特開2023-184194クロマトグラフィー担体を使用するタンパク質の精製方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023184194
(43)【公開日】2023-12-28
(54)【発明の名称】クロマトグラフィー担体を使用するタンパク質の精製方法
(51)【国際特許分類】
C07K 1/16 20060101AFI20231221BHJP
【ＦＩ】
C07K1/16
【審査請求】未請求
【請求項の数】15
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022098205
(22)【出願日】2022-06-17
(71)【出願人】
【識別番号】000000033
【氏名又は名称】旭化成株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100108903
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 和広
(74)【代理人】
【識別番号】100142387
【弁理士】
【氏名又は名称】齋藤 都子
(74)【代理人】
【識別番号】100135895
【弁理士】
【氏名又は名称】三間 俊介
(72)【発明者】
【氏名】岡村 大祐
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA20
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA23
4H045GA25
4H045GA26
(57)【要約】
【課題】高流速域での吸着及び分離性能と、細孔が目詰まりしにくい性能と、を両立したクロマトグラフィー担体を使用した、タンパク質の精製方法を提供する。
【解決手段】陰イオン交換材料、陽イオン交換材料、キレート形成材料及び疎水材料からなる群から選ばれる１つ以上であるクロマトグラフィー担体であって、
前記陰イオン交換材料、前記陽イオン交換材料、前記キレート形成材料及び、前記疎水材料の各々は、陰イオン交換基、陽イオン交換基、キレート形成基及び疎水性基の各々を有するグラフト鎖がグラフト重合を介して基材に導入されている材料であり、
前記基材が、モノフィラメント糸又はマルチフィラメント糸であり、
前記担体が、ワインドフィルターカートリッジモジュールの形態であるもの
を使用して、高い吸着容量と細孔が目詰まりしにくい性能により円滑にタンパク質の精製を実行できる。
【選択図】図１
【解決手段】陰イオン交換材料、陽イオン交換材料、キレート形成材料及び疎水材料からなる群から選ばれる１つ以上であるクロマトグラフィー担体であって、
前記陰イオン交換材料、前記陽イオン交換材料、前記キレート形成材料及び、前記疎水材料の各々は、陰イオン交換基、陽イオン交換基、キレート形成基及び疎水性基の各々を有するグラフト鎖がグラフト重合を介して基材に導入されている材料であり、
前記基材が、モノフィラメント糸又はマルチフィラメント糸であり、
前記担体が、ワインドフィルターカートリッジモジュールの形態であるもの
を使用して、高い吸着容量と細孔が目詰まりしにくい性能により円滑にタンパク質の精製を実行できる。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
目的タンパク質と不純物とを含む被処理液中の前記目的タンパク質を精製する方法であって、前記方法が、
陰イオン交換材料、陽イオン交換材料、キレート形成材料及び疎水材料からなる群から選ばれる１つ以上であるクロマトグラフィー担体に前記被処理液を通過させることによって前記被処理液中の前記目的タンパク質を精製するクロマトグラフィー工程を含み、
前記陰イオン交換材料、前記陽イオン交換材料、前記キレート形成材料及び、前記疎水材料の各々は、陰イオン交換基、陽イオン交換基、キレート形成基及び疎水性基の各々を有するグラフト鎖がグラフト重合を介して基材に導入されている材料であり、
前記基材が、モノフィラメント糸又はマルチフィラメント糸であり、
前記担体は、前記グラフト鎖が導入された基材を芯材に巻回し、任意に前記芯材を取り除いて形成されてなるワインドフィルターカートリッジモジュールの形態を有する、タンパク質の精製方法。
陰イオン交換材料、陽イオン交換材料、キレート形成材料及び疎水材料からなる群から選ばれる１つ以上であるクロマトグラフィー担体に前記被処理液を通過させることによって前記被処理液中の前記目的タンパク質を精製するクロマトグラフィー工程を含み、
前記陰イオン交換材料、前記陽イオン交換材料、前記キレート形成材料及び、前記疎水材料の各々は、陰イオン交換基、陽イオン交換基、キレート形成基及び疎水性基の各々を有するグラフト鎖がグラフト重合を介して基材に導入されている材料であり、
前記基材が、モノフィラメント糸又はマルチフィラメント糸であり、
前記担体は、前記グラフト鎖が導入された基材を芯材に巻回し、任意に前記芯材を取り除いて形成されてなるワインドフィルターカートリッジモジュールの形態を有する、タンパク質の精製方法。
【請求項2】
前記クロマトグラフィー担体のグラフト率が２０％以上３００％以下である、請求項１に記載のタンパク質の精製方法。
【請求項3】
前記ワインドフィルターカートリッジモジュールの孔径が０．５μｍ以上、５００μｍ以下である、請求項１又は２に記載のタンパク質の精製方法。
【請求項4】
前記クロマトグラフィー工程において、被処理液を前記ワインドフィルターカートリッジモジュールに透過圧力１００ｋＰａ以下で透過させる、請求項１又は２に記載のタンパク質の精製方法。
【請求項5】
前記クロマトグラフィー工程の後に、前記クロマトグラフィー担体の後段に配置された中空糸型限外ろ過（ＵＦ）膜モジュールに被処理液をフロースルーモードで流下する工程をさらに含む、請求項１又は２に記載のタンパク質の精製方法。
【請求項6】
前記ワインドフィルターカートリッジモジュールが、シングルユースである、請求項１又は２に記載のタンパク質の精製方法。
【請求項7】
前記クロマトグラフィー工程の後段に、分画分子量が１０，０００以上、８００，０００以下のろ過膜に被処理液を通過させる膜ろ過工程をさらに含む、請求項１又は２に記載のタンパク質の精製方法。
【請求項8】
前記膜ろ過工程の後に、ウイルス除去フィルターに被処理液を通過させるウイルス除去工程をさらに含む、請求項７に記載のタンパク質の精製方法。
【請求項9】
前記目的タンパク質が、中空糸膜モジュールを使ったタンジェンシャルフロー型の連続培養で生成されている、請求項１又は２に記載のタンパク質の精製方法。
【請求項10】
前記中空糸膜モジュールが、以下の特徴：
・膜材質：ポリフッ化ビニリデン、
・孔径：０．０５～０．７μｍ、
・内表面開口率：２５～５０％、
・内径：１～５ｍｍ、及び
・内表面膜面積：１ｍ２以上、
を有する中空糸膜モジュールである、請求項９に記載のタンパク質の精製方法。
・膜材質：ポリフッ化ビニリデン、
・孔径：０．０５～０．７μｍ、
・内表面開口率：２５～５０％、
・内径：１～５ｍｍ、及び
・内表面膜面積：１ｍ２以上、
を有する中空糸膜モジュールである、請求項９に記載のタンパク質の精製方法。
【請求項11】
前記中空糸膜モジュールが、シングルユースである、請求項１０に記載のタンパク質の精製方法。
【請求項12】
前記クロマトグラフィー担体が前記陰イオン交換材料を含み、
前記陰イオン交換基が３級アミノ基及び４級アミノ基からなる群から選ばれる１つ以上を含む、請求項１又は２に記載のタンパク質の精製方法。
前記陰イオン交換基が３級アミノ基及び４級アミノ基からなる群から選ばれる１つ以上を含む、請求項１又は２に記載のタンパク質の精製方法。
【請求項13】
前記クロマトグラフィー担体が前記陽イオン交換材料を含み、
前記陽イオン交換基がスルホン酸基及びアクリル酸基からなる群から選ばれる１つ以上を含む、請求項１又は２に記載のタンパク質の精製方法。
前記陽イオン交換基がスルホン酸基及びアクリル酸基からなる群から選ばれる１つ以上を含む、請求項１又は２に記載のタンパク質の精製方法。
【請求項14】
前記クロマトグラフィー担体が前記キレート形成材料を含み、
前記キレート形成基がイミノ二酢酸基及びイミノ二エタノール基からなる群から選ばれる１つ以上を含む、請求項１又は２に記載のタンパク質の精製方法。
前記キレート形成基がイミノ二酢酸基及びイミノ二エタノール基からなる群から選ばれる１つ以上を含む、請求項１又は２に記載のタンパク質の精製方法。
【請求項15】
前記クロマトグラフィー担体が前記疎水材料を含み、
前記疎水性基がフェニル基及びＣ４～Ｃ１８アルキル基からなる群から選ばれる１つ以上を含む、請求項１又は２に記載のタンパク質の精製方法。
前記疎水性基がフェニル基及びＣ４～Ｃ１８アルキル基からなる群から選ばれる１つ以上を含む、請求項１又は２に記載のタンパク質の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、モノクローナル抗体等のタンパク質を精製するために適したクロマトグラフィー担体を使用するタンパク質の精製方法に関する。
【背景技術】
【0002】
モノクローナル抗体等の各種治療用タンパク質は、細胞培養液等の生物由来材料から、複数のクロマトグラフィー精製工程を経て製造されている。これらのクロマトグラフィー工程には、例えば、多孔質ビーズを基材としたイオン交換クロマトグラフィー樹脂を充填したカラムが用いられている。多孔質ビーズは比表面積が大きく、高いイオン交換基密度を達成出来るため、目的の治療用タンパク質の高い吸着容量を実現できる反面、多孔質ビーズ細孔内部への治療用タンパク質の拡散速度が吸着特性に大きく影響するため、高流速域では吸着容量が著しく低下する。さらに、多孔質ビーズを充填したカラムは、ビーズが圧縮されて変形し圧力が上昇するため、高流速域で使用することができない。これらの事情から、治療用タンパク質を商業的に製造する際には、直径１ｍを超える大型カラムと１００Ｌを超える大量のクロマトグラフィー樹脂が使用されている。そのため、多孔質ビーズを用いるクロマトグラフィー精製工程は、高コストで処理時間もかかる工程となっている。
【0003】
これに対し、多孔質膜を基材としたクロマトグラフィー膜は、その細孔部を直接、液が流れていくため、高流速域でも高吸着容量を維持するという特性がある。特にアニオン交換膜は、治療用タンパク質よりも不純物を選択的にアニオン交換膜に吸着させるフロースルーモードによる精製工程の処理速度を著しく効率化できるため、モノクローナル抗体の製造等に普及しつつある。しかし、多孔質膜を基材としたクロマトグラフィー膜は、膜詰まりを起こしやすいという欠点もある。
【0004】
特許文献１及び非特許文献１には、天然繊維であるセルロース系繊維の基材に放射線グラフト重合によってイオン交換基を導入したクロマトグラフィー担体が記載されている。
【0005】
特許文献２には、断面形状を星型にすることによって表面積を大きくした特殊な形状のナイロン繊維を基材とし、当該基材にグラフト重合によってイオン交換基を導入したクロマトグラフィー媒体が記載されている。
【0006】
特許文献３及び特許文献４には、ナイロン、ポリエチレン、或いはポリプロピレン繊維からなる不織布に、エマルジョングラフト重合法を用いて、イオン交換基を導入した不織布フィルタが記載されている。
【0007】
特許文献５には、グラフト重合法を用いて、イオン交換基を導入した中空糸多孔膜が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】米国特許出願公開第２０１０／００６５４９９号明細書
【特許文献2】国際公開第２０１２／０１５９０８号
【特許文献3】特許第５０８２０３８号公報
【特許文献4】特許第５０１３３３３号公報
【特許文献5】国際公開第２００９／０５４２２６号
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ２０１５、３、２０４－２２１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
