物を含む、請求項２４に記載の方法。
【化3】
【請求項26】
前記細胞は、非分裂細胞である請求項２３に記載の方法。
【請求項27】
前記非分裂細胞は、筋細胞、又は神経細胞である、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明の実施形態は、ポリペプチド、外来遺伝子発現方法、導入キャリア及びキットに関する。
【背景技術】
【0002】
非分裂細胞での外来遺伝子発現量を向上することが可能な、ポリペプチド、外来遺伝子発現方法、導入キャリア及びキットが求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
本発明が解決しようとする課題は、非分裂細胞での外来遺伝子発現量を向上することが可能な、ポリペプチド、外来遺伝子発現方法、導入キャリア及びキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0004】
実施形態によれば、ＨＳＣ７０結合ドメインと、ｐＲｂ結合ドメインと、核移行シグナルドメインとを含むポリペプチドが提供される。このポリペプチドは細胞の周期を停止状態（Ｇ０期）からＤＮＡ合成準備期（Ｇ１期）へと移行させることができる。
【図面の簡単な説明】
【0005】
【発明を実施するための形態】
【0006】
以下、実施形態について、添付の図面を参照して説明する。なお、各実施形態において、実質的に同一の構成部位には同一の符号を付し、その説明を一部省略する場合がある。図面は模式的なものであり、各部の厚さと平面寸法との関係、各部の厚さの比率等は現実のものとは異なる場合がある。
【0007】
（第１実施形態）
・Ｇ１期移行促進ポリペプチド
第１実施形態によれば、非分裂細胞へと導入するための、Ｇ１期移行促進ポリペプチドが提供される。図１に示す通り、Ｇ１期移行促進ポリペプチド１は、ＨＳＣ７０結合ドメイン２と、ｐＲｂ結合ドメイン３と、核移行シグナルドメイン４とを少なくとも含む。
・Ｇ１期移行促進ポリペプチド
第１実施形態によれば、非分裂細胞へと導入するための、Ｇ１期移行促進ポリペプチドが提供される。図１に示す通り、Ｇ１期移行促進ポリペプチド１は、ＨＳＣ７０結合ドメイン２と、ｐＲｂ結合ドメイン３と、核移行シグナルドメイン４とを少なくとも含む。
【0008】
ＨＳＣ７０結合ドメイン２は、７０ｋＤａヒートショックコグネイトタンパク質（７０ｋＤａ Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｃｏｇｎａｔｅ：ＨＳＣ７０）に結合するアミノ酸配列（以下、「ＨＳＣ７０結合配列」と称する）を含む。ＨＳＣ７０は、Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＳＰ）７０ファミリーの一つであり、ＨＳＰ７０のアミノ酸配列と高い相同性を示すタンパク質である。
【0009】
ＨＳＰ７０は、その補因子であるＨＳＰ４０ファミリーと結合して機能するものであり、ＨＳＰ７０とＨＳＰ４０は、ＨＳＰ４０のJドメインを介して結合する。このため、ＨＳＣ７０結合配列は、例えばＨＳＰ４０ファミリーのJドメインを構成するアミノ酸配列又はその一部を含んでいてもよい。具体的には、ＨＳＣ７０結合配列は、ＨＳＰ４０ファミリータンパク質のJドメインと相同性を有する、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ＪＣウイルス及びＢＫウイルスからなる群から選択される何れかのウイルスのラージＴ抗原タンパク質を構成するＤｎａＪ様タンパク質のＪドメインのアミノ酸配列又はその一部の配列が好ましい。
【0010】
例えばＨＳＣ７０結合ドメイン２は、表１に示すように、ＳＶ４０のラージＴ抗原タンパク質のＪドメインを構成するアミノ酸配列（配列番号１）からなる配列である。
【0011】
【表1】
【0012】
また、ＨＳＣ７０結合配列は、例えばヒスチジン－プロリン－アスパラギン酸からなるＨＰＤモチーフを含む配列であることが好ましい。しかしながら、ＨＳＣ７０結合配列はこれらに限定されるものではなく、ＨＳＣ７０に結合する機能を有する限りにおいて、列挙したアミノ酸配列の一部を改変したもの等を使用することができる。
【0013】
Ｇ１期移行促進ポリペプチド１が細胞に導入された場合、ＨＳＣ７０結合ドメイン２は、細胞内のＨＳＣ７０と結合することによって、その細胞周期のうちの分裂期（Ｍ期）におけるタンパク質合成を活性化することができる。
【0014】
また、ＨＳＣ７０結合ドメイン２はＨＳＣ７０と結合する部位を複数備えていてもよい。換言すれば、ＨＳＣ７０結合ドメイン２は、ＨＳＣ７０結合配列が複数連結されてなる配列であってもよい。複数連結されるＨＳＣ７０結合配列は、互いに異なる配列であってもよいし、同一の配列であってもよい。例えば、ＨＳＣ７０結合ドメイン２は、ＳＶ４０、ＪＣウイルス及びＢＫウイルスからなる群から選択される何れかのウイルスのラージＴ抗原タンパク質のＨＳＣ７０結合ドメインを構成するアミノ酸配列の反復配列を含んでいてもよい。
【0015】
複数のＨＳＣ７０結合配列は、後述するリンカー配列を介して連結されていてもよい。ＨＳＣ７０と結合する部位を複数備えている場合、ＨＳＣ７０結合ドメイン２がＨＳＣ７０と結合しやすくなり、分裂期（Ｍ期）の細胞におけるタンパク質合成をさらに活性化することができるため、好ましい。
【0016】
ｐＲｂ結合ドメイン３は、レチノブラストーマタンパク質（Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ Ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｒｂタンパク質）に結合するアミノ酸配列（以下、「ｐＲｂ結合配列」と称する）を含む。ｐＲｂ結合配列は、例えばＳＶ４０、ＪＣウイルス及びＢＫウイルスからなる群から選択される何れかのウイルスのラージＴ抗原タンパク質のｐＲｂ結合ドメインを構成するアミノ酸配列又はその一部の配列とし得る。例えばｐＲｂ結合配列３は、表２に示すように、ＳＶ４０のラージＴ抗原タンパク質のｐＲｂ結合ドメインを構成するアミノ酸配列（配列番号２）であり得る。
【0017】
【表2】
【0018】
しかしながら、ｐＲｂ結合配列はこれらに限定されるものではなく、Ｒｂタンパク質と結合する限りにおいて、上述のように列挙したアミノ酸配列の一部を改変したものを使用することができる。
【0019】
