(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023182179
(43)【公開日】2023-12-26
(54)【発明の名称】１，５－アンヒドロ－Ｄ－マンニトールの製造法
(51)【国際特許分類】
C12P 19/02 20060101AFI20231219BHJP
C12N 1/16 20060101ALI20231219BHJP
【ＦＩ】
C12P19/02
C12N1/16 G
【審査請求】未請求
【請求項の数】2
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022095646
(22)【出願日】2022-06-14
(71)【出願人】
【識別番号】390015004
【氏名又は名称】株式会社サナス
(74)【代理人】
【識別番号】100080609
【弁理士】
【氏名又は名称】大島 正孝
(74)【代理人】
【識別番号】100113217
【弁理士】
【氏名又は名称】奥貫 佐知子
(74)【代理人】
【識別番号】100202496
【弁理士】
【氏名又は名称】鹿角 剛二
(72)【発明者】
【氏名】吉永 一浩
(72)【発明者】
【氏名】安部 淳一
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AF02
4B064CA06
4B064CE10
4B064DA01
4B065AA72X
4B065AC14
4B065BD36
4B065CA20
(57)【要約】
【課題】本発明は、１，５－アンヒドロ－Ｄ－フルクトースを出発物質とし１，５－アンヒドロ－Ｄ－マンニトールへの高い変換能を有する微生物を用いた１，５－アンヒドロ－Ｄ－マンニトールの製造法を提供する。
【解決手段】本発明は、ウィッカーハモマイセス・アノマルス種の菌株を１，５－アンヒドロ－Ｄ－フルクトースと接触させて１，５－アンヒドロ－Ｄ－マンニトールを生成させ、次いで生成した１，５－アンヒドロ－Ｄ－マンニトールを採取することを特徴とする１，５－アンヒドロ－Ｄ－マンニトールの製造法。
【選択図】図１
【解決手段】本発明は、ウィッカーハモマイセス・アノマルス種の菌株を１，５－アンヒドロ－Ｄ－フルクトースと接触させて１，５－アンヒドロ－Ｄ－マンニトールを生成させ、次いで生成した１，５－アンヒドロ－Ｄ－マンニトールを採取することを特徴とする１，５－アンヒドロ－Ｄ－マンニトールの製造法。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ウィッカーハモマイセス・アノマルス種の菌株を１，５－アンヒドロ－Ｄ－フルクトースと接触させて１，５－アンヒドロ－Ｄ－マンニトールを生成させ、次いで生成した１，５－アンヒドロ－Ｄ－マンニトールを採取することを特徴とする１，５－アンヒドロ－Ｄ－マンニトールの製造法。
【請求項2】
前記ウィッカーハモマイセス・アノマルス種の菌株がＮＢＲＣ ０７０７またはＮＢＲＣ １０２１３である請求項１に記載の１，５－アンヒドロ－Ｄ－マンニトールの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、１，５－アンヒドロ－Ｄ－マンニトールの微生物による製造法に関する。
【背景技術】
【0002】
１，５－アンヒドロ－Ｄ－マンニトール（以下１，５－ＡＭ）は、マンノースの１位の水酸基が還元された構造をもつポリオールである。１，５－ＡＭは、動物細胞の培養基材として用いることで、抗体の産生が増強することが知られている。また、１，５－ＡＭに脂肪酸を結合させることで脂質のゲル化剤となることも報告されている。このように１，５－ＡＭは、産業的に価値の高い糖である。
【0003】
１，５－ＡＭの製造法としては、化学的に水素付加する方法が報告されている（非特許文献１参照）。しかし、この方法では、１，５－ＡＭの他に１，５－ＡＭの２位のエピマーである、１，５－アンヒドロ－Ｄ－グルシトール（以下１，５－ＡＧ）も生成されてしまうため、１，５－ＡＭの収率が低いという問題があった。例えば、水素化ホウ素ナトリウムを用いた化学的な水素付加においては、副生物の１，５－ＡＧの収率が６０％と多量に生成する。また、パラジウム触媒存在下での水素付加においては１，５－ＡＭが優勢となるものの、１，５－ＡＭの収率は５８％と低収率である。
