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特開2023-182231ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ Ｓ糖タンパク質エクトドメインを含むプロテオリポソームおよびワクチンとしてのそれらの使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023182231
(43)【公開日】2023-12-26
(54)【発明の名称】ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ Ｓ糖タンパク質エクトドメインを含むプロテオリポソームおよびワクチンとしてのそれらの使用
(51)【国際特許分類】
C07K 14/165 20060101AFI20231219BHJP
C12N 15/50 20060101ALI20231219BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20231219BHJP
A61K 9/127 20060101ALI20231219BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20231219BHJP
A61K 39/215 20060101ALI20231219BHJP
A61K 47/44 20170101ALI20231219BHJP
A61K 9/12 20060101ALI20231219BHJP
【ＦＩ】
C07K14/165 ZNA
C12N15/50
C12P21/02 C
A61K9/127
A61P31/14
A61K39/215
A61K47/44
A61K9/12
【審査請求】未請求
【請求項の数】20
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022095715
(22)【出願日】2022-06-14
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り （１）２０２１年７月２６日、「ｂｉｏＲｘｉｖ Ｐｒｅｐｒｉｎｔ」（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２１．０７．２６．４５３７５５）、（２）２０２２年１月２３日、「Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｘｃｒｍ．２０２２．１００５２８）
(71)【出願人】
【識別番号】516247100
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・グルノーブル・アルプ
【氏名又は名称原語表記】Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ Ｇｒｅｎｏｂｌｅ Ａｌｐｅｓ
(71)【出願人】
【識別番号】519208029
【氏名又は名称】セントレ ナシオナル ドゥ ラ レシェルシェ サイエンティフィク
(71)【出願人】
【識別番号】502124444
【氏名又は名称】コミッサリア ア レネルジー アトミーク エ オ ゼネルジ ザルタナテイヴ
(71)【出願人】
【識別番号】313006773
【氏名又は名称】サントル オスピタリエ ユニヴェルシテール グルノーブル アルプ
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＨＯＳＰＩＴＡＬＩＥＲ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＩＲＥ ＧＲＥＮＯＢＬＥ ＡＬＰＥＳ
(74)【代理人】
【識別番号】100098394
【弁理士】
【氏名又は名称】山川 茂樹
(72)【発明者】
【氏名】ヴァイセンホルン，ヴィンフリート
(72)【発明者】
【氏名】スルバラン・マチャド，グイデン
(72)【発明者】
【氏名】ギリゲイ，デルフィーヌ
(72)【発明者】
【氏名】エファンタン，グレゴリー
(72)【発明者】
【氏名】アーメン，アクセル
(72)【発明者】
【氏名】ポワナール，パスカル
(72)【発明者】
【氏名】ル・グラン，ロジェ
(72)【発明者】
【氏名】メゾナス，ポリーヌ
【テーマコード（参考）】
4B064
4C076
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG32
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE12
4B064DA01
4C076AA19
4C076AA24
4C076AA93
4C076BB11
4C076BB13
4C076BB14
4C076BB15
4C076BB16
4C076BB25
4C076CC35
4C076EE52
4C076FF02
4C085AA03
4C085BA71
4C085BB33
4C085BB36
4C085DD86
4C085EE01
4C085EE06
4C085FF24
4C085GG01
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG06
4C085GG10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA01
4H045DA86
4H045EA31
4H045FA74
4H045GA22
4H045GA26
(57)【要約】
【課題】 コロナウイルス感染、特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の予防および／または治療。
【解決手段】 それぞれ少なくともＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質エクトドメインを含む３つの組換えプロトマーを含む組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質エクトドメイン三量体であって、各プロトマーにおいて、フューリン切断部位は不活化／破壊され；上記プロトマーの１つのＡｒｇ４０８は上記プロトマーの別のもののＬｙｓ３７８に共有結合的に連結され；かつ上記プロトマーの１つのＬｙｓ９４７は、上記プロトマーの別のもののＡｒｇ１０１９および／またはＬｙｓ７７６に共有結合的に連結されている三量体が開示される。
【選択図】図１
【解決手段】 それぞれ少なくともＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質エクトドメインを含む３つの組換えプロトマーを含む組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質エクトドメイン三量体であって、各プロトマーにおいて、フューリン切断部位は不活化／破壊され；上記プロトマーの１つのＡｒｇ４０８は上記プロトマーの別のもののＬｙｓ３７８に共有結合的に連結され；かつ上記プロトマーの１つのＬｙｓ９４７は、上記プロトマーの別のもののＡｒｇ１０１９および／またはＬｙｓ７７６に共有結合的に連結されている三量体が開示される。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
それぞれ少なくともＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質エクトドメインを含む３つの組換えプロトマーを含む組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質エクトドメイン三量体であって、
前記プロトマーの各々において、天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の６８２～６８５番に位置するフューリン切断部位は不活化／破壊され；
前記プロトマーの１つの天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の４０８番の位置のアミノ酸残基は、前記プロトマーの別のものの天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の３７８番の位置のアミノ酸残基に共有結合的に連結され；並びに
前記プロトマーの１つの天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の９４７番の位置のアミノ酸残基は、前記プロトマーの別のものの天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の１０１９番の位置のアミノ酸残基に共有結合的に連結され、かつ／または前記プロトマーの１つの天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の９４７番の位置のアミノ酸残基は、前記プロトマーの別のものの天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の７７６番の位置のアミノ酸残基に共有結合的に連結されている、
三量体。
前記プロトマーの各々において、天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の６８２～６８５番に位置するフューリン切断部位は不活化／破壊され；
前記プロトマーの１つの天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の４０８番の位置のアミノ酸残基は、前記プロトマーの別のものの天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の３７８番の位置のアミノ酸残基に共有結合的に連結され；並びに
前記プロトマーの１つの天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の９４７番の位置のアミノ酸残基は、前記プロトマーの別のものの天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の１０１９番の位置のアミノ酸残基に共有結合的に連結され、かつ／または前記プロトマーの１つの天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の９４７番の位置のアミノ酸残基は、前記プロトマーの別のものの天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の７７６番の位置のアミノ酸残基に共有結合的に連結されている、
三量体。
【請求項2】
前記プロトマーの各々において、天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の６８２～６８５番に位置するアミノ酸残基は、配列ＧＳＡＳ（配列番号２）のアミノ酸モチーフによって置換されている、請求項１に記載の三量体。
【請求項3】
前記プロトマーの各々は、Ｃ末端三量体化ドメインに連結されている、請求項１に記載の三量体。
【請求項4】
前記プロトマーの各々において、天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の４０８番の位置のアミノ酸残基はアルギニン残基であり、天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の３７８番の位置のアミノ酸残基はリシン残基であり、かつ、前記プロトマーの１つの前記アルギニン残基と前記プロトマーの別のものの前記リシン残基はメチレン架橋により連結されている、請求項１に記載の三量体。
【請求項5】
前記プロトマーの各々、天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の９４７番の位置のアミノ酸残基はリシン残基であり、天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の１０１９番の位置のアミノ酸残基はアルギニン残基であり、かつ、前記プロトマーの１つの前記リシン残基と前記プロトマーの別のものの前記アルギニン残基はメチレン架橋により連結されている、請求項１に記載の三量体。
【請求項6】
前記プロトマーの各々、天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の９４７番の位置のアミノ酸残基はリシン残基であり、天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の７７６番の位置のアミノ酸残基はリシン残基であり、かつ、前記リシン残基どうしはメチレン架橋により連結されている、請求項１に記載の三量体。
【請求項7】
前記プロトマーの各々は、天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の９８６番および９８７番の位置に少なくとも２つのプロリン置換を含む、請求項１に記載の三量体。
【請求項8】
前記プロトマーの各々は、そのＣ末端で少なくとも１つのタグに連結されている、請求項１に記載の三量体。
【請求項9】
前記プロトマーの各々は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質の最初の１２０８のアミノ酸残基またはそれと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を含む、請求項１に記載の三量体。
【請求項10】
ホモ三量体である、請求項１に記載の三量体。
【請求項11】
宿主細胞において前記組換えプロトマーをコードする核酸分子を発現させて前記三量体を生産すること、
前記三量体を精製すること、および
前記三量体をホルムアルデヒドで処理すること
を含む、請求項１に記載の三量体の生産方法。
前記三量体を精製すること、および
前記三量体をホルムアルデヒドで処理すること
を含む、請求項１に記載の三量体の生産方法。
【請求項12】
表面が請求項１に記載の三量体でコーティングされた脂質小胞を含むプロテオリポソーム。
【請求項13】
前記脂質小胞は、６０質量％のＬ－α－ホスファチジルコリン、３６質量％のコレステロールおよび４質量％のポリヒスチジンタグコンジュゲート脂質を含む、請求項１２に記載のプロテオリポソーム。
【請求項14】
前記三量体を前記脂質小胞とともにインキュベートすることを含む、請求項１２に記載のプロテオリポソームの調製方法。
【請求項15】
請求項１２または１３に記載のプロテオリポソーム、ならびに任意選択により薬学上許容される担体および／またはアジュバントを含む、ワクチン。
【請求項16】
単位用量中に５０～１００μｇの前記プロテオリポソームを含む、請求項１５に記載のワクチン。
【請求項17】
対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を治療または予防するための請求項１５または１６に記載のワクチン。
【請求項18】
前記対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の治療または予防は、前記ワクチンを前記対象に少なくとも２回投与することを含む、請求項１７に記載のワクチン。
【請求項19】
前記対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の治療または予防は、前記ワクチンを前記対象に少なくとも３回投与することを含む、請求項１７に記載のワクチン。
【請求項20】
前記対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の治療または予防は、前記ワクチンを前記対象に筋肉内または鼻腔内投与することを含む、請求項１７に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、コロナウイルス感染、特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を予防および／または治療の分野に関する。
【0002】
より詳しくは、本発明は、天然コンフォメーションで安定化された組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質エクトドメイン三量体、ならびにこのような組換え三量体を含むプロテオリポソームおよびこのようなプロテオリポソームに基づくワクチンに関する。本発明はまた、このようなワクチンを用いて対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を治療または予防する方法に関する。
【背景技術】
【0003】
ベータコロナウイルスである重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２、すなわち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、コロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）の病原体であり、瞬く間に世界的パンデミックに拡大し、２０２１年１１月時点の死者は５００万人を超え、有効な感染制御および予防の切迫したニーズが強調される。
【0004】
抗ウイルスワクチンの保護と中和抗体の生成には大きな相関がある。中和抗体を誘導するための主要なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的は、スパイク（Ｓ）糖タンパク質であり、これは特に表面に位置するために、宿主細胞に対するウイルスの付着、融合および侵入に不可欠な役割を果たしている。Ｓ糖タンパク質は、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を保持するＳ１サブユニットとウイルス膜にＳ三量体を係留するＳ２膜融合サブユニットから構成される。
【0005】
ＲＢＤが細胞受容体アンギオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）に結合するとウイルスが付着し、続いてのＳ２により媒介されるエンドソーム膜との融合が感染を確立する。Ｓ糖タンパク質は、三量体の前駆体ポリタンパク質として合成され、これはゴルジでフューリンおよびフューリン様プロテアーゼによってタンパク質分解により切断され、非共有結合的に連結されたＳ１－Ｓ２ヘテロ三量体を生成する。Ｓ糖タンパク質の構造から、Ｓ１（ＮＴＤ、ＲＢＤ、ＲＢＭおよび２つのサブドメイン）、Ｓ２（膜貫通領域）および細胞質ドメインから構成されるコンパクトなヘテロ三量体であることが明らかである。ＲＢＤのコンフォメーションは、受容体が接近不能な閉鎖したコンフォメーションにある全ＲＢＤまたは受容体が接近可能な「アップ」コンフォメーションにある１つもしくは２つのＲＢＤの間の動的平衡状態にある。「アップ」位のＳ ＲＢＤのみに受容体の結合が可能であり、これによって、タンパク質分解により切断されたＳ糖タンパク質にＳ２融合後コンフォメーションが誘導される（非特許文献１；非特許文献２）。
【0006】
Ｓ糖タンパク質を標的とする抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２血清転換の際に同定され、主として免疫優性であるＲＢＤを標的とする(非特許文献３)。これによって多くの中和抗体の単離に至り、抗体に基づくワクチン接種戦略が確立された。これらの抗体の多くは、小動物および非ヒト霊長類におけるＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２抗原投与に対してｉｎ ｖｉｖｏ防御効果を有することが示されており、臨床開発および使用中である（非特許文献４）。
【0007】
