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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023182825
(43)【公開日】2023-12-26
(54)【発明の名称】小腸での代謝又は修飾産物を生体外で生産する方法
(51)【国際特許分類】
C12P 1/00 20060101AFI20231219BHJP
C12N 5/077 20100101ALN20231219BHJP
【ＦＩ】
C12P1/00 Z
C12N5/077
【審査請求】有
【請求項の数】2
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023182513
(22)【出願日】2023-10-24
(62)【分割の表示】P 2019063993の分割
【原出願日】2019-03-28
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＰＬＵＲＯＮＩＣ
(71)【出願人】
【識別番号】000002897
【氏名又は名称】大日本印刷株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】510136312
【氏名又は名称】国立研究開発法人国立成育医療研究センター
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】井上 允
(72)【発明者】
【氏名】田中 裕一
(72)【発明者】
【氏名】阿久津 英憲
(57)【要約】
【課題】本発明は生体の小腸において物質が代謝及び／又は修飾されて生じる産物と同等の産物を、生体外で生産することを目的とする。
【解決手段】本発明に係る、物質が代謝及び／又は修飾されて生じる産物を生産する方法は、外表面上に絨毛層を有する、小腸上皮細胞を含む袋状の細胞構造物と、前記物質を含む液とを、前記絨毛層に前記液が接するように配置すること、及び、前記細胞構造物の内部に、前記産物を蓄積させることを含むことを特徴とする。
【選択図】図３
【解決手段】本発明に係る、物質が代謝及び／又は修飾されて生じる産物を生産する方法は、外表面上に絨毛層を有する、小腸上皮細胞を含む袋状の細胞構造物と、前記物質を含む液とを、前記絨毛層に前記液が接するように配置すること、及び、前記細胞構造物の内部に、前記産物を蓄積させることを含むことを特徴とする。
【選択図】図３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
物質が代謝及び／又は修飾されて生じる産物を活性成分として含む医薬を製造する方法であって、
外表面上に絨毛層を有する、小腸上皮細胞を含む袋状の細胞構造物と、前記物質を含む液とを、前記絨毛層に前記液が接するように配置すること、
前記細胞構造物の内部に、前記産物を蓄積させること、
前記細胞構造物に蓄積された前記産物を回収すること、及び、
回収された前記産物を医薬として許容される製剤に製剤化すること
を含む方法。
外表面上に絨毛層を有する、小腸上皮細胞を含む袋状の細胞構造物と、前記物質を含む液とを、前記絨毛層に前記液が接するように配置すること、
前記細胞構造物の内部に、前記産物を蓄積させること、
前記細胞構造物に蓄積された前記産物を回収すること、及び、
回収された前記産物を医薬として許容される製剤に製剤化すること
を含む方法。
【請求項2】
物質が代謝及び／又は修飾されて生じる産物を活性成分として含む医薬を製造する方法であって、
外表面上に絨毛層を有する、小腸上皮細胞を含む袋状の細胞構造物と、前記物質を含む液とを、前記絨毛層に前記液が接するように配置すること、
前記細胞構造物の内部に、前記産物を蓄積させること、
前記産物を蓄積した前記細胞構造物を回収すること、及び、
回収された前記細胞構造物を医薬として許容される製剤に製剤化すること
を含む方法。
外表面上に絨毛層を有する、小腸上皮細胞を含む袋状の細胞構造物と、前記物質を含む液とを、前記絨毛層に前記液が接するように配置すること、
前記細胞構造物の内部に、前記産物を蓄積させること、
前記産物を蓄積した前記細胞構造物を回収すること、及び、
回収された前記細胞構造物を医薬として許容される製剤に製剤化すること
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、物質が代謝及び／又は修飾されて生じる産物を生産する方法、物質が代謝及び／又は修飾されて生じる産物を活性成分として含む医薬を製造する方法、被験物質の小腸での挙動を評価する方法、並びに、被験物質の小腸での挙動を評価するためのキットに関する。
【背景技術】
【0002】
薬物の薬効・薬物動態を評価するためには、生体内での薬物の代謝経路と酵素機能への影響の評価が必要であり、特に、ヒト小腸組織での薬物動態の評価の必要性が高い。この評価を適性に行うためには、ヒト生体試料もしくはそれに類似する試料を用いることが望まれる。しかしながら、ヒト小腸組織の生体試料は、培養維持が難しく、代謝機能が失活し易いため取扱いが難しい。薬物の吸収評価試験に広く利用されている大腸がん細胞株Ｃａｃｏ－２は、小腸組織に由来するものではないうえに、代謝酵素の活性が欠落していため、ヒト小腸組織での薬物動態の評価には適していない。
【0003】
近年、多能性幹細胞から小腸上皮細胞を分化誘導し薬物動態の評価に用いることができるとする報告がある。特許文献１には、多能性幹細胞から分化誘導した小腸上皮様細胞が薬物代謝酵素及び薬物トランスポーターを発現していることが記載されており、小腸上皮様細胞を用いて薬物動態を評価する方法が記載されている。特許文献２には、人工多能性幹細胞から分化誘導した腸管上皮細胞を用いて被検物質の体内動態を評価する方法が記載されている。これらの特許文献の発明者のグループによる代謝に関する報告としては非特許文献１及び２がある。しかし、これらの文献において分化誘導して得られた細胞を含む組織は、その形態が小腸組織と類似するものではなく、ヒト小腸組織での薬物動態の評価系として適したものとは言えない。
【0004】
特許文献３、特許文献４及び非特許文献３には、細胞接着部のパターンが形成された基材上で多能性幹細胞を培養して分化誘導し、腸と類似した構造を有する組織を調製することが記載されている。特に、特許文献４及び非特許文献３に記載の袋状構造を有する腸様オルガノイドは、腸細胞、杯細胞、腸管内分泌細胞、パネート細胞等の細胞を含み小腸と類似した高次構造を有し、腸管蠕動様運動を示す（非特許文献４）。
【0005】
一方、代謝の様式のひとつである薬物代謝では、代謝酵素が機能し薬や毒物などの生体外物質を分解・排出する。薬物代謝は、主に生体組織として肝臓と腸に依存しており、これら組織でＣＹＰファミリーの酵素、ＣＥＳファミリーの酵素等の代謝酵素が活性化し機能する。例えば非特許文献５及び６には、各代謝酵素の詳細が説明されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】ＷＯ２０１６／１４７９７５
【特許文献2】ＷＯ２０１７／１５４７９５
【特許文献3】特許第６１５１０９７号公報
【特許文献4】ＷＯ２０１８／２３０１０２
【特許文献5】特許第５０７０５６５号公報
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ozawa T et al., Scientific Report, 5, 16479 (2015)
【非特許文献2】Onozato D et al., Drug Metab Dispos, 46, (2018) 1572-1580
【非特許文献3】Uchida et al., JCI Insight 第2巻 e86492 2017年
【非特許文献4】菅原 亨、阿久津 英憲, 医学のあゆみ 第264巻 8号 2017年
【非特許文献5】Zhang QY et al., Drug Metab Dispo, 27, (1999) 804-9
【非特許文献6】S. Casey Laizure et al., Pharmacotherapy, 33, (2013) 210-222
【非特許文献7】Okochi et al., Langmuir 第25巻 6947～6953ページ 2009年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
生体の小腸において物質が代謝及び／又は修飾されて生じる産物を、生体外で生産することができれば、薬物の小腸での挙動を研究するうえで有用であると考えられる。また、生理活性物質は、それ自体よりも、生体の小腸において代謝及び／又は修飾されて生じる産物がより強い生理活性を有する場合があることから、これらの産物を生体外で生産することができれば、医薬の開発においても有用であると考えられる。しかしながら、上記の通り、小腸に類似した構造を有する腸様オルガノイドを用いて、物質が代謝及び／又は修飾されて生じる産物を生体外で効率的に生産することが可能な系は従来提供されていない。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明は、以下の発明を包含する。
（１）物質が代謝及び／又は修飾されて生じる産物を生産する方法であって、
外表面上に絨毛層を有する、小腸上皮細胞を含む袋状の細胞構造物と、前記物質を含む液とを、前記絨毛層に前記液が接するように配置すること、及び、
前記細胞構造物の内部に、前記産物を蓄積させること
を含む方法。
（２）前記細胞構造物に蓄積された前記産物を回収すること、又は、前記産物を蓄積した前記細胞構造物を回収することを更に含む、（１）に記載の方法。
（３）前記細胞構造物の長軸方向の長さが５ｍｍ以上である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記細胞構造物が小腸の性質を有する、（１）～（３）のいずれかに記載の方法。（５）前記細胞構造物が、多能性幹細胞から分化誘導されて形成された細胞構造物である（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
（６）物質が代謝及び／又は修飾されて生じる産物を活性成分として含む医薬を製造する方法であって、
外表面上に絨毛層を有する、小腸上皮細胞を含む袋状の細胞構造物と、前記物質を含む液とを、前記絨毛層に前記液が接するように配置すること、
前記細胞構造物の内部に、前記産物を蓄積させること、
前記細胞構造物に蓄積された前記産物を回収すること、及び、
回収された前記産物を医薬として許容される製剤に製剤化すること
を含む方法。
（７）物質が代謝及び／又は修飾されて生じる産物を活性成分として含む医薬を製造する方法であって、
外表面上に絨毛層を有する、小腸上皮細胞を含む袋状の細胞構造物と、前記物質を含む液とを、前記絨毛層に前記液が接するように配置すること、
前記細胞構造物の内部に、前記産物を蓄積させること、
前記産物を蓄積した前記細胞構造物を回収すること、及び、
回収された前記細胞構造物を医薬として許容される製剤に製剤化すること
を含む方法。
（８）被験物質の小腸での挙動を評価する方法であって、
外表面上に絨毛層を有する、小腸上皮細胞を含む袋状の細胞構造物と、前記被験物質を含む液とを、前記絨毛層に前記液が接するように配置すること、
前記細胞構造物を培養すること、及び、
培養後の前記細胞構造物の内部に蓄積された成分の組成を分析すること
を含む方法。
（９）被験物質の小腸での挙動を評価するためのキットであって、
外表面上に絨毛層を有する、小腸上皮細胞を含む袋状の細胞構造物、及び、
前記細胞構造物を培養するための培地
を含むキット。
（１０）前記細胞構造物の内部に蓄積された成分を取り出すための器具を更に含む、（９）に記載のキット。
（１）物質が代謝及び／又は修飾されて生じる産物を生産する方法であって、
