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特開2023-181909融合タンパク質、２本鎖ＤＮＡ標識剤、２本鎖ＤＮＡ標識用キット、ＤＮＡ、及びベクター
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023181909
(43)【公開日】2023-12-25
(54)【発明の名称】融合タンパク質、２本鎖ＤＮＡ標識剤、２本鎖ＤＮＡ標識用キット、ＤＮＡ、及びベクター
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20231218BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20231218BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20231218BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20231218BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20231218BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z ZNA
C12N15/12
C07K19/00
C07K14/47
【審査請求】未請求
【請求項の数】5
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022095293
(22)【出願日】2022-06-13
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】800000068
【氏名又は名称】学校法人東京電機大学
(74)【代理人】
【識別番号】100106002
【弁理士】
【氏名又は名称】正林 真之
(72)【発明者】
【氏名】高橋 俊介
(72)【発明者】
【氏名】長原 礼宗
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
【課題】本発明の課題は、より安全な２本鎖ＤＮＡ標識技術を提供することである。
【解決手段】本発明は、融合タンパク質であって、前記融合タンパク質が、２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質と、蛍光タンパク質と、を含み、前記２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が、Ｐ３９４７６、Ｆ４Ｂ８Ｘ５、Ａ０Ａ１２５ＳＪ９７、又はＱ９６Ｘ５６である、融合タンパク質を提供する。
【選択図】図１
【解決手段】本発明は、融合タンパク質であって、前記融合タンパク質が、２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質と、蛍光タンパク質と、を含み、前記２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が、Ｐ３９４７６、Ｆ４Ｂ８Ｘ５、Ａ０Ａ１２５ＳＪ９７、又はＱ９６Ｘ５６である、融合タンパク質を提供する。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
融合タンパク質であって、
前記融合タンパク質が、２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質と、蛍光タンパク質と、を含み、
前記２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が、Ｐ３９４７６、Ｆ４Ｂ８Ｘ５、Ａ０Ａ１２５ＳＪ９７、又はＱ９６Ｘ５６である、
融合タンパク質。
前記融合タンパク質が、２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質と、蛍光タンパク質と、を含み、
前記２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が、Ｐ３９４７６、Ｆ４Ｂ８Ｘ５、Ａ０Ａ１２５ＳＪ９７、又はＱ９６Ｘ５６である、
融合タンパク質。
【請求項2】
請求項１に記載の融合タンパク質からなる、２本鎖ＤＮＡ標識剤。
【請求項3】
請求項１に記載の融合タンパク質を含む、２本鎖ＤＮＡ標識用キット。
【請求項4】
請求項１に記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項5】
請求項４に記載のＤＮＡが組み込まれたベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、融合タンパク質、２本鎖ＤＮＡ標識剤、２本鎖ＤＮＡ標識用キット、ＤＮＡ、及びベクターに関する。
【背景技術】
【0002】
ヒトゲノムプロジェクトの完了にともない、各種塩基配列情報が得られたものの、ＤＮＡ代謝の分子機構等には未だ不明な部分が多く残されている。
【0003】
ＤＮＡ代謝等の研究においては、ＤＮＡ分子の可視化のために、蛍光イメージング技術が広く用いられている。
通常、ＤＮＡ分子を蛍光観察するためには、蛍光化合物で標識する必要がある。このような蛍光化合物について各種開発されている。
通常、ＤＮＡ分子を蛍光観察するためには、蛍光化合物で標識する必要がある。このような蛍光化合物について各種開発されている。
【0004】
例えば、２本鎖ＤＮＡを標識する蛍光化合物は、（ｉ）２本鎖ＤＮＡの副溝及び／又は主溝に結合するもの、（ｉｉ）ｄｓＤＮＡの塩基対間に挿入するもの、（ｉｉｉ）左記（ｉ）及び（ｉｉ）の両方を行うもの、という３種に分類され得る。
このような蛍光化合物のうち、特に、インターカレーター型蛍光色素（「ＹＯＹＯ－１」、「ＳＹＴＯＸ Ｏｒａｎｇｅ」、ヨウ化プロピジウム等）は、２本鎖ＤＮＡと高い親和性で相互作用し、蛍光強度が非常に高いという利点があるため、ＤＮＡの１分子イメージングや、フローサイトメトリーにおける諸解析（細胞周期解析、アポトーシス検出等）等に幅広く利用されている（例えば、非特許文献１～６）。
このような蛍光化合物のうち、特に、インターカレーター型蛍光色素（「ＹＯＹＯ－１」、「ＳＹＴＯＸ Ｏｒａｎｇｅ」、ヨウ化プロピジウム等）は、２本鎖ＤＮＡと高い親和性で相互作用し、蛍光強度が非常に高いという利点があるため、ＤＮＡの１分子イメージングや、フローサイトメトリーにおける諸解析（細胞周期解析、アポトーシス検出等）等に幅広く利用されている（例えば、非特許文献１～６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌｕｍｅ ２４９， Ｉｓｓｕｅ １， １５ Ｊｕｎｅ １９９７， Ｐａｇｅｓ ４４－５３
【非特許文献2】Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ． ２０１０ Ｄｅｃ １０；４０３（２）：２２５－９． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｂｂｒｃ．２０１０．１１．０１５． Ｅｐｕｂ ２０１０ Ｎｏｖ １０
【非特許文献3】Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ． ２００５ Ｊｕｎ １；７７（１１）：３５５４－６２． ｄｏｉ： １０．１０２１／ａｃ０５０３０６ｕ
【非特許文献4】Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ． ２０１５； ６： ７３０４
【非特許文献5】Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ３８ （２０１０） ６５２６－６５３２
【非特許文献6】Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ４８ （２０１５） １８６０－１８６５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
他方で、インターカレーター型蛍光色素等の核酸染色試薬は、その作用上、ＤＮＡの塩基対間に入り込むため、塩基対の間隔を広げてＤＮＡの２重らせん構造を歪め、ＤＮＡ代謝等を阻害し得る（例えば、非特許文献５及び６）。そのため、インターカレーター型蛍光色素を使用した解析系は、解析の正確性を損ない得るうえ、安全性に懸念がある。
【0007】
本発明は以上の実情に鑑みてなされたものであり、より安全な２本鎖ＤＮＡ標識技術の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らが検討した結果、蛍光タンパク質とともに、所定の２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含む融合タンパク質によれば上記課題を解決できる点を見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は以下を提供する。
【0009】
（１） 融合タンパク質であって、
前記融合タンパク質が、２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質と、蛍光タンパク質と、を含み、
前記２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が、Ｐ３９４７６、Ｆ４Ｂ８Ｘ５、Ａ０Ａ１２５ＳＪ９７、又はＱ９６Ｘ５６である、
融合タンパク質。
前記融合タンパク質が、２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質と、蛍光タンパク質と、を含み、
前記２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が、Ｐ３９４７６、Ｆ４Ｂ８Ｘ５、Ａ０Ａ１２５ＳＪ９７、又はＱ９６Ｘ５６である、
融合タンパク質。
【0010】
（２） （１）に記載の融合タンパク質からなる、２本鎖ＤＮＡ標識剤。
【0011】
（３） （１）に記載の融合タンパク質を含む、２本鎖ＤＮＡ標識用キット。
【0012】
（４） （１）に記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ。
【0013】
（５） （４）に記載のＤＮＡが組み込まれたベクター。
【発明の効果】
【0014】
本発明によれば、より安全な２本鎖ＤＮＡ標識技術が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】本発明の融合タンパク質、又は核酸染色試薬（ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ）を用いた、２本鎖ＤＮＡへの結合活性を示す図である。
【図2】「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」とλＤＮＡとの複合体に対する塩による影響を示す図である。
【図3】本発明の融合タンパク質で染色された細胞における、フローサイトメトリーによる細胞内状態及び細胞内ＤＮＡ含有量の解析結果を示す図である。
【図4】共焦点顕微鏡による固定化細胞内核染色の観察結果を示す図である。
【図5】共焦点顕微鏡による生細胞内核染色の観察結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0016】
以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明はこれに限定されない。
【0017】
＜融合タンパク質＞
本発明の融合タンパク質は、２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質と、蛍光タンパク質と、を含み、かつ、該２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が、Ｐ３９４７６、Ｆ４Ｂ８Ｘ５、Ａ０Ａ１２５ＳＪ９７、又はＱ９６Ｘ５６である。
本発明の融合タンパク質は、２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質と、蛍光タンパク質と、を含み、かつ、該２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が、Ｐ３９４７６、Ｆ４Ｂ８Ｘ５、Ａ０Ａ１２５ＳＪ９７、又はＱ９６Ｘ５６である。
【0018】
本発明の融合タンパク質は、２本鎖ＤＮＡの標識に用いられる。
具体的には、まず、本発明の融合タンパク質に含まれる所定の２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を、標識対象である２本鎖ＤＮＡに結合させる。次いで、本発明の融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質を発色させることで、標識対象である２本鎖ＤＮＡを可視化することができる。
また、本発明における所定の２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、インターカレーター型蛍光色素等の核酸染色試薬のように２本鎖ＤＮＡの塩基対間に入り込むのではなく、静電気相互作用によって２本鎖ＤＮＡに結合する（Ｈ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ， ３９２ （１９９８） ２０２－２０５；Ｙ．Ｇ．， Ｇａｏら，Ｎａｔ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ５ （１９９８） ７８２－７８６等）。
具体的には、まず、本発明の融合タンパク質に含まれる所定の２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を、標識対象である２本鎖ＤＮＡに結合させる。次いで、本発明の融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質を発色させることで、標識対象である２本鎖ＤＮＡを可視化することができる。
また、本発明における所定の２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、インターカレーター型蛍光色素等の核酸染色試薬のように２本鎖ＤＮＡの塩基対間に入り込むのではなく、静電気相互作用によって２本鎖ＤＮＡに結合する（Ｈ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ， ３９２ （１９９８） ２０２－２０５；Ｙ．Ｇ．， Ｇａｏら，Ｎａｔ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ５ （１９９８） ７８２－７８６等）。
【0019】
本発明において「２本鎖ＤＮＡを安全に標識する」とは、インターカレーター型蛍光色素等の核酸染色試薬を用いた系と比較して、２本鎖ＤＮＡを安全に標識することを包含する。
例えば、核酸染色試薬には、変異原性、刺激性、発癌性、催奇性等があり得る。そのため、核酸染色試薬を用いた操作においては、手袋等の着用が必須である。
これに対し、本発明における２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は生体分子から構成されているため、本発明の融合タンパク質は手袋等を着用せずに取扱うことが可能である。