自然感染の際のＳ糖タンパク質に対する抗体応答の大きさは様々であり、疾病の重症度および期間と相関する。基礎応答は一般に感染後数か月維持されるが、特に無症候性個体では数週間で低下する。従って、ワクチンに基づくアプローチは長期間持続する免疫を誘導することを目標にする。
【0008】
ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２感染を研究するために、マカクザルモデルを始めとするいくつかの動物モデルが開発されており、感染時に自然応答、細胞性応答および体液性応答を誘導し、再感染に対して部分的保護を付与することが実証された(非特許文献５)。結果として、現在認可されているＳ特異的ｍＲＮＡ送達に基づくワクチン（ＢＮＴ１６２ｂ２、Ｐｆｉｚｅｒ／ＢｉｏＮＴｅｃｈ；ｍＲＮＡ－１２７３、Ｍｏｄｅｒｎａ）、アデノウイルスベクター（ＣｈＡｄＯｘ１ ｎＣｏＶ－１９、Ｏｘｆｏｒｄ／ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ；Ａｄ２６．ＣＯＶ２．Ｓ、Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ）および不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＰｉＣｏＶａｃｃ／ＣｏｒｏｎａＶａｃ、Ｓｉｎｏｖａｃ）を含む初期の多くのワクチン候補がマカクザルモデルに対して防御効果があった。古典的サブユニットアプローチを採った場合、Ｓ糖タンパク質サブユニットワクチン候補は、前臨床試験において種々のレベルの中和抗体応答を生じた（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Yan et al. (2020). Science 367, 1444-1448
【非特許文献2】Lan et al. (2020). Nature 581, 215-220
【非特許文献3】Piccoli et al. (2020). Cell 183, 1024-1042
【非特許文献4】Weinreich et al. (2021). N Engl J Med 384, 238-251
【非特許文献5】Deng et al. (2020). Science 369, 818-823
【非特許文献6】Liang et al. (2021). Nat Commun 12, 1346
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らは、今般、特定の修飾を含む組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質エクトドメイン三量体は、リポソームを使用した合成ウイルス様粒子に組み込まれた場合に、それを投与した動物を少なくとも野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびアルファ偽ウイルス変異株による感染から効率的に保護し、殺菌免疫を提供することによって、より詳しくは、粘膜の免疫応答を増強することによって低い効力でベータおよびガンマ偽ウイルス変異株を中和することを見出した。さらに、ＲＢＤ特異的抗体は初回および２回目の免疫誘導後には優勢であるが、３回目の免疫誘導のＳ特異的ＥＤ５０中央値はＲＢＤ特異的ＥＤ５０の３倍であり、３回以上の免疫誘導が非ＲＢＤ Ｓエピトープを標的とする反応性Ｂ細胞レパートリーの拡大増殖を可能とし、天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびその変異株に対するワクチン開発の分野で特に有利となることが示唆される。
【0011】
より詳しくは、本発明の１つの目的は、それぞれ少なくともＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質エクトドメインを含む３つの組換えプロトマーを含む組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質エクトドメイン三量体であり、少なくとも、
各プロトマーにおいて、天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の６８２～６８５番に位置するフューリン切断部位は不活化／破壊され；
上記プロトマーの１つ天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の４０８番に位置するアミノ酸残基は、上記プロトマーの別のものの天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の３７８番に位置するアミノ酸残基に共有結合的に連結され；ならびに
上記プロトマーの１つの天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の９４７番に位置するアミノ酸残基は、上記プロトマーの別のものの天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の１０１９番に位置するアミノ酸残基に共有結合的に連結され、かつ／または上記プロトマーの天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の９４７番に位置するアミノ酸残基は、上記プロトマーの別のものの天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の７７６番に位置するアミノ酸残基に共有結合的に連結されている。
各プロトマーにおいて、天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の６８２～６８５番に位置するフューリン切断部位は不活化／破壊され；
上記プロトマーの１つ天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の４０８番に位置するアミノ酸残基は、上記プロトマーの別のものの天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の３７８番に位置するアミノ酸残基に共有結合的に連結され；ならびに
上記プロトマーの１つの天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の９４７番に位置するアミノ酸残基は、上記プロトマーの別のものの天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の１０１９番に位置するアミノ酸残基に共有結合的に連結され、かつ／または上記プロトマーの天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の９４７番に位置するアミノ酸残基は、上記プロトマーの別のものの天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の７７６番に位置するアミノ酸残基に共有結合的に連結されている。
【0012】
これらの特徴を備えた三量体は有利には、天然コンフォメーションで安定化される。
【0013】
本発明の特定の実施形態では、上記三量体組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質エクトドメインの各プロトマーは、
天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の６８２～６８５番に位置するアミノ酸残基が配列ＧＳＡＳ（配列番号２）のアミノ酸モチーフにより置換され；かつ／または
それがＣ末端三量体化ドメインに連結され；かつ／または
それが天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の９８６および９８７番の位置の少なくとも２つのプロリン置換を含み；かつ／または
それがそのＣ末端で少なくとも１つのタグに連結され；かつ／または
それがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質の最初の１２０８のアミノ酸残基若しくはそれと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を含む、特に、それらからなる。
天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の６８２～６８５番に位置するアミノ酸残基が配列ＧＳＡＳ（配列番号２）のアミノ酸モチーフにより置換され；かつ／または
それがＣ末端三量体化ドメインに連結され；かつ／または
それが天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の９８６および９８７番の位置の少なくとも２つのプロリン置換を含み；かつ／または
それがそのＣ末端で少なくとも１つのタグに連結され；かつ／または
それがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質の最初の１２０８のアミノ酸残基若しくはそれと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を含む、特に、それらからなる。
【0014】
特定の実施形態では、
天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の４０８番に位置するアミノ酸残基はアルギニン残基であり、天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の３７８番に位置するアミノ酸残基はリシン残基であり、かつ、上記プロトマーの１つの上記アルギニン残基と上記プロトマーの別のものの上記リシン残基は、メチレン架橋により連結され；かつ／または
天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の９４７番に位置するアミノ酸残基はリシン残基であり、天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の１０１９番に位置するアミノ酸残基はアルギニン残基であり、かつ、上記プロトマーの１つの上記リシン残基と上記プロトマーの別のものの上記アルギニン残基は、メチレン架橋により連結され；かつ／または
天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の９４７番に位置するアミノ酸残基はリシン残基であり、天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の７７６番に位置するアミノ酸残基はリシン残基であり、かつ、上記リシン残基どうしはメチレン架橋により連結されている。
天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の４０８番に位置するアミノ酸残基はアルギニン残基であり、天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の３７８番に位置するアミノ酸残基はリシン残基であり、かつ、上記プロトマーの１つの上記アルギニン残基と上記プロトマーの別のものの上記リシン残基は、メチレン架橋により連結され；かつ／または
天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の９４７番に位置するアミノ酸残基はリシン残基であり、天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の１０１９番に位置するアミノ酸残基はアルギニン残基であり、かつ、上記プロトマーの１つの上記リシン残基と上記プロトマーの別のものの上記アルギニン残基は、メチレン架橋により連結され；かつ／または
天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の９４７番に位置するアミノ酸残基はリシン残基であり、天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の７７６番に位置するアミノ酸残基はリシン残基であり、かつ、上記リシン残基どうしはメチレン架橋により連結されている。
【0015】
本発明の特定の実施形態では、三量体は、ホモ三量体である。
【0016】
本発明によれば、このような組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質エクトドメイン三量体を生産する方法は、宿主細胞において上記プロトマーをコードする核酸分子を発現させて上記三量体を生産すること、上記三量体を精製すること、および上記三量体をホルムアルデヒドで処理することを含む。
【0017】
本発明の別の目的は、表面が本発明の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質エクトドメイン三量体でコーティングされた脂質小胞を含むプロテオリポソームである。
【0018】
このようなプロテオリポソームの調製方法は、上記三量体を上記脂質小胞とともにインキュベートすることを含む。
【0019】
本発明の別の目的は、本発明のプロテオリポソーム、ならびに任意選択により薬学上許容される担体および／またはアジュバントを含むワクチンである。
【0020】
本発明はまた、対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の治療または予防するための本発明のワクチンの治療的使用に関する。
【0021】
本発明の特定の実施形態では、対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の治療または予防は、対象にワクチンを少なくとも２回、または少なくとも３回投与することを含む。
【0022】
ワクチンは、特に、対象に筋肉内または鼻腔内投与され得る。
【0023】
本発明の特徴および利点は、図１～７を補助として以下の実施例に照らしてより明らかとなり、これらの実施例は例示目的で提供されるに過ぎず、本発明を何ら限定しない。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】図１は、本発明（ＦＡ－Ｓ）の三量体およびこの三量体に基づくプロテオリポソーム（ＦＡ－Ｓ－ＬＶｓ）の構造的特徴の結果を示す。（Ａ）左のパネル、３つ全てＲＢＤダウンのＦＡ－ＳのクライオＥＭ密度。この構造はＣ３対称とした１２６，７１９粒子から計算した；中央のパネル、リボンとして示される３．４Åの分解能まで精密化したＦＡ－Ｓの分子モデル。モデル化されたＮ結合グリカンが全原子モデルとして示される；右のパネル、異なるプロトマーからのＲＢＤとＳ２サブユニットを共有結合的に連結する２つの主要な架橋部位。（Ｂ）ＲＢＤ間の架橋部位の拡大（左のパネル）；側鎖を接続する連続密度により示されるような隣接するプロトマーのＫ３７８およびＲ４０８のホルムアルデヒド架橋アミノ基（右のパネル）。（Ｃ）Ｓ２間の架橋部位の拡大（左のパネル）；中央のヘリックスＲ１０１９ならびにＳ２ Ｋ７７６とＳ２ ＨＲ１Ｋ９４７との間の連続密度は、プロトマー間の、占有率の等しい２つの交互架橋を示す（右のパネル）。（Ｄ）Ｓ三量体によるリポソームの規則的装飾を明らかにするＦＡ－Ｓ－ＬＶｓのネガティブ染色電子顕微鏡による分析。５０のＦＡ－Ｓ－ＬＶｓ（ネガティブ染色ＥＭ二次元画）上でのＦＡ－Ｓ三量体の計数は、２３１±９２の三量体を示した。よって、およそまたは少なくとも４６０±１８４のＦＡ－Ｓ三量体がＬＶｓと結合していると推定される。スケールバーは２００ｎｍ。
【図2】図２は、カニクイザルのＦＡ－Ｓ－ＬＶｓワクチン接種により誘導された抗体応答の分析結果を示す。（Ａ）ワクチン接種、抗原投与およびサンプル採取のスキーム。シリンジはワクチン接種の時点を示し、ウイルス粒子は抗原投与の時点を示す。全ての図で各マカクザルを識別する記号を使用する。（Ｂ）試験中、０、２、４、６、８、１０、１２、２２、２４、２６、２８週目に決定されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質特異的ＩｇＧのＥＬＩＳＡ、各動物のＡｂ力価を示す。（Ｃ）試験中示された週数に決定されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＦＡ－Ｓタンパク質特異的ＩｇＧのＥＬＩＳＡ。（Ｄ）試験中示された週数に決定されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＢＤ特異的ＩｇＧのＥＬＩＳＡ。パネル（Ｂ）、（Ｃ）、および（Ｄ）については、対応する群間の差はウィルコクソンの符合順位検定（ｐ＜０．１）を用いて比較した。（ＥおよびＦ）鼻咽頭液におけるＳ特異的ＩｇＧ（Ｅ）およびＩｇＡ（Ｆ）の検出。鼻咽頭ぬぐい液におけるＬｕｍｉｎｅｘに基づく血清アッセイで測定したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳへのＩｇＧおよびＩｇＡの結合の相対平均蛍光強度（ＭＦＩ）。バックグラウンドレベルを点線で示す。水平の線は、抗原投与日を示す。パネル（Ｅ）および（Ｆ）では、群はマン・ホイットニーＵ検定（＊ｐ＜０．０５）を用いて比較した。Ａ～Ｆに示されたデータは技術的反復からのものである。
【図3】図３は、ＦＡ－Ｓ－ＬＶｓワクチン接種時のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスの血清中和を示す。（Ａ）Ａｂ力価を中和するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の進化を、０、２、４、６、８、１１、１２、１９週目に採取した血清に関して示す。バーは４個体の動物の力価中央値を示す。対応する群間の差はウィルコクソン符合順位検定（ｐ＜０．１）を用いて比較した。示されたデータは技術的反復からのものである。（Ｂ）アフィニティークロマトグラフィーによれば１１週目の血清ではＲＢＤ特異的Ａｂが枯渇し、各動物の完全な血清の中和活性を１００％とし、ＲＢＤ枯渇血清およびＲＢＤ特異的血清と比較した。
【図4】図４は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対するカニクイザルのＦＡ－Ｓ－ＬＶｓ免疫誘導の結果を示す。抗原投与後の対照（黒）およびワクチン接種した（灰色）マカクザルの気管ぬぐい液（左）および鼻咽頭ぬぐい液（中央）におけるゲノム（Ａ）およびサブゲノム（ｓｇ）ＲＮＡウイルス量（Ｂ）。抗原投与後の対照およびワクチン接種したマカクザルにおける気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）中のウイルス量を示す（右）。バーはウイルス量中央値を示す。垂直の点線は、抗原投与日を示す。水平の点線は、定量限界示す。示されたデータは技術的反復からのものである。示されたデータは技術的反復からのものである。
【図5】図５は、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２抗原投与後のワクチン接種および対照カニクイザルの血清抗体力価および中和の分析の結果を示す。抗体ＩｇＧ力価は、（Ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ、（Ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＦＡ－Ｓおよび（Ｃ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＢＤに対して２４週目（抗原投与）、２５週目、２６週目、２７週目および２８週目にＥＬＩＳＡによって決定した。ワクチン接種動物を灰色の記号で示し、対照動物を黒い記号で示す。（Ｄ）２４週目（抗原投与）および曝露１週間後、２週間後および４週間後（２５週目、２６週目、２８週目）のＳＡＲＳ ＣｏＶ－２偽ウイルス中和力価。バーは力価中央値を示す。パネルＡ～Ｄについて、対応する群間の差は、ウィルコクソン符合順位検定（ｐ＜０．１）を用いて比較した。Ａ～Ｄに示されたデータは技術的反復からのものである。
