特開2023-182524枝角種属由来を高速で鑑別する特徴的ポリペプチドライブラリー及びその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023182524
(43)【公開日】2023-12-26
(54)【発明の名称】枝角種属由来を高速で鑑別する特徴的ポリペプチドライブラリー及びその使用
(51)【国際特許分類】
C40B 40/10 20060101AFI20231219BHJP
G01N 30/72 20060101ALI20231219BHJP
G01N 30/88 20060101ALI20231219BHJP
G01N 30/06 20060101ALI20231219BHJP
G01N 30/26 20060101ALI20231219BHJP
G01N 30/34 20060101ALI20231219BHJP
G01N 27/62 20210101ALI20231219BHJP
C07K 7/04 20060101ALN20231219BHJP
C07K 14/47 20060101ALN20231219BHJP
【ＦＩ】
C40B40/10
G01N30/72 C ZNA
G01N30/88 J
G01N30/06 E
G01N30/26 A
G01N30/34 E
G01N27/62 V
C07K7/04
C07K14/47
【審査請求】有
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023046786
(22)【出願日】2023-03-23
(11)【特許番号】
(45)【特許公報発行日】2023-12-18
(31)【優先権主張番号】202210622026.4
(32)【優先日】2022-06-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(71)【出願人】
【識別番号】521331364
【氏名又は名称】山東省食品薬品検験研究院
【氏名又は名称原語表記】Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｔｒｏｌ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ． ２７４９， Ｘｉｎｌｕｏ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ． Ｚｏｎｅ， Ｊｉｎａｎ Ｃｉｔｙ， Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002262
【氏名又は名称】ＴＲＹ国際弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】林 永強
(72)【発明者】
【氏名】薛 菲
(72)【発明者】
【氏名】孫 沛霖
(72)【発明者】
【氏名】郭 東暁
(72)【発明者】
【氏名】馬 双成
(72)【発明者】
【氏名】程 顕隆
(72)【発明者】
【氏名】牛 艶
(72)【発明者】
【氏名】穆 向栄
(72)【発明者】
【氏名】于 鳳蕊
(72)【発明者】
【氏名】許 麗麗
【テーマコード（参考）】
2G041
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G041CA01
2G041DA05
2G041EA04
2G041FA12
2G041FA13
2G041GA03
2G041GA09
2G041HA01
2G041KA01
2G041LA07
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA14
4H045BA16
4H045BA17
4H045CA40
4H045EA50
(57)【要約】 （修正有）
【解決手段】本発明は枝角種属鑑別の分野に属し、具体的には、枝角種属由来を高速で鑑別する特徴的ポリペプチドライブラリー及びその使用に関する。該特徴的ポリペプチドライブラリーの具体的な組成は、ＥＦＴＰＥＬＱＡＤＹＱＫ、ＶＤＥＶＧＧＥＡＬＧＲ、ＦＦＥＨＦＧＤＬＳＴＡＤＡＶＭＨＮＡＫ、ＶＤＥＶＧＡＥＡＬＧＲ、ＭＬＴＳＥＥＫ、ＤＦＴＰＶＬＱＡＤＦＱＫ、ＦＦＥＨＦＧＤＬＳＳＡＤＡＶｍＧＮＰＫ、ＬＬＧＮＶＬＶＶＶＭＡＲ、ＦＦＥＨＦＧＤＬＳＴＰＤＡＶｍＧＮＰＫ、ＶＶＡＧＶＡｎＡＬＡＨＲ、ＦＦＥＨＦＧＤＬＳＴＡＤＡＶｍＧＮＰＫである。
【効果】本発明は、７種類の鹿科動物の枝角を鑑別、同定することができ、効率が高く、特異性に優れ、検出方法が簡単で効率的であり、枝角に関連する製品の品質制御のレベルを高め、臨床薬の安全性及び有効性を向上させ、しかも、検出限界が低く、検出用サンプルの使用量が少ない。
【選択図】図１
【効果】本発明は、７種類の鹿科動物の枝角を鑑別、同定することができ、効率が高く、特異性に優れ、検出方法が簡単で効率的であり、枝角に関連する製品の品質制御のレベルを高め、臨床薬の安全性及び有効性を向上させ、しかも、検出限界が低く、検出用サンプルの使用量が少ない。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
枝角種属由来を高速で鑑別する特徴的ポリペプチドライブラリーであって、
前記特徴的ポリペプチドライブラリーは以下：
に示されることを特徴とする特徴的ポリペプチドライブラリー。
前記特徴的ポリペプチドライブラリーは以下：
【請求項2】
前記特徴的ポリペプチド配列において、
ペプチドセグメント７は配列ＦＦＥＨＦＧＤＬＳＳＡＤＡＶｍＧＮＰＫであり、ｍはＭの酸化翻訳後修飾であり、