例えば、核酸染色試薬には、変異原性、刺激性、発癌性、催奇性等があり得る。そのため、核酸染色試薬を用いた操作においては、手袋等の着用が必須である。
これに対し、本発明における２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は生体分子から構成されているため、本発明の融合タンパク質は手袋等を着用せずに取扱うことが可能である。
【0020】
さらに、本発明における所定の２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、核酸染色試薬のようにＤＮＡの２重らせん構造を歪めないため、ＤＮＡ代謝（転写、複製等）等を阻害しにくい。
そのため、本発明の融合タンパク質によれば、細胞内のＤＮＡ代謝等の挙動をより捉えやすい。
そのため、本発明の融合タンパク質によれば、細胞内のＤＮＡ代謝等の挙動をより捉えやすい。
【0021】
さらに、本発明の融合タンパク質は、インターカレーター型蛍光色素等の核酸染色試薬を用いた系と比較して、蛍光退色時間（蛍光が退色するまでに要する時間）が長く、より長時間の蛍光イメージングを実現し得る。
例えば、本発明の融合タンパク質によれば、インターカレーター型蛍光色素を用いた系と比較して、蛍光退色時間が２．２～６．７倍長い可能性がある。
なお、本発明において「蛍光退色時間」は、実施例に示した方法で特定し得る。
例えば、本発明の融合タンパク質によれば、インターカレーター型蛍光色素を用いた系と比較して、蛍光退色時間が２．２～６．７倍長い可能性がある。
なお、本発明において「蛍光退色時間」は、実施例に示した方法で特定し得る。
【0022】
以下、本発明の融合タンパク質の構成について説明する。
【0023】
（１）２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質
本発明においては、２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質として所定のタンパク質、すなわち、「Ｐ３９４７６」、「Ｆ４Ｂ８Ｘ５」、「Ａ０Ａ１２５ＳＪ９７」、又は「Ｑ９６Ｘ５６」を使用することに主要な技術的特徴を有する。
２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、種々知られているものの、本発明らは、上記４種のタンパク質が、結合対象である２本鎖ＤＮＡの作用を阻害せずに結合し、２本鎖ＤＮＡの標識において特に有用であることを見出した。
本発明においては、２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質として所定のタンパク質、すなわち、「Ｐ３９４７６」、「Ｆ４Ｂ８Ｘ５」、「Ａ０Ａ１２５ＳＪ９７」、又は「Ｑ９６Ｘ５６」を使用することに主要な技術的特徴を有する。
２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、種々知られているものの、本発明らは、上記４種のタンパク質が、結合対象である２本鎖ＤＮＡの作用を阻害せずに結合し、２本鎖ＤＮＡの標識において特に有用であることを見出した。
【0024】
本発明における４種の２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、すなわち、「Ｐ３９４７６」、「Ｆ４Ｂ８Ｘ５」、「Ａ０Ａ１２５ＳＪ９７」、及び「Ｑ９６Ｘ５６」は、いずれも、「７ｋｄａ ｄｎａ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｎｄｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｐ２ ｆａｍｉｌｙ」（例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／？ｑｕｅｒｙ＝ｆａｍｉｌｙ：％２２７＋ｋＤａ＋ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ％２Ｆｅｎｄｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ＋Ｐ２＋ｆａｍｉｌｙ％２２＆ｓｏｒｔ＝ｓｃｏｒｅを参照。）に属する。
【0025】
本発明における４種の２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質に対応する各遺伝子名は、以下のとおりである。ただし、以下、各２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質について、各タンパク質名及び各遺伝子名を互換的に使用することがある（例えば、２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を、対応する遺伝子名によって特定することがある。）。
【0026】
【表1】
【0027】
本発明の融合タンパク質は、「Ｐ３９４７６」、「Ｆ４Ｂ８Ｘ５」、「Ａ０Ａ１２５ＳＪ９７」、及び「Ｑ９６Ｘ５６」のうちいずれか１以上を含む。
本発明において、これらのうち複数を含む態様は排除されないが、２本鎖ＤＮＡとの結合効率の観点等から、本発明の融合タンパク質は、「Ｐ３９４７６」、「Ｆ４Ｂ８Ｘ５」、「Ａ０Ａ１２５ＳＪ９７」、及び「Ｑ９６Ｘ５６」のうちいずれか１つのみを含むことが好ましい。
本発明において、これらのうち複数を含む態様は排除されないが、２本鎖ＤＮＡとの結合効率の観点等から、本発明の融合タンパク質は、「Ｐ３９４７６」、「Ｆ４Ｂ８Ｘ５」、「Ａ０Ａ１２５ＳＪ９７」、及び「Ｑ９６Ｘ５６」のうちいずれか１つのみを含むことが好ましい。
【0028】
本発明における４種の２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の由来は特に限定されず、標識対象である２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の由来等に応じて適宜設定できる。２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の由来は、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｌｏｂｕｓ ｓｈｉｂａｔａｅ等であり得る。
【0029】
２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、発現効率の向上等の観点から、コドン使用頻度等に基づき最適化された遺伝子から発現されたものであってもよい。
コドン使用頻度に基づく遺伝子設計は、実施例に示した方法を採用できる。
コドン使用頻度に基づく遺伝子設計は、実施例に示した方法を採用できる。
【0030】
２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、例えば、実施例に示した遺伝子配列（配列番号１３～１６）に基づき発現されたものであってもよい。
【0031】
本発明における２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質のうち「Ｆ４Ｂ８Ｘ５」を用いた態様は、蛍光退色時間が特に長い点で好ましい。
【0032】
（２）蛍光タンパク質
蛍光タンパク質としては、２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質とともに発現させることができる任意の蛍光タンパク質を採用できる。
このような蛍光タンパク質として、「ｍＣｌｏｖｅｒ３」、「Ｅｎｈａｎｃｅｄ ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）」、「ｍＣｈｅｒｒｙ」等が挙げられる。
蛍光タンパク質としては、２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質とともに発現させることができる任意の蛍光タンパク質を採用できる。
このような蛍光タンパク質として、「ｍＣｌｏｖｅｒ３」、「Ｅｎｈａｎｃｅｄ ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）」、「ｍＣｈｅｒｒｙ」等が挙げられる。
【0033】
本発明の融合タンパク質は、蛍光タンパク質を１種単独で含んでいてもよく、２種以上を含んでいてもよい。
【0034】
蛍光タンパク質は、その構造等に応じて、２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の任意の部分に結合していてもよい。例えば、蛍光タンパク質は、２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の末端（アミノ末端（Ｎ末端）の上流及び／又はカルボキシル末端（Ｃ末端））の下流にペプチドリンカーを介して融合し得る。
【0035】
本発明の融合タンパク質の好ましい態様は、「Ｆ４Ｂ８Ｘ５」とともに「ｍＣｌｏｖｅｒ３」を含むものを包含する。
【0036】
（３）その他の構成
本発明の融合タンパク質は、２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の結合特性や、蛍光タンパク質の発色等を阻害しない範囲で、目的に応じて、２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、及び蛍光タンパク質以外の構成を含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。
本発明の融合タンパク質は、２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の結合特性や、蛍光タンパク質の発色等を阻害しない範囲で、目的に応じて、２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、及び蛍光タンパク質以外の構成を含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。
【0037】
２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、及び蛍光タンパク質以外の構成としては、リンカー、タンパク質タグ（ＳＮＡＰ－Ｔａｇ、ＣＬＩＰ－Ｔａｇ等）、抗体等が挙げられる。
【0038】
本発明は、融合タンパク質が、２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、及び蛍光タンパク質のみからなる態様を包含する。
【0039】
＜融合タンパク質の製造方法＞
本発明の融合タンパク質は、融合タンパク質の製造方法として知られる任意の方法によって製造できる。
このような方法として、実施例に示した、プラスミドベクターを用いた方法等が挙げられる。得られた融合タンパク質は、適宜精製等を行ってもよい。
本発明の融合タンパク質は、融合タンパク質の製造方法として知られる任意の方法によって製造できる。
このような方法として、実施例に示した、プラスミドベクターを用いた方法等が挙げられる。得られた融合タンパク質は、適宜精製等を行ってもよい。
【0040】
＜融合タンパク質の用途＞
本発明の融合タンパク質は、２本鎖ＤＮＡの標識に用いられる。
したがって、本発明は、本発明の融合タンパク質からなる２本鎖ＤＮＡ標識剤、本発明の融合タンパク質を含む２本鎖ＤＮＡ標識用キット、本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡが組み込まれた発現ベクター等を包含する。
本発明の融合タンパク質は、２本鎖ＤＮＡの標識に用いられる。
したがって、本発明は、本発明の融合タンパク質からなる２本鎖ＤＮＡ標識剤、本発明の融合タンパク質を含む２本鎖ＤＮＡ標識用キット、本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡが組み込まれた発現ベクター等を包含する。
【0041】
本発明の融合タンパク質の標識対象である２本鎖ＤＮＡとしては特に限定されず、バクテリオファージラムダＤＮＡ（λＤＮＡ）、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片、プラスミドＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ等が挙げられる。
【0042】
本発明の融合タンパク質を用いた２本鎖ＤＮＡの標識方法としては特に限定されず、例えば、本発明の融合タンパク質とともに２本鎖ＤＮＡを室温（例えば、２０～３０℃）で、１～３０分インキュベートする方法等が挙げられる。
次いで、蛍光タンパク質の種類に応じた方法で、蛍光タンパク質を発色させることで、２本鎖ＤＮＡに結合した本発明の融合タンパク質を可視化することができる。
次いで、蛍光タンパク質の種類に応じた方法で、蛍光タンパク質を発色させることで、２本鎖ＤＮＡに結合した本発明の融合タンパク質を可視化することができる。
【0043】
本発明の融合タンパク質が２本鎖ＤＮＡを標識できたかどうかは、例えば、実施例に示したゲルシフトアッセイ等によって評価できる。
【0044】
上述のとおり、本発明の融合タンパク質によれば、従来の核酸染色試薬と比較して安全に２本鎖ＤＮＡを標識できる。また、本発明の融合タンパク質は、蛍光顕微鏡やフローサイトメトリー等の使用において、蛍光が退色するまでの時間が長く、より長時間の蛍光イメージング及び蛍光検出を実現し得る。
したがって、本発明の融合タンパク質は、従来の核酸染色試薬の良好な代替品となり得るものであり、従来の核酸染色試薬と同様に利用することができる。
したがって、本発明の融合タンパク質は、従来の核酸染色試薬の良好な代替品となり得るものであり、従来の核酸染色試薬と同様に利用することができる。
【実施例0045】
以下に、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0046】
＜試験１＞
以下の方法に基づき、２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、及び蛍光タンパク質を含む融合タンパク質の分子クローニング、並びに、大腸菌への形質転換を行った。
以下の方法に基づき、２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、及び蛍光タンパク質を含む融合タンパク質の分子クローニング、並びに、大腸菌への形質転換を行った。
【0047】
（１）２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質遺伝子配列の設計
以下の方法に基づき、大腸菌のコドン使用頻度へ最適化した２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質遺伝子配列を設計した。
まず、大腸菌の異種タンパク質である、Ｓａｃｃｈａｒｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、又はＡｃｉｄｉａｎｕｓ ｈｏｓｐｉｔａｌｉｓに由来する下記４種類の２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を効率よく発現させるため、コドン最適化ツールを使用して、大腸菌のコドン使用頻度へ最適化した「Ｓｓｏ７ｄ」、「Ａｈｏ７ｃ」、「ＡＴＳＶ７」及び「Ｓｔｏ７」の遺伝子配列を設計した。
・Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ ７ｋＤａ ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｓｓｏ７ｄ）：Ｐ３９４７６タンパク質と対応する。
・Ａｃｉｄｉａｎｕｓ ｈｏｓｐｉｔａｌｉｓ ７ｋＤａ ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ａｈｏ７ｃ）：Ｆ４Ｂ８Ｘ５タンパク質と対応する。
・Ａｒｃｈａｅａｌ Ｌａｒｇｅ Ｔａｉｌｅｄ Ｓｐｉｎｄｌｅ Ｖｉｒｕｓ ７ ｋＤａ ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＴＳＶ７）：Ａ０Ａ１２５ＳＪ９７タンパク質と対応する。
・Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ ７ｋＤａ ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｓｔｏ７）：Ｑ９６Ｘ５６タンパク質と対応する。
以下の方法に基づき、大腸菌のコドン使用頻度へ最適化した２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質遺伝子配列を設計した。
まず、大腸菌の異種タンパク質である、Ｓａｃｃｈａｒｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、又はＡｃｉｄｉａｎｕｓ ｈｏｓｐｉｔａｌｉｓに由来する下記４種類の２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を効率よく発現させるため、コドン最適化ツールを使用して、大腸菌のコドン使用頻度へ最適化した「Ｓｓｏ７ｄ」、「Ａｈｏ７ｃ」、「ＡＴＳＶ７」及び「Ｓｔｏ７」の遺伝子配列を設計した。
・Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ ７ｋＤａ ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｓｓｏ７ｄ）：Ｐ３９４７６タンパク質と対応する。
・Ａｃｉｄｉａｎｕｓ ｈｏｓｐｉｔａｌｉｓ ７ｋＤａ ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ａｈｏ７ｃ）：Ｆ４Ｂ８Ｘ５タンパク質と対応する。
・Ａｒｃｈａｅａｌ Ｌａｒｇｅ Ｔａｉｌｅｄ Ｓｐｉｎｄｌｅ Ｖｉｒｕｓ ７ ｋＤａ ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＴＳＶ７）：Ａ０Ａ１２５ＳＪ９７タンパク質と対応する。
・Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ ７ｋＤａ ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｓｔｏ７）：Ｑ９６Ｘ５６タンパク質と対応する。
【0048】
次いで、ＲＮＡ２次構造予測ツールを使用して、コドン最適化ツールから複数出力された遺伝子配列のｍＲＮＡの不安定性を評価した。この工程により、大腸菌のコドン使用頻度へ最適化した「Ｓｓｏ７ｄ」、「Ａｈｏ７ｃ」、「ＡＴＳＶ７」及び「Ｓｔｏ７」の遺伝子配列を選択した。これらの遺伝子配列は以下のとおりである。
【0049】
【表2】
【0050】
なお、本例において、コドン最適化ツールは、「Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ」（ＣＯＵＳＩＮ； ｈｔｔｐｓ：／／ｃｏｕｓｉｎ．ｉｒｄ．ｆｒ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）を使用した。
ＲＮＡ２次構造予測ツールは、「ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｔｏｏｌｓ」（ｈｔｔｐ：／／ｒｎａ．ｕｒｍｃ．ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ．ｅｄｕ／ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅＷｅｂ／）を使用した。
ＲＮＡ２次構造予測ツールは、「ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｔｏｏｌｓ」（ｈｔｔｐ：／／ｒｎａ．ｕｒｍｃ．ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ．ｅｄｕ／ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅＷｅｂ／）を使用した。
【0051】
（２）２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の分子クローニング
上記（１）で設計した「Ｓｓｏ７ｄ」、「Ａｈｏ７ｃ」、「ＡＴＳＶ７」及び「Ｓｔｏ７」の遺伝子配列の人工合成遺伝子を、受託合成（ユーロフィン社）によって調達した。
次いで、「ＫＯＤ －Ｐｌｕｓ－」（東洋紡社製）によって、添付の説明書に従い、下記プライマー（配列番号：１～８）を用いて、各遺伝子配列を増幅した。
上記（１）で設計した「Ｓｓｏ７ｄ」、「Ａｈｏ７ｃ」、「ＡＴＳＶ７」及び「Ｓｔｏ７」の遺伝子配列の人工合成遺伝子を、受託合成（ユーロフィン社）によって調達した。
次いで、「ＫＯＤ －Ｐｌｕｓ－」（東洋紡社製）によって、添付の説明書に従い、下記プライマー（配列番号：１～８）を用いて、各遺伝子配列を増幅した。
【0052】
【表3】
【0053】
ＰＣＲ反応条件は、以下のように設定した。
９８℃、２分の熱変性の後、以下の温度サイクルを３０サイクル行う。：９８℃、３０秒→５５℃、３０秒→６８℃、３０秒
９８℃、２分の熱変性の後、以下の温度サイクルを３０サイクル行う。：９８℃、３０秒→５５℃、３０秒→６８℃、３０秒
【0054】
得られたＰＣＲ増幅産物、及びｐＥＴ２２ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を、制限酵素（ＸｈｏＩ、及びＨｉｎｄＩＩＩ）で切断した。
次いで、「ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ」（ＱＩＡｇｅｎ社製）を用いて、ＤＮＡ産物を精製した。
精製したインサートＤＮＡ、及び各ベクターＤＮＡを混合し、得られた混合ＤＮＡ溶液と１：１になるように「ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ」（ＴａＫａＲａ社製）を加え、恒温槽（ＴＡＩＴＥＣ社製）中で１６℃、１時間から終夜静置し、ＤＮＡライゲーション反応を行った。
ＤＮＡライゲーション反応後、「Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９コンピテントセル」（ＴａＫａＲａ社製）を用いて、添付の説明書に従い形質転換を行い、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（ナカライテスク社製）を含むＬＢ寒天培地に広げて、３７℃で終夜培養し、形質転換体を得た。
次いで、「ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ」（ＱＩＡｇｅｎ社製）を用いて、ＤＮＡ産物を精製した。
精製したインサートＤＮＡ、及び各ベクターＤＮＡを混合し、得られた混合ＤＮＡ溶液と１：１になるように「ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ」（ＴａＫａＲａ社製）を加え、恒温槽（ＴＡＩＴＥＣ社製）中で１６℃、１時間から終夜静置し、ＤＮＡライゲーション反応を行った。
ＤＮＡライゲーション反応後、「Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９コンピテントセル」（ＴａＫａＲａ社製）を用いて、添付の説明書に従い形質転換を行い、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（ナカライテスク社製）を含むＬＢ寒天培地に広げて、３７℃で終夜培養し、形質転換体を得た。
【0055】
（３）ダイレクトコロニーＰＣＲ及びＤＮＡシーケンシング解析－１
上記（２）で得られた形質転換体を用いて、シカジーニアスＤＮＡ抽出試薬（関東化学社製）により、添付の説明書に従い、大腸菌コロニーからＤＮＡ抽出物を調製した。
得られたＤＮＡ抽出物をＰＣＲ反応用テンプレートとして、「ＴａＫａＲａ Ｅｘ－Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ」（ＴａＫａＲａ社製）によって、添付の説明書に従い、下記プライマー（配列番号：９、１０）を用いて、目的ＤＮＡ配列を増幅した。
上記（２）で得られた形質転換体を用いて、シカジーニアスＤＮＡ抽出試薬（関東化学社製）により、添付の説明書に従い、大腸菌コロニーからＤＮＡ抽出物を調製した。
得られたＤＮＡ抽出物をＰＣＲ反応用テンプレートとして、「ＴａＫａＲａ Ｅｘ－Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ」（ＴａＫａＲａ社製）によって、添付の説明書に従い、下記プライマー（配列番号：９、１０）を用いて、目的ＤＮＡ配列を増幅した。
【0056】
【表4】
【0057】
ＰＣＲ反応条件は、以下のように設定した。
９５℃、２分の熱変性の後、以下の温度サイクルを３０サイクル行う。：９５℃、２０秒→５５℃、３０秒→７２℃、３０秒
９５℃、２分の熱変性の後、以下の温度サイクルを３０サイクル行う。：９５℃、２０秒→５５℃、３０秒→７２℃、３０秒
【0058】
得られたＰＣＲ反応産物溶液の一部を、２％アガロースゲル（ナカライテスク社製）により電気泳動し、目的のバンド（約５６９ｂｐ）を確認した。
その後、残りのＰＣＲ反応産物溶液を、「ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ」（ＱＩＡｇｅｎ社製）を用い、添付の説明書に従い精製した。
その後、残りのＰＣＲ反応産物溶液を、「ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ」（ＱＩＡｇｅｎ社製）を用い、添付の説明書に従い精製した。
【0059】
得られた目的ＤＮＡ配列を、受託解析（ジーンウィズ社）によって評価した結果、設計通りに、「Ｓｓｏ７ｄ」、「Ａｈｏ７ｃ」、「ＡＴＳＶ７」及び「Ｓｔｏ７」の各遺伝子配列を含むクローン化ＤＮＡ（ベクター）を取得した。
以下、得られた４種類のベクターを、「ｐＥＴ２２－Ｓｓｏ７ｄベクター」、「ｐＥＴ２２－Ａｈｏ７ｃベクター」、「ｐＥＴ２２－ＡＴＳＶ７ベクター」、「ｐＥＴ２２－Ｓｔｏ７ベクター」と称する。
以下、得られた４種類のベクターを、「ｐＥＴ２２－Ｓｓｏ７ｄベクター」、「ｐＥＴ２２－Ａｈｏ７ｃベクター」、「ｐＥＴ２２－ＡＴＳＶ７ベクター」、「ｐＥＴ２２－Ｓｔｏ７ベクター」と称する。
【0060】
（４）プラスミド抽出－１
上記（３）で得られた４種類のベクターによる大腸菌形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ液体培地に３７℃で終夜培養した。菌体培養液を遠心で集菌し、「ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ」（キアゲン社製）を用い、添付の説明書に従い、ベクターを抽出及び精製した。
上記（３）で得られた４種類のベクターによる大腸菌形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ液体培地に３７℃で終夜培養した。菌体培養液を遠心で集菌し、「ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ」（キアゲン社製）を用い、添付の説明書に従い、ベクターを抽出及び精製した。
【0061】
（５）蛍光タンパク質融合２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の分子クローニング
以下の方法に基づき、上記（２）乃至（４）で得られた４種類のベクターに、蛍光タンパク質（ｍＣｌｏｖｅｒ３）をクローニングした。
まず、「ＫＯＤ －Ｐｌｕｓ－」（東洋紡社製）を用いて、添付の説明書に従い、下記プライマー（配列番号：１１、１２）を用いて、蛍光タンパク質（ｍＣｌｏｖｅｒ３）の遺伝子配列（配列番号１７）を増幅した。
以下の方法に基づき、上記（２）乃至（４）で得られた４種類のベクターに、蛍光タンパク質（ｍＣｌｏｖｅｒ３）をクローニングした。
まず、「ＫＯＤ －Ｐｌｕｓ－」（東洋紡社製）を用いて、添付の説明書に従い、下記プライマー（配列番号：１１、１２）を用いて、蛍光タンパク質（ｍＣｌｏｖｅｒ３）の遺伝子配列（配列番号１７）を増幅した。
【0062】
【表5】
【0063】
【表6】
【0064】
ＰＣＲ反応条件は、以下のように設定した。
９８℃、２分の熱変性の後、以下の温度サイクルを３０サイクル行う。：９８℃、３０秒→５５℃、３０秒→６８℃、６０秒
９８℃、２分の熱変性の後、以下の温度サイクルを３０サイクル行う。：９８℃、３０秒→５５℃、３０秒→６８℃、６０秒
【0065】
得られたＰＣＲ増幅産物、及び４種類のベクターを、制限酵素（ＮｃｏＩ、及びＥｃｏＲＩ）で切断した。
次いで、「ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ」（ＱＩＡｇｅｎ社製）を用いて、ＤＮＡ産物を精製した。
精製したインサートＤＮＡ、及び各ベクターＤＮＡを混合し、得られた混合ＤＮＡ溶液と１：１になるように「ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ」（ＴａＫａＲａ社製）を加え、恒温槽（ＴＡＩＴＥＣ社製）中で１６℃、１時間から終夜静置し、ＤＮＡライゲーション反応を行った。
ＤＮＡライゲーション反応後、「Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９コンピテントセル」（ＴａＫａＲａ社製）を用いて、添付の説明書に従い形質転換を行い、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（ナカライテスク社製）を含むＬＢ寒天培地に広げて、３７℃で終夜培養し、形質転換体を得た。
次いで、「ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ」（ＱＩＡｇｅｎ社製）を用いて、ＤＮＡ産物を精製した。
精製したインサートＤＮＡ、及び各ベクターＤＮＡを混合し、得られた混合ＤＮＡ溶液と１：１になるように「ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ」（ＴａＫａＲａ社製）を加え、恒温槽（ＴＡＩＴＥＣ社製）中で１６℃、１時間から終夜静置し、ＤＮＡライゲーション反応を行った。
