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▶ ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニアの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023182637
(43)【公開日】2023-12-26
(54)【発明の名称】制御性Ｔ細胞を改変するための組成物および方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0783 20100101AFI20231219BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20231219BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20231219BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231219BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20231219BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20231219BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231219BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231219BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0783 ZNA
C12N15/09 110
C12N15/113 Z
C12N5/10
A61K35/17
A61P37/06
A61P35/00
A61P43/00 105
【審査請求】有
【請求項の数】15
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023158419
(22)【出願日】2023-09-22
(62)【分割の表示】P 2021519859の分割
【原出願日】2019-10-10
(31)【優先権主張番号】62/744,058
(32)【優先日】2018-10-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】506115514
【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(72)【発明者】
【氏名】マーソン アレクサンダー
(72)【発明者】
【氏名】コルテス ジェシカ ティー．
(72)【発明者】
【氏名】ブルーストーン ジェフリー エイ．
(72)【発明者】
【氏名】シフルット エリック
(72)【発明者】
【氏名】ヴァン グール フレデリック
(57)【要約】 （修正有）
【課題】制御性T細胞を安定化させる方法、または腫瘍微小環境における免疫寛容原性効果を取り除くために制御性T細胞を積極的に不安定化させる方法を提供する。
【解決手段】制御性T細胞を改変するための組成物および方法が、本明細書において提供される。本発明者らは、Treg細胞の重要な転写調節因子であるFoxp3の発現に影響を及ぼす核内因子を同定した。これらの核内因子のうちの1つまたは複数を阻害することおよび／または過剰発現させることによりTreg細胞を改変して、安定化Treg細胞または不安定化Treg細胞を作製することができる。
【選択図】図１
【解決手段】制御性T細胞を改変するための組成物および方法が、本明細書において提供される。本発明者らは、Treg細胞の重要な転写調節因子であるFoxp3の発現に影響を及ぼす核内因子を同定した。これらの核内因子のうちの1つまたは複数を阻害することおよび／または過剰発現させることによりTreg細胞を改変して、安定化Treg細胞または不安定化Treg細胞を作製することができる。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒト制御性T (Treg) 細胞の安定性を高める方法であって、ヒトTreg細胞において、
表1に記載の1つもしくは複数の核内因子の発現を阻害する段階、および／または
表2に記載の1つもしくは複数の核内因子を過剰発現させる段階
を含む、前記方法。
表1に記載の1つもしくは複数の核内因子の発現を阻害する段階、および／または
表2に記載の1つもしくは複数の核内因子を過剰発現させる段階
を含む、前記方法。
【請求項2】
ヒトTreg細胞の安定性を低下させる方法であって、ヒトTreg細胞において、
表2に記載の1つもしくは複数の核内因子の発現を阻害する段階、および／または
表1に記載の1つもしくは複数の核内因子を過剰発現させる段階
を含む、前記方法。
表2に記載の1つもしくは複数の核内因子の発現を阻害する段階、および／または
表1に記載の1つもしくは複数の核内因子を過剰発現させる段階
を含む、前記方法。
【請求項3】
阻害する段階が、
核内因子の発現を減少させること、または
核内因子をコードするポリヌクレオチドの発現を減少させること
を含む、請求項1または2に記載の方法。
核内因子の発現を減少させること、または
核内因子をコードするポリヌクレオチドの発現を減少させること
を含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項4】
過剰発現させる段階が、
核内因子の発現を増加させること、または
核内因子をコードするポリヌクレオチドの発現を増加させること
を含む、請求項1または2に記載の方法。
核内因子の発現を増加させること、または
核内因子をコードするポリヌクレオチドの発現を増加させること
を含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項5】
過剰発現させる段階が、核内因子をコードするポリヌクレオチドをTreg細胞に導入することを含む、請求項4に記載の方法。
【請求項6】
阻害する段階が、核内因子をコードするポリヌクレオチドを、標的指向ヌクレアーゼ、ガイドRNA (gRNA)、siRNA、アンチセンスRNA、マイクロRNA (miRNA)、または短鎖ヘアピンRNA (shRNA) と接触させることを含む、請求項3に記載の方法。
【請求項7】
阻害する段階が、核内因子をコードするポリヌクレオチドを、少なくとも1つのgRNAおよび任意で標的指向ヌクレアーゼと接触させることを含み、少なくとも1つのgRNAが表3より選択される配列を含む、請求項6に記載の方法。
【請求項8】
阻害する段階が、核内因子をコードするポリヌクレオチドを変異させることを含む、請求項1～7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
阻害する段階が、ポリヌクレオチドを標的指向ヌクレアーゼと接触させることを含む、請求項8に記載の方法。
【請求項10】
標的指向ヌクレアーゼがポリヌクレオチド内の標的領域に二本鎖切断を導入する、請求項9に記載の方法。
【請求項11】
標的指向ヌクレアーゼがRNAガイドヌクレアーゼである、請求項6または10に記載の方法。
【請求項12】
RNAガイドヌクレアーゼがCpf1ヌクレアーゼまたはCas9ヌクレアーゼであり、前記方法が、ポリヌクレオチド内の標的領域に特異的にハイブリダイズするgRNAをTreg細胞に導入する段階をさらに含む、請求項11に記載の方法。
【請求項13】
Cpf1ヌクレアーゼまたはCas9ヌクレアーゼとgRNAとが、リボ核タンパク質 (RNP) 複合体としてTreg細胞に導入される、請求項12に記載の方法。
【請求項14】
阻害する段階が、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート (CRISPR)／Casゲノム編集を行うことを含む、請求項9～13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
Treg細胞が、阻害する段階および／または過剰発現させる段階の後に、ヒトに投与される、請求項1～14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
Treg細胞をヒトから採取した後、該Treg細胞を、核内因子の発現を阻害するおよび／または核内因子を過剰発現させるために処理し、処理したTreg細胞をヒトに再導入する、請求項1～15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
発現の阻害および／または過剰発現が、安定性の向上したTreg細胞をもたらす、請求項16に記載の方法。
【請求項18】
ヒトが自己免疫障害を有する、請求項17に記載の方法。
【請求項19】
発現の阻害および／または過剰発現が、安定性の低下したTreg細胞をもたらす、請求項16に記載の方法。
【請求項20】
ヒトががんを有する、請求項19に記載の方法。
【請求項21】
請求項1～14のいずれか一項に記載の方法によって作製された、Treg細胞。
【請求項22】
表1に記載の核内因子の発現を阻害する遺伝子改変もしくは異種ポリヌクレオチド、および／または表2に記載の核内因子をコードする異種ポリヌクレオチドを含む、Treg細胞。
【請求項23】
表2に記載の核内因子の発現を阻害する遺伝子改変もしくは異種ポリヌクレオチド、および／または表1に記載の核内因子をコードする異種ポリヌクレオチドを含む、Treg細胞。
【請求項24】
表3より選択される配列を含む少なくとも1つのガイドRNA (gRNA)を含む、Treg。
【請求項25】
表1または表2に記載の核内因子の発現が、gRNAを含まないTreg細胞における核内因子の発現と比較して、前記Treg細胞において減少する、請求項24に記載のTreg細胞。
【請求項26】
それを必要とする対象においてTregを不安定化させる方法であって、対象のヒトTreg細胞において、
表2に記載の1つもしくは複数の核内因子の発現を阻害する段階、および／または
表1に記載の1つもしくは複数の核内因子を過剰発現させる段階
を含む、前記方法。
表2に記載の1つもしくは複数の核内因子の発現を阻害する段階、および／または
表1に記載の1つもしくは複数の核内因子を過剰発現させる段階
を含む、前記方法。
【請求項27】
表2に記載の1つもしくは複数の核内因子の発現を阻害する段階、および／または表1に記載の1つもしくは複数の核内因子を過剰発現させる段階が、インビボで行われる、請求項26に記載の方法。
【請求項28】
Treg細胞を不安定化させる方法が、
(a) 対象からTreg細胞を採取する段階；
(b) 該Treg細胞において表2に記載の核内因子の発現を阻害すること、および／または表1に記載の核内因子を過剰発現させることにより、該Treg細胞を不安定化させる段階；ならびに
(c) 該不安定化Treg細胞を対象に投与する段階
を含む、請求項26に記載の方法。
(a) 対象からTreg細胞を採取する段階；
(b) 該Treg細胞において表2に記載の核内因子の発現を阻害すること、および／または表1に記載の核内因子を過剰発現させることにより、該Treg細胞を不安定化させる段階；ならびに
(c) 該不安定化Treg細胞を対象に投与する段階
を含む、請求項26に記載の方法。
【請求項29】
対象ががんを有する、請求項26～27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
それを必要とする対象においてTregを安定化させる方法であって、対象のヒトTreg細胞において、
表1に記載の1つもしくは複数の核内因子の発現を阻害する段階、および／または
表2に記載の1つもしくは複数の核内因子を過剰発現させる段階
を含む、前記方法。
表1に記載の1つもしくは複数の核内因子の発現を阻害する段階、および／または
表2に記載の1つもしくは複数の核内因子を過剰発現させる段階
を含む、前記方法。
【請求項31】
表1に記載の1つもしくは複数の核内因子の発現を阻害する段階、および／または表2に記載の1つもしくは複数の核内因子を過剰発現させる段階が、インビボで行われる、請求項30に記載の方法。
【請求項32】
Treg細胞を安定化させる方法が、
(a) 対象からTreg細胞を採取する段階；
(b) 該Treg細胞において表1に記載の核内因子の発現を阻害すること、および／または表2に記載の核内因子を過剰発現させることにより、該Treg細胞を安定化させる段階；ならびに
(c) 該不安定化Treg細胞を対象に投与する段階
を含む、請求項30に記載の方法。
(a) 対象からTreg細胞を採取する段階；
(b) 該Treg細胞において表1に記載の核内因子の発現を阻害すること、および／または表2に記載の核内因子を過剰発現させることにより、該Treg細胞を安定化させる段階；ならびに
(c) 該不安定化Treg細胞を対象に投与する段階
を含む、請求項30に記載の方法。
【請求項33】
対象が自己免疫障害を有する、請求項30～32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
対象において自己免疫障害を処置する方法であって、自己免疫疾患を有する対象に請求項22に記載のTreg細胞の集団を投与する段階を含む、前記方法。
【請求項35】
対象においてがんを処置する方法であって、がんを有する対象に請求項23に記載のTreg細胞の集団を投与する段階を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
先行する関連出願
本出願は、2018年10月10日に出願された米国仮特許出願第62/744,058号の恩典を主張するものであり、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本出願は、2018年10月10日に出願された米国仮特許出願第62/744,058号の恩典を主張するものであり、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
制御性T細胞（Treg細胞）は、免疫応答を調節する役割を果たしている。いくつかの事例では、例えば一部のがんでは、Treg細胞は、がん細胞を標的にして破壊する免疫系の能力を阻害する。他の事例では、例えば自己免疫疾患では、Treg細胞は免疫系を制御するために利用不可能である。自己免疫疾患の処置のためにTreg細胞を安定化させる方法、または腫瘍微小環境における免疫寛容原性効果を取り除くためにTreg細胞を積極的に不安定化させる方法には、大きな治療可能性がある。
制御性T細胞（Treg細胞）は、免疫応答を調節する役割を果たしている。いくつかの事例では、例えば一部のがんでは、Treg細胞は、がん細胞を標的にして破壊する免疫系の能力を阻害する。他の事例では、例えば自己免疫疾患では、Treg細胞は免疫系を制御するために利用不可能である。自己免疫疾患の処置のためにTreg細胞を安定化させる方法、または腫瘍微小環境における免疫寛容原性効果を取り除くためにTreg細胞を積極的に不安定化させる方法には、大きな治療可能性がある。
【発明の概要】
【0003】
本発明は、Treg細胞を改変するための組成物および方法を対象にする。本発明者らは、Treg細胞の重要な転写調節因子であるFoxp3の発現に影響を及ぼす核内因子を同定した。これらの核内因子のうちの1つまたは複数を阻害するおよび／または過剰発現させることによりTreg細胞を改変して、安定化Treg細胞または不安定化Treg細胞を作製することができる。いくつかの例において、安定化Treg細胞は、自己免疫障害を処置するため、臓器移植を支援するため、移植片対宿主病または炎症を処置するために使用される。自己免疫疾患の例には、1型糖尿病、関節リウマチ、炎症性腸疾患、多発性硬化症、および多臓器自己免疫症候群が含まれるが、これらに限定されない。他の例において、不安定化Treg細胞は、がんを処置するために使用される。例えば、いくつかの態様では、不安定化Tregを、例えばTreg細胞が免疫抑制性微小環境に寄与する場合の固形腫瘍を標的にするために使用することができる。そのようながんの例には卵巣がんが含まれるが、これに限定されない。
【0004】
ヒト制御性T (Treg) 細胞の安定性を高める方法であって、ヒトTreg細胞において、表1に記載の核内因子の発現を阻害する段階、および／または表2に記載の核内因子を過剰発現させる段階を含む方法が、本明細書において提供される。
【0005】
ヒトTreg細胞の安定性を低下させる方法であって、ヒトTreg細胞において、表2に記載の核内因子の発現を阻害する段階、および／または表1に記載の核内因子を過剰発現させる段階を含む方法もまた、提供される。
【0006】
いくつかの態様において、阻害する段階は、Treg細胞において、核内因子の発現を減少させること、または核内因子をコードするポリヌクレオチドの発現を減少させることを含む。いくつかの態様において、過剰発現させる段階は、Treg細胞において、核内因子の発現を増加させること、または核内因子をコードするポリヌクレオチドの発現を増加させることを含む。
【0007】
いくつかの態様において、Treg細胞において阻害する段階は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、標的指向ヌクレアーゼ、ガイドRNA (gRNA)、siRNA、アンチセンスRNA、マイクロRNA (miRNA)、または短鎖ヘアピンRNA (shRNA) と接触させることを含む。いくつかの態様において、阻害する段階は、核内因子をコードするポリヌクレオチドを、少なくとも1つのgRNAおよび任意で標的指向ヌクレアーゼと接触させることを含み、この場合、少なくとも1つのgRNAは表3より選択される配列を含む。いくつかの態様において、阻害する段階は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを変異させることを含む。いくつかの態様において、阻害する段階は、ポリヌクレオチドを標的指向ヌクレアーゼと接触させることを含む。
【0008】
いくつかの態様において、標的指向ヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド内の標的領域に二本鎖切断を導入する。いくつかの態様において、標的指向ヌクレアーゼはRNAガイドヌクレアーゼである。いくつかの態様において、RNAガイドヌクレアーゼはCpf1ヌクレアーゼまたはCas9ヌクレアーゼであり、前記方法は、ポリヌクレオチド内の標的領域に特異的にハイブリダイズするgRNAをTreg細胞に導入する段階をさらに含む。いくつかの態様において、Cpf1ヌクレアーゼまたはCas9ヌクレアーゼとgRNAとが、リボ核タンパク質 (RNP) 複合体としてTreg細胞に導入される。いくつかの態様において、阻害する段階は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート (CRISPR)／Casゲノム編集を行うことを含む。
【0009】
いくつかの態様において、Treg細胞は、阻害する段階および／または過剰発現させる段階の後にヒトに投与される。いくつかの態様においては、Treg細胞をヒトから採取した後、該Treg細胞を、核内因子の発現を阻害するおよび／または核内因子を過剰発現させるために処理し、処理したTreg細胞をヒトに再導入する。いくつかの態様においては、インビボのTreg細胞において、核内因子の発現が阻害される、および／または核内因子が過剰発現される。いくつかの態様において、ヒトは、自己免疫障害、GVHD、炎症を有するか、または臓器移植のレシピエントである。いくつかの態様において、ヒトはがんを有する。
【0010】
別の態様においては、本明細書に記載される方法のいずれかによって作製されたTreg細胞が、本明細書において提供される。別の態様において、本発明は、表1に記載の核内因子の発現を阻害する遺伝子改変もしくは異種ポリヌクレオチド、および／または表2に記載の核内因子によってコードされるタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含むTreg細胞を提供する。別の態様において、本発明は、表2に記載の核内因子の発現を阻害する遺伝子改変もしくは異種ポリヌクレオチド、および／または表1に記載の核内因子によってコードされるポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含むTreg細胞を提供する。
【0011】
別の態様においては、表3より選択される配列を含む少なくとも1つのガイドRNA (gRNA) を含むTregが、本明細書において提供される。いくつかの態様において、表1または表2に記載の核内因子の発現は、gRNAを含まないTreg細胞における核内因子の発現と比較して、前記Treg細胞において減少する。
【0012】
別の態様においては、それを必要とする対象においてTregを不安定化させる方法であって、対象のヒトTreg細胞において、表2に記載の1つもしくは複数の核内因子の発現を阻害する段階、および／または表1に記載の1つもしくは複数の核内因子を過剰発現させる段階を含む方法が、本明細書において提供される。いくつかの態様において、Treg細胞はインビボで不安定化される。他の態様において、Treg細胞はエクスビボで不安定化される。いくつかの態様において、対象はがんを有する。
【0013】
別の態様においては、それを必要とする対象においてTregを安定化させる方法であって、対象のヒトTreg細胞において、表1に記載の1つもしくは複数の核内因子の発現を阻害する段階、および／または表2に記載の1つもしくは複数の核内因子を過剰発現させる段階を含む方法が、本明細書において提供される。いくつかの態様において、Treg細胞はインビボで安定化される。他の態様において、Treg細胞はエクスビボで安定化される。いくつかの態様において、対象は自己免疫障害を有する。
【0014】
別の態様においては、対象において自己免疫障害を処置する方法であって、自己免疫疾患を有する対象に安定化Treg細胞の集団を投与する段階を含む方法が、本明細書において提供される。別の態様において、本発明は、対象においてがんを処置する方法であって、がんを有する対象に不安定化Treg細胞の集団を投与する段階を含む方法を提供する。
【0015】
別の態様においては、対象において自己免疫障害、GVHD、もしくは炎症を処置するか、または臓器移植処置を支援する方法であって、(a) 対象（例えば、自己免疫障害を有する）からTreg細胞を採取する段階；(b) Treg細胞において表1に記載の核内因子の発現を阻害すること、および／または表2に記載の核内因子を過剰発現させることにより、Treg細胞を改変する段階；ならびに (c) 改変されたTreg細胞を対象に投与する段階を含む方法が、本明細書において提供される。
【0016】
別の態様において、本発明は、対象においてがんを処置する方法であって、(a) がんを有する対象からTreg細胞を採取する段階；(b) Treg細胞において表2に記載の核内因子の発現を阻害すること、および／または表1に記載の核内因子を過剰発現させることにより、Treg細胞を改変する段階；ならびに (c) 改変されたTreg細胞を対象に投与する段階を含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0017】
本出願は以下の図を含む。図は、組成物および方法のある特定の態様および／または特徴を例示すること、ならびに組成物および方法の任意の説明を補足することを意図している。明細書がそうであることを明示的に示さない限り、図は組成物および方法の範囲を限定しない。
【図1】CRISPRスクリーンにおける核内因子の阻害に際してFoxp3+ TregおよびFoxp3- ex Tregを同定するために使用されたTreg運命レポーターマウスの模式図である。
【図2-1】図2aは、Foxp3の安定性に影響を及ぼす核内因子を同定するために使用されたプール化CRISPRスクリーニング戦略の模式図である。図2bは、スクリーンからのヒットのボルケーノプロットである。X軸は、遺伝子レベルlog2変化倍率 (LFC) のZスコア；スケール調整された、遺伝子当たりの全単一ガイドRNA (sgRNA) のLFCの中央値を示す。Y軸は、MAGeCKによって算出されたp値を示す。赤色は負の調節因子（Foxp3低細胞において枯渇）であり、青色ドットは、FDR＜0.5およびZスコア＞0.5により定義されたすべての正の調節因子（Foxp3低細胞において濃縮）を示す。図2c（上部パネル）は、ガイド2,000個の、Foxp3高細胞に対するFoxp3低細胞のsgRNAレベルlog変化倍率 (LFC) 値の分布を示す。図2c（下部パネル）は、Foxp3低細胞において濃縮された遺伝子（青線）および枯渇した遺伝子（赤線）を標的にする4つすべての個々のsgRNAのLFCを、全体の分布を描写する灰色の勾配に重ねて示す。
【図2-2】図2dは、STRING-dbによって作成された、上位ヒットである16個の負の調節因子（赤色）と25個の正の調節因子（赤色）との間の、実験的に決定されかつ予測されるタンパク質間相互作用の模式図を示す。黒線は相互作用するタンパク質をつなぎ、点線は公知のタンパク質複合体を示す。図2eは、上位スクリーンヒットの、フローサイトメトリーによって測定された、マウスTregにおけるCas9 RNPのエレクトロポレーションから5日後のFoxp3発現を示す。図2fは、図2eのデータからのFoxp3の平均蛍光強度 (MFI) を示す。図2gは、ヒトTregからのFOXP3およびCD25のMFIを示す代表的なヒストグラムを示す。図2hは、6つの生物学的複製物におけるヒトTregからのFOXP3 MFIの統計解析を示す。
【図2-3】図2iは、スクリーンからのヒットのS字曲線である。X軸は、遺伝子レベルLFCのランクスコアを示し；ランク1は最上位の負のヒット (Sp1) であり、ランク493は最上位の正のヒット (Foxp3) である。Y軸は、MAGeCKによって算出された遺伝子レベルLFCを示す。赤色ドットは、上位20位にランク付けされたヒットの中で選択された負のヒット（Foxp3低細胞において枯渇）を示し、青色ドットは、選択された正のヒット（Foxp3低細胞において濃縮）を示す。図2jは、2000個超のgRNAの標的指向スクリーンにおいて、Foxp3およびUsp22を標的にするsgRNAがFoxp3低細胞において濃縮されたことを示す。非標的sgRNAは、細胞集団全体に均等に分布された（黒色）。
【図3】図3a～gは、初代マウスTregにおける標的指向プール化CRISPRスクリーンの設計および品質管理を示す。(a) 偏りのない標的指向ライブラリーのための遺伝子の選択の設計戦略。遺伝子は、遺伝子オントロジー (GO) 注釈付けに基づき選択し、次いで任意のCD4 T細胞サブセットにわたる最も高い発現に基づきサブ選択して、合計で2,000個のsgRNAとした；(b) sgRNAライブラリーのレトロウイルス形質導入に使用された、Thy1.1レポーターを有するMSCV発現ベクター；(c) 12日間の標的指向スクリーンパイプラインの詳細な予定表の模式図。矢印は、細胞を分割し、培地を補充した時点を示す；(d) フローサイトメトリーによって測定されたThy1.1表面発現によって示される、初代マウスTregにおける標的指向ライブラリーのレトロウイルス形質導入効率。高効率の感染多重度を達成するために、感染を増やした；(e) フローサイトメトリーによって測定された、スクリーンインプット、アウトプット、および対照細胞からのFoxp3発現。上段：0日目における、GFP発現によって測定された、インプットFoxp3+精製TregからのFoxp3発現。中段：12日目における、対照Treg（ライブラリーを形質導入されていない）からの、内因性細胞内染色によって測定されたFoxp3発現。下段：12日目における、スクリーンTreg（ライブラリーを形質導入された）からの、内因性細胞内染色によって測定されたFoxp3発現；(f) 標的指向スクリーン（ガイド2,000個）は、Foxp3およびUsp22を標的にするsgRNAがFoxp3低細胞において濃縮されたことを示す（青色）。非標的対照 (NT Ctrl) sgRNAは、細胞集団全体に均等に分布された（黒色）。(g) 選別された細胞集団、Foxp3高およびFoxp3低のsgRNAの次世代シーケンシング後のリード数の分布。
【図4】図4a～gは、Cas9 RNPアレイを用いた、初代マウスおよびヒトTregにおける、Foxp3発現を調節する遺伝子標的の検証を示す。(a) Cas9 RNPのアレイ化エレクトロポレーションを用いる直交検証戦略の概要。(b) ヒトTregにおけるCas9 RNPのエレクトロポレーションから7日後のFOXP3およびCD25の発現を示す代表的なフロープロット。Foxp3hiCD25hi亜集団を赤色ゲートで強調してある。(c) 6つの生物学的複製物におけるヒトTregからのFOXP3+細胞の割合。(d) 6つの生物学的複製物におけるヒトTregからのFoxp3hiCD25hi細胞の割合。(e) エレクトロポレーションの5日後に収集されたマウスTregにおけるRNP対照；左側：NT対照と比較した、CD4 RNP（カット対照）からのCD4発現。右側：NT対照と比較した、CD4ノックアウト細胞（左側パネル）からのFoxp3発現。(f) フローサイトメトリーによって測定された、Cas9 RNPのエレクトロポレーションから6日後のFoxp3発現。細胞は、リンパ球、生細胞、CD4+、CD25hi細胞に予めゲート設定した；(g) パネルgのデータからのFoxp3の平均蛍光強度 (MFI) の統計解析。統計解析には、Holm-Sidak多重比較検定を伴う二元配置ANOVAを用いた。**p≦0.01、****p≦0.0001。
【図5】図5a～bは、Cas9 RNPアレイを用いた、初代マウスTregにおけるRnf20の検証を示す。(a) Rnf20を標的にする2つのgRNAのフローサイトメトリーヒストグラムは、Rnf20のノックアウトが安定したFoxp3発現を維持することを示す。(b) 図5aからのFoxp3 MFIデータの棒グラフ。
【図6】RNPアレイを用いた、初代ヒトTregにおけるFoxp3発現のUSP22による調節の検証を示す。(a) フローサイトメトリーによって測定された、Cas9 RNPのエレクトロポレーションから7日後のFoxp3発現。細胞は、リンパ球、生細胞、CD4+、CD25hi細胞に予めゲート設定した。(b) パネルaのデータからのFoxp3 MFI。
【図7】マウスTregにおけるUsp22およびAtxn7l3のノックアウトがFoxp3発現を減少させる一方で、Rnf20のノックダウンは安定したFoxp3発現を維持することを示す。
【発明を実施するための形態】
【0018】
定義
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、「1つの (a)」、「1つの (an)」、および「その」という単数形は、文脈上明白に別の意味を示していない限り、複数の指示対象も含む。
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、「1つの (a)」、「1つの (an)」、および「その」という単数形は、文脈上明白に別の意味を示していない限り、複数の指示対象も含む。
【0019】
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボ核酸 (DNA) またはリボ核酸 (RNA)、および一本鎖形態もしくは二本鎖形態のいずれかであるそれらのポリマーを指す。具体的に限定されない限り、本用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、かつ天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される、天然ヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸を包含する。他に指示がない限り、特定の核酸配列は、明確に示される配列ばかりでなく、その保存的に改変された変種（例えば、縮重コドン置換物）、対立遺伝子、オルソログ、SNP、および相補的配列もまた暗に包含する。具体的には、縮重コドン置換物は、1つもしくは複数の選択された（またはすべての）コドンの3番目の位置を混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換した配列を作製することによって達成され得る（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)；Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)；およびRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。核酸という用語は、遺伝子、遺伝子によってコードされるcDNAおよびmRNAと互換的に使用される。
【0020】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の産生またはコード化に関与するDNAのセグメントを指し得る。これは、コード領域に先行する領域および後続する領域（リーダーおよびトレイラー）、ならびに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含み得る。
【0021】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は本明細書において互換的に用いられて、アミノ酸残基のポリマーを指す。本明細書で用いられる場合、本用語は、アミノ酸残基が共有結合性ペプチド結合によって連結されている、全長タンパク質を含めた任意の長さのアミノ酸鎖を包含する。
【0022】
「発現を阻害すること」という用語は、遺伝子産物、例えばRNAまたはタンパク質の発現を阻害することまたは減少させることを指す。全体を通して用いられる場合、「核内因子」という用語は、Foxp3の発現を直接的または間接的に変化させるタンパク質、例えば転写因子を指す。遺伝子の発現を阻害するまたは減少させるために、遺伝子の配列および／または構造を、遺伝子が転写（DNAの場合）もしくは翻訳（RNAの場合）されないように、または転写もしくは翻訳されて、機能的なタンパク質、例えば表1もしくは表2に記載の遺伝子によってコードされるポリペプチドもしくはタンパク質を産生しないように、改変することができる。発現を阻害するまたは減少させるための様々な方法は、本明細書においてさらに詳細に記載される。いくつかの方法は、野生型遺伝子に核酸の置換、付加、および／または欠失を導入し得る。いくつかの方法はまた、遺伝子に一本鎖または二本鎖の切断を導入し得る。タンパク質の発現を阻害するまたは減少させるために、タンパク質をコードする遺伝子またはポリヌクレオチドの発現を阻害するまたは減少させることができる。他の態様においては、例えば抗体またはプロテアーゼを使用して、タンパク質を直接標的にしてタンパク質の発現を阻害するまたは減少させることができる。「阻害された」発現は、参照対照レベルと比較して少なくとも10%の減少、例えば、少なくとも約20%、または少なくとも約30%、または少なくとも約40%、または少なくとも約50%、または少なくとも約60%、または少なくとも約70%、または少なくとも約80%、または少なくとも約90%の減少、または100%を含む最大100%の減少（すなわち、参照試料と比較してレベルが存在しない）を指す。
【0023】
「過剰発現させること」または「過剰発現」という用語は、遺伝子またはタンパク質の発現を増加させることを指す。「過剰発現」は、参照対照レベルと比較して少なくとも10%の発現の増加、例えばTreg細胞において発現するmRNAもしくはタンパク質の量の増加、または少なくとも約20%、または少なくとも約30%、または少なくとも約40%、または少なくとも約50%、または少なくとも約60%、または少なくとも約70%、または少なくとも約80%、または少なくとも約90%、または少なくとも約100%、または少なくとも約200%、または少なくとも約300%、または少なくとも約400%の増加を指す。過剰発現のための様々な方法は当業者に公知であり、これには、過剰発現させようとするタンパク質（すなわち、表1もしくは表2に記載の核内因子）をコードする異種ポリヌクレオチドを細胞内に安定的もしくは一過性に導入すること、またはタンパク質をコードする内因性遺伝子の過剰発現を細胞内で誘導することが含まれるが、これらに限定されない。
【0024】
本明細書で用いられる場合、「異種の」という語句は、天然には見出されないものを指す。「異種配列」という用語は、天然では所与の細胞において通常は見出されない配列を指す。したがって、異種のヌクレオチドまたはタンパク質配列は、(a) その宿主細胞にとって外来性であってよい（すなわち、細胞にとって外因性である）；(b) 宿主細胞において天然に見出される（すなわち、内因性である）が、細胞内で非天然の量（すなわち、宿主細胞において天然に見出されるよりも多いもしくは少ない量）で存在してよい；または (c) 宿主細胞において天然に見出されるが、その天然の遺伝子座の外側に位置してよい。
【0025】
「処置すること」は、軽減；寛解；症状の減少、もしくは疾患状態を患者にとってより許容できるようにすること；変性もしくは減退の速度を遅らせること；または変性の最終点の衰弱を少なくさせることなどの、任意の客観的または主観的パラメータを含む、疾患、状態、または障害の処置または改善または予防における成功の任意の兆候を指す。
【0026】
「プロモーター」は、核酸の転写を指示する1つまたは複数の核酸制御配列と定義される。本明細書で用いられる場合、プロモーターは、ポリメラーゼII型プロモーターの場合のTATAエレメントのような、転写開始部位の近くの必要な核酸配列を含む。プロモーターはまた任意で、遠位のエンハンサーエレメントまたはリプレッサーエレメントを含み、これらは転写開始部位から数千塩基対ほど離れて位置してよい。
【0027】
本明細書で用いられる場合、「相補的」または「相補性」という用語は、ヌクレオチドまたは核酸間の特異的塩基対合を指す。相補的ヌクレオチドは、一般にAとT（もしくはAとU）またはGとCである。本明細書に記載されるガイドRNAは、ゲノム配列と完全に相補的または実質的に相補的である（例えば、1～4個のミスマッチを有する）配列、例えばDNA標的指向配列を含み得る。
【0028】
全体を通して用いられる場合、対象は個体を意味する。例えば、対象は、霊長類などの哺乳動物、およびより具体的にはヒトである。非ヒト霊長類も同様に対象である。対象という用語は、ネコ、イヌ等などの飼育動物、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等）、および実験動物（例えば、フェレット、チンチラ、マウス、ウサギ、ラット、スナネズミ、モルモット等）を含む。したがって、獣医学的使用および医学的使用ならびに製剤化が本明細書において企図される。本用語は、特定の年齢または性別を示すものではない。したがって、成体または新生対象が、雌雄を問わず、網羅されることが意図される。本明細書で用いられる場合、患者または対象は互換的に使用されてよく、疾患または障害に罹患した対象を指し得る。
【0029】
全体を通して用いられる場合、「標的指向ヌクレアーゼ」という用語は、細胞のゲノム内の特定のDNA配列を標的にして、その特定のDNA配列において鎖切断を生じるヌクレアーゼを指す。鎖切断は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。標的指向ヌクレアーゼには、Casヌクレアーゼ、TAL-エフェクターヌクレアーゼ、およびジンクフィンガーヌクレアーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【0030】
「CRISPR/Cas」システムは、外来核酸に対する防御のための広範なクラスの細菌システムを指す。CRISPR/Casシステムは、広範囲の真正細菌生物および古細菌生物において見出される。CRISPR/Casシステムには、I型、II型、およびIII型のサブタイプが含まれる。野生型II型CRISPR/Casシステムは、ガイドおよび活性化RNAと複合体を形成したRNA媒介性ヌクレアーゼ、例えばCas9を利用して、外来核酸を認識し切断する。ガイドRNAおよび活性化RNAの両方の活性を有するガイドRNAもまた、当技術分野において公知である。場合によっては、そのような二重活性ガイドRNAは単一ガイドRNA (sgRNA) と称される。
