(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023182293
(43)【公開日】2023-12-26
(54)【発明の名称】牛妊娠関連糖タンパク質測定キット
(51)【国際特許分類】
G01N 33/543 20060101AFI20231219BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20231219BHJP
【ＦＩ】
G01N33/543 521
G01N33/543 541B
G01N33/53 V
【審査請求】未請求
【請求項の数】4
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022095818
(22)【出願日】2022-06-14
(71)【出願人】
【識別番号】000003160
【氏名又は名称】東洋紡株式会社
(72)【発明者】
【氏名】山口 達哉
(57)【要約】
【課題】 本発明は、酪農の現場において、乳牛の乳汁中ｂＰＡＧ濃度を迅速、簡便、高感度に測定可能なイムノクロマト測定キットを提供する。
【解決手段】 本発明は、乳汁中のｂＰＡＧを定量するためのイムノクロマト測定キットであって、前記乳汁を希釈するための検体希釈液、およびイムノクロマトストリップを含み、前記検体希釈液は、ランタノイド錯体で標識されたｂＰＡＧに対する抗体を含む測定キットである。
【選択図】なし
【解決手段】 本発明は、乳汁中のｂＰＡＧを定量するためのイムノクロマト測定キットであって、前記乳汁を希釈するための検体希釈液、およびイムノクロマトストリップを含み、前記検体希釈液は、ランタノイド錯体で標識されたｂＰＡＧに対する抗体を含む測定キットである。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
乳汁中のｂＰＡＧを定量するためのイムノクロマト測定キットであって、
前記乳汁を希釈するための検体希釈液、およびイムノクロマトストリップを含み、
前記検体希釈液は、ランタノイド錯体で標識されたｂＰＡＧに対する抗体を含む、
ことを特徴とする測定キット。
前記乳汁を希釈するための検体希釈液、およびイムノクロマトストリップを含み、
前記検体希釈液は、ランタノイド錯体で標識されたｂＰＡＧに対する抗体を含む、
ことを特徴とする測定キット。
【請求項2】
前記イムノクロマトストリップは、試料添加部材、膜担体、および吸収部材が順に連接配置されており、前記膜担体はテストラインおよびコントロールラインを有することを特徴とする請求項１に記載の測定キット。
【請求項3】
前記テストラインには、抗ｂＰＡＧ抗体が固定化されており、前記コントロールラインには、前記標識されたｂＰＡＧに対する抗体と特異的に結合する抗体が固定化されていることを特徴とする請求項２に記載の測定キット。
【請求項4】
前記ランタノイドは、ユウロピウム、テルビウム、サマリウム、またはジスプロシウム、あるいはそれらの組み合わせであることを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、牛から得られる生体試料中の牛妊娠関連糖タンパク質（ｂＰＡＧ）を測定するためのイムノクロマト測定キットに関する。より詳しくは、乳汁（検体）を希釈するための検体希釈液、およびｂＰＡＧを定量するためのイムノクロマトストリップを含む、乳汁中のｂＰＡＧを測定するための測定キットに関する。
【背景技術】
【0002】
酪農経営にとって乳牛が妊娠することは、牛乳を搾る上での必要条件である。乳牛が妊娠し、分娩して初めて牛乳の生産が開始される。より多くの妊娠牛を確保することは、酪農の経営安定化には最も重要である。受精後、不受胎になった場合には、経済的損失を抑えるためになるべく早期に再交配を行うなどの対処が必要となる。従って、授精後に妊娠診断を行い、妊娠の成否をなるべく早期に知ることは極めて重要である。乳牛の妊娠検査は、直腸検査法、携帯型超音波画像診断装置を用いた診断、７０日ノンリターン法(授精後７０日を経て発情がなければ妊娠したと判定する方法)などの方法により、従来から実施されてきている。近年、新たな妊娠検査法として、血中や乳汁中のｂＰＡＧを測定する方法の有用性が報告されており、その利用が広がりつつある。
【0003】
ｂＰＡＧの測定には、ＥＬＩＳＡ法が一般に用いられている。例えば、特許文献１には、ｂＰＡＧのＥＬＩＳＡ測定に関する記載がされている。しかし、現場で乳汁や血液を採取し、検査機関にサンプルを送付し測定を依頼するケースでは、検査結果が出るのは翌日～数日後であり、万一、非妊娠である場合には対処が遅れる可能性があるという欠点がある。