【図6】図６は、ＦＡ－Ｓ－ＬＶ免疫カニクイザルにおける抗原特異的ＣＤ４ Ｔ細胞応答を示す。免疫誘導後（ｐ．ｉｍ．）（Ｗ）２１週目（すなわち、４回目の免疫誘導の２週間後、曝露前）および曝露１４日後（ｄｐｅ．）の各免疫したマカクザル（ｎ＝４）に関するそれぞれ総ＣＤ４＋Ｔ細胞集団中の（Ａ）ＩＦＮγ＋、ＴＦＮα＋およびＩＬ－２＋、（Ｂ）Ｔｈ１（ＩＦＮ γ＋／－、ＩＬ－２＋／－、ＴＮＦα＋）、（Ｃ）ＩＬ－１３＋および（Ｄ）ＩＬ－１７＋抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ１５４＋）の頻度。ＰＢＭＣを培養培地単独（「ＮＳ」、薄い灰色の記号）またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓオーバーラッピングペプチドプール（「Ｓ１＋Ｓ２」、灰色の記号）で一晩刺激した。バーは平均を示す。各実験群の時点は、ウィルコクソン符合順位検定を用いて比較した。
【発明を実施するための形態】
【0025】
組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質エクトドメイン三量体
本発明の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質エクトドメイン三量体は、それぞれ少なくともＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳ糖タンパク質エクトドメインを含む３つの組換えプロトマーを含む。
本発明の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質エクトドメイン三量体は、それぞれ少なくともＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳ糖タンパク質エクトドメインを含む３つの組換えプロトマーを含む。
【0026】
本発明の特に好ましい実施形態では、これらの３つのプロトマー同一であり、従って、本発明の三量体はホモ三量体である。
【0027】
本発明の別の実施形態では、これらの３つのプロトマーは全て互いに異なるか、またはそのうち２つが同一であり、もう１つが異なる。
【0028】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質エクトドメインは、本発明では、慣例として、細胞外間隙に伸びるタンパク質のドメインと定義される。より詳しくは、最初に同定されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス（重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２武漢－Ｈｕ－１分離株）のＳ糖タンパク質のアミノ酸配列では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質のエクトドメインは、アミノ残基１２～１１９０に相当する。本明細書で「天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質」と称されるこのＳ糖タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースには受託番号ＭＮ９０８９４７．３（「Ｓ」コード配列（ヌクレオチド２１５６３～２５３８４））として記載されている。
【0029】
本発明によれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質エクトドメインには、本明細書で「天然エクトドメイン」と称される配列番号３のアミノ酸配列の天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質のエクトドメイン、ならびに中和抗体応答を誘導する天然エクトドメインの応力を保持する、および好ましくは配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％、いっそうより好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するその任意の変異体が含まれる。
【0030】
このような変異株は、最初に同定されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの任意の変異株または突然変異株、例えば、変異株アルファ（変異株Ｂ．１．１．７としても知られる）、変異株ベータ（変異株Ｂ．１．３５１としても知られる）、変異株ガンマ（変異株Ｐ．１としても知られる）、変異株デルタ（変異株Ｂ．１．６１７．２としても知られる）、変異株オミクロン（変異株Ｂ．１．１．５２９としても知られる）などのＳ糖タンパク質エクトドメインからなり得るか、またはそれと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％、いっそうより好ましくは少なくとも９９％のアミノ酸同一性を有し、かつ、中和抗体応答を誘導するそれらの能力を保持する任意のタンパク質からなり得る。
【0031】
天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質エクトドメインの変異株は、特に、参照配列を構成する天然エクトドメインの配列に比べて、挿入、欠失および／または置換、特に、Ｎ末端および／またはＣ末端修飾、および／またはアミノ酸残基間の非天然結合を有してよい。置換の場合、これは好ましくは、元のアミノ酸と同じファミリーのアミノ酸によって、例えば、アルギニンなどの塩基性残基の、リシン残基などの別の塩基性残基による置換、アスパラギン酸などの酸性残基の、グルタミン酸などの別の酸性残基による置換、セリンなどの極性残基の、トレオニンなどの別の極性残基による置換、ロイシンなどの脂肪族残基の、イソロイシンなどの別の脂肪族残基による置換などによって行われる。
【0032】
２つのアミノ酸配列間の同一性のパーセンテージは、本明細書では、それ自体慣例の方法で、２つの最適にアラインされた配列を比較ウインドウで比較することによって決定される。比較ウインドウ内で比較され、比較ウインドウ内に位置するアミノ酸配列は、それらの２配列間で最適なアラインメントを得るために参照配列に対して付加または削除を含んでもよい。次に、同一性パーセンテージは、比較する２配列でアミノ酸残基が同一である位置の数を求めた後、この位置の数を比較ウインドウ内の位置の総数で割り、得られた数値に１００を掛けて２配列間の同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。
【0033】
特に融合前の状態において安定性が改善されたと従来技術に記載された天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質エクトドメインの変異体は、本発明の文脈で特に好ましい。
【0034】
特定の実施形態では、少なくとも１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つの本発明のプロトマーは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質エクトドメインからなる。別の実施形態では、それ／それらはまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質の付加的アミノ酸残基、例えば、その残基１～１１および／または残基１１９１～１２０８も含む。
【0035】
本明細書の全域において、アミノ酸の位置は、天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）の配列を参照して示される。これらの位置は、考慮するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質の変異体に応じて若干異なる場合がある。所与の変異体に関して、特定のアミノ酸に基づいて、また、変異体の配列と天然配列との比較に基づいてこれらの位置を特定することは、当業者の技術の範囲内である。さらに、これらの位置がこのＳ糖タンパク質のエクトドメインの上流に位置するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質の最初のアミノ酸を含まない場合には、それらの位置は実際の組換えプロトマーにおける位置と必ずしも対応しない。本発明に関して定義されるアミノ酸残基のプロトマーにおける位置を天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質配列におけるその位置によって特定することは、当業者の技術の範囲内である。
【0036】
本発明の三量体の各プロトマーは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質の最初の１２０８のアミノ酸残基、あるいはそれと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性有し、かつ、中和抗体応答を誘導するその能力を保持するタンパク質を含み得る、またはからなり得る。このようなタンパク質は特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質の最初の１２０８のアミノ酸残基に関して１以上のアミノ酸置換、挿入および／または欠失を含み得る。
【0037】
本発明の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質エクトドメイン三量体では、各プロトマーにおいて、フューリン切断部位が不活化／破壊されている。このフューリン切断部位は、天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の６８２～６８５番に位置する残基に相当する４つのアミノ酸残基（天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質のアミノ酸配列のａｒｇ６８２、ａｒｇ６８３、ａｌａ６８４およびａｒｇ６８５）からなる。
【0038】
このフューリン切断部位のこのような不活性化は、フューリンなどの細胞プロテアーゼによるＳ１ドメインとＳ２ドメインの間の切断を防ぐことによって組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質エクトドメイン三量体の細胞安定性を増す。
【0039】
特定の実施形態では、本発明の三量体のプロトマーの少なくとも１つ、好ましくは２つ、より好ましくはそれぞれは、６８２Ｇ、６８３Ｓ、６８４Ａおよび／または６８５Ｓ置換を含む。
【0040】
特定の実施形態では、本発明の三量体のプロトマーの少なくとも１つ、好ましくは２つ、より好ましくはそれぞれにおいて、天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の６８２～６８５番に位置するものに相当するアミノ酸残基は、配列ＧＳＡＳ（配列番号２）のアミノ酸モチーフによって置換されている。
【0041】
本発明の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質エクトドメイン三量体において、上記プロトマーの１つの天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の４０８番の位置のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基は、上記プロトマーの別のものの天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の３７８番の位置のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基に共有結合的に連結されている。三量体の少なくとも２つのプロトマー間の架橋は有利には、これを天然の閉鎖した「ＲＢＤ－ダウン」コンフォメーションに維持する。これらのアミノ酸は、共有結合によって直接相互に連結されていてもよいし、またはスペーサーアームによって共有結合的に連結されていてもよい。一例として、これらのアミノ酸は、メチレン架橋によって相互に連結することができる。それ以外では、１つのプロトマーと他のプロトマーの間のこの架橋は、プロトマー内の好適な置換によって導入されたシステイン残基間の非天然ジスルフィド結合であり得る。
【0042】
好ましくは、少なくとも１つのプロトマーは、１つのプロトマーの４０８番の位置のアミノ酸と他のプロトマーの３７８番の位置のアミノ酸の間の分子間結合によって別のプロトマーに共有結合的に連結されている。これらのアミノ酸残基は、例えば、１つのプロトマーにおける３７８Ｃ置換および他のプロトマーにおける４０８Ｃ置換によって導入されるシステイン残基間のメチレン架橋または非天然ジスルフィド結合によって相互に結合させることができる。
【0043】
本発明の特定の実施形態では、少なくとも１つのプロトマーにおいて、好ましくは各プロトマーにおいて、天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の４０８番の位置のアミノ酸残基はアルギニン残基（Ａｒｇ４０８）であり、少なくとも別のプロトマーにおいて、好ましくは各プロトマーにおいて、天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の３７８番の位置のアミノ酸残基はリシン残基（Ｌｙｓ３７８）であり、上記プロトマーの上記アルギニン残基と上記プロトマーの別のものの上記リシン残基はメチレン架橋により連結されている。
【0044】
本発明の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質エクトドメイン三量体において、少なくとも１つのプロトマーは、Ｓ２サブユニット間の分子間結合によって別のプロトマー共有結合的に連結されている。より詳しくは、プロトマーの１つの天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の９４７番の位置のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基は、中央のＳ２ヘリックスに位置するプロトマーの別のものの天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の１０１９番の位置のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基に共有結合的に連結されている。三量体の少なくとも２つのプロトマー間のこの付加的架橋は有利には、三量体を安定化させる。これらのアミノ酸残基は、共有結合によって直接相互に連結されていてもよいし、またはスペーサーアームによって共有結合的に連結されていてもよい。一例として、これらのアミノ酸は、メチレン架橋によって相互に連結することができる。
【0045】
好ましくは、少なくとも１つのプロトマーは、中央のＳ２ヘリックスにおいて、プロトマーの９４７番の位置のアミノ酸残基と他のプロトマーの１０１９番の位置のアミノ酸残基の間の分子間結合によって別のプロトマーに共有結合的に連結されている。これらのアミノ酸残基は、例えば、１つのプロトマーの９４７番の位置のリシン残基と他のプロトマーの１０１９番の位置のアルギニン残基に結合しているメチレン架橋によって相互に連結させることができる。
【0046】
本発明の特定の実施形態では、少なくとも１つのプロトマーにおいて、好ましくは、各プロトマーにおいて、天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の９４７番の位置のアミノ酸残基はリシン残基（Ｌｙｓ９４７）であり、少なくとも別のプロトマーにおいて、好ましくは各プロトマーにおいて、天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の１０１９番の位置のアミノ酸残基はアルギニン残基（Ａｒｇ１０１９）であり、上記プロトマーの１つの上記リシン残基と上記プロトマーの別のものの上記アルギニン残基はメチレン架橋により連結されている。
【0047】
代わりに、または加えて、本発明の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質エクトドメイン三量体において、少なくとも１つのプロトマーは、Ｓ２サブユニット間の異なる分子間結合によって別のプロトマーに共有結合的に連結されている。より詳しくは、プロトマーの１つの天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の９４７番の位置のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基は、プロトマーの別のものの天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の７７６番の位置のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基に共有結合的に連結されている。三量体の少なくとも２つのプロトマー間のこの付加的架橋もまた有利には、三量体を安定化させる。これらのアミノ酸は、共有結合によって直接相互に連結されていてもよいし、またはスペーサーアームによって共有結合的に連結されていてもよい。一例として、これらのアミノ酸は、メチレン架橋によって相互に連結することができる。
【0048】
好ましくは、少なくとも１つのプロトマーは、１つのプロトマーの９４７番の位置のアミノ酸残基と他のプロトマーの７７６番の位置のアミノ酸の間の分子間結合によって別のプロトマーに共有結合的に連結されている。これらのアミノ酸残基は、例えば、１つのプロトマーの９４７番の位置のリシン残基および他のプロトマーの７７６番の位置のリシン残基に結合しているメチレン架橋によって相互に連結させることができる。
【0049】
本発明の特定の実施形態では、少なくとも１つのプロトマーにおいて、好ましくは各プロトマーにおいて、天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の９４７番の位置のアミノ酸残基はリシン残基（Ｌｙｓ９４７）であり、少なくとも別のプロトマーにおいて、好ましくは各プロトマーにおいて、天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の７７６番の位置のアミノ酸残基はリシン残基（Ｌｙｓ７７６）であり、上記プロトマーの９４７番の位置の上記リシン残基と上記プロトマーの別のものの７７６番の位置の上記リシン残基は、メチレン架橋により連結されている。
【0050】
本発明の三量体は、いずれの数およびいずれの組合せの上記の分子間共有結合を含むこともできる。
【0051】
これらの共有結合的分子間結合は、例えば、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質エクトドメイン三量体をホルムアルデヒドで処理することによって得ることができる。
【0052】
本発明者らは、意外にも、これらの共有結合的分子間結合は組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質エクトドメイン三量体を、有利には,閉鎖したＲＢＤ－ダウンコンフォメーションで、長期間安定化させ、融合後コンフォメーションに至るコンフォメーション変化を防ぐが、抗体生産を妨げず、抗体により認識されるエピトープをマスクしないことを見出した。よって、本発明の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質エクトドメイン三量体は、天然タンパク質の三次元エピトープを認識する抗体の生産を可能とする。