ペプチドセグメント９は配列ＦＦＥＨＦＧＤＬＳＴＰＤＡＶｍＧＮＰＫであり、ｍはＭの酸化翻訳後修飾であり、
ペプチドセグメント１０は配列ＶＶＡＧＶＡｎＡＬＡＨＲであり、ｎはＮの脱アミド翻訳後修飾であり、
ペプチドセグメント１１は配列ＦＦＥＨＦＧＤＬＳＴＡＤＡＶｍＧＮＰＫであり、ｍはＭの酸化翻訳後修飾であることを特徴とする請求項１に記載の特徴的ポリペプチドライブラリー。
ペプチドセグメント７は配列ＦＦＥＨＦＧＤＬＳＳＡＤＡＶｍＧＮＰＫであり、ｍはＭの酸化翻訳後修飾であり、
ペプチドセグメント９は配列ＦＦＥＨＦＧＤＬＳＴＰＤＡＶｍＧＮＰＫであり、ｍはＭの酸化翻訳後修飾であり、
ペプチドセグメント１０は配列ＶＶＡＧＶＡｎＡＬＡＨＲであり、ｎはＮの脱アミド翻訳後修飾であり、
ペプチドセグメント１１は配列ＦＦＥＨＦＧＤＬＳＴＡＤＡＶｍＧＮＰＫであり、ｍはＭの酸化翻訳後修飾であることを特徴とする請求項１に記載の特徴的ポリペプチドライブラリー。
【請求項3】
請求項１に記載の特徴的ポリペプチドライブラリーの、枝角種属由来の高速鑑別における使用であって、
判定原則として、
（１）サンプルにおいて、ヘラジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント１又はペプチドセグメント２又はペプチドセグメント３を検出していると、サンプルはヘラジカ由来であり、
（２）サンプルにおいて、トナカイ対照生薬に対応するペプチドセグメント４又はペプチドセグメント５又はペプチドセグメント６を検出していると、サンプルはトナカイ由来であり、
（３）サンプルにおいて、オジロジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント７を検出していると、サンプルはオジロジカ由来であり、
（４）サンプルにおいて、クチジロジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント８を検出していると、サンプルはクチジロジカ由来であり、
（５）サンプルにおいて、ダマジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント９を検出しているが、ペプチドセグメント８とペプチドセグメント１１を検出していないと、サンプルはダマジカ由来であり、
（６）サンプルにおいて、ニホンジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント１０を検出しているとともに、ペプチドセグメント１１を検出していると、サンプルはニホンジカ由来であり、
（７）サンプルにおいて、アカシカ対照生薬に対応するペプチドセグメント１１を検出しているが、ペプチドセグメント１０を検出していないと、サンプルはアカシカ由来であるとすることを特徴とする使用。
判定原則として、
（１）サンプルにおいて、ヘラジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント１又はペプチドセグメント２又はペプチドセグメント３を検出していると、サンプルはヘラジカ由来であり、
（２）サンプルにおいて、トナカイ対照生薬に対応するペプチドセグメント４又はペプチドセグメント５又はペプチドセグメント６を検出していると、サンプルはトナカイ由来であり、
（３）サンプルにおいて、オジロジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント７を検出していると、サンプルはオジロジカ由来であり、
（４）サンプルにおいて、クチジロジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント８を検出していると、サンプルはクチジロジカ由来であり、
（５）サンプルにおいて、ダマジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント９を検出しているが、ペプチドセグメント８とペプチドセグメント１１を検出していないと、サンプルはダマジカ由来であり、
（６）サンプルにおいて、ニホンジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント１０を検出しているとともに、ペプチドセグメント１１を検出していると、サンプルはニホンジカ由来であり、
（７）サンプルにおいて、アカシカ対照生薬に対応するペプチドセグメント１１を検出しているが、ペプチドセグメント１０を検出していないと、サンプルはアカシカ由来であるとすることを特徴とする使用。
【請求項4】
具体的には、
サンプルを製造する際には、サンプルを粉砕して、篩にかけ、粉末５０ｍｇを秤量して、変性緩衝液１０ｍＬを加え、よく混ぜて、８０℃で一晩処理し、取り出して室温まで放冷し、１２０００ｒで１０分遠心分離し、サンプル抽出液を５００μＬ取り、分子量３ｋＤａの限外濾過遠心分離管を用いてサンプルに脱塩と酵素分解を行うステップ（１）と、
高速液体クロマトグラフィー－トリプル四重極質量分析計により同定を行うステップ（２）と、を含むことを特徴とする請求項３に記載の使用。
サンプルを製造する際には、サンプルを粉砕して、篩にかけ、粉末５０ｍｇを秤量して、変性緩衝液１０ｍＬを加え、よく混ぜて、８０℃で一晩処理し、取り出して室温まで放冷し、１２０００ｒで１０分遠心分離し、サンプル抽出液を５００μＬ取り、分子量３ｋＤａの限外濾過遠心分離管を用いてサンプルに脱塩と酵素分解を行うステップ（１）と、
