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特開2023-184429二次電池成長因子を豊富に含む乾燥粉末が炎症または損傷を緩和する一種の用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023184429
(43)【公開日】2023-12-28
(54)【発明の名称】二次電池成長因子を豊富に含む乾燥粉末が炎症または損傷を緩和する一種の用途
(51)【国際特許分類】
A61K 38/18 20060101AFI20231221BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20231221BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20231221BHJP
A61P 19/00 20060101ALI20231221BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20231221BHJP
A61P 19/04 20060101ALI20231221BHJP
【ＦＩ】
A61K38/18
A61P29/00
A61P17/00
A61P19/00
A61P19/02
A61P19/04
【審査請求】有
【請求項の数】20
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023049460
(22)【出願日】2023-03-27
(31)【優先権主張番号】17/841,941
(32)【優先日】2022-06-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】111150685
(32)【優先日】2022-12-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】TW
(71)【出願人】
【識別番号】523109699
【氏名又は名称】スピリット サイエンティフィック カンパニー リミテッド
(71)【出願人】
【識別番号】523109703
【氏名又は名称】ダオ ルン スティーブン リン
(74)【代理人】
【識別番号】110000671
【氏名又は名称】ＩＢＣ一番町弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】チン－ホ チェン
(72)【発明者】
【氏名】ダオ ルン スティーブン リン
【テーマコード（参考）】
4C084
【Ｆターム（参考）】
4C084AA06
4C084CA26
4C084MA44
4C084NA14
4C084ZA89
4C084ZA94
4C084ZA96
4C084ZB11
(57)【要約】 （修正有）
【課題】炎症や損傷（ｉｎｊｕｒｙ）を効果的に緩和または治療できる成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）を提供すること。
【解決手段】成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）の炎症または損傷を緩和するための一種の用途を提供し、その中、１グラムあたりの成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）は、ＰＤＧＦ－ＢＢを９×１０４ｐｇ以上で含む。
【選択図】図２Ａ
【解決手段】成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）の炎症または損傷を緩和するための一種の用途を提供し、その中、１グラムあたりの成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）は、ＰＤＧＦ－ＢＢを９×１０４ｐｇ以上で含む。
【選択図】図２Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
一種成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）の製造方法であって、製造工程に
（ａ）血小板を含む溶液を一ユニット（ｕｎｉｔ）取り、血小板の純化プロセス（ｐｒｏｃｅｓｓ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）を実行して純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得るプロセス；
（ｂ）純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）し、成長因子を放出させて血小板成長因子抽出液（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｔｒａｃｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得るプロセス；
（ｃ）血小板関連構造物（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を除去するプロセスを実行して、成長因子を豊富に含む溶液（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得るプロセス；および
（ｄ）成長因子を豊富に含む溶液（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を乾燥（ｄｒｙｉｎｇ）させて、成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）を得るプロセス
を含む成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）の製造方法。
（ａ）血小板を含む溶液を一ユニット（ｕｎｉｔ）取り、血小板の純化プロセス（ｐｒｏｃｅｓｓ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）を実行して純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得るプロセス；
（ｂ）純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）し、成長因子を放出させて血小板成長因子抽出液（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｔｒａｃｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得るプロセス；
（ｃ）血小板関連構造物（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を除去するプロセスを実行して、成長因子を豊富に含む溶液（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得るプロセス；および
（ｄ）成長因子を豊富に含む溶液（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を乾燥（ｄｒｙｉｎｇ）させて、成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）を得るプロセス
を含む成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）の製造方法。
【請求項2】
前記乾燥プロセスが凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｙｉｎｇ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ステップ（ａ）において、血小板精製プロセス（ｐｒｏｃｅｓｓ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）には、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中の白血球濃度が１ｍＬあたり１０６個未満になるように白血球を除去するプロセスをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記ステップ（ａ）において、血小板精製プロセス（ｐｒｏｃｅｓｓ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）には、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中のアルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ）濃度が３ｇ／ｄＬ未満になるように血漿を除去するプロセス；または、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中のグロブリン（ｇｌｏｂｕｌｉｎ）濃度が２ｇ／ｄＬ未満になるように血漿を除去するプロセス；または、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中のフィブリノーゲン（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）濃度が１００μｇ／ｍＬ未満になるように血漿を除去するプロセスをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記血小板を含む溶液が全血であり、且つステップ（ａ）には
（ａ１）血小板を含む溶液を一ユニット（ｕｎｉｔ）取ること；
（ａ２）一次沈降プロセス（ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）を実行し、血小板を含む溶液を血漿層（Ｐｌａｓｍａ ｌａｙｅｒ）、バッフィーコート層（Ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ ｌａｙｅｒ）および赤血球層に分離すること；
（ａ３）バッフィーコート層（Ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ ｌａｙｅｒ）と赤血球層（Ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ ｌａｙｅｒ）を除去して、血漿層溶液（Ｐｌａｓｍａ ｌａｙｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得ること；
（ａ４）血小板が沈殿してペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を形成させるため、二次沈降プロセス（ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）を実行すること；
（ａ５）上清液を除去し、沈殿物を溶媒と混合して、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得ること
を含む、請求項１に記載の方法。
（ａ１）血小板を含む溶液を一ユニット（ｕｎｉｔ）取ること；
（ａ２）一次沈降プロセス（ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）を実行し、血小板を含む溶液を血漿層（Ｐｌａｓｍａ ｌａｙｅｒ）、バッフィーコート層（Ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ ｌａｙｅｒ）および赤血球層に分離すること；
（ａ３）バッフィーコート層（Ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ ｌａｙｅｒ）と赤血球層（Ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ ｌａｙｅｒ）を除去して、血漿層溶液（Ｐｌａｓｍａ ｌａｙｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得ること；
（ａ４）血小板が沈殿してペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を形成させるため、二次沈降プロセス（ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）を実行すること；
（ａ５）上清液を除去し、沈殿物を溶媒と混合して、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得ること
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）プロセスが凍結後解凍（ｆｒｅｅｚｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｈａｗｉｎｇ）プロセス、カルシウムイオンの添加（ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａ２＋）プロセス、トロンビンの添加（ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｏｍｂｉｎ）プロセス、コラーゲンの添加（ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ）プロセス、またはアデノシン二リン酸の添加（ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ＡＤＰ）プロセス、またはその任意の組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）プロセスが凍結後解凍（ｆｒｅｅｚｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｈａｗｉｎｇ）プロセス（すなわち、凍結融解工程（ｆｒｅｅｚｅ－ｔｈａｗ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ））であり、前記凍結後解凍プロセス（凍結融解工程）の手順には、
（ｂ１）純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を含む容器を液体窒素（ｌｉｑｕｉｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ）中に入れ、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を凍結すること；および
（ｂ２）容器の温度を上げて、凍結した純粋血小板溶液（ｆｒｏｚｅｎ ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を解凍すること
を含む、請求項１に記載の方法。
（ｂ１）純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を含む容器を液体窒素（ｌｉｑｕｉｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ）中に入れ、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を凍結すること；および
（ｂ２）容器の温度を上げて、凍結した純粋血小板溶液（ｆｒｏｚｅｎ ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を解凍すること
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）の製造方法であって、
（１）グラム（ｇ）当たりの成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）中のＰＤＧＦ－ＢＢの含有量が１０ ｐｇ ～ ３×１０７ ｐｇである；または、
（２）グラム（ｇ）当たりの成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）中のＶＥＧＦの含有量が２×１０２ ｐｇ ～３×１０６ ｐｇである；または、
（３）グラム（ｇ）当たりの成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）中のＦＧＦの含有量が１０ ｐｇ ～１×１０４ ｐｇである；または、
（４）グラム（ｇ）当たりの成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）中のＴＧＦ－β１の含有量が２×１０５ ｐｇ ～１．２×１０７ｐｇである；または、
（５）グラム（ｇ）当たりの成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）中のＥＧＦの含有量が１×１０２ ｐｇ ～６×１０５ｐｇである、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
（１）グラム（ｇ）当たりの成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）中のＰＤＧＦ－ＢＢの含有量が１０ ｐｇ ～ ３×１０７ ｐｇである；または、
（２）グラム（ｇ）当たりの成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）中のＶＥＧＦの含有量が２×１０２ ｐｇ ～３×１０６ ｐｇである；または、
（３）グラム（ｇ）当たりの成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）中のＦＧＦの含有量が１０ ｐｇ ～１×１０４ ｐｇである；または、
（４）グラム（ｇ）当たりの成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）中のＴＧＦ－β１の含有量が２×１０５ ｐｇ ～１．２×１０７ｐｇである；または、
（５）グラム（ｇ）当たりの成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）中のＥＧＦの含有量が１×１０２ ｐｇ ～６×１０５ｐｇである、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記凍結乾燥プロセスが、温度を－３５℃以下に調整し、圧力を８０ｍＴｏｒｒ以下に調整することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項10】
前記血小板を含む溶液が、全血（ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ）、血漿交換血小板（ａｐｈｅｒｅｓｉｓ ｐｌａｔｅｌｅｔ）、白血球除去済み血小板（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ－ｒｅｄｕｃｅｄ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ａｐｈｅｒｅｓｉｓ）、もしくは血小板リッチプラズマ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－Ｒｉｃｈ Ｐｌａｓｍａ， ＰＲＰ）、もしくはその任意の組み合わせであり；または、前記血小板を含む溶液が、自己の血液検体（Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｅ）、もしくは異種の検体（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｅ）、もしくはその組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記ステップ（ａ５）における溶媒は、無菌生理食塩水、注射用水、０．４５％ＮａＣｌ、４．５％高張食塩水、無菌温泉水、もしくは等張食塩水である；または、ステップ（ａ５）における純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中の血小板濃度は１×１０９個／ｍＬ～１０×１０９個／ｍＬである、請求項５に記載の方法。
