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特開2023-183055免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進するための剤、腸管免疫増強剤、粘膜免疫増強剤及び免疫制御剤
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023183055
(43)【公開日】2023-12-27
(54)【発明の名称】免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進するための剤、腸管免疫増強剤、粘膜免疫増強剤及び免疫制御剤
(51)【国際特許分類】
A61K 31/702 20060101AFI20231220BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20231220BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20231220BHJP
【ＦＩ】
A61K31/702 ZNA
A61P37/02
A61P37/04
【審査請求】未請求
【請求項の数】6
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022096449
(22)【出願日】2022-06-15
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】505089614
【氏名又は名称】国立大学法人福島大学
(74)【代理人】
【識別番号】100110766
【弁理士】
【氏名又は名称】佐川 慎悟
(74)【代理人】
【識別番号】100165515
【弁理士】
【氏名又は名称】太田 清子
(74)【代理人】
【識別番号】100169340
【弁理士】
【氏名又は名称】川野 陽輔
(74)【代理人】
【識別番号】100195682
【弁理士】
【氏名又は名称】江部 陽子
(74)【代理人】
【識別番号】100206623
【弁理士】
【氏名又は名称】大窪 智行
(72)【発明者】
【氏名】松田 幹
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA01
4C086NA14
4C086ZB07
4C086ZB09
(57)【要約】
【課題】免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進するための剤、体内に侵入する多様な物質に対して結合・排出が可能であり、幅広い抗原や病原体による疾患、症状等を予防又は治療することのできる腸管免疫増強剤及び粘膜免疫増強剤、並びに免疫制御剤を提供する。
【解決手段】分泌型免疫グロブリンＡ（ｓＩｇＡ）の可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進するための剤は、ラフィノースを有効成分とする。
【選択図】図２
【解決手段】分泌型免疫グロブリンＡ（ｓＩｇＡ）の可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進するための剤は、ラフィノースを有効成分とする。
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ラフィノースを有効成分とする、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進するための剤。
【請求項2】
前記可変領域は、重鎖可変領域である、
ことを特徴とする請求項１に記載の剤。
ことを特徴とする請求項１に記載の剤。
【請求項3】
前記ＩｇＡは、腸管分泌型ＩｇＡ又は粘膜分泌型ＩｇＡである、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の剤。
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の剤。
【請求項4】
ラフィノースを有効成分とする、腸管免疫増強剤。
【請求項5】
ラフィノースを有効成分とする、粘膜免疫増強剤。
【請求項6】
ラフィノースを有効成分とする、免疫制御剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進するための剤、腸管免疫増強剤、粘膜免疫増強剤及び免疫制御剤に関する。
【背景技術】
【0002】
免疫グロブリンＡ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ａ：ＩｇＡ）は、抗体の一種で、ヒトの体内ではＩｇＧに次いで２番目に多い抗体である。特に、眼、鼻、喉、消化管などの外界と接する粘膜組織において、粘膜表面に分泌されるＩｇＡは、分泌型ＩｇＡ（ｓＩｇＡ）と呼ばれる。
【0003】
ラフィノースは、ビフィズス菌・乳酸桿菌に資化される三糖のオリゴ糖であり、大豆やビートをはじめ植物界に広く分布している。
【0004】
ラフィノースの、アレルギーやアトピー性皮膚炎を改善する効果について、以下のとおり報告がなされてきた。
【0005】
特許文献１には、ラフィノースを有効成分とするＩｇＥ抗体産生低減剤及びアレルギー体質改善剤が開示されている。また、特許文献２には、ラフィノースを有効成分とする抗アトピー性皮膚炎組成物が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特開２００１－２８８０９３号公報
【特許文献2】特開平１１－２５５６５６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
しかしながら、特許文献１の剤は、ＩｇＥ抗体産生を低減することで抗アレルギー作用を有するものの、ＩｇＡに対する効果は不明であった。また、特許文献２の組成物は、アトピー性皮膚炎に効果を奏するものの、多種多様な抗原によるアレルギーに対して一律に効果を有するものではない点で課題を残していた。
【0008】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進するための剤、体内に侵入する多様な物質に対して結合・排出が可能であり、幅広い抗原や病原体による疾患、症状等を予防又は治療することのできる腸管免疫増強剤及び粘膜免疫増強剤、並びに免疫制御剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
上記目的を達成するため、本発明の第１の観点に係る免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進するための剤は、
ラフィノースを有効成分とする。
ラフィノースを有効成分とする。
【0010】
例えば、前記可変領域は、重鎖可変領域である。
【0011】
例えば、前記ＩｇＡは、腸管分泌型ＩｇＡ又は粘膜分泌型ＩｇＡである。
【0012】
本発明の第２の観点に係る腸管免疫増強剤は、
ラフィノースを有効成分とする。
ラフィノースを有効成分とする。
【0013】
本発明の第３の観点に係る粘膜免疫増強剤は、
ラフィノースを有効成分とする。
ラフィノースを有効成分とする。
【0014】
本発明の第４の観点に係る免疫制御剤は、
ラフィノースを有効成分とする。
ラフィノースを有効成分とする。
【発明の効果】
【0015】
本発明によれば、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進するための剤、体内に侵入する多様な物質に対して結合・排出が可能であり、幅広い抗原や病原体による疾患、症状等を予防又は治療することのできる腸管免疫増強剤及び粘膜免疫増強剤、並びに免疫制御剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】ラフィノース摂取によってマウスの組織におけるＩｇＡのＣＤＲ３の多様化が促進されたことを表すグラフ図であり、（ａ）は対照群、（ｂ）はラフィノース群のグラフ図である。
【図2】ラフィノース摂取によってマウスの組織におけるＩｇＡのＣＤＲ３配列の多様化が促進されたことを表すグラフ図である。
【図3】ラフィノース摂取によってマウスの組織におけるＩｇＡのＶＤＪ領域の多様化が促進されたことを表すグラフ図である。
【図4】ラフィノース摂取によってマウスの腸管に分泌されたＩｇＡ抗体の抗原結合の多様化が促進されたことを表すグラフ図であり、（ａ）は対照群、（ｂ）はラフィノース群のグラフ図である。
【図5】ラフィノース摂取によってマウスの組織において免疫制御に関わる遺伝子の発現が促進されたことを表すグラフ図であり、（ａ）はＴｇｆｂ１、（ｂ）はＦｏｘｐ３のグラフ図である。
【発明を実施するための形態】
【0017】
（１．免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進するための剤）
本発明のＩｇＡの可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進するための剤は、ラフィノースを有効成分として含有する。ＩｇＡは、未消化のタンパク質、病原菌、毒素等と結合し、それらの吸収を抑制する作用を有する。したがって、本発明による剤は、ＩｇＡの可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進することで、後述するように幅広い抗原や病原体による疾患、症状等を予防又は治療することができる。
本発明のＩｇＡの可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進するための剤は、ラフィノースを有効成分として含有する。ＩｇＡは、未消化のタンパク質、病原菌、毒素等と結合し、それらの吸収を抑制する作用を有する。したがって、本発明による剤は、ＩｇＡの可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進することで、後述するように幅広い抗原や病原体による疾患、症状等を予防又は治療することができる。
【0018】