外表面上に絨毛層を有する、小腸上皮細胞を含む袋状の細胞構造物と、前記物質を含む液とを、前記絨毛層に前記液が接するように配置すること、及び、
前記細胞構造物の内部に、前記産物を蓄積させること
を含む方法。
（２）前記細胞構造物に蓄積された前記産物を回収すること、又は、前記産物を蓄積した前記細胞構造物を回収することを更に含む、（１）に記載の方法。
（３）前記細胞構造物の長軸方向の長さが５ｍｍ以上である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記細胞構造物が小腸の性質を有する、（１）～（３）のいずれかに記載の方法。（５）前記細胞構造物が、多能性幹細胞から分化誘導されて形成された細胞構造物である（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
（６）物質が代謝及び／又は修飾されて生じる産物を活性成分として含む医薬を製造する方法であって、
外表面上に絨毛層を有する、小腸上皮細胞を含む袋状の細胞構造物と、前記物質を含む液とを、前記絨毛層に前記液が接するように配置すること、
前記細胞構造物の内部に、前記産物を蓄積させること、
前記細胞構造物に蓄積された前記産物を回収すること、及び、
回収された前記産物を医薬として許容される製剤に製剤化すること
を含む方法。
（７）物質が代謝及び／又は修飾されて生じる産物を活性成分として含む医薬を製造する方法であって、
外表面上に絨毛層を有する、小腸上皮細胞を含む袋状の細胞構造物と、前記物質を含む液とを、前記絨毛層に前記液が接するように配置すること、
前記細胞構造物の内部に、前記産物を蓄積させること、
前記産物を蓄積した前記細胞構造物を回収すること、及び、
回収された前記細胞構造物を医薬として許容される製剤に製剤化すること
を含む方法。
（８）被験物質の小腸での挙動を評価する方法であって、
外表面上に絨毛層を有する、小腸上皮細胞を含む袋状の細胞構造物と、前記被験物質を含む液とを、前記絨毛層に前記液が接するように配置すること、
前記細胞構造物を培養すること、及び、
培養後の前記細胞構造物の内部に蓄積された成分の組成を分析すること
を含む方法。
（９）被験物質の小腸での挙動を評価するためのキットであって、
外表面上に絨毛層を有する、小腸上皮細胞を含む袋状の細胞構造物、及び、
前記細胞構造物を培養するための培地
を含むキット。
（１０）前記細胞構造物の内部に蓄積された成分を取り出すための器具を更に含む、（９）に記載のキット。
【発明の効果】
【0010】
本発明の一実施形態に係る、物質が代謝及び／又は修飾されて生じる産物を生産する方法によれば、袋状の細胞構造物の内部に目的とする産物が蓄積されるため、目的とする産物を効率的かつ容易に回収し利用することができる。
本発明の一実施形態に係る、医薬の製造方法によれば、物質が代謝及び／又は修飾されて生じる産物を活性成分とする医薬を、効率的に製造することができる。
本発明の一実施形態に係る、医薬の製造方法によれば、物質が代謝及び／又は修飾されて生じる産物を活性成分とする医薬を、効率的に製造することができる。
【0011】
本発明の一実施形態に係る、被験物質の小腸での挙動を評価する方法によれば、細胞構造物の内部に蓄積された成分の組成を分析することで、効率的に、被験物質の小腸での挙動を評価することができる。また、袋状の細胞構造物は長期間にわたり培養が可能であるため、長期間にわたる被験物質の小腸での挙動の評価が可能である。そして、本発明の一実施形態に係るキットはこの評価方法に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】図１は、実施例１の経時的遺伝子発現パターンの解析の結果を示す。多能性幹細胞（Edom iPS）、パターン培養７日間（Ｄ７）、１４日間（Ｄ１４）、２１日間（Ｄ２１）でサンプリングを実施し各遺伝子の発現を継時的に観察した。胚体内胚葉マーカー（ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４）、幹細胞マーカー（Ｏｃｔ）、初期内胚葉／中胚葉マーカー（ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、Ｔ）、腸管上皮マーカー（ＣＤＸ２）、外胚葉マーカー（ＳＯＸ１）で腸様オルガノイドの分化誘導を観察した。また、代謝酵素としてＣＹＰ３Ａ４とＣＥＳ２の発現傾向を観察した。
【図2】図２は、実施例２の免疫染色の結果を示す。ヒト腸組織（Ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）、大腸がん細胞株Ｃａｃｏ－２、腸様オルガノイド（Ｍｉｎｉ－Ｇｕｔ）を用い代謝酵素ＣＹＰ３Ａ４、多剤排出トランスポーターｐ－ｇｐの発現を免疫染色で観察した。
【図3】図３は、実施例３の定量ＰＣＲの結果を示す。腸様オルガノイド（ｍｉｎｉ－ｇｕｔ）にビタミンＤ３（ＶＤ３）処理を行い代謝酵素ＣＹＰ３Ａ４、多剤排出トランスポーターｐ－ｇｐのｍＲＮＡ発現を観察した。コントロールとしてヒト腸組織（Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）と大腸がん細胞株Ｃａｃｏ－２のｃＤＮＡを使用した。ブランクとしてＤＭＳＯを用いた。
【図4A】図４Ａは、実施例４での免疫染色の結果を示す。実施例４では、ｉＰＳ細胞由来腸様オルガノイドにビタミンＤ３（ＶＤ３）処理を行い代謝酵素ＣＹＰ３Ａ４、多剤排出トランスポーターｐ－ｇｐのｍＲＮＡ発現と免疫染色によるタンパク質発現を観察した。
【図5A】図５Ａは、実施例５のＰ４５０－ＧｌｏＴＭ ＣＹＰ３Ａ４ Ａｓｓａｙの手順を示す模式図である。腸様オルガノイドを用いＰ４５０－ＧｌｏＴＭ ＣＹＰ３Ａ４ Ａｓｓａｙを実施した。薬剤添加・反応後、培地上清と腸様オルガノイドの内部液をシリンジ、針などの器具を用いて吸い出しを実施した。各培地上清と吸い出した内部液をサンプルとして発光強度を測定した。
【図6】図６は、実施例６のＬＣ／ＭＳ／ＭＳの結果を示す。実施例６では、腸様オルガノイドを用いてＣＹＰ３Ａ４基質ミタゾラム、ＣＥＳ２基質イリノテカンの代謝産物を測定した。各薬剤添加後に継時的にサンプリングし代謝産物の濃度を測定した。
【発明を実施するための形態】
【0013】
＜１．細胞構造物＞
本発明で用いることのできる細胞構造物は、外表面上に絨毛層を有する、小腸上皮細胞を含む袋状の細胞構造物である。
本発明で用いることのできる細胞構造物は、外表面上に絨毛層を有する、小腸上皮細胞を含む袋状の細胞構造物である。
【0014】
小腸上皮細胞は、細胞核に転写因子のＣＤＸ２及びＨＮＦ４、絨毛層にｖｉｌｌｉｎが発現し、かつ内胚葉系マーカーのＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎなどが発現していることを指標に確認することができる。これらのマーカーの存在は、抗体を使用した組織免疫染色やｍＲＮＡによるＰＣＲ評価などで検出可能である。
絨毛層は、ｖｉｌｌｉｎが発現していることを指標に確認することができる。また細胞構造物の外表面を顕微鏡観察して絨毛層の存在を確認することができる。
細胞構造物の外表面上に更に陰窩が発達していることが好ましい。
絨毛層は、ｖｉｌｌｉｎが発現していることを指標に確認することができる。また細胞構造物の外表面を顕微鏡観察して絨毛層の存在を確認することができる。
細胞構造物の外表面上に更に陰窩が発達していることが好ましい。
【0015】
本発明で用いることのできる細胞構造物は、小腸上皮細胞を含んでおり、腸と同等の機能を有する腸様オルガノイドとして有用である。「腸様オルガノイド」とは、細胞の起源生物の腸、特にヒト等の哺乳動物の腸、特にヒト腸に類似した機能（具体的には、蠕動運動する機能、粘液分泌機能、物質吸収機能等）を有する細胞構造体（組織）を指す。
【0016】
袋状の細胞構造物とは、内部に細胞が存在しない液体を保持することができる空間（空洞）を内包する細胞構造物である。該空間は全体が閉じた空間であってもよいし、一部が開放された空間であってもよい。袋状の細胞構造物の輪郭形状は特に限定されないが粒状であることが通常である。「粒状」は球状も包含する。
【0017】
本発明で用いることができる細胞構造物は、外表面の少なくとも一部に絨毛層を含む。この構成により、細胞構造物の外側にある物質を、外表面の絨毛層を構成する小腸上皮細胞を介して空洞内に吸収することができる。吸収の際に物質が代謝及び／又は修飾される場合、代謝及び／又は修飾産物も空洞内に吸収され蓄積される。また、外表面の絨毛層を構成する小腸上皮細胞は更に、トランスポーター陽性であって、トランスポーターを介した物質の取り込みが可能であることが好ましい。すなわち、トランスポーター陽性の小腸上皮細胞を含む細胞構造物は、腸と類似した物質吸収能を有する。なお、哺乳動物の腸では、小腸上皮細胞が空洞である腸管の内側を向いており、この実施形態に係る細胞構造物とは異なる。
【0018】
本発明に用いることのできる細胞構造物は、長軸方向の長さが５ｍｍ以上であり、好ましくは８ｍｍ以上であり、より好ましくは１０ｍｍ以上であり、より好ましくは１２ｍｍ以上であり、より好ましくは１５ｍｍ以上である。このような大寸法の細胞構造物を用いると、内部に蓄積された産物を回収することが容易となるため好ましい。
【0019】
ここで「長軸方向の長さ」は、適当な緩衝液中の細胞構造物を目視又は光学顕微鏡を用いて観察したときの観察像において、細胞構造物の観察像の輪郭上の、輪郭内のみを通る一本の直線で結ぶことができる二点間の距離のうち最長の距離を指す。個々の細胞構造物の輪郭は蠕動運動により変形し得るが、測定した最大値を長軸方向の長さとすればよい。 本発明に用いることのできる細胞構造物は好ましくは、内胚葉系細胞、外胚葉系細胞及び中胚葉系細胞を含む。
【0020】
内胚葉は消化管のほか肺、甲状腺、膵臓、肝臓などの器官の組織、消化管に開口する分泌腺の細胞、腹膜、胸膜、喉頭、耳管、気管、気管支、尿路（膀胱、尿道の大部分、尿管の一部）などを形成する。ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞から内胚葉系細胞への分化は、内胚葉に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。内胚葉に特異的な遺伝子としては、後述するもののほかに、例えば、ＡＦＰ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＳＴ、ＩＳＬ１、ＩＰＦ１、ＩＡＰＰ、ＥＯＭＥＳ、ＨＧＦ、ＡＬＢＵＭＩＮ、ＰＡＸ４、ＴＡＴ等を挙げることができる。
【0021】
細胞構造物に含まれる小腸上皮細胞は内胚葉系細胞の１種である。細胞構造物は、小腸上皮細胞として、腸細胞、杯細胞、腸管内分泌細胞及びパネート細胞から選択される１以上を含むことが好ましく、腸上皮細胞として、腸細胞、杯細胞、腸管内分泌細胞及びパネート細胞を全て含むことが特に好ましい。細胞構造物に内胚葉系細胞が存在することは内胚葉系細胞のマーカーの発現が陽性であることに基づき判断できる。腸細胞マーカーとしてはＣＤＸ２、杯細胞マーカーとしてはＭＵＣ２、腸管内分泌細胞マーカーとしてはＣＧＡ、パネート細胞マーカーとしてはＤＥＦＡ６が挙げられる。そのほか、ＥＣＡＤ、Ｎａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ、ビリンが腸上皮細胞のマーカーである。また、胚体内胚葉マーカーＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４も内胚葉系細胞を判別するためのマーカーとして利用できる。また、初期内胚葉及び中胚葉のマーカーであるＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６又はＴ（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）も、内胚葉系細胞を判別するためのマーカーとして利用できる。