高速液体クロマトグラフィー－トリプル四重極質量分析計により同定を行うステップ（２）と、を含むことを特徴とする請求項３に記載の使用。
【請求項5】
前記変性緩衝液は６Ｍグアニジン塩酸塩、１Ｍ Ｔｒｉｓ、２．５ｍＭエチレンジアミン四酢酸に濃塩酸を加えてｐＨを８．０に調整したものであることを特徴とする請求項４に記載の使用。
【請求項6】
前記脱塩と酵素分解は、具体的には、サンプル抽出液を限外濾過遠心分離管の上層に加え、１２０００ｒで１０分遠心分離し、下層の溶液を捨てて、水５００μＬを加え、１２０００ｒで１０分遠心分離し、下層の溶液を捨てて、水５００μＬを加え、１２０００ｒで１０分遠心分離し、下層の溶液を捨てて、１％ ＮＨ４ＨＣＯ３溶液５００μＬと１０ｍｇ／ｍＬのウシトリプシン溶液１０μＬを加え、３７℃で１５分酵素分解し、取り出して室温まで放冷し、遠心分離して上澄み液を得ることであることを特徴とする請求項４又は５に記載の使用。
【請求項7】
液相条件として、クロマトグラフィーカラムはＡｇｉｌｅｎｔ ＳＢ Ｃ１８ （２．１×１００ｍｍ、１．８μｍ）、カラム温度は４３℃、流速は０．３ｍＬ／ｍｉｎ、移動相Ａは０．１％ギ酸溶液、移動相Ｂは０．１％ギ酸アセトニトリル溶液であり、勾配溶出が行われ、注入量は５μＬであることを特徴とする請求項４に記載の使用。
【請求項8】
前記勾配溶出条件は、０～９ｍｉｎ、３％Ｂ→７．５％Ｂ；９～１３ｍｉｎ、７．５％Ｂ→２５％Ｂ；１３～１４ｍｉｎ、２５％Ｂ→９０％Ｂ；１４～１７ｍｉｎ、９０％Ｂ；１７～１７．５ｍｉｎ、９０％Ｂ→９７％Ｂ、１７．５～２１ｍｉｎ、９７％Ｂであることを特徴とする請求項７に記載の使用。
【請求項9】
前記質量分析条件としては、質量分析検出器を用いて、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を行い、プラスイオンモードで多重反応モニタリングを行い、
シースガス流速は４６Ｌ／ｈｒ、補助ガス流速は８５０Ｌ／ｈｒ、スプレー電圧は３．５ＫＶ、イオン源温度は１５０℃、補助ガス温度は４００℃、コーン電圧は３０Ｖ、衝突電圧は３５Ｖ、溶媒遅延（ｓｏｌｖｅｎｔ ｄｅｌａｙ）は０～４ｍｉｎ及び１６～２０ｍｉｎとすることを特徴とする請求項７又は８に記載の使用。
シースガス流速は４６Ｌ／ｈｒ、補助ガス流速は８５０Ｌ／ｈｒ、スプレー電圧は３．５ＫＶ、イオン源温度は１５０℃、補助ガス温度は４００℃、コーン電圧は３０Ｖ、衝突電圧は３５Ｖ、溶媒遅延（ｓｏｌｖｅｎｔ ｄｅｌａｙ）は０～４ｍｉｎ及び１６～２０ｍｉｎとすることを特徴とする請求項７又は８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は枝角種属鑑別の分野に属し、具体的には、枝角種属由来を高速で鑑別する特徴的ポリペプチドライブラリー及びその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
鹿科動物は宝だらけである。昔から鹿製品はずっと皇室と貴族が長寿を追及するためのサプリメントとして使用されており、今も、すでに一般庶民の疾患を防いで体を丈夫にして、滋養美容、延命や健康維持に好適な製品になっている。現代の鹿飼い業の急速な発展に伴い、鹿製品はますます多く開発されてきて、医療や健康維持における鹿製品の不思議な効果が豊かになり、人々に多くの有益な効果をもたらす。鹿製品は人間に極めて豊富な製品を提供し、その中で最も貴重な製品の１つは極めて高い薬用価値と保健効果を持っている枝角である。鹿科動物の種類は非常に多いため、市販されている枝角の由来は顕微鏡鑑別及び薄層クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィーなどの伝統的な鑑別手段によって区別することができない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
従来技術に存在する問題に対して、本発明は枝角種属由来を高速で鑑別する特徴的ポリペプチドライブラリーを提供する。
【0004】
本発明はまた、上記特徴的ポリペプチドライブラリーの枝角種属由来の鑑別における使用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明が上記の目的を達成させるために使用される技術的解決手段は以下のとおりである。
【0006】
本発明は、枝角種属由来を高速で鑑別する特徴的ポリペプチドライブラリーを提供し、前記特徴的ポリペプチドライブラリーはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１～１１に示され、具体的な配列を以下に示す。
上記の特徴的ポリペプチドにおいて、
ペプチドセグメント７は配列ＦＦＥＨＦＧＤＬＳＳＡＤＡＶｍＧＮＰＫであり、ｍはＭの酸化翻訳後修飾であり、
ペプチドセグメント９は配列ＦＦＥＨＦＧＤＬＳＴＰＤＡＶｍＧＮＰＫであり、ｍはＭの酸化翻訳後修飾であり、
ペプチドセグメント１０は配列ＶＶＡＧＶＡｎＡＬＡＨＲであり、ｎはＮの脱アミド翻訳後修飾であり、
ペプチドセグメント１１は配列ＦＦＥＨＦＧＤＬＳＴＡＤＡＶｍＧＮＰＫであり、ｍはＭの酸化翻訳後修飾である。
ペプチドセグメント７は配列ＦＦＥＨＦＧＤＬＳＳＡＤＡＶｍＧＮＰＫであり、ｍはＭの酸化翻訳後修飾であり、
ペプチドセグメント９は配列ＦＦＥＨＦＧＤＬＳＴＰＤＡＶｍＧＮＰＫであり、ｍはＭの酸化翻訳後修飾であり、
ペプチドセグメント１０は配列ＶＶＡＧＶＡｎＡＬＡＨＲであり、ｎはＮの脱アミド翻訳後修飾であり、
ペプチドセグメント１１は配列ＦＦＥＨＦＧＤＬＳＴＡＤＡＶｍＧＮＰＫであり、ｍはＭの酸化翻訳後修飾である。