【請求項12】
前記ステップ（ｃ）は、（ｃ１）沈降プロセス（ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）を実行し、血小板関連構造物（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を沈降させて血小板関連構造物の沈澱物（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｅｌｌｅｔ）を形成すること；
（ｃ２）血小板関連構造物の沈澱物（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｅｌｌｅｔ）を除去して、成長因子を豊富に含む溶液を得ること、
を含む、請求項１に記載の方法。
（ｃ２）血小板関連構造物の沈澱物（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｅｌｌｅｔ）を除去して、成長因子を豊富に含む溶液を得ること、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
一種の製造方法により製造される成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）であって、当該製造方法は、
（ａ） 血小板を含む溶液を一ユニット（ｕｎｉｔ）取り、血小板の純化プロセス（ｐｒｏｃｅｓｓ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）を実行して純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得るプロセス；
（ｂ）純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）し、成長因子を放出させて血小板成長因子抽出液（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｔｒａｃｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得るプロセス；
（ｃ）血小板関連構造物（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を除去するプロセスを実行して、成長因子を豊富に含む溶液（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得るプロセス；および
（ｄ）成長因子を豊富に含む溶液（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を乾燥（ｄｒｙｉｎｇ）させて、成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）を得るプロセス；その中、前記凍結乾燥プロセスには、温度を－３０℃以下に調整し、圧力を１００ ｍＴｏｒｒ以下に調整することが含まれ、
を含み、グラム（ｇ）あたりの成長因子を豊富に含む乾燥粉末中のＰＤＧＦ－ＢＢ含有量は１０ ｐｇ ～３×１０７ ｐｇである。
（ａ） 血小板を含む溶液を一ユニット（ｕｎｉｔ）取り、血小板の純化プロセス（ｐｒｏｃｅｓｓ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）を実行して純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得るプロセス；
（ｂ）純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）し、成長因子を放出させて血小板成長因子抽出液（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｔｒａｃｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得るプロセス；
（ｃ）血小板関連構造物（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を除去するプロセスを実行して、成長因子を豊富に含む溶液（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得るプロセス；および
（ｄ）成長因子を豊富に含む溶液（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を乾燥（ｄｒｙｉｎｇ）させて、成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）を得るプロセス；その中、前記凍結乾燥プロセスには、温度を－３０℃以下に調整し、圧力を１００ ｍＴｏｒｒ以下に調整することが含まれ、
を含み、グラム（ｇ）あたりの成長因子を豊富に含む乾燥粉末中のＰＤＧＦ－ＢＢ含有量は１０ ｐｇ ～３×１０７ ｐｇである。
【請求項14】
前記活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）プロセスが凍結後解凍（ｆｒｅｅｚｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｈａｗｉｎｇ）プロセス（すなわち凍結融解工程（ｆｒｅｅｚｅ－ｔｈａｗ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ））であり、前記凍結後解凍プロセス（凍結融解工程）の手順には、
（ｂ１）純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を含む容器を液体窒素（ｌｉｑｕｉｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ）中に入れ、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を凍結すること；および
（ｂ２）容器の温度を上げて、凍結した純粋血小板溶液（ｆｒｏｚｅｎ ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を解凍すること
を含む、請求項１３に記載の成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）。
（ｂ１）純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を含む容器を液体窒素（ｌｉｑｕｉｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ）中に入れ、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を凍結すること；および
（ｂ２）容器の温度を上げて、凍結した純粋血小板溶液（ｆｒｏｚｅｎ ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を解凍すること
を含む、請求項１３に記載の成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）。
【請求項15】
個体の一部に有効量を投与し個体の一部の炎症または損傷（ｉｎｊｕｒｙ）の程度を緩和（ｒｅｌｉｅｖｅ）するための医薬組成物または健康補助剤を製造するための、請求項１３に記載の成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）の使用。
【請求項16】
前記破砕プロセスが凍結後解凍（ｆｒｅｅｚｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｈａｗｉｎｇ）プロセス（すなわち凍結融解工程（ｆｒｅｅｚｅ－ｔｈａｗ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ））であり、前記凍結後解凍プロセス（凍結融解工程）は、
（ｂ１）純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を含む容器を液体窒素（ｌｉｑｕｉｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ）中に入れ、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を凍結すること；および
（ｂ２）容器の温度を上げて、凍結した純粋血小板溶液（ｆｒｏｚｅｎ ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を解凍すること
を含む、請求項１５に記載の成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）の使用。
（ｂ１）純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を含む容器を液体窒素（ｌｉｑｕｉｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ）中に入れ、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を凍結すること；および
（ｂ２）容器の温度を上げて、凍結した純粋血小板溶液（ｆｒｏｚｅｎ ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を解凍すること
を含む、請求項１５に記載の成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）の使用。
【請求項17】
前記ステップ（ａ）において、血小板精製プロセス（ｐｒｏｃｅｓｓ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）には、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中の白血球濃度が１ｍＬあたり１０６個未満になるように白血球を除去するプロセスをさらに含む、請求項１５に記載の使用。
【請求項18】
前記ステップ（ａ）において、血小板精製プロセス（ｐｒｏｃｅｓｓ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）には、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中のアルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ）濃度が３ｇ／ｄＬ未満になるように血漿を除去するプロセス；または、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中のグロブリン（ｇｌｏｂｕｌｉｎ）濃度が２ｇ／ｄＬ未満になるように血漿を除去するプロセス；または、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中のフィブリノーゲン（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）濃度が１００μｇ／ｍＬ未満になるように血漿を除去するプロセスをさらに含む、請求項１５に記載の使用。
【請求項19】
前記成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）の使用であって、
（１）グラム（ｇ）当たりの成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）中のＶＥＧＦの含有量が２×１０２ ｐｇ ～３×１０６ ｐｇである；または、
（２）グラム（ｇ）当たりの成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）中のＦＧＦの含有量が１０ ｐｇ ～１×１０４ ｐｇである；または、
（３）グラム（ｇ）当たりの成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）中のＴＧＦ－β１の含有量が２×１０５ ｐｇ ～１．２×１０７ｐｇである；または、
（４）グラム（ｇ）当たりの成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）中のＥＧＦの含有量が１×１０２ ｐｇ ～６×１０５ｐｇである、
ことを特徴とする請求項１５に記載の使用。
（１）グラム（ｇ）当たりの成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）中のＶＥＧＦの含有量が２×１０２ ｐｇ ～３×１０６ ｐｇである；または、
（２）グラム（ｇ）当たりの成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）中のＦＧＦの含有量が１０ ｐｇ ～１×１０４ ｐｇである；または、
（３）グラム（ｇ）当たりの成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）中のＴＧＦ－β１の含有量が２×１０５ ｐｇ ～１．２×１０７ｐｇである；または、
（４）グラム（ｇ）当たりの成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）中のＥＧＦの含有量が１×１０２ ｐｇ ～６×１０５ｐｇである、
ことを特徴とする請求項１５に記載の使用。
【請求項20】
個体の呼吸器部位、皮膚部位、筋肉部位、腱部位、骨格部位、関節部位もしくは靭帯部位の炎症または損傷（ｉｎｊｕｒｙ）を緩和（ｒｅｌｉｅｖｅ）するための医薬組成物または健康補助剤を製造するための、請求項１５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）に関するものであり、とりわけ成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）が炎症または損傷を緩和するための一種の用途に関するものである。
【背景技術】
【0002】
炎症は人体の防御メカニズムである。身体部位は、感染 （ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、外傷（ｔｒａｕｍａ）、または過敏症（ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）によって炎症反応を引き起こし、有害刺激を除去し、病原体を除去し、組織修復を促進する。炎症は、急性炎症（ａｃｕｔｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）と慢性炎症（ｃｈｒｏｎｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ）に分類される。例えば、皮膚炎（Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ））、アレルギー性鼻炎（Ａｌｌｅｒｇｉｃ Ｒｈｉｎｉｔｉｓ）、肺炎（Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、肝炎（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）、腸炎（Ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ）が挙げられる。皮膚炎は、刺激性接触皮膚炎（Ｉｒｒｉｔａｎｔ ｃｏｎｔａｃｔ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ、ＩＣＤ）およびアレルギー性接触皮膚炎（Ａｌｌｅｒｇｉｃ ｃｏｎｔａｃｔ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）に分けられる。重度の肺炎は、慢性閉塞性肺疾患（Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅ， ＣＯＰＤ）や肺線維症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）などの疾患を引き起こす。重度の肝炎は、肝硬変（Ｌｉｖｅｒ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）やがん（Ｃａｎｃｅｒ）などの疾患を引き起こす。
【0003】
高濃度血小板血漿（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－Ｒｉｃｈ Ｐｌａｓｍａ， ＰＲＰ）は、血液由来の製品（ｂｌｏｏｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）であり、血小板濃度は通常の血液の１．５～５倍である。血小板（ｐｌａｔｅｌｅｔ）には、血小板関連の成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｒｅｌａｔｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ）が含まれる。血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ， ＰＤＧＦ）、血管内皮成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ， ＶＥＧＦ）、表皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ， ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ， ＦＧＦ）およびβ型転換成長因子（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｂｅｔａ １， ＴＧＦ－β１）などが挙げられる。
【0004】
高濃度血小板血漿（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－Ｒｉｃｈ Ｐｌａｓｍａ， ＰＲＰ）には、抗炎症特性（ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）がある（文献１、２を参照）。しかし、臨床研究では、高濃度血小板血漿（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－Ｒｉｃｈ Ｐｌａｓｍａ， ＰＲＰ）の抗炎症効果は不十分であることが判明しており、その原因は、高濃度血小板血漿（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－Ｒｉｃｈ Ｐｌａｓｍａ， ＰＲＰ）中の成長因子濃度が低く、品質が不安定であり、保存が困難であることである。また、異種移植において高濃度血小板血漿（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－Ｒｉｃｈ Ｐｌａｓｍａ， ＰＲＰ）を使用すると、アレルギー反応を引き起こす可能性があり、臨床使用のリスクが増大する。
【0005】
マーケットにおいては、現在の技術の限界を突破することができる、各部位の炎症または損傷を緩和または治療するために医薬組成物が必要とされている。
【発明の概要】
