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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023184489
(43)【公開日】2023-12-28
(54)【発明の名称】抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲート
(51)【国際特許分類】
A61K 47/68 20170101AFI20231221BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20231221BHJP
A61K 31/573 20060101ALI20231221BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20231221BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20231221BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20231221BHJP
【ＦＩ】
A61K47/68 ZNA
A61K39/395 L
A61K31/573
A61P35/02
C12N15/13
C07K16/28
【審査請求】未請求
【請求項の数】19
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023098262
(22)【出願日】2023-06-15
(31)【優先権主張番号】63/366,520
(32)【優先日】2022-06-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/488,302
(32)【優先日】2023-03-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】523221348
【氏名又は名称】アッヴィ・バイオセラピューティクス・インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110001173
【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】チョーウェイ・エイ・チャン
(72)【発明者】
【氏名】イーサン・ディー・エンバリー
(72)【発明者】
【氏名】エイドリアン・ディー・ホブソン
(72)【発明者】
【氏名】クリストファー・シー・マービン
(72)【発明者】
【氏名】ジェームズ・ダブリュ・パーセル
【テーマコード（参考）】
4C076
4C085
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076CC50
4C076EE59
4C085AA13
4C085AA14
4C085AA25
4C085BB11
4C085CC02
4C085DD62
4C085EE01
4C085GG01
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086DA10
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA13
4C086ZB07
4C086ZB27
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA72
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
【解決手段】本開示は、抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を、そのようなＡＤＣを使用する組成物及び方法も含め、提供する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の構造：
（式中、
Ａは、抗体であり、
Ｒは、抗体のシステイン残基を介した抗体の付着点であり、連結されると－Ｓ－基をもたらし、
ＡＡ１及びＡＡ２は、アラニン（Ａｌａ）であり、
Ｒ１は、水素又は－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２であり、
ｎは、１～１０の整数である）
を含む、抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲートであって、
抗体が、
ＣＤＲ－Ｈ１ドメイン、ＣＤＲ－Ｈ２ドメイン及びＣＤＲ－Ｈ３ドメインを含む重鎖可変領域、並びに
ＣＤＲ－Ｌ１ドメイン、ＣＤＲ－Ｌ２ドメイン及びＣＤＲ－Ｌ３ドメインを含む軽鎖可変領域
を含む抗ＣＤ１９抗体であり、
ＣＤＲ－Ｈ１が、アミノ酸配列ＧＦＴＦＴＴＹＷＩＮ（配列番号１）を含み、
ＣＤＲ－Ｈ２が、アミノ酸配列ＮＩＹＰＳＤＳＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号２）を含み、
ＣＤＲ－Ｈ３が、アミノ酸配列ＥＤＹＹＧＳＳＳＹＹＡＭＤＹ（配列番号３）を含み、
ＣＤＲ－Ｌ１が、アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＧＴＡＶＡ（配列番号４）を含み、
ＣＤＲ－Ｌ２が、アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号５）を含み、及び
ＣＤＲ－Ｌ３が、アミノ酸配列ＱＱＹＳＴＹＰＬＴ（配列番号６）を含む、抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲート。
【化1】
Ａは、抗体であり、
Ｒは、抗体のシステイン残基を介した抗体の付着点であり、連結されると－Ｓ－基をもたらし、
ＡＡ１及びＡＡ２は、アラニン（Ａｌａ）であり、
Ｒ１は、水素又は－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２であり、
ｎは、１～１０の整数である）
を含む、抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲートであって、
抗体が、
ＣＤＲ－Ｈ１ドメイン、ＣＤＲ－Ｈ２ドメイン及びＣＤＲ－Ｈ３ドメインを含む重鎖可変領域、並びに
ＣＤＲ－Ｌ１ドメイン、ＣＤＲ－Ｌ２ドメイン及びＣＤＲ－Ｌ３ドメインを含む軽鎖可変領域
を含む抗ＣＤ１９抗体であり、
ＣＤＲ－Ｈ１が、アミノ酸配列ＧＦＴＦＴＴＹＷＩＮ（配列番号１）を含み、
ＣＤＲ－Ｈ２が、アミノ酸配列ＮＩＹＰＳＤＳＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号２）を含み、
ＣＤＲ－Ｈ３が、アミノ酸配列ＥＤＹＹＧＳＳＳＹＹＡＭＤＹ（配列番号３）を含み、
ＣＤＲ－Ｌ１が、アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＧＴＡＶＡ（配列番号４）を含み、
ＣＤＲ－Ｌ２が、アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号５）を含み、及び
ＣＤＲ－Ｌ３が、アミノ酸配列ＱＱＹＳＴＹＰＬＴ（配列番号６）を含む、抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲート。
【請求項2】
抗体が、ＩｇＧ抗体である、請求項１に記載の抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲート。
【請求項3】
抗体が、ＩｇＧ１抗体である、請求項２に記載の抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲート。
【請求項4】
抗体が、配列番号７として記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号８として記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲート。
【請求項5】
抗体が、配列番号９又は配列番号１１として記載されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１０として記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１に記載の抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲート。
【請求項6】
抗体が、脱フコシル化されたものである、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲート。
【請求項7】
Ｒ１が、－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２である、請求項３又は４に記載の抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲート。
【請求項8】
Ｒ１が、－Ｈである、請求項３又は４に記載の抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲート。
【請求項9】
脱フコシル化が、ＡＳＮ－３００（ＥＵ：ＡＳＮ－２９７）位におけるものである、請求項６～８のいずれか一項に記載の抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲート。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか一項に記載の抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲートの集団、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項11】
抗体が、約７０％以上、８０％以上、９０％以上又は約９９％又は約１００％脱フコシル化されたものである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項12】
Ｂ細胞悪性腫瘍を治療する方法であって、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲートを、それを必要とする患者に投与するステップを含む、方法。
【請求項13】
ＣＤＲ－Ｈ１ドメイン、ＣＤＲ－Ｈ２ドメイン及びＣＤＲ－Ｈ３ドメインを含む重鎖可変領域、並びにＣＤＲ－Ｌ１ドメイン、ＣＤＲ－Ｌ２ドメイン及びＣＤＲ－Ｌ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１９抗体であって、
ＣＤＲ－Ｈ１が、アミノ酸配列ＧＦＴＦＴＴＹＷＩＮ（配列番号１）を含み、
ＣＤＲ－Ｈ２が、アミノ酸配列ＮＩＹＰＳＤＳＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号２）を含み、
ＣＤＲ－Ｈ３が、アミノ酸配列ＥＤＹＹＧＳＳＳＹＹＡＭＤＹ（配列番号３）を含み、
ＣＤＲ－Ｌ１が、アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＧＴＡＶＡ（配列番号４）を含み、
ＣＤＲ－Ｌ２が、アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号５）を含み、及び
ＣＤＲ－Ｌ３が、アミノ酸配列ＱＱＹＳＴＹＰＬＴ（配列番号６）を含む、抗ＣＤ１９抗体。
ＣＤＲ－Ｈ１が、アミノ酸配列ＧＦＴＦＴＴＹＷＩＮ（配列番号１）を含み、
ＣＤＲ－Ｈ２が、アミノ酸配列ＮＩＹＰＳＤＳＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号２）を含み、
ＣＤＲ－Ｈ３が、アミノ酸配列ＥＤＹＹＧＳＳＳＹＹＡＭＤＹ（配列番号３）を含み、
ＣＤＲ－Ｌ１が、アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＧＴＡＶＡ（配列番号４）を含み、
ＣＤＲ－Ｌ２が、アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号５）を含み、及び
ＣＤＲ－Ｌ３が、アミノ酸配列ＱＱＹＳＴＹＰＬＴ（配列番号６）を含む、抗ＣＤ１９抗体。
【請求項14】
配列番号７として記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号８として記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１３に記載の抗ＣＤ１９抗体。
【請求項15】
配列番号９又は配列番号１１として記載されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１０として記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１３に記載の抗ＣＤ１９抗体。
【請求項16】
脱フコシル化されたものである、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ１９抗体。
【請求項17】
脱フコシル化が、ＡＳＮ－３００（ＥＵ：ＡＳＮ－２９７）位におけるものである、請求項１６に記載の抗ＣＤ１９抗体。
【請求項18】
以下の構造：
（式中、
Ａは、抗体であり、
Ｒは、抗体のシステイン残基を介した抗体の付着点であり、連結されると－Ｓ－基をもたらし、
ＡＡ１及びＡＡ２は、アラニン（Ａｌａ）であり、
Ｒ１は、－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２であり、ｎは、２～８の整数である）
を含む抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲートであって、
抗体が、それぞれが配列番号９又は配列番号１１として記載されるアミノ酸配列からなる２本の重鎖、及びそれぞれが配列番号１０として記載されるアミノ酸配列からなる２本の軽鎖を含む抗ＣＤ１９抗体であり、
抗体が、ＡＳＮ－３００（ＥＵ：ＡＳＮ－２９７）位において脱フコシル化されたものである、
抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲート。
【化2】
Ａは、抗体であり、
Ｒは、抗体のシステイン残基を介した抗体の付着点であり、連結されると－Ｓ－基をもたらし、
ＡＡ１及びＡＡ２は、アラニン（Ａｌａ）であり、
Ｒ１は、－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２であり、ｎは、２～８の整数である）
を含む抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲートであって、
抗体が、それぞれが配列番号９又は配列番号１１として記載されるアミノ酸配列からなる２本の重鎖、及びそれぞれが配列番号１０として記載されるアミノ酸配列からなる２本の軽鎖を含む抗ＣＤ１９抗体であり、
抗体が、ＡＳＮ－３００（ＥＵ：ＡＳＮ－２９７）位において脱フコシル化されたものである、
抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲート。
【請求項19】
ｎが、２、４、６又は８である、請求項１８に記載の抗ＣＤ１９抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
１．関連出願の相互参照
本出願は、それらの開示全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれている、２０２２年６月１６日に出願した米国仮特許出願第６３／３６６，５２０号及び２０２３年３月３日に出願した米国仮特許出願第６３／４８８，３０２号の利益及び優先権を主張するものである。
本出願は、それらの開示全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれている、２０２２年６月１６日に出願した米国仮特許出願第６３／３６６，５２０号及び２０２３年３月３日に出願した米国仮特許出願第６３／４８８，３０２号の利益及び優先権を主張するものである。
【0002】
２．配列表
本出願は、．ｘｍｌフォーマットで電子的に提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、配列表を含有する。前記．ｘｍｌコピーは、２０２３年３月３日に作成されたものであり、名称は３５０７９４．４６７１０であり、サイズは２０，９０３バイトである。
本出願は、．ｘｍｌフォーマットで電子的に提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、配列表を含有する。前記．ｘｍｌコピーは、２０２３年３月３日に作成されたものであり、名称は３５０７９４．４６７１０であり、サイズは２０，９０３バイトである。
【0003】
３．技術分野
本出願は、とりわけ、新規の抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）及びそれを作出する方法に関する。
本出願は、とりわけ、新規の抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）及びそれを作出する方法に関する。
【背景技術】
【0004】
４．背景
ＣＤ１９は、Ｂ細胞マーカーであり、ＰＩ３Ｋなどの下流のタンパク質を活性化し、それにより、増殖性表現型をもたらす、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）複合体のコアクチベーターである。この機構に起因して、ＣＤ１９は必須のＢ細胞抗原であり、ＣＲＩＳＰＲ又はＲＮＡｉによってＣＤ１９発現を失わせると、正常なＢ細胞及びＢ細胞がん株が生存不可能になる。ＣＤ１９は、Ｂ細胞悪性腫瘍（例えば、ＤＬＢＣＬ、ＦＬ、ＣＬＬ）にわたって高発現を有する、臨床的に検証された標的である。
ＣＤ１９は、Ｂ細胞マーカーであり、ＰＩ３Ｋなどの下流のタンパク質を活性化し、それにより、増殖性表現型をもたらす、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）複合体のコアクチベーターである。この機構に起因して、ＣＤ１９は必須のＢ細胞抗原であり、ＣＲＩＳＰＲ又はＲＮＡｉによってＣＤ１９発現を失わせると、正常なＢ細胞及びＢ細胞がん株が生存不可能になる。ＣＤ１９は、Ｂ細胞悪性腫瘍（例えば、ＤＬＢＣＬ、ＦＬ、ＣＬＬ）にわたって高発現を有する、臨床的に検証された標的である。
【0005】
全身性グルココルチコイドがＢ細胞悪性腫瘍の治療に使用されている。これらの全身性ステロイドは、高用量において頑強な単独療法活性を有するが、慢性ステロイド関連毒性が生じる恐れがあり、投薬及び有効性の潜在性が限定されている。グルココルチコイドは、細胞内グルココルチコイド受容体（ＧＲ）に結合し、次いでそれが核に輸送され、そこでグルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）に結合し、転写活性化を駆動することによって機能する。ステロイドに誘導される転写変化は、アポトーシス促進性タンパク質（例えば、ＢＩＭ、ＢＡＸ）のアップレギュレーション、抗アポトーシス性タンパク質（例えば、ＢＣＬ２）の減少及び最終的にアポトーシス性がん細胞死をもたらすＮＦκＢ増殖シグナルの阻害を含む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
したがって、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を治療するためにグルココルチコイドモジュレーターを送達する作用剤が当技術分野において必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【0007】
（発明の要旨）
５．要約
本発明は、グルココルチコイド受容体モジュレーター（ＧＲＭ）アゴニストペイロードと連結した抗ＣＤ１９抗体を介してＢ細胞を標的とする抗体薬物コンジュゲートを提供し、また、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を治療するための新規の手法を提供する。本明細書に記載の抗ＣＤ１９ ＧＲＭアゴニストＡＤＣは、明確に異なる作用機構：（１）効力の高いグルココルチコイド受容体モジュレーター（ＧＲＭ）アゴニストペイロードの標的化送達、（２）ＣＤ１９シグナル伝達の阻害並びに（３）ＣＤ１９抗体脱フコシル化による抗体依存性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）（ＡＤＣＣ）及び抗体依存性細胞ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）などのＦｃエフェクター機能を有するように工学的に操作されたものである。従来の細胞傷害性ＡＤＣとは異なり、ＧＲＭペイロードは、細胞内グルココルチコイド受容体（ＧＲ）に結合し、次いでそれが核に輸送され、アポトーシス性調節因子のモジュレーションを含めた持続的なグルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）関連転写事象を駆動し、それにより、ペイロードにより駆動されるアポトーシス細胞死をもたらすアゴニストである。ＡＤＣＣは、Ｂ細胞悪性腫瘍における高度に有効な機構である。ある実施形態では、ＡＤＣの抗ＣＤ１９抗体は、ＧＲＭアゴニストペイロードとのコンジュゲーション後にＡＤＣＣ活性の増大が維持されるように工学的に操作される。分子をこのように工学的に操作することにより、抗ＣＤ１９ ＧＲＭアゴニストＡＤＣが、頑強な単一作用剤活性を有し、種々のＢ細胞悪性腫瘍に対する著しい臨床的有用性をもたらすように設計された多様式の抗体薬物コンジュゲートになる。
５．要約
本発明は、グルココルチコイド受容体モジュレーター（ＧＲＭ）アゴニストペイロードと連結した抗ＣＤ１９抗体を介してＢ細胞を標的とする抗体薬物コンジュゲートを提供し、また、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を治療するための新規の手法を提供する。本明細書に記載の抗ＣＤ１９ ＧＲＭアゴニストＡＤＣは、明確に異なる作用機構：（１）効力の高いグルココルチコイド受容体モジュレーター（ＧＲＭ）アゴニストペイロードの標的化送達、（２）ＣＤ１９シグナル伝達の阻害並びに（３）ＣＤ１９抗体脱フコシル化による抗体依存性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）（ＡＤＣＣ）及び抗体依存性細胞ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）などのＦｃエフェクター機能を有するように工学的に操作されたものである。従来の細胞傷害性ＡＤＣとは異なり、ＧＲＭペイロードは、細胞内グルココルチコイド受容体（ＧＲ）に結合し、次いでそれが核に輸送され、アポトーシス性調節因子のモジュレーションを含めた持続的なグルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）関連転写事象を駆動し、それにより、ペイロードにより駆動されるアポトーシス細胞死をもたらすアゴニストである。ＡＤＣＣは、Ｂ細胞悪性腫瘍における高度に有効な機構である。ある実施形態では、ＡＤＣの抗ＣＤ１９抗体は、ＧＲＭアゴニストペイロードとのコンジュゲーション後にＡＤＣＣ活性の増大が維持されるように工学的に操作される。分子をこのように工学的に操作することにより、抗ＣＤ１９ ＧＲＭアゴニストＡＤＣが、頑強な単一作用剤活性を有し、種々のＢ細胞悪性腫瘍に対する著しい臨床的有用性をもたらすように設計された多様式の抗体薬物コンジュゲートになる。
【0008】
ある特定の態様では、本発明は、以下の構造：
【0009】
【化1】
Ａは、抗体であり、
Ｒは、抗体のシステイン残基を介した抗体の付着点であり、連結されると－Ｓ－基をもたらし、
ＡＡ１及びＡＡ２は、アラニン（Ａｌａ）であり、
Ｒ１は、水素又は－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２であり、
ｎは、１～１０の整数である）
を含む抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲートであって、
抗体が、
ＣＤＲ－Ｈ１ドメイン、ＣＤＲ－Ｈ２ドメイン及びＣＤＲ－Ｈ３ドメインを含む重鎖可変領域、並びに
ＣＤＲ－Ｌ１ドメイン、ＣＤＲ－Ｌ２ドメイン及びＣＤＲ－Ｌ３ドメインを含む軽鎖可変領域
を含む抗ＣＤ１９抗体であり、
ＣＤＲ－Ｈ１が、アミノ酸配列ＧＦＴＦＴＴＹＷＩＮ（配列番号１）を含み、
ＣＤＲ－Ｈ２が、アミノ酸配列ＮＩＹＰＳＤＳＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号２）を含み、
ＣＤＲ－Ｈ３が、アミノ酸配列ＥＤＹＹＧＳＳＳＹＹＡＭＤＹ（配列番号３）を含み、 ＣＤＲ－Ｌ１が、アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＧＴＡＶＡ（配列番号４）を含み、
ＣＤＲ－Ｌ２が、アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号５）を含み、及び
ＣＤＲ－Ｌ３が、アミノ酸配列ＱＱＹＳＴＹＰＬＴ（配列番号６）を含む、抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲートを提供する。
【0010】
６．図面の簡単な説明
本特許又は出願のファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含有する。カラーの図面を伴う本特許又は特許出願公開のコピーは、要請し、必要な料金を支払えば、特許庁により提供される。
本特許又は出願のファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含有する。カラーの図面を伴う本特許又は特許出願公開のコピーは、要請し、必要な料金を支払えば、特許庁により提供される。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】ＧＲＭペイロードの、承認済みの低分子ステロイド（デキサメタゾン及びプレドニゾロン）と比較したインビトロ細胞傷害性アッセイを示す図である。５日間化合物で処理した後の、ビヒクル対照と比べたＲＳ４；１１の％細胞生存率が示されている。各化合物のＥＣ５０が表に要約されている。
【図2】ＣＤ１９ ｍＡｂがＣＤ１９のリソソームへの内部移行を誘導することを示す写真である。ＲＳ４；１１における、ＣＤ１９ ｍＡｂによる処理後のＣＤ１９受容体のリソソーム区画への局在を示す免疫蛍光染色である。ＬＡＭＰ－１がリソソーム区画のマーカーとして使用される。
【図3】ＡＤＣ－１がグルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）ルシフェラーゼレポーターの転写活性化を誘導することを示すグラフである。ヒトＣＤ１９を発現するＫ５６２細胞をＡＤＣ－１で７２時間処理した。％最大ＧＲＥ活性化は、各濃度におけるＧＲＥ発光シグナルを３３３ｎＭにおけるＧＲＥ発光シグナルで割ることによって算出される。
【図4A】インビトロにおいてＣＤ１９ ｍＡｂがＤＬＢＣＬ細胞増殖及びＡＫＴ活性化を阻害することを示す図である。アイソタイプ又はＣＤ１９ ｍＡｂを用いた５日間の処理後の、ビヒクル対照と比べたＳＵ－ＤＨＬ－６の％生存率。
【図4B】インビトロにおいてＣＤ１９ ｍＡｂがＤＬＢＣＬ細胞増殖及びＡＫＴ活性化を阻害することを示す図である。ＳＵ－ＤＨＬ－６細胞をアイソタイプ又はＣＤ１９ ｍＡｂで１時間処理し、次いで、１μｇ／ｍｌの抗ＩｇＭを用いて示されている時間にわたって刺激した後、細胞溶解を行った。ＡＫＴのＳ４７３のリン酸化を免疫ブロッティングによって検出し、ＧＡＰＤＨをローディング対照として使用する。
【図5A】ＣＤ１９ ｍＡｂ及びＡＤＣ－１が、ＦｃγＲＩＩＩａ Ｖ１５８及びＦ１５８アロタイプを発現するＪｕｒｋａｔレポーター細胞におけるＮＦＡＴ活性化を誘導することを示すグラフである。Ａ及びＢ、Ｒａｊｉ細胞を、用量設定した抗体又はＡＤＣで処理し、Ｖ１５８（Ａ）及びＦ１５８（Ｂ）ＦｃγＲＩＩＩａバリアントを発現するＪｕｒｋａｔ細胞と共インキュベートした。４時間（Ａ）又は１６時間（Ｂ）インキュベートした後の発光シグナルが示されている。
【図5B】ＣＤ１９ ｍＡｂ及びＡＤＣ－１が、ＦｃγＲＩＩＩａ Ｖ１５８及びＦ１５８アロタイプを発現するＪｕｒｋａｔレポーター細胞におけるＮＦＡＴ活性化を誘導することを示すグラフである。Ａ及びＢ、Ｒａｊｉ細胞を、用量設定した抗体又はＡＤＣで処理し、Ｖ１５８（Ａ）及びＦ１５８（Ｂ）ＦｃγＲＩＩＩａバリアントを発現するＪｕｒｋａｔ細胞と共インキュベートした。４時間（Ａ）又は１６時間（Ｂ）インキュベートした後の発光シグナルが示されている。
【図6A】ＣＤ１９ ｍＡｂ及びＡＤＣ－１がｅｘ ｖｉｖｏにおけるＰＭＢＣ共培養ＡＤＣＣアッセイにおいてＢ細胞悪性腫瘍細胞株に対するＡＤＣＣを誘導することを示すグラフである。Ａ～Ｃ、ＲＳ４；１１（Ａ）、Ｒａｊｉ（Ｂ）及びＫＡＲＰＡＳ４２２（Ｃ）を用量設定した抗体又はＡＤＣと一緒にインキュベートし、初代ＰＢＭＣとエフェクター標的比（Ｅ：Ｔ）２０：１で４時間、共インキュベートする。細胞の％特異的溶解を無処理の試料に対して算出した。
