特開 2023-181998 魚類寄生虫駆除用組成物｛Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｅｘｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ Ｆｉｓｈ Ｐａｒａｓｉｔｅｓ｝

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023181998

(43)【公開日】2023-12-25

(54)【発明の名称】魚類寄生虫駆除用組成物｛Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｅｘｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ Ｆｉｓｈ Ｐａｒａｓｉｔｅｓ｝

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/52 20060101AFI20231218BHJP

   A61P 33/00 20060101ALI20231218BHJP

   A23K 10/30 20160101ALI20231218BHJP

   A01K 61/13 20170101ALI20231218BHJP

【ＦＩ】

A61K36/52

A61P33/00 171

A23K10/30

A01K61/13

【審査請求】有

【請求項の数】6

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2023096789

(22)【出願日】2023-06-13

(31)【優先権主張番号】10-2022-0071211

(32)【優先日】2022-06-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(71)【出願人】

【識別番号】515260704

【氏名又は名称】大韓民国（国立水産科学院）

【氏名又は名称原語表記】ＲＥＰＵＢＬＩＣ ＯＦ ＫＯＲＥＡ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ）

【住所又は居所原語表記】２１６ Ｇｉｊａｎｇｈａｅａｎ－ｒｏ Ｇｉｊａｎｇ－ｅｕｐ Ｇｉｊａｎｇ－ｇｕｎ， Ｂｕｓａｎ ６１９－７０５ ／ ＫＲ

(74)【代理人】

【識別番号】100139594

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 健次郎

(72)【発明者】

【氏名】キム ナヨン

(72)【発明者】

【氏名】キム ミョンソク

(72)【発明者】

【氏名】チョイ ヘスン

(72)【発明者】

【氏名】ハン ヒョンジャ

(72)【発明者】

【氏名】ウ スジ

(72)【発明者】

【氏名】チョン ウンジ

【テーマコード（参考）】

2B104

2B150

4C088

【Ｆターム（参考）】

2B104AA05

2B104BA13

2B150AA08

2B150AB10

2B150BC06

2B150DD45

2B150DD57

4C088AB12

4C088AC04

4C088BA08

4C088CA05

4C088CA06

4C088MA52

4C088NA07

4C088NA14

4C088ZB37

(57)【要約】      （修正有）

【課題】安全で效能の高い天然物の抽出物を有効成分として含有する魚類寄生虫駆除用組成物を提供する。
【解決手段】オニグルミ（Juglans mandshurica）皮抽出物を有効成分として含有する魚類寄生虫駆除用組成物とする。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

オニグルミ（Juglans mandshurica）皮抽出物を有効成分として含有する魚類寄生虫駆除用組成物。

【請求項2】

前記寄生虫は、スクーチカ虫であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記オニグルミ皮抽出物は、エタノール、メタノール、クロロホルム及び水からなる群から選択される溶媒抽出物であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

前記オニグルミ皮抽出物は、エタノール抽出物であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

請求項１に記載の魚類寄生虫感染駆除用組成物を経口投与または薬浴投与する段階を含む魚類寄生虫の駆除方法。

【請求項6】

前記魚類寄生虫は、スクーチカ虫であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生薬剤抽出物を有効成分として含有する魚類寄生虫駆除用組成物に関し、さらに詳しくは、オニグルミ（Juglans mandshurica）皮抽出物を有効成分として含有する魚類寄生虫駆除用組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

韓国の養殖生産量は毎年増加しているが、養殖場の密集、老朽化及び沿岸汚染による水産生物の疾患問題は、養殖水産業が直面した主要懸案問題の中の一つとして浮上した。その中の代表養殖魚種であるヒラメは、2020年度の韓国国内の魚類養殖生産量882百トン中の438百トンで、全体の生産量の50%を占める一方で(統計庁、2021)、スクーチカ症(50.5%)、やせ症(19.3%)、レンサ球菌症(15.7%)などの疾患により、年間生産量の15.1%程度が死亡することが確認された(韓国国立水産科学院、2020)。

【0003】

スクーチカ症は、1990年に養殖ヒラメで最初に確認された以後、毎年韓国全国のヒラメ養殖場で主に稚魚期に感染して大量死亡を誘発し、近来では、ヒラメに深刻な経済的被害を引き起こし、累積死亡が46～57%まで達している(韓国国立水産科学院、2016)。スクーチカ虫は、スクーチカ症を引き起こす繊毛虫類寄生虫で、現在20種余りがあり、その中でヒラメに強い病原性を有するMiamiensis avidusが優占種であることが明らかになった(Song et al., Dis. Aquat. Org., 83, 133, 2009)。M. avidusは、血清型のタイプがI、IIがあることが知られており、タイプ別の特性が異なると推定される。