特許文献１及び非特許文献１に記載される技術によれば、繊維基材の担体をカラムに充填することによって、多孔質ビーズよりも高流速域での吸着及び分離性能に優れ、また濁質存在下でも詰まりにくいカラムを作製することができる。しかし、一般的にセルロース系繊維は、吸水性が高く緩衝液中では著しく膨潤し、湿潤強度も著しく低下するため、安定してカラムに充填することが困難である。
【0011】
また、特許文献２に記載される技術に関し、一般的にナイロン等の合成繊維は、セルロース系繊維に比べて吸水性に乏しく膨潤しないので、湿潤強度に優れている。しかし、このような特殊な形状の繊維は、基材としての供給安定性やコスト面で最良ではない。また、高い吸着容量を得るために大表面積を有する特殊な形状のナイロン繊維を採用したにもかかわらず、その吸着容量は、多孔質ビーズ基材の媒体と比べて、十分高いとはいえない。
【0012】
また、特許文献３及び特許文献４に記載の不織布フィルタにおいては、不織布フィルタによるタンパク質の吸着分離性能については検証されていない。
【0013】
また、特許文献５に記載の中空糸多孔膜においては、タンパク質吸着量は大きいものの、吸着するにつれて細孔径が狭まり、ついには目詰まりしてしまうという問題があった。
【0014】
本発明は、上記の問題を解決し、高流速域での吸着及び分離性能と、細孔が目詰まりしにくい性能と、を両立した材料を使用することによって、効率よく抗体医薬等のタンパク質の精製を実行できる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0015】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、グラフト重合を介して、イオン交換基又は疎水性基を有するグラフト鎖が導入されている、モノフィラメント糸又はマルチフィラメント糸である基材を芯材に巻回したクロマトグラフィー担体である、ワインドフィルターカートリッジモジュールを使用することにより、低透過圧力かつ、安価なため、フロースルーモードかつシングルユースで不要タンパク質を除去できることを見出した。
【0016】
＜態様１＞
目的タンパク質と不純物とを含む被処理液中の前記目的タンパク質を精製する方法であって、前記方法が、
陰イオン交換材料、陽イオン交換材料、キレート形成材料及び疎水材料からなる群から選ばれる１つ以上であるクロマトグラフィー担体に前記被処理液を通過させることによって前記被処理液中の前記目的タンパク質を精製するクロマトグラフィー工程を含み、
前記陰イオン交換材料、前記陽イオン交換材料、前記キレート形成材料及び、前記疎水材料の各々は、陰イオン交換基、陽イオン交換基、キレート形成基及び疎水性基の各々を有するグラフト鎖がグラフト重合を介して基材に導入されている材料であり、
前記基材が、モノフィラメント糸又はマルチフィラメント糸であり、
前記担体は、前記グラフト鎖が導入された基材を芯材に巻回し、任意に前記芯材を取り除いて形成されてなるワインドフィルターカートリッジモジュールの形態を有する、タンパク質の精製方法。
＜態様２＞
前記クロマトグラフィー担体のグラフト率が２０％以上３００％以下である、態様１に記載のタンパク質の精製方法。
＜態様３＞
前記ワインドフィルターカートリッジモジュールの孔径が０．５μｍ以上、５００μｍ以下である、態様１又は２に記載のタンパク質の精製方法。
＜態様４＞
前記クロマトグラフィー工程において、被処理液を前記ワインドフィルターカートリッジモジュールに透過圧力１００ｋＰａ以下で透過させる、態様１～３の何れか１項に記載のタンパク質の精製方法。
＜態様５＞
前記クロマトグラフィー工程の後に、前記クロマトグラフィー担体の後段に配置された中空糸型限外ろ過（ＵＦ）膜モジュールに被処理液をフロースルーモードで流下する工程をさらに含む、態様１～４の何れか１項に記載のタンパク質の精製方法。
＜態様６＞
前記ワインドフィルターカートリッジモジュールが、シングルユースである、態様１～５の何れか１項に記載のタンパク質の精製方法。
＜態様７＞
前記クロマトグラフィー工程の後段に、分画分子量が１０，０００以上、８００，０００以下のろ過膜に被処理液を通過させる膜ろ過工程をさらに含む、態様１～６の何れか１項に記載のタンパク質の精製方法。
＜態様８＞
前記膜ろ過工程の後に、ウイルス除去フィルターに被処理液を通過させるウイルス除去工程をさらに含む、態様７に記載のタンパク質の精製方法。
＜態様９＞
前記目的タンパク質が、中空糸膜モジュールを使ったタンジェンシャルフロー型の連続培養で生成されている、態様１～８の何れか１項に記載のタンパク質の精製方法。
＜態様１０＞
前記中空糸膜モジュールが、以下の特徴：
・膜材質：ポリフッ化ビニリデン、
・孔径：０．０５～０．７μｍ、
・内表面開口率：２５～５０％、
・内径：１～５ｍｍ、及び
・内表面膜面積：１ｍ２以上、
を有する中空糸膜モジュールである、態様９に記載のタンパク質の精製方法。
＜態様１１＞
前記中空糸膜モジュールが、シングルユースである、態様１０に記載のタンパク質の精製方法。
＜態様１２＞
前記クロマトグラフィー担体が前記陰イオン交換材料を含み、
前記陰イオン交換基が３級アミノ基及び４級アミノ基からなる群から選ばれる１つ以上を含む、態様１～１１の何れか１項に記載のタンパク質の精製方法。
方法。
＜態様１３＞
前記クロマトグラフィー担体が前記陽イオン交換材料を含み、
前記陽イオン交換基がスルホン酸基及びアクリル酸基からなる群から選ばれる１つ以上を含む、態様１～１２の何れか１項に記載のタンパク質の精製方法。
＜態様１４＞
前記クロマトグラフィー担体が前記キレート形成材料を含み、
前記キレート形成基がイミノ二酢酸基、イミノ二エタノール基からなる群から選ばれる１つ以上を含む、態様１～１３の何れか１項に記載のタンパク質の精製方法。
＜態様１５＞
前記クロマトグラフィー担体が前記疎水材料を含み、
前記疎水性基がフェニル基及びＣ４～Ｃ１８アルキル基からなる群から選ばれる１つ以上を含む、態様１～１４の何れか１項に記載のタンパク質の精製方法。
目的タンパク質と不純物とを含む被処理液中の前記目的タンパク質を精製する方法であって、前記方法が、
陰イオン交換材料、陽イオン交換材料、キレート形成材料及び疎水材料からなる群から選ばれる１つ以上であるクロマトグラフィー担体に前記被処理液を通過させることによって前記被処理液中の前記目的タンパク質を精製するクロマトグラフィー工程を含み、
前記陰イオン交換材料、前記陽イオン交換材料、前記キレート形成材料及び、前記疎水材料の各々は、陰イオン交換基、陽イオン交換基、キレート形成基及び疎水性基の各々を有するグラフト鎖がグラフト重合を介して基材に導入されている材料であり、
前記基材が、モノフィラメント糸又はマルチフィラメント糸であり、
前記担体は、前記グラフト鎖が導入された基材を芯材に巻回し、任意に前記芯材を取り除いて形成されてなるワインドフィルターカートリッジモジュールの形態を有する、タンパク質の精製方法。
＜態様２＞
前記クロマトグラフィー担体のグラフト率が２０％以上３００％以下である、態様１に記載のタンパク質の精製方法。
＜態様３＞
前記ワインドフィルターカートリッジモジュールの孔径が０．５μｍ以上、５００μｍ以下である、態様１又は２に記載のタンパク質の精製方法。
＜態様４＞
前記クロマトグラフィー工程において、被処理液を前記ワインドフィルターカートリッジモジュールに透過圧力１００ｋＰａ以下で透過させる、態様１～３の何れか１項に記載のタンパク質の精製方法。
＜態様５＞
前記クロマトグラフィー工程の後に、前記クロマトグラフィー担体の後段に配置された中空糸型限外ろ過（ＵＦ）膜モジュールに被処理液をフロースルーモードで流下する工程をさらに含む、態様１～４の何れか１項に記載のタンパク質の精製方法。
＜態様６＞
前記ワインドフィルターカートリッジモジュールが、シングルユースである、態様１～５の何れか１項に記載のタンパク質の精製方法。
＜態様７＞
前記クロマトグラフィー工程の後段に、分画分子量が１０，０００以上、８００，０００以下のろ過膜に被処理液を通過させる膜ろ過工程をさらに含む、態様１～６の何れか１項に記載のタンパク質の精製方法。
＜態様８＞
前記膜ろ過工程の後に、ウイルス除去フィルターに被処理液を通過させるウイルス除去工程をさらに含む、態様７に記載のタンパク質の精製方法。
＜態様９＞
前記目的タンパク質が、中空糸膜モジュールを使ったタンジェンシャルフロー型の連続培養で生成されている、態様１～８の何れか１項に記載のタンパク質の精製方法。
＜態様１０＞
前記中空糸膜モジュールが、以下の特徴：
・膜材質：ポリフッ化ビニリデン、
・孔径：０．０５～０．７μｍ、
・内表面開口率：２５～５０％、
・内径：１～５ｍｍ、及び
・内表面膜面積：１ｍ２以上、
を有する中空糸膜モジュールである、態様９に記載のタンパク質の精製方法。
＜態様１１＞
前記中空糸膜モジュールが、シングルユースである、態様１０に記載のタンパク質の精製方法。
＜態様１２＞
前記クロマトグラフィー担体が前記陰イオン交換材料を含み、
前記陰イオン交換基が３級アミノ基及び４級アミノ基からなる群から選ばれる１つ以上を含む、態様１～１１の何れか１項に記載のタンパク質の精製方法。
方法。
＜態様１３＞
前記クロマトグラフィー担体が前記陽イオン交換材料を含み、
前記陽イオン交換基がスルホン酸基及びアクリル酸基からなる群から選ばれる１つ以上を含む、態様１～１２の何れか１項に記載のタンパク質の精製方法。
＜態様１４＞
前記クロマトグラフィー担体が前記キレート形成材料を含み、
前記キレート形成基がイミノ二酢酸基、イミノ二エタノール基からなる群から選ばれる１つ以上を含む、態様１～１３の何れか１項に記載のタンパク質の精製方法。
＜態様１５＞
前記クロマトグラフィー担体が前記疎水材料を含み、
前記疎水性基がフェニル基及びＣ４～Ｃ１８アルキル基からなる群から選ばれる１つ以上を含む、態様１～１４の何れか１項に記載のタンパク質の精製方法。
【発明の効果】
【0017】
本発明によれば、高流速域での吸着及び分離性能と、細孔が目詰まりしにくい性能と、を両立する材料を採用することで、効率的なタンパク質の精製方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】本発明の一態様に係るタンパク質の精製方法のフローを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0019】
以下、本発明の好適な実施の形態（以下において、「実施の形態」という。）について詳細に説明する。なお以下の示す実施の形態は、この発明の技術的思想を具体化するための装置や方法を例示するものであって、この発明の技術的思想は構成部材の組み合わせ等を下記のものに特定するものではない。この発明の技術的思想は、特許請求の範囲において種々の変更を加えることができる。
【0020】
以下の説明において、段階的な記載の数値範囲における上限値又は下限値は、ほかの段階的な記載の数値範囲における上限値又は下限値に置き換わってよい。また、以下の説明において、ある数値範囲における上限値又は下限値は、実施例に記載の値に置き換わってよい。さらに、以下の説明における用語「工程」について、独立した工程はもちろん、他の工程と明確に区別できない場合でも、その「工程」の機能が達成されれば本用語に含まれうる。
【0021】
実施の形態に係るタンパク質精製用のクロマトグラフィー担体は、陰イオン交換材料、陽イオン交換材料、キレート形成材料及び疎水材料からなる群から選ばれる１つ以上である。これら材料の各々は、陰イオン交換基、陽イオン交換基、キレート形成基及び疎水性基の各々を有するグラフト鎖がグラフト重合を介してモノフィラメント糸又はマルチフィラメント糸である基材に導入されている材料である。
一態様において、当該担体は、当該グラフト鎖が導入された基材を芯材に巻回し、任意に芯材を取り除いて作製された形態、すなわち、イオン交換基（ＩＥＸ）又は疎水性基（ＨＩＣ）を有するクロマトグラフィーワインドフィルターカートリッジモジュール（ＷＦＣ）の形態を有するものである。イオン交換基又は疎水性基を有するグラフト鎖は、グラフト重合を介して基材に導入される。