ＤＮＡライゲーション反応後、「Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９コンピテントセル」（ＴａＫａＲａ社製）を用いて、添付の説明書に従い形質転換を行い、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（ナカライテスク社製）を含むＬＢ寒天培地に広げて、３７℃で終夜培養し、形質転換体を得た。
【0066】
（６）ダイレクトコロニーＰＣＲとＤＮＡシーケンシング解析－２
上記（５）で得られた形質転換体を用いて、シカジーニアスＤＮＡ抽出試薬（関東化学社製）により、添付の説明書に従い、大腸菌コロニーからＤＮＡ抽出物を調製した。
得られたＤＮＡ抽出物をＰＣＲ反応用テンプレートとして、「ＴａＫａＲａ Ｅｘ－Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ」（ＴａＫａＲａ社製）によって、添付の説明書に従い、「ダイレクトコロニーＰＣＲ及びＤＮＡシーケンシング解析－１」と同様のプライマー（配列番号：９、１０）を用いて、目的ＤＮＡ配列を増幅した。
上記（５）で得られた形質転換体を用いて、シカジーニアスＤＮＡ抽出試薬（関東化学社製）により、添付の説明書に従い、大腸菌コロニーからＤＮＡ抽出物を調製した。
得られたＤＮＡ抽出物をＰＣＲ反応用テンプレートとして、「ＴａＫａＲａ Ｅｘ－Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ」（ＴａＫａＲａ社製）によって、添付の説明書に従い、「ダイレクトコロニーＰＣＲ及びＤＮＡシーケンシング解析－１」と同様のプライマー（配列番号：９、１０）を用いて、目的ＤＮＡ配列を増幅した。
【0067】
ＰＣＲ反応条件は、以下のように設定した。
９５℃、２分の熱変性の後、以下の温度サイクルを３０サイクル行う。：９５℃、２０秒→５５℃、３０秒→７２℃、６０秒
９５℃、２分の熱変性の後、以下の温度サイクルを３０サイクル行う。：９５℃、２０秒→５５℃、３０秒→７２℃、６０秒
【0068】
得られたＰＣＲ反応産物溶液の一部を、１％アガロースゲル（ナカライテスク社製）により電気泳動し、目的のバンド（約１２６２ｂｐ）を確認した。
その後、残りのＰＣＲ反応産物溶液を、「ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ」（キアゲン社製）を用い、添付の説明書に従い精製した。
その後、残りのＰＣＲ反応産物溶液を、「ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ」（キアゲン社製）を用い、添付の説明書に従い精製した。
【0069】
得られた目的ＤＮＡ配列を、受託解析（ジーンウィズ社）によって評価した結果、設計通りに、蛍光タンパク質（ｍＣｌｏｖｅｒ３）の遺伝子配列とともに、「Ｓｓｏ７ｄ」、「Ａｈｏ７ｃ」、「ＡＴＳＶ７」及び「Ｓｔｏ７」の各遺伝子配列を含むクローン化ＤＮＡ（ベクター）を取得した。
以下、得られた４種類のベクターを、「ｐＥＴ２２－Ｓｓｏ７ｄ－ｍＣｌｏｖｅｒ３ベクター」、「ｐＥＴ２２－Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３ベクター」、「ｐＥＴ２２－ＡＴＳＶ７－ｍＣｌｏｖｅｒ３ベクター」、「ｐＥＴ２２－Ｓｔｏ７－ｍＣｌｏｖｅｒ３ベクター」と称する。
以下、得られた４種類のベクターを、「ｐＥＴ２２－Ｓｓｏ７ｄ－ｍＣｌｏｖｅｒ３ベクター」、「ｐＥＴ２２－Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３ベクター」、「ｐＥＴ２２－ＡＴＳＶ７－ｍＣｌｏｖｅｒ３ベクター」、「ｐＥＴ２２－Ｓｔｏ７－ｍＣｌｏｖｅｒ３ベクター」と称する。
【0070】
（７）プラスミド抽出－２
上記（６）で得られた４種類のベクターによる大腸菌形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ液体培地に３７℃で終夜培養した。菌体培養液を遠心で集菌し、「ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ」（キアゲン社製）を用い、添付の説明書に従い、ベクターを抽出及び精製した。
上記（６）で得られた４種類のベクターによる大腸菌形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ液体培地に３７℃で終夜培養した。菌体培養液を遠心で集菌し、「ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ」（キアゲン社製）を用い、添付の説明書に従い、ベクターを抽出及び精製した。
【0071】
＜試験２＞
以下の方法に基づき、蛍光タンパク質融合２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の発現、抽出及び精製を行った。
以下の方法に基づき、蛍光タンパク質融合２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の発現、抽出及び精製を行った。
【0072】
（１）蛍光タンパク質融合２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の発現及び抽出
上記＜試験１＞で得られた４種類のベクター「ｐＥＴ２２－Ｓｓｏ７ｄ－ｍＣｌｏｖｅｒ３ベクター」、「ｐＥＴ２２－Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３ベクター」、「ｐＥＴ２２－ＡＴＳＶ７－ｍＣｌｏｖｅｒ３ベクター」、及び「ｐＥＴ２２－Ｓｔｏ７－ｍＣｌｏｖｅｒ３ベクター」を大腸菌に導入した。
大腸菌への導入は、「Ｒｏｓｅｔｔａ（商標） （ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ」（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いて、添付の説明書に従った。
次いで、大腸菌を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（ナカライテスク社製）、及び１２．５μｇ／ｍＬクロラムフェニコール（ナカライテスク社製）を含むＬＢ寒天培地に広げて、３７℃で終夜培養し、形質転換体を得た。
上記＜試験１＞で得られた４種類のベクター「ｐＥＴ２２－Ｓｓｏ７ｄ－ｍＣｌｏｖｅｒ３ベクター」、「ｐＥＴ２２－Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３ベクター」、「ｐＥＴ２２－ＡＴＳＶ７－ｍＣｌｏｖｅｒ３ベクター」、及び「ｐＥＴ２２－Ｓｔｏ７－ｍＣｌｏｖｅｒ３ベクター」を大腸菌に導入した。
大腸菌への導入は、「Ｒｏｓｅｔｔａ（商標） （ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ」（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いて、添付の説明書に従った。
次いで、大腸菌を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（ナカライテスク社製）、及び１２．５μｇ／ｍＬクロラムフェニコール（ナカライテスク社製）を含むＬＢ寒天培地に広げて、３７℃で終夜培養し、形質転換体を得た。
【0073】
得られた形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンと１２．５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含む２ｍＬのＬＢ液体培地に３７℃で終夜培養（前培養）した。
前培養した菌体培養液を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンと１２．５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含む１００ｍＬのＬＢ液体培地に加え、菌体濁度（ＯＤ６００値）が０．５に達するまで、３７℃で培養した。
その後、菌体培養液の最終濃度が０．５ｍＭになるようにＩＰＴＧを加え、１６℃で２４時間培養した。
培養後、６，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃で菌体培養液を遠心分離し、上清を捨て、菌体ペレットを回収した。
前培養した菌体培養液を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンと１２．５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含む１００ｍＬのＬＢ液体培地に加え、菌体濁度（ＯＤ６００値）が０．５に達するまで、３７℃で培養した。
その後、菌体培養液の最終濃度が０．５ｍＭになるようにＩＰＴＧを加え、１６℃で２４時間培養した。
培養後、６，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃で菌体培養液を遠心分離し、上清を捨て、菌体ペレットを回収した。
【0074】
得られた菌体ペレットを含むチューブに、５ｍＬのフィルター滅菌したＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ イミダゾール）を加え、菌体ペレットを懸濁し、洗浄した。洗浄後、６，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃で菌体培養液を遠心分離し、菌体ペレットを回収した。
菌体ペレットを含むチューブに、５ｍＬのＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒを加え、菌体ペレットを懸濁した後、超音波破砕機での条件下で３０分間菌体を破砕した。
その後、菌体破砕液を７０℃で１５分間インキュベートした後、１５，０００ｒｐｍ、３０分間、４℃で遠心分離し、上清を回収した。
得られた上清を、シリンジフィルター（メルク社製）に通液した後、下記の固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）精製に供した。
菌体ペレットを含むチューブに、５ｍＬのＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒを加え、菌体ペレットを懸濁した後、超音波破砕機での条件下で３０分間菌体を破砕した。
その後、菌体破砕液を７０℃で１５分間インキュベートした後、１５，０００ｒｐｍ、３０分間、４℃で遠心分離し、上清を回収した。
得られた上清を、シリンジフィルター（メルク社製）に通液した後、下記の固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）精製に供した。
【0075】
（２）蛍光タンパク質融合２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の精製
上記（１）で得られた蛍光タンパク質融合２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を精製するために、以下の操作を行った。
上記（１）で得られた蛍光タンパク質融合２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を精製するために、以下の操作を行った。
【0076】
まず、カラムに、１ｍＬの「ＴＡＬＯＮ（商標） Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎ」（ＴａＫａＲａ社製）を加え、通液した。次いで、カラムに、１０ｍＬのＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒを加え、通液することで、「ＴＡＬＯＮ（商標） Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎ」の洗浄、及び平衡化を行った。
【0077】
上記（１）で得られた蛍光タンパク質融合２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の溶液をカラムに加え、通液させることで、「ＴＡＬＯＮ（商標） Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎ」に蛍光タンパク質融合２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を固定化させた。通液後、１ｍＬのＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した。
洗浄後、カラムに、５ｍＬのＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ イミダゾール）を加え、通液することで、「ＴＡＬＯＮ（商標） Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎ」に非特異的に結合しているタンパク質を洗浄した。
洗浄後、カラムに、５ｍＬのＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、３００ｍＭ イミダゾール）を加え、通液することで、蛍光タンパク質融合２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を溶出させた。
次いで、溶出液に含まれる高濃度のイミダゾールを除去するため、溶出液を透析チューブに加えた後、該チューブを、１ＬのＤｉａｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（５０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％ ＮＰ－４０、０．２％ Ｔｗｅｅｎ２０、２ｍＭ ＤＴＴ）に浸し、４℃で４時間透析した。その後、透析チューブを取り出し、新たな１ＬのＤｉａｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒに透析チューブを浸し、４℃で１６時間さらに透析した。透析サンプルを１．５ｍＬの遮光チューブに加え、－２０℃で保存した。また、透析サンプルの一部をＳＤＳ－ＰＡＧＥで解析し、目的のバンド（約３７ｋＤａ）を確認した。
得られた透析サンプルは、本発明の融合タンパク質（精製蛍光タンパク質融合２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質）に相当する。
以下、得られた４種類の精製蛍光タンパク質融合２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を、「Ｓｓｏ７ｄ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」、「ＡＴＳＶ７－ｍＣｌｏｖｅｒ３」、及び「Ｓｔｏ７－ｍＣｌｏｖｅｒ３」と称する。これらの融合タンパク質は、２本鎖結合タンパク質のＮ末端の上流に蛍光タンパク質（ｍＣｌｏｖｅｒ３）が結合した構造を有する。
また、これらの精製蛍光タンパク質融合２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を、単に「本発明の融合タンパク質」ともいう。
