特開 2023-182807 遺伝子およびタンパク質の発現を検出する生体分子プローブおよびその検出方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023182807

(43)【公開日】2023-12-26

(54)【発明の名称】遺伝子およびタンパク質の発現を検出する生体分子プローブおよびその検出方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/686 20180101AFI20231219BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20231219BHJP

   C12Q 1/6813 20180101ALI20231219BHJP

   C12Q 1/6888 20180101ALN20231219BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/686 Z

C12N15/09 Z ZNA

C12Q1/6813 Z

C12Q1/6888 Z

【審査請求】有

【請求項の数】33

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023180942

(22)【出願日】2023-10-20

(62)【分割の表示】P 2020542878の分割

【原出願日】2019-02-11

(31)【優先権主張番号】62/629,180

(32)【優先日】2018-02-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/771,212

(32)【優先日】2018-11-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】513322707

【氏名又は名称】ナノストリング テクノロジーズ，インコーポレイティド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居 良太郎

(74)【代理人】

【識別番号】100197169

【弁理士】

【氏名又は名称】柴田 潤二

(72)【発明者】

【氏名】ジョーセフ ビーチェム

(72)【発明者】

【氏名】テ キム

(72)【発明者】

【氏名】マーガレット ホアン

(72)【発明者】

【氏名】マーク グレゴリー

(72)【発明者】

【氏名】エリン ピアザ

(72)【発明者】

【氏名】デニース チョウ

(57)【要約】

【課題】遺伝子およびタンパク質の発現を検出する生体分子プローブおよびその検出方法の提供。
【解決手段】本発明は、特に、利用者規定の組織領域、利用者規定の細胞、および／または細胞内の利用者規定の細胞内構造における、タンパク質および／または核酸の発現を同時に多重化検出および定量するための、既存の配列決定技術での使用に適応可能なプローブ、組成物、方法、およびキットに関する。
【選択図】図２０

【特許請求の範囲】

【請求項1】

組織試料からの少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する方法であって、以下：
（１）組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を、標的結合ドメイン及び識別子オリゴヌクレオチドを含む少なくとも１つのプローブと接触させる工程であって、ここで識別子オリゴヌクレオチドは、前記標的結合ドメインに結合した前記標的検体を識別する固有の核酸配列を含む、工程；
（２）前記識別子オリゴヌクレオチドを解放させるのに十分な力を前記組織試料の位置に加える工程；
（３）解放された前記識別子オリゴヌクレオチドを採取する工程；
（４）解放された前記識別子オリゴヌクレオチドに第１の核酸プローブおよび第２の核酸プローブをハイブリダイズする工程であって、
ここで前記第１の核酸プローブは、
前記識別子オリゴヌクレオチドの一部分に相補的な核酸、
固有の分子識別子を含む核酸配列、および
第１の増幅プライマー結合部位を含み、
ここで前記第２の核酸プローブは、
前記識別子オリゴヌクレオチドの一部分に相補的な核酸、および
第２の増幅プライマー結合部位を含み、
ここで前記第１および第２の核酸プローブは、前記第１および第２の核酸プローブが隣接しているが重ならないように前記識別子オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする、工程；
（５）ハイブリダイズされた前記第１および第２の核酸プローブを共に連結する工程； （６）工程（５）で生成された前記連結産物を増幅する工程；および
（７）工程（６）で生成された前記増幅産物を配列決定して前記解放された識別子オリゴヌクレオチドを識別し、それにより組織試料中の前記少なくとも１つの細胞内の前記少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する工程
を含む、方法。

【請求項2】

前記連結産物を増幅する工程は、ＰＣＲを実施する工程を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ＰＣＲを実施する工程は、第１の増幅プライマーおよび第２の増幅プライマーを含み、 ここで前記第１の増幅プライマーは、
第１のフローセル結合部位、
前記識別子オリゴヌクレオチドが解放された前記組織試料の前記特定の位置を識別する第１の核酸配列、および
前記第２の増幅プライマー結合部位に相補的な核酸配列
を含み；
ここで前記第２の増幅プライマーは、
第２のフローセル結合部位、
前記識別子オリゴヌクレオチドが解放された前記試料の前記特定の位置を識別する第２の核酸配列、および
前記第１の増幅プライマー結合部位に相補的な核酸配列
を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記増幅プライマーのうちの少なくとも１つは親和性分子を含む、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記標的結合ドメインに結合した前記標的検体を識別する前記固有の核酸配列は、約１０ヌクレオチド～約５０ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記増幅プライマー結合部位のうちの少なくとも１つは、約２０～約５０ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

組織試料からの少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する方法であって、以下：
（１）組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を、標的結合ドメインおよび識別子オリゴヌクレオチドを含む少なくとも１つのプローブと接触させる工程であって、
ここで前記識別子オリゴヌクレオチドは、
前記標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列、
固有の分子識別子を含む核酸配列、
第１の増幅プライマー結合部位、および
第２の増幅プライマー結合部位
を含む、工程；
（２）前記識別子オリゴヌクレオチドを解放させるのに十分な力を前記組織試料の位置に加える工程；
（３）前記解放された識別子オリゴヌクレオチドを採取する工程；
（４）前記採取された識別子オリゴヌクレオチドを増幅する工程；および
（５）工程（４）で生成された前記増幅産物を配列決定して前記解放された識別子オリゴヌクレオチドを識別し、それにより組織試料中の前記少なくとも１つの細胞内の前記少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する工程
を含む、方法。

【請求項8】

前記採取された識別子オリゴヌクレオチドを増幅する工程は、ＰＣＲを実施する工程を含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記ＰＣＲを実施する工程は、第１の増幅プライマーおよび第２の増幅プライマーを含み、
ここで前記第１の増幅プライマーは、
第１のフローセル結合部位、
前記識別子オリゴヌクレオチドが解放された前記組織試料の前記特定の位置を識別する第１の核酸配列、および
前記第２の増幅プライマー結合部位に相補的な核酸配列
を含み；
ここで前記第２の増幅プライマーは、
第２のフローセル結合部位、
前記識別子オリゴヌクレオチドが解放された前記試料の前記特定の位置を識別する第２の核酸配列、および
前記第１の増幅プライマー結合部位に相補的な核酸配列
を含む、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記フローセル結合部位のうちの少なくとも１つは、配列決定に適するフローセルアダプター配列を含む、請求項３または９に記載の方法。

【請求項11】

前記フローセル結合部位のうちの少なくとも１つは、Ｐ５フローセルアダプター配列を含み、ここで前記Ｐ５フローセルアダプター配列は配列番号３に記載の配列を含む、請求項３または９に記載の方法。

【請求項12】

前記フローセル結合部位のうちの少なくとも１つは、Ｐ７フローセルアダプター配列を含み、前記Ｐ７フローセルアダプター配列は配列番号４に記載の配列を含む、請求項３または９に記載の方法。

【請求項13】

前記フローセル結合部位のうちの少なくとも１つは、約１５～約４０ヌクレオチドを含む、請求項３または９に記載の方法。

【請求項14】

前記標的結合ドメインに結合した前記標的検体を識別する前記固有の核酸配列は、約５ヌクレオチド～約２５ヌクレオチドを含む、請求項７に記載の方法。

【請求項15】

前記増幅プライマー結合部位のうちの少なくとも１つは、約１０～約４０ヌクレオチドを含む、請求項７に記載の方法。

【請求項16】

前記増幅プライマー結合部位のうちの少なくとも１つはｉ７配列を含み、ここで前記ｉ７配列は配列番号１に記載の配列を含む、請求項１または７に記載の方法。

【請求項17】

前記増幅プライマー結合部位のうちの少なくとも１つはｉ５配列を含み、ここで前記ｉ５配列は配列番号２に記載の配列を含む、請求項１または７に記載の方法。

【請求項18】

前記識別子オリゴヌクレオチドが解放された前記組織試料の前記特定の位置を識別する前記核酸配列のうちの少なくとも１つは、約１～約２０ヌクレオチドを含む、請求項３または９に記載の方法。

【請求項19】

固有の分子識別子を含む前記核酸配列は、約５～約２０ヌクレオチドを含む、請求項１または７に記載の方法。

【請求項20】

前記標的結合ドメインは、約１０ヌクレオチド～約７０ヌクレオチドを含む、請求項７に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明の背景技術
本出願は、２０１８年２月１２日に出願された米国仮出願第６２／６２９，１８０号、および２０１８年１１月２６日に出願された米国仮出願第６２／７７１，２１２号の優先権およびそれらの利益を主張する。前述のそれぞれの特許出願の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列リスト
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを通してＡＳＣＩＩ方式で提出された配列一覧を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１９年２月１日に作成された前記ＡＳＣＩＩの複製物は、「ＮＡＴＥ－０３７＿００１ＷＯ．ｔｘｔ」と命名され、容量は４８．４ＫＢである。

【背景技術】

【0003】

標準的な免疫組織化学的かつｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイズ法は、最大で６～１０個、典型的には３～４個のタンパク質または核酸標的の同時検出を可能にする。組織の利用者規定の領域、利用者規定の細胞、および／または細胞内の利用者規定の部分細胞組織中のタンパク質発現および／または核酸発現の同時多重検出および定量のために、プローブ、組成物、方法、およびキットが必要とされている。さらに、多数の最終利用者に既に活用されている既存の配列決定技術での使用に適合可能なこのようなシステムが必要とされている。

【発明の概要】

【0004】

本開示は、組織の利用者規定の領域、利用者規定の細胞、および／または細胞内の利用者規定の部分細胞組織でのタンパク質発現および／または核酸発現の同時多重の空間的検出および定量のためのプローブ、組成物、方法、およびキットに関する。

【0005】

本開示は、組織試料からの少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する方法を提供し、この方法は、（１）組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を、標的結合ドメインならびに標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列を含む識別子オリゴヌクレオチドを含む少なくとも１つのプローブと接触させる工程、（２）識別子オリゴヌクレオチドを解放させるのに十分な力を組織試料の位置に加える工程、（３）解放された識別子オリゴヌクレオチドを採取する工程、（４）解放された識別子オリゴヌクレオチドに、識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列、固有の分子識別子を含む核酸配列、第１の増幅プライマー結合部位、第２の増幅プライマー結合部位、および任意に連結の偏りを最小にするための定常核酸配列を含む少なくとも１つの核酸アダプターを連結する工程、（５）工程（４）で生成された連結産物を増幅する工程、および（６）工程（５）で生成された増幅産物を配列決定して解放された識別子オリゴヌクレオチドを識別し、それにより組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する工程を含む。

【0006】

本開示はまた、組織試料からの少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する方法を提供し、この方法は、（１）組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を、標的結合ドメインならびに標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列を含む識別子オリゴヌクレオチドを含む少なくとも１つのプローブと接触させる工程、（２）識別子オリゴヌクレオチドを解放させるのに十分な力を組織試料の位置に加える工程、（３）解放された識別子オリゴヌクレオチドを採取する工程、（４）解放された識別子オリゴヌクレオチドに、固有の分子識別子を含む核酸配列、第１の増幅プライマー結合部位、第２の増幅プライマー結合部位、および任意に連結の偏りを最小にするための定常核酸配列を含む少なくとも１つの核酸アダプターを連結する工程であって、ここで第１または第２の増幅プライマー結合部位の少なくとも１つは、識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する、工程、（５）工程（４）で生成された連結産物を増幅する工程、および（６）工程（５）で生成された増幅産物を配列決定して解放された識別子オリゴヌクレオチドを識別し、それにより組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する工程を含む。

【0007】

本開示はまた、組織試料からの少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する方法を提供し、この方法は、（１）組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を、標的結合ドメインならびに標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列を含む識別子オリゴヌクレオチドを含む少なくとも１つのプローブと接触させる工程、（２）識別子オリゴヌクレオチドを解放させるのに十分な力を組織試料の位置に加える工程、（３）解放された識別子オリゴヌクレオチドを採取する工程、（４）解放された識別子オリゴヌクレオチドに、固有の分子識別子を含む核酸配列、第１の増幅プライマー結合部位、第２の増幅プライマー結合部位、および任意に連結の偏りを最小にするための定常核酸配列を含む少なくとも１つの核酸アダプターを連結する工程であって、ここで前記第１および第２の増幅プライマーのうちの少なくとも１つは、識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列を含む、工程、（５）第１の増幅プライマー結合部位に結合できる第１の増幅プライマーおよび第２の増幅プライマー結合部位に結合できる第２の増幅プライマーを用いて、工程（４）で生成された伸長産物を増幅する工程、および（６）工程（５）で生成された増幅産物を配列決定して解放された識別子オリゴヌクレオチドを識別し、それにより組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する工程を含む。

【0008】

工程（４）の核酸アダプターは、部分的に二本鎖の核酸分子であってもよい。部分的に二本鎖の核酸アダプターは、二本鎖アニール領域、第１の一本鎖不一致領域および第２の一本鎖不一致領域を含んでもよい。第１の一本鎖不一致領域および第２の一本鎖不一致領域は、二本鎖アニール領域の反対側に存在してもよい。

【0009】

識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列は、部分的に二本鎖の核酸アダプターの二本鎖アニール領域に存在してもよい。

【0010】

連結の偏りを最小にするための定常核酸配列は、部分的に二本鎖の核酸アダプターの二本鎖アニール領域に存在してもよい。

【0011】

固有の分子識別子は、部分的に二本鎖の核酸アダプターの第１または第２の一本鎖不一致領域の少なくとも一つに存在してもよい。

【0012】

第１の増幅プライマー結合部位は、部分的に二本鎖の核酸アダプターの第１の一本鎖不一致領域に存在してもよく、第２の増幅プライマー結合部位は、同じ部分的に二本鎖の核酸アダプターの第２の一本鎖不一致領域に存在してもよい。

【0013】

前述の本開示の方法はさらに、工程（４）の前に、末端修復反応を実施する工程を含んでもよい。この方法はさらに、工程（４）の前に、付加（ｔａｉｌｉｎｇ）反応を実施して、単一ヌクレオチドの突出部を識別子オリゴヌクレオチドの３’末端に結合させる工程を含んでもよい。この方法はさらに、工程（４）の前に、末端修復反応および付加反応を実施して、単一ヌクレオチドの突出部を識別子オリゴヌクレオチドの３’末端に結合させる工程を含んでもよい。付加反応および末端修復反応は、順次に、あるいは同時に実施してもよい。

【0014】

本開示は、組織試料からの少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する方法を提供し、この方法は、（１）組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を、標的結合ドメインならびに第１の増幅プライマー結合部位および標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列を含む識別子オリゴヌクレオチドを含む少なくとも１つのプローブと接触させる工程、（２）識別子オリゴヌクレオチドを解放させるのに十分な力を組織試料の位置に加える工程、（３）解放された識別子オリゴヌクレオチドを採取する工程、（４）解放された識別子オリゴヌクレオチドに、識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列、固有の分子識別子を含む核酸配列、第２の増幅プライマー結合部位、および任意に連結の偏りを最小にするための定常核酸配列を含む少なくとも１つの核酸アダプターを連結する工程、（５）工程（４）で生成された連結産物を増幅する工程、および（６）工程（５）で生成された増幅産物を配列決定して解放された識別子オリゴヌクレオチドを識別し、それにより組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する工程を含む。

【0015】

本開示はまた、組織試料からの少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する方法を提供し、この方法は、（１）組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を、標的結合ドメインならびに第１の増幅プライマー結合部位および標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列を含む識別子オリゴヌクレオチドを含む少なくとも１つのプローブと接触させる工程、（２）識別子オリゴヌクレオチドを解放させるのに十分な力を組織試料の位置に加える工程、（３）解放された識別子オリゴヌクレオチドを採取する工程、（４）解放された識別子オリゴヌクレオチドに、固有の分子識別子を含む核酸配列、第２の増幅プライマー結合部位、および任意に連結の偏りを最小にするための定常核酸配列を含む少なくとも１つの核酸アダプターを連結する工程、（５）第１の増幅プライマー結合部位に結合できる第１の増幅プライマーおよび第２の増幅プライマー結合部位に結合できる第２の増幅プライマーを用いて、工程（４）で生成された伸長産物を増幅する工程であって、ここで前記増幅プライマーのうちの少なくとも１つは、識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列を含む、工程、および（６）工程（５）で生成された増幅産物を配列決定して解放された識別子オリゴヌクレオチドを識別し、それにより組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する工程を含む。

【0016】

工程（４）の核酸アダプターは、部分的に二本鎖の核酸分子であってもよい。部分的に二本鎖の核酸アダプターは、二本鎖アニール領域および一本鎖不一致領域を含んでもよい。

【0017】

識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列は、部分的に二本鎖の核酸アダプターの二本鎖アニール領域に存在してもよい。

【0018】

連結の偏りを最小にするための定常核酸配列は、部分的に二本鎖の核酸アダプターの二本鎖アニール領域に存在してもよい。定常核酸配列はまた、切断可能な部分を含んでもよい。切断可能な部分は、酵素により切断可能な部分であってもよい。酵素により切断可能な部分は、ユーザー（ＵＳＥＲ）配列であってもよい。

【0019】

固有の分子識別子は、部分的に二本鎖の核酸アダプターの一本鎖不一致領域内に存在してもよい。

【0020】

第２の増幅プライマー結合部位は、部分的に二本鎖の核酸アダプターの一本鎖不一致領域に存在してもよい。

【0021】

本開示は、組織試料からの少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する方法を提供し、この方法は、（１）組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を、標的結合ドメインならびに第１の増幅プライマー結合部位および標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列を含む識別子オリゴヌクレオチドを含む少なくとも１つのプローブと接触させる工程、（２）識別子オリゴヌクレオチドを解放させるのに十分な力を組織試料の位置に加える工程、（３）解放された識別子オリゴヌクレオチドを採取する工程、（４）解放された識別子オリゴヌクレオチドに、識別子オリゴヌクレオチドの固有の核酸配列に相補的な領域、固有の分子識別子を含む核酸配列、第２の増幅プライマー結合部位に相補的な核酸配列、および任意に親和性分子を含む一本鎖の核酸鋳型をハイブリダイズする工程、（５）工程（４）の識別子オリゴヌクレオチドを伸長させて、識別子オリゴヌクレオチド、固有の分子識別子に相補的な核酸配列、および第２の増幅プライマー結合部位を含む、一本鎖の核酸鋳型に相補的な伸長産物を生成する工程、（６）第１の増幅プライマー結合部位に結合できる第１の増幅プライマーおよび第２の増幅プライマー結合部位に結合できる第２の増幅プライマーを用いて、工程（５）で生成された伸長産物を増幅する工程であって、ここで前記第１および第２の増幅プライマーのうちの少なくとも１つは、識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列を含む、工程、および（７）工程（６）で生成された増幅産物を配列決定して解放された識別子オリゴヌクレオチドを識別し、それにより組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出することを含む。

【0022】

本開示は、組織試料からの少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する方法を提供し、この方法は、（１）組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を、標的結合ドメインならびに第１の増幅プライマー結合部位および標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列を含む識別子オリゴヌクレオチドを含む少なくとも１つのプローブと接触させる工程、（２）識別子オリゴヌクレオチドを解放させるのに十分な力を組織試料の位置に加える工程、（３）解放された識別子オリゴヌクレオチドを採取する工程、（４）解放された識別子オリゴヌクレオチドに、識別子オリゴヌクレオチドの固有の核酸配列に相補的な領域、識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列、固有の分子識別子を含む核酸配列、第２の増幅プライマー結合部位に相補的な核酸配列、および任意に親和性分子を含む一本鎖の核酸鋳型をハイブリダイズする工程、（５）工程（４）の識別子オリゴヌクレオチドを伸長させて、識別子オリゴヌクレオチド、識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列に相補的な核酸配列、固有の分子識別子に相補的な核酸配列、および第２の増幅プライマー結合部位を含む、一本鎖の核酸鋳型に相補的な伸長産物を生成する工程、（６）工程（５）で生成された伸長産物を増幅する工程、および（７）工程（６）で生成された増幅産物を配列決定して解放された識別子オリゴヌクレオチドを識別し、それにより組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出することを含む。

【0023】

一本鎖の核酸鋳型はさらに、親和性分子を含んでもよい。一本鎖の核酸鋳型が親和性分子を含む側面では、前述の本開示の方法はさらに、工程（４）と（５）の間に親和性の精製工程を含んでもよい。

【0024】

本開示は、組織試料からの少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する方法を提供し、この方法は、（１）組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を、標的結合ドメインならびに標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列を含む識別子オリゴヌクレオチドを含む少なくとも１つのプローブと接触させる工程、（２）識別子オリゴヌクレオチドを解放させるのに十分な力を組織試料の位置に加える工程、（３）解放された識別子オリゴヌクレオチドを採取する工程、（４）解放された識別子オリゴヌクレオチドに第１の核酸プローブおよび第２の核酸プローブをハイブリダイズする工程であって、ここで第１の核酸プローブは、識別子オリゴヌクレオチドの一部分に相補的な核酸、識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列、および第１の増幅プライマー結合部位を含み、ここで第２の核酸プローブは、識別子オリゴヌクレオチドの一部分に相補的な核酸、固有の分子識別子を含む核酸配列、および第２の増幅プライマー結合部位を含み、ここで第１および第２の核酸プローブは、第１および第２の核酸プローブが隣接しているが重ならないように識別子オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする、工程、（５）ハイブリダイズされた第１および第２の核酸プローブが共に連結されるようにニック修復（ｎｉｃｋ ｒｅｐａｉｒ）を実施する工程、（６）工程（５）で生成された連結産物を増幅する工程、および（７）工程（６）で生成された増幅産物を配列決定して解放された識別子オリゴヌクレオチドを識別し、それにより組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出することを含む。

【0025】

本開示はまた、組織試料からの少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する方法を提供し、この方法は、（１）組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を、標的結合ドメインならびに標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列を含む識別子オリゴヌクレオチドを含む少なくとも１つのプローブと接触させる工程、（２）識別子オリゴヌクレオチドを解放させるのに十分な力を組織試料の位置に加える工程、（３）解放された識別子オリゴヌクレオチドを採取する工程、（４）解放された識別子オリゴヌクレオチドに第１の核酸プローブおよび第２の核酸プローブをハイブリダイズする工程であって、ここで第１の核酸プローブは、識別子オリゴヌクレオチドの一部分に相補的な核酸および第１の増幅プライマー結合部位を含み、ここで第２の核酸プローブは、識別子オリゴヌクレオチドの一部分に相補的な核酸および第２の増幅プライマー結合部位を含み、ここで第１または第２の核酸プローブの少なくとも１つは、固有の分子識別子を含む核酸配列を含み、ここで第１または第２の核酸プローブの少なくとも１つは、識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列を含み、ここで第１および第２の核酸プローブは、隣接しているが重ならないように、識別子オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする、工程、（５）ハイブリダイズされた第１および第２の核酸プローブが共に連結されるようにニック修復を実施する工程、（６）工程（５）で生成された連結産物を増幅する工程、および（７）工程（６）で生成された増幅産物を配列決定して解放された識別子オリゴヌクレオチドを識別し、それにより組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出することを含む。

【0026】

本開示はまた、組織試料からの少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する方法を提供し、この方法は、（１）組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を、標的結合ドメインならびに標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列を含む識別子オリゴヌクレオチドを含む少なくとも１つのプローブと接触させる工程、（２）識別子オリゴヌクレオチドを解放させるのに十分な力を組織試料の位置に加える工程、（３）解放された識別子オリゴヌクレオチドを採取する工程、（４）解放された識別子オリゴヌクレオチドに第１の核酸プローブおよび第２の核酸プローブをハイブリダイズする工程であって、ここで第１の核酸プローブは、識別子オリゴヌクレオチドの一部分に相補的な核酸、識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列、および第１の増幅プライマー結合部位を含み、ここで第２の核酸プローブは、識別子オリゴヌクレオチドの一部分に相補的な核酸、固有の分子識別子を含む核酸配列、および第２の増幅プライマー結合部位を含み、ここで第１および第２の核酸プローブは、第１および第２の核酸プローブが隣接しているが重ならないように識別子オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする、工程、（５）ハイブリダイズされた第１および第２の核酸プローブが共に連結されるように、間隙伸長（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）およびニック修復反応を実施する工程、（６）工程（５）で生成された連結産物を増幅する工程、および（７）工程（６）で生成された増幅産物を配列決定して解放された識別子オリゴヌクレオチドを識別し、それにより組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出することを含む。

【0027】

本開示はまた、組織試料からの少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する方法を提供し、この方法は、（１）組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を、標的結合ドメインならびに標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列を含む識別子オリゴヌクレオチドを含む少なくとも１つのプローブと接触させる工程、（２）識別子オリゴヌクレオチドを解放させるのに十分な力を組織試料の位置に加える工程、（３）解放された識別子オリゴヌクレオチドを採取する工程、（４）解放された識別子オリゴヌクレオチドに第１の核酸プローブおよび第２の核酸プローブをハイブリダイズする工程であって、ここで第１の核酸プローブは、識別子オリゴヌクレオチドの一部分に相補的な核酸、および第１の増幅プライマー結合部位を含み、ここで第２の核酸プローブは、識別子オリゴヌクレオチドの一部分に相補的な核酸、および第２の増幅プライマー結合部位を含み、ここで第１または第２の核酸プローブの少なくとも１つは、固有の分子識別子を含む核酸配列を含み、ここで第１または第２の核酸プローブの少なくとも１つは、識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列を含み、ここで第１および第２の核酸プローブは、第１および第２の核酸プローブが隣接しているが重ならないように識別子オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする、工程、（５）ハイブリダイズされた第１および第２の核酸プローブが共に連結されるように、間隙伸長およびニック修復反応を実施する工程、（６）工程（５）で生成された連結産物を増幅する工程、および（７）工程（６）で生成された増幅産物を配列決定して解放された識別子オリゴヌクレオチドを識別し、それにより組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出することを含む。

【0028】

識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列が第１の核酸プローブに位置する側面では、識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列は、第１の増幅プライマー結合部位の５’に位置してもよい。

【0029】

固有の分子識別子が第２の核酸プローブに位置する側面では、固有の分子識別子は、第２の増幅プライマー結合部位の３’に位置してもよい。

【0030】

識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列および固有の分子識別子が第１の核酸プローブに存在する側面では、識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列および固有の分子識別子は、第１の増幅プライマー結合部位の５’に位置してもよい。

【0031】

識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列および固有の分子識別子が第２の核酸プローブに存在する側面では、識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列および固有の分子識別子は、第２の増幅プライマー結合部位の３’に位置してもよい。

【0032】

固有の分子識別子が第１の核酸プローブに存在し、識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列が第２の核酸プローブに存在する側面では、固有の分子識別子は、第１の増幅プライマー結合部位の５’に位置してもよく、識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列は、第２の増幅結合部位の３’に位置してもよい。

【0033】

本開示は、組織試料からの少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する方法を提供し、この方法は、（１）組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を、標的結合ドメインならびに標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列を含む識別子オリゴヌクレオチドを含む少なくとも１つのプローブと接触させる工程、（２）識別子オリゴヌクレオチドを解放させるのに十分な力を組織試料の位置に加える工程、（３）解放された識別子オリゴヌクレオチドを採取する工程、（４）解放された識別子オリゴヌクレオチドに第１の核酸プローブおよび第２の核酸プローブをハイブリダイズする工程であって、ここで第１の核酸プローブは、識別子オリゴヌクレオチドの一部分に相補的な核酸、識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列、第１の増幅プライマー結合部位、第１の固有の分子識別子を含む核酸配列、および第１のフローセル結合部位を含み、ここで第２の核酸プローブは、識別子オリゴヌクレオチドの一部分に相補的な核酸、第２の固有の分子識別子を含む核酸配列、第３の固有の分子識別子を含む核酸配列、および第２のフローセル結合部位を含み、ここで第１および第２の核酸プローブは、第１および第２の核酸プローブが隣接しているが重ならないように識別子オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする、工程、（５）ハイブリダイズした第１および第２の核酸プローブが共に連結されるように、ニック修復反応を実施する工程、（６）工程（５）で生成された連結産物を増幅する工程、および（７）工程（６）で生成された増幅産物を配列決定して解放された識別子オリゴヌクレオチドを識別し、それにより組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出することを含む。