【0031】
Cas9相同体は、以下の分類群：放線菌門、アクウィフェクス門、バクテロイデス門-クロロビウム門、クラジミア門-ウェルコミクロビウム門、クロロフレクサス門、シアノバクテリア門、ファーミキューテス門、プロテオバクテリア門、スピロヘータ門、およびテルモトガ門の細菌を含むがこれらに限定されない、多種多様な真正細菌において見出される。例示的なCas9タンパク質は、化膿性連鎖球菌 (Streptococcus pyogenes) のCas9タンパク質である。さらなるCas9タンパク質およびその相同体は、例えば、Chylinksi, et al., RNA Biol. 2013 May 1; 10(5): 726-737；Nat. Rev. Microbiol. 2011 June; 9(6): 467-477；Hou, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Sep 24;110(39):15644-9；Sampson et al., Nature. 2013 May 9; 497(7448):254-7；およびJinek, et al., Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21に記載されている。本明細書において提供されるCas9ヌクレアーゼのいずれかの変種は、宿主細胞における効率的な活性または増強された安定性のために最適化することができる。したがって、操作されたCas9ヌクレアーゼもまた企図される。
【0032】
全体を通して用いられる場合、ガイドRNA (gRNA) 配列は、部位特異的または標的指向ヌクレアーゼと相互作用し、細胞のゲノム内の標的核酸に特異的に結合またはハイブリダイズする配列であり、したがってgRNAと標的指向ヌクレアーゼは細胞のゲノム内の標的核酸に共局在化する。各gRNAは、ゲノム内の標的DNA配列に特異的に結合またはハイブリダイズする、約10～50ヌクレオチド長のDNA標的指向配列またはプロトスペーサー配列を含む。例えば、標的指向配列は、約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50ヌクレオチド長であってよい。いくつかの態様において、gRNAは、crRNA配列およびトランス活性化crRNA (tracrRNA) 配列を含む。いくつかの態様において、gRNAはtracrRNA配列を含まない。表3は、本開示の方法において使用される例示的なgRNA配列を示す。
【0033】
本明細書で用いられる場合、「Cas9」という用語は、RNA媒介性ヌクレアーゼ（例えば、細菌もしくは古細菌起源の、またはそれらに由来する）を指す。例示的なRNA媒介性ヌクレアーゼには、前記のCas9タンパク質およびその相同体が含まれる。他のRNA媒介性ヌクレアーゼには、Cpf1（例えば、Zetsche et al., Cell, Volume 163, Issue 3, p759-771, 22 October 2015を参照されたい）およびその相同体が含まれる。同様に、本明細書で用いられる場合、「Cas9リボ核タンパク質」複合体などの用語は、Cas9タンパク質とガイドRNAとの複合体、Cas9タンパク質とcrRNAとの複合体、Cas9タンパク質とトランス活性化crRNA (tracrRNA) との複合体、またはそれらの組み合わせ（例えば、Cas9タンパク質、tracrRNA、およびcrRNAガイドRNAを含む複合体）を指す。本明細書に記載される態様のいずれにおいても、Cas9ヌクレアーゼをCpf1ヌクレアーゼまたは任意の他のガイドヌクレアーゼと置換できることが理解される。
【0034】
本明細書で用いられる場合、「改変すること」という語句は、Treg細胞の標的ゲノム領域においてゲノムの配列に構造的変化を誘導することを指す。例えば、改変は、ヌクレオチド配列を細胞のゲノムに挿入する形態を取ることができる。そのような改変は、例えば、標的ゲノム領域内に二本鎖切断を誘導すること、または反対鎖上に標的ゲノム領域に隣接する一対の一本鎖ニックを導入することによって行うことができる。標的ゲノム領域においてまたは標的ゲノム領域内に一本鎖または二本鎖切断を誘導する方法には、Cas9ヌクレアーゼドメインまたはその誘導体、および標的ゲノム領域に向けられたガイドRNAまたは一対のガイドRNAの使用が含まれる。「改変すること」はまた、Treg細胞において核内因子の発現を変化させること、例えば、Treg細胞において核内因子の発現を阻害することまたは核内因子を過剰発現させることを指し得る。
【0035】
本明細書で用いられる場合、核酸または核酸を含む複合体、例えばRNP複合体を導入するという文脈での「導入すること」という語句は、細胞の外側から細胞の内側への核酸配列またはRNP複合体の移行を指す。場合によっては、導入することは、細胞の外側から細胞の核の内側への核酸または複合体の移行を指す。エレクトロポレーション、ナノワイヤまたはナノチューブとの接触、受容体媒介性の内部移行、細胞透過性ペプチドを介した移行、リポソーム媒介性の移行などを含むがこれらに限定されない、そのような移行の様々な方法が企図される。
【0036】
発明の詳細な説明
以下の説明は、本発明の組成物および方法の様々な局面および態様を列挙している。特定の態様は、組成物および方法の範囲を定義することを意図していない。むしろ、態様は、開示された組成物および方法の範囲内に少なくとも含まれる様々な組成物および方法の非限定的な例を単に提供しているに過ぎない。説明は、当業者の観点から読まれるべきであり；それゆえ、当業者に周知の情報は必ずしも含まれていない。
以下の説明は、本発明の組成物および方法の様々な局面および態様を列挙している。特定の態様は、組成物および方法の範囲を定義することを意図していない。むしろ、態様は、開示された組成物および方法の範囲内に少なくとも含まれる様々な組成物および方法の非限定的な例を単に提供しているに過ぎない。説明は、当業者の観点から読まれるべきであり；それゆえ、当業者に周知の情報は必ずしも含まれていない。
【0037】
I. 序論
Treg細胞は、炎症を抑制して恒常性を維持し、自己免疫を防ぐ、CD4+ T細胞の特殊なサブセットである。Treg細胞の発生および機能は、主要転写因子Foxp3の発現に依存している。Treg細胞は不可逆的に抑制機能に深く関与すると考えられてきたが、系統追跡研究により、Treg細胞が柔軟性を示し得ることが明らかになった。Foxp3の発現を失ったTreg細胞は、「exTreg」と称され、炎症性エフェクターT細胞のサイトカイン産生能力を獲得し、自己免疫を悪化させることが示されている。しかしながら、様々な生理条件下でTreg細胞におけるFoxp3の安定性を促進または妨害する遺伝子調節プログラムは、十分に理解されていない。本発明者らは、Foxp3の発現を調節し、それによってTreg細胞の安定性を変化させる核内因子を同定した。
Treg細胞は、炎症を抑制して恒常性を維持し、自己免疫を防ぐ、CD4+ T細胞の特殊なサブセットである。Treg細胞の発生および機能は、主要転写因子Foxp3の発現に依存している。Treg細胞は不可逆的に抑制機能に深く関与すると考えられてきたが、系統追跡研究により、Treg細胞が柔軟性を示し得ることが明らかになった。Foxp3の発現を失ったTreg細胞は、「exTreg」と称され、炎症性エフェクターT細胞のサイトカイン産生能力を獲得し、自己免疫を悪化させることが示されている。しかしながら、様々な生理条件下でTreg細胞におけるFoxp3の安定性を促進または妨害する遺伝子調節プログラムは、十分に理解されていない。本発明者らは、Foxp3の発現を調節し、それによってTreg細胞の安定性を変化させる核内因子を同定した。
【0038】
II. 方法および組成物
本明細書に記載されるように、本開示は、制御性T (Treg) 細胞において1つもしく複数の核内因子の発現を阻害すること、および／または1つもしくは複数の核内因子を過剰発現させることにより、Treg細胞の安定性を改変することを対象にする組成物および方法を提供する。本開示はまた、安定性が改変されたTreg細胞を含む組成物を特徴とする。不安定化された改変Treg細胞の集団は、がんの処置において治療上の利点をもたらす可能性がある。安定化された改変Treg細胞の集団は、自己免疫疾患の処置において治療上の利点をもたらす可能性がある。
本明細書に記載されるように、本開示は、制御性T (Treg) 細胞において1つもしく複数の核内因子の発現を阻害すること、および／または1つもしくは複数の核内因子を過剰発現させることにより、Treg細胞の安定性を改変することを対象にする組成物および方法を提供する。本開示はまた、安定性が改変されたTreg細胞を含む組成物を特徴とする。不安定化された改変Treg細胞の集団は、がんの処置において治療上の利点をもたらす可能性がある。安定化された改変Treg細胞の集団は、自己免疫疾患の処置において治療上の利点をもたらす可能性がある。
【0039】
本発明は、制御性T細胞（「Treg細胞」とも称される）の安定性を改変するための組成物および方法を対象にする。本発明者らは、1つもしく複数の核内因子の発現を阻害すること、および／または1つもしくは複数の核内因子を過剰発現させることにより、Treg細胞の安定性を変化させることができることを発見した。いくつかの態様において、Treg細胞は、1つもしくは複数の核内因子の発現を阻害すること、および／または1つもしくは複数の核内因子を過剰発現させることにより不安定化させることができ、その結果、Treg細胞はより低い免疫抑制効果を有して、がんの処置に対する治療上の利点が向上する可能性がある。不安定化Treg細胞の集団を用いて、様々ながん治療を強化もしくは改善することができ、またはがんを有する個体のTreg細胞を標的にして、Treg細胞を不安定化させることができる。他の態様において、Treg細胞は、1つもしくは複数の核内因子の発現を阻害すること、および／または1つもしくは複数の核内因子を過剰発現させることにより安定化させることができ、その結果、Treg細胞はより高い免疫抑制効果を有して、自己免疫疾患の処置に対する治療上の利点が向上する可能性がある。安定化Treg細胞の集団を用いて、自己免疫疾患を処置もしくは緩和することができ、または自己免疫疾患を有する個体のTreg細胞を標的にして、Treg細胞を安定化させることができる。
【0040】
本明細書に記載される方法において、Treg細胞の安定性を改変するために発現を変化させることができる核内因子の例には、表1および表2に記載の核内因子が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、本発明は、制御性T (Treg) 細胞の安定性を高める方法であって、Treg細胞において、表1に記載の1つもしくは複数の核内因子の発現を阻害する段階、および／または表2に記載の1つもしくは複数の核内因子を過剰発現させる段階を含む方法を提供する。表1に記載の1つもしくは複数の核内因子の阻害および／または表2に記載の1つもしくは複数の核内因子の過剰発現は、Treg細胞におけるFoxp3発現を増加させるか、またはFoxp3発現を安定化させ（例えば、そうでなければFoxp3発現の減少をもたらす炎症環境において）、それによってTreg細胞の安定性を高めることができる。
【0041】
他の態様において、本発明は、Treg細胞の安定性を低下させる方法であって、Treg細胞において、表2に記載の1つもしくは複数の核内因子の発現を阻害する段階、および／または表1に記載の1つもしくは複数の核内因子を過剰発現させる段階を含む方法を提供する。表2に記載の1つもしくは複数の核内因子の阻害および／または表1に記載の1つもしくは複数の核内因子の過剰発現は、Treg細胞におけるFoxp3の発現を減少させ、それによってTreg細胞の安定性を低下させることができる。表1は、阻害されると、Foxp3発現を増加させる核内因子を提供する。表1に記載の核内因子を過剰発現させると、Foxp3発現を減少させることができる。いくつかの態様においては、表1に記載のアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列の発現が阻害される。いくつかの態様においては、表1に記載のアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列が過剰発現される。表2は、阻害されると、Foxp3発現を減少させる核内因子を提供する。表2に記載の核内因子を過剰発現させると、Foxp3発現を増加させることができる。いくつかの態様においては、表2に記載のアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列の発現が阻害される。いくつかの態様においては、表2に記載のアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列が過剰発現される。表1または表2に記載の1つまたは複数の核内因子に言及する場合、これはタンパク質、すなわち核内因子、または核内因子をコードするポリヌクレオチドであり得ることが理解される。
【0042】
（表１）Foxp3発現を増加させるために阻害するか、またはFoxp3発現を減少させるために過剰発現させることができる核内因子
【0043】
（表２）Foxp3発現を減少させるために阻害するか、またはFoxp3発現を増加させるために過剰発現させることができる核内因子
【0044】
Treg細胞の安定性は、FACSマーカーを用いて評価することができる。使用されるFACSマーカーのいくつかは、標準的なTreg細胞シグネチャータンパクである。例えば、Treg細胞において特定の遺伝子をノックアウトまたは阻害した状態で、これらの改変細胞が、FOXP3、CTLA4、CD25、IL-10、および／またはIKZF2などのTreg細胞標準マーカーの獲得または維持を示す場合、これはTreg細胞がより安定化していることを示し得る。いくつかの態様において、Treg細胞標準マーカーの消失ならびに／または炎症性マーカー（例えば、IL-17a、IL-4、IFNγ、およびIL-2）の獲得は、Treg細胞が不安定化していることを示し得る。別の例では、Treg細胞において特定の核内因子を過剰発現させた状態で、これらの改変細胞が、FOXP3、CTLA4、CD25、IL-10、および／またはIKZF2などのTreg細胞標準マーカーの獲得または維持を示す場合、これはTreg細胞がより安定化していることを示し得る。いくつかの態様において、Treg細胞において特定の核内因子を過剰発現させた状態で、これらの改変細胞が、Treg細胞標準マーカーの消失ならびに／または炎症性マーカー（例えば、IL-17a、IL-4、IFNγ、およびIL-2）の獲得を示す場合、これはTreg細胞が不安定化していることを示し得る。Tregを検出および濃縮する方法については、例えば、国際特許出願公開番号WO2007140472を参照されたい。
【0045】
本明細書に記載される方法のいくつかの態様において、表1または表2に記載の核内因子の発現を阻害する段階は、Treg細胞において、核内因子の発現を減少させること、または核内因子をコードするポリヌクレオチド、例えばmRNAの発現を減少させることを含み得る。いくつかの態様においては、Treg細胞において、表1または表2に記載の1つまたは複数の核内因子の発現が阻害される。本明細書においてさらに詳細に記載されるように、1つまたは複数の利用可能な方法を用いて、表1または表2に記載の1つまたは複数の核内因子の発現を阻害することができる。
【0046】
本明細書に記載される方法のいくつかの態様において、表1に記載の核内因子または表2に記載の核内因子を過剰発現させる段階は、核内因子をコードするポリヌクレオチドを、Treg細胞に導入することを含み得る。本明細書に記載される方法の他の態様において、表1に記載の核内因子または表2に記載の核内因子を過剰発現させる段階は、核内因子をコードする内因性遺伝子の発現を誘導する作用物質をTreg細胞に導入することを含み得る。例えば、短い二本鎖RNAがプロモーター配列を標的にすることにより内因性遺伝子の発現を誘導するRNA活性化を用いて、内因性遺伝子の発現を誘導することができる。例えば、Wang et al. 「Inducing gene expression by targeting promoter sequences using small activating RNAs,」 J. Biol. Methods 2(1): e14 (2015) を参照されたい。別の例では、ジンクフィンガー結合ドメインを含む人工転写因子を使用して、内因性遺伝子の発現を活性化または抑制することができる。例えば、Dent et al., 「Regulation of endogenous gene expressing using small molecule-controlled engineered zinc-finger protein transcription factors,」 Gene Ther. 14(18): 1362-9 (2007) を参照されたい。
【0047】
いくつかの態様において、発現を阻害する段階は、核内因子をコードするポリヌクレオチドを、標的ヌクレアーゼ、ガイドRNA (gRNA)、siRNA、アンチセンスRNA、マイクロRNA (miRNA)、または短鎖ヘアピンRNA (shRNA) と接触させることを含み得る。特定の態様において、表1または表2に記載のヒト核内因子をコードするポリヌクレオチドの発現を阻害するために、gRNAおよび標的ヌクレアーゼ（例えば、Cas9）が使用される場合、gRNAは、表3に記載の配列、表3に記載の配列に相補的な配列、またはそれらの一部を含み得る。表3は、表1および表2に記載の各核内因子の遺伝子ID番号、mRNAのGenbankアクセッション番号、ゲノム配列、ヌクレアーゼ切断後のゲノム内の位置、sgRNA標的配列、標的コンテクスト配列、PAM配列、およびsgRNAが標的にするエクソンを提供する。ZNF281は、マウスZfp281のヒト相同体である。
【0048】
（表３）核内因子を標的にするためのgRNA標的配列および関連情報
【0049】
本明細書に記載されるように、Treg細胞の安定性は、表1または表2に記載の1つまたは複数の核内因子の発現を阻害することによって改変することができる。Treg細胞の安定性はまた、表1または表2に記載の1つまたは複数の核内因子を過剰発現させることによって改変することができる。その後、改変Treg細胞が作製されたならば、改変Treg細胞をヒトに投与することができる。Treg細胞が安定化しているか不安定化しているかに応じて、改変Treg細胞を用いて異なる適応症を処置することができる。例えば、ヒトの全血試料からTreg細胞を単離し、エクスビボで拡大することができる。次いで、拡大されたTreg細胞を、表1または表2に記載の核内因子の発現を阻害するように処理し、そのようにして改変Treg細胞を作製することができる。ある適応症を処置するために、改変Treg細胞をヒトに再導入することができる。いくつかの態様において、より低い免疫抑制効果を有する不安定化Treg細胞は、がんを処置するために使用することができる。いくつかの態様において、改善された免疫抑制効果を有する安定化Treg細胞は、自己免疫疾患を処置するために使用することができる。Treg細胞におけるある特定の核内因子は、その発現が阻害されると、Foxp3発現を増加させ（表1）、安定化効果を有する一方で、他の核内因子は、その発現が阻害されると、Treg細胞におけるFoxp3発現を減少させ（表2）、不安定化効果を有する。細胞の安定性は、Foxp3、Helios、CTLA-4、CD25、IL-10のようなTreg細胞マーカー、ならびにIL-2、IFNγ、IL-17a、およびIL-4のようなエフェクターT細胞サブセットに典型的に関連するサイトカインなどのエフェクターに基づいたマルチカラーFACSパネルによって決定することができる。Treg細胞の安定性を測定するためのアッセイは、例えば、McClymont, et al., 「Plasticity of Human Regulatory T Cells in Healthy Subjects and Patients with Type 1 Diabetes」 J. immunol. 186 (2011) において見出すことができる。適応症および治療上の必要性に応じて、1つまたは複数の核内因子を標的にして、不安定化または安定化した改変Treg細胞を作製することを選択することができる。
【0050】
他の事例では、対象のTreg細胞を、例えば、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスベクターなどの標的指向ベクターを使用することにより、インビボで改変することができる。Treg細胞のゲノムを改変する標的指向ヌクレアーゼのインビボ送達もまた使用することができる。例えば、米国特許第9,737,604号、およびZhang et al. 「Lipid nanoparticle-mediated efficient delivery of CRISPR/Cas9 for tumor therapy,」 NPG Asia Materials Volume 9, page e441 (2017) を参照されたい。
【0051】
表1または表2に記載の1つまたは複数の核内因子の発現が阻害されているTreg細胞もまた提供される。表1または表2に記載の1つまたは複数の核内因子が過剰発現されているTreg細胞がさらに提供される。本開示はまた、表1に記載の1つもしくは複数の核内因子の発現を阻害する遺伝子改変もしくは異種ポリヌクレオチド、および／または表2に記載の核内因子をコードする異種ポリヌクレオチドを含むTreg細胞を特徴とする。表2に記載の核内因子の発現を阻害する遺伝子改変もしくは異種ポリヌクレオチド、および／または表1に記載の核内因子をコードする異種ポリヌクレオチドを含むTreg細胞もまた提供される。
【0052】
遺伝子改変は、核内因子の発現の阻害をもたらす、核内因子をコードするポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド変異または任意の配列変化であってよい。異種ポリヌクレオチドは、もともと核内因子をコードしているが改変されている、すなわち1つまたは複数のヌクレオチド変異または配列変化を含む、ポリヌクレオチドを指し得る。いくつかの態様において、異種ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドを含むベクター、例えばウイルスベクターを導入することにより、Treg細胞のゲノムに挿入される。ウイルスベクターの例には、アデノ随伴ウイルス (AAV) ベクター、レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、レンチウイルスベクターはインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターである。
【0053】
表3より選択される配列を含む少なくとも1つのガイドRNA (gRNA) を含むTreg細胞もまた、本明細書において提供される。gRNAを含むTreg細胞における、表1または表2に記載の1つまたは複数の核内因子の発現は、gRNAを含まないTreg細胞における1つまたは複数の核内因子の発現と比較して該Treg細胞において減少し得る。他の例において、表1または表2に記載の内因性核内因子は、転写抑制因子と融合された非活性化標的指向ヌクレアーゼ、例えばdCAs9を、内因性核内因子遺伝子のプロモーター領域に標的指向させることにより、阻害することができる。他の例において、表1または表2に記載の内因性核内因子は、転写活性化因子と融合された非活性化標的指向ヌクレアーゼ、例えばdCAs9を、内因性核内因子遺伝子のプロモーター領域に標的指向させることにより、上方制御するまたは過剰発現させることができる。例えば、Qi et al. 「The New State of the Art: Cas9 for Gene Activation and Repression,」 Mol. and Cell. Biol., 35(22): 3800-3809 (2015) を参照されたい。
【0054】
III. 発現を阻害する方法
CRISPR/Casゲノム編集
CRISPR（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）／Cas（CRISPR関連タンパク質）ヌクレアーゼシステムは、ゲノム操作のために使用され得る、細菌システムに基づく操作されたヌクレアーゼシステムである。これは、多くの細菌および古細菌の適応免疫応答の一部に基づく。ウイルスまたはプラスミドが細菌に侵入すると、侵入者のDNAのセグメントが「免疫」応答によってCRISPR RNA (crRNA) に変換される。次いで、crRNAは、tracrRNAと称される別の種類のRNAと部分的相補性の領域を介して会合し、「プロトスペーサー」と称される標的DNA中のcrRNAと相同な領域にCas（例えば、Cas9）ヌクレアーゼを導く。Cas（例えば、Cas9）ヌクレアーゼは、crRNA転写物内に含まれる20ヌクレオチドガイド配列によって特定される部位において、DNAを切断して二本鎖切断点に平滑末端を生じる。Cas（例えば、Cas9）ヌクレアーゼは、部位特異的なDNAの認識および切断のためにcrRNAおよびtracrRNAの両方を必要とし得る。このシステムは現在、crRNAとtracrRNAが1つの分子（「ガイドRNA」または「gRNA」）へ組み合わされ得るように操作されており、単一ガイドRNAのcrRNA相当部分を操作して、任意の所望の配列を標的にするようにCas（例えば、Cas9）ヌクレアーゼを導くことができる（例えば、Jinek et al. (2012) Science 337:816-821；Jinek et al. (2013) eLife 2:e00471；Segal (2013) eLife 2:e00563を参照されたい）。したがって、CRISPR/Casシステムを操作して、細胞のゲノム中の所望の標的において二本鎖切断を生じ、かつ細胞の内因性機構を利用して、誘導された切断を相同組換え修復 (HDR) または非相同末端結合 (NHEJ) によって修復することができる。
CRISPR/Casゲノム編集
CRISPR（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）／Cas（CRISPR関連タンパク質）ヌクレアーゼシステムは、ゲノム操作のために使用され得る、細菌システムに基づく操作されたヌクレアーゼシステムである。これは、多くの細菌および古細菌の適応免疫応答の一部に基づく。ウイルスまたはプラスミドが細菌に侵入すると、侵入者のDNAのセグメントが「免疫」応答によってCRISPR RNA (crRNA) に変換される。次いで、crRNAは、tracrRNAと称される別の種類のRNAと部分的相補性の領域を介して会合し、「プロトスペーサー」と称される標的DNA中のcrRNAと相同な領域にCas（例えば、Cas9）ヌクレアーゼを導く。Cas（例えば、Cas9）ヌクレアーゼは、crRNA転写物内に含まれる20ヌクレオチドガイド配列によって特定される部位において、DNAを切断して二本鎖切断点に平滑末端を生じる。Cas（例えば、Cas9）ヌクレアーゼは、部位特異的なDNAの認識および切断のためにcrRNAおよびtracrRNAの両方を必要とし得る。このシステムは現在、crRNAとtracrRNAが1つの分子（「ガイドRNA」または「gRNA」）へ組み合わされ得るように操作されており、単一ガイドRNAのcrRNA相当部分を操作して、任意の所望の配列を標的にするようにCas（例えば、Cas9）ヌクレアーゼを導くことができる（例えば、Jinek et al. (2012) Science 337:816-821；Jinek et al. (2013) eLife 2:e00471；Segal (2013) eLife 2:e00563を参照されたい）。したがって、CRISPR/Casシステムを操作して、細胞のゲノム中の所望の標的において二本鎖切断を生じ、かつ細胞の内因性機構を利用して、誘導された切断を相同組換え修復 (HDR) または非相同末端結合 (NHEJ) によって修復することができる。
【0055】
本明細書に記載される方法のいくつかの態様においては、表1または表2に記載の1つまたは複数の核内因子の発現を阻害するために、CRISPR/Casゲノム編集を用いることができる。
【0056】
いくつかの態様において、CasヌクレアーゼはDNA切断活性を有する。Casヌクレアーゼは、標的DNA配列中の位置、すなわち表1または表2に記載の核内因子をコードするポリヌクレオチド中の位置において、一方または両方の鎖の切断を指示し得る。いくつかの態様において、Casヌクレアーゼは、標的DNA配列の一本鎖を切断する、1つまたは複数の不活性化触媒ドメインを有するニッカーゼであってよい。
【0057】
Casヌクレアーゼの非限定的な例には、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9（Csn1およびCsx12としても公知である）、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、それらの相同体、それらの変種、それらの変異体、ならびにそれらの誘導体が含まれる。Casヌクレアーゼには3つの主要な型（I型、II型、およびIII型）があり、5つのI型、3つのII型、および2つのIII型タンパク質を含む10個のサブタイプがある（例えば、Hochstrasser and Doudna, Trends Biochem Sci, 2015:40(1):58-66を参照されたい）。II型Casヌクレアーゼには、Cas1、Cas2、Csn2、およびCas9が含まれる。これらのCasヌクレアーゼは当業者に公知である。例えば、化膿性連鎖球菌野生型Cas9ポリペプチドのアミノ酸配列は、例えばNBCI参照配列番号NP_269215に記載されており、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）野生型Cas9ポリペプチドのアミノ酸配列は、例えばNBCI参照配列番号WP_011681470に記載されている。本明細書に記載される方法において使用され得るいくつかのCRISPR関連エンドヌクレアーゼは、例えば、米国特許出願公開第2014/0068797号、第2014/0302563号、および第2014/0356959号に開示されている。
【0058】
Casヌクレアーゼ、例えばCas9ポリペプチドは、以下を含むがそれらに限定されない種々の細菌種に由来し得る：ベイロネラ・アティピカル (Veillonella atypical)、フソバクテリウム・ヌクレアタム (Fusobacterium nucleatum)、フィリファクター・アロシス (Filifactor alocis)、ソロバクテリウム・ムーレイ (Solobacterium moorei)、コプロコッカス・カツス (Coprococcus catus)、トレポネーマ・デンティコーラ (Treponema denticola)、ペプトニフィラス・デュエルデニイ (Peptoniphilus duerdenii)、カテニバクテリウム・ミツオカイ (Catenibacterium mitsuokai)、ストレプトコッカス・ミュータンス (Streptococcus mutans)、リステリア・イノキュア (Listeria innocua)、スタフィロコッカス・シュードインターメディウス (Staphylococcus pseudintermedius)、アシダミノコッカス・インテスティン (Acidaminococcus intestine)、オルセネラ・ウリ (Olsenella uli)、オエノコッカス・キタハラエ (Oenococcus kitaharae)、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム (Bifidobacterium bifidum)、ラクトバチルス・ラムノサス (Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・ガセリ (Lactobacillus gasseri)、フィネゴルディア・マグナ (Finegoldia magna)、マイコプラズマ・モービレ (Mycoplasma mobile)、マイコプラズマ・ガリセプチカム (Mycoplasma gallisepticum)、マイコプラズマ・オビニューモニエ (Mycoplasma ovipneumoniae)、マイコプラズマ・カニス (Mycoplasma canis)、マイコプラズマ・シノビエ (Mycoplasma synoviae)、ユーバクテリウム・レクタレ (Eubacterium rectale)、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ユーバクテリウム・ドリクム (Eubacterium dolichum)、ラクトバチルス・コリニフォルミス亜種トルクエンス (Lactobacillus coryniformis subsp. Torquens)、イリオバクター・ポリトロパス (Ilyobacter polytropus)、ルミノコッカス・アルブス (Ruminococcus albus)、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）、アシドサーマス・セルロリティカス (Acidothermus cellulolyticus)、ビフィドバクテリウム・ロングム (Bifidobacterium longum)、ビフィドバクテリウム・デンティウム (Bifidobacterium dentium)、コリネバクテリウム・ジフテリア (Corynebacterium diphtheria)、エルシミクロビウム・ミヌツム (Elusimicrobium minutum)、ニトラティフラクター・サルスギニス (Nitratifractor salsuginis)、スファエロカエタ・グロブス (Sphaerochaeta globus)、フィブロバクター・サクシノゲネス亜種サクシノゲネス (Fibrobacter succinogenes subsp. Succinogenes)、バクテロイデス・フラジリス (Bacteroides fragilis)、カプノサイトファーガ・オクラセア (Capnocytophaga ochracea)、ロドシュードモナス・パルストリス (Rhodopseudomonas palustris)、プレボテラ・ミカンス (Prevotella micans)、プレボテラ・ルミニコラ (Prevotella ruminicola)、フラボバクテリウム・カラムナーレ (Flavobacterium columnare)、アミノモナス・パウシボランス (Aminomonas paucivorans)、ロドスピリラム・ラブラム (Rhodospirillum rubrum)、カンジダタス・プニセイスピリルム・マリナム (Candidatus Puniceispirillum marinum)、ベルミネフロバクター・エイセニアエ (Verminephrobacter eiseniae)、ラルストニア・シジジイ (Ralstonia syzygii)、ディノロセオバクター・シバエ (Dinoroseobacter shibae)、アゾスピリルム (Azospirillum)、ニトロバクター・ハンブルゲンシス (Nitrobacter hamburgensis)、ブラディリゾビウム (Bradyrhizobium)、ウォリネラ・サクシノゲネス (Wolinella succinogenes)、カンピロバクター・ジェジュニ亜種ジェジュニ (Campylobacter jejuni subsp. Jejuni)、ヘリコバクター・ムステラエ (Helicobacter mustelae)、バチルス・セレウス (Bacillus cereus)、アシドボラクス・エブレウス (Acidovorax ebreus)、クロストリジウム・パーフリンゲンス (Clostridium perfringens)、パルビバクラム・ラバメンティボランス (Parvibaculum lavamentivorans)、ロゼブリア・インテスティナリス (Roseburia intestinalis)、髄膜炎菌 (Neisseria meningitidis)、パスツレラ・ムルトシダ亜種ムルトシダ (Pasteurella multocida subsp. Multocida)、ステレラ・ワズワーセンシス (Sutterella wadsworthensis)、プロテオバクテリア (proteobacterium)、レジオネラ・ニューモフィラ (Legionella pneumophila)、パラステレラ・エクスクレメンチホミニス (Parasutterella excrementihominis)、ウォリネラ・サクシノゲネス、およびフランシセラ・ノビシダ (Francisella novicida)。
【0059】
野生型Cas9ヌクレアーゼは、異なるDNA鎖を切断し得る2つの機能的ドメイン、例えばRuvCおよびHNHを有する。Cas9は、両方の機能的ドメインが活性である場合に、ゲノムDNA（標的DNA）において二本鎖切断を誘導することができる。Cas9酵素は、コリネバクター属、ステレラ属、レジオネラ属、トレポネーマ属、フィリファクター属、ユーバクテリウム属、ストレプトコッカス属、ラクトバチルス属、マイコプラズマ属、バクテロイデス属、フラビイボラ属、フラボバクテリウム属、スファエロカエタ属、アゾスピリルム属、グルコンアセトバクター属、ナイセリア属、ロゼブリア属、パルビバクラム属、スタフィロコッカス属、ニトラティフラクター属、およびカンピロバクター属からなる群に属する細菌に由来するCas9タンパク質の1つまたは複数の触媒ドメインを含み得る。いくつかの態様において、Cas9は融合タンパク質であってよく、例えば、2つの触媒ドメインは異なる細菌種に由来する。
【0060】
Cas9ヌクレアーゼの有用な変種は、RuvC-もしくはHNH-酵素またはニッカーゼのように、単一の不活性触媒ドメインを含み得る。Cas9ニッカーゼは、活性のある機能的ドメインを1つだけ有し、標的DNAの一方の鎖のみを切断することができ、それによって一本鎖切断またはニックを生じる。いくつかの態様において、Cas9ヌクレアーゼは、1つまたは複数のアミノ酸変異を有する変異体Cas9ヌクレアーゼであってよい。例えば、少なくともD10A変異を有する変異体Cas9は、Cas9ニッカーゼである。他の態様において、少なくともH840A変異を有する変異体Cas9ヌクレアーゼは、Cas9ニッカーゼである。Cas9ニッカーゼに存在する変異の他の例には、非限定的に、N854AおよびN863Aが含まれる。反対のDNA鎖を標的にする少なくとも2つのDNA標的指向RNAが用いられる場合には、Cas9ニッカーゼを用いて二本鎖切断を導入することができる。二重にニックを入れて誘導された二本鎖切断は、NHEJまたはHDRにより修復され得る (Ran et al., 2013, Cell, 154:1380-1389)。この遺伝子編集戦略はHDRを優先し、オフターゲットDNA部位におけるインデル変異の頻度を減少させる。Cas9ヌクレアーゼまたはニッカーゼの非限定的な例は、例えば、米国特許第8,895,308号；第8,889,418号；および第8,865,406号、ならびに米国特許出願公開第2014/0356959号、第2014/0273226号、および第2014/0186919号に記載されている。Cas9ヌクレアーゼまたはニッカーゼは、標的細胞または標的生物に対してコドン最適化することができる。
【0061】