【0006】
従来技術の欠点に鑑み、本発明の目的は、炎症や損傷（ｉｎｊｕｒｙ）を効果的に緩和または治療できる成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）を提供することである。
【0007】
本発明のもう一つの目的は、成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）を製造する方法を提供することである。
【0008】
本発明のもう一つの目的は、成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）が炎症や損傷（ｉｎｊｕｒｙ）を効果的に緩和するための使用を提供することである。
【0009】
本発明のもう一つの目的は、炎症や損傷（ｉｎｊｕｒｙ）を緩和または治療するための医薬組成物または健康補助剤を調製するための使用を提供することである。
【0010】
成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）を製造する一種の方法、そのうち（ａ） 血小板を含む溶液を一ユニット（ｕｎｉｔ）取り、血小板の純化プロセス（ｐｒｏｃｅｓｓ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）を実行して純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得るプロセス；（ｂ） 純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）し、成長因子を放出させて血小板成長因子抽出液（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｔｒａｃｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得るプロセス；（ｃ） 血小板関連構造物（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を除去するプロセスを実行して、成長因子を豊富に含む溶液（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得るプロセス；および（ｄ） 成長因子を豊富に含む溶液（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を乾燥（ｄｒｙｉｎｇ）させて、成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）を得るプロセスを含む。
【0011】
一部の実施例において、乾燥プロセスは凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｙｉｎｇ）プロセスである。一部の実施例において、乾燥プロセスは凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｙｉｎｇ）プロセスであり、この凍結乾燥プロセスには複数の操作ステップが含まれている。この複数の操作ステップにより、成長因子を豊富に含む溶液中の複数の成分が凍結し、少なくとも１つの凍結した成分が直接昇華して気体に蒸発し、それにより（１）成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）内に複数の孔隙（例えば、複数の気体収容孔隙または複数の気体蒸発孔隙）が形成されるか、または（２）成長因子を豊富に含む溶液から成長因子を豊富に含む乾燥粉末に変化させる過程で、生理反応が変化する程度の変化が生じる。一部の実施例において、これらの凍結した成分には、凍結した溶質、凍結した血小板関連成長因子、および複数の凍結した他の成分が含まれ、かつ直接昇華して気体に蒸発する凍結した成分は、（１’）凍結した溶質または（１’’）凍結した溶質と少なくとも１種類の凍結した他の成分が含まれる。一部の実施例において、電子顕微鏡または他の方法で、成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）内の複数の孔隙（例えば、複数の気体収容孔隙または複数の気体蒸発孔隙）の形態を観察する。
【0012】
一部の実施例において、乾燥プロセスは凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｙｉｎｇ）、低温乾燥（ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｄｒｙｉｎｇ）、または真空乾燥（ｖａｃｕｕｍ ｄｒｙｉｎｇ）である。
【0013】
一部の実施例において、ステップ（ａ）の血小板純化プロセス（ｐｒｏｃｅｓｓ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）には、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中の白血球の数が１０６個未満になるよう、白血球を除去するプロセスがさらに含まれる。
【0014】
一部の実施例において、ステップ（ａ）の血小板純化プロセス（ｐｒｏｃｅｓｓ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）には、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中の白血球の数が５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、または８００，０００個未満になるよう、白血球を除去するプロセスがさらに含まれる。
【0015】
一部の実施例において、ステップ（ａ）の血小板純化プロセス（ｐｒｏｃｅｓｓ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）には、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中のアルブミン濃度（ａｌｂｕｍｉｎ）が３ｇ／ｄＬ未満になるように、血漿を除去するプロセスが含まれる。一部の実施例において、ステップ（ａ）の血小板純化プロセス（ｐｒｏｃｅｓｓ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）には、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中のグロブリン濃度（ｇｌｏｂｕｌｉｎ）が２ｇ／ｄＬ未満になるように、血漿を除去するプロセスが含まれる。一部の実施例において、ステップ（ａ）の血小板純化プロセス（ｐｒｏｃｅｓｓ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）には、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中のフィブリノーゲン濃度（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）が１００μｇ／ｍＬ未満になるように、血漿を除去するプロセスが含まれる。
【0016】
一部の実施例において、ステップ（ａ）の血小板純化プロセス（ｐｒｏｃｅｓｓ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）には、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中のアルブミン濃度（ａｌｂｕｍｉｎ）が０．２５、０．５、０．７５、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、または２．７５ ｇ／ｄＬ未満になるように、血漿を除去するプロセスがさらに含まれる。
【0017】
一部の実施例において、ステップ（ａ）の血小板純化プロセス（ｐｒｏｃｅｓｓ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）には、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中のグロブリン濃度（ｇｌｏｂｕｌｉｎ）が０．２５、０．５、０．７５、１、または１．２５ｇ／ｄＬ未満になるように、血漿を除去するプロセスがさらに含まれる。
【0018】
一部の実施例において、ステップ（ａ）の血小板純化プロセス（ｐｒｏｃｅｓｓ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）には、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中のフィブリノーゲン濃度（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）が１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０μｇ／ｍＬ未満になるように、血漿を除去するプロセスがさらに含まれる。
【0019】
一部の実施例において、血小板を含む溶液は全血であり、かつステップ（ａ）には、（ａ１）血小板を含む溶液を一ユニット（ｕｎｉｔ）取る、（ａ２）血小板を含む溶液を血漿層（Ｐｌａｓｍａ ｌａｙｅｒ）、バッフィーコート層（Ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ ｌａｙｅｒ）、および赤血球層（Ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ ｌａｙｅｒ）に分離するための一回目の沈降プロセスを施す、（ａ３）血小板をバッフィーコート層（Ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ ｌａｙｅｒ）および赤血球層（Ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ ｌａｙｅｒ）を除去して血漿層溶液（Ｐｌａｓｍａ ｌａｙｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得る、（ａ４）血小板が沈殿してペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を形成させるための沈降プロセスを施す、および（ａ５）上清液を除去し、該ペレットを溶媒と混合して純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得るステップが含まれる。
【0020】
一部の実施例において、活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）プロセスは凍結後に解凍する（ｆｒｅｅｚｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｈａｗｉｎｇ）プロセス（すなわち凍結融解プロセス（ｆｒｅｅｚｅ－ｔｈａｗ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ））、カルシウムイオンの添加（ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａ２＋）プロセス、トロンビンの添加（ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｏｍｂｉｎ）プロセス、コラーゲンの添加（ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ）プロセス、またはアデノシン二リン酸の添加（ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ＡＤＰ）プロセス、またはそれらの任意の組み合わせである。
【0021】
一部の実施例において、活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）プロセスは凍結後に解凍する（ｆｒｅｅｚｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｈａｗｉｎｇ）プロセス（すなわち凍結融解工程（ｆｒｅｅｚｅ－ｔｈａｗ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ））であり、かつ当該凍結後に解凍する（ｆｒｅｅｚｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｈａｗｉｎｇ）プロセス（すなわち凍結融解工程（ｆｒｅｅｚｅ－ｔｈａｗ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ））には、（ｂ１）純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を含む容器を液体窒素（ｌｉｑｕｉｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ）中に置き、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を凍結する、および（ｂ２）容器の温度を上げて凍結した純粋血小板溶液（ｆｒｏｚｅｎ ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を解凍するステップを含む。
【0022】
一部の実施例において、１グラム（ｇ）あたりの成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）中、ＰＤＧＦ－ＢＢの含量は１０ ｐｇ ～ ３×１０７ｐｇである。
【0023】
一部の実施例において、１グラム（ｇ）あたりの成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）中、ＰＤＧＦ－ＢＢの含量は１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１×１０２、５×１０２、１×１０３、５×１０３、１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、または１×１０７ｐｇである。
【0024】
一部の実施例において、１グラム（ｇ）あたりの成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）中、ＶＥＧＦの含量は２×１０２ｐｇ ～３×１０６ ｐｇである。
【0025】
一部の実施例において、１グラム（ｇ）あたりの成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）中、ＶＥＧＦの含量は４×１０２、８×１０２、１×１０３、５×１０３、１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、または１×１０６ ｐｇである。
【0026】
一部の実施例において、１グラム（ｇ）あたりの成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）中、ＦＧＦの含量は１０ ｐｇ ～１×１０４ｐｇである。
【0027】
一部の実施例において、１グラム（ｇ）あたりの成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）中、ＦＧＦの含量は１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１×１０２、５×１０２、１×１０３、または５×１０３ｐｇである。
【0028】
一部の実施例において、１グラム（ｇ）あたりの成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）中、ＴＧＦ－β１の含量は２×１０５ｐｇ～１．２×１０７ｐｇである。
【0029】
一部の実施例において、１グラム（ｇ）あたりの成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）中、ＴＧＦ－β１の含量は３×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、または１×１０７ｐｇである。
【0030】
一部の実施例において、１グラム（ｇ）あたりの成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）中、ＥＧＦの含量は１×１０２ｐｇ～６×１０５ｐｇである。
【0031】
一部の実施例において、１グラム（ｇ）あたりの成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）中、ＥＧＦの含量は２×１０２、５×１０２、１×１０３、５×１０３、１×１０４、５×１０４、１×１０５、または５×１０５ｐｇである。
【0032】
一部の実施例において、凍結乾燥プロセスは温度を－３５℃以下に調整し、圧力を８０ｍＴｏｒｒ以下に調整することを含む。
【0033】
一部の実施例において、凍結乾燥プロセスは温度を－４０、－４５、－５０、－６０、－６５、または－７０℃以下に調整することを含む。
【0034】
一部の実施例において、凍結乾燥プロセスは圧力を７０、６０、５０、４０、または３０ ｍＴｏｒｒ以下に調整することを含む。
【0035】
一部の実施例において、血小板を含む溶液は、全血（ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ）、アフェレーシス血小板、（ａｐｈｅｒｅｓｉｓ ｐｌａｔｅｌｅｔ）白血球除去アフェレーシス血小板（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ－ｒｅｄｕｃｅｄ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ａｐｈｅｒｅｓｉｓ）、プレートレットリッチプラズマ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－Ｒｉｃｈ Ｐｌａｓｍａ， ＰＲＰ）、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる；もしく、血小板を含む溶液は自己血液検体（Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｅ）または同種検体（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｅ）から派生し、またはその組み合わせである。
【0036】
一部の実施例において、ステップ（ａ５）における溶媒は、無菌の生理食塩水、注射用水、４５％ＮａＣｌ、４．５％高張性食塩水、無菌温泉水、または等張性食塩水である；もしく、ステップ（ａ５）における純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中の血小板濃度は１×１０９個／ｍＬ～１０×１０９個／ｍＬである。
【0037】
一部の実施例において、ステップ（ａ５）における純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中の血小板濃度は２×１０９個／ｍＬ、３×１０９個／ｍＬ、４×１０９個／ｍＬ、５×１０９個／ｍＬ、６×１０９個／ｍＬ、７×１０９個／ｍＬ、８×１０９個／ｍＬ、または９×１０９個／ｍＬである。
【0038】