【図6B】ＣＤ１９ ｍＡｂ及びＡＤＣ－１がｅｘ ｖｉｖｏにおけるＰＭＢＣ共培養ＡＤＣＣアッセイにおいてＢ細胞悪性腫瘍細胞株に対するＡＤＣＣを誘導することを示すグラフである。Ａ～Ｃ、ＲＳ４；１１（Ａ）、Ｒａｊｉ（Ｂ）及びＫＡＲＰＡＳ４２２（Ｃ）を用量設定した抗体又はＡＤＣと一緒にインキュベートし、初代ＰＢＭＣとエフェクター標的比（Ｅ：Ｔ）２０：１で４時間、共インキュベートする。細胞の％特異的溶解を無処理の試料に対して算出した。
【図6C】ＣＤ１９ ｍＡｂ及びＡＤＣ－１がｅｘ ｖｉｖｏにおけるＰＭＢＣ共培養ＡＤＣＣアッセイにおいてＢ細胞悪性腫瘍細胞株に対するＡＤＣＣを誘導することを示すグラフである。Ａ～Ｃ、ＲＳ４；１１（Ａ）、Ｒａｊｉ（Ｂ）及びＫＡＲＰＡＳ４２２（Ｃ）を用量設定した抗体又はＡＤＣと一緒にインキュベートし、初代ＰＢＭＣとエフェクター標的比（Ｅ：Ｔ）２０：１で４時間、共インキュベートする。細胞の％特異的溶解を無処理の試料に対して算出した。
【図7A】ＡＤＣ－１が、単球由来マクロファージとの共培養下のＢ細胞悪性腫瘍細胞株の抗体依存性細胞ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）を誘導することを示すグラフである。Ａ及びＢ、ＣＦＳＥ標識されたＮｕＤＨＬ１細胞（Ａ）及びＲａｊｉ細胞（Ｂ）を２００ｎＭの示されている作用剤で処理し、単球由来マクロファージと３時間共培養した。ＣＤ６８＋を成熟マクロファージのマーカーとして使用し、ファゴサイトーシス指数は、総成熟マクロファージ（ＣＤ６８＋）ゲートのうちの貪食された標的細胞（ＣＦＳＥ＋ＣＤ６８＋）のパーセンテージを表す。
【図7B】ＡＤＣ－１が、単球由来マクロファージとの共培養下のＢ細胞悪性腫瘍細胞株の抗体依存性細胞ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）を誘導することを示すグラフである。Ａ及びＢ、ＣＦＳＥ標識されたＮｕＤＨＬ１細胞（Ａ）及びＲａｊｉ細胞（Ｂ）を２００ｎＭの示されている作用剤で処理し、単球由来マクロファージと３時間共培養した。ＣＤ６８＋を成熟マクロファージのマーカーとして使用し、ファゴサイトーシス指数は、総成熟マクロファージ（ＣＤ６８＋）ゲートのうちの貪食された標的細胞（ＣＦＳＥ＋ＣＤ６８＋）のパーセンテージを表す。
【図8AB】様々な用量のＡＤＣ－１による、免疫無防備状態のマウスにおける異種移植されたびまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＯＣＩ－ＬＹ１９及びＳＵ－ＤＨＬ－６）の成長阻害を示すグラフである。Ａ及びＢ、ＡＤＣ－１の腹腔内（ＩＰ）投与による、ＣＢ１７／ＳＣＩＤマウス（Ａ）及びＳＵ－ＤＨＬ－６（Ｂ）細胞において成長させた異種移植されたＯＣＩ－ＬＹ１９腫瘍の成長阻害。ランダム化及び投薬後、皮下腫瘍の体積を時間に応じてプロットした。皮下腫瘍（平均腫瘍体積１１７～２０５ｍｍ３）を有するマウスにおける、ＳＣＩＤ－ｂｅｉｇｅマウスにおいて成長させたＯＣＩ－ＬＹ１９腫瘍（Ａ）及びＳＵ－ＤＨＬ－６腫瘍（Ｂ）の、ＡＤＣ－１、アイソタイプ－ＧＲＭ、ｈｕＣＤ１９抗体、アイソタイプ抗体を種々の用量レベル（用量１～５、用量２は用量１の用量の３倍であり、用量３は用量１の用量の１０倍であり、用量４は用量１の用量の３０倍であり、用量５は用量１の用量の５０倍である）で単回投薬（ＱＤ×１）として投与することによる成長阻害について試験した。ＧＲＭ－ＳＭは複数回の１日用量（ＱＤ×５）３として投与した。曲線上の各点は、７つ（ＳＵ－ＤＨＬ－６）又は８つ（ＯＣＩ－ＬＹ１９）の腫瘍の平均値を表す。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。
【図9】様々な用量のＡＤＣ－１による、異種移植された急性リンパ芽球性白血病（ＲＳ４；１１）の成長阻害を示すグラフである。ＡＤＣ－１の投与による、異種移植されたＲＳ４；１１腫瘍（免疫無防備状態のＣＢ１７／ＳＣＩＤマウス）の成長阻害。ランダム化及び投薬後、皮下腫瘍の体積を時間に応じてプロットした。皮下腫瘍（平均腫瘍体積１１８ｍｍ３）を有するマウスにおける、異種移植されたＲＳ４；１１細胞の、ＡＤＣ－１、アイソタイプ－ＧＲＭを、様々な用量（用量１及び用量２、用量２は用量１の用量の２倍である）で単回投薬（ＱＤ×１）として投与することによる成長阻害を試験した。曲線上の各点は、５つの腫瘍の平均値を表す。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。
【図10A】ヒト化免疫適格ｈｕＣＤ３４＋ＮＳＧ ｈｕＩＬ－１５マウスにおける、様々な用量のＡＤＣ－１による異種移植されたびまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫細胞（ＯＣＩ－ＬＹ１９）の成長阻害を示すグラフである。Ａ、アイソタイプｍＡｂ、ＣＤ１９ ｍＡｂ及びＡＤＣ－１のＩＰ投与による、異種移植されたＯＣＩ－ＬＹ１９腫瘍の成長阻害。ＡＤＣ－１を種々の用量レベル（用量１～３、用量２は用量１の用量の３倍であり、用量３は用量１の用量の１０倍である）で単回投薬（ＱＤ×１）として投与した。曲線上の各点は、４つ又は５つの腫瘍の平均値を表す。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。Ｂ、示されている時点で得た尾静脈採血からのヒトＢ細胞及びヒトＮＫ細胞のフローサイトメトリーデータ。曲線上の各点は、４匹又は５匹の動物の平均値を表す。エラーバーは、平均値の標準偏差を示す。
【図10B】ヒト化免疫適格ｈｕＣＤ３４＋ＮＳＧ ｈｕＩＬ－１５マウスにおける、様々な用量のＡＤＣ－１による異種移植されたびまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫細胞（ＯＣＩ－ＬＹ１９）の成長阻害を示すグラフである。Ａ、アイソタイプｍＡｂ、ＣＤ１９ ｍＡｂ及びＡＤＣ－１のＩＰ投与による、異種移植されたＯＣＩ－ＬＹ１９腫瘍の成長阻害。ＡＤＣ－１を種々の用量レベル（用量１～３、用量２は用量１の用量の３倍であり、用量３は用量１の用量の１０倍である）で単回投薬（ＱＤ×１）として投与した。曲線上の各点は、４つ又は５つの腫瘍の平均値を表す。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。Ｂ、示されている時点で得た尾静脈採血からのヒトＢ細胞及びヒトＮＫ細胞のフローサイトメトリーデータ。曲線上の各点は、４匹又は５匹の動物の平均値を表す。エラーバーは、平均値の標準偏差を示す。
【図11】ＡＤＣ－１が、高用量のＣＤ１９ ｍＡｂ、プレドニゾロン単独及びＣＤ１９ ｍＡｂとプレドニゾロンの組合せと比較して優れた抗腫瘍活性を誘導することを示すグラフである。示されている処置の投与による、ＣＢ１７／ＳＣＩＤマウスにおける異種移植されたＲＳ４；１１腫瘍の成長阻害。ランダム化及び投薬後、皮下腫瘍の体積を時間に応じてプロットした。本試験ではフコシル化ｍＡｂ及びＡＤＣ－１を使用した。種々の用量レベルを使用した（用量１～３、用量２は用量１の用量の１０倍であり、用量３は用量１の用量の３３＋１／３倍である）。曲線上の各点は、５つの腫瘍の平均値を表す。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。
【図12A】ＡＤＣ－１が、プレドニゾロン又はアイソタイプＧＲＭ対照と比較して、Ｂ細胞悪性腫瘍の複数の異種移植モデルにおいてインビボで抗腫瘍活性を示すことを示すグラフである。Ａ～Ｃ、ＤＢ（Ａ）、ＳＵＰＢ１５（Ｂ）及びＲＳ４；１１（Ｃ）異種移植モデルを示されている作用剤で処置した。様々な用量を使用した（用量１～５、用量２は用量１の用量の３＋１／３倍であり、用量３は用量１の用量の６＋２／３倍であり、用量４は用量１の用量の１０倍であり、用量５は、用量１の用量の３３＋１／３倍である）。各異種移植腫瘍モデルについてのマウス系統及びＣＤ１９のインビトロ細胞表面コピー数が示されている通り列挙されている。
【図12BC】ＡＤＣ－１が、プレドニゾロン又はアイソタイプＧＲＭ対照と比較して、Ｂ細胞悪性腫瘍の複数の異種移植モデルにおいてインビボで抗腫瘍活性を示すことを示すグラフである。Ａ～Ｃ、ＤＢ（Ａ）、ＳＵＰＢ１５（Ｂ）及びＲＳ４；１１（Ｃ）異種移植モデルを示されている作用剤で処置した。様々な用量を使用した（用量１～５、用量２は用量１用量の３＋１／３であり、用量３は用量１の用量の６＋２／３倍であり、用量４は用量１の用量の１０倍であり、用量５は、用量１の用量の３３＋１／３倍である）。各異種移植腫瘍モデルについてのマウス系統及びＣＤ１９のインビトロ細胞表面コピー数が示されている通り列挙されている。
【図13A】１０例のＤＬＢＣＬ患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデルにおいて観察された抗腫瘍有効性。胚中心Ｂ細胞様（ＧＣＢ）及び非ＧＣＢ ＤＬＢＣＬ患者由来のＰＤＸモデルをＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスに埋め込み、腫瘍が約２００ｍｍ３に達したところでランダム化した。マウスをＡＤＣ－１（用量３、Ｉ．Ｐ）の単回投薬で処置し、対照で処置したＰＤＸと比べて腫瘍成長をモニタリングした。デルタ％ＴＧＩ最大＝１－（Ｘ日目の処置群の腫瘍体積－ランダム化時点での処置群の腫瘍体積）／（Ｘ日目の対照の腫瘍体積－ランダム化時点での対照の腫瘍体積）］＊１００として示される腫瘍成長阻害。処置群と対照群の差異が最大になった時に決定した。腫瘍退縮（応答者）：＞１０５％デルタＴＧＩ最大－応答あり／なし。
【図13B】１０例のＤＬＢＣＬ患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデルにおいて観察された抗腫瘍有効性。胚中心Ｂ細胞様（ＧＣＢ）及び非ＧＣＢ ＤＬＢＣＬ患者由来のＰＤＸモデルをＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスに埋め込み、腫瘍が約２００ｍｍ３に達したところでランダム化した。マウスをＡＤＣ－１（用量３、Ｉ．Ｐ）の単回投薬で処置し、対照で処置したＰＤＸと比べて腫瘍成長をモニタリングした。［（時点での腫瘍体積／ランダム化時点での腫瘍体積）－１］×１００によって算出される、ビヒクル対照腫瘍が１０００ｍｍ３に達した時点での腫瘍体積の変化（％）。
【図14A】Ｒ－ＣＨＯＰ再発ＰＤＸモデルにおいて観察された抗腫瘍有効性を示すグラフである。Ｒ－ＣＨＯＰ再発患者（４サイクルの処置を受けた）に由来するＤＬＢＣＬ患者由来のＰＤＸモデルをＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスに埋め込み、腫瘍が約２００ｍｍ３に達したところでランダム化した。マウスを、ＡＤＣ－１又はＣＤ１９抗体を用量３（Ｉ．Ｐ）で用い、単回投薬で処置し、対照で処置したＰＤＸと比べて腫瘍成長をモニタリングした。ＧＣＢ ＤＬＢＣＬを有し、Ｒ－ＣＨＯＰ治療で再発（４サイクル）し、イブルチニブでわずかな均衡状態の３８歳男性に由来するＰＤＸモデルＬＹ－２４－０２０７。
【図14B】Ｒ－ＣＨＯＰ再発ＰＤＸモデルにおいて観察された抗腫瘍有効性を示すグラフである。Ｒ－ＣＨＯＰ再発患者（４サイクルの処置を受けた）に由来するＤＬＢＣＬ患者由来のＰＤＸモデルをＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスに埋め込み、腫瘍が約２００ｍｍ３に達したところでランダム化した。マウスを、ＡＤＣ－１又はＣＤ１９抗体を用量３（Ｉ．Ｐ）で用い、単回投薬で処置し、対照で処置したＰＤＸと比べて腫瘍成長をモニタリングした。活性化Ｂ細胞（ＡＢＣ）ＤＬＢＣＬ、Ｒ－ＣＨＯＰ治療で再発（４サイクル）、イブルチニブに対して抵抗性の５９歳男性に由来するＰＤＸモデルＬＹ－２４－００１６。
【図15】ＧＲＭ及びＡＤＣ－１がＤＬＢＣＬ細胞株におけるアポトーシスを誘導することを示す図である。Ｆａｒａｇｅ細胞、ＳＵ－ＤＨＬ－６細胞、ＯＣＩ－ＬＹ１９細胞をＧＲＭ又はＡＤＣ－１で示されている時間にわたって処理した後、細胞溶解を行った。溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、アポトーシス促進性調節因子ＢＩＭ及びアポトーシス誘導のマーカー（切断型カスパーゼ－３、切断型ＰＡＲＰ）に対する抗体を用いて免疫ブロッティングを行った。矢印は、アポトーシス性切断産物を示す。ＧＡＰＤＨをローディング対照として使用した。
【図16】ＡＤＣ－１が、ＬＣ－ＭＳトータルイオン（Ａ２８０）クロマトグラムを低減させることを示すグラフである。ＬＣ＝軽鎖、ＬＣ＋２＝軽鎖＋２つの遊離のチオール、ＤＬ（Ｘ）＝薬物リンカー（付着数）、ＨＣ Ｇ０＝Ｇ０グリカンを有する重鎖。
【発明を実施するための形態】
【0012】
７．詳細な説明
本開示は、抗ＣＤ１９抗体と連結したグルココルチコイド受容体モジュレーターアゴニストを含む抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を提供する。
７．１．ＣＤ１９抗体
ＣＤ１９は、ＤＬＣＢ、ＦＬ、ＣＬＬ及びＡＬＬを含む大多数のＢ細胞悪性腫瘍における発現レベルが高いので、Ｂ細胞起源のがんに対する魅力的な免疫療法標的である。Ｂ細胞及びＣＤ１９陽性がん細胞の表面に発現されるＣＤ１９に特異的に結合し、それによりＣＤ１９シグナル伝達を阻害するヒト化抗ＣＤ１９抗体を開発した。ある実施形態では、抗体は、２つの重鎖可変領域及び２つの軽鎖可変領域で構成される。各可変領域に３つのＣＤＲが存在し、それにより抗体がＣＤ１９に結合することが可能になる。可変鎖の両方に、合計で６つの異なるＣＤＲが存在する。さらに、抗体は、免疫グロブリンクラスＧ１（ＩｇＧ１）のヒトＦｃを含むヒト重鎖定常領域を含有する。本明細書に記載の抗ＣＤ１９抗体は、フコシル化されたもの又は脱フコシル化されたものであり得、インビトロ機能性、免疫安全性及び薬物様特性を示す。
本開示は、抗ＣＤ１９抗体と連結したグルココルチコイド受容体モジュレーターアゴニストを含む抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を提供する。
７．１．ＣＤ１９抗体
ＣＤ１９は、ＤＬＣＢ、ＦＬ、ＣＬＬ及びＡＬＬを含む大多数のＢ細胞悪性腫瘍における発現レベルが高いので、Ｂ細胞起源のがんに対する魅力的な免疫療法標的である。Ｂ細胞及びＣＤ１９陽性がん細胞の表面に発現されるＣＤ１９に特異的に結合し、それによりＣＤ１９シグナル伝達を阻害するヒト化抗ＣＤ１９抗体を開発した。ある実施形態では、抗体は、２つの重鎖可変領域及び２つの軽鎖可変領域で構成される。各可変領域に３つのＣＤＲが存在し、それにより抗体がＣＤ１９に結合することが可能になる。可変鎖の両方に、合計で６つの異なるＣＤＲが存在する。さらに、抗体は、免疫グロブリンクラスＧ１（ＩｇＧ１）のヒトＦｃを含むヒト重鎖定常領域を含有する。本明細書に記載の抗ＣＤ１９抗体は、フコシル化されたもの又は脱フコシル化されたものであり得、インビトロ機能性、免疫安全性及び薬物様特性を示す。
【0013】
ある特定の実施形態では、本発明の脱フコシル化抗体は、免疫細胞上に発現されるある特定のＦｃγＲ受容体に対してより高い親和性を有する。例として、脱フコシル化ＩｇＧ１抗体は、その抗体のフコシル化形態と比較して、ＮＫ細胞上に発現されるＦｃγＲＩＩＩＡに対する結合性が増大し、その結果、精製されたナチュラルキラー細胞又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）ＡＤＣＣアッセイにおける活性が増強される。抗ＣＤ１９抗体のＡＤＣＣ活性は、当技術分野で公知のＡＤＣＣバイオアッセイ技法を使用して実証され得る。例えば、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ Ｖ１５８又はＦ１５８対立遺伝子バリアントレポーター株に対するＡＤＣＣレポーターバイオアッセイを使用することができる（実施例３を参照されたい）。
【0014】
種々の実施形態では、抗体は、抗体の定常領域の全部又は一部を含む。一部の実施形態では、定常領域は、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１又はＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）及びＩｇＭから選択されるアイソタイプである。特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＤ１９抗体は、ＩｇＧ１を含む。本明細書で使用される場合、抗体の「定常領域」は、天然の定常領域、アロタイプ又はバリアントを包含する。
【0015】
抗ＣＤ１９抗体の軽鎖定常領域は、軽鎖カッパ（κ）領域又はラムダ（λ）領域であってよい。軽鎖λ領域は、公知の亜型、例えば、λ１、λ２、λ３又はλ４のうちの任意の１つであってよい。一部の実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、軽鎖カッパ（κ）領域を含む。
【0016】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ハイブリドーマ技術によって産生された抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、任意の真核生物クローンを含めた、単一のクローンに由来するものである。
【0017】
「キメラ」抗体という用語は、本明細書で使用される場合、ラット又はマウス抗体などの非ヒト免疫グロブリンに由来する可変配列及び一般にはヒト免疫グロブリン鋳型から選択されるヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体を指す。
【0018】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、少なくとも１つ、一般には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、そのＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体は、一般にはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分も含み得る。
【0019】
「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を包含し、また、ヒト免疫グロブリンライブラリーから単離された抗体、又は１つ以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックであり、内因性の機能的な免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体を包含する。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用したファージディスプレイ法を含めた当技術分野で公知の種々の方法によって作出され得る。
【0020】
本開示の抗ＣＤ１９抗体は、全長の（インタクトな）抗体分子を包含する。
【0021】
抗ＣＤ１９抗体は、その配列が、少なくとも１つの、定常領域に媒介される生物学的エフェクター機能が変更されるように改変された抗体であり得る。例えば、本明細書に記載の抗ＣＤ１９抗体は、改変されていない抗体と比べて、少なくとも１つの、定常領域に媒介される生物学的エフェクター機能が獲得又は改善されるように、例えば、ＦｃγＲ相互作用が増強されるように（例えば、米国特許出願第２００６／０１３４７０９号、米国特許第８，６４２，２９２Ｂ２号を参照されたい）又はＡＤＣＣを媒介する抗体の能力が増強されるように、改変された抗体を包含する。例えば、本開示の抗ＣＤ１９抗体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡ及び／又はＦｃγＲＩＩＩＢに、対応する改変されていない定常領域よりも大きな親和性で結合する定常領域を有し得る。本開示の抗ＣＤ１９抗体は、改変されたＦｃ領域を有し、増強されたＡＤＣＣ応答を媒介するものであり得、ここで、ＡＤＣＣ応答は、同じ可変領域（すなわち、ＶＨ及びＶＬ）並びに野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域（すなわち、野生型ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を有する抗体を基準として増強されたものである。ヒトＣＤ１９に対する高い親和性を有する抗ＣＤ１９抗体は、治療及び診断への使用に望ましいものであり得る。したがって、本開示は、ヒトＣＤ１９に対する高い結合親和性を有する抗体を意図するものである。特定の実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、ヒトＣＤ１９に約１５ｎＭ、１０ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ又は０．１ｎＭの親和性で結合する。一部の実施形態では、抗体は、ヒトＣＤ１９に約０．１ｎＭ～約１０ｎＭの範囲の親和性で結合する。
【0022】
一部の実施形態では、本発明は、６つの異なる相補性決定領域（ＣＤＲ）２セット、２つの異なる可変領域２セット、完全な重鎖２本及び完全な軽鎖２本を含むモノクローナル抗ＣＤ１９抗体を提供する。
【0023】
一部の実施形態では、抗体は、ヒトＣＤ１９に結合する、組換え、脱フコシル化、ヒト化、ＩｇＧ１カッパモノクローナル抗体である。
【0024】
ある実施形態では、抗体は、以下の配列を含む、６つのＣＤＲを含む：
【0025】
【化2】
【0026】
一部の実施形態では、本開示の抗体は、配列番号１として示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２として示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ２、配列番号３として示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ３、配列番号４として示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５として示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号６として示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ３を含む。
【0027】
一部の実施形態では、本開示の抗体は、配列番号７：
【0028】
【化3】
【0029】
【化4】
【0030】
一部の実施形態では、本開示の抗体は、配列番号９として示されるアミノ酸配列を含む又は配列番号９として示されるアミノ酸配列からなる重鎖（定常領域は標準の文字列であり、可変重ドメインには下線が引かれており、ＣＤＲは、下線が引かれた太字のイタリック体であり（それぞれ、出現順に配列番号１～３と開示される）、Ｎ－結合型グルコシル化部位が下付き文字「ｇ」で示されている）：
【0031】
【化5】
【0032】
【化6】
【0033】
ある実施形態では、本開示の抗体は、配列番号１０による軽鎖及び配列番号１１による重鎖を含む又はそれからなり、これは、Ｃ末端リシンが短縮された配列番号９のアミノ酸配列である：
【0034】
【化7】
【0035】
ある実施形態では、抗体は、配列番号９又は配列番号１１に記載の重鎖アミノ酸配列及び配列番号１０による軽鎖アミノ酸配列を有するＣＤ１９ ｍＡｂである。
【0036】
一実施形態では、本開示の抗体重鎖は、以下のヌクレオチド配列（配列番号１２として開示される全長の配列）によってコードされる。
【0037】
【化8】
【0038】
分泌シグナルペプチドがイタリック体になっており、最終的な終止コドン（ＴＧＡ）を含み、定常領域が太字になっており、ＣＤＲに下線が引かれている。
【0039】
一実施形態では、本開示の抗体の軽鎖は、以下のヌクレオチド配列（配列番号１３として開示される全長の配列）によってコードされる：
【0040】
【化9】
【0041】
分泌シグナルペプチドがイタリック体になっており、最終的な終止コドン（ＴＧＡ）を含み、定常領域が太字になっており、ＣＤＲに下線が引かれている。
【0042】
一部の実施形態では、抗体は、ヒトＣＨ１、ヒトヒンジ、ヒトＣＨ２及びヒトＣＨ３ドメインを含むヒト重鎖定常領域を含む。一部の実施形態では、コードされる重鎖定常領域は、Ｆｃ部分を含み、ここで、Ｆｃ部分は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又はＩｇＭアイソタイプである。ある実施形態では、ＦｃはＩｇＧ１であり、アロタイプはｚ、非ａである。ある実施形態では、軽鎖はカッパ軽鎖である。
【0043】
一部の実施形態では、抗体は、脱フコシル化されたＩｇＧ１ Ｆｃ定常領域を含む。脱フコシル化は、当技術分野で公知の技法によって実施され得る。例えば、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ（２０２０）１９（５）：１１０２－１１０９）及びＰＮＡＳ（２０１３）１１０（１４）５４０４～５４０９を参照されたい。例えば、例えばＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼの欠乏に起因してＧＤＰ－フコース形成に欠陥がある細胞株における抗体の産生；フコシルトランスフェラーゼのレベルが低下している細胞における抗体の産生；ＧＤＰ－フコース輸送体のレベルが低下している細胞における抗体の産生；β－１，４－マンノシル－糖タンパク質４－β－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧｎＴ－ＩＩＩ）を過剰発現する細胞における抗体の産生；又は細菌ＧＤＰ－６－デオキシ－Ｄ－リキソ－４－ヘキスロースレダクターゼ（ＲＭＤ）を発現する細胞における抗体の産生。ある実施形態では、本発明の脱フコシル化抗ＣＤ１９抗体を産生させるために使用される細胞は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＲＭＤを発現するように工学的に操作されたＣＨＯ細胞である。抗体の脱フコシル化の程度は、当技術分野で公知の技法によって決定され得る。一般には、抗体は、７０％以上、８０％以上、９０％以上又は約９９％又は約１００％脱フコシル化されたものである。脱フコシル化の程度は、９０％以上であることが好ましい。一部の実施形態では、抗体は、ＡＳＮ－３００（ＥＵ：ＡＳＮ－２９７）位において７０％以上、８０％以上、９０％以上又は約１００％脱フコシル化されたものである。脱フコシル化は、脱フコシル化の程度が断片化抗体の極性依存性分離によって決定される親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）アッセイ技法によって決定され得る。
【0044】
ある実施形態では、総脱フコシル化グリカン種は、放出されたＮ結合型グリカンを、蛍光検出を用いたＨＩＬＩＣによって分析することによって決定される。グリカンをペプチドＮ－グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ）を使用して放出させ、続いて、蛍光タグで標識する。蛍光標識されたＮ結合型グリカンを、蛍光検出を用いたＨＩＬＩＣによって分析する。パーセント脱フコシル化グリカン種を、クロマトグラムにおける全てのグリカンピークの総ピーク面積に対する全ての脱フコシル化グリカンピークのピーク面積の合計に基づいて決定する。相対的存在量が０．５％以上の全てのピークをパーセント脱フコシル化グリカン種の決定に含める。
【0045】
本開示は、抗ＣＤ１９抗体の免疫グロブリン軽鎖及び重鎖遺伝子をコードするポリヌクレオチド分子、そのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び本開示の抗ＣＤ１９抗体を産生することが可能な宿主細胞を包含する。
【0046】
本開示の抗ＣＤ１９抗体は、宿主細胞における免疫グロブリン軽鎖及び重鎖遺伝子の組換え発現によって調製され得る。抗体を組換えによって発現させるために、宿主細胞に抗体の免疫グロブリン軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡ断片を有する１つ以上の組換え発現ベクターをトランスフェクトし、その結果、軽鎖及び重鎖が宿主細胞において発現され、任意選択的に、宿主細胞が培養されている培地中に分泌され、その培地から抗体を回収することができる。
【0047】
そのような抗ＣＤ１９抗体をコードするポリヌクレオチドを生成するために、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域をコードするＤＮＡ断片をまず得る。これらのＤＮＡは、生殖細胞系列ＤＮＡ又は軽鎖及び重鎖可変配列をコードするｃＤＮＡを、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、増幅及び改変することによって得られ得る。
【0048】
抗ＣＤ１９抗体に関連するＶＨ及びＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られたら、これらのＤＮＡ断片は、例えば、可変領域遺伝子を全長の抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子又はｓｃＦｖ遺伝子に変換するために、標準の組換えＤＮＡ技法によってさらに操作され得る。これらの操作では、ＶＬ又はＶＨをコードするＤＮＡ断片は、抗体定常領域又は柔軟なリンカーなどの別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片に作動可能に連結される。「作動可能に連結」という用語は、これに関連して使用される場合、２つのＤＮＡ断片が、その２つのＤＮＡ断片にコードされるアミノ酸配列がインフレームのままになるように接合していることを意味するものとする。