Ｒｂタンパク質は、遺伝子発現調整因子であるＥ２Ｆ１－ＤＰヘテロ二量体に核内において結合することで、Ｇ１期からＳ期への移行を抑制する機能を有する。Ｇ１期移行促進ポリペプチド１が細胞に導入された場合、ｐＲｂ結合ドメイン３は、導入細胞内のＲｂタンパク質に競合結合することでＧ１期からＳ期への移行を抑制する機能を阻害し、細胞周期のＧ１期からＳ期への移行を促進できる。さらに、今般、発明者らは、ｐＲｂ結合ドメイン３が、細胞を停止状態（Ｇ０期）からＤＮＡ合成期（Ｇ１期）へと移行することを促進する機能を有していることを明らかにした。従って、Ｇ１期移行促進ポリペプチド１のｐＲｂ結合ドメイン３は、細胞分裂に係る期間を短縮することが可能である。
【0020】
また、ｐＲｂ結合ドメイン３は、Ｒｂタンパク質と結合する部位を複数含んでいてもよい。換言すれば、ｐＲｂ結合ドメイン３は、ｐＲｂ結合配列が複数連結されてなる配列であってもよい。複数連結されるｐＲｂ結合配列は、互いに異なる配列であってもよいし、同一の配列であってもよい。例えば、ｐＲｂ結合ドメイン３は、ＳＶ４０、ＪＣウイルス及びＢＫウイルスからなる群から選択される何れかのウイルスのラージＴ抗原タンパク質のｐＲｂ結合ドメインを構成するアミノ酸配列の反復配列を含んでいてもよい。
【0021】
複数のｐＲｂ結合配列は、後述するリンカー配列を介して連結されていてもよい。ｐＲｂ結合配列が複数連結されている場合、ｐＲｂ結合ドメイン３とＲｂタンパク質とが結合しやすくなり、停止状態（Ｇ０期）からＤＮＡ合成準備期（Ｇ１期）への移行、及び、ＤＮＡ合成準備期（Ｇ１期）からＤＮＡ合成期（Ｓ期）への移行をさらに促進可能であるため、好ましい。
【0022】
核移行シグナルドメイン４は、核移行シグナル（Ｎｕｃｌｅａ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ：ＮＬＳ）を含む。ＮＬＳは、典型的な（ｃｌａｓｓｉｃａｌ）ＮＬＳであってもよいし、非典型的な（ｎｏｎ－ｃｌａｓｓｉｃａｌ）ＮＬＳであってもよい。
【0023】
典型的なＮＬＳとして、例えば表３に示す、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のラージＴ抗原タンパク質のＮＬＳを用いてもよい。
【0024】
【表3】
【0025】
さらなる典型的なＮＬＳとして、ヌクレオプラスミン又はＳｅｘ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ Ｙ（ＳＲＹ）を構成するアミノ酸配列を用いてもよい。
【0026】
一方、非典型的なＮＬＳとして、例えば表４に示すように、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ：ＨＩＶ）のＴｒａｎｓ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＴＡＴ）タンパク質のＮＬＳ（配列番号４）を用いてもよい。
【0027】
【表4】
【0028】
ただし、ＮＬＳはこれらに限定されるものではなく、ＮＬＳとしての機能を有する限りにおいて、上で列挙したアミノ酸配列の一部を改変したものを使用することができる。ここで、ＮＬＳ（ひいては、ＮＬＳを含む核移行シグナルドメイン４）の機能とは、細胞内に導入したＧ１期移行促進ポリペプチド１を核内に移行させることを指す。
【0029】
前述したとおり、Ｒｂタンパク質は、核内において、遺伝子発現調整因子であるＥ２Ｆ１－ＤＰヘテロ二量体に結合することでＧ１期からＳ期への移行を抑制している。従って、Ｇ１期移行促進ポリペプチド１を構成する核移行シグナルドメイン２の機能によって、ｐＲｂ結合ドメイン３も核内に移行させることで、より効率的にＧ１期からＳ期への移行の抑制を解消することができる。
【0030】
また、核移行シグナルドメイン４は、ＮＬＳが複数連結されてなる配列であってもよい。複数連結したＮＬＳから構成されるアミノ酸配列は、例えば互いに異なる特定の配列のＮＬＳを繰り返し含むアミノ酸配列である。例えば核移行シグナルドメイン４として、ＨＩＶのＴＡＴタンパク質のＮＬＳ（配列番号３）とＳＶ４０ラージＴ抗原タンパク質のＮＬＳ（配列番号４）とをＮ末端からこの順番で連結したアミノ酸配列を含有する、タンパク質を用いることも可能である。また、複数のＮＬＳは後述のリンカー配列５を介して連結されていてもよい。
【0031】
以上、Ｇ１期移行促進ポリペプチド１を構成するＨＳＣ７０結合ドメイン２、ｐＲｂ結合ドメイン３及び核移行シグナルドメイン４を説明したが、これらの配列は任意の順番で連結していてもよい。例えば、Ｎ末端からＨＳＣ７０結合ドメイン２、核移行シグナルドメイン４、ｐＲｂ結合ドメイン３の順番で連結されていてもよいし、ｐＲｂ結合ドメイン３、ＨＳＣ７０結合ドメイン２、核移行シグナルドメイン４の順番、ｐＲｂ結合ドメイン３、核移行シグナルドメイン４、ＨＳＣ７０結合ドメイン２の順番、核移行シグナルドメイン４、ＨＳＣ７０結合ドメイン２、ｐＲｂ結合ドメイン３の順番、又は核移行シグナルドメイン４、ｐＲｂ結合ドメイン３、ＨＳＣ７０結合ドメイン２の順番で連結していてもよい。
【0032】
本明細書において「連結」とは、各ドメイン同士、又は、各ドメインを構成する複数のアミノ酸配列同士が、その機能を発揮することが可能な状態で結合されていることをいう。また、「連結」とは、直接結合されている状態や、他の配列を介して結合されている状態のことをいう。
【0033】
上述の他の配列とは、各ドメイン、又は、各ドメインが複数のアミノ酸配列から構成される場合は該アミノ酸配列が有する機能に悪影響を与えない、アミノ酸配列又はポリペプチドである。例えばこのようなアミノ酸配列又はポリペプチドとして、各アミノ酸配列の間に間隔を設ける以外の役割を持たない、リンカー配列５であってもよい。リンカー配列５は、例えば５アミノ酸～２０アミノ酸の長さが好ましい。リンカー配列は、Ｇ１期移行促進ポリペプチドの機能を損なわない限り、例えばＧＳリンカーと呼ばれるアミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）の１～６回の繰り返し配列からなる一般的なリンカー配列を用いてもよいし、他の既知のリンカー配列を用いてもよい。リンカー配列５を設けることで、各アミノ酸配列が両隣の配列から干渉されることを防止できる。
【0034】
実施形態に従うＧ１期移行促進ポリペプチドは、上述の作用を示す３つのドメインを含んでいるため、停止状態（Ｇ０期）の細胞に導入することで、その細胞周期のＤＮＡ合成準備期（Ｇ１期）への移行を促進できる。ひいてはＤＮＡ合成期（Ｓ期）への移行も促進することが可能であり、分裂期（Ｍ期）の細胞におけるタンパク質合成をさらに活性化することができる。加えて、分裂期（Ｍ期）には、核膜が消失することから、Ｇ０期には核膜によって阻害されていた外来遺伝子の核内への移動量が増加する。その結果、実施形態に従うＧ１期移行促進ポリペプチドは、導入した細胞における外来遺伝子の発現を活発化することが可能である。