いくつかの態様において、Casヌクレアーゼは、RuvC1およびHNHヌクレアーゼドメインの2つのサイレンシング変異（D10AおよびH840A）を含むCas9ポリペプチドであってよく、それはdCas9と称される（Jinek et al., Science, 2012, 337:816-821；Qi et al., Cell, 152(5):1173-1183）。1つの態様において、化膿性連鎖球菌由来のdCas9ポリペプチドは、D10、G12、G17、E762、H840、N854、N863、H982、H983、A984、D986、A987位、またはそれらの任意の組合せにおいて少なくとも1つの変異を含む。そのようなdCas9ポリペプチドおよびそれらの変種の説明は、例えば国際特許公開番号WO 2013/176772に提供されている。dCas9酵素は、D10、E762、H983、またはD986における変異、およびH840またはN863における変異を含み得る。場合によっては、dCas9酵素は、D10AまたはD10N変異を含み得る。同様に、dCas9酵素は、H840A、H840Y、またはH840Nを含み得る。いくつかの態様において、dCas9酵素は、D10AおよびH840A；D10AおよびH840Y；D10AおよびH840N；D10NおよびH840A；D10NおよびH840Y；またはD10NおよびH840Nの置換を含み得る。置換は、Cas9ポリペプチドを触媒的に不活性にし、かつ標的DNAに結合することができるようにする、保存的または非保存的置換であってよい。
【0062】
いくつかの態様において、Casヌクレアーゼは、低下したオフターゲット作用および頑強なオンターゲット切断を有する、高忠実度のまたは特異性が増強されたCas9ポリペプチド変種であってよい。オンターゲットの特異性が向上したCas9ポリペプチド変種の非限定的な例には、Slaymaker et al., Science, 351(6268):84-8 (2016) に記載されているSpCas9 (K855A)、SpCas9 (K810A/K1003A/R1060A)（eSpCas9(1.0) とも称される）およびSpCas9 (K848A/K1003A/R1060A)（eSpCas9(1.1) とも称される）変種、ならびに以下の変異：N497A、R661A、Q695A、およびQ926Aのうちの1つ、2つ、3つ、または4つを含む、Kleinstiver et al., Nature, 529(7587):490-5 (2016) に記載されているSpCas9変種（例えば、SpCas9-HF1は4つすべての変異を含む）が含まれる。
【0063】
上記の通り、gRNAはcrRNAおよびtracrRNAを含み得る。gRNAは、gRNA媒介性ヌクレアーゼ（例えば、Cas9またはdCas9）と安定したかつ活性のある複合体を形成するように構成することができる。gRNAは、標的遺伝子エレメントへの特異的結合を提供する結合領域を含む。表1または表2に記載の核内因子をコードするポリヌクレオチド内の領域を標的にするために使用され得る例示的なgRNAは、以下の表3に収載される。表1または表2に記載の核内因子をコードするポリヌクレオチド内の領域を標的にするために使用されるgRNAは、以下の表3より選択される配列またはその一部を含み得る。
【0064】
いくつかの態様において、標的指向ヌクレアーゼ、例えばCpf1ヌクレアーゼまたはCas9ヌクレアーゼ、およびgRNAは、リボ核タンパク質 (RNP) 複合体としてTreg細胞に導入される。いくつかの態様において、RNP複合体は、約1×105～約2×106個細胞（例えば、1×105個細胞～約5×105個細胞、約1×105個細胞～約1×106個細胞、1×105個細胞～約1.5×106個細胞、1×105個細胞～約2×106個細胞、約1×106個細胞～約1.5×106個細胞、または約1×106個細胞～約2×106個細胞）に導入され得る。いくつかの態様において、Treg細胞は、改変Treg細胞の集団を拡大するのに有効な条件下で培養される。細胞の少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、またはそれ以上のゲノムが、表1または表2に記載の1つまたは複数の核内因子の発現を阻害する遺伝子改変または異種ポリヌクレオチドを含むTreg細胞の集団もまた、本明細書において開示される。
【0065】
いくつかの態様において、RNP複合体は、エレクトロポレーションによってTreg細胞に導入される。細胞をエレクトロポレーションしてRNP複合体を導入するための方法、組成物、および装置は、当技術分野で利用可能であり、例えば、WO 2016/123578、WO/2006/001614、およびKim, J.A. et al. Biosens. Bioelectron. 23, 1353-1360 (2008) を参照されたい。細胞をエレクトロポレーションしてRNP複合体を導入するための付加的または代替的な方法、組成物、および装置には、米国特許出願公開第2006/0094095号、第2005/0064596号；または第2006/0087522号；Li, L.H. et al. Cancer Res. Treat. 1, 341-350 (2002)；米国特許第6,773,669号；第7,186,559号；第7,771,984号；第7,991,559号；第6,485,961号；第7,029,916号；ならびに米国特許出願公開第2014/0017213号；および第2012/0088842号；Geng, T. et al., J. Control Release 144, 91-100 (2010)；ならびにWang, J., et al. Lab. Chip 10, 2057-2061 (2010) に記載されているものが含まれ得る。
【0066】
いくつかの態様において、gRNAの配列またはその一部は、タンパク質をコードするポリヌクレオチド内の標的領域を相補する（例えば、完全に相補する）または実質的に相補する（例えば、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94% 95%、96%、97%、98%、もしくは99%相補する）ように設計される。いくつかの態様において、ポリヌクレオチド内の標的領域を相補し、それと結合するgRNAの部分は、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、もしくは40ヌクレオチド長、またはそれ以上、あるいはおよそそのような長さである。場合によっては、ポリヌクレオチド内の標的領域を相補し、それと結合するgRNAの部分は、約19～約21ヌクレオチド長である。場合によっては、gRNAは、ゆらぎ塩基または縮重塩基を組み込んで、標的領域と結合し得る。場合によっては、gRNAは、安定性を高めるために変更することができる。例えば、分解に対するRNAの耐性を高めるために、非天然ヌクレオチドを組み込むことができる。場合によっては、gRNAは、二次構造形成を回避するかまたは減少させるように変更または設計することができる。場合によっては、gRNAは、G-C含量を最適化するように設計することができる。場合によっては、G-C含量は約40%～約60%（例えば、40%、45%、50%、55%、60%）である。場合によっては、結合領域は、非限定的にメチル化ヌクレオチドまたはリン酸化ヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドを含有し得る。
【0067】
いくつかの態様においては、1つまたは複数のヌクレオチドの置換、欠失、または付加により、gRNAを発現に関して最適化することができる。場合によっては、コード鋳型核酸からの非効率的な転写をもたらすヌクレオチド配列を、欠失させるかまたは置換することができる。例えば、場合によっては、gRNAは、RNAポリメラーゼIIIプロモーターに機能的に連結された核酸から転写される。そのような場合、Nielsen et al., Science. 2013 Jun 28;340(6140):1577-80に記載されているような、RNAポリメラーゼIIIによる非効率的な転写を引き起こすgRNA配列を、欠失させるかまたは置換することができる。例えば、1つまたは複数の連続したウラシルを、gRNA配列から欠失させるかまたは置換することができる。場合によっては、ウラシルが対応するアデニンと水素結合している場合、gRNA配列を変更してアデニンとウラシルを交換することができる。この「A-Uフリップ」は、連続したウラシルヌクレオチドの数を減少させることにより、発現を向上させながら、gRNA分子の全体的な構造および機能を維持することができる。
【0068】
いくつかの態様においては、gRNAを安定性に関して最適化することができる。安定性は、gRNA：ヌクレアーゼ相互作用の安定性を最適化する、gRNA：ヌクレアーゼ複合体の会合を最適化する、RNA不安定化配列エレメントを除去もしくは変更する、またはRNA安定化配列エレメントを付加することによって、強化することができる。いくつかの態様において、gRNAは、gRNA媒介性ヌクレアーゼと相互作用する領域の近位に、またはそれに隣接して、5'ステム-ループ構造を含む。5'ステム-ループ構造の最適化は、gRNA：ヌクレアーゼ複合体の安定性または会合の強化をもたらし得る。場合によっては、5'ステム-ループ構造は、ステム-ループ構造のステム部分の長さを増加させることによって最適化される。
【0069】
gRNAは、当技術分野において公知の方法によって修飾することができる。場合によっては、修飾には、以下の配列エレメントのうちの1つまたは複数の付加が含まれ得るが、これらに限定されない：5'キャップ（例えば、7-メチルグアニル酸キャップ）；3'ポリアデニル化尾部：リボスイッチ配列；安定性制御配列：ヘアピン；細胞内局在配列；検出配列もしくは標識；または1つもしくは複数のタンパク質に対する結合部位。修飾にはまた、蛍光ヌクレオチドおよびメチル化ヌクレオチドのうちの1つまたは複数を含むがこれらに限定されない、非天然ヌクレオチドの導入が含まれ得る。
【0070】
宿主細胞においてgRNAを産生するための発現カセットおよびベクターもまた、本明細書に記載される。発現カセットは、gRNAをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーター（例えば、異種プロモーター）を含み得る。プロモーターは、誘導性または構成的であってよい。プロモーターは組織特異的であってよい。場合によっては、プロモーターは、U6、H1、または脾フォーカス形成ウイルス (SFFV) の長い末端反復配列プロモーターである。場合によっては、プロモーターは、ヒト伸長因子1プロモーター (EF1A) と比較して弱い哺乳動物プロモーターである。場合によっては、弱い哺乳動物プロモーターは、ユビキチンCプロモーターまたはホスホグリセリン酸キナーゼ1プロモーター (PGK) である。場合によっては、弱い哺乳動物プロモーターは、誘導因子の非存在下でのTetOnプロモーターである。場合によっては、TetOnプロモーターを利用する場合、宿主細胞はまたテトラサイクリントランス活性化因子と接触させる。いくつかの態様において、選択されるgRNAプロモーターの強度は、Cas9またはdCas9の量に比例する量のgRNAの量を発現するように選択される。発現カセットは、プラスミド、ウイルスベクター、レンチウイルスベクター等などのベクター中に存在し得る。場合によっては、発現カセットは宿主細胞中に存在する。gRNA発現カセットは、エピソーム性であってよく、または宿主細胞中に組み込まれ得る。
【0071】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ (ZFN)
「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」または「ZFN」は、FokI切断ドメインと、3つまたはそれ以上のジンクフィンガーモチーフを含むDNA認識ドメインとの融合物である。正確な配向および間隔で2つの個々のZFNがDNA中の特定の位置でヘテロ二量体化することで、DNAの二本鎖切断が起こる。本明細書に記載される方法のいくつかの態様においては、ZFNを用いて、すなわち、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを切断することにより、表1または表2に記載の1つまたは複数の核内因子の発現を阻害することができる。
「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」または「ZFN」は、FokI切断ドメインと、3つまたはそれ以上のジンクフィンガーモチーフを含むDNA認識ドメインとの融合物である。正確な配向および間隔で2つの個々のZFNがDNA中の特定の位置でヘテロ二量体化することで、DNAの二本鎖切断が起こる。本明細書に記載される方法のいくつかの態様においては、ZFNを用いて、すなわち、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを切断することにより、表1または表2に記載の1つまたは複数の核内因子の発現を阻害することができる。
【0072】
場合によっては、ZFNは、切断ドメインを各ジンクフィンガードメインのC末端に融合させる。2つの切断ドメインが二量体化してDNAを切断できるようにするために、2つの個々のZFNは、それらのC末端を一定の距離だけ離してDNAの反対鎖と結合する。場合によっては、ジンクフィンガードメインと切断ドメインとの間のリンカー配列は、各結合部位の5'末端が約5～7 bp離れていることを必要とする。本明細書に記載される方法において使用され得る例示的なZFNには、Urnov et al., Nature Reviews Genetics, 2010, 11:636-646；Gaj et al., Nat Methods, 2012, 9(8):805-7；米国特許第6,534,261号；第6,607,882号；第6,746,838号；第6,794,136号；第6,824,978号；第6,866,997号；第6,933,113号；第6,979,539号；第7,013,219号；第7,030,215号；第7,220,719号；第7,241,573号；第7,241,574号；第7,585,849号；第7,595,376号；第6,903,185号；第6,479,626号；ならびに米国特許出願公開第2003/0232410号および第2009/0203140に記載されるものが含まれるが、これらに限定されない。
【0073】
ZFNは、標的DNA中に二本鎖切断を生じ、遺伝子改変の導入を可能にするDNA切断修復をもたらし得る。DNA切断修復は、非相同末端結合 (NHEJ) または相同組換え修復 (HDR) を介して起こり得る。HDRでは、標的DNAの部位に隣接する相同アームを含むドナーDNA修復鋳型が提供され得る。
【0074】
いくつかの態様において、ZFNは、部位特異的な一本鎖DNA切断またはニックを誘導し、そのようにしてHDRをもたらす、操作されたZFNであり得るジンクフィンガーニッカーゼである。ジンクフィンガーニッカーゼの説明は、例えば、Ramirez et al., Nucl Acids Res, 2012, 40(12):5560-8；Kim et al., Genome Res, 2012, 22(7):1327-33において見られる。
【0075】
TALEN
TALENもまた、表1または表2に記載の1つまたは複数の核内因子の発現を阻害するために用いることができる。「TALEN」または「TALエフェクターヌクレアーゼ」は、DNA結合タンデムリピートの中央ドメイン、核局在化シグナル、およびC末端転写活性化ドメインを含む、操作された転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼである。場合によっては、DNA結合タンデムリピートは、33～35アミノ酸長を含み、1つまたは複数の特定のDNA塩基対を認識し得る2つの超可変アミノ酸残基を12位および13位に含む。TALENは、TALエフェクターDNA結合ドメインをDNA切断ドメインに融合させることによって作製することができる。例えば、TALEタンパク質を、野生型もしくは変異型のFokIエンドヌクレアーゼまたはFokIの触媒ドメインなどのヌクレアーゼに融合させることができる。例えば、切断の特異性または活性を改善するFokIに対するいくつかの変異が、TALENにおけるその使用のために作製されてきた。そのようなTALENを操作して、任意の所望のDNA配列に結合させることができる。
TALENもまた、表1または表2に記載の1つまたは複数の核内因子の発現を阻害するために用いることができる。「TALEN」または「TALエフェクターヌクレアーゼ」は、DNA結合タンデムリピートの中央ドメイン、核局在化シグナル、およびC末端転写活性化ドメインを含む、操作された転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼである。場合によっては、DNA結合タンデムリピートは、33～35アミノ酸長を含み、1つまたは複数の特定のDNA塩基対を認識し得る2つの超可変アミノ酸残基を12位および13位に含む。TALENは、TALエフェクターDNA結合ドメインをDNA切断ドメインに融合させることによって作製することができる。例えば、TALEタンパク質を、野生型もしくは変異型のFokIエンドヌクレアーゼまたはFokIの触媒ドメインなどのヌクレアーゼに融合させることができる。例えば、切断の特異性または活性を改善するFokIに対するいくつかの変異が、TALENにおけるその使用のために作製されてきた。そのようなTALENを操作して、任意の所望のDNA配列に結合させることができる。
【0076】
TALENを用いて、標的DNA配列中に二本鎖切断を作製し、次にそれがNHEJまたはHDRを受けることによって、遺伝子改変をもたらすことができる。場合によっては、HDRを促進するために、一本鎖のドナーDNA修復鋳型が提供される。
【0077】
TALENおよび遺伝子編集のためのそれらの使用の詳細な説明は、例えば、米国特許第8,440,431号；第8,440,432号；第8,450,471号；第8,586,363号；および第8,697,853号；Scharenberg et al., Curr Gene Ther, 2013, 13(4):291-303；Gaj et al., Nat Methods, 2012, 9(8):805-7；Beurdeley et al., Nat Commun, 2013, 4:1762；ならびにJoung and Sander, Nat Rev Mol Cell Biol, 2013, 14(1):49において見られる。
【0078】
メガヌクレアーゼ
「メガヌクレアーゼ」は、高い特異性を有し得る低頻度切断エンドヌクレアーゼまたはホーミングエンドヌクレアーゼであり、少なくとも12塩基対長、例えば12～40塩基対長または12～60塩基対長に及ぶDNA標的部位を認識する。メガヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼの少なくとも1つの触媒ドメインおよび少なくとも1つのDNA結合ドメインまたは核酸標的配列を特定するタンパク質を含む任意の融合タンパク質などの、モジュール式のDNA結合ヌクレアーゼであり得る。DNA結合ドメインは、一本鎖または二本鎖DNAを認識する少なくとも1つのモチーフを含み得る。メガヌクレアーゼは、単量体または二量体であってよい。
「メガヌクレアーゼ」は、高い特異性を有し得る低頻度切断エンドヌクレアーゼまたはホーミングエンドヌクレアーゼであり、少なくとも12塩基対長、例えば12～40塩基対長または12～60塩基対長に及ぶDNA標的部位を認識する。メガヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼの少なくとも1つの触媒ドメインおよび少なくとも1つのDNA結合ドメインまたは核酸標的配列を特定するタンパク質を含む任意の融合タンパク質などの、モジュール式のDNA結合ヌクレアーゼであり得る。DNA結合ドメインは、一本鎖または二本鎖DNAを認識する少なくとも1つのモチーフを含み得る。メガヌクレアーゼは、単量体または二量体であってよい。
【0079】
本明細書に記載される方法のいくつかの態様においては、メガヌクレアーゼを用いて、すなわち、核内因子をコードするポリヌクレオチド内の標的領域を切断することにより、表1または表2に記載の1つまたは複数の核内因子の発現を阻害することができる。いくつかの例では、メガヌクレアーゼは、天然に存在するもの（天然に見られるもの）または野生型であり、その他の例では、メガヌクレアーゼは、非天然の、人工的な、操作された、合成の、または合理的に設計されたものである。ある特定の態様において、本明細書に記載される方法において使用され得るメガヌクレアーゼには、I-CreIメガヌクレアーゼ、I-CeuIメガヌクレアーゼ、I-MsoIメガヌクレアーゼ、I-SceIメガヌクレアーゼ、これらの変種、これらの変異体、およびこれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
【0080】
有用なメガヌクレアーゼおよび遺伝子編集におけるそれらの適用の詳細な説明は、例えば、Silva et al., Curr Gene Ther, 2011, 11(1):11-27；Zaslavoskiy et al., BMC Bioinformatics, 2014, 15:191；Takeuchi et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 111(11):4061-4066、ならびに米国特許第7,842,489号；第7,897,372号；第8,021,867号；第8,163,514号；第8,133,697号；第8,021,867号；第8,119,361号；第8,119,381号；第8,124,36号；および第8,129,134号に見られる。
【0081】
RNAに基づく技術
表1または表2に記載の1つまたは複数の核内因子の発現を阻害するために、本明細書に記載される方法において、RNAに基づく様々な技術を使用することもできる。RNAに基づく技術の例には、低分子干渉RNA (siRNA)、アンチセンスRNA、マイクロRNA (miRNA)、および短鎖ヘアピンRNA (shRNA) が含まれるが、これらに限定されない。
表1または表2に記載の1つまたは複数の核内因子の発現を阻害するために、本明細書に記載される方法において、RNAに基づく様々な技術を使用することもできる。RNAに基づく技術の例には、低分子干渉RNA (siRNA)、アンチセンスRNA、マイクロRNA (miRNA)、および短鎖ヘアピンRNA (shRNA) が含まれるが、これらに限定されない。
【0082】
RNAに基づく技術は、転写因子をコードする配列またはその一部を標的にするために、siRNA、アンチセンスRNA、miRNA、またはshRNAを使用し得る。いくつかの態様においては、転写因子によって調節される1つまたは複数の遺伝子もまた、siRNA、アンチセンスRNA、miRNA、またはshRNAによって標的にされ得る。siRNA、アンチセンスRNA、miRNA、またはshRNAは、少なくとも10個、少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、少なくとも90個、または少なくとも100個の連続したヌクレオチドを含む配列を標的にし得る。
【0083】
siRNAは、ショートヘアピンRNA (shRNA) から産生され得る。shRNAは、ヘアピンターンを有する人工的なRNA分子であり、それを用いて、それが細胞内で産生するsiRNAを介して標的遺伝子の発現をサイレンシングすることができる。例えば、Fire et. al., Nature 391:806-811, 1998；Elbashir et al., Nature 411:494-498, 2001；Chakraborty et al., Mol Ther Nucleic Acids 8:132-143, 2017；およびBouard et al., Br. J. Pharmacol. 157:153-165, 2009を参照されたい。細胞におけるshRNAの発現は典型的には、プラスミドの送達によって、またはウイルスベクターもしくは細菌ベクターを介して達成される。適切な細菌ベクターには、アデノ随伴ウイルス (AAV)、アデノウイルス、およびレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されない。ベクターが宿主ゲノムに組み込まれた後、次いでshRNAがポリメラーゼIIまたはポリメラーゼIII（使用されるプロモーターに依存する）によって核内で転写される。その結果生じたプレshRNAは、核から運び出され、次いでダイサーと称されるタンパク質によってプロセシングされ、RNA誘導サイレンシング複合体 (RISC) に負荷される。センス鎖はRISCによって分解され、アンチセンス鎖は、相補的配列を有するmRNAにRISCを誘導する。次いで、RISC中のAgo2と称されるタンパク質がmRNAを切断するか、場合によってはmRNAの翻訳を抑制し、その結果、mRNAが破壊され、最終的にmRNAによってコードされるタンパク質が減少する。したがって、shRNAは標的化遺伝子のサイレンシングをもたらす。
【0084】
shRNAまたはsiRNAは、ベクター中にコードされ得る。いくつかの態様において、ベクターは、例えば、プロモーター（例えば、誘導性プロモーターまたは組織特異的プロモーター）、エンハンサー、および転写ターミネーターを含む、当技術分野で公知の適切な発現制御エレメントをさらに含む。
【0085】
IV. 処置の方法
本明細書に記載される方法のいずれかを用いて、ヒト対象における、またはヒト対象から採取されたTreg細胞を改変することができる。本明細書に記載される方法および組成物のいずれかを用いて、疾患（例えば、対象におけるがん、自己免疫疾患、感染症、移植拒絶、移植片対宿主病、またはその他の炎症性障害）を処置または予防するために、ヒト対象から採取されたTreg細胞を改変することができる。
本明細書に記載される方法のいずれかを用いて、ヒト対象における、またはヒト対象から採取されたTreg細胞を改変することができる。本明細書に記載される方法および組成物のいずれかを用いて、疾患（例えば、対象におけるがん、自己免疫疾患、感染症、移植拒絶、移植片対宿主病、またはその他の炎症性障害）を処置または予防するために、ヒト対象から採取されたTreg細胞を改変することができる。
【0086】
対象において自己免疫障害を処置する方法であって、表1に記載の核内因子の発現を阻害する遺伝子改変もしくは異種ポリヌクレオチド、および／または表2に記載の核内因子をコードする異種ポリヌクレオチドを含むTreg細胞の集団を、自己免疫障害を有する対象に投与する段階を含む方法が、本明細書において提供される。
【0087】
対象においてがんを処置する方法であって、表2に記載の核内因子の発現を阻害する遺伝子改変もしくは異種ポリヌクレオチド、および／または表1に記載の核内因子をコードする異種ポリヌクレオチドを含むTreg細胞の集団を、がんを有する対象に投与する段階を含む方法もまた、提供される。
【0088】
ヒト対象においてがんを処置する方法であって、a) 対象からTreg細胞を採取する段階；b) Treg細胞の安定性を低下させるために、本明細書において提供される方法のいずれかを用いてTreg細胞を改変する段階；および c) 改変されたTreg細胞を対象に投与する段階を含む方法が、本明細書において提供され、この場合、ヒト対象はがんを有する。ヒト対象において自己免疫疾患を処置する方法であって、a) 対象からTreg細胞を採取する段階；b) Treg細胞の安定性を高めるために、本明細書において提供される方法のいずれかを用いてTreg細胞を改変する段階；および c) 改変されたTreg細胞を対象に投与する段階を含む方法もまた、本明細書において提供され、この場合、ヒト対象は自己免疫疾患を有する。
【0089】
いくつかの態様においては、がん対象から採取されたTreg細胞をエクスビボで拡大することができる。対象のがんの特徴により、目的に合った一連の細胞改変（すなわち、表1および／または表2からのどの核内因子を標的にすべきか）が決定され得、これらの改変は、本明細書に記載される方法のいずれかを用いてTreg細胞に適用することができる。次いで、改変されたTreg細胞を対象に再導入することができる。この戦略は、対象の天然のがん特異的T細胞のレパートリーを活用し、その機能を強化することで、変異原性がん細胞を迅速に排除するための多様な武器を提供する。同様の戦略は、自己免疫疾患の処置にも適用できる可能性があり、その場合、改変されたTreg細胞は改善された安定性を有することになる。
【0090】
他の事例では、対象におけるTreg細胞を、インビボ改変のために標的にすることができる。例えば、米国特許第9,737,604号、およびZhang et al. 「Lipid nanoparticle-mediated efficient delivery of CRISPR/Cas9 for tumor therapy,」 NPG Asia Materials Volume 9, page e441 (2017) を参照されたい。
【0091】
開示された方法および組成物に使用され得る、それらと併用して使用され得る、それらの調製において使用され得る、またはそれらの産物である、材料、組成物、および構成要素が開示される。これらおよびその他の材料が本明細書において開示されており、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループ等が開示される場合、これらの化合物の各種個別のおよび集合的な組み合わせおよび順列の具体的な言及が明確に開示されていない可能性があるが、各々が本明細書において具体的に企図され記載されていることが理解される。例えば、ある方法が開示および議論され、その方法に含まれる1つまたは複数の分子に対してなされ得るいくつかの改変が議論される場合、その方法および可能な改変のありとあらゆる組み合わせおよび順列は、そうでないと具体的に示されない限り、具体的に企図される。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせもまた、具体的に企図され開示される。この概念は、開示された組成物を使用する方法における段階を含むがこれに限定されない、本開示のすべての局面に適用される。したがって、実施できる種々の追加的段階が存在する場合、これらの追加的段階の各々が、開示された方法の任意の特定の方法段階または方法段階の組み合わせと共に実施できること、およびそのような組み合わせまたは組み合わせのサブセットの各々が具体的に企図され、開示されていると見なされるべきであることが理解される。
【0092】
本明細書において引用されている出版物およびそれらが引用されている材料は、全体として参照により本明細書に具体的に組み入れられる。
【実施例0093】
以下の実施例は、限定の目的ではなく、単に例証の目的で提供される。当業者は、本質的に同じまたは同様の結果をもたらすために変更または修正できる、重要でない種々のパラメータを容易に認識するであろう。
【0094】
マウス
以前に記載されているように (Bailey-Bucktrout et al., 「Self-antigen-driven activation induces instability of regulatory T cells during an inflammatory autoimmune response,」 Immunity. 39, 949-62 (2013))、B6 Foxp3-GFP-Creマウス (Zhou et al., 「Selective miRNA disruption in T reg cells leads to uncontrolled autoimmunity,」 J Exp Med. 205, 1983-91 (2008)) をB6 Rosa26-RFPレポーターマウス (Luche et al., 「Faithful activation of an extra-bright red fluorescent protein in “knock-in” Cre-reporter mice ideally suited for lineage tracing studies,」 Eur. J. Immunol. 37, 43-53 (2007)) と交配させて、Foxp3運命レポーターマウスを作製した（図1）。次いで、これらのマウスをB6構成的Cas9発現マウス (Platt et al., 「CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling,」 Cell. 159, 440-455 (2014)) と交配させて、CRISPRスクリーンに用いられるFoxp3-GFP-Cre/Rosa26-RFP/Cas9マウスを作製した。アレイ化検証実験には、Jackson Laboratoriesから入手したB6 Foxp3-EGFPノックインマウス（株番号006772）を使用した。マウスはすべて、施設内動物管理使用委員会 (Institutional Animal Care and Use Committee) および実験動物資源センター (Laboratory Animal Resource Center) により確立された指針に従って、UCSF特定病原体除去動物施設で飼育した。
以前に記載されているように (Bailey-Bucktrout et al., 「Self-antigen-driven activation induces instability of regulatory T cells during an inflammatory autoimmune response,」 Immunity. 39, 949-62 (2013))、B6 Foxp3-GFP-Creマウス (Zhou et al., 「Selective miRNA disruption in T reg cells leads to uncontrolled autoimmunity,」 J Exp Med. 205, 1983-91 (2008)) をB6 Rosa26-RFPレポーターマウス (Luche et al., 「Faithful activation of an extra-bright red fluorescent protein in “knock-in” Cre-reporter mice ideally suited for lineage tracing studies,」 Eur. J. Immunol. 37, 43-53 (2007)) と交配させて、Foxp3運命レポーターマウスを作製した（図1）。次いで、これらのマウスをB6構成的Cas9発現マウス (Platt et al., 「CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling,」 Cell. 159, 440-455 (2014)) と交配させて、CRISPRスクリーンに用いられるFoxp3-GFP-Cre/Rosa26-RFP/Cas9マウスを作製した。アレイ化検証実験には、Jackson Laboratoriesから入手したB6 Foxp3-EGFPノックインマウス（株番号006772）を使用した。マウスはすべて、施設内動物管理使用委員会 (Institutional Animal Care and Use Committee) および実験動物資源センター (Laboratory Animal Resource Center) により確立された指針に従って、UCSF特定病原体除去動物施設で飼育した。
【0095】
初代マウスTregの単離および培養
マウスから脾臓および末梢リンパ節を摘出し、2% FBSおよび1 mM EDTAを含む1×PBS中で解離した。次いで、この混合物を70μmフィルターに通した。CD4+陰性選択キット（StemCell Technologies、Cat# 19752）を用いてCD4+ T細胞を単離した後、蛍光活性化細胞選別を行った。スクリーン前の選別では、Tregは、リンパ球、生細胞、CD4+、CD62L+、RFP+、Foxp3-GFP+細胞にゲート設定した。アレイ化検証実験では、Tregは、リンパ球、生細胞、CD4+、Foxp3-GFP+細胞にゲート設定した。選別されたTregは、24ウェルプレートにおいて、完全DMEM、10% FBS、1% pen/strep＋2000U hIL-2中で100万個細胞／mLで培養した。3:1のビーズ対細胞の比率でCD3/CD28マウスTアクチベーターDynabeads（Thermo Fisher、Cat# 11456D）を用いて、Tregを48時間刺激した。2～3日ごとに細胞を分割し、培地を更新した。
マウスから脾臓および末梢リンパ節を摘出し、2% FBSおよび1 mM EDTAを含む1×PBS中で解離した。次いで、この混合物を70μmフィルターに通した。CD4+陰性選択キット（StemCell Technologies、Cat# 19752）を用いてCD4+ T細胞を単離した後、蛍光活性化細胞選別を行った。スクリーン前の選別では、Tregは、リンパ球、生細胞、CD4+、CD62L+、RFP+、Foxp3-GFP+細胞にゲート設定した。アレイ化検証実験では、Tregは、リンパ球、生細胞、CD4+、Foxp3-GFP+細胞にゲート設定した。選別されたTregは、24ウェルプレートにおいて、完全DMEM、10% FBS、1% pen/strep＋2000U hIL-2中で100万個細胞／mLで培養した。3:1のビーズ対細胞の比率でCD3/CD28マウスTアクチベーターDynabeads（Thermo Fisher、Cat# 11456D）を用いて、Tregを48時間刺激した。2～3日ごとに細胞を分割し、培地を更新した。
【0096】
プール化sgRNAライブラリーの設計および構築
標的指向ライブラリーのクローニングについては、以前に記載されたカスタムsgRNAライブラリークローニングプロトコールに従った (Joung et al., 「Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening,」 Nat Protocols. 12, 828-863 (2017))。MSCV-U6-sgRNA-IRES-Thy1.1骨格を利用した。このプラスミドをライブラリーのクローニング用に最適化するために、まずsgRNAを、隣接BsgI切断部位を有するlentiGuide-Puroプラスミド（Addgene、プラスミド#52963）由来の1.9kbスタッファーと置換した。このスタッファーをBsgI制限酵素（NEB、Cat# R0559）を用いて切り出し、直鎖状骨格をゲル精製した（Qiagen、Cat# 28706）。「核酸結合転写因子」、「タンパク質結合転写因子」、「クロマチン構築への関与」、および「エピジェネティック調節への関与」の遺伝子オントロジーと一致するすべての遺伝子を含むように、標的指向ライブラリーを設計した。次いで、Stubbingtonら (Stubbington et al., 「An atlas of mouse CD4+ T cell transcriptomes,」 Biol Direct. 10. 14 (2015)) によって定義された、任意のマウスCD4 T細胞サブセットにわたって最も高い発現レベルを有するものに基づいて、遺伝子を選択した。全体で、遺伝子当たり4つのガイドを伴う493個の標的、および28個の非標的対照を含めた。ガイドは、Brie sgRNAライブラリーからサブセット化し (Doench et al., 「Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9,」 Nature biotechnology. 34(2), 184-191 (2016))、プール化オリゴライブラリーは、ベクター骨格に一致するようにTwist Bioscienceに注文した。オリゴをPCR増幅し、Joungらにより記載されているようにギブソン・アッセンブリーによって改変MSCV骨格にクローニングした。製造業者のプロトコールに従ってEnduraエレクトロコンピテントセルを用いて（Endura、Cat #60242-1）、ライブラリーを増幅した。