免疫グロブリンＡ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ａ：ＩｇＡ）は、抗体の一種で、ヒトの抗体の中では量的に最も優勢な抗体で、その多くは腸管や気道など体外に分泌される。ＩｇＡは、体内でもＩｇＧに次いで２番目に多い抗体である。ＩｇＡは、同じ構造をした２本の重鎖（Ｈ鎖）と２本の軽鎖（Ｌ鎖）とによって形成されている。Ｈ鎖及びＬ鎖のＮ末端側に存在する、ＶＨ及びＶＬ領域は、ＩｇＡの「可変領域」と呼ばれており、構成するアミノ酸の種類、配列ともに多様性が見られる。Ｈ鎖の可変領域においては、超可変領域（相補性決定領域：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ（ＣＤＲ））と呼ばれる３つの小さな領域が存在している。ＣＤＲは５～１０個のアミノ酸によって構成される短い配列であり、特にアミノ酸配列の多様性に富むことが知られている。ＣＤＲを構成するアミノ酸の種類及び配列の違いによって、認識する抗原が変化することから、ＣＤＲは抗体の抗原認識特異性を決定づけているといえる。
【0019】
本発明による剤は、ＩｇＡの可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進する。本明細書において「ＩｇＡの可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進する」とは、ラフィノースを摂取した個体由来のＩｇＡの可変領域のアミノ酸配列と、ラフィノース非摂取又は摂取前の個体由来のＩｇＡの可変領域のアミノ酸配列と、を比較した場合、後者より前者のほうで同一の配列の割合が減少し、異なる配列（特に、互いに類似度の低い配列）の割合が増大することを意味する。異なる配列の割合の増大の程度は、例えば、可変領域のアミノ酸配列の種類の数、可変領域のアミノ酸配列の同一性又は相同性、ＩｇＡの抗原特異性、抗原結合性の変化等を指標とすることができる。
【0020】
「ＩｇＡの可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進する」ことの確認方法は、例えば、後述の実施例に記載される方法が挙げられる。具体的には、ラフィノースを摂取した個体の組織からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを調製する。調製したｃＤＮＡを鋳型として、ＩｇＡ重鎖可変領域に特異的なプライマーを用いたＰＣＲにより、ＩｇＡの可変領域であるＶＤＪ遺伝子領域を網羅的に増幅し、次世代シーケンサー（ＮＧＳ：Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）を用いて、その塩基配列を決定する。続いて、免疫グロブリン配列解析パイプラインを用いて得られた塩基配列データを解析し、アミノ酸配列及び各配列のリードカウントを計算し、種数を測定する。ラフィノース非摂取又は摂取前の個体由来の当該種数と比較し、ラフィノースを摂取した個体由来の当該種数が多い場合（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）に、またリードカウントが特定の配列に偏っていない場合（ｅｖｅｎｎｅｓｓ）に、ＩｇＡの可変領域のアミノ酸配列の多様化が促進されたことを確認することができる。
【0021】
本発明において、「ＩｇＡの可変領域」は、重鎖（Ｈ鎖）可変領域又は軽鎖（Ｌ鎖）可変領域のいずれであってもよいが、好ましくは重鎖（Ｈ鎖）可変領域である。また、「ＩｇＡの可変領域」は、重鎖（Ｈ鎖）相補性決定領域（ＣＤＲ）１～３又は軽鎖（Ｌ鎖）相補性決定領域（ＣＤＲ）１～３のいずれであってもよいが、好ましくは、抗原結合に最も寄与する重鎖（Ｈ鎖）相補性決定領域（ＣＤＲ）３又はＶＤＪ領域である。ＣＤＲ３は、Ｖ遺伝子、Ｄセグメント及びＪ遺伝子の３つが連結した領域であり、ＶＤＪ領域は、抗体Ｖ遺伝子、Ｄセグメント及びＪ遺伝子にコードされる領域である。なお、本発明による剤は、ＣＤＲ３配列の多様性を促進するとともに、ＶＤＪ領域の配列の多様性を促進してもよい。
【0022】
本発明において、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）は、眼、鼻、喉、消化管等の外界と接する粘膜組織、脾臓などいずれの組織由来のＩｇＡであってもよいが、好ましくは腸管分泌型ＩｇＡ又は粘膜分泌型ＩｇＡである。腸管を含む消化管等の外界と接する粘膜組織において、粘膜表面に分泌されるＩｇＡは、分泌型ＩｇＡ（ｓＩｇＡ）と呼ばれ、ｓＩｇＡは、未消化のタンパク質、病原菌、毒素などと結合し、それらの吸収を抑制することが報告されている。
【0023】
本発明のＩｇＡの可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進するための剤は、ラフィノースを有効成分として含有する。ラフィノース（Ｇａｌａｃｔｏｓｅ α（１→６）Ｇｕｌｃｏｓｅ α（１→２）β Ｆｒｕｃｔｏｓｅ）は、ビフィズス菌・乳酸桿菌に資化される三糖（Ｇａｌ－Ｇｌｃ－Ｆｒｕ）であり、大豆やビートをはじめ植物界に広く分布している。
【0024】
本発明の剤の投与剤型は任意であり、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の経口用固形製剤（サプリメントを含む）、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤、注射剤などの非経口用液体製剤等に適宜調製することができる。また、適切なドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）を用いてもよい。また、医薬品又はサプリメント中に通常用いられる賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、崩壊剤、増粘剤、保存剤、安定化剤、ｐＨ調整剤等を添加することができる。また、本剤の投与方法についても任意であり、ヒト又は非ヒト哺乳動物に対し、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮内投与、舌下投与、局所投与等、適宜選択され得る。なお、上記については、後述の腸管免疫増強剤、粘膜免疫増強剤及び免疫制御剤においても同様である。
【0025】
本発明の剤の投与量及び投与間隔は、投与対象の年齢、体重、適応症状等によって適宜設定することができ、例えば、１日に１～３回投与であってもよいが、これに制限されるものではなく、また、食事中投与、食後投与、食前投与、食間投与、就寝前投与等のいずれも可能である。なお、上記については、後述の腸管免疫増強剤、粘膜免疫増強剤及び免疫制御剤においても同様である。
【0026】
本発明の剤を飲食品又は飼料に用いてもよい。この場合、顆粒状、粒状、ペースト状、ゲル状、固形状、液体状等の状態で用いることができる。また、飲食品中又は飼料中に含有させることが認められている賦形剤、結合剤、崩壊剤、増粘剤、分散剤、再吸収促進剤、矯味剤、緩衝剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、ｐＨ調製剤等を適宜含有させることができる。なお、上記については、後述の腸管免疫増強剤、粘膜免疫増強剤及び免疫制御剤においても同様である。
【0027】
本発明の剤を飲食品に用いる場合、摂取量及び摂取間隔は、摂取対象の年齢、体重、適応症状等によって適宜設定することができ、例えば、１日に１～３回摂取であってもよいが、これに制限されるものではない。また、例えば、腸管免疫増強、粘膜免疫増強等をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した飲食品、機能性食品、病者用食品、特定保健用食品等に応用することができる。なお、上記については、後述の腸管免疫増強剤、粘膜免疫増強剤及び免疫制御剤においても同様である。
【0028】
本発明の剤を飼料に用いる場合、例えば、哺乳類、鳥類、魚類等の産業動物及び伴侶動物に対する飼料・餌料、ペットフード、ペット用サプリメント等に使用することができる。なお、上記については、後述の腸管免疫増強剤、粘膜免疫増強剤及び免疫制御剤においても同様である。
【0029】
本発明による剤は、ＩｇＡの可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進するため、結合できる未消化のタンパク質、病原菌、毒素などの種類を増やし、それに伴い、予防又は改善できる疾患（例えば、免疫機能の低下に起因して起こる感染症、アレルギー性疾患、炎症性疾患等）の種類を増やすことができ、様々な疾患の予防又は治療効果を得ることができる。本発明による剤は、ＩｇＡの可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進することに意義を有する、すべての用途に用いることができる。
【0030】
なお、本明細書において、疾患の「予防」には、該疾患の発症を抑制する又は遅延させ、またその再発を抑制することが含まれ、疾患の「治療」には、該疾患を完全に治療することの他、症状を緩和し、またその進行を抑制することも含まれる。
【0031】
なお、本発明には、ラフィノースを有効成分とする、ＩｇＡ抗体の抗原結合の多様性を促進するための剤も包含される。ラフィノースによって、ＩｇＡの可変領域のアミノ酸配列の多様性が促進されることで、細菌・ウイルス抗原、自己抗原、食物抗原など多様な抗原に対するＩｇＡ抗体の結合が促進される。ラフィノースによってＩｇＡ抗体の抗原結合の多様性が促進されることで、体内に侵入してきた多様な物質に対して結合・排出が可能となることから、本発明の剤によって幅広い抗原や病原体による疾患、症状等を予防又は治療することができる。
【0032】
（２．腸管免疫増強剤）
本発明の腸管免疫増強剤は、ラフィノースを有効成分とする。
本発明の腸管免疫増強剤は、ラフィノースを有効成分とする。
【0033】