【0035】
従来、例えば非分裂細胞のような遺伝子発現が不活発な細胞に外来遺伝子を導入する際には、ウイルスベクターが用いられていた。しかしながら同方法は、導入対象から排出されたウイルスベクターが環境中に拡散し得ること、宿主細胞ゲノムへウイルス遺伝子が挿入されること、及び、遺伝子発現量が十分ではないことが課題であった。
【0036】
一方、実施形態に従うＧ１期移行促進ポリペプチドによれば、外来遺伝子の導入と同時にＧ１期移行促進ポリペプチドを細胞に導入することで、外来遺伝子発現を活発化することが可能である。これにより、実施形態に従うＧ１期移行促進ポリペプチドは、対象のゲノムに遺伝子を組み込むことなく、外来遺伝子発現量を増大させることが可能であり、ゲノムの組み込み等で遺伝子を損傷させることなく、遺伝子発現量を向上させることができ、好ましい。
【0037】
また、実施形態に従うＧ１期移行促進ポリペプチドは、停止状態であった細胞周期を、一過的に分裂状態に誘導するものであり、従来のウイルスベクターよりも安全性が高いため好ましい。
【0038】
（第２実施形態）
・外来遺伝子発現方法
第２実施形態によれば、第１実施形態で説明したＧ１期移行促進ポリペプチドを使用して対象となる細胞に同細胞内で外来遺伝子を発現させる、外来遺伝子発現方法が提供される。
・外来遺伝子発現方法
第２実施形態によれば、第１実施形態で説明したＧ１期移行促進ポリペプチドを使用して対象となる細胞に同細胞内で外来遺伝子を発現させる、外来遺伝子発現方法が提供される。
【0039】
第２実施形態に係る方法は、図２に示すように、
（Ｓ１）細胞と、Ｇ１期移行促進ポリペプチドと、導入用核酸とを用意すること、
（Ｓ２）導入用核酸及びＧ１期移行促進ポリペプチドを細胞に導入すること、及び
（Ｓ３）導入用核酸及びＧ１期移行促進ポリペプチドを導入した細胞を生育すること
を含む。
（Ｓ１）細胞と、Ｇ１期移行促進ポリペプチドと、導入用核酸とを用意すること、
（Ｓ２）導入用核酸及びＧ１期移行促進ポリペプチドを細胞に導入すること、及び
（Ｓ３）導入用核酸及びＧ１期移行促進ポリペプチドを導入した細胞を生育すること
を含む。
【0040】
以下、本方法の手順を例示し、詳細に説明する。
【0041】
用意工程（Ｓ１）では、導入の対象である細胞を用意する。細胞は例えば、ヒト、動物又は植物由来のもの、或いは細菌又は菌類等の微生物由来の細胞であり得る。細胞は、好ましくは動物細胞であり、より好ましくは哺乳類細胞であり、最も好ましくはヒト細胞である。細胞は、例えば生体外に取り出された細胞であってもよく、それは例えば、血液等の体液、組織又はバイオプシー等から分離された細胞であってもよい。細胞は、例えば、単離細胞、培養細胞又は株化された細胞であってもよい。或いは、細胞は生体内の細胞であってもよい。
【0042】
細胞は、例えば非分裂細胞のような遺伝子発現が不活発な細胞であり得る。非分裂細胞は、休止細胞とも呼ばれ、細胞周期が休止期（Ｇ０期）に入り分裂を停止している細胞及び分裂能力が低下した細胞のことを指す。例えば非分裂細胞は、筋細胞又は神経細胞等であり得る。
【0043】
用意工程（Ｓ１）では、さらに、細胞に導入するための核酸（以下、「導入用核酸」と称する）も用意する。導入用核酸は、細胞内で発現させたいタンパク質をコードする外来遺伝子の塩基配列を含む、核酸である。また、必要であれば、導入用核酸は、細胞のゲノムに組込まれることを目的とした遺伝子の塩基配列、及び／又は遺伝子をゲノムに組み込むための酵素をコードする塩基配列を含む核酸であってもよい。
【0044】
導入用核酸は、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、又は塩基配列を構成できる他のヌクレオチドから構成される塩基配列であり、その構造は直鎖状、環状を問わず、一本鎖又は２本鎖のどちらでもよい。
【0045】
また、導入用核酸は、発現を所望するタンパク質をコードする外来遺伝子の塩基配列の他、必要であれば遺伝子の転写を調節するエンハンサー、プロモーター、及び／又は転写終結配列等を含んでもよく、ベクターの一部として組み込まれた形態であってもよい。
【0046】
導入用核酸は、所望のポリペプチド又はタンパク質をコードする塩基配列を含んでいてもよい。所望のポリペプチド又はタンパク質とは、例えば抗体製造に用いられる抗原タンパク質、抗原ペプチド、抗体、抗体断片、抗生物質等のタンパク質薬若しくはペプチド医薬、又は食品添加物のタンパク質若しくはペプチド等であり得るが、これらに限定されるものではない。例えば、導入用核酸を対象細胞における抗原タンパク質又はその断片にあたる抗原ペプチドをコードする核酸に設定することで、遺伝子治療の用途や、ＤＮＡワクチン又はＲＮＡワクチン等の遺伝子ワクチンの用途として使用してもよい。
【0047】
次に導入工程（Ｓ２）として、対象となる細胞に、Ｇ１期移行促進ポリペプチドと導入用核酸とを導入する。導入工程（Ｓ２）は、例えば細胞が生体外に取り出された細胞である場合、リポソーム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、リン酸カルシウム共沈殿法、カチオン性ポリマー法、マイクロインジェクション法、又はソノポレーション法等の公知の方法で行うことができる。
【0048】
導入工程（Ｓ２）では、特にリポソーム法を用いることが好ましい。例えば、リポソーム法において、Ｇ１期移行促進ポリペプチド及び導入用核酸をリポソーム（脂質粒子）に内包させ、この脂質粒子を含む組成物等を細胞と接触させることで導入をおこなうことができる。このようなリポソーム法によれば、脂質粒子は例えばエンドサイトーシスにより細胞に取り込まれ、その内包物は細胞内に放出される。脂質粒子の詳細については、後述の実施形態において説明する。
【0049】
導入対象が生体内の細胞である場合、導入は、Ｇ１期移行促進ポリペプチド及び導入用核酸を含む組成物を生体へ注射又は点滴する等で、行うことができる。同組成物として、例えば、Ｇ１期移行促進ポリペプチド及び導入用核酸を内包する脂質粒子を含んでもよい。
【0050】
第２実施形態に係る方法によれば、導入工程（Ｓ２）でＧ１期移行促進ポリペプチドを導入することにより、細胞周期の、停止状態（Ｇ０期）からＤＮＡ合成準備期（Ｇ１期）への移行が促進され、かつ、Ｇ１期からＤＮＡ合成期（Ｓ期）への移行も促進される。