【0053】
本発明の三量体はまた、分子間または分子内結合であり得る、特にメチレン架橋を介した付加的共有結合を含み得る。これらの付加的結合は、上記のアミノ酸残基間、このような残基と他のアミノ酸残基の間、または他のアミノ酸残基間のものであり得る。
【0054】
本発明の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質エクトドメイン三量体において、１つ、２つまたは３つのプロトマーは、Ｃ末端および／またはＮ末端修飾を含み得る。
【0055】
本発明の特定の実施形態では、プロトマーの少なくとも１つ、好ましくは２つ、より好ましくはそれぞれは、三量体形態でのその安定性を増強するＣ末端三量体化ドメイン、例えば、Ｃ末端Ｔ４フィブリチン三量体化ドメイン、またはそれが連結されるタンパク質の三量体化を誘発および／または安定化するその能力が当業者に知られている他のいずれかのドメインに連結される。
【0056】
本発明の好ましい実施形態では、各プロトマーは、そのＣ末端に、延長Ｎ末端領域（Ｇ１－Ｑ１１）、β－ヘアピン（Ａ１２－Ｌ２３）、およびＣ末端３１０ヘリックス（Ｌ２３－Ｌ２７）からなるアミノ酸配列ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（配列番号４）の、フォルドンドメインとしても知られるＣ末端Ｔ４フィブリチン三量体化モチーフを含む。この延長Ｎ末端領域は、Ｐ４残基とＰ７残基の間にポリプロリンＩＩヘリックスを含み、疎水性接触によってβ－ヘアピンの一端に接して稠密となっている。
【0057】
本発明の特定の実施形態では、プロトマーの少なくとも１つ、好ましくは２、より好ましくはそれぞれは、天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の９８６番および９８７番の位置のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基に少なくとも２つのプロリン置換を含む。これらのプロリン置換は、細胞において三量体のその天然コンフォメーションでの安定性を増強する。
【0058】
本発明の特定の実施形態では、プロトマーの少なくとも１つ、好ましくは２、より好ましくはそれぞれは、好ましくは、天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列の８１７番、８９２番、８９９番および／または９４２番の位置のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基に、２～４つの付加的プロリン置換を含む。これらの付加的プロリン置換は、細胞において三量体のその天然コンフォメーションでの安定性をよりいっそう増強する。
【0059】
本発明の特定の実施形態では、プロトマーの少なくとも１つ、好ましくは２、より好ましくはそれぞれは、好ましくは、そのＣ末端において、その精製を容易にするためにツインＳｔｒｅｐ－ｔａｇ（登録商標）および／またはポリヒスチジンタグ（例えば、８つの連続するヒスチジン残基のもの）などの少なくとも１つのタグと連結される。
【0060】
ツインＳｔｒｅｐ－ｔａｇ（登録商標）は、配列ＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号５）の、間隔をおいた２つの同一のアミノ酸配列からなり、特定の操作を行ったストレプトアビジンに特異的に結合する能力を有する。
【0061】
各プロトマーは、Ｃ末端三量体化モチーフと１つまたは複数のタグの間に、配列ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号６）のＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ切断部位などの切断部位をさらに含み得る。
【0062】
本発明による組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質エクトドメイン三量体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む少なくとも１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つのプロトマーを含み得る。
【0063】
特定の実施形態では、プロトマーの少なくとも１つ、好ましくは２、より好ましくはそれぞれは、配列番号８のアミノ酸配列からなる。
【0064】
組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質エクトドメイン三量体を生産する方法
本発明による三量体を生産する方法は、
上記で定義されるような本発明の組換えプロトマーをコードする核酸分子を宿主細胞で発現させてこのようなプロトマーの三量体を生産すること、
この三量体を精製すること、および
この三量体をホルムアルデヒドで処理すること
を含む。
本発明による三量体を生産する方法は、
上記で定義されるような本発明の組換えプロトマーをコードする核酸分子を宿主細胞で発現させてこのようなプロトマーの三量体を生産すること、
この三量体を精製すること、および
この三量体をホルムアルデヒドで処理すること
を含む。
【0065】
この方法の第一のステップは、遺伝子組換えによる、少なくともＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質エクトドメインを含む３つのプロトマーの生産である。このステップは、当業者に公知の任意の様式によって、特に、これらのプロトマーをコードする核酸分子を含む発現ベクターを用いて行うことができる。全てのプロトマーが同一である場合このような核酸分子の１つだけが必要とされる。
【0066】
発現ベクターは、遺伝子工学において使用するためのそれ自体公知のいずれのタイプのものであってもよく、特に、本発明によるプロトマーをコードする配列の転写および翻訳のために必要な要素を含むプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージであり得る。発現ベクターは特に、各プロトマーに関して、機能的に連結された以下の要素：本発明によるプロトマーをコードするヌクレオチド配列の５’側に位置するプロモーター、およびこの配列の３’側の転写終結シグナルを含み得る。
【0067】
宿主細胞は、核酸分子が発現され得るいずれの細胞であってもよい。この宿主細胞は、同等に原核細胞、特に、プロトマーの大量生産のための細菌、または真核細胞であってよく、真核細胞は、下等または高等真核生物、例えば、酵母、無脊椎動物または哺乳動物細胞であり得る。宿主細胞は、安定な様式、誘導的様式もしくは構成的様式、あるいはまた一過性様式で本発明のプロトマーを発現し得る。一例として、本発明のプロトマーをコードする核酸分子は、ヒト胎児腎臓細胞株で一過性発現させ得る。
【0068】
宿主細胞は、発現およびこのようにして生産されたプロトマーの回収を可能とする条件下で培養され、プロトマーは三量体形態で自然に組み立てられる。細胞種に応じてこのような培養条件を決定することは、当業者の技術の範囲内である。
【0069】
このようにして得られた三量体は、それ自体公知のいずれの方法によって精製してもよい。本発明の特定の実施形態において、組換えプロトマーの少なくとも１つは、特に、そのＣ末端にポリヒスチジンタグなどのタグを含み、精製方法は、このタグの、結合相手、例えば、ポリヒスチジンタグの場合にはセファロース樹脂と結合する特定の能力を利用することができる。
【0070】
三量体をホルムアルデヒドで処理するステップは、プロトマー間、例えば、
４０８番の位置のアミノ酸残基、好ましくはＡｒｇ４０８と３７８番の位置のアミノ酸残基、好ましくはＬｙｓ３７８の間、
および９４７番の位置のアミノ酸残基、好ましくはＬｙｓ９４７と１０１９番の位置のアミノ酸残基、好ましくはＡｒｇ１０１９の間、および／または
９４７番の位置のアミノ酸残基、好ましくはＬｙｓ９４７と、７７６番の位置のアミノ酸残基、好ましくはＬｙｓ７７６の間
の分子内メチレン架橋の形成を可能とする条件で行われる。
４０８番の位置のアミノ酸残基、好ましくはＡｒｇ４０８と３７８番の位置のアミノ酸残基、好ましくはＬｙｓ３７８の間、
および９４７番の位置のアミノ酸残基、好ましくはＬｙｓ９４７と１０１９番の位置のアミノ酸残基、好ましくはＡｒｇ１０１９の間、および／または
９４７番の位置のアミノ酸残基、好ましくはＬｙｓ９４７と、７７６番の位置のアミノ酸残基、好ましくはＬｙｓ７７６の間
の分子内メチレン架橋の形成を可能とする条件で行われる。
【0071】
それは好ましくは、プロトマー間の完全な架橋を得るために数時間、少なくとも２時間、好ましくは一晩行われる。それは室温で、すなわち２０～２５℃の温度で行われる。
【0072】
一例として、三量体をホルムアルデヒドで処理するステップは、三量体を４％ｖ／ｖのホルムアルデヒドを含む水溶液と接触させることを含む。この水溶液に導入されるタンパク質の含量は好ましくは、０．３～１．２ｍｇ／ｍｌである。それは例えば約１ｍｇ／ｍｌである。
【0073】
プロテオリポソーム
本発明によるプロテオリポソームは、表面が本発明による組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質エクトドメイン三量体によりコーティングされた脂質小胞を含む。
本発明によるプロテオリポソームは、表面が本発明による組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質エクトドメイン三量体によりコーティングされた脂質小胞を含む。
【0074】
好ましくは定義された脂質組成のこのようなプロテオリポソームは、有利にはウイルス様粒子に類似し、組換え三量体の安定性の増大およびｉｎ ｖｉｖｏ循環半減期の延長をもたらす。ワクチンとして使用される場合、本発明のプロテオリポソームは、本発明の組換え三量体単独での免疫誘導よりも効率的な免疫応答を誘導する。
【0075】
脂質小胞は、特にワクチンとして、生物、例えば、ヒトへの投与のためのそれ自体公知のいずれのタイプのものであってもよい。
【0076】
本発明の特定の実施形態では、脂質小胞は、Ｌ－α－ホスファチジルコリン、コレステロールおよびポリヒスチジンタグコンジュゲート脂質、特に、５６～６１質量％のＬ－α－ホスファチジルコリン、３４～３６質量％のコレステロールおよび３～１０質量％のポリヒスチジンタグコンジュゲート脂質、例えば、６０質量％のＬ－α－ホスファチジルコリン、３６質量％のコレステロールおよび４質量％のポリヒスチジンタグコンジュゲート脂質の混合物を含む。
【0077】
ポリヒスチジンタグコンジュゲート脂質は、ニッケルまたはコバルト陽イオンなどの金属陽イオンを固定化するキレート剤によって修飾された脂質であり得る。例えば、Ａｖａｎｔｉ（登録商標）Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓにより名称ＤＧＳ－ＮＴＡ－（Ｎｉ２＋）（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－［（Ｎ－（５－アミノ－１－カルボキシペンチル）イミノ二酢酸）スクシニル］（ニッケル塩））として市販されている製品が使用できる。
【0078】
あるいは、脂質二重層に組み込まれたコバルトポルフィリンリン脂質（ＣｏＰｏＰ）が、ポリヒスチジンタグを有する糖タンパク質(Federizon et al, 2021, Pharmaceutics, 13, 98)、より詳しくは、本発明の文脈では、本発明の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質エクトドメイン三量体を付着させるために使用することができる。
【0079】
プロテオリポソームを調製する方法
本発明によるプロテオリポソームを調製する方法は、本発明の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質エクトドメイン三量体と脂質小胞とを、非共有結合的相互作用による脂質小胞の表面への三量体の固定化を確保するためにインキュベートすることを含む。
本発明によるプロテオリポソームを調製する方法は、本発明の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質エクトドメイン三量体と脂質小胞とを、非共有結合的相互作用による脂質小胞の表面への三量体の固定化を確保するためにインキュベートすることを含む。
【0080】
このインキュベーションは好ましくは、少なくとも６時間、好ましくは１２～２４時間、好ましくは２０～２５℃の温度で行われる。
【0081】
三量体／脂質小胞比は好ましくは、脂質小胞を飽和させるために十分過剰量のタンパク質、より詳しくは少なくとも２倍過剰のタンパク質を含むように選択される。三量体／脂質小胞比は好ましくは、２：１ ｗ／ｗ～４：１ ｗ／ｗである。この比は例えば３：１ ｗ：ｗに相当する。
【0082】
あるいは、本発明の組換え三量体は、例えば、三量体の少なくとも１つのプロトマーの少なくとも１つのシステイン残基、好ましくはプロトマーのＣ末端部分に位置するシステイン残基を、脂質小胞が保持する、スルフヒドリル基と反応し得る基と反応させることによって脂質小胞の表面に共有結合的に連結することができる。
【0083】
この方法は、得られるプロテオリポソームを精製する最終工程を含み得る。
【0084】
ワクチン
本発明によるワクチンは、上記で定義されるものなどのようなプロテオリポソーム、ならびに任意選択により薬学上許容される担体および／またはアジュバントを含む。
本発明によるワクチンは、上記で定義されるものなどのようなプロテオリポソーム、ならびに任意選択により薬学上許容される担体および／またはアジュバントを含む。
【0085】
薬学上許容される担体は、特にワクチン組成物の分野での従来のいずれの担体からなってもよい。担体は例えば液体水性担体である。
【0086】
宿主の免疫応答を増強し得るいずれのアジュバントが本発明のワクチンに含まれてもよい。アジュバントの例は、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）およびアルミニウム塩、例えば、水酸化アルミニウムもしくはリン酸アルミニウム、例えば、ＡＳ５０４、またはスクアレン、例えば、ＭＦ５９に基づく。
【0087】
本発明によるワクチンは、さらに、それ自体公知の従来のいずれの添加剤、ならびに任意選択により、他の有効物質を含有してもよい。
【0088】
本発明によるワクチンで使用可能な添加剤としては、賦形剤、希釈剤、界面活性剤、特に、ポリソルベート種のもの、分解防止剤などが挙げられる。
【0089】
本発明によるワクチンは、哺乳動物、特に、ヒト対象への投与に好適ないずれの投与形態で調剤することもできる。このワクチンは、好ましくは非経口投与に好適な投与形態で調剤される。特に、このワクチンは、筋肉内注射、静脈内注射、腹腔内注射もしくは皮下注射、または鼻腔経路もしくは吸入による投与に好適な投与形態で調剤することができる。このワクチンは、例えば、注射用溶液またはスプレー用製剤として調剤することができる。
【0090】
本発明のワクチンは、単回形態または多回形態、例えば、５用量バイアルに調整することができる。本発明の特定の実施形態では、ワクチンの単位用量は、５０～１００μｇの本発明のプロテオリポソームを含む。
【0091】
対象においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を治療または予防するためのワクチンの治療的使用
本発明のワクチンは、対象においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を治療または予防するために使用することができる。この使用は、この対象に治療上有効な量の本発明のワクチンを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２糖タンパク質Ｓエクトドメインに対する免疫応答が誘導されるように投与することを含む。
本発明のワクチンは、対象においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を治療または予防するために使用することができる。この使用は、この対象に治療上有効な量の本発明のワクチンを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２糖タンパク質Ｓエクトドメインに対する免疫応答が誘導されるように投与することを含む。
【0092】
対象は好ましくは、哺乳動物、特に、ヒト対象である。
【0093】
本発明のワクチンは、それを必要とする任意の対象、特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を受けている任意の対象、または予防的手段として、このような感染症にかかる可能性のある任意の非罹患対象を処置するために使用することができる。
【0094】
特に、本発明のワクチンによるカニクイザルの免疫誘導はワクチン株、アルファ、ベータおよびガンマ変異株に対する強力な中和活性を伴う高い抗体力価ならびにＴＨ１ ＣＤ４＋に偏向したＴ細胞応答を誘導することが発明者らによって見出された。高い力価は２回の免疫誘導後にすでに誘導され、２回の免疫誘導から２週間後のＩＤ５０中央値は約８０００であった。さらに、抗ＲＢＤ特異的抗体応答は初期に優勢であるが、３回目の免疫誘導は有意な非ＲＢＤ抗体力価を増強する。３回目の免疫誘導から４週間後、Ｓ特異的ＥＤ５０中央値はＲＢＤ特異的ＥＤ５０の３倍である。この傾向は４回目の免疫誘導後も続き、免疫誘導から５週間後にＳに対するＩＤ５０中央値はＲＢＤの３．５倍であることが明らかである。これらの結果は、３回以上の免疫誘導が非ＲＢＤ Ｓエピトープを標的とする反応性Ｂ細胞レパートリーの拡大増殖を可能とすることを示す。さらに、ワクチン接種動物にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原投与を行うと、殺菌免疫を介した完全な保護を示す。特に、Ｃｏｖｉｄ－１９疾患に特徴的なリンパ球減少症および肺損傷などの感染の臨床的徴候がないことと一致して、上気道および下気道にはウイルス複製の徴候が検出できない。
ウイルス抗原投与時に鼻咽頭液には有意なＩｇＧおよびＩｇＡが検出され、本発明のワクチンの投与が粘膜の免疫応答を惹起することによって殺菌保護を誘導することを示す。よって、本発明のワクチンは有効かつ安全である。
ウイルス抗原投与時に鼻咽頭液には有意なＩｇＧおよびＩｇＡが検出され、本発明のワクチンの投与が粘膜の免疫応答を惹起することによって殺菌保護を誘導することを示す。よって、本発明のワクチンは有効かつ安全である。
【0095】
この本発明のワクチンの投与は、いずれの経路によって行うこともできる。投与は好ましくは、非経口経路によって、特に、注射またはスプレーによって行われる。
【0096】
本発明の特に好ましい実施形態では、ワクチンは、対象に筋肉内または鼻腔内投与される。
【0097】
あるいは、ワクチンは、静脈内、腹腔内、動脈内もしくは皮下注射、または吸入によって対象に投与することができる。
【0098】
本発明のワクチンは、対象に単回用量、または複数用量で投与することができ、特に、数日あけて投与することができる。
【0099】
治療上有効な用量および投与される用量数は、対象、特に、その年齢、体重、症状などによって異なる。正確な投与条件の決定は、実務者の職務の範囲内である。
【0100】
例えば、各投与は、５０～１００μｇの本発明のプロテオリポソームを対象に送達するために行われる。
【0101】
好ましくは、治療上有効な量のワクチンは対象に少なくとも２回投与される。２回の投与ステップは好ましくは、２～８週間の期間あけられる。
【0102】