【0004】
また、血中ｂＰＡＧを測定するためには採血が必要であり、これは獣医師に委ねなければならないことが多いため、容易に採取可能な乳汁中のｂＰＡＧを測定対象とすることが望ましい。このため、乳汁中のｂＰＡＧを牛の飼育現場で簡便に測定する方法が求められている。一方で、乳汁中のｂＰＡＧは血液中に比べると著しくその濃度が低いことが報告されており、通常のイムノクロマト法では正確に測定することは容易ではない（非特許文献１）。即ち、高感度に乳汁中ｂＰＡＧ濃度の測定が出来る、イムノクロマト法の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】国際公開公報２００９／０７６６３２
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】ＰＬＯＳ ＯＮＥ，２０２１，１２；１６（５），ｅ０２５１４１４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、乳牛の飼育現場において乳汁中のｂＰＡＧ濃度を迅速、簡便、高感度に測定することができるイムノクロマト測定キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者は、前記課題を解決するために鋭意検討した結果、以下に示す手段により前記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。
【0009】
すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
（１） 乳汁中のｂＰＡＧを定量するためのイムノクロマト測定キットであって、
前記乳汁を希釈するための検体希釈液、およびイムノクロマトストリップを含み、
前記検体希釈液は、ランタノイド錯体で標識されたｂＰＡＧに対する抗体を含む、
ことを特徴とする測定キット。
（２） 前記イムノクロマトストリップは、試料添加部材、膜担体、および吸収部材が順に連接配置されており、前記膜担体はテストラインおよびコントロールラインを有することを特徴とする（１）に記載の測定キット。
（３） 前記テストラインには、抗ｂＰＡＧ抗体が固定化されており、前記コントロールラインには、前記標識されたｂＰＡＧに対する抗体と特異的に結合する抗体が固定化されていることを特徴とする（２）に記載の測定キット。
（４） 前記ランタノイドは、ユウロピウム、テルビウム、サマリウム、またはジスプロシウム、あるいはそれらの組み合わせであることを特徴とする（１）～（３）のいずれかに記載の測定キット。
（１） 乳汁中のｂＰＡＧを定量するためのイムノクロマト測定キットであって、
前記乳汁を希釈するための検体希釈液、およびイムノクロマトストリップを含み、
前記検体希釈液は、ランタノイド錯体で標識されたｂＰＡＧに対する抗体を含む、
ことを特徴とする測定キット。
（２） 前記イムノクロマトストリップは、試料添加部材、膜担体、および吸収部材が順に連接配置されており、前記膜担体はテストラインおよびコントロールラインを有することを特徴とする（１）に記載の測定キット。
（３） 前記テストラインには、抗ｂＰＡＧ抗体が固定化されており、前記コントロールラインには、前記標識されたｂＰＡＧに対する抗体と特異的に結合する抗体が固定化されていることを特徴とする（２）に記載の測定キット。
（４） 前記ランタノイドは、ユウロピウム、テルビウム、サマリウム、またはジスプロシウム、あるいはそれらの組み合わせであることを特徴とする（１）～（３）のいずれかに記載の測定キット。
【発明の効果】
【0010】
本発明により、乳牛の飼育現場において乳汁中のｂＰＡＧ濃度を、高感度、迅速、簡便に測定することが可能なｂＰＡＧ測定用イムノクロマトキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】イムノクロマトストリップの一例を示す模式図（上面図）である。
【図2】イムノクロマトストリップの一例を示す模式図（側面図）である。
【図3】ハウジングケースに収容したイムノクロマトストリップの一例を示す模式図である。
【図4】本発明のイムノクロマト測定キットを用いて得られたｂＰＡＧの測定値の一例を示すグラフである。
【図5】本発明のイムノクロマト測定キットおよびＥＬＩＳＡ法による測定値の関係の一例を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0012】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0013】