一部の実施例において、ステップ（ｃ）は、（ｃ１）血小板関連構造物（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を沈降させ、血小板関連構造物沈殿物（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｅｌｌｅｔ）を形成する沈降プロセス（ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）を実行、（ｃ２）血小板関連構造物沈殿物（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｅｌｌｅｔ）を除去して、成長因子濃縮溶液（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得ることを含む。
【0039】
本発明はさらに、製造方法で製造した細胞成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）を提供し、該製造方法は、（ａ）血小板を含む溶液を一ユニット（ｕｎｉｔ）取り、血小板の純化プロセス（ｐｒｏｃｅｓｓ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）を実行して純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得る；（ｂ）純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）の血小板溶液中の血小板を活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）して細胞成長因子を放出させ、血小板成長因子抽出溶液（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｔｒａｃｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得る活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）プロセス；（ｃ）血小板関連構造物（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を除去するプロセスを実行して、成長因子を豊富に含む溶液（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得る；および（ｄ）成長因子を豊富に含む溶液（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を乾燥（ｄｒｙｉｎｇ）させて、成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）を得ることを含む。この凍結乾燥プロセスには、温度を－３０℃以下に調整し、圧力を１００ ｍＴｏｒｒ以下に調整することを含み、１グラム（ｇ）あたりの成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）中、ＰＤＧＦ－ＢＢの含量は１０ ｐｇ ～ ３×１０７ｐｇである。
【0040】
一部の実施例において、活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）プロセスは凍結後に解凍する（ｆｒｅｅｚｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｈａｗｉｎｇ）プロセス（すなわち凍結融解プロセス（ｆｒｅｅｚｅ－ｔｈａｗ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ））であり、かつ該凍結後に解凍する（ｆｒｅｅｚｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｈａｗｉｎｇ）プロセス（すなわち凍結融解プロセス（ｆｒｅｅｚｅ－ｔｈａｗ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ））には、（ｂ１）純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を含む容器を液体窒素（ｌｉｑｕｉｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ）中に置き、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を凍結する、および（ｂ２）容器の温度を上げて凍結した純粋血小板溶液（ｆｒｏｚｅｎ ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を解凍するステップを含む。
【0041】
本発明はさらに、有効量で個体の一部位に用いて、当該個体の当該部位の炎症や損傷（ｉｎｊｕｒｙ）を緩和（ｒｅｌｉｅｖｅ）するための医療組成物または機能性組成物を調製するための、成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）の使用を提供する。
【0042】
一部の実施例において、前記個体は人間または他の哺乳動物である。
【0043】
一部の実施例において、活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）プロセスは凍結後に解凍する（ｆｒｅｅｚｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｈａｗｉｎｇ）プロセス（すなわち凍結融解工程（ｆｒｅｅｚｅ－ｔｈａｗ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ））であり、かつ該凍結後に解凍する（ｆｒｅｅｚｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｈａｗｉｎｇ）プロセス（すなわち凍結融解工程（ｆｒｅｅｚｅ－ｔｈａｗ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ））には、（ｂ１）純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を含む容器を液体窒素（ｌｉｑｕｉｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ）中に置き、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を凍結する、および（ｂ２）容器の温度を上げて凍結した純粋血小板溶液（ｆｒｏｚｅｎ ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を解凍するステップをさらに含む。
【0044】
一部の実施例において、ステップ（ａ）は、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中白血球数が１０６個未満になるように、血小板の精製プロセス（ｐｒｏｃｅｓｓ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）に白血球を除去するプロセスがさらに含まれる。
【0045】
一部の実施例において、ステップ（ａ）は、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中グロブリン（ａｌｂｕｍｉｎ）濃度が３ｇ／ｄＬ未満になるように、血小板の精製プロセス（ｐｒｏｃｅｓｓ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）に血漿を除去するプロセスが含まれる；もしくは、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中グロブリン（ａｌｂｕｍｉｎ）濃度が２ｇ／ｄＬ未満になるように、血小板の精製プロセス（ｐｒｏｃｅｓｓ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）に血漿を除去するプロセスが含まれる；もしくは、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中フィブリノーゲン濃度（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）が１００μｇ／ｍＬ未満になるように、血小板の精製プロセス（ｐｒｏｃｅｓｓ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）に血漿を除去するプロセスがさらに含まれる。
【0046】
一部の実施例において、１グラム（ｇ）あたりの成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）中、ＶＥＧＦの含量は２×１０２ｐｇ～３×１０６ｐｇである。
【0047】
一部の実施例において、１グラム（ｇ）あたりの成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）中、ＦＧＦの含量は１０ｐｇ ～１×１０４ｐｇである。
【0048】
一部の実施例において、１グラム（ｇ）あたりの成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）中、ＴＧＦ－β１の含量は２×１０５ｐｇ～１．２×１０７ｐｇである。
【0049】
一部の実施例において、１グラム（ｇ）あたりの成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）中、ＥＧＦの含量は１×１０２ｐｇ～６×１０５ｐｇである。
【0050】
一部の実施例において、個体の呼吸器部位、皮膚部位、筋肉部位、腱部位、骨格部位、関節部位、もしくは靭帯部位の炎症や損傷（ｉｎｊｕｒｙ）を緩和（ｒｅｌｉｅｖｅ）するための医薬組成物または健康補助剤を調製するための使用である。
【図面の簡単な説明】
【0051】
【実施例0052】
以下は、本発明の実施形態、ならびに本発明の技術および特徴について詳細に説明する。しかしながら、本実施例は本発明を制限するものではなく、この技術に熟知している者は、本発明の精神と範囲を超えない範囲内での様々な変更や改善は、本発明の特許範囲に含まれる。
【0053】
本発明において、成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）は、血小板関連の成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｒｅｌａｔｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ）が豊富に含まれる乾燥粉末を指す。例えば、血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＰＤＧＦ）が豊富に含まれる乾燥粉末、血管内皮成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）が豊富に含まれる乾燥粉末、表皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＥＧＦ）が豊富に含まれる乾燥粉末、線維芽細胞成長因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＦＧＦ）が豊富に含まれる乾燥粉末、または変換成長因子ベータ１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｂｅｔａ １、ＴＧＦ－β１）が豊富に含まれる乾燥粉末、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。
【0054】
本発明において、「血小板関連の成長因子が豊富に含まれた」乾燥粉末（“ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｒｅｌａｔｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ”ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）は、その分離源液よりも高濃度の血小板関連の成長因子を有する。
【0055】
本発明において、成長因子を豊富に含む溶液（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）は、血小板関連の成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｒｅｌａｔｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ）が豊富に含まれる溶液を指す。例えば、血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＰＤＧＦ）が豊富に含まれる溶液、血管内皮成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）が豊富に含まれる溶液、表皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＥＧＦ）が豊富に含まれる溶液、線維芽細胞成長因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＦＧＦ）が豊富に含まれる溶液、または変換成長因子ベータ１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｂｅｔａ １、ＴＧＦ－β１）が豊富に含まれる溶液、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。
【0056】
本発明において、「血小板関連の成長因子が豊富に含まれた」溶液（“ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｒｅｌａｔｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ”ｓｏｌｕｔｉｏｎ）は、その分離源液よりも高濃度の血小板関連の成長因子を有する。
【0057】
本発明において、「１ユニット（ｕｎｉｔ）」の血小板溶液は、血小板を含む溶液を含む容器の任意の大きさを指す。例えば、血小板を含む溶液を含む袋の容量が２５０ｍＬである場合、５０ｍＬの遠心管に含まれる血小板を含む液体の容量が５０ｍＬである場合、または１ｍＬの容器に含まれる血小板を含む液体の容量が１ｍＬである場合があります。
【0058】
本発明において、超純化血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）は、血小板を含む溶液を純化した、より高純度の血小板溶液を指す。
【0059】
本発明において、血小板関連の構造物（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）は、血小板、血小板破片、または血小板間凝集によって形成される血小板構造物、またはそれらの任意の組み合わせを指す。
【0060】
本発明において、沈降プロセス（ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）は、物質を沈降させ集積させるプロセスを指す。例えば、重力、遠心力、または電磁力を利用して物質を沈降させ集積させるプロセスである。
【0061】
本発明において、「健康組成物」または「健康補助剤」は、栄養補助食品、個体の組織を正常な生理機能を維持するよう促進するために個体に投与される組成物、または個体の症状（ｓｙｍｐｔｏｍ）を緩和するために個体に投与される組成物を指す。
【0062】
図１を参照し、成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）を製造する過程は以下の手順を含む：
（Ｓ１１） 血小板溶液を１ユニット（ｕｎｉｔ）取り、血小板を純化するプロセスを実行（ｐｒｏｃｅｓｓ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）して、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得る；
（Ｓ１２） 活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）プロセスを実行して、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中の血小板を活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）し、成長因子を放出させ、血小板増殖因子抽出液（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｔｒａｃｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得る；
（Ｓ１３） 血小板関連構造体（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を除去するプロセスを実行して、生長因子を豊富に含む溶液（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得る；および
（Ｓ１４） 生長因子を豊富に含む溶液（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を凍結乾燥処理（ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｙｉｎｇ）し、生長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）を得る。
（Ｓ１１） 血小板溶液を１ユニット（ｕｎｉｔ）取り、血小板を純化するプロセスを実行（ｐｒｏｃｅｓｓ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）して、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得る；
（Ｓ１２） 活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）プロセスを実行して、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中の血小板を活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）し、成長因子を放出させ、血小板増殖因子抽出液（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｔｒａｃｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得る；
（Ｓ１３） 血小板関連構造体（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を除去するプロセスを実行して、生長因子を豊富に含む溶液（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得る；および
（Ｓ１４） 生長因子を豊富に含む溶液（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を凍結乾燥処理（ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｙｉｎｇ）し、生長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）を得る。
【0063】