【0004】
１，５－ＡＭを食品素材として使用する場合、摂取しても安全である素材であることが求められる。しかしながら、上記のような化学合成法では、生成物中に化学物質の残留等のおそれがあるため、化学合成法ではなく、より自然な製造法、例えば微生物を用いた１，５－ＡＭの製造法が望ましいといえる。
【0005】
微生物を用いた１，５－ＡＭの製造法として、１，５－アンヒドロ－Ｄ－フルクトース（以下１，５－ＡＦ）に、パン酵母を接触させて１，５－ＡＭを製造する方法が報告されている（非特許文献２参照）。しかし、この方法においても１，５－ＡＧが副生物として生成されるという問題があり、１，５－ＡＭの収率は約５０％と低い。
【0006】
上記の通り従来の合成方法においては、副生物が多く生成して１，５－ＡＦから１，５－ＡＭへの変換率が低く十分でなかった。従って、副生物を生成せず、１，５－ＡＦから１，５－ＡＭのみを選択的に効率良く製造する方法が望まれている。
【0007】
微生物を用いて１，５－ＡＦから１，５－ＡＭのみを選択的に製造する方法の一つとして、シノリゾビウム・モレレンス種の菌株から、１，５－ＡＦを１，５－ＡＭに変換する還元酵素を分離し、当該還元酵素を用いて１，５－ＡＭを製造する技術が提案されている（非特許文献３参照）。
この製造法においては反応系に１，５－ＡＦから１，５－ＡＭに還元する際に補酵素（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸；ＮＡＤＰＨ）が必要であり、反応系内にグルコース－６－リン酸とグルコース－６－リン酸脱水素酵素が添加される。ここで、反応においては１モルの１，５－ＡＦの還元に１モルのＮＡＤＰＨが必要であり、１モルのＮＡＤＰＨの発生に、１モルのグルコース－６－リン酸が必要となる。従って、１，５－ＡＦの還元には、１，５－ＡＦと等モルのグルコース６リン酸が必要となる。しかしながら、グルコース－６－リン酸は非常に高価であることから、この反応による製造法では１，５－ＡＭの製造コストが非常に高くなるという問題があるため、より安価な１，５－ＡＭの製造法が求められている。
この製造法においては反応系に１，５－ＡＦから１，５－ＡＭに還元する際に補酵素（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸；ＮＡＤＰＨ）が必要であり、反応系内にグルコース－６－リン酸とグルコース－６－リン酸脱水素酵素が添加される。ここで、反応においては１モルの１，５－ＡＦの還元に１モルのＮＡＤＰＨが必要であり、１モルのＮＡＤＰＨの発生に、１モルのグルコース－６－リン酸が必要となる。従って、１，５－ＡＦの還元には、１，５－ＡＦと等モルのグルコース６リン酸が必要となる。しかしながら、グルコース－６－リン酸は非常に高価であることから、この反応による製造法では１，５－ＡＭの製造コストが非常に高くなるという問題があるため、より安価な１，５－ＡＭの製造法が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３７（２００２），８７３－８９０
【非特許文献2】Ｔｈｅ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ，５９，１４５－１５１（２０１２）
【非特許文献3】ＡＰＰＬＩＥＤ ＡＮＤ ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＲＯＧＹ，Ｆｅｂ．２００６，ｐ．１２４８－１２５７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明はこのような従来の問題点を解決して、１，５－ＡＦを出発物質とし１，５－ＡＭへの高い変換能を有する微生物を用いた１，５－ＡＭの製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明においては、ウィッカーハモマイセス・アノマルス種の菌株を１，５－アンヒドロ－Ｄ－フルクトースと接触させて１，５－アンヒドロ－Ｄ－マンニトールを生成させ、次いで生成した１，５－アンヒドロ－Ｄ－マンニトールを採取することを特徴とする１，５－アンヒドロ－Ｄ－マンニトールの製造法が提供される。