洗浄後、カラムに、５ｍＬのＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ イミダゾール）を加え、通液することで、「ＴＡＬＯＮ（商標） Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎ」に非特異的に結合しているタンパク質を洗浄した。
洗浄後、カラムに、５ｍＬのＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、３００ｍＭ イミダゾール）を加え、通液することで、蛍光タンパク質融合２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を溶出させた。
次いで、溶出液に含まれる高濃度のイミダゾールを除去するため、溶出液を透析チューブに加えた後、該チューブを、１ＬのＤｉａｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（５０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％ ＮＰ－４０、０．２％ Ｔｗｅｅｎ２０、２ｍＭ ＤＴＴ）に浸し、４℃で４時間透析した。その後、透析チューブを取り出し、新たな１ＬのＤｉａｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒに透析チューブを浸し、４℃で１６時間さらに透析した。透析サンプルを１．５ｍＬの遮光チューブに加え、－２０℃で保存した。また、透析サンプルの一部をＳＤＳ－ＰＡＧＥで解析し、目的のバンド（約３７ｋＤａ）を確認した。
得られた透析サンプルは、本発明の融合タンパク質（精製蛍光タンパク質融合２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質）に相当する。
以下、得られた４種類の精製蛍光タンパク質融合２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を、「Ｓｓｏ７ｄ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」、「ＡＴＳＶ７－ｍＣｌｏｖｅｒ３」、及び「Ｓｔｏ７－ｍＣｌｏｖｅｒ３」と称する。これらの融合タンパク質は、２本鎖結合タンパク質のＮ末端の上流に蛍光タンパク質（ｍＣｌｏｖｅｒ３）が結合した構造を有する。
また、これらの精製蛍光タンパク質融合２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を、単に「本発明の融合タンパク質」ともいう。
【0078】
＜試験３＞
以下の方法に基づき、２本鎖ＤＮＡへの、本発明の融合タンパク質の結合評価を行った。
以下の方法に基づき、２本鎖ＤＮＡへの、本発明の融合タンパク質の結合評価を行った。
【0079】
（１）試験管内実験での２本鎖ＤＮＡ結合評価
上記＜試験２＞で得られた、４種類の本発明の融合タンパク質「Ｓｓｏ７ｄ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」、「ＡＴＳＶ７－ｍＣｌｏｖｅｒ３」、及び「Ｓｔｏ７－ｍＣｌｏｖｅｒ３」について、２本鎖ＤＮＡへの結合をゲルシフトアッセイで評価した。
上記＜試験２＞で得られた、４種類の本発明の融合タンパク質「Ｓｓｏ７ｄ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」、「ＡＴＳＶ７－ｍＣｌｏｖｅｒ３」、及び「Ｓｔｏ７－ｍＣｌｏｖｅｒ３」について、２本鎖ＤＮＡへの結合をゲルシフトアッセイで評価した。
【0080】
アッセイの際には、反応溶液（１×ＢＳＡ Ｂｕｆｆｅｒ（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）、５ｎｇ／μＬ ２本鎖ＤＮＡ、２．５ｎｇ／μＬ 本発明の各融合タンパク質）を調製し、室温で３０分間インキュベートした。
また、ネガティブコントロールとして対照反応溶液（１×ＢＳＡ Ｂｕｆｆｅｒ（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）、５ｎｇ／μＬ ２本鎖ＤＮＡ）を調製し、室温で３０分間インキュベートした。
また、ネガティブコントロールとして対照反応溶液（１×ＢＳＡ Ｂｕｆｆｅｒ（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）、５ｎｇ／μＬ ２本鎖ＤＮＡ）を調製し、室温で３０分間インキュベートした。
【0081】
（２）結果
得られた反応産物を、１％アガロースゲルで電気泳動を実施した。
その結果、４種類の本発明の融合タンパク質それぞれを含む２本鎖ＤＮＡのバンドは、２本鎖ＤＮＡのみのバンドと比較して、バンドの位置が上に出現した。このことから、２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の２本鎖ＤＮＡへの結合によってゲルシフトが生じたことが示された。
上記の結果は、４種類の本発明の融合タンパク質は、２本鎖ＤＮＡへの結合活性を有することを意味する。特に、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」の２本鎖ＤＮＡへの結合によるバンドの移動度が高かったため、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」は２本鎖ＤＮＡへの結合親和性が特に高いことが示された。
得られた反応産物を、１％アガロースゲルで電気泳動を実施した。
その結果、４種類の本発明の融合タンパク質それぞれを含む２本鎖ＤＮＡのバンドは、２本鎖ＤＮＡのみのバンドと比較して、バンドの位置が上に出現した。このことから、２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の２本鎖ＤＮＡへの結合によってゲルシフトが生じたことが示された。
上記の結果は、４種類の本発明の融合タンパク質は、２本鎖ＤＮＡへの結合活性を有することを意味する。特に、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」の２本鎖ＤＮＡへの結合によるバンドの移動度が高かったため、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」は２本鎖ＤＮＡへの結合親和性が特に高いことが示された。
【0082】
＜試験４＞
以下の方法に基づき、本発明の融合タンパク質による２本鎖ＤＮＡの可視化を行った。
以下の方法に基づき、本発明の融合タンパク質による２本鎖ＤＮＡの可視化を行った。
【0083】
（１）ＤＮＡ伸長固定のための基板の作成
本試験における可視化機構は以下のとおりである。
ガラス基板表面に、蛍光標識したＤＮＡ溶液をスポットし、蛍光顕微鏡でイメージングをすると、溶液内でＤＮＡ分子がブラウン運動することで、ランダムなコンフォメーションをとる。このため、ＤＮＡ分子は光点としてしか観察されないため、ＤＮＡの全長鎖を把握できず、ＤＮＡに作用するタンパク質の位置情報や反応過程を捉えることが難しい（例えば、Ｍ． Ｏｓｈｉｇｅら， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ４００ （２０１０） １４５－１４７；Ｍ． Ｏｓｈｉｇｅら、Ｊ． Ｆｌｕｏｒｅｓｃ． ２１ （２０１１） １１８９－１１９４）。
そこで、本発明者は、ガラス基板をアミノシラン化することで、ガラス基板表面をプラスにチャージすることで、マイナスにチャージされているＤＮＡ分子を伸張させ、蛍光標識したＤＮＡ１分子のイメージングを行った。
本試験における可視化機構は以下のとおりである。
ガラス基板表面に、蛍光標識したＤＮＡ溶液をスポットし、蛍光顕微鏡でイメージングをすると、溶液内でＤＮＡ分子がブラウン運動することで、ランダムなコンフォメーションをとる。このため、ＤＮＡ分子は光点としてしか観察されないため、ＤＮＡの全長鎖を把握できず、ＤＮＡに作用するタンパク質の位置情報や反応過程を捉えることが難しい（例えば、Ｍ． Ｏｓｈｉｇｅら， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ４００ （２０１０） １４５－１４７；Ｍ． Ｏｓｈｉｇｅら、Ｊ． Ｆｌｕｏｒｅｓｃ． ２１ （２０１１） １１８９－１１９４）。
そこで、本発明者は、ガラス基板をアミノシラン化することで、ガラス基板表面をプラスにチャージすることで、マイナスにチャージされているＤＮＡ分子を伸張させ、蛍光標識したＤＮＡ１分子のイメージングを行った。
【0084】
分子コーミング法に基づき、ＤＮＡ伸長固定のためのアミノシラン化ガラス基板を作製した。
まず、スライドガラス（松浪硝子社製）をガラスケースに入れた後、スライドガラスを１％（Ｖ／Ｖ）コンタミノンＵＳに浸漬し、５０℃で３０分間超音波洗浄を実施した。
次いで、スライドガラスをエタノールと脱イオン蒸留水で２回繰り返して洗浄した後、３０％の過酸化水素に浸漬し、４℃で１６時間程度インキュベートした。
インキュベート後、エタノールを溶媒とした２％（Ｖ／Ｖ）の３－ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ溶液（ナカライテスク社製）にスライドガラスを浸漬し、室温で１時間程度インキュベートした。
その後、アミノシラン化スライドガラスをエタノールで洗浄し、１００℃で２時間以上ベークし、アミノシラン化ガラス基板を得た。
まず、スライドガラス（松浪硝子社製）をガラスケースに入れた後、スライドガラスを１％（Ｖ／Ｖ）コンタミノンＵＳに浸漬し、５０℃で３０分間超音波洗浄を実施した。
次いで、スライドガラスをエタノールと脱イオン蒸留水で２回繰り返して洗浄した後、３０％の過酸化水素に浸漬し、４℃で１６時間程度インキュベートした。
インキュベート後、エタノールを溶媒とした２％（Ｖ／Ｖ）の３－ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ溶液（ナカライテスク社製）にスライドガラスを浸漬し、室温で１時間程度インキュベートした。
その後、アミノシラン化スライドガラスをエタノールで洗浄し、１００℃で２時間以上ベークし、アミノシラン化ガラス基板を得た。
【0085】
（２）本発明の融合タンパク質による２本鎖ＤＮＡの可視化
４種類の本発明の融合タンパク質を用いて、２本鎖ＤＮＡであるλＤＮＡ（４８，５０２ｂｐ）を可視化するため、反応溶液（１×ＢＳＡ Ｂｕｆｆｅｒ（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）、０．２５ｎｇ／μＬ λＤＮＡ、０．５ｎｇ／μＬ 本発明の各融合タンパク質）を調製し、室温で３０分間インキュベートした。
また、コントロールとして対照反応溶液（１×ＢＳＡ Ｂｕｆｆｅｒ（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）、０．２５ｎｇ／μＬ λＤＮＡ、１００ｎＭ ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製））を調製し、室温で３０分間インキュベートした。
その後、得られた調製溶液をアミノシラン処理ガラス基板に垂らし、液滴移動によりλＤＮＡを伸長固定した。
次いで、コアユニット顕微鏡（シグマ光機社製）、青色ＬＥＤ蛍光ユニット（ＯｐｔｏＳｉｇｍａ社製）、及び１００ｘ１．３開口数（ＮＡ）油浸対物レンズ（オリンパス社製）を用いて、青色励起のＬＥＤの一定光量条件下（ＬＥＤライト用のコントロールユニット（ＣＳＳ社製）を使用して、高レンジ調光レベル２の条件下）で蛍光標識ＤＮＡを直接観察した。蛍光画像は、ＣＳ－６７Ｍ高感度冷却カメラ（ビットラン社製）を用いて取得した。このとき、励起波長及び発光波長は、４８８ｎｍフィルターセット（青色励起光、ＥＸ４４８－６３、ＤＭ４９４、及びＥＭ５２６－５２；ＯｐｔｏＳｉｇｍａ社製）を選択した。
４種類の本発明の融合タンパク質を用いて、２本鎖ＤＮＡであるλＤＮＡ（４８，５０２ｂｐ）を可視化するため、反応溶液（１×ＢＳＡ Ｂｕｆｆｅｒ（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）、０．２５ｎｇ／μＬ λＤＮＡ、０．５ｎｇ／μＬ 本発明の各融合タンパク質）を調製し、室温で３０分間インキュベートした。
また、コントロールとして対照反応溶液（１×ＢＳＡ Ｂｕｆｆｅｒ（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）、０．２５ｎｇ／μＬ λＤＮＡ、１００ｎＭ ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製））を調製し、室温で３０分間インキュベートした。
その後、得られた調製溶液をアミノシラン処理ガラス基板に垂らし、液滴移動によりλＤＮＡを伸長固定した。
次いで、コアユニット顕微鏡（シグマ光機社製）、青色ＬＥＤ蛍光ユニット（ＯｐｔｏＳｉｇｍａ社製）、及び１００ｘ１．３開口数（ＮＡ）油浸対物レンズ（オリンパス社製）を用いて、青色励起のＬＥＤの一定光量条件下（ＬＥＤライト用のコントロールユニット（ＣＳＳ社製）を使用して、高レンジ調光レベル２の条件下）で蛍光標識ＤＮＡを直接観察した。蛍光画像は、ＣＳ－６７Ｍ高感度冷却カメラ（ビットラン社製）を用いて取得した。このとき、励起波長及び発光波長は、４８８ｎｍフィルターセット（青色励起光、ＥＸ４４８－６３、ＤＭ４９４、及びＥＭ５２６－５２；ＯｐｔｏＳｉｇｍａ社製）を選択した。
【0086】
（３）結果
画像解析の結果、本発明の各融合タンパク質とλＤＮＡとの複合体のそれぞれが、伸長状態で直接観察された。すなわち、本発明の各融合タンパク質とλＤＮＡとの結合によって、蛍光観察が可能であることがわかった。
画像解析の結果、本発明の各融合タンパク質とλＤＮＡとの複合体のそれぞれが、伸長状態で直接観察された。すなわち、本発明の各融合タンパク質とλＤＮＡとの結合によって、蛍光観察が可能であることがわかった。
【0087】
また、本発明の各融合タンパク質とλＤＮＡとの複合体、及び、核酸染色試薬（ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ）で標識したλＤＮＡのそれぞれにおける、蛍光退色時間（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｃａｙ ｔｉｍｅ、単位：秒）を図１に示す。図中、蛍光退色時間が長いほど、退色するまでの時間が長かったことを意味する。
【0088】
図１に示されるとおり、本発明の各融合タンパク質とλＤＮＡとの複合体「Ｓｓｏ７ｄ－ｍＣｌｏｖｅｒ３－λＤＮＡ複合体」、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３－λＤＮＡ複合体」、「ＡＴＳＶ７－ｍＣｌｏｖｅｒ３－λＤＮＡ複合体」、「Ｓｔｏ７－ｍＣｌｏｖｅｒ３－λＤＮＡ複合体」は、それぞれ、１５３秒、３２２秒、１０７秒、１６１秒程度で退色した。
これに対し、コントロールとして用いた、核酸染色試薬（ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ）で標識したλＤＮＡは、４８秒程度で蛍光が退色した。
したがって、本発明の各融合タンパク質による２本鎖ＤＮＡの蛍光退色時間は、核酸染色試薬で染色した２本鎖ＤＮＡの蛍光退色時間よりも非常に遅いことが示された。