一部の実施例において、血小板を含む溶液は全血（ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ）、血漿交換術による血小板（ａｐｈｅｒｅｓｉｓ ｐｌａｔｅｌｅｔ）、白血球除去血漿交換術による血小板（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ－ｒｅｄｕｃｅｄ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ａｐｈｅｒｅｓｉｓ）、または血小板リッチプラズマ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－Ｒｉｃｈ Ｐｌａｓｍａ， ＰＲＰ）、またはその任意の組み合わせである。一部の実施例において、血小板を含む溶液は自己の血液検体（Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｅ）または異種の検体（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｅ）、またはその組み合わせから得る。
【0064】
一部の実施例において、ステップ（Ｓ１１）にはサブステップが含まれる：
（Ｓ１１１） 血小板を含む溶液の１ユニット（ｕｎｉｔ）を取る；および
（Ｓ１１２） 少なくとも１回の沈殿プロセス（ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）を実行し、血小板層（第一血小板層など）と白血球層を含む複数の層に分離する。白血球層を除去して、白血球数が１ｍＬあたり１０６個未満の純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得る。もしく、少なくとも１回の沈殿プロセス（ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）を実行し、血小板層（第二血小板層など）と血漿・血漿蛋白層を含む複数の層に分離する。血漿・血漿蛋白層を除去して、アルブミン濃度が３ｇ／ｄＬ以下であるか、グロブリン濃度が２ｇ／ｄＬ以下であるか、フィブリノーゲン濃度が１００μｇ／ｍＬ以下になるような純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得る。
（Ｓ１１１） 血小板を含む溶液の１ユニット（ｕｎｉｔ）を取る；および
（Ｓ１１２） 少なくとも１回の沈殿プロセス（ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）を実行し、血小板層（第一血小板層など）と白血球層を含む複数の層に分離する。白血球層を除去して、白血球数が１ｍＬあたり１０６個未満の純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得る。もしく、少なくとも１回の沈殿プロセス（ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）を実行し、血小板層（第二血小板層など）と血漿・血漿蛋白層を含む複数の層に分離する。血漿・血漿蛋白層を除去して、アルブミン濃度が３ｇ／ｄＬ以下であるか、グロブリン濃度が２ｇ／ｄＬ以下であるか、フィブリノーゲン濃度が１００μｇ／ｍＬ以下になるような純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得る。
【0065】
一部の実施例において、ステップ（Ｓ１１２）にはサブステップが含まれる：
（Ｓ１１２１） 第一次沈降プロセス（ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）を実行し、血小板を含む溶液を第一血小板層（例えば血漿層（Ｐｌａｓｍａ ｌａｙｅｒ））と白血球層（例えば血沈棕色層（Ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ ｌａｙｅｒ））および赤血球層（Ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ ｌａｙｅｒ）に分離し、
（Ｓ１１２２） 血沈棕色層（Ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ ｌａｙｅｒ）および赤血球層（ Ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ ｌａｙｅｒ ）を除去し、血漿層溶液（Ｐｌａｓｍａ ｌａｙｅｒｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得る；
（Ｓ１１２３） 第二次沈降プロセス（ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）を実行し、血小板を沈降させ、沈殿物（ｐｅｌｌｅｔ）を形成する。この沈殿物は第二血小板層であり、上澄液は血漿および血漿蛋白層である；および
（Ｓ１１２４） 上澄液を除去し、沈殿物を溶媒と混合して、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得る。
（Ｓ１１２１） 第一次沈降プロセス（ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）を実行し、血小板を含む溶液を第一血小板層（例えば血漿層（Ｐｌａｓｍａ ｌａｙｅｒ））と白血球層（例えば血沈棕色層（Ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ ｌａｙｅｒ））および赤血球層（Ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ ｌａｙｅｒ）に分離し、
（Ｓ１１２２） 血沈棕色層（Ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ ｌａｙｅｒ）および赤血球層（ Ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ ｌａｙｅｒ ）を除去し、血漿層溶液（Ｐｌａｓｍａ ｌａｙｅｒｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得る；
（Ｓ１１２３） 第二次沈降プロセス（ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）を実行し、血小板を沈降させ、沈殿物（ｐｅｌｌｅｔ）を形成する。この沈殿物は第二血小板層であり、上澄液は血漿および血漿蛋白層である；および
（Ｓ１１２４） 上澄液を除去し、沈殿物を溶媒と混合して、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得る。
【0066】
一部の実施例において、溶媒は無菌の生理食塩水、注射用水、４５％ＮａＣｌ、４．５％高張ソルト水、無菌温泉水、または等張ソルト水、またはその任意の組み合わせである。一部の実施例において、純粋血小板溶液の血小板濃度は１×１０９／ｍＬ～１０×１０９／ｍＬである。
【0067】
一部の実施例において、ステップ（Ｓ１２）の破砕プロセスは、凍結後に解凍するプロセス（ｆｒｅｅｚｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｈａｗｉｎｇ）、カルシウムイオンの添加（ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａ２＋）プロセス、トロンビンの添加（ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｏｍｂｉｎ）プロセス、コラーゲンの添加（ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ）プロセス、またはアデノシン二リン酸の添加（ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ＡＤＰ）プロセス、またはその任意の組み合わせである。
【0068】
一部の実施例において、ステップ（Ｓ１２）の活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）プロセスは凍結後に解凍する（ｆｒｅｅｚｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｈａｗｉｎｇ）プロセス（すなわち凍結融解プロセス（ｆｒｅｅｚｅ－ｔｈａｗ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ））であり、ステップ（Ｓ１２）には以下のサブステップが含まれる。
【0069】
（Ｓ１２１） 純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を含む容器を液体窒素（ｌｉｑｕｉｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ）に置き、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を凍結する；および。
【0070】
（Ｓ１２２） 容器の温度を上げて、凍結した純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を解凍し、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中の血小板を活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）させ成長因子を放出し、血小板成長因子抽出液（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｔｒａｃｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得る。
【0071】
一部の実施例において、ステップ（Ｓ１３）には以下のサブステップが含まれる。
【0072】
（Ｓ１３１） 沈降プロセス（ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）を実行し、血小板関連構造物（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）が沈降して血小板関連構造物ペレット（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｅｌｌｅｔ）を形成する；および
（Ｓ１３２） 血小板関連構造物ペレット（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｅｌｌｅｔ）を除去し、成長因子を豊富に含む溶液（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得る。
（Ｓ１３２） 血小板関連構造物ペレット（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｅｌｌｅｔ）を除去し、成長因子を豊富に含む溶液（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得る。
【0073】
一部の実施例において、ステップ（Ｓ１４）の凍結乾燥プロセスには、温度を－３０℃以下に調整し、圧力を１００ ｍＴｏｒｒ以下に調整することが含まれる。一部の実施例において、ステップ（Ｓ１４）の凍結乾燥プロセスには、温度を－３５℃以下に調整し、圧力を８０ ｍＴｏｒｒ以下に調整することが含まれる。
【0074】
実験１：成長因子を豊富に含む乾燥パウダー（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）の製造と成長因子濃度分析
実験１－１：成長因子を豊富に含む乾燥パウダー（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）の製造
本実験は以下のステップ（Ｓ１１’）～（Ｓ１４’）に従って、成長因子を豊富に含む乾燥パウダー（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）を製造した。
実験１－１：成長因子を豊富に含む乾燥パウダー（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）の製造
本実験は以下のステップ（Ｓ１１’）～（Ｓ１４’）に従って、成長因子を豊富に含む乾燥パウダー（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）を製造した。
【0075】
（Ｓ１１’） 純粋血小板溶液を調製する手順は、以下のサブステップが含まれる：
（Ｓ１１１’） ２５０ ｍＬのヒト全血（Ｗｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ）を抗凝血剤が含まれた血袋に入れる；
（Ｓ１１２’） 血小板の精製工程（ｐｒｏｃｅｓｓ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）を実行する。この工程には、以下のサブステップが含まれる：
（Ｓ１１２１’） 遠心分離機を使用し、ヒト全血を遠心分離し（５００～１，２００ｇ、５～８分間；これは一回目の遠心分離）、ヒト全血が上から順に血漿層（Ｐｌａｓｍａ ｌａｙｅｒ）、バッファー層（Ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ ｌａｙｅｒ、白血球はこの層に分布する）、赤血球層（Ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ ｌａｙｅｒ）の三層に分かれる（参考文献３～６参照）。離心後の血球の分離状況は、一般的な知識を持つ技術分野の人々によく知られていて、かつ一回目の遠心分離条件は、３００～１，５００ｇ、３～１０分間に拡大しうる。遠心分離後、血小板（ｐｌａｔｅｌｅｔ）は血漿層（Ｐｌａｓｍａ ｌａｙｅｒ）に分布し、バッファー層（Ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ ｌａｙｅｒ）の近くに位置する。
（Ｓ１１２２’） 無菌操作により、血漿層（Ｐｌａｓｍａ ｌａｙｅｒ）を取り出し、白血球と赤血球を完全に除去し、これを高濃度血小板血漿（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－Ｒｉｃｈ Ｐｌａｓｍａ， ＰＲＰ）と呼ぶ。本発明では、血漿層溶液（Ｐｌａｓｍａ ｌａｙｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）とも呼ぶ；
（Ｓ１１２３’） 自動血球分析器（モデルＸＰ－３００、ブランドＳＹＳＭＥＸ）を使用して、血漿層溶液（Ｐｌａｓｍａ ｌａｙｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中の血小板（ｐｌａｔｅｌｅｔ）の総数を測定する。遠心分離機を使用して、血漿層溶液を再度遠心分離する（１，０００～２，５００、５分間；これは二回目の遠心分離）。これにより、血小板が沈殿物（ｐｅｌｌｅｔ）を形成し、沈殿物が血小板層となる。上清液は血漿層と血漿蛋白層である。二回目遠心分離の条件は５００～３，０００ｇ、５～２０分間に拡大可能であり、上述の一回目遠心分離（３００～１，５００ｇ、３～１０分間）で使用された実際の離心速度よりも高速である必要がある；
（Ｓ１１２４’） 上清液を完全に除去することで血漿（ｐｌａｓｍａ）および血漿（ｐｌａｓｍａ）中のタンパク質を完全に除去し、注射用水（Ｗａｔｅｒ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を使用して血小板層中の血小板を懸濁させる（血小板濃度が１×１０９／ｍになるように、１０～２０ ｍＬにする）ことで、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得る。
（Ｓ１１１’） ２５０ ｍＬのヒト全血（Ｗｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ）を抗凝血剤が含まれた血袋に入れる；
（Ｓ１１２’） 血小板の精製工程（ｐｒｏｃｅｓｓ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）を実行する。この工程には、以下のサブステップが含まれる：
（Ｓ１１２１’） 遠心分離機を使用し、ヒト全血を遠心分離し（５００～１，２００ｇ、５～８分間；これは一回目の遠心分離）、ヒト全血が上から順に血漿層（Ｐｌａｓｍａ ｌａｙｅｒ）、バッファー層（Ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ ｌａｙｅｒ、白血球はこの層に分布する）、赤血球層（Ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ ｌａｙｅｒ）の三層に分かれる（参考文献３～６参照）。離心後の血球の分離状況は、一般的な知識を持つ技術分野の人々によく知られていて、かつ一回目の遠心分離条件は、３００～１，５００ｇ、３～１０分間に拡大しうる。遠心分離後、血小板（ｐｌａｔｅｌｅｔ）は血漿層（Ｐｌａｓｍａ ｌａｙｅｒ）に分布し、バッファー層（Ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ ｌａｙｅｒ）の近くに位置する。
（Ｓ１１２２’） 無菌操作により、血漿層（Ｐｌａｓｍａ ｌａｙｅｒ）を取り出し、白血球と赤血球を完全に除去し、これを高濃度血小板血漿（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－Ｒｉｃｈ Ｐｌａｓｍａ， ＰＲＰ）と呼ぶ。本発明では、血漿層溶液（Ｐｌａｓｍａ ｌａｙｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）とも呼ぶ；
（Ｓ１１２３’） 自動血球分析器（モデルＸＰ－３００、ブランドＳＹＳＭＥＸ）を使用して、血漿層溶液（Ｐｌａｓｍａ ｌａｙｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中の血小板（ｐｌａｔｅｌｅｔ）の総数を測定する。遠心分離機を使用して、血漿層溶液を再度遠心分離する（１，０００～２，５００、５分間；これは二回目の遠心分離）。これにより、血小板が沈殿物（ｐｅｌｌｅｔ）を形成し、沈殿物が血小板層となる。上清液は血漿層と血漿蛋白層である。二回目遠心分離の条件は５００～３，０００ｇ、５～２０分間に拡大可能であり、上述の一回目遠心分離（３００～１，５００ｇ、３～１０分間）で使用された実際の離心速度よりも高速である必要がある；
（Ｓ１１２４’） 上清液を完全に除去することで血漿（ｐｌａｓｍａ）および血漿（ｐｌａｓｍａ）中のタンパク質を完全に除去し、注射用水（Ｗａｔｅｒ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を使用して血小板層中の血小板を懸濁させる（血小板濃度が１×１０９／ｍになるように、１０～２０ ｍＬにする）ことで、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得る。
【0076】
（Ｓ１２’） 活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）プロセスを実行し、次のサブステップを含む：
（Ｓ１２１’） 純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を入れた冷凍管に液体窒素（ｌｉｑｕｉｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ）を入れ、２０～３０分間静置し（冷凍時間は５～１２０分間に拡大しうる）。このため、この冷凍管には１×１０９個の血小板が含まれており、純粋血小板溶液中の血小板濃度は１×１０９／ｍＬである。