本発明の特定の実施形態では、治療上有効な量のワクチンは対象に少なくとも３回投与される。上記で示したように、３回目の免疫誘導は有利には、有意な非ＲＢＤ抗体力価を増強する。
【0103】
あるいは、本発明のワクチンは、他の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの２回の投与後に対照に投与することもできる。
【0104】
本発明の一態様は、対象においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を治療または予防する方法であって、本発明によるワクチンをこの対象に投与することを含む。この方法は、対象においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を治療または予防するための本発明のワクチンの使用に関して上記した特徴のいずれに応答してもよい。
【実施例0105】
実験モデルおよび対象の詳細
細胞株
ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１１２６８）およびＨＥＫ２９３Ｆ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）は、ヒト胎児腎臓細胞株である。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞は、懸濁液中で増殖するように適合されている。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞は、３７℃、８％ＣＯ２、２９３ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ発現培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、１２５ｒｐｍで振盪しながら培養した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）およびペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）を添加したＤＭＥＭが入ったフラスコにて、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。ＨＥＫ２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞は、ヒトアンギオテンシン変換酵素２を発現するヒト胎児腎臓細胞である。ＨＥＫ２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞は、１０％ＦＢＳ、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）およびペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）を添加したＤＭＥＭが入ったフラスコにて、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。ＶｅｒｏＥ６細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８６）は、アフリカミドリザルからの腎臓上皮細胞である。ＶｅｒｏＥ６細胞は、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）およびペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）を添加したまたは添加しない、また、５または１０％ＦＢＳを添加したまたは添加しない、また、ＴＰＣＫ－トリプシンを添加したまたは添加しないＤＭＥＭにて、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。ＰＢＭＣはマカクザル血清から単離し、１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０ ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）培地（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））中で培養した。
細胞株
ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１１２６８）およびＨＥＫ２９３Ｆ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）は、ヒト胎児腎臓細胞株である。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞は、懸濁液中で増殖するように適合されている。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞は、３７℃、８％ＣＯ２、２９３ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ発現培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、１２５ｒｐｍで振盪しながら培養した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）およびペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）を添加したＤＭＥＭが入ったフラスコにて、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。ＨＥＫ２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞は、ヒトアンギオテンシン変換酵素２を発現するヒト胎児腎臓細胞である。ＨＥＫ２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞は、１０％ＦＢＳ、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）およびペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）を添加したＤＭＥＭが入ったフラスコにて、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。ＶｅｒｏＥ６細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８６）は、アフリカミドリザルからの腎臓上皮細胞である。ＶｅｒｏＥ６細胞は、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）およびペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）を添加したまたは添加しない、また、５または１０％ＦＢＳを添加したまたは添加しない、また、ＴＰＣＫ－トリプシンを添加したまたは添加しないＤＭＥＭにて、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。ＰＢＭＣはマカクザル血清から単離し、１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０ ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）培地（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））中で培養した。
【0106】
ウイルス
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス（ｈＣｏＶ－１９／フランス／ＩＤＦ０３７２／２０２０株）は、Lescure et al. (2020). Lancet Infect Dis 20, 697-706に記載されるように、呼吸器系ウイルスナショナルリファレンスセンター(National Reference Center for Respiratory Viruses)（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ、パリ、フランス）によって分離され、ＦＢＳ不含で、１％Ｐ／Ｓ（ペニシリン１０，０００Ｕ．ｍｌ－１およびストレプトマイシン１０，０００μｇ．ｍｌ－１）および１μｇ．ｍｌ－１ ＴＰＣＫ－トリプシンを添加したＤＭＥＭ（ダルベッコの改変イーグル培地）中、３７℃、加湿ＣＯ２インキュベーター内で、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞上での２回の継代培養によって作出し、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞で力価測定を行った。全ゲノムシーケンシングを行ったところ、最初の検体と比較して改変は見られず、ＧＩＳＡＩＤ ＥｐｉＣｏＶプラットフォームでのアセンブリの後に受託番号ＩＤ ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿４１０７２０として配列を寄託した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス（ｈＣｏＶ－１９／フランス／ＩＤＦ０３７２／２０２０株）は、Lescure et al. (2020). Lancet Infect Dis 20, 697-706に記載されるように、呼吸器系ウイルスナショナルリファレンスセンター(National Reference Center for Respiratory Viruses)（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ、パリ、フランス）によって分離され、ＦＢＳ不含で、１％Ｐ／Ｓ（ペニシリン１０，０００Ｕ．ｍｌ－１およびストレプトマイシン１０，０００μｇ．ｍｌ－１）および１μｇ．ｍｌ－１ ＴＰＣＫ－トリプシンを添加したＤＭＥＭ（ダルベッコの改変イーグル培地）中、３７℃、加湿ＣＯ２インキュベーター内で、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞上での２回の継代培養によって作出し、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞で力価測定を行った。全ゲノムシーケンシングを行ったところ、最初の検体と比較して改変は見られず、ＧＩＳＡＩＤ ＥｐｉＣｏＶプラットフォームでのアセンブリの後に受託番号ＩＤ ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿４１０７２０として配列を寄託した。
【0107】
倫理および生物安全性の陳述
表１に記載されるＭａｕｒｉｔｉａｎ ＡＡＡＬＡＣ認定育種センターを起源とするカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）をこの試験で使用した。ＭＦ１～ＭＦ４はワクチン接種群であり、ＭＦ５～ＭＦ８は対照群である。
表１に記載されるＭａｕｒｉｔｉａｎ ＡＡＡＬＡＣ認定育種センターを起源とするカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）をこの試験で使用した。ＭＦ１～ＭＦ４はワクチン接種群であり、ＭＦ５～ＭＦ８は対照群である。
【0108】
【表1】
【0109】
全ての動物はＩＤＭＩＴ基盤施設（ＣＥＡ、Ｆｏｎｔｅｎａｙ－ａｕｘ－ｒｏｓｅｓ）にて、必要であればＢＳＬ－２およびＢＳＬ－３の包含下（動物施設承認＃Ｄ９２－０３２－０２、オー・ド・セーヌ県、フランス）、欧州指令２０１０／６３／ＥＵ、フランス法および実験動物福祉法局のｔｈｅ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ（保証番号＃Ａ５８２６－０１、ＵＳ）に準じて収容した。これらのプロトコールは、施設内倫理委員会“Ｃｏｍｉｔｅ ｄ’Ｅｔｈｉｑｕｅ ｅｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ａｎｉｍａｌｅ ｄｕ Ｃｏｍｍｉｓｓａｒｉａｔ ａ ｌ’Ｅｎｅｒｇｉｅ Ａｔｏｍｉｑｕｅ ｅｔ ａｕｘ Ｅｎｅｒｇｉｅｓ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ”（ＣＥｔＥＡ ＃４４）によりステートメント番号Ａ２０－０１１として承認されたものである。この試験は、“Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ”により登録番号ＡＰＡＦＩＳ＃２４４３４－２０２００３０２１６５３２８６３として認可されたものである。
【0110】
動物および研究デザイン
カニクイザルを無作為に２つの試験群に割り当てた。ワクチン接種群（ｎ＝４）には、ＰＢＳに希釈した５００μｇのＭＰＬＡリポソーム（Ｐｏｌｙｍｕｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をアジュバントとする５０μｇの本発明のプロテオリポソーム（ＳＡＲＳＣｏＶ－２ Ｓ－ＬＶ）を０、４、８および１９週目に与え、対照動物（ｎ＝４）にはワクチン接種を施さなかった。ワクチン接種動物には０、２、４、６、８、１１、１２、１４、１９、２１および２２週目に血液採取を行った。２４週目に、前投薬のためのアトロピン（０．０４ｍｇ／ｋｇ）および麻酔のためのケタミン（５ｍｇ／ｋｇ）とメデトミジン（０．０４２ｍｇ／ｋｇ）を用い、全ての動物を鼻腔内経路と気管内経路の組合せ（各鼻孔に０，２５ｍＬおよび気管内に４，５ｍＬ、すなわち合計５ｍＬ；０日目）によって合計用量１０５ｐｆｕのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス（ｈＣｏＶ－１９／フランス／ｌＤＦ０３７２／２０２０株；受託番号ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿４１０７２０としてＧＩＳＡＩＤ ＥｐｉＣｏＶプラットフォーム）に曝露した。鼻咽頭、気管および直腸のぬぐい液を曝露２、３、４、６、７、１０、１４および２７日後に収集し、血液は曝露２、４、７、１０、１４および２７日後に採取した。気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）は、曝露３および７日後に５０ｍＬの無菌生理食塩水を用いて行った。麻酔した動物で、チレタミン（４ｍｇ．ｋｇ－１）およびゾラゼパム（４ｍｇ．ｋｇ－１）を用いて曝露３、７、１０および１４日後に胸部ＣＴを行った。血液細胞総数、ヘモグロビン、およびヘマトクリットは、ＥＤＴＡ血液から、ＤＨＸ８００アナライザー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて決定した。
カニクイザルを無作為に２つの試験群に割り当てた。ワクチン接種群（ｎ＝４）には、ＰＢＳに希釈した５００μｇのＭＰＬＡリポソーム（Ｐｏｌｙｍｕｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をアジュバントとする５０μｇの本発明のプロテオリポソーム（ＳＡＲＳＣｏＶ－２ Ｓ－ＬＶ）を０、４、８および１９週目に与え、対照動物（ｎ＝４）にはワクチン接種を施さなかった。ワクチン接種動物には０、２、４、６、８、１１、１２、１４、１９、２１および２２週目に血液採取を行った。２４週目に、前投薬のためのアトロピン（０．０４ｍｇ／ｋｇ）および麻酔のためのケタミン（５ｍｇ／ｋｇ）とメデトミジン（０．０４２ｍｇ／ｋｇ）を用い、全ての動物を鼻腔内経路と気管内経路の組合せ（各鼻孔に０，２５ｍＬおよび気管内に４，５ｍＬ、すなわち合計５ｍＬ；０日目）によって合計用量１０５ｐｆｕのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス（ｈＣｏＶ－１９／フランス／ｌＤＦ０３７２／２０２０株；受託番号ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿４１０７２０としてＧＩＳＡＩＤ ＥｐｉＣｏＶプラットフォーム）に曝露した。鼻咽頭、気管および直腸のぬぐい液を曝露２、３、４、６、７、１０、１４および２７日後に収集し、血液は曝露２、４、７、１０、１４および２７日後に採取した。気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）は、曝露３および７日後に５０ｍＬの無菌生理食塩水を用いて行った。麻酔した動物で、チレタミン（４ｍｇ．ｋｇ－１）およびゾラゼパム（４ｍｇ．ｋｇ－１）を用いて曝露３、７、１０および１４日後に胸部ＣＴを行った。血液細胞総数、ヘモグロビン、およびヘマトクリットは、ＥＤＴＡ血液から、ＤＨＸ８００アナライザー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて決定した。
【0111】
方法詳細
タンパク質発現および精製
残基９８６および９８７にプロリン置換（「２Ｐ」）、フューリン切断部位（残基６８２～６８５）に「ＧＳＡＳ」（配列番号２）置換を有し、そのＣ末端においてＴ４フィブリチン三量体化モチーフ（配列番号４の配列の）、Ｃ末端ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ切断部位（配列番号６の配列の）、８ＸヒスチジンタグおよびＴｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐタグ（登録商標）（配列番号５の配列の間隔をあけた２つのリピート）に連続的に連結された、天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質の残基１～１２０８に相当する配列番号８のアミノ酸配列のタンパク質／プロトマーをコードする配列番号９のヌクレオチド配列の遺伝子を、トランスフェクションのためにポリエチレンイミン（ＰＥＩ）１μｇ／μｌを用いて、ヒト胎児腎臓細胞株ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３Ｆ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で一過性に発現させた。
タンパク質発現および精製
残基９８６および９８７にプロリン置換（「２Ｐ」）、フューリン切断部位（残基６８２～６８５）に「ＧＳＡＳ」（配列番号２）置換を有し、そのＣ末端においてＴ４フィブリチン三量体化モチーフ（配列番号４の配列の）、Ｃ末端ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ切断部位（配列番号６の配列の）、８ＸヒスチジンタグおよびＴｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐタグ（登録商標）（配列番号５の配列の間隔をあけた２つのリピート）に連続的に連結された、天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ糖タンパク質の残基１～１２０８に相当する配列番号８のアミノ酸配列のタンパク質／プロトマーをコードする配列番号９のヌクレオチド配列の遺伝子を、トランスフェクションのためにポリエチレンイミン（ＰＥＩ）１μｇ／μｌを用いて、ヒト胎児腎臓細胞株ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３Ｆ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で一過性に発現させた。
【0112】