これに対し、コントロールとして用いた、核酸染色試薬（ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ）で標識したλＤＮＡは、４８秒程度で蛍光が退色した。
したがって、本発明の各融合タンパク質による２本鎖ＤＮＡの蛍光退色時間は、核酸染色試薬で染色した２本鎖ＤＮＡの蛍光退色時間よりも非常に遅いことが示された。
【0089】
また、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」は、上記＜試験３＞でも示されたとおり、２本鎖ＤＮＡとの結合親和性が特に高く、その他の融合タンパク質を用いた場合よりも、蛍光退色時間が２倍以上長かった。
このことから、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」は、長時間のＤＮＡの蛍光を捉えることが可能な蛍光標識剤として有用であることが示された。
このことから、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」は、長時間のＤＮＡの蛍光を捉えることが可能な蛍光標識剤として有用であることが示された。
【0090】
＜試験５－１＞
以下の方法に基づき、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」と２本鎖ＤＮＡとの結合に対する塩による影響を、試験管内実験において検討した。
なお、以下、塩としては塩化ナトリウムを用いた。
以下の方法に基づき、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」と２本鎖ＤＮＡとの結合に対する塩による影響を、試験管内実験において検討した。
なお、以下、塩としては塩化ナトリウムを用いた。
【0091】
（１）２本鎖ＤＮＡとの結合に対する塩による影響の評価
塩（塩化ナトリウム等）を含む水溶液は、ＤＮＡ－タンパク質間の静電的な相互作用を遮蔽することにより、ＤＮＡからタンパク質を脱離させることができる。そのため、ＤＮＡへのタンパク質の結合の性質は、塩を含む緩衝液を用いることによって評価することができる。
そこで、本発明者は、本発明の融合タンパク質のうち、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」について、２本鎖ＤＮＡとの結合に対する塩による影響をゲルシフトアッセイで評価した。
塩（塩化ナトリウム等）を含む水溶液は、ＤＮＡ－タンパク質間の静電的な相互作用を遮蔽することにより、ＤＮＡからタンパク質を脱離させることができる。そのため、ＤＮＡへのタンパク質の結合の性質は、塩を含む緩衝液を用いることによって評価することができる。
そこで、本発明者は、本発明の融合タンパク質のうち、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」について、２本鎖ＤＮＡとの結合に対する塩による影響をゲルシフトアッセイで評価した。
【0092】
アッセイの際には、異なる塩濃度（０、１００、２００、３００、４００、又は５００ｍＭ）の緩衝液（１×ＢＳＡ Ｂｕｆｆｅｒ、５ｎｇ／μＬ ２本鎖ＤＮＡ、２．５ｎｇ／μＬ Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３）で、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」と２本鎖ＤＮＡとの複合体を形成させ、室温で３０分間インキュベートした。
その後、得られた反応産物を１％アガロースゲルで電気泳動した。
その後、得られた反応産物を１％アガロースゲルで電気泳動した。
【0093】
（２）結果
０、１００、又は２００ｍＭの塩濃度では、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」の２本鎖ＤＮＡへの結合によって、ＤＮＡのバンドの位置が上にシフトすることが示された。
このことは、２００ｍＭ程度までの塩濃度では、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」の２本鎖ＤＮＡへの結合が維持されたことを意味する。
０、１００、又は２００ｍＭの塩濃度では、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」の２本鎖ＤＮＡへの結合によって、ＤＮＡのバンドの位置が上にシフトすることが示された。
このことは、２００ｍＭ程度までの塩濃度では、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」の２本鎖ＤＮＡへの結合が維持されたことを意味する。
【0094】
他方で、３００ｍＭ以上の塩濃度では、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」の２本鎖ＤＮＡへの結合によって生じたＤＮＡバンドのシフトが解消された。
このことは、３００ｍＭ以上の塩濃度では、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」と２本鎖ＤＮＡとの結合が塩によって遮蔽され、２本鎖ＤＮＡから「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」が脱離したことを意味する。
このことは、３００ｍＭ以上の塩濃度では、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」と２本鎖ＤＮＡとの結合が塩によって遮蔽され、２本鎖ＤＮＡから「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」が脱離したことを意味する。
【0095】
以上の結果から、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」は、２本鎖ＤＮＡに対して、静電気相互作用に基づき結合していることが示された。
【0096】
＜試験５－２＞
上記＜試験５－１＞の結果、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」の２本鎖ＤＮＡへの結合は、塩濃度が３００ｍＭ以上である場合に、相互作用が遮蔽され、２本鎖ＤＮＡからタンパク質が解離することが示された。
しかしながら、試験管内実験の結果は、多分子の挙動の平均値の情報しか反映しておらず、個々の分子の揺らぎの影響を解析することはできない。
そこで、以下の方法に基づき、個々の分子の平均値からの揺らぎの影響を解析した。
上記＜試験５－１＞の結果、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」の２本鎖ＤＮＡへの結合は、塩濃度が３００ｍＭ以上である場合に、相互作用が遮蔽され、２本鎖ＤＮＡからタンパク質が解離することが示された。
しかしながら、試験管内実験の結果は、多分子の挙動の平均値の情報しか反映しておらず、個々の分子の揺らぎの影響を解析することはできない。
そこで、以下の方法に基づき、個々の分子の平均値からの揺らぎの影響を解析した。
【0097】
（１）１分子イメージングでの複合体の塩による影響の評価
異なる塩濃度（０、２５、５０、１００、２００、又は３００ｍＭ）の塩濃度を含む緩衝液（１×ＢＳＡ Ｂｕｆｆｅｒ、５ｎｇ／μＬ λＤＮＡ、２．５ｎｇ／μＬ Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３）で、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」とλＤＮＡとの複合体を形成させ、室温で３０分間インキュベートした。
その後、得られた調製溶液を、アミノシラン処理ガラス基板に垂らし、液滴移動により、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３－λＤＮＡ複合体」を伸長固定した。
次いで、コアユニット顕微鏡（シグマ光機社製）、青色ＬＥＤ蛍光ユニット（ＯｐｔｏＳｉｇｍａ社製）、及び１００ｘ１．３開口数（ＮＡ）油浸対物レンズ（オリンパス社製）を用いて、青色励起のＬＥＤの一定光量条件下（ＬＥＤライト用のコントロールユニット（ＣＳＳ社製）を使用して、高レンジ調光レベル２の条件下）で蛍光標識ＤＮＡを直接観察した。蛍光画像は、ＣＳ－６７Ｍ高感度冷却カメラ（ビットラン社製）を用いて取得した。このとき、励起波長及び発光波長は、４８８ｎｍフィルターセット（青色励起光、ＥＸ４４８－６３、ＤＭ４９４、及びＥＭ５２６－５２；ＯｐｔｏＳｉｇｍａ社製）を選択した。
異なる塩濃度（０、２５、５０、１００、２００、又は３００ｍＭ）の塩濃度を含む緩衝液（１×ＢＳＡ Ｂｕｆｆｅｒ、５ｎｇ／μＬ λＤＮＡ、２．５ｎｇ／μＬ Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３）で、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」とλＤＮＡとの複合体を形成させ、室温で３０分間インキュベートした。
その後、得られた調製溶液を、アミノシラン処理ガラス基板に垂らし、液滴移動により、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３－λＤＮＡ複合体」を伸長固定した。
次いで、コアユニット顕微鏡（シグマ光機社製）、青色ＬＥＤ蛍光ユニット（ＯｐｔｏＳｉｇｍａ社製）、及び１００ｘ１．３開口数（ＮＡ）油浸対物レンズ（オリンパス社製）を用いて、青色励起のＬＥＤの一定光量条件下（ＬＥＤライト用のコントロールユニット（ＣＳＳ社製）を使用して、高レンジ調光レベル２の条件下）で蛍光標識ＤＮＡを直接観察した。蛍光画像は、ＣＳ－６７Ｍ高感度冷却カメラ（ビットラン社製）を用いて取得した。このとき、励起波長及び発光波長は、４８８ｎｍフィルターセット（青色励起光、ＥＸ４４８－６３、ＤＭ４９４、及びＥＭ５２６－５２；ＯｐｔｏＳｉｇｍａ社製）を選択した。
【0098】
（２）結果
２５ｍＭの塩濃度では、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３－λＤＮＡ複合体」は、伸長状態で観察されたが、そのＤＮＡの全長は、塩含まない緩衝液での「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３－λＤＮＡ複合体」の全長よりも３倍程度短くなった。
このことは、塩によって、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」が２本鎖ＤＮＡを凝集させたことを意味する。
２５ｍＭの塩濃度では、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３－λＤＮＡ複合体」は、伸長状態で観察されたが、そのＤＮＡの全長は、塩含まない緩衝液での「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３－λＤＮＡ複合体」の全長よりも３倍程度短くなった。
このことは、塩によって、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」が２本鎖ＤＮＡを凝集させたことを意味する。
【0099】
５０、１００、２００、又は３００ｍＭの塩濃度では、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３－λＤＮＡ複合体」は光点としてのみ観察された。また、緩衝液の塩濃度の増加にともない、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３－λＤＮＡ複合体」の光点の数が減少した。
このことは、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」のλＤＮＡへの結合が、塩による遮蔽効果によって妨げられたため、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」がλＤＮＡから解離したことを意味する。
このことは、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」のλＤＮＡへの結合が、塩による遮蔽効果によって妨げられたため、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」がλＤＮＡから解離したことを意味する。
【0100】
以上から、５０ｍＭ以上の塩濃度では、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３－λＤＮＡ複合体」が凝集し、光点として観察されることがわかった。
そこで、塩濃度が１００ｍＭである緩衝液で、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」とλＤＮＡとの複合体を形成させた後、その一部の溶液を、塩を含まない緩衝液に加えた場合における、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３－λＤＮＡ複合体」のＤＮＡ形態を評価した。
その結果、１００ｍＭの塩濃度では、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３－λＤＮＡ複合体」は光点としてしか観察されなかったが、複合体を形成させた後の一部の溶液を、塩を含まない緩衝液に加えた場合においては、伸長状態の「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３－λＤＮＡ複合体」が観察された（図２）。
このことから、塩濃度の変化によって、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３－λＤＮＡ複合体」の形態が、伸張状態から凝集状態に変化することが示された。
そこで、塩濃度が１００ｍＭである緩衝液で、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」とλＤＮＡとの複合体を形成させた後、その一部の溶液を、塩を含まない緩衝液に加えた場合における、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３－λＤＮＡ複合体」のＤＮＡ形態を評価した。
その結果、１００ｍＭの塩濃度では、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３－λＤＮＡ複合体」は光点としてしか観察されなかったが、複合体を形成させた後の一部の溶液を、塩を含まない緩衝液に加えた場合においては、伸長状態の「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３－λＤＮＡ複合体」が観察された（図２）。
このことから、塩濃度の変化によって、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３－λＤＮＡ複合体」の形態が、伸張状態から凝集状態に変化することが示された。
【0101】
＜試験６＞
以下の方法に基づき、本発明の各融合タンパク質とλＤＮＡとの複合体を基質とした、生化学的試験を行った。