本発明の１，５－アンヒドロ－Ｄ－マンニトールの製造法においては、前記ウィッカーハモマイセス・アノマルス種の菌株がＮＢＲＣ ０７０７またはＮＢＲＣ １０２１３であることが好ましい。
本発明の１，５－アンヒドロ－Ｄ－マンニトールの製造法においては、前記ウィッカーハモマイセス・アノマルス種の菌株がＮＢＲＣ ０７０７またはＮＢＲＣ １０２１３であることが好ましい。
【発明の効果】
【0011】
本発明においては、ウィッカーハモマイセス・アノマルス種の菌株を用いることにより、１，５－ＡＦを１，５－ＡＭのみに選択的に変換し副生物を生成しないため、生産性が向上する。
ウィッカーハモマイセス・アノマルス種の菌株は、従来から食品分野で幅広く使用されてきた菌株であり、例えばワインの製造に用いられる酵母の一種である。従って当該菌株を用いた製造法は、化学的に水素付加する方法等に比べ、安全性が高い。
さらに、ウィッカーハモマイセス・アノマルス種の菌株を用いた１，５－ＡＭの製造は、グルコース－６－リン酸等の高価な添加剤を用いる必要がないため、製造コストが低く安価な１，５－ＡＭの製造法である。
ウィッカーハモマイセス・アノマルス種の菌株は、従来から食品分野で幅広く使用されてきた菌株であり、例えばワインの製造に用いられる酵母の一種である。従って当該菌株を用いた製造法は、化学的に水素付加する方法等に比べ、安全性が高い。
さらに、ウィッカーハモマイセス・アノマルス種の菌株を用いた１，５－ＡＭの製造は、グルコース－６－リン酸等の高価な添加剤を用いる必要がないため、製造コストが低く安価な１，５－ＡＭの製造法である。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】実施例５における発酵時間と１，５－ＡＭ変換率との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0013】
１，５－ＡＦを１，５－ＡＭに変換する高い能力を持つウィッカーハモマイセス・アノマルス種の菌株としては、具体的にはＮＢＲＣ ０７０７またはＮＢＲＣ １０２１３などが挙げられる。これら菌株は、ブダペスト条約による国際寄託がなされており、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部（Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ Ａｇｅｎｃｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ から入手可能である。但し、本発明に用いられるウィッカーハモマイセス・アノマルス種の菌株は、１，５－ＡＦを１，５－ＡＭに変換する能力を有するウィッカーハモマイセス・アノマルス種の菌株であれば全てが使用可能であり、上記菌株に限定されるものではない。
本発明のウィッカーハモマイセス・アノマルス種の菌株は、前記の菌株より派生する変異株、例えば紫外線照射、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）処理、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）処理、亜硝酸処理、アクリジン処理等による変異株、あるいは細胞融合もしくは遺伝子組み換え法などの遺伝学的手法により誘導される遺伝子組み換え株などいずれの株であっても良い。
本発明のウィッカーハモマイセス・アノマルス種の菌株は、前記の菌株より派生する変異株、例えば紫外線照射、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）処理、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）処理、亜硝酸処理、アクリジン処理等による変異株、あるいは細胞融合もしくは遺伝子組み換え法などの遺伝学的手法により誘導される遺伝子組み換え株などいずれの株であっても良い。