したがって、グラフト化モノフィラメント又はマルチフィラメント糸において、イオン交換基又は疎水性基を有するグラフト鎖は、基材と共有結合している。例えば、グラフト化モノフィラメント糸又はマルチフィラメント糸は、放射線照射によって活性化された基材と、１種類以上の反応性モノマーと、を、接触させて、基材上にグラフト鎖を形成させて製造される。反応性モノマーの少なくとも１種類は、イオン交換基又はイオン交換基導入前駆体、或いは、疎水性基又は疎水性基前駆体を有する。グラフト化モノフィラメント又はマルチフィラメント糸は、グラフト鎖の形成と同時に、又はグラフト鎖形成の後に、イオン交換基又は疎水性基を基材上に導入することにより製造される。
一態様において、当該担体は、当該グラフト鎖が導入された基材を芯材に巻回し、任意に芯材を取り除いて作製された形態、すなわち、イオン交換基（ＩＥＸ）又は疎水性基（ＨＩＣ）を有するクロマトグラフィーワインドフィルターカートリッジモジュール（ＷＦＣ）の形態を有するものである。イオン交換基又は疎水性基を有するグラフト鎖は、グラフト重合を介して基材に導入される。
したがって、グラフト化モノフィラメント又はマルチフィラメント糸において、イオン交換基又は疎水性基を有するグラフト鎖は、基材と共有結合している。例えば、グラフト化モノフィラメント糸又はマルチフィラメント糸は、放射線照射によって活性化された基材と、１種類以上の反応性モノマーと、を、接触させて、基材上にグラフト鎖を形成させて製造される。反応性モノマーの少なくとも１種類は、イオン交換基又はイオン交換基導入前駆体、或いは、疎水性基又は疎水性基前駆体を有する。グラフト化モノフィラメント又はマルチフィラメント糸は、グラフト鎖の形成と同時に、又はグラフト鎖形成の後に、イオン交換基又は疎水性基を基材上に導入することにより製造される。
【0022】
実施の形態に係るＩＥＸ－ＷＦＣ又はＨＩＣ－ＷＦＣは、目的タンパク質と不純物を含む被処理液中の目的タンパク質の精製に用いられる。精製対象となる目的タンパク質は、例えば、抗体タンパク質の単量体やインスリンやアルブミンなどのタンパク質医薬品である。不純物とは、例えば抗体タンパク質の２量体以上の凝集体、その他のタンパク質の夾雑物、ＨＣＰ、ＤＮＡ、及びエンドトキシン等である。目的タンパク質の精製は、被処理液から不純物の少なくとも一部を除去すること、被処理液から目的タンパク質の少なくとも一部を回収すること、又はこれらの組み合わせにより達成してよい。
【0023】
生理活性物質の一例である抗体タンパク質は、生化学における一般的な定義のとおり、脊椎動物の感染防禦機構としてＢリンパ球が産生する糖タンパク質分子（γ－グロブリン又は免疫グロブリンともいう）である。例えば、実施の形態に係るＩＥＸ－ＷＦＣ又はＨＩＣ－ＷＦＣで精製される抗体タンパク質は、ヒトの医薬品として使用され、投与対象であるヒトの体内にある抗体タンパク質と実質的に同一の構造を有する。
【0024】
抗体タンパク質は、ヒト抗体タンパク質であってもよく、ヒト以外のウシ及びマウス等の哺乳動物由来抗体タンパク質であってもよい。或いは、抗体タンパク質は、ヒトＩｇＧとのキメラ抗体タンパク質、及びヒト化抗体タンパク質であってもよい。ヒトＩｇＧとのキメラ抗体タンパク質とは、可変領域がマウス等のヒト以外の生物由来であるが、その他の定常領域がヒト由来の免疫グロブリンに置換された抗体タンパク質である。また、ヒト化抗体タンパク質とは、可変領域のうち、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ： ＣＤＲ）がヒト以外の生物由来であるが、その他のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ： ＦＲ）がヒト由来である抗体タンパク質である。ヒト化抗体タンパク質は、キメラ抗体タンパク質よりも免疫原性がさらに低減される。
【0025】
実施の形態に係るクロマトグラフィー担体の精製対象の一例である抗体タンパク質のクラス（アイソタイプ）及びサブクラスは特に限定されない。例えば、抗体タンパク質は、定常領域の構造の違いにより、ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＤ，及びＩｇＥの５種類のクラスに分類される。しかし、実施の形態に係るイオン交換クロマトグラフィー担体が精製対象とする抗体タンパク質は、５種類のクラスのいずれであってもよい。また、ヒト抗体タンパク質においては、ＩｇＧにはＩｇＧ１～ＩｇＧ４の４つのサブクラスがあり、ＩｇＡにはＩｇＡ１とＩｇＡ２の２つのサブクラスがある。しかし、実施の形態に係るＩＥＸ－ＷＦＣ又はＨＩＣ－ＷＦＣが精製対象とする抗体タンパク質のサブクラスは、いずれであってもよい。なお、Ｆｃ領域にタンパク質を結合したＦｃ融合タンパク質等の抗体関連タンパク質も、実施の形態に係るＩＥＸ－ＷＦＣ又はＨＩＣ－ＷＦＣが精製対象とする抗体タンパク質に含まれ得る。
【0026】
さらに、抗体タンパク質は、由来によっても分類することができる。しかし、実施の形態に係るクロマトグラフィー担体が精製対象とする抗体タンパク質は、天然のヒト抗体タンパク質、遺伝子組換え技術により製造された組換えヒト抗体タンパク質、モノクローナル抗体タンパク質、及びポリクローナル抗体タンパク質のいずれであってもよい。これらの抗体タンパク質の中でも、実施の形態に係るＩＥＸ－ＷＦＣ又はＨＩＣ－ＷＦＣが精製対象とする抗体タンパク質としては、抗体医薬としての需要や重要性の観点から、ヒトＩｇＧが好適であるが、これに限定されない。
目的タンパク質がタンパク質医薬品となる場合、目的タンパク質（インスリンやアルブミンなど）を大量生産するように形質転換されたピキア酵母や大腸菌を培養器で培養し、破砕及び／又は、除菌したのちに目的タンパク質であるインスリンやアルブミンが精製される。その過程でクロマトグラフィー担体がその精製過程の一端を担い、その際にＩＥＸ－ＷＦＣ又はＨＩＣ－ＷＦＣが好適に用いられる。
目的タンパク質がタンパク質医薬品となる場合、目的タンパク質（インスリンやアルブミンなど）を大量生産するように形質転換されたピキア酵母や大腸菌を培養器で培養し、破砕及び／又は、除菌したのちに目的タンパク質であるインスリンやアルブミンが精製される。その過程でクロマトグラフィー担体がその精製過程の一端を担い、その際にＩＥＸ－ＷＦＣ又はＨＩＣ－ＷＦＣが好適に用いられる。
【0027】
実施の形態に係るＩＥＸ－ＷＦＣ又はＨＩＣ－ＷＦＣの基材は、一態様において合成繊維からなる。合成繊維は、通常の円柱形状を有していてよい。合成繊維は、例えば、ポリオレフィン、ポリアミド、又はポリエステル等から作られる繊維が好ましく、ポリアミド繊維がより好ましい。
また、基材は、モノフィラメント糸であってもよいし、マルチフィラメント糸であってもよいが、マルチフィラメント糸の方が表面積を確保できる点で好ましい。なお、モノフィラメント糸とは、単繊維からなる構造をいう。また、マルチフィラメント糸とは、多数の単繊維を撚り合せた構造をいう。実施の形態に係る基材は、グラフト鎖が導入される前のモノフィラメント糸又はマルチフィラメント糸である。モノフィラメント糸又はマルチフィラメント糸は、組み紐及び織布などに成型加工して利用できる。
また、基材は、モノフィラメント糸であってもよいし、マルチフィラメント糸であってもよいが、マルチフィラメント糸の方が表面積を確保できる点で好ましい。なお、モノフィラメント糸とは、単繊維からなる構造をいう。また、マルチフィラメント糸とは、多数の単繊維を撚り合せた構造をいう。実施の形態に係る基材は、グラフト鎖が導入される前のモノフィラメント糸又はマルチフィラメント糸である。モノフィラメント糸又はマルチフィラメント糸は、組み紐及び織布などに成型加工して利用できる。
【0028】
ポリオレフィンの例としては、エチレン、プロピレン、ブチレン、及びフッ化ビニリデン等のオレフィン単独重合体、該オレフィンの２種以上の共重合体、又は１種若しくは２種以上のオレフィンと、パーハロゲン化オレフィンと、の共重合体等が挙げられる。パーハロゲン化オレフィンの例としては、テトラフルオロエチレン及び／又はクロロトリフルオロエチレン等が挙げられる。これらの中でも、機械的強度に優れ、かつタンパク質等の夾雑物の高い吸着容量が得られる点で、ポリエチレン又はポリプロピレンが好ましい。
【0029】
ポリアミドの例としては、ナイロン６（ε－カプロラクタムの重縮合体）、ナイロン１１（ウンデカンラクタムの重縮合体）、ナイロン１２（ラウリルラクタムの重縮合体）、ナイロン６６（ヘキサメチレンジアミンとアジピン酸の共縮重合体）、ナイロン６１０（ヘキサメチレンジアミンとアジピン酸の共縮重合体）、ナイロン６Ｔ（ヘキサメチレンジアミンとテレフタル酸の共縮重合体）、ナイロン９Ｔ（ノナンジアミンとテレフタル酸の共縮重合体）、ナイロンＭ５Ｔ（メチルペンタンジアミンとテレフタル酸の共縮重合体）、ナイロン６２１（カプロラクタムとラウリルラクタムの共縮重合体）、ｐ－フェニレンジアミンとテレフタル酸の共縮重合体、並びにｍ－フェニレンジアミンとイソフタル酸の共縮重合体等が挙げられる。
【0030】
ポリエステルの例としては、ポリエチレンテレフタレート、ポリトリメチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、及びポリブチレンナフタレート等が挙げられる。
【0031】
基材に共有結合しているグラフト鎖は、モノマー単位により構成されている。一態様においては、モノマー単位が、イオン交換基又は疎水性基を有する。イオン交換基は、精製対象や精製条件に応じて、陽イオン（カチオン）交換基（ＣＥＸ）、陰イオン（アニオン）交換基（ＡＥＸ）又は、キレート形成基（ＣＨＥ）から選ばれる。
【0032】
カチオン交換基は、不純物が除去できれば、強カチオン交換基であってもよく、弱カチオン交換基であってもよい。
【0033】
強カチオン交換基の例としては、スルホン酸基等が挙げられる。ほぼ全ての強カチオン交換基は、抗体タンパク質を精製する際における実用的な抗体溶液のｐＨ領域で荷電しているため、荷電量が一定である。したがって、基材上に強カチオン交換基が存在することで、常に一定以上の荷電量が保証される。また、ｐＨ微変化によってＣＥＸ材料の性能が大きく左右されることを抑制することができる。
【0034】
弱カチオン交換基の例としては、カルボン酸基（例えば、アクリル酸基）、ホスホン酸基、及びリン酸基等が挙げられる。弱カチオン交換基は、移動相のｐＨにより、荷電量を変化させることが可能である。そのため、移動相のｐＨを変化させることにより、カチオン交換クロマトグラフィー担体の電荷密度の調整が可能となる。したがって、除去すべき不純物の特性に合わせて、ｐＨを調整することにより、任意の不純物の除去が可能となる。
【0035】
製造のしやすさという観点からは、カチオン交換基としてはスルホン酸基及びアクリル酸基が好ましく、スルホン酸基がより好ましい。
【0036】
アニオン交換基は、液中で負に帯電したタンパク質等を吸着することができればよく、例えば、特に限定されないが、アニオン交換基の例としては、３級アミノ基であるジエチルアミノ基（ＤＥＡ、Ｅｔ2Ｎ－）及びトリエチレンジアミノ基（ＴＥＤＡ、Ｅｔ3Ｎ２－）、４級アンモニウム基（Ｑ、Ｒ3Ｎ+－）、４級アミノエチル基（ＱＡＥ、Ｒ3Ｎ+－（ＣＨ2）2－）、ジエチルアミノエチル基（ＤＥＡＥ、Ｅｔ2Ｎ－（ＣＨ2）2－）、及びジエチルアミノプロピル基（ＤＥＡＰ、Ｅｔ2Ｎ－（ＣＨ2）3－）等が挙げられる。ここで、Ｒは、特に限定されず、同一のＮに結合するＲが同一又は異なっていてもよく、好適には、アルキル基、フェニル基、アラルキル基等の炭化水素基を表す。４級アンモニウム基としては、例えば、トリメチルアミノ基（トリメチルアンモニウム基、Ｍｅ3Ｎ+－）等が挙げられる。なお、３級アミノ基及び４級アミノ基は、それぞれ、ジアルキル置換アミノ基及びトリアルキル置換アミノ基ともいう。基材への化学的な固定が容易であり、高い吸着容量が得られるという観点からは、アニオン交換基としてはＤＥＡ、ＴＥＤＡ、及びトリメチルアミノ基が好ましく、ＤＥＡがより好ましい。
【0037】
キレート形成基は、金属を吸着することができればよく、例えば、金属を含むタンパク質等も吸着することができる。キレート形成基は、特定の金属と錯体を形成して吸着するため、特定の金属（例えば、銅、鉄、ニッケルなど）、又は、特定の金属を含むタンパク質を吸着することが可能になる。
キレート形成基としては、例えば、分子内に、２つ以上の酸素と、窒素及び／又は硫黄とを有する基が挙げられ、イミノ二酢酸基、イミノ二エタノール基がより好ましい。