【0051】
なお、導入工程（Ｓ２）において、Ｇ１期移行促進ポリペプチド及び導入用核酸を、それぞれ互いに異なる方法を用いて異なるタイミングで細胞に導入させてもよい。すなわち、Ｇ１期移行促進ポリペプチドを細胞に導入する工程は、導入用核酸を細胞に導入する工程とは別の工程として行ってもよい。導入する細胞の種類によっては、Ｇ１期移行促進ポリペプチドと導入用核酸とで適切な導入方法が異なる場合があるが、それぞれに適した導入方法を採ることができるため、好ましい。
【0052】
次に、生育工程（Ｓ３）として、導入した遺伝子を発現させるために細胞を生育する。生育は、細胞の種類によって選択される、細胞の生存に適した公知の方法で行えばよい。生育は、細胞が生体外であれば同細胞を培養することによって、生体内の細胞であれば生体を維持することによって、実行できる。生育後、遺伝子発現によって所望のタンパク質が得られる場合には、培養上清及び／又は細胞から、公知の方法で精製され回収してもよい。培養上清からは、ろ過による濃縮及び精製、アフィニティー精製、イオン交換精製又はゲルろ過精製等によりタンパク質を精製することができる。細胞からタンパク質を取り出す場合は、細胞破砕を行って得られた細胞抽出液から細胞成分を除去し、その後上記生成を行うことでタンパク質を精製することができる。
【0053】
第２実施形態に係る方法によれば、工程（Ｓ２）によって遺伝子の発現を活発化させているため、導入した遺伝子を細胞内にて効率的に発現させることができる。特に非分裂細胞等、遺伝子発現が不活発な細胞においても効率的に遺伝子発現を活発化させることができるため好ましい。
【0054】
また、第２実施形態に係る方法が、遺伝子発現の産物として所望のタンパク質を産生させることを目的としていた場合には、タンパク質をコードする導入用核酸とＧ１期移行促進ポリペプチドをともに導入することにより、細胞においてタンパク質の発現量が向上し、ひいてはタンパク質製造効率を向上することが可能である。特に、非分裂細胞及び遺伝子発現が不活発な細胞を用いた場合には、タンパク質の製造量を大きく向上させることが可能である。また、産生したタンパク質を遺伝子治療に用いる場合には、第２実施形態に係る方法を用いることによってタンパク質収量が向上するため、治療の効果も向上し得る。
【0055】
（第３実施形態）
・キット
第３実施形態によれば、第２実施形態の方法に使用するためのキットが提供される。当該キットは、Ｇ１期移行促進ポリペプチドを少なくとも含む。また、当該キットは、さらに導入用核酸を含んでいてもよい。
・キット
第３実施形態によれば、第２実施形態の方法に使用するためのキットが提供される。当該キットは、Ｇ１期移行促進ポリペプチドを少なくとも含む。また、当該キットは、さらに導入用核酸を含んでいてもよい。
【0056】
Ｇ１期移行促進ポリペプチド及び導入用核酸は、例えば、溶媒に含まれた組成物として提供される。溶媒は、例えば、エンドトキシンフリー水、ＰＢＳ、ＴＥバッファー又はＨＥＰＥＳバッファー等を用いることができる。組成物は、更に賦形剤、安定剤、希釈剤及び／又は補助剤等を含んでもよい。
【0057】
Ｇ１期移行促進ポリペプチド及び導入用核酸は、脂質粒子に内包された状態でキットに含まれていてもよい。そのような脂質粒子を含有する場合、キットは、脂質粒子の保管安定性を向上させる物質を具備していてもよい。以下、脂質粒子について図３を用いて説明する。なお、Ｇ１期移行促進ポリペプチド及び導入用核酸のような物質を内包する脂質粒子を「導入キャリア」とも称する。
【0058】
図３の（ａ）に示すように、脂質粒子２０は中空で球状の脂質膜であり、Ｇ１期移行促進ポリペプチド１と導入用核酸１０とがともに脂質粒子２０に内包されている。脂質粒子２０を構成する脂質膜は、単層、脂質二重層若しくは脂質三重層等の脂質膜である。また、脂質粒子２０は脂質膜が更に複数の重なった多層構造であってもよい。
【0059】
脂質粒子２０は、１種類の脂質材料からなるものであってもよいが、好ましくは複数種類の脂質材料を含んでいるものであってもよい。脂質材料は、例えば、下記に例示するベース脂質と、生分解性脂質である第１の脂質化合物及び第２の脂質化合物とを少なくとも含むことが好ましい。
【0060】
ベース脂質は、リン脂質又はスフィンゴ脂質、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、ケファリン又はセレブロシド、或いはこれらの組み合わせ等であることが好ましい。ベース脂質は、例えば生体膜の主成分の脂質であってもよく、人工的に合成した脂質であってもよい。
【0061】
ベース脂質として、特にカチオン性脂質又は中性脂質の脂質を用いること好ましく、その含有量によって脂質粒子２０の酸解離定数を調節することができる。カチオン性脂質として１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）を用いることが好ましく、中性脂質として１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を用いることが好ましい。ベース脂質は、脂質材料の全体に対して３０％～約８０％（モル比）含まれることが好ましい。或いは、１００％近くがベース脂質から構成されていてもよい。
【0062】
第１の脂質化合物は、Ｑ－ＣＨＲ２の式で表される化合物である。
（式中、
Ｑは、３級窒素を２つ以上含み、酸素を含まない含窒素脂肪族基であり、
Ｒは、それぞれ独立に、Ｃ１２～Ｃ２４の脂肪族基であり、
少なくとも一つのＲは、その主鎖中又は側鎖中に、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、及び－ＮＨＣ（＝Ｏ）－からなる群から選択される連結基ＬＲを含む）。
（式中、
Ｑは、３級窒素を２つ以上含み、酸素を含まない含窒素脂肪族基であり、
Ｒは、それぞれ独立に、Ｃ１２～Ｃ２４の脂肪族基であり、
少なくとも一つのＲは、その主鎖中又は側鎖中に、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、及び－ＮＨＣ（＝Ｏ）－からなる群から選択される連結基ＬＲを含む）。
【0063】
第２の脂質化合物は、Ｐ－［Ｘ－Ｗ－Ｙ－Ｗ’－Ｚ］２の式で表される化合物である。
（式中、
Ｐは、１つ以上のエーテル結合を主鎖に含むアルキレンオキシであり、
Ｘは、それぞれ独立に、三級アミン構造を含む２価連結基であり、
Ｗは、それぞれ独立に、Ｃ１～Ｃ６アルキレンであり、