【0014】
１，５－ＡＦを原料として１，５－ＡＭを製造するには１，５－ＡＦにウィッカーハモマイセス・アノマルス種の菌株に１，５－ＡＦを接触させればよく、具体的には、微生物用の培地中に１，５－ＡＦとウィッカーハモマイセス・アノマルス種の菌株を共存させる方法が好適に採用される。
微生物培養のための１，５－ＡＦを含む培養液は、炭水化物、窒素源、無機イオン、更に必要に応じて有機栄養源を含む培地を用いることができる。炭水化物としては、例えばグルコース、フルクトース、マルトース、スクロース、グリセロール、マンノースなどが挙げられる。グルコースが特に好ましい。有機栄養源としては、例えばビタミン、アミノ酸等を含有する酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、カゼイン分解物などが適宜使用される。無機イオンとしては、例えばマグネシウムイオン、リン酸イオン、カルシウムイオンなどが適宜使用される。その培地に、別にフィルター滅菌した１，５－ＡＦ水溶液を添加して１，５－ＡＭ採取用の培地とすることができる。
微生物培養のための１，５－ＡＦを含む培養液は、炭水化物、窒素源、無機イオン、更に必要に応じて有機栄養源を含む培地を用いることができる。炭水化物としては、例えばグルコース、フルクトース、マルトース、スクロース、グリセロール、マンノースなどが挙げられる。グルコースが特に好ましい。有機栄養源としては、例えばビタミン、アミノ酸等を含有する酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、カゼイン分解物などが適宜使用される。無機イオンとしては、例えばマグネシウムイオン、リン酸イオン、カルシウムイオンなどが適宜使用される。その培地に、別にフィルター滅菌した１，５－ＡＦ水溶液を添加して１，５－ＡＭ採取用の培地とすることができる。
【0015】
反応温度は１０℃から４０℃が良く、好ましくは２０℃～３５℃、より好ましくは２５℃から３５℃が良い。ｐＨは７．０以下、好ましくは６．５以下、より好ましくは５．０以下が良い。これらの反応条件下においては、ウィッカーハモマイセス・アノマルス種の菌株の１，５－ＡＦから１，５－ＡＭへの変換能力が適切に作用する。また、微生物の活性化のために反応中にグルコースなどの炭素源を供給しても良い。
【0016】
生成された物質が１，５－ＡＭであることは、ＨＰＬＣにより１，５－ＡＭ標準試料とのピークを比較することで確認できる。培養液中の１，５－ＡＭ生成量も、同様にＨＰＬＣで速やかに測定することができ、１，５－ＡＭ生成量が最高に達した時点で培養を終了する。なお、１，５－ＡＭ生成量は、ＨＰＬＣ測定により検出された１，５－ＡＭのピーク面積によりあらかじめ作成した標準試料の検量線から求めることができる。
ＨＰＬＣ測定の詳細条件を以下に示す。
分離カラム：ＭＩＴＳＵＢＩＳＨＩ ＭＣＩＧＥＬＣＫ０８Ｓの２連結（三菱化学（株）製）、
移動相：水、流速：１．０ｍＬ／分、
カラム温度：６０℃、
検出器：示差屈折率検出器、
サンプル供与量：２０μＬ
ＨＰＬＣ測定の詳細条件を以下に示す。
分離カラム：ＭＩＴＳＵＢＩＳＨＩ ＭＣＩＧＥＬＣＫ０８Ｓの２連結（三菱化学（株）製）、
移動相：水、流速：１．０ｍＬ／分、
カラム温度：６０℃、
検出器：示差屈折率検出器、
サンプル供与量：２０μＬ
【0017】
このようにして培養液中に生成した１，５－ＡＭを通常実施される周知の手段で培養物より精製して採取する。具体的には、遠心分離、珪藻土ろ過で菌体および固形物を除去した後、活性炭で脱色、イオン交換樹脂で脱塩し、濃縮後、結晶化させる。結晶化の方法としては、例えば、１，５－ＡＭの水溶液から結晶１，５－ＡＭを析出させる方法等が挙げられるが、特に限定されるものではない。
【実施例0018】
以下、実施例にて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。以後の説明中に用いる％は、特に断りがない限り容量（ｗ／ｖ）％である。
＜１，５－ＡＭ変換率＞