【0007】
本発明はまた、上記の特徴的ポリペプチドライブラリーの枝角種属由来の高速鑑別における使用であって、判定原則として、
（１）サンプルにおいて、ヘラジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント１又はペプチドセグメント２又はペプチドセグメント３を検出していると、サンプルはヘラジカ由来であり、
（２）サンプルにおいて、トナカイ対照生薬に対応するペプチドセグメント４又はペプチドセグメント５又はペプチドセグメント６を検出していると、サンプルはトナカイ由来であり、
（３）サンプルにおいて、オジロジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント７を検出していると、サンプルはオジロジカ由来であり、
（４）サンプルにおいて、クチジロジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント８を検出していると、サンプルはクチジロジカ由来であり、
（５）サンプルにおいて、ダマジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント９を検出しているが、ペプチドセグメント８とペプチドセグメント１１を検出していないと、サンプルはダマジカ由来であり、
（６）サンプルにおいて、ニホンジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント１０を検出しているとともに、ペプチドセグメント１１を検出していると、サンプルはニホンジカ由来であり、
（７）サンプルにおいて、アカシカ対照生薬に対応するペプチドセグメント１１を検出しているが、ペプチドセグメント１０を検出していないと、サンプルはアカシカ由来であるとする使用を提供する。
（１）サンプルにおいて、ヘラジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント１又はペプチドセグメント２又はペプチドセグメント３を検出していると、サンプルはヘラジカ由来であり、
（２）サンプルにおいて、トナカイ対照生薬に対応するペプチドセグメント４又はペプチドセグメント５又はペプチドセグメント６を検出していると、サンプルはトナカイ由来であり、
（３）サンプルにおいて、オジロジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント７を検出していると、サンプルはオジロジカ由来であり、
（４）サンプルにおいて、クチジロジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント８を検出していると、サンプルはクチジロジカ由来であり、
（５）サンプルにおいて、ダマジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント９を検出しているが、ペプチドセグメント８とペプチドセグメント１１を検出していないと、サンプルはダマジカ由来であり、
（６）サンプルにおいて、ニホンジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント１０を検出しているとともに、ペプチドセグメント１１を検出していると、サンプルはニホンジカ由来であり、
（７）サンプルにおいて、アカシカ対照生薬に対応するペプチドセグメント１１を検出しているが、ペプチドセグメント１０を検出していないと、サンプルはアカシカ由来であるとする使用を提供する。
【0008】
さらに、具体的には、
サンプルを製造する際には、サンプルを粉砕して、篩にかけ、粉末５０ｍｇを秤量して、変性緩衝液１０ｍＬを加え、よく混ぜて、８０℃で一晩処理し、取り出して室温まで放冷し、１２０００ｒで１０分遠心分離し、サンプル抽出液を５００μＬ取り、分子量３ｋＤａの限外濾過遠心分離管を用いてサンプルに脱塩と酵素分解を行うステップ（１）と、
高速液体クロマトグラフィー－トリプル四重極質量分析計により同定を行うステップ（２）と、を含む。
サンプルを製造する際には、サンプルを粉砕して、篩にかけ、粉末５０ｍｇを秤量して、変性緩衝液１０ｍＬを加え、よく混ぜて、８０℃で一晩処理し、取り出して室温まで放冷し、１２０００ｒで１０分遠心分離し、サンプル抽出液を５００μＬ取り、分子量３ｋＤａの限外濾過遠心分離管を用いてサンプルに脱塩と酵素分解を行うステップ（１）と、
高速液体クロマトグラフィー－トリプル四重極質量分析計により同定を行うステップ（２）と、を含む。
【0009】
本発明に使用される変性緩衝液は６Ｍグアニジン塩酸塩、１Ｍ Ｔｒｉｓ、２．５ｍＭエチレンジアミン四酢酸に濃塩酸を加えてｐＨを８．０に調整したものである。
【0010】
さらに、前記脱塩と酵素分解は、具体的には、サンプル抽出液を限外濾過遠心分離管の上層に加え、１２０００ｒで１０分遠心分離し、下層の溶液を捨てて、水５００μＬを加え、１２０００ｒで１０分遠心分離し、下層の溶液を捨てて、水５００μＬを加え、１２０００ｒで１０分遠心分離し、下層の溶液を捨てて、１％ ＮＨ４ＨＣＯ３溶液５００μＬと１０ｍｇ／ｍＬのウシトリプシン溶液１０μＬを加え、３７℃で１５分酵素分解し、取り出して室温まで放冷し、遠心分離して上澄み液を得ることである。
【0011】
さらに、前記液相条件として、クロマトグラフィーカラムはＡｇｉｌｅｎｔ ＳＢ Ｃ１８ （２．１×１００ｍｍ、１．８μｍ）、カラム温度は４３℃、流速は０．３ｍＬ／ｍｉｎ、移動相Ａは０．１％ギ酸溶液、移動相Ｂは０．１％ギ酸アセトニトリル溶液であり、勾配溶出が行われ、注入量は５μＬである。