キレート形成基としては、例えば、分子内に、２つ以上の酸素と、窒素及び／又は硫黄とを有する基が挙げられ、イミノ二酢酸基、イミノ二エタノール基がより好ましい。
【0038】
クロマトグラフィー担体が陰イオン交換材料を含む場合、陰イオン交換基が３級アミノ基及び４級アミノ基からなる群から選ばれる１つ以上を含むことが好ましく、陰イオン交換基がジエチルアミノ基及びトリメチルアミノ基、トリエチレンジアミノ基からなる群から選ばれる１つ以上を含むことがより好ましい。
クロマトグラフィー担体が陽イオン交換材料を含む場合、陽イオン交換基がスルホン酸基及びアクリル酸基からなる群から選ばれる１つ以上を含むことが好ましい。
クロマトグラフィー担体がキレート形成材料を含む場合、キレート形成基がイミノ二酢酸基、イミノ二エタノール基からなる群から選ばれる１つ以上を含むことが好ましい。
クロマトグラフィー担体が陽イオン交換材料を含む場合、陽イオン交換基がスルホン酸基及びアクリル酸基からなる群から選ばれる１つ以上を含むことが好ましい。
クロマトグラフィー担体がキレート形成材料を含む場合、キレート形成基がイミノ二酢酸基、イミノ二エタノール基からなる群から選ばれる１つ以上を含むことが好ましい。
【0039】
疎水性基（ＨＩＣ）の例としては、Ｃ４～Ｃ１８の脂肪族炭化水素基（好ましくはアルキル基）及び芳香族炭化水素基（好ましくはフェニル基）等が挙げられ、クロマトグラフィー担体が疎水材料を含む場合、疎水性基がフェニル基及びＣ４～Ｃ１８アルキル基からなる群から選ばれる１つ以上を含むことが好ましい。
【0040】
実施の形態に係るクロマトグラフィー担体は、陰イオン交換材料、陽イオン交換材料、キレート形成材料及び疎水材料からなる群から選ばれる１つ以上を含む。好ましい一態様において、クロマトグラフィー担体は、陰イオン交換材料、陽イオン交換材料及びキレート形成材料を含む。別の好ましい一態様において、クロマトグラフィー担体は、疎水材料を含む。
実施の形態に係る陰イオン交換材料、陽イオン交換材料、キレート形成材料及び、疎水材料の各々は、モノフィラメント糸又はマルチフィラメント糸である基材に、陰イオン交換基、陽イオン交換基、キレート形成基及び疎水性基の各々を有するグラフト鎖がグラフト重合を介して導入されている材料である。
実施の形態に係るタンパク質の精製方法に使用するイオン交換基（陽イオン交換基若しくは陰イオン交換基又はキレート形成基）又は疎水性基は、一つの種類を単独又は複数組み合わせて使用してもよい。また、イオン交換基又は疎水性基は、それぞれの複数の種類を単独又は複数組み合わせて使用してもよい。
通常、被処理液中のタンパク質の夾雑物などの不純物の除去には、陰イオン交換基が好ましく、目的タンパク質の二量体や三量体などの多量体の選択的除去には、疎水性基が好ましい。また、被処理液のイオン強度が高い場合には、吸着能力が低下しない陽イオン交換基が好ましい。
さらに、特定の金属、又は、特定の金属を含むタンパク質を選択的に除去するには、キレート形成基が好ましい。
典型的な態様において、クロマトグラフィー担体に被処理液を通過させる際、陰イオン交換基で不純物を除去し、次に目的タンパク質の多量体を疎水性基で選択的に除去してから陽イオン交換基で目的タンパク質を選択的に回収することが好ましいが、実施の態様に応じて都度、被処理液を通過させるイオン交換基（陽イオン交換基や陰イオン交換基、若しくは、キレート形成基）又は疎水性基の順序を変更することも可能である。
実施の形態に係る陰イオン交換材料、陽イオン交換材料、キレート形成材料及び、疎水材料の各々は、モノフィラメント糸又はマルチフィラメント糸である基材に、陰イオン交換基、陽イオン交換基、キレート形成基及び疎水性基の各々を有するグラフト鎖がグラフト重合を介して導入されている材料である。
実施の形態に係るタンパク質の精製方法に使用するイオン交換基（陽イオン交換基若しくは陰イオン交換基又はキレート形成基）又は疎水性基は、一つの種類を単独又は複数組み合わせて使用してもよい。また、イオン交換基又は疎水性基は、それぞれの複数の種類を単独又は複数組み合わせて使用してもよい。
通常、被処理液中のタンパク質の夾雑物などの不純物の除去には、陰イオン交換基が好ましく、目的タンパク質の二量体や三量体などの多量体の選択的除去には、疎水性基が好ましい。また、被処理液のイオン強度が高い場合には、吸着能力が低下しない陽イオン交換基が好ましい。
さらに、特定の金属、又は、特定の金属を含むタンパク質を選択的に除去するには、キレート形成基が好ましい。
典型的な態様において、クロマトグラフィー担体に被処理液を通過させる際、陰イオン交換基で不純物を除去し、次に目的タンパク質の多量体を疎水性基で選択的に除去してから陽イオン交換基で目的タンパク質を選択的に回収することが好ましいが、実施の態様に応じて都度、被処理液を通過させるイオン交換基（陽イオン交換基や陰イオン交換基、若しくは、キレート形成基）又は疎水性基の順序を変更することも可能である。
【0041】
典型的な態様において、基材にグラフト鎖を導入する際、基材は、放射線照射により活性化される。基材にラジカルを生成させるためにはいかなる手段も採用しうるが、基材に電離性放射線を照射すると、基材全体に均一なラジカルが生成するため、好適である。電離性放射線の種類としては、γ線、電子線、β線、及び中性子線等が利用できるが、工業規模での実施には電子線又はγ線が好ましい。電離性放射線は、コバルト６０、ストロンチウム９０、及びセシウム１３７等の放射性同位体から、又はＸ線撮影装置、電子線加速器及び紫外線照射装置等により得られる。
【0042】
電離性放射線の照射線量は、１ｋＧｙ以上１０００ｋＧｙ以下が好ましく、より好ましくは２ｋＧｙ以上２００ｋＧｙ以下、さらに好ましくは５ｋＧｙ以上５０ｋＧｙ以下である。照射線量が１ｋＧｙ以上の場合、ラジカルが均一に生成しやすい傾向にある。また、基材の物理的強度の観点から、照射線量が１０００ｋＧｙ以下であるとよい。
【0043】
電離性放射線の照射によるグラフト重合法には、一般に基材にラジカルを生成した後、次いでラジカルを反応性モノマーと接触させる前照射法と、基材を反応性モノマーと接触させた状態で基材にラジカルを生成させる同時照射法と、に大別される。実施の形態においては、いかなる方法も適用しうるが、オリゴマーの生成が少ない前照射法が好ましい。ここでいうオリゴマーとは、遊離オリゴマーのことを指す。遊離オリゴマーはグラフト鎖中には取り込まれないため、生成されないことが好ましい。
【0044】
基材上にグラフト重合される反応性モノマーは、イオン交換基を有する反応性モノマーであってもよいし、「ＩＥＸ又はＨＩＣ導入前駆体」を有する反応性モノマーであってもよい。「ＩＥＸ又はＨＩＣ導入前駆体」を有する反応性モノマーを使用する場合、反応性モノマーを共重合した後、ＩＥＸ又はＨＩＣ導入前駆体をＩＥＸ又はＨＩＣに変換する。
【0045】
ここでいう、「ＩＥＸ又はＨＩＣ導入前駆体」とは、ＩＥＸ又はＨＩＣを付与しうる官能基のことをいい、例えばエポキシ基等が挙げられるが、これに限定されるものではない。「ＩＥＸ又はＨＩＣ導入前駆体」を有する反応性モノマーとは、ＩＥＸ又はＨＩＣを付与しうる官能基を有する反応性モノマーのことをいう。また、「ＩＥＸ又はＨＩＣ導入前駆体」は「ＩＥＸ又はＨＩＣの前駆体」を含みうる。「ＩＥＸ又はＨＩＣの前駆体」とは、例えばイオン交換基に保護基が付いたものである。「ＩＥＸ又はＨＩＣの前駆体」を有する反応性モノマーとしては、フェニルビニルスルホネート等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0046】
強カチオン基を有する反応性モノマーの例としては、スルホン酸基を有するポリマーの構成単位である（メタ）アクリルアミドアルキルスルホン酸、ビニルスルホン酸、アクリルアミドｔ－ブチルスルホン酸、スチレンスルホン酸、及びそれらの金属塩等が挙げられる。
【0047】
弱カチオン基を有する反応性モノマーの例としては、アクリル酸、２－アクリロキシエチルコハク酸、２－アクリロイロキシエチルヘキサヒドロフタル酸、２－アクリロイロキシエチルフタル酸、メタクリル酸、２－メタクリロキシエチルコハク酸、２－メタクリロイロキシエチルヘキサヒドロフタル酸、２－メタクリロイロキシエチルフタル酸、２－ビニル安息香酸、３－ビニル安息香酸、４－ビニル安息香酸、及びそれらの金属塩等が挙げられる。
【0048】
アニオン基を有する反応性モノマーの例としては、２－（ジメチルアミノ）エチルアクリレート、２－（ジエチルアミノ）エチルアクリレート、２－（ジメチルアミノ）エチルアクリレート、及び２－（ジエチルアミノ）エチルアクリレート、及びビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド等が挙げられる。
【0049】
イオン交換基（ＩＥＸ）導入前駆体を有する反応性モノマーの例としては、グリシジルメタクリレート、グリシジルエーテル、スチレン、クロロメチルスチレン、アクリロニトリル、アクロレイン、及びビニルベンジル等が挙げられる。
【0050】
イオン交換基導入前駆体を有する反応性モノマーがグリシジルメタクリレートの場合、基材上でグリシジルメタクリレートを重合してグラフト鎖を形成した後、亜硫酸ナトリウムと反応させることにより、グリシジルメタクリレートのエポキシ基の一部又は全部をスルホン酸基に変換することができる。
また、基材上でグリシジルメタクリレートを重合してグラフト鎖を形成した後、ジエチルアミンと反応させることにより、グリシジルメタクリレートのエポキシ基の一部又は全部をジエチルアミノ基に変換することができる。
さらに、基材上でグリシジルメタクリレートを重合してグラフト鎖を形成した後、イミノ二酢酸二ナトリウムと反応させることにより、グリシジルメタクリレートのエポキシ基の一部又は全部をイミノ二酢酸基に変換することができる。
また、基材上でグリシジルメタクリレートを重合してグラフト鎖を形成した後、ジエチルアミンと反応させることにより、グリシジルメタクリレートのエポキシ基の一部又は全部をジエチルアミノ基に変換することができる。
さらに、基材上でグリシジルメタクリレートを重合してグラフト鎖を形成した後、イミノ二酢酸二ナトリウムと反応させることにより、グリシジルメタクリレートのエポキシ基の一部又は全部をイミノ二酢酸基に変換することができる。
【0051】
疎水性基（ＨＩＣ）導入前駆体を有する反応性モノマーの例としては、グリシジルメタクリレート、グリシジルエーテル及びスチレン等が挙げられる。
【0052】
実施の形態に係るクロマトグラフィー担体のグラフト鎖の結合率（グラフト率）は、吸着容量等の観点から２０％以上が好ましく、より好ましくは２５％以上、さらに好ましくは３０％以上である。また、力学的に安定な強度を確保するという観点から、好ましくは３００％以下、より好ましくは２００％以下、さらに好ましくは１５０％以下、特に好ましくは１２０％以下である。しかし、好適なグラフト率は用いる基材や導入するモノマー単位に依存するため、適宜最適化を行うことが望ましく、上記範囲に限定されない。グラフト率は下記（１）式によって算出される。
【0053】
グラフト率：ｄg（％）＝（ｗ1－ｗ０）／ｗ０×１００ ・・・式（１）
ここで、ｗ０はグラフト鎖が導入される前の基材の質量、ｗ1はグラフト鎖が導入された後の基材、すなわちクロマトグラフィー担体の質量である。
ここで、ｗ０はグラフト鎖が導入される前の基材の質量、ｗ1はグラフト鎖が導入された後の基材、すなわちクロマトグラフィー担体の質量である。
【0054】
通常、反応性モノマーは、基材内部の非晶部に入り込んでグラフト重合され、基材内部にもグラフト鎖が形成されると考えられる。しかし、グラフト鎖が吸着する吸着対象分子は、基材内部の非晶部に入れる大きさではない。そのため、基材内部に形成されたグラフト鎖は、吸着対象分子の吸着に利用できない。グラフト重合の開始点を生成する放射線の照射線量は、高いと開始点が多く、低いと開始点が少ない。そのため、同一のグラフト率では、照射線量が低い方が、開始点が少ないので、長いグラフト鎖が形成している。したがって、照射線量を低くすることで、基材上に多くのグラフト鎖が形成され、より多くのグラフト鎖を吸着対象分子の吸着に有効に利用することが可能である。この時の照射線量の目安としては、１０～５０ｋGｙであることが好ましい。