１，５－ＡＭへ変換された割合（１，５－ＡＭ変換率）は、培地中に添加した１，５－ＡＦが１，５－ＡＭに変換された割合を示し、ＨＰＬＣで検出される１，５－ＡＭと１，５－ＡＧのピーク面積を用いて下記の式に従って求めた。
１，５－ＡＭ変換率（％）＝Ｓ１／（Ｓ１＋Ｓ２）×１００
Ｓ１：１，５－ＡＭのピーク面積の実測値（％）
Ｓ２：１，５－ＡＧのピーク面積の実測値（％）
なお、１，５－ＡＭのピーク面積の実測値が５％以下または９５％以上については、少ない成分のピーク面積が正確に検出できないため、それぞれ０％または１００％と表記した。
また、実施例で用いたＮＢＲＣ ０７０７およびＮＢＲＣ １０２１３の菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部（Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ Ａｇｅｎｃｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ から入手したものである。
＜１，５－ＡＭ変換率＞
１，５－ＡＭへ変換された割合（１，５－ＡＭ変換率）は、培地中に添加した１，５－ＡＦが１，５－ＡＭに変換された割合を示し、ＨＰＬＣで検出される１，５－ＡＭと１，５－ＡＧのピーク面積を用いて下記の式に従って求めた。
１，５－ＡＭ変換率（％）＝Ｓ１／（Ｓ１＋Ｓ２）×１００
Ｓ１：１，５－ＡＭのピーク面積の実測値（％）
Ｓ２：１，５－ＡＧのピーク面積の実測値（％）
なお、１，５－ＡＭのピーク面積の実測値が５％以下または９５％以上については、少ない成分のピーク面積が正確に検出できないため、それぞれ０％または１００％と表記した。
また、実施例で用いたＮＢＲＣ ０７０７およびＮＢＲＣ １０２１３の菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部（Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ Ａｇｅｎｃｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ から入手したものである。
【0019】
＜実施例１＞（カビおよび酵母の１，５－ＡＭ変換率の比較）
１，５－ＡＦは微生物の増殖を抑制する作用を有するが、その作用は細菌に対しては強いものの、カビや酵母には殆ど作用しない。従って、１，５－ＡＦから１，５－ＡＭを微生物により製造するには、１，５－ＡＦの増殖抑制の影響が少ない酵母やカビが良いと考えられるため、表１に示すカビおよび酵母を準備し、１，５－ＡＭ変換率を調べた。
グルコース１．０％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％および麦芽エキス０．３％、からなるＹＭ液体培地（ｐＨ６．２）５ｍＬを１５ｍＬ容の遠心チューブに分注し、この遠心チューブ中に寒天培地（グルコース１．０％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、寒天粉末１．５％、ｐＨ６．２）で培養した表１に示す菌株をそれぞれ１白金耳接種し、３０℃、１３０ｒｐｍで一晩振盪培養した。この培養液を遠心分離（３０００ｇ、１５分）して菌体を回収した。回収した菌体に、孔径０．４５μｍフィルターで除菌処理した０．１％／２２ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８６）の１，５－ＡＦ溶液を２ｍＬ添加し、３０℃、１３０ｒｐｍで一晩菌体と１，５－ＡＦを接触させた。
この液をＨＰＬＣ分析し、１，５－ＡＭおよび１，５－ＡＧのピーク面積を測定して１，５－ＡＭ変換率を求めた。その結果を表１に示す。カビに比べて、酵母の方が１，５－ＡＭ変換率が高い傾向にあった。
１，５－ＡＦは微生物の増殖を抑制する作用を有するが、その作用は細菌に対しては強いものの、カビや酵母には殆ど作用しない。従って、１，５－ＡＦから１，５－ＡＭを微生物により製造するには、１，５－ＡＦの増殖抑制の影響が少ない酵母やカビが良いと考えられるため、表１に示すカビおよび酵母を準備し、１，５－ＡＭ変換率を調べた。