標的指向ライブラリーのクローニングについては、以前に記載されたカスタムsgRNAライブラリークローニングプロトコールに従った (Joung et al., 「Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening,」 Nat Protocols. 12, 828-863 (2017))。MSCV-U6-sgRNA-IRES-Thy1.1骨格を利用した。このプラスミドをライブラリーのクローニング用に最適化するために、まずsgRNAを、隣接BsgI切断部位を有するlentiGuide-Puroプラスミド（Addgene、プラスミド#52963）由来の1.9kbスタッファーと置換した。このスタッファーをBsgI制限酵素（NEB、Cat# R0559）を用いて切り出し、直鎖状骨格をゲル精製した（Qiagen、Cat# 28706）。「核酸結合転写因子」、「タンパク質結合転写因子」、「クロマチン構築への関与」、および「エピジェネティック調節への関与」の遺伝子オントロジーと一致するすべての遺伝子を含むように、標的指向ライブラリーを設計した。次いで、Stubbingtonら (Stubbington et al., 「An atlas of mouse CD4+ T cell transcriptomes,」 Biol Direct. 10. 14 (2015)) によって定義された、任意のマウスCD4 T細胞サブセットにわたって最も高い発現レベルを有するものに基づいて、遺伝子を選択した。全体で、遺伝子当たり4つのガイドを伴う493個の標的、および28個の非標的対照を含めた。ガイドは、Brie sgRNAライブラリーからサブセット化し (Doench et al., 「Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9,」 Nature biotechnology. 34(2), 184-191 (2016))、プール化オリゴライブラリーは、ベクター骨格に一致するようにTwist Bioscienceに注文した。オリゴをPCR増幅し、Joungらにより記載されているようにギブソン・アッセンブリーによって改変MSCV骨格にクローニングした。製造業者のプロトコールに従ってEnduraエレクトロコンピテントセルを用いて（Endura、Cat #60242-1）、ライブラリーを増幅した。
【0097】
レトロウイルスの産生
トランスフェクションの16時間前に、Platinum-E (Plat-E) レトロウイルスパッケージング細胞（Cell Biolabs, Inc.、Cat# RV-101）を15 cmポリ-L-リジンコーティングディッシュに1000万個細胞で播種し、完全DMEM、10% FBS、1% pen/strep、1μg/mLピューロマイシン、および10μg/mLブラストサイジン中で培養した。トランスフェクションの直前に、培地を抗生物質不含の完全DMEM、10% FBSと交換した。製造業者のプロトコールに従ってTransIT-293トランスフェクション試薬を用いて（Mirus、Cat# MIR 2700）、細胞にsgRNA導入プラスミド (MSCV-U6-sgRNA-IRES-Thy1.1) をトランスフェクトした。翌朝、培地を完全DMEM、10% FBS、1% pen/strepと交換した。トランスフェクションの48時間後にウイルス上清を収集し、0.45μmのポリエーテルスルホン滅菌シリンジフィルター（Whatman、Cat# 6780-2504）に通してろ過して、細胞残屑を除去した。ウイルス上清を一定分量に分割し、使用時まで-80℃で貯蔵した。
トランスフェクションの16時間前に、Platinum-E (Plat-E) レトロウイルスパッケージング細胞（Cell Biolabs, Inc.、Cat# RV-101）を15 cmポリ-L-リジンコーティングディッシュに1000万個細胞で播種し、完全DMEM、10% FBS、1% pen/strep、1μg/mLピューロマイシン、および10μg/mLブラストサイジン中で培養した。トランスフェクションの直前に、培地を抗生物質不含の完全DMEM、10% FBSと交換した。製造業者のプロトコールに従ってTransIT-293トランスフェクション試薬を用いて（Mirus、Cat# MIR 2700）、細胞にsgRNA導入プラスミド (MSCV-U6-sgRNA-IRES-Thy1.1) をトランスフェクトした。翌朝、培地を完全DMEM、10% FBS、1% pen/strepと交換した。トランスフェクションの48時間後にウイルス上清を収集し、0.45μmのポリエーテルスルホン滅菌シリンジフィルター（Whatman、Cat# 6780-2504）に通してろ過して、細胞残屑を除去した。ウイルス上清を一定分量に分割し、使用時まで-80℃で貯蔵した。
【0098】
レトロウイルスの導入
Tregを上記のように48～60時間刺激した。細胞を計数し、15μg/mLのRetroNectin（Takara、Cat# T100A）で室温で3時間コーティングし、続いて1×PBSで洗浄した6ウェルプレートの各ウェルに、2×hIL-2を含む1 mLの培地中で300万個細胞で播種した。レトロウイルスを1:1のv/v比で添加し (1 mL)、プレートを2000g、30℃で1時間遠心分離し、37℃のインキュベーター内に一晩置いた。翌日、プレートから1:1のレトロウイルスと培地の混合物の半量 (1 mL) を除去し、1 mLの新鮮なレトロウイルスを添加した。プレートを直ちに2000g、30℃で1時間遠心分離した。2回目のスピンフェクションの後、細胞をペレット化し、洗浄し、新鮮な培地中で培養した。
Tregを上記のように48～60時間刺激した。細胞を計数し、15μg/mLのRetroNectin（Takara、Cat# T100A）で室温で3時間コーティングし、続いて1×PBSで洗浄した6ウェルプレートの各ウェルに、2×hIL-2を含む1 mLの培地中で300万個細胞で播種した。レトロウイルスを1:1のv/v比で添加し (1 mL)、プレートを2000g、30℃で1時間遠心分離し、37℃のインキュベーター内に一晩置いた。翌日、プレートから1:1のレトロウイルスと培地の混合物の半量 (1 mL) を除去し、1 mLの新鮮なレトロウイルスを添加した。プレートを直ちに2000g、30℃で1時間遠心分離した。2回目のスピンフェクションの後、細胞をペレット化し、洗浄し、新鮮な培地中で培養した。
【0099】
Foxp3細胞内染色およびスクリーン後の細胞収集
2回目の形質導入の8日後にTregをその培養容器から収集し、300gで5分間遠心分離した。細胞をまず、1×PBSで1:1,000に希釈した生存率色素で4℃で20分間染色し、次いでEasySep緩衝液（1×PBS、2% FBS、1 mM EDTA）で洗浄した。次いで、細胞を適切な表面染色抗体カクテルに再懸濁し、4℃で30分間インキュベートした後、EasySep緩衝液で洗浄した。次いで細胞を固定し、透過処理し、製造業者の説明書に従ってFoxp3転写因子染色緩衝液セット（eBioscience、Cat# 00-5523-00）を用いて転写因子について染色した。CRISPRスクリーンでは、リンパ球、生細胞、CD4+にゲート設定し、かつ内因性Foxp3細胞内染色によるFoxp3発現細胞の上位40%（Foxp3高）およびFoxp3発現細胞の下位40%（Foxp3低）にゲート設定することにより、蛍光活性化細胞選別を用いてFoxp3高およびFoxp3低の集団を単離した。sgRNA当たり少なくとも1,000個の細胞のライブラリーカバレッジを維持するために、選別された両方の集団について200万個超の細胞を収集した。
2回目の形質導入の8日後にTregをその培養容器から収集し、300gで5分間遠心分離した。細胞をまず、1×PBSで1:1,000に希釈した生存率色素で4℃で20分間染色し、次いでEasySep緩衝液（1×PBS、2% FBS、1 mM EDTA）で洗浄した。次いで、細胞を適切な表面染色抗体カクテルに再懸濁し、4℃で30分間インキュベートした後、EasySep緩衝液で洗浄した。次いで細胞を固定し、透過処理し、製造業者の説明書に従ってFoxp3転写因子染色緩衝液セット（eBioscience、Cat# 00-5523-00）を用いて転写因子について染色した。CRISPRスクリーンでは、リンパ球、生細胞、CD4+にゲート設定し、かつ内因性Foxp3細胞内染色によるFoxp3発現細胞の上位40%（Foxp3高）およびFoxp3発現細胞の下位40%（Foxp3低）にゲート設定することにより、蛍光活性化細胞選別を用いてFoxp3高およびFoxp3低の集団を単離した。sgRNA当たり少なくとも1,000個の細胞のライブラリーカバレッジを維持するために、選別された両方の集団について200万個超の細胞を収集した。
【0100】
固定細胞からのゲノムDNAの単離
細胞を選別および収集した後、固定細胞に特有のプロトコールを用いてゲノムDNA (gDNA) を単離した。細胞ペレットを、1:25 v/vの5M NaClを含む細胞溶解緩衝液（0.5% SDS、50 mM Tris、pH 8、10 mM EDTA）に再懸濁して架橋を反転させ、66℃で一晩インキュベートした。RNase A (10 mg/mL) を1:50 v/vで添加し、37℃で1時間インキュベートした。プロテイナーゼK (20 mg/mL) を1:50 v/vで添加し、45℃で1時間インキュベートした。フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール (25:24:1) を1：1 v/vで試料に添加し、phase lock gel lightチューブ（QuantaBio、Cat# 2302820）に移し、激しく反転させ、20,000gで5分間遠心分離した。次いで、水相を清潔なチューブに移し、1:10 v/vのNaAc、1μlのGeneElute-LPA（Sigma、Cat#56575）、および2.5:1 v/vのイソプロパノールを添加した。試料をボルテックスし、固形に凍結するまで-80℃でインキュベートした。次いで融解し、20,000gで30分間遠心分離した。細胞ペレットを500μlの75% EtOHで洗浄し、穏やかに反転させて20,000gで5分間遠心分離し、吸引し、乾燥させ、20μl TE緩衝液に再懸濁した。
細胞を選別および収集した後、固定細胞に特有のプロトコールを用いてゲノムDNA (gDNA) を単離した。細胞ペレットを、1:25 v/vの5M NaClを含む細胞溶解緩衝液（0.5% SDS、50 mM Tris、pH 8、10 mM EDTA）に再懸濁して架橋を反転させ、66℃で一晩インキュベートした。RNase A (10 mg/mL) を1:50 v/vで添加し、37℃で1時間インキュベートした。プロテイナーゼK (20 mg/mL) を1:50 v/vで添加し、45℃で1時間インキュベートした。フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール (25:24:1) を1：1 v/vで試料に添加し、phase lock gel lightチューブ（QuantaBio、Cat# 2302820）に移し、激しく反転させ、20,000gで5分間遠心分離した。次いで、水相を清潔なチューブに移し、1:10 v/vのNaAc、1μlのGeneElute-LPA（Sigma、Cat#56575）、および2.5:1 v/vのイソプロパノールを添加した。試料をボルテックスし、固形に凍結するまで-80℃でインキュベートした。次いで融解し、20,000gで30分間遠心分離した。細胞ペレットを500μlの75% EtOHで洗浄し、穏やかに反転させて20,000gで5分間遠心分離し、吸引し、乾燥させ、20μl TE緩衝液に再懸濁した。
【0101】
次世代シーケンシング用のゲノムDNAの調製
細胞表面サブライブラリーのためのsgRNAの増幅およびバーコーディングは、いくらかの修正を加えて以前に記載されたように行った（Gilbert et al., 「Genome scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation,」 Cell. 159, 647-661 (2014))。簡潔に説明すると、gDNAの単離後、一段階PCRを用いてsgRNAを増幅し、かつTruSeq Single Indexでバーコード化した。Foxp3低集団にはTruSeq Adaptor Index 12 (CTTGTA) を使用し、Foxp3高集団にはTrueSeq Adaptor Index 14 (AGTTCC) を使用した。各PCR反応物は、50μLのNEBNext Ultra II Q5 Master Mix (NEB #M0544)、1μgのgDNA、それぞれ2.5μLの10μMフォワードプライマーおよびリバースプライマー、ならびに合計100μLとするための水からなった。PCRサイクリング条件は、98℃で3分、続いて98℃で10秒、62℃で10秒、72℃で25秒の26サイクル；および72℃での最後の2分間の伸長であった。PCRの後、製造業者のプロトコールに従ってAgencourt AMPure XPSPRIビーズ（Beckman Coulter、cat #A63880）を用いて試料を精製し、Qubit ssDNA高感度アッセイキット（Thermo Fisher Scientific、cat #Q32854）を用いて定量化し、次いで2100バイオアナライザー装置で解析した。次いで、カスタム配列決定プライマーを用いて、試料をIllumina MiniSeqで配列決定した。
細胞表面サブライブラリーのためのsgRNAの増幅およびバーコーディングは、いくらかの修正を加えて以前に記載されたように行った（Gilbert et al., 「Genome scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation,」 Cell. 159, 647-661 (2014))。簡潔に説明すると、gDNAの単離後、一段階PCRを用いてsgRNAを増幅し、かつTruSeq Single Indexでバーコード化した。Foxp3低集団にはTruSeq Adaptor Index 12 (CTTGTA) を使用し、Foxp3高集団にはTrueSeq Adaptor Index 14 (AGTTCC) を使用した。各PCR反応物は、50μLのNEBNext Ultra II Q5 Master Mix (NEB #M0544)、1μgのgDNA、それぞれ2.5μLの10μMフォワードプライマーおよびリバースプライマー、ならびに合計100μLとするための水からなった。PCRサイクリング条件は、98℃で3分、続いて98℃で10秒、62℃で10秒、72℃で25秒の26サイクル；および72℃での最後の2分間の伸長であった。PCRの後、製造業者のプロトコールに従ってAgencourt AMPure XPSPRIビーズ（Beckman Coulter、cat #A63880）を用いて試料を精製し、Qubit ssDNA高感度アッセイキット（Thermo Fisher Scientific、cat #Q32854）を用いて定量化し、次いで2100バイオアナライザー装置で解析した。次いで、カスタム配列決定プライマーを用いて、試料をIllumina MiniSeqで配列決定した。
【0102】
プール化CRISPRスクリーンのパイプライン
5～7ヶ月齢の雄性Foxp3-GFP-Cre/Rosa26-RFP/Cas9マウス3匹の脾臓およびリンパ節から初代Tregを単離し、共にプールし、60時間刺激した。次いで、細胞にsgRNAライブラリーをレトロウイルスによって形質導入し、sgRNA当たり少なくとも細胞1,000個のライブラリーカバレッジを維持し続けながら、100万個細胞／mlの密度で培養した。2回目の形質導入の8日後に、細胞内染色によって定義されたFoxp3発現に基づいて細胞を選別した。各集団からゲノムDNAを回収し、次いでsgRNAコード領域をPCRによって増幅し、カスタム配列決定プライマーを用いてIllumina MiniSeqで配列決定した。このデータから、各集団（Foxp3高およびFoxp3低）において、それぞれ異なるsgRNAを発現している細胞の頻度を定量化し、Foxp3安定化（Foxp3高において濃縮）またはFoxp3不安定化（Foxp3低において濃縮）と定義したsgRNAの表現型を定量化した（図2）。
5～7ヶ月齢の雄性Foxp3-GFP-Cre/Rosa26-RFP/Cas9マウス3匹の脾臓およびリンパ節から初代Tregを単離し、共にプールし、60時間刺激した。次いで、細胞にsgRNAライブラリーをレトロウイルスによって形質導入し、sgRNA当たり少なくとも細胞1,000個のライブラリーカバレッジを維持し続けながら、100万個細胞／mlの密度で培養した。2回目の形質導入の8日後に、細胞内染色によって定義されたFoxp3発現に基づいて細胞を選別した。各集団からゲノムDNAを回収し、次いでsgRNAコード領域をPCRによって増幅し、カスタム配列決定プライマーを用いてIllumina MiniSeqで配列決定した。このデータから、各集団（Foxp3高およびFoxp3低）において、それぞれ異なるsgRNAを発現している細胞の頻度を定量化し、Foxp3安定化（Foxp3高において濃縮）またはFoxp3不安定化（Foxp3低において濃縮）と定義したsgRNAの表現型を定量化した（図2）。
【0103】
プール化CRISPRスクリーンの解析
解析は、以前に記載されたように行った (Shifrut et al., 「Genome-wide CRISPR Screens in Primary Human T Cells Reveal Key Regulators of Immune Function. Biorxiv. (2018)doi:https://doi.org/10.1101/384776))。スクリーンからのヒットを同定するために、MAGeCKソフトウェアを使用して、ガイド濃縮について定量化し調べた (Li et al., 「MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens,」 Genome Biol.15, 554 (2014)）。生のfastqファイルに対してMAGeCK「計数」モジュールを使用することにより、ガイドの存在量をまず決定した。標的指向ライブラリーでは、MAGeCKによって一定の5'トリムが自動的に検出された。頑強なガイドおよび遺伝子レベルの濃縮を調べるために、MAGeCK「試験」モジュールをデフォルトのパラメータで使用した。この段階は、様々なリード深度を考慮するための中央値比の正規化を含む。非標的対照ガイドを用いて正規化のためのサイズファクターを推定し、また帰無分布の平均分散モデルを構築し、これは有意なガイド濃縮を見出すために使用される。MAGeCKは各方向（すなわち、正および負)のガイドレベル濃縮スコアを作成し、次いでこれをα-ロバストランクアグリゲーション (RRA) に使用して遺伝子レベルスコアを得た。各遺伝子のp値は、ガイドの割り当てを無作為化する並べ替え検定により決定し、Benjamini-Hochberg法により偽発見率について調整してある。Log2変化倍率 (LFC) もまた各遺伝子について算出し、これは全体を通して遺伝子標的当たりの全ガイドの中央値LFCとして定義される。表示されている場合には、LFCを平均値0および標準偏差1を有するように正規化して、LFC Zスコアを得た。
解析は、以前に記載されたように行った (Shifrut et al., 「Genome-wide CRISPR Screens in Primary Human T Cells Reveal Key Regulators of Immune Function. Biorxiv. (2018)doi:https://doi.org/10.1101/384776))。スクリーンからのヒットを同定するために、MAGeCKソフトウェアを使用して、ガイド濃縮について定量化し調べた (Li et al., 「MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens,」 Genome Biol.15, 554 (2014)）。生のfastqファイルに対してMAGeCK「計数」モジュールを使用することにより、ガイドの存在量をまず決定した。標的指向ライブラリーでは、MAGeCKによって一定の5'トリムが自動的に検出された。頑強なガイドおよび遺伝子レベルの濃縮を調べるために、MAGeCK「試験」モジュールをデフォルトのパラメータで使用した。この段階は、様々なリード深度を考慮するための中央値比の正規化を含む。非標的対照ガイドを用いて正規化のためのサイズファクターを推定し、また帰無分布の平均分散モデルを構築し、これは有意なガイド濃縮を見出すために使用される。MAGeCKは各方向（すなわち、正および負)のガイドレベル濃縮スコアを作成し、次いでこれをα-ロバストランクアグリゲーション (RRA) に使用して遺伝子レベルスコアを得た。各遺伝子のp値は、ガイドの割り当てを無作為化する並べ替え検定により決定し、Benjamini-Hochberg法により偽発見率について調整してある。Log2変化倍率 (LFC) もまた各遺伝子について算出し、これは全体を通して遺伝子標的当たりの全ガイドの中央値LFCとして定義される。表示されている場合には、LFCを平均値0および標準偏差1を有するように正規化して、LFC Zスコアを得た。
【0104】
アレイ化Cas9リボ核タンパク質 (RNP) の調製およびエレクトロポレーション
RNPは、以前に記載されているように、2成分のgRNAをCas9と複合体形成させることにより生成した (Schumann et al., 「Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins,」 Proc. Natl Acad. Sci.USA. 112, 10437-10442 (2015))。簡潔に説明すると、crRNAおよびtracrRNAを化学合成し (IDT)、組換えCas9-NLSを産生させ精製した (QB3 Macrolab)。凍結乾燥RNAをヌクレアーゼ不含Duplex緩衝液（IDT、Cat# 1072570）に160μMの濃度で再懸濁し、一定分割量で-80℃で貯蔵した。crRNAおよびtracrRNAの一定分割量を融解し、容積により1:1で混合し、37℃で30分間インキュベートすることによりアニールさせて80μM gRNA溶液を形成した。組換えCas9は、20 mM HEPES-KOH、pH7.5、150 mM KCl、10%グリセロール、1 mM DTT中に40μMで貯蔵し、次いで80μM gRNAと容積により1:1（2:1のgRNA対Cas9モル比）で37℃で15分間混合して、20μMのRNPを形成した。RNPは、複合体形成後、直ちにエレクトロポレーションした。最初の刺激の3日後に、RNPをエレクトロポレーションした。Tregをその培養容器から収集し、300gで5分間遠心分離し、吸引し、200,000個細胞当たり20μlの緩衝液を用いてLonzaエレクトロポレーション緩衝液P3に再懸濁した。パルスコードEO148でLonza 4D 96ウェルエレクトロポレーションシステムを用いて、ウェル当たり200,000個のTregをエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後直ちに、予め加温した80μLの培地を各ウェルに添加し、細胞を37℃で15分間インキュベートした。次いで細胞を丸底96ウェル組織培養プレートに移し、完全DMEM、10% FBS、1% pen/strep＋2000U hIL-2中で、200μlの培地中に200,000個細胞／ウェルで培養した。
RNPは、以前に記載されているように、2成分のgRNAをCas9と複合体形成させることにより生成した (Schumann et al., 「Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins,」 Proc. Natl Acad. Sci.USA. 112, 10437-10442 (2015))。簡潔に説明すると、crRNAおよびtracrRNAを化学合成し (IDT)、組換えCas9-NLSを産生させ精製した (QB3 Macrolab)。凍結乾燥RNAをヌクレアーゼ不含Duplex緩衝液（IDT、Cat# 1072570）に160μMの濃度で再懸濁し、一定分割量で-80℃で貯蔵した。crRNAおよびtracrRNAの一定分割量を融解し、容積により1:1で混合し、37℃で30分間インキュベートすることによりアニールさせて80μM gRNA溶液を形成した。組換えCas9は、20 mM HEPES-KOH、pH7.5、150 mM KCl、10%グリセロール、1 mM DTT中に40μMで貯蔵し、次いで80μM gRNAと容積により1:1（2:1のgRNA対Cas9モル比）で37℃で15分間混合して、20μMのRNPを形成した。RNPは、複合体形成後、直ちにエレクトロポレーションした。最初の刺激の3日後に、RNPをエレクトロポレーションした。Tregをその培養容器から収集し、300gで5分間遠心分離し、吸引し、200,000個細胞当たり20μlの緩衝液を用いてLonzaエレクトロポレーション緩衝液P3に再懸濁した。パルスコードEO148でLonza 4D 96ウェルエレクトロポレーションシステムを用いて、ウェル当たり200,000個のTregをエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後直ちに、予め加温した80μLの培地を各ウェルに添加し、細胞を37℃で15分間インキュベートした。次いで細胞を丸底96ウェル組織培養プレートに移し、完全DMEM、10% FBS、1% pen/strep＋2000U hIL-2中で、200μlの培地中に200,000個細胞／ウェルで培養した。
【0105】
ヒトTreg細胞の単離および培養
すべての実験のための初代ヒトTreg細胞は、UCSFヒト研究委員会 (UCSF Committee on Human Research) (CHR#13-11950) によって承認されたプロトコールの下で、Trimaアフェレーシス (Blood Centers of the Pacific) 後の白血球除去チャンバーからの残留物から入手した。末梢血単核細胞 (PBMC) は、SepMateチューブ（StemCell、Cat #85460）を用いるLymphoprep遠心分離（StemCell、Cat #07861）により試料から単離した。CD4+ T細胞は、EasySepヒトCD4+ T細胞単離キット（StemCell、Cat#17952）を用いる磁気陰性選択によりPBMCから単離し、次いでTregは、CD4+、CD25+、CD127低細胞にゲート設定することにより蛍光活性化細胞選別を用いて単離した。単離後、製造業者のプロトコールに従ってImmunoCultヒトCD3/CD28/CD2 T細胞アクチベーター（StemCell、Cat# 10970）で細胞を刺激し、9日間拡大した。細胞は、300U/mLのhIL-2を含む完全RPMI培地、10% FBS、50 mM 2-メルカプトエタノール、および1% pen/strep中で、100万個細胞／mLで培養した。拡大後、RNPエレクトロポレーションの前に、Tregを同じ方法で24時間再刺激した。
すべての実験のための初代ヒトTreg細胞は、UCSFヒト研究委員会 (UCSF Committee on Human Research) (CHR#13-11950) によって承認されたプロトコールの下で、Trimaアフェレーシス (Blood Centers of the Pacific) 後の白血球除去チャンバーからの残留物から入手した。末梢血単核細胞 (PBMC) は、SepMateチューブ（StemCell、Cat #85460）を用いるLymphoprep遠心分離（StemCell、Cat #07861）により試料から単離した。CD4+ T細胞は、EasySepヒトCD4+ T細胞単離キット（StemCell、Cat#17952）を用いる磁気陰性選択によりPBMCから単離し、次いでTregは、CD4+、CD25+、CD127低細胞にゲート設定することにより蛍光活性化細胞選別を用いて単離した。単離後、製造業者のプロトコールに従ってImmunoCultヒトCD3/CD28/CD2 T細胞アクチベーター（StemCell、Cat# 10970）で細胞を刺激し、9日間拡大した。細胞は、300U/mLのhIL-2を含む完全RPMI培地、10% FBS、50 mM 2-メルカプトエタノール、および1% pen/strep中で、100万個細胞／mLで培養した。拡大後、RNPエレクトロポレーションの前に、Tregを同じ方法で24時間再刺激した。
【0106】
結果
図2a～2jおよび表1に示されるように、上記の方法を用いて、転写因子のプール化CRISPRスクリーニングにより、Sp1、Rnf20、Smarcb1、Satb1、Sp3、およびNsd1を含む、Foxp3発現を増加させる（Foxp3高）転写因子が同定された。図2a～jおよび表2に示されるように、このスクリーニングにより、Cbfb、Myc、Atxn713、Runx1、Usp22、およびStat5bを含む、Foxp3発現を減少させる（Foxp3低）転写因子もまた同定された。図3a～3gは、初代マウスTregにおけるプール化CRISPRスクリーンの設計および結果を示す。
図2a～2jおよび表1に示されるように、上記の方法を用いて、転写因子のプール化CRISPRスクリーニングにより、Sp1、Rnf20、Smarcb1、Satb1、Sp3、およびNsd1を含む、Foxp3発現を増加させる（Foxp3高）転写因子が同定された。図2a～jおよび表2に示されるように、このスクリーニングにより、Cbfb、Myc、Atxn713、Runx1、Usp22、およびStat5bを含む、Foxp3発現を減少させる（Foxp3低）転写因子もまた同定された。図3a～3gは、初代マウスTregにおけるプール化CRISPRスクリーンの設計および結果を示す。
【0107】
Rnf20、ならびにSAGA脱ユビキチン化モジュールのメンバーであるUsp22およびAtxn7l3を含む、CRISPRスクリーンからの以前に記載されていない候補遺伝子の役割を検証するために、追加の研究を行った。CRISPR-Cas9リボ核タンパク質 (RNP) を用いて、ヒトおよびマウス両方の初代Tregにおいて候補遺伝子をノックアウトし、フローサイトメトリーによりいくつかのTreg特有マーカーおよび炎症性サイトカインにおいて変化を同定した。上位ランクの正の調節因子のうちの5つを、Cas9 RNPを用いた個々のCRISPRノックアウトにより評価した。試験したガイドはすべて、Foxp3発現の減少をもたらし、スクリーンデータを再現した（図2eおよび2f）。
【0108】
マウスTregにおけるUsp22およびAtxn7l3のノックアウトがFoxp3発現を減少させる一方で（図4a、4f、および4g）、Rnf20のノックダウンは安定したFoxp3発現を維持することもまた見出された（図5a、5b、および7）。図4eは、エレクトロポレーションの5日後に収集されたマウスTregにおけるRNP対照を示す。ヒトTregにおけるUsp22のノックアウトはFoxp3発現を減少させることもまた見出された（図6）。追加の研究により、USP22をRNPでノックアウトすることで、6つの生物学的複製物にわたるUSP22欠損ヒトTregにおいて、FOXP3およびCD25の平均蛍光強度 (MFI)（図2gおよび2h）ならびにFOXP3hiCD25hi細胞の頻度が有意に低下することが示された（図4b～4d）。さらに、配列決定に基づく解析ツールを用いて、ゲノム編集の定量的な評価を行った。USP22のノックダウンは、混合した非標的対照と比較して、FOXP3、CTLA4、CD25、およびIL-10発現の減少をもたらす一方で、IFN-γ発現の増加をもたらすことが見出された。このデータから、USP22がFOXP3発現およびTreg同一性の維持において重要な役割を果たし得ることが示唆される。
【0109】
配列情報
SEQUENCE LISTING
<110> The Regents of the University of California
<120> Compositions and Methods for Modifying Regulatory T Cells
<150> US 62/744,058
<151> 2018-10-10
<160> 271
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 737
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 1
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Ile Arg Leu Ser Ser Glu Leu Ser Gly Ser Ile Asn Asp Leu Asn
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Cys Val Ser Asp Pro Leu Gln Thr Ser Gly Lys Ala Ala Ala Pro
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Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Asp Thr Cys Gln Gln Tyr Phe Ser Arg
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Ile Arg Arg Lys Phe Gly Val Phe Asn Tyr Ser Pro Phe Arg Thr Pro
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Leu Ile Ser Pro Lys Arg Gln Ile Arg Ser Arg Phe Gln Leu Asn Leu
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Leu Asp Ser Asp Ser Glu Ser Glu Leu Val Ile Asp Leu Gly Glu Asp
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<220>
<223> Synthetic construct
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Leu Thr Thr Gly Ser Tyr Pro Arg Leu Pro Thr Cys Ile Arg Asp Lys
165 170 175
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Pro Thr Gln Leu Ser Tyr Lys Tyr Tyr Phe Met Ser Val Asn Ala Ala
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Asp Arg Glu Asp Ser Pro Ala Met Ala Leu Leu Leu Gln Gln Phe Lys
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Glu Asn Ile Gln Asp Leu Val Phe Arg Thr Lys Thr Gly Lys Gln Thr
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Arg Thr Asn Ala Lys Arg Lys Leu Ser Asp Asp Pro Cys Pro Val Glu
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Ser Lys Lys Thr Lys Arg Ala Gly Glu Met Cys Ala Phe Asn Lys Val
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Leu Ala His Phe Val Ala Met Cys Asp Thr Asn Met Pro Phe Val Gly
645 650 655
Leu Arg Leu Glu Leu Ser Asn Leu Glu Ile Pro His Gln Gly Val Gln
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Val Glu Gly Asp Gly Phe Ser His Ala Ile Arg Leu Leu Lys Ile Pro
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Gly Gly Ile Thr Ile Ala Trp Lys Phe Asp Ser Gln Glu Arg Met Phe
625 630 635 640
Trp Asn Leu Met Pro Phe Thr Thr Arg Asp Phe Ser Ile Arg Ser Leu
645 650 655
Ala Asp Arg Leu Gly Asp Leu Asn Tyr Leu Ile Tyr Val Phe Pro Asp
660 665 670
Arg Pro Lys Asp Glu Val Tyr Ser Lys Tyr Tyr Thr Pro Val Pro Cys
675 680 685
Glu Ser Ala Thr Ala Lys Ala Val Asp Gly Tyr Val Lys Pro Gln Ile
690 695 700
Lys Gln Val Val Pro Glu Phe Val Asn Ala Ser Ala Asp Ala Gly Gly
705 710 715 720
Gly Ser Ala Thr Tyr Met Asp Gln Ala Pro Ser Pro Ala Val Cys Pro
725 730 735
Gln Ala His Tyr Asn Met Tyr Pro Gln Asn Pro Asp Ser Val Leu Asp
740 745 750
Thr Asp Gly Asp Phe Asp Leu Glu Asp Thr Met Asp Val Ala Arg Arg
755 760 765
Val Glu Glu Leu Leu Gly Arg Pro Met Asp Ser Gln Trp Ile Pro His
770 775 780
Ala Gln Ser
785
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<223> Synthetic construct
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ttactaccag tggatcatca 20
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<223> Synthetic construct
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ggagggcact accactacgc 20
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<223> Synthetic construct
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<400> 115
tgctgagtaa tacgtcacgg 20
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic construct
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<223> Synthetic construct
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gcggaccagt gtacagcacg 20
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic construct