本発明の腸管免疫増強剤は、ラフィノースを有効成分として含有することで、腸管分泌型ＩｇＡの可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進する。このため、腸管分泌型ＩｇＡが幅広い種類の未消化のタンパク質、病原菌、毒素などと結合できるようになり、それらの吸収を抑制することで、腸管免疫を増強させることができる。その結果、腸管免疫機能の低下に起因して起こる感染症、アレルギー性疾患、炎症性疾患等、様々な疾患、症状等への予防又は治療効果を得ることができる。また、これら以外にも、腸管分泌型ＩｇＡの可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進することに意義を有する、すべての用途に用いることができる。
【0034】
（３．粘膜免疫増強剤）
本発明の粘膜免疫増強剤は、ラフィノースを有効成分とする。
本発明の粘膜免疫増強剤は、ラフィノースを有効成分とする。
【0035】
本発明の粘膜免疫増強剤は、ラフィノースを有効成分として含有することで、眼、鼻、喉、消化管等の外界と接する粘膜組織に分泌される分泌型ＩｇＡ（ｓＩｇＡ）の可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進する。このため、ｓＩｇＡが幅広い種類の未消化のタンパク質、病原菌、毒素などと結合できるようになり、それらの吸収を抑制することで、粘膜免疫を増強させることができる。その結果、免疫機能の低下に起因して起こる感染症、アレルギー性疾患、炎症性疾患等、様々な疾患、症状等への予防又は治療効果を得ることができる。また、これら以外にも、ｓＩｇＡの可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進することに意義を有する、すべての用途に用いることができる。
【0036】
（４．免疫制御剤）
本発明の免疫制御剤は、ラフィノースを有効成分とする。
本発明の免疫制御剤は、ラフィノースを有効成分とする。
【0037】
本発明の免疫制御剤は、ラフィノースを有効成分として含有することで、免疫制御に関わる因子（例えば、ＴＧＦ－β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－β：免疫抑制性又は抗炎症性サイトカイン）、Ｆｏｘｐ３（ｆｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ Ｐ３：制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のマスター転写因子）等）の発現を増強し、例えば、自己免疫疾患（ベーチェット病、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、クローン病、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性動脈周囲炎、大動脈炎症候群、悪性関節リウマチ、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、ウェゲナー肉芽腫症、混合性結合組織病、シェーグレン症候群、成人スティル病、アレルギー性肉芽腫性血管炎、過敏性血管炎、コーガン症候群、ＲＳ３ＰＥ、側頭動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、線維筋痛症、抗リン脂質抗体症候群、好酸球性筋膜炎、ＩｇＧ４関連疾患、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、慢性萎縮性胃炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、大動脈炎症候群、グッドパスチャー症候群、急速進行性糸球体腎炎、巨赤芽球性貧血、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性好中球減少症、特発性血小板減少性紫斑病、バセドウ病、橋本病、自己免疫性副腎機能不全、原発性甲状腺機能低下症、特発性アジソン病、Ｉ型糖尿病、緩徐進行性Ｉ型糖尿病、慢性円板状エリテマトーデス、限局性強皮症、乾癬、乾癬性関節炎、天疱瘡、類天疱瘡、妊娠性疱疹、線状ＩｇＡ水疱性皮膚症、後天性表皮水疱症、円形脱毛症、白斑、尋常性白斑、アトピー性皮膚炎、視神経脊髄炎、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、サルコイドーシス、水疱性類天疱瘡、巨細胞性動脈炎、筋委縮性側索硬化症、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、原田病、自己免疫性視神経症、特発性無精子症、習慣性流産、炎症性腸疾患、セリアック病等）、移植片対宿主病、重症薬疹等、様々な免疫系疾患に対して予防又は治療効果を得ることができる。
【実施例0038】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0039】
以下の実施例では、特段の記載のない限り、百分率（％）は質量％を示す。また、固形分濃度は、試料に含まれる可溶性固形分の含有量を表す。
【0040】
（実施例１）
（試験方法）
抗カゼイン高応答系統の４週齢のＤＢＡ／２雌性マウス（日本ＳＬＣ）を対照群（ｎ＝８）及びラフィノース群（ｎ＝８）の２群に分け、対照群には、一般的な精製飼料であるＡＩＮ－９３Ｇを基本として精製した飼料（コントロール飼料）を与えた。一方で、ラフィノース群には、コントロール飼料中のコーンスターチを、ラフィノース含量が５％（ｗ／ｗ）となるようにラフィノース（Ｇａｌａｃｔｏｓｅ α（１→６）Ｇｕｌｃｏｓｅ α（１→２）β Ｆｒｕｃｔｏｓｅ：日本甜菜製糖株式会社）へ置き換えた飼料を与えた。飼育開始から１０週間後に解剖を実施し、小腸（回腸部分）、小腸（パイエル板を含む）、盲腸及び脾臓を採取した。
（試験方法）
抗カゼイン高応答系統の４週齢のＤＢＡ／２雌性マウス（日本ＳＬＣ）を対照群（ｎ＝８）及びラフィノース群（ｎ＝８）の２群に分け、対照群には、一般的な精製飼料であるＡＩＮ－９３Ｇを基本として精製した飼料（コントロール飼料）を与えた。一方で、ラフィノース群には、コントロール飼料中のコーンスターチを、ラフィノース含量が５％（ｗ／ｗ）となるようにラフィノース（Ｇａｌａｃｔｏｓｅ α（１→６）Ｇｕｌｃｏｓｅ α（１→２）β Ｆｒｕｃｔｏｓｅ：日本甜菜製糖株式会社）へ置き換えた飼料を与えた。飼育開始から１０週間後に解剖を実施し、小腸（回腸部分）、小腸（パイエル板を含む）、盲腸及び脾臓を採取した。
【0041】
（採取した組織からのｔｏｔａｌ ＲＮＡ抽出）
対照群及びラフィノース群から各々摘出した組織（小腸、脾臓、パイエル板及び盲腸）からのＲＮＡ抽出を行った。採取した組織を１．５ｍＬチューブに移し、ＴＲＩｚｏｌを１ｍＬ添加した後、バイオマッシャーを用いて組織を破砕した。その破砕液４００μＬを新しい１．５ｍＬチューブに移し、ここにクロロホルムを８０μＬ添加した後、ｖｏｒｔｅｘで１０秒間攪拌することで溶液をホモジナイズした。室温で５分間静置した後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１５分間、４℃）を行った。中間層のタンパク質及び下層を混入させないように、上層１６０μＬを採取し、新しい１．５ｍＬチューブに移した。ここにイソプロパノールを２００μＬ加え、ｖｏｒｔｅｘで５秒間攪拌し、室温で１０分間静置した後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）を行った。上清をデカンテーションにより除去した後、７５％エタノールを４００μＬ添加し、３～４回転倒混和した。遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）し、上清を除去した後、室温で数分間風乾した。ＤＥＰＣ処理水を１６μＬ添加し、沈殿を溶解して得られた溶液をｔｏｔａｌ ＲＮＡ溶液とした。その後、ＮＡＮＯ ＤＲＯＰ ２０００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ溶液中のＲＮＡ濃度及び純度（Ａ２６０／Ａ２８０）を測定した。このｔｏｔａｌ ＲＮＡ溶液１μＬを用いて１％アガロースゲル電気泳動を行い、１８Ｓ及び２８Ｓ ｒＲＮＡの存在を確認した（図示せず）。
対照群及びラフィノース群から各々摘出した組織（小腸、脾臓、パイエル板及び盲腸）からのＲＮＡ抽出を行った。採取した組織を１．５ｍＬチューブに移し、ＴＲＩｚｏｌを１ｍＬ添加した後、バイオマッシャーを用いて組織を破砕した。その破砕液４００μＬを新しい１．５ｍＬチューブに移し、ここにクロロホルムを８０μＬ添加した後、ｖｏｒｔｅｘで１０秒間攪拌することで溶液をホモジナイズした。室温で５分間静置した後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１５分間、４℃）を行った。中間層のタンパク質及び下層を混入させないように、上層１６０μＬを採取し、新しい１．５ｍＬチューブに移した。ここにイソプロパノールを２００μＬ加え、ｖｏｒｔｅｘで５秒間攪拌し、室温で１０分間静置した後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）を行った。上清をデカンテーションにより除去した後、７５％エタノールを４００μＬ添加し、３～４回転倒混和した。遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）し、上清を除去した後、室温で数分間風乾した。ＤＥＰＣ処理水を１６μＬ添加し、沈殿を溶解して得られた溶液をｔｏｔａｌ ＲＮＡ溶液とした。その後、ＮＡＮＯ ＤＲＯＰ ２０００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ溶液中のＲＮＡ濃度及び純度（Ａ２６０／Ａ２８０）を測定した。このｔｏｔａｌ ＲＮＡ溶液１μＬを用いて１％アガロースゲル電気泳動を行い、１８Ｓ及び２８Ｓ ｒＲＮＡの存在を確認した（図示せず）。
【0042】
（ＤＮａｓｅ処理によるゲノムＤＮＡの除去）
Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ １～４μｇに、１０×ＤＮａｓｅＩ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１．７５μＬ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮａｓｅＩ（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｇｒａｄｅ、１Ｕ／μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１．７５μＬ及びＤＥＰＣ処理水を添加した。ＤＥＰＣ処理水を、溶液の液量が１７．５μＬになるように加えた。この溶液を室温で１５分間静置した後、２５ｍＭ ＥＤＴＡを１．７５μＬ添加し、６５℃で１０分間加温した。
Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ １～４μｇに、１０×ＤＮａｓｅＩ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１．７５μＬ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮａｓｅＩ（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｇｒａｄｅ、１Ｕ／μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１．７５μＬ及びＤＥＰＣ処理水を添加した。ＤＥＰＣ処理水を、溶液の液量が１７．５μＬになるように加えた。この溶液を室温で１５分間静置した後、２５ｍＭ ＥＤＴＡを１．７５μＬ添加し、６５℃で１０分間加温した。
【0043】
（逆転写反応：ＲＴ）
ＲＴ（＋）、ＲＴ（－）ともに、ＤＮａｓｅ処理済みＴｏｔａｌ ＲＮＡ １１μＬ（ＲＮＡ量が全個体で等しくなるようにＤＥＰＣ処理水で希釈）にＯｌｉｇｏ（ｄＴ）１２－１８ Ｐｒｉｍｅｒ（０．５μｇ／μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１μＬ添加し、７０℃で１０分間静置した後、氷上で３分間静置した。５×Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を４μＬ、０．１Ｍ ＤＴＴを２μＬ、１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ Ｍｉｘ（ＴａＫａＲａ）を１μＬ加え混合し、ＲＴ（＋）には Ｓｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１μＬ、ＲＴ（－）にはＤＥＰＣ処理水を１μＬ添加した後、４２℃で５０分間静置した。その後、７０℃で１５分間静置し、得られた溶液をｃＤＮＡプールとした。
ＲＴ（＋）、ＲＴ（－）ともに、ＤＮａｓｅ処理済みＴｏｔａｌ ＲＮＡ １１μＬ（ＲＮＡ量が全個体で等しくなるようにＤＥＰＣ処理水で希釈）にＯｌｉｇｏ（ｄＴ）１２－１８ Ｐｒｉｍｅｒ（０．５μｇ／μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１μＬ添加し、７０℃で１０分間静置した後、氷上で３分間静置した。５×Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を４μＬ、０．１Ｍ ＤＴＴを２μＬ、１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ Ｍｉｘ（ＴａＫａＲａ）を１μＬ加え混合し、ＲＴ（＋）には Ｓｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１μＬ、ＲＴ（－）にはＤＥＰＣ処理水を１μＬ添加した後、４２℃で５０分間静置した。その後、７０℃で１５分間静置し、得られた溶液をｃＤＮＡプールとした。
【0044】
（ＩｇＡ可変領域ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅及びＮＧＳ解析）
（プライマーの設計）
上記で得られた各ｃＤＮＡプールを用いて、ＩｇＡ可変領域（ＶＨ領域からＣα領域）をＰＣＲにより増幅及びアガロースゲル電気泳動によって確認するため、以下に示したプライマーを作成した。ＩｇＡのＨ鎖の定常領域（Ｃα）とＶ遺伝子領域（ＶＨ）とに相補的なプライマーを用いた（Ｌｉｎｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。なお、両プライマーともに、次世代シーケンサーを用いた解析を行うために、プライマーの５’末端側に 次世代シークエンサーＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ用のオーバーハング配列を付加した。
・Ｆｏｒｗａｒｄ（定常領域（Ｃα））
５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＡＧＣＴＣＧＴＧＧＧＡＧＴＧＴＣＡＧＴＧ－３’（配列番号１）
（Ｆｏｒｗａｒｄオーバーハング配列：（５’側から）「ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ」）
・Ｒｅｖｅｒｓｅ（マウスに固有のすべてのＶＨ遺伝子、ＶＨ遺伝子の５’保存領域）
５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧ－３’（配列番号２）
（Ｒｅｖｅｒｓｅオーバーハング配列：（５’側から）「ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ」）
（プライマーの設計）
上記で得られた各ｃＤＮＡプールを用いて、ＩｇＡ可変領域（ＶＨ領域からＣα領域）をＰＣＲにより増幅及びアガロースゲル電気泳動によって確認するため、以下に示したプライマーを作成した。ＩｇＡのＨ鎖の定常領域（Ｃα）とＶ遺伝子領域（ＶＨ）とに相補的なプライマーを用いた（Ｌｉｎｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。なお、両プライマーともに、次世代シーケンサーを用いた解析を行うために、プライマーの５’末端側に 次世代シークエンサーＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ用のオーバーハング配列を付加した。
・Ｆｏｒｗａｒｄ（定常領域（Ｃα））
５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＡＧＣＴＣＧＴＧＧＧＡＧＴＧＴＣＡＧＴＧ－３’（配列番号１）
（Ｆｏｒｗａｒｄオーバーハング配列：（５’側から）「ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ」）
・Ｒｅｖｅｒｓｅ（マウスに固有のすべてのＶＨ遺伝子、ＶＨ遺伝子の５’保存領域）
５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧ－３’（配列番号２）
（Ｒｅｖｅｒｓｅオーバーハング配列：（５’側から）「ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ」）
【0045】
上記で得られた各ｃＤＮＡプールを鋳型として、上記のプライマーを用いてＰＣＲを行った。反応条件は以下のとおりである。
ｃＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ ５μＬ
１０×Ｅｘ Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ ４μＬ
ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ ０．２５μＬ
１０μＭ Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ３μＬ
１０μＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ３μＬ
ＳＱ ２９．７５μＬ
Ｔｏｔａｌ ５０μＬ
９６℃、２分→（９５℃、１０秒→５８℃、３０秒→７２℃、１分）×３５サイクル→４℃、時間無制限（∞）
ｃＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ ５μＬ
１０×Ｅｘ Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ ４μＬ
ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ ０．２５μＬ
１０μＭ Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ３μＬ
１０μＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ３μＬ
ＳＱ ２９．７５μＬ
Ｔｏｔａｌ ５０μＬ
９６℃、２分→（９５℃、１０秒→５８℃、３０秒→７２℃、１分）×３５サイクル→４℃、時間無制限（∞）
【0046】
（アンプリコンＰＣＲ：ＩｇＡ可変領域のｃＤＮＡの増幅（アンプリコンの調製））
前述で得られた各組織由来のｃＤＮＡプール及び次世代シークエンサーＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ用のオーバーハング配列を付加したプライマーを用いて、ＩｇＡ可変領域（ＶＨ領域から定常領域（Ｃα）領域）をＰＣＲにより増幅した。
前述で得られた各組織由来のｃＤＮＡプール及び次世代シークエンサーＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ用のオーバーハング配列を付加したプライマーを用いて、ＩｇＡ可変領域（ＶＨ領域から定常領域（Ｃα）領域）をＰＣＲにより増幅した。
【0047】
各組織由来のｃＤＮＡの一定量（３μＬ）を鋳型に、ＤＮＡポリメラーゼであるＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いてマウスＩｇＡ重鎖の可変領域のｃＤＮＡを増幅した。
【0048】