【0004】

現在、韓国国内でスクーチカ症を治療するために許可された水産用駆虫剤は、ホルマリンと過酸化水素('15年品目許可)の2つの有効成分がある。その中の水産用ホルマリンは、2006年度に最初に5つの製品が品目許可を受けた後、2020年に11個の製品が市販されており、使用量が最も多い。しかし、水産用ホルマリンは薬浴剤として許可されており、スクーチカ虫が初期体表感染を始めに、脳まで感染して大量死亡を引き起こす場合、薬浴では治療が難しく、水産用ホルマリンの薬浴效能に対する疑問が提起されている。

【0005】

世界保健機関(WHO)傘下の国際がん研究所(International agency for Research on Cancer, IARC)では、ホルマリン(formaldehyde: CAS No. 50-00-0)を吸入したり、人体に直接露出時、発がん物質(Group 1)と規定している。しかし、アメリカ食品医薬品局(FDA)は、ホルマリン(37% formaldehyde)が水産疾患治療を目的に使用する濃度では、人体及び水産食品の安全性に問題がないという水産用ホルマリンの承認に基づき、安全性及び有効性に対する調査後に、水産用駆虫剤として使用承認を受けたが、マスコミや環境団体で水産用ホルマリンを発がん物質及び環境破壊物質として規定している。

【0006】

ホルマリン代替剤の開発研究は、ほとんどワクチン及び化学製剤と天然物製剤に対する研究論文及び特許登録技術で、ワクチンは商品化の前段階であるが、化学製剤及び天然物製剤の製品はない。韓国国内外で化学製剤の使用により発生する多くの副作用のため、天然物を用いた研究が活性化されており、特に韓国国内で2024年度からは、農薬許容物質リスト管理システム(Positive List System, PLS)の導入により、化学製剤に対する規制がさらに強化される予定である。

【0007】

そこで、本発明者らは、これらの問題を解決するために、残留問題から自由であり、安全で效能の高い天然物を対象に、スクーチカ虫の感染に対して駆虫効能を示すホルマリン代替剤を開発しようと鋭意努力した結果、オニグルミ皮抽出物がスクーチカ虫に優れた死滅効果を有することを確認し、本発明を完成するに至った。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明の目的は、安全で效能の高い天然物の抽出物を有効成分として含有する魚類寄生虫駆除用組成物を提供することである。

【0009】

本発明の他の目的は、前記魚類寄生虫感染駆除用組成物を用いた魚類寄生虫の駆除方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0010】

前記目的を達成するために、本発明は、オニグルミ皮抽出物を有効成分として含有する魚類寄生虫駆除用組成物を提供する。

【0011】

本発明は、また、前記魚類寄生虫感染駆除用組成物を経口投与または薬浴投与する段階を含む魚類寄生虫の駆除方法を提供する。

【発明の効果】

【0012】

本発明によると、従来、魚類のスクーチカ症の駆除のために使用されていた有害性の高いホルマリンに代わって、天然物由来の抽出物を用いて、安全で効果的にスクーチカ虫を駆除することができる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】水産用駆虫剤のスクリーニングのために使用された生薬素材を示した図である。

【図2】オニグルミ皮抽出物のエタノール抽出濃度別の細胞毒性を確認した結果を示した図である。

【図3】オニグルミ皮抽出物のヒラメの投与による死亡率(A; LC_50, B; LD₅₀)を示した図である。

【図4】オニグルミ皮抽出物のヒラメの薬浴による急性毒性試験(LC₅₀)の血液生化学的分析結果を示した図である(ALP, alanine aminotransferase; GOT, glutamic oxalacetic transaminase; GPT, glutamic pyruvate transaminase; GLU, glucose; BUN, blood urea nitrogen)。

【図5】ヒラメにおけるオニグルミ皮抽出物の投与方法別のスクーチカ虫の駆除効果を示した図である。

【発明を実施するための形態】

【0014】

他に定義されない限り、本明細書で使用されたすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野において熟練した専門家により通常理解されるものと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使用される命名法は、当該技術分野において周知であり、通常使用されるものである。

【0015】

本発明では、養殖ヒラメで大量死亡を誘発する魚類の寄生虫であるスクーチカ虫を残留問題から自由であり、安全で效能の高い天然物の抽出物を用いて駆除するために、生薬剤抽出物を作製し、スクーチカ虫に対する死滅能を有する抽出物をスクリーニングし、オニグルミ皮のエタノール抽出物が高いスクーチカ虫の死滅活性を示すことを確認した。