【0034】

本開示はまた、組織試料からの少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する方法を提供し、この方法は、（１）組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を、標的結合ドメインならびに標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列を含む識別子オリゴヌクレオチドを含む少なくとも１つのプローブと接触させる工程、（２）識別子オリゴヌクレオチドを解放させるのに十分な力を組織試料の位置に加える工程、（３）解放された識別子オリゴヌクレオチドを採取する工程、（４）解放された識別子オリゴヌクレオチドに第１の核酸プローブおよび第２の核酸プローブをハイブリダイズする工程であって、ここで第１の核酸プローブは、識別子オリゴヌクレオチドの一部分に相補的な核酸、第１の増幅プライマー結合部位、第１の固有の分子識別子を含む核酸配列、および第１のフローセル結合部位を含み、ここで第２の核酸プローブは、識別子オリゴヌクレオチドの一部分に相補的な核酸、第２の固有の分子識別子を含む核酸配列、および第２のフローセル結合部位を含み、ここで第１または第２の核酸プローブの少なくとも１つは、第３の固有の分子識別子を含む核酸配列を含み、ここで第１または第２の核酸プローブの少なくとも１つは、識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列を含み、ここで第１および第２の核酸プローブは、第１および第２の核酸プローブが隣接しているが重ならないように識別子オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする、工程（５）ハイブリダイズされた第１および第２の核酸プローブが共に連結されるように、ニック修復を実施する工程、（６）工程（５）で生成された連結産物を増幅する工程、および（７）工程（６）で生成された増幅産物を配列決定して解放された識別子オリゴヌクレオチドを識別し、それにより組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出することを含む。

【0035】

本開示はまた、組織試料からの少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する方法を提供し、この方法は、（１）組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を、標的結合ドメインならびに標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列を含む識別子オリゴヌクレオチドを含む少なくとも１つのプローブと接触させる工程、（２）識別子オリゴヌクレオチドを解放させるのに十分な力を組織試料の位置に加える工程、（３）解放された識別子オリゴヌクレオチドを採取する工程、（４）解放された識別子オリゴヌクレオチドに第１の核酸プローブおよび第２の核酸プローブをハイブリダイズする工程であって、ここで第１の核酸プローブは、識別子オリゴヌクレオチドに相補的な核酸、識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列、第１の増幅プライマー結合部位、第１の固有の分子識別子を含む核酸配列、および第１のフローセル結合部位を含み、ここで第２の核酸プローブは、識別子オリゴヌクレオチドに相補的な核酸、第２の固有の分子識別子を含む核酸配列、第３の固有の分子識別子を含む核酸配列、および第２のフローセル結合部位を含み、ここで第１および第２の核酸プローブは、第１および第２の核酸プローブが隣接しているが重ならないように識別子オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする、工程、（５）ハイブリダイズされた第１および第２の核酸プローブが共に連結されるように、間隙伸長およびニック修復反応を実施する工程、（６）工程（５）で生成された連結産物を増幅する工程、および（７）工程（６）で生成された増幅産物を配列決定して解放された識別子オリゴヌクレオチドを識別し、それにより組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出することを含む。

【0036】

本開示はまた、組織試料からの少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する方法を提供し、この方法は、（１）組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を、標的結合ドメインならびに標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列を含む識別子オリゴヌクレオチドを含む少なくとも１つのプローブと接触させる工程、（２）識別子オリゴヌクレオチドを解放させるのに十分な力を組織試料の位置に加える工程、（３）解放された識別子オリゴヌクレオチドを採取する工程、（４）解放された識別子オリゴヌクレオチドに第１の核酸プローブおよび第２の核酸プローブをハイブリダイズする工程であって、ここで第１の核酸プローブは、識別子オリゴヌクレオチドに相補的な核酸、第１の増幅プライマー結合部位、第１の固有の分子識別子を含む核酸配列、および第１のフローセル結合部位を含み、ここで第２の核酸プローブは、識別子オリゴヌクレオチドに相補的な核酸、第２の固有の分子識別子を含む核酸配列、および第２のフローセル結合部位を含み、ここで第１または第２の核酸プローブの少なくとも１つは、第３の固有の分子識別子を含む核酸配列を含み、ここで第１または第２の核酸プローブの少なくとも１つは、識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列を含み、ここで第１および第２の核酸プローブは、第１および第２の核酸プローブが隣接しているが重ならないように識別子オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする、工程、（５）ハイブリダイズされた第１および第２の核酸プローブが共に連結されるように、間隙伸長およびニック修復反応を実施する工程、（６）工程（５）で生成された連結産物を増幅する工程、および（７）工程（６）で生成された増幅産物を配列決定して解放された識別子オリゴヌクレオチドを識別し、それにより組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出することを含む。

【0037】

識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列および第１の固有の分子識別子が第１の核酸プローブに存在する側面では、識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列および第１の固有の分子識別子は、第１のフローセル結合部位の５’に位置してもよい。

【0038】

第２および第３の固有の分子識別子が第２の核酸プローブに存在する側面では、第２および第３の固有の分子識別子は、第２のフローセル結合部位の３’に位置してもよい。

【0039】

側面によっては、第１の固有の分子識別子は、第１の核酸プローブに存在してもよく、第１のフローセル結合部位の５’に位置してもよい。他の側面では、第２の固有の分子識別子は、第２の核酸プローブに存在してもよく、第２のフローセル結合部位の３’に位置してもよい。

【0040】

側面によっては、識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列および第３の固有の分子識別子は、第１の核酸プローブに存在してもよく、第１のフローセル結合部位の５’に位置してもよい。

【0041】

側面によっては、識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列および第３の固有の分子識別子は、第２の核酸プローブに存在してもよく、第２のフローセル結合部位の３’に位置してもよい。

【0042】

側面によっては、第３の固有の分子識別子は、第１の核酸プローブに存在してもよく、第１のフローセル結合部位の５’に位置してもよい。これと同じ側面では、識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列は、第２の核酸プローブに存在してもよく、第２のフローセル結合部位の３’に位置してもよい。

【0043】

本開示は、組織試料からの少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する方法を提供し、この方法は、（１）組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を、標的結合ドメインならびに標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列、固有の分子識別子を含む核酸配列、第１の増幅プライマー結合部位、および第２の増幅プライマー結合部位を含む識別子オリゴヌクレオチドを含む少なくとも１つのプローブと接触させる工程、（２）識別子オリゴヌクレオチドを解放させるのに十分な力を組織試料の位置に加える工程、（３）解放された識別子オリゴヌクレオチドを採取する工程、（４）第１の増幅プライマー結合部位に結合できる第１の増幅プライマーおよび第２の増幅プライマー結合部位に結合できる第２の増幅プライマーを用いて、解放された識別子オリゴヌクレオチドを増幅する工程であって、ここで前記第１および第２の増幅プライマーのうちの少なくとも１つは、識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列を含む、工程、および（５）工程（４）で生成された増幅産物を配列決定して解放された識別子オリゴヌクレオチドを識別し、それにより組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出することを含む。

【0044】

本開示はまた、組織試料からの少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する方法を提供し、この方法は、（１）組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を、標的結合ドメインならびに標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列、第１の増幅プライマー結合部位、および第２の増幅プライマー結合部位を含む識別子オリゴヌクレオチドを含む少なくとも１つのプローブと接触させる工程、（２）識別子オリゴヌクレオチドを解放させるのに十分な力を組織試料の位置に加える工程、（３）解放された識別子オリゴヌクレオチドを採取する工程、（４）第１の増幅プライマー結合部位に結合できる第１の増幅プライマーおよび第２の増幅プライマー結合部位に結合できる第２の増幅プライマーを用いて、解放された識別子オリゴヌクレオチドを増幅する工程であって、ここで前記第１および第２の増幅プライマーのうちの少なくとも１つは、識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列を含み、ここで前記第１および第２の増幅プライマーのうちの少なくとも１つは、固有の分子識別子を含む核酸配列を含む、工程、および（５）工程（４）で生成された増幅産物を配列決定して解放された識別子オリゴヌクレオチドを識別し、それにより組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出することを含む。

【0045】

本開示は、組織試料からの少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する方法を提供し、この方法は、（１）組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を、標的結合ドメインならびに標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列および捕捉プローブ結合部位を含む識別子オリゴヌクレオチドを含む少なくとも１つのプローブと接触させる工程、（２）識別子オリゴヌクレオチドを解放させるのに十分な力を組織試料の位置に加える工程、（３）解放された識別子オリゴヌクレオチドを採取する工程、（４）解放された識別子オリゴヌクレオチドに、親和性分子および捕捉プローブ結合部位に相補的な領域を含む捕捉プローブをハイブリダイズする工程、および（５）工程（４）で生成された増幅ハイブリダイズ産物を配列決定して解放された識別子オリゴヌクレオチドを識別し、それにより組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出することを含む。

【0046】

本開示は、組織試料からの少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する方法を提供し、この方法は、（１）組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を、標的結合ドメインならびに標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列、捕捉プローブ結合部位、および多重プローブ結合部位を含む識別子オリゴヌクレオチドを含む少なくとも１つのプローブと接触させる工程、（２）識別子オリゴヌクレオチドを解放させるのに十分な力を組織試料の位置に加える工程、（３）解放された識別子オリゴヌクレオチドを採取する工程、（４）解放された識別子オリゴヌクレオチドに、親和性分子および捕捉プローブ結合部位に相補的な領域を含む捕捉プローブ、ならびに識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列および多重プローブ結合部位に相補的な領域を含む多重プローブをハイブリダイズする工程、および（５）工程（４）で生成されたハイブリダイズ産物を配列決定して解放された識別子オリゴヌクレオチドを識別し、それにより組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出することを含む。

【0047】

本開示は、組織試料からの少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する方法を提供し、この方法は、（１）組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を、標的結合ドメインならびに標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列を含む識別子オリゴヌクレオチドを含む少なくとも１つのプローブと接触させる工程、（２）識別子オリゴヌクレオチドを解放させるのに十分な力を組織試料の位置に加える工程、（３）解放された識別子オリゴヌクレオチドを採取する工程、（４）解放された識別子オリゴヌクレオチドに第１の核酸プローブおよび第２の核酸プローブをハイブリダイズする工程であって、ここで第１の核酸プローブは、識別子オリゴヌクレオチドの一部分に相補的な核酸配列、固有の分子識別子を含む核酸配列、および第１の増幅プライマー結合部位を含み、ここで第２の核酸プローブは、識別子オリゴヌクレオチドの一部分に相補的な核酸、および第２の増幅プライマー結合部位を含み、ここで第１および第２の核酸プローブは、第１および第２の核酸プローブが隣接しているが重ならないように識別子オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする、工程、（５）ハイブリダイズした第１および第２の核酸プローブを共に連結する工程、（６）工程（５）で生成された連結産物を増幅する工程、および（７）工程（６）で生成された増幅産物を配列決定して解放された識別子オリゴヌクレオチドを識別し、それにより組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出することを含む。

【0048】

本開示は、組織試料からの少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する方法を提供し、この方法は、（１）組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を、標的結合ドメインならびに標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列、固有の分子識別子を含む核酸配列、第１の増幅プライマー結合部位、および第２の増幅プライマー結合部位を含む識別子オリゴヌクレオチドを含む少なくとも１つのプローブと接触させる工程、（２）識別子オリゴヌクレオチドを解放させるのに十分な力を組織試料の位置に加える工程、（３）解放された識別子オリゴヌクレオチドを採取する工程、（４）採取された識別子オリゴヌクレオチドを増幅する工程、および（５）工程（４）で生成された増幅産物を配列決定して解放された識別子オリゴヌクレオチドを識別し、それにより組織試料の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出することを含む。

【0049】

本開示のすべての方法では、連結工程は、ニック連結工程であってもよい。ニック連結工程は、ニック修復工程であってもよい。

【0050】

本開示のすべての方法では、配列決定は、酵素を含まない配列決定法であってもよい。

【0051】

本開示のすべての方法では、識別子オリゴヌクレオチドは二本鎖であってもよい。識別子オリゴヌクレオチドが二本鎖である側面では、識別子オリゴヌクレオチドの２つの鎖のうちの少なくとも１つは、少なくとも２つの異なる核酸分子を含んでもよい。あるいは、識別子オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの３’末端は、単一のヌクレオチド突出部を含んでもよい。

【0052】

本開示のすべての方法では、識別子オリゴヌクレオチドは、一本鎖であってもよい。

【0053】

本開示のすべての方法では、標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列は、約５ヌクレオチド～約４０ヌクレオチド、好ましくは約３５ヌクレオチド、さらに好ましくは約１０ヌクレオチドを含んでもよい。

【0054】

本開示のすべての方法では、識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列は、約６ヌクレオチド～約１５ヌクレオチド、好ましくは約１２ヌクレオチド、さらに好ましくは約１０ヌクレオチドを含んでもよい。

【0055】

本開示のすべての方法では、第１の核酸プローブまたは第２の核酸プローブの少なくとも１つは、親和性分子を含んでもよい。例えば、第１の核酸プローブまたは第２の核酸プローブの少なくとも１つは、ビオチンを含んでもよい。

【0056】

本開示のすべての方法では、増幅プライマー結合部位は、約１８ヌクレオチド～約４０ヌクレオチド、好ましくは約３２ヌクレオチド、さらに好ましくは約２５ヌクレオチドを含んでもよい。増幅プライマー結合部位は、ｉ７配列を含んでもよく、このｉ７配列は、配列番号１に記載の配列を含む。増幅プライマー結合部位は、ｉ５配列を含んでもよく、このｉ５配列は、配列番号２に記載の配列を含む。

【0057】

本開示のすべての方法では、増幅プライマーは、フローセルアダプター配列を含んでもよく、このフローセルアダプター配列は、配列決定をするのに適している。増幅プライマーは、Ｐ５フローセルアダプター配列を含んでもよく、このＰ５フローセルアダプター配列は、配列番号３に記載の配列を含む。増幅プライマーは、Ｐ７フローセルアダプター配列を含んでもよく、このＰ７フローセルアダプター配列は、配列番号４に記載の配列を含む。

【0058】

本開示のすべての方法では、フローセル結合部位は、フローセルアダプター配列を含んでもよく、このフローセルアダプター配列は、配列決定をするのに適している。フローセル結合部位は、Ｐ５フローセルアダプター配列を含んでもよく、このＰ５フローセルアダプター配列は、配列番号３に記載の配列を含む。フローセル結合部位は、Ｐ７フローセルアダプター配列を含んでもよく、このＰ７フローセルアダプター配列は、配列番号４に記載の配列を含む。

【0059】

本発明のすべての方法では、第１および第２の増幅プライマーのうちの少なくとも１つは、親和性分子を含んでもよい。例えば、第１および第２の増幅プライマーのうちの少なくとも１つはビオチンを含んでもよい。

【0060】

本開示のすべての方法では、増幅は、ＰＣＲを実施することを含んでもよい。ＰＣＲの実施には、増幅プライマーを含んでもよい。

【0061】

増幅プライマーは、フローセル結合部位を含んでもよい。増幅プライマーは、識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列を含んでもよい。増幅プライマーは、増幅プライマー結合部位に相補的な核酸配列を含んでもよい。

【0062】

上記のいずれの側面も、その他のいずれの側面と組み合わせてもよい。

【0063】

別途定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者が通常理解しているのと同じ意味を有する。本明細書では、文脈中に明確な指示がない限り、単数形には複数形も含まれ、例として、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という用語は単数または複数であると理解され、「ｏｒ」という用語は包括的であると理解される。例として、「１つの要素」は、１つ以上の要素を意味する。本明細書を通して、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形例は、記述された要素、整数または工程、あるいは要素、整数または工程の群を含むことを意味するが、その他の要素、整数または工程、あるいは要素、整数または工程の群の排除を意味しないと理解される。「約」とは、記載された数値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％以内と理解してもよい。文脈に別途明確にされない限り、本明細書で提供されるすべての数値は、「約」という用語によって加減されている。

【0064】

本明細書での記載と同様または同等の方法および材料を本開示の実施または試験に使用してもよいが、適切な方法および材料は、以下に記載される通りである。本明細書で記載されるすべての出版物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれている。本明細書で引用される参考文献は、請求される本発明の先行技術であるとは認められない。矛盾がある場合には、定義を含んで本明細書が優先される。さらに、材料、方法、および実施例は、単に例示であり、限定することを意図するものではない。本開示のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および請求項から明らかになる。

【0065】

上記の特徴かつさらなる特徴は、添付の図面と併せて解釈すると、以下の詳細な説明からより明確に理解できる。

【図面の簡単な説明】

【0066】

【図1】図１は、本開示の二末端アダプター連結法の概略図である。

【0067】

【図2】図２は、本開示の一末端アダプター連結法の概略図である。

【0068】

【図3】図３は、本開示の鋳型プライマー伸長法の概略図である。

【0069】

【図4】図４は、本開示の鋳型を伸長した識別子オリゴヌクレオチドの概略図である。

【0070】

【図5】図５は、本開示の短プローブハイブリダイズ法の概略図である。

【0071】

【図6】図６は、本開示の短プローブハイブリダイズ法の概略図である。

【0072】

【図7】図７は、本開示の短プローブハイブリダイズ法の概略図である。

【0073】

【図8】図８は、本開示の長プローブハイブリダイズ法の概略図である。

【0074】

【図9】図９は、本開示の長プローブハイブリダイズ法の概略図である。

【0075】

【図10】図１０は、本開示の長プローブハイブリダイズ法の概略図である。

【0076】

【図11】図１１は、本開示の直接ＰＣＲ法の概略図である。

【0077】

【図12】図１２は、本開示の無酵素法の概略図である。

【0078】

【図13】図１３は、本開示の多重化無酵素法の概略図である。

【0079】

【図14】図１４は、標的核酸に間接的に結合する本開示のプローブの概略図である。

【0080】

【図15】図１５は、本開示の識別子オリゴヌクレオチド－短核酸プローブ複合体の概略図である。

【0081】

【図16】図１６は、本開示の短プローブハイブリダイズ法の概略図である。

【0082】

【図17】図１７は、本開示の識別子オリゴヌクレオチド－短核酸プローブ複合体の概略図である。

【0083】

【図18】図１８は、本開示の短プローブハイブリダイズ法の概略図である。

【0084】

【図19】図１９は、本開示の直接ＰＣＲ法の概略図である。

【0085】

【図20】図２０は、本開示の方法の全体概略図である。

【0086】

【図21-1】図２１は、本開示の方法を用いるタンパク質標的検体の空間的検出を示す。

【図21-2】（同上）

【図21-3】（同上）

【図21-4】（同上）

【0087】

【図22-1】図２２は、本開示の方法を用いるＲＮＡ標的検体の空間的検出を示す。

【図22-2】（同上）

【図22-3】（同上）

【図22-4】（同上）

【0088】

【図23】図２３は、本開示の方法を用いるタンパク質標的検体の空間的検出を示す。

【0089】

【図24】図２４は、本開示の方法を用いるＲＮＡ標的検体の空間的検出を示す。

【0090】

【図25】図２５は、本開示の方法を用いるタンパク質標的検体の空間的検出を示す。

【0091】

【図26】図２６は、本開示のプローブの概略図である。

【0092】

【図27】図２７は、本開示の方法でのプローブタイリング（tiling）の使用を示す。

【0093】

【図28】図２８は、組織のマイクロアレイ上に選択された対象領域を示す。

【0094】

【図29】図２９は、本開示の方法を用いて達成された読取り深さを示す一連のグラフである。

【0095】

【図30】図３０は、本開示の方法を用いる、陰性対照試料中のＲＮＡ標的検体の空間的検出を示す一連のグラフである。

【0096】

【図31】図３１は、本開示の方法を用いる、ＨＥＫ２９３試料（上部図）およびジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞試料（下部図）中のＲＮＡ標的検体の空間的検出を示す一連のグラフである。

【0097】

【図32-1】図３２は、本開示の方法を用いる、１６個のＦＦＰＥ試料中のＲＮＡ標的検体の空間的検出を示す一連のグラフである。

【図32-2】（同上）

【図32-3】（同上）

【図32-4】（同上）

【0098】

【図33】図３３は、本開示の方法を用いる、ＨＥＫ２９３試料中のＲＮＡ標的検体の空間的検出を示すグラフである。

【0099】

【図34】図３４は、本開示の方法を用いる、ジャーカット細胞試料中のＲＮＡ標的検体の空間的検出を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0100】

本発明の詳細な説明
本開示は、既存の配列決定法を用いて、組織中の利用者規定の領域、利用者規定の細胞、および／または細胞内の利用者規定の部分細胞組織でのタンパク質発現および／または核酸発現を同時に多重かつ空間的に検出および定量するためのプローブ、組成物、方法、およびキットに、一部基づいている。

【0101】

本開示は、第１の対象領域（例えば、組織型、（正常細胞および異常細胞を含む）細胞、および細胞内の部分細胞組織）内に存在する標的タンパク質および／または標的核酸の識別および存在量、および第２の対象領域内に存在する標的タンパク質および／または標的核酸の識別および存在量を比較する。対象領域の数および実行可能な比較の数には所定の上限はなく、その上限は、試料のサイズに対する対象領域のサイズに関与している。例として、１個の細胞が対象領域である場合に、１つの断片には数百から数千の対象領域が存在する可能性があるが、組織断片に２種類の細胞型しか含まれないのなら、その断片には、（それぞれが１つの細胞型のみを含む）２つの対象領域しか存在しないことになる。

【0102】

本開示は、標準的な免疫組織化学的またはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイズ法により可能となる多重処理に比較して、より多くの多重処理を提供する。標準的な免疫組織化学的方法では、最大で６～１０個、より典型的には３～４個のタンパク質標的を同時に検出可能である。同様にｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイズ法では、１０個未満の核酸標的の同時検出が限界となる。本開示は、試料の規定領域からの核酸標的および／またはタンパク質標的の多くの組合せによる検出を提供する。本開示は、デジタル化定量によって客観測定数を増やすことができ、かつ信頼性および一貫性を向上でき、それにより多数の対象間での結果の比較が可能になる。

【0103】

本開示の様々な組成物および方法は、本明細書に細部にわたり詳細に記載されている。

【0104】

一側面では、本開示は、本明細書で「二末端アダプター連結法」と呼ばれる方法で本開示のプローブを用いて、試料中の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出するための組成物および方法を提供する。

【0105】

本開示の二末端アダプター連結法は、（１）試料中の少なくとも１つの標的検体を、本開示の少なくとも１つのプローブと接触させる工程を含んでもよい。本開示のプローブおよび試料は、本明細書にさらに詳細に説明される。少なくとも１つの標的検体は、標的タンパク質または標的核酸であってもよい。少なくとも１つの標的検体が標的タンパク質である側面では、プローブは、対象の標的タンパク質に特異的に結合できる標的タンパク質結合領域である標的結合ドメインを含んでもよい。少なくとも１つの標的検体が標的核酸である側面では、プローブは、対象の標的核酸に直接的にまたは間接的にハイブリダイズできる標的核酸結合領域を含んでもよい。プローブはさらに、識別子オリゴヌクレオチドを含む。識別子オリゴヌクレオチドは、標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列を含んでもよい。

【0106】

少なくとも１つの標的検体を少なくとも１つのプローブと接触させた後に、二末端アダプター連結法はさらに、（２）識別子オリゴヌクレオチドを解放させるのに十分な力を試料の位置に加える工程を含んでもよい。非限定的な例で、プローブが識別子オリゴヌクレオチドと標的結合ドメインとの間に光切断性リンカーを含む側面では、対象領域は、光切断性リンカーを切断可能とするのに十分な波長の光によって励起される。

【0107】

識別子オリゴヌクレオチドの解放後に、二末端アダプター連結法はさらに、（３）解放された識別子オリゴヌクレオチドを採取する工程を含んでもよい。工程（２）で特定の位置のみに力を導いて、識別子オリゴヌクレオチドは、その位置内のプローブのみから解放され、その位置の外側にあるプローブからは解放されない。したがって、識別子オリゴヌクレオチドは、その位置内の標的に結合しているプローブのみに対して採取され、それによって、その位置内にのみ配置される標的（タンパク質および／または核酸）の識別および量の検出が可能となる。

【0108】

解放された識別子オリゴヌクレオチドの採取後に、二末端アダプター連結法はさらに、（４）工程（３）で採取された解放された識別子オリゴヌクレオチドに、少なくとも１つの核酸アダプターを連結する工程を含んでもよい。

【0109】

核酸アダプターは、識別子オリゴヌクレオチドが解放された試料の特定の位置を識別する核酸配列を含んでもよい。例えば、識別子オリゴヌクレオチドが「ＲＯＩ＃１」と命名された試料の位置から解放されるのなら、核酸アダプターは「ＲＯＩ＃１」に対応する核酸配列を含むと思われる。

【0110】

核酸アダプターはまた、固有の分子識別子を含んでもよい。

【0111】

核酸アダプターはまた、第１の増幅プライマー結合部位を含んでもよい。別の側面では、核酸アダプターはまた、第２の増幅プライマー結合部位を含んでもよい。

【0112】

側面によっては、核酸アダプターはまた、特定の識別子オリゴヌクレオチドの配列の差異によってもたらされる連結の偏りを最小にするために、定常核酸配列を含んでもよい。

【0113】

核酸アダプターは、部分的に二本鎖の核酸分子であってもよい。核酸アダプターが部分的に二本鎖である側面では、核酸アダプターは、二本鎖アニール領域、第１の一本鎖不一致領域、および第２の一本鎖不一致領域を含む。第１の一本鎖不一致領域および第２の一本鎖不一致領域は、二本鎖アニール領域の反対側に存在してもよい。

【0114】

核酸アダプターが部分的に二本鎖であり、かつ識別子オリゴヌクレオチドが解放された試料の特定の位置を識別する核酸配列を含む側面では、識別子オリゴヌクレオチドが解放された試料の特定の位置を識別する核酸配列は、核酸アダプターの二本鎖アニール領域に存在してもよい。

【0115】

核酸アダプターが部分的に二本鎖であり、かつ連結の偏りを最小にするために定常核酸配列を含む側面では、連結の偏りを最小にするための定常核酸配列は、核酸アダプターの二本鎖アニール領域に存在してもよい。

【0116】

核酸アダプターが部分的に二本鎖であり、かつ固有の分子識別子を含む側面では、固有の分子識別子は、核酸アダプターの第１または第２の一本鎖不一致領域の少なくとも１つに存在してもよい。

【0117】

核酸アダプターが部分的に二本鎖であり、かつ第１および第２の増幅プライマー結合部位を含む側面では、第１の増幅プライマー結合部位は、核酸アダプターの第１の一本鎖不一致領域に存在してもよく、第２の増幅プライマー結合部位は、核酸アダプターの第２の一本鎖不一致領域に存在してもよい。

【0118】

少なくとも１つの核酸アダプターの連結後に、二末端アダプター連結法はさらに、（５）第１および第２の増幅プライマー結合部位に結合する増幅プライマーを用いて、工程（４）で生成された連結産物を増幅する工程を含んでもよく、（６）工程（５）で生成された増幅産物を配列決定して解放されたオリゴヌクレオチドを識別し、それにより試料中の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する工程を含んでもよい。