本発明は、乳汁中のｂＰＡＧを定量するためのイムノクロマト測定キットであって、前記乳汁を希釈するための検体希釈液、およびイムノクロマトストリップを含み、前記検体希釈液は、ランタノイド錯体で標識されたｂＰＡＧに対する抗体を含む測定キットである。
【0014】
（生体試料）
本発明において、係る対象となる生体試料としては、乳汁が適しているが特に限定されない。動物種も、ウシの他、ヒト、ウマ、イヌ、ネコなどを測定対象とすることが出来る。
本発明において、係る対象となる生体試料としては、乳汁が適しているが特に限定されない。動物種も、ウシの他、ヒト、ウマ、イヌ、ネコなどを測定対象とすることが出来る。
【0015】
（ｂＰＡＧ）
ｂＰＡＧ（牛妊娠関連糖タンパク質）は、妊娠時にのみ胎盤から分泌される糖タンパク質であり、アスパルティックプロテアーゼファミリーに属する。胎盤で産生されたｂＰＡＧは血液中に分泌される。末梢血中のｂＰＡＧは妊娠２０日前後に約１ｎｇ／ｍＬの濃度で検出され、妊娠の経過とともに増加し、分娩の約２０日前から急増して、分娩日には１～２μｇ／ｍＬの濃度にまで達する。ｂＰＡＧには、ｂＰＡＧ－１、ｂＰＡＧ－２などの他、全部で２０種以上のアイソフォームが存在し、それぞれが異なるアミノ酸配列を有することが明らかとなっている。ｂＰＡＧは血清、血漿、唾液、乳または尿中にも含まれているが、乳汁中のｂＰＡＧは血液中の濃度と関係が深く、血中ＰＡＧと同様に妊娠時に上昇し、分娩後に減少していく。本発明においては、ＰＡＧ－１の他、いずれのアイソフォームも定量することができる。
ｂＰＡＧ（牛妊娠関連糖タンパク質）は、妊娠時にのみ胎盤から分泌される糖タンパク質であり、アスパルティックプロテアーゼファミリーに属する。胎盤で産生されたｂＰＡＧは血液中に分泌される。末梢血中のｂＰＡＧは妊娠２０日前後に約１ｎｇ／ｍＬの濃度で検出され、妊娠の経過とともに増加し、分娩の約２０日前から急増して、分娩日には１～２μｇ／ｍＬの濃度にまで達する。ｂＰＡＧには、ｂＰＡＧ－１、ｂＰＡＧ－２などの他、全部で２０種以上のアイソフォームが存在し、それぞれが異なるアミノ酸配列を有することが明らかとなっている。ｂＰＡＧは血清、血漿、唾液、乳または尿中にも含まれているが、乳汁中のｂＰＡＧは血液中の濃度と関係が深く、血中ＰＡＧと同様に妊娠時に上昇し、分娩後に減少していく。本発明においては、ＰＡＧ－１の他、いずれのアイソフォームも定量することができる。
【0016】
（ランタノイド）
ランタノイド（Ｌｎ）とは、周期表で第６周期第３族に位置する１５個の金属元素の総称である。これらの金属は他の分子との複合体（錯体）を形成したときに強い蛍光を発するが、その蛍光は、通常の有機化合物の蛍光に比べて、水中で約１万倍から１０万倍という長い蛍光寿命を持つことが大きな特徴である。ランタノイド錯体の蛍光プローブを用いれば、励起光を当てた後に一定の時間を置いて（余分な蛍光が減衰してから）測定を開始することにより、高いＳ／Ｎ比で測定することが出来る。これは時間分解測定と呼ばれる。
ランタノイド（Ｌｎ）とは、周期表で第６周期第３族に位置する１５個の金属元素の総称である。これらの金属は他の分子との複合体（錯体）を形成したときに強い蛍光を発するが、その蛍光は、通常の有機化合物の蛍光に比べて、水中で約１万倍から１０万倍という長い蛍光寿命を持つことが大きな特徴である。ランタノイド錯体の蛍光プローブを用いれば、励起光を当てた後に一定の時間を置いて（余分な蛍光が減衰してから）測定を開始することにより、高いＳ／Ｎ比で測定することが出来る。これは時間分解測定と呼ばれる。
【0017】
（ランタノイド標識）
ランタノイド錯体は、蛍光標識物質として抗体などのタンパク質に結合させることが出来る。例えば、市販の標識体作成のためのキット（ＱｕｉｃｋＡＬＬＡｓｓａｙＴＭユーロピウムキレートラベリングキット、ＢＮｐａｎｄｓ、Ｗ１０２４）などを利用することが出来る。キットを利用して、例えば、ユウロピウム錯体標識した抗ｂＰＡＧ抗体を作製することが出来る。
ランタノイド錯体は、蛍光標識物質として抗体などのタンパク質に結合させることが出来る。例えば、市販の標識体作成のためのキット（ＱｕｉｃｋＡＬＬＡｓｓａｙＴＭユーロピウムキレートラベリングキット、ＢＮｐａｎｄｓ、Ｗ１０２４）などを利用することが出来る。キットを利用して、例えば、ユウロピウム錯体標識した抗ｂＰＡＧ抗体を作製することが出来る。
【0018】
（蛍光強度測定）