【0012】
上記の勾配溶出条件は、０～９ｍｉｎ、３％Ｂ→７．５％Ｂ；９～１３ｍｉｎ、７．５％Ｂ→２５％Ｂ；１３～１４ｍｉｎ、２５％Ｂ→９０％Ｂ；１４～１７ｍｉｎ、９０％Ｂ；１７～１７．５ｍｉｎ、９０％Ｂ→９７％Ｂ、１７．５～２１ｍｉｎ、９７％Ｂである。
【0013】
さらに、前記質量分析条件としては、質量分析検出器を用いて、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を行い、プラスイオンモードで多重反応モニタリングを行い、
シースガス流速は４６Ｌ／ｈｒ、補助ガス流速は８５０Ｌ／ｈｒ；スプレー電圧は３．５ＫＶ；イオン源温度は１５０℃、補助ガス温度は４００℃、コーン電圧は３０Ｖ、衝突電圧は３５Ｖ、溶媒遅延（ｓｏｌｖｅｎｔ ｄｅｌａｙ）は０～４ｍｉｎ及び１６～２０ｍｉｎとする。
シースガス流速は４６Ｌ／ｈｒ、補助ガス流速は８５０Ｌ／ｈｒ；スプレー電圧は３．５ＫＶ；イオン源温度は１５０℃、補助ガス温度は４００℃、コーン電圧は３０Ｖ、衝突電圧は３５Ｖ、溶媒遅延（ｓｏｌｖｅｎｔ ｄｅｌａｙ）は０～４ｍｉｎ及び１６～２０ｍｉｎとする。
【0014】
本発明は、７種類の鹿科動物の枝角を鑑別できる枝角の特徴的ポリペプチドライブラリーを提供する。本発明の特徴的ペプチドセグメント由来は鹿科動物の血液に広く存在しているβグロビンであり、このため、微量の血液を含有するサンプルでは適用できる。
【発明の効果】
【0015】
本発明の有益な効果は以下のとおりである。
（１）本発明では、高速液体クロマトグラフィー－トリプル四重極質量分析方法を用いることで、７種類の鹿科動物を鑑別、同定することができ、効率が高く、特異性に優れる。
（１）本発明では、高速液体クロマトグラフィー－トリプル四重極質量分析方法を用いることで、７種類の鹿科動物を鑑別、同定することができ、効率が高く、特異性に優れる。
【0016】
（２）本発明では、大量の実験を通じて研究して、区分して同定することができる特徴的ポリペプチドが得られ、この特徴的ポリペプチドは特異性が高く、検出方法が簡単で効率的であり、鹿科動物に関連する製品の品質制御のレベルを高め、臨床薬の安全性及び有効性を向上させ、しかも、検出限界が低く、検出用サンプルの使用量が少ない。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】実施例１において特徴的ポリペプチドライブラリーを利用して検出するときの判定原則についてのフローチャートである。
【図2】ペプチドセグメント１、２、３の正確な配列及びｂ、ｙイオンの帰属である。
【図3】ペプチドセグメント４、５、６の正確な配列及びｂ、ｙイオンの帰属である。
【図4】ペプチドセグメント７の正確な配列及びｂ、ｙイオンの帰属である。
【図5】ペプチドセグメント８、９の正確な配列及びｂ、ｙイオンの帰属である。
【図6】ペプチドセグメント１０、１１の正確な配列及びｂ、ｙイオンの帰属である。
【図7】実施例１における各特徴的ポリペプチドセグメントのピークタイムであり、（Ａ）ヘラジカペプチドセグメント１、２、３ＭＲＭピークタイム；（Ｂ）トナカイペプチドセグメント４、５、６ＭＲＭピークタイム；（Ｃ）オジロジカペプチドセグメント７ＭＲＭピークタイム；（Ｄ）クチジロジカペプチドセグメント８、９ＭＲＭピークタイム；（Ｅ）ニホンジカペプチドセグメント１０、１１ＭＲＭピークタイムである。
【発明を実施するための形態】
【0018】
以下、特定実施例によって本発明の技術的解決手段をさらに解釈して説明する。
【0019】
実施例１ 特徴的ポリペプチドのスクリーニング
サンプル上澄み液をナノリットル液体クロマトグラフィー－高分解能質量分析にかけて、質量分析データをＰＥＡＫＳ ８．５ソフトウェアに導入し、「Ａｄｕｌｔ－ｂｅｔａ ｇｌｏｂｉｎ ｏｆ ｄｅｅｒ」タンパク質データベースを用いて、ペプチドセグメントのすべてについてｄｅ ｎｏｖｏシークエンシング及びペプチドセグメントマッチングを行った。合計３３１８５本のペプチドセグメントまでｄｅ ｎｏｖｏシークエンシングを行い、データベースにおいてマッチングさせたところ、合計３３３本のペプチドセグメントを同定した。高速液体クロマトグラフィー－トリプル四重極質量分析計により同定した３３３本のペプチドセグメントの、アカシカ、ニホンジカ、ヘラジカ、トナカイ、クチジロジカ、オジロジカ及びダマジカに対する特異性を検証して調べ、応答が最も強い親イオンと娘イオンを定性イオンと定量イオンとした。
サンプル上澄み液をナノリットル液体クロマトグラフィー－高分解能質量分析にかけて、質量分析データをＰＥＡＫＳ ８．５ソフトウェアに導入し、「Ａｄｕｌｔ－ｂｅｔａ ｇｌｏｂｉｎ ｏｆ ｄｅｅｒ」タンパク質データベースを用いて、ペプチドセグメントのすべてについてｄｅ ｎｏｖｏシークエンシング及びペプチドセグメントマッチングを行った。合計３３１８５本のペプチドセグメントまでｄｅ ｎｏｖｏシークエンシングを行い、データベースにおいてマッチングさせたところ、合計３３３本のペプチドセグメントを同定した。高速液体クロマトグラフィー－トリプル四重極質量分析計により同定した３３３本のペプチドセグメントの、アカシカ、ニホンジカ、ヘラジカ、トナカイ、クチジロジカ、オジロジカ及びダマジカに対する特異性を検証して調べ、応答が最も強い親イオンと娘イオンを定性イオンと定量イオンとした。
【0020】
実施例２