【0119】

本開示の二末端アダプター連結法はさらに、工程（４）の前に、当技術分野で既知の方法を用いて末端修復反応を実施する工程を含んでもよい。この方法はさらに、工程（４）の前に、当技術分野で既知の方法を用いて、単一のヌクレオチド突出部を識別子オリゴヌクレオチドの３’末端に結合させる付加反応を実施する工程を含んでもよい。側面によっては、末端修復反応および付加反応は、順次に、または同時に実施してもよい。

【0120】

二末端アダプター連結法の好ましい側面では、核酸アダプターは、解放・採取された識別子オリゴヌクレオチドの両末端に連結される。

【0121】

二末端アダプター連結法の他の側面では、工程（４）で生成された連結産物を増幅する工程（５）で用いられる第1および第２の増幅プライマーのうちの少なくとも１つは、識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列を含む。例えば、識別子オリゴヌクレオチドが「ＲＯＩ＃１」と命名された試料の位置から解放された場合に、第1および第２の増幅プライマーのうちの少なくとも１つは、「ＲＯＩ＃１」に対応する核酸配列を含むと思われる。

【0122】

図１は、本開示の二末端アダプター連結法の好ましい側面の概略図を示す。この側面では、プローブは、標的タンパク質に結合する抗体を含む標的結合ドメインを含む。左上部の図では、プローブが標的タンパク質に結合している。右上部の図では、標的結合ドメインと識別子オリゴヌクレオチドとの間に位置するＵＶ光切断性リンカーが切断されて、識別子オリゴヌクレオチドが解放されている。識別子オリゴヌクレオチドは、標的結合ドメインに結合した標的タンパク質を識別する固有の核酸配列を含む。下部の図では、核酸アダプターは、識別子オリゴヌクレオチドの両末端に連結されている。この非限定的な例では、核酸アダプターは部分的に二本鎖であり、かつ二本鎖アニール領域、第１の一本鎖不一致領域、および第２の一本鎖不一致領域を含む。二本鎖アニール領域には、連結の偏りを最小にするための定常核酸配列、および識別子オリゴヌクレオチドが解放された試料の特定の位置を識別する核酸配列が存在している。第１の一本鎖不一致領域には、第1の増幅プライマー結合部位が存在している。第２の一本鎖不一致領域には、固有の分子識別子および第２の増幅プライマー結合部位が存在している。核酸アダプターの識別子オリゴヌクレオチドへの連結後に、生成物を、第１および第２の増幅プライマー結合部位を結合する増幅プライマーを用いて増幅し、配列決定してプローブが結合する標的タンパク質を識別する。

【0123】

一側面では、本開示は、試料中の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出するために、２つの核酸アダプターに二重に連結された識別子オリゴヌクレオチドの組成物を提供する。２つの核酸アダプターに二重に連結された識別子オリゴヌクレオチドは、試料中の標的検体を識別可能な固有の核酸配列を含む識別子オリゴヌクレオチドを含む。識別子オリゴヌクレオチドの各末端は、核酸アダプター分子に結合され、この核酸アダプター分子は、部分的に二本鎖であり、かつ二本鎖アニール領域、第１の一本鎖不一致領域、および第２の一本鎖不一致領域を含む。第１の一本鎖不一致領域および第２の一本鎖不一致領域は、二本鎖アニール領域の反対側に存在する。二本鎖不一致領域は、連結の偏りを最小にするための定常核酸配列、および試料の特定の位置を識別可能な核酸配列を含む。第１の一本鎖不一致領域は、第１の増幅プライマー結合部位を含む。第２の一本鎖不一致領域は、第２の増幅プライマー結合部位および固有の分子識別子を含む核酸配列を含む。２つの核酸アダプターに二重に連結された識別子オリゴヌクレオチドの概略図を、図１の下部の図に示す。

【0124】

別の側面では、本開示は、本明細書で「一末端アダプター連結法」と呼ばれる方法で、本開示のプローブを用いて試料中の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出するための組成物および方法を提供する。

【0125】

本開示の一末端アダプター連結法は、（１）試料中の少なくとも１つの標的検体を、本開示の少なくとも１つのプローブと接触させることを含んでもよい。少なくとも１つの標的検体は、標的タンパク質または標的核酸であってもよい。少なくとも１つの標的検体が標的タンパク質である側面では、プローブは、対象の標的タンパク質に特異的に結合できる標的タンパク質結合領域である標的結合ドメインを含んでもよい。少なくとも１つの標的検体が標的核酸である側面では、プローブは、対象の標的核酸に直接的にまたは間接的にハイブリダイズできる標的核酸結合領域を含んでもよい。プローブはさらに、識別子オリゴヌクレオチドを含む。識別子オリゴヌクレオチドは、標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列を含んでもよい。識別子オリゴヌクレオチドはまた、第１の増幅プライマー結合部位を含んでもよい。側面によっては、識別子オリゴヌクレオチドはまた、単一のヌクレオチド突出部を備える少なくとも１つの３’末端を含む。

【0126】

少なくとも１つの標的検体を少なくとも１つのプローブと接触させた後に、一末端アダプター連結法はさらに、（２）識別子オリゴヌクレオチドを解放させるのに十分な力を試料の特定の位置に加える工程を含んでもよい。非限定的な例で、プローブが識別子オリゴヌクレオチドと標的結合ドメインとの間に光切断性リンカーを含む側面では、対象領域（ＲＯＩ）は、光切断性リンカーを切断可能とするのに十分な波長の光によって励起される。

【0127】

識別子オリゴヌクレオチドの解放後に、一末端アダプター連結法はさらに、（３）解放された識別子オリゴヌクレオチドを採取する工程を含んでもよい。工程（２）で特定の場所のみに力を導いて、識別子オリゴヌクレオチドは、その位置内のプローブからのみ解放され、その位置の外側にあるプローブからは解放されない。したがって、識別子オリゴヌクレオチドは、工程（３）でその位置内の標的に結合されたプローブに対してのみ採取され、それによって、その位置内にのみ配置される標的（タンパク質および／または核酸）の識別および量の検出が可能となる。

【0128】

解放された識別子オリゴヌクレオチドの採取後に、一末端アダプター連結法はさらに、（４）工程（３）で採取した解放されたオリゴヌクレオチドに、少なくとも１つの核酸アダプターを連結する工程を含んでもよい。

【0129】

核酸アダプターは、識別子オリゴヌクレオチドが解放された試料の特定の位置を識別する核酸配列を含んでもよい。例えば、識別子オリゴヌクレオチドが「ＲＯＩ＃１」と命名された試料の位置から解放されるのなら、核酸アダプターは、「ＲＯＩ＃１」に対応する核酸配列を含むと思われる。核酸アダプターはまた、固有の分子識別子を含んでもよい。核酸アダプターはまた、第２の増幅プライマー結合部位を含んでもよい。

【0130】

側面によっては、核酸アダプターはまた、特定の識別子オリゴヌクレオチドの配列の差異によってもたらされる連結の偏りを最小にするために、定常核酸配列を含んでもよい。定常核酸配列は、切断可能な部分を含んでもよい。切断可能な部分は、酵素により切断可能であってもよい。非限定的な例では、酵素により切断可能な部分は、ユーザー（ＵＳＥＲ）配列であってもよく、このユーザー配列は、配列ＧＵＧＵＡＴＵＧを含む。

【0131】

核酸アダプターは、上述の形質の任意の組み合わせを含んでもよい。

【0132】

核酸アダプターは、部分的に二本鎖の核酸分子であってもよい。核酸アダプターが部分的に二本鎖である側面では、核酸アダプターは、二本鎖アニール領域および一本鎖不一致領域を含む。

【0133】

核酸アダプターが部分的に二本鎖であり、かつ識別子オリゴヌクレオチドが解放された試料の特定の位置を識別する核酸配列を含む側面では、識別子オリゴヌクレオチドが解放された試料の特定の位置を識別する核酸配列は、核酸アダプターの二本鎖アニール領域に存在してもよい。

【0134】

核酸アダプターが部分的に二本鎖であり、かつ連結の偏りを最小にするために定常核酸配列を含む側面では、連結の偏りを最小にする定常核酸配列は、核酸アダプターの二本鎖アニール領域に存在してもよい。

【0135】

核酸アダプターが部分的に二本鎖であり、かつ固有の分子識別子を含む側面では、固有の分子識別子は、一本鎖の不一致領域に存在してもよい。

【0136】

核酸アダプターが部分的に二本鎖であり、かつ第２の増幅プライマー結合部位を含む側面では、第２の増幅プライマー結合部位は、核酸アダプターの一本鎖不一致領域に存在してもよい。

【0137】

少なくとも１つの核酸アダプターの連結後に、二末端アダプター連結法はさらに、（５）工程（４）で生成された連結産物を増幅する工程を含んでもよく、（６）工程（５）で生成された増幅産物を配列決定して解放されたオリゴヌクレオチドを識別し、それにより試料中の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する工程を含んでもよい。

【0138】

本開示の一末端アダプター連結法の他の側面では、工程（４）で生成された連結産物を増幅するために工程（５）で用いられる第1および第２の増幅プライマーのうちの少なくとも１つは、識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列を含む。例えば、識別子オリゴヌクレオチドが「ＲＯＩ＃１」と命名された試料の位置から解放されるのなら、増幅プライマーの少なくとも１つは、「ＲＯＩ＃１」に対応する核酸配列を含むと思われる。

【0139】

図２は、本開示の一末端アダプター連結法の好ましい側面の概略図を示す。この側面では、プローブは、標的タンパク質に結合する抗体である標的結合ドメインを含む。左上部の図では、プローブは標的タンパク質に結合している。右上部の図では、標的結合ドメインと識別子オリゴヌクレオチドとの間に配置されるＵＶ光切断性リンカーが切断され、識別子オリゴヌクレオチドが解放されている。識別子オリゴヌクレオチドは、標的タンパク質を識別する固有の核酸配列および第１の増幅プライマー結合部位を含む。この非限定的な例では、識別子オリゴヌクレオチドは、３種の異なる核酸分子を含む１本の鎖を備える２本鎖である。識別子オリゴヌクレオチドはまた、単一のヌクレオチド突出部を備えた１つの３’末端を含む。

【0140】

図２の下部の図では、核酸アダプターは、３’単一ヌクレオチド突出部を含む識別子オリゴヌクレオチドの末端に連結される。この非限定的な例では、核酸アダプターは、部分的に二本鎖であり、かつ二本鎖アニール領域および一本鎖不一致領域を含む。二本鎖アニール領域には、連結の偏りを最小にするための定常核酸配列、および識別子オリゴヌクレオチドが解放された試料の特定の位置を識別する核酸配列が存在する。一本鎖不一致領域には、固有の分子識別子および第２の増幅プライマー結合部位が存在する。核酸アダプターの識別子オリゴヌクレオチドへの連結後に、生成物を、第１および第２の増幅プライマー結合部位に結合する増幅プライマーを用いて増幅し、配列決定してプローブが結合する標的タンパク質を識別する。

【0141】

一側面では、本開示は、試料中の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出するために、１つの核酸アダプターに連結された識別子オリゴヌクレオチドの組成物を提供する。１つの核酸アダプターに連結された識別子オリゴヌクレオチドは、試料中の標的検体を識別できる固有の核酸配列、および第１の増幅プライマー結合部位を含む識別子オリゴヌクレオチドを含む。識別子オリゴヌクレオチドの一末端は、核酸アダプター分子に結合され、この核酸アダプター分子は、部分的に二本鎖であり、かつ二本鎖アニール領域ならびに一本鎖不一致領域および第２の一本鎖不一致領域を含む。二本鎖不一致領域は、連結の偏りを最小にするための定常核酸配列、および試料の特定の位置を識別できる核酸配列を含む。一本鎖不一致領域は、第２の増幅プライマー結合部位を含む。１つの核酸アダプターに連結された識別子オリゴヌクレオチドの概略図を、図２の下部の図に示す。

【0142】

別の側面では、本開示は、本明細書で「鋳型プライマー伸長法」と呼ばれる方法で、本開示のプローブを用いて試料中の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出するための組成物および方法を提供する。

【0143】

本開示の鋳型プライマー伸長方法は、（１）試料中の少なくとも１つの標的検体を、本開示の少なくとも１つのプローブと接触させる工程を含んでもよい。少なくとも１つの標的検体は、標的タンパク質または標的核酸であってもよい。少なくとも１つの標的検体が標的タンパク質である側面では、プローブは、対象の標的タンパク質に特異的に結合できる標的タンパク質結合領域である標的結合ドメインを含んでもよい。少なくとも１つの標的検体が標的核酸である側面では、プローブは、対象の標的核酸に直接的にまたは間接的にハイブリダイズできる標的核酸結合領域を含んでもよい。プローブはさらに、識別子オリゴヌクレオチドを含む。識別子オリゴヌクレオチドは、標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列を含んでもよい。識別子オリゴヌクレオチドはまた、第１の増幅プライマー結合部位を含んでもよい。

【0144】

少なくとも１つの標的検体を少なくとも１つのプローブと接触させた後に、鋳型プライマー伸長法はさらに、（２）識別子オリゴヌクレオチドを解放させるのに十分な力を試料の位置に加える工程を含んでもよい。非限定的な例で、プローブが識別子オリゴヌクレオチドと標的結合ドメインとの間に光切断性リンカーを含む側面では、対象領域（ＲＯＩ）は、光切断性リンカーを切断可能となるのに十分な波長の光により励起される。

【0145】

識別子オリゴヌクレオチドの解放後に、鋳型プライマー伸長法はさらに、（３）解放された識別子オリゴヌクレオチドを採取する工程を含んでもよい。工程（２）で特定の位置のみに力を導いて、識別子オリゴヌクレオチドは、その位置内のプローブからのみ解放され、その位置の外側にあるプローブからは解放されない。したがって、識別子オリゴヌクレオチドは、工程（３）でその位置内の標的に結合されたプローブに対してのみ採取され、それによって、その位置内にのみ配置する標的（タンパク質および／または核酸）の識別および量の検出が可能となる。

【0146】

解放された識別子オリゴヌクレオチドの採取後に、鋳型プライマー伸長法はさらに、（４）工程（３）で採取された解放された識別子オリゴヌクレオチドに、一本鎖核酸鋳型をハイブリダイズする工程を含んでもよい。

【0147】

一本鎖核酸鋳型は、識別子オリゴヌクレオチドの固有の核酸配列に相補的な領域を含んでもよく、それにより一本鎖核酸鋳型の採取された識別子オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズが可能となる。

【0148】

一本鎖核酸鋳型はまた、固有の分子識別子を含む核酸配列を含んでもよい。

【0149】

一本鎖核酸鋳型はまた、識別子オリゴヌクレオチドが解放された試料の特定の位置を識別する核酸配列を含んでもよい。

【0150】

一本鎖核酸鋳型はまた、第２の増幅プライマー結合部位に相補的である核酸配列を含んでもよい。

【0151】

一本鎖核酸鋳型は、上述の形質の任意の組合わせを含んでもよい。

【0152】

識別子オリゴヌクレオチドの一本鎖核酸鋳型へのハイブリダイズ後に、鋳型プライマー伸長法はさらに、（５）工程（４）の識別子オリゴヌクレオチドを伸長して、一本鎖核酸鋳型に相補的な伸長産物を生成する工程であって、ここで伸長産物は、識別子オリゴヌクレオチドおよび一本鎖核酸鋳型に相補的な配列を含む、工程、（６）第１および第２の増幅プライマー結合部位にハイブリダイズする増幅プライマーを用いて、工程（６）の伸長産物を増幅する工程、および（７）工程（６）で生成された増幅産物を配列決定して解放された識別子オリゴヌクレオチドを識別し、それにより試料中の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する工程を含み得る。

【0153】

側面によっては、一本鎖核酸鋳型は、親和性分子を含んでもよい。一本鎖核酸鋳型が親和性分子を含む側面では、鋳型プライマー伸長法はさらに、工程（４）と（５）の間に親和性の精製工程を含んでもよい。

【0154】

図３は、本開示の鋳型プライマー伸長法の好ましい側面の概略図を示す。この側面では、プローブは、標的タンパク質に結合する抗体である標的結合ドメインを含む。左上部の図では、プローブは標的タンパク質に結合している。右上部の図では、標的結合ドメインと識別子オリゴヌクレオチドとの間に配置されるＵＶ光切断性リンカーが切断され、識別子オリゴヌクレオチドが解放されている。識別子オリゴヌクレオチドは、標的タンパク質を識別する固有の核酸配列および第１の増幅プライマー結合部位を含む。右下部の図では、識別子オリゴヌクレオチドは、一本鎖核酸鋳型にハイブリダイズしている。この非限定的な例では、一本鎖核酸鋳型は、親和性分子、識別子オリゴヌクレオチドの固有の核酸配列に相補的な核酸配列、第１の固有の分子識別子、および第２の増幅プライマー結合部位に相補的な配列を含む。識別子オリゴヌクレオチドは伸長されて、一本鎖核酸鋳型に相補的な伸長産物を生成する。左下部の図に示すように、伸長産物は、識別子オリゴヌクレオチド、第１の固有の分子識別子に相補的な核酸配列、および第２の増幅プライマー結合部位を含む。伸長反応に続いて、プライマー伸長産物は、第１および第２の増幅プライマー結合部位に結合する増幅プライマーを用いて増幅される。この非限定的な例では、前記第1および第２の増幅プライマーのうちの１つは、識別子オリゴヌクレオチドが解放された試料の特定の位置を識別する核酸配列を含む。次に増幅産物を配列決定して、プローブが結合した標的タンパク質を識別する。

【0155】

一側面では、本開示は、試料中の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出するために、鋳型伸長識別子オリゴヌクレオチドの組成物を提供する。鋳型伸長識別子オリゴヌクレオチドは、配列決定に適する第１のフローセルアダプター配列、続いて第１の固有の分子識別子、続いて識別子オリゴヌクレオチド、続いて第２の固有の分子識別子、続いて第２の増幅プライマー結合部位、続いて第３の固有の分子識別子、続いて配列決定に適する第２のフローセルアダプター配列を含む。識別子オリゴヌクレオチドは、第１の増幅プライマー結合部位、および試料中の標的検体を識別できる固有の核酸配列を含む。鋳型伸長識別子オリゴヌクレオチドの概略図を図４の下部の図に示す。

【0156】

別の側面では、本開示は、本明細書で「短プローブハイブリダイズ法」と呼ばれる方法で、本開示のプローブを用いて試料中の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出するための組成物および方法を提供する。

【0157】

本開示の短プローブハイブリダイズ法は、（１）試料中の少なくとも１つの標的検体を、本開示の少なくとも１つのプローブと接触させる工程を含んでもよい。少なくとも１つの標的検体は、標的タンパク質または標的核酸であってもよい。少なくとも１つの標的検体が標的タンパク質である側面では、プローブは、対象の標的タンパク質に特異的に結合できる標的タンパク質結合領域である標的結合ドメインを含んでもよい。少なくとも１つの標的検体が標的核酸である側面では、プローブは、対象の標的核酸に直接的にまたは間接的にハイブリダイズできる標的核酸結合領域を含んでもよい。プローブはさらに、識別子オリゴヌクレオチドを含む。識別子オリゴヌクレオチドは、標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列を含んでもよい。

【0158】

少なくとも１つの標的検体を少なくとも１つのプローブと接触させた後に、短プローブハイブリダイズ法はさらに、（２）識別子オリゴヌクレオチドを解放させるのに十分な力を試料の位置に加えることを含んでもよい。非限定的な例で、プローブが識別子オリゴヌクレオチドと標的結合ドメインとの間に光切断性リンカーを含む側面では、対象領域（ＲＯＩ）は、光切断性リンカーを切断可能となるのに十分な波長の光により励起される。

【0159】

識別子オリゴヌクレオチドの解放後に、短プローブハイブリダイズ法はさらに、（３）解放された識別子オリゴヌクレオチドを採取する工程を含んでもよい。工程（２）で特定の位置にのみ力を導いて、識別子オリゴヌクレオチドは、その位置内のプローブからのみ解放され、その位置の外側にあるプローブからは解放されない。したがって、識別子オリゴヌクレオチドは、工程（３）でその位置内の標的に結合されているプローブに対してのみ採取され、それによって、その位置内にのみに配置する標的（タンパク質および／または核酸）の識別および量の検出が可能となる。

【0160】

解放された識別子オリゴヌクレオチドの採取後に、短プローブハイブリダイズ法はさらに、（４）解放された識別子オリゴヌクレオチドに、第１の核酸プローブおよび第２の核酸プローブをハイブリダイズさせる工程を含んでもよい。

【0161】

第１または第２の核酸プローブは、識別子オリゴヌクレオチドの一部分に相補的な核酸配列を含んでもよい。第１または第２の核酸プローブはまた、識別子オリゴヌクレオチドが解放された試料の特定の位置を識別する核酸配列を含んでもよい。第１または第２の核酸プローブはまた、固有の分子識別子を含む核酸配列を含んでもよい。第１の核酸プローブは、第１の増幅プライマー結合部位を含んでもよい。第２の核酸プローブは、第２の増幅プライマー結合部位を含んでもよい。

【0162】

第１または第２の核酸プローブは、上述の形質の任意の組合せを含んでもよい。図５に示す好ましい側面では、第１の核酸プローブは、第１の増幅プライマー結合部位、識別子オリゴヌクレオチドが解放された試料の特定の位置を識別する核酸配列、および識別子オリゴヌクレオチドに相補的な核酸配列を含む。同じ好ましい側面では、第２の核酸プローブは、第２の増幅プライマー結合部位、固有の分子識別子を含む核酸配列、および識別子オリゴヌクレオチドの一部分に相補的な核酸配列を含む。この好ましい側面では、識別子オリゴヌクレオチドが解放された試料の特定の位置を識別する核酸配列は、第１の増幅プライマー結合部位の５’に位置し、固有の分子識別子は、第２の増幅プライマー結合の３’に位置する。

【0163】

図６に示す別の好ましい側面では、第１の核酸プローブは、第１の増幅プライマー結合部位、識別子オリゴヌクレオチドが解放された試料の特定の位置を識別する核酸配列、固有の分子識別子を含む核酸配列、および識別子オリゴヌクレオチドの一部分に相補的な核酸配列を含む。この同じ好ましい側面では、第２の核酸プローブは、第２の増幅プライマー結合部位および識別子オリゴヌクレオチドに相補的な核酸配列を含む。この好ましい側面では、識別子オリゴヌクレオチドが解放された試料の特定の位置を識別する核酸配列および固有の分子識別子は、第１の増幅プライマー結合部位の５’に位置する。

【0164】

図７に示す別の好ましい側面では、第１の核酸プローブは、第１の増幅プライマー結合部位および識別子オリゴヌクレオチドの一部分に相補的な核酸配列を含む。この同じ好ましい側面では、第２の核酸プローブは、第２の増幅プライマー結合部位、識別子オリゴヌクレオチドが解放された試料の特定の位置を識別する核酸配列、固有の分子識別子を含む核酸配列、および識別子オリゴヌクレオチドに相補的な核酸配列を含む。この好ましい側面では、識別子オリゴヌクレオチドが解放された試料の特定の位置を識別する核酸配列および固有の分子識別子は、第２の増幅プライマー結合部位の３’に位置する。

【0165】

図１５に示す別の好ましい側面では、第１の核酸プローブは、第１の増幅プライマー結合部位、固有の分子識別子を含む核酸配列、および識別子オリゴヌクレオチドの一部分に相補的な核酸配列を含む。同じ好ましい側面では、第２の核酸プローブは、第２の増幅プライマー結合部位、および識別子オリゴヌクレオチドの一部分に相補的な核酸配列を含む。この好ましい側面では、固有の分子識別子を含む核酸配列は、第１の増幅結合部位の３’に位置する。

【0166】

図１７に示される別の好ましい側面では、第１の核酸プローブは、第１の増幅プライマー結合部位、固有の分子識別子を含む核酸配列、および識別子オリゴヌクレオチドの一部分に相補的な核酸配列を含む。同じ好ましい側面では、第２の核酸プローブは、第２の増幅プライマー結合部位および識別子オリゴヌクレオチドの一部分に相補的な核酸配列を含む。この好ましい側面では、固有の分子識別子を含む核酸配列は、第１の増幅結合部位の５’に位置する。

【0167】

第１の核酸プローブおよび第２の核酸プローブは、第１の核酸プローブおよび第２の核酸プローブが隣接しているが重ならないように、識別子オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしてもよい。あるいは、第１の核酸プローブおよび第２の核酸プローブは、第１の核酸プローブおよび第２の核酸プローブが隣接せずにかつ重ならないように、識別子オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしてもよい。

【0168】

第１および第２の核酸プローブの識別子オリゴヌクレオチドへのハイブリダイズ後に、ショートプローブハイブリダイズ法はさらに、（５）第１および第２の核酸プローブが隣接しているが重ならないように識別子オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする側面では、例えばニック修復反応を実施して、第１および第２の核酸プローブを共に連結する工程を含んでもよい。あるいは、第１および第２の核酸プローブが隣接せずにかつ重ならないように識別子オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする側面では、この方法は、例えば間隙伸長反応およびニック修復反応を実施して第１および第２の核酸プローブが共に連結されるように、第１および第２の核酸プローブを共に連結する工程を含む。

【0169】

第１および第２の核酸プローブの連結後に、短プローブハイブリダイズ法はさらに、（６）工程（５）で生成された連結産物を、第１および第２の増幅プライマー結合部位にハイブリダイズする増幅プライマーを用いて増幅する工程を含んでもよく、（７）工程（６）で生成された増幅産物を配列決定して解放された識別子オリゴヌクレオチドを識別し、それにより試料中の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する工程を含んでもよい。

【0170】

一側面では、本開示は、試料中の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出するために、識別子オリゴヌクレオチド－短核酸プローブ複合体の組成物を提供する。識別子オリゴヌクレオチド－短核酸プローブ複合体は、第１の核酸プローブおよび第２の核酸プローブにハイブリダイズされた識別子オリゴヌクレオチドを含む。識別子オリゴヌクレオチドは、試料中の標的検体を識別できる固有の核酸配列を含む。第１の核酸プローブは、第１の増幅プライマー結合部位、続いて試料中の特定の位置を識別できる固有の核酸配列、続いて識別子オリゴヌクレオチドに相補的な領域を含む。第２の核酸プローブは、第２の増幅プライマー結合部位、続いて固有の分子識別子を含む核酸配列、続いて識別子オリゴヌクレオチドに相補的な領域を含む。識別子オリゴヌクレオチド－短核酸プローブ複合体の概略図を図５に示す。

【0171】

一側面では、本開示は、試料中の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出するために、識別子オリゴヌクレオチド－短核酸プローブ複合体の組成物を提供する。識別子オリゴヌクレオチド－短核酸プローブ複合体は、第１の核酸プローブおよび第２の核酸プローブにハイブリダイズした識別子オリゴヌクレオチドを含む。識別子オリゴヌクレオチドは、試料中の標的検体を識別できる固有の核酸配列を含む。第１の核酸プローブは、第１の増幅プライマー結合部位、続いて固有の分子識別子を含む核酸配列、続いて識別子オリゴヌクレオチドに相補的な領域を含み、この固有の分子識別子を含む核酸配列は、第１の増幅プライマー結合部位の３’に位置する。第２の核酸プローブは、第２の増幅プライマー結合部位、続いて識別子オリゴヌクレオチドに相補的な領域を含む。識別子オリゴヌクレオチド－短核酸プローブ複合体の概略図を図１５に示す。