【0049】
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及び任意選択的にＣＨ４）をコードする別のＤＮＡ分子と作動可能に連結することによって全長の重鎖遺伝子に変換され得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１～３２４２を参照されたい）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準のＰＣＲ増幅によって得られ得る。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域であってよいが、ある特定の実施形態では、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４である。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子に関しては、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子と作動可能に連結され得る。
【0050】
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子と作動可能に連結することによって全長の軽鎖遺伝子（並びにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換され得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で公知であり（例えば、Ｋａｂａｔら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１～３２４２を参照されたい）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準のＰＣＲ増幅によって得られ得る。軽鎖定常領域はカッパ定常領域であってもラムダ定常領域であってもよいが、ある特定の実施形態では、カッパ定常領域である。
【0051】
本開示の抗ＣＤ１９抗体を発現させるために、上記の通り得られた部分的な又は全長の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡが、発現ベクターに、遺伝子が転写及び翻訳制御配列に作動可能に連結されるように挿入される。これに関連して、「作動可能に連結」という用語は、抗体遺伝子が、ベクター内に、ベクター内の転写及び翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節するそれらの意図された機能を果たすようにライゲーションされることを意味するものとする。発現ベクター及び発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選択される。抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子は、別々のベクターに挿入されてもよいが、より一般には、両方の遺伝子が同じ発現ベクターに挿入される。
【0052】
抗体遺伝子は、発現ベクターに標準の方法（例えば、抗体遺伝子断片とベクターの相補的な制限部位のライゲーション又は制限部位が存在しない場合には平滑末端ライゲーション）によって挿入される。発現ベクターは、抗ＣＤ１９抗体に関連する軽鎖又は重鎖配列の挿入前に抗体定常領域配列をすでに有していてよい。例えば、抗ＣＤ１９モノクローナル抗体に関連するＶＨ及びＶＬ配列を全長の抗体遺伝子に変換するための１つの手法は、それらのＶＨ及びＶＬ配列を、それぞれ重鎖定常領域及び軽鎖定常領域をすでにコードする発現ベクターに、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントに作動可能に連結され、ＶＬセグメントがベクター内のＣＬセグメントに作動可能に連結されるように挿入することである。それに加えて又はその代わりに、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を容易にするシグナルペプチドをコードしていてよい。抗体鎖遺伝子は、ベクターに、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端に対してインフレームに連結されるようにクローニングされ得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドであってもよく、異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であってもよい。
【0053】
抗体鎖遺伝子に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を有する。「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー及び抗体鎖遺伝子の転写又は翻訳を制御する他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むものとする。
【0054】
抗体鎖遺伝子及び調節配列に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、追加的な配列、例えば、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば、複製開始点）及び選択マーカー遺伝子を有してよい。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にするものである。軽鎖及び重鎖の発現のために、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターが標準の技法によって宿主細胞にトランスフェクトされる。「トランスフェクション」という用語の様々な形態は、外因性ＤＮＡを真核生物宿主細胞に導入するために一般に使用される多種多様な技法、例えば、電気穿孔、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクションなどを包含するものとする。
【0055】
ある特定の実施形態では、抗体の発現は、適当にフォールディングされており、免疫学的に活性な抗体が最適に分泌される真核細胞、例えば哺乳動物宿主細胞において実施される。本開示の組換え抗体を発現させるための例示的な哺乳動物宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えばＫａｕｆｍａｎ及びＳｈａｒｐ、１９８２、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１～６２１に記載されているＤＨＦＲ選択マーカーと共に使用される、Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ、１９８０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６－４２２０に記載されているＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞が挙げられる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入される場合、抗体は、宿主細胞を、宿主細胞における抗体の発現又は宿主細胞を成長させている培養培地中への抗体の分泌を可能にするために十分な期間にわたって培養することによって産生される。宿主細胞はまた、インタクトな抗体の一部、例えばＦａｂ断片又はｓｃＦｖ分子を産生させるためにも使用され得る。上記の手順の変形形態が本開示の範囲内に入ることが理解される。例えば、宿主細胞に本開示の抗ＣＤ１９抗体の軽鎖又は重鎖のいずれか（両方ではなく）をコードするＤＮＡをトランスフェクトすることが望ましい場合がある。
【0056】
組換えＤＮＡ技術は、ヒトＣＤ１９への結合に必要ではない軽鎖及び重鎖のいずれか又は両方をコードするＤＮＡの一部又は全部を除去するためにも使用され得る。そのような短縮されたＤＮＡ分子から発現される分子も本開示の抗体に包含される。
【0057】
本開示の抗ＣＤ１９抗体の組換え発現のために、宿主細胞に、２つの本開示の発現ベクター、重鎖由来ポリペプチドをコードする第１のベクター及び軽鎖由来ポリペプチドをコードする第２のベクターを同時トランスフェクトすることができる。２つのベクターは、同一の選択マーカーを含有してもよく、それぞれが別々の選択マーカーを含有してもよい。あるいは、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方をコードする単一のベクターが使用され得る。
【0058】
７．２．グルココルチコイド受容体モジュレーターと連結した抗ＣＤ１９抗体
抗ＣＤ１９抗体と連結したグルココルチコイド受容体モジュレーター（ＧＲＭ）アゴニストを含む抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）が本発明で提供される。
抗ＣＤ１９抗体と連結したグルココルチコイド受容体モジュレーター（ＧＲＭ）アゴニストを含む抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）が本発明で提供される。
【0059】
ある特定の実施形態では、（ａ）抗ＣＤ１９抗体；及び（ｂ）式（Ｉ）：
【0060】
【化10】
のグルココルチコイド受容体モジュレーターのラジカル
を含む抗体薬物コンジュゲートであって、
さらに、抗体とグルココルチコイド受容体モジュレーターが、式：
（式中、Ｒは、抗体のシステイン残基を介した抗体とリンカーとの付着点であり、連結されると－Ｓ－基をもたらし、ＡＡ１及びＡＡ２はアラニン（Ａｌａ）であり、ｐ及びｑは１である）
のリンカーによってコンジュゲートしている、
抗体薬物コンジュゲートが提供される。
【0061】
ある特定の実施形態では、式（ＩＩ）：
【0062】
【化11】
の抗体薬物コンジュゲートが提供される。複数の実施形態では、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。複数の実施形態では、ｎは、２、３、４、５、６、７又は８である。別の実施形態では、ｎは、１、２、３、４又は５である。別の実施形態では、ｎは、２、３、４又は５である。ある実施形態では、ｎは、２、４、６又は８である。別の実施形態では、ｎは、２、４又は６である。別の実施形態では、ｎは、１である。別の実施形態では、ｎは、２である。別の実施形態では、ｎは、３である。別の実施形態では、ｎは、４である。別の実施形態では、ｎは、５である。別の実施形態では、ｎは、６である。別の実施形態では、ｎは、７である。別の実施形態では、ｎは、８である。
【0063】
ある特定の実施形態では、ＡＤＣの抗ＣＤ１９抗体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６として記載される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号７として記載される重鎖可変領域及び配列番号８として記載される軽鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号９又は配列番号１１として記載される重鎖及び配列番号１０として記載される軽鎖を含み、ｎは、主に２、４及び６である。ある実施形態では、ＡＤＣはＡＤＣ－１であり、抗体はＣＤ１９ ｍＡｂである。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ１９抗体重鎖は配列番号１２として記載されるヌクレオチド配列によってコードされ、軽鎖は配列番号１３として記載されるヌクレオチド配列によってコードされる。
【0064】
７．３．組成物
本開示の抗ＣＤ１９ ＧＲＭアゴニストＡＤＣは、対象への投与に適した組成物として提供され得る。一部の実施形態では、抗ＣＤ１９ ＧＲＭアゴニストＡＤＣ組成物は、本開示の抗ＣＤ１９ ＧＲＭアゴニストＡＤＣ及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。
本開示の抗ＣＤ１９ ＧＲＭアゴニストＡＤＣは、対象への投与に適した組成物として提供され得る。一部の実施形態では、抗ＣＤ１９ ＧＲＭアゴニストＡＤＣ組成物は、本開示の抗ＣＤ１９ ＧＲＭアゴニストＡＤＣ及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。
【0065】
ＡＤＣ組成物は、構造式ＩＩに従って、異なるｎ整数値を有するＡＤＣの混合物を含み得る。ＡＤＣに連結したＧＲＭアゴニスト薬物の数は、抗体上の利用可能な付着部位の数に依存する。「薬物抗体比」又は「ＤＡＲ」は、本明細書で使用される場合、ＡＤＣ組成物中のＧＲＭ薬物と抗体のモル比を指す。
【0066】
複数の実施形態では、製剤は、ｎ値が２，４及び６であり、ＤＡＲが２～６である構造式ＩＩによるＡＤＣの混合物から本質的になる。
【0067】
７．４．使用方法
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、Ｂ細胞悪性腫瘍、例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）などを有する患者を、ＣＤ１９ ＧＲＭアゴニストＡＤＣを用いて治療することを伴う。複数の実施形態では、ＣＤ１９ ＧＲＭアゴニストＡＤＣを含む組成物がそれを必要とする対象に投与される。複数の実施形態では、方法は、式ＩＩＩの化合物、式ＩＶの化合物又は式ＩＩＩ及びＩＶの両方の化合物の対象への送達をもたらすＡＤＣの投与を含む。複数の実施形態では、式ＩＩＩの化合物、式ＩＶの化合物又は式ＩＩＩ及びＩＶの両方の化合物が対象内のＢ細胞悪性腫瘍に送達される。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、Ｂ細胞悪性腫瘍、例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）などを有する患者を、ＣＤ１９ ＧＲＭアゴニストＡＤＣを用いて治療することを伴う。複数の実施形態では、ＣＤ１９ ＧＲＭアゴニストＡＤＣを含む組成物がそれを必要とする対象に投与される。複数の実施形態では、方法は、式ＩＩＩの化合物、式ＩＶの化合物又は式ＩＩＩ及びＩＶの両方の化合物の対象への送達をもたらすＡＤＣの投与を含む。複数の実施形態では、式ＩＩＩの化合物、式ＩＶの化合物又は式ＩＩＩ及びＩＶの両方の化合物が対象内のＢ細胞悪性腫瘍に送達される。
【0068】
単一の作用剤としてもたらされると、ＣＤ１９－ＧＲＭアゴニストＡＤＣは、Ｂ細胞悪性腫瘍に由来するヒト腫瘍細胞株の皮下異種移植片の成長を阻害する。びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ：ＯＣＩ－ＬＹ１９及びＳＵ－ＤＨＬ－６；図８及び１０参照）及び急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ：ＲＳ４；１１；図９参照）に関する実施例を参照されたい。
【0069】
７．５．抗ＣＤ１９ ＡＤＣを作製するためのプロセス
ある特定の実施形態では、抗ＣＤ１９－ＧＲＭアゴニストＡＤＣを作製するためのプロセスが本明細書に記載される。特定の実施形態では、抗ＣＤ１９－ＧＲＭアゴニストＡＤＣを作製するためのプロセスが本明細書に記載され、ここで、抗体は、それぞれが配列番号９又は配列番号１１として記載されるアミノ酸配列からなる２本の重鎖及びそれぞれが配列番号１０として記載されるアミノ酸配列からなる２本の軽鎖を含む抗ＣＤ１９抗体であり、抗体は、ＡＳＮ－３００（ＥＵ：ＡＳＮ－２９７）位において脱フコシル化されたものであり、プロセスは、抗体を過剰量の還元剤で還元するステップ、その後、抗体を過剰量の式Ｖの薬物リンカーとコンジュゲートするステップを含む。
ある特定の実施形態では、抗ＣＤ１９－ＧＲＭアゴニストＡＤＣを作製するためのプロセスが本明細書に記載される。特定の実施形態では、抗ＣＤ１９－ＧＲＭアゴニストＡＤＣを作製するためのプロセスが本明細書に記載され、ここで、抗体は、それぞれが配列番号９又は配列番号１１として記載されるアミノ酸配列からなる２本の重鎖及びそれぞれが配列番号１０として記載されるアミノ酸配列からなる２本の軽鎖を含む抗ＣＤ１９抗体であり、抗体は、ＡＳＮ－３００（ＥＵ：ＡＳＮ－２９７）位において脱フコシル化されたものであり、プロセスは、抗体を過剰量の還元剤で還元するステップ、その後、抗体を過剰量の式Ｖの薬物リンカーとコンジュゲートするステップを含む。
【0070】
８．例示的な実施形態
種々の特定の実施形態を例示し、説明し、一部を以下に示すが、本発明の主旨及び範囲から逸脱することなく種々の変化をなすことができることが理解されよう。
種々の特定の実施形態を例示し、説明し、一部を以下に示すが、本発明の主旨及び範囲から逸脱することなく種々の変化をなすことができることが理解されよう。
【0071】
１．以下の構造：
【0072】
【化12】
Ａは、抗体であり、
Ｒは、抗体のシステイン残基を介した抗体の付着点であり、連結されると－Ｓ－基をもたらし、
ＡＡ１及びＡＡ２は、アラニン（Ａｌａ）であり、
Ｒ１は、水素又は－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２であり、
ｎは、１～１０の整数である）
を含む抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲートであって、
抗体が、
ＣＤＲ－Ｈ１ドメイン、ＣＤＲ－Ｈ２ドメイン及びＣＤＲ－Ｈ３ドメインを含む重鎖可変領域、並びに
ＣＤＲ－Ｌ１ドメイン、ＣＤＲ－Ｌ２ドメイン及びＣＤＲ－Ｌ３ドメインを含む軽鎖可変領域
を含む抗ＣＤ１９抗体であり、
ＣＤＲ－Ｈ１が、アミノ酸配列ＧＦＴＦＴＴＹＷＩＮ（配列番号１）を含み、
ＣＤＲ－Ｈ２が、アミノ酸配列ＮＩＹＰＳＤＳＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号２）を含み、
ＣＤＲ－Ｈ３が、アミノ酸配列ＥＤＹＹＧＳＳＳＹＹＡＭＤＹ（配列番号３）を含み、
ＣＤＲ－Ｌ１が、アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＧＴＡＶＡ（配列番号４）を含み、
ＣＤＲ－Ｌ２が、アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号５）を含み、及び
ＣＤＲ－Ｌ３が、アミノ酸配列ＱＱＹＳＴＹＰＬＴ（配列番号６）を含む、抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲート。
【0073】
２．抗体が、ＩｇＧ抗体である、実施形態１の抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲート。
【0074】
３．抗体が、ＩｇＧ１抗体である、実施形態２の抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲート。
【0075】
４．抗体が、配列番号７として記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号８として記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、実施形態１の抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲート。
【0076】
５．抗体が、配列番号９又は配列番号１１として記載されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１０として記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施形態１の抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲート。
【0077】
６．抗体が、２本の同一の重鎖及び２本の同一の軽鎖からなり、各重鎖が、配列番号９又は配列番号１１として記載されるアミノ酸配列からなり、各軽鎖が、配列番号１０として記載されるアミノ酸配列からなる、実施形態１の抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲート。
【0078】
７．抗体が、脱フコシル化されたものである、実施形態１～６のいずれか１つによる抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲート。
【0079】
８．抗体が、７０％以上、８０％以上、９０％以上又は約９９％又は約１００％脱フコシル化されたものである、実施形態７による抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲート。
【0080】
９．脱フコシル化が、ＡＳＮ－３００（ＥＵ：ＡＳＮ－２９７）位におけるものである、実施形態７又は実施形態８による抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲート。
【0081】
１０．実施形態１～９のいずれか１つの抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲート及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【0082】
１１．Ｂ細胞悪性腫瘍を治療する方法であって、実施形態１～９のいずれか１つによる抗体薬物コンジュゲートを、それを必要とする患者に投与するステップを含む、方法。
【0083】
１２．ｎが、２、４又は６である、実施形態１～９のいずれか１つの抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲート。
【0084】
１３．ｎが２である、実施形態１～９のいずれか１つの抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲート。
【0085】
１４．ｎが４である、実施形態１～９のいずれか１つの抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲート。
【0086】
１５．ｎが６である、実施形態１～９のいずれか１つの抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲート。
【0087】
１６．ＣＤＲ－Ｈ１ドメイン、ＣＤＲ－Ｈ２ドメイン及びＣＤＲ－Ｈ３ドメインを含む重鎖可変領域、並びに
ＣＤＲ－Ｌ１ドメイン、ＣＤＲ－Ｌ２ドメイン及びＣＤＲ－Ｌ３ドメインを含む軽鎖可変領域
を含む抗ＣＤ１９抗体であって、
ＣＤＲ－Ｈ１が、アミノ酸配列ＧＦＴＦＴＴＹＷＩＮ（配列番号１）を含み、
ＣＤＲ－Ｈ２が、アミノ酸配列ＮＩＹＰＳＤＳＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号２）を含み、
ＣＤＲ－Ｈ３が、アミノ酸配列ＥＤＹＹＧＳＳＳＹＹＡＭＤＹ（配列番号３）を含み、
ＣＤＲ－Ｌ１が、アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＧＴＡＶＡ（配列番号４）を含み、
ＣＤＲ－Ｌ２が、アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号５）を含み、及び
ＣＤＲ－Ｌ３が、アミノ酸配列ＱＱＹＳＴＹＰＬＴ（配列番号６）を含む、
抗ＣＤ１９抗体。
ＣＤＲ－Ｌ１ドメイン、ＣＤＲ－Ｌ２ドメイン及びＣＤＲ－Ｌ３ドメインを含む軽鎖可変領域
を含む抗ＣＤ１９抗体であって、
ＣＤＲ－Ｈ１が、アミノ酸配列ＧＦＴＦＴＴＹＷＩＮ（配列番号１）を含み、
ＣＤＲ－Ｈ２が、アミノ酸配列ＮＩＹＰＳＤＳＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号２）を含み、
ＣＤＲ－Ｈ３が、アミノ酸配列ＥＤＹＹＧＳＳＳＹＹＡＭＤＹ（配列番号３）を含み、
ＣＤＲ－Ｌ１が、アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＧＴＡＶＡ（配列番号４）を含み、
ＣＤＲ－Ｌ２が、アミノ酸配列ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号５）を含み、及び
ＣＤＲ－Ｌ３が、アミノ酸配列ＱＱＹＳＴＹＰＬＴ（配列番号６）を含む、
抗ＣＤ１９抗体。
【0088】
１７．ＩｇＧ抗体である、実施形態１６に記載の抗ＣＤ１９抗体。
【0089】
１８．ＩｇＧ１抗体である、実施形態１７に記載の抗ＣＤ１９抗体。
【0090】
１９．配列番号７として記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号８として記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、実施形態１６による抗ＣＤ１９抗体。
【0091】
２０．配列番号９又は配列番号１１として記載されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１０として記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施形態１６による抗ＣＤ１９抗体。
【0092】
２１．脱フコシル化されたものである、実施形態１６～２０のいずれか１つによる抗ＣＤ１９抗体。
【0093】
２２．７０％以上、８０％以上、９０％以上又は約９９％又は約１００％脱フコシル化されたものである、実施形態２１による抗ＣＤ１９抗体。
【0094】
２３．脱フコシル化が、ＡＳＮ－３００（ＥＵ：ＡＳＮ－２９７）位におけるものである、実施形態２１又は実施形態２２による抗ＣＤ１９抗体。
【0095】
２４．ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、ＩｇＧ４抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、ラクダ化抗体（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ｓｃＦｖ－Ｆｃ抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ又はｓｃＦｖである、実施形態１６又は１９による抗ＣＤ１９抗体。
【0096】
２５．脱フコシル化されたものである、実施形態２４による抗ＣＤ１９抗体。
【0097】
２６．７０％以上、８０％以上、９０％以上又は約９９％又は約１００％脱フコシル化されたものである、実施形態２５による抗ＣＤ１９抗体。
【0098】
２７．脱フコシル化が、ＡＳＮ－３００（ＥＵ：ＡＳＮ－２９７）位におけるものである、実施形態２５又は実施形態２６による抗ＣＤ１９抗体。
【0099】
２８．以下の構造：
【0100】
【化13】
Ａは、抗体であり、
Ｒは、抗体のシステイン残基を介した抗体の付着点であり、連結されると－Ｓ－基をもたらし、
ＡＡ１及びＡＡ２は、アラニン（Ａｌａ）であり、
Ｒ１は、－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２であり、
ｎは、２～８の整数である）
を含む抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲートであって、
抗体が、
それぞれが配列番号９又は配列番号１１として記載されるアミノ酸配列からなる２本の重鎖及びそれぞれが配列番号１０として記載されるアミノ酸配列からなる２本の軽鎖
を含む抗ＣＤ１９抗体であり、
抗体が、ＡＳＮ－３００（ＥＵ：ＡＳＮ－２９７）位において脱フコシル化されたものである、
抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲート。
【0101】
２９．ｎが２である、実施形態２８による抗ＣＤ１９抗体。
【0102】
３０．ｎが４である、実施形態２８による抗ＣＤ１９抗体。
【0103】
３１．ｎが６である、実施形態２８による抗ＣＤ１９抗体。
【0104】
３２．ｎが８である、実施形態２８による抗ＣＤ１９抗体。
【0105】
３３．実施形態１６による抗ＣＤ１９抗体をコードする１つ以上のポリヌクレオチド。
【0106】
３４．以下の構造：
【0107】
【化14】
Ａは、抗体であり、
Ｒは、抗体のシステイン残基を介した抗体の付着点であり、連結されると－Ｓ－基をもたらし、
ＡＡ１及びＡＡ２は、アラニン（Ａｌａ）であり、Ｒ１は、－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２であり、
ｎは、２～８の整数である）
を含む抗ＣＤ１９抗体薬物コンジュゲートを作製するためのプロセスであって、
抗体が、
それぞれが配列番号９又は配列番号１１として記載されるアミノ酸配列からなる２本の重鎖及びそれぞれが配列番号１０として記載されるアミノ酸配列からなる２本の軽鎖を含む
抗ＣＤ１９抗体であり、
抗体が、ＡＳＮ－３００（ＥＵ：ＡＳＮ－２９７）位において脱フコシル化されたものであり、