【0016】

従って、本発明は一つの観点から、オニグルミ皮抽出物を有効成分として含有する魚類寄生虫駆除用組成物に関する。

【0017】

本発明において、前記魚類寄生虫は、スクーチカ虫であることを特徴とすることができる。

【0018】

本発明において、前記オニグルミ皮抽出物は、エタノール、メタノール、クロロホルム及び水からなる群から選択される溶媒抽出物であることを特徴とすることができ、望ましくはエタノール抽出物であることが望ましい。

【0019】

本発明のオニグルミ皮エタノール抽出物は、100～10％のエタノール抽出物であってもよく、望ましくは90～20％のエタノール抽出物であってもよく、より望ましくは80～30％のエタノール抽出物であってもよく、さらに望ましくは70～40％のエタノール抽出物であることが望ましく、なおさら望ましくは60～45％のエタノール抽出物であることが望ましい。

【0020】

本発明において、前記オニグルミ皮は、マンシュウグルミ(Juglans mandshurica)の樹皮であり、クルミ「科」とクルミ「属」は、世界的に15種、韓国には栽培しているものまで合わせて4種がある。

【0021】

マンシュウグルミは、ユグロン(hydrojuglone)とタンニン(tannin)系列の成分が多量含有されており、その他、キノン、フェノール、フラボノイド、クマリン、リグナン、ステロイド系列の成分が主に含有されており、マンシュウグルミの樹皮、根、葉、未熟な果実の皮などが殺虫、殺菌効果を示し、特に根から分泌されるユグロンは細胞毒性、抗炎症作用をし、タンニンは収斂作用で抗菌と抗炎症作用をすることが知られている。

【0022】

別の観点から、本発明は、前記魚類寄生虫感染駆除用組成物を経口投与または薬浴投与する段階を含む魚類寄生虫の駆除方法に関する。

【0023】

本発明において、前記魚類寄生虫は、スクーチカ虫であることを特徴とすることができる。

【0024】

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、あくまでも本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されるものと解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって自明である。

【0025】

実施例1：天然物由来の水産用駆虫剤候補物質の作製
生薬剤と海藻類を対象に水産用駆虫剤候補物質として選定し、抽出を行った。生薬剤は溶媒別(熱水及びエタノール)に抽出物を作製した。生薬剤50gに溶媒を入れ、超音波抽出(3回反復)して減圧濃縮した後、抽出溶媒の影響がなくなるように凍結乾燥した。最後にDimethyl sulfoxide (DMSO)に溶かして濃度別に投与し、抗寄生虫效能測定に使用した。

【0026】

抗寄生虫効能が知られている生薬素材15種(図1)を対象として溶媒別(エタノール及び熱水)に抽出物を作製し、減圧濃縮及び凍結乾燥後、濃度別(0～10,000mg/L)にスクーチカ虫に対する效能を調査した結果、抗寄生虫效能は羌活、オニグルミ皮、ヤブジラミ、鶴蝨で確認し、效能の基準は水産用ホルマリン投与濃度と類似した100mg/Lと表れた(表1)。

【0027】

実施例2：生薬素材の抗寄生虫效能の確認及び薬物効力濃度の調査
実施例1で作製した生薬抽出物のスクーチカ虫に対する死滅能を確認した。

【0028】

スクーチカ虫に感染した個体の腹腔から虫を分離し、魚類株化細胞(hirame natural embryo cell, HINAE)に接種し、1% antibiotics(Gibco)と10% FBS(Gibco)を添加したMEM(Minimium essential media, Welgene)培地を用いて20℃の培養器で培養した。3～4日程度培養して完全に増殖したスクーチカ虫は、3000g、4℃で10分間遠心分離した後、上層液を除去してスクーチカ虫を分離し、96wellに1X10⁴/wellでスクーチカ虫を分注して実験に使用した。培養されたスクーチカ虫に抽出物を濃度別に添加し、20℃の培養器で10分、30分、1時間、2時間、4時間間隔で殺虫可否(虫体の死滅程度、動き、細胞質の破壊程度)を観察した。

【0029】

スクーチカ虫の效能においては、羌活が最も効果が高く表れたが、羌活の経口投与で強い魚体毒性を確認し、病理組織検査の結果、鰓上皮の脱落、腎臓の空胞変性、肝臓の萎縮症状を示し、全般的に薬物毒性反応が表れ、最終的にオニグルミ皮、鶴蝨、羌活の順に選定された。