【0022】
外胚葉は皮膚の表皮や男性の尿道末端部の上皮、毛髪、爪、皮膚腺（乳腺、汗腺を含む）、感覚器（口腔、咽頭、鼻、直腸の末端部の上皮を含む、唾液腺）水晶体などを形成する。外胚葉の一部は発生過程で溝状に陥入して神経管を形成し、脳や脊髄などの中枢神経系のニューロンやメラノサイトなどの元にもなる。また末梢神経系も形成する。ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞から外胚葉系細胞への分化は、外胚葉に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。外胚葉に特異的な遺伝子としては、例えば、β－ＴＵＢＬＩＮ、ＮＥＳＴＩＮ、ＧＡＬＡＮＩＮ、ＧＣＭ１、ＧＦＡＰ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＯＬＩＧ２、ＳＹＮＡＰＴＰＨＹＳＩＮ、ＤＥＳＭＩＮ、ＴＨ等を挙げることができる。
【0023】
細胞構造物に含まれ得る外胚葉系細胞としては特に腸管神経叢を構成する細胞が挙げられる。細胞構造物に外胚葉系細胞が存在することは外胚葉系細胞のマーカーの発現が陽性であることに基づき判断できる。外胚葉系細胞を判別するためのマーカーとしては腸管神経叢マーカーＰＧＰ９．５や、神経前駆細胞マーカーＳＯＸ１が利用できる。
【0024】
中胚葉は体腔及びそれを裏打ちする中皮、筋肉、骨格、皮膚真皮、結合組織、心臓、血管（血管内皮も含む）、血液（血液細胞も含む）、リンパ管、脾臓、腎臓、尿管、性腺（精巣、子宮、性腺上皮）を形成する。ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞から中胚葉系細胞への分化は、中胚葉に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。中胚葉に特異的な遺伝子としては、例えば、ＦＬＫ－１、ＣＯＬ２Ａ１、ＦＬＴ１、ＨＢＺ、ＭＹＦ５、ＭＹＯＤ１、ＲＵＮＸ２、ＰＥＣＡＭ１等を挙げることができる。
【0025】
細胞構造物に含まれ得る中胚葉系細胞としては特に平滑筋細胞、カハール介在細胞が挙げられる。細胞構造物に中胚葉系細胞が存在することは、中胚葉系細胞マーカーの発現が陽性であることに基づき判断できる。中胚葉系細胞マーカーとしては、平滑筋細胞マーカーのα－平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、カハール介在細胞マーカーのＣＤ３４及びＣＫＩＴ（二重陽性の場合）が利用できる。また、初期内胚葉及び中胚葉のマーカーであるＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６又はＴ（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）も、中胚葉系細胞を判別するためのマーカーとして利用できる。
細胞構造物は、更に好ましくは腸幹細胞を更に含む。腸幹細胞の存在は、腸幹細胞マーカーＬＧＲ５が陽性であることを指標として判断できる。
細胞構造物は更に、セロトニン陽性の腸管内分泌細胞を含むことが好ましい。
細胞構造物は、更に好ましくは腸幹細胞を更に含む。腸幹細胞の存在は、腸幹細胞マーカーＬＧＲ５が陽性であることを指標として判断できる。
細胞構造物は更に、セロトニン陽性の腸管内分泌細胞を含むことが好ましい。
【0026】
細胞構造物は更にトランスポーター陽性細胞を含み、トランスポーターを介した物質の取り込みが可能であることが好ましい。トランスポーターとしては、腸オリゴペプチドトランスポーター（ＰＥＰＴ１）、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーターであるＡＢＣＢ１及びＡＢＣＧ２等が例示できる。
【0027】
細胞構造物は更に嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)陽性の腸上皮細胞を含むことが好ましい。CFTR陽性の腸上皮細胞は粘液の分泌に関与している。すなわち、CFTR陽性の腸上皮細胞を有する細胞構造物は、腸と類似した粘液分泌能を有する。
細胞構造物は更にヒスタミンＨ１受容体陽性細胞を含むことが好ましい。
細胞構造物は更にヒスタミンＨ１受容体陽性細胞を含むことが好ましい。
【0028】
本発明で用いることができる細胞構造物は、好ましくは、蠕動運動に類似した収縮運動をする能力を有する。このような機能は、神経ネットワークと平滑筋の発達により生じるものである。以下の説明では、蠕動運動に類似した収縮運動をする能力を「蠕動能」という場合がある。蠕動能を有する細胞構造物は、特に好ましくは、ヒスタミン処理により収縮の頻度が高まり、アトロピン処理により収縮の頻度が低下するという、腸と同様の薬剤応答性を示す。
以上の特徴を有する細胞構造物としては、特許文献４及び非特許文献３に記載の腸オルガノイドが特に好ましい。
以上の特徴を有する細胞構造物としては、特許文献４及び非特許文献３に記載の腸オルガノイドが特に好ましい。
【0029】
＜２．細胞構造物の製造方法＞
本発明で用いることのできる細胞構造物は、幹細胞を培養し分化誘導して製造することができる。ここで幹細胞としては、小腸上皮細胞への分化能を有する幹細胞であればよいが、好ましくは、内胚葉系細胞（小腸上皮細胞等）、外胚葉系細胞及び中胚葉系細胞への分化能を有する幹細胞であり、より好ましくは、多能性幹細胞である。多能性幹細胞としては特に、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が好適である。
本発明で用いることのできる細胞構造物は、幹細胞を培養し分化誘導して製造することができる。ここで幹細胞としては、小腸上皮細胞への分化能を有する幹細胞であればよいが、好ましくは、内胚葉系細胞（小腸上皮細胞等）、外胚葉系細胞及び中胚葉系細胞への分化能を有する幹細胞であり、より好ましくは、多能性幹細胞である。多能性幹細胞としては特に、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が好適である。
【0030】
本発明において使用される胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、好ましくは哺乳動物由来のＥＳ細胞であり、例えば、マウスなどのげっ歯類又はヒトなどの霊長類由来のＥＳ細胞などを使用することができる。特に好ましくは、マウス又はヒト由来のＥＳ細胞を使用する。ＥＳ細胞は、動物の発生初期段階である胚盤胞期の胚の一部に属する内部細胞塊より作られる幹細胞株を指し、生体外にて、理論上すべての組織に分化する分化多能性を保ちつつ、ほぼ無限に増殖させることができる。ＥＳ細胞としては、例えば、その分化の程度の確認を容易とするために、Ｐｄｘ１遺伝子付近にレポーター遺伝子を導入した細胞を用いることができる。例えば、Ｐｄｘ１座にＬａｃＺ遺伝子を組み込んだ１２９／Ｓｖ由来ＥＳ細胞株又はＰｄｘ１プロモーター制御下のＧＦＰレポータートランスジーンをもつＥＳ細胞ＳＫ７株などを使用することができる。あるいは、Ｈｎｆ３β内胚葉特異的エンハンサー断片制御下のｍＲＦＰ１レポータートランスジーン及びＰｄｘ１プロモーター制御下のＧＦＰレポータートランスジーンを有するＥＳ細胞ＰＨ３株を使用することもできる。また、国立成育医療研究センターの生殖・細胞医療研究部で樹立し、Akutsu H, et al. Regen Ther. 2015;1:18-29 に開示したＥＳ細胞株である、ＳＥＥＳ１、ＳＥＥＳ２、ＳＥＥＳ３、ＳＥＥＳ４、ＳＥＥＳ５、ＳＥＥＳ６又はＳＥＥＳ７や、これらのＥＳ細胞株に更なる遺伝子を導入した細胞株を使用することもできる。
【0031】
本発明において使用される人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、体細胞を初期化することによって得られる多能性を有する細胞である。人工多能性幹細胞の作製は、京都大学の山中伸弥教授らのグループ、マサチューセッツ工科大学のルドルフ・ヤニッシュ（Ｒｕｄｏｌｆ Ｊａｅｎｉｓｃｈ）らのグループ、ウイスコンシン大学のジェームス・トムソン（Ｊａｍｅｓ Ｔｈｏｍｓｏｎ）らのグループ、ハーバード大学のコンラッド・ホッケドリンガー（Ｋｏｎｒａｄ Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ）らのグループなどを含む複数のグループが成功している。例えば、国際公開ＷＯ２００７／０６９６６６号公報には、Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子及びＭｙｃファミリー遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子、並びにＯｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子及びＭｙｃファミリー遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子が記載されており、さらに体細胞に上記核初期化因子を接触させる工程を含む、体細胞の核初期化により誘導多能性幹細胞を製造する方法が記載されている。
【0032】
ｉＰＳ細胞の作製に用いる体細胞の種類は特に限定されず、任意の体細胞を用いることができる。即ち、本発明で言う体細胞とは、生体を構成する細胞の内生殖細胞以外の全ての細胞を包含し、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。体細胞の由来は、哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類、両生類の何れでもよく特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（例えば、マウスなどのげっ歯類、又はヒトなどの霊長類）であり、特に好ましくはマウス又はヒトである。また、ヒトの体細胞を用いる場合、胎児、新生児又は成人の何れの体細胞を用いてもよい。体細胞の具体例としては、例えば、線維芽細胞（例えば、皮膚線維芽細胞）、上皮細胞（例えば、胃上皮細胞、肝上皮細胞、肺胞上皮細胞）、内皮細胞（例えば血管、リンパ管）、神経細胞（例えば、ニューロン、グリア細胞）、すい臓細胞、血球細胞、骨髄細胞、筋肉細胞（例えば、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞）、肝実質細胞、非肝実質細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、歯周組織を構成する細胞（例えば、歯根膜細胞、セメント芽細胞、歯肉線維芽細胞、骨芽細胞）、腎臓・眼・耳を構成する細胞などが挙げられる。
【0033】
ｉＰＳ細胞は、所定の培養条件下（例えば、ＥＳ細胞を培養する条件下）において長期にわたって自己複製能を有し、また所定の分化誘導条件下において外胚葉、中胚葉及び内胚葉への多分化能を有する幹細胞のことを言う。また、本発明におけるｉＰＳ細胞はマウスなどの試験動物に移植した場合にテラトーマを形成する能力を有する幹細胞でもよい。
【0034】
体細胞からｉＰＳ細胞を製造するためには、まず、少なくとも１種類以上の初期化遺伝子を体細胞に導入する。初期化遺伝子とは、体細胞を初期化してｉＰＳ細胞とする作用を有する初期化因子をコードする遺伝子である。初期化遺伝子の組み合わせの具体例としては、以下の組み合わせを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
（ｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子
（ｉｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子
（ｉｉｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＳＶ４０ ｌａｒｇｅＴ遺伝子
（ｉｖ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子
（ｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子
（ｉｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子
（ｉｉｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＳＶ４０ ｌａｒｇｅＴ遺伝子
（ｉｖ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子
【0035】
本発明で用いることができる細胞構造物は、
上記で挙げたような幹細胞を、下記の細胞培養基材上に播種する工程１、及び、
播種された幹細胞を培養して分化誘導する工程２
を含む方法により製造することができる。
上記で挙げたような幹細胞を、下記の細胞培養基材上に播種する工程１、及び、
播種された幹細胞を培養して分化誘導する工程２
を含む方法により製造することができる。
【0036】
細胞培養基材は、好ましくは、細胞接着部と、細胞接着部の周囲を囲う細胞非接着部とを含む表面を有する支持基材を含む。細胞培養基材では、好ましくは、細胞非接着部のなかに細胞接着部が島状に少なくとも１つ、好ましくは複数、存在するように配置されている。このような細胞培養基材としては、特許文献４及び非特許文献３に記載された細胞培養基材が特に好ましい。
【0037】
支持基材としては、その表面に、細胞非接着部と細胞接着部を形成することが可能な材料で形成された支持基材であれば特に限定されるものではない。具体的には、ガラス、金属、セラミック、シリコン等の無機材料、エラストマー、プラスチック（例えば、ポリスチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）で代表される有機材料を含む支持基材を挙げることができる。特に、ガラス基材を支持基材として用いることが好ましい。支持基材の形状も限定されず、例えば、平板、平膜、フィルム、多孔質膜等の平坦な形状や、シリンダ、スタンプ、マルチウェルプレート、マイクロ流路等の立体的な形状が挙げられる。
【0038】
本発明において「細胞接着性」とは、細胞を接着する強度、すなわち細胞の接着しやすさを意味する。「細胞接着部」とは細胞接着性が良好な表面上の領域を意味し、「細胞非接着部」とは、細胞の接着性が悪い表面上の領域を意味する。従って、細胞接着部と細胞非接着部とが所定のパターンで配置された表面上に細胞を播種すると、細胞接着部には細胞が接着するが、細胞非接着部には細胞が接着しないため、細胞培養基材の表面に細胞がパターン状に配列されることになる。
【0039】
「細胞接着部」は、実際に培養する細胞、好ましくは幹細胞、を細胞培養基材に播種した際に接着する部分と定義され、「細胞非接着部」は、実際に培養する細胞、好ましくは幹細胞、を播種した際に接着する部分と定義される。細胞培養基材に細胞を播種する際に、細胞培養基材の表面は、タンパク質等でコーティングされ、細胞接着性が高められた状態であってもよい。細胞非接着部は、細胞接着部に接着し増殖した細胞により被覆されてもよい。
【0040】
細胞接着部であるか細胞非接着部であるかを判断する指標として、実際に細胞培養した際の細胞接着伸展率を用いることができる。細胞接着性を有する細胞接着部の表面は、細胞接着伸展率が６０％以上の表面であることが好ましく、細胞接着伸展率が８０％以上の表面であることが更に好ましい。細胞接着伸展率が高いと、効率的に細胞を培養することができる。本発明における細胞接着伸展率は、播種密度が４０００ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上３００００ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２未満の範囲内で培養しようとする細胞を測定対象表面に播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％のインキュベータ内に保管し、１４．５時間培養した時点で接着伸展している細胞の割合（｛（接着している細胞数）／（播種した細胞数）｝×１００（％））と定義する。
【0041】
上記測定において、細胞の播種は、１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地に懸濁させて測定対象表面上に播種し、その後、細胞ができるだけ均一に分布するよう、細胞が播種された測定対象表面をゆっくりと振とうすることにより行うものである。さらに、細胞接着伸展率の測定は、測定直前に培地交換を行って接着していない細胞を除去した後に行う。細胞接着伸展率の測定では、細胞の存在密度が特異的になりやすい箇所（例えば、存在密度が高くなりやすい所定領域の中央、存在密度が低くなりやすい所定領域の周縁）を除いた箇所を測定箇所とする。
【0042】
一方、細胞非接着部は、細胞が接着しにくい性質（細胞非接着性）を有する表面の領域である。細胞非接着性は、表面の化学的性質や物理的性質等によって細胞の接着や伸展が起こりにくいか否かで決定される。細胞非接着部の表面は、上記で定義した細胞接着伸展率が６０％未満の表面であることが好ましく、４０％未満の表面であることがより好ましく、５％以下の表面であることが更に好ましく、２％以下の表面であることが最も好ましい。
【0043】
細胞接着部は、支持基材の表面に細胞接着層が形成された領域であってもよいし、支持基材の表面が細胞接着性である場合（例えばガラス基材の表面）は、支持基材の表面が露出した領域であってもよいが、好ましくは、支持基材の細胞接着性の表面が露出した領域である。細胞非接着部は、支持基材の表面に細胞非接着層が形成された領域であることができる。細胞接着部および細胞非接着部は、種々の材料や方法により形成可能である。好ましくは、細胞非接着部は、支持基材の表面が、親水性ポリマー等の親水性有機化合物を含む層等の細胞非接着層により被覆された部分である。細胞非接着部を構成する細胞非接着層の平均厚さは、特許文献５に記載されているように、０．８ｎｍ～５００μｍが好ましく、０．８ｎｍ～１００μｍがより好ましく、１ｎｍ～１０μｍがより好ましく、１．５ｎｍ～１μｍが最も好ましい。平均厚さが０．８ｎｍ以上であれば、タンパク質の吸着や細胞の接着において、支持基材の細胞非接着層で覆われていない領域の影響を受けにくいため好ましい。また、平均厚さが５００μｍ以下であればコーティングが比較的容易である。特に、細胞非接着層を、ポリエチレングリコールの層により形成する場合、その膜厚の一例として５ｎｍ～１０ｎｍが例示できる。
【0044】
細胞非接着層として親水性ポリマーとしてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む細胞培養基材の製造方法としては、特許文献５及び非特許文献７に記載された方法を用いることができる。
【0045】
親水性有機化合物としては、親水性ポリマー（親水性オリゴマーを包含する）、水溶性有機化合物、界面活性物質、両親媒性物質等が挙げられ、親水性ポリマーが特に好ましい。
【0046】
具体的な親水性ポリマーとしては、ポリアルキレングリコール、リン脂質極性基を有する両性イオンポリマー、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリビニルアルコール、多糖類等を挙げることができる。親水性ポリマーのこれらの具体例は、その誘導体の形態のものも包含する。親水性ポリマーの分子形状は、直鎖状、分岐を有するもの、デンドリマー等を挙げることができる。
【0047】
ポリアルキレングリコールとしては具体的には、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールの共重合体、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１０８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７等が好ましい。
【0048】
リン脂質極性基を有する両性イオンポリマーとしては具体的には、ポリ（メタクリロイルオキシエチルフォスフォリルコリン）（＝ＭＰＣポリマー）、メタクリロイルオキシエチルフォスフォリルコリンとアクリルモノマーの共重合体等が好ましい。
ポリアクリルアミドとしては具体的にはポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）が例示できる。
ポリメタクリル酸としては具体的にはポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）が例示できる。
多糖類としては具体的にはデキストラン、ヘパリン等が例示できる。
ポリアクリルアミドとしては具体的にはポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）が例示できる。
ポリメタクリル酸としては具体的にはポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）が例示できる。
多糖類としては具体的にはデキストラン、ヘパリン等が例示できる。
【0049】
支持基材の表面に親水性有機化合物の層を形成して細胞非接着部を形成し、次いで、前記層を部分的に除去して支持基材の表面が露出した細胞接着部を形成することで、細胞培養基材を製造することができる。親水性有機化合物の層を部分的に除去する方法としては、紫外線照射処理する方法、光触媒処理する方法、酸化剤で処理する方法等が挙げられる。部分的な処理のためにフォトマスクやステンシルマスク等のマスクを用いたり、スタンプを用いたりすることができる。また、紫外線レーザ等のレーザを用いた方式等の直描方式で前記層を除去してもよい。
【0050】
本発明で用いる細胞培養基材においては、各細胞接着部の面積は特に限定されない。各細胞接着部の面積の具体例としては０．１ｍｍ２以上が例示でき、好ましくは０．５ｍｍ２以上、好ましくは０．７８５ｍｍ２以上、より好ましくは１．０ｍｍ２以上、より好ましくは１．２ｍｍ２以上、さらに好ましくは１．５ｍｍ２以上、最も好ましくは１．７ｍｍ２以上であり、好ましくは２５ｍｍ２以下、より好ましくは１５ｍｍ２以下、さらに好ましくは１０ｍｍ２以下、最も好ましくは５ｍｍ２以下の範囲となるようパターン形成されている。細胞接着部の面積がこの範囲のとき、長軸方向の長さが５ｍｍを超える大寸法の細胞構造物を培養することが容易である。
【0051】
各細胞接着部の形状は特に制限されないが、四角形を初めとする多角形、円形、楕円形等であることができる。円形のものが好ましい。円形の場合の直径は、好ましくは、上記面積の範囲を満たす直径であることができ、具体的には円形の直径は０．３５ｍｍ以上が例示でき、好ましくは０．８ｍｍ以上、好ましくは１．０ｍｍ以上、好ましくは１．２ｍｍ以上、より好ましくは１．５ｍｍ以上であり、好ましくは６ｍｍ以下、より好ましくは４ｍｍ以下、さらに好ましくは３ｍｍ以下、さらに好ましくは２ｍｍ以下である。１つの細胞培養基材において、複数存在する細胞接着部は、いずれも同じ面積を有することが好ましく、同じ面積と形状を有することがさらに好ましいが、異なる面積や形状が混在していてもよい。
【0052】