プロセスが、抗体を過剰量の還元剤で還元するステップ、その後、抗体を、過剰量の、以下の構造：
【0108】
【化15】
プロセス。
【実施例0109】
９．実施例
本明細書に記載の抗体及び結合性断片の例示的な実施形態のある特定の特色及び特性を強調する以下の実施例は例示のために提示するものである。
本明細書に記載の抗体及び結合性断片の例示的な実施形態のある特定の特色及び特性を強調する以下の実施例は例示のために提示するものである。
【0110】
９．１
［実施例１］ ＣＤ１９抗体の生成
マウス抗体クローン４Ｂ１２（マウス抗ヒトＣＤ１９）の相補性決定領域（ＣＤＲ）からなるＣＤ１９抗体を、ハイブリドーマ技術を使用して単離した。これらのＣＤＲ配列（配列番号１～６）を、９つのマウス可変重鎖フレームワーク復帰変異及び２つのマウス可変軽鎖フレームワーク復帰変異を有するヒトＩｇＧ１重鎖及びヒトカッパ軽鎖定常領域ドメインにクローニングして、Ｈ鎖配列（配列番号９）及びＬ鎖配列（配列番号１０）を生成した。ヒト化ＣＤ１９抗体（ＣＤ１９ ｍＡｂ）は、親マウスハイブリドーマクローン４Ｂ１２のＣＤ１９結合効力及び選択性を保持する。
［実施例１］ ＣＤ１９抗体の生成
マウス抗体クローン４Ｂ１２（マウス抗ヒトＣＤ１９）の相補性決定領域（ＣＤＲ）からなるＣＤ１９抗体を、ハイブリドーマ技術を使用して単離した。これらのＣＤＲ配列（配列番号１～６）を、９つのマウス可変重鎖フレームワーク復帰変異及び２つのマウス可変軽鎖フレームワーク復帰変異を有するヒトＩｇＧ１重鎖及びヒトカッパ軽鎖定常領域ドメインにクローニングして、Ｈ鎖配列（配列番号９）及びＬ鎖配列（配列番号１０）を生成した。ヒト化ＣＤ１９抗体（ＣＤ１９ ｍＡｂ）は、親マウスハイブリドーマクローン４Ｂ１２のＣＤ１９結合効力及び選択性を保持する。
【0111】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に、ＣＤ１９抗体を発現するように設計された発現ベクター（ｐＣＤ－ＣＤ１９抗体）を電気穿孔によってトランスフェクトした。細胞を、発現ベクターからのＤＨＦＲ及びＣＤ１９抗体を発現する細胞の選択を可能にする化学的限定培地中で成長させた。細胞を成長させ、クローン性増殖を抗ＣＤ１９抗体発現についてスクリーニングした。スクリーニングに基づいて、安定なトランスフェクタントをさらなる開発のための親細胞株として同定した。
【0112】
次いで、この安定なトランスフェクタントに追加的なベクター（シュードモナス酵素ＧＤＰ－６－デオキシ－Ｄ－リキソ－４－ヘキスロースレダクターゼ（ＲＭＤ）を発現するｐＹＨ９ｎｅｏ－ＲＭＤ）を電気穿孔によってトランスフェクトした。この発現ベクターは、例えばＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼの欠乏に起因してＧＤＰ－フコース形成に欠陥がある細胞株における脱フコシル化ＣＤ１９抗体（９０％以上脱フコシル化されたもの）の産生を可能にするものである。クローン細胞を脱フコシル化ＣＤ１９抗体の成長及び発現についてスクリーニングした。最終的なサブクローンを選択し、マスターセルバンク（Ｍａｓｔｅｒ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）を生成した。
【0113】
９．２
［実施例２］ ＣＤ１９ ＧＲＭアゴニストＡＤＣであるＡＤＣ－１の合成
［実施例２］ ＣＤ１９ ＧＲＭアゴニストＡＤＣであるＡＤＣ－１の合成
【0114】
９．２．１．概要
ＣＤ１９ ＧＲＭアゴニストＡＤＣを、実施例１の抗ＣＤ１９抗体をコンジュゲートすること（Ｒ１がリン酸基の場合の式ＩのＧＲＭを含有するリンカー薬物と）によって形成した。式（ＩＩＩ）：
ＣＤ１９ ＧＲＭアゴニストＡＤＣを、実施例１の抗ＣＤ１９抗体をコンジュゲートすること（Ｒ１がリン酸基の場合の式ＩのＧＲＭを含有するリンカー薬物と）によって形成した。式（ＩＩＩ）：
【0115】
【化16】
【0116】
【化17】
【0117】
コンジュゲートした材料を、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使用して処理して、コンジュゲートしたリンカー薬物を含有しない抗体及び抗体当たり８つのＧＲＭ分子を含有するＡＤＣを実質的に減少させ、その結果、主に２つ、４つ又は６つのＧＲＭ分子を含有するＡＤＣの混合物を含み、ＤＡＲが２～６である最終的な薬物製品をもたらす。
【0118】
ＣＤ１９ ＧＲＭアゴニストＡＤＣであるＡＤＣ－１を生成するために使用した分析手順を以下に詳述する。
【0119】
９．２．２．低分子分析手順
別段の指定のない限り、１Ｈ及び１３Ｃ ＮＭＲ（核磁気共鳴）データは全てＶａｒｉａｎ Ｍｅｒｃｕｒｙ Ｐｌｕｓ ４００ＭＨｚ、Ａｇｉｌｅｎｔ ＭＲ ４００ＭＨｚ又はＢｒｕｋｅｒ ＡＶＩＩＩ ３００ＭＨｚ、４００ＭＨｚ、５００ＭＨｚ又は６００ＭＨｚ機器で収集した。化学シフトは百万分率（ｐｐｍ）で引用される。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及びＬＣＭＳ分析データは実験内で又は表１に列挙されている条件を参照して詳述される。
別段の指定のない限り、１Ｈ及び１３Ｃ ＮＭＲ（核磁気共鳴）データは全てＶａｒｉａｎ Ｍｅｒｃｕｒｙ Ｐｌｕｓ ４００ＭＨｚ、Ａｇｉｌｅｎｔ ＭＲ ４００ＭＨｚ又はＢｒｕｋｅｒ ＡＶＩＩＩ ３００ＭＨｚ、４００ＭＨｚ、５００ＭＨｚ又は６００ＭＨｚ機器で収集した。化学シフトは百万分率（ｐｐｍ）で引用される。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及びＬＣＭＳ分析データは実験内で又は表１に列挙されている条件を参照して詳述される。
【0120】
【表1】
【0121】
９．２．３．前駆体分子の合成
【0122】
９．２．３．１．（２Ｓ，６ａＳ，６ｂＲ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）－１０－（４－（３－アミノベンジル）フェニル）－２，６ｂ－ジフルオロ－７－ヒドロキシ－８ｂ－（２－ヒドロキシアセチル）－６ａ，８ａ－ジメチル－１，２，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ－ドデカヒドロ－４Ｈ－ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２－ｄ］［１，３］ジオキソール－４－オン（式ＩＶのＧＲＭ）の合成
【0123】
【化18】
【0124】
ステップ１：４－（ブロモメチル）ベンズアルデヒドの合成。水素化ジイソブチルアルミニウム（１５３ｍＬ、１５３ｍｍｏｌ、トルエン中１Ｍ）をトルエン（４００ｍＬ）中の４－（ブロモメチル）ベンゾニトリル（２０ｇ、１０２ｍｍｏｌ）の０℃の溶液に１時間にわたって液滴添加した。２つの追加的な反応を上記の通りセットアップした。３つ全ての反応混合物を精製のために合わせた。合わせた反応混合物を、１０％ＨＣｌ水溶液（１．５Ｌ）を用いてクエンチし、ジクロロメタン（３×５００ｍＬ）を用いて抽出し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、溶媒を減圧下で除去した。１０：１石油エーテル／酢酸エチルを用いたカラムクロマトグラフィー（シリカゲル）溶出によって精製することによりを得た表題化合物（５０ｇ、収率８２％）。1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 10.02 (s, 1H), 7.91 - 7.82 (m, 2H), 7.56 (d, J=7.9 Hz, 2H), 4.55 - 4.45 (m, 2H).
【0125】
ステップ２：３－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）アニリンの合成。１，４－ジオキサン（４８０ｍＬ）中３－ブロモアニリン（４０ｇ、２３３ｍｍｏｌ）の溶液に、４，４，４’，４’，５，５，５’，５’－オクタメチル－２，２’－ビ（１，３，２－ジオキサボロラン）（９４ｇ、３７２ｍｍｏｌ）、酢酸カリウム（４５．６ｇ、４６５ｍｍｏｌ）、２－ジシクロヘキシルホスフィノ－２’，４’，６’－トリ－ｉ－プロピル－１，１’－ビフェニル（８．０７ｇ、１３．９５ｍｍｏｌ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（８．５２ｇ、９．３０ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、得られた混合物を、窒素下、８０℃で４時間加熱した。追加的な反応を上記の通りセットアップした。２つの反応混合物を合わせ、溶媒を減圧下で除去した。１０：１石油エーテル／酢酸エチルを用いたカラムクロマトグラフィー（シリカゲル）溶出によって精製することにより表題化合物を得た（６０ｇ、収率５５．４％）。1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 7.23 - 7.13 (m, 3H), 6.80 (d, J=7.5 Hz, 1H), 3.82 - 3.38 (m, 2H), 1.34 (s, 12H).
【0126】
ステップ３：ｔｅｒｔ－ブチル（３－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）フェニル）カルバメートの合成。３－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）アニリン（３０ｇ、１３７ｍｍｏｌ）及びジ－ｔｅｒｔ－ブチルジカーボネート（３８．９ｇ、１７８ｍｍｏｌ）をトルエン（６００ｍＬ）中、１００℃で２４時間にわたって混合した。別の反応を上記の通りセットアップした。２つの反応混合物を合わせ、溶媒を減圧下で除去した。粗残留物を酢酸エチル（１．５Ｌ）中に溶解させ、０．１ＮのＨＣｌ水溶液（３×２Ｌ）、ブライン（３Ｌ）を用いて洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、減圧下で濃縮して、表題化合物を得た（５０ｇ、収率５７％）。1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 7.63 (br m, 2H), 7.48 (d, J=7.1 Hz, 1H), 7.37 - 7.28 (m, 1H), 1.52 (s, 9H), 1.34 (s, 12H).
【0127】
ステップ４：ｔｅｒｔ－ブチル（３－（４－ホルミルベンジル）フェニル）カルバメートの合成。テトラヒドロフラン（４００ｍＬ）中、４－（ブロモメチル）ベンズアルデヒド（２４．９４ｇ、１２５ｍｍｏｌ）、１，１’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセンジクロロパラジウム（ＩＩ）ジクロロメタン（１３．７５ｇ、１８．８０ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ－ブチル（３－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）フェニル）カルバメート（２０ｇ、６２．７ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム（４３．３ｇ、３１３ｍｍｏｌ）の混合物を１２時間にわたって８０℃まで加熱した。別の追加的な反応を上記の通りセットアップした。２つの反応混合物を合わせ、水（５００ｍＬ）を用いて希釈し、酢酸エチル（３×５００ｍＬ）を用いて抽出した。合わせた有機層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、溶媒を減圧下で除去した。１０：１石油エーテル／酢酸エチルを用いたカラムクロマトグラフィー（シリカゲル）溶出によって精製することにより表題化合物を得た（１５ｇ、収率３８．４％）。1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 9.95 (s, 1H), 7.78 (d, J=7.9 Hz, 2H), 7.33 (d, J=7.9 Hz, 2H), 7.27 - 7.13 (m, 3H), 6.82 (d, J=7.1 Hz, 1H), 6.47 (br. s., 1H), 4.00 (s, 2H), 1.48 (s, 9H).
【0128】
ステップ５：（６Ｓ，８Ｓ，９Ｒ，１０Ｓ，１１Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１６Ｒ，１７Ｓ）－６，９－ジフルオロ－１１，１６，１７－トリヒドロキシ－１７－（２－ヒドロキシアセチル）－１０，１３－ジメチル－６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－ドデカヒドロ－３Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－オンの合成。（２Ｓ，６ａＳ，６ｂＲ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）－２，６ｂ－ジフルオロ－７－ヒドロキシ－８ｂ－（２－ヒドロキシアセチル）－６ａ，８ａ，１０，１０－テトラメチル－１，２，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ－ドデカヒドロ－４Ｈ－ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２－ｄ］［１，３］ジオキソール－４－オン（２０ｇ、４４．２ｍｍｏｌ）を４０％ＨＢＦ４水溶液（４４０ｍＬ）中に懸濁させ、混合物を２５℃で４８時間撹拌した。反応の完了後、水２Ｌを添加し、濾過によって固体を収集した。固体を水（１Ｌ）、次いでメタノール（２００ｍＬ）を用いて洗浄して、表題化合物を得た（１１ｇ、収率６０．３％）。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 7.25 (d, J=10.1 Hz, 1H), 6.28 (d, J=10.1 Hz, 1H), 6.10 (s, 1H), 5.73 - 5.50 (m, 1H), 5.39 (br. s., 1H), 4.85 - 4.60 (m, 2H), 4.50 (d, J=19.4 Hz, 1H), 4.20 - 4.04 (m, 2H), 2.46 - 2.06 (m, 6H), 1.87 - 1.75 (m, 1H), 1.56 - 1.30 (m, 6H), 0.83 (s, 3H).
【0129】
ステップ６：（２Ｓ，６ａＳ，６ｂＲ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）－１０－（４－（３－アミノベンジル）フェニル）－２，６ｂ－ジフルオロ－７－ヒドロキシ－８ｂ－（２－ヒドロキシアセチル）－６ａ，８ａ－ジメチル－１，２，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ－ドデカヒドロ－４Ｈ－ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２－ｄ］［１，３］ジオキソール－４－オンの合成。アセトニトリル（１００ｍＬ）中（６Ｓ，８Ｓ，９Ｒ，１０Ｓ，１１Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１６Ｒ，１７Ｓ）－６，９－ジフルオロ－１１，１６，１７－トリヒドロキシ－１７－（２－ヒドロキシアセチル）－１０，１３－ジメチル－６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－ドデカヒドロ－３Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－オン（４．４ｇ、１０．６７ｍｍｏｌ）及びＭｇＳＯ４（６．４２ｇ、５３．３ｍｍｏｌ）の懸濁液を２０℃で１時間撹拌した。アセトニトリル（１００ｍＬ）中ｔｅｒｔ－ブチル（３－（４－ホルミルベンジル）フェニル）カルバメート（３．６５ｇ、１１．７４ｍｍｏｌ）の溶液を一度に添加した。氷浴を使用して内部の温度を室温未満に維持しながら、トリフルオロメタンスルホン酸（９．０１ｍＬ、５３．３ｍｍｏｌ）を液滴添加した。添加後、混合物を２０℃で２時間撹拌した。３つの追加的な反応を上記の通りセットアップした。４つ全ての反応混合物を合わせ、溶媒を減圧下で除去した。分取ＨＰＬＣによって精製することにより表題化合物を得た（４．５ｇ、収率１４．２％）。ＬＣＭＳ（方法ａ、表１）Ｒｔ＝２．６５分；ＭＳ ｍ／ｚ＝６０６．２（Ｍ＋Ｈ）＋。1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.34 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.24 (dd, J = 16.2, 9.0 Hz, 3H), 6.88 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 6.43 - 6.33 (m, 3H), 6.30 (d, J = 10.2 Hz, 1H), 6.13 (s, 1H), 5.75 - 5.55 (m, 1H), 5.52 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 5.44 (s, 1H), 5.11 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 4.94 (s, 3H), 4.51 (dd, J = 19.6, 6.5 Hz, 1H), 4.29 - 4.07 (m, 2H), 3.73 (s, 2H), 2.76 - 2.55 (m, 1H), 2.39 - 2.13 (m, 2H), 2.10 - 1.96 (m, 1H), 1.85 - 1.61 (m, 3H), 1.61 - 1.39 (m, 4H), 0.86 (s, 3H).分取ＨＰＬＣ法：機器：Ｇｉｌｓｏｎ ２８１半分取ＨＰＬＣシステム；移動相：Ａ：ギ酸／Ｈ２Ｏ＝０．０１ｖ／ｖ％；Ｂ：アセトニトリル；カラム：Ｌｕｎａ Ｃ１８ １５０＊２５ ５ミクロン；流量：２５ｍＬ／分；モニタリング波長：２２０ｎｍ及び２５４ｎｍ。
【0130】
【表2】
【0131】
９．２．３．２．２－（（２Ｓ，６ａＳ，６ｂＲ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）－１０－（４－（３－アミノベンジル）フェニル）－２，６ｂ－ジフルオロ－７－ヒドロキシ－６ａ，８ａ－ジメチル－４－オキソ－１，２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ－ドデカヒドロ－８ｂＨ－ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２－ｄ］［１，３］ジオキソール－８ｂ－イル）－２－オキソエチルリン酸二水素（式ＩＩＩのリン酸－ＧＲＭ）の合成
【0132】
【化19】
【0133】
ジホスホリルクロリド（６．８６ｇ、２７．２ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフラン（３０ｍＬ）中、（２Ｓ，６ａＳ，６ｂＲ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）－１０－（４－（３－アミノベンジル）フェニル）－２，６ｂ－ジフルオロ－７－ヒドロキシ－８ｂ－（２－ヒドロキシアセチル）－６ａ，８ａ－ジメチル－１，２，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ－ドデカヒドロ－４Ｈ－ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２－ｄ］［１，３］ジオキソール－４－オン（３．３０ｇ、５．４５ｍｍｏｌ）及びパラ－トルエンスルホン酸（０．９３８ｇ、５．４５ｍｍｏｌ）の－４０℃の溶液に液滴添加した。混合物を－４０℃で２時間撹拌した。３つの追加的な反応を上記の通りセットアップした。合わせた反応混合物を、－４０℃で水（４５０ｍＬ）を用いてクエンチし、０℃まで温め、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を添加することによってｐＨを約７に調整した。大きな液体体積でフラスコが満たされてきたので懸濁液を約６のｐＨで濾過した。次いで、濾液をｐＨ７に調整し、濾過された固体を通してすすいだ。濾液を、１ＭのＨＣｌ水溶液（２００ｍＬ）を添加することによってｐＨ３まで酸性に戻し、それにより懸濁液がもたらされた。混合物を濾過し、合わせた固体を母液で２回すすぎ、収集した。粗製固体を真空下で乾燥させ、Ｎａｎｏ－ｍｉｃｒｏ Ｋｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８ ３ミクロンカラム（１００×４０ｍｍ）において分取ＨＰＬＣによって精製した。アセトニトリル（Ａ）及び水中１％トリフルオロ酢酸（Ｂ）のグラジエントを５０ｍＬ／分の流量で使用した（０～５．０分、２０％Ａ、５．０～２５．０分、リニアグラジエント２０～５０％Ａ、５分間保持）。精製された画分のｐＨを約５に調整し、凍結乾燥させて表題化合物を白色固体として得た（３．５０ｇ、収率２３％）。ＬＣＭＳ（方法ｂ、表１）Ｒｔ＝０．７０７分、ｍ／ｚ ６８６．２（Ｍ＋Ｈ＋）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.35 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.26 (td, J = 7.3, 6.2, 3.1 Hz, 3H), 7.07 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 6.73 - 6.60 (m, 3H), 6.30 (dd, J = 10.2, 1.9 Hz, 1H), 6.12 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 5.75 - 5.55 (m, 1H), 5.54 (s, 1H), 4.98 - 4.86 (m, 2H), 4.59 (dd, J = 18.2, 8.3 Hz, 1H), 4.25 - 4.17 (m, 1H), 3.83 (s, 2H), 2.79 - 2.56 (m, 1H), 2.37 - 2.17 (m, 2H), 2.05 (dt, J = 13.7, 3.6 Hz, 1H), 1.72 (q, J = 9.3, 8.1 Hz, 3H), 1.60 - 1.41 (m, 1H), 1.50 (s, 3H), 0.88 (s, 3H). 19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) δ -73.76, -164.99, -186.36. 31P NMR (162 MHz, DMSO-d6) δ -1.17.
【0134】
９．２．３．３．（Ｓ）－２－（２－ブロモアセトアミド）－Ｎ－（（Ｓ）－１－（（３－（４－（（２Ｓ，６ａＳ，６ｂＲ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）－２，６ｂ－ジフルオロ－７－ヒドロキシ－８ｂ－（２－ヒドロキシアセチル）－６ａ，８ａ－ジメチル－４－オキソ－２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ－ドデカヒドロ－１Ｈ－ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２－ｄ］［１，３］ジオキソール－１０－イル）ベンジル）フェニル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）プロパンアミド（式ＶＩの薬物リンカー）の合成
【0135】
【化20】
【0136】
ステップ１：ｔｅｒｔ－ブチル（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（３－（４－（（２Ｓ，６ａＳ，６ｂＲ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）－２，６ｂ－ジフルオロ－７－ヒドロキシ－８ｂ－（２－ヒドロキシアセチル）－６ａ，８ａ－ジメチル－４－オキソ－２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ－ドデカヒドロ－１Ｈ－ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２－ｄ］［１，３］ジオキソール－１０－イル）ベンジル）フェニル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）カルバメートの合成。
【0137】
２，６－ルチジン（０．５ｍＬ、４．２９ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフラン（５．５ｍＬ）中、（２Ｓ，６ａＳ，６ｂＲ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）－１０－（４－（３－アミノベンジル）フェニル）－２，６ｂ－ジフルオロ－７－ヒドロキシ－８ｂ－（２－ヒドロキシアセチル）－６ａ，８ａ－ジメチル－１，２，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ－ドデカヒドロ－４Ｈ－ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２－ｄ］［１，３］ジオキソール－４－オン（０．５０５ｇ、０．８３４ｍｍｏｌ）、（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）プロパンアミド）プロパン酸［ＣＡＳ番号２７３１７－６９－７、Ｃｈｅｍ－Ｉｍｐｅｘ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．から購入したもの］（０．２１７ｇ、０．８３５ｍｍｏｌ）及びＨＡＴＵ（１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロリン酸）（０．４８１ｇ、１．２６６ｍｍｏｌ）の室温の懸濁液に添加した。１６時間後、反応物をＥｔＯＡｃ（４０ｍＬ）で希釈し、１ＮのＨＣｌ水溶液（２×２０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２０ｍＬ）、ブライン（２０ｍＬ）を用いて洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。０～１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭのグラジエントを用いたクロマトグラフィー（シリカ、４０ｇ）溶出によって精製することにより表題化合物を類白色固体として得た（０．６４８ｇ、収率９２％）。ＬＣＭＳ（方法ｃ、ＥＳＩ、表１）Ｒｔ＝０．８９分、ｍ／ｚ＝８４８．６（Ｍ＋Ｈ＋）。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 9.82 (s, 1H), 7.94 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.46 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.38 (t, J = 2.0 Hz, 1H), 7.38 - 7.33 (m, 2H), 7.26 (dd, J = 10.2, 1.5 Hz, 1H), 7.26 - 7.22 (m, 2H), 7.19 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 6.95 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 6.91 (dt, J = 7.7, 1.2 Hz, 1H), 6.29 (dd, J = 10.1, 1.9 Hz, 1H), 6.14 - 6.11 (m, 1H), 5.72 - 5.56 (m, 1H), 5.53 - 5.49 (m, 1H), 5.44 (s, 1H), 5.09 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 4.94 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 4.51 (dd, J = 19.4, 6.1 Hz, 1H), 4.35 (t, J = 7.1 Hz, 1H), 4.23 - 4.16 (m, 2H), 3.97 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 3.88 (s, 2H), 2.65 (ddt, J = 28.2, 15.3, 7.9 Hz, 1H), 2.36 - 2.16 (m, 2H), 2.07 - 2.01 (m, 1H), 1.78 - 1.63 (m, 3H), 1.57 - 1.50 (m, 1H), 1.49 (s, 3H), 1.36 (s, 9H), 1.26 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 1.20 - 1.15 (m, 3H), 0.86 (s, 3H).