Ｙは、それぞれ独立に、単結合、エーテル結合、カルボン酸エステル結合、チオカルボン酸エステル結合、チオエステル結合、アミド結合、カルバメート結合及び尿素結合からなる群から選ばれる２価連結基であり、
Ｗ’は、それぞれ独立に、単結合又はＣ１～Ｃ６アルキレンであり、
Ｚは、それぞれ独立に、脂溶性ビタミン残基、ステロール残基、又はＣ１２～Ｃ２２脂肪族炭化水素基である）。
（式中、
Ｐは、１つ以上のエーテル結合を主鎖に含むアルキレンオキシであり、
Ｘは、それぞれ独立に、三級アミン構造を含む２価連結基であり、
Ｗは、それぞれ独立に、Ｃ１～Ｃ６アルキレンであり、
Ｙは、それぞれ独立に、単結合、エーテル結合、カルボン酸エステル結合、チオカルボン酸エステル結合、チオエステル結合、アミド結合、カルバメート結合及び尿素結合からなる群から選ばれる２価連結基であり、
Ｗ’は、それぞれ独立に、単結合又はＣ１～Ｃ６アルキレンであり、
Ｚは、それぞれ独立に、脂溶性ビタミン残基、ステロール残基、又はＣ１２～Ｃ２２脂肪族炭化水素基である）。
【0064】
脂質粒子２０が、第１の脂質化合物を含む場合、脂質粒子２０の表面が非カチオン性となるため、細胞導入における障害が低減され、内包物の導入効率が高まり得る。また、脂質粒子２０が、第２の脂質化合物を含む場合、脂質粒子２０への核酸構築物の内包量が多くなり得る。
【0065】
特に、第１の脂質化合物として下記式（１－０１）の脂質化合物を、第２の脂質化合物として下記式（１－０２）の脂質化合物を用いることが好ましい。以下、下記式（１－０１）の脂質化合物を「ＦＦＴ－１０」と、下記式（１－０２）の脂質化合物を「ＦＦＴ－２０」と称する。
【0066】
【化1】
【0067】
以上に説明した第１及び第２の脂質化合物を含む脂質粒子２０を用いた場合、Ｇ１期移行促進ポリペプチド及び導入用核酸の内包量を増加させ、且つ、Ｇ１期移行促進ポリペプチド及び導入用核酸の細胞への導入効率を高めることが可能である。さらには、導入した細胞の細胞死も低減することができる。
【0068】
第１及び第２の脂質化合物は、脂質材料の全体に対して約２０％～約７０％（モル比）で含まれることが好ましい。
【0069】
脂質材料は、脂質粒子２０同士の凝集を防止する脂質、例えばポリエチレングリコール－ジミリストイルグリセロール（ＤＭＧ－ＰＥＧ）を含むこともまた、好ましい。このような脂質は、脂質粒子２０の脂質材料全体に対して約１％～約５％（モル比）で含まれることが好ましい。
【0070】
脂質材料は、毒性を調整するための相対的に毒性の低い脂質；脂質粒子２０に配位子を結合させる官能基を有する脂質；ステロール（例えばコレステロール）等の、内包物の漏出を抑制するための脂質等の脂質を更に含んでもよい。特に、コレステロールを含ませることが好ましい。
【0071】
用いられる脂質の種類及び組成は、それらが構成する脂質粒子が所望の性質を有するように、考慮して選択されるとよい。脂質粒子の性質とは、導入する細胞に適した酸解離定数（ｐＫａ）、サイズ、内包物の種類、或いは導入する細胞中での安定性等である。
【0072】
例えば、脂質粒子２０は、ＦＦＴ－１０及び／又はＦＦＴ－２０と、ＤＯＰＥ及び／又はＤＯＴＡＰと、コレステロールと、ＤＭＧ－ＰＥＧとを含むことが好ましい。
【0073】
脂質粒子２０は、小分子を脂質粒子２０に封入する際に用いられる公知の方法、例えば、バンガム法、有機溶媒抽出法、界面活性剤除去法又は凍結融解法等を用いて製造することができる。例えば、脂質粒子２０の材料を所望の比率でアルコール等の有機溶媒に含ませて得られた脂質混合物と、ベクター等の内包するべき成分を含む水性緩衝液を用意し、脂質混合物に水性緩衝液を添加する。得られた混合物を撹拌して懸濁することによりベクター等を内包した脂質粒子２０が形成される。
【0074】
さらなる実施形態として、図３の（ｂ）に示すように、Ｇ１期移行促進ポリペプチド１と導入用核酸１０は、別々の脂質粒子２０に内包させてもよい。Ｇ１期移行促進ポリペプチド１と導入用核酸１０を、それぞれ互いに異なるタイミングで導入することによって、導入用核酸１０に内包した核酸からのタンパク質の発現量を最大化することができる。細胞の種類によっては、非分裂細胞にＧ１期移行促進ポリペプチド１を内包した脂質粒子を投与して細胞に分裂（Ｇ１期移行）を開始させてから、時が経過した後、例えば２４時間後に、導入用核酸１０を内包した脂質粒子で外来遺伝子を投与することにより、細胞への外来遺伝子の導入、及びタンパク質発現を最大化できる。このように、Ｇ１期移行促進ポリペプチド１と導入用核酸１０を別々の脂質粒子２０に内包させた場合には、導入する細胞の種類によって、Ｇ１期移行促進ポリペプチドと導入用核酸を、それぞれの細胞に適したタイミングで投与することができるため、好ましい。
【0075】
［例］
以下、実施形態に係るキットを製造して使用した例について説明する。
以下、実施形態に係るキットを製造して使用した例について説明する。
【0076】
例１ Ｇ１期移行促進ペプチドをコードするＤＮＡ配列の用意
Ｇ１期移行促進ペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号１）を合成した。以下、Ｇ１期移行促進ペプチドは「ＬＴＪ」と、Ｇ１期移行促進ペプチドをコードするＤＮＡ配列を「ＬＴＪ配列」と称する。ここで、ＬＴＪは、表５に示すアミノ酸配列（配列番号５）から構成されるものとした。
Ｇ１期移行促進ペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号１）を合成した。以下、Ｇ１期移行促進ペプチドは「ＬＴＪ」と、Ｇ１期移行促進ペプチドをコードするＤＮＡ配列を「ＬＴＪ配列」と称する。ここで、ＬＴＪは、表５に示すアミノ酸配列（配列番号５）から構成されるものとした。
【0077】
【表5】
【0078】
詳述すると、ＬＴＪのアミノ酸配列は、そのＮ末端から表４に示すアミノ酸配列（配列番号４）、表３に示すアミノ酸配列（配列番号３）、表１に示すアミノ酸配列（配列番号１）、表２に示すアミノ酸配列（配列番号２）、及び、表３に示すアミノ酸配列（配列番号３）がこの順番で連結してなるアミノ酸配列である。配列番号１及び配列番号２のアミノ酸配列は、ＳＶ４０のＬＴタンパク質のＮ末端から１３３残基に亘る配列と同一のアミノ酸配列であり、ＬＴタンパク質におけるＪドメイン及びｐＲｂ結合ドメインを含むものである。配列番号４のアミノ酸配列は、ＨＩＶのＴＡＴタンパク質のＮＬＳにあたるアミノ酸配列である。配列番号５のアミノ酸配列は、ＬＴタンパク質のＮＬＳにあたるアミノ酸配列である。
【0079】
例２ ＬＴＪ配列を備えるプラスミドベクターの用意