前述のように、ランタノイドは、通常の蛍光物質と比較し蛍光寿命が非常に長いという特徴がある。この特徴を利用した時間分解測定では、通常の蛍光が消光した後に測定を開始し、一定時間内の蛍光強度の測定を行う。更に、ランタノイドはストークスシフト（ユウロピウムの場合は、励起波長３４０ｎｍ、蛍光波長６１５ｎｍ）が非常に広いという特徴を持ち合わせているため、バックグラウンドの影響を最小限に抑えることができる。本発明の測定キットの蛍光強度測定には、ユウロピウムの時間分解測定に対応したイムノクロマトリーダーなどが好適に利用出来る。
前述のように、ランタノイドは、通常の蛍光物質と比較し蛍光寿命が非常に長いという特徴がある。この特徴を利用した時間分解測定では、通常の蛍光が消光した後に測定を開始し、一定時間内の蛍光強度の測定を行う。更に、ランタノイドはストークスシフト（ユウロピウムの場合は、励起波長３４０ｎｍ、蛍光波長６１５ｎｍ）が非常に広いという特徴を持ち合わせているため、バックグラウンドの影響を最小限に抑えることができる。本発明の測定キットの蛍光強度測定には、ユウロピウムの時間分解測定に対応したイムノクロマトリーダーなどが好適に利用出来る。
【0019】
（検体希釈液）
本発明において、検体希釈液は、所定のｐＨ範囲において充分な緩衝能力を有していれば、いかなる種類の緩衝剤を用いてもよく、例えば、トリス、リン酸、フタル酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、ホウ酸、酒石酸、酢酸、炭酸、グッドバッファー（ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、コラミン塩酸、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、アセトアミドグリシン、トリシン、グリシンアミド、ビシン）等が挙げられる。
本発明において、検体希釈液は、所定のｐＨ範囲において充分な緩衝能力を有していれば、いかなる種類の緩衝剤を用いてもよく、例えば、トリス、リン酸、フタル酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、ホウ酸、酒石酸、酢酸、炭酸、グッドバッファー（ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、コラミン塩酸、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、アセトアミドグリシン、トリシン、グリシンアミド、ビシン）等が挙げられる。
【0020】
本発明において、検体希釈液は、生体試料を展開させるための展開液として使用することができる。検体希釈液は、イムノクロマトストリップ上での生体試料の展開性を向上させ、かつ免疫反応に影響しない非イオン性界面活性剤を含むことが好ましい。非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アルキルグルコシド、ショ糖脂肪酸エステル等が挙げられる。また、検体希釈液中の界面活性剤の濃度は、生体試料の希釈倍率にもよるが０．０１質量％以上０．２質量％以下が好ましく、０．０５質量％以上０．２質量％以下がより好ましく、０．０５質量％以上０．１５質量％以下がさらに好ましい。濃度が低すぎると、生体試料希釈液が展開しにくくなることがあり、濃度が高すぎると、テストラインのシグナルが低くなることがある。
【0021】
また、検体希釈液は、競合反応の効率化、促進、特異性向上のために、ポリエチレングリコールおよび／または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。検体希釈液へのポリエチレングリコールおよび塩化ナトリウムの添加濃度は、生体試料希釈液中の終濃度がそれぞれ、１質量％以上４質量％以下、１質量％以上３質量％以下となるように添加するのが好ましい。なお、使用するポリエチレングリコールの数平均分子量は、好ましくは２０００以上１６０００以下であり、より好ましくは５０００以上１００００以下である。数平均分子量が小さい場合、本発明に適した充分な抗原抗体反応の促進作用が得られないことがある。また、数平均分子量が大きい場合、同様に、抗原抗体反応の促進作用が得られないとか、生体試料希釈液の粘性が高くなり、イムノクロマトストリップ上の展開性が低下することがある。
【0022】
本発明において、検体希釈液は、ランタノイド錯体により標識された抗ｂＰＡＧ抗体を含んでいる。抗体は、ｂＰＡＧに対する抗体であればよく、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