このような試験において生化学的反応の有無を確認することで、本発明の各融合タンパク質が、ＤＮＡの蛍光標識剤として、ＤＮＡに働くタンパク質の動態挙動や、ＤＮＡ複製等のＤＮＡ代謝を阻害するのか、あるいは、阻害せずに、その反応過程を捉えることができるかどうかがわかる。
以下の方法に基づき、本発明の各融合タンパク質とλＤＮＡとの複合体を基質とした、生化学的試験を行った。
このような試験において生化学的反応の有無を確認することで、本発明の各融合タンパク質が、ＤＮＡの蛍光標識剤として、ＤＮＡに働くタンパク質の動態挙動や、ＤＮＡ複製等のＤＮＡ代謝を阻害するのか、あるいは、阻害せずに、その反応過程を捉えることができるかどうかがわかる。
【0102】
（１）生化学的試験
本例では、誌試験管内実験を行い、本発明の各融合タンパク質が結合した２本鎖ＤＮＡと基質とした、ＤＮＡ分解酵素（Ｔ７ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）によるＤＮＡの分解を評価した。
本例では、誌試験管内実験を行い、本発明の各融合タンパク質が結合した２本鎖ＤＮＡと基質とした、ＤＮＡ分解酵素（Ｔ７ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）によるＤＮＡの分解を評価した。
【0103】
Ｔ７ ＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅによるＤＮＡ分解反応を評価するために、反応溶液（１×ＮＥ Ｂｕｆｆｅｒ４（ニューイングランドバイオラボ社製）、５ｎｇ／μＬ ２本鎖ＤＮＡ、２．５ｎｇ／μＬ 本発明の各融合タンパク質）を調製し、室温で３０分間インキュベートした。
また、ネガティブコントロールとして対照反応溶液（１×ＮＥ Ｂｕｆｆｅｒ、４．５ｎｇ／μＬ ２本鎖ＤＮＡ）を調製し、室温で３０分間インキュベートした。
その後、得られた反応溶液に、０．１ｕｎｉｔｓ／μＬ（最終濃度）Ｔ７ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅを加え、２５℃で３０分間インキュベートした。
得られた反応産物を１％アガロースゲルで電気泳動した。
また、ネガティブコントロールとして対照反応溶液（１×ＮＥ Ｂｕｆｆｅｒ、４．５ｎｇ／μＬ ２本鎖ＤＮＡ）を調製し、室温で３０分間インキュベートした。
その後、得られた反応溶液に、０．１ｕｎｉｔｓ／μＬ（最終濃度）Ｔ７ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅを加え、２５℃で３０分間インキュベートした。
得られた反応産物を１％アガロースゲルで電気泳動した。
【0104】
（２）結果
Ｔ７ ＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅによるＤＮＡ分解活性によって、「Ｓｓｏ７ｄ－ｍＣｌｏｖｅｒ３－λＤＮＡ複合体」、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３－λＤＮＡ複合体」、「ＡＴＳＶ７－ｍＣｌｏｖｅｒ３－λＤＮＡ複合体」、「Ｓｔｏ７－ｍＣｌｏｖｅｒ３－λＤＮＡ複合体」におけるＤＮＡが分解することが確認された。
他方で、Ｔ７ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ非存在下では、ＤＮＡは分解されず、これらの複合体は維持された。
これらの結果から、本発明の各融合タンパク質は、ＤＮＡ複製を始めとするＤＮＡ代謝を阻害せずに、ＤＮＡを蛍光標識できることがわかった。このことは、ＤＮＡ－タンパク質間相互作用（転写やＤＮＡ複製等）を阻害する核酸染色試薬等の蛍光化合物と比較して、本発明の各融合タンパク質が、生体反応を阻害しにくいことを示唆する。
Ｔ７ ＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅによるＤＮＡ分解活性によって、「Ｓｓｏ７ｄ－ｍＣｌｏｖｅｒ３－λＤＮＡ複合体」、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３－λＤＮＡ複合体」、「ＡＴＳＶ７－ｍＣｌｏｖｅｒ３－λＤＮＡ複合体」、「Ｓｔｏ７－ｍＣｌｏｖｅｒ３－λＤＮＡ複合体」におけるＤＮＡが分解することが確認された。
他方で、Ｔ７ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ非存在下では、ＤＮＡは分解されず、これらの複合体は維持された。
これらの結果から、本発明の各融合タンパク質は、ＤＮＡ複製を始めとするＤＮＡ代謝を阻害せずに、ＤＮＡを蛍光標識できることがわかった。このことは、ＤＮＡ－タンパク質間相互作用（転写やＤＮＡ複製等）を阻害する核酸染色試薬等の蛍光化合物と比較して、本発明の各融合タンパク質が、生体反応を阻害しにくいことを示唆する。
【0105】
＜試験７＞
上記の試験から、本発明の融合タンパク質のうち、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」は、２本鎖ＤＮＡへの蛍光標識において特に有効であることが示された。
そこで、本例では、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」が結合した２本鎖ＤＮＡの動態挙動を分析した。このような挙動を捉えることができれば、ＤＮＡ複製を始めとするＤＮＡ代謝過程の蛍光イメージングが可能となる。
上記の試験から、本発明の融合タンパク質のうち、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」は、２本鎖ＤＮＡへの蛍光標識において特に有効であることが示された。
そこで、本例では、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」が結合した２本鎖ＤＮＡの動態挙動を分析した。このような挙動を捉えることができれば、ＤＮＡ複製を始めとするＤＮＡ代謝過程の蛍光イメージングが可能となる。
【0106】
（１）動的挙動解析
１分子イメージングは、試験管内実験では覆い隠されて解析することができない対象（例えば、ＤＮＡに作用するタンパク質の動態挙動、ＤＮＡ複製等のＤＮＡ代謝の反応過程）の解析に有効である。
本例では、微細流路装置を用いて、１分子イメージングによる、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３－λＤＮＡ複合体」の動態挙動を評価した。
１分子イメージングは、試験管内実験では覆い隠されて解析することができない対象（例えば、ＤＮＡに作用するタンパク質の動態挙動、ＤＮＡ複製等のＤＮＡ代謝の反応過程）の解析に有効である。
本例では、微細流路装置を用いて、１分子イメージングによる、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３－λＤＮＡ複合体」の動態挙動を評価した。
【0107】
微細流路内でのガラス基板を作製するために、清浄なスライドガラスにポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）流路（ヨダカ技研社製）を貼り付けた後、マイクロシリンジポンプ（ＫＤＳ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、３３ｎＭ Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎを含む、１×ＢＳＡ ｂｕｆｆｅｒをマイクロ流路に注入した。
注入後、マイクロシリンジポンプを用いて、リポソームＢｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ）をマイクロ流路に注入した。
その後、マイクロシリンジポンプを用いて、０．４ｍｇ／ｍＬのＤＯＰＣ（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）リポソーム（ＴＣＩ社製）をマイクロ流路に注入した。次いで、マイクロシリンジポンプを用いて、リポソームＢｕｆｆｅｒをマイクロ流路に注入した。
注入後、λＤＮＡの片末端にビオチン修飾した、０．０１ｎｇのビオチン化λＤＮＡを含む、１×ＢＳＡ ｂｕｆｆｅｒをマイクロ流路に注入することで、基板表面にビオチン化λＤＮＡを固定化させた。
固定化後、２０ｎＭの「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」を含む、１×ＢＳＡ ｂｕｆｆｅｒをマイクロ流路に注入することで、ビオチン化λＤＮＡに「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」を結合させた。
余剰の蛍光を取り除くため、１×ＢＳＡ ｂｕｆｆｅｒをマイクロ流路に注入することで、基板を洗浄した。
注入後、マイクロシリンジポンプを用いて、リポソームＢｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ）をマイクロ流路に注入した。
その後、マイクロシリンジポンプを用いて、０．４ｍｇ／ｍＬのＤＯＰＣ（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）リポソーム（ＴＣＩ社製）をマイクロ流路に注入した。次いで、マイクロシリンジポンプを用いて、リポソームＢｕｆｆｅｒをマイクロ流路に注入した。
注入後、λＤＮＡの片末端にビオチン修飾した、０．０１ｎｇのビオチン化λＤＮＡを含む、１×ＢＳＡ ｂｕｆｆｅｒをマイクロ流路に注入することで、基板表面にビオチン化λＤＮＡを固定化させた。
固定化後、２０ｎＭの「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」を含む、１×ＢＳＡ ｂｕｆｆｅｒをマイクロ流路に注入することで、ビオチン化λＤＮＡに「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」を結合させた。
余剰の蛍光を取り除くため、１×ＢＳＡ ｂｕｆｆｅｒをマイクロ流路に注入することで、基板を洗浄した。
【0108】
コアユニット顕微鏡（シグマ光機社製）、青色ＬＥＤ蛍光ユニット（ＯｐｔｏＳｉｇｍａ社製）、及び１００ｘ１．３開口数（ＮＡ）油浸対物レンズ（オリンパス社製）を用いて、青色励起のＬＥＤの一定光量条件下（ＬＥＤライト用のコントロールユニット（ＣＳＳ社製）を使用して、高レンジ調光レベル２の条件下）で蛍光標識ＤＮＡを直接観察した。蛍光画像は、ＣＳ－６７Ｍ高感度冷却カメラ（ビットラン社製）を用いて取得した。このとき、励起波長及び発光波長は、４８８ｎｍフィルターセット（青色励起光、ＥＸ４４８－６３、ＤＭ４９４、及びＥＭ５２６－５２；ＯｐｔｏＳｉｇｍａ社製）を選択した。
【0109】
（２）結果
「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３－λＤＮＡ複合体」は、流路内の溶液流れがある状態では伸長状態を維持し、溶液流れがない状態ではランダムコイル状態へと変化した。
このような挙動は、核酸染色試薬で標識したλＤＮＡの動的挙動と同様であることから、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」がＤＮＡの１分子蛍光イメージングにおいて有用であることが示された。
「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３－λＤＮＡ複合体」は、流路内の溶液流れがある状態では伸長状態を維持し、溶液流れがない状態ではランダムコイル状態へと変化した。
このような挙動は、核酸染色試薬で標識したλＤＮＡの動的挙動と同様であることから、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」がＤＮＡの１分子蛍光イメージングにおいて有用であることが示された。
【0110】
＜試験８＞
以下の方法に基づき、フローサイトメトリーによる「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」の細胞内核染色の解析を行った。
以下の方法に基づき、フローサイトメトリーによる「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」の細胞内核染色の解析を行った。
【0111】
（１）フローサイトメトリー
１０％ウシ胎児血清（ニチレイ社製）、及び７５ｍｇ／ｌ 硫酸カナマイシン（富士フイルム和光純薬社製）を添加した「ＲＰＭＩ－１６４０培地」（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を使用し、ヒト白血病Ｔ細胞株Ｊｕｒｋａｔ細胞の培養を行った。
培養は、９５％のエアー、５％のＣＯ２の条件下で、３７℃のインキュベーター（ＥＳＰＥＣ Ｏｓａｋａ Ｊａｐａｎ社製）で行った。
培養後、細胞（１×１０６）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、透過性緩衝液（０．１％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ １００を含むＰＢＳ緩衝液）に懸濁した。
１０％ウシ胎児血清（ニチレイ社製）、及び７５ｍｇ／ｌ 硫酸カナマイシン（富士フイルム和光純薬社製）を添加した「ＲＰＭＩ－１６４０培地」（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を使用し、ヒト白血病Ｔ細胞株Ｊｕｒｋａｔ細胞の培養を行った。
培養は、９５％のエアー、５％のＣＯ２の条件下で、３７℃のインキュベーター（ＥＳＰＥＣ Ｏｓａｋａ Ｊａｐａｎ社製）で行った。
培養後、細胞（１×１０６）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、透過性緩衝液（０．１％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ １００を含むＰＢＳ緩衝液）に懸濁した。
【0112】
細胞内の核を染色するため、以下のいずれかを添加した。
・１ｎｇ／μＬの「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」、及び０．５ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅＡを含む溶液
・２μｇ／ｍＬ ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（富士フイルム和光純薬社製）、及び０．５ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅＡを含む溶液
・０．５ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅＡのみを含む溶液
・１ｎｇ／μＬの「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」、及び０．５ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅＡを含む溶液
・２μｇ／ｍＬ ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（富士フイルム和光純薬社製）、及び０．５ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅＡを含む溶液