【0138】
ステップ２：（Ｓ）－２－アミノ－Ｎ－（（Ｓ）－１－（（３－（４－（（２Ｓ，６ａＳ，６ｂＲ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）－２，６ｂ－ジフルオロ－７－ヒドロキシ－８ｂ－（２－ヒドロキシアセチル）－６ａ，８ａ－ジメチル－４－オキソ－２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ－ドデカヒドロ－１Ｈ－ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２－ｄ］［１，３］ジオキソール－１０－イル）ベンジル）フェニル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）プロパンアミドの合成
トリフルオロ酢酸（２．０ｍＬ、２６．０ｍｍｏｌ）を、ｔｅｒｔ－ブチル（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（３－（４－（（２Ｓ，６ａＳ，６ｂＲ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）－２，６ｂ－ジフルオロ－７－ヒドロキシ－８ｂ－（２－ヒドロキシアセチル）－６ａ，８ａ－ジメチル－４－オキソ－２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ－ドデカヒドロ－１Ｈ－ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２－ｄ］［１，３］ジオキソール－１０－イル）ベンジル）フェニル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）カルバメート（０．６４８ｇ、０．７６４ｍｍｏｌ）の室温の溶液に添加した。反応物を開口フラスコ中で２０分にわたって撹拌し、次いで、溶媒を減圧下で除去した。残留物をＥｔＯＡｃ（６０ｍＬ）中に溶解させ、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（３×２０ｍＬ）、飽和ＮａＢｒ水溶液（２０ｍＬ）を用いて洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。ＭＴＢＥ／ヘプタンを用いて残留物を粉砕し、溶媒を除去することにより表題化合物を得、それを、さらなる精製を行わずに次のステップに使用した。ＬＣＭＳ（方法ｃ、ＥＳＩ、表１）Ｒｔ＝０．７２分；ｍ／ｚ７４８．５（Ｍ＋Ｈ＋）。
トリフルオロ酢酸（２．０ｍＬ、２６．０ｍｍｏｌ）を、ｔｅｒｔ－ブチル（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（３－（４－（（２Ｓ，６ａＳ，６ｂＲ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）－２，６ｂ－ジフルオロ－７－ヒドロキシ－８ｂ－（２－ヒドロキシアセチル）－６ａ，８ａ－ジメチル－４－オキソ－２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ－ドデカヒドロ－１Ｈ－ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２－ｄ］［１，３］ジオキソール－１０－イル）ベンジル）フェニル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）カルバメート（０．６４８ｇ、０．７６４ｍｍｏｌ）の室温の溶液に添加した。反応物を開口フラスコ中で２０分にわたって撹拌し、次いで、溶媒を減圧下で除去した。残留物をＥｔＯＡｃ（６０ｍＬ）中に溶解させ、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（３×２０ｍＬ）、飽和ＮａＢｒ水溶液（２０ｍＬ）を用いて洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。ＭＴＢＥ／ヘプタンを用いて残留物を粉砕し、溶媒を除去することにより表題化合物を得、それを、さらなる精製を行わずに次のステップに使用した。ＬＣＭＳ（方法ｃ、ＥＳＩ、表１）Ｒｔ＝０．７２分；ｍ／ｚ７４８．５（Ｍ＋Ｈ＋）。
【0139】
ステップ３：（Ｓ）－２－（２－ブロモアセトアミド）－Ｎ－（（Ｓ）－１－（（３－（４－（（２Ｓ，６ａＳ，６ｂＲ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）－２，６ｂ－ジフルオロ－７－ヒドロキシ－８ｂ－（２－ヒドロキシアセチル）－６ａ，８ａ－ジメチル－４－オキソ－２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ－ドデカヒドロ－１Ｈ－ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２－ｄ］［１，３］ジオキソール－１０－イル）ベンジル）フェニル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）プロパンアミドの合成。
【0140】
２，６－ルチジン（０．２ｍＬ、１．７１７ｍｍｏｌ）を、ジメチルホルムアミド（４ｍＬ）中、（Ｓ）－２－アミノ－Ｎ－（（Ｓ）－１－（（３－（４－（（２Ｓ，６ａＳ，６ｂＲ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）－２，６ｂ－ジフルオロ－７－ヒドロキシ－８ｂ－（２－ヒドロキシアセチル）－６ａ，８ａ－ジメチル－４－オキソ－２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ－ドデカヒドロ－１Ｈ－ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２－ｄ］［１，３］ジオキソール－１０－イル）ベンジル）フェニル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）プロパンアミド（０．２８６ｇ、０．３８２ｍｍｏｌ）及びブロモ酢酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（０．４１４ｇ、１．７５３ｍｍｏｌ）の室温の溶液に添加した。反応をＬＣＭＳにより２０分以内に完了させた。同じサイズの第２の反応をセットアップした。両方の反応物をＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｃ１８（２）１０ミクロンカラム（２５０×５０ｍｍ）での分取ＨＰＬＣによる精製のために合わせた。アセトニトリル（Ａ）及び水中１％トリフルオロ酢酸（Ｂ）のグラジエントを９０ｍＬ／分の流量で使用した（０～５．０分、１５％Ａ、５．０～２０．０分、リニアグラジエント１５～９５％Ａ、５分間の保持）。生成物画分をフリーズドライして、表題化合物を白色固体として得た（０．２５４ｇ、収率３８％）。ＬＣＭＳ（方法ｃ、ＥＳＩ、表１）Ｒｔ＝０．８２分、ｍ／ｚ８６８．４、８７０．３（Ｍ＋Ｈ）＋。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 9.82 (s, 1H), 8.45 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 8.20 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.46 (dd, J = 8.4, 2.2 Hz, 1H), 7.40 (t, J = 1.9 Hz, 1H), 7.38 - 7.33 (m, 2H), 7.28 - 7.19 (m, 4H), 7.19 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 6.91 (dt, J = 7.7, 1.3 Hz, 1H), 6.29 (dd, J = 10.2, 1.9 Hz, 1H), 6.12 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.64 (dddd, J = 48.5, 11.4, 6.8, 1.9 Hz, 1H), 5.51 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 5.45 (s, 1H), 4.94 (d, J = 5.3 Hz, 1H), 4.51 (d, J = 19.4 Hz, 1H), 4.40 - 4.33 (m, 1H), 4.31 (p, J = 7.2 Hz, 1H), 4.23 - 4.16 (m, 2H), 3.94 - 3.87 (m, 4H), 2.71 - 2.58 (m, 1H), 2.27 (ddq, J = 31.2, 12.4, 6.3, 5.7 Hz, 1H), 2.04 (dt, J = 13.7, 3.7 Hz, 1H), 1.77 - 1.63 (m, 3H), 1.57 - 1.50 (m, 1H), 1.50 (s, 3H), 1.27 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 1.21 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 0.86 (s, 3H).
【0141】
９．２．３．４．２－（（２Ｓ，６ａＳ，６ｂＲ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）－１０－（４－（３－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－（２－ブロモアセトアミド）プロパンアミド）プロパンアミド）ベンジル）フェニル）－２，６ｂ－ジフルオロ－７－ヒドロキシ－６ａ，８ａ－ジメチル－４－オキソ－１，２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ－ドデカヒドロ－８ｂＨ－ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２－ｄ］［１，３］ジオキソール－８ｂ－イル）－２－オキソエチルリン酸二水素（式Ｖの薬物リンカー）の合成
【0142】
【化21】
【0143】
ステップ１：（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（３－（４－（（２Ｓ，６ａＳ，６ｂＲ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）－２，６ｂ－ジフルオロ－７－ヒドロキシ－８ｂ－（２－ヒドロキシアセチル）－６ａ，８ａ－ジメチル－４－オキソ－２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ－ドデカヒドロ－１Ｈ－ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２－ｄ］［１，３］ジオキソール－１０－イル）ベンジル）フェニル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）カルバメートの合成。
【0144】
２，６－ルチジン（１．２ｍＬ、１０．３０ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフラン（１５ｍＬ）中、（２Ｓ，６ａＳ，６ｂＲ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）－１０－（４－（３－アミノベンジル）フェニル）－２，６ｂ－ジフルオロ－７－ヒドロキシ－８ｂ－（２－ヒドロキシアセチル）－６ａ，８ａ－ジメチル－１，２，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ－ドデカヒドロ－４Ｈ－ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２－ｄ］［１，３］ジオキソール－４－オン（１．３７７ｇ、２．２７ｍｍｏｌ）、（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｌ－アラニル－Ｌ－アラニン［ＣＡＳ番号８７５１２－３１－０、Ｃｈｅｍ－Ｉｍｐｅｘ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．から購入したもの］（０．８７８ｇ、２．２９５ｍｍｏｌ）及びＨＡＴＵ（１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロリン酸）（１．３２７ｇ、３．４９ｍｍｏｌ）の室温の溶液に添加した。１５時間後、混合物を、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）を用いて希釈し、１ＮのＨＣｌ水溶液（２×５０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍＬ）、ブライン（５０ｍＬ）を用いて洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。０～１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭのグラジエントを用いたクロマトグラフィー（シリカ、１２０ｇ）溶出によって精製することにより生成物を白色固体として得た（１．９８ｇ、収率９０％）。ＬＣＭＳ（方法ｃ、ＡＰＣＩ、表１）Ｒｔ＝０．９８分、ｍ／ｚ９７０．６（Ｍ＋Ｈ＋）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.83 (s, 1H), 8.06 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.91 - 7.84 (m, 2H), 7.71 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 7.53 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.49 - 7.13 (m, 12H), 6.91 (dt, J = 7.7, 1.4 Hz, 1H), 6.29 (dd, J = 10.2, 1.9 Hz, 1H), 6.14 (q, J = 1.6 Hz, 1H), 5.73 - 5.54 (m, 1H), 5.52 (dd, J = 4.4, 1.8 Hz, 1H), 5.44 (s, 1H), 5.10 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 4.95 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 4.51 (dd, J = 19.5, 6.2 Hz, 1H), 4.37 (p, J = 7.0 Hz, 1H), 4.30 - 4.14 (m, 5H), 4.14 - 4.02 (m, 1H), 3.86 (s, 2H), 2.74 - 2.55 (m, 1H), 2.35 - 2.18 (m, 2H), 2.08 - 1.96 (m, 1H), 1.77 - 1.61 (m, 3H), 1.60 - 1.49 (m, 1H), 1.50 (s, 3H), 1.27 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 1.23 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 0.86 (s, 3H).
【0145】
ステップ２：（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（３－（４－（（２Ｓ，６ａＳ，６ｂＲ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）－８ｂ－（２－（（ジ－ｔｅｒｔ－ブトキシホスホリル）オキシ）アセチル）－２，６ｂ－ジフルオロ－７－ヒドロキシ－６ａ，８ａ－ジメチル－４－オキソ－２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ－ドデカヒドロ－１Ｈ－ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２－ｄ］［１，３］ジオキソール－１０－イル）ベンジル）フェニル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）カルバメートの合成。
【0146】
ジ－ｔｅｒｔ－ブチルＮ，Ｎ－ジエチルホスホラミダイト（１．８ｍＬ、６．０２ｍｍｏｌ）を、（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（３－（４－（（２Ｓ，６ａＳ，６ｂＲ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）－２，６ｂ－ジフルオロ－７－ヒドロキシ－８ｂ－（２－ヒドロキシアセチル）－６ａ，８ａ－ジメチル－４－オキソ－２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ－ドデカヒドロ－１Ｈ－ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２－ｄ］［１，３］ジオキソール－１０－イル）ベンジル）フェニル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）カルバメート（１．９８ｇ、２．０４１ｍｍｏｌ）及びテトラゾール（アセトニトリル中０．４５Ｍ）（１８ｍＬ、８．１０ｍｍｏｌ）の室温の溶液に添加した。５０分後、反応物を過酸化水素（水中３０％、１．２ｍＬ、１１．７５ｍｍｏｌ）を用いて処理した。１０分後、反応物を、１ＭのＮａＳ２Ｏ３水溶液（８０ｍＬ）を用いて処理して、あらゆる未反応の過酸化水素をクエンチした［注意：発熱性］。混合物を、ＥｔＯＡｃ（３×６０ｍｌ）を用いて抽出した。合わせた有機層を、ブライン（５０ｍＬ）を用いて洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。０～１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭのグラジエントを用いたクロマトグラフィー（シリカ、１２０ｇ）溶出によって精製することにより、所望の生成物を白色泡状物として得た（１．８５ｇ、収率７８％）。ＬＣＭ（方法ｄ、ＥＳＩ、表１）Ｒｔ＝１．１２分、ｍ／ｚ１１６２．７（Ｍ＋Ｈ＋）。
【0147】
ステップ３：２－（（２Ｓ，６ａＳ，６ｂＲ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）－１０－（４－（３－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－アミノプロパンアミド）プロパンアミド）ベンジル）フェニル）－２，６ｂ－ジフルオロ－７－ヒドロキシ－６ａ，８ａ－ジメチル－４－オキソ－１，２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ－ドデカヒドロ－８ｂＨ－ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２－ｄ］［１，３］ジオキソール－８ｂ－イル）－２－オキソエチル ジ－ｔｅｒｔ－ブチルリン酸の合成。
【0148】
ピペリジン（１．０ｍｌ、１０．１０ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフラン（１６ｍＬ）中、（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（３－（４－（（２Ｓ，６ａＳ，６ｂＲ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）－８ｂ－（２－（（ジ－ｔｅｒｔ－ブトキシホスホリル）オキシ）アセチル）－２，６ｂ－ジフルオロ－７－ヒドロキシ－６ａ，８ａ－ジメチル－４－オキソ－２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ－ドデカヒドロ－１Ｈ－ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２－ｄ］［１，３］ジオキソール－１０－イル）ベンジル）フェニル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）カルバメート（１．８５４ｇ、１．５９５ｍｍｏｌ）の室温の溶液に添加した。２５分後、溶媒を減圧下で除去した。残留物を、トルエン（３×３０ｍＬ）を用いて繰り返し処理し、それを各処理後に減圧下で除去して、確実にピペリジンを除去した。収率を１００％と仮定し、粗生成物を、さらなる精製を行わずに次のステップに使用した。ＬＣＭＳ（方法ｄ、ＥＳＩ、表１）Ｒｔ＝１．１１分、ｍ／ｚ９４０．７（Ｍ＋Ｈ＋）。
【0149】
ステップ４：２－（（２Ｓ，６ａＳ，６ｂＲ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）－１０－（４－（３－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－（２－ブロモアセトアミド）プロパンアミド）プロパンアミド）ベンジル）フェニル）－２，６ｂ－ジフルオロ－７－ヒドロキシ－６ａ，８ａ－ジメチル－４－オキソ－１，２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ－ドデカヒドロ－８ｂＨ－ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２－ｄ］［１，３］ジオキソール－８ｂ－イル）－２－オキソエチルジ－ｔｅｒｔ－ブチルリン酸の合成。
【0150】
ＥＥＤＱ（２－エトキシ－１－エトキシカルボニル－１，２－ジヒドロキノリン）（１．６３０ｇ、６．５９ｍｍｏｌ）を、ジメチルホルムアミド（４ｍＬ）中、ブロモ酢酸（０．６８０ｇ、４．９０ｍｍｏｌ）の室温の溶液に添加した。カップリングのためにブロモ酢酸を活性化するために混合物を９０分間撹拌した。それとは別に、２－（（２Ｓ，６ａＳ，６ｂＲ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）－１０－（４－（３－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－アミノプロパンアミド）プロパンアミド）ベンジル）フェニル）－２，６ｂ－ジフルオロ－７－ヒドロキシ－６ａ，８ａ－ジメチル－４－オキソ－１，２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ－ドデカヒドロ－８ｂＨ－ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２－ｄ］［１，３］ジオキソール－８ｂ－イル）－２－オキソエチル ジ－ｔｅｒｔ－ブチルリン酸（１．４９９ｇ、１．５９５ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（８ｍＬ）中に溶解させた。この溶液を、活性化されたブロモ酢酸を含有するバイアルに移した。反応が不完全だったので、活性化されたブロモ酢酸の第２の供給量を調製した：ブロモ酢酸（０．３６３ｇ、２．６１ｍｍｏｌ）を、ジメチルホルムアミド（３ｍＬ）中、ＥＥＤＱ（２－エトキシ－１－エトキシカルボニル－１，２－ジヒドロキノリン）（０．８１３ｇ、３．２９ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、７０分間撹拌し、次いで、反応混合物と併せた。１５分後、反応を、ＥｔＯＡｃ（６０ｍＬ）を用いて希釈し、水（２×２０ｍＬ）を用いて洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。０～１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭのグラジエントを用いたクロマトグラフィー（シリカ、８０ｇ）溶出によって精製することにより生成物を白色固体として得た（０．７６０ｇ、収率４５％）。ＬＣＭＳ（方法ｃ、ＥＳＩ、表１）Ｒｔ＝１．０３分、ｍ／ｚ１０６０．６、１０６２．１（Ｍ＋Ｈ＋）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.83 (s, 1H), 8.47 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 8.22 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.49 - 7.43 (m, 1H), 7.41 (t, J = 1.9 Hz, 1H), 7.35 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.32 - 7.23 (m, 3H), 7.19 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 6.91 (dt, J = 7.7, 1.4 Hz, 1H), 6.30 (dd, J = 10.2, 1.9 Hz, 1H), 6.12 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 5.74 - 5.55 (m, 2H), 5.56 (s, 1H), 5.03 - 4.90 (m, 2H), 4.65 (dd, J = 18.0, 9.3 Hz, 1H), 4.34 (dt, J = 15.6, 7.2 Hz, 2H), 4.26 - 4.16 (m, 1H), 3.94 - 3.86 (m, 4H), 3.31 (s, 1H), 2.75 - 2.56 (m, 1H), 2.35 - 2.17 (m, 2H), 2.07 (d, J = 13.2 Hz, 1H), 1.72 (td, J = 13.9, 4.2 Hz, 2H), 1.67 - 1.52 (m, 1H), 1.49 (s, 3H), 1.42 (s, 9H), 1.42 (s, 9H), 1.27 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 1.20 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.89 (s, 3H).
【0151】
ステップ５：２－（（２Ｓ，６ａＳ，６ｂＲ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）－１０－（４－（３－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－（２－ブロモアセトアミド）プロパンアミド）プロパンアミド）ベンジル）フェニル）－２，６ｂ－ジフルオロ－７－ヒドロキシ－６ａ，８ａ－ジメチル－４－オキソ－１，２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ－ドデカヒドロ－８ｂＨ－ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２－ｄ］［１，３］ジオキソール－８ｂ－イル）－２－オキソエチルリン酸二水素の合成。
【0152】
トリフルオロ酢酸（２．５ｍＬ、３２．４ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（５ｍＬ）中、２－（（２Ｓ，６ａＳ，６ｂＲ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）－１０－（４－（３－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－（２－ブロモアセトアミド）プロパンアミド）プロパンアミド）ベンジル）フェニル）－２，６ｂ－ジフルオロ－７－ヒドロキシ－６ａ，８ａ－ジメチル－４－オキソ－１，２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ－ドデカヒドロ－８ｂＨ－ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２－ｄ］［１，３］ジオキソール－８ｂ－イル）－２－オキソエチル ジ－ｔｅｒｔ－ブチルリン酸（０．７６０ｇ、０．７１６ｍｍｏｌ）の室温の溶液に添加した。開口容器中で１５分間撹拌した後、溶媒を減圧下で除去して泡状物を得、それを３：１アセトニトリル／水（１６ｍＬ）中に溶解させ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｃ１８（２）１０ミクロンカラム（２５０×５０ｍｍ）での分取ＨＰＬＣによって精製した。アセトニトリル（Ａ）及び水中１％トリフルオロ酢酸（Ｂ）のグラジエントを９０ｍＬ／分の流量で使用した（０～５．０分、１５％Ａ、５．０～２０．０分、リニアグラジエント１５～９５％Ａ、５分間の保持）。生成物画分をフリーズドライして表題化合物を白色固体として得た（０．２９１ｇ、収率４３％）。ＬＣＭＳ（方法ｃ、ＡＰＣＩ、表１）Ｒｔ＝０．８４分、ｍ／ｚ９４８．４、９５０．４（Ｍ＋Ｈ＋）。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 9.83 (s, 1H), 8.46 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 8.21 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.46 (ddd, J = 8.2, 2.2, 1.1 Hz, 1H), 7.39 (t, J = 1.9 Hz, 1H), 7.38 - 7.33 (m, 2H), 7.29 - 7.23 (m, 3H), 7.19 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 6.91 (dt, J = 7.7, 1.3 Hz, 1H), 6.30 (dd, J = 10.1, 1.9 Hz, 1H), 6.13 (dt, J = 2.6, 1.3 Hz, 1H), 5.64 (dddd, J = 48.3, 11.1, 6.4, 1.9 Hz, 2H), 5.53 (s, 1H), 4.96 - 4.89 (m, 2H), 4.59 (dd, J = 18.1, 8.4 Hz, 1H), 4.34 (dp, J = 23.2, 7.1 Hz, 2H), 4.21 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 3.93 - 3.88 (m, 4H), 2.72 - 2.61 (m, 1H), 2.32 - 2.20 (m, 2H), 2.09 - 2.03 (m, 1H), 1.72 (dd, J = 12.8, 6.3 Hz, 2H), 1.68 (s, 1H), 1.57 - 1.49 (m, 1H), 1.49 (s, 3H), 1.27 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 1.21 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 0.88 (s, 3H).