（アガロースゲル電気泳動によるＰＣＲ増幅産物の確認及びＤＮＡ量の推定）
電気泳動後の各サンプルのバンド強度をＩｍａｇｅ Ｊにより定量し、１００ ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｇｇｅｒ（ＢｉｏＬａｂｓ）中の５００ｂｐのバンドとバンド強度比較を行い、各サンプル１μＬ中のＤＮＡ量を概算した。この数値を用いて、後述する測定サンプルの混合を行った。
電気泳動後の各サンプルのバンド強度をＩｍａｇｅ Ｊにより定量し、１００ ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｇｇｅｒ（ＢｉｏＬａｂｓ）中の５００ｂｐのバンドとバンド強度比較を行い、各サンプル１μＬ中のＤＮＡ量を概算した。この数値を用いて、後述する測定サンプルの混合を行った。
【0049】
（ＰＣＲ産物の精製（ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ＵＰ １））
前述のとおり増幅した各組織由来のｃＤＮＡについて、磁気ビーズＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ｂｅａｄｓ（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ）を用いてプライマー及び塩類を除去し、ＰＣＲで得られた増幅ＤＮＡ（アンプリコン）の精製を行った。精製したＤＮＡ溶液を次のインデックスＰＣＲの鋳型として用いた。
前述のとおり増幅した各組織由来のｃＤＮＡについて、磁気ビーズＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ｂｅａｄｓ（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ）を用いてプライマー及び塩類を除去し、ＰＣＲで得られた増幅ＤＮＡ（アンプリコン）の精製を行った。精製したＤＮＡ溶液を次のインデックスＰＣＲの鋳型として用いた。
【0050】
Ａｍｐｌｉｃｏｎ ＰＣＲ産物２５μＬが入った９６穴ＰＣＲプレートの各ウェルに、３０分室温に戻した磁気ビーズＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ｂｅａｄｓを２５μＬずつ添加し、ピペッティングにより穏やかに懸濁した。室温で５分間静置した後、９６穴ＰＣＲプレートをマグネティックスタンド（９６Ｓ Ｓｕｐｅｒ Ｍａｇｎｅｔ Ｐｌａｔｅ、ＡＬＰＡＱＵＡ）にセットし、上清が透明になるまで静置した。上清を除去した後の各ウェルに８０％エタノールを２００μＬ加え、マグネティックスタンド上で３０秒間静置し、上清を除去した。再度８０％エタノールを２００μＬ加え、マグネティックスタンド上で３０秒間静置し、上清を除去した。Ｐ２０マイクロピペットで残存しているエタノールを完全に除去し、マグネティックスタンド上で、１０分間風乾した。９６穴ＰＣＲプレートをマグネティックスタンドから外し、各ウェルにＴｒｉｓ緩衝液ＥＤＴＡ（ＴＥ）を５２．５μＬ加えた後、穏やかにピペッティングし、磁気ビーズを完全に再懸濁させた。室温で２分間静置した後、９６穴ＰＣＲプレートをマグネティックスタンドにセットし、上清が透明になるまで静置した。上清を５０μＬ回収し、このＤＮＡ溶液をＩｎｄｅｘ ＰＣＲの鋳型として用いた。
【0051】
（インデックスＰＣＲプライマー）
上記オーバーハング配列の５’側に個体・組織識別用のインデックス配列を付加したインデックスＰＣＲプライマーを合成した。
・インデックスＰＣＲプライマー（Ｉｎｄｅｘ １）
５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ（配列番号３）－Ｉｎｄｅｘ１－Ｒｅｖｅｒｓｅオーバーハング配列－３’
・インデックスＰＣＲプライマー（Ｉｎｄｅｘ ２）
５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ（配列番号４）－Ｉｎｄｅｘ２－Ｆｏｒｗａｒｄオーバーハング配列－３’
上記オーバーハング配列の５’側に個体・組織識別用のインデックス配列を付加したインデックスＰＣＲプライマーを合成した。
・インデックスＰＣＲプライマー（Ｉｎｄｅｘ １）
５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ（配列番号３）－Ｉｎｄｅｘ１－Ｒｅｖｅｒｓｅオーバーハング配列－３’
・インデックスＰＣＲプライマー（Ｉｎｄｅｘ ２）
５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ（配列番号４）－Ｉｎｄｅｘ２－Ｆｏｒｗａｒｄオーバーハング配列－３’
【0052】
（インデックスＰＣＲ：インデックスタグを付加したアンプリコンの調製）
前述のとおり精製したアンプリコンＰＣＲ産物を鋳型に、ＤＮＡポリメラーゼであるＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いて、以下の反応液組成及び反応条件でインデックスＰＣＲを行った。
前述のとおり精製したアンプリコンＰＣＲ産物を鋳型に、ＤＮＡポリメラーゼであるＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いて、以下の反応液組成及び反応条件でインデックスＰＣＲを行った。
【0053】
（ＰＣＲ産物の精製（ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ＵＰ ２））
前述のＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ＵＰ １と同様、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ｂｅａｄｓを用いて、インデックスＰＣＲで得られたＰＣＲ産物の精製を行った。
前述のＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ＵＰ １と同様、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ｂｅａｄｓを用いて、インデックスＰＣＲで得られたＰＣＲ産物の精製を行った。
【0054】
精製操作は、ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ＵＰ １と同様に行ったが、ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ＵＰ ２では、インデックスＰＣＲ産物５０μＬに対し、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ｂｅａｄｓを５６μＬ加えた。また、ビーズからのＤＮＡ溶出の際には、ＴＥを２７．５μＬ加え、２５μＬのＤＮＡ溶液を回収した。
【0055】
（次世代シーケンサー（ＮＧＳ）解析用サンプルの調製）
マウス各個体（２群、ｎ＝８／群）の小腸組織由来及び盲腸組織由来のｃＤＮＡから調製したインデックスタグ付きアンプリコンＤＮＡサンプルを１つのチューブに、脾臓組織由来及びパイエル板由来のｃＤＮＡから調製したインデックスタグ付きアンプリコンＤＮＡサンプルを別の１つのチューブに混合し、２サンプルとした。１サンプル（１チューブ）に含まれるＤＮＡは、２群×８個体×４組織＝６４アンプリコンとなる。ここに、別の研究での３２アンプリコンを相乗りさせて、合わせて９６アンプリコンとして２サンプル（１０万リードペア／サンプル）とした。なお、アンプリコンＰＣＲ後にバンド強度から概算した各サンプル１μＬ中のＤＮＡ量をもとに、各サンプル中ＤＮＡ量が１０ｎｇとなるように混合した。
マウス各個体（２群、ｎ＝８／群）の小腸組織由来及び盲腸組織由来のｃＤＮＡから調製したインデックスタグ付きアンプリコンＤＮＡサンプルを１つのチューブに、脾臓組織由来及びパイエル板由来のｃＤＮＡから調製したインデックスタグ付きアンプリコンＤＮＡサンプルを別の１つのチューブに混合し、２サンプルとした。１サンプル（１チューブ）に含まれるＤＮＡは、２群×８個体×４組織＝６４アンプリコンとなる。ここに、別の研究での３２アンプリコンを相乗りさせて、合わせて９６アンプリコンとして２サンプル（１０万リードペア／サンプル）とした。なお、アンプリコンＰＣＲ後にバンド強度から概算した各サンプル１μＬ中のＤＮＡ量をもとに、各サンプル中ＤＮＡ量が１０ｎｇとなるように混合した。
【0056】
（次世代シークエンサー（ＮＧＳ）による塩基配列解析）
次世代シークエンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ３００ＰＥ）による塩基配列解析は、外部委託（北海道システム・サイエンス株式会社）により行った。Ａｇｉｌｅｎｔ ２２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍによってアンプリコンの濃度測定・品質の確認を行った後、次世代シーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ３００ＰＥ）を使用して、以下の条件でシークエンス解析を行った。
解析方法：Ｐａｉｒｅｄ ｅｎｄ
読み取り塩基長：３００塩基／リード
取得リード数：２０万リードペア／２サンプル
平均取得リード数：１０万リードペア（２０万リード）
次世代シークエンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ３００ＰＥ）による塩基配列解析は、外部委託（北海道システム・サイエンス株式会社）により行った。Ａｇｉｌｅｎｔ ２２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍによってアンプリコンの濃度測定・品質の確認を行った後、次世代シーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ３００ＰＥ）を使用して、以下の条件でシークエンス解析を行った。
解析方法：Ｐａｉｒｅｄ ｅｎｄ
読み取り塩基長：３００塩基／リード
取得リード数：２０万リードペア／２サンプル