・０．５ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅＡのみを含む溶液
【0113】
各細胞について、フローサイトメトリー（ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ； Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）による解析を行った。
得られたデータは「Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ」（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を使用して解析した。
得られたデータは「Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ」（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を使用して解析した。
【0114】
（２）結果
フローサイトメトリーによる解析結果を図３に示す。
図３に示されるとおり、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」によって細胞内の核が蛍光標識されたことで、細胞内のＤＮＡ含有量の評価が可能であることが示された。
以上から、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」は、細胞内の核染色として使用できるだけでなく、細胞内ＤＮＡ含有量評価に適用できることが示された。
フローサイトメトリーによる解析結果を図３に示す。
図３に示されるとおり、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」によって細胞内の核が蛍光標識されたことで、細胞内のＤＮＡ含有量の評価が可能であることが示された。
以上から、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」は、細胞内の核染色として使用できるだけでなく、細胞内ＤＮＡ含有量評価に適用できることが示された。
【0115】
特に、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」により蛍光標識された細胞内ＤＮＡ含有量を示すヒストグラムは、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ、細胞内ＤＮＡ含有量評価において一般的に使用される核酸染色試薬）により染色された細胞内ＤＮＡ含有量を示すヒストグラムとほぼ同様であった。
ただし、ＰＩで染色した細胞内ＤＮＡ含有量を示すヒストグラムでは、細胞周期のＭ期を示すピークが検出されたが、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」で蛍光標識した細胞内ＤＮＡ含有量を示すヒストグラムでは、細胞周期のＭ期を示すピークはほとんど検出されなかった。
このことは、細胞周期のＭ期において、細胞内の核で染色体凝縮が起こり、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」が裸のＤＮＡにアクセスすることができなかったことによると推察される。すなわち、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」は、細胞周期のＭ期の生化学的解析においても利用し得る。
ただし、ＰＩで染色した細胞内ＤＮＡ含有量を示すヒストグラムでは、細胞周期のＭ期を示すピークが検出されたが、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」で蛍光標識した細胞内ＤＮＡ含有量を示すヒストグラムでは、細胞周期のＭ期を示すピークはほとんど検出されなかった。
このことは、細胞周期のＭ期において、細胞内の核で染色体凝縮が起こり、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」が裸のＤＮＡにアクセスすることができなかったことによると推察される。すなわち、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」は、細胞周期のＭ期の生化学的解析においても利用し得る。
【0116】
また、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」で染色された細胞と、ＰＩで染色された細胞とは、細胞内状態が異なっていた。
具体的には、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」で染色された細胞の細胞内状態は、無染色の細胞内状態と同様であったのに対し、ＰＩで染色された細胞の細胞内状態は、無染色の細胞内状態とは異なっていた。
このことから、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」は、細胞内の核内環境を維持しつつ、ＤＮＡの標識が可能であることが示唆された。
具体的には、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」で染色された細胞の細胞内状態は、無染色の細胞内状態と同様であったのに対し、ＰＩで染色された細胞の細胞内状態は、無染色の細胞内状態とは異なっていた。
このことから、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」は、細胞内の核内環境を維持しつつ、ＤＮＡの標識が可能であることが示唆された。
【0117】
＜試験９＞
以下の方法に基づき、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」による細胞内核染色を、共焦点顕微鏡で直接観察した。
以下の方法に基づき、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」による細胞内核染色を、共焦点顕微鏡で直接観察した。
【0118】
（１）共焦点顕微鏡による細胞内核染色の直接観察
１０％ウシ胎児血清（ニチレイ社製）、及び７５ｍｇ／ｌ 硫酸カナマイシン（富士フイルム和光純薬社製）を添加した「ＲＰＭＩ－１６４０培地」（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を使用し、ヒト肝癌由来細胞株ＨｅｐＧ２細胞の培養を行った。
培養は、９５％のエアー、５％のＣＯ２の条件下で、３７℃のインキュベーター（ＥＳＰＥＣ Ｏｓａｋａ Ｊａｐａｎ社製）で行った。
培養後、細胞（約１×１０６個）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で、０．２５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに希釈し、ガラスボトムディッシュ（松浪硝子工業株式会社製）に３．０ｍＬずつ播種した。
ガラスボトムディッシュ中の培養細胞を７２時間さらにインキュベートした後、細胞培養液をアスピレートし、ＰＢＳで２回洗浄し、「非固定化細胞（生細胞）」を得た。
次いで、得られた非固定化細胞を、１．０ｍＬの４％パラホルムアルデヒドに浸し、４℃で１５分間静置して固定した、その後、固定化細胞をＰＢＳで３回洗浄した。洗浄後の細胞は、「固定化細胞」に相当する。
１０％ウシ胎児血清（ニチレイ社製）、及び７５ｍｇ／ｌ 硫酸カナマイシン（富士フイルム和光純薬社製）を添加した「ＲＰＭＩ－１６４０培地」（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を使用し、ヒト肝癌由来細胞株ＨｅｐＧ２細胞の培養を行った。
培養は、９５％のエアー、５％のＣＯ２の条件下で、３７℃のインキュベーター（ＥＳＰＥＣ Ｏｓａｋａ Ｊａｐａｎ社製）で行った。
培養後、細胞（約１×１０６個）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で、０．２５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに希釈し、ガラスボトムディッシュ（松浪硝子工業株式会社製）に３．０ｍＬずつ播種した。
ガラスボトムディッシュ中の培養細胞を７２時間さらにインキュベートした後、細胞培養液をアスピレートし、ＰＢＳで２回洗浄し、「非固定化細胞（生細胞）」を得た。
次いで、得られた非固定化細胞を、１．０ｍＬの４％パラホルムアルデヒドに浸し、４℃で１５分間静置して固定した、その後、固定化細胞をＰＢＳで３回洗浄した。洗浄後の細胞は、「固定化細胞」に相当する。
【0119】
固定化細胞内、及び非固定化細胞（生細胞）内の核を染色するため、以下のいずれかを添加した。
（染色液－１）１μｇの「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」、及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（富士フイルム和光純薬）を含む溶液
（染色液－２）２５μｇのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（富士フイルム和光純薬社製）、及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を含む溶液
（対照染色液）ＰＢＳ、及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００溶液を含む溶液
（染色液－１）１μｇの「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」、及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（富士フイルム和光純薬）を含む溶液
（染色液－２）２５μｇのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（富士フイルム和光純薬社製）、及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を含む溶液
（対照染色液）ＰＢＳ、及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００溶液を含む溶液
【0120】
各細胞について、共焦点顕微鏡（「共焦点レーザ走査型顕微鏡ＦＶ１０ｉ ＦＬＵＯＶＩＥＷ」、オリンパス社製）による直接観察を行った。
観察時の励起光の波長は、４７３ｎｍ（「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」の励起レーザー波長）、又は、５５９ｎｍ（ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の励起レーザー波長）に設定した。
得られたデータはＩｍａｇｅ Ｊ （アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）製）で解析した。
観察時の励起光の波長は、４７３ｎｍ（「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」の励起レーザー波長）、又は、５５９ｎｍ（ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の励起レーザー波長）に設定した。
得られたデータはＩｍａｇｅ Ｊ （アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）製）で解析した。
【0121】
【0122】
各図において、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」は、「染色液－１」で染色された細胞の観察結果である。「ＰＩ」は、「染色液－２」で染色された細胞の観察結果である。「Ｎｏｎ－ｄｙｅ」は、「染色液－３」で染色された細胞の観察結果である。
また、各図において、「Ｐｈａｓｅ ｃｏｎｔｒａｓｔ」は明視野像である。「４７３ｎｍ」は、４７３ｎｍの励起光を照射した際の観察結果である。「５５９ｎｍ」は、５５９ｎｍの励起光を照射した際の観察結果である。「Ｍｅｒｇｅｄ」は、「Ｐｈａｓｅ ｃｏｎｔｒａｓｔ」、「４７３ｎｍ」及び「５５９ｎｍ」の各画像を重ね合わせたものである。
また、各図において、「Ｐｈａｓｅ ｃｏｎｔｒａｓｔ」は明視野像である。「４７３ｎｍ」は、４７３ｎｍの励起光を照射した際の観察結果である。「５５９ｎｍ」は、５５９ｎｍの励起光を照射した際の観察結果である。「Ｍｅｒｇｅｄ」は、「Ｐｈａｓｅ ｃｏｎｔｒａｓｔ」、「４７３ｎｍ」及び「５５９ｎｍ」の各画像を重ね合わせたものである。
【0123】
図４及び５に示されるとおり、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」によって細胞内の核が蛍光標識されたことが示された。
したがって、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」は、共焦点顕微鏡による細胞内の核染色試薬として使用できることがわかる。
したがって、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」は、共焦点顕微鏡による細胞内の核染色試薬として使用できることがわかる。
【0124】
特に、図４に示されるとおり、ガラス表面上に固定化された細胞は「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」により細胞内の核のみが染色されていた。
一方、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ、細胞内ＤＮＡ含有量評価において一般的に使用される核酸染色試薬）により染色された固定化細胞は細胞内全体が染色された。
以上の結果から、ガラス表面上に固定化された細胞では、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」によって、ヨウ化プロピジウム等の核酸染色試薬よりも鮮明に細胞内の核のみを染色できることが示された。
一方、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ、細胞内ＤＮＡ含有量評価において一般的に使用される核酸染色試薬）により染色された固定化細胞は細胞内全体が染色された。
以上の結果から、ガラス表面上に固定化された細胞では、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」によって、ヨウ化プロピジウム等の核酸染色試薬よりも鮮明に細胞内の核のみを染色できることが示された。
【0125】
以上から、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」は、固定化細胞及び生細胞内の核内染色が可能であることが示されたことから、「Ａｈｏ７ｃ－ｍＣｌｏｖｅｒ３」を用いた細胞周期解析がアポトーシス検出等に使用できる可能性が明らかになった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】