各細胞接着部の形状の他の例としては、環形状が挙げられる。環形状の細胞接着部は、中央に細胞非接着部が１つ配置され、中央の細胞非接着部の周囲を囲うように細胞接着部が形成されている。環形状の細胞接着部の外周の形状は、好ましくは四角形を初めとする多角形、円形、楕円形等であることができ、より好ましくは円形である。環形状の細胞接着部の外周で囲われる領域の面積（環形状の細胞培養部と中央の細胞非接着部との合計面積）は、細胞接着部の面積として上記の通りである。環形状の細胞接着部の外周が円形である場合の円形の直径は、細胞接着部が円形である場合の面積として上記の通りである。環形状の細胞接着部の幅（中央の細胞非接着部の重心を通る直線に沿った方向の幅）は、特に限定されないが、好ましくは３０μｍ超４００μｍ以下であり、より好ましくは６０μｍ以上３００μｍ以下である。
【0053】
続いて、細胞構造物を製造する方法の工程１及び工程２について説明する。
【0054】
工程１は、幹細胞を、下記の細胞培養基材上に播種する工程である。
【0055】
工程１において、細胞培養基材上に播種する前の幹細胞は非分化誘導培地を用いて未分化性を維持したものとする。細胞培養基材表面へ播種する前後において分化誘導培地に切り換え、基材表面へ播種する。
【0056】
非分化誘導培地は、幹細胞を分化誘導させない培地であれば特に限定されないが、例えば、マウス胚性幹細胞及びマウス人工多能性幹細胞の未分化性を維持する性質を有していることが知られているｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒを含む培地が挙げられる。
【0057】
工程１において、細胞培養基材への幹細胞の播種密度は常法に従えばよく特に限定されるものではない。本発明の一実施形態では、幹細胞を、細胞培養基材に対し、３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上の密度で播種することが好ましく、３×１０４～５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種することがより好ましく、３×１０４～２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種することがさらに好ましい。
【0058】
工程２は、工程１で播種された播種された幹細胞を培養して分化誘導する工程である。 工程２における培養温度は、通常３７℃である。ＣＯ２細胞培養装置などを利用して、５％程度のＣＯ２濃度雰囲気下で培養するのが好ましい。
【0059】
工程２は分化誘導培地中で行う。分化誘導培地としては、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞等の幹細胞を分化誘導させる培地であれば特に限定されるものではないが、例えば、血清含有培地や、血清に代替する性質を有する既知成分を含有した無血清培地等が挙げられる。用いる細胞の種類に応じて、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ－Ｆ１２培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ－１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地及びＲＰＭＩ１６４０培地等を用いることができる。培地に、各種増殖因子、抗生物質、アミノ酸などを加えてもよい。例えば、０．０５ｍＭ～１．０ｍＭの非必須アミノ酸、１ｍＭ～５ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉ、０．０１ｍＭ～０．１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、０．１ｍＭ～２ｍＭピルビン酸、１０Ｕ／ｍｌ～２００Ｕ／ｍｌペニシリン、１０μｇ／ｍｌ～２００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１０μｇ／ｍｌ～２００μｇ／ｍｌ Ｌ－アスコルビン酸２－リン酸、１μＭ～２０μＭのＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ－２７６３２）等が挙げられる。
【0060】
工程２において分化誘導培地中で細胞を培養すると、播種後３日間程度で、細胞接着部内で細胞がコンフルエントになり細胞パターンを形成する。その後さらに培養を継続すると、細胞パターンが細胞接着部のうえで半球ドーム状に盛り上がった細胞塊となり、細胞塊中で分化が進む。播種後約３０日で細胞塊は細胞接着部から剥離し培地中に浮遊する。浮遊した状態で必要に応じて更に培養を続けると、腸様オルガノイドが得られる。培養期間は特に限定されず、細胞接着部から剥離した段階で培養を終えてもよいが、典型的には、播種から３０日後～１３０日後まで培養を行う。この間培地は適宜交換する。この方法では、細胞塊のなかで自律的に分化が進み腸様オルガノイドに変化するため、手順が簡便であるとともに、得られた腸様オルガノイドが自然の腸により近い機能を有すると考えられるため好ましい。
工程１及び工程２を含む細胞構造物の製造方法のより具体的な例は、特許文献４及び非特許文献３に記載されている。
工程１及び工程２を含む細胞構造物の製造方法のより具体的な例は、特許文献４及び非特許文献３に記載されている。
【0061】
＜３．物質が代謝及び／又は修飾されて生じる産物を生産する方法＞
本発明の第一の実施形態は、
物質が代謝及び／又は修飾されて生じる産物を生産する方法であって、
外表面上に絨毛層を有する、小腸上皮細胞を含む袋状の細胞構造物と、前記物質を含む液とを、前記絨毛層に前記液が接するように配置すること、及び、
前記細胞構造物の内部に、前記産物を蓄積させること
を含む方法に関する。
この方法によれば、物質が小腸により代謝及び／又は修飾されて生じる産物を、生体外で生産することが可能である。
本発明の第一の実施形態は、
物質が代謝及び／又は修飾されて生じる産物を生産する方法であって、
外表面上に絨毛層を有する、小腸上皮細胞を含む袋状の細胞構造物と、前記物質を含む液とを、前記絨毛層に前記液が接するように配置すること、及び、
前記細胞構造物の内部に、前記産物を蓄積させること
を含む方法に関する。
この方法によれば、物質が小腸により代謝及び／又は修飾されて生じる産物を、生体外で生産することが可能である。
【0062】
原料となる物質としては、小腸により代謝及び／又は修飾されて生じる産物が医薬としての活性等の有用な性質を有することとなる前駆体化合物や、小腸での挙動、すなわち、小腸で代謝及び／又は修飾されたときにどのような産物を生じるか、の評価の対象となる生理活性化合物等の被験物質が挙げられる。
【0063】
本発明者らは、驚くべきことに、外表面上に絨毛層を有する、小腸上皮細胞を含む袋状の細胞構造物が、以下の代謝関連酵素遺伝子から選択される１以上の遺伝子が発現し、該遺伝子に対応する酵素活性を有することを見出した。
薬物トランスポーター遺伝子：ＭＴ２Ａ、ＭＴ３、ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＣ１、ＧＰＩ
薬物トランスポーター遺伝子：ＭＴ２Ａ、ＭＴ３、ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＣ１、ＧＰＩ
【0064】
第Ｉ相代謝酵素遺伝子：ＣＹＰ１１Ｂ２、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ１９Ａ１、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ２Ｆ１、ＣＹＰ２Ｊ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５
【0065】
第ＩＩ相代謝酵素遺伝子：ＣＥＳ１、ＣＥＳ２、ＣＥＳ３、ＧＡＤ１、ＧＡＤ２、ＡＤＨ１Ｂ、ＡＤＨ１Ｃ、ＡＤＨ４、ＡＤＨ５、ＡＤＨ６、ＡＬＡＤ、ＡＬＡＤＨ１Ａ１、ＨＳＤ１７Ｂ１、ＨＳＤ１７Ｂ２、ＨＳＤ１７Ｂ３、ＧＰＸ１、ＧＰＸ２、ＧＰＸ３、ＧＰＸ４、ＧＰＸ５、ＧＳＴＡ３、ＧＳＴＡ４、ＧＳＴＭ２、ＧＳＴＭ３、ＧＳＴＭ５、ＧＳＴＰ１、ＧＳＴＴ１、ＧＳＴＺ１、ＬＰＯ、ＭＰＯ、ＡＬＯＸ１２、ＡＬＯＸ１５、ＡＬＯＸ５、ＡＰＯＥ、ＡＳＮＡ１、ＥＰＨＸ１、ＦＡＡＨ、ＦＰＢ１、ＨＫ２、ＰＫＬＲ、ＰＫＭ、ＡＯＣ１、ＢＬＶＲＡ、ＢＬＶＲＢ、ＣＹＢ５Ｒ３、ＧＳＲ、ＭＴＨＦＲ、ＮＯＳ３、ＮＱＯ１、ＳＲＤ５Ａ１、ＳＲＤ５Ａ２、ＰＯＮ１、ＰＯＮ２、ＰＯＮ３、ＭＧＳＴ１、ＭＧＳＴ２、ＭＧＳＴ３、ＣＨＳＴ１、ＮＡＴ１、ＮＡＴ２、ＣＯＭＴ
他の薬物代謝遺伝子：ＡＨＲ、ＡＲＮＴ、ＧＣＫＲ、ＳＮＮ
他の薬物代謝遺伝子：ＡＨＲ、ＡＲＮＴ、ＧＣＫＲ、ＳＮＮ
【0066】
本発明で用いる細胞構造物は、これらの代謝関連酵素遺伝子の発現レベル、特に、ＣＹＰファミリー酵素遺伝子（ＣＹＰ１１Ｂ２、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ１９Ａ１、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ２Ｆ１、ＣＹＰ２Ｊ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５）並びにＣＥＳファミリー酵素遺伝子（ＣＥＳ１、ＣＥＳ２、ＣＥＳ３）の発現レベルが、ヒト小腸の生体サンプルでの発現レベルと遜色のないレベルであることから、物質が細胞構造物の外表面の絨毛層から吸収され、代謝及び／又は修飾されて、細胞構造物の内部に蓄積される産物は、小腸において代謝及び／又は修飾されて生じる産物と同等である。このため、本発明の第一の方法によれば、これらの代謝関連酵素から選ばれる１以上による、原料物質の代謝及び／又は修飾産物を製造することができる。
【0067】
本発明の第一の方法では、まず、袋状の細胞構造物と、原料となる物質を含む液とを、細胞構造物の絨毛層に前記液が接するように配置する。ここで物質を含む液としては、水中に物質が溶解した水溶液を用いることができる。物質の水溶液は、細胞構造物を培養することができる緩衝液又は培地であることが好ましい。このような物質を含む液を、袋状の細胞構造物の絨毛層に接するように配置することで、液中の物質が、細胞構造物の内部に取り込まれ、細胞構造物が有する上記のような代謝関連酵素による代謝及び／又は修飾を受け、袋状の細胞構造物の内部に蓄積される。
【0068】
本発明の第一の方法では、好ましくは、物質を含む液中に、袋状の細胞構造物を懸濁させる。このとき、物質を含む液は、物質を含む緩衝液又は培地であることが好ましい。緩衝液又は培地としては袋状の細胞構造物を培養できる培地又は緩衝液であれば特に限定されないが、好ましくは１５％Ｘｅｎｏ－Ｆｒｅｅ ＫＳＲ入りＤＭＥＭ培地、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等が使用できる。物質を含む液は更に、代謝酵素の発現を促進する成分を含むことが好ましい。代謝酵素の発現を促進する成分としては、１α，２５－Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ Ｄ３が例示できる。本発明で用いる袋状の細胞構造物は、小腸と同様の機能を有しており、小腸において代謝酵素の発現を促進する成分の添加により、代謝酵素の発現が促進される。
【0069】
本発明の第一の方法では、袋状の細胞構造物の内部に産物を蓄積させることを更なる特徴とする。袋状の細胞構造物は、液中の物質を、外向きの絨毛層から吸収し細胞構造物の内部に取り込み、代謝関連酵素による代謝及び／又は修飾を受けた産物（代謝修飾産物）を内部に蓄積することができるという驚くべき機能を有する。この機能により、原料物質は細胞構造物の外側に存在し、代謝修飾産物は細胞構造物の内側に蓄積されて両者は混在することがないため、目的とする代謝修飾産物を容易に回収することができる。
【0070】