（１）サンプルを製造する際に、アカシカ枝角、ニホンジカ枝角、ヘラジカ枝角、トナカイ枝角、ダマジカ枝角、オジロジカ枝角、クチジロジカ枝角サンプルを粉砕して、篩にかけ、粉末５０ｍｇを秤量して、変性緩衝液１０ｍＬを加え（６Ｍグアニジン塩酸塩、１Ｍ Ｔｒｉｓ、２．５ｍＭエチレンジアミン四酢酸に濃塩酸を加えてｐＨを８．０に調整したもの）、よく混ぜて、８０℃で一晩処理し、取り出して室温まで放冷し、１２０００ｒで１０分遠心分離し、５００μＬを取り、分子量３ｋの限外濾過遠心分離管を用いてサンプルに脱塩と酵素分解を行った（１２０００ｒで１０分遠心分離し、下層の溶液を捨てて、水５００μＬを加え、１２０００ｒで１０分遠心分離し、下層の溶液を捨てて、水５００μＬを加え、１２０００ｒで１０分遠心分離し、下層の溶液を捨てて、１％ ＮＨ４ＨＣＯ３溶液５００μＬとウシトリプシン溶液１０μＬを加え、３７℃で１５分酵素分解し、取り出して室温まで放冷し、遠心分離し、上澄み液を得る）。
（１）対照サンプルの製造方法はサンプルの製造方法と同様であった。
（３）液相条件：クロマトグラフィーカラムはＡｇｉｌｅｎｔ ＳＢ Ｃ１８ （２．１×１００ｍｍ、１．８μｍ）、カラム温度は４３℃、流速は０．３ｍＬ／ｍｉｎ、移動相Ａは０．１％ギ酸溶液、移動相Ｂは０．１％ギ酸アセトニトリル溶液とし、勾配溶出が行われ（０～９ｍｉｎ、３％Ｂ→７．５％Ｂ；９～１３ｍｉｎ、７．５％Ｂ→２５％Ｂ；１３～１４ｍｉｎ、２５％Ｂ→９０％Ｂ；１４～１７ｍｉｎ、９０％Ｂ；１７～１７．５ｍｉｎ、９０％Ｂ →９７％Ｂ、１７．５～２１ｍｉｎ、９７％Ｂ）、注入量は５μＬであった。質量分析条件：質量分析検出器を用いて、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を行い、プラスイオンモードで多重反応モニタリングを行い、シースガス流速は４６Ｌ／ｈｒ、補助ガス流速は８５０ Ｌ／ｈｒ、スプレー電圧は３．５ＫＶ、イオン源温度は１５０℃、補助ガス温度は４００℃。コーン電圧は３０Ｖ、衝突電圧は３５Ｖ、溶媒遅延（ｓｏｌｖｅｎｔ ｄｅｌａｙ）は０～４ｍｉｎ及び１６～２０ｍｉｎとした。
（１）サンプルを製造する際に、アカシカ枝角、ニホンジカ枝角、ヘラジカ枝角、トナカイ枝角、ダマジカ枝角、オジロジカ枝角、クチジロジカ枝角サンプルを粉砕して、篩にかけ、粉末５０ｍｇを秤量して、変性緩衝液１０ｍＬを加え（６Ｍグアニジン塩酸塩、１Ｍ Ｔｒｉｓ、２．５ｍＭエチレンジアミン四酢酸に濃塩酸を加えてｐＨを８．０に調整したもの）、よく混ぜて、８０℃で一晩処理し、取り出して室温まで放冷し、１２０００ｒで１０分遠心分離し、５００μＬを取り、分子量３ｋの限外濾過遠心分離管を用いてサンプルに脱塩と酵素分解を行った（１２０００ｒで１０分遠心分離し、下層の溶液を捨てて、水５００μＬを加え、１２０００ｒで１０分遠心分離し、下層の溶液を捨てて、水５００μＬを加え、１２０００ｒで１０分遠心分離し、下層の溶液を捨てて、１％ ＮＨ４ＨＣＯ３溶液５００μＬとウシトリプシン溶液１０μＬを加え、３７℃で１５分酵素分解し、取り出して室温まで放冷し、遠心分離し、上澄み液を得る）。
（１）対照サンプルの製造方法はサンプルの製造方法と同様であった。
（３）液相条件：クロマトグラフィーカラムはＡｇｉｌｅｎｔ ＳＢ Ｃ１８ （２．１×１００ｍｍ、１．８μｍ）、カラム温度は４３℃、流速は０．３ｍＬ／ｍｉｎ、移動相Ａは０．１％ギ酸溶液、移動相Ｂは０．１％ギ酸アセトニトリル溶液とし、勾配溶出が行われ（０～９ｍｉｎ、３％Ｂ→７．５％Ｂ；９～１３ｍｉｎ、７．５％Ｂ→２５％Ｂ；１３～１４ｍｉｎ、２５％Ｂ→９０％Ｂ；１４～１７ｍｉｎ、９０％Ｂ；１７～１７．５ｍｉｎ、９０％Ｂ →９７％Ｂ、１７．５～２１ｍｉｎ、９７％Ｂ）、注入量は５μＬであった。質量分析条件：質量分析検出器を用いて、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を行い、プラスイオンモードで多重反応モニタリングを行い、シースガス流速は４６Ｌ／ｈｒ、補助ガス流速は８５０ Ｌ／ｈｒ、スプレー電圧は３．５ＫＶ、イオン源温度は１５０℃、補助ガス温度は４００℃。コーン電圧は３０Ｖ、衝突電圧は３５Ｖ、溶媒遅延（ｓｏｌｖｅｎｔ ｄｅｌａｙ）は０～４ｍｉｎ及び１６～２０ｍｉｎとした。
【0021】
使用される特徴的ポリペプチドライブラリーを表１に示す。
【0022】
【0023】
上記の特徴的ポリペプチドライブラリーを用いて検出を行う場合、判定原則は以下のとおりである。
【0024】
１．サンプルにおいて、ヘラジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント１又はペプチドセグメント２又はペプチドセグメント３を検出していると、サンプルはヘラジカ由来であるとする。
【0025】
２．サンプルにおいて、トナカイ対照生薬に対応するペプチドセグメント４又はペプチドセグメント５又はペプチドセグメント６を検出していると、サンプルはトナカイ由来であるとする。
【0026】
３．サンプルにおいて、オジロジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント７を検出していると、サンプルはオジロジカ由来であるとする。
【0027】
４．サンプルにおいて、クチジロジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント８を検出していると、サンプルはクチジロジカ由来であるとする。
【0028】
５．サンプルにおいて、ダマジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント９を検出しているが、ペプチドセグメント８とペプチドセグメント１１を検出していないと、サンプルはダマジカ由来であるとする。