例１で得たＬＴＪ配列に、表６に示す８×グリシンタグ（配列番号６）、及び、表７に示すＳｔｒｅｐ－ｔａｇＩＩ（配列番号７）の塩基配列を連結させるようにプラスミドｐＳＲＯｚ1に組み込むことで、プラスミドベクターｐＳＲＯｚ１－ＬＴＪを作成した。
例１で得たＬＴＪ配列に、表６に示す８×グリシンタグ（配列番号６）、及び、表７に示すＳｔｒｅｐ－ｔａｇＩＩ（配列番号７）の塩基配列を連結させるようにプラスミドｐＳＲＯｚ1に組み込むことで、プラスミドベクターｐＳＲＯｚ１－ＬＴＪを作成した。
【0080】
【表6】
【0081】
【表7】
【0082】
例３ ＬＴＪの合成及び精製
例２で得たｐＳＲＯｚ１－ＬＴＪにｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ法を適用することで、８×グリシンタグ及びＳｔｒｅｐ－ｔａｇＩＩが付加されたＬＴＪ配列を転写し、さらに転写産物をカイコ後部絹糸腺抽出液の無細胞タンパク質合成系に投入することで翻訳し、表８に示す、Ｃ末端に８×グリシンタグとＳｔｒｅｐ－ｔａｇＩＩが付加されたＬＴＪ（配列番号８）を産生した。産生したＬＴＪを含有する溶液にＳｔｒｅｐＴｒａｐ ＨＰカラム（Ｇｌｏｂａｌ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を使用して精製、濃縮、及び、バッファー交換を行うことで、ＬＴＪ及びを含有する溶液を得た。
例２で得たｐＳＲＯｚ１－ＬＴＪにｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ法を適用することで、８×グリシンタグ及びＳｔｒｅｐ－ｔａｇＩＩが付加されたＬＴＪ配列を転写し、さらに転写産物をカイコ後部絹糸腺抽出液の無細胞タンパク質合成系に投入することで翻訳し、表８に示す、Ｃ末端に８×グリシンタグとＳｔｒｅｐ－ｔａｇＩＩが付加されたＬＴＪ（配列番号８）を産生した。産生したＬＴＪを含有する溶液にＳｔｒｅｐＴｒａｐ ＨＰカラム（Ｇｌｏｂａｌ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を使用して精製、濃縮、及び、バッファー交換を行うことで、ＬＴＪ及びを含有する溶液を得た。
【表8】
【0083】
例４ ＬＴＪ内包リポソームの用意
エタノールを溶媒とする脂質溶液を用意した。脂質溶液の組成は、ＦＦＴ－１０が０．３５ｎｍｏｌ／Ｌ，ＦＦＴ－２０が０．７０２ｎｍｏｌ／Ｌ，ＤＯＰＥが０．０９ｎｍｏｌ／Ｌ，ＤＯＴＡＰが０．２１ｎｍｏｌ／Ｌ，Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌが０．８７５ｎｍｏｌ／Ｌ，ＰＥＧ－ＤＭＧが０．１０５ｎｍｏｌ／Ｌである。
エタノールを溶媒とする脂質溶液を用意した。脂質溶液の組成は、ＦＦＴ－１０が０．３５ｎｍｏｌ／Ｌ，ＦＦＴ－２０が０．７０２ｎｍｏｌ／Ｌ，ＤＯＰＥが０．０９ｎｍｏｌ／Ｌ，ＤＯＴＡＰが０．２１ｎｍｏｌ／Ｌ，Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌが０．８７５ｎｍｏｌ／Ｌ，ＰＥＧ－ＤＭＧが０．１０５ｎｍｏｌ／Ｌである。
【0084】
用意した脂質溶液に、例３で用意したＬＴＪを含有する溶液を添加し、さらに６．６倍量の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を静かに添加することで、リポソームを形成させ、リポソームを含有する溶液を調製した。調製したリポソームを含有する溶液は、遠心式限外ろ過チューブ（Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ－０．５，Ｕｌｔｒａｃｅｌ－５０ｍｅｍｂｒａｎｅ，５０ＫＤａ，Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に移し、１４，０００×ｇで遠心分離操作を加えて濃縮した。
【0085】
濃縮したリポソーム材料溶液に、更に、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を加え、同様の遠心式限外ろ過により、バッファー交換と濃縮操作で同時におこなうことで、ＬＴＪを内包するリポソームを含有する溶液（以下、「ＬＴＪ内包リポソーム溶液」と称する）を得た。
【0086】
例５ ＬＴＪのＧ１期移行促進効果の測定
ヒト末梢血単核球細胞群（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌ：ＰＢＭＣ）の試料（Ｌｏｎｚａ社製）に、例４で用意したＬＴＪ内包リポソームを導入することで細胞周期に及ぼす影響を調べた。
ヒト末梢血単核球細胞群（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌ：ＰＢＭＣ）の試料（Ｌｏｎｚａ社製）に、例４で用意したＬＴＪ内包リポソームを導入することで細胞周期に及ぼす影響を調べた。
【0087】
ＰＢＭＣは、起眠させた後、サイトカイン（ＩＬ－７を１０ｎｇ／ｍＬ、及び、ＩＬ－１５を５ｎｇ／ｍＬ）を含有するＴｅｘＭＡＣＳ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙ Ｂｉｏｔｅｃ社製）に懸濁させて、１．０×１０６（Ｃｅｌｌ／ｍＬ）の細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液は、ＣＤ３／ＣＤ２８抗体でコーティングした９６ウェル丸底プレート（Ｎｕｎｃ Ｎｏｎ－ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）に１ウェルあたり２００μＬ播種した。細胞懸濁液を播種した後、２４時間にわたって３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養することでＴ細胞を活性化させた。
【0088】
なお、プレートへのＣＤ３／ＣＤ２８抗体のコーティングは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１００倍希釈したＣＤ３／ＣＤ２８抗体溶液を１ウェルあたり１５０μＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で２時間以上静置した後、抗体溶液を除去することでおこなった。
【0089】