グルコース１．０％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％および麦芽エキス０．３％、からなるＹＭ液体培地（ｐＨ６．２）５ｍＬを１５ｍＬ容の遠心チューブに分注し、この遠心チューブ中に寒天培地（グルコース１．０％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、寒天粉末１．５％、ｐＨ６．２）で培養した表１に示す菌株をそれぞれ１白金耳接種し、３０℃、１３０ｒｐｍで一晩振盪培養した。この培養液を遠心分離（３０００ｇ、１５分）して菌体を回収した。回収した菌体に、孔径０．４５μｍフィルターで除菌処理した０．１％／２２ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８６）の１，５－ＡＦ溶液を２ｍＬ添加し、３０℃、１３０ｒｐｍで一晩菌体と１，５－ＡＦを接触させた。
この液をＨＰＬＣ分析し、１，５－ＡＭおよび１，５－ＡＧのピーク面積を測定して１，５－ＡＭ変換率を求めた。その結果を表１に示す。カビに比べて、酵母の方が１，５－ＡＭ変換率が高い傾向にあった。
【0020】
【表1】
【0021】
＜実施例２＞（各酵母の１，５－ＡＭ変換率の比較）
実施例１より、酵母の方が１，５－ＡＭ変換率が高いことが分かったため、表２に示す酵母を準備し、その中で１，５－ＡＭ変換率の高い酵母を調べた。
グルコース１．０％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％および麦芽エキス０．３％、からなるＹＭ液体培地（ｐＨ６．２）５ｍＬを１５ｍＬ容の遠心チューブに分注し、この遠心チューブ中に寒天培地（グルコース１．０％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、寒天粉末１．５％、ｐＨ６．２）で培養した表２に示す菌株をそれぞれ１白金耳接種し、３０℃、１３０ｒｐｍで一晩振盪培養した。この培養液を遠心分離（３０００ｇ、１５分）して菌体を回収した。回収した菌体に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を１ｍＬ添加して混合し、遠心分離（３０００ｇ、１５分）後に上澄みを廃棄し菌体を回収した。これに孔径０．４５μｍフィルターで除菌処理した０．１％の１，５－ＡＦ／２２ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８６）を１ｍＬ添加して、２５℃、１３０ｒｐｍで一晩菌体と１，５－ＡＦを接触させた。
この液をＨＰＬＣ分析し、生成した１，５－ＡＧと１，５－ＡＭのピーク面積を測定し、１，５－ＡＭ変換率を求めた。その結果、評価した殆どの微生物が１，５－ＡＧと１，５－ＡＭの両方を生成したが、ウィッカーハモマイセス・アノマルス種の菌株だけが１，５－ＡＭのみを選択的に生成し、１，５－ＡＭ変換率は１００％であった。
実施例１より、酵母の方が１，５－ＡＭ変換率が高いことが分かったため、表２に示す酵母を準備し、その中で１，５－ＡＭ変換率の高い酵母を調べた。
グルコース１．０％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％および麦芽エキス０．３％、からなるＹＭ液体培地（ｐＨ６．２）５ｍＬを１５ｍＬ容の遠心チューブに分注し、この遠心チューブ中に寒天培地（グルコース１．０％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、寒天粉末１．５％、ｐＨ６．２）で培養した表２に示す菌株をそれぞれ１白金耳接種し、３０℃、１３０ｒｐｍで一晩振盪培養した。この培養液を遠心分離（３０００ｇ、１５分）して菌体を回収した。回収した菌体に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を１ｍＬ添加して混合し、遠心分離（３０００ｇ、１５分）後に上澄みを廃棄し菌体を回収した。これに孔径０．４５μｍフィルターで除菌処理した０．１％の１，５－ＡＦ／２２ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８６）を１ｍＬ添加して、２５℃、１３０ｒｐｍで一晩菌体と１，５－ＡＦを接触させた。
