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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023019084
(43)【公開日】2023-02-09
(54)【発明の名称】顕微鏡システム、撮像方法、及びプログラム
(51)【国際特許分類】
G02B 21/00 20060101AFI20230202BHJP
G01N 21/64 20060101ALN20230202BHJP
【ＦＩ】
G02B21/00
G01N21/64 F
【審査請求】未請求
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021123560
(22)【出願日】2021-07-28
(71)【出願人】
【識別番号】000006507
【氏名又は名称】横河電機株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100169823
【弁理士】
【氏名又は名称】吉澤 雄郎
(74)【代理人】
【識別番号】230128026
【弁護士】
【氏名又は名称】駒木 寛隆
(72)【発明者】
【氏名】横山 耕徳
【テーマコード（参考）】
2G043
2H052
【Ｆターム（参考）】
2G043AA03
2G043CA04
2G043DA02
2G043DA05
2G043EA01
2G043FA01
2G043FA02
2G043GA03
2G043GA07
2G043GB01
2G043GB21
2G043HA01
2G043HA09
2G043HA15
2G043JA02
2G043JA03
2G043LA03
2G043MA16
2H052AA08
2H052AA09
2H052AB01
2H052AC04
2H052AC15
2H052AD03
2H052AD06
2H052AD19
2H052AE13
2H052AF14
(57)【要約】
【課題】試料面が傾いている場合であっても、機構設計上の制限、及び撮像速度の著しい低下等を伴わずに、視野内の部分的な輝度低下のない明瞭な試料の画像を撮像することを可能にする。
【解決手段】観察対象となる試料の像を取得する顕微鏡システムは、照明光を照射する発光装置と、照明光を試料に対して走査する走査部を有する共焦点スキャナと、共焦点スキャナにより走査された照明光による像を試料に投影する対物レンズを有する、顕微鏡と、照明光が照射された試料からの被測定光を検出する、撮像面が走査部に対して共役の位置に配置された、撮像装置と、顕微鏡及び撮像装置の動作を制御する処理装置と、を備え、処理装置は、試料に対する対物レンズの焦点の相対位置を、照明光の光軸に平行な方向に変位させながら、撮像装置による撮像を行うための制御信号を、顕微鏡及び撮像装置へ送信する。
【選択図】図１
【解決手段】観察対象となる試料の像を取得する顕微鏡システムは、照明光を照射する発光装置と、照明光を試料に対して走査する走査部を有する共焦点スキャナと、共焦点スキャナにより走査された照明光による像を試料に投影する対物レンズを有する、顕微鏡と、照明光が照射された試料からの被測定光を検出する、撮像面が走査部に対して共役の位置に配置された、撮像装置と、顕微鏡及び撮像装置の動作を制御する処理装置と、を備え、処理装置は、試料に対する対物レンズの焦点の相対位置を、照明光の光軸に平行な方向に変位させながら、撮像装置による撮像を行うための制御信号を、顕微鏡及び撮像装置へ送信する。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
観察対象となる試料の像を取得する顕微鏡システムであって、
照明光を照射する発光装置と、
前記照明光を前記試料に対して走査する走査部を有する共焦点スキャナと、