平均取得リード数：１０万リードペア（２０万リード）
【0057】
１サンプル（チューブ）には、インデックスタグを付した、４８検体由来のアンプリコンが含まれており、平均取得リード数を１０万リードペアとすると、１検体あたり約２０００リードペア程度の塩基配列が得られることが想定された。
【0058】
（ＩｇＡ重鎖可変領域（ＶＤＪ領域）塩基配列のレパートリー解析）
次世代シーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ３００ＰＥ）によるＰａｉｒｅｄ－ｅｎｄシーケンシングで得られた個体・組織ごとのＩｇＡ重鎖可変領域の塩基配列データ（ＦＡＳＴｑ ｆｉｌｅ）をウェブサーバー上で公開されている免疫グロブリン配列解析パイプラインＡＳＡＰ（Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１８ Ｊｕｌ ３０；９：１６８６．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１８．０１６８６．ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ２０１８．）を用いて以下の項目のデータを得た。
（１）マウス個体ごとのＶＤＪ領域の塩基配列とリード数（総リード数）
（２）ＣＤＲ３ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅａｄ ｃｏｕｎｔｓ：ＶＤＪの各遺伝子断片の連結部近傍で超可変領域の一つで、抗原結合における相補性を決定する領域３（相補性決定部位３：ＣＤＲ３）について、この領域の塩基配列から翻訳したアミノ酸配列とそれぞれのリードカウント
（３）ＩＧＨ ｓｏｍａｔｉｃ ｈｙｐｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：ＶＤＪ領域に見られる体細胞変異（生殖細胞系列との塩基配列の違い）のリードごとの数（変異塩基の総数を総リード数で除した値）
（４）ＩＧＨ Ｖ－Ｊ ｕｓａｇｅ：可変領域に動員されているＶＤＪ遺伝子断片の種類（属するファミリーの種類）
次世代シーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ３００ＰＥ）によるＰａｉｒｅｄ－ｅｎｄシーケンシングで得られた個体・組織ごとのＩｇＡ重鎖可変領域の塩基配列データ（ＦＡＳＴｑ ｆｉｌｅ）をウェブサーバー上で公開されている免疫グロブリン配列解析パイプラインＡＳＡＰ（Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１８ Ｊｕｌ ３０；９：１６８６．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１８．０１６８６．ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ２０１８．）を用いて以下の項目のデータを得た。
（１）マウス個体ごとのＶＤＪ領域の塩基配列とリード数（総リード数）
（２）ＣＤＲ３ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅａｄ ｃｏｕｎｔｓ：ＶＤＪの各遺伝子断片の連結部近傍で超可変領域の一つで、抗原結合における相補性を決定する領域３（相補性決定部位３：ＣＤＲ３）について、この領域の塩基配列から翻訳したアミノ酸配列とそれぞれのリードカウント
（３）ＩＧＨ ｓｏｍａｔｉｃ ｈｙｐｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：ＶＤＪ領域に見られる体細胞変異（生殖細胞系列との塩基配列の違い）のリードごとの数（変異塩基の総数を総リード数で除した値）
（４）ＩＧＨ Ｖ－Ｊ ｕｓａｇｅ：可変領域に動員されているＶＤＪ遺伝子断片の種類（属するファミリーの種類）
【0059】
前述のとおり次世代シーケンサーにより得られたデータを評価及び描出した。対照群とラフィノース群の２群間の統計的有意性を、マンホイットニーＵ検定（ウィルコクソン符号順位検定）及びＴ検定を使用して評価した。ボックスウィスカープロットでは、ボックスは２５パーセンタイルから７５パーセンタイルまで伸び、５０パーセンタイルが内部に描画された。
【0060】
（結果）
結果を図１～図３に示す。図１において、縦軸はリードカウント（同じＣＤＲ３を持つｒｅａｄの数）、横軸はＩｇＡ重鎖のＶＤＪ遺伝子の連結部であるＣＤＲ３配列の数（種類）を表す。また、図２において、縦軸は、重鎖のＣＤＲ３の種数を総リード数で除した値を表す。さらに、図３において、縦軸はＶＤＪ領域の変異塩基数（単位リード当たりの平均値）を表す。図１は、マウスの小腸（回腸部分）におけるリードカウント及びＣＤＲ３配列の数を示す。ラフィノース群（図１（ｂ））では、リード数が少ない配列が多く存在しており、対照群（図１（ａ））に比して配列の種類の数が顕著に多く（８個体中６個体で２００種類以上）、ＣＤＲ３の配列の多様化が促進されたことが示された。図２は、組織間で統計的に比較解析するために、上記の小腸（回腸部分）に加え、小腸（パイエル板を含む部分）、盲腸及び脾臓におけるＣＤＲ３の種数を総リード数で除した値として示す。その値は、小腸（回腸部）及び小腸（パイエル板を含む部位）のいずれにおいても危険率０．０１以下で、さらに脾臓においても危険率０．０５以下で、ラフィノース群が対照群に比べて有意に高かった。一方、盲腸においては、Ｔ検定では危険率０．０５以下で有意に高いが、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定では有意差はなかった。以上の結果から、ラフィノース群においてＣＤＲ３の配列の多様化が促進されたことが示された。図３は、上記の４つの組織についてＶＤＪ領域の変異塩基数（単位リード当たりの平均値）を２群間で比較した結果を示す。Ｔ検定では、盲腸以外の３つの組織において危険率０．０５あるいは０．０１以下で、ラフィノース群で有意に高いことが示された。一方、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定では、小腸（回腸）において危険率０．０１以下で、ラフィノース群で有意に高いことが示された。以上の結果から、小腸及び脾臓では、ラフィノース群においてＶＤＪ領域での体細胞突然変異（ＳＨＭ）の頻度が有意に高く、ＣＤＲ３配列での多様性に加えて、ＶＤＪ領域での配列の多様化も促進されたことが示された。これらの２つの異なる領域での多様性の増加は、その組合せの数を考慮すると相乗的な増加効果を示すものと考えられる。
結果を図１～図３に示す。図１において、縦軸はリードカウント（同じＣＤＲ３を持つｒｅａｄの数）、横軸はＩｇＡ重鎖のＶＤＪ遺伝子の連結部であるＣＤＲ３配列の数（種類）を表す。また、図２において、縦軸は、重鎖のＣＤＲ３の種数を総リード数で除した値を表す。さらに、図３において、縦軸はＶＤＪ領域の変異塩基数（単位リード当たりの平均値）を表す。図１は、マウスの小腸（回腸部分）におけるリードカウント及びＣＤＲ３配列の数を示す。ラフィノース群（図１（ｂ））では、リード数が少ない配列が多く存在しており、対照群（図１（ａ））に比して配列の種類の数が顕著に多く（８個体中６個体で２００種類以上）、ＣＤＲ３の配列の多様化が促進されたことが示された。図２は、組織間で統計的に比較解析するために、上記の小腸（回腸部分）に加え、小腸（パイエル板を含む部分）、盲腸及び脾臓におけるＣＤＲ３の種数を総リード数で除した値として示す。その値は、小腸（回腸部）及び小腸（パイエル板を含む部位）のいずれにおいても危険率０．０１以下で、さらに脾臓においても危険率０．０５以下で、ラフィノース群が対照群に比べて有意に高かった。一方、盲腸においては、Ｔ検定では危険率０．０５以下で有意に高いが、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定では有意差はなかった。以上の結果から、ラフィノース群においてＣＤＲ３の配列の多様化が促進されたことが示された。図３は、上記の４つの組織についてＶＤＪ領域の変異塩基数（単位リード当たりの平均値）を２群間で比較した結果を示す。Ｔ検定では、盲腸以外の３つの組織において危険率０．０５あるいは０．０１以下で、ラフィノース群で有意に高いことが示された。一方、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定では、小腸（回腸）において危険率０．０１以下で、ラフィノース群で有意に高いことが示された。以上の結果から、小腸及び脾臓では、ラフィノース群においてＶＤＪ領域での体細胞突然変異（ＳＨＭ）の頻度が有意に高く、ＣＤＲ３配列での多様性に加えて、ＶＤＪ領域での配列の多様化も促進されたことが示された。これらの２つの異なる領域での多様性の増加は、その組合せの数を考慮すると相乗的な増加効果を示すものと考えられる。
【0061】
以上より、ラフィノースを摂取することで、各組織（特に腸管）におけるＩｇＡの可変領域のアミノ酸配列の多様性が促進されることが示された。ＩｇＡの可変領域のアミノ酸配列の多様性が促進されることで、体内に侵入してきた多様な物質に対して結合・排出が可能となることから、幅広い抗原や病原体による疾患、症状等を予防又は治療することができる。
【0062】
（実施例２）
ラフィノースを摂取したマウスにおいて、腸管に分泌されたＩｇＡ抗体の抗原結合の多様性が促進されるかについて、ＥＬＩＳＡにより検証した。
ラフィノースを摂取したマウスにおいて、腸管に分泌されたＩｇＡ抗体の抗原結合の多様性が促進されるかについて、ＥＬＩＳＡにより検証した。
【0063】
実施例１の対照群及びラフィノース群において、飼育開始から１０週間後のマウス糞便を採取し、以下の試験に用いた。
【0064】
（マウス糞便からの水溶性タンパク質画分（ＩｇＡを含む）の抽出）