この液をＨＰＬＣ分析し、生成した１，５－ＡＧと１，５－ＡＭのピーク面積を測定し、１，５－ＡＭ変換率を求めた。その結果、評価した殆どの微生物が１，５－ＡＧと１，５－ＡＭの両方を生成したが、ウィッカーハモマイセス・アノマルス種の菌株だけが１，５－ＡＭのみを選択的に生成し、１，５－ＡＭ変換率は１００％であった。
【0022】
【表2】
【0023】
＜実施例３＞（各ウィッカーハモマイセス属の１，５－ＡＭ変換率の比較）
実施例２から、ウィッカーハモマイセス・アノマルス種の菌株を用いると１，５－ＡＭ変換率が高いことが分かったため、表３に示すウィッカーハモマイセス属の菌株を準備し、その中で１，５－ＡＭ変換率の高い菌株を調べた。
用いる菌体を、表３に示すウィッカーハモマイセス属の菌体にした以外は実施例２と同様にして１，５－ＡＭ変換率を求めた。その結果、ウィッカーハモマイセス属の中でもウィッカーハモマイセス・アノマルス種の菌株のみが１，５－ＡＭ変換率が１００％であった。
実施例２から、ウィッカーハモマイセス・アノマルス種の菌株を用いると１，５－ＡＭ変換率が高いことが分かったため、表３に示すウィッカーハモマイセス属の菌株を準備し、その中で１，５－ＡＭ変換率の高い菌株を調べた。
用いる菌体を、表３に示すウィッカーハモマイセス属の菌体にした以外は実施例２と同様にして１，５－ＡＭ変換率を求めた。その結果、ウィッカーハモマイセス属の中でもウィッカーハモマイセス・アノマルス種の菌株のみが１，５－ＡＭ変換率が１００％であった。
【0024】
【表3】
【0025】
＜実施例４＞（ウィッカーハモマイセス・アノマルス種の菌株の１，５－ＡＭ資化性）
合成培地（ＹＥＭ培地：Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ）５ｍＬを１５ｍＬ容の遠心チューブに分注し、この遠心チューブ中に寒天培地（グルコース１．０％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、寒天粉末１．５％、ｐＨ６．２）で培養したウィッカーハモマイセス・アノマルス種の菌株（ＮＢＲＣ０７０７）を１白金耳接種し、３０℃、１３０ｒｐｍで一晩振盪培養した。これを種培養液とした。別に合成培地（ＹＥＭ培地）５ｍＬを試験管に分注し、孔径０．４５μｍフィルターで除菌処理した表４に示す糖類をそれぞれの試験管に１％になるように添加し、種培養液を２０μＬ添加して、２５℃、１３０ｒｐｍで一晩振盪培養した。
この培養液を適量サンプリングし、濁度計（バイオクロム社製、ジーンクオント１００）を用いて６６０ｎｍの波長における培養液の濁度を測定した。この結果を、添加した糖類ごとに表４に示す。
添加した糖類がグルコースの場合は、６６０ｎｍの波長の透過率が減少し濁度が増加したことから、ウィッカーハモマイセス・アノマルス種の菌株（ＮＢＲＣ０７０７）が増殖していることが分かった。これに対して、添加した糖類が１，５－ＡＭの場合は、濁度の増加は認められず、ウィッカーハモマイセス・アノマルス種の菌株（ＮＢＲＣ０７０７）が増殖しないことが分かった。
上記より、ウィッカーハモマイセス・アノマルス種の菌株（ＮＢＲＣ０７０７）は１，５－ＡＭを資化することができず、生成した１，５－ＡＭは培地に蓄積されていくことが分かった。よって、ウィッカーハモマイセス・アノマルス種の菌株（ＮＢＲＣ０７０７）は、１，５－ＡＭの生成に適した菌であることが分かった。
合成培地（ＹＥＭ培地：Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ）５ｍＬを１５ｍＬ容の遠心チューブに分注し、この遠心チューブ中に寒天培地（グルコース１．０％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、寒天粉末１．５％、ｐＨ６．２）で培養したウィッカーハモマイセス・アノマルス種の菌株（ＮＢＲＣ０７０７）を１白金耳接種し、３０℃、１３０ｒｐｍで一晩振盪培養した。これを種培養液とした。別に合成培地（ＹＥＭ培地）５ｍＬを試験管に分注し、孔径０．４５μｍフィルターで除菌処理した表４に示す糖類をそれぞれの試験管に１％になるように添加し、種培養液を２０μＬ添加して、２５℃、１３０ｒｐｍで一晩振盪培養した。