【0172】

一側面では、本開示は、試料中の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出するために、識別子オリゴヌクレオチド－短核酸プローブ複合体の組成物を提供する。識別子オリゴヌクレオチド－短核酸プローブ複合体は、第１の核酸プローブおよび第２の核酸プローブにハイブリダイズした識別子オリゴヌクレオチドを含む。識別子オリゴヌクレオチドは、試料中の標的検体を識別できる固有の核酸配列を含む。第１の核酸プローブは、第１の増幅プライマー結合部位、続いて固有の分子識別子を含む核酸配列、続いて識別子オリゴヌクレオチドに相補的な領域を含み、この固有の分子識別子を含む核酸配列は、第１の増幅プライマー結合部位の５’に位置する。第２の核酸プローブは、第２の増幅プライマー結合部位、続いて識別子オリゴヌクレオチドに相補的な領域を含む。識別子オリゴヌクレオチド－短核酸プローブ複合体の概略図を図１７に示す。

【0173】

図１６は、典型的な本開示の短プローブハイブリダイズ法の全体概略図を示す。まず試料中の少なくとも１つの標的検体を、本開示の少なくとも１つのプローブと接触させる。少なくとも１つの標的検体は、標的タンパク質または標的核酸であってもよい。少なくとも１つの標的検体が標的タンパク質である側面では、プローブは、対象の標的タンパク質に特異的に結合できる標的タンパク質結合領域である標的結合ドメインを含んでもよい。少なくとも１つの標的検体が標的核酸である側面では、プローブは、対象の標的核酸に直接的にまたは間接的にハイブリダイズできる標的核酸結合領域を含んでもよい。プローブはさらに、識別子オリゴヌクレオチドを含む。識別子オリゴヌクレオチドは、標的ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列を含んでもよい。

【0174】

少なくとも１つの標的検体を少なくとも１つのプローブと接触させた後に、識別子オリゴヌクレオチドを解放するのに十分な力を試料の特定の位置に加える。図１６の最上部の図に示すように、識別子オリゴヌクレオチドを解放後に採取する。

【0175】

図１６の上から２番目の図に示すように、解放された識別子オリゴヌクレオチドは、次に、第１の核酸プローブおよび第２の核酸プローブにハイブリダイズされる。この非限定的な例では、第１の核酸プローブは、第１の増幅プライマー結合部位、固有の分子識別子を含む核酸配列、および識別子オリゴヌクレオチドの一部分に相補的な核酸配列を含む。固有の分子識別子を含む核酸配列は、第１の増幅プライマー結合部位の３’に位置する。第２の核酸プローブは、第２の増幅プライマー結合部位、および識別子オリゴヌクレオチドの一部分に相補的な核酸配列を含む。この非限定的な例では、第１および第２の核酸プローブは、第１および第２の核酸プローブが隣接しているが重ならないように、識別子オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。識別子オリゴヌクレオチドへのハイブリダイズ後に、第１および第２のプローブは、例えばニック修復反応を実施して、共に連結される。

【0176】

第１および第２の核酸プローブの連結後に、連結産物は、第１および第２の増幅プライマー結合部位にハイブリダイズする増幅プライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅される。図１６の下部から２番目の図に示すように、第２の増幅プライマー結合部位にハイブリダイズする増幅プライマーは、第１のフローセル結合部位、識別子オリゴヌクレオチドが解放された試料の特定の位置を識別する第１の核酸配列、および第２の増幅プライマー結合部位に相補的な核酸配列を含む。第１の増幅プライマー結合部位にハイブリダイズする増幅プライマーは、第２のフローセル結合部位、識別子オリゴヌクレオチドが解放された特定の位置を識別する第２の核酸配列、および第１の増幅プライマー結合部位に相補的な核酸配列を含む。次に図１６の最下部の図に示すＰＣＲ産物に配列決定を実施し、解放されたオリゴヌクレオチドを識別して、それにより試料中の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する。

【0177】

図１８は、典型的な本開示の短プローブハイブリダイズ法の全体概略図を示す。まず試料中の少なくとも１つの標的検体を、本開示の少なくとも１つのプローブと接触させる。少なくとも１つの標的検体は、標的タンパク質または標的核酸であってもよい。少なくとも１つの標的検体が標的タンパク質である側面では、プローブは、対象の標的タンパク質に特異的に結合できる標的タンパク質結合領域である標的結合ドメインを含んでもよい。少なくとも１つの標的検体が標的核酸である側面では、プローブは、対象の標的核酸に直接的にまたは間接的にハイブリダイズできる標的核酸結合領域を含んでもよい。プローブはさらに、識別子オリゴヌクレオチドを含む。識別子オリゴヌクレオチドは、標的ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列を含んでもよい。

【0178】

少なくとも１つの標的検体を少なくとも１つのプローブと接触させた後に、識別子オリゴヌクレオチドを解放するのに十分な力を試料の位置に加える。図１８の最上部の図に示すように、識別子オリゴヌクレオチドを解放後に採取する。

【0179】

図１８の上部から２番目の図に示すように、解放された識別子オリゴヌクレオチドは、次に第１の核酸プローブおよび第２の核酸プローブにハイブリダイズされる。この非限定的な例では、第１の核酸プローブは、第１の増幅プライマー結合部位、固有の分子識別子を含む核酸配列、および識別子オリゴヌクレオチドの一部分に相補的な核酸配列を含む。固有の分子識別子を含む核酸配列は、第１の増幅プライマー結合部位の５’に位置する。第２の核酸プローブは、第２の増幅プライマー結合部位、および識別子オリゴヌクレオチドの一部分に相補的な核酸配列を含む。この非限定的な例では、第１および第２の核酸プローブは、第１および第２の核酸プローブが隣接しているが重ならないように、識別子オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。識別子オリゴヌクレオチドへのハイブリダイズ後に、第１および第２のプローブは、例えばニック修復反応を実施して、共に連結される。

【0180】

第１および第２の核酸プローブの連結後に、連結産物は、第１および第２の増幅プライマー結合部位にハイブリダイズする増幅プライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅される。図１８の下部から２番目の図に示すように、第２の増幅プライマー結合部位にハイブリダイズする増幅プライマーは、第１のフローセル結合部位、識別子のオリゴヌクレオチドが解放された試料の特定の位置を識別する第１の核酸配列、および第２の増幅プライマー結合部位に相補的な核酸配列を含む。第１の増幅プライマー結合部位にハイブリダイズする増幅プライマーは、第２のフローセル結合部位、識別子オリゴヌクレオチドが解放された特定の位置を識別する第２の核酸配列、および第１の増幅プライマー結合部位に相補的な核酸配列を含む。次に図１８の最下部に示すＰＣＲ産物に配列決定を実施し、解放されたオリゴヌクレオチドを識別し、それにより試料内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する。

【0181】

別の側面では、本開示は、本明細書で「長プローブハイブリダイズ法」と呼ばれる方法で、本開示のプローブを用いて試料中の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出するための組成物および方法を提供する。

【0182】

本開示の長プローブハイブリダイズ法は、（１）試料中の少なくとも１つの標的検体を本開示の少なくとも１つのプローブと接触させる工程を含んでもよい。少なくとも１つの標的検体は、標的タンパク質または標的核酸であってもよい。少なくとも１つの標的検体が標的タンパク質である側面では、プローブは、対象の標的タンパク質に特異的に結合できる標的タンパク質結合領域である標的結合ドメインを含んでもよい。少なくとも１つの標的検体が標的核酸である側面では、プローブは、対象の標的核酸に直接的にまたは間接的にハイブリダイズできる標的核酸結合領域を含んでもよい。プローブはさらに、識別子オリゴヌクレオチドを含む。識別子オリゴヌクレオチドは、標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列を含んでもよい。

【0183】

少なくとも１つの標的検体を少なくとも１つのプローブと接触させた後に、長プローブハイブリダイズ法はさらに、（２）識別子オリゴヌクレオチドを解放するのに十分な力を試料の位置に加える工程を含んでもよい。非限定的な例で、プローブが識別子オリゴヌクレオチドと標的結合ドメインとの間に光切断性リンカーを含む側面では、対象領域（ＲＯＩ）は、光切断性リンカーを切断可能とするのに十分な波長の光により励起される。

【0184】

識別子オリゴヌクレオチドの解放後に、長プローブハイブリダイズ法はさらに、（３）解放された識別子オリゴヌクレオチドを採取する工程を含んでもよい。工程（２）で特定の位置のみに力を導いて、識別子オリゴヌクレオチドはその位置内のプローブからのみ解放され、その位置の外側にあるプローブからは解放されない。したがって、識別子オリゴヌクレオチドは、工程（３）でその位置内の標的に結合されたプローブに対してのみ採取され、それによりその位置内にのみ配置する標的（タンパク質および／または核酸）の識別および量の検出が可能となる。

【0185】

解放された識別子オリゴヌクレオチドの採取後に、長プローブハイブリダイズ法はさらに、（４）解放された識別子オリゴヌクレオチドに第１の核酸プローブおよび第２の核酸プローブをハイブリダイズする工程を含んでもよい。

【0186】

第１または第２の核酸プローブは、識別子オリゴヌクレオチドの一部分に相補的な核酸配列を含んでもよい。第１または第２の核酸プローブはまた、識別子オリゴヌクレオチドが解放された試料の特定の位置を識別する核酸配列を含んでもよい。

【0187】

第１または第２の核酸プローブはまた、第１の固有の分子識別子を含んでもよい。第１または第２の核酸プローブはまた、第２の固有の分子識別子を含んでもよい。第１または第２の核酸プローブはまた、第３の固有の分子識別子を含んでもよい。

【0188】

第１の核酸プローブは、第１の増幅プライマー結合部位を含んでもよい。

【0189】

第１の核酸プローブはまた、第１のフローセル結合部位を含んでもよい。第２の核酸プローブは、第２のフローセル結合部位を含んでもよい。

【0190】

第１および第２の核酸プローブは、上述の形質の任意の組合せを含んでもよい。図８に示す好ましい側面では、第１の核酸プローブは、第１のフローセル結合部位、第１の固有の分子識別子、第１の増幅プライマー結合部位、識別子オリゴヌクレオチドが解放された試料の特定の位置を識別する核酸配列、および識別子オリゴヌクレオチドに相補的な核酸配列を含む。同じ好ましい側面では、第２の核酸プローブは、第２のフローセル結合部位、第２の固有の分子識別子、第３の固有の分子識別子、および識別子オリゴヌクレオチドに相補的な核酸配列を含む。この好ましい側面では、識別子オリゴヌクレオチドが解放された試料の特定の位置を識別する核酸配列および第１の固有の分子識別子は、第１のフローセル結合部位の５’に位置し、第２および第３の固有の分子識別子は、第２のフローセル結合部位の３’に位置する。

【0191】

図９に示す別の好ましい側面では、第１の核酸プローブは、第１のフローセル結合部位、第１の固有の分子識別子、第２の固有の分子識別子、第１の増幅プライマー結合部位、識別子オリゴヌクレオチドが解放された試料の特定の位置を識別する核酸配列、および識別子オリゴヌクレオチドに相補的な核酸配列を含む。同じ好ましい側面では、第２の核酸プローブは、第２のフローセル結合部位、第３の固有の分子識別子、および識別子オリゴヌクレオチドに相補的な核酸配列を含む。この好ましい側面では、第１の固有の分子識別子、第２の固有の分子識別子、および識別子オリゴヌクレオチドが解放された試料の特定の位置を識別する核酸配列は、第１のフローセル結合部位の５’に位置し、第３の固有の分子識別子は、第２のフローセル結合部位の３’に位置する。

【0192】

図１０に示す別の好ましい側面では、第１の核酸プローブは、第１のフローセル結合部位、第１の固有の分子識別子、第１の増幅プライマー結合部位、および識別子オリゴヌクレオチドに相補的な核酸配列を含む。この同じ好ましい側面では、第２の核酸プローブは、第２のフローセル結合部位、第２の固有の分子識別子、第３の固有の分子識別子、識別子オリゴヌクレオチドが解放された試料の特定の位置を識別する核酸配列、および識別子オリゴヌクレオチドに相補的な核酸配列を含む。この好ましい側面では、第１の固有の分子識別子は、第１のフローセル結合部位の５’に位置し、第２の固有の分子識別子、第３の固有の分子識別子、および識別子オリゴヌクレオチドが解放された試料の特定の位置を識別する核酸配列は、第２の増幅プライマー結合部位の３’に位置する。

【0193】

第１の核酸プローブおよび第２の核酸プローブは、第１および第２の核酸プローブが隣接しているが重ならないように、識別子オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしてもよい。あるいは、第１の核酸プローブおよび第２の核酸プローブは、第１および第２の核酸プローブが隣接せずにかつ重ならないように、識別子オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしてもよい。

【0194】

第１および第２の核酸プローブの識別子オリゴヌクレオチドへのハイブリダイズ後に、長プローブハイブリダイズ法はさらに、（５）第１および第２の核酸プローブが隣接しているが重ならないように識別子オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする側面では、第１および第２の核酸プローブが共に連結されるように、ニック修復反応を実施する工程を含んでもよい。あるいは、第１および第２の核酸プローブが隣接せずにかつ重ならないように識別子オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする側面では、この方法は、第１および第２の核酸プローブが共に連結されるように、間隙伸長およびニック修復反応を実施する工程を含む。

【0195】

この方法はさらに、（６）第１および第２の増幅プライマー結合部位にハイブリダイズする増幅プライマーを用いて、工程（５）で生成された連結産物を増幅する工程を含んでもよく、（７）工程（６）で生成された増幅産物を配列決定して解放された識別子オリゴヌクレオチドを識別し、それにより試料中の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する工程を含んでもよい。

【0196】

一側面では、本開示は、試料中の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出するために、識別子オリゴヌクレオチド－長核酸プローブ複合体の組成物を提供する。識別子オリゴヌクレオチド－長核酸プローブ複合体は、第１の核酸プローブおよび第２の核酸プローブにハイブリダイズした識別子オリゴヌクレオチドを含む。識別子オリゴヌクレオチドは、試料中の標的検体を識別できる固有の核酸配列を含む。第１の核酸プローブは、配列決定に適する第１のフローセル結合部位、続いて第１の固有の分子識別子、続いて第１の増幅プライマー結合部位、続いて試料中の特定の位置を識別できる固有の核酸配列、続いて識別子オリゴヌクレオチドに相補的な領域を含む。第２の核酸プローブは、第２のフローセル結合部位、続いて第２の固有の分子識別子、続いて第３の固有の分子識別子、続いて識別子オリゴヌクレオチドに相補的な領域を含む。識別子オリゴヌクレオチド－短核酸プローブ複合体の概略図を図８に示す。

【0197】

別の側面では、本開示は、本明細書で「直接ＰＣＲ法」と呼ばれる方法で、本開示のプローブを用いて試料中の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出するための組成物および方法を提供する。

【0198】

本開示の直接ＰＣＲ法は、（１）試料中の少なくとも１つの標的検体を本開示の少なくとも１つのプローブと接触させる工程を含んでもよい。少なくとも１つの標的検体は、標的タンパク質または標的核酸であってもよい。少なくとも１つの標的検体が標的タンパク質である側面では、プローブは、対象の標的タンパク質に特異的に結合できる標的タンパク質結合領域である標的結合ドメインを含んでもよい。少なくとも１つの標的検体が標的核酸である側面では、プローブは、対象の標的核酸に直接的にまたは間接的にハイブリダイズできる標的核酸結合領域を含んでもよい。プローブはさらに、識別子オリゴヌクレオチドを含む。識別子オリゴヌクレオチドは、標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列を含んでもよい。識別子オリゴヌクレオチドはまた、第１の増幅プライマー結合部位、第２の増幅プライマー結合部位、または固有の分子識別子を含んでもよい。識別子オリゴヌクレオチドは、これらの形質の任意の組合せを含んでもよい。これらの形質のいずれも、約１ヌクレオチド～約１０ヌクレオチドの定常核酸配列を含む領域に隣接してもよい。

【0199】

少なくとも１つの検体を少なくとも１つのプローブと接触させた後に、直接ＰＣＲ法はさらに、（２）識別子オリゴヌクレオチドを解放するのに十分な力を試料の位置に加える工程を含む。非限定的な例で、プローブが識別子オリゴヌクレオチドと標的結合ドメインとの間に光切断性リンカーを含む側面では、対象領域（ＲＯＩ）は、光切断性リンカーを切断可能とするのに十分な波長の光により励起される。

【0200】

直接ＰＣＲ法はさらに、（３）解放された識別子オリゴヌクレオチドを採取する工程を含んでもよい。工程（２）で特定の位置のみに力を導いて、識別子オリゴヌクレオチドはその位置内のプローブからのみ解放され、その位置の外側にあるプローブからは解放されない。したがって、識別子オリゴヌクレオチドは、工程（３）でその位置内の標的に結合されたプローブに対してのみ採取され、それによりその位置内にのみ配置される標的（タンパク質および／または核酸）の識別および量の検出が可能となる。

【0201】

識別子オリゴヌクレオチドの解放後に、直接ＰＣＲ法はさらに、（４）第１の増幅プライマー結合部位に結合できる第１の増幅プライマーおよび第２の増幅プライマー結合部位に結合できる第２の増幅プライマーを用いて、解放された識別子オリゴヌクレオチドを増幅する工程を含んでもよい。側面によっては、第１および第２の増幅プライマーのうちの少なくとも１つは、識別子オリゴヌクレオチドが解放された試料の特定の位置を識別する核酸配列を含む。例えば、識別子オリゴヌクレオチドが「ＲＯＩ＃１」と命名された試料の位置から解放されるのなら、第１および第２の増幅プライマーのうちの少なくとも１つは「ＲＯＩ＃１」に対応する核酸配列を含むと思われる。さらに他の側面では、第１および第２の増幅プライマーのうちの少なくとも１つは、固有の分子識別子を含む。

【0202】

増幅後に、本開示の直接ＰＣＲ法はさらに、（５）工程（５）で生成された増幅産物を配列決定して解放されたオリゴヌクレオチドを識別し、それにより試料中の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する工程を含んでもよい。

【0203】

図１１は、本開示の直接ＰＣＲ法の好ましい側面の概略図を示す。この側面では、プローブは、標的核酸に相補的な核酸配列を含む標的結合ドメインを含む。上部の図では、プローブは標的核酸にハイブリダイズしている。下部の図では、標的結合ドメインと識別子オリゴヌクレオチドとの間にあるＵＶ光切断性リンカーが切断されて、識別子オリゴヌクレオチドが解放される。識別子オリゴヌクレオチドは、第１の増幅プライマー結合部位、第２の増幅プライマー結合部位、固有の分子識別子、および標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列を含む。これらの４つの形質の間には、長さが３ヌクレオチドの定常スペーサー領域が配置されている。識別子オリゴヌクレオチドは二本鎖であり、３つの異なる核酸分子を含む一本の鎖を含む。解放の後に、識別子オリゴヌクレオチドは、第１の増幅プライマー結合部位にハイブリダイズしかつ識別子オリゴヌクレオチドが解放された試料の特定の位置を識別する核酸配列を含む第１増幅プライマー、および第２の増幅プライマー結合部位にハイブリダイズする第２増幅プライマーを用いて増幅される。次に増幅産物を配列決定して、プローブが結合した標的核酸を識別する。

【0204】

図１９は、本開示の直接ＰＣＲ法の好ましい側面の概略図を示す。この側面では、識別子オリゴヌクレオチドは、図１９の上部の図に示すように、第１の増幅プライマー結合部位、固有の分子識別子を含む核酸配列、標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列、および第２の増幅プライマー結合部位を含む。識別子オリゴヌクレオチドは、第１および第２の増幅プライマー結合部位にハイブリダイズする増幅プライマーを用いて増幅される。図１９の中央の図に示すように、第２の増幅プライマー結合部位にハイブリダイズする増幅プライマーは、第１のフローセル結合部位、識別子オリゴヌクレオチドが解放された試料の特定の位置を識別する第１の核酸配列、および第２の増幅プライマー結合部位に相補的な核酸配列を含む。第１の増幅プライマー結合部位にハイブリダイズする増幅プライマーは、第２のフローセル結合部位、識別子オリゴヌクレオチドが解放された試料の特定の位置を識別する第２の核酸配列、および第１の増幅プライマー結合部位に相補的な核酸配列を含む。図１９の下部の図に示すＰＣＲ産物を配列決定して、解放されたオリゴヌクレオチドを識別し、それにより試料中の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する。

【0205】

一側面では、本開示は、試料中の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出するために、直接ＰＣＲに適合する識別子オリゴヌクレオチドの組成物を提供する。直接ＰＣＲに適合する識別子オリゴヌクレオチドは、第１の増幅プライマー結合部位、続いて試料中の標的検体を識別できる固有の核酸配列、続いて固有の分子識別子、続いて第２の増幅プライマー結合部位を含む。直接ＰＣＲに適合する識別子オリゴヌクレオチドの概略図を図１１の下部の図に示す。

【0206】

一側面では、本開示は、試料中の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出するために、直接ＰＣＲに適合する識別子オリゴヌクレオチドの組成物を提供する。直接ＰＣＲに適合する識別子オリゴヌクレオチドは、第１の増幅プライマー結合部位、続いて固有の分子識別子を含む核酸配列、続いて試料中の標的検体を識別できる固有の核酸配列、続いて第２の増幅プライマー結合部位を含む。直接ＰＣＲに適合する識別子オリゴヌクレオチドの概略図を図１９の上部の図に示す。

【0207】

本開示の方法の側面によっては、１個以上、または２個以上、または３個以上、または４個以上、または５個以上、または６個以上、または７個以上、または８個以上、または９個以上、または１０個以上、または１１個以上、または１２個以上、または１３個以上、または１４個以上、または１５個以上、または１６個以上、または１７個以上、または１８個以上、または１９個以上、または２０個以上、または３０個以上、または４０個以上、または５０個以上、または６０個以上、または７０個以上、または８０個以上、または９０個以上、または１００個以上のプローブが、１個の標的検体に対応してもよい。本明細書で使用される「タイリング（ｔｉｌｉｎｇ）」という用語は、本開示の２個以上のプローブが標的検体に結合される際の説明に使用される。図２７の上部の図では、１個の標的ＲＮＡへの複数のプローブのタイリングを示している。１個の標的検体に複数のプローブをタイリングすることにより、標的検体の各部が個別に複数回検出され、測定値の全体の精度が向上することを示している。非限定的な例では、図２７の下部の図に示すように、１０個のプローブが１個の標的ＲＮＡにタイリングされる場合に、プローブうちの１つが誤って非常に多くの回数で検出される可能性があり（異常な多計数プローブ）、別のプローブが誤って非常に少ない回数で検出される可能性がある（異常な少計数プローブ）。しかし、他の８個のプローブは、同等の計数程度で検出できるので、解析中に２個の異常値は破棄した方がよく、８個のプローブからの信号を使用して標的ＲＮＡの存在量のより正確な測定値が得られることを示している。

【0208】

本開示は、「無酵素法」と本明細書で呼ばれる方法で、本開示のプローブを用いて試料中の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出するための組成物および方法を提供する。

【0209】

本開示の無酵素法は、（１）試料中の少なくとも１つの標的検体を本開示の少なくとも１つのプローブと接触させる工程を含んでもよい。少なくとも１つの標的検体は、標的タンパク質または標的核酸であってもよい。少なくとも１つの標的検体が標的タンパク質である側面では、プローブは、対象の標的タンパク質に特異的に結合できる標的タンパク質結合領域である標的結合ドメインを含んでもよい。少なくとも１つの標的検体が標的核酸である側面では、プローブは、対象の標的核酸に直接的にまたは間接的にハイブリダイズできる標的核酸結合領域を含んでもよい。プローブはさらに、識別子オリゴヌクレオチドを含む。識別子オリゴヌクレオチドは、標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列を含んでもよい。識別子オリゴヌクレオチドはまた、捕捉プローブ結合部位を含んでもよい。

【0210】

少なくとも１つの標的検体を少なくとも１つのプローブと接触させた後に、無酵素法はさらに、（２）識別子オリゴヌクレオチドを解放するのに十分な力を試料の位置に加える工程を含んでもよい。非限定的な例で、プローブが識別子オリゴヌクレオチドと標的結合ドメインとの間にある光切断性リンカーを含む側面では、対象領域（ＲＯＩ）は、光切断性リンカーを切断可能とするのに十分な波長の光により励起される。

【0211】

識別子オリゴヌクレオチドの解放後に、無酵素法はさらに、（３）解放された識別子オリゴヌクレオチドを採取する工程を含んでもよい。工程（２）で特定の位置のみに力を導いて、識別子オリゴヌクレオチドはその位置内のプローブからのみ解放され、その位置の外側にあるプローブからは解放されない。したがって、識別子オリゴヌクレオチドは、工程（３）でその位置内の標的に結合されたプローブに対してのみ採取され、それによりその位置内にのみ配置される標的（タンパク質および／または核酸）の識別および量の検出が可能となる。

【0212】

解放された識別子オリゴヌクレオチドの採取後に、無酵素法はさらに、（４）解放された識別子オリゴヌクレオチドに捕捉プローブをハイブリダイズする工程を含んでもよい。

【0213】

捕捉プローブは、捕捉プローブ結合部位に相補的な領域を含んでもよい。捕捉プローブはまた、親和性分子を含んでもよい。

【0214】

捕捉プローブのハイブリダイズ後に、無酵素法はさらに、（５）工程（４）で生成されたハイブリダイズ産物を配列決定して解放された識別子オリゴヌクレオチドを識別し、それにより組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する工程を含んでもよい。

【0215】

工程（４）で生成されたハイブリダイズ産物を、無酵素の配列決定法を用いて配列決定してもよい。無酵素の配列決定法は、例えば、米国特許第２０１４９４６３８６号および米国特許第１５／８１９，１５１号に記載されており、それら特許のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

【0216】

図１２は、本開示の無酵素法の好ましい側面の概略図を示す。この側面では、プローブは、標的核酸に相補的である核酸配列を含む標的結合ドメインを含む。上部の図では、プローブは標的核酸にハイブリダイズしている。中央の図では、標的結合ドメインと識別子オリゴヌクレオチドとの間にあるＵＶ光切断性リンカーが切断され、識別子オリゴヌクレオチドが解放される。識別子オリゴヌクレオチドは、標的結合ドメインに結合した標的核酸を識別する固有の核酸配列および捕捉プローブ結合部位を含む。解放の後に、識別子オリゴヌクレオチドは、下部の図に示すように捕捉プローブにハイブリダイズされる。捕捉プローブは、捕捉プローブ結合部位に相補的な核酸配列および親和性分子を含む。次にハイブリダイズ産物は、無酵素の配列決定法を用いて配列決定されて、プローブが結合した標的核酸を識別する。

【0217】

一側面では、本開示は、試料中の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出するために、ハイブリダイズした識別子オリゴヌクレオチド－捕捉プローブ複合体の組成物を提供する。ハイブリダイズした識別子オリゴヌクレオチド－捕捉プローブ複合体は、捕捉プローブにハイブリダイズした識別子オリゴヌクレオチドを含む。識別子オリゴヌクレオチドは、試料中の特定の標的検体を識別できる固有の核酸配列および捕捉プローブ結合部位を含む。捕捉プローブは、親和性分子および捕捉プローブ結合部位に相補的な領域を含む。ハイブリダイズした識別子オリゴヌクレオチド－捕捉プローブ複合体の概略図を図１２の下部の図に示す。

【0218】

本開示は、本明細書の「多重化無酵素法」と呼ばれる方法で、本開示のプローブを用いて試料中の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出するための組成物および方法を提供する。