【0055】
基材内部に形成されるグラフト鎖は、内部グラフト鎖、或いはポリマールーツと呼ばれる。基材上に形成されるグラフト鎖は、表面グラフト鎖、或いはポリマーブラシと呼ばれる。実施の形態に係るクロマトグラフィー担体において、グラフト鎖全体に占める表面グラフト鎖の割合は、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上である。表面グラフト鎖の割合は、エポキシ基等のイオン交換基導入前駆体のイオン交換基へのモル転化率と、イオン交換基の吸着対象分子の飽和吸着量と、の関係を示すグラフを作成して現れる変曲点におけるモル転化率と一致する。好ましくは、実施の形態に係るクロマトグラフィー担体において、基材内部に、グラフト鎖が実質的に形成されない。
【0056】
実施の形態に係るモノフィラメント糸又はマルチフィラメント糸である基材に、ＩＥＸ又はＨＩＣを有するグラフト鎖を、グラフト重合を介して導入した基材を、芯材に巻回することにより、タンパク質精製用ＩＥＸ又はＨＩＣワインドフィルターカートリッジモジュール（ＩＥＸ－ＷＦＣ、ＨＩＣ－ＷＦＣ）を作製できる。芯材（例えば、円筒状芯材）は、多孔質であってもよい。また、フィラメント糸を円筒状芯材に巻きつけた後、円筒状芯材を抜いてもよい。
実施の形態に係るクロマトグラフィー担体は、グラフト鎖が導入された基材を芯材に巻回し、任意に芯材を取り除いて形成されてなるワインドフィルターカートリッジモジュールの形態を有する。
実施の形態に係るクロマトグラフィー担体は、グラフト鎖が導入された基材を芯材に巻回し、任意に芯材を取り除いて形成されてなるワインドフィルターカートリッジモジュールの形態を有する。
【0057】
ワインドフィルターカートリッジモジュール(ＷＦＣ）は、シングルユースとして、好適に使用できる。つまり、ＩＥＸ－ＷＦＣ又はＨＩＣ－ＷＦＣは、シングルユースとして、好適に使用できる。
【0058】
実施の形態に係るＩＥＸ－ＷＦＣ又はＨＩＣ－ＷＦＣによれば、高流速域でのタンパク質の吸着及び分離性能と、細孔が目詰まりしにくい性能と、を両立することが可能である。また、実施の形態に係るクロマトグラフィー担体は、タンパク質の高吸着容量を有し、湿潤強度に優れる。
【0059】
通常、芯材の直径は３０ｍｍ程度のものがよく用いられる。巻回体の厚みは、２０ｍｍ～１００ｍｍ程度に設定する。より厚い方が不純物を逃さず吸着できるが、厚すぎると液を透過させるときの透過圧力が増える。厚みは２０ｍｍ以上あれば、最低限の吸着性能は担保でき、１００ｍｍ以下であれば、さほど透過圧力が大きくならない。
【0060】
また、ＷＦＣの捕捉粒子径は、通常、シリカやラテックスの均質粒子を含む液を透過させ、透過側に検出されるかどうかで測定される。均質粒子の９０％以上を捕捉した粒子径を、そのＷＦＣの孔径と定義する。
モノフィラメント糸又はマルチフィラメント糸の糸径により、ＷＦＣの孔径をコントロールでき、細い糸を巻回するほど、孔径は小さくなり、太い糸を用いるほど孔径は大きくなる。本実施形態では、ＷＦＣの孔径０．５μｍ以上、５００μｍ以下が好ましく、より好ましくは、１μｍ以上、１５０μｍ以下である。孔径が小さいと透過圧力が大きくなり、孔径が大きすぎると動的吸着性能が悪くなる。孔径が０．５μｍ以上であれば、透過圧力は許容範囲であり、５００μｍ以下であれば、動的吸着性能にもそれほど影響しない。
モノフィラメント糸又はマルチフィラメント糸の糸径により、ＷＦＣの孔径をコントロールでき、細い糸を巻回するほど、孔径は小さくなり、太い糸を用いるほど孔径は大きくなる。本実施形態では、ＷＦＣの孔径０．５μｍ以上、５００μｍ以下が好ましく、より好ましくは、１μｍ以上、１５０μｍ以下である。孔径が小さいと透過圧力が大きくなり、孔径が大きすぎると動的吸着性能が悪くなる。孔径が０．５μｍ以上であれば、透過圧力は許容範囲であり、５００μｍ以下であれば、動的吸着性能にもそれほど影響しない。
【0061】
クロマトグラフィー工程において、ＷＦＣへ被処理液を透過させるときの透過圧力は、１００ｋＰａ以下であることが好ましく、５０ｋＰａ以下であることがより好ましい。さらに好ましくは３５ｋＰａ以下である。
【0062】
実施の形態に係るＷＦＣは、目的タンパク質を精製するための方法に使用することができる。実施の形態に係る精製方法は、目的タンパク質と不純物を含む被処理液中の目的タンパク質を精製するクロマトグラフィー工程を含み、任意に、膜ろ過工程及び／又はウイルス除去工程を含む。膜ろ過工程及びウイルス除去工程は、それぞれ、好ましくはクロマトグラフィー工程よりも後に行う。膜ろ過工程及びウイルス除去工程をともに行う場合の好適順は、膜ろ過工程、次いでウイルス除去工程の順である。
以下、図１を参照して、タンパク質の精製方法の例示のフローを説明する。なお、図１では、被処理液が細胞の連続培養で得られる場合について例示するが、被処理液の種類及び調製方法は目的に応じて適宜選定され得る。
以下、図１を参照して、タンパク質の精製方法の例示のフローを説明する。なお、図１では、被処理液が細胞の連続培養で得られる場合について例示するが、被処理液の種類及び調製方法は目的に応じて適宜選定され得る。
【0063】
［被処理液を準備する工程］
まず、培地を培養槽に供給しながら培養液を培養槽から抜き出すことで、目的タンパク質を生産する細胞を連続培養する（図１（Ａ））。なお、連続培養とは、培地を培養槽に連続的に供給するとともに、同量の培養液を同時に抜き出す方法である。この際、抜き出した培養液から細胞を培養槽内に戻し、槽内培養液中の細胞を定常状態で培養する。連続培養で得られた培養液を分離膜に通過させて培養液から細胞を分離除去して、目的タンパク質及び不純物を含む被処理液を得る（図１（Ｂ））。
まず、培地を培養槽に供給しながら培養液を培養槽から抜き出すことで、目的タンパク質を生産する細胞を連続培養する（図１（Ａ））。なお、連続培養とは、培地を培養槽に連続的に供給するとともに、同量の培養液を同時に抜き出す方法である。この際、抜き出した培養液から細胞を培養槽内に戻し、槽内培養液中の細胞を定常状態で培養する。連続培養で得られた培養液を分離膜に通過させて培養液から細胞を分離除去して、目的タンパク質及び不純物を含む被処理液を得る（図１（Ｂ））。
【0064】
［クロマトグラフィー工程］
次いで、上記被処理液をクロマトグラフィー担体に通過させて目的タンパク質の精製を行う（クロマトグラフィー工程）。精製は、被処理液からの不純物の分離除去、及び／又は、被処理液からの目的タンパク質の分離回収であってよい。図１では、被処理液を、陰イオン交換材料に通過させ（図１（Ｃ））、次いで疎水材料に通過させ（図１（Ｄ））、次いで陽イオン交換材料に通過させる（図１（Ｅ））処理の例を示しているが、クロマトグラフィー担体は１つ以上用いればよい。また、被処理液を、キレート形成材料に通過させてもよい。すなわち、クロマトグラフィー工程における処理は、単独のクロマトグラフィー担体で実施してもよく、又は、２つ以上のクロマトグラフィー担体で実施してもよい。なお、被処理液を通過させる順序は特に制限されず、実施の形態に応じて変更できる。
次いで、上記被処理液をクロマトグラフィー担体に通過させて目的タンパク質の精製を行う（クロマトグラフィー工程）。精製は、被処理液からの不純物の分離除去、及び／又は、被処理液からの目的タンパク質の分離回収であってよい。図１では、被処理液を、陰イオン交換材料に通過させ（図１（Ｃ））、次いで疎水材料に通過させ（図１（Ｄ））、次いで陽イオン交換材料に通過させる（図１（Ｅ））処理の例を示しているが、クロマトグラフィー担体は１つ以上用いればよい。また、被処理液を、キレート形成材料に通過させてもよい。すなわち、クロマトグラフィー工程における処理は、単独のクロマトグラフィー担体で実施してもよく、又は、２つ以上のクロマトグラフィー担体で実施してもよい。なお、被処理液を通過させる順序は特に制限されず、実施の形態に応じて変更できる。
【0065】
［膜ろ過工程及びウイルス除去工程］
クロマトグラフィー工程で得た被処理液を、所望に応じて、膜ろ過工程（図１（Ｆ））、及び／又はウイルス除去工程（図１（Ｇ））に供して、目的タンパク質をさらに精製してよい。
クロマトグラフィー工程で得た被処理液を、所望に応じて、膜ろ過工程（図１（Ｆ））、及び／又はウイルス除去工程（図１（Ｇ））に供して、目的タンパク質をさらに精製してよい。
【0066】
以上の手順で精製された目的タンパク質を回収する（図１（Ｈ））。
【0067】
上記の膜ろ過工程及びウイルス除去工程は、クロマトグラフィー工程により除去しきれない不純物が存在する場合の不純物のさらなる除去、及び／又は脱塩の目的で行うことができる。膜ろ過工程は、クロマトグラフィー工程の後段に設けてよく、例えば、中空糸型限外ろ過（ＵＦ）膜モジュールを用いて行うことができる。目的タンパク質よりも高分子量の不純物が存在する場合には、目的タンパク質よりも少し大きな分画分子量を持つＵＦ膜モジュールを設置することで、目的タンパク質は膜を透過し、不純物は膜を透過できない。一方、目的タンパク質よりも低分子量の不純物の場合には、不純物を透過し、目的タンパク質を阻止する分画分子量を選定する。目的タンパク質が抗体の場合、その分子量が１５０，０００前後であることから、ＵＦ膜の分画分子量は１０，０００以上８００，０００以下の範囲から選ばれることが好ましい。膜ろ過工程は、クロマトグラフィー工程の後段で、分画分子量が１０，０００以上、８００，０００以下のろ過（ＵＦ）膜に被処理液を通過させる工程である。
【0068】
また、上記のウイルス除去工程は、ウイルス除去フィルターに被処理液を通過させる工程であり、好ましくは膜ろ過工程の後に行う。ウイルス除去フィルターとしては、中空糸型限外ろ過（ＵＦ）膜モジュールを使用できる。中空糸型限外ろ過（ＵＦ）膜モジュールに被処理液を通過させると、目的タンパク質は膜を透過する一方、ウイルスは膜を透過できないため、ウイルス除去を効率的に実施することができる。
【0069】
クロマトグラフィー工程の後に、ＩＥＸ－ＷＦＣ及びＨＩＣ－ＷＦＣにおいて被処理液をフロースルーモードで流下する工程を含む場合、クロマトグラフィー担体の後段に配置されたＵＦ膜モジュール（一態様において、膜ろ過工程及び／又はウイルス除去工程で用いるモジュール）は、間にタンクなどを置かず、スムーズにろ過操作を実施することが可能になる。また、実施の形態によれば、ＷＦＣの透過圧力が低いので、ＩＥＸ－ＷＦＣ及びＨＩＣ－ＷＦＣを直列に接続でき、またＵＦ膜モジュールもそのまま接続することが可能である。
【0070】
膜ろ過工程及びウイルス除去工程で用いるＵＦ膜の材質は、目的タンパク質の膜表面への非特異的な吸着が起きないように親水性の材料であることが好ましい。親水性材料として、ＰＡＮ（ポリアクリロニトリル）、ＣＴＡ（三酢酸セルロース）などを挙げることができる。
【0071】
被処理液を細胞培養で得る場合、当該細胞培養は、連続培養であることが好ましい。前述のように、連続培養とは、培地を培養槽に連続的に供給するとともに、同量の培養液を同時に抜き出す。抜き出した培養液から細胞を培養槽内に戻し、槽内培養液中の細胞を定常状態で培養する方法である。連続培養を採用すると、細胞培養から目的タンパク質の精製までを一貫して連続的に実施できるため、好ましい。特に、目的タンパク質は、中空糸膜モジュール、例えば後述するような精密ろ過（ＭＦ）膜を使ったタンジェンシャルフロー型の連続培養で生産されることが好ましい。
【0072】
中空糸膜モジュールは、シングルユースであることが好ましい。
【0073】
実施の形態によれば、クロマトグラフィー工程におけるＩＥＸ－ＷＦＣ及びＨＩＣ－ＷＦＣの透過圧力が低いので、連続培養のろ液出口にＩＥＸ－ＷＦＣ及びＨＩＣ－ＷＦＣを直接接続して、連続培養からクロマトグラフィー工程までをフロースルーモードにより運転することができる。
【0074】
培養液を培養槽から抜き出すときに、通常分離膜が用いられる。分離膜は、一態様において、中空糸膜モジュールから構成される。分離膜は細胞を阻止して培養液（被処理液）だけを透過するために、孔径０．０５～０．７μｍ程度の分離膜（精密ろ過（ＭＦ）膜）が使用される。この時、分離膜が目詰まりしないように、クロスフローろ過により運転されることが多いが、それでも目詰まりを防ぐこと、目的タンパク質の分離膜への非特異的吸着が発生する場合がある。