<400> 119
taaggtgagg actttgcaca 20
<210> 120
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 120
atttccagga ggtgaaacat 20
<210> 121
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic construct
<400> 121
ctggtatgag gacctgcaag 20
<210> 122
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 122
gactggaatc tggagagtga 20
<210> 123
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 123
tcagccaagc cagagaagca 20
<210> 124
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 124
agatgtattc cgcatagtca 20
<210> 125
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 125
cacttagcgt gataaacccg 20
<210> 126
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 126
ctcttccgcc caaacttccg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 127
ggagcgcggc atatccgaca 20
<210> 128
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 128
atcacacata gcgacgaagt 20
<210> 129
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 129
cagagcatct ctagctaacg 20
<210> 130
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 130
ctaactctgc tacccaagtg 20
<210> 131
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 131
taatgttaat ccgagaacgg 20
<210> 132
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 132
aagtgttgtt tgatcagtca 20
<210> 133
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 133
acatactcta agtcaggcag 20
<210> 134
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 134
gtgtaattta gagagcagcg 20
<210> 135
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 135
tctgttcaga ctctaatagg 20
<210> 136
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 136
atgctgggca cgaacgacgg 20
<210> 137
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 137
catggataac aacaaaacgc 20
<210> 138
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 138
gaagctaccc cagaaaaagg 20
<210> 139
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 139
ggacattatc aacccggaca 20
<210> 140
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 140
cacagcagga ttcatctcag 20
<210> 141
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 141
gccgactcag cgcctcgcgg 20
<210> 142
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 142
gctcaggcct gagtaaacac 20
<210> 143
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 143
tcaccagctt ctgcacatgt 20
<210> 144
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 144
agaggaggag acacatgtcg 20
<210> 145
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 145
catacaccat gtccatagag 20
<210> 146
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 146
gccttctgac aattcagccc 20
<210> 147
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 147
gttctgtaga cttcacatgc 20
<210> 148
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 148
cagccaggac aacaatgcga 20
<210> 149
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 149
gtggccttaa tgttctcctg 20
<210> 150
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 150
gttcattgta caatatatgg 20
<210> 151
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 151
taagaggtca gaccgtcgtg 20
<210> 152
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 152
aaaccaacag attatcacaa atcgaggaag 30
<210> 153
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 153
ccatcatcat ccggacacca acagtggggc 30
<210> 154
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 154
ctcagtatgt gaccaatgta ccagtggccc 30
<210> 155
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 155
aactttacta ccagtggatc atcagggacc 30
<210> 156
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 156
agaaacttcg gcaagacttt gaggaggtca 30
<210> 157
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 157
aaaagcatcg caccatgtct caggaggtac 30
<210> 158
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 158
tgcaggaggg cactaccact acgcaggcgt 30
<210> 159
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 159
agtatcggtt gacaatcaat agtgaggcat 30
<210> 160
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 160
tgccacaacg ataccaatag gttgaggaga 30
<210> 161
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 161
ccaaagctga atcactgata acaagggcag 30
<210> 162
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 162
tttcctggat tcggaatacc ctagaggaac 30
<210> 163
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 163
caaggaagcg ggctaattcc aagacggtgt 30
<210> 164
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 164
cggcaggttg gtgactgtga acgccggctt 30
<210> 165
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 165
atggagttca tcgacaacaa gctgcggcgc 30
<210> 166
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 166
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<210> 167
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 167
ctggtctgtt gtggggtctg aacggggtgg 30
<210> 168
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 168
ttgcaatttc atgccaagtc acctgggtaa 30
<210> 169
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 169
tcccccagta ccaatattag catgtggcaa 30
<210> 170
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 170
gtctgttatt gtacaggttc gagtaggtga 30
<210> 171
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 171
gatctgataa tcaagtgatt cactgggaaa 30
<210> 172
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 172
tttgaagcac ataaagatga acggagggga 30
<210> 173
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 173
tgaggaattg ctagttaaaa cgccaggtaa 30
<210> 174
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 174
ggaggcccta tcggcagtac tacgtggagg 30
<210> 175
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 175
aagatatgca tgatagtaag acgaaggagc 30
<210> 176
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 176
tacagagaac ctcggaacat acggaggtag 30
<210> 177
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 177
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<210> 178
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 178
gttctcttct tgtctcggcc catgcggttc 30
<210> 179
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 179
tccatgagaa cgcatctcag cccgaggtgc 30
<210> 180
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 180
gccgaaacca gggccaccga aaggcggcgg 30
<210> 181
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 181
ggcgccctcg cgcttgaggc cgcgcggtcc 30
<210> 182
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 182
cagccttcgg tctcttcgac gacgcggccg 30
<210> 183
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 183
gggttcgggg taatagaacg caggcggcgg 30
<210> 184
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 184
gtgacgatcc aaatttgaac gccgtggaca 30
<210> 185
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 185
aaaagagcaa actgcgttat acagaggagg 30
<210> 186
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 186
ccacttaccc cagaaccaga cggatggggg 30
<210> 187
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 187
gcagtttgtg cagttatgcc agcagggaca 30
<210> 188
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 188
ttctatgcta agtacctgtg aaagggggca 30
<210> 189
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 189
acgccattga atatgattgc aaggaggagc 30
<210> 190
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 190
ctgataggtg ttgatacgag cccagggtgc 30
<210> 191
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 191
ggcttattca tagatctact gacaggggga 30
<210> 192
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 192
cctcacccag gcatcatccg acaagggctc 30
<210> 193
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 193
tgtccccacc cacagggatc aacgtggcca 30
<210> 194
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 194
tctccctact taggcactgc caggcggacc 30
<210> 195
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 195
cccggagggt gccaccatga ctaggggcag 30
<210> 196
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 196
ctgcacctgg tgtggaccca cgcgaggcac 30
<210> 197
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 197
atcacctcga actgcaccat aggtgggtgg 30
<210> 198
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 198
ctcagccatt gatctgatgt acggaggcat 30
<210> 199
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 199
gagctggggc tctgcatctc acagcggtgc 30
<210> 200
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 200
ttctaagtcg acatactctc ggctaggtgt 30
<210> 201
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 201
cccgcctgcc tcacctcaca ctcgcggctc 30
<210> 202
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 202
gccagccgac ttacgatttc cgagcggccg 30
<210> 203
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 203
gaatggagtc tgtgttatct ggaaaggctg 30
<210> 204
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 204
cttccacttc gaccgacaaa cctgaggtca 30
<210> 205
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 205
aggactgatc gtaggaccac ggtggggatg 30
<210> 206
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 206
taaaggcagt ggagtggttc agggaggcac 30
<210> 207
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 207
aaactagatg atcagaccaa gcccgggagc 30
<210> 208
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 208
cctcagagtg catcgacccc tcggtggtct 30
<210> 209
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 209
tgccctgcgg ggaggactcc gtcgaggaga 30
<210> 210
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 210
ctcccttcgg ggagacaacg acggcggtgg 30
<210> 211
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 211
tacggctgca ccgagtcgta gtcgaggtca 30
<210> 212
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 212
acagaatcag atgacaatga gtcagggaca 30
<210> 213
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 213
tcagcaatac aatatgccac agggaggcgg 30
<210> 214
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 214
agggcctaac catatgccta tgcagggacc 30
<210> 215
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 215
tgaaggcatg ttgtgagagc gtggaggtgg 30
<210> 216
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 216
taccacactg gaacatatca agaccggtta 30
<210> 217
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 217
atatgacaaa tgcaatgaaa actgtggtgg 30
<210> 218
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 218
tgcaggacat cgtgtaccgc accatggaga 30
<210> 219
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 219
agcaggccgc ccgggaagtc aacacggcgt 30
<210> 220
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 220
acgacacgga ccctgatagc atgaaggatt 30
<210> 221
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 221
aggccatcgc tcaggagata tacgcggacc 30
<210> 222
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 222
aacagcagcc gaatcgccaa ccgccggtga 30
<210> 223
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 223
aggagcttcg cagcctgcta accacggtga 30
<210> 224
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 224
atccacatcg actgctggac aatgaggatg 30
<210> 225
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 225
cagtcagtga gtagtgccaa accaaggcac 30
<210> 226
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 226
atgggtggcg tactgcacgt gtcgtggctg 30
<210> 227
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 227
acctttcaca ttatgaccaa caccaggtca 30
<210> 228
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 228
tacaatgatg tttgatgacc gtcgcggacg 30
<210> 229
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 229
taaactgttg ggacataccg ctcggggcca 30
<210> 230
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 230
ttatgatgat atgagccctc gtcgaggacc 30
<210> 231
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 231
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<211> 30
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic construct
<400> 232
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<210> 233
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 233
ccagcgaaca gccccccata gtggtggtgg 30
<210> 234
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 234
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<210> 235
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
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ctgctgctga gtaatacgtc acggtggtgc 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 236
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
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ttctgcagaa cgaggctgcc ctagaggtct 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
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<211> 30
<212> DNA
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<220>
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cttcatttcc aggaggtgaa acataggtac 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
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aagcctggta tgaggacctg caagaggtcc 30
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
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ctctgactgg aatctggaga gtgagggctc 30
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<211> 30
<212> DNA
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<220>
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tcagtcagcc aagccagaga agcagggtca 30
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<211> 30
<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic construct
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<220>
<223> Synthetic construct
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<211> 30
<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic construct
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cccgctcttc cgcccaaact tccgcggctg 30
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<211> 30
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<220>
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<211> 30
<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic construct
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<211> 30
<212> DNA
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<220>
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<211> 30
<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic construct
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
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<220>
<223> Synthetic construct
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<223> Synthetic construct
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<223> Synthetic construct
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<212> DNA
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<223> Synthetic construct
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic construct
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic construct
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<223> Synthetic construct
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic construct
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic construct
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic construct
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<220>
<223> Synthetic construct
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<220>
<223> Synthetic construct
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic construct
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ttgggttctg tagacttcac atgcaggtgg 30
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
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atggcagcca ggacaacaat gcgacggcca 30
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic construct
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ctgggtggcc ttaatgttct cctgtggatt 30
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 270
ctctgttcat tgtacaatat atggcggatg 30
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 271
gaattaagag gtcagaccgt cgtggggcag 30
SEQUENCE LISTING
<110> The Regents of the University of California
<120> Compositions and Methods for Modifying Regulatory T Cells
<150> US 62/744,058
<151> 2018-10-10
<160> 271
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 737
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 1
Met Ser Asp Gln Asp His Ser Met Asp Glu Met Thr Ala Val Val Lys
1 5 10 15
Ile Glu Lys Gly Val Gly Gly Asn Asn Gly Gly Asn Gly Asn Gly Gly
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Gly Ala Phe Ser Gln Ala Arg Ser Ser Ser Thr Gly Ser Ser Ser Ser
35 40 45
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50 55 60
Ser Ser Gly Ala Thr Pro Thr Ser Lys Glu Gln Ser Gly Ser Ser Thr
65 70 75 80
Asn Gly Ser Asn Gly Ser Glu Ser Ser Lys Asn Arg Thr Val Ser Gly
85 90 95
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100 105 110
Leu Thr Gly Leu Pro Gly Val Met Pro Asn Ile Gln Tyr Gln Val Ile
115 120 125
Pro Gln Phe Gln Thr Val Asp Gly Gln Gln Leu Gln Phe Ala Ala Thr
130 135 140
Gly Ala Gln Val Gln Gln Asp Gly Ser Gly Gln Ile Gln Ile Ile Pro
145 150 155 160
Gly Ala Asn Gln Gln Ile Ile Thr Asn Arg Gly Ser Gly Gly Asn Ile
165 170 175
Ile Ala Ala Met Pro Asn Leu Leu Gln Gln Ala Val Pro Leu Gln Gly
180 185 190
Leu Ala Asn Asn Val Leu Ser Gly Gln Thr Gln Tyr Val Thr Asn Val
195 200 205
Pro Val Ala Leu Asn Gly Asn Ile Thr Leu Leu Pro Val Asn Ser Val
210 215 220
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Ser Gly Ser Gln Glu Ser Gly Ser Gln Pro Val Thr Ser Gly Thr Thr
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Ile Ser Ser Ala Ser Leu Val Ser Ser Gln Ala Ser Ser Ser Ser Phe
260 265 270
Phe Thr Asn Ala Asn Ser Tyr Ser Thr Thr Thr Thr Thr Ser Asn Met
275 280 285
Gly Ile Met Asn Phe Thr Thr Ser Gly Ser Ser Gly Thr Asn Ser Gln
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Gly Gln Thr Pro Gln Arg Val Ser Gly Leu Gln Gly Ser Asp Ala Leu
305 310 315 320
Asn Ile Gln Gln Asn Gln Thr Ser Gly Gly Ser Leu Gln Ala Gly Gln
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Gln Lys Glu Gly Glu Gln Asn Gln Gln Thr Gln Gln Gln Gln Ile Leu
340 345 350
Ile Gln Pro Gln Leu Val Gln Gly Gly Gln Ala Leu Gln Ala Leu Gln
355 360 365
Ala Ala Pro Leu Ser Gly Gln Thr Phe Thr Thr Gln Ala Ile Ser Gln
370 375 380
Glu Thr Leu Gln Asn Leu Gln Leu Gln Ala Val Pro Asn Ser Gly Pro
385 390 395 400
Ile Ile Ile Arg Thr Pro Thr Val Gly Pro Asn Gly Gln Val Ser Trp
405 410 415