【0219】

本開示の多重化無酵素法は、（１）試料中の少なくとも１つの標的検体を本開示の少なくとも１つのプローブと接触させる工程を含んでもよい。少なくとも１つの標的検体は、標的タンパク質または標的核酸であってもよい。少なくとも１つの標的検体が標的タンパク質である側面では、プローブは、対象の標的タンパク質に特異的に結合できる標的タンパク質結合領域である標的結合ドメインを含んでもよい。少なくとも１つの標的検体が標的核酸である側面では、プローブは、対象の標的核酸に直接的にまたは間接的にハイブリダイズできる標的核酸結合領域を含んでもよい。プローブはさらに、識別子オリゴヌクレオチドを含む。識別子オリゴヌクレオチドは、標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列を含んでもよい。識別子オリゴヌクレオチドはまた、捕捉プローブ結合部位を含んでもよい。識別子オリゴヌクレオチドはまた、多重プローブ結合部位を含んでもよい。

【0220】

少なくとも１つの標的検体を少なくとも１つのプローブと接触させた後に、多重化無酵素法はさらに、（２）識別子オリゴヌクレオチドを解放するのに十分な力を試料の位置に加える工程を含んでもよい。非限定的な例で、プローブが識別子オリゴヌクレオチドと標的結合ドメインとの間にある光切断性リンカーを含む側面では、対象領域（ＲＯＩ）は、光切断性リンカーを切断可能とするのに十分な波長の光により励起される。

【0221】

識別子オリゴヌクレオチドの解放後に、多重化無酵素法はさらに、（３）解放された識別子オリゴヌクレオチドを採取する工程を含んでもよい。工程（２）で特定の位置のみに力を導いて、識別子オリゴヌクレオチドはその位置内のプローブからのみ解放され、その位置の外側にあるプローブからは解放されない。したがって、識別子オリゴヌクレオチドは、工程（３）でその位置内の標的に結合されたプローブに対してのみ採取され、それによりその位置内にのみ配置される標的（タンパク質および／または核酸）の識別および量の検出が可能となる。

【0222】

解放された識別子オリゴヌクレオチドの採取後に、多重化無酵素法はさらに、（４）解放された識別子オリゴヌクレオチドに捕捉プローブおよび多重プローブをハイブリダイズする工程を含んでもよい。

【0223】

捕捉プローブは、捕捉プローブ結合部位に相補的な領域を含んでもよい。捕捉プローブはまた、親和性分子を含んでもよい。

【0224】

多重プローブは、多重プローブ結合部位に相補的な領域を含んでもよい。多重プローブはまた、識別子オリゴヌクレオチドが解放された試料の特定の位置を識別する核酸配列および多重プローブ結合部位に相補的な領域を含んでもよい。

【0225】

捕捉プローブと多重プローブのハイブリダイズ後に、多重化無酵素法はさらに、（５）工程（４）で生成されたハイブリダイズ産物を配列決定して解放された識別子オリゴヌクレオチドを識別し、それにより組織試料中の少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する工程を含んでもよい。

【0226】

工程（４）で生成されたハイブリダイズ産物は、無酵素の配列決定法を用いて配列決定してもよい。無酵素の配列決定法は、例えば、米国特許第２０１４９４６３８６号および米国特許第１５／８１９，１５１号に記載されており、それら特許のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

【0227】

図１３は、本開示の多重化無酵素法の好ましい側面の概略図を示す。この側面では、プローブは、標的核酸に相補的な核酸配列を含む標的結合ドメインを含む。上部の図では、プローブは標的核酸にハイブリダイズしている。中央の図では、標的結合ドメインと識別子オリゴヌクレオチドとの間にあるＵＶ光切断性リンカーが切断され、識別子オリゴヌクレオチドを解放する。識別子オリゴヌクレオチドは、中央の図に示すように、標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列、捕捉プローブ結合部位、および多重プローブ結合部位を含む。解放の後に、識別子オリゴヌクレオチドは、下部の図に示すように、捕捉プローブおよび多重プローブにハイブリダイズする。捕捉プローブは、捕捉プローブ結合部位に相補的な核酸配列および親和性分子を含む。多重プローブは、多重プローブ結合部位に相補的な核酸配列、および識別子オリゴヌクレオチドが解放された試料の特定の位置を識別する核酸配列を含む。次にハイブリダイズ産物を、無酵素の配列決定法を用いて配列決定して、プローブが結合した標的核酸を識別する。

【0228】

一側面では、本開示は、試料中の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出するために、ハイブリダイズされた識別子オリゴヌクレオチド－捕捉プローブ－多重プローブ複合体の組成物を提供する。ハイブリダイズした識別子オリゴヌクレオチド－捕捉プローブ－多重プローブ複合体は、捕捉プローブおよび多重プローブにハイブリダイズした識別子オリゴヌクレオチドを含む。識別子オリゴヌクレオチドは、試料中の特定の標的検体を識別できる固有の核酸配列、捕捉プローブ結合部位、および多重プローブ結合部位を含む。捕捉プローブは、親和性分子および捕捉プローブ結合部位に相補的な領域を含む。多重プローブは、識別子オリゴヌクレオチドが解放された試料の特定の位置を識別する核酸配列、および多重プローブ結合部位に相補的な領域を含む。ハイブリダイズされた識別子オリゴヌクレオチド－捕捉プローブ－多重プローブ複合体の概略図を図１３の下部の図に示す。

【0229】

図２０は、本開示の典型的な方法の全体概略図である。まず顕微鏡スライド上の試料を本開示の複数のプローブと接触させる（図２０の工程１）。次にスライドを画像化して特定の対象領域（ＲＯＩ）を選択する（図２０の工程２）。次に特定のＲＯＩをＵＶ光で照射して、ＲＯＩ内で結合したプローブから識別子オリゴヌクレオチドを解放する。次に解放された識別子オリゴヌクレオチドを、マイクロキャピラリーを用いた吸引により採取する。吸引後に、識別子オリゴヌクレオチドを９６ウェルプレート内の特定のウェルに移す。次に工程２で特定されたＲＯＩ毎に工程４および５を繰返す。すべてのＲＯＩが照射され、かつすべての解放された識別子オリゴヌクレオチドが採取された後に、識別子オリゴヌクレオチドを次世代シーケンス法（ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）を用いて配列決定して、試料中の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する。

【0230】

前述のように、本開示は、試料中の少なくとも１つの標的検体を空間的に検出する組成物および方法に適するプローブを提供する。本開示は、標的結合ドメインおよび識別子オリゴヌクレオチドを含むプローブを提供する。標的結合ドメインは、試料中の少なくとも１つの標的検体に特異的に結合するプローブの所定の領域である。

【0231】

本開示のプローブは、標的核酸を空間的に検出するのに使用できる。この側面では、標的結合ドメインは、標的核酸結合領域であってもよい。標的核酸結合領域は、好ましくは長さが少なくとも１５ヌクレオチドであり、より好ましくは長さが少なくとも２０ヌクレオチドである。特定の側面では、標的核酸結合領域は、長さが約１０～５００、２０～４００、２５、３０～３００、３５、４０～２００、または５０～１００ヌクレオチドである。標的核酸を結合および識別するためのプローブおよび方法は、例えば、米国特許第２００３／００１３０９１号、第２００７／０１６６７０８号、第２０１０／００１５６０７号、第２０１０／０２６１０２６号、第２０１０／０２６２３７４号、第２０１０／０１１２７１０号、第２０１０／００４７９２４号、および第２０１４／０３７１０８８号に記載されていて、これら特許のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

【0232】

標的核酸結合領域は、試料中に存在する標的核酸に直接的にハイブリダイズしてもよい。あるいは、本開示のプローブは、（中間オリゴヌクレオチドを介して）試料中に存在する標的核酸に間接的にハイブリダイズしてもよい。図１４は、この側面のプローブ（または組成物）を示している。プローブは、合成オリゴヌクレオチド（中間オリゴヌクレオチド）に結合し、さらに次々に生体試料中の標的核酸に結合する標的核酸結合ドメインを含む。中間オリゴヌクレオチドは、核酸の骨格を含みかつ標的核酸に結合できるので、本明細書に定義されるようなプローブであると言える。これらの側面では、プローブの標的核酸結合領域は、試料中に存在する標的核酸とは異なる中間オリゴヌクレオチド（即ち合成オリゴヌクレオチド）の領域にハイブリダイズする。したがって、プローブの標的結合領域は、試料中の最終的な標的核酸に支配されない。これにより、検定の（試料中に存在する）標的に固有の成分は、高価なプローブではなく安価で広く入手可能な合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド中に含まれるので、検定の設計時には経済的で迅速に対応できるという融通が利く。この合成オリゴヌクレオチドは、試料中に存在する標的核酸にハイブリダイズする領域、およびプローブにハイブリダイズする領域を含むことにより容易に設計できる。したがって、１組の間接的な結合プローブを用いて、検定の標的特異的（合成）オリゴヌクレオチド部分を単に置き換えるだけで、様々な試験で（試料中に存在する）膨大で多様な標的核酸を検出できる。

【0233】

標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、好ましくはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはｍｉＲＮＡであってもよい。

【0234】

本開示のプローブを用いて、標的タンパク質を検出できる。この側面では、標的結合ドメインは、標的タンパク質結合領域であってもよい。標的タンパク質結合領域には、少なくとも１つの標的タンパク質、少なくとも１つの標的タンパク質代用物、またはその両方に結合するように設計され、かつ適切な条件でプローブおよび標的タンパク質を含む分子複合体を生成できる分子または構築物が含まれる。標的タンパク質結合領域は、抗体、ペプチド、アプタマー、またはペプトイドを含んでもよい。抗体は、限定はされないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、組換え発現抗体、ヒト化抗体、植物抗体などを含む種々の供給源から取得できる。タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、およびアミノ酸配列という用語は、本明細書では互換的に使用されて、任意の長さのアミノ酸ポリマーを指す。このポリマーは、鎖状あるいは分岐状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでいてもよく、非アミノ酸または合成アミノ酸によって分断されていてもよい。この用語はまた、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分との結合などその他の操作によって修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。本明細書で使用されるアミノ酸という用語は、限定はされないが、グリシンおよびＤまたはＬ光学異性体の両方を含む天然および／または非天然または合成アミノ酸、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模擬物を指す。標的タンパク質を結合および識別するためのプローブおよび方法は、例えば、米国特許第２０１１／００８６７７４号に記載されていて、その特許の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。

【0235】

識別子オリゴヌクレオチドは、標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する核酸分子である。識別子オリゴヌクレオチドは、プローブの標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列を含む。非限定的な例では、タンパク質Ｐ５３に結合する標的結合ドメインを有するプローブは、Ｐ５３に対応する固有の核酸配列を有する識別子オリゴヌクレオチドを含み、タンパク質Ｐ９７に結合する標的結合ドメインを有するプローブは、Ｐ９７に対応する固有の核酸配列を有する識別子オリゴヌクレオチドを含む。

【0236】

識別子オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡとＲＮＡの組合せであってもよい。

【0237】

側面によっては、識別子オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの増幅プライマー結合部位を含んでもよい。増幅プライマー結合部位は、増幅プライマーに結合できる核酸配列である。増幅プライマーを用いて、限定はされないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの当技術分野で既知の方法を使用して、その増幅プライマーが結合している核酸分子を増幅してもよい。

【0238】

側面によっては、識別子オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの固有の分子識別子を含んでもよい。

【0239】

識別子オリゴヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、または部分的に二本鎖の核酸分子であってもよい。識別子オリゴヌクレオチドが二本鎖または部分的に二本鎖である側面では、２本の鎖のうちの少なくとも１本は、理論に束縛されることなく、識別子オリゴヌクレオチドの低温での変性を可能にする少なくとも２つの異なる核酸分子を含んでもよい。

【0240】

識別子オリゴヌクレオチドはまた、単一のヌクレオチド突出部を含む少なくとも１つの３’末端を含んでもよい。

【0241】

識別子オリゴヌクレオチドはまた、捕捉プローブ結合部位を含んでもよい。捕捉プローブ結合部位は、捕捉プローブが結合できる核酸配列である。

【0242】

本開示の捕捉プローブは、捕捉プローブ結合部位に相補的な核酸配列を含んでもよい。捕捉プローブはまた、親和性分子を含んでもよい。

【0243】

識別子オリゴヌクレオチドはまた、多重プローブ結合部位を含んでもよい。多重プローブ結合部位は、多重プローブが結合できる核酸配列である。

【0244】

本開示の多重プローブは、多重プローブ結合部位に相補的な核酸配列を含んでもよい。多重プローブはまた、識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列を含んでもよい。

【0245】

本開示のプローブは、適切な力を加えた後に識別子オリゴヌクレオチドの解放を可能にする領域を含んでもよい。非限定的な一例では、この領域は切断可能なモチーフ（例えば、制限酵素部位または切断可能なリンカー）である。切断可能なモチーフは、結合した標的核酸またはタンパク質からの識別子オリゴヌクレオチドを解放し、次いで識別子オリゴヌクレオチドが採取および検出される。識別子オリゴヌクレオチドを解放可能とする領域は、標的結合ドメインと識別子オリゴヌクレオチドとの間に配置されて、標的結合ドメインからの識別子オリゴヌクレオチドの解放を可能とする。識別子オリゴヌクレオチドがプローブの残りの部分から分離（即ち切断および解放）される場合に、識別子オリゴヌクレオチドは解放可能であると言える。切断可能なモチーフの例として、限定はされないが、光切断性リンカーが挙げられる。光切断性リンカーは、適切な干渉性光源（例えばレーザーおよびＵＶ光源）、または適切な非干渉性光源（例えばアーク灯および発光ダイオード（ＬＥＤ））によって提供される光によって切断できる。

【0246】

側面によっては、識別子オリゴヌクレオチドは、識別子オリゴヌクレオチドが解放される地点または少なくとも１つの細胞に、例えば少なくともそのすぐ上またはその周りなど、近位の溶液から採取される。近位の溶液を、例えば、ピペット、毛細管、マイクロアレイピン、穴を含むフローセル、または当技術分野で既知の別の適切な吸引システム、あるいはそれらの任意の組合せなどの吸引によって採取してもよい。毛細管は、光の力を、例えばＵＶ光を少なくとも１つの細胞に送達できる光学装置を含んでもよい。1つのピペットまたはマイクロアレイピンは、複数のピペットまたはマイクロアレイピンを含むアレイに取り付けられてもよい。近位の溶液は、アニオン性ポリマー、例えば、硫酸デキストランおよび／またはサケ精子ＤＮＡを含んでもよく、および／または採取された信号となるオリゴヌクレオチドは、アニオン性ポリマー、例えば、硫酸デキストランおよび／またはサケ精子ＤＮＡを含む溶液に添加されてもよい。サケ精子ＤＮＡに加えて、またはその代わりに、当技術分野で既知の他の非特異的遮断剤を使用してもよい。

【0247】

側面によっては、識別子オリゴヌクレオチドは、組織、少なくとも１つの細胞、または識別子オリゴヌクレオチドが、液体の層流、乱流、または移行流を介して解放される地点の近位から採取される。この流れは、例えば、組織と組織の上に配置された流体装置または不透過性バリアとの間に２５～５００ｍの深さを有する流路を通過してもよい。

【0248】

プローブの標的結合ドメインが抗体である側面では、プローブは、好ましくは抗体のヒンジ領域重鎖に対して安定で部位特異的であるシステイン生体共役反応法を用いて調製してもよい。この調製法は、抗体の化学量論比に対して相対的に制御可能な識別子オリゴヌクレオチドを提供する。プローブは、１抗体当たり複数（即ち２個以上、例えば、２、３、４、５個、またはそれ以上）の識別子オリゴヌクレオチドを含んでもよい。一般に、１抗体当たり３個または４個の識別子オリゴヌクレオチドを含む「より重い」プローブは、識別子オリゴヌクレオチドの少ない抗体、すなわち１抗体当たり１個または２個の識別子オリゴヌクレオチドを含む「より軽い」プローブよりも著しく感度が劣る。

【0249】

側面によっては、プローブは、典型的には、免疫組織化学（ＩＨＣ）またはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイズ（ＩＳＨ）に使用される濃度よりも低い濃度で試料に提供される。あるいは、濃度は、ＩＨＣまたはＩＳＨに使用される濃度よりも大幅に低い場合もある。例えば、プローブ濃度は、２倍少なく、５倍少なく、１０倍少なく、２０倍少なく、２５倍少なく、３０倍少なく、５０倍少なく、６０倍少なく、７０倍少なく、８０倍少なく、９０倍少なく、１００倍少なく、２００倍少なく、３００倍少なく、４００倍少なく、５００倍少なく、６００倍少なく、７００倍少なく、８００倍少なく、９００倍少なく、１０００倍少なく、２０００倍少なく、またはそれ以上に少なく、およびそれら数値の間の倍数で少なくてもよい。側面によっては、プローブは、１００ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０９ｎＭ、０．０８ｎＭ、０．０７ｎＭ、０．０６ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０４ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０２ｎＭ、０．０１ｎＭ、およびそれ未満の濃度、ならびにそれら数値の間の任意の濃度で提供される。

【0250】

タンパク質検出中の背景ノイズは、未処理のプローブ分子に負の精製を実施することで低減できる。これは、対象領域から溶出液を採取した後に、抗体または光切断性リンカーのアフィニティ精製によって実施できる。通常は、解放された信号となるオリゴヌクレオチドは、溶液からは引き出せない。この工程には、ピペット先端、管、または皿中でのタンパク質－Ｇまたはタンパク質－Ｏの機序を使用してもよい。このための装置および試薬は市販されている。

【0251】

核酸検出中の背景ノイズは、未処理のプローブ分子に負の精製を実施することで低減できる。これは、対象領域から溶出液を採取した後に、標的結合ドメインまたは光切断性リンカーのアフィニティ精製によって実施できる。通常は、解放された信号となるオリゴヌクレオチドは、溶液から引き出せない。負の精製を促進するために、汎用的な精製配列が、例えば、標的結合ドメイン内のプローブに含まれてもよい。

【0252】

タンパク質標的プローブおよび核酸標的プローブは、条件がタンパク質標的および核酸標的の両方の結合を許容する限り、同時に適用してもよい。あるいは、タンパク質標的および核酸標的の両方の結合を許容する条件が受け入れられない場合には、タンパク質標的プローブおよび核酸標的プローブは、順次適用してもよい。

【0253】

１組のプローブは、複数のプローブの混成物と同じ意味を指している。１組のプローブは、少なくとも１種の、すなわち１個の標的が対象のプローブを含む。１組のプローブは、好ましくは、２種以上、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００種、またはそれ以上の種のプローブを含む。１組のプローブには、各種プローブの１個以上のコピーを含んでもよい。

【0254】

プローブの第１の組のみを試料に適用してもよい。あるいは、プローブの第２の組（またはそれ以上の組）をその後に試料に適用してもよい。第１の組および第２の組（またはそれ以上の組）は、核酸だけ、タンパク質だけを標的にしてもよく、またはそれらの組合わせを標的にしてもよい。

【0255】

本開示では、２個以上の標的（即ち、タンパク質、核酸、またはそれらの組合せ）が検出され、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個、またはそれ以上の個数の標的、およびそれら数字の間の任意の個数の標的が検出される。

【0256】

１組のプローブは、標的とされる細胞型または組織型に基づいて予め規定されてもよい。例えば、組織が乳がんの場合に、その1組のプローブには、乳がん細胞に関連するタンパク質（例えば、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、ＰＲ）を対象とするプローブ、および／または正常な乳房組織に関連するタンパク質を対象とするプローブが含まれる。さらに、その1組のプローブは、標的にされる細胞または組織の発達状態に基づいて予め規定されてもよい。あるいは、その１組のプローブは、対象の細胞内での局在部、例えば、核、細胞質、および膜に対して、予め規定されてもよい。例えば、Ｆｏｘｐ３、ヒストンＨ３、またはＰ－Ｓ６を対象とする抗体は核を標識し、ＣＤ３、ＣＤ４、ＰＤ－１、またはＣＤ４５ＲＯを対象とする抗体は細胞質を標識し、ＰＤ－Ｌ１を対象とする抗体は膜を標識する。

【0257】

プローブは、化学的に合成されてもよく、プローブをコードする核酸がクローニングされたベクターを用いて生物学的に生成されてもよい。

【0258】

本明細書に記載される任意のプローブまたは任意のプローブ組は、本開示の方法およびキットに使用できる。

【0259】

本明細書に記載のプローブに関して、特定の標的核酸または標的タンパク質に対する固有の核酸配列の関連性は固定されていない。

【0260】

前述のように、本開示のプローブを用いて、任意の試料中、例えば生体試料中に存在する標的核酸または標的タンパク質を検出できる。当業者には分かっているように、試料は、限定はされないが、（初代細胞および培養細胞株の両方を含む）細胞、および（培養または外植を含む）組織を含む多くのものを含んでもよい。側面によっては、（定型または不定型の）組織試料は、埋め込まれて連続的に切片にされ、顕微鏡のスライド上に固定される。周知のように、１対の連続切片では、２つの連続切片中に少なくとも１つの細胞が存在する。第１の連続切片に位置する構造および細胞型は、隣接の連続切片の同じ位置にも含まれる。試料は、スライド上に固定された（定型または不定型の）培養細胞または解離細胞である。試料は、ホルマリン固定パラフィン埋設（ＦＦＰＥ）組織試料であってもよい。

【0261】

側面によっては、組織試料は、生検された腫瘍またはその一部分、すなわち、臨床的な関連組織試料である。例えば、腫瘍は乳がん由来の場合がある。試料は切除されたリンパ節であってもよい。

【0262】

試料は、例えば、植物、真菌、および動物界の多細胞生物を含む実質的に任意の生物由来であり、好ましくは、試料は、動物、例えば哺乳動物由来である。ヒトからの試料が特に好ましい。

【0263】

側面によっては、本明細書に記載されるプローブ、組成物、方法、およびキットは、病気の診断に使用される。本明細書で使用される用語「診断または病気の診断」は、病気の予測または診断、病気の素因の決定、病気の治療の監視、疾患の治療反応の診断、ならびに病気の予後、病気の進行、および病気の特定の治療に対する応答の診断を包含する。例えば、組織試料を、本明細書に記載のプローブ、方法、またはキットのいずれかに従って検査して、試料中の疾患マーカーまたは悪性細胞型のマーカーの存在および／または量を（非罹患状態と比較して）決定して、それにより疾患または癌を診断または病期分類することができる。

【0264】

一般的に、スライドに固定された試料を、まず蛍光（例えば、蛍光抗体または蛍光染色（ＤＡＰＩなど））を用いて画像化し、形態、対象の領域、対象の細胞型、および単一の細胞を識別して、次にタンパク質および／または核酸の発現を、同一のスライド上の試料からデジタル方式で計数してもよい。

【0265】

本開示の組成物およびキットは、プローブ、および他の試薬を含んでもよく、例えば、試料中のタンパク質および／または核酸の結合を促進するために、すなわちハイブリダイズ反応を引き起こすように、緩衝液および当技術分野で既知の他の試薬を含んでもよい。

【0266】

キットはまた、限定はされないが、標識オリゴヌクレオチドをプローブにハイブリダイズするのに、プローブを標的特異的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするのに、標的特異的オリゴヌクレオチドを標的核酸にハイブリダイズするのに、かつ／あるいはプローブを標的タンパク質にハイブリダイズするのに必要な情報を含む、キットの成分の使用説明書を含む。

【0267】

対象領域は、試料中に存在する組織型、細胞型、細胞、または細胞内の部分細胞組織であってもよい。

【0268】

同時に、第１の対象領域（例えば、組織型、（正常および異常細胞を含む）細胞型、および細胞内の部分細胞組織）に存在する標的タンパク質および／または標的核酸の識別および存在量と、第２の対象領域またはより多くの対象領域に存在する標的タンパク質および／または標的核酸の識別および存在量との比較を、本開示の方法を用いて実施してもよい。

【0269】

前述のように、本開示の方法によって生成された産物は、核酸増幅に使用してもよい。好ましい側面では、核酸増幅は、固相の核酸増幅であってもよい。したがって、さらなる側面では、本発明は、本開示の方法を用いて５’末端および３’末端に共通配列を有する鋳型ポリヌクレオチド分子のライブラリーを作成する工程、および前記鋳型ポリヌクレオチド分子が増幅される固相の核酸増幅反応を実行する工程を含む、鋳型ポリヌクレオチド分子の固相の核酸増幅方法を提供する。核酸増幅および配列決定用の組成物および方法は、例えば、米国特許第９３７６６７８号に記載されていて、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

【0270】

本明細書で使用される用語「固相増幅」は、増幅産物の全部または一部が生成されたままに固形支持体に固定されるように、固形支持体上で、または固形支持体と共に実施される任意の核酸増幅反応を指す。特にこの用語は、順方向および逆方向の増幅プライマーのうちの一方または両方が固形支持体に固定されていることを除いて、標準的な液相のＰＣＲに類似した反応である固相ポリメラーゼ連鎖反応（固相ＰＣＲ）を包含する。

【0271】

本発明には、一方の増幅プライマーのみが固定される「固相」の増幅方法も包含するが（もう一方のプライマーは、通常は遊離溶液中に存在する）、固形支持体には、固定された順方向プライマーおよび逆方向プライマーの両方が設けられることが好ましい。実際には、ＰＣＲ工程は増幅を継続するために過剰なプライマーを必要とするので、固形支持体に固定された「複数」の同一の順方向プライマーおよび／または「複数」の同一の逆方向プライマーが存在する。本明細書での順方向プライマーおよび逆方向プライマーについては、文脈でそうではないと示さない限り、「複数」の両方のプライマーを包含するものとして適宜に解釈すべきである。

【0272】

当業者には分かるように、任意の所定のＰＣＲ反応は、増幅される鋳型に特異的な少なくとも１種の順方向プライマーおよび少なくとも１種の逆方向プライマーを必要とする。しかしながら、特定の側面では、順方向プライマーおよび逆方向プライマーは、同一の配列の鋳型特異的部分を含んでもよく、また（任意の非ヌクレオチド修飾を含む）完全に同一のヌクレオチド配列および構造を有してもよい。言い換えると、１種のプライマーのみを用いて固相増幅を実施することも可能であり、この単一プライマー法も本発明の範囲に包含される。他の側面では、同一の鋳型特異的配列を含むが、その他のいくつかの構造的特徴が異なる順方向および逆方向プライマーを使用してもよい。例えば、一方のプライマーは、他方のプライマーには存在しない非ヌクレオチド修飾を含んでもよい。

【0273】

本発明の他の側面では、順方向プライマーおよび逆方向プライマーは、異なる配列の鋳型特異的部分を含んでもよい。

【0274】

固相ＰＣＲ用の増幅プライマーは、好ましくは、プライマーの５’末端にまたはその近傍に固形支持体との共有結合により固定され、プライマーの鋳型特異的部分はその同族の鋳型へのアニールのために固定しないままとし、３’ヒドロキシル基はプライマー伸長のために固定しないままとする。当技術分野で既知の任意の適切な共有結合手段を、この目的に使用してもよい。結合化学手段は、固形支持体の性質、およびそれに適用される誘導体化または官能化に応じて選択される。プライマー自体は、結合を促進するために、非ヌクレオチド化学修飾であってもよい部分を含んでもよい。特に好ましい一側面では、プライマーは、５’末端に、ホスホロチオ酸またはチオリン酸などの硫黄含有求核剤を含んでもよい。（以下に説明する）固形支持されたポリアクリルアミドヒドロゲルの場合には、この求核剤はヒドロゲル内に存在する「Ｃ」基に結合する。プライマーと鋳型を固形支持体に結合する最も好ましい手段は、重合アクリルアミドおよびＮ－（５－ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）からなるヒドロゲルへの５’ホスホロチオ酸結合を介することである。

【0275】

用語「クラスター」および「コロニー」は、本明細書では互換的に使用されて、複数の同一の固定核酸鎖および複数の同一の固定相補的核酸鎖からなる固形支持体上での個々の部位を指す。用語「クラスター化アレイ」は、これらクラスターまたはコロニーから形成されるアレイを指す。この文脈において、用語「アレイ」では、クラスターの秩序だった配列が必要になるとは考えるべきではない。