ＰＢＭＣの細胞周期測定の試料は次のように用意した。上述の通りに活性化させたＴ細胞を含む細胞懸濁液に、例４で得たＬＴＪ内包リポソーム溶液を１ウェルあたり５μＬ投与して、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で４８時間にわたって培養を継続した。その後、核染色用蛍光色素であるＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２を１．０ｍｇ／ｍＬ濃度、及び、ｍＲＮＡ染色用蛍光色素であるＰｙｒｏｎｉｎ－Ｙを５．０ｍｇ／ｍＬ濃度となるようにさらに添加し、３７℃、３０分間のインキュベートを行った。インキュベート後の細胞懸濁液には遠心分離操作を適用して細胞を沈殿させ、かつ、上清を取除いてＰＢＳで再度懸濁することでバッファー交換を行い、ＰＢＭＣの細胞周期測定の試料とした。また、コントロールの実験系として、ＬＴＪ内包リポソーム溶液を投与しないこと以外は上記と同様の条件で活性化、培養、蛍光色素の導入を行った試料も用意し、ＰＢＭＣの細胞周期測定の試料として供した。
【0090】
試料の細胞周期は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）の手法を用いて測定した。ＦＡＣＳはフローサイトメーターであるＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用し、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で標識された細胞はＶ４５０フィルターセットで、Ｐｙｒｏｎｉｎ－Ｙで染色された細胞はＰＥフィルターセットで検出した。ＦＡＣＳ測定で得られたデータはＦＡＣＳｕｉｔｅソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で解析した。
【0091】
【0092】
コントロール実験系の結果とＬＪＴ投与実験系の結果とを比較すると、ＰＢＭＣにＬＪＴを投入することでＧ０期の細胞が３７％から１７％に減少し、かつ、Ｇ１期の細胞が５３％から７８％に増加したことが分かる。従って、ＬＴＪが、Ｇ０期からＧ１期への移行を促進させる効果を発揮することが示された。
【0093】
例６ ＬＴＪによる細胞分裂促進効果の評価
例６では、例４で得たＬＴＪ内包リポソームをＰＢＭＣに投与することで、ＬＴＪ内包リポソームが細胞分裂に及ぼす影響を調べた。
例６では、例４で得たＬＴＪ内包リポソームをＰＢＭＣに投与することで、ＬＴＪ内包リポソームが細胞分裂に及ぼす影響を調べた。
【0094】
例５と同じ方法で、活性化したＴ細胞を含む細胞懸濁液を収容する、９６ウェル丸底プレートを用意した。ウェルに収容された細胞懸濁液に、例４で得たＬＴＪ内包リポソーム溶液を１ウェルあたり５μＬ投与し、かつ、細胞分裂解析用蛍光試薬であるＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｆａｒ Ｒｅｄ（Ｇｉｂｃｏ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）を１ウェルあたり０．２μＬ投与して、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で６日間にわたって培養を継続した。培養終了後には細胞培養液に遠心分離操作を加え、細胞を沈殿させて上清を取除き、ＰＢＳへとバッファー交換をすることでＰＢＭＣの細胞分裂状態の分析に供した。また、コントロールとして、ＬＴＪ内包リポソーム溶液は投与しないこと以外は同様の条件に設定した実験系を用意し、同様にＰＢＭＣの細胞分裂状態の分析に供した。
【0095】
細胞分裂分析として、細胞分裂解析用蛍光色素であるＣｅｌｌＴｒａｃｅを指標としたＦＡＣＳによる分析を行った。同分析は、細胞分裂を経るとＣｅｌｌＴｒａｃｅで染色した細胞の蛍光強度が半減することを利用して、分裂細胞の割合を測定する方法である。具体的には、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ標識細胞をＦＡＣＳのＡＰＣフィルターセットで検出し、入手したデータをＦＡＣＳｕｉｔｅソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で解析した。
【0096】
例６の結果を、図５の（ａ）及び（ｂ）に示す。それぞれ、図５の（ａ）はコントロールの実験系、図５の（ｂ）はＬＴＪを添加した実験系における、ＣｅｌｌＴｒａｃｅが導入された細胞に関するヒストグラムであり、縦軸は細胞数（％）を、横軸は細胞分裂解析用蛍光色素の相対的蛍光強度（－）を示す。１回以上分裂した細胞群は、グラフ中の破線よりも左側の領域にある、より蛍光強度の低い細胞群である。
【0097】
図５（ａ）と図５（ｂ）との結果を比較すると、ＬＴＪを投与したＰＢＭＣは、コントロールの実験系のＰＢＭＣに比べて、１回以上分裂した細胞の割合が増加していることが分かる。従って、ＬＴＪが細胞分裂を促進する効果を有することが示された。
【0098】
例７ ＬＴJによる外来ｍＲＮＡの発現の促進効果の評価
・ｍＲＮＡ内包リポソームの調製
ＬＴJによる外来ｍＲＮＡの発現の促進効果を評価するためのリポソームとして、緑色蛍光タンパク質遺伝子のｍＲＮＡ（以下、「ＧＦＰ－ｍＲＮＡ」と称する）を含有するリポソーム溶液を、下記に示す工程を以て調製した。ＧＦＰ－ｍＲＮＡは、ＯＺ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳから購入し、水溶液中に溶解させたものを使用した。
・ｍＲＮＡ内包リポソームの調製
ＬＴJによる外来ｍＲＮＡの発現の促進効果を評価するためのリポソームとして、緑色蛍光タンパク質遺伝子のｍＲＮＡ（以下、「ＧＦＰ－ｍＲＮＡ」と称する）を含有するリポソーム溶液を、下記に示す工程を以て調製した。ＧＦＰ－ｍＲＮＡは、ＯＺ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳから購入し、水溶液中に溶解させたものを使用した。
【0099】
また、例４と同一組成の脂質溶液及びＬＴＪ溶液を用意した。用意した脂質溶液及びＬＴＪ溶液を混合すると同時に上述のＧＦＰ－ｍＲＮＡの水溶液を添加すること以外は、例４と同一の方法でＧＦＰ－ｍＲＮＡ及びＬＴＪを内包するリポソーム溶液を調製し、ＬＴJによるＧＦＰ－ｍＲＮＡの発現促進効果の評価に供する試料とした。一方、ＬＴＪ溶液を混合しないこと以外は、上述のＧＦＰ－ｍＲＮＡ及びＬＴＪを内包するリポソーム溶液の調製と同様に調製した、ＧＦＰ－ｍＲＮＡを内包するリポソーム溶液も同評価に供する試料とした。
・ＬＴＪによる外来ｍＲＮＡの発現の促進効果