【0023】
本発明ではまた、前記検体希釈液を用いて生体試料を希釈する際の希釈倍率は、２倍～５００倍程度が好ましく、５倍～１００倍がより好ましい。この希釈倍率においては、検体中の夾雑物の影響を回避し、且つ、より正確にｂＰＡＧの測定が可能となる。
【0024】
（抗ｂＰＡＧ抗体）
本発明において、抗ｂＰＡＧ抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、ポリクローナル抗体は、ウサギやマウスなどに免疫して得られた抗血清からＩｇＧを精製するなどして得ることが出来る。モノクローナル抗体の産生細胞は、例えば、精製したｂＰＡＧを適当なアジュバントとともにマウスのような動物に免疫したのち、免疫された動物の脾細胞とミエローマ細胞とを融合し、融合細胞のみが増殖出来る選択培地で培養し、増殖した細胞を前記ｂＰＡＧなどを使用して、たとえば酵素標識免疫法などにより選別することにより取得することができる。
本発明において、抗ｂＰＡＧ抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、ポリクローナル抗体は、ウサギやマウスなどに免疫して得られた抗血清からＩｇＧを精製するなどして得ることが出来る。モノクローナル抗体の産生細胞は、例えば、精製したｂＰＡＧを適当なアジュバントとともにマウスのような動物に免疫したのち、免疫された動物の脾細胞とミエローマ細胞とを融合し、融合細胞のみが増殖出来る選択培地で培養し、増殖した細胞を前記ｂＰＡＧなどを使用して、たとえば酵素標識免疫法などにより選別することにより取得することができる。
【0025】
（イムノクロマトストリップ）
イムノクロマトストリップの具体例としては、図１、２に示されるようなイムノクロマトストリップ７が挙げられる。図１、２において、１は粘着シート、２は膜担体、３はテストライン、４はコントロールライン、５は試料添加部材、６は吸収部材を示している。膜担体２は、幅５ｍｍ、長さ２５ｍｍの細長い帯状のニトロセルロース製メンブレンからなり、同じく幅５ｍｍの粘着シート１の中ほどに貼り付けられている。膜担体２には、クロマト展開の始点側、すなわち図１、２の左側（上流側）の末端から右側（下流側）に向かって３ｍｍ以上１５ｍｍ以下の位置に、抗ｂＰＡＧ抗体が線状に固定され、生体試料（希釈液）中のｂＰＡＧを捕捉するためのテストライン４が形成（標識体中の化合物を特異的に結合する抗体が固定化）されている。さらに、膜担体２の上流側の末端から下流側に向かって８ｍｍ以上２５ｍｍ以下の位置にコントロールライン４が形成されている。なお、テストラインはコントロールラインよりも上流側に配置され、テストラインとコントロールラインとの距離は３ｍｍ以上１０ｍｍ未満とするのが好ましい。コントロールライン４は、分析対象物質であるｂＰＡＧの存否に係わらずイムノクロマト展開が行われたことを確認するためのものである。例えば、標識体に結合している抗体（ＩｇＧ）に対する抗体をコントロールライン４に固定化することによって形成することができる。
イムノクロマトストリップの具体例としては、図１、２に示されるようなイムノクロマトストリップ７が挙げられる。図１、２において、１は粘着シート、２は膜担体、３はテストライン、４はコントロールライン、５は試料添加部材、６は吸収部材を示している。膜担体２は、幅５ｍｍ、長さ２５ｍｍの細長い帯状のニトロセルロース製メンブレンからなり、同じく幅５ｍｍの粘着シート１の中ほどに貼り付けられている。膜担体２には、クロマト展開の始点側、すなわち図１、２の左側（上流側）の末端から右側（下流側）に向かって３ｍｍ以上１５ｍｍ以下の位置に、抗ｂＰＡＧ抗体が線状に固定され、生体試料（希釈液）中のｂＰＡＧを捕捉するためのテストライン４が形成（標識体中の化合物を特異的に結合する抗体が固定化）されている。さらに、膜担体２の上流側の末端から下流側に向かって８ｍｍ以上２５ｍｍ以下の位置にコントロールライン４が形成されている。なお、テストラインはコントロールラインよりも上流側に配置され、テストラインとコントロールラインとの距離は３ｍｍ以上１０ｍｍ未満とするのが好ましい。コントロールライン４は、分析対象物質であるｂＰＡＧの存否に係わらずイムノクロマト展開が行われたことを確認するためのものである。例えば、標識体に結合している抗体（ＩｇＧ）に対する抗体をコントロールライン４に固定化することによって形成することができる。
【0026】
（試料添加部材）