【0276】

本発明はまた、固相増幅によって生成された増幅核酸を配列決定する方法を含む。したがって、本発明は、上述の本開示の方法により核酸鋳型のライブラリーを増幅する工程、上述の固相増幅を用いてこのライブラリーを固形支持体上で増幅する工程、および核酸配列決定反応を実施して、固相増幅反応で生成された少なくとも１本の増幅核酸鎖の全体または一部分の配列を決定する工程を含む核酸配列決定法を提供する。

【0277】

本明細書で言う配列決定は、任意の適切な「合成による配列決定」技術を用いて実行されてもよく、この技術では、複数のヌクレオチドが、遊離した３’ヒドロキシル基に連続的に付加されて、結果として５’から ３’の方向へのポリヌクレオチド鎖が合成される。付加されるヌクレオチドの性質は、それぞれのヌクレオチドの付加後に決定されるのが好ましい。

【0278】

配列決定反応の開始点は、配列決定プライマーを全ゲノムまたは固相増幅反応の産物にアニールすることにより提供されてもよい。これに関連して、鋳型ライブラリーの形成中に付加されるアダプターの一方または両方は、鋳型ライブラリーの全ゲノムまたは固相増幅により誘導される増幅産物に配列決定プライマーをアニールさせるヌクレオチド配列を含んでもよい。

【0279】

順方向および逆方向増幅プライマーの両方が固形表面に共有結合的に固定されている固相増幅反応の産物は、固定ポリヌクレオチド鎖および固定相補鎖の対をアニールすることによって形成されるいわゆる「架橋」構造であり、両方の鎖は５’末端で固形支持体に結合されている。この架橋構造からなるアレイは、これら固定鎖のうちの１本に対する通常の配列決定プライマーのハイブリダイズが、ハイブリダイズのための標準条件で、固定相補鎖に対するこの固定鎖のアニールに比較して適切ではないので、核酸配列決定のためには非効率な鋳型を提供することになる。

【0280】

核酸配列決定のためにより適切な鋳型を提供するには、少なくとも部分的に一本鎖である鋳型を生成するために、「架橋」構造中の固定鎖のうちの１本の実質的にすべてまたは少なくとも一部分を除去することが好ましい。したがって、一本鎖である鋳型の一部分は、配列決定プライマーへのハイブリダイゼーションに利用可能である。「架橋」された二本鎖核酸構造中の１本の固定鎖のすべてまたは一部分を除去する工程は、本明細書では「直線化」と呼ばれる場合がある。

【0281】

架橋鋳型構造は、制限エンドヌクレアーゼによる一方または両方の鎖の切断により、またはニッキング・エンドヌクレアーゼによる一方の鎖の切断により、直線化されてもよい。制限酵素またはニッキング酵素の代替として、α間の化学的切断（例えば過ヨウ素酸塩によるジオール結合の切断）、エンドヌクレアーゼによる切断または熱またはアルカリへの曝露による脱塩基部位の切断、別の方法でデオキシリボヌクレオチドから構成された増幅産物に組み込まれたリボヌクレオチドの切断、光化学的切断、またはペプチドリンカーの切断など、その他の切断方法を使用してもよい。

【0282】

固相増幅反応が、共有結合により固定された１本のみのプライマーを用いて、また遊離溶液中の他のプライマーを用いて実施される場合には、直線化工程は必須ではない場合があることが分かっている。

【0283】

配列決定に適する直線化された鋳型を生成するためには、完全にまたは部分的に一本鎖である配列決定のための直線化した鋳型を残すように、増幅によって形成される架橋構造中の「均等でない」量の相補鎖を除去する必要がある。架橋構造の１本の鎖は、実質的にまたは完全に除去されるのが、最も好ましい。

【0284】

切断工程の後に、切断に用いた方法に関係はなく、切断反応の生成物は、固形支持体に結合されていない切断された鎖部分を除去するために、変性条件に曝されてもよい。適切な変性条件は、標準的な分子生物学手順を参照すれば、当業者には明らかである。

【0285】

変性（およびその後の切断された鎖の再アニール）により、部分的または実質的に一本鎖である配列決定鋳型が生成される。次いで鋳型の一本鎖部分への配列決定プライマーのハイブリダイズにより、配列決定反応を開始してもよい。

【0286】

したがって、核酸配列決定の反応は、配列決定プライマーを直線化増幅産物の一本鎖領域にハイブリダイズする工程、配列決定される増幅鋳型鎖の領域に相補的なポリヌクレオチド鎖中に１つ以上のヌクレオチドを連続的に組み込む工程、１つ以上の組み込まれたヌクレオチド中に存在する塩基を識別する工程、およびそれにより鋳型鎖の領域の配列を決定する工程を含む。

【0287】

本発明に従って使用できる１つの好ましい配列決定法は、連鎖停止剤として機能できる修飾ヌクレオチドの使用に依存している。修飾ヌクレオチドが、配列決定される鋳型の領域に相補的な増殖中のポリヌクレオチド鎖内に組み込まれても、さらなる配列伸長を誘導するために利用できる遊離の３’－ＯＨ基がないために、ポリメラーゼはさらなるヌクレオチドを付加できない。増殖中の鎖に組み込まれた塩基の性質が決定されると、３’区画を除去して、次の連続するヌクレオチドを付加できる。これらの修飾ヌクレオチドを用いて誘導された産物を順序付けして、ＤＮＡ鋳型のＤＮＡ配列を推定できる。この反応は、修飾ヌクレオチドのそれぞれが特定の塩基に対応することが既知である異なる標識を付加している場合には、1回の実験で実施することができ、各取り込み工程で付加された塩基間の識別を容易にできる。あるいは、それぞれの修飾ヌクレオチドを個別に含有する個々の反応を実施してもよい。

【0288】

修飾ヌクレオチドには、それらの検出を容易にするように標識を担持させてもよい。好ましくは、この標識は蛍光標識である。ヌクレオチドの種類毎に異なる蛍光標識を担持させてもよい。しかしながら、検出可能な標識としては蛍光標識である必要はない。組み込まれたヌクレオチドの検出を可能にする任意の標識を使用してもよい。

【0289】

蛍光標識ヌクレオチドを検出する１つの方法は、標識ヌクレオチドに特異的な波長のレーザー光の使用、または他の適切な照明源の使用を含む。ヌクレオチドの標識からの蛍光は、ＣＣＤカメラまたは他の適切な検出手段によって検出してもよい。

【0290】

本発明は、ヌクレオチドのポリヌクレオチド鎖への連続的取り込みに基づく本質的にいかなる配列決定方法も使用できるので、上記に概説した配列決定法の使用に限定することを意図していない。適切な代替技術には、例えば、パイロシーケンス（Pyrosequencing）、ＦＩＳＳＥＱ（蛍光インサイチュ配列決定、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｉｎ ｓｉｔｕ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、ＭＰＳＳ（大規模並列シグネチャ配列決定、ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）および連結ベースの方法による配列決定が含まれる。

【0291】

本開示の方法では、プローブの標的結合ドメインに結合した標的検体を識別するプローブの識別子オリゴヌクレオチド中に存在する固有の核酸配列は、約５ヌクレオチド～約５０ヌクレオチドを含んでもよい。好ましくは、この配列は、約２０ヌクレオチド～約４０ヌクレオチドを含む。さらにより好ましくは、この配列は約３５ヌクレオチドを含む。いくつかの好ましい側面では、この配列は１０ヌクレオチドを含む。

【0292】

本開示の方法では、識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列は、約６ヌクレオチド～約１５ヌクレオチドを含む。好ましくは、この配列は約１２ヌクレオチドを含む。

【0293】

本開示の方法では、増幅プライマー結合部位は、約１８ヌクレオチド～約４０ヌクレオチドを含む。好ましくは、増幅プライマー結合部位は、約３２ヌクレオチドを含む。

【0294】

本開示の方法の側面によっては、増幅プライマー結合部位は、ｉ７配列を含んでもよく、このｉ７配列は、配列番号１に記載の配列を含む。

【0295】

本開示の方法の側面によっては、増幅プライマー結合部位は、ｉ５配列を含んでもよく、このｉ５配列は、配列番号２に記載の配列を含む。

【0296】

本開示の方法の側面によっては、増幅プライマーは、フローセルアダプター配列を含んでもよく、このフローセルアダプター配列は、配列決定に適している。好ましくは、本開示の方法で使用される少なくとも１つの増幅プライマーは、Ｐ５フローセルアダプター配列を含み、このＰ５フローセルアダプター配列は、配列番号３に記載の配列を含む。さらに好ましくは、本開示の方法で使用される少なくとも１つの増幅プライマーは、Ｐ７フローセルアダプター配列を含み、このＰ７フローセルアダプター配列は、配列番号４に記載の配列を含む。

【0297】

本開示の方法では、固有の分子識別子は、約６ヌクレオチド～約３０ヌクレオチドを含んでもよい。好ましくは、固有の分子識別子は、約１５ヌクレオチドを含んでもよい。用語「固有の分子識別子およびランダム分子タグ」は、本明細書では互換的に使用される。当技術分野で既知の方法を用いる場合に、固有の分子識別子は、配列決定前に増幅の偏りを補正するために使用できるランダム配列である。

【0298】

本開示の方法では、連結の偏りを最小にするための定常核酸配列は、約１ヌクレオチド～約１５ヌクレオチドを含む。好ましくは、定常配列は約８ヌクレオチドを含む。

【0299】

側面によっては、フローセル結合部位は、約１５～約４０ヌクレオチドを含んでもよい。フローセル結合部位は、約２９ヌクレオチドを含んでもよい。フローセル結合部位は、約２４ヌクレオチドを含んでもよい。

【0300】

側面によっては、標的結合ドメインは、約１０～約７０ヌクレオチドを含んでもよい。標的結合ドメインは、約３０～約５５ヌクレオチドを含んでもよい。標的結合ドメインは、約３５～約５０ヌクレオチドを含んでもよい。

【0301】

側面によっては、標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列は、約２０～約４０を含んでもよい。標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列は、約２５ヌクレオチド、または約３５ヌクレオチド、または約１２ヌクレオチドである。

【0302】

側面によっては、増幅プライマー結合部位は、約２０～約５０ヌクレオチドを含んでもよい。増幅プライマー結合部位は、約３３ヌクレオチド、または約３４ヌクレオチドを含んでもよい。

【0303】

側面によっては、識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列は、約１～約２０ヌクレオチドを含んでもよい。識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列は、約８ヌクレオチドを含んでもよい。

【0304】

側面によっては、固有の分子識別子を含む核酸配列は、約５～約２０ヌクレオチドを含んでもよい。固有の分子識別子を含む核酸配列は、約１４ヌクレオチドを含んでもよい。

【0305】

本明細書で使用される用語「対象領域」および「ＲＯＩ」は、それらの最も広い意味で使用されて、本開示の方法を用いて分析される試料内の特定の位置を指す。

【0306】

本明細書で使用される用語「隣接する」は、約１ヌクレオチド以内、または約２ヌクレオチド以内、または約３ヌクレオチド以内、または約４ヌクレオチド以内、または約５ヌクレオチド以内、または約６ヌクレオチド以内、または約７ヌクレオチド以内、または約８ヌクレオチド以内、または約９ヌクレオチド以内、または約１０ヌクレオチド以内、または約１１ヌクレオチド以内、または約１２ヌクレオチド以内、または約１３ヌクレオチド以内、または約１４ヌクレオチド以内、または約１５ヌクレオチド、または約１６ヌクレオチド以内、または約１７ヌクレオチド以内、または約１８ヌクレオチド以内、または約１９ヌクレオチド以内、または約２０ヌクレオチド以内、または約２１ヌクレオチド以内、または約２２ヌクレオチド以内、または約２３ヌクレオチド以内、または約２４ヌクレオチド以内、または約２５ヌクレオチド以内、または約２６ヌクレオチド以内、または約２７ヌクレオチド以内、または約２８ヌクレオチド以内、または約２９ヌクレオチド以内、または約３０ヌクレオチド以内、または約４０ヌクレオチド以内、または約５０ヌクレオチド以内、または約６０ヌクレオチド以内、または約７０ヌクレオチド以内、または約８０ヌクレオチド以内、または約９０ヌクレオチド以内、または約１００ヌクレオチド以内を意味してもよい。

【0307】

本明細書で使用される用語「空間的に検出する」は、その最も広い意味で使用されて、試料中の特定の対象領域内での特定の標的検体の存在の識別を指す。空間的に検出することは、試料中の特定の対象領域内に存在する特定の標的検体の量を決定することを含んでもよい。空間的に検出することはさらに、試料の特定の対象領域内の第１の標的検体の相対量を、試料の特定の対象領域内の少なくとも第２の標的検体の量と比較して決定することを含んでもよい。空間的に検出することはまた、試料中の第１の対象領域内の特定の標的検体の相対量を、同一の試料または異なる試料の少なくとも第２の対象領域の同一の標的検体の量と比較して決定することを含んでもよい。

【0308】

本開示の方法および組成物の側面によっては、標的検体は、空間的に検出される試料内の任意の分子であってもよい。標的検体には、限定はされないが、核酸分子およびタンパク質分子が含まれる。標的検体がタンパク質である場合に、このタンパク質は標的タンパク質と呼んでもよい。標的検体が核酸である場合に、この核酸は標的核酸と呼んでもよい。標的核酸として、限定はされないが、ｍＲＮＡ分子、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子、ｔＲＮＡ分子、ｒＲＮＡ分子、ｇＤＮＡ、または試料内に存在するその他の核酸を挙げてもよい。

【0309】

本開示の方法および組成物の側面によっては、用語「標的結合ドメイン」は、その最も広い意味で使用されて、試料中に存在する標的検体に直接的にまたは間接的に結合する本開示のプローブの一部分を指す。標的結合ドメインは、核酸、タンパク質、少なくとも１つの抗体、アプタマー、またはそれらの任意の組合せを含んでもよい。標的結合ドメインは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。標的結合ドメインは、任意の数の修飾ヌクレオチドおよび／または核酸類似体を含んでもよい。

【0310】

空間的に検出される標的検体が標的タンパク質である側面では、標的結合ドメインは、タンパク質標的結合ドメインであってもよい。タンパク質標的結合ドメインは、標的タンパク質に結合する抗体または抗体断片を含んでもよい。

【0311】

空間的に検出される標的検体が標的核酸である側面では、標的結合ドメインは、標的核酸結合領域であってもよい。標的核酸結合領域は、空間的に検出される標的核酸に相補的な核酸を含んでもよい。標的核酸結合領域は、検出される標的核酸にハイブリダイズする核酸を含んでもよい。

【0312】

本明細書中で使用される用語「ハイブリダイズする」は、その最も広い意味で使用されて、安定な核酸二本鎖の生成を意味する。一側面では、「安定な二本鎖」とは、二本鎖構造が、例えば、二本鎖中の１本の鎖のＴｍより約５℃低いまたは約５℃高い温度、および例えば０．２Ｍ未満、あるいは０．１Ｍ未満または当業者に既知の塩濃度未満などの低い一価塩濃度などの条件での厳しい洗浄でも破壊されないことを意味する。二本鎖は、二本鎖を構成するポリヌクレオチド鎖および／またはオリゴヌクレオチド鎖が互いに二本鎖構造を形成するように、各鎖中のすべてのヌクレオチドが他の鎖のヌクレオチドとワトソン－クリック塩基対を形成するように、「完全に一致」できる。用語「二本鎖」は、限定はされないが、デオキシイノシン、２－アミノプリン塩基を有するヌクレオシド、およびＰＮＡなど、使用可能なヌクレオシド類似体の対を包含する。二本鎖は、少なくとも１つの不一致を含んでもよく、用語「不一致」は、二本鎖中の一対のヌクレオチドがワトソン－クリック結合を起こすことができないことを意味する。

【0313】

本明細書で使用される用語「ハイブリダイズ条件」は、典型的には、約１Ｍ未満の塩濃度を含み、より一般的には約５００ｍＭ未満、さらにより一般的には約２００ｍＭ未満の塩濃度を包含する。ハイブリダイズ温度は、５℃まで低くしてもよいが、典型的には２２℃超、より典型的には約３０℃超、多くの場合には約３７℃超である。ハイブリダイズは、一般的には、厳密な条件で、例えば、プローブがその標的検体に特異的にハイブリダイズする条件で実施される。この厳密な条件は、配列に依存し、環境毎に異なる。より長い断片には、特定のハイブリダイズのために、より高いハイブリダイズ温度を必要とする可能性がある。相補鎖の塩基組成とその長さ、有機溶媒の存在、および塩基の不一致範囲などの他の要因がハイブリダイズの厳密性に影響を及ぼす可能性があるので、それらパラメーターの組合せは、いずれかの単独のパラメーターでの無条件の測定よりも重要となる。特定のハイブリダイズ条件は、標的結合ドメインの全長と標的検体の間に二本鎖の生成を促進する。その他のハイブリダイズ条件は、標的結合ドメインの特定の部分のみに沿って、二本鎖の生成を促進する。

【0314】

本開示の方法および組成物の側面によっては、プローブは、直接的にまたは間接的に識別子オリゴヌクレオチドに連結される標的結合ドメインを含んでもよい。プローブとの関連では、識別子オリゴヌクレオチドは、そのプローブの標的結合ドメインに結合する標的検体を識別する核酸配列を含むポリヌクレオチドである。すなわち、識別子オリゴヌクレオチドは、識別子オリゴヌクレオチドが付加している標的結合に結合した特定の標的検体に先験的に割り当てられる特定の核酸配列を含む。非限定的な例では、「標的検体Ｘ」を空間的に検出するように設計された「プローブＸ」と命名されたプローブは、「識別子オリゴヌクレオチドＸ」と命名された識別子オリゴヌクレオチドに連結された「標的結合ドメインＸ」と命名された標的結合ドメインを含む。標的結合ドメインＸは標的検体Ｘに結合し、識別子オリゴヌクレオチドＸは、標的検体Ｘに対応する「核酸配列Ｘ」と命名された核酸配列を含む。したがって、本開示の方法を実施する当業者が試料中の対象領域から解放された識別子オリゴヌクレオチドを採取し、その配列決定後に核酸配列Ｘを得たのなら、当業者には、その対象領域に標的検体Ｘが存在したことが分かることになる。核酸配列Ｘの量または配列決定での読取り数値を用いて、対象領域内の標的検体Ｘの量を絶対的または相対的な表現で決定できる。

【0315】

本明細書で使用される用語「増幅プライマー結合部位」は、その最も広い意味で使用されて、少なくとも１つの増幅プライマーに相補的または少なくとも部分的に相補的な核酸配列を指し、この増幅プライマーは、例えばＰＣＲによるＤＮＡおよび／またはＲＮＡの合成を刺激するのに十分である短い一本鎖または部分的に一本鎖のオリゴヌクレオチドである。

【0316】

本開示の方法および組成物の側面によっては、標的結合ドメインは、切断可能なリンカーによって識別子オリゴヌクレオチドに連結されてもよい。適切な切断性リンカーとして、限定はされないが、化学切断性リンカー（例えば、特定の化学物質、あるいは化学物質または反応条件の組合せに曝されると切断されるリンカー）、光切断性リンカー（例えば、十分な波長の光または十分な波長範囲を含む光に曝されると切断されるリンカー）、または酵素切断性リンカー（例えば、特定の酵素または酵素類によって切断されるリンカー）が挙げられる。したがって、本明細書で使用される「識別子オリゴヌクレオチドを解放するのに十分な力を試料の位置に加えること」という語句は、その最も広い意味で使用されて、対象領域内の標的検体に結合する任意のプローブに対して、プローブの標的結合ドメインとプローブの識別子オリゴヌクレオチドとの間のリンカーが切断され、それにより識別子オリゴヌクレオチドは標的結合ドメインから分離されて識別子オリゴヌクレオチドをその後に溶液から採取できるように、試料内の特定の対象領域内の状態を変更することを説明している。例えば、プローブが標的結合ドメインと識別子オリゴヌクレオチドとの間に化学切断性リンカーを含む側面では、識別子オリゴヌクレオチドを解放するのに十分な力を試料の位置に加えることは、試料のその位置を特定の化学物質、あるいはリンカーの切断を触媒する化学物質または反応条件の組合せに曝すことを含んでもよい。別の非限定的な例で、プローブが標的結合ドメインと識別子オリゴヌクレオチドとの間に光切断性リンカーを含む側面では、識別子オリゴヌクレオチドを解放するのに十分な力を試料の位置に加えることは、光切断性リンカーを切断可能とするのに十分な波長の光を用いて、試料のその位置を曝露／励起することを含んでもよい。別の非限定的な例で、プローブが標的結合ドメインと識別子オリゴヌクレオチドとの間に酵素切断性リンカーを含む側面では、識別子オリゴヌクレオチドを解放するのに十分な力を試料の位置に加えることは、リンカーの切断を触媒するのに十分な酵素の量に、試料のその位置を曝すことを含んでもよい。

【0317】

識別子オリゴヌクレオチドを解放するのに十分な力を試料の位置に加えると、試料のその位置内の標的検体に結合する約１０％以上、または約２０％以上、または約３０％以上、または約４０％以上、または約５０％以上、または約６０％以上、または約７０％以上、または約８０％以上、または約８５％以上、または約９０％以上、または約９５％以上、または約９９％以上のプローブが、標的結合ドメインと識別子オリゴヌクレオチドを連結するリンカーの切断を被ることになる。

【0318】

当業者には分かっているように、用語「固有の分子識別子」または「ＵＭＩ」は、配列決定反応の前に核酸増幅によって引き起こされる偏り量を測定しかつ低減するのに用いられる短い核酸配列を指す。

【0319】

本開示の方法および組成物の側面によっては、親和性部分は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、核酸、またはそれらの任意の組合せを含んでもよい。

【0320】

本開示の方法および組成物の側面によっては、プローブは、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約１６０、少なくとも約１７０、少なくとも約１８０、少なくとも約１９０、または少なくとも約２００ヌクレオチドを含んでもよい。

【0321】

本開示の方法および組成物の側面によっては、標的結合ドメインは、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約１６０、少なくとも約１７０、少なくとも約１８０、少なくとも約１９０、または少なくとも約２００ヌクレオチドを含んでもよい。

【0322】

本開示の方法および組成物の側面によっては、識別子オリゴヌクレオチドは、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約１６０、少なくとも約１７０、少なくとも約１８０、少なくとも約１９０、または少なくとも約２００ヌクレオチドを含んでもよい。

【0323】

本開示の方法および組成物の側面によっては、増幅プライマーは、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約１６０、少なくとも約１７０、少なくとも約１８０、少なくとも約１９０、または少なくとも約２００ヌクレオチドを含んでもよい。

【0324】

本開示の方法および組成物の側面によっては、核酸プローブは、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約１６０、少なくとも約１７０、少なくとも約１８０、少なくとも約１９０、または少なくとも約２００ヌクレオチドを含んでもよい

【0325】

本開示の方法および組成物の側面によっては、識別子オリゴヌクレオチドの一部分に相補的な核酸は、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、または少なくとも約１００ヌクレオチドを含んでもよい。

【0326】

本開示の方法および組成物の側面によっては、分子識別子を含む核酸配列は、少なくとも約５、または少なくとも約１０、または少なくとも約１５、または少なくとも約２０、または少なくとも約２５、または少なくとも約３０、または少なくとも約３５、または少なくとも約４０、または少なくとも約４５、または少なくとも約５０ヌクレオチドを含んでもよい。

【0327】

本開示の方法および組成物の側面によっては、増幅プライマー結合部位は、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、または少なくとも約７０ヌクレオチドを含んでもよい。

【0328】

本開示の方法および組成物の側面によっては、配列決定に適するフローセルアダプター配列は、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、または少なくとも約１００ヌクレオチドを含んでもよい。

【0329】

本開示の方法および組成物の側面によっては、フローセル結合部位は、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約９５、または少なくとも約１００ヌクレオチドを含んでもよい。

【0330】

本開示の方法および組成物の側面によっては、識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列は、少なくとも約５、または少なくとも約１０ヌクレオチド、または少なくとも約１５、または少なくとも約２０、または少なくとも約２５、または少なくとも約３０、または少なくとも約３５、または少なくとも約４０、または少なくとも約４５、または少なくとも約５０ヌクレオチドを含んでもよい。

【0331】

本開示の方法および組成物の側面によっては、標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列は、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約９５、または少なくとも約１００ヌクレオチドを含んでもよい。

【0332】

本開示の方法および組成物の側面によっては、プローブ、標的結合ドメイン、識別子オリゴヌクレオチド、増幅プライマー、核酸プローブ、識別子オリゴヌクレオチドの一部分に相補的な核酸、分子識別子を含む核酸配列、増幅プライマー結合部位、フローセルアダプター配列、フローセル結合部位、識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列、標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列、またはそれらの任意の組合せは、少なくとも１つの天然塩基を含んでもよく、天然塩基を含まなくてもよく、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたは核酸類似体を含んでもよく、修飾ヌクレオチドまたは核酸類似体を含まなくてもよく、少なくとも１つのユニバーサル塩基を含んでもよく、ユニバーサル塩基を含まなくてもよく、少なくとも１つの縮重塩基を含んでもよく、または縮重塩基を含まなくてもよい。

【0333】

本開示の方法および組成物の側面によっては、プローブ、標的結合ドメイン、識別子オリゴヌクレオチド、増幅プライマー、核酸プローブ、識別子オリゴヌクレオチドの一部分に相補的な核酸、分子識別子を含む核酸配列、増幅プライマー結合部位、フローセルアダプター配列、フローセル結合部位、識別子オリゴヌクレオチドが解放された組織試料の特定の位置を識別する核酸配列、標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列、またはそれらの任意の組合せは、天然塩基（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上の天然塩基）、修飾ヌクレオチドまたは核酸類似体（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上の修飾ヌクレオチドまたは類似体ヌクレオチド）、ユニバーサル塩基（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上のユニバーサル塩基）、または縮重塩基（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上の縮重塩基）の任意の組合せを含んでもよい。組合せにより存在する場合には、天然塩基、修飾ヌクレオチドまたは核酸類似体、ユニバーサル塩基、および縮重塩基は、任意の順序で配列させてもよい。

【0334】

用語「修飾ヌクレオチド」または「核酸類似体」には、限定はされないが、ロックド核酸（ＬＮＡ）、架橋核酸（ＢＮＡ）、プロピン修飾核酸、ｚｉｐ核酸（ZNA（登録商標））、イソグアニン、およびイソシトシンが包含される。好ましくは、修飾ヌクレオチドまたは核酸類似体はロックド核酸（ＬＮＡ）である。

【0335】

本明細書で使用される用語「ロックド核酸（ＬＮＡ）」には、限定はされないが、リボース部分が２’酸素および４’炭素を連結するメチレン架橋を含む修飾ＲＮＡヌクレオチドが包含される。このメチレン架橋は、Ａ型ＲＮＡ二本鎖に見られる、ノース確認部とも呼ばれる３’内確認部にリボースを固定する。用語「隔絶ＲＮＡ」はＬＮＡと互換的に使用できる。本明細書で使用される用語「架橋核酸（ＢＮＡ）」は、限定はされないが、ノース確認部としても知られる固定３’内確認部を有する５員または６員の架橋構造を含む修飾ＲＮＡ分子を包含する。架橋構造は、リボースの２’酸素をリボースの４’炭素に連結する。炭素原子、窒素原子、および水素原子を含む様々な異なる架橋構造が可能となる。本明細書で使用される用語「プロピン修飾核酸」は、限定はされないが、核酸塩基のＣ５位にプロピン修飾を含むピリミジン、すなわちシトシンおよびチミン／ウラシルを包含する。本明細書で使用される用語「ｚｉｐ核酸（ＺＮＡ（登録商標））」は、限定はされないが、カチオン性スペルミン部分と共役しているオリゴヌクレオチドを包含する。