トランスフェクション５日後に上清を採取し、３０分間、５０００ｒｐｍで遠心分離し、０．２０μｍフィルター（ＣｌｅａｒＬｉｎｅ（登録商標））を用いて濾過した。三量体（「Ｓ」）を上清からバッファーＡ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、２００ｍＭ ＮａＣｌ）中、Ｎｉ２＋－セファロースクロマトグラフィー（Ｅｘｃｅｌ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｓｉｎ、Ｃｙｔｉｖａ）によって精製し、バッファーＢ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール）で溶出させた。溶出した三量体含有画分をＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（カットオフ：３０ＫＤａ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮し、バッファーＡまたはＰＢＳ中、スーパーロース（登録商標）６カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によってさらに精製した。
【0113】
ＲＢＤ発現については、以下の試薬はＨＨＳＮ２７２２０１４００００８Ｃの下に作製され、ＢＥＩ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、ＮＩＡＩＤ、ＮＩＨを通して入手した：ＳＡＲＳ関連コロナウイルス２、武漢－Ｈｕ－１スパイク糖タンパク質受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、ＮＲ－５２３０９を含有するベクターｐＣＡＧＧＳ。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＢＤドメイン（残基３１９～５４１）を、製造者のプロトコール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従って一過性トランスフェクションによりＥＸＰＩ２９３細胞で発現させた。上清をトランスフェクション５日後に採取し、遠心分離によって明澄化した。上清を０．４５μｍフィルターに通し、バッファーＣ（２０ｍＭトリスｐＨ７．５および１５０ｍＭ ＮａＣｌバッファー）中、Ｎｉ２＋－クロマトグラフィー（ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＲＢＤを精製した後、バッファーＤ（２０ｍＭトリスｐＨ７．５および１５０ｍＭ ＮａＣｌバッファー、７５ｍＭイミダゾール）での洗浄工程およびバッファーＥ（２０ｍＭトリスｐＨ７．５および１５０ｍＭ ＮａＣｌバッファー、５００ｍＭイミダゾール）での溶出を行った。溶出したＲＢＤをバッファーＣ中、スーパーデックス７５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのＳＥＣによりさらに精製した。タンパク質濃度は、ＰｒｏｔＰａｒａｍを用い、それぞれＳタンパク質およびＲＢＤに対して１０．４および１３．０６の２８０ｎｍ吸収係数（Ａ１％、１ｃｍ）を用いて決定した。
【0114】
三量体の架橋
ＰＢＳ中、１ｍｇ／ｍｌの三量体「Ｓタンパク質」を、室温で一晩、４％ホルムアルデヒド（ＦＡ）（Ｓｉｇｍａ）で架橋させた。反応を、１ＭトリスＨＣｌ ｐＨ７．４で、７．５ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ７．４にサンプルバッファーを調整して停止させた。ＦＡは、３０ＫＤａカットオフ濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ（登録商標））を用いてＰＢＳバッファー交換によって除去した。ＦＡ架橋は、ホルムアルデヒドで処理した三量体「ＦＡ－Ｓタンパク質」を還元条件下での１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離することによって確認した。
ＰＢＳ中、１ｍｇ／ｍｌの三量体「Ｓタンパク質」を、室温で一晩、４％ホルムアルデヒド（ＦＡ）（Ｓｉｇｍａ）で架橋させた。反応を、１ＭトリスＨＣｌ ｐＨ７．４で、７．５ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ７．４にサンプルバッファーを調整して停止させた。ＦＡは、３０ＫＤａカットオフ濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ（登録商標））を用いてＰＢＳバッファー交換によって除去した。ＦＡ架橋は、ホルムアルデヒドで処理した三量体「ＦＡ－Ｓタンパク質」を還元条件下での１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離することによって確認した。
【0115】
リポソームへの三量体のカップリング
リポソームは次のように調製した。
リポソームは次のように調製した。
【0116】
リポソームは、６０％のＬ－α－ホスファチジルコリン、４％Ｈｉｓタグコンジュゲート脂質、ＤＧＳ－ＮＴＡ－（Ｎｉ２＋）および３６％コレステロール（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）から構成した。脂質成分をクロロホルムに溶解させ、混合し、真空下、室温でデシケーター内に２時間置いて脂質フィルムを得た。このフィルムを、濾過した（０．２２μｍ）ＰＢＳ中で水和させ、リポソームは、孔径０．１μｍのメンブレンフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ（登録商標）Ｔｒａｃｋ－Ｅｔｃｈｅｄメンブレン）を用いた押出によって調製した。リポソームの完全性および大きさはネガティブ染色－ＥＭによって分析した。
【0117】
タンパク質のカップリングのために、リポソームを３：１比（ｗ／ｗ）のＦＡ－Ｓタンパク質またはＳタンパク質とともに一晩インキュベートした。
【0118】
遊離ＦＡ－Ｓタンパク質は、ＳＷ５５ローターにて４０，０００ｒｐｍで２時間のスクロース勾配（５～４０％）遠心分離によりＦＡ－Ｓ－プロテオリポソーム（Ｓ－ＬＶ）から分離した。リポソームにコンジュゲートされたタンパク質の量は、Ｓ－ＬＶバンドを標準Ｓタンパク質濃度と比較するブラッドフォードアッセイおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥ濃度計分析によって決定した。
【0119】
三量体の熱安定性
天然またはＦＡ架橋型のＳタンパク質の熱変性は、Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＮＴ．４８装置（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いる、後方散乱と組み合わせた示差走査蛍光定量法によって分析した。タンパク質サンプルはまずＰＢＳ ｐＨ７．４に対して十分に透析し、タンパク質濃度を０．３ｍｇ／ｍｌに調整した。１０μＬのサンプルをキャピラリーにロードし、固有蛍光は励起出力３０％、傾斜率１℃／分で測定した。タンパク質の折り畳み解除を、３５０および３３０ｎｍでの蛍光放出の変化によってモニタリングした。タンパク質の熱変性中点（Ｔｍ）を、Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＮＴソフトウエアを用いて決定した。
天然またはＦＡ架橋型のＳタンパク質の熱変性は、Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＮＴ．４８装置（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いる、後方散乱と組み合わせた示差走査蛍光定量法によって分析した。タンパク質サンプルはまずＰＢＳ ｐＨ７．４に対して十分に透析し、タンパク質濃度を０．３ｍｇ／ｍｌに調整した。１０μＬのサンプルをキャピラリーにロードし、固有蛍光は励起出力３０％、傾斜率１℃／分で測定した。タンパク質の折り畳み解除を、３５０および３３０ｎｍでの蛍光放出の変化によってモニタリングした。タンパク質の熱変性中点（Ｔｍ）を、Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＮＴソフトウエアを用いて決定した。
【0120】
ネガティブ染色電子顕微鏡
タンパク質サンプルは、０．１～０．２ｍｇ／ｍｌのタンパク質を含有する３～４μＬのアリコートを使用するネガティブ染色電子顕微鏡（ＥＭ）によって可視化した。サンプルをマイカカーボンフィルムに１０秒間塗布し、２０ｍＡで３０秒間グロー放電させた４００メッシュのＣｕグリッドに移した後、２％（ｗｔ／ｖｏｌ）酢酸ウラニル（ＵＡｃ）で３０秒間ネガティブ染色した。データは、Ｇａｔａｎ Ｏｒｉｕｓ １０００ ＣＣＤカメラを用い、１２０ｋＶ加速電圧、２３ｋ倍率（画素サイズ２．８Å）で作動するＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ Ｔ１２ ＬａＢ６－ＥＭで収集した。サンプル当たり平均３０～４０枚の顕微鏡写真を用い、ソフトウエアＲｅｌｉｏｎで二次元（２Ｄ）クラス平均を求めた。得られた最良の５クラスを各６０００前後の粒子から計算した。
タンパク質サンプルは、０．１～０．２ｍｇ／ｍｌのタンパク質を含有する３～４μＬのアリコートを使用するネガティブ染色電子顕微鏡（ＥＭ）によって可視化した。サンプルをマイカカーボンフィルムに１０秒間塗布し、２０ｍＡで３０秒間グロー放電させた４００メッシュのＣｕグリッドに移した後、２％（ｗｔ／ｖｏｌ）酢酸ウラニル（ＵＡｃ）で３０秒間ネガティブ染色した。データは、Ｇａｔａｎ Ｏｒｉｕｓ １０００ ＣＣＤカメラを用い、１２０ｋＶ加速電圧、２３ｋ倍率（画素サイズ２．８Å）で作動するＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ Ｔ１２ ＬａＢ６－ＥＭで収集した。サンプル当たり平均３０～４０枚の顕微鏡写真を用い、ソフトウエアＲｅｌｉｏｎで二次元（２Ｄ）クラス平均を求めた。得られた最良の５クラスを各６０００前後の粒子から計算した。
【0121】
クライオ電子顕微鏡
データ収集 ３．５μＬのサンプルを１．２／１．３ Ｃ－Ｆｌａｔ（登録商標）（Ｐｒｏｔｏｃｈｉｐｓ Ｉｎｃ）ホーリーカーボングリッドに塗布し、Ｖｉｔｒｏｂｏｔ Ｍａｒｋ ＩＶ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（ブロット時間６秒、ブロット力０）を用い、液体エタン中で急速冷凍した。このサンプルをＧｌａｃｉｏｓ（登録商標）電子顕微鏡（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で２００ｋＶにて観察した。画像は、Ｋ２ ｓｕｍｍｉｔ直接電子検出器（Ｇａｔａｎ Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）にて、ＳｅｒｉａｌＥＭを用いる連続様式で自動的に記録した。動画は、１動画当たり４０フレームおよび総線量４０ｅ-／Å２として総露光４．５秒間記録した。倍率は３６，０００倍（カメラレベルで１．１５Å／画素）であった。画像のデフォーカスは－１．０～－２．５μｍの間で変更した。同じグリットに対して２つの異なるデータセットを取得した。まず、１０４０動画を各ホール間のステージ移動で記録し、次に、７５１８を超える動画を３×３ホールパターン上の画像シフトで記録した。
データ収集 ３．５μＬのサンプルを１．２／１．３ Ｃ－Ｆｌａｔ（登録商標）（Ｐｒｏｔｏｃｈｉｐｓ Ｉｎｃ）ホーリーカーボングリッドに塗布し、Ｖｉｔｒｏｂｏｔ Ｍａｒｋ ＩＶ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（ブロット時間６秒、ブロット力０）を用い、液体エタン中で急速冷凍した。このサンプルをＧｌａｃｉｏｓ（登録商標）電子顕微鏡（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で２００ｋＶにて観察した。画像は、Ｋ２ ｓｕｍｍｉｔ直接電子検出器（Ｇａｔａｎ Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）にて、ＳｅｒｉａｌＥＭを用いる連続様式で自動的に記録した。動画は、１動画当たり４０フレームおよび総線量４０ｅ-／Å２として総露光４．５秒間記録した。倍率は３６，０００倍（カメラレベルで１．１５Å／画素）であった。画像のデフォーカスは－１．０～－２．５μｍの間で変更した。同じグリットに対して２つの異なるデータセットを取得した。まず、１０４０動画を各ホール間のステージ移動で記録し、次に、７５１８を超える動画を３×３ホールパターン上の画像シフトで記録した。
【0122】
３Ｄ再構成 これらの画像をまずＭｏｔｉｏｎＣｏｒ２でドリフト補正した。後の画像処理は、ＲＥＬＩＯＮ ３．１．２およびＧＣＴＦを用いたＣＴＦ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎで行った。最初の粒子セット（ボックスサイズ２００画素、サンプル採取２．３Å／画素）は、ガウシアンブロッブを用いたオートピッキングによって得た。２Ｄ分類の後、最も良く見える２Ｄクラス平均を２回目のオートピッキングに使用した。さらなる２Ｄ分類ステップの後、最も良く見える２Ｄクラス平均に属す粒子を最初の出発３Ｄモデルを作成するために使用し、次にこれを用いてＣ３対称性を有する最初の３Ｄ再構成を計算した。次に、３Ｄモデルからの２Ｄ投影を用いて最後に１回のオートピッキングを行い、合計２，５８２，８５７粒子を得た。さらなる２Ｄ分類および３Ｄ分類（Ｃ１対称性、５クラス）ステップの後、２４０，７７７粒子から４．６Å分解能の３Ｄマップを得た。これらの粒子を再抽出した（ボックスサイズ４００画素、サンプル採取１．１５Å／画素）。さらなる３Ｄ精密化（Ｃ３対称性）および３Ｄ分類（Ｃ１対称性、アラインメント無し、３クラス）ステップの後、１２６，７１９粒子の最終セットを特定し、これにより３Ｄ再構成が３．６Å分解能で得られた。ＣＴＦパラメーターの精密化、粒子ポリッシングおよび２回目のＣＴＦパラメーターの精密化により、分解能はさらに向上し３．４Åとなった。分解能は、Ｆｏｕｒｉｅｒ Ｓｈｅｌｌ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ（ＦＳＣ）によって、２つの独立した３Ｄマップ間で０．１４３にて決定した。局部的分解能はｂｌｏｃｒｅｓで計算し、３～５Åであることが判明した。最終３ＤマップをＤｅｅｐＥＭｈａｎｃｅｒで鮮鋭化した。
【0123】
モデルの精密化 ＣｈｉｍｅｒａにてクライオＥＭ密度マップ内で閉構造のＳタンパク質の原子モデル（ＰＤＢ ６ＶＸＸ）のリジッドボディフィッティングを行った。次に、原子座標をＰＨＥＮＩＸで精密化した。精密化した原子モデルを視覚的に確認し、ＣＯＯＴにて補正した（必要がある場合）。最終モデルは、ＭＯＬＰＲＯＢＩＴＹでバリデートした。
【0124】
図は、ＣＨＩＭＥＲＡおよびＣＨＩＭＥＲＡＸで作成した。原子座標およびクライオＥＭマップは、タンパク質データバンクおよび電子顕微鏡データバンクにそれぞれ受託コード７ＱＩＺおよびＥＭＤ－１３７７６として寄託されている。
【0125】
ＮＨＰサンプルにおけるウイルス定量
上気道（鼻咽頭および気管）および直腸検体をぬぐい液（Ｖｉｒａｌ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｍｅｄｉｕｍ、ＣＤＣ、ＤＳＲ－０５２－０１）で採取した。気管ぬぐい液は、喉頭蓋の先端の上から喉頭蓋からおよそ１．５ｃｍの上気道にぬぐい液を挿入することによって行った。全ての検体をＲＴ－ｑＰＣＲによる分析まで２℃～８℃で保存し、プラスミドの標準濃度範囲は、ＲｄＲｐ－ＩＰ４ ＲＴ－ＰＣＲ標的配列を含むＲｄＲｐ遺伝子断片を含む。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｅ遺伝子サブゲノムｍＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）レベルは、以下のプライマーおよびプローブを用いるＲＴ－ｑＰＣＲによって評価した。
下記配列のリーダー特異的プライマーｓｇＬｅａｄＳＡＲＳＣｏＶ２－Ｆ：
ＣＧＡＴＣＴＣＴＴＧＴＡＧＡＴＣＴＧＴＴＣＴＣ（配列番号１０）、
下記配列のＥ－Ｓａｒｂｅｃｏ－Ｒプライマー：
ＡＴＡＴＴＧＣＡＧＣＡＧＴＡＣＧＣＡＣＡＣＡ（配列番号１１）、および
下記配列のＥ－Ｓａｒｂｅｃｏプローブ：
ＨＥＸ－ＡＣＡＣＴＡＧＣＣＡＴＣＣＴＴＡＣＴＧＣＧＣＴＴＣＧ－ＢＨＱ１（配列番号１２）、ここで、ＨＥＸはヘキサクロロフルオレセインを表し、ＢＨＱ１はＢＨＱ１クエンチャーを表す。
上気道（鼻咽頭および気管）および直腸検体をぬぐい液（Ｖｉｒａｌ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｍｅｄｉｕｍ、ＣＤＣ、ＤＳＲ－０５２－０１）で採取した。気管ぬぐい液は、喉頭蓋の先端の上から喉頭蓋からおよそ１．５ｃｍの上気道にぬぐい液を挿入することによって行った。全ての検体をＲＴ－ｑＰＣＲによる分析まで２℃～８℃で保存し、プラスミドの標準濃度範囲は、ＲｄＲｐ－ＩＰ４ ＲＴ－ＰＣＲ標的配列を含むＲｄＲｐ遺伝子断片を含む。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｅ遺伝子サブゲノムｍＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）レベルは、以下のプライマーおよびプローブを用いるＲＴ－ｑＰＣＲによって評価した。
下記配列のリーダー特異的プライマーｓｇＬｅａｄＳＡＲＳＣｏＶ２－Ｆ：
ＣＧＡＴＣＴＣＴＴＧＴＡＧＡＴＣＴＧＴＴＣＴＣ（配列番号１０）、
下記配列のＥ－Ｓａｒｂｅｃｏ－Ｒプライマー：
ＡＴＡＴＴＧＣＡＧＣＡＧＴＡＣＧＣＡＣＡＣＡ（配列番号１１）、および
下記配列のＥ－Ｓａｒｂｅｃｏプローブ：
ＨＥＸ－ＡＣＡＣＴＡＧＣＣＡＴＣＣＴＴＡＣＴＧＣＧＣＴＴＣＧ－ＢＨＱ１（配列番号１２）、ここで、ＨＥＸはヘキサクロロフルオレセインを表し、ＢＨＱ１はＢＨＱ１クエンチャーを表す。
【0126】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出のためのこの手順を表すプロトコールは、ＷＨＯウェブサイト(https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/whoinhouseassays.pdf)で入手できる。
【0127】
胸部ＣＴおよび画像解析
肺画像は、コンピューター断層撮影（ＣＴ）システム（Ｖｅｒｅｏｓ－Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ、Ｐｈｉｌｉｐｓ）を用いて取得し、ＩＮＴＥＬＬＩＳＰＡＣＥ ＰＯＲＴＡＬ ８ソフトウエア（Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて解析した。全ての画像は、同じウインドウレベル－３００およびウインドウ幅１，６００を有した。病変はすりガラス陰影、メロンの皮様所見、浸潤影胸膜肥厚として定義した。病変および瘢痕は、各肺葉において盲検で２人により独立に評価し、最終結果は総意によって確定した。総合ＣＴスコアは、各肺葉について病変タイプ（スコア０～３）および病変体積（スコア０～４）の合計とした。