【0075】
この目詰まりの問題を回避する観点から、分離膜は、３次元網目構造であることが好ましく、膜材質はポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）やポリエチレン（ＰＥ）などが好ましい。また、内表面開口率は２５％以上であることが好ましく、５０％以下であることが好ましい。このような膜を採用することで、クロスフローろ過が効率的に行え、また分離膜への非特異的吸着を抑制することができる。
さらに、内径１～５ｍｍの分離膜であれば、クロスフロー流の透過圧力が低く、好適に使用できる。加えて、生産効率の観点から内表面膜面積は１ｍ２以上であることが好ましい。
さらに、内径１～５ｍｍの分離膜であれば、クロスフロー流の透過圧力が低く、好適に使用できる。加えて、生産効率の観点から内表面膜面積は１ｍ２以上であることが好ましい。
【実施例0076】
以下に、実施の形態を実施例に基づいてさらに詳しく説明するが、これらは実施の形態を何ら限定するものではない。
（ａ）以下に示す方法で、タンパク質の精製のための担体（ワインドフィルターカートリッジモジュール）を作製した。
（１）グリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）の放射線グラフト重合
直径約３５μｍのナイロン繊維にガンマ線を２０ｋＧｙ照射した。次に予め窒素バブリングにより脱酸素したグリシジルメタクリレート／メタノール（＝１／９重量比）のモノマー溶液に浸漬し、４５℃で６時間反応させた。反応終了後の繊維をジメチルホルムアミド溶液に浸漬し、さらにメタノールに浸漬して洗浄した。乾燥後の重量を測定することにより、質量増加率（グラフト率）は１０４％であった。
（ａ）以下に示す方法で、タンパク質の精製のための担体（ワインドフィルターカートリッジモジュール）を作製した。
（１）グリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）の放射線グラフト重合
直径約３５μｍのナイロン繊維にガンマ線を２０ｋＧｙ照射した。次に予め窒素バブリングにより脱酸素したグリシジルメタクリレート／メタノール（＝１／９重量比）のモノマー溶液に浸漬し、４５℃で６時間反応させた。反応終了後の繊維をジメチルホルムアミド溶液に浸漬し、さらにメタノールに浸漬して洗浄した。乾燥後の重量を測定することにより、質量増加率（グラフト率）は１０４％であった。
【0077】
（２）ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド（ＶＢＴＡＣ）の放射線グラフト重合（ＶＢＴＡＣ／ＮＶＰ－ＡＥＸ）
直径約１４μｍのナイロン繊維にガンマ線を２０ｋＧｙ照射した。次に予め窒素バブリングにより脱酸素したＶＢＴＡＣ／Ｎ－ビニルピロリドン／純水（＝１／１／８重量比）のモノマー溶液に浸漬し、４５℃で６時間反応させた。反応終了後の繊維をジメチルホルムアミド溶液に浸漬し、さらにメタノールに浸漬して洗浄した。乾燥後の重量を測定することにより、質量増加率（グラフト率）は４０％であった。
質量増加率から計算するとトリメチルアミノ基導入量は、０．８ｍｍｏｌ／ｇであった。
直径約１４μｍのナイロン繊維にガンマ線を２０ｋＧｙ照射した。次に予め窒素バブリングにより脱酸素したＶＢＴＡＣ／Ｎ－ビニルピロリドン／純水（＝１／１／８重量比）のモノマー溶液に浸漬し、４５℃で６時間反応させた。反応終了後の繊維をジメチルホルムアミド溶液に浸漬し、さらにメタノールに浸漬して洗浄した。乾燥後の重量を測定することにより、質量増加率（グラフト率）は４０％であった。
質量増加率から計算するとトリメチルアミノ基導入量は、０．８ｍｍｏｌ／ｇであった。
【0078】
（３）ＧＭＡグラフト繊維へのトリエチレンジアミノ（ＴＥＤＡ）基の導入（ＴＥＤＡ－ＡＥＸ）
（１）で得られたＧＭＡグラフト繊維をｐＨ９になるよう塩酸で調整した１０質量％ＴＥＤＡ水溶液に浸漬し、７０℃で６時間加温し、ＴＥＤＡ導入反応を行った。反応後の繊維をメタノール洗浄後、乾燥質量を測定し、質量増加率を測定すると４０．１％であった。質量増加率からＴＥＤＡ導入量を計算すると１．９ｍｍｏｌ／ｇであった。
（１）で得られたＧＭＡグラフト繊維をｐＨ９になるよう塩酸で調整した１０質量％ＴＥＤＡ水溶液に浸漬し、７０℃で６時間加温し、ＴＥＤＡ導入反応を行った。反応後の繊維をメタノール洗浄後、乾燥質量を測定し、質量増加率を測定すると４０．１％であった。質量増加率からＴＥＤＡ導入量を計算すると１．９ｍｍｏｌ／ｇであった。
【0079】
（４）ＧＭＡグラフト繊維へのジエチルアミノ（ＤＥＡ）基の導入（ＤＥＡ－ＡＥＸ）
（１）で得られたＧＭＡグラフト繊維を５０ｖ／ｖ％のジエチルアミン水溶液に４０℃で１５時間浸漬し、グリシジルメタクリレート由来のエポキシ基にアニオン交換基としてのジエチルアミノ基を導入後、メタノールで十分に洗浄した。質量増加率から、ＤＥＡ導入量を計算すると１．６ｍｍｏｌ／ｇであった。
（１）で得られたＧＭＡグラフト繊維を５０ｖ／ｖ％のジエチルアミン水溶液に４０℃で１５時間浸漬し、グリシジルメタクリレート由来のエポキシ基にアニオン交換基としてのジエチルアミノ基を導入後、メタノールで十分に洗浄した。質量増加率から、ＤＥＡ導入量を計算すると１．６ｍｍｏｌ／ｇであった。
【0080】
（５）ＧＭＡグラフト繊維へのスルホン酸基の導入（ＣＥＸ）
（１）で得られたＧＭＡグラフト繊維を、タウリン溶液（濃度: ５０質量％、溶媒: ジオキサン／水＝１／１、ｐＨ：１３）に４０℃で１５時間浸漬し、グリシジルメタクリレート由来のエポキシ基にカチオン交換基としてのスルホン酸基を導入後、メタノールで十分に洗浄した。質量増加率から、スルホン酸基導入量を計算すると１．６ｍｍｏｌ／ｇであった。
（１）で得られたＧＭＡグラフト繊維を、タウリン溶液（濃度: ５０質量％、溶媒: ジオキサン／水＝１／１、ｐＨ：１３）に４０℃で１５時間浸漬し、グリシジルメタクリレート由来のエポキシ基にカチオン交換基としてのスルホン酸基を導入後、メタノールで十分に洗浄した。質量増加率から、スルホン酸基導入量を計算すると１．６ｍｍｏｌ／ｇであった。
【0081】
（６）ＧＭＡグラフト繊維へのキレート形成基の導入（ＣＨＥ）
（１）で得られたＧＭＡグラフト繊維を、イミノ二酢酸二ナトリウム溶液（濃度: ０．５Ｍ、溶媒: イソプロピルアルコール／水＝１／１）に５０℃で１５時間浸漬し、グリシジルメタクリレート由来のエポキシ基にキレート形成基としてのイミノ二酢酸基を導入後、メタノールで十分に洗浄した。質量増加率から、ＣＨＥ導入量を計算すると１．５ｍｍｏｌ／ｇであった。
（１）で得られたＧＭＡグラフト繊維を、イミノ二酢酸二ナトリウム溶液（濃度: ０．５Ｍ、溶媒: イソプロピルアルコール／水＝１／１）に５０℃で１５時間浸漬し、グリシジルメタクリレート由来のエポキシ基にキレート形成基としてのイミノ二酢酸基を導入後、メタノールで十分に洗浄した。質量増加率から、ＣＨＥ導入量を計算すると１．５ｍｍｏｌ／ｇであった。
【0082】
（７）ＧＭＡグラフト繊維への疎水性基の導入（ＨＩＣ）
（１）で得られたＧＭＡグラフト繊維を、１０質量％ドデシルアミンーイソプロパノール溶液に７０℃で６時間浸漬し、グリシジルメタクリレート由来のエポキシ基に疎水性基としてのドデシル基を導入後、メタノールで十分に洗浄した。質量増加率から、ドデシル基（疎水性基）導入量を計算すると１．５ｍｍｏｌ／ｇであった。
（１）で得られたＧＭＡグラフト繊維を、１０質量％ドデシルアミンーイソプロパノール溶液に７０℃で６時間浸漬し、グリシジルメタクリレート由来のエポキシ基に疎水性基としてのドデシル基を導入後、メタノールで十分に洗浄した。質量増加率から、ドデシル基（疎水性基）導入量を計算すると１．５ｍｍｏｌ／ｇであった。
【0083】
（８）ワインドフィルターカートリッジモジュール（ＷＦＣ）の作製
（２）～（７）で得られたそれぞれの官能基が入ったグラフト繊維（担体）をポリプロピレン製の直径３０ｍｍ、長さ２５０ｍｍの芯材に、厚みが２０ｍｍになるまで巻回させてから芯材を除き、ＶＢＴＡＣ／ＮＶＰ－ＡＥＸ、ＴＥＤＡ－ＡＥＸ、ＤＥＡ－ＡＥＸ、ＣＥＸ、ＣＨＥ及びＨＩＣが導入されたワインドフィルターカートリッジモジュールをそれぞれ作製した。
（２）～（７）で得られたそれぞれの官能基が入ったグラフト繊維（担体）をポリプロピレン製の直径３０ｍｍ、長さ２５０ｍｍの芯材に、厚みが２０ｍｍになるまで巻回させてから芯材を除き、ＶＢＴＡＣ／ＮＶＰ－ＡＥＸ、ＴＥＤＡ－ＡＥＸ、ＤＥＡ－ＡＥＸ、ＣＥＸ、ＣＨＥ及びＨＩＣが導入されたワインドフィルターカートリッジモジュールをそれぞれ作製した。
【0084】
（９）作製したＷＦＣの孔径の測定
作製したＷＦＣにユニフォームラテックス：ＰＭ０１０ＵＭ（粒子径：１０μｍ、Ｍａｇｓｐｈｅｒｅ社）の均質粒子を０．１％含む水溶液を透過させ、透過側で検出されるかどうかを確認したところ、１００％阻止することを確認した。一方、ＰＭ００５ＵＭ（粒子径：５μｍ、Ｍａｇｓｐｈｅｒｅ社）の均質粒子を同様に透過させると、１０％の阻止率であった。この結果から、作製したＷＦＣの孔径を１０μｍと判断した。
作製したＷＦＣにユニフォームラテックス：ＰＭ０１０ＵＭ（粒子径：１０μｍ、Ｍａｇｓｐｈｅｒｅ社）の均質粒子を０．１％含む水溶液を透過させ、透過側で検出されるかどうかを確認したところ、１００％阻止することを確認した。一方、ＰＭ００５ＵＭ（粒子径：５μｍ、Ｍａｇｓｐｈｅｒｅ社）の均質粒子を同様に透過させると、１０％の阻止率であった。この結果から、作製したＷＦＣの孔径を１０μｍと判断した。
【0085】
［実施例１］
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に０．１７Ｍの濃度となるようにＮａＣｌを添加し、金属塩を含む緩衝液を調製した。この緩衝液にＢＳＡ（ｐＩ：５．６）を１ｇ／Ｌの濃度で溶解して、タンパク質溶液を調製した。このタンパク質溶液２０ＬをＶＢＴＡＣ／ＮＶＰ－ＡＥＸ、ＴＥＤＡ－ＡＥＸ、ＤＥＡ－ＡＥＸ及びＨＩＣそれぞれが導入されたＷＦＣの中心から外側に向かって、１ｍＬ／ｍｉｎ／ｍＬ－Ｂｅｄの速度で通液させ、タンパク質吸着実験を行った。ＶＢＴＡＣ／ＮＶＰ－ＡＥＸ、ＴＥＤＡ－ＡＥＸ、ＤＥＡ－ＡＥＸ及びＨＩＣの吸着容量は、それぞれ６８、７３、８０、６５ｍｇ／ｍＬ－Ｂｅｄであった。また、２０Ｌのタンパク質溶液を流し切ったときの透過圧力は、それぞれ２９、３０、３２及び３０ｋＰａであり、高い吸着容量にも関わらず、低圧で運転できることがわかり、フロースルーモードでの使用に適していることが分かった。
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に０．１７Ｍの濃度となるようにＮａＣｌを添加し、金属塩を含む緩衝液を調製した。この緩衝液にＢＳＡ（ｐＩ：５．６）を１ｇ／Ｌの濃度で溶解して、タンパク質溶液を調製した。このタンパク質溶液２０ＬをＶＢＴＡＣ／ＮＶＰ－ＡＥＸ、ＴＥＤＡ－ＡＥＸ、ＤＥＡ－ＡＥＸ及びＨＩＣそれぞれが導入されたＷＦＣの中心から外側に向かって、１ｍＬ／ｍｉｎ／ｍＬ－Ｂｅｄの速度で通液させ、タンパク質吸着実験を行った。ＶＢＴＡＣ／ＮＶＰ－ＡＥＸ、ＴＥＤＡ－ＡＥＸ、ＤＥＡ－ＡＥＸ及びＨＩＣの吸着容量は、それぞれ６８、７３、８０、６５ｍｇ／ｍＬ－Ｂｅｄであった。また、２０Ｌのタンパク質溶液を流し切ったときの透過圧力は、それぞれ２９、３０、３２及び３０ｋＰａであり、高い吸着容量にも関わらず、低圧で運転できることがわかり、フロースルーモードでの使用に適していることが分かった。
【0086】
［比較例１］
実施例１で調製したタンパク質溶液をＱｙｕ Ｓｐｅｅｄ Ｄ １５０ｍＬ（旭化成メディカル社製、中空糸膜、３級アミノ基）に膜の内面から外面へ向かって、１ｍＬ／ｍｉｎ／ｍＬ－Ｂｅｄの速度で通液させ、タンパク質吸着実験を行った。吸着容量は７０ｍｇ／ｍＬであり、２０Ｌのタンパク質溶液を流し切ったときの透過圧力は、１５０ｋＰａであり、吸着とともに上昇した。
実施例１で調製したタンパク質溶液をＱｙｕ Ｓｐｅｅｄ Ｄ １５０ｍＬ（旭化成メディカル社製、中空糸膜、３級アミノ基）に膜の内面から外面へ向かって、１ｍＬ／ｍｉｎ／ｍＬ－Ｂｅｄの速度で通液させ、タンパク質吸着実験を行った。吸着容量は７０ｍｇ／ｍＬであり、２０Ｌのタンパク質溶液を流し切ったときの透過圧力は、１５０ｋＰａであり、吸着とともに上昇した。