前記共焦点スキャナにより走査された前記照明光による像を前記試料に投影する対物レンズと、前記試料が載置される容器の前記対物レンズの焦点位置に対する位置を検出する位置センサと、を有する、顕微鏡と、
前記照明光が照射された前記試料からの被測定光を検出する、撮像面が前記走査部に対して共役の位置に配置された、撮像装置と、
前記顕微鏡及び前記撮像装置の動作を制御する処理装置と、
を備え、
前記処理装置は、前記容器の前記対物レンズの焦点位置に対する位置に基づいて、前記試料に対する前記対物レンズの焦点の相対位置を、前記照明光の光軸に平行な方向に変位させながら、前記撮像装置による撮像を行うための制御信号を、前記顕微鏡及び前記撮像装置へ送信する、
顕微鏡システム。
照明光を照射する発光装置と、
前記照明光を前記試料に対して走査する走査部を有する共焦点スキャナと、
前記共焦点スキャナにより走査された前記照明光による像を前記試料に投影する対物レンズと、前記試料が載置される容器の前記対物レンズの焦点位置に対する位置を検出する位置センサと、を有する、顕微鏡と、
前記照明光が照射された前記試料からの被測定光を検出する、撮像面が前記走査部に対して共役の位置に配置された、撮像装置と、
前記顕微鏡及び前記撮像装置の動作を制御する処理装置と、
を備え、
前記処理装置は、前記容器の前記対物レンズの焦点位置に対する位置に基づいて、前記試料に対する前記対物レンズの焦点の相対位置を、前記照明光の光軸に平行な方向に変位させながら、前記撮像装置による撮像を行うための制御信号を、前記顕微鏡及び前記撮像装置へ送信する、
顕微鏡システム。
【請求項2】
前記共焦点スキャナは、前記走査部として、複数のピンホールが配設されたピンホールディスクを回転して、前記発光装置から照射された前記照明光を前記試料に対して走査し、
前記対物レンズは、前記共焦点スキャナにより走査された前記照明光による前記複数のピンホールの像を前記試料に投影し、
前記撮像装置は、前記撮像面が、前記複数のピンホールに対して共役の位置に配置される、
請求項１に記載の顕微鏡システム。
前記対物レンズは、前記共焦点スキャナにより走査された前記照明光による前記複数のピンホールの像を前記試料に投影し、
前記撮像装置は、前記撮像面が、前記複数のピンホールに対して共役の位置に配置される、
請求項１に記載の顕微鏡システム。
【請求項3】
前記顕微鏡は、前記対物レンズを前記照明光の光軸に平行な方向に変位させることが可能な駆動装置を更に備え、
前記処理装置は、前記駆動装置が前記対物レンズを変位させながら、前記撮像装置による撮像を行うように、前記顕微鏡及び前記撮像装置を制御する、
請求項１又は２に記載の顕微鏡システム。
前記処理装置は、前記駆動装置が前記対物レンズを変位させながら、前記撮像装置による撮像を行うように、前記顕微鏡及び前記撮像装置を制御する、
請求項１又は２に記載の顕微鏡システム。
【請求項4】
前記処理装置は、前記試料に対する前記対物レンズの焦点の相対位置を等速度で変位させながら、前記撮像装置による撮像を行うように、前記顕微鏡及び前記撮像装置を制御する、請求項１から３のいずれか一項に記載の顕微鏡システム。
【請求項5】
前記処理装置は、
前記容器の前記対物レンズの焦点位置に対する前記位置に基づき、前記容器の局所的な傾きを検出し、
検出した前記容器の局所的な傾きに基づいて、前記撮像装置による撮像を行う間における、前記試料に対する前記対物レンズの焦点の相対位置の変位幅を決定し、
前記試料に対する前記対物レンズの焦点の相対位置を、前記決定された変位幅だけ変位させながら、前記撮像装置による撮像を行うように、前記顕微鏡及び前記撮像装置を制御する、
請求項１から４のいずれか一項に記載の顕微鏡システム。
前記容器の前記対物レンズの焦点位置に対する前記位置に基づき、前記容器の局所的な傾きを検出し、
検出した前記容器の局所的な傾きに基づいて、前記撮像装置による撮像を行う間における、前記試料に対する前記対物レンズの焦点の相対位置の変位幅を決定し、