【0029】
６．サンプルにおいて、ニホンジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント１０を検出しているとともに、ペプチドセグメント１１を検出していると、サンプルはニホンジカ由来であるとする。
【0030】
７．サンプルにおいて、アカシカ対照生薬に対応するペプチドセグメント１１を検出しているが、ペプチドセグメント１０を検出していないと、サンプルはアカシカ由来であるとする。
【0031】
【0032】
効果の検証
特異性の検証：アカシカ枝角、ニホンジカ枝角、ヘラジカ枝角、トナカイ枝角、ダマジカ枝角、オジロジカ枝角、クチジロジカ枝角サンプルをそれぞれ実験したところ、各鹿科動物の枝角に特異的なペプチドセグメントはいずれも検出可能であり、しかも、他の鹿科動物においては検出されておらず、このため、該方法は特異性に優れたと確認できた。
特異性の検証：アカシカ枝角、ニホンジカ枝角、ヘラジカ枝角、トナカイ枝角、ダマジカ枝角、オジロジカ枝角、クチジロジカ枝角サンプルをそれぞれ実験したところ、各鹿科動物の枝角に特異的なペプチドセグメントはいずれも検出可能であり、しかも、他の鹿科動物においては検出されておらず、このため、該方法は特異性に優れたと確認できた。
【0033】
耐久性の実験：Ａｇｉｌｅｎｔ ＺＯＲＢＡＸ ＳＢ ＲＲＨＤ、Ａｇｉｌｅｎｔ ＺＯＲＢＡＸ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＲＲＨＤ、Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＨＳＳクロマトグラフィーカラムをそれぞれ用いて、アカシカ枝角、ニホンジカ枝角、ヘラジカ枝角、トナカイ枝角、ダマジカ枝角、オジロジカ枝角、クチジロジカ枝角サンプルを実験したところ、各鹿科動物の枝角に特異的なペプチドセグメントはいずれも検出可能であり、このため、該方法は耐久性に優れたと確認できた。
【0034】
再現性実験：アカシカ枝角、ニホンジカ枝角、ヘラジカ枝角、トナカイ枝角、ダマジカ枝角、オジロジカ枝角、クチジロジカ枝角サンプルを３つにして平行実験を行ったところ、各鹿科動物の枝角に特異的なペプチドセグメントはいずれも検出可能であり、このため、該方法は再現性に優れたと確認できた。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-10-10
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
枝角種属由来を高速で鑑別する特徴的ポリペプチドライブラリーであって、
前記特徴的ポリペプチドライブラリーは以下：
に示され、
前記特徴的ポリペプチド配列において、
ペプチドセグメント７は配列ＦＦＥＨＦＧＤＬＳＳＡＤＡＶｍＧＮＰＫであり、ｍはＭの酸化翻訳後修飾であり、
ペプチドセグメント９は配列ＦＦＥＨＦＧＤＬＳＴＰＤＡＶｍＧＮＰＫであり、ｍはＭの酸化翻訳後修飾であり、
ペプチドセグメント１０は配列ＶＶＡＧＶＡｎＡＬＡＨＲであり、ｎはＮの脱アミド翻訳後修飾であり、
ペプチドセグメント１１は配列ＦＦＥＨＦＧＤＬＳＴＡＤＡＶｍＧＮＰＫであり、ｍはＭの酸化翻訳後修飾である
各配列のポリペプチドからなることを特徴とする特徴的ポリペプチドライブラリー。
前記特徴的ポリペプチドライブラリーは以下：
前記特徴的ポリペプチド配列において、
ペプチドセグメント７は配列ＦＦＥＨＦＧＤＬＳＳＡＤＡＶｍＧＮＰＫであり、ｍはＭの酸化翻訳後修飾であり、
ペプチドセグメント９は配列ＦＦＥＨＦＧＤＬＳＴＰＤＡＶｍＧＮＰＫであり、ｍはＭの酸化翻訳後修飾であり、
ペプチドセグメント１０は配列ＶＶＡＧＶＡｎＡＬＡＨＲであり、ｎはＮの脱アミド翻訳後修飾であり、
ペプチドセグメント１１は配列ＦＦＥＨＦＧＤＬＳＴＡＤＡＶｍＧＮＰＫであり、ｍはＭの酸化翻訳後修飾である
各配列のポリペプチドからなることを特徴とする特徴的ポリペプチドライブラリー。
【請求項2】
請求項１に記載の特徴的ポリペプチドライブラリーの、枝角種属由来の高速鑑別における使用であって、
判定原則として、
（１）サンプルにおいて、ヘラジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント１又はペプチドセグメント２又はペプチドセグメント３を検出していると、サンプルはヘラジカ由来であり、
（２）サンプルにおいて、トナカイ対照生薬に対応するペプチドセグメント４又はペプチドセグメント５又はペプチドセグメント６を検出していると、サンプルはトナカイ由来であり、
（３）サンプルにおいて、オジロジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント７を検出していると、サンプルはオジロジカ由来であり、
（４）サンプルにおいて、クチジロジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント８を検出していると、サンプルはクチジロジカ由来であり、
（５）サンプルにおいて、ダマジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント９を検出しているが、ペプチドセグメント８とペプチドセグメント１１を検出していないと、サンプルはダマジカ由来であり、