【0336】

本明細書で使用される用語「ユニバーサル塩基」は、限定はされないが、ワトソン－クリックの塩基対の規則に従わずに、むしろ標的核酸に位置する４つの標準塩基（Ａ、Ｔ／Ｕ、Ｃ、Ｇ）のうちのいずれかに結合できるヌクレオチド塩基を包含する。本明細書で使用される用語「縮重塩基」は、限定はされないが、ワトソン－クリックの塩基対の規則に従わずに、むしろ４つの標準塩基（Ａ、Ｔ／Ｕ、Ｃ、Ｇ）のうちの４つすべてではないが少なくとも２つに結合できるヌクレオチド塩基を包含する。縮重塩基は、ゆらぎ塩基とも呼ばれ、これら用語は、本明細書では互換的に使用される。

【0337】

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈にそうでないことを明示しない限り、複数の指示対象を含む。

【0338】

本明細書で使用される用語「または」は、具体的に記載されるか、または文脈に明示されない限り、包括的であると理解され、「または」および「および」の両方を含む。

【0339】

本明細書で使用される用語「約」は、具体的に記載されるか、または文脈に明示されない限り、当技術分野での通常の許容範囲以内、例えば平均の２標準偏差以内であると解釈される。「約」は、記載値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％と解釈してもよい。文脈からそうでないことが明確でない限り、本明細書に提供されるすべての数値は、用語「約」によって加減されている。

【0340】

別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明に属する当業者が通常に解釈するのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の他のプローブ、組成物、方法、およびキットを本開示の実施に使用できるが、本明細書には好ましい材料および方法が記載されている。なお、本明細書で使用される用語は、特定の側面の説明のみを目的としており、限定を意図するものではない。

【実施例0341】

実施例１：９６個の多重化試料用の二末端アダプター連結法

【0342】

この実施例では、本開示の二末端アダプター連結法を用いて、９６個の多重化試料から採取された識別子オリゴヌクレオチドを配列決定した。この実験で用いた核酸アダプターは部分的に二本鎖であった。この核酸アダプターは第１の鎖および第２の鎖を含んでいた。第１の鎖は連結用の５’リン酸部分を含んでいた。第１の鎖はまた、連結の偏りを最小にするための定常核酸配列（ＧＣＧＴＡＧＴＧ）、固有の分子識別子を含む核酸配列、識別子オリゴヌクレオチドが解放された試料の特定の位置を識別する固有の核酸配列、および第１の増幅プライマー結合部位（配列番号２）を含んでいた。第２の鎖は、３’末端に単一の突出チミンヌクレオチド、第１の鎖内に存在する連結の偏りを最小にするための定常核酸配列に相補的な配列、第１の鎖内に存在する識別子オリゴヌクレオチドが解放された試料の特定の位置を識別する固有の核酸配列に相補的な配列、および第２の増幅プライマー結合部位（配列番号１）を含んでいた。

【0343】

部分的に二本鎖の核酸アダプターを生成するために、第１の鎖のオリゴヌクレオチドおよび第２の鎖のオリゴヌクレオチドを等モル比で組合せて、５０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液中で２８μＭの総オリゴヌクレオチド最終濃度を得た。オリゴヌクレオチド混合液を９５℃で２分間加熱し、周囲温度で３０分間冷却し、それにより第１の鎖と第２の鎖のオリゴヌクレオチドを共にアニールして、部分的に二本鎖の核酸アダプターを生成した。アニールした核酸アダプターを、ｐＨ８の１０ｍＭのＴｒｉｓと０．０５％のＴｗｅｅｎ２０の溶液中で、０．０２μＭ～０．００２μＭの範囲の最終濃度になるように希釈した。

【0344】

採取された識別子オリゴヌクレオチドを、補正された手順によりＩｌｌｕｍｉｎａ用のＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、末端修復およびＡ付加処理を実施した。末端修復／Ａ付加処理用のマスターミックスは、６２７．８μＬのＰＣＲ等級のＨ_２Ｏ、１４３．９μＬのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ Ｅｎｄ Ｐｒｅｐの反応緩衝液、６１．７μＬのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ Ｅｎｄ Ｐｒｅｐの酵素ミックスを組合わせて調製した。８．３μＬの末端修復／Ａ付加処理用のマスターミックスを、４μＬの識別用オリゴヌクレオチドの各試料に添加した。７５℃超に加熱した蓋をして、反応物を２０℃で３０分間培養し、その後に６５℃で３０分間第２の培養を実施した。次に修復／Ａ付加処理した識別子オリゴヌクレオチド混合液を４℃で保存した。

【0345】

末端修復およびＡ付加処理に続いて、修復／Ａ付加処理した識別子オリゴヌクレオチド混合液のそれぞれに、６．４μＬのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ連結マスターミックス、０．２μＬのＮＥＢＮｅｘｔ連結エンハンサー、および１μＬの核酸アダプター希釈液を添加して、核酸アダプターを修復／Ａ付加処理した識別子オリゴヌクレオチドに連結した。これらの反応物を、加熱した蓋を外して２０℃で１５分間培養し、続いて１μＬの０．５ＭのＥＤＴＡにより停止した。次にすべての反応物を、１５ｍＬの１本の円錐管に貯蔵して、貯蔵アダプター連結試料を作製した。

【0346】

貯蔵アダプター連結試料を、希釈したＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ磁気ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｉｎｃ．）を用いて精製した。この磁気ビーズは、３５０μＬのＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズおよび３．１５ｍＬのＡＭＰｕｒｅ ＸＰ緩衝液（２．５ＭのＮａＣｌ、２０％のＰＥＧ８０００）を組合わせて調製した。ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ精製を、３．５ｍＬの希釈ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを用いて実施し、ｐＨ８の１０ｍＭのＴｒｉｓおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む２００μＬの緩衝液中に溶出した。次にＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ精製を、４００μＬのＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを用いて繰り返し、ｐＨ８の１０ｍＭのＴｒｉｓおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む２０μＬの緩衝液中に溶出して、精製アダプター連結試料を得た。

【0347】

ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ精製に続いて、精製アダプター連結試料を用いたＰＣＲ反応を調製して、アダプター連結識別子オリゴヌクレオチドを増幅した。６μＬの精製アダプター連結試料に、１０μＬのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ Ｑ５マスターミックス、０．２μＬの１００μＭの順方向および逆方向プライマー、および３．６μＬのＰＣＲ等級のＨ_２Ｏを添加した。順方向プライマーは、配列決定に適するフローセルアダプター配列、固有の分子識別子、および核酸アダプターの第１の鎖に位置する第１の増幅プライマー結合部位に相補的な核酸配列を含んでいた。用いた順方向プライマーの配列を表１に示す。

表１．二末端アダプター連結用の順方向プライマー

【表1】

【0348】

逆方向プライマーは、配列決定に適するフローセルアダプター配列、固有の分子識別子、および核酸アダプターの第２の鎖に位置する第２の増幅プライマー結合部位に相補的な核酸配列を含んでいた。用いた逆方向プライマーの配列を表２に示す。

表２．両末端アダプター連結用の逆方向プライマー

【表2】

【0349】

ＰＣＲサイクルの最適な回数を、３通りのＰＣＲ反応により経験的に決定した。あるいは、リアルタイム／ｑＰＣＲを用いてＰＣＲサイクルの最適な回数を決定することもできた。用いたＰＣＲプログラムは、以下の工程を含んだ。（１）９８℃で３０秒（２）９８℃で１０秒（３）６５℃で１分（４）（２）と（３）を９回繰返す（５）６５℃で５分

【0350】

増幅産物を、１８μＬのＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを用い、ｐＨ８の１０ｍＭのＴｒｉｓおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む２０μＬの緩衝液で溶出して精製した。

【0351】

増幅産物を、２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）での高感度ＤＮＡ片およびＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム用のＫＡＰＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて検定した。増幅産物をまた、１５ｐＭまで希釈して、ヌクレオチド配列ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＡＡＧＡＣＧＡＣＧＴＣＧＣＴＡＴＧＧＣＣＴＣＴＣＣ（配列番号２５）を含む特注のスパイクインプライマーを用いて、製造元の指示書（ＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｖ３ ２×７５ｂｐ）に従ってＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で配列決定した。

【0352】

実施例２：９６個の多重化試料用の一末端アダプター連結法

【0353】

この実施例では、本開示の一末端アダプター連結法を用いて、９６個の多重化試料から採取された識別子オリゴヌクレオチドを配列決定した。この実験で用いた核酸アダプターは部分的に二本鎖であった。核酸アダプターは第１の鎖および第２の鎖を含んでいた。第１の鎖は連結用の５’リン酸部分を含んでいた。第１の鎖はまた、連結の偏りを最小にするための定常核酸配列（ＣＡＣＴＡＣＧＣ）、固有の分子識別子を含む核酸配列、識別子オリゴヌクレオチドが解放された試料の特定の位置を識別する固有の核酸配列、および第１の増幅プライマー結合部位（配列番号１）を含んでいた。第２の鎖は、３’末端に単一の突出チミンヌクレオチド、第１の鎖内に存在する連結の偏りを最小にするための定常核酸配列に相補的な配列、および第１の鎖内に存在する識別子オリゴヌクレオチドが解放された試料の特定の位置を識別する固有の核酸配列に相補的な配列を含んでいた。

【0354】

部分的に二本鎖の核酸アダプターを生成するために、第１の鎖のオリゴヌクレオチドおよび第２の鎖のオリゴヌクレオチドを等モル比で組合せて、５０ｍＭのＮａＣｌ中で２８μＭの総オリゴヌクレオチド最終濃度を得た。オリゴヌクレオチド混合液を９５℃で２分間加熱し、周囲温度で３０分間冷却し、それにより第１の鎖と第２の鎖のオリゴヌクレオチドを共にアニールして、部分的に二本鎖の核酸アダプターを生成した。アニールした核酸アダプターを、ｐＨ８の１０ｍＭのＴｒｉｓと０．０５％のＴｗｅｅｎ２０の溶液中で、０．０２μＭ～０．００２μＭの範囲の最終濃度になるように希釈した。

【0355】

採取した識別子オリゴヌクレオチドの各試料に１０μＬの２Ｘ高速連結緩衝液（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）、１μＬのＴ４ ＤＮＡ高速連結酵素（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）、および１μＬのアニールした核酸アダプター希釈液を添加して、核酸アダプターを採取した識別子オリゴヌクレオチドに連結した。加熱された蓋を外して試料を２０℃で１５分間培養し、続いて１μＬの０．５ＭのＥＤＴＡにより停止した。次にすべての反応物を１本の１５ｍＬの円錐管に貯蔵して、貯蔵アダプター連結試料を生成した。

【0356】

貯蔵アダプター連結試料を、希釈したＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ磁気ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｉｎｃ．）を用いて精製した。この磁気ビーズは、３５０μＬのＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズおよび３．１５ｍＬのＡＭＰｕｒｅ ＸＰ緩衝液（２．５ＭのＮａＣｌ、２０％のＰＥＧ８０００）を組合わせて調製した。ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ精製を、３．５ｍＬの希釈ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを用いて実施し、ｐＨ８の１０ｍＭのＴｒｉｓおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む２００μＬの緩衝液中に溶出した。次にＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ精製を、４００μＬのＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを用いて繰り返し、ｐＨ８の１０ｍＭのＴｒｉｓおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む２０μＬの緩衝液中に溶出して、精製アダプター連結試料を得た。

【0357】

ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ精製に続いて、精製アダプター連結試料を用いたＰＣＲ反応を調製して、アダプター連結識別子オリゴヌクレオチドを増幅した。６μＬの精製アダプター連結試料に、１０μＬのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ Ｑ５マスターミックス、０．２μＬの１００μＭの順方向および逆方向プライマー、および３．６μＬのＰＣＲ等級のＨ_２Ｏを添加した。順方向プライマーは、配列決定に適するフローセルアダプター配列、固有の分子識別子、および核酸アダプターの第１の鎖に位置する第１の増幅プライマー結合部位に相補的な核酸配列を含んでいた。用いた順方向プライマーの配列を表３に示す。

表３．二末端アダプター連結用の順方向プライマー

【表3】

【0358】

逆方向プライマーは、配列決定に適するフローセルアダプター配列、固有の分子識別子、および核酸アダプターの第２の鎖に位置する第２の増幅プライマー結合部位に相補的な核酸配列を含んでいた。用いた逆方向プライマーの配列を表４に示す。

表４．二末端アダプター連結用の逆方向プライマー

【表4】

【0359】

ＰＣＲサイクルの最適な回数を、３通りのＰＣＲ反応により経験的に決定した。あるいは、リアルタイム／ｑＰＣＲを用いて、ＰＣＲサイクルの最適な回数を決定することもできた。用いたＰＣＲプログラムは、以下の工程を含んだ。（１）９８℃で３０秒（２）９８℃で１０秒（３）６５℃で１分（４）（２）と（３）を９回繰返す（５）６５℃で５分

【0360】

増幅産物を、１８μＬのＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを用い、ｐＨ８の１０ｍＭのＴｒｉｓおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む２０μＬの緩衝液で溶出して精製した。

【0361】

増幅産物を、２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）での高感度ＤＮＡ片およびＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム用のＫＡＰＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて評価した。増幅産物をまた、１５ｐＭまで希釈して、ヌクレオチド配列ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＡＡＧＡＣＧＡＣＧＴＣＧＣＴＡＴＧＧＣＣＴＣＴＣＣ（配列番号２５）を含む特注のスパイクインプライマーを用いて、製造元の指示書（ＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｖ３ ２×７５ｂｐ）に従ってＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）により配列決定した。

【0362】

実施例３：９６個の多重化試料用の鋳型プライマー伸長法

【0363】

この実施例では、本開示の鋳型プライマー伸長法を用いて、９６個の多重化試料から採取した識別子オリゴヌクレオチドを配列決定した。この例で用いられる一本鎖核酸鋳型は、３’ビオチン部分、採取した識別子オリゴヌクレオチドに存在する固有の核酸配列に相補的な領域、固有の分子識別子を含む核酸配列、および第２の増幅プライマー結合配列（ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ、配列番号２６）を含んでいた。この実施例で用いた一本鎖核酸鋳型の配列を表５に示す。

表５．鋳型プライマー伸長法用の一本鎖核酸鋳型

【表5-1】

【表5-2】

【0364】

一本鎖核酸鋳型は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．から取り寄せて、ＮａｎｏＤｒｏｐ １０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量した。個々の一本鎖核酸鋳型を標準濃度に正規化し、その後等モルにして貯蔵した。一本鎖核酸鋳型の貯蔵物を、ｐＨ８の１０ｍＭのＴｒｉｓおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む緩衝液中に０．８３ｎＭまで希釈した。

【0365】

採取した識別子オリゴヌクレオチドを、一本鎖核酸鋳型にハイブリダイズし、２μＬの識別子オリゴヌクレオチドの各試料に１０μＬのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ Ｑ５マスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、４μＬの希釈した一本鎖核酸鋳型貯蔵物、および４μＬのＨ_２Ｏを添加して伸長した。以下のＰＣＲプログラムを使用して、識別子オリゴヌクレオチドを伸長した。
（１）９８℃で３０秒、１０回
（２）９８℃で１分、
（３）６８℃で１分
（４）７２℃で１分
（５）工程（２）～（４）を１０回繰返す
（６）７２℃で２分

【0366】

伸長産物を４℃で保存した。ストレプトアビジン磁性ビーズ（ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１ ｂｅａｄｓ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１Ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ Ｗａｓｈｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、１ＭのＮａＣｌ）で洗浄し、５μＬのストレプトアビジンビーズを各伸長産物試料に添加した。伸長産物試料を、軌道型攪拌器でビーズと共に最短１５分間培養した。培養後に、試料を９５℃で３分間加熱し、磁気皿に移した。十分にビーズとペレット化した直後に上清を抽出して、精製した伸長産物試料を得た。

【0367】

７．５μＬの精製伸長産物試料のそれぞれに、１２．５μＬのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ Ｑ５マスターミックス、０．２５μＬの１００μＭの順方向プライマー、１μＬの２５μＭの逆方向プライマー、および３．８μＬのＰＣＲ等級のＨ_２Ｏを添加して、この精製伸長産物試料を増幅した。順方向プライマーは、配列決定に適するフローセルアダプター配列、固有の分子識別子、および識別子オリゴヌクレオチドに位置する第１の増幅プライマー結合部位に相補的な核酸配列を含んでいた。この例で用いた順方向プライマーの配列を表６に示す。

表６．鋳型プライマー伸長法用の順方向プライマー

【表6】

【0368】

逆方向プライマーは、配列決定に適するフローセルアダプター配列、固有の分子識別子、および一本鎖核酸鋳型に位置する第２の増幅プライマー結合部位に相補的な核酸配列を含んでいた。用いた逆方向プライマーの配列を表７に示す。

表７．鋳型プライマー伸長法用の逆方向プライマー

【表7-1】

【表7-2】

【表7-3】

【0369】

精製伸長産物を増幅するのに使用されるＰＣＲプログラムは、以下の工程を含んでいた。
（１）９８℃で３０秒
（２）９８℃で１０秒
（３）６５℃で３０秒
（４）７２℃で３０秒
（５）工程（２）～（４）を１８回繰り返す
（６）７２℃で２分

【0370】

増幅伸長産物を４℃で保存した。４μＬの各ＰＣＲ反応液を、１個の貯蔵物当たりに２４個の試料からなる４個の貯蔵物としてまとめた。

【0371】

貯蔵ＰＣＲ反応液を、希釈したＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ磁性ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｉｎｃ．）を用いて精製した。この磁気ビーズは、１００μＬのＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズおよび４００μＬのＡＭＰｕｒｅ ＸＰ緩衝液（２．５ＭのＮａＣｌ、２０％のＰＥＧ８０００）を組合わせて調製した。精製を７６．８μＬの希釈ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを用いて実施し、ｐＨ８の１０ｍＭのＴｒｉｓおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む２０μＬの緩衝液中に溶出した。ビーズをそのまま留めて、精製工程を２４μＬのＡＭＰｕｒｅ ＸＰ緩衝液を用いて繰り返し、ｐＨ８の１０ｍＭのＴｒｉｓおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む２０μＬの緩衝液中に溶出した。

【0372】

精製ＰＣＲ産物を、２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）での高感度ＤＮＡ片およびＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム用のＫＡＰＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて評価した。精製ＰＣＲ産物をまた、１５ｐＭまで希釈して、ヌクレオチド配列ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＡＡＧＡＣＧＡＣＧＴＣＧＣＴＡＴＧＧＣＣＴＣＴＣＣ（配列番号２５）を含む特注のスパイクインプライマーを用いて、製造元の指示書（ＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｖ３ ２×７５ｂｐ）に従ってＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）により配列決定した。

【0373】

実施例４：９６個の多重化試料用の長プローブハイブリダイズ法

【0374】

この実施例では、本開示の長プローブハイブリダイズ法を使用して、９６個の多重化試料から採取した識別子オリゴヌクレオチドを配列決定した。この例では、第１の核酸プローブは、５’リン酸部分、識別子オリゴヌクレオチドの一部分に相補的な核酸配列、ｉ７配列（配列番号１）を含む第１の増幅プライマー結合部位、識別子オリゴヌクレオチドが解放された試料の特定の位置を識別する固有の核酸配列、およびＰ７フローセルアダプター配列（配列番号４）を含む。第２の核酸プローブは、識別子オリゴヌクレオチドの一部分に相補的な核酸配列、固有の分子識別子を含む核酸配列、ｉ５配列（配列番号２）を含む第２の増幅プライマー結合部位、およびＰ５フローセルアダプター配列（配列番号３）を含む。

【0375】

第１および第２の核酸プローブは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．から取り寄せて、ＮａｎｏＤｒｏｐ １０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量した。個々の核酸プローブを標準濃度に正規化し、等モルにして貯蔵し、かつｐＨ８の１０ｍＭのＴｒｉｓおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む緩衝液中に０．８３ｎＭまで希釈した。核酸プローブおよび識別子オリゴヌクレオチドを、０．５μＬの希釈した核酸プローブ貯蔵物と試料溶液から採取した２μＬの識別子オリゴヌクレオチドの混合液とを５０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液中で組合せてハイブリダイズした。この混合液を９５℃で２分間加熱し、周囲温度で３０分間冷却して、アニール済みの識別子オリゴヌクレオチド－核酸プローブ混合液を生成した。

【0376】

第１および第２の核酸プローブは隣接せずにかつ重ならないように、第１および第２の核酸プローブが識別子オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする場合には、間隙伸長反応を実施した。２．５μＬのアニール済みの識別子オリゴヌクレオチド－核酸プローブ混合液のそれぞれに、３．８μＬのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ Ｑ５マスターミックスおよび１．３μＬのＰＣＲ等級のＨ_２Ｏを加えた。次に混合液を以下の間隙伸長の温度サイクルに供した。（１）９８℃で３０秒
（２）９８℃で１分
（３）６８℃で１分
（４）７２℃で１分
（５）工程（２）～（４）を１０回繰り返す
（６）７２℃で２分

【0377】

次に間隙伸長産物を４℃で保存した。続いて１μＬの間隙伸長産物に、１０μＬの２Ｘ高速連結緩衝液（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）、１μＬのＴ４ ＤＮＡ高速連結酵素（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）、および８μＬのＰＣＲ等級のＨ_２Ｏを加えて、第１および第２の核酸プローブを共に連結した。これらの連結反応液を２０℃で１５分間培養した後に、１μＬの０．５ＭのＥＤＴＡにより停止して、１本の１５ｍＬの円錐管に貯蔵した。

【0378】

第１および第２の核酸プローブは隣接しているが重ならないように第１および第２の核酸プローブが識別子オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする場合には、ニック修復連結反応を実施した。２．５μＬのアニール済みの識別子オリゴヌクレオチド－核酸プローブ混合液のそれぞれに、１０μＬの２Ｘ高速連結緩衝液（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）、１μＬのＴ４ ＤＮＡ高速連結酵素（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）、および１μＬのＰＣＲ等級のＨ_２Ｏを加えた。これらの連結反応液を２０℃で１５分間培養した後に、１μＬの０．５ＭのＥＤＴＡにより停止して、１本の１５ｍＬの円錐管に貯蔵した。

【0379】

次に停止した連結反応液の貯蔵物を、希釈したＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ磁気ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｉｎｃ．）を用いて精製した。この磁気ビーズは、３５０μＬのＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズおよび３．１５ｍＬのＡＭＰｕｒｅ ＸＰ緩衝液（２．５ＭのＮａＣｌ、２０％のＰＥＧ８０００）を組合わせて調製した。精製を３．５ｍＬの希釈ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを用いて実施し、ｐＨ８の１０ｍＭのＴｒｉｓおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む２００μＬの緩衝液中に溶出した。次に、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズの精製を４００μＬのＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズにより繰り返し、ｐＨ８の１０ｍＭのＴｒｉｓおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む２０μＬの緩衝液中に溶出した。

【0380】

精製連結産物を増幅するために、精製連結産物およびプライマーを有するＰＣＲ反応液を調製した。６μＬの精製連結産物に、１０μＬのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ Ｑ５マスターミックス、０．２μＬの１００μＭの順方向プライマー（ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡ、配列番号１５３）ならびに逆方向プライマー（ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ、配列番号１５４）、および３．６μＬのＰＣＲ等級のＨ_２Ｏを加えた。精製伸長産物を増幅するのに使用されるＰＣＲプログラムは、以下の工程を含んだ。
（１）９８℃で３０秒
（２）９８℃で１０秒
（３）６５℃で３０秒
（４）７２℃で３０秒
（５）工程（２）～（４）を１８回繰り返す
（６）７２℃で２分

【0381】

増幅産物を４℃で保存した。４μＬのＰＣＲ反応液をそれぞれ、１個の貯蔵物当たり１６個の試料となる６個の貯蔵物としてまとめた。増幅産物をさらに、６４μＬのＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズによるＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ精製を用いて、かつｐＨ８の１０ｍＭのＴｒｉｓおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む２０μＬの緩衝液に溶出して精製した。

【0382】

精製増幅産物を、２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）での高感度ＤＮＡ片およびＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム用のＫＡＰＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて評価した。精製増幅産物をまた、１５ｐＭまで希釈して、標準の配列決定プライマーまたは特注のスパイクインＲｅａｄ１プライマー（配列番号２５）のいずれかを用いて、製造元の指示書（ＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｖ３ ２×７５ ｂｐ）に従ってＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）により配列決定した。

【0383】

実施例５：９６個の多重化試料用の短プローブハイブリダイズ法

【0384】

この実施例では、本開示の短プローブハイブリダイズ法を使用して、９６個の多重化試料から採取した識別子オリゴヌクレオチドを配列決定した。この例では、第１の核酸プローブは、５’リン酸部分、識別子オリゴヌクレオチドの一部分に相補的な核酸配列、ｉ７配列（配列番号１）を含む第１の増幅プライマー結合部位、および識別子オリゴヌクレオチドが解放された試料の特定の位置を識別する固有の核酸配列を含む。第２の核酸プローブは、識別子オリゴヌクレオチドの一部分に相補的な核酸配列、固有の分子識別子を含む核酸配列、およびｉ５配列（配列番号２）を含む第２の増幅プライマー結合部位を含む。

【0385】

第１および第２の核酸プローブは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．から取り寄せて、ＮａｎｏＤｒｏｐ １０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量した。個々の核酸プローブを標準濃度に正規化し、等モルにして貯蔵し、かつｐＨ８の１０ｍＭのＴｒｉｓおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む緩衝液中で０．８３ｎＭまで希釈した。核酸プローブおよび識別子オリゴヌクレオチドを、０．５μＬの希釈した核酸プローブ貯蔵物と試料溶液から採取した２μＬの識別子オリゴヌクレオチドの混合液とを５０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液中で組合せてハイブリダイズした。この混合液を９５℃で２分間加熱し、周囲温度で３０分間冷却して、アニール済みの識別子オリゴヌクレオチド－核酸プローブ混合液を生成した。

【0386】

第１および第２の核酸プローブは隣接せずにかつ重ならないように、第１および第２の核酸プローブが識別子オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする場合には、間隙伸長反応を実施した。２．５μＬのアニール済みの識別子オリゴヌクレオチド－核酸プローブ混合液のそれぞれに、３．８μＬのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ Ｑ５マスターミックスおよび１．３μＬのＰＣＲ等級のＨ_２Ｏを加えた。次に、混合液を以下の間隙伸長の温度サイクルに供した。
（１）９８℃で３０秒
（２）９８℃で１分
（３）６８℃で１分
（４）７２℃で１分
（５）工程（２）～（４）を１０回繰り返す
（６）７２℃で２分

【0387】

次に、間隙伸長産物を４℃で保存した。続いて、１μＬの間隙伸長産物に１０μＬの２Ｘ高速連結緩衝液（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）、１μＬのＴ４ ＤＮＡ高速連結酵素（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）、および８μＬのＰＣＲ等級のＨ_２Ｏを加えて、第１および第２の核酸プローブを共に連結した。これらの連結反応液を２０℃で１５分間培養した後に、１μＬの０．５ＭのＥＤＴＡにより停止して、１本の１５ｍＬの円錐管内に貯蔵した。

【0388】

第１および第２の核酸プローブは隣接しているが重ならないように、第１および第２の核酸プローブが識別子オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする場合には、ニック修復連結反応を実施した。２．５μＬのアニール済みの識別子オリゴヌクレオチド－核酸プローブ混合液のそれぞれに、１０μＬの２Ｘ高速連結緩衝液（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）、１μＬのＴ４ ＤＮＡ高速連結酵素（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）、および１μＬのＰＣＲ等級のＨ_２Ｏを加えた。これらの連結反応液を２０℃で１５分間培養した後に、１μＬの０．５ＭのＥＤＴＡにより停止して、１本の１５ｍＬの円錐管内に貯蔵した。