【0087】
［実施例２］
１５０ｍＭ リン酸（ｐＨ６．０）緩衝液にリゾチーム（ｐＩ：１１．３５）を１ｇ／Ｌの濃度で溶解して、タンパク質溶液を調製した。このタンパク質溶液２０ＬをＣＥＸが導入されたＷＦＣの中心から外側に向かって、１ｍＬ／ｍｉｎ／ｍＬ－Ｂｅｄの速度で通液させ、タンパク質吸着実験を行った。１５０ｍＭという高いイオン強度下でも吸着容量は、８０ｍｇ／ｍＬ－Ｂｅｄであった。また、２０Ｌのタンパク質溶液を流し切ったときの透過圧力は、３５ｋＰａであり、高い吸着容量にも関わらず、低圧で運転できることがわかり、フロースルーモードでの使用に適していることが分かった。
［実施例３］
ＣＨＥが導入されたＷＦＣの中心から外側に１０ｍＭ硫酸ニッケル溶液（１０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ：５．０）を透過して，ＮｉイオンをＣＨＥとのキレート形成によってＷＦＣに固定した。
ヒスチジンタグのついた緑色蛍光タンパク質を大腸菌に発現させるため、Ｈｉｓ－ｔａｇ融合ＧＦＰ遺伝子を導入したｐＵＣ１９－ＧＦＰｕｖ／Ｈｉｓで形質転換した大腸菌ＤＨ１０ＢをＬＢ培地で３７℃、１２ｈ培養した。遠心集菌し、液体窒素を用いて、凍結と融解を３回繰り返し、溶菌し、遠心上清を、上記Ｎｉイオンを固定したＣＨＥ－ＷＦＣに１ｍＬ／ｍｉｎ／ｍＬ－Ｂｅｄの速度で通液させ、タンパク質吸着実験を行った。その後０．５ＭのＮａＣｌ溶液（１０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ：５．０）で溶離させると、ヒスチジンタグのついた緑色蛍光タンパク質だけを溶離できていることをＳＤＳ－ＰＡＧＥにて確認した。透過圧力は、３５ｋＰａであり、低圧で運転できることが分かった。
１５０ｍＭ リン酸（ｐＨ６．０）緩衝液にリゾチーム（ｐＩ：１１．３５）を１ｇ／Ｌの濃度で溶解して、タンパク質溶液を調製した。このタンパク質溶液２０ＬをＣＥＸが導入されたＷＦＣの中心から外側に向かって、１ｍＬ／ｍｉｎ／ｍＬ－Ｂｅｄの速度で通液させ、タンパク質吸着実験を行った。１５０ｍＭという高いイオン強度下でも吸着容量は、８０ｍｇ／ｍＬ－Ｂｅｄであった。また、２０Ｌのタンパク質溶液を流し切ったときの透過圧力は、３５ｋＰａであり、高い吸着容量にも関わらず、低圧で運転できることがわかり、フロースルーモードでの使用に適していることが分かった。
［実施例３］
ＣＨＥが導入されたＷＦＣの中心から外側に１０ｍＭ硫酸ニッケル溶液（１０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ：５．０）を透過して，ＮｉイオンをＣＨＥとのキレート形成によってＷＦＣに固定した。
ヒスチジンタグのついた緑色蛍光タンパク質を大腸菌に発現させるため、Ｈｉｓ－ｔａｇ融合ＧＦＰ遺伝子を導入したｐＵＣ１９－ＧＦＰｕｖ／Ｈｉｓで形質転換した大腸菌ＤＨ１０ＢをＬＢ培地で３７℃、１２ｈ培養した。遠心集菌し、液体窒素を用いて、凍結と融解を３回繰り返し、溶菌し、遠心上清を、上記Ｎｉイオンを固定したＣＨＥ－ＷＦＣに１ｍＬ／ｍｉｎ／ｍＬ－Ｂｅｄの速度で通液させ、タンパク質吸着実験を行った。その後０．５ＭのＮａＣｌ溶液（１０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ：５．０）で溶離させると、ヒスチジンタグのついた緑色蛍光タンパク質だけを溶離できていることをＳＤＳ－ＰＡＧＥにて確認した。透過圧力は、３５ｋＰａであり、低圧で運転できることが分かった。
【0088】
（ｂ）以下に示す方法で、連続培養用精密ろ過（ＭＦ）中空糸膜ミニモジュールを作製した。
【0089】
熱可塑性樹脂としてＰＶＤＦ樹脂（クレハ社製、ＫＦ－Ｗ＃１０００）４０質量％と、微粉シリカ（一次粒径：１６ｎｍ）２３質量％と、非溶剤としてアジピン酸ビス２－エチルヘキシル（ＤＯＡ）３２．９質量％と、貧溶剤としてアセチルクエン酸トリブチル（ＡＴＢＣ,沸点３４３℃）４．１質量％とを用いて、溶融混練物を調製した。得られた溶融混練物の温度は２４０℃であった。得られた溶融混練物を２重管構造の紡糸ノズルを用い、中空糸状押出し物を１２０ｍｍの空走距離を通した後、３０℃の水中で固化させ、熱誘起相分離法により多孔質構造を発達させた。得られた中空糸状押出し物を、５ｍ/分の速度で引き取り、かせに巻き取った。巻き取った中空糸状押出し物をイソプロピルアルコール中に浸漬させてＤＯＡとＡＴＢＣを抽出除去し、次いで、水中に３０分間浸漬し、中空糸膜を水置換し、次いで、２０質量％ＮａＯＨ水溶液中に７０℃にて１時間浸漬し、更に水洗を繰り返して微粉シリカを抽出除去して、多孔質中空糸膜を作製した。
【0090】
有効長５００ｍｍのモジュールケースに膜面積が１．９ｍ２となるように、得られた多孔質中空糸膜を入れ、両端をエポキシ樹脂によりポッティングし、両端開口の連続培養用精密ろ過（ＭＦ）中空糸膜ミニモジュールを作製した。
【0091】
（ｃ）以下に示す方法で、中空糸型限外ろ過（ＵＦ）膜モジュールを作製した。
【0092】
モノマーとして、アクリロニトリル９１．５質量％、アクリル酸メチル８．０質量％及びメタリルスルホン酸ナトリウム０．５質量％で重合したコポリマ一（極限粘度：１．２）１８質量％及び重量平均分子量６００のポリエチレングリコール（和光純薬社製、ＰＥＧ６００)２１．０質量％を、プロピレンカーボネート９．１５質量％とジメチルスルホキシド５１．８５質量％との混合溶剤に溶解して均一溶液とした。溶液中の水分量は、カールフィッシャー水分計で測定したところ６００ｐｐｍ以下であった。この溶液を６０℃に保ち、テトラエチレングリコール５０質量％と水５０質量％との混合溶液（２０℃で２４ｃＰの粘度）からなる内部液とともに、紡口（二重環状ノズル０．５ｍｍ-０．７ｍｍ-１．３ｍｍ)から吐出させ、２０ｍｍのエアギャップを通過させて４３℃の水からなる全長５ｍの凝固浴槽を通過させ、多孔質中空糸状ろ過膜を得た。
この時、紡口から凝固浴までを円筒状の筒で囲み、筒の中のエアギャップ部の相対湿度を１００％に制御した。また、紡速は、１０ｍ／分に固定した。得られた中空糸状ろ過膜を２５℃の純水中に１日間浸潰して膜中の残存溶剤を充分取り除いた。湿潤膜中のポリエチレングリコール、プロピレンカーボネート及びジメチルスルホキシドの残存量は１ｐｐｍ以下であった。
さらに、得られた中空糸状ろ過膜を２０℃の純水中に浸漬して、１５℃／時の昇温速度で加熱して行き、到達温度５５℃の水中にて２時間浸漬した。
この時、紡口から凝固浴までを円筒状の筒で囲み、筒の中のエアギャップ部の相対湿度を１００％に制御した。また、紡速は、１０ｍ／分に固定した。得られた中空糸状ろ過膜を２５℃の純水中に１日間浸潰して膜中の残存溶剤を充分取り除いた。湿潤膜中のポリエチレングリコール、プロピレンカーボネート及びジメチルスルホキシドの残存量は１ｐｐｍ以下であった。
さらに、得られた中空糸状ろ過膜を２０℃の純水中に浸漬して、１５℃／時の昇温速度で加熱して行き、到達温度５５℃の水中にて２時間浸漬した。
【0093】
有効長２０ｃｍのモジュールケースに膜面積が１．９ｍ２となるように得られた多孔質中空糸ろ過膜を入れ、両端をエポキシ樹脂によりポッティングし、両端開口の中空糸型限外ろ過（ＵＦ）膜ミニモジュールを作製した。
【0094】
［実施例４］
目的タンパク質としてγ－グロブリンを０．５ｇ／Ｌを含むＣＨＯ無血清細胞培養液を、（ｂ）で作製した精密ろ過（ＭＦ）中空糸膜モジュールを用いてデッドエンドろ過し、除濁した液を得た。その液を（ａ）で作製したＤＥＡ－ＡＥＸ及びＨＩＣが導入されたＷＦＣに、この順に通液させ、さらにその後、（ｃ）で作製した中空糸型限外ろ過（ＵＦ）膜モジュールにフロースルーモードでろ過することで、目的タンパク質としてγ－グロブリンを連続精製した。このとき、ＤＥＡ－ＡＥＸ及びＨＩＣが導入されたＷＦＣの透過圧力が３５ｋＰａと低いので、そのまま中空糸型限外ろ過膜へ供給することができた。
代表的な不純物であるＨＣＰ及びＤＮＡの濃度は、ＤＥＡ－ＡＥＸ及びＨＩＣが導入されたＷＦＣ、及び中空糸型限外ろ過膜の透過前の細胞培養上清中にはそれぞれ、３５１μｇ／ｍＬ及び８２００ｎｇ／ｍＬであったものが、透過液中ではそれぞれ３６μｇ／ｍＬ及び５３ｎｇ／ｍＬと大幅に減少しており、これら溶存して存在する不純物タンパク質の除去に優れていることが分かった。
一方のγ－グロブリンは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにて精製できていることを確認した。この膜ろ過工程では、ポリアクリロニトリル製の中空糸型限外ろ過膜を使用しているので、非特異的な膜へのタンパク質の吸着を抑えることができ、高い分画性能を有していた。
目的タンパク質としてγ－グロブリンを０．５ｇ／Ｌを含むＣＨＯ無血清細胞培養液を、（ｂ）で作製した精密ろ過（ＭＦ）中空糸膜モジュールを用いてデッドエンドろ過し、除濁した液を得た。その液を（ａ）で作製したＤＥＡ－ＡＥＸ及びＨＩＣが導入されたＷＦＣに、この順に通液させ、さらにその後、（ｃ）で作製した中空糸型限外ろ過（ＵＦ）膜モジュールにフロースルーモードでろ過することで、目的タンパク質としてγ－グロブリンを連続精製した。このとき、ＤＥＡ－ＡＥＸ及びＨＩＣが導入されたＷＦＣの透過圧力が３５ｋＰａと低いので、そのまま中空糸型限外ろ過膜へ供給することができた。
代表的な不純物であるＨＣＰ及びＤＮＡの濃度は、ＤＥＡ－ＡＥＸ及びＨＩＣが導入されたＷＦＣ、及び中空糸型限外ろ過膜の透過前の細胞培養上清中にはそれぞれ、３５１μｇ／ｍＬ及び８２００ｎｇ／ｍＬであったものが、透過液中ではそれぞれ３６μｇ／ｍＬ及び５３ｎｇ／ｍＬと大幅に減少しており、これら溶存して存在する不純物タンパク質の除去に優れていることが分かった。
一方のγ－グロブリンは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにて精製できていることを確認した。この膜ろ過工程では、ポリアクリロニトリル製の中空糸型限外ろ過膜を使用しているので、非特異的な膜へのタンパク質の吸着を抑えることができ、高い分画性能を有していた。
【0095】
［比較例２］
市販のアニオン交換基を有する膜として、ＳａｒｔｏｂｉｎｄＱ ＭＡ７５（ザルトリウス製、平膜、膜体積２．０６ｍＬ、４級アミノ基）、ＭｕｓｔａｎｇＱ Ａｃｒｏｄｉｓｃ（ポール製、平膜、膜体積０．１８ｍＬ、４級アミノ基）及びＢｉｏＣａｐ２５Ｆｉｌｔｅｒ ９０ＺＡ（キュノ製、平膜、膜体積５ｍＬ以上、４級アミノ基）の３種類を用い、実施例４と同様にして、目的タンパク質としてγ－グロブリンを０．５ｇ／Ｌ含むＣＨＯ無血清細胞培養の上清液を、それぞれの膜体積の１００倍相当の体積分通液して不純物除去を行った。γ－グロブリンの精製ができているかの確認として、実施例４と同様にしてＳＤＳ－ＰＡＧＥによる評価を行った。
アニオン交換膜モジュール透過前の細胞培養上清中のＨＣＰ及びＤＮＡの濃度はそれぞれ、３５１μｇ／ｍＬ及び８２００ｎｇ／ｍＬであったが、透過後の液中にはそれぞれ、ＳａｒｔｏｂｉｎｄＱ ＭＡ７５で２５９μｇ／ｍＬ及び４８２ｎｇ／ｍＬ、ＭｕｓｔａｎｇＱ Ａｃｒｏｄｉｓｃで２４４μｇ／ｍＬ及び３８１６ｎｇ／ｍＬ、ＢｉｏＣａｐ２５Ｆｉｌｔｅｒ ９０ＺＡで３３０μｇ／ｍＬ及び６６００ｎｇ／ｍＬであり、実施の形態の方法に比べて不純物の除去性が低いことが分かった。
市販のアニオン交換基を有する膜として、ＳａｒｔｏｂｉｎｄＱ ＭＡ７５（ザルトリウス製、平膜、膜体積２．０６ｍＬ、４級アミノ基）、ＭｕｓｔａｎｇＱ Ａｃｒｏｄｉｓｃ（ポール製、平膜、膜体積０．１８ｍＬ、４級アミノ基）及びＢｉｏＣａｐ２５Ｆｉｌｔｅｒ ９０ＺＡ（キュノ製、平膜、膜体積５ｍＬ以上、４級アミノ基）の３種類を用い、実施例４と同様にして、目的タンパク質としてγ－グロブリンを０．５ｇ／Ｌ含むＣＨＯ無血清細胞培養の上清液を、それぞれの膜体積の１００倍相当の体積分通液して不純物除去を行った。γ－グロブリンの精製ができているかの確認として、実施例４と同様にしてＳＤＳ－ＰＡＧＥによる評価を行った。