【0153】
９．２．４．コンジュゲーション及び分析方法
【0154】
９．２．４．１．低分子分析手順
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及びＬＣＭＳ分析データは、実験内で又は表３に列挙されている条件を参照して詳述される。
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及びＬＣＭＳ分析データは、実験内で又は表３に列挙されている条件を参照して詳述される。
【0155】
【表3】
【0156】
９．２．４．２．ＣＤ１９リン酸化ＧＲＭアゴニストＡＤＣ
約５０ｍｇ／ｍＬの濃度の実施例１のＣＤ１９抗体（ＣＤ１９ ｍＡｂ）１７０．４ｇを、ＰＢＥ（１２５ｍＭのリン酸、６ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．３）緩衝剤を用いて１：１ｗ／ｗに希釈し、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）（２．６当量、０．８４７ｇ、注射用水（ＷＦＩ）中２５ｍＭの溶液）を用い、約４℃、窒素下で一晩、部分的に還元した。次いで、還元された抗体と、式Ｖ：
約５０ｍｇ／ｍＬの濃度の実施例１のＣＤ１９抗体（ＣＤ１９ ｍＡｂ）１７０．４ｇを、ＰＢＥ（１２５ｍＭのリン酸、６ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．３）緩衝剤を用いて１：１ｗ／ｗに希釈し、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）（２．６当量、０．８４７ｇ、注射用水（ＷＦＩ）中２５ｍＭの溶液）を用い、約４℃、窒素下で一晩、部分的に還元した。次いで、還元された抗体と、式Ｖ：
【0157】
【化22】
【0158】
９．２．４．３質量分析
ＡＤＣ試料を完全に還元した後にＭＳ分析を行った。使用した質量分析条件は以下の通りである：ＨＰＬＣカラム＝Ｗａｔｅｒｓ ＢｉｏＲｅｓｏｌｖｅ ＲＰ ｍＡｂ ポリフェニル４５０Ａ ２．７μｍ、１５０×２．１ｍｍ；移動相Ａ：水中０．１％ジフルオロ酢酸；移動相Ｂ：アセトニトリル中０．１％ジフルオロ酢酸；流量：０．４ｍＬ／分；グラジエント：２０％Ｂで開始、０～１２分、２０～４５％Ｂ、１４～１６分、４５～６０％Ｂ、１６～１８分、６０～１００％Ｂ、４分にわたって２０％Ｂに再平衡化；カラム温度：８０℃；ＭＳイオン化源：ＥＳＩ。
ＡＤＣ試料を完全に還元した後にＭＳ分析を行った。使用した質量分析条件は以下の通りである：ＨＰＬＣカラム＝Ｗａｔｅｒｓ ＢｉｏＲｅｓｏｌｖｅ ＲＰ ｍＡｂ ポリフェニル４５０Ａ ２．７μｍ、１５０×２．１ｍｍ；移動相Ａ：水中０．１％ジフルオロ酢酸；移動相Ｂ：アセトニトリル中０．１％ジフルオロ酢酸；流量：０．４ｍＬ／分；グラジエント：２０％Ｂで開始、０～１２分、２０～４５％Ｂ、１４～１６分、４５～６０％Ｂ、１６～１８分、６０～１００％Ｂ、４分にわたって２０％Ｂに再平衡化；カラム温度：８０℃；ＭＳイオン化源：ＥＳＩ。
【0159】
各サブユニットの還元逆相（Ａ２８０）クロマトグラフ及びデコンボリューションされた質量スペクトルを生成した。図１６を参照されたい。薬物リンカー分子がゼロ又は１つ付着した軽鎖及び薬物リンカー分子がゼロ、１つ、２つ又は３つ付着した重鎖に対応するピークを分離し、同定した。
【0160】
９．２．４．４．ＣＤ１９脱リン酸ＧＲＭアゴニストＡＤＣ
約５０ｍｇ／ｍＬの濃度の実施例１のＣＤ１９抗体（ＣＤ１９ ｍＡｂ）２．８２ｇをＰＢＥ（１２５ｍＭのリン酸、６ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．３）緩衝剤中に１：１ｗ／ｗで希釈し、ＴＣＥＰ（２．５６当量、０．０１４１ｇ、ＷＦＩ中４．９３ｍＭの溶液）を用い、約４℃、窒素下で一晩、部分的に還元した。次いで、還元された抗体と、式ＶＩ
約５０ｍｇ／ｍＬの濃度の実施例１のＣＤ１９抗体（ＣＤ１９ ｍＡｂ）２．８２ｇをＰＢＥ（１２５ｍＭのリン酸、６ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．３）緩衝剤中に１：１ｗ／ｗで希釈し、ＴＣＥＰ（２．５６当量、０．０１４１ｇ、ＷＦＩ中４．９３ｍＭの溶液）を用い、約４℃、窒素下で一晩、部分的に還元した。次いで、還元された抗体と、式ＶＩ
【0161】
【化23】
【0162】
９．３
［実施例３］ 抗体及びＡＤＣの特徴付け
実施例２、セクション８．２．４．２のＣＤ１９リン酸化ＧＲＭアゴニストＡＤＣ（ＡＤＣ－１）及びその親脱フコシル化抗体（ＣＤ１９ ｍＡｂとも称される）の結合及び細胞内活性を特徴付けた。ＡＤＣ－１及びＣＤ１９ ｍＡｂは、複数のＢ細胞リンパ腫細胞株の表面上に内因性に発現されるＣＤ１９に結合する。ＡＤＣ－１は、複数のＢ細胞悪性腫瘍細胞株に対する効力の高い抗増殖効果及びＡＤＣＣ活性を引き出した。さらに、ＡＤＣ－１は、Ｆ１５８又はＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａバリアントを発現するＮＦＡＴ ＡＤＣＣレポーター細胞を同様の効力で活性化する。ＡＤＣ－１は、マウス又はラットＣＤ１９に対しては無視できる結合を示したが、一方、ヒト及びカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＣＤ１９に対しては親和性の高い結合を示し、また、ヒト又はｃｙｎｏ ＣＤ１９を発現するＧＲＥレポーター細胞株を活性化した。
［実施例３］ 抗体及びＡＤＣの特徴付け
実施例２、セクション８．２．４．２のＣＤ１９リン酸化ＧＲＭアゴニストＡＤＣ（ＡＤＣ－１）及びその親脱フコシル化抗体（ＣＤ１９ ｍＡｂとも称される）の結合及び細胞内活性を特徴付けた。ＡＤＣ－１及びＣＤ１９ ｍＡｂは、複数のＢ細胞リンパ腫細胞株の表面上に内因性に発現されるＣＤ１９に結合する。ＡＤＣ－１は、複数のＢ細胞悪性腫瘍細胞株に対する効力の高い抗増殖効果及びＡＤＣＣ活性を引き出した。さらに、ＡＤＣ－１は、Ｆ１５８又はＶ１５８ ＦｃγＲＩＩＩａバリアントを発現するＮＦＡＴ ＡＤＣＣレポーター細胞を同様の効力で活性化する。ＡＤＣ－１は、マウス又はラットＣＤ１９に対しては無視できる結合を示したが、一方、ヒト及びカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＣＤ１９に対しては親和性の高い結合を示し、また、ヒト又はｃｙｎｏ ＣＤ１９を発現するＧＲＥレポーター細胞株を活性化した。
【0163】
９．３．１．材料及び方法
【0164】
９．３．１．１．抗体、タンパク質及び化合物
ヒト化抗ＣＤ１９抗体（ＣＤ１９ ｍＡｂ）を、ＰｒｏＢｉｏｇｅｎ技術を用いて脱フコシル化した。ＡＤＣ－１を、ＣＤ１９ ｍＡｂと式Ｖの薬物リンカーをコンジュゲートすることによって作出した。ＣＤ１９ ｍＡｂ及びＡＤＣ－１のＧＬＰ材料を全ての実験に使用した。試験した陰性対照には、脱フコシル化抗破傷風トキソイド抗体ＡＢ０９５（アイソタイプｍＡｂ）及び式Ｖの薬物リンカーとコンジュゲートしたＡＢ０９５からなるそのＡＤＣ（アイソタイプ－ＧＲＭ）が含まれる。分析した化合物には、式ＩＶのＧＲＭ、デキサメタゾン（Ｃｌｉｎｉｇｅｎ、ｃａｔ＃００６４１－０３６７－２５）及びプレドニゾロン（Ｃｌｉｎｉｇｅｎ、ｃａｔ＃４４５２３－０１８２－０８）が含まれる。
ヒト化抗ＣＤ１９抗体（ＣＤ１９ ｍＡｂ）を、ＰｒｏＢｉｏｇｅｎ技術を用いて脱フコシル化した。ＡＤＣ－１を、ＣＤ１９ ｍＡｂと式Ｖの薬物リンカーをコンジュゲートすることによって作出した。ＣＤ１９ ｍＡｂ及びＡＤＣ－１のＧＬＰ材料を全ての実験に使用した。試験した陰性対照には、脱フコシル化抗破傷風トキソイド抗体ＡＢ０９５（アイソタイプｍＡｂ）及び式Ｖの薬物リンカーとコンジュゲートしたＡＢ０９５からなるそのＡＤＣ（アイソタイプ－ＧＲＭ）が含まれる。分析した化合物には、式ＩＶのＧＲＭ、デキサメタゾン（Ｃｌｉｎｉｇｅｎ、ｃａｔ＃００６４１－０３６７－２５）及びプレドニゾロン（Ｃｌｉｎｉｇｅｎ、ｃａｔ＃４４５２３－０１８２－０８）が含まれる。
【0165】
９．３．１．２．細胞培養
がん細胞株Ｒａｊｉ（バーキットリンパ腫；ＡＴＣＣ、ｃａｔ＃ＣＣＬ－８６）、ＳＵＰ－Ｂ１５（急性リンパ芽球性白血病；ＡＴＣＣ、ｃａｔ＃ＣＲＬ－１９２９）、ＲＳ４；１１（急性リンパ芽球性白血病；ＡＴＣＣ、ｃａｔ＃ＣＲＬ－１８７３）、ＳＵ－ＤＨＬ－６（びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫；ＡＴＣＣ、ｃａｔ＃ＣＲＬ－２９５９）及びＨＣＴ１１６（結腸直腸がん；ＡＴＣＣ、ｃａｔ＃ＣＣＬ－２４７）を、１０％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃２６１４００７９）を補充したＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃Ａ１０４９１０１）中で培養した。がん細胞株ＯＣＩ－ＬＹ１９（びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫；ＤＳＭＺ、ｃａｔ＃ＡＣＣ ５２８）を、乏血小板血漿由来の滅菌濾過された１０％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ｃａｔ＃Ｐ２９１８－１００ＭＬ）を伴うＩＭＤＭ培地中で培養した。２９３Ｔ（ＡＴＣＣ、ｃａｔ＃ＣＲＬ－３２１６）細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で培養した。全ての細胞を加湿チャンバー内、３７℃、５％ＣＯ２で培養する。
がん細胞株Ｒａｊｉ（バーキットリンパ腫；ＡＴＣＣ、ｃａｔ＃ＣＣＬ－８６）、ＳＵＰ－Ｂ１５（急性リンパ芽球性白血病；ＡＴＣＣ、ｃａｔ＃ＣＲＬ－１９２９）、ＲＳ４；１１（急性リンパ芽球性白血病；ＡＴＣＣ、ｃａｔ＃ＣＲＬ－１８７３）、ＳＵ－ＤＨＬ－６（びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫；ＡＴＣＣ、ｃａｔ＃ＣＲＬ－２９５９）及びＨＣＴ１１６（結腸直腸がん；ＡＴＣＣ、ｃａｔ＃ＣＣＬ－２４７）を、１０％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃２６１４００７９）を補充したＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃Ａ１０４９１０１）中で培養した。がん細胞株ＯＣＩ－ＬＹ１９（びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫；ＤＳＭＺ、ｃａｔ＃ＡＣＣ ５２８）を、乏血小板血漿由来の滅菌濾過された１０％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ｃａｔ＃Ｐ２９１８－１００ＭＬ）を伴うＩＭＤＭ培地中で培養した。２９３Ｔ（ＡＴＣＣ、ｃａｔ＃ＣＲＬ－３２１６）細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で培養した。全ての細胞を加湿チャンバー内、３７℃、５％ＣＯ２で培養する。
【0166】
９．３．１．３．工学的に操作された細胞株の生成
ヒトＣＤ１９を発現するＫ５６２ ＧＲＥルシフェラーゼレポーター細胞株をＡｂｂＶｉｅにおいて生成した。簡単に述べると、Ｋ５６２細胞を、完全成長培地［Ｌ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃１１８３５－０３０）、１０％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、ｃａｔ＃２６１４０－０７９）、１％ピルビン酸Ｎａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、ｃａｔ＃１１３６０－０７０）及び１％ＭＥＭ ＮＥＡＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、ｃａｔ＃１１１１４０－５０）を補充したＲＰＭＩ １６４０］２ｍＬを伴う６ウェルディッシュ（Ｃｏｓｔａｒ、ｃａｔ＃３５１６）に、ウェル当たり細胞５００，０００個で播種し、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間置いた。翌日、ｐＧＬ４．３６［Ｌｕｃ２Ｐ／ＭＭＴＶ／Ｈｙｇｒｏ］（Ｐｒｏｍｅｇａ ｃａｔ＃Ｅ３１６）１．５μｇ及びＰＬＵＳ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃１０９６４－０２１）３μＬをＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃３１９８５－０７０）２４４μＬ中に希釈し、室温で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、希釈したＤＮＡ溶液を、１：１Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃９４７５６）（１３．２μＬ＋Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ ２５６．８μＬ）と一緒にプレインキュベートし、室温で２５分間インキュベートして、ＤＮＡ－Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ複合体を形成した。インキュベーション後、ＤＮＡ－Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ複合体５００μＬを、細胞を含有するウェルに直接添加した。Ｋ５６２細胞へのトランスフェクションを３７℃、５％ＣＯ２で２４時間にわたって行った。インキュベーション後、細胞を、ＰＢＳ ３ｍＬを用いて洗浄し、１２５μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃１０６８７－０１０）を含有する完全成長培地を用い、２週間にわたって選択を行った。
ヒトＣＤ１９を発現するＫ５６２ ＧＲＥルシフェラーゼレポーター細胞株をＡｂｂＶｉｅにおいて生成した。簡単に述べると、Ｋ５６２細胞を、完全成長培地［Ｌ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃１１８３５－０３０）、１０％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、ｃａｔ＃２６１４０－０７９）、１％ピルビン酸Ｎａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、ｃａｔ＃１１３６０－０７０）及び１％ＭＥＭ ＮＥＡＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、ｃａｔ＃１１１１４０－５０）を補充したＲＰＭＩ １６４０］２ｍＬを伴う６ウェルディッシュ（Ｃｏｓｔａｒ、ｃａｔ＃３５１６）に、ウェル当たり細胞５００，０００個で播種し、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間置いた。翌日、ｐＧＬ４．３６［Ｌｕｃ２Ｐ／ＭＭＴＶ／Ｈｙｇｒｏ］（Ｐｒｏｍｅｇａ ｃａｔ＃Ｅ３１６）１．５μｇ及びＰＬＵＳ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃１０９６４－０２１）３μＬをＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃３１９８５－０７０）２４４μＬ中に希釈し、室温で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、希釈したＤＮＡ溶液を、１：１Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃９４７５６）（１３．２μＬ＋Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ ２５６．８μＬ）と一緒にプレインキュベートし、室温で２５分間インキュベートして、ＤＮＡ－Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ複合体を形成した。インキュベーション後、ＤＮＡ－Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ複合体５００μＬを、細胞を含有するウェルに直接添加した。Ｋ５６２細胞へのトランスフェクションを３７℃、５％ＣＯ２で２４時間にわたって行った。インキュベーション後、細胞を、ＰＢＳ ３ｍＬを用いて洗浄し、１２５μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃１０６８７－０１０）を含有する完全成長培地を用い、２週間にわたって選択を行った。
【0167】
Ｋ５６２ ｐＧＬ４．３６［Ｌｕｃ２Ｐ／ＭＭＴＶ／Ｈｙｇｒｏ］細胞を回収し、完全成長培地（ＲＰＭＩ＋Ｌ－Ｇｌｕ、１０％ＦＢＳ、１％ピルビン酸Ｎａ及び１％ＭＥＭ ＮＥＡＡ）１ｍＬを伴う１５ｍＬの円錐管（Ｃｏｓｔａｒ、ｃａｔ＃３５１６）にウェル当たり細胞２５０，０００個で播種した。ヒトＣＤ１９（Ｏｒｉｇｅｎｅ、＃ＲＣ２３０２６７）３μｇ及びＰＬＵＳ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃１０９６４－０２１）３μＬをＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃３１９８５－０７０）２４４μＬ中に希釈し、室温で５分間インキュベートした。インキュベーション後、希釈したＤＮＡ溶液を、１：１Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃９４７５６）（１１μＬ＋Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ ２３９μＬ）と一緒にプレインキュベートし、室温で１５分間インキュベートして、ＤＮＡ－Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ複合体を形成した。続いて、ＤＮＡ－Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ複合体５００μＬを、細胞を含有する円錐管に直接添加した。細胞とＤＮＡ－リポフェクタミンを混合し、６ウェルディッシュ（Ｃｏｓｔａｒ、ｃａｔ＃３５１６）に播種し、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。２４時間のインキュベーション後、細胞の選択を、１２５μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃１０６８７－０１０）及び２２５μｇ／ｍＬのＧ４１８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃１０１３１－０２７）を含有する完全成長培地２ｍｌを用いて２週間にわたって行った。
【0168】
９．３．１．４．細胞増殖アッセイ
接着細胞（２９３Ｔ及びＨＣＴ１１６）をトリプシン処理によって剥離させた。３８４ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ｃａｔ＃３７６４）、完全ＲＰＭＩ １６４０ ４０μＬ中、ウェル当たり細胞１０００～２０００個をプレーティングした。接着細胞を一晩付着させた。翌日、細胞を、１０μＬ中、示されている濃度の薬物を用いて処理し、３７℃、５％ＣＯ２で５日間インキュベートする。終点において、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ｃａｔ＃Ｇ７５７３）をウェル当たり４０μＬで添加した。プレートをＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダーにおいてＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅの設定で読み取った。細胞生存率を無処理の対照に対するパーセンテージとして表した。
接着細胞（２９３Ｔ及びＨＣＴ１１６）をトリプシン処理によって剥離させた。３８４ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ｃａｔ＃３７６４）、完全ＲＰＭＩ １６４０ ４０μＬ中、ウェル当たり細胞１０００～２０００個をプレーティングした。接着細胞を一晩付着させた。翌日、細胞を、１０μＬ中、示されている濃度の薬物を用いて処理し、３７℃、５％ＣＯ２で５日間インキュベートする。終点において、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ｃａｔ＃Ｇ７５７３）をウェル当たり４０μＬで添加した。プレートをＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダーにおいてＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅの設定で読み取った。細胞生存率を無処理の対照に対するパーセンテージとして表した。
【0169】
９．３．１．５．免疫蛍光法
ＲＳ４；１１細胞株をＶ底プレート（Ｃｏｓｔａｒ Ｃａｔ＃３８９４）にウェル当たり細胞５０，０００個でプレーティングした。細胞を、ＰＢＳ＋５％正常ヒト血清（Ｓｉｇｍａ ｃａｔ＃Ｈ４５２２）及び２％ＦＢＳを用いてＦｃブロッキングした。細胞を洗浄し、染色緩衝剤（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）中に再懸濁した。細胞を、染色緩衝剤中５μｇ／ｍＬの、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ６４７色素とコンジュゲートした抗ｈｕ－ＣＤ１９抗体（ＣＤ１９ ｍＡｂ）を用いて染色し、氷上で１時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を、２％ＦＢＳを含有するＰＢＳを用いて３回洗浄し、３７℃で０．５時間、１時間、３時間及び２４時間追跡して、内部移行を誘導し、Ｔ＝０時点対照として氷上で染色した細胞と比較した。次いで、製造者の指示を使用して細胞を固定し、透過処理した（ＢＤ、Ｃａｔ＃５５４７１４）。細胞を、１％サポニン＋２％マウス血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ＃３８８１）を含有する染色緩衝剤を用いてブロッキングし、２μｇ／ｍＬの、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８とコンジュゲートしたＬＡＭＰ１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ＃３２８６１０）を用いて４℃で一晩染色した。細胞を、２％ＦＢＳを含有するＰＢＳ中で３回洗浄した。細胞をイメージング培地（ＦｌｕｒｏＢｒｉｔｅ：Ｇｉｂｃｏ ｃａｔ＃Ａ１８９６７０１）中に再懸濁させ、ガラス底のイメージングプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃１６０３７６）に移し、ＩＭＸ Ｍｉｃｒｏ Ｃｏｎｆｏｃａｌ ｉｍａｇｅｒで分析した。
ＲＳ４；１１細胞株をＶ底プレート（Ｃｏｓｔａｒ Ｃａｔ＃３８９４）にウェル当たり細胞５０，０００個でプレーティングした。細胞を、ＰＢＳ＋５％正常ヒト血清（Ｓｉｇｍａ ｃａｔ＃Ｈ４５２２）及び２％ＦＢＳを用いてＦｃブロッキングした。細胞を洗浄し、染色緩衝剤（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）中に再懸濁した。細胞を、染色緩衝剤中５μｇ／ｍＬの、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ６４７色素とコンジュゲートした抗ｈｕ－ＣＤ１９抗体（ＣＤ１９ ｍＡｂ）を用いて染色し、氷上で１時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を、２％ＦＢＳを含有するＰＢＳを用いて３回洗浄し、３７℃で０．５時間、１時間、３時間及び２４時間追跡して、内部移行を誘導し、Ｔ＝０時点対照として氷上で染色した細胞と比較した。次いで、製造者の指示を使用して細胞を固定し、透過処理した（ＢＤ、Ｃａｔ＃５５４７１４）。細胞を、１％サポニン＋２％マウス血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ＃３８８１）を含有する染色緩衝剤を用いてブロッキングし、２μｇ／ｍＬの、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８とコンジュゲートしたＬＡＭＰ１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ＃３２８６１０）を用いて４℃で一晩染色した。細胞を、２％ＦＢＳを含有するＰＢＳ中で３回洗浄した。細胞をイメージング培地（ＦｌｕｒｏＢｒｉｔｅ：Ｇｉｂｃｏ ｃａｔ＃Ａ１８９６７０１）中に再懸濁させ、ガラス底のイメージングプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃１６０３７６）に移し、ＩＭＸ Ｍｉｃｒｏ Ｃｏｎｆｏｃａｌ ｉｍａｇｅｒで分析した。
【0170】
９．３．１．６．免疫ブロッティング
ＳＵ－ＤＨＬ－６細胞を、アイソタイプｍＡｂ又はＣＤ１９ ｍＡｂを用いて１時間処理し、次いで、１μｇ／ｍｌの抗ＩｇＭを用いて０分間、５分間、１５分間又は３０分間にわたって刺激した。細胞を、氷冷したＰＢＳを用いて２回洗浄することによって回収し、次いで、１×Ｈａｌｔ（商標）プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃７８４４６）を補充したＲＩＰＡ溶解緩衝剤（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ｃａｔ＃Ｒ０２７８）中で溶解させた。溶解物のタンパク質濃度をＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃２３２２７）を用いて測定した。溶解物１０～２０μｇを４～１２％グラジエントゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ＮＷ０４１２０ＢＯＸ）で分離し、ニトロセルロースメンブレン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ＩＢ２３００１）に転写した。メンブレンを、製造者により提唱された濃度の一次抗体と一緒に４℃で一晩インキュベートした。この試験に使用した一次抗体には、ホスホ－ＡＫＴ Ｓｅｒ４７３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｃａｔ＃４０６０）又はＧＡＰＤＨ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｃａｔ＃９７１６６）が含まれる。メンブレンを、１×ＰＢＳＴ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｃａｔ＃９８０９）を用いて３回洗浄し、続いて、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ｃａｔ＃１１５－０３５－００３）又はＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ｃａｔ＃１１１－０３５－００３）と一緒に室温で１時間インキュベートした。メンブレンを、１×ＰＢＳＴを用いて３回洗浄し、次いで、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃３２１０６）と一緒にインキュベートした。次いで、メンブレンに対してＡｚｕｒｅ Ｉｍａｇｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃ６００を用いて検出を行った。