（Ｓ１２２’） 冷凍された純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を３７℃の水浴槽で解凍し、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中の血小板を活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）させ、成長因子を放出することで、血小板成長因子抽出液（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｔｒａｃｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得る。
（Ｓ１２１’） 純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を入れた冷凍管に液体窒素（ｌｉｑｕｉｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ）を入れ、２０～３０分間静置し（冷凍時間は５～１２０分間に拡大しうる）。このため、この冷凍管には１×１０９個の血小板が含まれており、純粋血小板溶液中の血小板濃度は１×１０９／ｍＬである。
（Ｓ１２２’） 冷凍された純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を３７℃の水浴槽で解凍し、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中の血小板を活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）させ、成長因子を放出することで、血小板成長因子抽出液（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｔｒａｃｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得る。
【0077】
（Ｓ１３’） 血小板関連構造物（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を除去するプロセスを実行し、次のサブステップを含む：
（Ｓ１３１’） 血小板成長因子抽出液（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｔｒａｃｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を遠心分離機で遠心分離し（１０，０００～１５，０００ｇ、５～１０分間）、血小板関連構造物（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）が血小板関連構造物沈殿物（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｅｌｌｅｔ）として沈む。遠心条件は、８，０００～２０，０００ｇ、３～１５分間に拡大しうる。
（Ｓ１３２’） 慎重に上清液を検体瓶に移し、血小板関連の構造物の沈殿物（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｅｌｌｅｔ）を完全に取り除き、上清液が成長因子を豊富に含む溶液（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）である。検体瓶には、約１ｍＬの成長因子を豊富に含む溶液が含まれており、この約１ｍＬの成長因子を豊富に含む溶液には、１×１０９個の血小板によって放出された成長因子が含まれている。
（Ｓ１３１’） 血小板成長因子抽出液（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｔｒａｃｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を遠心分離機で遠心分離し（１０，０００～１５，０００ｇ、５～１０分間）、血小板関連構造物（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）が血小板関連構造物沈殿物（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｅｌｌｅｔ）として沈む。遠心条件は、８，０００～２０，０００ｇ、３～１５分間に拡大しうる。
（Ｓ１３２’） 慎重に上清液を検体瓶に移し、血小板関連の構造物の沈殿物（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｅｌｌｅｔ）を完全に取り除き、上清液が成長因子を豊富に含む溶液（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）である。検体瓶には、約１ｍＬの成長因子を豊富に含む溶液が含まれており、この約１ｍＬの成長因子を豊富に含む溶液には、１×１０９個の血小板によって放出された成長因子が含まれている。
【0078】
（Ｓ１４’） 凍結乾燥プロセスを実行し、次のサブステップを含む：
（Ｓ１４１’） 予冷却（－３０～－５０℃、少なくとも５時間）；
（Ｓ１４２’） 一次乾燥（温度はステップＳ１４１’の温度勾配から１０℃まで上昇し、１０～２０時間、真空値は１００ｍＴｏｒｒ以下）；および
（Ｓ１４３’） 二次乾燥（２０℃、３～５時間、真空値は１００ｍＴｏｒｒ以下）。凍結乾燥後の乾燥物が成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）である。
（Ｓ１４１’） 予冷却（－３０～－５０℃、少なくとも５時間）；
（Ｓ１４２’） 一次乾燥（温度はステップＳ１４１’の温度勾配から１０℃まで上昇し、１０～２０時間、真空値は１００ｍＴｏｒｒ以下）；および
（Ｓ１４３’） 二次乾燥（２０℃、３～５時間、真空値は１００ｍＴｏｒｒ以下）。凍結乾燥後の乾燥物が成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）である。
【0079】
上記の製造プロセスから、成長因子が豊富な乾燥パウダーを製造するプロセスには、白血球（ＷＢＣ）および血漿の除去ステップ、血小板の刺激ステップ（例えば凍結および解凍を介して）、血小板関連構造体（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の除去ステップ、および乾燥ステップ（例えば冷凍、極低温、または真空乾燥ステップ）が含まれていることがわかる。したがって、成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）には、白血球 （ＷＢＣ）、血漿、血小板が低濃度含むまたはまったく含まれていない。
【0080】
一部の実施例において、成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）には、アルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ）が低濃度含むまたはまったく含まれていない。
【0081】
一部の実施例において、成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）には、グロブリン（ｇｌｏｂｕｌｉｎ）が低濃度含むまたはまったく含まれていない。
【0082】
一部の実施例において、成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）には、フィブリノーゲン（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）が低濃度含むまたはまったく含まれていない。
【0083】
実験１－２：成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）の構成成分分析
精密電子天秤（モデルＭＥ２０４、メトラー社製）を使用して、成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）３本の重量で測定した。成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）３本をそれぞれ１ｍＬの生理食塩水と混合して、成長因子を豊富に含む乾燥粉末溶液（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ／ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）を３本作成します。自動血球分析装置（モデルＸＰ－３００、ＳＹＳＭＥＸ社製）を使用して、各成長因子を豊富に含む乾燥粉末溶液（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ／ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）の白血球（ＷＢＣ）数を分析し、顕微鏡とカウント方式で成長因子を豊富に含む乾燥粉末溶液（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ／ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）の血小板数を検出し、さらに酵素連結免疫吸着測定法（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）を使用して、成長因子が豊富な乾燥パウダー溶液中の各種成長因子（ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ－β１を含む）の濃度を分析した。次に、成長因子を豊富に含む乾燥粉末溶液（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ／ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）中の各種成長因子の濃度、白血球（ＷＢＣ）の濃度、および血小板の数を用いて、１グラム（ｇ）あたりの成長因子を豊富に含む乾燥粉末溶液（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ／ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）中の各種成長因子の重量、白血球（ＷＢＣ）の数、および血小板の数を推定した。実験結果は表１に示される通り。
精密電子天秤（モデルＭＥ２０４、メトラー社製）を使用して、成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）３本の重量で測定した。成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）３本をそれぞれ１ｍＬの生理食塩水と混合して、成長因子を豊富に含む乾燥粉末溶液（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ／ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）を３本作成します。自動血球分析装置（モデルＸＰ－３００、ＳＹＳＭＥＸ社製）を使用して、各成長因子を豊富に含む乾燥粉末溶液（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ／ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）の白血球（ＷＢＣ）数を分析し、顕微鏡とカウント方式で成長因子を豊富に含む乾燥粉末溶液（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ／ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）の血小板数を検出し、さらに酵素連結免疫吸着測定法（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）を使用して、成長因子が豊富な乾燥パウダー溶液中の各種成長因子（ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ－β１を含む）の濃度を分析した。次に、成長因子を豊富に含む乾燥粉末溶液（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ／ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）中の各種成長因子の濃度、白血球（ＷＢＣ）の濃度、および血小板の数を用いて、１グラム（ｇ）あたりの成長因子を豊富に含む乾燥粉末溶液（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ／ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）中の各種成長因子の重量、白血球（ＷＢＣ）の数、および血小板の数を推定した。実験結果は表１に示される通り。
【0084】
【表1】
【0085】
表１から、成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）一本あたりの平均重量は０．００３０ｇであり、１グラム（ｇ）あたりの成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）中には、平均３，４４６，２００ｐｇのＰＤＧＦ－ＢＢ、３７９，７８７．０１ｐｇのＶＥＧＦ、２５３，４３０ｐｇのＥＧＦ、４，５１５．０５ｐｇのＦＧＦ、および８１９，５３０ｐｇのＴＧＦ－β１が含まれている。また、平均１ナノグラム（ｎｇ）あたりの成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）中には、白血球（ＷＢＣ）が未検出（もしく、約０～１００個の白血球（ＷＢＣ）を含む）または血小板が未検出（もしく、約０～１，０００個の血小板（ｐｌａｔｅｌｅｔ）を含む）である。
【0086】
実験２：凍結解凍（活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）プロセス）が成長因子放出倍数に与える影響
実験１－１の手順（Ｓ１１’）を実行して、純粋な血小板溶液を作成し、その純粋な血小板溶液中の血小板濃度は１×１０９／ｍＬである。上述純粋な血小板溶液を冷蔵グループと凍結解凍グループに分ける。
実験１－１の手順（Ｓ１１’）を実行して、純粋な血小板溶液を作成し、その純粋な血小板溶液中の血小板濃度は１×１０９／ｍＬである。上述純粋な血小板溶液を冷蔵グループと凍結解凍グループに分ける。
【0087】
凍結解凍グループ：１ｍＬの純粋な血小板溶液を取り、実験１－１の手順（Ｓ１２’）～（Ｓ１４’）を実行して、凍結解凍グループの乾燥粉末（すなわち、本発明の成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ））を作成した。
【0088】
冷蔵グループ：１ｍＬの純粋な血小板溶液を取り、活性化プロセスの実験１－１の手順（Ｓ１２’）を実行せず、すなわち、純粋な血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）が液体窒素（ｌｉｑｕｉｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ）に置かれて凍結解凍されなかった状態で、４℃に冷蔵された。その後、実験１－１の手順（Ｓ１３’）および（Ｓ１４’）を実行して、冷蔵グループの乾燥粉末を作成した。
【0089】
冷蔵グループ乾燥粉末と凍結解凍グループ乾燥粉末をそれぞれ１ｍＬの注射用水（Ｗａｔｅｒ ｆｏｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）に混合して、冷蔵グループ乾燥粉末溶液および凍結解凍グループ乾燥粉末溶液を作成し、酵素連結免疫吸着法（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ， ＥＬＩＳＡ）を用いて各溶液中の成長因子濃度を分析し、以下の式を用いて各グループの成長因子放出倍数を計算した。
【0090】
凍結解凍グループの成長因子放出倍数＝（凍結解凍グループ溶液の成長因子濃度×凍結解凍グループ溶液の体積）÷（冷蔵グループ溶液の成長因子濃度×冷蔵グループ溶液の体積）
冷蔵グループの成長因子放出倍数＝（冷蔵グループ溶液の成長因子濃度×冷蔵グループ溶液の体積）÷（冷蔵グループ溶液の成長因子濃度×冷蔵グループ溶液の体積）
冷蔵グループの成長因子放出倍数＝（冷蔵グループ溶液の成長因子濃度×冷蔵グループ溶液の体積）÷（冷蔵グループ溶液の成長因子濃度×冷蔵グループ溶液の体積）
【0091】
【表2】
【0092】
表２の実験結果を参照。表２からは、凍結解凍グループ乾燥粉末溶液の成長因子総量が冷蔵グループ乾燥粉末溶液の成長因子総量の１．８～１５倍であることがわかった。これにより、凍結後に再解凍する活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）プロセスによって成長因子放出量が１．８～１５倍大幅に増加することがわかり、予期しない効果があると言える。
【0093】
実験３：成長因子放出の倍増に対する異なる活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）方法の影響
実験３－１：成長因子放出の倍増に対する異なる活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）方法の影響
実験１－１の手順（Ｓ１１’）を実行して、血小板濃度が１×１０９／ｍＬの純粋血小板溶液を調製した。次に、この純粋血小板溶液を対照群とカルシウムイオン群、コラーゲン群、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）群、および－１９６℃（液体窒素）群の４つの実験群に分けた。
実験３－１：成長因子放出の倍増に対する異なる活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）方法の影響
実験１－１の手順（Ｓ１１’）を実行して、血小板濃度が１×１０９／ｍＬの純粋血小板溶液を調製した。次に、この純粋血小板溶液を対照群とカルシウムイオン群、コラーゲン群、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）群、および－１９６℃（液体窒素）群の４つの実験群に分けた。
【0094】
対照群：１ ｍＬの純粋血小板溶液を取り、実験１－１の手順（Ｓ１２’）の活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）プロセスを行わずに、実験１－１の手順（Ｓ１３’）～（Ｓ１４’）を実行して、活性化されていない成長因子粉末を調製し、１ ｍＬの注射用水（Ｗａｔｅｒ ｆｏｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）と混合し、これを対照群溶液とした。
【0095】
－１９６℃（液体窒素）群：１ ｍＬの純粋血小板溶液を取り、実験１－１の手順（Ｓ１２’）～（Ｓ１４’）を実行して、－１９６℃（液体窒素）群粉末（すなわち本発明の成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ））を調製し、１ ｍＬの注射用水（Ｗａｔｅｒ ｆｏｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）と混合して、－１９６℃（液体窒素）群溶液を調製した。