肺画像は、コンピューター断層撮影（ＣＴ）システム（Ｖｅｒｅｏｓ－Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ、Ｐｈｉｌｉｐｓ）を用いて取得し、ＩＮＴＥＬＬＩＳＰＡＣＥ ＰＯＲＴＡＬ ８ソフトウエア（Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて解析した。全ての画像は、同じウインドウレベル－３００およびウインドウ幅１，６００を有した。病変はすりガラス陰影、メロンの皮様所見、浸潤影胸膜肥厚として定義した。病変および瘢痕は、各肺葉において盲検で２人により独立に評価し、最終結果は総意によって確定した。総合ＣＴスコアは、各肺葉について病変タイプ（スコア０～３）および病変体積（スコア０～４）の合計とした。
【0128】
ＥＬＩＳＡ
可溶性天然Ｓ糖タンパク質、ＦＡ架橋三量体（ＦＡ－Ｓ）およびＲＢＤに特異的な血清抗体力価は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて評価した。簡単に述べれば、９６ウェルマイクロタイタープレートを４℃にて一晩ＰＢＳ中で、１μｇのＳ、ＦＡ－ＳまたはＲＢＤタンパク質でコーティングし、１５０μＬのＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０ ０．０５％で３回洗浄した後、室温にて１時間３％ＢＳＡでブロッキングした。血清希釈液を各ウェルに３７℃で２時間加え、プレートをＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）で５回洗浄した。次に、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗サルＨ＋Ｌ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、１時間インキュベートした後、余分なＡｂを洗い流し、ＨＲＰ基質を添加した。吸光度を４５０ｎｍで決定した。抗体力価はＥＤ５０（有効希釈５０値）として表し、ＩｇＧ結合が５０％低下した血清希釈率として定義した。ＥＤ５０を生データ（Ｏ．Ｄ）から、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ｖｅｒｓｉｏｎ ６）"log(inhibitor) vs normalized response"関数を用いて正規化した後計算した。ＥＬＩＳＡは二反復で行った。
可溶性天然Ｓ糖タンパク質、ＦＡ架橋三量体（ＦＡ－Ｓ）およびＲＢＤに特異的な血清抗体力価は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて評価した。簡単に述べれば、９６ウェルマイクロタイタープレートを４℃にて一晩ＰＢＳ中で、１μｇのＳ、ＦＡ－ＳまたはＲＢＤタンパク質でコーティングし、１５０μＬのＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０ ０．０５％で３回洗浄した後、室温にて１時間３％ＢＳＡでブロッキングした。血清希釈液を各ウェルに３７℃で２時間加え、プレートをＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）で５回洗浄した。次に、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗サルＨ＋Ｌ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、１時間インキュベートした後、余分なＡｂを洗い流し、ＨＲＰ基質を添加した。吸光度を４５０ｎｍで決定した。抗体力価はＥＤ５０（有効希釈５０値）として表し、ＩｇＧ結合が５０％低下した血清希釈率として定義した。ＥＤ５０を生データ（Ｏ．Ｄ）から、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ｖｅｒｓｉｏｎ ６）"log(inhibitor) vs normalized response"関数を用いて正規化した後計算した。ＥＬＩＳＡは二反復で行った。
【0129】
Ｌｕｍｉｎｅｘビーズへのタンパク質のカップリング
タンパク質をＭａｇＰｌｅｘ（登録商標）ビーズ（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に、１２５０万のビーズに対して７５μｇのＳ三量体の比率を用い、２段階カルボジイミド反応によって共有結合的にカップリングさせた。ＭａｇＰｌｅｘ（登録商標）ビーズを１００ｍＭの一塩基性リン酸ナトリウムｐＨ６．２で洗浄し、室温にてローター上で、スルホ－Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の添加によって３０分間活性化した。活性化したビーズを５０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．０で３回洗浄し、Ｓ三量体に加え、これを５０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．０で希釈した。カップリング反応物をローテーター上、室温で３時間インキュベートした。次に、これらのビーズをＰＢＳで洗浄し、２％ＢＳＡ、３％ＦＣＳおよび０．０２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０を含有するＰＢＳで、ローテーター上、室温で３０分間ブロッキングした。最後に、ビーズを洗浄し、０．０５％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ中、４℃で保存し、３か月以内に使用した。
タンパク質をＭａｇＰｌｅｘ（登録商標）ビーズ（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に、１２５０万のビーズに対して７５μｇのＳ三量体の比率を用い、２段階カルボジイミド反応によって共有結合的にカップリングさせた。ＭａｇＰｌｅｘ（登録商標）ビーズを１００ｍＭの一塩基性リン酸ナトリウムｐＨ６．２で洗浄し、室温にてローター上で、スルホ－Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の添加によって３０分間活性化した。活性化したビーズを５０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．０で３回洗浄し、Ｓ三量体に加え、これを５０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．０で希釈した。カップリング反応物をローテーター上、室温で３時間インキュベートした。次に、これらのビーズをＰＢＳで洗浄し、２％ＢＳＡ、３％ＦＣＳおよび０．０２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０を含有するＰＢＳで、ローテーター上、室温で３０分間ブロッキングした。最後に、ビーズを洗浄し、０．０５％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ中、４℃で保存し、３か月以内に使用した。
【0130】
Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ
１μＬ当たり２０個のビーズを含む５０μＬの実施用ビーズ混合物を５０μＬの希釈鼻咽頭液とともに４℃で一晩インキュベートした。鼻咽頭液は、Ｓ特異的ＩｇＧおよびＩｇＡの検出のために１：２０希釈した。プレートを密閉し、プレートシェーカー上で４℃にて一晩インキュベートした。ハンドヘルドマグネティックセパレーターを用いて０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０を含有するＴＢＳ（ＴＢＳＴ）でプレートを洗浄した。ビーズを５０μＬのヤギ抗サルＩｇＧ－ビオチンまたはヤギ抗サルＩｇＡ－ビオチン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に再懸濁させ、プレートシェーカー上で室温にて２時間インキュベートした。その後、ビーズをＴＢＳＴで洗浄し、５０μＬのストレプトアビジン－ＰＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に再懸濁させ、プレートシェーカー上で室温にて１時間インキュベートした。最後に、ビーズをＴＢＳＴで洗浄し、７０μＬ Ｍａｇｐｉｘ（登録商標） ｄｒｉｖｅ ｆｌｕｉｄ（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に再懸濁した。ビーズをプレートシェーカー上で、室温にて数分間振盪し、次いで、ＭＡＧＰＩＸ（登録商標）（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）にて読み取りを行った。結果の再現性は、反復を行うことで確認した。
１μＬ当たり２０個のビーズを含む５０μＬの実施用ビーズ混合物を５０μＬの希釈鼻咽頭液とともに４℃で一晩インキュベートした。鼻咽頭液は、Ｓ特異的ＩｇＧおよびＩｇＡの検出のために１：２０希釈した。プレートを密閉し、プレートシェーカー上で４℃にて一晩インキュベートした。ハンドヘルドマグネティックセパレーターを用いて０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０を含有するＴＢＳ（ＴＢＳＴ）でプレートを洗浄した。ビーズを５０μＬのヤギ抗サルＩｇＧ－ビオチンまたはヤギ抗サルＩｇＡ－ビオチン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に再懸濁させ、プレートシェーカー上で室温にて２時間インキュベートした。その後、ビーズをＴＢＳＴで洗浄し、５０μＬのストレプトアビジン－ＰＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に再懸濁させ、プレートシェーカー上で室温にて１時間インキュベートした。最後に、ビーズをＴＢＳＴで洗浄し、７０μＬ Ｍａｇｐｉｘ（登録商標） ｄｒｉｖｅ ｆｌｕｉｄ（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に再懸濁した。ビーズをプレートシェーカー上で、室温にて数分間振盪し、次いで、ＭＡＧＰＩＸ（登録商標）（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）にて読み取りを行った。結果の再現性は、反復を行うことで確認した。
【0131】
偽ウイルス中和アッセイ
偽ウイルスは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１１２６８）にｐＣＲ３ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＳΔ１９発現プラスミド（武漢Ｈｕ－１；ＧｅｎＢａｎｋ：ＭＮ９０８９４７．３）とｐＨＩＶ－１ＮＬ４３ ΔＥｎｖ－ＮａｎｏＬｕｃリポーターウイルスプラスミドを同時トランスフェクトすることによって作製した。ｐＣＲ３ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＳΔ１９発現プラスミドは、対象とする変異体に対する野生型と比較して以下の突然変異を含んでいた：Ｂ．１．１．７（アルファ、ＵＫ）におけるＨ６９、Ｖ７０およびＹ１４４の欠失（Δ）、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２ＡおよびＤ１１１８Ｈ；Ｂ．１．３５１（ベータ、ＳＡ）におけるＬ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｌ２４２Ｈ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４ＧおよびＡ７０１Ｖ；Ｐ．１（ガンマ、ＢＲ）におけるＬ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５ＹおよびＴ１０２７。
偽ウイルスは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１１２６８）にｐＣＲ３ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＳΔ１９発現プラスミド（武漢Ｈｕ－１；ＧｅｎＢａｎｋ：ＭＮ９０８９４７．３）とｐＨＩＶ－１ＮＬ４３ ΔＥｎｖ－ＮａｎｏＬｕｃリポーターウイルスプラスミドを同時トランスフェクトすることによって作製した。ｐＣＲ３ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＳΔ１９発現プラスミドは、対象とする変異体に対する野生型と比較して以下の突然変異を含んでいた：Ｂ．１．１．７（アルファ、ＵＫ）におけるＨ６９、Ｖ７０およびＹ１４４の欠失（Δ）、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２ＡおよびＤ１１１８Ｈ；Ｂ．１．３５１（ベータ、ＳＡ）におけるＬ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｌ２４２Ｈ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４ＧおよびＡ７０１Ｖ；Ｐ．１（ガンマ、ＢＲ）におけるＬ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５ＹおよびＴ１０２７。
【0132】
ＨＥＫ２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞は、中和アッセイの開始の１日前に、５０μｇ／ｍＬのポリ－Ｌ－リシンでコーティングした９６ウェルプレートに２０，０００細胞／ウェルの密度で播種した。熱失活血清（１：１００希釈）を１０％ＦＢＳ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）およびＧｌｕｔａＭａｘ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ）を添加した細胞培養培地（ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で３倍連続希釈し、偽ウイルスと１：１比で混合し、３７℃で１時間インキュベートした。次に、これらの混合物を細胞に１：１比で加え、３７℃で４８時間インキュベートした後、ＰＢＳ洗浄液および溶解バッファーを添加した。細胞溶解液のルシフェラーゼ活性は、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびＧｌｏＭａｘシステム（Ｔｕｒｎｅｒ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定した。相対発光単位（ＲＬＵ）を、細胞を血清の不在下で偽ウイルスに感染させた陽性対照ウェルに対して正規化した。中和力価（ＩＤ５０）は、非線形回帰曲線フィット（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアバージョン８．３）を用いてそれぞれ感染力を５０％阻害した血清希釈率として決定した。特に、この偽ウイルス中和アッセイは、ヒト回復期血清のパネルで真正の中和と優れた相関を示した。
【0133】
非ヒト霊長類細胞を用いた抗原特異的Ｔ細胞アッセイ
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質特異的Ｔ細胞を分析するために、１１のアミノ酸（ａａ）がオーバーラップし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク配列（ａａ１～１２７３）にわたる１５マーのペプチド（ｎ＝１５７およびｎ＝１５８）がＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ベルリン、ドイツ）により合成され、終濃度２μｇ／ｍＬで使用された。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質特異的Ｔ細胞を分析するために、１１のアミノ酸（ａａ）がオーバーラップし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク配列（ａａ１～１２７３）にわたる１５マーのペプチド（ｎ＝１５７およびｎ＝１５８）がＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ベルリン、ドイツ）により合成され、終濃度２μｇ／ｍＬで使用された。
【0134】
Ｔ細胞応答を、２つのペプチドプールで刺激した際にＩＬ－２（ＰｅｒＣＰ５．５、ＭＱ１－１７Ｈ１２、ＢＤ）、ＩＬ－１７ａ（Ａｌｅｘａ７００、Ｎ４９－６５３、ＢＤ）、ＩＦＮ－γ（Ｖ４５０、Ｂ２７、ＢＤ）、ＴＮＦ－α（ＢＶ６０５、Ｍａｂ１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＩＬ－１３（ＢＶ７１１、ＪＥＳ１０－５Ａ２、ＢＤ）、ＣＤ１３７（ＡＰＣ、４Ｂ４、ＢＤ）およびＣＤ１５４（ＦＩＴＣ、ＴＲＡＰ１、ＢＤ）を発現するＰＢＭＣの頻度の測定によって特徴付けた。ＣＤ３（ＡＰＣ－Ｃｙ７、ＳＰ３４－２、ＢＤ）、ＣＤ４（ＢＶ５１０、Ｌ２００、ＢＤ）およびＣＤ８（ＰＥ－Ｖｉｏ７７０、ＢＷ１３５／８０、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）抗体を細胞系マーカーとして使用した。１００万個のＰＢＭＣを、補助刺激抗体（ＦａｓｔＩｍｍｕｎｅ（登録商標）ＣＤ２８／ＣＤ４９ｄ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を添加した完全培地（ＲＰＭＩ１６４０ Ｇｌｕｔａｍａｘ（登録商標）＋、Ｇｉｂｃｏ；１０％ＦＢＳを添加）で培養した。これらの細胞を終濃度２μｇ／ｍＬのＳ配列オーバーラッピングペプチドプールで刺激した。ブレフェルジンＡを各ウェルに終濃度１０μｇ／ｍＬで加え、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした。次に、細胞を洗浄し、生存力色素（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）ｆｉｘａｂｌｅ Ｂｌｕｅ死細胞染色キット、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で染色し、次いで、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（登録商標）試薬で固定および透過処理を施した。透過処理を施した細胞サンプルを染色手順まで－８０℃で保存した。抗体染色は透過処理の後に一段階で行った。４℃、暗所での３０分のインキュベーションの後に、細胞をＢＤ（登録商標）Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファーで洗浄し、次いで、ＬＳＲＩＩサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で取得した。解析はＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ｖ．１０ソフトウエアで行った。データは各ペプチドプールの合計として示し、非刺激（ＮＳ）条件に２を掛けた。
【0135】
統計分析
群間の統計的有意性はＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（ｖ９．２．０）を用いて調べた。対応しない群間の差は対応のないマン・ホイットニーのＵ検定（有意性ｐ＜０．０５）を用いて比較し、対応する群間の差はウィルコクソン符合順位検定（ｐ＜０．１）を用いて比較した。ＮＨＰ ｇＲＮＡおよびｓｇＲＮＡの統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエア（ｖ８．３．０）にてマン・ホイットニーの対応のないｔ検定を用いて行った。