ＳＵ－ＤＨＬ－６細胞を、アイソタイプｍＡｂ又はＣＤ１９ ｍＡｂを用いて１時間処理し、次いで、１μｇ／ｍｌの抗ＩｇＭを用いて０分間、５分間、１５分間又は３０分間にわたって刺激した。細胞を、氷冷したＰＢＳを用いて２回洗浄することによって回収し、次いで、１×Ｈａｌｔ（商標）プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃７８４４６）を補充したＲＩＰＡ溶解緩衝剤（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ｃａｔ＃Ｒ０２７８）中で溶解させた。溶解物のタンパク質濃度をＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃２３２２７）を用いて測定した。溶解物１０～２０μｇを４～１２％グラジエントゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ＮＷ０４１２０ＢＯＸ）で分離し、ニトロセルロースメンブレン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ＩＢ２３００１）に転写した。メンブレンを、製造者により提唱された濃度の一次抗体と一緒に４℃で一晩インキュベートした。この試験に使用した一次抗体には、ホスホ－ＡＫＴ Ｓｅｒ４７３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｃａｔ＃４０６０）又はＧＡＰＤＨ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｃａｔ＃９７１６６）が含まれる。メンブレンを、１×ＰＢＳＴ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｃａｔ＃９８０９）を用いて３回洗浄し、続いて、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ｃａｔ＃１１５－０３５－００３）又はＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ｃａｔ＃１１１－０３５－００３）と一緒に室温で１時間インキュベートした。メンブレンを、１×ＰＢＳＴを用いて３回洗浄し、次いで、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃３２１０６）と一緒にインキュベートした。次いで、メンブレンに対してＡｚｕｒｅ Ｉｍａｇｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃ６００を用いて検出を行った。
【0171】
９．３．１．７．グルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）活性化アッセイ
Ｋ５６２親ＧＲＥ細胞（ｐＧＬ４．３６［ｌｕｃ２Ｐ／ＭＭＴＶ／Ｈｙｇｒｏ］）及びＫ５６２ヒトＣＤ１９ ＧＲＥ細胞（ｐＧＬ４．３６［ｌｕｃ２Ｐ／ＭＭＴＶ／Ｈｙｇｒｏ］）又はＫ５６２カニクイザルＣＤ１９ ＧＲＥ細胞（ｐＧＬ４．３６［ｌｕｃ２Ｐ／ＭＭＴＶ／Ｈｙｇｒｏ］）を９６ウェル組織培養処理済み白色プレート（Ｃｏｓｔａｒ、ｃａｔ＃３９１７）に、アッセイ培地（１×ＲＰＭＩ＋Ｌ－Ｇｌｕ、１％ＣＳＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、ｃａｔ＃１２６７６－０２９）、１％ピルビン酸Ｎａ及び１％ＭＥＡＡ）７５μＬ中、ウェル当たり細胞５０，０００個でプレーティングした。ＧＲＥ Ｋ５６２親細胞又はヒトＣＤ１９を発現する細胞及びカニクイザルＣＤ１９を発現する細胞を、アッセイ培地中に４倍段階希釈したＣＤ１９－ＧＲＭ ２５μＬを用いて処理し、３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。１００ｎＭのデキサメタゾンを陽性対照としてこれらのアッセイに加えた。７２時間のインキュベーション後、細胞を、Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ ｃａｔ＃Ｅ２９２０）１００μＬを用いて１０分間処理し、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して発光について分析した。用量－応答データを、非線形回帰を使用してＳ字状曲線に当てはめ、ＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ ９．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いて算出した。
Ｋ５６２親ＧＲＥ細胞（ｐＧＬ４．３６［ｌｕｃ２Ｐ／ＭＭＴＶ／Ｈｙｇｒｏ］）及びＫ５６２ヒトＣＤ１９ ＧＲＥ細胞（ｐＧＬ４．３６［ｌｕｃ２Ｐ／ＭＭＴＶ／Ｈｙｇｒｏ］）又はＫ５６２カニクイザルＣＤ１９ ＧＲＥ細胞（ｐＧＬ４．３６［ｌｕｃ２Ｐ／ＭＭＴＶ／Ｈｙｇｒｏ］）を９６ウェル組織培養処理済み白色プレート（Ｃｏｓｔａｒ、ｃａｔ＃３９１７）に、アッセイ培地（１×ＲＰＭＩ＋Ｌ－Ｇｌｕ、１％ＣＳＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、ｃａｔ＃１２６７６－０２９）、１％ピルビン酸Ｎａ及び１％ＭＥＡＡ）７５μＬ中、ウェル当たり細胞５０，０００個でプレーティングした。ＧＲＥ Ｋ５６２親細胞又はヒトＣＤ１９を発現する細胞及びカニクイザルＣＤ１９を発現する細胞を、アッセイ培地中に４倍段階希釈したＣＤ１９－ＧＲＭ ２５μＬを用いて処理し、３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。１００ｎＭのデキサメタゾンを陽性対照としてこれらのアッセイに加えた。７２時間のインキュベーション後、細胞を、Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ ｃａｔ＃Ｅ２９２０）１００μＬを用いて１０分間処理し、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して発光について分析した。用量－応答データを、非線形回帰を使用してＳ字状曲線に当てはめ、ＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ ９．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いて算出した。
【0172】
９．３．１．８．ＮＦＡＴ ＡＤＣＣレポーターアッセイ
ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイ（Ｖ及びＦバリアント；Ｐｒｏｍｅｇａ、ｃａｔ＃Ｇ７０１０及びＧ９７９０）を製造者のプロトコールに従い、軽微な改変を伴って実施した。簡単に述べると、標的細胞株Ｒａｊｉを、ＡＤＣＣアッセイ緩衝剤（４％低ＩｇＧ血清を含有するＲＰＭＩ培地）５μＬ中に、ウェル当たり細胞２５００個でプレーティングした。抗体を、ＡＤＣＣアッセイ緩衝剤中に力価設定し、示されている抗体濃度で５μＬを添加した。Ｖバリアントキット及びＦバリアントキットからのエフェクター細胞をＡＤＣＣアッセイ緩衝剤中に再懸濁させ、ウェル当たり５μＬで添加して、エフェクター対標的細胞比６：１を実現した。標的細胞－抗体混合物を、Ｖバリアントを発現するエフェクター細胞及びＦバリアントを発現するエフェクター細胞と一緒に３７℃でそれぞれ６時間及び２４時間インキュベートした。終点において、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅａｇｅｎｔ １５μＬを添加し、ルシフェラーゼ活性を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダーを用いて測定した。
ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイ（Ｖ及びＦバリアント；Ｐｒｏｍｅｇａ、ｃａｔ＃Ｇ７０１０及びＧ９７９０）を製造者のプロトコールに従い、軽微な改変を伴って実施した。簡単に述べると、標的細胞株Ｒａｊｉを、ＡＤＣＣアッセイ緩衝剤（４％低ＩｇＧ血清を含有するＲＰＭＩ培地）５μＬ中に、ウェル当たり細胞２５００個でプレーティングした。抗体を、ＡＤＣＣアッセイ緩衝剤中に力価設定し、示されている抗体濃度で５μＬを添加した。Ｖバリアントキット及びＦバリアントキットからのエフェクター細胞をＡＤＣＣアッセイ緩衝剤中に再懸濁させ、ウェル当たり５μＬで添加して、エフェクター対標的細胞比６：１を実現した。標的細胞－抗体混合物を、Ｖバリアントを発現するエフェクター細胞及びＦバリアントを発現するエフェクター細胞と一緒に３７℃でそれぞれ６時間及び２４時間インキュベートした。終点において、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅａｇｅｎｔ １５μＬを添加し、ルシフェラーゼ活性を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダーを用いて測定した。
【0173】
９．３．１．９．ＰＢＭＣ共培養ＡＤＣＣアッセイ
標的細胞株（ＲＳ４；１１、Ｒａｊｉ及びＫＡＲＰＡＳ４２２）を、ＰＢＳを用いて洗浄し、ＰＢＳ中１μＭのＣＦＳＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃Ｃ３４５５４）を用いて３７℃で５分間にわたって標識を行った。次いで、標識された標的細胞を、１０％ＦＢＳを含有する培地を用いて３回洗浄した。５０μＬ中２０，０００個の標識された標的細胞をＶ形９６ウェルプレートにプレーティングした。抗体及びＡＤＣを培養培地中に力価設定し、１０μＬを添加して、示されている最終濃度を実現した。正常なドナー（ＡｌｌＣｅｌｌｓ）由来のＰＭＢＣを４０μＬ中、エフェクター対標的細胞比２０：１で添加し、細胞を３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を、ＰＢＳを用いて１回洗浄し、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｃａｔ＃Ｌ３４９５５）を用いて室温で３０分にわたって染色を行い、次いで、氷冷したＰＢＳ ２００μＬを用いて１回洗浄した。細胞を、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドを用いて１５分にわたって固定し、次いで、ＰＢＳ ２００μＬを用いて１回洗浄した。固定された細胞を、ＰＢＳ １００μＬに再懸濁させ、Ｓｔｒａｔｅｄｉｇｍ Ｓ１０００ＥＯＮフローサイトメーターでの分析を行うまで４℃で保管した。Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｖｉｏｌｅｔ色素陽性細胞のパーセンテージを捕捉し、％特異的溶解を、各処理条件におけるＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｖｉｏｌｅｔ陽性細胞のパーセンテージを、エフェクター細胞及び標的細胞のみを含有する無処理の対照を用いて引き算することによって算出した。
標的細胞株（ＲＳ４；１１、Ｒａｊｉ及びＫＡＲＰＡＳ４２２）を、ＰＢＳを用いて洗浄し、ＰＢＳ中１μＭのＣＦＳＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃Ｃ３４５５４）を用いて３７℃で５分間にわたって標識を行った。次いで、標識された標的細胞を、１０％ＦＢＳを含有する培地を用いて３回洗浄した。５０μＬ中２０，０００個の標識された標的細胞をＶ形９６ウェルプレートにプレーティングした。抗体及びＡＤＣを培養培地中に力価設定し、１０μＬを添加して、示されている最終濃度を実現した。正常なドナー（ＡｌｌＣｅｌｌｓ）由来のＰＭＢＣを４０μＬ中、エフェクター対標的細胞比２０：１で添加し、細胞を３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を、ＰＢＳを用いて１回洗浄し、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｃａｔ＃Ｌ３４９５５）を用いて室温で３０分にわたって染色を行い、次いで、氷冷したＰＢＳ ２００μＬを用いて１回洗浄した。細胞を、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドを用いて１５分にわたって固定し、次いで、ＰＢＳ ２００μＬを用いて１回洗浄した。固定された細胞を、ＰＢＳ １００μＬに再懸濁させ、Ｓｔｒａｔｅｄｉｇｍ Ｓ１０００ＥＯＮフローサイトメーターでの分析を行うまで４℃で保管した。Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｖｉｏｌｅｔ色素陽性細胞のパーセンテージを捕捉し、％特異的溶解を、各処理条件におけるＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｖｉｏｌｅｔ陽性細胞のパーセンテージを、エフェクター細胞及び標的細胞のみを含有する無処理の対照を用いて引き算することによって算出した。
【0174】
９．３．１．１０．ＡＤＣＰアッセイ
ヒト単球（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、１０％ＦＢＳ及び５０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＭ－ＣＳＦ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を含有するＲＰＭＩ－１６４０中、８日間にわたってマクロファージに分化させた。十分に分化したマクロファージをフラスコから剥離して、ファゴサイトーシスアッセイにおいて標的がん細胞と共培養した。内因性ＣＤ１９を発現するヒト非ホジキンリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ及びＮｕＤＨＬ１を標的細胞として選択した。ＰＢＳを用いて洗浄した後、標的がん細胞を、５μＭのＣＦＳＥ色素溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて１５分間にわたって標識し、次いで、ヒトマクロファージと１：１の比で共インキュベートした。ＣＤ１９ ｍＡｂ又はＣＤ１９－ＧＲＭを種々の濃度で添加した。３７℃で３時間共培養した後、細胞を回収し、洗浄し、マクロファージ成熟化マーカーに対する抗体、ＡＰＣ－Ｃｙ７標識されたＣＤ６８抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色し、その後、フローサイトメトリー分析を行った。ファゴサイトーシス指数を、ファゴサイトーシス性マクロファージの集団パーセンタイルを示すものである、総ＣＤ６８＋マクロファージの間のＣＦＳＥ＋ＣＤ６８＋２重陽性マクロファージを計数することによって算出した。
ヒト単球（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、１０％ＦＢＳ及び５０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＭ－ＣＳＦ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を含有するＲＰＭＩ－１６４０中、８日間にわたってマクロファージに分化させた。十分に分化したマクロファージをフラスコから剥離して、ファゴサイトーシスアッセイにおいて標的がん細胞と共培養した。内因性ＣＤ１９を発現するヒト非ホジキンリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ及びＮｕＤＨＬ１を標的細胞として選択した。ＰＢＳを用いて洗浄した後、標的がん細胞を、５μＭのＣＦＳＥ色素溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて１５分間にわたって標識し、次いで、ヒトマクロファージと１：１の比で共インキュベートした。ＣＤ１９ ｍＡｂ又はＣＤ１９－ＧＲＭを種々の濃度で添加した。３７℃で３時間共培養した後、細胞を回収し、洗浄し、マクロファージ成熟化マーカーに対する抗体、ＡＰＣ－Ｃｙ７標識されたＣＤ６８抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色し、その後、フローサイトメトリー分析を行った。ファゴサイトーシス指数を、ファゴサイトーシス性マクロファージの集団パーセンタイルを示すものである、総ＣＤ６８＋マクロファージの間のＣＦＳＥ＋ＣＤ６８＋２重陽性マクロファージを計数することによって算出した。
【0175】
９．３．１．１１．アポトーシスアッセイ
アポトーシスを、ウエスタンブロットアッセイを使用して検出した。ＤＬＢＣＬ細胞株であるＦａｒａｇｅ細胞、ＳＵ－ＤＨＬ－６細胞、ＯＣＩ－ＬＹ１９細胞を、ＧＲＭペイロード（１００ｎＭ）又はＡＤＣ－１（１μＭ）を用い、示されている時間にわたって処理した後、細胞溶解を行った。細胞溶解物を、Ｍ－ＰＥＲ（商標）Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃７８５０１）を使用して生成し、タンパク質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃２３２４６）を使用して決定した。各処理条件からのタンパク質溶解物（１０μｇ）をＢｏｌｔ（商標）４～１２％、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓで分離し、ｉＢｌｏｔ（商標）２ Ｇｅｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｄｅｖｉｃｅを用いてＰＶＤＦメンブレンに転写した。メンブレンを、５％ＢＳＡを用いてブロッキングし、次いで、目的のタンパク質に対する抗体を用いて免疫ブロッティングを行った：ＢＩＭ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ｃａｔ＃２９３３）、カスパーゼ３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ｃａｔ＃９６６２）、ＰＡＲＰ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ｃａｔ＃９５３２）及びＧＡＰＤＨ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ｃａｔ＃５１７４）。続いて、メンブレンを、ウサギ又はマウスＩｇＧに対する西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートした二次抗体を用いてプロービングし、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ＰＬＵＳ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃３４５８０）を用い、Ａｚｕｒｅ Ｉｍａｇｅｒで検出した。
アポトーシスを、ウエスタンブロットアッセイを使用して検出した。ＤＬＢＣＬ細胞株であるＦａｒａｇｅ細胞、ＳＵ－ＤＨＬ－６細胞、ＯＣＩ－ＬＹ１９細胞を、ＧＲＭペイロード（１００ｎＭ）又はＡＤＣ－１（１μＭ）を用い、示されている時間にわたって処理した後、細胞溶解を行った。細胞溶解物を、Ｍ－ＰＥＲ（商標）Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃７８５０１）を使用して生成し、タンパク質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃２３２４６）を使用して決定した。各処理条件からのタンパク質溶解物（１０μｇ）をＢｏｌｔ（商標）４～１２％、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓで分離し、ｉＢｌｏｔ（商標）２ Ｇｅｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｄｅｖｉｃｅを用いてＰＶＤＦメンブレンに転写した。メンブレンを、５％ＢＳＡを用いてブロッキングし、次いで、目的のタンパク質に対する抗体を用いて免疫ブロッティングを行った：ＢＩＭ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ｃａｔ＃２９３３）、カスパーゼ３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ｃａｔ＃９６６２）、ＰＡＲＰ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ｃａｔ＃９５３２）及びＧＡＰＤＨ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ｃａｔ＃５１７４）。続いて、メンブレンを、ウサギ又はマウスＩｇＧに対する西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートした二次抗体を用いてプロービングし、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ＰＬＵＳ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃３４５８０）を用い、Ａｚｕｒｅ Ｉｍａｇｅｒで検出した。
【0176】
９．３．２．インビボ試験
９．３．２．１．マウス及び管理
雌ＣＢ１７／ＳＣＩＤ及びＳＣＩＤ／ｂｅｉｇｅをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から、及びＣＤ３４＋ヒト化ＮＳＧ ＩＬ－１５をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から、６～８週齢で入手し、ケージ当たり最大１０匹で飼育した。到着時の体重は１８～２０ｇであった。食物及び水を自由に摂取可能にした。マウスを、実験の開始前少なくとも３日間にわたって動物施設に気候順化させた。動物に対する試験を１２時間の明：１２時間の暗スケジュール（０６：００時間に明かりをつける）明期に行った。全ての実験を、ＡｂｂＶｉｅ’ｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓガイドラインに従って行った。
９．３．２．１．マウス及び管理
雌ＣＢ１７／ＳＣＩＤ及びＳＣＩＤ／ｂｅｉｇｅをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から、及びＣＤ３４＋ヒト化ＮＳＧ ＩＬ－１５をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から、６～８週齢で入手し、ケージ当たり最大１０匹で飼育した。到着時の体重は１８～２０ｇであった。食物及び水を自由に摂取可能にした。マウスを、実験の開始前少なくとも３日間にわたって動物施設に気候順化させた。動物に対する試験を１２時間の明：１２時間の暗スケジュール（０６：００時間に明かりをつける）明期に行った。全ての実験を、ＡｂｂＶｉｅ’ｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓガイドラインに従って行った。
【0177】
９．３．２．２．化合物
腹腔内投与経路を使用した。ＧＲＭ低分子（ＧＲＭ－ＳＭ）については、水中０．０５％ＨＰＭＣ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ－８０中に製剤化し、４℃で保管し、経口投薬を用いた。
腹腔内投与経路を使用した。ＧＲＭ低分子（ＧＲＭ－ＳＭ）については、水中０．０５％ＨＰＭＣ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ－８０中に製剤化し、４℃で保管し、経口投薬を用いた。
【0178】
実施例１のＣＤ１９ ｍＡｂは、ヒト及びカニクイザルＣＤ１９に対して高い親和性を有する脱フコシル化モノクローナル抗体（ＩｇＧ１、κ）である。ＡＤＣ－１は、ＣＤ１９ ｍＡｂをブロモアセトアミドアラニン－アラニンペプチドリンカーを用いて式ＶのＧＲＭ分子と連結したコンジュゲートである。アイソタイプ抗体（ＡＢ０９５）は、異種移植片によってもいかなるマウス組織によっても提示されない破傷風トキソイド抗原を認識する。
【0179】
９．３．２．３．有効性のパラメータ
薬物の有効性を参照するために、治療応答の大きさのパラメータ（最大腫瘍成長阻害、［ＴＧＩｍａｘ］）及び長続きのパラメータ（腫瘍成長遅延、ＴＧＤ）を使用した。ＴＧＩは、薬物処置群の平均腫瘍体積と、薬物ビヒクル又はアイソタイプを対応させた非結合性抗体を用いて処置した対照群の平均腫瘍体積の相違を示すものであり、対照群に対する平均体積のパーセンテージとして表わされる。ＴＧＩｍａｘ値は、処置群と対照群の差異が最大になった時点で決定される。ＴＧＤ（ｎ）は、薬物処置群における規定された腫瘍体積（１ｃｍ３）に達するまでの時間の中央値の、ビヒクルで処置した対照群における同じ体積に達するまでの時間の中央値と比較した差異を示すものである。この差異は、対照群における指定の腫瘍体積に達するまでの時間の中央値に対するパーセンテージとして表わされる。
薬物の有効性を参照するために、治療応答の大きさのパラメータ（最大腫瘍成長阻害、［ＴＧＩｍａｘ］）及び長続きのパラメータ（腫瘍成長遅延、ＴＧＤ）を使用した。ＴＧＩは、薬物処置群の平均腫瘍体積と、薬物ビヒクル又はアイソタイプを対応させた非結合性抗体を用いて処置した対照群の平均腫瘍体積の相違を示すものであり、対照群に対する平均体積のパーセンテージとして表わされる。ＴＧＩｍａｘ値は、処置群と対照群の差異が最大になった時点で決定される。ＴＧＤ（ｎ）は、薬物処置群における規定された腫瘍体積（１ｃｍ３）に達するまでの時間の中央値の、ビヒクルで処置した対照群における同じ体積に達するまでの時間の中央値と比較した差異を示すものである。この差異は、対照群における指定の腫瘍体積に達するまでの時間の中央値に対するパーセンテージとして表わされる。
【0180】
９．３．２．４．側腹部皮下腫瘍の腫瘍担持マウスの生成及び腫瘍体積の決定
皮下異種移植片試験それぞれについて、０日目に生存細胞をマウスの右側腹部に接種した。注射体積は０．１ｍＬであり、Ｓ－ＭＥＭ又はＨＢＳＳ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ）とマトリゲル（ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）の１：１混合物で構成された。腫瘍のサイズをおよそ８０～２００ｍｍ３で釣り合わせた。治療は、通常、必要なコホートへのランダム化及び腫瘍サイズの釣り合せを行った後、２４時間以内に開始した。治療開始時のマウスの体重はおよそ２０～２２ｇであった。腫瘍体積を週に１～２回推定した。腫瘍の長さ（Ｌ）及び幅（Ｗ）の測定値を電子カリパスによって得、体積を以下の方程式に従って算出した：Ｖ＝（Ｌ×Ｗ２）／２。腫瘍体積が最大２，０００ｍｍ３に達した時、又は施設のガイドラインに従って、動物の健康が損なわれた場合に、マウスを安楽死させた。