前記試料に対する前記対物レンズの焦点の相対位置を、前記決定された変位幅だけ変位させながら、前記撮像装置による撮像を行うように、前記顕微鏡及び前記撮像装置を制御する、
請求項１から４のいずれか一項に記載の顕微鏡システム。
【請求項6】
前記処理装置は、前記容器の局所的な傾きを検出し、当該局所的な傾きに基づいて、前記試料に対する前記対物レンズの焦点の相対位置の変位幅を決定する処理と、前記対物レンズの焦点の相対位置を、前記決定された変位幅だけ変位させながら、前記撮像装置による撮像を行うように、前記顕微鏡及び前記撮像装置を制御する処理と、を交互に実行して、前記容器に載置された複数の前記試料の各々を撮像する、請求項５に記載の顕微鏡システム。
【請求項7】
前記処理装置は、前記試料に対する前記対物レンズの焦点の相対位置を、ユーザにより指定された変位幅だけ変位させながら、前記撮像装置による撮像を行うように、前記顕微鏡及び前記撮像装置を制御する、請求項１から４のいずれか一項に記載の顕微鏡システム。
【請求項8】
観察対象となる試料の像を取得する、発光装置と、共焦点スキャナ、顕微鏡、撮像装置、及び処理装置を備えた顕微鏡システムの撮像方法であって、
前記発光装置が照明光を照射し、
前記共焦点スキャナの走査部が、前記照明光を前記試料に対して走査する工程と、
前記顕微鏡の対物レンズが、前記共焦点スキャナにより走査された前記照明光による像を前記試料に投影する工程と、
前記顕微鏡の位置センサが、前記試料が載置される容器の前記対物レンズの焦点位置に対する位置を検出する工程と、
撮像面が前記走査部に対して共役の位置に配置された前記撮像装置が、前記照明光が照射された前記試料からの被測定光を検出する工程と、
を有し、
前記処理装置は、前記容器の前記対物レンズの焦点位置に対する位置に基づいて、前記試料に対する前記対物レンズの焦点の相対位置を、前記照明光の光軸に平行な方向に変位させながら、前記撮像装置による撮像を行うための制御信号を、前記顕微鏡及び前記撮像装置へ送信する、
顕微鏡システムの撮像方法。
前記発光装置が照明光を照射し、
前記共焦点スキャナの走査部が、前記照明光を前記試料に対して走査する工程と、
前記顕微鏡の対物レンズが、前記共焦点スキャナにより走査された前記照明光による像を前記試料に投影する工程と、
前記顕微鏡の位置センサが、前記試料が載置される容器の前記対物レンズの焦点位置に対する位置を検出する工程と、
撮像面が前記走査部に対して共役の位置に配置された前記撮像装置が、前記照明光が照射された前記試料からの被測定光を検出する工程と、
を有し、
前記処理装置は、前記容器の前記対物レンズの焦点位置に対する位置に基づいて、前記試料に対する前記対物レンズの焦点の相対位置を、前記照明光の光軸に平行な方向に変位させながら、前記撮像装置による撮像を行うための制御信号を、前記顕微鏡及び前記撮像装置へ送信する、
顕微鏡システムの撮像方法。
【請求項9】
コンピュータを請求項１から７のいずれか一項に記載の顕微鏡システムが備える処理装置として動作させるプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、顕微鏡システム、撮像方法、及びプログラムに関する。
【背景技術】
【0002】
特許文献１には、ニポウディスク方式共焦点スキャナの共焦点画像取り出しポートに接続される光学画像分離装置が記載されている。
【0003】
特許文献２には、径の異なる複数の種類のピンホールが配設され、何れかの径のピンホールのみに選択的に光を通過させることが可能なピンホ－ルディスクを回転して光スキャンを行う共焦点スキャナが記載されている。
【0004】
特許文献３には、試料からの蛍光信号を蛍光画像として取得する手段と、試料からの蛍光信号を共焦点画像として取得する手段からなり、蛍光画像と共焦点画像のいずれかを得るための光路切替を行う創薬スクリーニング装置が記載されている。
【0005】