本発明において、試料添加部材５は、例えば、多孔質ポリエチレンおよび多孔質ポリプロピレンなどのような多孔質合成樹脂のシートまたはフィルム、あるいは、濾紙および綿布などのようなセルロース製の紙または不織布などを用いることができる。
本発明において、試料添加部材５は、例えば、多孔質ポリエチレンおよび多孔質ポリプロピレンなどのような多孔質合成樹脂のシートまたはフィルム、あるいは、濾紙および綿布などのようなセルロース製の紙または不織布などを用いることができる。
【0027】
（膜担体）
本発明において、膜担体２は、ニトロセルロース製メンブレンフィルターを用いているが、生体試料に含まれるｂＰＡＧをクロマト展開可能で、かつテストライン３を形成する抗体等の物質を固定可能なものであれば、いかなるものであってもよく、他のセルロース類膜、ナイロン膜、ガラス繊維膜なども使用できる。
本発明において、膜担体２は、ニトロセルロース製メンブレンフィルターを用いているが、生体試料に含まれるｂＰＡＧをクロマト展開可能で、かつテストライン３を形成する抗体等の物質を固定可能なものであれば、いかなるものであってもよく、他のセルロース類膜、ナイロン膜、ガラス繊維膜なども使用できる。
【0028】
（テストライン）
本発明において、テストラインに固定化する抗体は、ｂＰＡＧに特異的に結合することが出来る抗ｂＰＡＧ抗体であればよく、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。また、テストラインに固定化する抗体は、１種類であっても良いし、複数種を混合して用いても良い。
本発明において、テストラインに固定化する抗体は、ｂＰＡＧに特異的に結合することが出来る抗ｂＰＡＧ抗体であればよく、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。また、テストラインに固定化する抗体は、１種類であっても良いし、複数種を混合して用いても良い。
【0029】
（コントロールライン）
本発明において、コントロールラインには、標識体中の化合物を特異的に結合する抗体が固定化されているのが好ましい。例えば、抗ウサギＩｇＧ抗体や抗マウスＩｇＧ抗体などを膜担体に固定化することによって形成することができる。コントロールラインを用いることにより、イムノクロマト展開が（正常に）行われたことを確認することができる。
本発明において、コントロールラインには、標識体中の化合物を特異的に結合する抗体が固定化されているのが好ましい。例えば、抗ウサギＩｇＧ抗体や抗マウスＩｇＧ抗体などを膜担体に固定化することによって形成することができる。コントロールラインを用いることにより、イムノクロマト展開が（正常に）行われたことを確認することができる。
【0030】
（吸収部材）
本発明において、吸収部材６は、液体をすみやかに吸収、保持できる材質のものであればよく、綿布、濾紙、およびポリエチレン、ポリプロピレン等からなる多孔質プラスチック製不織布等を挙げることができるが、特に濾紙が最適である。
本発明において、吸収部材６は、液体をすみやかに吸収、保持できる材質のものであればよく、綿布、濾紙、およびポリエチレン、ポリプロピレン等からなる多孔質プラスチック製不織布等を挙げることができるが、特に濾紙が最適である。
【0031】
イムノクロマトストリップ７は、これを保護するため、また、取り扱いがし易いように、プラスチック製のハウジングケース８などに収容されるのが好ましい（図３）。このケースは、例えば、イムノクロマトストリップの試料添加部材５およびテストライン３およびコントロールライン４の上部に試料滴下部９と判定部（判定窓）１０が開口されていることが好ましい。
【0032】
（イムノクロマト展開）
生体試料と検体希釈液とを混合して調製した生体試料希釈液を試料添加部材５の試料滴下部９に滴下して毛細管現象を利用してイムノクロマトストリップ上を展開させる。展開中に試料中のｂＰＡＧは、ランタノイド錯体で標識された抗ｂＰＡＧ抗体に捕捉される。同時に、試料中ｂＰＡＧは、テストライン上の抗ｂＰＡＧ抗体にも捕捉される。このようにして得られたテストラインの蛍光強度を測定することにより、試料中のｂＰＡＧ濃度を定量することが出来る。
生体試料と検体希釈液とを混合して調製した生体試料希釈液を試料添加部材５の試料滴下部９に滴下して毛細管現象を利用してイムノクロマトストリップ上を展開させる。展開中に試料中のｂＰＡＧは、ランタノイド錯体で標識された抗ｂＰＡＧ抗体に捕捉される。同時に、試料中ｂＰＡＧは、テストライン上の抗ｂＰＡＧ抗体にも捕捉される。このようにして得られたテストラインの蛍光強度を測定することにより、試料中のｂＰＡＧ濃度を定量することが出来る。