【0389】

次に停止した連結反応液の貯蔵物を、希釈したＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ磁性ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｉｎｃ．）を用いて精製した。この磁性ビーズは、３５０μＬのＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズおよび３．１５ｍＬのＡＭＰｕｒｅ ＸＰ緩衝液（２．５ＭのＮａＣｌ、２０％のＰＥＧ８０００）を組合わせて調製した。精製を３．５ｍＬの希釈ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを用いて実施し、ｐＨ８の１０ｍＭのＴｒｉｓおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む２００μＬの緩衝液中に溶出した。次に、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズの精製を４００μＬのＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズにより繰り返し、ｐＨ８の１０ｍＭのＴｒｉｓおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む２０μＬの緩衝液中に溶出した。

【0390】

精製連結産物を増幅するために、精製連結産物およびプライマーを有するＰＣＲ反応液を調製した。６μＬの精製連結産物に、１０μＬのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ Ｑ５マスターミックス、０．２μＬの１００μＭの順方向プライマーならびに逆方向プライマー、および３．６μＬのＰＣＲ等級のＨ_２Ｏを添加した。順方向プライマーは、配列決定に適するフローセルアダプター配列、固有の分子識別子、および核酸アダプターの第１の鎖に位置する第１の増幅プライマー結合部位に相補的な核酸配列を含んでいた。用いた順方向プライマーの配列を表８に示す。

表８．短プローブハイブリダイズ法用の順方向プライマー

【表8】

【0391】

逆方向プライマーは、配列決定に適するフローセルアダプター配列、固有の分子識別子、および核酸アダプターの第２の鎖に位置する第２の増幅プライマー結合部位に相補的な核酸配列を含んでいた。用いた逆方向プライマーの配列を表９に示す。

表９．短プローブハイブリダイズ法用の逆方向プライマー

【表9】

【0392】

精製伸長産物を増幅するのに使用されるＰＣＲプログラムは、以下の工程を含んだ。
（１）９８℃で３０秒
（２）９８℃で１０秒
（３）６５℃で３０秒
（４）７２℃で３０秒
（５）工程（２）～（４）を１８回繰り返す
（６）７２℃で２分

【0393】

増幅産物をを４℃で保存した。４μＬのＰＣＲ反応液をそれぞれ、１個の貯蔵物当たり１６個の試料である６個の貯蔵物として纏めた。増幅産物をさらに、６４μＬのＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズによるＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ精製を使用して、かつｐＨ８の１０ｍＭのＴｒｉｓおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む２０μＬの緩衝液で溶出して精製した。

【0394】

精製増幅産物を、２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）での高感度ＤＮＡ片およびＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム用のＫＡＰＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて評価した。精製増幅産物をまた、１５ｐＭまで希釈して、標準の配列決定プライマーまたは特注のスパイクインＲｅａｄ１プライマー（配列番号２５）のいずれかを用いて、製造元の指示書（ＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｖ３ ２×７５ｂｐ）に従ってＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）により配列決定した。

【0395】

実施例６：９６個の多重化試料用の直接ＰＣＲ法

【0396】

この実施例では、本開示の直接ＰＣＲ法を使用して、９６個の多重化試料から採取した識別子オリゴヌクレオチドを配列決定した。この例では、８種の順方向増幅プライマーおよび１２種の逆方向増幅プライマーを用いた。順方向プライマーは、Ｐ５フローセルアダプター（配列番号３）、固有の分子識別子を含む核酸配列、および識別子オリゴヌクレオチドに存在する第１の増幅プライマー結合部位に相補的な領域を含んでいた。用いた順方向増幅プライマーの配列を表１０に示す。

表１０．直接ＰＣＲ法用の順方向増幅プライマー

【表10】

【0397】

逆方向プライマーは、Ｐ７フローセルアダプター（配列番号４）、固有の分子識別子を含む核酸配列、および識別子オリゴヌクレオチドに存在する第２の増幅プライマー結合部位に相補的な領域を含んでいた。用いた逆方向増幅プライマーの配列を表１１に示す。

表１１．直接ＰＣＲ法用の逆方向増幅プライマー

【表11】

【0398】

８種の順方向増幅プライマーおよび１２種の逆方向増幅プライマーの場合に、一対の順方向プライマーおよび逆方向プライマーからの固有の分子識別子を組合せると、合計９６個の固有の組合せを得ることができ、９６試料の多重化が可能となる。

【0399】

配列決定用に採取した識別子オリゴヌクレオチドを増幅するために、採取した識別子オリゴヌクレオチドならびに順方向および逆方向増幅プライマーを有するＰＣＲ反応液を、２μＬのそれぞれの識別子オリゴヌクレオチド試料、１０μＬのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ Ｑ５マスターミックス、２μＬの１０μＭの順方向増幅プライマー、２μＬの逆方向増幅プライマー、および４μＬのＰＣＲ等級のＨ_２Ｏとともに、９６個のウェルプレートに調製した。９６個のウェルプレート内の各ウェルには、識別子オリゴヌクレオチド試料ならびに順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーの固有の組合せが含まれていた。使用したＰＣＲプログラムは、以下の工程を含んだ。
（１）９８℃で３０秒
（２）９８℃で１０秒
（３）６５℃で３０秒
（４）７２℃で３０秒
（５）工程（２）～（４）を６～１０回繰り返す。
（６）７２℃で２分

【0400】

増幅産物を４℃で保存した。１０μＬのＰＣＲ反応液を、それぞれ１本の１５ｍＬの円錐管に貯蔵した。

【0401】

貯蔵されたＰＣＲ反応液を、希釈したＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ磁性ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｉｎｃ．）を用いて精製した。この磁性ビーズは、１１５．２μＬのＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズと１０３６．８μＬのＡＭＰｕｒｅ ＸＰ緩衝液（２．５ＭのＮａＣｌ、２０％のＰＥＧ８０００）を組合せて調製した。精製を１１５２μＬの希釈したＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズにより実施し、ｐＨ８の１０ｍＭのＴｒｉｓを含む６０μＬの緩衝液中に溶出した。精製工程を６０μＬのＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズにより繰返し、ｐＨ８の１０ｍＭのＴｒｉｓを含む７０μＬの緩衝液中に溶出した。

【0402】

ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ精製に続いて、ユニバーサルプライマーを有するＰＣＲ反応液を、９μＬの貯蔵された直接ＰＣＲ産物、１５μＬのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ Ｑ５マスターミックス、３μＬの１０μＭのユニバーサルＰ７プライマー（配列番号１５３）、および２μＬの１０μＭのユニバーサルＰ５プライマー（配列番号１５４）を用いて調製した。使用したＰＣＲプログラムは以下の通りである。
（１）９８℃で３０秒
（２）９８℃で１０秒
（３）６５℃で３０秒
（４）７２℃で３０秒
（５）工程（２）～（４）を１５～２４回繰り返す
（６）７２℃で２分

【0403】

２回のＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ精製を実施した。１回目は、３０μＬのビーズで実施して、ｐＨ８の１０ｍＭのＴｒｉｓを含む２０μＬの緩衝液により溶出し、２回目は、２０μＬのビーズで実施して、ｐＨ８の１０ｍＭのＴｒｉｓを含む１１μＬの緩衝液により溶出した。

【0404】

これらの精製ＰＣＲ産物を、２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）での高感度ＤＮＡ片を用いて評価した。精製ＰＣＲ産物をまた希釈して、特注のスパイクインプライマー（配列番号２５）を用いて、製造元の指示書（ＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｖ３ ２×７５ｂｐ）に従ってＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）により配列決定した。

【0405】

実施例７：ＦＦＰＥ試料中の標的検体の空間的検出

【0406】

本発明の方法を使用して、炎症を起こしたヒト扁桃腺組織のＦＦＰＥ切片試料中の、標的タンパク質および標的ＲＮＡを含む複数の異なる標的検体を空間的に検出した。

【0407】

一実験では、炎症を起こしたヒト扁桃腺組織のＦＦＰＥ断片から切断された２個の連続切片で、本開示の方法を使用して３０種の異なる標的タンパク質を空間的に検出した。３０種の標的タンパク質を表１２に示す。３０種の標的タンパク質には、陰性対照としてＩｇＧウサギアイソタイプおよびＩｇＧマウスアイソタイプを含み、これらの標的タンパク質は、炎症を起こしたヒト扁桃腺試料に存在すべきものではなく、したがって検出されるべきものではない。

表１２．標的タンパク質

【表12】

【0408】

３０種の標的タンパク質を空間的に検出するために、本開示の３０個の異なるプローブが用いられた。それぞれのプローブは、表１２の３０種の標的タンパク質のうちの１つに特異的に結合する抗体を含む標的結合ドメインを含んでいた。２個の連続切片を、３０個の異なるプローブのうちの大部分と接触させた。次に９６個の対象領域（ＲＯＩ）を特定した。各ＲＯＩでは、ＲＯＩをＵＶ光で照射して、ＲＯＩ内で結合したプローブから識別子オリゴヌクレオチドを解放した。続いて解放された識別子オリゴヌクレオチドを採取し、本開示の短プローブハイブリダイズ法を使用して識別し、それにより２個の連続切片中の３０種の標的タンパク質を空間的に検出した。図２１に示すように、２個の連続切片の各ＲＯＩ中の標的タンパク質ごとの読取り数値はよく相関していて、この方法が再現性のある結果を導くことを示していた。

【0409】

第２の実験では、炎症を起こしたヒト扁桃腺組織のＦＦＰＥ断片から切断した２個の異なる連続切片で、本開示の方法を使用して２０種の異なる標的ＲＮＡを空間的に検出した。２０種の異なる標的ＲＮＡを表１３に示す。２０種の標的ＲＮＡには、試料中に検出されるべきものではない６種の陰性対照（陰性プローブ）を含んでいた。

表１３．標的ＲＮＡ

【表13】

【0410】

２０種の標的ＲＮＡを空間的に検出するために、本開示の２０個の異なるプローブが用いられた。それぞれのプローブは、２０種の標的ＲＮＡのうちの１つの少なくとも一部分に相補的な核酸配列を含む標的結合ドメインを含んでいた。２個の連続切片を、２０個の異なるプローブのうちの大部分と接触させた。次に９６個の対象領域（ＲＯＩ）を特定した。各ＲＯＩでは、ＲＯＩをＵＶ光で照射して、ＲＯＩ内で結合したプローブから識別子オリゴヌクレオチドを解放した。続いて解放された識別子オリゴヌクレオチドを採取し、本開示の直接ＰＣＲ法を使用して識別し、それにより２個の連続切片中で２０種の標的ＲＮＡを空間的に検出した。図２２に示すように、２個の連続切片の各ＲＯＩ中の標的ＲＮＡごとの読取り数値はよく相関していて、この方法が再現性のある結果を導くことを示していた。

【0411】

実施例８：蛍光染色されたＦＦＰＥ試料中の標的タンパク質の空間的検出

【0412】

別の実験では、炎症を起こしたヒト扁桃腺組織の５μｍのＦＦＰＥ切片を４種の蛍光可視化マーカー、すなわち図２３の左の図に示す（１）ＣＤ３Ｅ（Ｔ細胞マーカー）、（２）ＰａｎＣＫ（上皮細胞マーカー）、（３）Ｋｉ－６７（増殖マーカー）、および（４）ＳＹＴＯ８３（ＤＮＡ染色）により染色した。次に染色されたＦＦＰＥ切片を、実施例７で説明したように、３０種の標的タンパク質を対象としたプローブと接触させた。図２３の左の図に示すように、９６個の対象領域（ＲＯＩ）を選択した。ＲＯＩはそれぞれ、直径５００μｍの円形であった。それぞれのＲＯＩでは、ＲＯＩをＵＶ光で照射して、ＲＯＩ内で結合したプローブから識別子オリゴヌクレオチドを解放した。続いて解放された識別子オリゴヌクレオチドを採取し、本開示の短プローブハイブリダイズ法を使用して識別して、それによりＦＦＰＥ切片内の３０種の標的タンパク質を空間的に検出した。図２３の右側の図に示すように、ＰａｎＣＫ、ＣＤ３Ｅ、およびＫｉ６７は、それら蛍光可視化マーカーと関連付いたＲＯＩで空間的に検出された。したがって、本開示の方法によって得られた結果は、既定の免疫組織化学的方法を使用して得られた結果と相関している。

【0413】

実施例９：ＦＦＰＥ試料中の標的ＲＮＡの空間的検出

【0414】

別の実験では、実施例７の説明のように、炎症を起こしたヒト扁桃腺組織のＦＦＰＥ塊からの５μｍ切片を２０種の標的ＲＮＡを対象したプローブと接触させた。次に９６個の対象領域（ＲＯＩ）を選択した。ＲＯＩはそれぞれ、直径５００μｍの円形であった。それぞれのＲＯＩでは、ＲＯＩをＵＶ光で照射して、ＲＯＩ内で結合したプローブから識別子オリゴヌクレオチドを解放した。続いて解放された識別子オリゴヌクレオチドを採取し、本開示の直接ＰＣＲ法を使用して識別して、それにより２個の連続切片中の２０種の標的ＲＮＡを空間的に検出した。次に、同一の炎症を起こしたヒト扁桃腺組織ＦＦＰＥ塊の２０μｍ切片からのすべてのＲＮＡを分離した。すべてのＲＮＡを、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）システムを用いて分析した。図２４は、本開示の方法を使用して記録された１１個の異なるＲＮＡ標的の平均カウント数が、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）システムを使用して記録された同一の１１個の異なるＲＮＡ標的の平均カウント数とよく相関することを示している。したがって、本開示の方法を使用して得られた結果は、既定の直接検出方法を使用して得られた結果に相関している。

【0415】

実施例１０：ＲＯＩの特定の部分領域での標的ＲＮＡの空間的検出

【0416】

別の実験では、実施例７の説明のように、炎症を起こしたヒト扁桃腺組織のＦＦＰＥ塊からの５μｍ切片を３０種の標的タンパク質を対象とするプローブと接触させた。同一の５μｍ切片はまた、４種の蛍光可視化マーカー、すなわち（１）ＣＤ３Ｅ（Ｔ細胞マーカー）、（２）ＰａｎＣＫ（上皮細胞マーカー）、（３）Ｋｉ－６７（増殖マーカー）、および（４）ＳＹＴＯ８３（ＤＮＡ染色）により染色された。図２５に示すように、４８個の対象領域（ＲＯＩ）を特定した。それぞれのＲＯＩでは、次に２個の部分領域を蛍光染色に基づいて識別した。図２５に示すように、ＰａｎＣＫ（ＰａｎＣＫ＋）に対して陽性に蛍光染色されたＲＯＩの区域は、「腫瘍」部分領域と命名され、ＰａｎＣＫの蛍光染色が見られなかったＲＯＩの区域は、「微小環境」部分領域と命名された。それぞれのＲＯＩでは、腫瘍部分領域および微小環境部分領域を別々にＵＶ光で照射して、ＰａｎＣＫの蛍光染色の強度に基づく特注のマスクを作成して、各部分領域内に結合したプローブから識別子オリゴヌクレオチドを解放した。解放された識別子オリゴヌクレオチドをさらに個別に採取した。続いて採取した識別子オリゴヌクレオチドを、本開示の短プローブハイブリダイズ法およびＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）システムを使用して分析した。図２５の下部の図に示すように、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）システムおよび本開示の短プローブハイブリダイズ法を使用した両方の結果はよく相関していた。さらに腫瘍の部分領域では、微小環境の部分領域と比較して、ＰａｎＣＫが顕著に高い濃度で検出された。したがって、本開示の方法によって得られる空間的検出の結果は、既定の蛍光免疫組織化学的方法に一致していて、試料の極めて特異的な領域内での空間的検出が可能であることを示す。

【0417】

実施例１１：９６項目のヒト免疫腫瘍学パネル

【0418】

本発明の直接ＰＣＲ法に使用するために、９６項目のヒト免疫腫瘍学パネルを設計した。このパネルは、本開示の直接ＰＣＲ法を使用して９６個の異なるヒト標的ＲＮＡを空間的に検出するのに用いることができる複数のプローブを含んでいた。９６個の標的ＲＮＡを表１４に示す。

表１４．標的ＲＮＡ

【表14】

【0419】

全体として、パネルは９２８個の異なるプローブを含んでいた。それぞれのプローブは、第１の増幅プライマー結合部位を含む識別子オリゴヌクレオチド、固有の分子識別子を含む核酸配列、標的結合ドメインに結合した標的ＲＮＡを識別する固有の核酸配列、および第２の増幅プライマー結合部位を含んでいた。図２６は、パネルで用いられるプローブの概略図を示す。９６個の標的ＲＮＡのそれぞれには、その標的ＲＮＡに直接的にまたは間接的にハイブリダイズする標的結合ドメインを含む９２８個のプローブ組のうちの少なくとも１個のプローブが存在していた。９６個の標的ＲＮＡの大部分では、特定の標的ＲＮＡに直接的にまたは間接的にハイブリダイズする１０個の異なるプローブが存在していた。図２７の上部の図に示すように、これらの１０個の異なるプローブは、標的ＲＮＡの異なる位置に直接的にまたは間接的にハイブリダイズして、「タイリング」効果を生み出した。標的ＲＮＡに複数のプローブをタイリングすると、標的ＲＮＡのそれぞれが個別に複数回で検出されて、測定値の全体的な精度が向上する。例えば図２７の下部の図に示すように、１０個のプローブが１本の標的ＲＮＡにタイリングされる場合に、プローブのうちの１個が誤って非常に多くの回数で検出される可能性があり（異常な多計数プローブ）、別のプローブが誤って非常に少ない回数で検出される可能性がある（異常な少計数プローブ）。しかし、他の８個のプローブは、同等の計数程度で検出できるので、解析中に２個の異常値は破棄した方がよく、８個のプローブからの信号を使用して標的ＲＮＡの存在量のより正確な測定値が得られる。

【0420】

９２８個のプローブの組は８０個の陰性対照プローブも含んでいた。８０個の陰性対照プローブのそれぞれは、標的結合ドメインがヒト試料内に存在するＲＮＡ分子に相補的にならないように、外部ＲＮＡ標準コンソーシアム（ｔｈｅ Ｅｘｔｅｒｎａｌ ＲＮＡ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）からの指針を用いて設計された、組換えされた非特異的核酸配列を含む標的結合ドメインを含んでいた。したがって、これらの８０個の陰性対照プローブは分析中には検出されるべきものではない。

【0421】

９６項目のヒト免疫腫瘍学パネルを用いて、組織マイクロアレイを分析した。組織マイクロアレイは、正常細胞型および癌性細胞型を含む、２２種の一般的なヒト細胞株のＦＦＰＥ試料を含んでいた。いくつかの細胞株を表１５に示す。

【0422】

表１５．細胞株

【表15】

【0423】

組織マイクロアレイはまた、陰性対照として１個のマウス細胞株（３Ｔ３）を含んでいた。マイクロアレイ上のＦＦＰＥ試料のそれぞれを、免疫腫瘍学パネル中の９２８個の異なるプローブの大部分と接触させた。図２８に示すように、各ＦＦＰＥ試料には、直径３００μｍの少なくとも３個の円形対象領域（ＲＯＩ）を選択した。陰性対照として、ＦＦＰＥ試料を含まないマイクロアレイの領域にもＲＯＩを選択した（ガラス陰性対照）。それぞれのＲＯＩでは、ＲＯＩをＵＶ光で照射して、ＲＯＩ内で結合したプローブから識別子オリゴヌクレオチドを解放した。続いて解放した識別子オリゴヌクレオチドを採取し、本開示の直接ＰＣＲ法を使用して識別して、それにより組織マイクロアレイ上の各ＦＦＰＥ試料中の９６種の標的ＲＮＡを空間的に検出した。

【0424】

図２９は、十分な読み取り深度がＭｉＳｅｑ ｖ３フローセルを用いて達成されたことを示している。図３０の上部の図は、ガラス陰性対照ＲＯＩでは、標的ＲＮＡが空間的に検出されなかったことを示している。同様に図３０の下部の図は、陰性対照のマウス３Ｔ３のＦＦＰＥ試料でも、標的ＲＮＡが殆ど検出されなかったことを示している。対照的に、図３１、３３、および３４に示すように、ＨＥＫ２９３（ヒト胚性腎臓）のＦＦＰＥ試料およびジャーカット（ヒトＴ細胞リンパ球）のＦＦＰＥ試料で、特定の標的ＲＮＡが正常に検出された。図３１、３３、および３４では、「タイリングした（ｔｉｌｅｄ）」プローブの集団が、ＡＫＴ１、Ｂ２Ｍ、ＣＤ３Ｅ、ＨＩＦ１Ａ、ＰＴＥＮ、ＲＰＳ６、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＶＥＧＦ、ＰＴＰＲＣ（ＣＤ４５）、およびＫＲＴ１／１０／１８／１９を含む特定の標的ＲＮＡに対して検出されたことを示している。これらの結果は、２つの異なる細胞株には特異的に転写される特定の標的ＲＮＡが存在することを示している。この実験の結果をまた、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒシステムを使用して検証して、採取した識別子オリゴヌクレオチドを識別した。図２７に示すように、本開示の直接ＰＣＲ法を使用した結果は、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒシステムを使用して得られた結果と一致していた。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21-1】

【図21-2】

【図21-3】

【図21-4】

【図22-1】

【図22-2】

【図22-3】

【図22-4】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32-1】

【図32-2】

【図32-3】

【図32-4】

【図33】

【図34】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2023-11-20

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

（１）組織試料中の少なくとも１つの標的検体を、少なくとも３つのプローブと接触させ、それにより前記少なくとも１つの標的検体上に前記プローブをタイリングする工程であって、
ここで前記プローブのそれぞれは：
前記少なくとも１つの標的検体に結合する標的結合ドメイン；および
前記標的結合ドメインに結合した標的検体を識別する固有の核酸配列を含む一本鎖識別子オリゴヌクレオチド
を含み、
ここで前記プローブのそれぞれが、前記一本鎖識別子オリゴヌクレオチドと前記標的結合ドメインとの間に光切断性リンカーを含む、工程；
（２）前記組織試料を１つ以上の蛍光標識抗体および／または蛍光染色と接触させる工程；
（３）前記１つ以上の蛍光標識抗体および／または蛍光染色を検出する工程；
（４）前記組織試料上の少なくとも１つの領域を光で励起して前記光切断性リンカーを切断し、それによって前記一本鎖識別子オリゴヌクレオチドを解放する工程；
（５）解放された前記一本鎖識別子オリゴヌクレオチドを採取する工程；および
（６）解放された前記一本鎖識別子オリゴヌクレオチドの配列を決定する工程
を含む、方法。

【請求項2】

配列決定された前記一本鎖識別子オリゴヌクレオチドを同定し、それによって前記組織試料中の前記少なくとも１つの標的検体を空間的に検出することをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記工程（３）の後に、検出された前記蛍光標識抗体および／または蛍光染色に基づいて、前記組織試料上の少なくとも１つの対象領域を同定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記工程（４）において励起される少なくとも１つの領域が、前記少なくとも１つの対象領域である、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

解放された前記一本鎖識別子オリゴヌクレオチドの配列を決定することが、採取された前記一本鎖識別子オリゴヌクレオチドを増幅することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記一本鎖識別子オリゴヌクレオチドが、固有の分子識別子を含む核酸配列をさらに含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記一本鎖識別子オリゴヌクレオチドが、第１の増幅プライマー結合部位および第２の増幅プライマー結合部位をさらに含む、請求項５に記載の方法。

【請求項8】

採取された前記一本鎖識別子オリゴヌクレオチドを増幅することが、ＰＣＲを実施することを含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記ＰＣＲを実施することは、第１の増幅プライマー及び第２の増幅プライマーの使用を含み、
ここで前記第１の増幅プライマーは：
前記識別子オリゴヌクレオチドが解放された前記組織試料の特定の位置を識別する第１の核酸配列；および
前記第２の増幅プライマー結合部位に相補的な核酸配列
を含み；
ここで前記第２の増幅プライマーは：
前記識別子オリゴヌクレオチドが解放された前記組織試料の特定の位置を識別する第２の核酸配列；および
前記第１の増幅プライマー結合部位に相補的な核酸配列
を含む、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記第１の増幅プライマーが第１のフローセル結合部位をさらに含み、前記第２の増幅プライマーが第２のフローセル結合部位をさらに含む、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記少なくとも１つの標的検体が核酸分子である、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

前記核酸分子が、ｍＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、ｔＲＮＡ分子、ｒＲＮＡ分子、またはｇＤＮＡ分子である、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記核酸分子が、ｍＲＮＡ分子である、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記標的結合ドメインが核酸分子を含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項15】

前記標的結合ドメインが１０ヌクレオチド～７０ヌクレオチドを含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記標的結合ドメインが３５ヌクレオチド～５０ヌクレオチドを含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

組織試料上の少なくとも１つの対象領域を同定するために、工程（２）からの１つ以上の蛍光標識抗体および／または蛍光染色を検出することが、形態、対象の細胞型、またはそれらの任意の組み合わせに基づいて少なくとも１つの対象領域を同定することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項18】

前記１つ以上の蛍光標識抗体および／または蛍光染色が、蛍光標識抗ＣＤ３Ｅ抗体、蛍光標識抗ＰａｎＣＫ抗体、蛍光標識抗Ｋｉ－６７抗体、ＤＡＰＩ、ＳＹＴ０８３、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項19】

工程（１）が、組織試料中の少なくとも１つの細胞内の前記少なくとも１つの標的検体を少なくとも５つのプローブと接触させることを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項20】

前記フローセル結合部位のうちの少なくとも１つは、配列決定に適するフローセルアダプター配列を含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項21】

前記フローセル結合部位のうちの少なくとも１つは、Ｐ５フローセルアダプター配列を含み、ここで前記Ｐ５フローセルアダプター配列は配列番号３に記載の配列を含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記フローセル結合部位のうちの少なくとも１つは、Ｐ７フローセルアダプター配列を含み、前記Ｐ７フローセルアダプター配列は配列番号４に記載の配列を含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項23】

前記標的結合ドメインに結合した前記標的検体を識別する前記固有の核酸配列は、５ヌクレオチド～２５ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項24】

前記標的結合ドメインに結合した前記標的検体を識別する前記核酸配列は、１２ヌクレオチドを含む、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記増幅プライマー結合部位のうちの少なくとも１つは、１０～４０ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項26】

前記増幅プライマー結合部位のうちの少なくとも１つは、３４ヌクレオチドを含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記増幅プライマー結合部位のうちの少なくとも１つは、３３ヌクレオチドを含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項28】

前記増幅プライマー結合部位のうちの少なくとも１つはｉ７配列を含み、ここで前記ｉ７配列は配列番号１に記載の配列を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項29】

前記増幅プライマー結合部位のうちの少なくとも１つはｉ５配列を含み、ここで前記ｉ５配列は配列番号２に記載の配列を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項30】

前記識別子オリゴヌクレオチドが解放された前記組織試料の前記特定の位置を識別する前記核酸配列のうちの少なくとも１つは、１～２０ヌクレオチドを含む、請求項９に記載の方法。

【請求項31】

前記識別子オリゴヌクレオチドが解放された前記組織試料の前記特定の位置を識別する前記核酸配列のうちの少なくとも１つは、８ヌクレオチドを含む、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

固有の分子識別子を含む前記核酸配列は、５～２０ヌクレオチドを含む、請求項６に記載の方法。

【請求項33】

固有の分子識別子を含む前記核酸配列は、１４ヌクレオチドを含む、請求項３２に記載の方法。