（６）サンプルにおいて、ニホンジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント１０を検出しているとともに、ペプチドセグメント１１を検出していると、サンプルはニホンジカ由来であり、
（７）サンプルにおいて、アカシカ対照生薬に対応するペプチドセグメント１１を検出しているが、ペプチドセグメント１０を検出していないと、サンプルはアカシカ由来であるとすることを特徴とする使用。
判定原則として、
（１）サンプルにおいて、ヘラジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント１又はペプチドセグメント２又はペプチドセグメント３を検出していると、サンプルはヘラジカ由来であり、
（２）サンプルにおいて、トナカイ対照生薬に対応するペプチドセグメント４又はペプチドセグメント５又はペプチドセグメント６を検出していると、サンプルはトナカイ由来であり、
（３）サンプルにおいて、オジロジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント７を検出していると、サンプルはオジロジカ由来であり、
（４）サンプルにおいて、クチジロジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント８を検出していると、サンプルはクチジロジカ由来であり、
（５）サンプルにおいて、ダマジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント９を検出しているが、ペプチドセグメント８とペプチドセグメント１１を検出していないと、サンプルはダマジカ由来であり、
（６）サンプルにおいて、ニホンジカ対照生薬に対応するペプチドセグメント１０を検出しているとともに、ペプチドセグメント１１を検出していると、サンプルはニホンジカ由来であり、
（７）サンプルにおいて、アカシカ対照生薬に対応するペプチドセグメント１１を検出しているが、ペプチドセグメント１０を検出していないと、サンプルはアカシカ由来であるとすることを特徴とする使用。
【請求項3】
具体的には、
サンプルを製造する際には、サンプルを粉砕して、篩にかけ、粉末５０ｍｇを秤量して、変性緩衝液１０ｍＬを加え、よく混ぜて、８０℃で一晩処理し、取り出して室温まで放冷し、１２０００ｒで１０分遠心分離し、サンプル抽出液を５００μＬ取り、分子量３ｋＤａの限外濾過遠心分離管を用いてサンプルに脱塩と酵素分解を行うステップ（１）と、
高速液体クロマトグラフィー－トリプル四重極質量分析計により同定を行うステップ（２）と、を含むことを特徴とする請求項２に記載の使用。
サンプルを製造する際には、サンプルを粉砕して、篩にかけ、粉末５０ｍｇを秤量して、変性緩衝液１０ｍＬを加え、よく混ぜて、８０℃で一晩処理し、取り出して室温まで放冷し、１２０００ｒで１０分遠心分離し、サンプル抽出液を５００μＬ取り、分子量３ｋＤａの限外濾過遠心分離管を用いてサンプルに脱塩と酵素分解を行うステップ（１）と、
高速液体クロマトグラフィー－トリプル四重極質量分析計により同定を行うステップ（２）と、を含むことを特徴とする請求項２に記載の使用。
【請求項4】
前記変性緩衝液は６Ｍグアニジン塩酸塩、１Ｍ Ｔｒｉｓ、２．５ｍＭエチレンジアミン四酢酸に濃塩酸を加えてｐＨを８．０に調整したものであることを特徴とする請求項３に記載の使用。
【請求項5】
前記脱塩と酵素分解は、具体的には、サンプル抽出液を限外濾過遠心分離管の上層に加え、１２０００ｒで１０分遠心分離し、下層の溶液を捨てて、水５００μＬを加え、１２０００ｒで１０分遠心分離し、下層の溶液を捨てて、水５００μＬを加え、１２０００ｒで１０分遠心分離し、下層の溶液を捨てて、１％ ＮＨ４ＨＣＯ３溶液５００μＬと１０ｍｇ／ｍＬのウシトリプシン溶液１０μＬを加え、３７℃で１５分酵素分解し、取り出して室温まで放冷し、遠心分離して上澄み液を得ることであることを特徴とする請求項３又は４に記載の使用。
【請求項6】
液相条件として、クロマトグラフィーカラムはＡｇｉｌｅｎｔ ＳＢ Ｃ１８ （２．１×１００ｍｍ、１．８μｍ）、カラム温度は４３℃、流速は０．３ｍＬ／ｍｉｎ、移動相Ａは０．１％ギ酸溶液、移動相Ｂは０．１％ギ酸アセトニトリル溶液であり、勾配溶出が行われ、注入量は５μＬであることを特徴とする請求項３に記載の使用。
【請求項7】
前記勾配溶出条件は、０～９ｍｉｎ、３％Ｂ→７．５％Ｂ；９～１３ｍｉｎ、７．５％Ｂ→２５％Ｂ；１３～１４ｍｉｎ、２５％Ｂ→９０％Ｂ；１４～１７ｍｉｎ、９０％Ｂ；１７～１７．５ｍｉｎ、９０％Ｂ→９７％Ｂ、１７．５～２１ｍｉｎ、９７％Ｂであることを特徴とする請求項６に記載の使用。
【請求項8】
前記質量分析条件としては、質量分析検出器を用いて、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を行い、プラスイオンモードで多重反応モニタリングを行い、
シースガス流速は４６Ｌ／ｈｒ、補助ガス流速は８５０Ｌ／ｈｒ、スプレー電圧は３．５ＫＶ、イオン源温度は１５０℃、補助ガス温度は４００℃、コーン電圧は３０Ｖ、衝突電圧は３５Ｖ、溶媒遅延（ｓｏｌｖｅｎｔ ｄｅｌａｙ）は０～４ｍｉｎ及び１６～２０ｍｉｎとすることを特徴とする請求項６又は７に記載の使用。
シースガス流速は４６Ｌ／ｈｒ、補助ガス流速は８５０Ｌ／ｈｒ、スプレー電圧は３．５ＫＶ、イオン源温度は１５０℃、補助ガス温度は４００℃、コーン電圧は３０Ｖ、衝突電圧は３５Ｖ、溶媒遅延（ｓｏｌｖｅｎｔ ｄｅｌａｙ）は０～４ｍｉｎ及び１６～２０ｍｉｎとすることを特徴とする請求項６又は７に記載の使用。