Gln Thr Leu Gln Leu Gln Asn Leu Gln Val Gln Asn Pro Gln Ala Gln
420 425 430
Thr Ile Thr Leu Ala Pro Met Gln Gly Val Ser Leu Gly Gln Thr Ser
435 440 445
Ser Ser Asn Thr Thr Leu Thr Pro Ile Ala Ser Ala Ala Ser Ile Pro
450 455 460
Ala Gly Thr Val Thr Val Asn Ala Ala Gln Leu Ser Ser Met Pro Gly
465 470 475 480
Leu Gln Thr Ile Asn Leu Ser Ala Leu Gly Thr Ser Gly Ile Gln Val
485 490 495
His Pro Ile Gln Gly Leu Pro Leu Ala Ile Ala Asn Ala Pro Gly Asp
500 505 510
His Gly Ala Gln Leu Gly Leu His Gly Ala Gly Gly Asp Gly Ile His
515 520 525
Asp Asp Thr Ala Gly Gly Glu Glu Gly Glu Asn Ser Pro Asp Ala Gln
530 535 540
Pro Gln Ala Gly Arg Arg Thr Arg Arg Glu Ala Cys Thr Cys Pro Tyr
545 550 555 560
Cys Lys Asp Ser Glu Gly Arg Gly Ser Gly Asp Pro Gly Lys Lys Lys
565 570 575
Gln His Ile Cys His Ile Gln Gly Cys Gly Lys Val Tyr Gly Lys Thr
580 585 590
Ser His Leu Arg Ala His Leu Arg Trp His Thr Gly Glu Arg Pro Phe
595 600 605
Met Cys Thr Trp Ser Tyr Cys Gly Lys Arg Phe Thr Arg Ser Asp Glu
610 615 620
Leu Gln Arg His Lys Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Lys Phe Ala Cys
625 630 635 640
Pro Glu Cys Pro Lys Arg Phe Met Arg Ser Asp His Leu Ser Lys His
645 650 655
Ile Lys Thr His Gln Asn Lys Lys Gly Gly Pro Gly Val Ala Leu Ser
660 665 670
Val Gly Thr Leu Pro Leu Asp Ser Gly Ala Gly Ser Glu Gly Ser Gly
675 680 685
Thr Ala Thr Pro Ser Ala Leu Ile Thr Thr Asn Met Val Ala Met Glu
690 695 700
Ala Ile Cys Pro Glu Gly Ile Ala Arg Leu Ala Asn Ser Gly Ile Asn
705 710 715 720
Val Met Gln Val Ala Asp Leu Gln Ser Ile Asn Ile Ser Gly Asn Gly
725 730 735
Phe
<210> 2
<211> 975
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 2
Met Ser Gly Ile Gly Asn Lys Arg Ala Ala Gly Glu Pro Gly Thr Ser
1 5 10 15
Met Pro Pro Glu Lys Lys Ala Ala Val Glu Asp Ser Gly Thr Thr Val
20 25 30
Glu Thr Ile Lys Leu Gly Gly Val Ser Ser Thr Glu Glu Leu Asp Ile
35 40 45
Arg Thr Leu Gln Thr Lys Asn Arg Lys Leu Ala Glu Met Leu Asp Gln
50 55 60
Arg Gln Ala Ile Glu Asp Glu Leu Arg Glu His Ile Glu Lys Leu Glu
65 70 75 80
Arg Arg Gln Ala Thr Asp Asp Ala Ser Leu Leu Ile Val Asn Arg Tyr
85 90 95
Trp Ser Gln Phe Asp Glu Asn Ile Arg Ile Ile Leu Lys Arg Tyr Asp
100 105 110
Leu Glu Gln Gly Leu Gly Asp Leu Leu Thr Glu Arg Lys Ala Leu Val
115 120 125
Val Pro Glu Pro Glu Pro Asp Ser Asp Ser Asn Gln Glu Arg Lys Asp
130 135 140
Asp Arg Glu Arg Gly Glu Gly Gln Glu Pro Ala Phe Ser Phe Leu Ala
145 150 155 160
Thr Leu Ala Ser Ser Ser Ser Glu Glu Met Glu Ser Gln Leu Gln Glu
165 170 175
Arg Val Glu Ser Ser Arg Arg Ala Val Ser Gln Ile Val Thr Val Tyr
180 185 190
Asp Lys Leu Gln Glu Lys Val Glu Leu Leu Ser Arg Lys Leu Asn Ser
195 200 205
Gly Asp Asn Leu Ile Val Glu Glu Ala Val Gln Glu Leu Asn Ser Phe
210 215 220
Leu Ala Gln Glu Asn Met Arg Leu Gln Glu Leu Thr Asp Leu Leu Gln
225 230 235 240
Glu Lys His Arg Thr Met Ser Gln Glu Phe Ser Lys Leu Gln Ser Lys
245 250 255
Val Glu Thr Ala Glu Ser Arg Val Ser Val Leu Glu Ser Met Ile Asp
260 265 270
Asp Leu Gln Trp Asp Ile Asp Lys Ile Arg Lys Arg Glu Gln Arg Leu
275 280 285
Asn Arg His Leu Ala Glu Val Leu Glu Arg Val Asn Ser Lys Gly Tyr
290 295 300
Lys Val Tyr Gly Ala Gly Ser Ser Leu Tyr Gly Gly Thr Ile Thr Ile
305 310 315 320
Asn Ala Arg Lys Phe Glu Glu Met Asn Ala Glu Leu Glu Glu Asn Lys
325 330 335
Glu Leu Ala Gln Asn Arg Leu Cys Glu Leu Glu Lys Leu Arg Gln Asp
340 345 350
Phe Glu Glu Val Thr Thr Gln Asn Glu Lys Leu Lys Val Glu Leu Arg
355 360 365
Ser Ala Val Glu Gln Val Val Lys Glu Thr Pro Glu Tyr Arg Cys Met
370 375 380
Gln Ser Gln Phe Ser Val Leu Tyr Asn Glu Ser Leu Gln Leu Lys Ala
385 390 395 400
His Leu Asp Glu Ala Arg Thr Leu Leu His Gly Thr Arg Gly Thr His
405 410 415
Gln His Gln Val Glu Leu Ile Glu Arg Asp Glu Val Ser Leu His Lys
420 425 430
Lys Leu Arg Thr Glu Val Ile Gln Leu Glu Asp Thr Leu Ala Gln Val
435 440 445
Arg Lys Glu Tyr Glu Met Leu Arg Ile Glu Phe Glu Gln Thr Leu Ala
450 455 460
Ala Asn Glu Gln Ala Gly Pro Ile Asn Arg Glu Met Arg His Leu Ile
465 470 475 480
Ser Ser Leu Gln Asn His Asn His Gln Leu Lys Gly Glu Val Leu Arg
485 490 495
Tyr Lys Arg Lys Leu Arg Glu Ala Gln Ser Asp Leu Asn Lys Thr Arg
500 505 510
Leu Arg Ser Gly Ser Ala Leu Leu Gln Ser Gln Ser Ser Thr Glu Asp
515 520 525
Pro Lys Asp Glu Pro Ala Glu Leu Lys Pro Asp Ser Glu Asp Leu Ser
530 535 540
Ser Gln Ser Ser Ala Ser Lys Ala Ser Gln Glu Asp Ala Asn Glu Ile
545 550 555 560
Lys Ser Lys Arg Asp Glu Glu Glu Arg Glu Arg Glu Arg Arg Glu Lys
565 570 575
Glu Arg Glu Arg Glu Arg Glu Arg Glu Lys Glu Lys Glu Arg Glu Arg
580 585 590
Glu Lys Gln Lys Leu Lys Glu Ser Glu Lys Glu Arg Asp Ser Ala Lys
595 600 605
Asp Lys Glu Lys Gly Lys His Asp Asp Gly Arg Lys Lys Glu Ala Glu
610 615 620
Ile Ile Lys Gln Leu Lys Ile Glu Leu Lys Lys Ala Gln Glu Ser Gln
625 630 635 640
Lys Glu Met Lys Leu Leu Leu Asp Met Tyr Arg Ser Ala Pro Lys Glu
645 650 655
Gln Arg Asp Lys Val Gln Leu Met Ala Ala Glu Lys Lys Ser Lys Ala
660 665 670
Glu Leu Glu Asp Leu Arg Gln Arg Leu Lys Asp Leu Glu Asp Lys Glu
675 680 685
Lys Lys Glu Asn Lys Lys Met Ala Asp Glu Asp Ala Leu Arg Lys Ile
690 695 700
Arg Ala Val Glu Glu Gln Ile Glu Tyr Leu Gln Lys Lys Leu Ala Met
705 710 715 720
Ala Lys Gln Glu Glu Glu Ala Leu Leu Ser Glu Met Asp Val Thr Gly
725 730 735
Gln Ala Phe Glu Asp Met Gln Glu Gln Asn Ile Arg Leu Met Gln Gln
740 745 750
Leu Arg Glu Lys Asp Asp Ala Asn Phe Lys Leu Met Ser Glu Arg Ile
755 760 765
Lys Ser Asn Gln Ile His Lys Leu Leu Lys Glu Glu Lys Glu Glu Leu
770 775 780
Ala Asp Gln Val Leu Thr Leu Lys Thr Gln Val Asp Ala Gln Leu Gln
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Val Val Arg Lys Leu Glu Glu Lys Glu His Leu Leu Gln Ser Asn Ile
805 810 815
Gly Thr Gly Glu Lys Glu Leu Gly Leu Arg Thr Gln Ala Leu Glu Met
820 825 830
Asn Lys Arg Lys Ala Met Glu Ala Ala Gln Leu Ala Asp Asp Leu Lys
835 840 845
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850 855 860
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865 870 875 880
Arg Ala Gln Glu Asp Ile Ser Arg Leu Arg Arg Lys Leu Glu Thr Thr
885 890 895
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900 905 910
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930 935 940
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Asn Ala Ala Phe Gly Ala Asn Asp Phe His Arg Ile Tyr Ile Gly
965 970 975
<210> 3
<211> 1460
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 3
Met Ala Glu Glu Gln Gln Gln Pro Pro Pro Gln Gln Pro Asp Ala His
1 5 10 15
Gln Gln Leu Pro Pro Ser Ala Pro Asn Ser Gly Val Ala Leu Pro Ala
20 25 30
Leu Val Pro Gly Leu Pro Gly Thr Glu Ala Ser Ala Leu Gln His Lys
35 40 45
Ile Lys Asn Ser Ile Cys Lys Thr Val Gln Ser Lys Val Asp Cys Ile
50 55 60
Leu Gln Glu Val Glu Lys Phe Thr Asp Leu Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Pro Ser Gly Leu Ser Asn Gly Glu Lys Ser Asp Gln Asn
85 90 95
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100 105 110
Arg Asn Thr Leu Glu Glu His Pro Glu Thr Ser Leu Pro Lys Gln Glu
115 120 125
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130 135 140
Leu Ser Ala Ala Asp Phe Gly Lys Ile Met Lys Asn Val Phe Pro Asn
145 150 155 160
Met Lys Ala Arg Arg Leu Gly Thr Arg Gly Lys Ser Lys Tyr Cys Tyr
165 170 175
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180 185 190
Leu Asp Phe His Lys Thr Gly Asp Gly Leu Glu Gly Ala Glu Pro Ser
195 200 205
Gly Gln Leu Gln Asn Ile Asp Glu Glu Val Ile Ser Ser Ala Cys Arg
210 215 220
Leu Val Cys Glu Trp Ala Gln Lys Val Leu Ser Gln Pro Phe Asp Thr
225 230 235 240
Val Leu Glu Leu Ala Arg Phe Leu Val Lys Ser His Tyr Ile Gly Thr
245 250 255
Lys Ser Met Ala Ala Leu Thr Val Met Ala Ala Ala Pro Ala Gly Met
260 265 270
Lys Gly Ile Thr Gln Pro Ser Ala Phe Ile Pro Thr Ala Glu Ser Asn
275 280 285
Ser Phe Gln Pro Gln Val Lys Thr Leu Pro Ser Pro Ile Asp Ala Lys
290 295 300
Gln Gln Leu Gln Arg Lys Ile Gln Lys Lys Gln Gln Glu Gln Lys Leu
305 310 315 320
Gln Ser Pro Leu Pro Gly Glu Ser Ala Ala Lys Lys Ser Glu Ser Ala
325 330 335
Thr Ser Asn Gly Val Thr Asn Leu Pro Asn Gly Asn Pro Ser Ile Leu
340 345 350
Ser Pro Gln Pro Ile Gly Ile Val Val Ala Ala Val Pro Ser Pro Ile
355 360 365
Pro Val Gln Arg Thr Arg Gln Leu Val Thr Ser Pro Ser Pro Met Ser
370 375 380
Ser Ser Asp Gly Lys Val Leu Pro Leu Asn Val Gln Val Val Thr Gln
385 390 395 400
His Met Gln Ser Val Lys Gln Ala Pro Lys Thr Pro Gln Asn Val Pro
405 410 415
Ala Ser Pro Gly Gly Asp Arg Ser Ala Arg His Arg Tyr Pro Gln Ile
420 425 430
Leu Pro Lys Pro Ala Asn Thr Ser Ala Leu Thr Ile Arg Ser Pro Thr
435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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Trp Tyr Cys Asn Asp Cys Lys Ala Gly Lys Lys Pro His Tyr Arg
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Glu Ile Val Trp Val Lys Val Gly Arg Tyr Arg Trp Trp Pro Ala
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Glu Ile Cys His Pro Arg Ala Val Pro Ser Asn Ile Asp Lys Met
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Arg His Asp Val Gly Glu Phe Pro Val Leu Phe Phe Gly Ser Asn
1520 1525 1530
Asp Tyr Leu Trp Thr His Gln Ala Arg Val Phe Pro Tyr Met Glu
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Gly Asp Val Ser Ser Lys Asp Lys Met Gly Lys Gly Val Asp Gly
1550 1555 1560
Thr Tyr Lys Lys Ala Leu Gln Glu Ala Ala Ala Arg Phe Glu Glu
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Leu Lys Ala Gln Lys Glu Leu Arg Gln Leu Gln Glu Asp Arg Lys
1580 1585 1590
Asn Asp Lys Lys Pro Pro Pro Tyr Lys His Ile Lys Val Asn Arg
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Pro Ile Gly Arg Val Gln Ile Phe Thr Ala Asp Leu Ser Glu Ile
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Pro Arg Cys Asn Cys Lys Ala Thr Asp Glu Asn Pro Cys Gly Ile
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Asp Ser Glu Cys Ile Asn Arg Met Leu Leu Tyr Glu Cys His Pro
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Thr Val Cys Pro Ala Gly Gly Arg Cys Gln Asn Gln Cys Phe Ser
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Gly Trp Gly Leu Arg Thr Lys Thr Asp Ile Lys Lys Gly Glu Phe
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Ala Arg Ile Arg Tyr Ala Gln Glu His Asp Ile Thr Asn Phe Tyr
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Met Leu Thr Leu Asp Lys Asp Arg Ile Ile Asp Ala Gly Pro Lys
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Gly Asn Tyr Ala Arg Phe Met Asn His Cys Cys Gln Pro Asn Cys
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Gln Gln Gly Lys Arg Arg Thr Gln Gly Glu Ile Thr Lys Glu Arg
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Glu Asp Glu Cys Phe Ser Cys Gly Asp Ala Gly Gln Leu Val Ser
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Asn Leu Thr Lys Arg Pro Ala Gly Lys Trp Glu Cys Pro Trp His
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Gln Cys Asp Ile Cys Gly Lys Glu Ala Ala Ser Phe Cys Glu Met
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Cys Pro Ser Ser Phe Cys Lys Gln His Arg Glu Gly Met Leu Phe
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Ile Ser Lys Leu Asp Gly Arg Leu Ser Cys Thr Glu His Asp Pro
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Cys Gly Pro Asn Pro Leu Glu Pro Gly Glu Ile Arg Glu Tyr Val
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Pro Pro Pro Val Pro Leu Pro Pro Gly Pro Ser Thr His Leu Ala
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Glu Gln Ser Thr Gly Met Ala Ala Gln Ala Pro Lys Met Ser Asp
1970 1975 1980
Lys Pro Pro Ala Asp Thr Asn Gln Met Leu Ser Leu Ser Lys Lys
1985 1990 1995
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2000 2005 2010
Leu Glu Arg Thr Asp Ser Arg Pro Gln Pro Leu Asp Lys Val Arg
2015 2020 2025
Asp Leu Ala Gly Ser Gly Thr Lys Ser Gln Ser Leu Val Ser Ser
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Gln Arg Pro Leu Asp Arg Pro Pro Ala Val Ala Gly Pro Arg Pro
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2060 2065 2070
Pro Ser Val Arg Ser Gln Pro Leu Glu Arg Pro Leu Gly Thr Ala
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Asp Pro Arg Leu Asp Lys Ser Ile Gly Ala Ala Ser Pro Arg Pro
2090 2095 2100
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Pro Arg Gln Lys Glu Arg Ala Ala Ser Pro His Gln Val Thr Pro
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Ala Ser Lys Gly Leu Gly His Met Pro Arg Ala Val Glu Lys Gly
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Leu Leu Ser Gln Pro Pro Ala Lys Ala Phe Leu Tyr Glu Pro Thr
2270 2275 2280
Thr Gln Ala Ser Gly Arg Ala Ser Ala Gly Ala Glu Gln Thr Pro
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
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Ser Leu Trp Arg Arg Leu Ala Thr Val Glu Glu Arg Lys Lys Ile Val
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65 70 75 80
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<223> Synthetic construct
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Pro Pro Pro Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Gly Leu Val Ser Glu Leu Leu
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<223> Synthetic construct
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Lys Ser Lys Leu Arg Tyr Thr Glu Glu Gly Lys Asp Val Asp Val Ser
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260 265 270
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275 280 285
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340 345 350
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370 375 380
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<220>
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Lys Thr Asn Leu Arg Lys Gly Thr Met Leu Pro Val Phe Cys Val Val
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485 490 495
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<220>
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245 250 255
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260 265 270
Val Arg Arg His Leu Trp Gly Ser His Gly Asn Ser Thr Phe Pro Glu
275 280 285
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305 310 315 320
Lys Gln Arg Thr Leu Asn Glu Ile Tyr His Trp Phe Thr Arg Met Phe
325 330 335
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 12
Met Val Ser Arg Pro Glu Pro Glu Gly Glu Ala Met Asp Ala Glu Leu
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Ser Ser Leu Phe Gln Glu Phe Tyr Ser Gly His Arg Ser Pro His Ile
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Asn Pro Asn His Cys Asn Cys Ile Ile Asp Gln Ile Phe Thr Gly Gly
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Arg Met Phe Ala Tyr Phe Arg Arg Asn Ala Ala Thr Trp Lys Asn Ala
500 505 510
Val Arg His Asn Leu Ser Leu His Lys Cys Phe Val Arg Val Glu Asn
515 520 525
Val Lys Gly Ala Val Trp Thr Val Asp Glu Val Glu Phe Gln Lys Arg
530 535 540
Arg Pro Gln Lys Ile Ser Gly Asn Pro Ser Leu Ile Lys Asn Met Gln
545 550 555 560
Ser Ser His Ala Tyr Cys Thr Pro Leu Asn Ala Ala Leu Gln Ala Ser
565 570 575
Met Ala Glu Asn Ser Ile Pro Leu Tyr Thr Thr Ala Ser Met Gly Asn
580 585 590
Pro Thr Leu Gly Asn Leu Ala Ser Ala Ile Arg Glu Glu Leu Asn Gly
595 600 605
Ala Met Glu His Thr Asn Ser Asn Glu Ser Asp Ser Ser Pro Gly Arg
610 615 620
Ser Pro Met Gln Ala Val His Pro Val His Val Lys Glu Glu Pro Leu
625 630 635 640
Asp Pro Glu Glu Ala Glu Gly Pro Leu Ser Leu Val Thr Thr Ala Asn
645 650 655
His Ser Pro Asp Phe Asp His Asp Arg Asp Tyr Glu Asp Glu Pro Val
660 665 670
Asn Glu Asp Met Glu
675
<210> 31
<211> 787
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 31
Met Ala Val Trp Ile Gln Ala Gln Gln Leu Gln Gly Glu Ala Leu His
1 5 10 15
Gln Met Gln Ala Leu Tyr Gly Gln His Phe Pro Ile Glu Val Arg His
20 25 30
Tyr Leu Ser Gln Trp Ile Glu Ser Gln Ala Trp Asp Ser Val Asp Leu
35 40 45
Asp Asn Pro Gln Glu Asn Ile Lys Ala Thr Gln Leu Leu Glu Gly Leu
50 55 60
Val Gln Glu Leu Gln Lys Lys Ala Glu His Gln Val Gly Glu Asp Gly
65 70 75 80
Phe Leu Leu Lys Ile Lys Leu Gly His Tyr Ala Thr Gln Leu Gln Asn
85 90 95
Thr Tyr Asp Arg Cys Pro Met Glu Leu Val Arg Cys Ile Arg His Ile
100 105 110
Leu Tyr Asn Glu Gln Arg Leu Val Arg Glu Ala Asn Asn Gly Ser Ser
115 120 125
Pro Ala Gly Ser Leu Ala Asp Ala Met Ser Gln Lys His Leu Gln Ile
130 135 140
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145 150 155 160
Glu Leu Lys Lys Leu Gln Gln Thr Gln Glu Tyr Phe Ile Ile Gln Tyr
165 170 175
Gln Glu Ser Leu Arg Ile Gln Ala Gln Phe Gly Pro Leu Ala Gln Leu
180 185 190
Ser Pro Gln Glu Arg Leu Ser Arg Glu Thr Ala Leu Gln Gln Lys Gln
195 200 205
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210 215 220
Tyr Arg Val Glu Leu Ala Glu Lys His Gln Lys Thr Leu Gln Leu Leu
225 230 235 240
Arg Lys Gln Gln Thr Ile Ile Leu Asp Asp Glu Leu Ile Gln Trp Lys
245 250 255
Arg Arg Gln Gln Leu Ala Gly Asn Gly Gly Pro Pro Glu Gly Ser Leu
260 265 270
Asp Val Leu Gln Ser Trp Cys Glu Lys Leu Ala Glu Ile Ile Trp Gln
275 280 285
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305 310 315 320
Thr Asp Ile Ile Ser Ala Leu Val Thr Ser Thr Phe Ile Ile Glu Lys
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
Glu Ser Val Thr Glu Glu Lys Phe Thr Ile Leu Phe Glu Ser Gln Phe
435 440 445
Ser Val Gly Gly Asn Glu Leu Val Phe Gln Val Lys Thr Leu Ser Leu
450 455 460
Pro Val Val Val Ile Val His Gly Ser Gln Asp Asn Asn Ala Thr Ala
465 470 475 480
Thr Val Leu Trp Asp Asn Ala Phe Ala Glu Pro Gly Arg Val Pro Phe
485 490 495
Ala Val Pro Asp Lys Val Leu Trp Pro Gln Leu Cys Glu Ala Leu Asn
500 505 510
Met Lys Phe Lys Ala Glu Val Gln Ser Asn Arg Gly Leu Thr Lys Glu
515 520 525
Asn Leu Val Phe Leu Ala Gln Lys Leu Phe Asn Asn Ser Ser Ser His
530 535 540
Leu Glu Asp Tyr Ser Gly Leu Ser Val Ser Trp Ser Gln Phe Asn Arg
545 550 555 560
Glu Asn Leu Pro Gly Arg Asn Tyr Thr Phe Trp Gln Trp Phe Asp Gly
565 570 575
Val Met Glu Val Leu Lys Lys His Leu Lys Pro His Trp Asn Asp Gly
580 585 590
Ala Ile Leu Gly Phe Val Asn Lys Gln Gln Ala His Asp Leu Leu Ile
595 600 605
Asn Lys Pro Asp Gly Thr Phe Leu Leu Arg Phe Ser Asp Ser Glu Ile
610 615 620
Gly Gly Ile Thr Ile Ala Trp Lys Phe Asp Ser Gln Glu Arg Met Phe
625 630 635 640
Trp Asn Leu Met Pro Phe Thr Thr Arg Asp Phe Ser Ile Arg Ser Leu
645 650 655
Ala Asp Arg Leu Gly Asp Leu Asn Tyr Leu Ile Tyr Val Phe Pro Asp
660 665 670
Arg Pro Lys Asp Glu Val Tyr Ser Lys Tyr Tyr Thr Pro Val Pro Cys