袋状の細胞構造物の内部に蓄積された代謝修飾産物を回収する方法は特に限定されない。例えば、シリンジなどの器具を用いて、代謝修飾産物を蓄積した袋状の細胞構造物から、代謝修飾産物を含む内部液を取り出して回収することができる。回収された内部液から更に精製処理を行い、代謝修飾産物を得てもよい。内部液が取り出された袋状の細胞構造物は、更に次の代謝修飾産物の生産に利用してもよい。或いは、代謝修飾産物を蓄積した袋状の細胞構造物自体を回収して（必要に応じて更に破砕又は精製して）、代謝修飾産物を得ることもできる。
【0071】
＜４．医薬の製造方法＞
本発明は第二に、物質が代謝及び／又は修飾されて生じる産物を活性成分として含む医薬を製造する方法であって、
外表面上に絨毛層を有する、小腸上皮細胞を含む袋状の細胞構造物と、前記物質を含む液とを、前記絨毛層に前記液が接するように配置すること、
前記細胞構造物の内部に、前記産物を蓄積させること、
前記細胞構造物に蓄積された前記産物を回収すること、及び、
回収された前記産物を医薬として許容される製剤に製剤化すること
を含む方法に関する。
本発明は第三に、物質が代謝及び／又は修飾されて生じる産物を活性成分として含む医薬を製造する方法であって、
外表面上に絨毛層を有する、小腸上皮細胞を含む袋状の細胞構造物と、前記物質を含む液とを、前記絨毛層に前記液が接するように配置すること、
前記細胞構造物の内部に、前記産物を蓄積させること、
前記産物を蓄積した前記細胞構造物を回収すること、及び、
回収された前記細胞構造物を医薬として許容される製剤に製剤化すること
を含む方法に関する。
本発明は第二に、物質が代謝及び／又は修飾されて生じる産物を活性成分として含む医薬を製造する方法であって、
外表面上に絨毛層を有する、小腸上皮細胞を含む袋状の細胞構造物と、前記物質を含む液とを、前記絨毛層に前記液が接するように配置すること、
前記細胞構造物の内部に、前記産物を蓄積させること、
前記細胞構造物に蓄積された前記産物を回収すること、及び、
回収された前記産物を医薬として許容される製剤に製剤化すること
を含む方法に関する。
本発明は第三に、物質が代謝及び／又は修飾されて生じる産物を活性成分として含む医薬を製造する方法であって、
外表面上に絨毛層を有する、小腸上皮細胞を含む袋状の細胞構造物と、前記物質を含む液とを、前記絨毛層に前記液が接するように配置すること、
前記細胞構造物の内部に、前記産物を蓄積させること、
前記産物を蓄積した前記細胞構造物を回収すること、及び、
回収された前記細胞構造物を医薬として許容される製剤に製剤化すること
を含む方法に関する。
【0072】
本発明の第二又は第三の方法において原料として用いる物質は、小腸により代謝及び／又は修飾されて生じる産物が医薬としての活性等の有用な性質を有することとなる前駆体化合物が例示できる。小腸の機能が衰えた患者では、前駆体化合物が投与されたときに、小腸で正常な代謝修飾産物が生成されず、所望の薬効が得られないことがある。そこで、本発明の第二又は第三の方法は、小腸での正常な代謝修飾産物を生体外で生産し、それを活性成分とする医薬を製造することを可能にする。
【0073】
本発明の第二又は第三の方法における、袋状の細胞構造物と物質を含む液とを配置する工程及び代謝修飾産物を蓄積させる工程については、本発明の第一の方法について記載の通りである。
【0074】
本発明の第二又は第三の方法で製造される医薬の活性成分である代謝修飾産物は、典型的には、上記の１以上の代謝関連酵素による原料物質の代謝修飾産物である。例えば原料物質がミタゾラムの場合、ＣＹＰ３Ａ４による代謝修飾産物を得ることができ、原料物質がイリノテカンの場合は、ＣＥＳ２による代謝修飾産物を得ることができる。
【0075】
本発明の第二の方法において、細胞構造物に蓄積された代謝修飾産物を回収する方法は、特に限定されない。例えば、シリンジなどの器具を用いて、代謝修飾産物を蓄積した袋状の細胞構造物から、代謝修飾産物を含む内部液を取り出して回収することができる。回収された内部液から更に精製処理を行い、代謝修飾産物を得てもよい。内部液が取り出された袋状の細胞構造物は、更に次の代謝修飾産物の生産に利用してもよい。或いは、代謝修飾産物を蓄積した袋状の細胞構造物自体を回収して（必要に応じて更に破砕又は精製して）、代謝修飾産物を得ることもできる。
本発明の第二の方法では、回収された代謝修飾産物を、医薬として許容される担体等と組み合わせて医薬として製剤化することがきできる。
本発明の第二の方法では、回収された代謝修飾産物を、医薬として許容される担体等と組み合わせて医薬として製剤化することがきできる。
【0076】
本発明の第三の方法では、代謝修飾産物を蓄積した袋状の細胞構造物を回収し、それを医薬として許容される担体等と組み合わせて医薬として製剤化する。代謝修飾産物を蓄積した袋状の細胞構造物は、それ自体が代謝修飾産物を内包するため活性成分として用いることができる。
【0077】
＜５．被験物質の小腸での挙動を評価する方法＞
本発明は第四に、被験物質の小腸での挙動を評価する方法であって、
外表面上に絨毛層を有する、小腸上皮細胞を含む袋状の細胞構造物と、前記被験物質を含む液とを、前記絨毛層に前記液が接するように配置すること、
前記細胞構造物を培養すること、及び、
培養後の前記細胞構造物の内部に蓄積された成分の組成を分析すること
を含む方法に関する。
本発明は第四に、被験物質の小腸での挙動を評価する方法であって、
外表面上に絨毛層を有する、小腸上皮細胞を含む袋状の細胞構造物と、前記被験物質を含む液とを、前記絨毛層に前記液が接するように配置すること、
前記細胞構造物を培養すること、及び、
培養後の前記細胞構造物の内部に蓄積された成分の組成を分析すること
を含む方法に関する。
【0078】
本発明の第四の方法において用いる被験物質としては小腸での挙動を知る必要がある医薬化合物や、生体での安全性を確認する必要がある化合物が挙げられる。本発明で用いる袋状の細胞構造物は、小腸と同様の代謝酵素活性及び機能を有するため、小腸サンプルによる被験物質の代謝修飾産物と同等の産物を生体外で生成することが可能である。このため、本発明の第四の方法は、被験物質の小腸での挙動を高精度で評価することができる。また、本発明で用いる袋状の細胞構造物は、生体の小腸サンプルと異なり、長期間培養することができるため、本発明の第四の方法は、被験物質の小腸での長期間に亘る挙動を評価することができる。
【0079】
本発明の第四の方法で生成される被験物質の代謝修飾産物は、典型的には、上記の１以上の代謝関連酵素による原料物質の代謝修飾産物である。例えば被験物質がミタゾラムの場合、ＣＹＰ３Ａ４による代謝修飾産物を得ることができ、被験物質がイリノテカンの場合は、ＣＥＳ２による代謝修飾産物を得ることができる。
【0080】
本発明の第四の方法における、袋状の細胞構造物と物質を含む液とを配置する工程については、本発明の第一の方法について記載の通りである。また、本発明の第四の方法での細胞構造物を培養する工程は、本発明の第一の方法において、細胞構造物の内部に代謝修飾産物を蓄積させる工程のための細胞構造物の培養と同様の方法で行うことができる。
【0081】
本発明の第四の方法において、培養後の細胞構造物の内部に蓄積された成分の組成を分析する工程は、培養後の細胞構造物の内部液をシリンジなどの器具を用いて回収し、更に必要に応じて精製して、回収されたものの組成を、液体クロマトグラフィー、質量分析等の通常の分析手段により分析する工程である。内部液が取り出された袋状の細胞構造物は、更に次の評価方法の実施に利用してもよい。或いは、培養後の細胞構造物自体を回収し、必要に応じて更に破砕又は精製して、回収されたものの組成を通常の分析手段により分析する工程であってもよい。
【0082】
＜６．被験物質の小腸での挙動を評価するためのキット＞
本発明は第五に、
被験物質の小腸での挙動を評価するためのキットであって、
外表面上に絨毛層を有する、小腸上皮細胞を含む袋状の細胞構造物、及び、
前記細胞構造物を培養するための培地
を含むキットに関する。このキットは本発明の第四の方法の実施に用いることができる。 袋状の細胞構造物及び細胞構造物を培養するための培地については既述の通りである。
本発明は第五に、
被験物質の小腸での挙動を評価するためのキットであって、
外表面上に絨毛層を有する、小腸上皮細胞を含む袋状の細胞構造物、及び、
前記細胞構造物を培養するための培地
を含むキットに関する。このキットは本発明の第四の方法の実施に用いることができる。 袋状の細胞構造物及び細胞構造物を培養するための培地については既述の通りである。
【0083】
本発明のキットには、細胞構造物の内部に蓄積された成分を取り出すための器具を更に含むきことが好ましい。このような器具としては、細胞構造物の内部液を取り出すためのシリンジが挙げられる。
以下、具体的な実験結果を参照して本発明を説明するが、本発明の範囲は実験結果の範囲には限定されない。
以下、具体的な実験結果を参照して本発明を説明するが、本発明の範囲は実験結果の範囲には限定されない。
【実施例0084】
＜実施例１＞
腸様オルガノイド形成過程における代謝酵素の発現パターンを評価するため経時的なサンプリングと定量ＰＣＲ解析を実施した。以下それらの方法を記載する。
腸様オルガノイド形成過程における代謝酵素の発現パターンを評価するため経時的なサンプリングと定量ＰＣＲ解析を実施した。以下それらの方法を記載する。
【0085】
ヒトｉＰＳ細胞として子宮内膜細胞由来のＥｄｏｍ ｉＰＳ細胞もしくはヒトＥＳ細胞の細胞株を用意した。細胞株はビトロネクチン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）コーティングした細胞培養用ディッシュ上でＳｔｅｍＦｉｔ培地（味の素社）を用いて増殖維持した。
【0086】
ビトロネクチンコーティングはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１／１００希釈したビトロネクチン溶液の、基板または培養ディッシュが被覆される量を滴下し、室温で３０分間放置したのち、ＰＢＳで洗浄することで実施した。
【0087】
ポリエチレングリコール被膜で覆われた細胞非接着部と、該細胞非接着部中に島状に点在した、前記被膜が分解除去された細胞接着部の直径１５００μｍの円形パターンとが表面に形成されたガラス基板（基板サイズ５ｃｍ×５ｃｍ）を特許文献５及び非特許文献７に記載の方法で製造した。このガラス基板を直径１０ｃｍの円形の培養ディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ社）に入れてビトロネクチンコートした後に、上記培養した細胞をＥＤＴＡ処理により剥離した上で１０７個の細胞を播種した。
【0088】
非特許文献３及び特許文献４の実施例に記載の方法に従い前記播種細胞の培養を行い、腸様オルガノイドを得た。なお播種翌日には、直径１０ｃｍの円形の培養ディッシュ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社）に移した上で培地を約１５ｍｌになるように維持して２日ごとに培地交換を行った。
未分化細胞、及び、７日、１４日、２１日の各日数基板上で培養した細胞を、それぞれサンプリングした。
回収したサンプルに９００μｌのＱｉａＺｏｌ溶液（Ｑｉａｇｅｎ社）を加え、ホモジナイゼーションにより細胞を破砕し、５分間静置した。
未分化細胞、及び、７日、１４日、２１日の各日数基板上で培養した細胞を、それぞれサンプリングした。
回収したサンプルに９００μｌのＱｉａＺｏｌ溶液（Ｑｉａｇｅｎ社）を加え、ホモジナイゼーションにより細胞を破砕し、５分間静置した。
【0089】