【0030】

【表1】

【0031】

最終的に候補物質はオニグルミ皮抽出物に選定し、水産用駆虫剤としての安全性及び酒精法で製品化するために50%エタノール抽出物に最終選定した。

【0032】

【表2】

【0033】

オニグルミ皮50%エタノール抽出物の細部活性濃度を選定するために再実験を実施し、最終40mg/L濃度でスクーチカ虫が死滅することを確認し、最終的に40mg/L濃度を選定して、以後実験を進行した。

【0034】

【表3】

【0035】

実施例3：生薬剤抽出物の細胞毒性の確認
魚類株化細胞(HINAE細胞)を用いて作製した抽出物の細胞毒性を測定した。1x10⁵/wellの細胞を24時間20℃で培養して80%の細胞密度を確認した後、抽出物を濃度別(0～1,000mg/L)に処理した。48時間培養した後、細胞毒性測定薬物(CCK-8, Dojindo)を処理して450nmで吸光度を測定し、その結果、図2に示すように、オニグルミ皮100%エタノール抽出物の場合、40mg/L以上の濃度で細胞毒性を示したが、オニグルミ皮50%エタノール抽出物の場合、200mg/L濃度でも細胞毒性を示さなかった。

【0036】

実施例4：天然物水産用駆虫剤の魚類急性毒性の試験
オニグルミ皮の安全性評価のために、実験区別に10尾のヒラメ(13.9±0.9cm, 27.1±4.6g)で薬浴及び経口投与による急性毒性試験(致死濃度50%; LC₅₀, 致死量50%; LD₅₀)を実施した。オニグルミ皮50%エタノール抽出物を0～1,000mg/Lで作製し、薬浴投与では対照区を含めて1,000mg/Lまで投与し、経口投与では400mg/kg B.W.まで濃度別に作製して投与した。濃度別に抽出物を投与した後、96時間の間毎日,死亡量を調査し、生存個体の血液及び病理組織学的検査を実施した。病理組織学分析は、実験魚の鰓、心臓、腸、腎臓、肝臓、脾臓を10%の中性ホルマリンに固定した後、脱水、パラフィン包埋過程を行い、切った組織にヘマトキシリン・エオシン(H&E)染色をして組織を検鏡した。

【0037】

その結果、図3に示すように、LC₅₀(96時間)は509.06mg/Lと表れ、LD₅₀(96時間)は805.8mg/kg B.W.と表れた。

【0038】

薬浴による急性毒性試験(LC₅₀)の血液生化学的分析の結果、図4に示すように、薬物毒性による主要な標的臓器である肝臓と腎臓機能の指標となる項目は対照区と比較して差がなかった。その中のGOTとGPTの数値は40mg/Lで顕著に減少する傾向を示したが、これはオニグルミ皮が有する効能の中の肝臓保護効果と密接な関係があると判断された。

【0039】

急性毒性評価の結果、オニグルミ皮抽出物のヒラメの薬浴及び経口投与による急性毒性試験(LC₅₀, LD₅₀)において、160mg/Lと160mg/kg B.W.では血液生化学的及び病理組織学的に有害な影響が表れず、安全であることを確認した。

【0040】

実施例5：オニグルミ皮抽出物の駆虫剤としての效能の確認
疾患にかかっていない健康なヒラメを韓国の種苗養殖場のヒラメ養殖場から購入し、海水流水式陸上水槽で水温20±1℃で2週間馴致後、実験魚として使用した。実験魚を10尾ずつ韓国国立水産科学院の病理研究課で保存中のスクーチカ虫(I、II)1x10⁵細胞/魚で人為感染させた後(スクーチカ虫タイプI、II)、2日目に40mg/Lの濃度で飼料丸に添加して魚類麻酔後、1回または2回経口及び薬浴投与を実施した。そのために、配合粉末飼料を飼料丸(約0.25g)として作製した後、40mg/kg B.W.になるようにオニグルミ皮粉末を添加し、もう一度混練した飼料でコーティングした。経口投与対照区は、抽出物を添加しない同一の方法で作製した飼料丸を魚類麻酔後、経口投与した。そこで最終的にスクーチカ虫による死亡を確認した。

【0041】

スクーチカ虫の駆除効果の調査結果を図5に示した。スクーチカ虫のタイプの違いによる病原性はそれほどなく、17日間スクーチカ虫による死亡を調査した結果、経口投与群は60～80％の相対生存率を示し、薬浴投与群は50～80％の相対生存率を確認した。

【0042】

以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界における通常の知識を有する者にとって、これらの具体的な技術は単なる望ましい実施態様に過ぎず、これによって本発明の範囲が限定されない点は明らかであろう。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物によって定義されるといえる。本発明の単純な変形ないし変更は、この分野の通常の知識を有する者によって容易に用いることができ、このような変形や変更はすべて本発明の領域に含まれると見ることができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【外国語明細書】