活性化したＴ細胞を含む、ＰＢＭＣの細胞懸濁液を収容する９６ウェル丸底プレートを、例５及び例６で説明した方法と同一の方法で用意した。このプレートが収容する細胞懸濁液にＧＦＰ－ｍＲＮＡを内包するリポソーム溶液を投与する実験系と、ＧＦＰ－ｍＲＮＡ及びＬＴＪを内包するリポソーム溶液を投与する実験系と、を用意した。また、コントロール実験系として、ＧＦＰ－ｍＲＮＡ及びＬＪＴを内包しないリポソーム溶液を投与した系も用意した。
・ＬＴＪによる外来ｍＲＮＡの発現の促進効果
活性化したＴ細胞を含む、ＰＢＭＣの細胞懸濁液を収容する９６ウェル丸底プレートを、例５及び例６で説明した方法と同一の方法で用意した。このプレートが収容する細胞懸濁液にＧＦＰ－ｍＲＮＡを内包するリポソーム溶液を投与する実験系と、ＧＦＰ－ｍＲＮＡ及びＬＴＪを内包するリポソーム溶液を投与する実験系と、を用意した。また、コントロール実験系として、ＧＦＰ－ｍＲＮＡ及びＬＪＴを内包しないリポソーム溶液を投与した系も用意した。
【0100】
・ＬＴJによる外来ｍＲＮＡの発現の促進効果の評価
３つの実験系においてリポソーム溶液を投与し、同条件で培養を開始してから５日後、ＰＢＭＣを回収してＰＢＳに懸濁し、ＦＡＣＳでＧＦＰの発現量を分析した。ＦＡＣＳの分析は、ＧＦＰ発現細胞をＦＩＴＣフィルターセットで検出し、その他は例６と同じ方法で解析した。
３つの実験系においてリポソーム溶液を投与し、同条件で培養を開始してから５日後、ＰＢＭＣを回収してＰＢＳに懸濁し、ＦＡＣＳでＧＦＰの発現量を分析した。ＦＡＣＳの分析は、ＧＦＰ発現細胞をＦＩＴＣフィルターセットで検出し、その他は例６と同じ方法で解析した。
【0101】
図６には、コントロールの実験系の解析結果と、ＧＦＰ－ｍＲＮＡを内包するリポソーム溶液を投与した系の解析結果と、ＧＦＰ－ｍＲＮＡ及びＬＴＪを内包するリポソーム溶液を投与した実験系の解析結果とを示した。なお、図６において、グラフの縦軸に示すＧＦＰ発現細胞の平均発光強度（ＭＦＩ）は、導入したＧＦＰ－ｍＲＮＡの発現量の指標であり、横軸は培養期間を表す。
【0102】
図６に示した３つの系の実験結果を比較すると、ＬＴＪを投与した系におけるＰＢＭＣに導入したＧＦＰ－ｍＲＮＡの発現量は、ＬＴＪを投与しなかった系における同発現量の約１．５倍であった。従って、ＬＴＪが、細胞に導入したｍＲＮＡの発現量を増強する効果を有することが示された。
【0103】
例８ ＬＴJによる外来遺伝子の発現の促進効果の評価
・外来遺伝子内包リポソームの調製
ＬＴJによる外来遺伝子の発現の促進効果を評価するためのリポソームとして、例７で調整したＧＦＰ－ｍＲＮＡ内包リポソーム、或いは、緑色蛍光タンパク質遺伝子のＤＮＡ（以下、「ＧＦＰ－ＤＮＡ」と称する）を含有するリポソーム溶液を、下記に示す工程を以て調製した。なお、ＧＦＰ－ＤＮＡとして、ＥＧＦＰ遺伝子の発現カセットを組み込んだプラスミドＤＮＡを使用した。
・外来遺伝子内包リポソームの調製
ＬＴJによる外来遺伝子の発現の促進効果を評価するためのリポソームとして、例７で調整したＧＦＰ－ｍＲＮＡ内包リポソーム、或いは、緑色蛍光タンパク質遺伝子のＤＮＡ（以下、「ＧＦＰ－ＤＮＡ」と称する）を含有するリポソーム溶液を、下記に示す工程を以て調製した。なお、ＧＦＰ－ＤＮＡとして、ＥＧＦＰ遺伝子の発現カセットを組み込んだプラスミドＤＮＡを使用した。
【0104】
１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）に、Ｔ細胞性白血病細胞Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ）を１．０×１０６細胞／ｍＬとなるように懸濁させた細胞懸濁液を調製した。このプレートが収容する細胞懸濁液にＧＦＰ－ｍＲＮＡを内包するリポソーム溶液を投与する実験系と、ＧＦＰ－ｍＲＮＡを内包するリポソーム溶液及びＬＴＪを内包するリポソーム溶液を投与する実験系と、を用意した。また、コントロール実験系として、ＧＦＰ－ｍＲＮＡ及びＬＪＴを内包しないリポソーム溶液を投与した系も用意した。
【0105】
さらに、細胞懸濁液にＧＦＰ－ＤＮＡを内包するリポソーム溶液を投与する実験系と、ＧＦＰ－ＤＮＡを内包するリポソーム溶液及びＬＴＪを内包するリポソーム溶液を投与する実験系と、を用意した。また、コントロール実験系として、ＧＦＰ－ＤＮＡ及びＬＪＴを内包しないリポソーム溶液を投与した系も用意した。
【0106】
全ての実験系は３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で５日間にわたって培養し、それぞれ培養終了後にＪｕｒｋａｔを回収してＰＢＳに懸濁し、それぞれの懸濁液をＬＴJによる外来遺伝子の発現促進効果の評価に供した。
【0107】
・外来遺伝子発現促進効果の評価
ＬＴＪが外来遺伝子であるＧＦＰ－ｍＲＮＡ又はＧＦＰ－ＤＮＡの発現量に及ぼす影響は、ＦＡＣＳで分析した。ＦＡＣＳの分析及び解析は、例７と同じ方法でおこなった。
ＬＴＪが外来遺伝子であるＧＦＰ－ｍＲＮＡ又はＧＦＰ－ＤＮＡの発現量に及ぼす影響は、ＦＡＣＳで分析した。ＦＡＣＳの分析及び解析は、例７と同じ方法でおこなった。
【0108】
例８の実験結果を図７に示す。図７の（ａ）はＧＦＰ－ｍＲＮＡを内包するリポソーム溶液を投与した系とそのコントロールの実験系、図７の（ｂ）はＧＦＰ－ＤＮＡを内包するリポソーム溶液を投与した系とそのコントロールの実験系、の解析結果を示す。なお、図７中のグラフの縦軸はＧＦＰ－ＤＮＡを発現した細胞の平均発光強度（ＭＦＩ）であり、これは外来遺伝子であるＧＦＰ－ｍＲＮＡ又はＧＦＰ－ＤＮＡの発現量の指標となる。
【0109】
図７の（ａ）において、ＬＴＪを投与したＪｕｒｋａｔにおけるＧＦＰ－ｍＲＮＡの発現量は、ＬＴＪを投与しなかった系の約１．９倍であった。また、図７の（ｂ）において、ＬＴＪを投与したＪｕｒｋａｔにおけるＧＦＰ－ＤＮＡの発現量は、ＬＴＪを投与しなかった系の約２．２倍に増加した。
【0110】
従って、ＬＴＪが、Ｊｕｒｋａｔに対し、外来遺伝子の分子形状がＤＮＡの場合もＲＮＡの場合も、その発現を増強する効果を示すことが示された。
【0111】
本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。
【符号の説明】
【0112】
１…Ｇ１期移行促進ポリペプチド、２…ＨＳＣ７０結合ドメイン、３…ｐＲｂ結合ドメイン、４…核移行シグナルドメイン、５…リンカー配列、１０…導入用核酸、２０…脂質粒子
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】