特許文献４には、試料のスライス像を共焦点画像として取得する共焦点スキャナと、顕微鏡の対物レンズの焦点位置を光軸方向に移動するアクチュエータを設け、対物レンズの焦点位置を光軸方向に移動しながら撮像を行う顕微鏡システムが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特開２００２－６２４８０号公報
【特許文献2】特開２０１１－９０１４５号公報
【特許文献3】特開２００８－６４６７１号公報
【特許文献4】特開２００５－７０６８９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
顕微鏡下での細胞撮像時には、観察容器としてウェルプレートが使用されることが一般的である。ウェルプレートのフレーム及び底面は、成形時のひずみを原因としてたわむことがあり（フレームの成形時のひずみは数百μｍ程度、底面の成形時のひずみは数１０μｍ程度）、その結果、顕微鏡の撮像平面に対して試料面が傾く場合がある。
【0008】
したがって、撮像平面に対して試料面が傾いている状態で、特許文献１の構成により共焦点撮像を行うと、その焦点深度の浅さから、視野の一部で著しく輝度が低下してしまう。特許文献２～特許文献４の構成を用いた撮像により視野の一部での輝度の低下を防ぐことができるが、機構設計上の制限、必要となる画像記憶容量の上昇、及び撮像時間の増大等の課題があった。
【0009】
本開示の目的は、試料面が傾いている場合であっても、機構設計上の制限、及び撮像速度の著しい低下等を伴わずに、視野内の部分的な輝度低下のない明瞭な試料の画像を撮像することが可能な顕微鏡システム、撮像方法、及びプログラムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0010】
幾つかの実施形態に係る顕微鏡システムは、観察対象となる試料の像を取得する顕微鏡システムであって、照明光を照射する発光装置と、前記照明光を前記試料に対して走査する走査部を有する共焦点スキャナと、前記共焦点スキャナにより走査された前記照明光による像を前記試料に投影する対物レンズと、前記試料が載置される容器の前記対物レンズの焦点位置に対する位置を検出する位置センサと、を有する、顕微鏡と、前記照明光が照射された前記試料からの被測定光を検出する、撮像面が前記走査部に対して共役の位置に配置された、撮像装置と、前記顕微鏡及び前記撮像装置の動作を制御する処理装置と、を備え、前記処理装置は、前記容器の前記対物レンズの焦点位置に対する位置に基づいて、前記試料に対する前記対物レンズの焦点の相対位置を、前記照明光の光軸に平行な方向に変位させながら、前記撮像装置による撮像を行うための制御信号を、前記顕微鏡及び前記撮像装置へ送信する。このように、試料における対物レンズの焦点位置を照明光の光軸に平行な方向に変位させながら共焦点撮像を行うため、試料面が傾いている場合であっても、共焦点撮像により、視野内の部分的な輝度低下のない明瞭な画像の撮像をすることが可能である。顕微鏡システムは、複雑な構成を要しないため、機構設計上の制限を伴わない。顕微鏡システムは、一回の撮像により撮像画像を取得するため、撮像速度が著しく低下することもない。したがって、試料面が傾いている場合であっても、機構設計上の制限、及び撮像速度の著しい低下等を伴わずに、視野内の部分的な輝度低下のない明瞭な画像の撮像をすることが可能である。
【0011】
一実施形態において、前記共焦点スキャナは、前記走査部として、複数のピンホールが配設されたピンホールディスクを回転して、前記発光装置から照射された前記照明光を前記試料に対して走査し、前記対物レンズは、前記共焦点スキャナにより走査された前記照明光による前記複数のピンホールの像を前記試料に投影し、前記撮像装置は、前記撮像面が、前記複数のピンホールに対して共役の位置に配置されてもよい。このように、ピンホールディスクを高速で回転させて照明光を試料に対して走査するため、試料の共焦点画像を撮像装置の撮像面に短時間で形成することができる。したがって、高速に撮像することができる。