群間の統計的有意性はＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（ｖ９．２．０）を用いて調べた。対応しない群間の差は対応のないマン・ホイットニーのＵ検定（有意性ｐ＜０．０５）を用いて比較し、対応する群間の差はウィルコクソン符合順位検定（ｐ＜０．１）を用いて比較した。ＮＨＰ ｇＲＮＡおよびｓｇＲＮＡの統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエア（ｖ８．３．０）にてマン・ホイットニーの対応のないｔ検定を用いて行った。
【0136】
結果
Ｓ－ＬＶの形成および特性評価
Ｓ糖タンパク質構築物「２Ｐ」を哺乳動物細胞で発現させ、Ｎｉ２＋アフィニティーおよびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により精製し、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を用いると収率は最大１０ｍｇ／リットルであった。生成されたこの天然三量体は、単一粒子のネガティブ染色電子顕微鏡および２Ｄクラス平均化によって決定した。生成された４％ホルムアルデヒド（ＦＡ）による化学架橋は、熱安定性をＴｍ６５℃まで高めることで天然Ｓ三量体よりも長期間Ｓ三量体の天然構造を保存した。３．４Å分解能におけるＦＡ架橋Ｓ（ＦＡ－Ｓ）のクライオ電子顕微鏡構造は、図１の（Ａ）に示されるように、架橋の２つの主要部位を明らかにした。図１の（Ａ）および（Ｂ）に示されるように、ＲＢＤ残基のＲ４０８とＫ３７８がＲＢＤ近傍で架橋して閉鎖した「ＲＢＤ－ダウン」コンフォメーションＳ三量体を生じていた。第２の部位は、図１の（Ｃ）に示されるように、中央のＳ２ヘリックスのＲ１０１９および／またはＳ２ Ｋ７７６とＳ２ ＨＲ１ Ｋ９４７の架橋により内部Ｓ２サブユニット結合を導入した。ＦＡ－Ｓは、リポソーム（ホスファチジルコリン６０％、コレステロール３６％、ＤＧＳ－ＮＴＡ ４％）とともにインキュベートしたところ、そのＣ末端Ｈｉｓタグを介して有効に捕捉された。Ｓプロテオリポソームからスクロース勾配遠心分離によって遊離型の非結合Ｆａ－Ｓを除去し、これらのリポソームのＦＡ－Ｓによる修飾（Ｓ－ＬＶ）が、図１の（Ｄ）に示されるように、ネガティブ染色電子顕微鏡によって確認された。
Ｓ－ＬＶの形成および特性評価
Ｓ糖タンパク質構築物「２Ｐ」を哺乳動物細胞で発現させ、Ｎｉ２＋アフィニティーおよびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により精製し、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を用いると収率は最大１０ｍｇ／リットルであった。生成されたこの天然三量体は、単一粒子のネガティブ染色電子顕微鏡および２Ｄクラス平均化によって決定した。生成された４％ホルムアルデヒド（ＦＡ）による化学架橋は、熱安定性をＴｍ６５℃まで高めることで天然Ｓ三量体よりも長期間Ｓ三量体の天然構造を保存した。３．４Å分解能におけるＦＡ架橋Ｓ（ＦＡ－Ｓ）のクライオ電子顕微鏡構造は、図１の（Ａ）に示されるように、架橋の２つの主要部位を明らかにした。図１の（Ａ）および（Ｂ）に示されるように、ＲＢＤ残基のＲ４０８とＫ３７８がＲＢＤ近傍で架橋して閉鎖した「ＲＢＤ－ダウン」コンフォメーションＳ三量体を生じていた。第２の部位は、図１の（Ｃ）に示されるように、中央のＳ２ヘリックスのＲ１０１９および／またはＳ２ Ｋ７７６とＳ２ ＨＲ１ Ｋ９４７の架橋により内部Ｓ２サブユニット結合を導入した。ＦＡ－Ｓは、リポソーム（ホスファチジルコリン６０％、コレステロール３６％、ＤＧＳ－ＮＴＡ ４％）とともにインキュベートしたところ、そのＣ末端Ｈｉｓタグを介して有効に捕捉された。Ｓプロテオリポソームからスクロース勾配遠心分離によって遊離型の非結合Ｆａ－Ｓを除去し、これらのリポソームのＦＡ－Ｓによる修飾（Ｓ－ＬＶ）が、図１の（Ｄ）に示されるように、ネガティブ染色電子顕微鏡によって確認された。
【0137】
ＦＡ－Ｓ－ＬＶｓ免疫誘導はカニクイザルにおいて強力な中和抗体応答を誘導した
カニクイザルの小規模ワクチン接種試験に関して免疫原性および中和抗体の惹起を評価するためにＦＡ－Ｓ－ＬＶｓを作製した。４個体のカニクイザルを、図２の（Ａ）に示されるように、０、４、８および１９週目に筋肉内経路によってモノリン脂質Ａ（ＭＰＬＡ）リポソームをアジュバントとする５０μｇのＳ－ＬＶｓで免疫した。免疫したマカクザルの血清を２週間隔で、天然Ｓ糖タンパク質（Ｓ）、ＦＡ架橋Ｓ糖タンパク質（ＦＡ－Ｓ）およびＲＢＤに対する結合に関して分析した。これらの結果から全ての動物で同等のＳ特異的Ａｂ力価が明らかになった。Ｓ ＥＤ５０力価は、図２の（Ｂ）に示されるように、それぞれ１回目、２回目および３回目の免疫誘導後に、４週目の約７５から６週目の約１００００、さらに１２週目の約２００００に増大した。図２の（Ｃ）に示されるように、ＦＡ－Ｓに対して力価の若干の低下が検出された。ＲＢＤ単独に対する力価は、図２の（Ｄ）に示されるように、数個体で、４週目に約１００、６週目に約４５００のＩＤ５０に達し、１２週目に若干増加した。このことは１回目と２回目の免疫誘導は有意なＲＢＤ力価を誘導し、一方、３回目の免疫誘導は非ＲＢＤ抗体を追加刺激したことを示し、これは、１２週目のＳ特異的力価はこの比率が低かった従前の時点とは対照的にＲＢＤ特異的力価の４倍を超えたためである。４回目の免疫誘導は抗体生成をさらに刺激することはなく、２２週目の力価は１２週目の力価よりも低いか同等であった。これらの結果は、ＦＡ－Ｓ－ＬＶ免疫誘導は１回目および２回目の免疫誘導後に主としてＲＢＤ特異的抗体を誘導し、３回目の免疫誘導は非ＲＢＤ抗体の生成を有意に増加させたことを示す。
カニクイザルの小規模ワクチン接種試験に関して免疫原性および中和抗体の惹起を評価するためにＦＡ－Ｓ－ＬＶｓを作製した。４個体のカニクイザルを、図２の（Ａ）に示されるように、０、４、８および１９週目に筋肉内経路によってモノリン脂質Ａ（ＭＰＬＡ）リポソームをアジュバントとする５０μｇのＳ－ＬＶｓで免疫した。免疫したマカクザルの血清を２週間隔で、天然Ｓ糖タンパク質（Ｓ）、ＦＡ架橋Ｓ糖タンパク質（ＦＡ－Ｓ）およびＲＢＤに対する結合に関して分析した。これらの結果から全ての動物で同等のＳ特異的Ａｂ力価が明らかになった。Ｓ ＥＤ５０力価は、図２の（Ｂ）に示されるように、それぞれ１回目、２回目および３回目の免疫誘導後に、４週目の約７５から６週目の約１００００、さらに１２週目の約２００００に増大した。図２の（Ｃ）に示されるように、ＦＡ－Ｓに対して力価の若干の低下が検出された。ＲＢＤ単独に対する力価は、図２の（Ｄ）に示されるように、数個体で、４週目に約１００、６週目に約４５００のＩＤ５０に達し、１２週目に若干増加した。このことは１回目と２回目の免疫誘導は有意なＲＢＤ力価を誘導し、一方、３回目の免疫誘導は非ＲＢＤ抗体を追加刺激したことを示し、これは、１２週目のＳ特異的力価はこの比率が低かった従前の時点とは対照的にＲＢＤ特異的力価の４倍を超えたためである。４回目の免疫誘導は抗体生成をさらに刺激することはなく、２２週目の力価は１２週目の力価よりも低いか同等であった。これらの結果は、ＦＡ－Ｓ－ＬＶ免疫誘導は１回目および２回目の免疫誘導後に主としてＲＢＤ特異的抗体を誘導し、３回目の免疫誘導は非ＲＢＤ抗体の生成を有意に増加させたことを示す。
【0138】
野生型偽ウイルスを用いた血清中和力価は、４個体全ての動物に惹起された。１回目の免疫誘導後の２週目に、１００～１０００のＩＤ５０力価が見られ、これは４週目にベースライン付近まで低下したが、６週目、すなわち２回目の免疫誘導後の２週間後に有意に上昇し、５０００～約２００００のＩＤ５０を示した。その後、ＩＤ５０は８週目に低下し、１１週目、すなわち３回目の免疫誘導の３週間後に２００００～約４００００に増加した。１９週目には、中和効力は低下したもののなお高く、３回の免疫誘導はロバストな中和力価を誘導したことを示す。４回目の免疫誘導は、図３の（Ａ）に示されるように、３回目の免疫誘導後と同レベルまで中和力価を増強した。
【0139】
１１週目の血清を抗ＲＢＤアフィニティークロマトグラフィーによって除去操作を行ったところ、ＥＬＩＳＡによって検出可能なＲＢＤ抗体は存在しなかった。ＲＢＤ特異的Ａｂ除去血清は、完全血清の１０～３０％の中和を示し、いくらかのレベルの非ＲＢＤ特異的中和を示した。２個体の動物では主としてＲＢＤ特異的Ａｂ中和が優勢であったが、図３の（Ｂ）に示されるように、非ＲＢＤ特異的Ａｂ中和活性の画分は他の２個体の動物でより高いと思われ、高い中和力価におけるこれらのＡｂの関与が示唆される。
【0140】
ＦＡ－Ｓ－ＬＶ免疫誘導はカニクイザルをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染から保護した
ＦＡ－Ｓ－ＬＶワクチン接種により誘導される保護の程度を決定するために、ワクチン接種動物および非ワクチン接種動物（ｎ＝４）に初代ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２分離株（ＢｅｔａＣｏＶ／フランス／ＩＤＦ／０３７２／２０２０）を、総用量１×１０５プラーク形成単位（ｐｆｕ）で感染させた。感染は、２４週目、すなわち最後の免疫誘導から５週間後に鼻腔内経路（各鼻孔に０．２５ｍＬ）と気管内経路（４．５ｍＬ）を組み合わせることによって誘導した。図４の（Ａ）に示されるように、対照動物群のウイルス量は、曝露３日後に気管で最大となり、中央値は６．０ｌｏｇ１０コピー／ｍｌであり、鼻咽頭では曝露４～６日後に最大となり、コピー数中央値は６．６ｌｏｇ１０コピー／ｍｌであった。その後、ウイルス量は低下し、気管では曝露１０日後にウイルスは検出されなくなったが、一部の動物では、鼻咽頭ぬぐい液に曝露１４日後までウイルスの検出を示した。気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）では、４個体のうち３個体の対照（ＣＴＲＬ）動物が曝露３日後に検出可能なウイルス量を示し、そのうち２個体は曝露７日後も検出可能なままであり、それぞれ平均値は５．４および３．６ｌｏｇ１０コピー／ｍＬであった。１個体の動物で直腸液は陽性と判定され、この個体は気管および鼻咽頭のウイルス量も最大であった。ぬぐい液を用いてまたは洗浄中に回収された感染細胞および増殖感染細胞の数を推定すると考えられているウイルスサブゲノムＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、図４の（Ｂ）に示されるように、気管および鼻咽頭液でそれぞれ曝露３／４～６日後に最大コピー数を示した。気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）では、高いゲノムウイルス量を呈する２個体の動物はまた、曝露３～７日後に検出可能なｓｇＲＮＡを示し、中央値はそれぞれ５．１および３．１ｌｏｇ１０コピー／ｍＬであった。
ＦＡ－Ｓ－ＬＶワクチン接種により誘導される保護の程度を決定するために、ワクチン接種動物および非ワクチン接種動物（ｎ＝４）に初代ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２分離株（ＢｅｔａＣｏＶ／フランス／ＩＤＦ／０３７２／２０２０）を、総用量１×１０５プラーク形成単位（ｐｆｕ）で感染させた。感染は、２４週目、すなわち最後の免疫誘導から５週間後に鼻腔内経路（各鼻孔に０．２５ｍＬ）と気管内経路（４．５ｍＬ）を組み合わせることによって誘導した。図４の（Ａ）に示されるように、対照動物群のウイルス量は、曝露３日後に気管で最大となり、中央値は６．０ｌｏｇ１０コピー／ｍｌであり、鼻咽頭では曝露４～６日後に最大となり、コピー数中央値は６．６ｌｏｇ１０コピー／ｍｌであった。その後、ウイルス量は低下し、気管では曝露１０日後にウイルスは検出されなくなったが、一部の動物では、鼻咽頭ぬぐい液に曝露１４日後までウイルスの検出を示した。気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）では、４個体のうち３個体の対照（ＣＴＲＬ）動物が曝露３日後に検出可能なウイルス量を示し、そのうち２個体は曝露７日後も検出可能なままであり、それぞれ平均値は５．４および３．６ｌｏｇ１０コピー／ｍＬであった。１個体の動物で直腸液は陽性と判定され、この個体は気管および鼻咽頭のウイルス量も最大であった。ぬぐい液を用いてまたは洗浄中に回収された感染細胞および増殖感染細胞の数を推定すると考えられているウイルスサブゲノムＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、図４の（Ｂ）に示されるように、気管および鼻咽頭液でそれぞれ曝露３／４～６日後に最大コピー数を示した。気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）では、高いゲノムウイルス量を呈する２個体の動物はまた、曝露３～７日後に検出可能なｓｇＲＮＡを示し、中央値はそれぞれ５．１および３．１ｌｏｇ１０コピー／ｍＬであった。
【0141】
対照動物とは対照的に、ワクチン接種群ではいずれの時点でも、ｇＲＮＡもｓｇＲＮＡも検出されなかった。対照群の気管および鼻咽頭の平均ｇＲＮＡピーク（それぞれ６．０および６．６ｌｏｇ１０コピー／ｍＬ）は、ワクチン接種群よりも高かった（ｐ＝０．０２８６）。曲線下面積も対照群の気管のほうが高かった（６．２ｌｏｇ１０、ｐ＝０．２８６）。気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）において、動物の数が少ないために、差は統計的に有意でなかった。ワクチン接種群には、上気道にも下気道にもウイルスＲＮＡが全く無かったことは、ワクチン接種によって殺菌免疫が誘導されたことを強く示唆した。図５の（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）に示されるように、Ｓ、ＦＡ－ＳおよびＲＢＤに対するＩＤ５０抗体力価は、感染日（２４週目）から曝露４週間後までやや低下したが、曝露１週間後（２５週目）ではＡｂ力価に小さな増加が見られる。図５の（Ｄ）に示されるように、Ａｂ力価はまた、２４週目から曝露４週間後まで中和における若干の低下と相関していたが、１個体の動物は、２５週目、すなわち曝露１週間後には中和に小さな増大を示した。これは、ワクチン接種動物の抗原投与がそれらの免疫系を有意には追加刺激しなかったことを示した。対照的に、対照群は、曝露２週間後（２６週目）にＳ、ＦＡ－ＳおよびＲＢＤ特異的ＩｇＧの明確な検出を示し始め、これはほとんどの動物で、曝露２週間後の中和の検出と相関していた。
ワクチン接種動物の保護は、図２の（Ｅ）に示されるように、鼻咽頭液の有意なＳおよびＲＢＤ特異的ＩｇＧおよびＩｇＡの存在とさらに相関していた。このことは、Ｓ－ＬＶワクチン接種が粘膜免疫を誘導し、これがワクチン接種の殺菌効果に寄与している可能性が極めて高いことを示した。
ワクチン接種動物の保護は、図２の（Ｅ）に示されるように、鼻咽頭液の有意なＳおよびＲＢＤ特異的ＩｇＧおよびＩｇＡの存在とさらに相関していた。このことは、Ｓ－ＬＶワクチン接種が粘膜免疫を誘導し、これがワクチン接種の殺菌効果に寄与している可能性が極めて高いことを示した。
【0142】
曝露後最初の１４日の間、全ての対照動物は、胸部コンピューター断層撮影法（ＣＴ）により検出される非拡張すりガラス陰影（ＧＧＯ）を特徴とする軽度肺病変を示した。ワクチン接種動物は、ＣＴスコアに抗原投与の有意な影響を示さなかった。１０を超える病変スコアを示した唯一の動物は対照群のものであった。全ての対照動物が曝露２～８日の間に、おそらくは感染に対する応答に相当する単球増加症を受けたが、ワクチン接種サルでは、これらの動物における検出可能な既往応答の不在と一致して、単球総数は抗原投与後も安定なままであった。
【0143】
ＣＤ４およびＣＤ８特異的Ｔ細胞のレベルを、両動物群で測定した。図６に示されるように、曝露前、Ｔｈ１型ＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、ＰＢＭＣのＳ－ペプチドプールによるｅｘ ｖｉｖｏ刺激の後の全てのワクチン接種したマカクザルに見られた。検出可能な抗Ｓ ＣＤ８＋Ｔ細胞を有するものはいなかった。この場合にもワクチン接種動物における既往応答の不在と一致して、曝露１４日後に有意差は見られなかった。対照的に、対照動物のほとんどのものでは、曝露後に抗Ｓ Ｔｈ１ ＣＤ４＋応答が増大した。
【0144】
これらの結果は、ＦＡ－Ｓ－ＬＶワクチン接種が殺菌免疫を生成し得ることを示し、このようなワクチン接種スキームがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２伝達の連鎖を経つために有効であることを示す。
【0145】
ＦＡ－Ｓ－ＬＶｓワクチン接種はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体のロバストな中和を生じた
血清中和を変異体Ｂ．１．１．７（アルファ、ＵＫ）、Ｂ．１．３５１（ベータ、ＳＡ）およびＰ．１（ガンマ、ＢＲ）に対してさらに試験した。ワクチン接種群と非ワクチン接種群の血清を２４週目および２８週目に比較したところ、３種類全ての変異体で高い中和力価を示し、ＩＤ５０中央値は１０．０００～２０．０００の範囲であり、野生型偽ウイルスの中和に匹敵した。しかしながら、非ワクチン接種抗原投与群の曝露前血清中和のバックグラウンドは比較的高かった（ＩＤ５０中央値は４００～１１００の範囲）ことから、８週目（２回の免疫誘導の後）、１２週目（３回の免疫誘導）および２４および２８週目（４回の免疫誘導）からのワクチン接種群の血清サンプルから精製したＩｇＧによる中和を繰り返した。これは、図７に示されるように、８週目に野生型（ＷＴ）およびアルファに対して、ＷＴ血清中和（図３（Ａ））に匹敵する約４５００のＩＤ５０中央値を示した。８週目のベータおよびガンマに対してはそれぞれより低いＩＤ５０が見られた。中和効力は３回目の免疫誘導（１２週目）の後に増加し、ＩＤ５０中央値は約５０００（ＷＴ）、約８０００（アルファ）、約８００（ベータ）および１０００（ガンマ）であった。図７に示されるように、中和力価は２４週目の４回目の免疫誘導の後には増加せず、２８週目に低下し始めた。これらの結果は、３回の免疫誘導が変異体に対するロバストな防御効果を発揮したことを示す。
血清中和を変異体Ｂ．１．１．７（アルファ、ＵＫ）、Ｂ．１．３５１（ベータ、ＳＡ）およびＰ．１（ガンマ、ＢＲ）に対してさらに試験した。ワクチン接種群と非ワクチン接種群の血清を２４週目および２８週目に比較したところ、３種類全ての変異体で高い中和力価を示し、ＩＤ５０中央値は１０．０００～２０．０００の範囲であり、野生型偽ウイルスの中和に匹敵した。しかしながら、非ワクチン接種抗原投与群の曝露前血清中和のバックグラウンドは比較的高かった（ＩＤ５０中央値は４００～１１００の範囲）ことから、８週目（２回の免疫誘導の後）、１２週目（３回の免疫誘導）および２４および２８週目（４回の免疫誘導）からのワクチン接種群の血清サンプルから精製したＩｇＧによる中和を繰り返した。これは、図７に示されるように、８週目に野生型（ＷＴ）およびアルファに対して、ＷＴ血清中和（図３（Ａ））に匹敵する約４５００のＩＤ５０中央値を示した。８週目のベータおよびガンマに対してはそれぞれより低いＩＤ５０が見られた。中和効力は３回目の免疫誘導（１２週目）の後に増加し、ＩＤ５０中央値は約５０００（ＷＴ）、約８０００（アルファ）、約８００（ベータ）および１０００（ガンマ）であった。図７に示されるように、中和力価は２４週目の４回目の免疫誘導の後には増加せず、２８週目に低下し始めた。これらの結果は、３回の免疫誘導が変異体に対するロバストな防御効果を発揮したことを示す。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】
【外国語明細書】