【0033】
（イムノクロマト測定キット）
本発明のイムノクロマト測定キットは、上記のイムノクロマトストリップに加えて、生体試料を希釈するための検体希釈液を少なくとも含み、更に必要に応じて、検量線を作成するための標準液や、希釈するための容器などを含む。また、イムノクロマト結果を測定するための測定装置も含む場合がある。
本発明のイムノクロマト測定キットは、上記のイムノクロマトストリップに加えて、生体試料を希釈するための検体希釈液を少なくとも含み、更に必要に応じて、検量線を作成するための標準液や、希釈するための容器などを含む。また、イムノクロマト結果を測定するための測定装置も含む場合がある。
【実施例0034】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、各特性値の測定は、以下の方法に従った。
【0035】
（抗ｂＰＡＧ抗体の作製）
ｂＰＡＧ－１（ＷＵＨＡＮ ＨＵＡＭＥＩ ＢＩＯＴＥＣＨ Ｃｏ．，Ｌｔｄ、ＣＳＢ－ＥＰ６４４９１７ＢＯ）をウサギに免疫して得られた血清から、アフィニティクロマトグラフィーによりＩｇＧを精製して得られたものを、抗ｂＰＡＧ抗体として用いた。
ｂＰＡＧ－１（ＷＵＨＡＮ ＨＵＡＭＥＩ ＢＩＯＴＥＣＨ Ｃｏ．，Ｌｔｄ、ＣＳＢ－ＥＰ６４４９１７ＢＯ）をウサギに免疫して得られた血清から、アフィニティクロマトグラフィーによりＩｇＧを精製して得られたものを、抗ｂＰＡＧ抗体として用いた。
【0036】
（ランタノイド錯体標識抗ｂＰＡＧ抗体の作製）
蛍光標識試薬であるユウロピウム錯体（ＡＴＢＴＡ－Ｅｕ３＋、東京化成工業、Ａ２０８３）を用いた。即ち、タンパク質のアミノ基にジクロロトリアジニル基を導入し、ＤＴＢＴＡ－Ｅｕ３＋に変換することにより、抗ｂＰＡＧ抗体のアミノ基をユウロピウム錯体標識した。
蛍光標識試薬であるユウロピウム錯体（ＡＴＢＴＡ－Ｅｕ３＋、東京化成工業、Ａ２０８３）を用いた。即ち、タンパク質のアミノ基にジクロロトリアジニル基を導入し、ＤＴＢＴＡ－Ｅｕ３＋に変換することにより、抗ｂＰＡＧ抗体のアミノ基をユウロピウム錯体標識した。
【0037】
（検体希釈液の調製）
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に０．１質量％のＴｒｉｔｏｎＸ１００を添加し、更に、ポリエチレングリコール＃６０００（ナカライテスク、Ｃｏｄｅ：１０２００－２５）を２質量％、塩化ナトリウムを１質量％となるように添加し調製した。更に、前記調製したユウロピウム錯体標識抗体を、０．１μｇ／ｍＬの濃度になるよう添加した。
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に０．１質量％のＴｒｉｔｏｎＸ１００を添加し、更に、ポリエチレングリコール＃６０００（ナカライテスク、Ｃｏｄｅ：１０２００－２５）を２質量％、塩化ナトリウムを１質量％となるように添加し調製した。更に、前記調製したユウロピウム錯体標識抗体を、０．１μｇ／ｍＬの濃度になるよう添加した。
【0038】
（テストラインおよびコントロールラインの作製）
前記作製した抗ｂＰＡＧ抗体を１ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した後、これを２５ｍｍ×３００ｍｍのニトロセルロース製メンブレンフィルターに１．０μＬ／ｃｍの量で線状に塗布してテストラインを作製した。
次に、抗ウサギＩｇＧ抗体（ＭｙＢｉｏｓｏｕｒｃｅ．Ｉｎｃ．、ＭＢＳ５３９７８０）を１ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した後、上記ニトロセルロース製メンブレンフィルターに１．０μＬ／ｃｍの量で線状に塗布してコントロールラインを作製した。
テストラインおよびコントロールラインを作製後、５０℃で３０分間乾燥させ、２５ｍｍ×５ｍｍの大きさに切断し、膜担体とした。
前記作製した抗ｂＰＡＧ抗体を１ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した後、これを２５ｍｍ×３００ｍｍのニトロセルロース製メンブレンフィルターに１．０μＬ／ｃｍの量で線状に塗布してテストラインを作製した。
次に、抗ウサギＩｇＧ抗体（ＭｙＢｉｏｓｏｕｒｃｅ．Ｉｎｃ．、ＭＢＳ５３９７８０）を１ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した後、上記ニトロセルロース製メンブレンフィルターに１．０μＬ／ｃｍの量で線状に塗布してコントロールラインを作製した。