675 680 685
Glu Ser Ala Thr Ala Lys Ala Val Asp Gly Tyr Val Lys Pro Gln Ile
690 695 700
Lys Gln Val Val Pro Glu Phe Val Asn Ala Ser Ala Asp Ala Gly Gly
705 710 715 720
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725 730 735
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<223> Synthetic construct
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<212> DNA
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<223> Synthetic construct
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<212> DNA
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<223> Synthetic construct
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<223> Synthetic construct
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic construct
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ggagggcact accactacgc 20
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<212> DNA
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<223> Synthetic construct
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<223> Synthetic construct
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<212> DNA
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<223> Synthetic construct
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<212> DNA
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<223> Synthetic construct
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<223> Synthetic construct
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<223> Synthetic construct
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<223> Synthetic construct
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<212> DNA
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<223> Synthetic construct
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<212> DNA
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<223> Synthetic construct
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<212> DNA
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<223> Synthetic construct
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic construct
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic construct
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic construct
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic construct
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic construct
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<223> Synthetic construct
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic construct
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<213> Artificial sequence
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic construct
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<212> DNA
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<223> Synthetic construct
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<223> Synthetic construct
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<211> 20
<212> DNA
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<223> Synthetic construct
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<212> DNA
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<223> Synthetic construct
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic construct
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic construct
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<212> DNA
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<223> Synthetic construct
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<223> Synthetic construct
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<223> Synthetic construct
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<223> Synthetic construct
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<220>
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<223> Synthetic construct
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<220>
<223> Synthetic construct
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<220>
<223> Synthetic construct
<400> 102
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 103
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<223> Synthetic construct
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<220>
<223> Synthetic construct
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic construct
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
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<213> Artificial sequence
<220>
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<220>
<223> Synthetic construct
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gatgatatga gccctcgtcg 20
<210> 111
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 111
taaaatcaaa gaacttcgag 20
<210> 112
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 112
cctccactgg aagacacggt 20
<210> 113
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 113
cgaacagccc cccatagtgg 20
<210> 114
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 114
gaggataaca cgcattgcgg 20
<210> 115
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 115
tgctgagtaa tacgtcacgg 20
<210> 116
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 116
cgggacacgt ctacttggtg 20
<210> 117
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 117
gcagaacgag gctgccctag 20
<210> 118
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 118
gcggaccagt gtacagcacg 20
<210> 119
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 119
taaggtgagg actttgcaca 20
<210> 120
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 120
atttccagga ggtgaaacat 20
<210> 121
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 121
ctggtatgag gacctgcaag 20
<210> 122
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 122
gactggaatc tggagagtga 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 123
tcagccaagc cagagaagca 20
<210> 124
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 124
agatgtattc cgcatagtca 20
<210> 125
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 125
cacttagcgt gataaacccg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 126
ctcttccgcc caaacttccg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 127
ggagcgcggc atatccgaca 20
<210> 128
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 128
atcacacata gcgacgaagt 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 129
cagagcatct ctagctaacg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 130
ctaactctgc tacccaagtg 20
<210> 131
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 131
taatgttaat ccgagaacgg 20
<210> 132
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 132
aagtgttgtt tgatcagtca 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 133
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 134
gtgtaattta gagagcagcg 20
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 135
tctgttcaga ctctaatagg 20
<210> 136
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 136
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 137
catggataac aacaaaacgc 20
<210> 138
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 138
gaagctaccc cagaaaaagg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 139
ggacattatc aacccggaca 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 140
cacagcagga ttcatctcag 20
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic construct
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic construct
<400> 142
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 143
tcaccagctt ctgcacatgt 20
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 144
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<210> 145
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 145
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic construct
<400> 146
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 147
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic construct
<400> 148
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 149
gtggccttaa tgttctcctg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 150
gttcattgta caatatatgg 20
<210> 151
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 151
taagaggtca gaccgtcgtg 20
<210> 152
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 152
aaaccaacag attatcacaa atcgaggaag 30
<210> 153
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 153
ccatcatcat ccggacacca acagtggggc 30
<210> 154
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 154
ctcagtatgt gaccaatgta ccagtggccc 30
<210> 155
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 155
aactttacta ccagtggatc atcagggacc 30
<210> 156
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 156
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<210> 157
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 157
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<210> 158
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 158
tgcaggaggg cactaccact acgcaggcgt 30
<210> 159
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 159
agtatcggtt gacaatcaat agtgaggcat 30
<210> 160
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 160
tgccacaacg ataccaatag gttgaggaga 30
<210> 161
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 161
ccaaagctga atcactgata acaagggcag 30
<210> 162
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 162
tttcctggat tcggaatacc ctagaggaac 30
<210> 163
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 163
caaggaagcg ggctaattcc aagacggtgt 30
<210> 164
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 164
cggcaggttg gtgactgtga acgccggctt 30
<210> 165
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 165
atggagttca tcgacaacaa gctgcggcgc 30
<210> 166
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 166
actggggctg acactagcag acactggtgc 30
<210> 167
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 167
ctggtctgtt gtggggtctg aacggggtgg 30
<210> 168
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 168
ttgcaatttc atgccaagtc acctgggtaa 30
<210> 169
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 169
tcccccagta ccaatattag catgtggcaa 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 170
gtctgttatt gtacaggttc gagtaggtga 30
<210> 171
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 171
gatctgataa tcaagtgatt cactgggaaa 30
<210> 172
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 172
tttgaagcac ataaagatga acggagggga 30
<210> 173
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 173
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<210> 174
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 174
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<210> 175
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 175
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<210> 176
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 176
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 177
gacagcagat cgagtcctac cccacggaca 30
<210> 178
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 178
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<210> 179
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 179
tccatgagaa cgcatctcag cccgaggtgc 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 180
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<210> 181
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 181
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<210> 182
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 182
cagccttcgg tctcttcgac gacgcggccg 30
<210> 183
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 183
gggttcgggg taatagaacg caggcggcgg 30
<210> 184
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 184
gtgacgatcc aaatttgaac gccgtggaca 30
<210> 185
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 185
aaaagagcaa actgcgttat acagaggagg 30
<210> 186
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 186
ccacttaccc cagaaccaga cggatggggg 30
<210> 187
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 187
gcagtttgtg cagttatgcc agcagggaca 30
<210> 188
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 188
ttctatgcta agtacctgtg aaagggggca 30
<210> 189
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 189
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<210> 190
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 190
ctgataggtg ttgatacgag cccagggtgc 30
<210> 191
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 191
ggcttattca tagatctact gacaggggga 30
<210> 192
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 192
cctcacccag gcatcatccg acaagggctc 30
<210> 193
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 193
tgtccccacc cacagggatc aacgtggcca 30
<210> 194
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 194
tctccctact taggcactgc caggcggacc 30
<210> 195
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 195
cccggagggt gccaccatga ctaggggcag 30
<210> 196
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 196
ctgcacctgg tgtggaccca cgcgaggcac 30
<210> 197
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 197
atcacctcga actgcaccat aggtgggtgg 30
<210> 198
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 198
ctcagccatt gatctgatgt acggaggcat 30
<210> 199
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 199
gagctggggc tctgcatctc acagcggtgc 30
<210> 200
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 200
ttctaagtcg acatactctc ggctaggtgt 30
<210> 201
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 201
cccgcctgcc tcacctcaca ctcgcggctc 30
<210> 202
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 202
gccagccgac ttacgatttc cgagcggccg 30
<210> 203
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 203
gaatggagtc tgtgttatct ggaaaggctg 30
<210> 204
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 204
cttccacttc gaccgacaaa cctgaggtca 30
<210> 205
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 205
aggactgatc gtaggaccac ggtggggatg 30
<210> 206
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 206
taaaggcagt ggagtggttc agggaggcac 30
<210> 207
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 207
aaactagatg atcagaccaa gcccgggagc 30
<210> 208
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 208
cctcagagtg catcgacccc tcggtggtct 30
<210> 209
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 209
tgccctgcgg ggaggactcc gtcgaggaga 30
<210> 210
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 210
ctcccttcgg ggagacaacg acggcggtgg 30
<210> 211
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 211
tacggctgca ccgagtcgta gtcgaggtca 30
<210> 212
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 212
acagaatcag atgacaatga gtcagggaca 30
<210> 213
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 213
tcagcaatac aatatgccac agggaggcgg 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 214
agggcctaac catatgccta tgcagggacc 30
<210> 215
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 215
tgaaggcatg ttgtgagagc gtggaggtgg 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 216
taccacactg gaacatatca agaccggtta 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 217
atatgacaaa tgcaatgaaa actgtggtgg 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 218
tgcaggacat cgtgtaccgc accatggaga 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 219
agcaggccgc ccgggaagtc aacacggcgt 30
<210> 220
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 220
acgacacgga ccctgatagc atgaaggatt 30
<210> 221
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 221
aggccatcgc tcaggagata tacgcggacc 30
<210> 222
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 222
aacagcagcc gaatcgccaa ccgccggtga 30
<210> 223
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 223
aggagcttcg cagcctgcta accacggtga 30
<210> 224
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 224
atccacatcg actgctggac aatgaggatg 30
<210> 225
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 225
cagtcagtga gtagtgccaa accaaggcac 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 226
atgggtggcg tactgcacgt gtcgtggctg 30
<210> 227
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 227
acctttcaca ttatgaccaa caccaggtca 30
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<211> 30
<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic construct
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tacaatgatg tttgatgacc gtcgcggacg 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic construct
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taaactgttg ggacataccg ctcggggcca 30
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<211> 30
<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic construct
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ttatgatgat atgagccctc gtcgaggacc 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
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gtgctaaaat caaagaactt cgagaggtaa 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
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tatgcctcca ctggaagaca cggtaggcat 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 233
ccagcgaaca gccccccata gtggtggtgg 30
<210> 234
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 234
agaggaggat aacacgcatt gcgggggagg 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
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ctgctgctga gtaatacgtc acggtggtgc 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 236
gatgcgggac acgtctactt ggtggggctc 30
<210> 237
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 237
ttctgcagaa cgaggctgcc ctagaggtct 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 238
cactgcggac cagtgtacag cacgaggttc 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
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tatgtaaggt gaggactttg cacagggcag 30
<210> 240
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 240
cttcatttcc aggaggtgaa acataggtac 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 241
aagcctggta tgaggacctg caagaggtcc 30
<210> 242
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 242
ctctgactgg aatctggaga gtgagggctc 30
<210> 243