マウスの新鮮糞便又は凍結保存したマウス糞便０．０１ｇ程度を秤量した後、１．５ｍＬマイクロチューブ（Ｂｉｏ Ｍａｓｈｅｒ（登録商標）ＩＩ）に移し、そこに抽出ｂｕｆｆｅｒ（組成については後述）を、糞便０．０１ｇ／抽出ｂｕｆｆｅｒ １００μＬとなるように添加した。ペッスル（Ｂｉｏ Ｍａｓｈｅｒ（登録商標）ＩＩ）を用いて糞便を分散させ懸濁させたた後、ＴＡＩＴＥＣ ＲＯＴＡＴＯＲを用いて、４℃で一晩回転混和した。遠心分離（２０，０００×ｇ，１０ｍｉｎ，４℃）した後、上清を新しい１．５ｍＬマイクロチューブに移し、ＤＩＳＭＩＣ ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ ＡＣＥＴＡＴＥ（ＰＯＲＥ ＳＩＺＥ ０．４５μｍ，ＡＤＶＡＮＴＥＣ（登録商標））を用いてフィルター濾過を行った。その後、フィルターを２００μＬ １×ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）で洗浄する操作を２回行い、得られた溶液を水溶性画分抽出溶液とした。
※抽出ｂｕｆｆｅｒの組成（各プロテアーゼ阻害剤を１×ＰＢＳに溶解）
プロテアーゼ阻害剤 終濃度
バシトラシン ５０μｇ／ｍＬ
ベンズアミジン ３００μｇ／ｍＬ
ロイペプチン ８０μｇ／ｍＬ
キモスタチン ２０μｇ／ｍＬ
ペプスタチン ２５μｇ／ｍＬ
マウスの新鮮糞便又は凍結保存したマウス糞便０．０１ｇ程度を秤量した後、１．５ｍＬマイクロチューブ（Ｂｉｏ Ｍａｓｈｅｒ（登録商標）ＩＩ）に移し、そこに抽出ｂｕｆｆｅｒ（組成については後述）を、糞便０．０１ｇ／抽出ｂｕｆｆｅｒ １００μＬとなるように添加した。ペッスル（Ｂｉｏ Ｍａｓｈｅｒ（登録商標）ＩＩ）を用いて糞便を分散させ懸濁させたた後、ＴＡＩＴＥＣ ＲＯＴＡＴＯＲを用いて、４℃で一晩回転混和した。遠心分離（２０，０００×ｇ，１０ｍｉｎ，４℃）した後、上清を新しい１．５ｍＬマイクロチューブに移し、ＤＩＳＭＩＣ ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ ＡＣＥＴＡＴＥ（ＰＯＲＥ ＳＩＺＥ ０．４５μｍ，ＡＤＶＡＮＴＥＣ（登録商標））を用いてフィルター濾過を行った。その後、フィルターを２００μＬ １×ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）で洗浄する操作を２回行い、得られた溶液を水溶性画分抽出溶液とした。
※抽出ｂｕｆｆｅｒの組成（各プロテアーゼ阻害剤を１×ＰＢＳに溶解）
プロテアーゼ阻害剤 終濃度
バシトラシン ５０μｇ／ｍＬ
ベンズアミジン ３００μｇ／ｍＬ
ロイペプチン ８０μｇ／ｍＬ
キモスタチン ２０μｇ／ｍＬ
ペプスタチン ２５μｇ／ｍＬ
【0065】
（ＥＬＩＳＡ）
後述する自己抗原、細菌・ウイルス抗原、食物抗原など多様な抗原を用いて、それらに結合するＩｇＡ抗体を固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により相対定量した。
後述する自己抗原、細菌・ウイルス抗原、食物抗原など多様な抗原を用いて、それらに結合するＩｇＡ抗体を固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により相対定量した。
【0066】
一次抗体については、上記の方法で抽出した溶液をＩｇＡ含有溶液として用いた（ＰＢＳＴ（ＰＢＳ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で５倍希釈）（糞便単位重量当たりのＩｇＡ量に相当）。また、二次抗体として、１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで１００００倍に希釈したＰＯＤ－抗マウスＩｇＡ（Ｎｏｒｄｉｃ）を用いた。なお、ＰＯＤ基質（発色）液は、ｏ－フェニレンジアミンをｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（０．０５ Ｍ ｃｉｔｒａｔｅ，０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４，ｐＨ５．０）に２ｍｇ／５ｍＬの割合で溶解させた溶液に、終濃度０．００３％となるようＨ２Ｏ２を加えたものである。
【0067】
反応はすべて１００μＬの系で行った。抗原溶液（組成については後述）を９６穴プレート（ＮＵＮＣ）に加えた後、アルミホイルでプレートを覆い、４℃、一晩インキュベートした。抗原溶液を捨て、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。続いて１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎを加え、３７℃で６０分間インキュベートしてブロッキングを行った。ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで洗浄後、一次抗体を加え、３７℃、９０分間インキュベートした。同様に３回洗浄後、二次抗体を加え、３７℃で６０分間インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで３回洗浄後、１００μＬの発色液を加え、室温で９０分間インキュベートした後、２．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４ ２５μＬを加え、発色反応を停止させて、４９２ｎｍの吸光度を測定し、ＥＬＩＳＡ ｖａｌｕｅとした。
※抗原溶液の組成
・自己抗原
マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ＤＮＡ）
・細菌・ウイルス抗原
リポ多糖（ＬＰＳ）、鞭毛抗原（Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ、図４ではＦＬＡＧ）、乳酸菌菌体抗原（ＬＢ）、ノロウイルス粒子外殻抗原（ＮｏＶＬＰ、図４ではＶＬＰ）
・食餌抗原
牛乳カゼイン（ＣＮ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、大豆トリプシンインヒビター（ＳＢＴＩ）
・暴露経験のない抗原：貝のヘモシアニン（ＫＬＨ）
※抗原溶液の組成
・自己抗原
マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ＤＮＡ）
・細菌・ウイルス抗原
リポ多糖（ＬＰＳ）、鞭毛抗原（Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ、図４ではＦＬＡＧ）、乳酸菌菌体抗原（ＬＢ）、ノロウイルス粒子外殻抗原（ＮｏＶＬＰ、図４ではＶＬＰ）
・食餌抗原
牛乳カゼイン（ＣＮ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、大豆トリプシンインヒビター（ＳＢＴＩ）
・暴露経験のない抗原：貝のヘモシアニン（ＫＬＨ）
【0068】
（結果）
結果を図４に示す。図４において、抗原として、ＭＳＡ：マウス血清アルブミン、ＣＮ：牛乳カゼイン、ＳＢＴＩ：大豆トリプシンインヒビター、ＬＰＳ：リポポリサッカライド、ＤＮＡ：二本鎖デオキシリボ核酸、ＫＬＨ：カラス貝ヘモシアニン、ＶＬＰ：ノロウイルス外殻タンパク質粒子、ＦＬＡＧ：細菌鞭毛タンパク質、ＬＢ：乳酸菌菌体、ＢＳＡ：ウシ血清アルブミンを表す。いずれの抗原においても、対照群（図４（ａ））に比してラフィノース群（図４（ｂ））では、マウスの腸管に分泌されたＩｇＡ抗体の抗原結合が促進されていることが示された。したがって、ラフィノースを摂取することで、ＩｇＡの可変領域のアミノ酸配列の多様性が促進された結果、自己抗原、細菌・ウイルス抗原、食物抗原など多様な抗原に対するＩｇＡ抗体の結合が促進されることが証明された。ラフィノースによってＩｇＡ抗体の抗原結合の多様性が促進されることで、体内に侵入してきた多様な物質に対して結合・排出が可能となることから、幅広い抗原や病原体による疾患、症状等を予防又は治療することができる。
結果を図４に示す。図４において、抗原として、ＭＳＡ：マウス血清アルブミン、ＣＮ：牛乳カゼイン、ＳＢＴＩ：大豆トリプシンインヒビター、ＬＰＳ：リポポリサッカライド、ＤＮＡ：二本鎖デオキシリボ核酸、ＫＬＨ：カラス貝ヘモシアニン、ＶＬＰ：ノロウイルス外殻タンパク質粒子、ＦＬＡＧ：細菌鞭毛タンパク質、ＬＢ：乳酸菌菌体、ＢＳＡ：ウシ血清アルブミンを表す。いずれの抗原においても、対照群（図４（ａ））に比してラフィノース群（図４（ｂ））では、マウスの腸管に分泌されたＩｇＡ抗体の抗原結合が促進されていることが示された。したがって、ラフィノースを摂取することで、ＩｇＡの可変領域のアミノ酸配列の多様性が促進された結果、自己抗原、細菌・ウイルス抗原、食物抗原など多様な抗原に対するＩｇＡ抗体の結合が促進されることが証明された。ラフィノースによってＩｇＡ抗体の抗原結合の多様性が促進されることで、体内に侵入してきた多様な物質に対して結合・排出が可能となることから、幅広い抗原や病原体による疾患、症状等を予防又は治療することができる。
【0069】
（実施例３）
Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ法によって、免疫制御に関連する遺伝子であるＴＧＦ－β１及びＦｏｘｐ３の発現解析を行った。ＴＧＦ－β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－β）は免疫抑制性又は抗炎症性サイトカインであり、Ｆｏｘｐ３（ｆｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ Ｐ３）は制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のマスター転写因子である。
Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ法によって、免疫制御に関連する遺伝子であるＴＧＦ－β１及びＦｏｘｐ３の発現解析を行った。ＴＧＦ－β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－β）は免疫抑制性又は抗炎症性サイトカインであり、Ｆｏｘｐ３（ｆｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ Ｐ３）は制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のマスター転写因子である。