アニオン交換膜モジュール透過前の細胞培養上清中のＨＣＰ及びＤＮＡの濃度はそれぞれ、３５１μｇ／ｍＬ及び８２００ｎｇ／ｍＬであったが、透過後の液中にはそれぞれ、ＳａｒｔｏｂｉｎｄＱ ＭＡ７５で２５９μｇ／ｍＬ及び４８２ｎｇ／ｍＬ、ＭｕｓｔａｎｇＱ Ａｃｒｏｄｉｓｃで２４４μｇ／ｍＬ及び３８１６ｎｇ／ｍＬ、ＢｉｏＣａｐ２５Ｆｉｌｔｅｒ ９０ＺＡで３３０μｇ／ｍＬ及び６６００ｎｇ／ｍＬであり、実施の形態の方法に比べて不純物の除去性が低いことが分かった。
【0096】
［実施例５］
（ｂ）で作製した連続培養用精密ろ過（ＭＦ）中空糸膜ミニモジュールを用い、ＫＭＬ－１００ＴＦＦパーフュージョンシステム（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ社製）を用いて、１５Ｌ（有効容積：８．５Ｌ）のガラス製バイオリアクター（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ社製）にモノクローナル抗体を発現する遺伝子を組み込まれたＣＨＯ－Ｋ１細胞を導入し、連続培養実験を行った。グルコースと消泡剤の入った基礎培地を連続的に添加し、細胞濃度が７５±１０×１０6Ｃｅｌｌｓ／ｍＬに保つように調整した。この時、有効容積の３／４が１日で入れ替わった。精密ろ過中空糸膜ミニモジュールは、透過流束：１Ｌ／ｍ2／ｈに設定し、中空糸膜の内面から外面へ透過させ、中空部を流れる培養液のシェアレートは、１，２５０ｓ-1に設定した。４０日ほど培養を行い、この間、精密ろ過中空糸膜の透過圧力は１０ｋＰａ程度で安定した運転をすることができた。
（ｂ）で作製した連続培養用精密ろ過（ＭＦ）中空糸膜ミニモジュールを用い、ＫＭＬ－１００ＴＦＦパーフュージョンシステム（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ社製）を用いて、１５Ｌ（有効容積：８．５Ｌ）のガラス製バイオリアクター（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ社製）にモノクローナル抗体を発現する遺伝子を組み込まれたＣＨＯ－Ｋ１細胞を導入し、連続培養実験を行った。グルコースと消泡剤の入った基礎培地を連続的に添加し、細胞濃度が７５±１０×１０6Ｃｅｌｌｓ／ｍＬに保つように調整した。この時、有効容積の３／４が１日で入れ替わった。精密ろ過中空糸膜ミニモジュールは、透過流束：１Ｌ／ｍ2／ｈに設定し、中空糸膜の内面から外面へ透過させ、中空部を流れる培養液のシェアレートは、１，２５０ｓ-1に設定した。４０日ほど培養を行い、この間、精密ろ過中空糸膜の透過圧力は１０ｋＰａ程度で安定した運転をすることができた。
【0097】
その透過液をそのまま（ａ）で作製したＤＥＡ－ＡＥＸ及びＨＩＣが導入されたＷＦＣを長さ：１ｃｍに短尺化して、この順に通液させ、連続的にモノクローナル抗体の精製を行った。通液速度は、１ｍＬ／ｍｉｎ／ｍＬ―Ｂｅｄに設定した。代表的な不純物であるＨＣＰ及びＤＮＡの濃度は、精密ろ過中空糸膜通液前の被処理液中には、それぞれ、９５１ｍｇ／ｍＬ及び８２μｎｇ／ｍＬであったものが、精製後の液ではそれぞれ１５６μｇ／ｍＬ及び４３ｎｇ／ｍＬと大幅に減少しており、これら溶存して存在する不純物の除去に優れていることが分かった。一方のモノクローナル抗体についても、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにて精製できていることを確認した。
（ａ）で作製したフィルターモジュールの透過圧力が低いため、連続培養の精密ろ過中空糸膜の透過液をそのまま透過させることができ、円滑な抗体の生産が可能であった。
（ａ）で作製したフィルターモジュールの透過圧力が低いため、連続培養の精密ろ過中空糸膜の透過液をそのまま透過させることができ、円滑な抗体の生産が可能であった。
【0098】
なお、表１に記載の孔径、表面開口率、透水性等又は引張破断強度試験等を以下の条件で測定又は実施した。
【0099】
細孔構造
電子顕微鏡ＳＵ８０００シリーズ（ＨＩＴＡＣＨＩ製）を使用し、加速電圧３ｋＶで作製した中空糸膜の表面及び断面の電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を５０００倍で撮影した。撮影した表面及び断面の様子を観察して、球晶がなくポリマー幹が３次元的にネットワーク構造を発現しているものを３次元網目構造と判定した。
電子顕微鏡ＳＵ８０００シリーズ（ＨＩＴＡＣＨＩ製）を使用し、加速電圧３ｋＶで作製した中空糸膜の表面及び断面の電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を５０００倍で撮影した。撮影した表面及び断面の様子を観察して、球晶がなくポリマー幹が３次元的にネットワーク構造を発現しているものを３次元網目構造と判定した。
【0100】
膜の孔径
作製した中空糸膜の耐薬液性試験前後の孔径の測定を以下の条件で実施した。
孔径は、表面に存在した各孔に対し、孔径の小さい方から順に各孔の孔面積を足していき、その和が、各孔の孔面積の総和の５０％に達する孔の孔径で決定した。
作製した中空糸膜の耐薬液性試験前後の孔径の測定を以下の条件で実施した。
孔径は、表面に存在した各孔に対し、孔径の小さい方から順に各孔の孔面積を足していき、その和が、各孔の孔面積の総和の５０％に達する孔の孔径で決定した。
【0101】
表面開口率
電子顕微鏡ＳＵ８０００シリーズ（ＨＩＴＡＣＨＩ製）を使用し、加速電圧３ｋＶで作製した中空糸膜の表面及び断面の電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を５０００倍で撮影した。断面の電子顕微鏡サンプルは、エタノール中で凍結した膜サンプルを輪切りに割断して得た。次に画像解析ソフトＷｉｎｒｏｏｆ６．１．３を使って、ＳＥＭ画像の「ノイズ除去」を数値「６」によって行い、更に単一しきい値による二値化により、「しきい値：１０５」によって二値化を行った。こうして得た二値化画像における孔の占有面積を求めることにより、膜表面の開口率を求めた。
電子顕微鏡ＳＵ８０００シリーズ（ＨＩＴＡＣＨＩ製）を使用し、加速電圧３ｋＶで作製した中空糸膜の表面及び断面の電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を５０００倍で撮影した。断面の電子顕微鏡サンプルは、エタノール中で凍結した膜サンプルを輪切りに割断して得た。次に画像解析ソフトＷｉｎｒｏｏｆ６．１．３を使って、ＳＥＭ画像の「ノイズ除去」を数値「６」によって行い、更に単一しきい値による二値化により、「しきい値：１０５」によって二値化を行った。こうして得た二値化画像における孔の占有面積を求めることにより、膜表面の開口率を求めた。
【0102】
膜の外径／内径
作製した中空糸膜をカミソリで薄くスライスし、１００倍拡大鏡にて、外径と内径を測定した。一つのサンプルについて、３０ｍｍ間隔で６０箇所の測定を行った。
作製した中空糸膜をカミソリで薄くスライスし、１００倍拡大鏡にて、外径と内径を測定した。一つのサンプルについて、３０ｍｍ間隔で６０箇所の測定を行った。
【0103】
膜面積
中空糸膜の膜面積とは、中空糸膜の中空部の内表面面積のことを指す。
中空糸膜の膜面積とは、中空糸膜の中空部の内表面面積のことを指す。
【0104】
引張破断強度及び引張破断伸度の測定
作製した中空糸膜の耐薬液性試験前後の引張破断強度及び引張破断伸度の測定を以下の条件で実施した。
引張破断強度試験は、チャック間距離５０ｍｍ、引張速度１０ｍｍ／分の条件で、ＡＧＸ－Ｖ（島津製作所製）を使用して実施した。
引張破断伸度試験を実施し、得られた結果から引張破断伸度をＪＩＳ Ｋ７１６１に従って算出した。
引張破断伸度試験は、チャック間距離：５ｃｍ、引張り速度：２０ｃｍ／分の条件で、ＡＧＳ－５Ｄ：インストロン型引張試験機（島津製作所製）を使用して実施した。
作製した中空糸膜の耐薬液性試験前後の引張破断強度及び引張破断伸度の測定を以下の条件で実施した。
引張破断強度試験は、チャック間距離５０ｍｍ、引張速度１０ｍｍ／分の条件で、ＡＧＸ－Ｖ（島津製作所製）を使用して実施した。
引張破断伸度試験を実施し、得られた結果から引張破断伸度をＪＩＳ Ｋ７１６１に従って算出した。
引張破断伸度試験は、チャック間距離：５ｃｍ、引張り速度：２０ｃｍ／分の条件で、ＡＧＳ－５Ｄ：インストロン型引張試験機（島津製作所製）を使用して実施した。
【0105】
透水性の測定
作製した中空糸膜の耐薬液性試験前後の透水性の測定を以下の条件で実施した。
中空糸膜をエタノール浸漬後に、純水への浸漬を数回繰り返し、約１０ｃｍ長の湿潤中空糸膜の一端を封止し、他端の中空部内に注射針を挿入し、２５℃の環境下にて注射針から０．１ＭＰａの圧力で２５℃の純水を中空部内に注入し、外表面から透過してくる純水量を測定し、下記式により純水フラックスを決定し、透水性を評価した。
純水フラックス［Ｌ／ｍ2／ｈ］＝６０×（透過水量［Ｌ］）／｛π×（膜外径［ｍ］）×（膜有効長［ｍ］）×（測定時間［ｍｉｎ］）｝
作製した中空糸膜の耐薬液性試験前後の透水性の測定を以下の条件で実施した。
中空糸膜をエタノール浸漬後に、純水への浸漬を数回繰り返し、約１０ｃｍ長の湿潤中空糸膜の一端を封止し、他端の中空部内に注射針を挿入し、２５℃の環境下にて注射針から０．１ＭＰａの圧力で２５℃の純水を中空部内に注入し、外表面から透過してくる純水量を測定し、下記式により純水フラックスを決定し、透水性を評価した。
純水フラックス［Ｌ／ｍ2／ｈ］＝６０×（透過水量［Ｌ］）／｛π×（膜外径［ｍ］）×（膜有効長［ｍ］）×（測定時間［ｍｉｎ］）｝
【0106】
なお、ここで膜有効長とは、注射針が挿入されている部分を除いた、正味の膜長を指す。
【0107】
得られた多孔質中空糸ろ過（ＭＦ）膜は、３次元網目構造を有していた。また、１質量％水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を添加した０．５質量％次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ）水溶液中に４０℃、７日間の条件で中空糸膜を浸漬して耐薬液性を測定したところ、耐薬液性試験前後で膜の引張破断強度及び引張破断伸度に変化は見られなかった。また、透水性及び孔径は、試験前後で変化又は低下は見られなかった。
結果を表１に示す。
結果を表１に示す。
【0108】
得られた多孔質中空糸状ろ過（ＵＦ）膜は、電子顕微鏡で観察したところ、内外両表面から膜の中央部へ向かって連続的に孔径が大きくなる傾斜構造を示し、大きさが１０μｍを超えるようなポリマ一の欠損部位を含まないスポンジ構造であった。膜の外表面には、０．０２μｍより大きな孔は見られなかった。一方、内表面には無数のスリット状の筋とスリット状の孔が観察された。
また、０．４質量％水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を添加した０．１質量％次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ）水溶液中に２５℃、５日間の条件で中空糸膜を浸漬して耐薬液性を測定したところ、耐薬液性試験前後で膜の引張破断強度及び引張破断伸度に変化は見られなかった。結果を表１に示す。
また、透水性は、試験前後で変化又は低下は見られなかった。
得られた多孔質中空糸膜の配合組成及び試験条件並びに各種物性を以下の表１に示す。
また、０．４質量％水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を添加した０．１質量％次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ）水溶液中に２５℃、５日間の条件で中空糸膜を浸漬して耐薬液性を測定したところ、耐薬液性試験前後で膜の引張破断強度及び引張破断伸度に変化は見られなかった。結果を表１に示す。
また、透水性は、試験前後で変化又は低下は見られなかった。
得られた多孔質中空糸膜の配合組成及び試験条件並びに各種物性を以下の表１に示す。
【0109】
【表1】
【産業上の利用可能性】
【0110】
本発明に係る、ワインドフィルターカートリッジモジュールを使用するタンパク質の精製方法によれば、効率よく抗体医薬等のタンパク質の精製が実行され得る。
【図1】