【0096】
カルシウムイオン群：１ ｍＬの純粋血小板溶液を取り、実験１－１の手順（Ｓ１２’）の活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）プロセスを行わずに、すなわち純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）が液体窒素（ｌｉｑｕｉｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ）で凍結解凍されていなく、塩化カルシウムと混合して、混合液中のカルシウムイオン濃度が４．５４ ｍｇ／ｍＬになるようにし、２０～３０分間静置する（活性化時間は５～１２０分間に拡張でき、静置時間は－１９６℃（液体窒素）群が手順（Ｓ１２１’）を実行したときと同じである）。次に、実験１－１の手順（Ｓ１３’）および（Ｓ１４’）を実行して、カルシウムイオン群粉末を調製し、１ ｍＬの注射用水と混合して、カルシウムイオン群溶液を調製した。
【0097】
コラーゲン群：１ ｍＬの純粋血小板溶液を取り、実験１－１の手順（Ｓ１２’）の活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）プロセスを行わずに、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）が液体窒素（ｌｉｑｕｉｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ）で凍結解凍されていなく、コラーゲン（Ｃ７６６１、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製）と混合して、混合液中のコラーゲン濃度が２５μｇ／ｍＬになるようにし、２０～３０分間静置した（活性化時間は５～１２０分間に拡張でき、静置時間は－１９６℃（液体窒素）群が手順（Ｓ１２１’）を実行したときと同じである）。次に、実験１－１の手順（Ｓ１３’）および（Ｓ１４’）を実行して、コラーゲン群粉末を調製し、１ ｍＬの注射用水と混合して、コラーゲン群溶液を調製した。
【0098】
アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）群：１ ｍＬの純粋血小板溶液を取り、実験１－１の手順（Ｓ１２’）の活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）プロセスを行わずに、純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）が液体窒素（ｌｉｑｕｉｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ）で凍結解凍されていなくアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）と混合して、混合液中のアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）濃度が０．８ｍＭになるようにし、２０～３０分間静置した（活性化時間は５～１２０分間に拡張でき、静置時間は－１９６℃（液体窒素）群が手順（Ｓ１２１’）を実行したときと同じである）。次に、実験１－１の手順（Ｓ１３’）および（Ｓ１４’）を実行して、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）群粉末を調製し、１ ｍＬの注射用水と混合して、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）群溶液を調製した。
【0099】
酵素連結免疫吸着分析法（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）を使用して、各溶液中の成長因子濃度を分析し、以下の式を使用して各組の成長因子放出倍数を計算した。
【0100】
対照群の成長因子放出倍数 ＝（対照群溶液の成長因子濃度×対照群溶液の体積）÷（対照群溶液の成長因子濃度×対照群溶液の体積）。
【0101】
実験群の成長因子放出倍数 ＝（実験群溶液の成長因子濃度×実験群溶液の体積）÷（対照群溶液の成長因子濃度×対照群溶液の体積）。
【0102】
実験結果は表３および図２Ａに示されたとおりである。
【0103】
【表3】
【0104】
【0105】
表３および図２Ａの結果から、カルシウムイオン溶液、コラーゲン溶液、およびアデノシン二リン酸溶液の成長因子総量はそれぞれ対照溶液の成長因子総量の０．６３倍、０．２３倍、および０．１９倍であり、これらの処理方法が成長因子総量を大幅に低下させることを示した。予期しなかったことは、－１９６℃（液体窒素）溶液の成長因子総量が対照溶液の成長因子総量の１．８倍であること。すなわち、－１９６℃（液体窒素）で凍結した後に再凍結解凍することで、カルシウムイオン溶液、コラーゲン溶液、およびアデノシン二リン酸溶液の成長因子放出量を２．９～９．５倍（１．８÷０．６３≒２．９、１．８÷０．１９≒９．５）に大幅に増加させることができるという予期しない効果がある。
【0106】
実験３－２：異なる凍結解凍プロセスが成長因子放出倍数に与える影響
実験１－１の手順（Ｓ１１’）を実行して、血小板濃度が１×１０９／ｍＬの純粋血小板溶液を作成した。次に、純粋血小板溶液を対照群と－２０℃群、－３０℃群、－４０℃群、－８０℃群、および－１９６℃（液体窒素）群の５つの実験群に分けた。
実験１－１の手順（Ｓ１１’）を実行して、血小板濃度が１×１０９／ｍＬの純粋血小板溶液を作成した。次に、純粋血小板溶液を対照群と－２０℃群、－３０℃群、－４０℃群、－８０℃群、および－１９６℃（液体窒素）群の５つの実験群に分けた。
【0107】
対照群：１ｍＬの純粋な血小板溶液を取り、実験１－１の手順（Ｓ１２’）の活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）プロセスを実行せずに、直接実験１－１の手順（Ｓ１３’）～（Ｓ１４’）を実行して活性化プロセスを行わずに成長因子乾燥粉末を作成し、１ｍＬの注射用水（Ｗａｔｅｒ ｆｏｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）と混合し、これを対照群溶液とした。
【0108】
－１９６℃（液体窒素）群：１ｍＬの純粋な血小板溶液を取り、手順１－１（Ｓ１２’）～（Ｓ１４’）を実行して－１９６℃（液体窒素）群乾燥粉末を作成した（すなわち、本発明における成長因子を豊富に含む乾燥粉末（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ））。
【0109】
－２０℃群：１ｍＬの純粋な血小板溶液を取り、実験１－１の手順（Ｓ１２’）の活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）プロセスを実行せずに、すなわち純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）が液体窒素（ｌｉｑｕｉｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ）で凍結解凍されていなく、－２０℃の冷凍庫に入れて冷凍解凍した。その後、実験１－１の手順（Ｓ１３’）および（Ｓ１４’）を実行して－２０℃群乾燥粉末を作成した。
【0110】
－３０℃群：１ｍＬの純粋な血小板溶液を取り、実験１－１の手順（Ｓ１２’）の活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）プロセスを実行せずに、すなわち純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）が液体窒素（ｌｉｑｕｉｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ）で凍結解凍されていなく、－３０℃の冷凍庫に入れて冷凍解凍した。その後、実験１－１の手順（Ｓ１３’）および（Ｓ１４’）を実行して－３０℃群乾燥粉末を作成した。
【0111】
－４０℃群：１ｍＬの純粋な血小板溶液を取り、実験１－１の手順（Ｓ１２’）の活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）プロセスを実行せずに、すなわち純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）が液体窒素（ｌｉｑｕｉｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ）で凍結解凍されていなく、－４０℃の冷凍庫に入れて冷凍解凍した。その後、実験１－１の手順（Ｓ１３’）および（Ｓ１４’）を実行して－４０℃群乾燥粉末を作成した。
【0112】
－８０℃群：１ｍＬの純粋な血小板溶液を取り、実験１－１の手順（Ｓ１２’）の活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）プロセスを実行せずに、すなわち純粋血小板溶液（ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）が液体窒素（ｌｉｑｕｉｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ）で凍結解凍されていなく、－８０℃の冷凍庫に入れて冷凍解凍した。その後、実験１－１の手順（Ｓ１３’）および（Ｓ１４’）を実行して－８０℃群乾燥粉末を作成した。
【0113】
－２０℃群乾燥粉末、－３０℃群乾燥粉末、－４０℃群乾燥粉末、－８０℃群乾燥粉末、および－１９６℃（液体窒素）群乾燥粉末をそれぞれ１ｍＬの注射用水（Ｗａｔｅｒ ｆｏｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）と混合し、各溶液中の成長因子濃度を酵素連結免疫吸着測定（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ， ＥＬＩＳＡ）法を用いて分析し、以下の式で各グループの成長因子放出倍数を計算した。
【0114】
対照組成長因子放出倍数＝（対照組溶液中の成長因子濃度×対照組溶液の体積）÷（対照組溶液中の成長因子濃度×対照組溶液の体積）。
【0115】
実験組成長因子放出倍数＝（実験組溶液中の成長因子濃度×実験組溶液の体積）÷（対照組溶液中の成長因子濃度×対照組溶液の体積）。
【0116】
実験結果は表４および図２Ｂに示され通りである。
【0117】
【表4】
【0118】
【0119】
表４および図２Ｂの結果は、－２０℃群溶液、－３０℃群溶液、－４０℃群溶液、および－８０℃群溶液の成長因子総量がそれぞれ対照組溶液の成長因子総量の１．０４倍、０．９７倍、０．８８倍、および１．０２倍であることを示す。すなわち、－２０℃から－８０℃での凍結解凍によって得られた成長因子総量は未凍結解凍群（対照群）の１±０．１２倍であり、－２０℃から－８０℃での凍結解凍プロセスでは成長因子総量を著しく増加させることができない。予期しなかったことに、－１９６℃（液体窒素）群の成長因子総量は対照組溶液の成長因子総量の１．８倍である。すなわち、－１９６℃（液体窒素）の冷凍後の活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）プロセスにより、成長因子放出量が１倍から大幅に１．８倍に増加することができ、予期しない効果を持つ。
【0120】
実験４：成長因子を豊富に含む乾燥粉末が組織修復と抗炎症効果に対する影響
実験４－１：成長因子を豊富に含む乾燥粉末が組織修復に対する影響
人間の皮膚線維芽細胞（ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ＨＤＦ）（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｓｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． から購入、製品番号２３２０）を１％の人間血小板溶解液（Ｈｕｍａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｌｙｓａｔｅ、ＨＰＬ）を含むイーグル最小限度必要培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ、ＤＭＥＭ、Ｃｏｒｎｉｎｇ １０－０１３ＣＶ）中で培養後、新しい培地に交換した。上述皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）は接着細胞（ａｄｈｅｒｅｎｔ ｃｅｌｌ）である。
実験４－１：成長因子を豊富に含む乾燥粉末が組織修復に対する影響
人間の皮膚線維芽細胞（ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ＨＤＦ）（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｓｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． から購入、製品番号２３２０）を１％の人間血小板溶解液（Ｈｕｍａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｌｙｓａｔｅ、ＨＰＬ）を含むイーグル最小限度必要培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ、ＤＭＥＭ、Ｃｏｒｎｉｎｇ １０－０１３ＣＶ）中で培養後、新しい培地に交換した。上述皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）は接着細胞（ａｄｈｅｒｅｎｔ ｃｅｌｌ）である。
【0121】
９６ウェルプレートを未処理ウェル（対照群ウェル）および実験１－１で作製された成長因子を豊富に含む乾燥粉末ウェル（ＲＤ２２０１ウェル）に分割し、二重複をする。人間の皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）を未処理ウェル（対照群ウェル）とＲＤ２２０１ウェルにそれぞれ加え、各ウェルに同じ数の細胞を含ませ、３７℃、５％二酸化炭素（ｃａｒｂｏｎ ｄｉｏｘｉｄｅ，ＣＯ２）の培養器で２４時間培養した。
【0122】
古い培地（ｕｓｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）を取り除いた。実験１－２の成長因子を豊富に含む乾燥粉末１本（平均１本あたり０．００３０グラム（ｇ）の成長因子を豊富に含む乾燥粉末を含む）と１ｍＬのＤＭＥＭ培地液（１％ＨＰＬ含有）と混合し、高濃度の混合液を得る。その後、高濃度の混合液をＤＭＥＭ培地液（１％ＨＰＬ含有）と混合し（高濃度の混合液とＤＭＥＭ培地液の体積比は１：１９）、成長因子を豊富に含む乾燥粉末培養液を調製した。成長因子を豊富に含む乾燥粉末培養液でＲＤ２２０１ウェル中の細胞を懸濁させ、ＤＭＥＭ培地液（１％ＨＰＬ含有）で未処理ウェル（対照群ウェル）中の細胞を懸濁させ、３７℃、５％二酸化炭素（ｃａｒｂｏｎ ｄｉｏｘｉｄｅ， ＣＯ２）の培養器で２４時間培養した。
【0123】
古い培地（ｕｓｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）を取り除く。各ウェルに、９０μＬのＤＭＥＭと１０μｌのＣＣＫ－８緩衝液（ｂｕｆｆｅｒ）（ＤＯＪＩＮＤＯ、製品番号ＣＫ０４）を加えた。３７℃、５％二酸化炭素（ｃａｒｂｏｎ ｄｉｏｘｉｄｅ， ＣＯ２）の培養器で３時間培養した。多機能マイクロプレート分光光度計（モデルＶａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を用いて、吸光値を４５０ｎｍに設定し分析した。ＣＣＫ－８緩衝液（ｂｕｆｆｅｒ）の製品説明書に従い、吸光値と細胞数の回帰曲線を作成し、吸光値を生存細胞数に換算した。
【0124】
平均値±ＳＤでデータを表示し、Ｔ検定（Ｔ ＴＥＳＴ）を使用して統計分析を行った。 「＊」標記された群は未処理ウェル（対照群ウェル）と統計的に有意差（ｐ ＜０．０５）があることを示す。
【0125】
図３Ａを参照されたい。図３Ａは、本発明の成長因子を豊富に含む乾燥粉末が人間の皮膚線維芽細胞の増殖に及ぼす影響を示す棒グラフである。図３Ａから、対照群ウェル中の細胞数が５，０００であり、ＲＤ２２０１群ウェル中の細胞数が６，２０３であり、両者間に有意差（ｐ ＜０．０５）があった。したがって、成長因子を豊富に含む乾燥粉末は、皮膚線維芽細胞の増殖を促進し、皮膚組織修復を促進する。発明者は成長因子を豊富に含む乾燥粉末が、他の人間の組織の線維芽細胞の増殖を促進し、それにより当該他の組織の修復を促進することができると予測した。
【0126】
実験４－２：成長因子を豊富に含む乾燥粉末が炎症反応を緩和する影響
実験４－１と同じ人間の皮膚線維芽細胞（Ｈｕｍａｎ Ｄｅｒｍａｌ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ＨＤＦ）を実験に用いた。人間の皮膚線維芽細胞を、２％の胎牛血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ）を含むイーグル最小限度必要培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ、ＤＭＥＭ、Ｃｏｒｎｉｎｇ １０－０１３ＣＶ）に培養し、その後新鮮な培地に交換した。
実験４－１と同じ人間の皮膚線維芽細胞（Ｈｕｍａｎ Ｄｅｒｍａｌ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ＨＤＦ）を実験に用いた。人間の皮膚線維芽細胞を、２％の胎牛血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ）を含むイーグル最小限度必要培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ、ＤＭＥＭ、Ｃｏｒｎｉｎｇ １０－０１３ＣＶ）に培養し、その後新鮮な培地に交換した。
【0127】
９６ウェルプレートを未処理ウェル（対照群ウェル）と成長因子を豊富に含む乾燥粉末ウェル（ＲＤ２２０１ウェル）に分け、それぞれ３回繰り返した。３回繰り返しの検体は、３つの異なる人間の全血からのものである。人間の皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）を未処理ウェル（対照組ウェル）およびＲＤ２２０１ウェルにそれぞれ加え、同じ細胞数を含むようにし、３７℃、５％二酸化炭素（ｃａｒｂｏｎ ｄｉｏｘｉｄｅ，ＣＯ２）の培養器で２４時間培養した。
【0128】
古い培地（ｕｓｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）を取り除く。実験１－２の成長因子を豊富に含む乾燥粉末１本（平均１本あたり０．００３０グラム（ｇ）の成長因子を豊富に含む乾燥粉末を含む）と１ｍＬのＤＭＥＭ培地液（２％ＨＰＬ含有）と混合し、高濃度の混合液を得る。その後、高濃度の混合液をＤＭＥＭ培地液（２％ＨＰＬ含有）と混合し（高濃度の混合液とＤＭＥＭ培地液の体積比は１：１９）、成長因子を豊富に含む乾燥粉末培養液を調製した。成長因子を豊富に含む乾燥粉末培養液でＲＤ２２０１ウェル中の細胞を懸濁させ、ＤＭＥＭ培地液（２％ＨＰＬ含有）で未処理ウェル（対照群ウェル）中の細胞を懸濁させ、３７℃、５％二酸化炭素（ｃａｒｂｏｎ ｄｉｏｘｉｄｅ， ＣＯ２）の培養器で２４時間培養した。