【0070】
前述の実施例１で得られた各組織由来のｃＤＮＡプールにおけるＴＧＦ－β１（Ｔｇｆｂ１）及びＦｏｘｐ３（Ｆｏｘｐ３）の発現をＲＴ－ＰＣＲ及びアガロースゲル電気泳動によって確認するため、以下に示すプライマーを作成した。
＜Ｔｇｆｂ１＞
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’－ＡＧＣＧＧＡＣＴＡＣＴＡＴＧＣＴＡＡＡＧ－３’（配列番号５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’－ＴＡＡＴＣＴＣＴＧＣＡＡＧＣＧＣＡＧ－３’（配列番号６）
＜Ｆｏｘｐ３＞
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’－ＣＴＴＴＣＡＣＣＴＡＴＧＣＣＡＣＣＣＴＴＡＴＣ－３’（配列番号７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’－ＡＴＣＴＡＣＧＧＴＣＣＡＣＡＣＴＣＣＴＣ－３’（配列番号８）
＜Ｔｇｆｂ１＞
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’－ＡＧＣＧＧＡＣＴＡＣＴＡＴＧＣＴＡＡＡＧ－３’（配列番号５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’－ＴＡＡＴＣＴＣＴＧＣＡＡＧＣＧＣＡＧ－３’（配列番号６）
＜Ｆｏｘｐ３＞
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’－ＣＴＴＴＣＡＣＣＴＡＴＧＣＣＡＣＣＣＴＴＡＴＣ－３’（配列番号７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’－ＡＴＣＴＡＣＧＧＴＣＣＡＣＡＣＴＣＣＴＣ－３’（配列番号８）
【0071】
（ＲＴ－ＰＣＲ）
調製したｃＤＮＡプールを鋳型として、ＴＧＦ－β１及びＦｏｘｐ３のＲＴ－ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物５μＬを用いて１％アガロースゲル電気泳動を行い、ゲノムＤＮＡの混入が無いこと、また正常に逆転写が行われたことを確認した（図示せず）。
調製したｃＤＮＡプールを鋳型として、ＴＧＦ－β１及びＦｏｘｐ３のＲＴ－ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物５μＬを用いて１％アガロースゲル電気泳動を行い、ゲノムＤＮＡの混入が無いこと、また正常に逆転写が行われたことを確認した（図示せず）。
【0072】
（アガロースゲル電気泳動によるＰＣＲ増幅産物の確認）
ＲＴ－ＰＣＲ産物５μＬと６×ｄｙｅ １μＬを混合し、この混合液５μＬを２％アガロースゲル（２％アガロース、エチジウムブロマイド含有Ｔｒｉｓ－ｂｏｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ＥＤＴＡ（ＴＢＥ））に添加した後、電気泳動を行った。泳動終了後、ＵＶを照射してＲＴ－ＰＣＲ産物を検出し、目的遺伝子の増幅を確認した（図示せず）。
ＲＴ－ＰＣＲ産物５μＬと６×ｄｙｅ １μＬを混合し、この混合液５μＬを２％アガロースゲル（２％アガロース、エチジウムブロマイド含有Ｔｒｉｓ－ｂｏｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ＥＤＴＡ（ＴＢＥ））に添加した後、電気泳動を行った。泳動終了後、ＵＶを照射してＲＴ－ＰＣＲ産物を検出し、目的遺伝子の増幅を確認した（図示せず）。
【0073】
（絶対定量に用いる検量線用のｃＤＮＡ断片の調製及び濃度／コピー数の算出）
（ＲＴ－ＰＣＲ）
調製したｃＤＮＡプールを鋳型として、上記の反応条件でＲＴ－ＰＣＲを行い、Ｔｇｆｂ１及びＦｏｘｐ３の遺伝子断片を増幅した。ＰＣＲ産物５μＬを２％アガロースゲルを用いて電気泳動し、目的とするバンドを確認した。
＜Ｔｇｆｂ１＞
全長：２１９１ｂｐ、ＯＲＦ：８６８．．２０４０ｂｐ
増幅領域：１１６７．．１３４７ｂｐ、ｃＤＮＡ断片の長さ：１８１ｂｐ
＜Ｆｏｘｐ３＞
全長：３８３２ｂｐ、ＯＲＦ：３４３．．１６３２ｂｐ、
増幅領域：１３５８．．１５６９ｂｐ、ｃＤＮＡ断片の長さ：２１２ｂｐ
（ＲＴ－ＰＣＲ）
調製したｃＤＮＡプールを鋳型として、上記の反応条件でＲＴ－ＰＣＲを行い、Ｔｇｆｂ１及びＦｏｘｐ３の遺伝子断片を増幅した。ＰＣＲ産物５μＬを２％アガロースゲルを用いて電気泳動し、目的とするバンドを確認した。
＜Ｔｇｆｂ１＞
全長：２１９１ｂｐ、ＯＲＦ：８６８．．２０４０ｂｐ
増幅領域：１１６７．．１３４７ｂｐ、ｃＤＮＡ断片の長さ：１８１ｂｐ
＜Ｆｏｘｐ３＞
全長：３８３２ｂｐ、ＯＲＦ：３４３．．１６３２ｂｐ、
増幅領域：１３５８．．１５６９ｂｐ、ｃＤＮＡ断片の長さ：２１２ｂｐ
【0074】
（ＴＡクローニング）
下記の混合液を１６℃で３０分間静置することによりｐＡＮＴ Ｖｅｃｔｏｒ にＴＡクローニングを行った。
ｐＡＮＴ Ｖｅｃｔｏｒ ０．９μＬ
精製後ＰＣＲ産物 ２５ｎｇ
５×Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｍｉｘ ２μＬ
１０× Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １μＬ
超純水により合計で１０μＬにする
下記の混合液を１６℃で３０分間静置することによりｐＡＮＴ Ｖｅｃｔｏｒ にＴＡクローニングを行った。
ｐＡＮＴ Ｖｅｃｔｏｒ ０．９μＬ
精製後ＰＣＲ産物 ２５ｎｇ
５×Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｍｉｘ ２μＬ
１０× Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １μＬ
超純水により合計で１０μＬにする
【0075】
（精製プラスミドＤＮＡコピー数の算出）
以下に示す式より、精製プラスミドＤＮＡコピー数を算出した。なお、挿入したｃＤＮＡ断片の分子量はＯｌｉｇｏ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒを用いて算出した。
コピー数（コピー／μＬ）＝Ａ／Ｂ ×６．０２２×１０１４
※Ａ＝Ａ２６０より算出されたプラスミドＤＮＡ濃度（ｎｇ／μＬ）
※Ｂ＝目的の遺伝子断片が挿入されたプラスミドＤＮＡの分子量
以下に示す式より、精製プラスミドＤＮＡコピー数を算出した。なお、挿入したｃＤＮＡ断片の分子量はＯｌｉｇｏ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒを用いて算出した。
コピー数（コピー／μＬ）＝Ａ／Ｂ ×６．０２２×１０１４
※Ａ＝Ａ２６０より算出されたプラスミドＤＮＡ濃度（ｎｇ／μＬ）
※Ｂ＝目的の遺伝子断片が挿入されたプラスミドＤＮＡの分子量
【0076】
（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲによる発現量解析）
ｃＤＮＡプール溶液（ＲＴ（＋）のみ）を鋳型に、ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、ＳｔｅｐＯｎｅ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ｓｙｓｔｅｍｓ）によるＲｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲを行った。なお、プライマーとしてＲＴ－ＰＣＲで用いたプライマーと同様のものを使用した。
ｃＤＮＡプール溶液（ＲＴ（＋）のみ）を鋳型に、ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、ＳｔｅｐＯｎｅ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ｓｙｓｔｅｍｓ）によるＲｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲを行った。なお、プライマーとしてＲＴ－ＰＣＲで用いたプライマーと同様のものを使用した。
【0077】
（結果）
結果を図５に示す。マウスの小腸（回腸）、脾臓、盲腸及び小腸（パイエル板を含む）のいずれにおいても、対照群と比較してラフィノース群でＴＧＦ－β１及びＦｏｘｐ３の発現が増強された。特に、全身性の免疫細胞群が集積する場所であり、生体における全身免疫系の応答に中心的な役割を持つ脾臓において、対照群に比してラフィノース群ではＴＧＦ－β１及びＦｏｘｐ３の有意な発現増強が示された。ＴＧＦ－β１は免疫抑制性又は抗炎症性サイトカインであり、Ｆｏｘｐ３は制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のマスター転写因子であるため、これらの因子の発現を増強させることで、免疫制御の効果が期待される。
結果を図５に示す。マウスの小腸（回腸）、脾臓、盲腸及び小腸（パイエル板を含む）のいずれにおいても、対照群と比較してラフィノース群でＴＧＦ－β１及びＦｏｘｐ３の発現が増強された。特に、全身性の免疫細胞群が集積する場所であり、生体における全身免疫系の応答に中心的な役割を持つ脾臓において、対照群に比してラフィノース群ではＴＧＦ－β１及びＦｏｘｐ３の有意な発現増強が示された。ＴＧＦ－β１は免疫抑制性又は抗炎症性サイトカインであり、Ｆｏｘｐ３は制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のマスター転写因子であるため、これらの因子の発現を増強させることで、免疫制御の効果が期待される。
【0078】
以上より、ラフィノースを摂取することで、免疫制御に関わる因子の発現が増強されることが示された。したがって、ラフィノースは、免疫制御剤として使用でき、自己免疫疾患、移植片対宿主病、重症薬疹等、様々な免疫系疾患に対する予防又は治療効果が得られることが示唆された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】