この培養液を適量サンプリングし、濁度計（バイオクロム社製、ジーンクオント１００）を用いて６６０ｎｍの波長における培養液の濁度を測定した。この結果を、添加した糖類ごとに表４に示す。
添加した糖類がグルコースの場合は、６６０ｎｍの波長の透過率が減少し濁度が増加したことから、ウィッカーハモマイセス・アノマルス種の菌株（ＮＢＲＣ０７０７）が増殖していることが分かった。これに対して、添加した糖類が１，５－ＡＭの場合は、濁度の増加は認められず、ウィッカーハモマイセス・アノマルス種の菌株（ＮＢＲＣ０７０７）が増殖しないことが分かった。
上記より、ウィッカーハモマイセス・アノマルス種の菌株（ＮＢＲＣ０７０７）は１，５－ＡＭを資化することができず、生成した１，５－ＡＭは培地に蓄積されていくことが分かった。よって、ウィッカーハモマイセス・アノマルス種の菌株（ＮＢＲＣ０７０７）は、１，５－ＡＭの生成に適した菌であることが分かった。
【0026】
【表4】
【0027】
＜実施例５＞（発酵時間と１，５－ＡＭ変換率の関係）
ＹＭ液体培地を１５ｍＬ容の遠心チューブに５ｍＬ調製し、この遠心チューブ中に寒天培地（グルコース１２．０％、ペプトン０．５１．０％、酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、寒天粉末１．５％、ｐＨ６．２）で培養したウィッカーハモマイセス・アノマルス種の菌株（ＮＢＲＣ０７０７）を１白金耳接種し、３０℃、１３０ｒｐｍで一晩振盪培養した。これを種培養液とした。別途、ペプトンを１．０ｇ、酵母エキスを０．６ｇ、麦芽エキスを０．６ｇ、および１，５－ＡＦ１２ｇを１００ｍＬの精製水に溶解した。該水溶液をポアサイズ０．２μＭのメンブレンフィルターでろ過し、次いでろ過後の水溶液に種培養液を５ｍＬ加え、２５℃、１３０ｒｐｍで振盪培養した。培養中に、５％グルコース水溶液を当該培地に連続して添加した。また、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキスも当該培地に適時添加した。
この培養中の培地から、２００μＬを随時サンプリングした。サンプリングした培地を精製水で１０倍希釈し、ＨＰＬＣ分析により１，５－ＡＭと１，５－ＡＧのピーク面積を測定して、１，５－ＡＭ変換率を求めた。発酵時間と１，５－ＡＭ変換率（％）の関係を図１に示す。この結果、発酵時間が２６４時間での１，５－ＡＭ変換率は７６．２％に達した。
ＹＭ液体培地を１５ｍＬ容の遠心チューブに５ｍＬ調製し、この遠心チューブ中に寒天培地（グルコース１２．０％、ペプトン０．５１．０％、酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、寒天粉末１．５％、ｐＨ６．２）で培養したウィッカーハモマイセス・アノマルス種の菌株（ＮＢＲＣ０７０７）を１白金耳接種し、３０℃、１３０ｒｐｍで一晩振盪培養した。これを種培養液とした。別途、ペプトンを１．０ｇ、酵母エキスを０．６ｇ、麦芽エキスを０．６ｇ、および１，５－ＡＦ１２ｇを１００ｍＬの精製水に溶解した。該水溶液をポアサイズ０．２μＭのメンブレンフィルターでろ過し、次いでろ過後の水溶液に種培養液を５ｍＬ加え、２５℃、１３０ｒｐｍで振盪培養した。培養中に、５％グルコース水溶液を当該培地に連続して添加した。また、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキスも当該培地に適時添加した。
この培養中の培地から、２００μＬを随時サンプリングした。サンプリングした培地を精製水で１０倍希釈し、ＨＰＬＣ分析により１，５－ＡＭと１，５－ＡＧのピーク面積を測定して、１，５－ＡＭ変換率を求めた。発酵時間と１，５－ＡＭ変換率（％）の関係を図１に示す。この結果、発酵時間が２６４時間での１，５－ＡＭ変換率は７６．２％に達した。
【図1】