破砕した細胞からのｍＲＮＡ抽出を、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）のプロトコールを参照して実施した。細胞破砕液に１００μｌのｇＤＮＡ Ｅｌｉｍｉｎａｔｏｒを加えて混合し、次に１８０μｌのクロロフォルム（ナカライテスク社）を加えて混合し２分間静置した。続いて混合液を１２ｋｒｐｍ、４℃、１５分間の条件で遠心し上清を回収した。上清に６００μｌの７０％エタノールを混合しＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎに加えて１０ｋｒｐｍ、４℃、１５秒の条件で遠心した。７００μｌのＲＷＴ ｂｕｆｆｅｒを加えて１０ｋｒｐｍ、４℃、１５秒の条件で遠心を１回、５００μｌのＲＰＥ ｂｕｆｆｅｒを加え１０ｋｒｐｍ、４℃、１５秒の条件で遠心を２回し洗浄した。最後に、３０μｌのＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ－ｗａｔｅｒを加え１０ｋｒｐｍ、４℃、１分間の条件で遠心し抽出した。
含有ｍＲＮＡのＯＤ値はＮａｎｏｄｒｏｐ装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）を用いて定量した。
含有ｍＲＮＡのＯＤ値はＮａｎｏｄｒｏｐ装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）を用いて定量した。
【0090】
ｃＤＮＡへの逆転写はＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ ＶＩＬＯ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）を用い行った。０．５μｇ～１．０μｇのｍＲＮＡサンプル、４μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ ＶＩＬＯ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘｔｕｒｅ、そして、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ－ｗａｔｅｒを加えて全量２０μｌに調整し、２５℃で１０分間、５０℃で１０分間、８０℃で５分間の１サイクルのＰＣＲ条件で反応させた。
【0091】
定量ＰＣＲでは、９６ウェルプレートの１ウェルに対して５～１０ｎｇのｃＤＮＡ、対象遺伝子の１０μＭのＦｏｒｗａｒｄプライマーと１０μＭのＲｅｖｅｒｓｅプライマーを各１μｌ（最終濃度０．２μＭ）、２×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを１２．５μｌ（最終濃度１×）、ＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｄｙｅを０．５μｌ（最終濃度０．５μＭ）、そして、ＭｉｌｌｉＱを加えて全量２５μｌに調整し、５０℃で２分間、９５℃で１０分間を１サイクル、９５℃で１５秒、６０℃で１ｍｉｎを４０サイクル、９５℃で１５秒、６０℃で１分間、９５℃で１分間を１サイクルのＰＣＲ条件で反応させ測定した。
各対象遺伝子の発現量の数値は相対的評価としており、各遺伝子のＣｔをインターナルコントロールＧＡＰＤＨのＣｔで補正を行いΔΔＣＴ法により算出した。
各対象遺伝子の発現量の数値は相対的評価としており、各遺伝子のＣｔをインターナルコントロールＧＡＰＤＨのＣｔで補正を行いΔΔＣＴ法により算出した。
【0092】
Ｅｄｏｍ ｉＰＳ細胞由来の腸様オルガノイドをサンプルとしたときの各遺伝子の発現量の評価結果は図１の通りである。腸様オルガノイド形成を示す腸マーカーＣＤＸ２の上昇と相関して後期に代謝酵素ＣＹＰ３Ａ４とＣＥＳ２の発現が観察された。この結果により腸様オルガノイドが代謝機能を持つ可能性が示唆された。
以下の実験では、上記の方法で製造したＥｄｏｍ ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞由来の腸様オルガノイドを使用した。
以下の実験では、上記の方法で製造したＥｄｏｍ ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞由来の腸様オルガノイドを使用した。
【0093】
＜実施例２＞
腸様オルガノイドがＣＹＰ３Ａ４発現と多薬剤排出トランスポーターｐ－ｇｐの発現を示すか確認するため免疫染色を実施した。以下それらの方法を記載する。
腸様オルガノイドがＣＹＰ３Ａ４発現と多薬剤排出トランスポーターｐ－ｇｐの発現を示すか確認するため免疫染色を実施した。以下それらの方法を記載する。
【0094】
培養１２０日後のＥＳ細胞由来の腸様オルガノイドをサンプリングし、２７Ｇ注射針（テルモ社）により袋構造物へ穴をあけた。穴をあけた袋構造物を１．５ｍｌ ｔｕｂｅに移し５０μｌの培養液を加えた。次に、ゲル包埋としてｉＰＧｅｌｌ Ｋｉｔ（ジェノスタッフ社）の溶液Ａを１０μｌ加え３回ピペッチング、溶液Ｂを５０μｌ加え３回ピペッチングし室温で１分間静置した。ゲル包埋後、１ｍｌの４％パラホルムアルデヒド（和光純薬社）で一晩４℃において固定した。
パラフィン切片は、パラフィン包埋された検体ブロックをミクロトームでスライスしスライドガラスへと貼り付け作製した。
パラフィン切片は、パラフィン包埋された検体ブロックをミクロトームでスライスしスライドガラスへと貼り付け作製した。
【0095】
パラフィン切片はキシレン溶液（武藤化学社）に５回浸し、次にアルコール溶液（武藤化学社）に５回浸し脱パラフィン処理を行った。次に抗原不活化処理として沸騰させたｐＨ８．０ ＴＥ ｂｕｆｆｅｒ内に入れレンジで１０分間処理を行った。その後、ブロッキング溶液であるＰｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋ（ダコ社）で室温３０分間ブロッキング処理を行った。０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で希釈したラビットＩｇＧ標識抗ｐ－ｇｐ抗体（Ａｂｃａｍ社；希釈率１／１０００）及びマウスＩｇＧ標識抗ＣＹＰ３Ａ４抗体（Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ社；希釈率１／２００）の一次抗体を切片領域に滴下し４℃一晩反応させた。一次抗体反応後、ＰＢＳで３回洗浄し０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で希釈したＡｌｅｘａ４８８標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社 希釈率１／１０００）、Ａｌｅｘａ５４６標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社 希釈率１／１０００）及びＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ社 希釈率１／１０００）を切片領域に滴下し室温３０分間反応させた後に封入し共焦点顕微鏡で観察した。
コントロールとして生体の小腸、及び、大腸がん細胞株Ｃａｃｏ－２にも同様の処理を行い観察した。
コントロールとして生体の小腸、及び、大腸がん細胞株Ｃａｃｏ－２にも同様の処理を行い観察した。
【0096】
結果は図２の通りである。生体の小腸と類似して腸様オルガノイドにおいてＣＹＰ３Ａ４とｐ－ｇｐのタンパク質の発現がある一方、大腸組織由来であるＣａｃｏ－２ではＣＹＰ３Ａ４が発現していなかった。この結果から、腸様オルガノイドでは、ヒト小腸組織と類似した代謝酵素が発現し、機能している可能性が示唆された。
【0097】
＜実施例３＞
腸様オルガノイドが、小腸組織と類似したＣＹＰ３Ａ４発現とその誘導経路を有しているかを確認するため定量ＰＣＲ解析を実施した。定量ＰＣＲ解析の手順は＜実施例１＞と同方法である。発現誘導処理は下記に示す。
腸様オルガノイドが、小腸組織と類似したＣＹＰ３Ａ４発現とその誘導経路を有しているかを確認するため定量ＰＣＲ解析を実施した。定量ＰＣＲ解析の手順は＜実施例１＞と同方法である。発現誘導処理は下記に示す。
【0098】
培養７８日後のＥＳ細胞由来の腸様オルガノイドに０．１％ＤＭＳＯ（ブランク）もしくは最終濃度１００ｎＭの１α，２５－Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ Ｄ３（ＳＩＧＭＡ－ＡＤＬＲＩＣＨ）を加え３７℃、２４時間反応させ誘導処理を行った。その後、サンプルの回収、逆転写、定量ＰＣＲ解析を＜実施例１＞と同条件で実施した。
コントロールとして大腸がん細胞Ｃａｃｏ－２に対して同様な処理を行い、定量ＰＣＲ解析を実施した。
コントロールとして大腸がん細胞Ｃａｃｏ－２に対して同様な処理を行い、定量ＰＣＲ解析を実施した。
【0099】
結果は図３の通りである。腸様オルガノイド（図３では「ｍｉｎｉ－ｇｕｔ」と省略）でのＣＹＰ３Ａ４とｐ－ｇｐの両遺伝子の発現（図３の「ｍｉｎｉ－ｇｕｔ＋ＤＭＳＯ」）は、ヒト小腸サンプルでの発現（図３の「Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ」）の３～７割であり遜色ない。大腸組織由来であるＣａｃｏ－２ではＣＹＰ３Ａ４が低発現であった。また、小腸特異的代謝酵素誘導体である１α，２５－Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ Ｄ３（図３では「ＶＤ３」と省略）で処理すると腸様オルガノイドでのＣＹＰ３Ａ４とｐ－ｇｐの発現が誘導されることが観察できた（図３の「ｍｉｎｉ－ｇｕｔ＋ＤＶ３」）。この結果から、腸様オルガノイドはヒト小腸組織と類似して代謝酵素の誘導経路があることが示唆された。
【0100】
＜実施例４＞
ｉＰＳ細胞由来腸様オルガノイドのＣＹＰ３Ａ４発現とその誘導経路がＥＳ細胞由来腸様オルガノイドと類似し細胞株の由来に影響しないことを確認するため定量ＰＣＲ解析と免疫染色を実施した。定量ＰＣＲ解析は＜実施例１＞、免疫染色は＜実施例２＞と同様の方法により行った。発現誘導処理について下記に説明する。
ｉＰＳ細胞由来腸様オルガノイドのＣＹＰ３Ａ４発現とその誘導経路がＥＳ細胞由来腸様オルガノイドと類似し細胞株の由来に影響しないことを確認するため定量ＰＣＲ解析と免疫染色を実施した。定量ＰＣＲ解析は＜実施例１＞、免疫染色は＜実施例２＞と同様の方法により行った。発現誘導処理について下記に説明する。
【0101】
培養１１６日後のｉＰＳ細胞由来腸様オルガノイドに０．１％ＤＭＳＯもしくは最終濃度１００ｎＭの１α，２５－Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ Ｄ３（ＳＩＧＭＡ－ＡＤＬＲＩＣＨ）を加え３７℃、２４時間反応させ誘導処理を行った。その後、サンプルの回収、逆転写、定量ＰＣＲ解析を＜実施例１＞と同条件で実施した。
培養６２日後のｉＰＳ細胞由来腸様オルガノイドのパラフィン切片作製、免疫染色を＜実施例２＞と同条件で実施した。
培養６２日後のｉＰＳ細胞由来腸様オルガノイドのパラフィン切片作製、免疫染色を＜実施例２＞と同条件で実施した。
【0102】
結果は図４Ａ及び図４Ｂの通りである。ｉＰＳ細胞由来腸様オルガノイドでのＣＹＰ３Ａ４とｐ－ｇｐの両遺伝子の発現が免疫染色から観察できた（図４Ａ）。また、小腸特異的代謝酵素誘導体である１α，２５－Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ Ｄ３（図４Ｂでは「ＶＤ３」と省略）で処理するとｉＰＳ細胞由来腸様オルガノイドのＣＹＰ３Ａ４とｐ－ｇｐの発現が誘導されることが観察できた（図４Ｂの「ｍｉｎｉ－ｇｕｔ＋ＤＶ３」）。これら結果から、ｉＰＳ細胞由来腸様オルガノイドはヒト小腸組織と類似する代謝酵素の誘導経路を有しており、作製した腸様オルガノイドの代謝機能は細胞株に依存しないことが示唆された。
【0103】
＜実施例５＞
袋構造を有する腸様オルガノイドを用いた代謝酵素活性評価（ＣＹＰ３Ａ４活性）において、腸様オルガノイドの内部液を吸い出して分析し評価することが有効かを確認するため、Ｐ４５０－ＧｌｏＴＭ ＣＹＰ３Ａ４ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）とそれに用いる内部液のサンプリングを実施した。以下それらの方法を記載する。