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 243
tcagtcagcc aagccagaga agcagggtca 30
<210> 244
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 244
tggaagatgt attccgcata gtcagggtgc 30
<210> 245
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 245
cagacactta gcgtgataaa cccggggaca 30
<210> 246
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 246
cccgctcttc cgcccaaact tccgcggctg 30
<210> 247
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 247
tgggggagcg cggcatatcc gacaaggaaa 30
<210> 248
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 248
ttgtatcaca catagcgacg aagtgggcta 30
<210> 249
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
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ggaccagagc atctctagct aacgaggcca 30
<210> 250
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 250
aacactaact ctgctaccca agtgcggtta 30
<210> 251
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 251
actctaatgt taatccgaga acggtgggga 30
<210> 252
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 252
gaacaagtgt tgtttgatca gtcatggttg 30
<210> 253
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 253
agacacatac tctaagtcag gcagtggctg 30
<210> 254
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 254
tcgagtgtaa tttagagagc agcgtggaga 30
<210> 255
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 255
gtgctctgtt cagactctaa taggaggtta 30
<210> 256
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 256
tttgatgctg ggcacgaacg acggcggaag 30
<210> 257
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 257
cggtcatgga taacaacaaa acgcaggtca 30
<210> 258
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 258
aaaagaagct accccagaaa aaggaggctg 30
<210> 259
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 259
agaaggacat tatcaacccg gacaaggtag 30
<210> 260
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 260
tggacacagc aggattcatc tcaggggaat 30
<210> 261
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 261
cggagccgac tcagcgcctc gcgggggcct 30
<210> 262
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 262
caaagctcag gcctgagtaa acacaggaga 30
<210> 263
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 263
ctgttcacca gcttctgcac atgtaggaat 30
<210> 264
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 264
gtgcagagga ggagacacat gtcgtggtca 30
<210> 265
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 265
cttgcataca ccatgtccat agagaggatg 30
<210> 266
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 266
caaggccttc tgacaattca gcccgggcag 30
<210> 267
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 267
ttgggttctg tagacttcac atgcaggtgg 30
<210> 268
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 268
atggcagcca ggacaacaat gcgacggcca 30
<210> 269
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 269
ctgggtggcc ttaatgttct cctgtggatt 30
<210> 270
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 270
ctctgttcat tgtacaatat atggcggatg 30
<210> 271
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 271
gaattaagag gtcagaccgt cgtggggcag 30
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-10-17
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒト制御性T (Treg) 細胞の安定性を高めるエクスビボ方法であって、ヒトTreg細胞において、
Rnf20、Sp1、Rfx7、Srf、Elp2、Nsd1、Smarcb1、Klf2、Ctcf、およびSatb1から選択される表1に記載の1つもしくは複数の核内因子の発現を阻害する段階、および／または
Usp22、Atxn7l3、Cbfb、Runx1、myc、Ss18、Med30、Med12、Hnrnpk、Zfp281、Taf5l、Ddit3、Zmynd8、Med14、Rad21、Dmap1、Med11、Zkscan3、Foxp1、Stat5b、およびFoxp3から選択される表2に記載の1つもしくは複数の核内因子を過剰発現させる段階
を含み、
阻害する段階または核内因子を過剰発現させる段階が、Treg細胞を遺伝子改変することによって行われる、前記方法。
Rnf20、Sp1、Rfx7、Srf、Elp2、Nsd1、Smarcb1、Klf2、Ctcf、およびSatb1から選択される表1に記載の1つもしくは複数の核内因子の発現を阻害する段階、および／または
Usp22、Atxn7l3、Cbfb、Runx1、myc、Ss18、Med30、Med12、Hnrnpk、Zfp281、Taf5l、Ddit3、Zmynd8、Med14、Rad21、Dmap1、Med11、Zkscan3、Foxp1、Stat5b、およびFoxp3から選択される表2に記載の1つもしくは複数の核内因子を過剰発現させる段階
を含み、
阻害する段階または核内因子を過剰発現させる段階が、Treg細胞を遺伝子改変することによって行われる、前記方法。
【請求項2】
ヒトTreg細胞の安定性を低下させるエクスビボ方法であって、ヒトTreg細胞において、
Usp22、Atxn7l3、Cbfb、Runx1、myc、Ss18、Med30、Med12、Hnrnpk、Zfp281、Taf5l、Ddit3、Zmynd8、Med14、Rad21、Dmap1、Med11、Zkscan3、Foxp1、Stat5b、およびFoxp3から選択される表2に記載の1つもしくは複数の核内因子の発現を阻害する段階、および／または
Rnf20、Sp1、Rfx7、Srf、Elp2、Nsd1、Smarcb1、Klf2、Ctcf、およびSatb1から選択される表1に記載の1つもしくは複数の核内因子を過剰発現させる段階
を含み、
阻害する段階または核内因子を過剰発現させる段階が、Treg細胞を遺伝子改変することによって行われる、前記方法。
Usp22、Atxn7l3、Cbfb、Runx1、myc、Ss18、Med30、Med12、Hnrnpk、Zfp281、Taf5l、Ddit3、Zmynd8、Med14、Rad21、Dmap1、Med11、Zkscan3、Foxp1、Stat5b、およびFoxp3から選択される表2に記載の1つもしくは複数の核内因子の発現を阻害する段階、および／または
Rnf20、Sp1、Rfx7、Srf、Elp2、Nsd1、Smarcb1、Klf2、Ctcf、およびSatb1から選択される表1に記載の1つもしくは複数の核内因子を過剰発現させる段階
を含み、
阻害する段階または核内因子を過剰発現させる段階が、Treg細胞を遺伝子改変することによって行われる、前記方法。
【請求項3】
(a) 阻害する段階が、
核内因子の発現を減少させること、または
核内因子をコードするポリヌクレオチドの発現を減少させること
を含む、または
(b) 過剰発現させる段階が、
核内因子の発現を増加させること、または
核内因子をコードするポリヌクレオチドの発現を増加させること
を含み、任意で、過剰発現させる段階が、核内因子をコードするポリヌクレオチドをTreg細胞に導入することを含む、
請求項1または2に記載の方法。
核内因子の発現を減少させること、または
核内因子をコードするポリヌクレオチドの発現を減少させること
を含む、または
(b) 過剰発現させる段階が、
核内因子の発現を増加させること、または
核内因子をコードするポリヌクレオチドの発現を増加させること
を含み、任意で、過剰発現させる段階が、核内因子をコードするポリヌクレオチドをTreg細胞に導入することを含む、
請求項1または2に記載の方法。
【請求項4】
阻害する段階が、核内因子をコードするポリヌクレオチドを、標的指向ヌクレアーゼ、またはガイドRNA (gRNA)と接触させることを含み、任意で、阻害する段階が、核内因子をコードするポリヌクレオチドを、少なくとも1つのgRNAおよび任意で標的指向ヌクレアーゼと接触させることを含み、少なくとも1つのgRNAが表3より選択される配列を含む、請求項3(a)に記載の方法。
【請求項5】
阻害する段階が、核内因子をコードするポリヌクレオチドを変異させることを含む、請求項1～4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
阻害する段階が、ポリヌクレオチドを標的指向ヌクレアーゼと接触させることを含み、
任意で、標的指向ヌクレアーゼがポリヌクレオチド内の標的領域に二本鎖切断を導入し、
さらに任意で、標的指向ヌクレアーゼがRNAガイドヌクレアーゼであり、
さらに任意で、RNAガイドヌクレアーゼがCpf1ヌクレアーゼまたはCas9ヌクレアーゼであり、前記方法が、ポリヌクレオチド内の標的領域に特異的にハイブリダイズするgRNAをTreg細胞に導入する段階をさらに含み、
さらに任意で、Cpf1ヌクレアーゼまたはCas9ヌクレアーゼとgRNAとが、リボ核タンパク質 (RNP) 複合体としてTreg細胞に導入される、
請求項5に記載の方法。
任意で、標的指向ヌクレアーゼがポリヌクレオチド内の標的領域に二本鎖切断を導入し、
さらに任意で、標的指向ヌクレアーゼがRNAガイドヌクレアーゼであり、
さらに任意で、RNAガイドヌクレアーゼがCpf1ヌクレアーゼまたはCas9ヌクレアーゼであり、前記方法が、ポリヌクレオチド内の標的領域に特異的にハイブリダイズするgRNAをTreg細胞に導入する段階をさらに含み、
さらに任意で、Cpf1ヌクレアーゼまたはCas9ヌクレアーゼとgRNAとが、リボ核タンパク質 (RNP) 複合体としてTreg細胞に導入される、
請求項5に記載の方法。
【請求項7】
阻害する段階が、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート (CRISPR)／Casゲノム編集を行うことを含む、請求項6に記載の方法。
【請求項8】
(a) Treg細胞が、阻害する段階および／または過剰発現させる段階の後に、ヒトに投与されるものである、かつ/または
(b) Treg細胞がヒト由来であり、該Treg細胞が、核内因子の発現を阻害するおよび／または核内因子を過剰発現させるために処理され、処理されたTreg細胞がヒトに再導入されるものであり、任意で、
(i) 発現の阻害および／または過剰発現が、安定性の向上したTreg細胞をもたらし、任意で、ヒトが自己免疫障害を有する、または
(ii) 発現の阻害および／または過剰発現が、安定性の低下したTreg細胞をもたらし、任意で、ヒトががんを有する、
請求項1～7のいずれか一項に記載の方法。
(b) Treg細胞がヒト由来であり、該Treg細胞が、核内因子の発現を阻害するおよび／または核内因子を過剰発現させるために処理され、処理されたTreg細胞がヒトに再導入されるものであり、任意で、
(i) 発現の阻害および／または過剰発現が、安定性の向上したTreg細胞をもたらし、任意で、ヒトが自己免疫障害を有する、または
(ii) 発現の阻害および／または過剰発現が、安定性の低下したTreg細胞をもたらし、任意で、ヒトががんを有する、
請求項1～7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
(a) 請求項1～7のいずれか一項に記載の方法によって作製された、
(b) Rnf20、Sp1、Rfx7、Srf、Elp2、Nsd1、Smarcb1、Klf2、Ctcf、およびSatb1から選択される表1に記載の核内因子の発現を阻害する遺伝子改変もしくは異種ポリヌクレオチド、および／またはUsp22、Atxn7l3、Cbfb、Runx1、myc、Ss18、Med30、Med12、Hnrnpk、Zfp281、Taf5l、Ddit3、Zmynd8、Med14、Rad21、Dmap1、Med11、Zkscan3、Foxp1、Stat5b、およびFoxp3から選択される表2に記載の核内因子をコードする異種ポリヌクレオチドを含む、
(c) Usp22、Atxn7l3、Cbfb、Runx1、myc、Ss18、Med30、Med12、Hnrnpk、Zfp281、Taf5l、Ddit3、Zmynd8、Med14、Rad21、Dmap1、Med11、Zkscan3、Foxp1、Stat5b、およびFoxp3から選択される表2に記載の核内因子の発現を阻害する遺伝子改変もしくは異種ポリヌクレオチド、および／またはRnf20、Sp1、Rfx7、Srf、Elp2、Nsd1、Smarcb1、Klf2、Ctcf、およびSatb1から選択される表1に記載の核内因子をコードする異種ポリヌクレオチドを含む、または
(d) 表3より選択される配列を含む少なくとも1つのガイドRNA (gRNA)を含み、任意で、Rnf20、Sp1、Rfx7、Srf、Elp2、Nsd1、Smarcb1、Klf2、Ctcf、およびSatb1から選択される表1に記載の核内因子の発現またはUsp22、Atxn7l3、Cbfb、Runx1、myc、Ss18、Med30、Med12、Hnrnpk、Zfp281、Taf5l、Ddit3、Zmynd8、Med14、Rad21、Dmap1、Med11、Zkscan3、Foxp1、Stat5b、およびFoxp3から選択される表2に記載の核内因子の発現が、gRNAを含まないTreg細胞における核内因子の発現と比較して、前記Treg細胞において減少する、
Treg細胞。
(b) Rnf20、Sp1、Rfx7、Srf、Elp2、Nsd1、Smarcb1、Klf2、Ctcf、およびSatb1から選択される表1に記載の核内因子の発現を阻害する遺伝子改変もしくは異種ポリヌクレオチド、および／またはUsp22、Atxn7l3、Cbfb、Runx1、myc、Ss18、Med30、Med12、Hnrnpk、Zfp281、Taf5l、Ddit3、Zmynd8、Med14、Rad21、Dmap1、Med11、Zkscan3、Foxp1、Stat5b、およびFoxp3から選択される表2に記載の核内因子をコードする異種ポリヌクレオチドを含む、
(c) Usp22、Atxn7l3、Cbfb、Runx1、myc、Ss18、Med30、Med12、Hnrnpk、Zfp281、Taf5l、Ddit3、Zmynd8、Med14、Rad21、Dmap1、Med11、Zkscan3、Foxp1、Stat5b、およびFoxp3から選択される表2に記載の核内因子の発現を阻害する遺伝子改変もしくは異種ポリヌクレオチド、および／またはRnf20、Sp1、Rfx7、Srf、Elp2、Nsd1、Smarcb1、Klf2、Ctcf、およびSatb1から選択される表1に記載の核内因子をコードする異種ポリヌクレオチドを含む、または
(d) 表3より選択される配列を含む少なくとも1つのガイドRNA (gRNA)を含み、任意で、Rnf20、Sp1、Rfx7、Srf、Elp2、Nsd1、Smarcb1、Klf2、Ctcf、およびSatb1から選択される表1に記載の核内因子の発現またはUsp22、Atxn7l3、Cbfb、Runx1、myc、Ss18、Med30、Med12、Hnrnpk、Zfp281、Taf5l、Ddit3、Zmynd8、Med14、Rad21、Dmap1、Med11、Zkscan3、Foxp1、Stat5b、およびFoxp3から選択される表2に記載の核内因子の発現が、gRNAを含まないTreg細胞における核内因子の発現と比較して、前記Treg細胞において減少する、
Treg細胞。
【請求項10】
それを必要とする対象においてTreg細胞を不安定化させるための薬学的組成物であって、
Usp22、Atxn7l3、Cbfb、Runx1、myc、Ss18、Med30、Med12、Hnrnpk、Zfp281、Taf5l、Ddit3、Zmynd8、Med14、Rad21、Dmap1、Med11、Zkscan3、Foxp1、Stat5b、およびFoxp3から選択される表2に記載の1つもしくは複数の核内因子の発現を阻害する物質、および／または
Rnf20、Sp1、Rfx7、Srf、Elp2、Nsd1、Smarcb1、Klf2、Ctcf、およびSatb1から選択される表1に記載の1つもしくは複数の核内因子を過剰発現させる物質
を含み、
阻害する物質が、標的指向ヌクレアーゼ、ガイドRNA (gRNA)、CRISPRヌクレアーゼシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TALEN、またはメガヌクレアーゼであり、かつ、
過剰発現させる物質が、Treg細胞に安定的もしくは一過性に導入されているRnf20、Sp1、Rfx7、Srf、Elp2、Nsd1、Smarcb1、Klf2、Ctcf、またはSatb1をコードする異種ポリヌクレオチドである、前記薬学的組成物。
Usp22、Atxn7l3、Cbfb、Runx1、myc、Ss18、Med30、Med12、Hnrnpk、Zfp281、Taf5l、Ddit3、Zmynd8、Med14、Rad21、Dmap1、Med11、Zkscan3、Foxp1、Stat5b、およびFoxp3から選択される表2に記載の1つもしくは複数の核内因子の発現を阻害する物質、および／または
Rnf20、Sp1、Rfx7、Srf、Elp2、Nsd1、Smarcb1、Klf2、Ctcf、およびSatb1から選択される表1に記載の1つもしくは複数の核内因子を過剰発現させる物質
を含み、
阻害する物質が、標的指向ヌクレアーゼ、ガイドRNA (gRNA)、CRISPRヌクレアーゼシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TALEN、またはメガヌクレアーゼであり、かつ、
過剰発現させる物質が、Treg細胞に安定的もしくは一過性に導入されているRnf20、Sp1、Rfx7、Srf、Elp2、Nsd1、Smarcb1、Klf2、Ctcf、またはSatb1をコードする異種ポリヌクレオチドである、前記薬学的組成物。
【請求項11】
対象ががんを有する、請求項10に記載の薬学的組成物。
【請求項12】
それを必要とする対象においてTreg細胞を安定化させるための薬学的組成物であって、
Rnf20、Sp1、Rfx7、Srf、Elp2、Nsd1、Smarcb1、Klf2、Ctcf、およびSatb1から選択される表1に記載の1つもしくは複数の核内因子の発現を阻害する物質、および／または
Usp22、Atxn7l3、Cbfb、Runx1、myc、Ss18、Med30、Med12、Hnrnpk、Zfp281、Taf5l、Ddit3、Zmynd8、Med14、Rad21、Dmap1、Med11、Zkscan3、Foxp1、Stat5b、およびFoxp3から選択される表2に記載の1つもしくは複数の核内因子を過剰発現させる物質
を含み、
阻害する物質が、標的指向ヌクレアーゼ、ガイドRNA (gRNA)、CRISPRヌクレアーゼシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TALEN、またはメガヌクレアーゼであり、かつ、
過剰発現させる物質が、Treg細胞に安定的もしくは一過性に導入されているUsp22、Atxn7l3、Cbfb、Runx1、myc、Ss18、Med30、Med12、Hnrnpk、Zfp281、Taf5l、Ddit3、Zmynd8、Med14、Rad21、Dmap1、Med11、Zkscan3、Foxp1、Stat5b、またはFoxp3をコードする異種ポリヌクレオチドである、前記薬学的組成物。
Rnf20、Sp1、Rfx7、Srf、Elp2、Nsd1、Smarcb1、Klf2、Ctcf、およびSatb1から選択される表1に記載の1つもしくは複数の核内因子の発現を阻害する物質、および／または
Usp22、Atxn7l3、Cbfb、Runx1、myc、Ss18、Med30、Med12、Hnrnpk、Zfp281、Taf5l、Ddit3、Zmynd8、Med14、Rad21、Dmap1、Med11、Zkscan3、Foxp1、Stat5b、およびFoxp3から選択される表2に記載の1つもしくは複数の核内因子を過剰発現させる物質
を含み、
阻害する物質が、標的指向ヌクレアーゼ、ガイドRNA (gRNA)、CRISPRヌクレアーゼシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TALEN、またはメガヌクレアーゼであり、かつ、
過剰発現させる物質が、Treg細胞に安定的もしくは一過性に導入されているUsp22、Atxn7l3、Cbfb、Runx1、myc、Ss18、Med30、Med12、Hnrnpk、Zfp281、Taf5l、Ddit3、Zmynd8、Med14、Rad21、Dmap1、Med11、Zkscan3、Foxp1、Stat5b、またはFoxp3をコードする異種ポリヌクレオチドである、前記薬学的組成物。
【請求項13】
対象が自己免疫障害を有する、請求項12に記載の薬学的組成物。
【請求項14】
対象において自己免疫障害を処置するための薬学的組成物であって、請求項9(b)に記載のTreg細胞の集団を含む、前記薬学的組成物。
【請求項15】
対象においてがんを処置するための薬学的組成物であって、請求項9(c)に記載のTreg細胞の集団を含む、前記薬学的組成物。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0016】
別の態様において、本発明は、対象においてがんを処置する方法であって、(a) がんを有する対象からTreg細胞を採取する段階；(b) Treg細胞において表2に記載の核内因子の発現を阻害すること、および／または表1に記載の核内因子を過剰発現させることにより、Treg細胞を改変する段階；ならびに (c) 改変されたTreg細胞を対象に投与する段階を含む方法を提供する。
[本発明1001]
ヒト制御性T (Treg) 細胞の安定性を高める方法であって、ヒトTreg細胞において、
表1に記載の1つもしくは複数の核内因子の発現を阻害する段階、および／または
表2に記載の1つもしくは複数の核内因子を過剰発現させる段階
を含む、前記方法。
[本発明1002]
ヒトTreg細胞の安定性を低下させる方法であって、ヒトTreg細胞において、
表2に記載の1つもしくは複数の核内因子の発現を阻害する段階、および／または
表1に記載の1つもしくは複数の核内因子を過剰発現させる段階
を含む、前記方法。
[本発明1003]
阻害する段階が、
核内因子の発現を減少させること、または
核内因子をコードするポリヌクレオチドの発現を減少させること
を含む、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
過剰発現させる段階が、
核内因子の発現を増加させること、または
核内因子をコードするポリヌクレオチドの発現を増加させること
を含む、本発明1001または1002の方法。
[本発明1005]
過剰発現させる段階が、核内因子をコードするポリヌクレオチドをTreg細胞に導入することを含む、本発明1004の方法。
[本発明1006]
阻害する段階が、核内因子をコードするポリヌクレオチドを、標的指向ヌクレアーゼ、ガイドRNA (gRNA)、siRNA、アンチセンスRNA、マイクロRNA (miRNA)、または短鎖ヘアピンRNA (shRNA) と接触させることを含む、本発明1003の方法。
[本発明1007]
阻害する段階が、核内因子をコードするポリヌクレオチドを、少なくとも1つのgRNAおよび任意で標的指向ヌクレアーゼと接触させることを含み、少なくとも1つのgRNAが表3より選択される配列を含む、本発明1006の方法。
[本発明1008]
阻害する段階が、核内因子をコードするポリヌクレオチドを変異させることを含む、本発明1001～1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
阻害する段階が、ポリヌクレオチドを標的指向ヌクレアーゼと接触させることを含む、本発明1008の方法。
[本発明1010]
標的指向ヌクレアーゼがポリヌクレオチド内の標的領域に二本鎖切断を導入する、本発明1009の方法。
[本発明1011]
標的指向ヌクレアーゼがRNAガイドヌクレアーゼである、本発明1006または1010の方法。
[本発明1012]
RNAガイドヌクレアーゼがCpf1ヌクレアーゼまたはCas9ヌクレアーゼであり、前記方法が、ポリヌクレオチド内の標的領域に特異的にハイブリダイズするgRNAをTreg細胞に導入する段階をさらに含む、本発明1011の方法。
[本発明1013]
Cpf1ヌクレアーゼまたはCas9ヌクレアーゼとgRNAとが、リボ核タンパク質 (RNP) 複合体としてTreg細胞に導入される、本発明1012の方法。
[本発明1014]
阻害する段階が、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート (CRISPR)／Casゲノム編集を行うことを含む、本発明1009～1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
Treg細胞が、阻害する段階および／または過剰発現させる段階の後に、ヒトに投与される、本発明1001～1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
Treg細胞をヒトから採取した後、該Treg細胞を、核内因子の発現を阻害するおよび／または核内因子を過剰発現させるために処理し、処理したTreg細胞をヒトに再導入する、本発明1001～1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
発現の阻害および／または過剰発現が、安定性の向上したTreg細胞をもたらす、本発明1016の方法。
[本発明1018]
ヒトが自己免疫障害を有する、本発明1017の方法。
[本発明1019]
発現の阻害および／または過剰発現が、安定性の低下したTreg細胞をもたらす、本発明1016の方法。
[本発明1020]
ヒトががんを有する、本発明1019の方法。
[本発明1021]
本発明1001～1014のいずれかの方法によって作製された、Treg細胞。
[本発明1022]
表1に記載の核内因子の発現を阻害する遺伝子改変もしくは異種ポリヌクレオチド、および／または表2に記載の核内因子をコードする異種ポリヌクレオチドを含む、Treg細胞。
[本発明1023]
表2に記載の核内因子の発現を阻害する遺伝子改変もしくは異種ポリヌクレオチド、および／または表1に記載の核内因子をコードする異種ポリヌクレオチドを含む、Treg細胞。
[本発明1024]
表3より選択される配列を含む少なくとも1つのガイドRNA (gRNA)を含む、Treg。
[本発明1025]
表1または表2に記載の核内因子の発現が、gRNAを含まないTreg細胞における核内因子の発現と比較して、前記Treg細胞において減少する、本発明1024のTreg細胞。
[本発明1026]
それを必要とする対象においてTregを不安定化させる方法であって、対象のヒトTreg細胞において、
表2に記載の1つもしくは複数の核内因子の発現を阻害する段階、および／または
表1に記載の1つもしくは複数の核内因子を過剰発現させる段階
を含む、前記方法。
[本発明1027]
表2に記載の1つもしくは複数の核内因子の発現を阻害する段階、および／または表1に記載の1つもしくは複数の核内因子を過剰発現させる段階が、インビボで行われる、本発明1026の方法。
[本発明1028]
Treg細胞を不安定化させる方法が、
(a) 対象からTreg細胞を採取する段階；
(b) 該Treg細胞において表2に記載の核内因子の発現を阻害すること、および／または表1に記載の核内因子を過剰発現させることにより、該Treg細胞を不安定化させる段階；ならびに
(c) 該不安定化Treg細胞を対象に投与する段階
を含む、本発明1026の方法。
[本発明1029]
対象ががんを有する、本発明1026～1027のいずれかの方法。
[本発明1030]
それを必要とする対象においてTregを安定化させる方法であって、対象のヒトTreg細胞において、
表1に記載の1つもしくは複数の核内因子の発現を阻害する段階、および／または
表2に記載の1つもしくは複数の核内因子を過剰発現させる段階
を含む、前記方法。
[本発明1031]
表1に記載の1つもしくは複数の核内因子の発現を阻害する段階、および／または表2に記載の1つもしくは複数の核内因子を過剰発現させる段階が、インビボで行われる、本発明1030の方法。
[本発明1032]
Treg細胞を安定化させる方法が、
(a) 対象からTreg細胞を採取する段階；
(b) 該Treg細胞において表1に記載の核内因子の発現を阻害すること、および／または表2に記載の核内因子を過剰発現させることにより、該Treg細胞を安定化させる段階；ならびに
(c) 該不安定化Treg細胞を対象に投与する段階
を含む、本発明1030の方法。
[本発明1033]
対象が自己免疫障害を有する、本発明1030～1032のいずれかの方法。
[本発明1034]
対象において自己免疫障害を処置する方法であって、自己免疫疾患を有する対象に本発明1022のTreg細胞の集団を投与する段階を含む、前記方法。
[本発明1035]
対象においてがんを処置する方法であって、がんを有する対象に本発明1023のTreg細胞の集団を投与する段階を含む、前記方法。
[本発明1001]
ヒト制御性T (Treg) 細胞の安定性を高める方法であって、ヒトTreg細胞において、
表1に記載の1つもしくは複数の核内因子の発現を阻害する段階、および／または
表2に記載の1つもしくは複数の核内因子を過剰発現させる段階
を含む、前記方法。
[本発明1002]
ヒトTreg細胞の安定性を低下させる方法であって、ヒトTreg細胞において、
表2に記載の1つもしくは複数の核内因子の発現を阻害する段階、および／または
表1に記載の1つもしくは複数の核内因子を過剰発現させる段階
を含む、前記方法。
[本発明1003]
阻害する段階が、
核内因子の発現を減少させること、または
核内因子をコードするポリヌクレオチドの発現を減少させること
を含む、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
過剰発現させる段階が、
核内因子の発現を増加させること、または
核内因子をコードするポリヌクレオチドの発現を増加させること
を含む、本発明1001または1002の方法。
[本発明1005]
過剰発現させる段階が、核内因子をコードするポリヌクレオチドをTreg細胞に導入することを含む、本発明1004の方法。
[本発明1006]
阻害する段階が、核内因子をコードするポリヌクレオチドを、標的指向ヌクレアーゼ、ガイドRNA (gRNA)、siRNA、アンチセンスRNA、マイクロRNA (miRNA)、または短鎖ヘアピンRNA (shRNA) と接触させることを含む、本発明1003の方法。
[本発明1007]
阻害する段階が、核内因子をコードするポリヌクレオチドを、少なくとも1つのgRNAおよび任意で標的指向ヌクレアーゼと接触させることを含み、少なくとも1つのgRNAが表3より選択される配列を含む、本発明1006の方法。
[本発明1008]
阻害する段階が、核内因子をコードするポリヌクレオチドを変異させることを含む、本発明1001～1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
阻害する段階が、ポリヌクレオチドを標的指向ヌクレアーゼと接触させることを含む、本発明1008の方法。
[本発明1010]
標的指向ヌクレアーゼがポリヌクレオチド内の標的領域に二本鎖切断を導入する、本発明1009の方法。
[本発明1011]
標的指向ヌクレアーゼがRNAガイドヌクレアーゼである、本発明1006または1010の方法。
[本発明1012]
RNAガイドヌクレアーゼがCpf1ヌクレアーゼまたはCas9ヌクレアーゼであり、前記方法が、ポリヌクレオチド内の標的領域に特異的にハイブリダイズするgRNAをTreg細胞に導入する段階をさらに含む、本発明1011の方法。
[本発明1013]
Cpf1ヌクレアーゼまたはCas9ヌクレアーゼとgRNAとが、リボ核タンパク質 (RNP) 複合体としてTreg細胞に導入される、本発明1012の方法。
[本発明1014]
阻害する段階が、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート (CRISPR)／Casゲノム編集を行うことを含む、本発明1009～1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
Treg細胞が、阻害する段階および／または過剰発現させる段階の後に、ヒトに投与される、本発明1001～1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
Treg細胞をヒトから採取した後、該Treg細胞を、核内因子の発現を阻害するおよび／または核内因子を過剰発現させるために処理し、処理したTreg細胞をヒトに再導入する、本発明1001～1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
発現の阻害および／または過剰発現が、安定性の向上したTreg細胞をもたらす、本発明1016の方法。
[本発明1018]
ヒトが自己免疫障害を有する、本発明1017の方法。
[本発明1019]
発現の阻害および／または過剰発現が、安定性の低下したTreg細胞をもたらす、本発明1016の方法。
[本発明1020]
ヒトががんを有する、本発明1019の方法。
[本発明1021]
本発明1001～1014のいずれかの方法によって作製された、Treg細胞。
[本発明1022]
表1に記載の核内因子の発現を阻害する遺伝子改変もしくは異種ポリヌクレオチド、および／または表2に記載の核内因子をコードする異種ポリヌクレオチドを含む、Treg細胞。
[本発明1023]
表2に記載の核内因子の発現を阻害する遺伝子改変もしくは異種ポリヌクレオチド、および／または表1に記載の核内因子をコードする異種ポリヌクレオチドを含む、Treg細胞。
[本発明1024]
表3より選択される配列を含む少なくとも1つのガイドRNA (gRNA)を含む、Treg。
[本発明1025]
表1または表2に記載の核内因子の発現が、gRNAを含まないTreg細胞における核内因子の発現と比較して、前記Treg細胞において減少する、本発明1024のTreg細胞。
[本発明1026]
それを必要とする対象においてTregを不安定化させる方法であって、対象のヒトTreg細胞において、
表2に記載の1つもしくは複数の核内因子の発現を阻害する段階、および／または
表1に記載の1つもしくは複数の核内因子を過剰発現させる段階
を含む、前記方法。
[本発明1027]
表2に記載の1つもしくは複数の核内因子の発現を阻害する段階、および／または表1に記載の1つもしくは複数の核内因子を過剰発現させる段階が、インビボで行われる、本発明1026の方法。
[本発明1028]
Treg細胞を不安定化させる方法が、
(a) 対象からTreg細胞を採取する段階；
(b) 該Treg細胞において表2に記載の核内因子の発現を阻害すること、および／または表1に記載の核内因子を過剰発現させることにより、該Treg細胞を不安定化させる段階；ならびに
(c) 該不安定化Treg細胞を対象に投与する段階
を含む、本発明1026の方法。
[本発明1029]
対象ががんを有する、本発明1026～1027のいずれかの方法。
[本発明1030]
それを必要とする対象においてTregを安定化させる方法であって、対象のヒトTreg細胞において、
表1に記載の1つもしくは複数の核内因子の発現を阻害する段階、および／または
表2に記載の1つもしくは複数の核内因子を過剰発現させる段階
を含む、前記方法。
[本発明1031]
表1に記載の1つもしくは複数の核内因子の発現を阻害する段階、および／または表2に記載の1つもしくは複数の核内因子を過剰発現させる段階が、インビボで行われる、本発明1030の方法。
[本発明1032]
Treg細胞を安定化させる方法が、
(a) 対象からTreg細胞を採取する段階；
(b) 該Treg細胞において表1に記載の核内因子の発現を阻害すること、および／または表2に記載の核内因子を過剰発現させることにより、該Treg細胞を安定化させる段階；ならびに
(c) 該不安定化Treg細胞を対象に投与する段階
を含む、本発明1030の方法。
[本発明1033]
対象が自己免疫障害を有する、本発明1030～1032のいずれかの方法。
[本発明1034]
対象において自己免疫障害を処置する方法であって、自己免疫疾患を有する対象に本発明1022のTreg細胞の集団を投与する段階を含む、前記方法。
[本発明1035]
対象においてがんを処置する方法であって、がんを有する対象に本発明1023のTreg細胞の集団を投与する段階を含む、前記方法。
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】