【0129】
未処理ウェル（対照群ウェル）およびＲＤ２２０１ウェルの細胞培地をそれぞれ微量遠心管に移し、インターロイキン（ＩＬ－６、炎症因子の１つ）ＥＬＩＳＡ試薬キット（Ｈｕｍａｎ ＩＬ－６ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ）（製品番号ａｂ１７８０１３、Ａｂｃａｍ製）を使用して、細胞培地中の人間のインターロイキン（Ｈｕｍａｎ ＩＬ－６）濃度を測定した。多機能マイクロプレート分光光度計（モデルＶａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸ、ブランドＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、吸光値を４５０ｎｍに設定し分析した。インターロイキン（ＩＬ－６）ＥＬＩＳＡ試薬キットの製品説明書に従って、吸光値と炎症因子ＩＬ－６濃度の回帰曲線を作成し、各群の炎症因子放出率を以下の式で計算した。
【0130】
対照群炎症因子放出率＝（対照群炎症因子ＩＬ－６濃度÷対照群炎症因子ＩＬ－６濃度）×１００％。
【0131】
ＲＤ２２０１群炎症因子放出率＝（ＲＤ２２０１群炎症因子ＩＬ－６濃度÷対照群炎症因子ＩＬ－６濃度）×１００％。
【0132】
平均値±ＳＤでデータを表示し、Ｔ検定（Ｔ ＴＥＳＴ）を使用して統計分析を行った。「＊」標記された群は未処理ウェル（対照群ウェル）と統計的に有意差（ｐ ＜０．０５）があることを示す。
【0133】
【表5】
【0134】
表５および図３Ｂを参照されたい。図３Ｂは、本発明の成長因子を豊富に含む乾燥粉末が人間の皮膚線維芽細胞の炎症反応を緩和する影響を示す棒グラフである。表５および図３Ｂの結果から、対照群の平均炎症因子放出率は１００％であり、ＲＤ２２０１群の平均炎症因子放出率は３６．９８％で、対照群と比較して有意差があり（ｐ＜０．０５）、減少率は６３％に達した。これにより、成長因子を豊富に含む乾燥粉末は人間の皮膚線維芽細胞の炎症反応を抑制し、皮膚の炎症を緩和することができることがわかった。発明者は、刺激物（例えばＬＰＳ）によって人間の他の組織の線維芽細胞の炎症反応を誘発した後、成長因子を豊富に含む乾燥粉末は誘発された炎症反応を緩和させ、その他の組織の炎症を緩和することができると予測した。
【0135】
実験５：異なる種類の成長因子を豊富に含む乾燥粉末が炎症反応を緩和する影響
実験４－２の手順に従って、必要な人間の皮膚線維芽細胞を準備した。９６ウェルプレートを未処理ウェル（対照群のウェル）、成長因子を豊富に含む乾燥粉末のウェル（ＲＤ２２０１ウェル）、および血漿とＲＤ２２０１の混合物のウェルに分け、それぞれ３回繰り返した。３回繰り返しの検体は、３つの異なる人間の全血からのものである。人間の皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）を未処理ウェル（対照群ウェル）、ＲＤ２２０１ウェル、および血漿とＲＤ２２０１の混合物のウェルにそれぞれ添加し、同じ細胞数を含むようにし、３７℃、５％二酸化炭素（ｃａｒｂｏｎ ｄｉｏｘｉｄｅ，ＣＯ２）の培養器で２４時間培養した。
実験４－２の手順に従って、必要な人間の皮膚線維芽細胞を準備した。９６ウェルプレートを未処理ウェル（対照群のウェル）、成長因子を豊富に含む乾燥粉末のウェル（ＲＤ２２０１ウェル）、および血漿とＲＤ２２０１の混合物のウェルに分け、それぞれ３回繰り返した。３回繰り返しの検体は、３つの異なる人間の全血からのものである。人間の皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）を未処理ウェル（対照群ウェル）、ＲＤ２２０１ウェル、および血漿とＲＤ２２０１の混合物のウェルにそれぞれ添加し、同じ細胞数を含むようにし、３７℃、５％二酸化炭素（ｃａｒｂｏｎ ｄｉｏｘｉｄｅ，ＣＯ２）の培養器で２４時間培養した。
【0136】
古い培地（ｕｓｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）を取り除く。血液検体を取り、実験１－１の手順で、同じ重量の２本の成長因子を豊富に含んだ乾燥粉末を得た。成長因子を豊富に含んだ乾燥粉末１本を１ｍＬの血漿（ｐｌａｓｍａ）（すなわち、Ｓ１１２３’の手順で得られる血漿と血漿タンパク質層の溶液）と混合して、成長因子を豊富に含んだ血漿溶液を作成した。もう１本の成長因子を豊富に含んだ乾燥粉末を１ ｍＬのＤＭＥＭ培地（２％ＦＢＳ含有）と混合して、成長因子を豊富に含んだ培地を作成した。次に、各群で以下の手順を実行した。
【0137】
未処理ウェル（対照群ウェル）：ＤＭＥＭ培地（２％ＦＢＳ含有）を使用して未処理ウェル（対照群ウェル）の細胞を懸濁し、３７℃、５％二酸化炭素（ｃａｒｂｏｎ ｄｉｏｘｉｄｅ，ＣＯ２）の培養器で２４時間培養した。
【0138】
ＲＤ２２０１ウェル：成長因子を豊富に含んだ培地とＤＭＥＭ培地（２％ＦＢＳ含有）を混合し（成長因子を豊富に含んだ培地とＤＭＥＭ培地の体積比は１：１９）、成長因子を豊富に含んだ乾燥粉末培地（成長因子の乾燥粉末濃度は１．５×１０－４ ｇ／ｍＬ）を作成し、ＲＤ２２０１ウェルの細胞をその成長因子を豊富に含んだ乾燥粉末培地で懸濁し、３７℃、５％二酸化炭素（ｃａｒｂｏｎ ｄｉｏｘｉｄｅ，ＣＯ２）の培養器で２４時間培養した。
【0139】
血漿とＲＤ２２０１の混合物のウェル：成長因子を豊富に含んだ血漿溶液とＤＭＥＭ培地（２％ＦＢＳ含有）を混合し（富含成長因子の血漿溶液とＤＭＥＭ培地の体積比は１：１９）、成長因子を豊富に含んだ乾燥粉末と血漿の培地を作成し（成長因子の乾燥粉末濃度は１．５×１０－４ ｇ／ｍＬ）、血漿とＲＤ２２０１の混合物のウェルの細胞をその成長因子を豊富に含んだ乾燥粉末と血漿の培地で懸濁し、３７℃、５％二酸化炭素（ｃａｒｂｏｎ ｄｉｏｘｉｄｅ，ＣＯ２）の培養器で２４時間培養した。
【0140】
未処理ウェル（対照群ウェル）、ＲＤ２２０１ウェル、および血漿とＲＤ２２０１の混合物のウェルの細胞培養液をそれぞれ微量遠心管に移し、インターロイキン（ＩＬ－６、炎症因子の１種）ＥＬＩＳＡ試薬キット（Ｈｕｍａｎ ＩＬ－６ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ）（製品番号ａｂ１７８０１３、Ａｂｃａｍ製）を使用して、細胞培養液中の人間ＩＬ－６濃度を測定します。次に、多機能マイクロプレートスペクトロメーター（モデルＶａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を用いて分析し、吸光値を４５０ｎｍに設定した。インターロイキン（ＩＬ－６）ＥＬＩＳＡ試薬キットの製品説明書に従って、吸光値と炎症因子ＩＬ－６濃度の回帰曲線を作成し、吸光値を炎症因子ＩＬ－６の濃度に変換し、各群の炎症因子放出率を以下の式で計算した。
【0141】
対照群の炎症因子放出率＝（対照群の炎症因子ＩＬ－６濃度÷対照群の炎症因子ＩＬ－６濃度）×１００％。
【0142】
ＲＤ２２０１群の炎症因子放出率＝（ＲＤ２２０１群の炎症因子ＩＬ－６濃度÷対照群の炎症因子ＩＬ－６濃度）×１００％。
【0143】
血漿とＲＤ２２０１の混合物の炎症因子放出率＝（血漿とＲＤ２２０１の混合物の炎症因子ＩＬ－６濃度÷対照群の炎症因子ＩＬ－６濃度）×１００％。
【0144】
平均値±ＳＤでデータを表示し、Ｔ検定（Ｔ ＴＥＳＴ）を使用して統計分析を行った。「＋」標記された群は成長因子を豊富に含んだ乾燥粉末ウェル（ＲＤ２２０１）と統計的に有意差（ｐ ＜０．０５）があることを示す。「＊」標記された群は未処理ウェル（対照群ウェル）と統計的に有意差（ｐ ＜０．０５）があることを示す。
【0145】
【表6】
【0146】
図４を参照されたい。図４は、異なる種類の成長因子を含む乾燥粉末溶液が人間の皮膚線維芽細胞の炎症を和らげる影響を示す棒グラフである。図４の結果は、対照群の平均炎症因子放出率は１００％であり、ＲＤ２２０１群の平均炎症因子放出率は３６．９８％であり、血漿とＲＤ２２０１の混合群の平均炎症因子放出率は４９４．４６％であることを示した。ＲＤ２２０１群は、対照群と比較して、炎症因子放出率が有意に低下し（ｐ ＜０．０５）、低下率は６３％に達した。一方、血漿とＲＤ２２０１の混合群の炎症因子放出率は有意に上昇し（ｐ ＜０．０５）、上昇率は３９４％に達しました。ＲＤ２２０１群と比較して、血漿とＲＤ２２０１の混合群の炎症因子放出率も有意に上昇し（ｐ ＜０．０５）、上昇率は４５７％に達しました。上記の実験から、血漿および血漿蛋白層を含む成長因子を豊富に含む乾燥粉末溶液は、人間の皮膚線維芽細胞の炎症を効果的に緩和することができず、炎症を大幅に悪化させてしまうことがわかった。したがって、本件において血漿および血漿蛋白を除去することは重要な技術的特徴であり、製品が炎症反応を大幅に緩和することができ、予期せぬ効果があることを示した。
【0147】
発明者は、刺激物（例えばＬＰＳ）を用いて他の人間組織の炎症反応を誘発し実験を行っても類似した結果、すなわち、本発明において血漿および血漿蛋白を除去することで、製品が誘発された炎症反応を大幅に緩和できることを予測した。
【0148】
実験６：凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｙｉｎｇ）プロセスが製品の抗炎症効果に与える影響
実験４－２の手順に従って、人間の皮膚線維芽細胞を準備した。９６ウェルプレートを未処理ウェル（対照群ウェル）、成長因子を豊富に含む乾燥粉末ウェル（ＲＤ２２０１ウェル）、成長因子を豊富に含む溶液ウェル（ＲＤ２２０１非凍結乾燥ウェル）に分け、それぞれ３回繰り返した。３回繰り返しの検体は、３つの異なる人間の全血からのものである。人間の皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）を未処理ウェル（対照群ウェル）、ＲＤ２２０１ウェル、およびＲＤ２２０１非凍結乾燥ウェルにそれぞれ加え、同じ細胞数を含むようにし、３７℃、５％の二酸化炭素（ｃａｒｂｏｎ ｄｉｏｘｉｄｅ，ＣＯ２）の培養器で２４時間培養した。
実験４－２の手順に従って、人間の皮膚線維芽細胞を準備した。９６ウェルプレートを未処理ウェル（対照群ウェル）、成長因子を豊富に含む乾燥粉末ウェル（ＲＤ２２０１ウェル）、成長因子を豊富に含む溶液ウェル（ＲＤ２２０１非凍結乾燥ウェル）に分け、それぞれ３回繰り返した。３回繰り返しの検体は、３つの異なる人間の全血からのものである。人間の皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）を未処理ウェル（対照群ウェル）、ＲＤ２２０１ウェル、およびＲＤ２２０１非凍結乾燥ウェルにそれぞれ加え、同じ細胞数を含むようにし、３７℃、５％の二酸化炭素（ｃａｒｂｏｎ ｄｉｏｘｉｄｅ，ＣＯ２）の培養器で２４時間培養した。
【0149】
古い培地（ｕｓｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）を取り除く。実験１－１の手順（Ｓ１１’）～（Ｓ１３’）を実行して、成長因子を豊富に含む溶液を得た。次に、各群は、以下の手順をそれぞれ実行した。
【0150】
未処理ウェル（対照群ウェル）：ＤＭＥＭ培地（２％ＦＢＳ含有）を使用して、未処理ウェル（対照群ウェル）の細胞を懸濁し、３７℃、５％の二酸化炭素（ｃａｒｂｏｎ ｄｉｏｘｉｄｅ， ＣＯ２）の培養器で２４時間培養した。
【0151】
ＲＤ２２０１ウェル：成長因子を豊富に含む溶液１ｍＬを取り、実験１－１の手順（Ｓ１４’）を実行して、成長因子を豊富に含む乾燥粉末を得た。その乾燥粉末を１ｍＬの注射用水と混合して、成長因子を豊富に含む乾燥粉末溶液を調製した。その乾燥粉末溶液をＤＭＥＭ培地（２％ＦＢＳ含有）と混合し、成長因子を豊富に含む乾燥粉末培地液（成長因子の乾燥粉末濃度は１．５×１０－４ ｇ／ｍＬ）を得た。その乾燥粉末培地液を使用して、ＲＤ２２０１ウェルの細胞を懸濁し、３７℃、５％の二酸化炭素（ｃａｒｂｏｎ ｄｉｏｘｉｄｅ，ＣＯ２）の培養器で２４時間培養した。
【0152】
ＲＤ２２０１非凍結乾燥ウェル：成長因子を豊富に含む溶液１ｍＬとＤＭＥＭ培地（２％ＦＢＳ含有）を混合し、成長因子を豊富に含む混合液（成長因子の乾燥粉末濃度は１．５×１０－４ ｇ／ｍＬ）を得た。その混合液を使用して、ＲＤ２２０１非凍結乾燥ウェルの細胞を懸濁し、３７℃、５％の二酸化炭素（ｃａｒｂｏｎ ｄｉｏｘｉｄｅ， ＣＯ２）の培養箱で２４時間培養した。
【0153】
未処理ウェル（対照群ウェル）、ＲＤ２２０１ウェル、およびＲＤ２２０１非凍結乾燥ウェルの細胞培養液をそれぞれ微量遠心管に移し、インターロイキン（ＩＬ－６、炎症因子の一種）ＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ ＩＬ－６ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ）（製品番号ａｂ１７８０１３、Ａｂｃａｍ製）を使用して、細胞培養液中の人間ＩＬ－６濃度を測定した。多機能マイクロプレート分光光度計（モデルＶａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を使用して分析を行い、吸光値を４５０ｎｍに設定した。インターロイキン（ＩＬ－６）ＥＬＩＳＡキットの製品説明書に従って、吸光値と炎症因子ＩＬ－６濃度の回帰曲線を作成し、吸光値をＩＬ－６濃度に変換して、各群の炎症因子放出率を以下の式で計算した。
【0154】
対照群炎症因子放出率＝（対照群炎症因子ＩＬ－６濃度÷対照群炎症因子ＩＬ－６濃度）×１００％。
【0155】
ＲＤ２２０１群炎症因子放出率＝（ＲＤ２２０１群炎症因子ＩＬ－６濃度÷対照群炎症因子ＩＬ－６濃度）×１００％。
【0156】
ＲＤ２２０１非凍結乾燥群炎症因子放出率＝（ＲＤ２２０１非凍結乾燥群炎症因子ＩＬ－６濃度÷対照群炎症因子ＩＬ－６濃度）×１００％
平均値±ＳＤでデータを表示し、Ｔ検定（Ｔ ＴＥＳＴ）を使用して統計分析を行った。「＊」標記された群は未処理ウェル（対照群ウェル）と統計的に有意差（ｐ ＜０．０５）があることを示す。
平均値±ＳＤでデータを表示し、Ｔ検定（Ｔ ＴＥＳＴ）を使用して統計分析を行った。「＊」標記された群は未処理ウェル（対照群ウェル）と統計的に有意差（ｐ ＜０．０５）があることを示す。
【0157】
【表7】
【0158】
表７および図５を参照されたい。図５は凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｙｉｎｇ）プロセスが製品の抗炎症効果に及ぼす影響の棒グラフである。図５の実験結果は、対照群の平均発炎因子放出率が１００％であるのに対し、ＲＤ２２０１群の平均発炎因子放出率が３６．９８％、ＲＤ２２０１非凍結乾燥群の平均発炎因子放出率が７５．６９％であることを示した。対照群と比較して、ＲＤ２２０１群の発炎因子放出率は有意に低下し（ｐ ＜０．０５）、低下率は６３％に達した。一方、対照群と比較して、ＲＤ２２０１非凍結乾燥群の発炎因子放出率は有意に低下していない（ｐ＞ ０．０５）。上述の実験から、ＲＤ２２０１非凍結乾燥群では人間の皮膚線維芽細胞の炎症を有効に緩和できないことがわかった。したがって、ＲＤ２２０１非凍結乾燥群は人間の皮膚線維芽細胞の炎症を効果的に緩和することができないため、本発明において凍結乾燥ステップは重要な技術特徴であり、製品が炎症反応を大幅に緩和することができ、予期しない効果を持つ。
【0159】
発明者は、刺激物（例えばＬＰＳ）を用いて他の人間組織の炎症反応を誘発し実験を行っても類似した結果、すなわち、本発明の凍結乾燥ステップは、製品が誘発された炎症反応を大幅に緩和し、組織の炎症を緩和することができると予測した。
【0160】
実験７：製剤手順中血小板濃度が成長因子総量に与える影響
本実験は、血小板濃度に基づいてグループ分けし、低濃度群、中濃度群、高濃度群に分けた。実験１－１の手順（Ｓ１１’）に従って、純血小板溶液を調製し、その純血小板溶液中の血小板濃度は１×１０９／ｍＬである。次に、以下の手順に従って各群の乾燥粉末を調製した。
本実験は、血小板濃度に基づいてグループ分けし、低濃度群、中濃度群、高濃度群に分けた。実験１－１の手順（Ｓ１１’）に従って、純血小板溶液を調製し、その純血小板溶液中の血小板濃度は１×１０９／ｍＬである。次に、以下の手順に従って各群の乾燥粉末を調製した。
【0161】
高濃度群：１０ｍＬの純血小板溶液を取り、遠心分離機を使用して純血小板溶液を遠心分離（１，０００～２，５００、５分）、血小板が沈降して沈殿物（ｐｅｌｌｅｔ）を形成させた。上清液を除去し、１ｍＬの注射用水を加え、高濃度群の純血小板溶液（血小板濃度は１０×１０９／ｍＬ）を得た。次に、実験１－１の手順（Ｓ１２’）～（Ｓ１４’）に従って、高濃度群の乾燥粉末を調製した。
【0162】
中濃度群：１０ｍＬの純血小板溶液を取り、遠心分離機を使用して純血小板溶液を遠心分離（１，０００～２，５００、５分）、血小板が沈降して沈殿物（ｐｅｌｌｅｔ）を形成させた。上清液を除去し、２ｍＬの注射用水を加え、中濃度群の純血小板溶液（血小板濃度は５×１０９／ｍＬ）を得た。次に、実験１－１の手順（Ｓ１２’）～（Ｓ１４’）に従って、中濃度群の乾燥粉末を調製した。
【0163】
低濃度群：１０ｍＬの純血小板溶液を取り、遠心分離機を使用して純血小板溶液を遠心分離（１，０００～２，５００、５分）、血小板が沈降して沈殿物（ｐｅｌｌｅｔ）を形成させた。上清液を除去し、３ｍＬの注射用水を加え、中濃度群の純血小板溶液（血小板濃度は３．３×１０９／ｍＬ）を得た。次に、実験１－１の手順（Ｓ１２’）～（Ｓ１４’）に従って、中濃度群の乾燥粉末を調製した。
【0164】
高濃度群の溶液、中濃度群の溶液、および低濃度群の溶液を、それぞれ１、２、および３ｍＬの注射用水と混合し、高濃度群溶液、中濃度群溶液、および低濃度群溶液を得た。次に、酵素連結免疫吸着分析法（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ， ＥＬＩＳＡ）を使用して、３つの群の成長因子濃度を分析し、以下の式を使用して各群の成長因子放出総量を計算した。
高濃度群の成長因子放出総量＝高濃度群溶液中の成長因子濃度×高濃度群溶液の体積
中濃度群の成長因子放出総量＝中濃度群溶液中の成長因子濃度×中濃度群溶液の体積
低濃度群の成長因子放出総量＝低濃度群溶液中の成長因子濃度×低濃度群溶液の体積
高濃度群の成長因子放出総量＝高濃度群溶液中の成長因子濃度×高濃度群溶液の体積
中濃度群の成長因子放出総量＝中濃度群溶液中の成長因子濃度×中濃度群溶液の体積
低濃度群の成長因子放出総量＝低濃度群溶液中の成長因子濃度×低濃度群溶液の体積
【0165】
【表8】
【0166】
図６を参照されたい。図６は、製剤手順中血小板濃度が成長因子総量に与える影響の棒グラフである。図６の結果から、純血小板溶液中の血小板濃度が３．３×１０９／ｍＬの場合、成長因子放出総量は１０９．５ｎｇであり、純血小板溶液中の血小板濃度が５×１０９／ｍＬの場合、成長因子放出総量は１２６．３ｎｇであり、純血小板溶液中の血小板濃度が１０×１０９／ｍＬの場合、成長因子放出総量は２６４ｎｇであることがわかった。図６から、純血小板溶液中の血小板濃度が５×１０９／ｍＬ～１０×１０９／ｍＬの場合、成長因子の放出総量が有意に増加し、上昇率が１５％～１４１％に達し、予期せぬ効果があることがわかった。
【0167】
上記は本発明の好ましい実施形態にすぎず、本発明の特許範囲を限定するものではない。したがって、本発明が開示された精神から逸脱しないその他のすべての変更または修正は、本件の特許範囲に含まれるものとすべきである。
【0168】
【表9】
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5】
【図6】
【外国語明細書】