手順の概要を図５Ａに模式的に示す。
袋構造を有する腸様オルガノイドを用いた代謝酵素活性評価（ＣＹＰ３Ａ４活性）において、腸様オルガノイドの内部液を吸い出して分析し評価することが有効かを確認するため、Ｐ４５０－ＧｌｏＴＭ ＣＹＰ３Ａ４ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）とそれに用いる内部液のサンプリングを実施した。以下それらの方法を記載する。
手順の概要を図５Ａに模式的に示す。
【0104】
各ウェルに５００μｌの液体培地を収容した２４穴培養プレート（コーニング社）に、培養１６０日後のｉＰＳ細胞由来の腸様オルガノイドを２～３個／ウェル入れ、ＣＹＰ３Ａ４の人工基質である０．５μｌのＬｕｃｉｆｅｒｉｎ－ＩＰＡを加え３７℃、２時間反応させた。反応後に、一部の試験区では腸様オルガノイドを培地から分離して腸様オルガノイドを含まない培地の上清２５μｌ（上清Ａ）を回収し、別の試験区では腸様オルガノイドを取り除かず含んだままの培地の上清２５μｌ（上清Ｃ）を回収した。
【0105】
上記で分離した腸様オルガノイドを新鮮な培地に入れ、針とシリンジ（伊藤製作所）で内部液を吸い出した。吸い出した内部液に培地を加えて容量を２５μｌに調整した（内容物）。また、腸様オルガノイドの内部液を吸い出す際に使用した培地の上清２５μｌ（上清Ｂ）を回収した。
【0106】
各回収した上清Ａ、上清Ｂ、上清Ｃ、内容物（内部液）を９６穴アッセイプレート（コーニング社）に移し、２５μｌのルシフェリン検出試薬を加え、室温、２０分間反応させた。その後、ルミノメトリー（ＢｉｏＴｅｋ社）で発光強度の測定を実施した。内容物（内部液）の発光強度は希釈率に沿って計算した。
【0107】
結果は図５Ｂの通りである。ＣＹＰ３Ａ４の代謝活性機能に相関する発光強度は、上清Ａ、上清Ｂ、上清Ｃに比べ内容物（内部液）では約２～４倍高かった。この結果から、腸様オルガノイドの代謝活性を評価することは可能であり、特に、腸様オルガノイドから吸い出した内部液に基づいて評価することが効果的であることが示唆された。
【0108】
＜実施例６＞
袋構造を有する腸様オルガノイドの代謝酵素活性（ＣＹＰ３Ａ４活性とＣＥＳ活性）を評価するため、ＣＹＰ３Ａ４基質のミタゾラムとＣＥＳ基質のイリノテカンに対する代謝活性を評価した。ミタゾラム及びイリノテカンのそれぞれの代謝産物をＬＣ／ＭＳ／ＭＳで分析した（鎌倉テクノサイエンス社）。以下それらの方法を記載する。
袋構造を有する腸様オルガノイドの代謝酵素活性（ＣＹＰ３Ａ４活性とＣＥＳ活性）を評価するため、ＣＹＰ３Ａ４基質のミタゾラムとＣＥＳ基質のイリノテカンに対する代謝活性を評価した。ミタゾラム及びイリノテカンのそれぞれの代謝産物をＬＣ／ＭＳ／ＭＳで分析した（鎌倉テクノサイエンス社）。以下それらの方法を記載する。
【0109】
チューブ内で１００ｍｍｏｌ／Ｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ ３００μｌに培養９０日後のＥＳ細胞由来の腸様オルガノイド１個を加え、氷冷下でスパチュラ等を用いて腸様オルガノイドの形態を潰したのち、超音波処理を行った。更に、ステンレスビーズ２個をチューブに加え、ビーズ破砕機を用いてホモジネートを調製した。
【0110】
氷冷下で２００μｌの腸様オルガノイド由来ホモジネート、１５６μｌの１００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７．４、４μｌの０．２ｍＭ Ｍｉｄａｚｏｌａｍ（５０％ＭｅＣＮ）により代謝反応用混液の調製を行った。Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎの場合は、４μｌの２ｍＭ Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ（５０％ＭｅＣＮ）を加えた。
【0111】
腸様オルガノイド由来ホモジネート毎に調製した１８０μｌの代謝反応用混液を１．５ｍｌマイクロチューブに採取し、３７℃下で代謝反応を実施した。５分間プレインキュベーションし、２０μｌの１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＡＤＰＨを添加・撹拌した。一定時間後、具体的には５分間、１５分間、３０分間、６０分間の各反応時間後に２０μｌのサンプリングを行った。また、反応時間０分としてホモジネート添加後、すぐにサンプリングを行った。サンプリング後、速やかに１００ｎｍｏｌ／Ｌ Ｐｈｅｎａｃｅｔｉｎを含む２０μｌのＭｅＣＮに添加・撹拌、氷冷、そして、２０μｌの２５％ ＭｅＣＮを添加・撹拌を行い１９００×ｇ、５分間の条件で遠心を行った。その２０μｌの上清に１００μｌの２０％ ＭｅＣＮを添加した。
【0112】
検量線用標準試料の調製として２０μＬの１００ｍｍｏｌ／Ｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒを８本のＰＰチューブ（Ｂｌａｎｋ＋７濃度）に採取し、１００ｎｍｏｌ／Ｌ Ｐｈｅｎａｃｅｔｉｎを含む２０μｌのＭｅＣＮ（ＢｌａｎｋにはＭｅＣＮ）を添加・撹拌後、氷冷し、２０μｌの標準溶液（Ｂｌａｎｋには２５％ ＭｅＣＮ）を添加・撹拌し、１９００×ｇ、５分間の条件下で遠心を行った。その２０μｌの上清に１００μｌの２０％ ＭｅＣＮを添加した。今回の検量線範囲はＢｌａｎｋ、０．０００３μＭ、０．００１μＭ、０．００３μＭ、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭとした。
代謝活性を算出するために、調整した各懸濁液中のタンパク質を、ＤＣプロテインアッセイキットＩＩ（バイオラッド社）を用いて定量化した。
代謝活性を算出するために、調整した各懸濁液中のタンパク質を、ＤＣプロテインアッセイキットＩＩ（バイオラッド社）を用いて定量化した。
【0113】
結果は図６の通りである。腸様オルガノイドのＣＹＰ３Ａ４活性化とＣＥＳ活性化の指標となるミタゾラムとイリノテカンそれぞれの代謝産物が経時的に増加していることが観察できた。これらの結果から、腸様オルガノイドは代謝酵素活性を有しており、薬剤に対する代謝機能を持つことが示唆された。
【0114】
＜実施例７＞
腸様オルガノイドにおける他の代謝関連遺伝子の発現を評価するためＲＴ２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ ＰＣＲ Ａｒｒａｙ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて網羅的解析を実施した。以下それらの方法を記載する。
腸様オルガノイドにおける他の代謝関連遺伝子の発現を評価するためＲＴ２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ ＰＣＲ Ａｒｒａｙ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて網羅的解析を実施した。以下それらの方法を記載する。
【0115】
培養９０日後のＥＳ細胞由来の腸様オルガノイドからｍＲＮＡサンプルを回収するため、１．５ｍｌチューブに腸様オルガノイドを１個入れホモジナイゼーションにより細胞を破砕し、１ｍｌのＴＲＩｚｏｌ溶液（ライフテクノロジーズ社）を加えて３７℃、１５分間反応させた。反応後、溶液を１５ｍｌ遠心チューブに移し、さらに４ｍｌのＴＲＩｚｏｌ溶液を加えて混和し、３７℃、５分間反応させた。次に１ｍｌのクロロフォルム（ナカライテスク社）を加えて混合し２分間静置した。混合液を３ｋｒｐｍ、４℃、１５分間の条件で遠心し上清を回収した。上清に２．５ｍｌのイソプロパノール（ナカライテスク社）を加え混和し１０分間静置した。混合液を３ｋｒｐｍ、４℃、１０分の条件で遠心し上清を除去した。上清除去後、５ｍｌのｃｏｌｄ ７５％ エタノールを加え３ｋｒｐｍ、４℃、１０分間の条件で遠心し上清を除去した。上清除去後、３０μｌのＵｌｔｒａＰｕｒｅ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ（インビトロジン社）を加え懸濁し１．５ｍｌチューブへ移し、６０℃、１０分間の条件で熱処理を行い溶出した。
含有ｍＲＮＡのＯＤ値はＮａｎｏｄｒｏｐ装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）を用いて定量した。
含有ｍＲＮＡのＯＤ値はＮａｎｏｄｒｏｐ装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）を用いて定量した。
【0116】
ｃＤＮＡへの逆転写はＲＴ２ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用い行った。実験はＫｉｔに付属しているプロトコールに沿って実施した。１．０μｇのｍＲＮＡサンプル、２μｌのＢｕｆｆｅｒ ＧＥ、そして、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ－ｗａｔｅｒにより全量１０μｌに調整し、４２℃で５分間反応させた後、氷上で１分間静置した。次に、１０μｌの反応液に４μｌの５×ｕｆｆｅｒ ＢＣ３、１μｌのＣｏｎｔｒｏｌ Ｐ２、２μｌのＲＥ３ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｍｉｘ、３μｌのＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ－ｗａｔｅｒを加えて全量２０μｌに調整し、４２℃で１５分間、９５℃で５分間反応させた。反応液に９１μｌのＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ－ｗａｔｅｒ加え混和させた。
【0117】
網羅的定量ＰＣＲはＲＴ２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ ＰＣＲ Ａｒｒａｙ Ｈｕｍａｎ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用い行った。実験はＫｉｔに付属しているプロトコールに沿って実施した。５ｍｌチューブに１０２μｌのｃＤＮＡサンプル、１３５０μｌの２×ＲＴ２ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ、１２４８μｌのＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ－ｗａｔｅｒを加え混和させた。９６ウェルプレートの１ウェルに対して２５μｌの混和液を添加した。すべてのウェルに添加後、プレートをＯｐｔｉｃａｌ Ｔｈｉｎ－Ｗａｌｌ ８－Ｃａｐ Ｓｔｒｉｐｓでしっかりと密封した。１ｋｒｐｍ、室温、１分間の条件で遠心し気泡を除去した。その後、９５℃で１分間を１サイクル、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間を４０サイクル、９５℃で１分間、６０℃で２分間、９５℃で２℃／分を１サイクルのＰＣＲ条件で反応させ測定した。コントロールサンプルとしてヒト小腸組織ｃＤＮＡを用い同条件で実験を実施した。
【0118】
数値は相対的評価としており、ヒト小腸組織（ＩＮＴＥＳＴＩＮ）と腸様オルガノイド（ＭＧＵＴ）の各遺伝子のＣｔをｋｉｔに付属してある複数のインターナルコントロールの平均Ｃｔで補正を行いΔΔＣＴ法により算出した。ヒト小腸組織（ＩＮＴＥＳＴＩＮ）を１として相対的評価を示した。
【0119】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図7F】
【図7G】