テストラインおよびコントロールラインを作製後、５０℃で３０分間乾燥させ、２５ｍｍ×５ｍｍの大きさに切断し、膜担体とした。
【0039】
（イムノクロマトストリップの作製）
粘着シート１の上に、前記得られた膜担体２、試料添加部材５、および吸収部材６を配置し、イムノクロマトストリップを作製した。
粘着シート１の上に、前記得られた膜担体２、試料添加部材５、および吸収部材６を配置し、イムノクロマトストリップを作製した。
【0040】
（ｂＰＡＧ標準液の調製）
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に、ｂＰＡＧ－１（ＷＵＨＡＮ ＨＵＡＭＥＩ ＢＩＯＴＥＣＨ Ｃｏ．，Ｌｔｄ、ＣＳＢ－ＥＰ６４４９１７ＢＯ）を溶解し、ｂＰＡＧ標準液を調製した。
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に、ｂＰＡＧ－１（ＷＵＨＡＮ ＨＵＡＭＥＩ ＢＩＯＴＥＣＨ Ｃｏ．，Ｌｔｄ、ＣＳＢ－ＥＰ６４４９１７ＢＯ）を溶解し、ｂＰＡＧ標準液を調製した。
【0041】
（測定キットを用いた試験）
前記標準液を、ＰＢＳで所定の濃度になるよう希釈した後、更に前記調製した検体希釈液を用いてそれぞれ５０倍希釈し、各濃度のｂＰＡＧ液を調製した。そして、イムノクロマトストリップの試料添加部材５の試料滴下部９にマイクロピペットで１００μＬ滴下し、1０分後、テストラインにおける蛍光強度をイムノクロマトリーダ（浜松ホトニクス、Ｃ１００６６－５０）にて測定した。その結果を表１に示した。また、測定の結果得られたグラフを図４に示した。
前記標準液を、ＰＢＳで所定の濃度になるよう希釈した後、更に前記調製した検体希釈液を用いてそれぞれ５０倍希釈し、各濃度のｂＰＡＧ液を調製した。そして、イムノクロマトストリップの試料添加部材５の試料滴下部９にマイクロピペットで１００μＬ滴下し、1０分後、テストラインにおける蛍光強度をイムノクロマトリーダ（浜松ホトニクス、Ｃ１００６６－５０）にて測定した。その結果を表１に示した。また、測定の結果得られたグラフを図４に示した。
【0042】
【表1】
【0043】
（ＥＬＩＳＡ法測定との比較実験）
１２頭の乳牛から得た乳汁中のｂＰＡＧ濃度を、ＥＬＩＳＡ法および本発明のイムノクロマト測定キットを用いて測定した。ＥＬＩＳＡ法の測定には、Ｂｏｖｉｎｅ ＰＡＧ１／Ｐｒｅｇｎａｎｃｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ．Ｉｎｃ．、ＭＢＳ２８９００５０）を使用した。イムノクロマト法では、各濃度の標準液を測定して得られた標準曲線（図４）より、各血清のｂＰＡＧ濃度を算出し測定結果を表２および図５に示した。イムノクロマト法の測定値とＥＬＩＳＡ法による測定値の相関係数は０．９６であり、良好な相関関係を示した。本発明の測定キットを用いることにより、精度よくｂＰＡＧを定量できることが確認された。
１２頭の乳牛から得た乳汁中のｂＰＡＧ濃度を、ＥＬＩＳＡ法および本発明のイムノクロマト測定キットを用いて測定した。ＥＬＩＳＡ法の測定には、Ｂｏｖｉｎｅ ＰＡＧ１／Ｐｒｅｇｎａｎｃｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ．Ｉｎｃ．、ＭＢＳ２８９００５０）を使用した。イムノクロマト法では、各濃度の標準液を測定して得られた標準曲線（図４）より、各血清のｂＰＡＧ濃度を算出し測定結果を表２および図５に示した。イムノクロマト法の測定値とＥＬＩＳＡ法による測定値の相関係数は０．９６であり、良好な相関関係を示した。本発明の測定キットを用いることにより、精度よくｂＰＡＧを定量できることが確認された。
【0044】
【表2】
【産業上の利用可能性】
【0045】
本発明により、酪農の生産現場において乳牛の乳汁中ｂＰＡＧ濃度を迅速、簡便、高感度に測定することができるため、乳牛の妊娠／非妊娠を判断する上で極めて有用である。
【符号の説明】
【0046】
１ 粘着シート
２ 膜担体
３ テストライン
４ コントロールライン
５ 試料添加部材
６ 吸収部材
７ イムノクロマトストリップ
８ ハウジングケース
９ 試料滴下部
１０ 判定部（窓）
２ 膜担体
３ テストライン
４ コントロールライン
５ 試料添加部材
６ 吸収部材
７ イムノクロマトストリップ
８ ハウジングケース
９ 試料滴下部
１０ 判定部（窓）
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