皮下異種移植片試験それぞれについて、０日目に生存細胞をマウスの右側腹部に接種した。注射体積は０．１ｍＬであり、Ｓ－ＭＥＭ又はＨＢＳＳ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ）とマトリゲル（ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）の１：１混合物で構成された。腫瘍のサイズをおよそ８０～２００ｍｍ３で釣り合わせた。治療は、通常、必要なコホートへのランダム化及び腫瘍サイズの釣り合せを行った後、２４時間以内に開始した。治療開始時のマウスの体重はおよそ２０～２２ｇであった。腫瘍体積を週に１～２回推定した。腫瘍の長さ（Ｌ）及び幅（Ｗ）の測定値を電子カリパスによって得、体積を以下の方程式に従って算出した：Ｖ＝（Ｌ×Ｗ２）／２。腫瘍体積が最大２，０００ｍｍ３に達した時、又は施設のガイドラインに従って、動物の健康が損なわれた場合に、マウスを安楽死させた。
【0181】
９．３．２．５．統計値
インビボにおける実験からのデータを、ＴＧＩｍａｘ値についてはスチューデントのｔ検定、及びＴＧＤについてはログランク検定（マン・ホイットニーＵ検定又はマンテル コックス）を使用して解析した。奏効率の差異をフィッシャーの直接検定によって評定した。
インビボにおける実験からのデータを、ＴＧＩｍａｘ値についてはスチューデントのｔ検定、及びＴＧＤについてはログランク検定（マン・ホイットニーＵ検定又はマンテル コックス）を使用して解析した。奏効率の差異をフィッシャーの直接検定によって評定した。
【0182】
９．３．２．６．ＰＤＸ試験
患者由来異種移植片（ＰＤＸ）試験を、外科的に切除された原発性患者腫瘍を起源とする、ＷｕＸｉにおいて樹立されたＤＬＢＣＬモデルに対して実施した。患者の治療歴を、治験審査委員会によって確立されたプロトコール及びガイドラインに従って収集した。各腫瘍検体（単一細胞浮遊液又は腫瘍断片）をマトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に調製し、６～８週齢ＮＯＤ ｓｃｉｄマウスの側腹部に埋め込んだ。マウスの取り扱い及び飼育をＩＡＣＵＣ／ＡＡＬＡＳプロトコール及び手順に従って行った。腫瘍を週に２回、カリパス測定値（長さ×幅２）／２によって測定し、腫瘍体積がおよそ１５０～２００ｍｍ３に達したところで処置を開始した。マウスを、示されている試験物をｎ＝５／群で用い、腹腔内に１回処置した（ビヒクル、ＣＤ１９抗体、ＡＤＣ－１）。処置した各ＤＬＢＣＬ ＰＤＸモデル（６つの胚中心Ｂ細胞（ＧＣＢ）及び処置が難しい非ＧＣＢ活性化Ｂ細胞亜型（ＡＢＣ）を含む４つの非ＧＣＢ）について、ＡＤＣ－１による処置後の腫瘍成長阻害を以下の通り決定した：デルタ％ＴＧＩ最大＝１－（Ｘ日目の処置群の腫瘍体積－ランダム化時点での処置群の腫瘍体積）／（Ｘ日目の対照の腫瘍体積－ランダム化時点での対照の腫瘍体積）］＊１００。デルタ％ＴＧＩ最大は、処置群と対照群の差異が最大になった時に決定した。ＰＤＸモデルを、腫瘍退縮を誘導するその能力に基づいて応答者又は非応答者と決定した（応答者）：＞１０５％デルタＴＧＩ最大－応答あり／なし。［（時点での腫瘍体積／ランダム化時点での腫瘍体積）－１］×１００によって算出される腫瘍体積の変化（％）も算出し、ビヒクル対照腫瘍が１０００ｍｍ３に達した時点に基づいてグラフにした。図１３Ａ～Ｂを参照されたい。
患者由来異種移植片（ＰＤＸ）試験を、外科的に切除された原発性患者腫瘍を起源とする、ＷｕＸｉにおいて樹立されたＤＬＢＣＬモデルに対して実施した。患者の治療歴を、治験審査委員会によって確立されたプロトコール及びガイドラインに従って収集した。各腫瘍検体（単一細胞浮遊液又は腫瘍断片）をマトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に調製し、６～８週齢ＮＯＤ ｓｃｉｄマウスの側腹部に埋め込んだ。マウスの取り扱い及び飼育をＩＡＣＵＣ／ＡＡＬＡＳプロトコール及び手順に従って行った。腫瘍を週に２回、カリパス測定値（長さ×幅２）／２によって測定し、腫瘍体積がおよそ１５０～２００ｍｍ３に達したところで処置を開始した。マウスを、示されている試験物をｎ＝５／群で用い、腹腔内に１回処置した（ビヒクル、ＣＤ１９抗体、ＡＤＣ－１）。処置した各ＤＬＢＣＬ ＰＤＸモデル（６つの胚中心Ｂ細胞（ＧＣＢ）及び処置が難しい非ＧＣＢ活性化Ｂ細胞亜型（ＡＢＣ）を含む４つの非ＧＣＢ）について、ＡＤＣ－１による処置後の腫瘍成長阻害を以下の通り決定した：デルタ％ＴＧＩ最大＝１－（Ｘ日目の処置群の腫瘍体積－ランダム化時点での処置群の腫瘍体積）／（Ｘ日目の対照の腫瘍体積－ランダム化時点での対照の腫瘍体積）］＊１００。デルタ％ＴＧＩ最大は、処置群と対照群の差異が最大になった時に決定した。ＰＤＸモデルを、腫瘍退縮を誘導するその能力に基づいて応答者又は非応答者と決定した（応答者）：＞１０５％デルタＴＧＩ最大－応答あり／なし。［（時点での腫瘍体積／ランダム化時点での腫瘍体積）－１］×１００によって算出される腫瘍体積の変化（％）も算出し、ビヒクル対照腫瘍が１０００ｍｍ３に達した時点に基づいてグラフにした。図１３Ａ～Ｂを参照されたい。
【0183】
９．３．２．７．結合活性
フローサイトメトリーを使用して、ＡＤＣ－１の、ＣＤ１９を内因性に発現する異なるがん細胞株及び全長ヒトＣＤ１９が形質導入された２９３Ｔ細胞への細胞表面結合を評定した。ＡＤＣ－１は、Ｂ細胞リンパ腫細胞株Ｒａｊｉ（バーキットリンパ腫）、ＳＵＰ－Ｂ１５（急性リンパ芽球性白血病）、ＲＳ４；１１（急性リンパ芽球性白血病）及びＯＣＩ－ＬＹ１９（びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫）に対して０．５４４～１．０６１ｎＭの範囲の結合ＥＣ５０を示し（表４）、全長ヒトＣＤ１９を用いて工学的に操作された２９３Ｔ細胞に対して１．０８６ｎＭの結合ＥＣ５０を示した（表４）。実施例１のコンジュゲートしていない親脱フコシル化ＣＤ１９抗体（ＣＤ１９ ｍＡｂ）は、０．４０１～０．８３６ｎＭの範囲のＥＣ５０で同様の結合親和性を示し（表４）、全長ヒトＣＤ１９を用いて工学的に操作された２９３Ｔ細胞に対しては０．９７７ｎＭの結合ＥＣ５０を示した（表４）。ＡＤＣ－１及びＣＤ１９ ｍＡｂのどちらもＣＤ１９陰性結腸直腸がん細胞株ＨＣＴ１１６に対しては検出可能な結合を示さなかった。
フローサイトメトリーを使用して、ＡＤＣ－１の、ＣＤ１９を内因性に発現する異なるがん細胞株及び全長ヒトＣＤ１９が形質導入された２９３Ｔ細胞への細胞表面結合を評定した。ＡＤＣ－１は、Ｂ細胞リンパ腫細胞株Ｒａｊｉ（バーキットリンパ腫）、ＳＵＰ－Ｂ１５（急性リンパ芽球性白血病）、ＲＳ４；１１（急性リンパ芽球性白血病）及びＯＣＩ－ＬＹ１９（びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫）に対して０．５４４～１．０６１ｎＭの範囲の結合ＥＣ５０を示し（表４）、全長ヒトＣＤ１９を用いて工学的に操作された２９３Ｔ細胞に対して１．０８６ｎＭの結合ＥＣ５０を示した（表４）。実施例１のコンジュゲートしていない親脱フコシル化ＣＤ１９抗体（ＣＤ１９ ｍＡｂ）は、０．４０１～０．８３６ｎＭの範囲のＥＣ５０で同様の結合親和性を示し（表４）、全長ヒトＣＤ１９を用いて工学的に操作された２９３Ｔ細胞に対しては０．９７７ｎＭの結合ＥＣ５０を示した（表４）。ＡＤＣ－１及びＣＤ１９ ｍＡｂのどちらもＣＤ１９陰性結腸直腸がん細胞株ＨＣＴ１１６に対しては検出可能な結合を示さなかった。
【0184】
【表4】
【0185】
９．３．２．８．グルココルチコイド受容体モジュレーター（ＧＲＭ）ペイロードは臨床的に承認済みのグルココルチコイドよりも効力が高い
ＧＲＭペイロードの効力の臨床的に承認済みのグルココルチコイド（デキサメタゾン及びプレドニゾロン）との比較を、インビトロにおいてＲＳ４；１１細胞に対する試験を行うことによって行った。式ＩＶのＧＲＭペイロードは、デキサメタゾン又はプレドニゾロンのいずれと比較しても高い効力を示した（図１）。ＥＣ５０は、式ＩＶのＧＲＭペイロード、デキサメタゾン及びプレドニゾロンについて、それぞれ０．２３ｎＭ、３．２８ｎＭ及び８２．９１ｎＭであった。
ＧＲＭペイロードの効力の臨床的に承認済みのグルココルチコイド（デキサメタゾン及びプレドニゾロン）との比較を、インビトロにおいてＲＳ４；１１細胞に対する試験を行うことによって行った。式ＩＶのＧＲＭペイロードは、デキサメタゾン又はプレドニゾロンのいずれと比較しても高い効力を示した（図１）。ＥＣ５０は、式ＩＶのＧＲＭペイロード、デキサメタゾン及びプレドニゾロンについて、それぞれ０．２３ｎＭ、３．２８ｎＭ及び８２．９１ｎＭであった。
【0186】
９．３．２．９．ＣＤ１９ ｍＡｂ及びＡＤＣ－１は内部移行し、ＧＲＭペイロードを送達して、Ｂ細胞リンパ腫細胞増殖を阻害する
ＣＤ１９ ｍＡｂの、ＣＤ１９内部移行を誘導する能力を調査するために、急性リンパ芽球性リンパ腫（ＡＬＬ）細胞株ＲＳ４；１１を、ＣＤ１９ ｍＡｂを用いて３７℃で０時間、０．５時間、１時間、３時間及び２４時間にわたって処理した。ＣＤ１９とリソソームマーカーＬＡＭＰ１の共局在によって示される通り、ＣＤ１９ ｍＡｂは、０．５時間という早さでＣＤ１９内部移行を誘導し、リソソームに局在化する（図２）。同様に、ＡＤＣ－１は、ヒトＣＤ１９を発現するように工学的に操作された、Ｋ５６２グルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）レポーター細胞においてＧＲＥレポーターを用量依存的に活性化する（図３）。
ＣＤ１９ ｍＡｂの、ＣＤ１９内部移行を誘導する能力を調査するために、急性リンパ芽球性リンパ腫（ＡＬＬ）細胞株ＲＳ４；１１を、ＣＤ１９ ｍＡｂを用いて３７℃で０時間、０．５時間、１時間、３時間及び２４時間にわたって処理した。ＣＤ１９とリソソームマーカーＬＡＭＰ１の共局在によって示される通り、ＣＤ１９ ｍＡｂは、０．５時間という早さでＣＤ１９内部移行を誘導し、リソソームに局在化する（図２）。同様に、ＡＤＣ－１は、ヒトＣＤ１９を発現するように工学的に操作された、Ｋ５６２グルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）レポーター細胞においてＧＲＥレポーターを用量依存的に活性化する（図３）。
【0187】
ＡＤＣ－１の細胞傷害性を評価するために、ＣＤ１９を異なるレベルで発現する胞株に対して増殖アッセイを実施した。ＡＤＣ－１は、式ＩＶのグルココルチコイド受容体モジュレーター（ＧＲＭ）ペイロードに対して感受性であるＣＤ１９を発現するがん細胞株の増殖を阻害し、ＡＤＣ－１のインビトロ細胞傷害性ＥＣ５０は０．０８２～０．３２１ｎＭにわたった（表５）。
【0188】
【表5】
【0189】
式ＩＩＩのＧＲＭプロドラッグペイロードを、インビトロ／インビボで脱リン酸化して、式ＩＶの脱リン酸化ＧＲＭペイロードにし、したがって、式ＩＶの脱リン酸化ペイロードを本発明らの試験における対照として使用した。ＡＤＣ－１は、ＣＤ１９陰性結腸直腸がん細胞株ＨＣＴ１１６に対しては活性ではなかった（表５）。特に、ＡＤＣ－１は、アイソタイプ－ＧＲＭと比較して効力が高く（表５）、これにより、ＧＲＭペイロードのＣＤ１９標的依存性送達が示される。
【0190】
９．３．２．１０．ＣＤ１９ ｍＡｂはインビトロにおいてＤＬＢＣＬ細胞増殖及びＡＫＴ活性化を阻害する
ＣＤ１９は、Ｂ細胞受容体の補助受容体であり、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路をトランス活性化し得る（Ｂｕｒｇｅｒら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ、２０１８．１８（３）：１４８～１６７頁）。さらに、機能的ゲノムスクリーニングにより、ＤＬＢＣＬ細胞株のサブセットが生存に関してＣＤ１９に依存することが実証された（Ｐｈｅｌａｎ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１８．５６０（７７１８）：３８７～３９１頁）。インビトロにおいて、ＣＤ１９ ｍＡｂ（実施例１）で処理することにより、ＳＵ－ＤＨＬ－６の細胞増殖が阻害された（図４Ａ）。ＣＤ１９ ｍＡｂで予め処理することにより、１μｇ／ｍｌの抗ＩｇＭを用いたＢＣＲ刺激に応答したＡＫＴリン酸化が除かれ（図４Ｂ）、これにより、ＣＤ１９ ｍＡｂがＢＣＲ媒介性ＡＫＴ経路活性化を有効に遮断することが実証される。
ＣＤ１９は、Ｂ細胞受容体の補助受容体であり、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路をトランス活性化し得る（Ｂｕｒｇｅｒら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ、２０１８．１８（３）：１４８～１６７頁）。さらに、機能的ゲノムスクリーニングにより、ＤＬＢＣＬ細胞株のサブセットが生存に関してＣＤ１９に依存することが実証された（Ｐｈｅｌａｎ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１８．５６０（７７１８）：３８７～３９１頁）。インビトロにおいて、ＣＤ１９ ｍＡｂ（実施例１）で処理することにより、ＳＵ－ＤＨＬ－６の細胞増殖が阻害された（図４Ａ）。ＣＤ１９ ｍＡｂで予め処理することにより、１μｇ／ｍｌの抗ＩｇＭを用いたＢＣＲ刺激に応答したＡＫＴリン酸化が除かれ（図４Ｂ）、これにより、ＣＤ１９ ｍＡｂがＢＣＲ媒介性ＡＫＴ経路活性化を有効に遮断することが実証される。
【0191】
９．３．２．１１．ＡＤＣ－１は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する
ＣＤ１９ ｍＡｂ及びＡＤＣ－１を、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を引き出すそれらの能力を増強するために脱フコシル化した。ＦｃγＲＩＩＩａの多型（Ｆ１５８又はＶ１５８）は、そのＩｇＧ１、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４への結合、並びにこれらの抗体の治療有効性に影響を及ぼす（Ｋｏｅｎｅ，Ｈ．Ｒ．ら、Ｂｌｏｏｄ、１９９７．９０（３）：１１０９～１１１４頁；Ｃａｒｔｒｏｎ，Ｇ．ら、Ｂｌｏｏｄ、２００２．９９（３）：７５４～８頁；Ｗｕ，Ｊ．ら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、１９９７．１００（５）：１０５９～７０頁）。
ＣＤ１９ ｍＡｂ及びＡＤＣ－１を、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を引き出すそれらの能力を増強するために脱フコシル化した。ＦｃγＲＩＩＩａの多型（Ｆ１５８又はＶ１５８）は、そのＩｇＧ１、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４への結合、並びにこれらの抗体の治療有効性に影響を及ぼす（Ｋｏｅｎｅ，Ｈ．Ｒ．ら、Ｂｌｏｏｄ、１９９７．９０（３）：１１０９～１１１４頁；Ｃａｒｔｒｏｎ，Ｇ．ら、Ｂｌｏｏｄ、２００２．９９（３）：７５４～８頁；Ｗｕ，Ｊ．ら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、１９９７．１００（５）：１０５９～７０頁）。
【0192】
インビトロにおいて、高親和性（Ｖ１５８）又は低親和性（Ｆ１５８）ＦｃγＲＩＩＩａを発現するように工学的に操作されたＮＦＡＴレポーターＪｕｒｋａｔ細胞を使用して、ＣＤ１９－ＧＲＭの、ＦｃγＲＩＩＩａに結合し、ＡＤＣＣを引き出す能力を決定した。ＣＤ１９－ＧＲＭは、ＡＤＣＣ ＮＦＡＴレポーター活性化が誘導され、ＥＣ５０はＶ１５８バリアント及びＦ１５８バリアントに対してそれぞれ０．０１７ｎＭ及び０．０１８ｎＭであった（図５Ａ及びＢ）。同様に、コンジュゲートしていない脱フコシル化抗体ＣＤ１９ ｍＡｂによっても効力の高いＡＤＣＣ活性が誘導され、ＥＣ５０はＶ１５８バリアント及びＦ１５８バリアントに対してそれぞれ０．０２７ｎＭ及び０．０２３ｎＭであった（図５Ａ及びＢ）。
【0193】
Ｂ細胞リンパ腫細胞株と初代ＰＢＭＣの共培養を実施して、ＡＤＣ－１のＡＤＣＣ活性を機能的に評定した。これらのアッセイでは、ＡＤＣ－１により、ＣＤ１９特異的がん細胞溶解が引き出され、ＥＣ５０は０．０７～０．１４２ｎＭにわたった（図６Ａ～Ｃ）。コンジュゲートしていないＣＤ１９ ｍＡｂも同様のＣＤ１９特異的がん細胞溶解を示し、ＥＣ５０は０．０７５～０．４０５ｎＭにわたった（図６Ａ～Ｃ）。
【0194】
９．３．２．１２．ＡＤＣ－１は抗体依存性細胞ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）を誘導する
ＡＤＣ－１のＡＤＣＰを誘導する能力を、Ｂ細胞リンパ腫細胞を単球由来マクロファージとインビトロで共培養することによって評価した。ＡＤＣ－１による処理及びＣＤ１９ ｍＡｂによる処理のどちらによっても、ＮｕＤＨＬ１及びＲａｊｉにおいて、アイソタイプｍＡｂ又はアイソタイプＧＲＭによる処理と比較して著しく高いＡＤＣＰ誘導がもたらされた（図７Ａ及びＢ）。
ＡＤＣ－１のＡＤＣＰを誘導する能力を、Ｂ細胞リンパ腫細胞を単球由来マクロファージとインビトロで共培養することによって評価した。ＡＤＣ－１による処理及びＣＤ１９ ｍＡｂによる処理のどちらによっても、ＮｕＤＨＬ１及びＲａｊｉにおいて、アイソタイプｍＡｂ又はアイソタイプＧＲＭによる処理と比較して著しく高いＡＤＣＰ誘導がもたらされた（図７Ａ及びＢ）。
【0195】
９．３．２．１３．ＧＲＭ及びＡＤＣ－１はＤＬＢＣＬ細胞株におけるアポトーシスを誘導する
試験した３種の細胞株全てにおいて、ＧＲＭ及びＡＤＣ１により、アポトーシス促進性タンパク質（ＢＩＭ）のアップレギュレーション及びアポトーシスのマーカー（切断型カスパーゼ－３及び切断型ＰＡＲＰ）の誘導によって測定される、アポトーシスが誘導された（図１５参照）。
試験した３種の細胞株全てにおいて、ＧＲＭ及びＡＤＣ１により、アポトーシス促進性タンパク質（ＢＩＭ）のアップレギュレーション及びアポトーシスのマーカー（切断型カスパーゼ－３及び切断型ＰＡＲＰ）の誘導によって測定される、アポトーシスが誘導された（図１５参照）。
【0196】
９．３．２．１４．ＡＤＣ－１は、インビボにおいて、ＧＲＭに駆動される抗腫瘍活性及びＡＤＣＣを引き出す
ＡＤＣ－１は、ＣＤ１９の細胞表面発現を有する腫瘍に対して効果的である。ＡＤＣ－１は、単一の作用剤としてもたらされると、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ：ＯＣＩ－ＬＹ１９及びＳＵ－ＤＨＬ－６）及び急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ：ＲＳ４；１１）などの、Ｂ細胞悪性腫瘍に由来するヒト腫瘍細胞株の皮下異種移植片の成長を阻害する（図８及び９）。ヒト異種移植片を、免疫無防備状態のＣＢ１７／ＳＣＩＤマウス（ＯＣＩ－ＬＹ１９、ＲＳ４；１１：図８Ａ及び図９）、免疫無防備状態のＳＣＩＤ／ｂｅｉｇｅマウス（ＳＵ－ＤＨＬ－６：図８Ｂ）及びヒト化ＣＤ３４＋ＮＳＧ－ｈｕＩＬ－１５マウスモデル（ＯＣＩ－ＬＹ１９：図１０）を使用して試験した。ＡＤＣ－１は、単回のボーラスとして腹腔内に投与され、用量依存的に効果的である。ＤＬＢＣＬ異種移植片（図８）に対しては、全ての用量のＡＤＣ－１及び式ＩＶのグルココルチコイド受容体モジュレーター低分子（ＧＲＭ－ＳＭ）により、統計的に有意な（ｐ＜０．０５）、ビヒクル、アイソタイプモノクローナル抗体、ヒトＣＤ１９モノクローナル抗体及び全身性ステロイド（プレドニゾロン、毎日の投薬）よりも大きい腫瘍成長阻害が誘導された。有意な長続きする応答がＤＬＢＣＬ異種移植片において最高用量で観察された。ＡＢ０９５－ＧＲＭ（アイソタイプ－ＧＲＭ対照）は、２つの最高用量でいくらかの成長阻害を示し、これは同じ用量のＡＤＣ－１よりも有意に低かった（ｐ＜０．０５）。ＡＬＬ異種移植モデルに投与されたＡＤＣ－１（図９）は、高い感受性を示し、低用量で長続きする応答及び統計的に有意な（ｐ＜０．０５）腫瘍成長阻害が伴った。用量２での腫瘍退縮は＞１００日間続いた。全ての用量が許容され、体重減少は観察されなかった。
ＡＤＣ－１は、ＣＤ１９の細胞表面発現を有する腫瘍に対して効果的である。ＡＤＣ－１は、単一の作用剤としてもたらされると、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ：ＯＣＩ－ＬＹ１９及びＳＵ－ＤＨＬ－６）及び急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ：ＲＳ４；１１）などの、Ｂ細胞悪性腫瘍に由来するヒト腫瘍細胞株の皮下異種移植片の成長を阻害する（図８及び９）。ヒト異種移植片を、免疫無防備状態のＣＢ１７／ＳＣＩＤマウス（ＯＣＩ－ＬＹ１９、ＲＳ４；１１：図８Ａ及び図９）、免疫無防備状態のＳＣＩＤ／ｂｅｉｇｅマウス（ＳＵ－ＤＨＬ－６：図８Ｂ）及びヒト化ＣＤ３４＋ＮＳＧ－ｈｕＩＬ－１５マウスモデル（ＯＣＩ－ＬＹ１９：図１０）を使用して試験した。ＡＤＣ－１は、単回のボーラスとして腹腔内に投与され、用量依存的に効果的である。ＤＬＢＣＬ異種移植片（図８）に対しては、全ての用量のＡＤＣ－１及び式ＩＶのグルココルチコイド受容体モジュレーター低分子（ＧＲＭ－ＳＭ）により、統計的に有意な（ｐ＜０．０５）、ビヒクル、アイソタイプモノクローナル抗体、ヒトＣＤ１９モノクローナル抗体及び全身性ステロイド（プレドニゾロン、毎日の投薬）よりも大きい腫瘍成長阻害が誘導された。有意な長続きする応答がＤＬＢＣＬ異種移植片において最高用量で観察された。ＡＢ０９５－ＧＲＭ（アイソタイプ－ＧＲＭ対照）は、２つの最高用量でいくらかの成長阻害を示し、これは同じ用量のＡＤＣ－１よりも有意に低かった（ｐ＜０．０５）。ＡＬＬ異種移植モデルに投与されたＡＤＣ－１（図９）は、高い感受性を示し、低用量で長続きする応答及び統計的に有意な（ｐ＜０．０５）腫瘍成長阻害が伴った。用量２での腫瘍退縮は＞１００日間続いた。全ての用量が許容され、体重減少は観察されなかった。
【0197】
ＡＤＣ－１は、抗体依存性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）（ＡＤＣＣ）適合性マウスモデル（ｈｕＣＤ３４＋ＮＳＧ－ｈｕＩＬ－１５）において用量依存的に効果的である。このマウスモデルでは、免疫無防備状態のＮＳＧマウスを、ヒトＩＬ－１５を発現するように遺伝子操作し、ヒトＰＢＭＣ（ＣＤ３４＋）を植え付ける。ヒトＩＬ－１５は、ＮＫ細胞生存率を支持し、ＡＤＣＣの試験を可能にするように機能する。このマウス系において、ＡＤＣ－１により、ＤＬＢＣＬに由来するヒト腫瘍細胞株の皮下異種移植片の成長の阻害が誘導された（ＯＣＩ－ＬＹ１９：図１０）。用量３で統計的に有意な（ｐ＜０．０５）腫瘍成長阻害及び長続きする応答（＞５０日間）が観察された。ＡＤＣ－１のヒト末梢血Ｂ細胞及びＮＫ細胞に対する影響をベースライン（投薬の４日前）並びに投薬の１日後、６日後、１３日後、２０日後及び２６日後に測定した。マウス血液１マイクロリットル当たりのヒトＢ細胞の数及び総ヒトＣＤ４５＋細胞に対するパーセンテージの両方が、全てのＡＤＣ－１用量レベルで低減した。Ｂ細胞抑制の持続時間は用量レベルと正に関連した。ＮＫ細胞数に対してはいずれの用量レベルのＡＤＣ－１によっても有意な影響はなかった。
【0198】
ＡＤＣ－１の有効性を、ＣＤ１９ ｍＡｂと全身性プレドニゾロンの組合せともＲＳ４；１１異種移植モデルにおいて直接比較した。このモデルでは、高用量の単一作用剤としてのＣＤ１９ ｍＡｂ又はプレドニゾロン（［ＱＤ×５］×３）は中程度の抗腫瘍活性を示したが、両方の作用剤を組み合わせると、より持続的な腫瘍成長阻害がもたらされた（図１１）。顕著に、単回の低用量ＡＤＣ－１により、ＣＤ１９ ｍＡｂと全身性プレドニゾロン（［ＱＤ×５］×３）の組合せと比較して長続きする抗腫瘍活性が誘導された。
【0199】
ＡＤＣ－１は、いくつかの異なるＢ細胞悪性腫瘍モデル、ＤＢ（図１２Ａ）、ＳＵＰＢ１５（図１２Ｂ）、ＲＳ４；１１（図１２Ｃ）における抗腫瘍有効性を示す。示されている通り免疫無防備状態のマウスにおいて成長させたＤＢ異種移植モデル及びＳＵＰＢ１５異種移植モデルにおいてＡＤＣ－１の抗腫瘍有効性をプレドニゾロン、［ＱＤ×５］×３又はアイソタイプ－ＧＲＭ ＡＤＣと直接比較した。ＤＢ異種移植モデル及びＳＵＰＢ１５異種移植モデルのどちらにおいても持続的な抗腫瘍有効性が観察され、これは、全身性ステロイドプレドニゾロンよりも優れたものであり、アイソタイプ－ＧＲＭ ＡＤＣよりも優れたものであり、これにより、ＡＤＣ－１のＣＤ１９標的化活性が確認される。ＡＬＬ腫瘍モデルＳＵＰＢ１５（図１２Ｂ）では、単回ＡＤＣ－１投薬後に５０日間を超えて続く持続的な抗腫瘍活性（完全奏効）が実証される。ＲＳ４；１１腫瘍（図１２Ｃ）を大きなサイズ（＞６００ｍｍ３）まで成長させ、次いで、ＡＤＣ－１を単回ＩＰ投薬で用いて処置した。この単回ＡＤＣ－１投与の結果、これらの大きな腫瘍の完全な腫瘍退縮がもたらされ、これは＞４０日間持続した。
【0200】
９．３．２．１５．ＡＤＣ－１はＤＬＢＣＬ ＰＤＸモデルにおける抗腫瘍活性を引き出す
図１３Ａに示されている通り、１０例のＤＬＢＣＬ ＰＤＸモデル全てで、対照で処置した同じモデルのＰＤＸと比べて腫瘍成長阻害が実証された。１０例のモデルのうち９例で、用量３のＡＤＣ－１の単回投薬を使用した場合に腫瘍退縮が示された（図１３Ｂ参照）。ＧＣＢ患者に由来するＰＤＸモデル及びＮｏｎ－ＧＣＢ患者に由来するＰＤＸモデルのどちらにおいても抗腫瘍有効性が認められた。１例のモデル、０２３２においてだけは、用量３のＡＤＣ－１を用いて処置した場合に均衡状態も退縮も示されなかった。このＰＤＳＸモデルは、７サイクルのＲ－ＣＨＯＰ治療を受けた患者由来のものであった。４サイクルの処置を受けたＲ－ＣＨＯＰ再発患者由来の３例のＰＤＸモデル、０３６７、００１６及び０２０７は応答した。
図１３Ａに示されている通り、１０例のＤＬＢＣＬ ＰＤＸモデル全てで、対照で処置した同じモデルのＰＤＸと比べて腫瘍成長阻害が実証された。１０例のモデルのうち９例で、用量３のＡＤＣ－１の単回投薬を使用した場合に腫瘍退縮が示された（図１３Ｂ参照）。ＧＣＢ患者に由来するＰＤＸモデル及びＮｏｎ－ＧＣＢ患者に由来するＰＤＸモデルのどちらにおいても抗腫瘍有効性が認められた。１例のモデル、０２３２においてだけは、用量３のＡＤＣ－１を用いて処置した場合に均衡状態も退縮も示されなかった。このＰＤＳＸモデルは、７サイクルのＲ－ＣＨＯＰ治療を受けた患者由来のものであった。４サイクルの処置を受けたＲ－ＣＨＯＰ再発患者由来の３例のＰＤＸモデル、０３６７、００１６及び０２０７は応答した。
【0201】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7A】
【図7B】
【図8AB】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11】
【図12A】
【図12BC】
【図13A】
【図13B】
【図14A】
【図14B】
【図15】
【図16】
【配列表】
【外国語明細書】