【0012】
一実施形態において、前記顕微鏡は、前記対物レンズを前記照明光の光軸に平行な方向に変位させることが可能な駆動装置を更に備え、前記処理装置は、前記駆動装置が前記対物レンズを変位させながら、前記撮像装置による撮像を行うように、前記顕微鏡及び前記撮像装置を制御してもよい。
【0013】
一実施形態において、前記処理装置は、前記試料に対する前記対物レンズの焦点の相対位置を等速度で変位させながら、前記撮像装置による撮像を行うように、前記顕微鏡及び前記撮像装置を制御してもよい。このように、撮像中は、試料に対する対物レンズの焦点の相対位置を等速度で変位させるため、撮像中に対物レンズに対する試料の相対位置が照明光の光軸に直行する方向に移動して、撮像画像が乱れることを防ぐことができる。
【0014】
一実施形態において、前記処理装置は、前記容器の前記対物レンズの焦点位置に対する前記位置に基づき、前記容器の局所的な傾きを検出し、検出した前記容器の局所的な傾きに基づいて、前記撮像装置による撮像を行う間における、前記試料に対する前記対物レンズの焦点の相対位置の変位幅を決定し、前記試料に対する前記対物レンズの焦点の相対位置を、前記決定された変位幅だけ変位させながら、前記撮像装置による撮像を行うように、前記顕微鏡及び前記撮像装置を制御してもよい。このように、容器の局所的な傾きに基づき、撮像を行う間における、試料に対する対物レンズの焦点の相対位置の変位幅を過不足なく決定するため、試料に対する対物レンズの焦点の相対位置を適切に変位させて撮像を行い、明瞭な画像を取得することができる。
【0015】
一実施形態において、前記容器の局所的な傾きを検出し、当該局所的な傾きに基づいて、前記試料に対する前記対物レンズの焦点の相対位置の変位幅を決定する処理と、前記対物レンズの焦点の相対位置を、前記決定された変位幅だけ変位させながら、前記撮像装置による撮像を行うように、前記顕微鏡及び前記撮像装置を制御する処理と、を交互に実行して、前記容器に載置された複数の前記試料の各々を撮像してもよい。このように、変位幅の決定と試料の撮影とを交互に行って複数の試料の各々を撮像することで、スキャンを１回行うだけで、容器の局所的な傾きに応じた過不足ない変位を伴う撮影を高速に行うことが可能である。
【0016】
一実施形態において、前記処理装置は、前記試料に対する前記対物レンズの焦点の相対位置を、ユーザにより指定された変位幅だけ変位させながら、前記撮像装置による撮像を行うように、前記顕微鏡及び前記撮像装置を制御してもよい。このように、試料に対する対物レンズの焦点の相対位置を、ユーザにより指定された変位幅だけ変位させながら撮像を行うため、試料に対する対物レンズの焦点の相対位置を適切に変位させて撮像を行い、明瞭な画像を取得することができる。
【0017】
幾つかの実施形態に係る顕微鏡システムの撮像方法は、観察対象となる試料の像を取得する、発光装置と、共焦点スキャナ、顕微鏡、撮像装置、及び処理装置を備えた顕微鏡システムの撮像方法であって、前記発光装置が照明光を照射し、前記共焦点スキャナの走査部が、前記照明光を前記試料に対して走査する工程と、前記顕微鏡の対物レンズが、前記共焦点スキャナにより走査された前記照明光による像を前記試料に投影する工程と、前記顕微鏡の位置センサが、前記試料が載置される容器の前記対物レンズの焦点位置に対する位置を検出する工程と、撮像面が前記走査部に対して共役の位置に配置された前記撮像装置が、前記照明光が照射された前記試料からの被測定光を検出する工程と、を有し、前記処理装置は、前記容器の前記対物レンズの焦点位置に対する位置に基づいて、前記試料に対する前記対物レンズの焦点の相対位置を、前記照明光の光軸に平行な方向に変位させながら、前記撮像装置による撮像を行うための制御信号を、前記顕微鏡及び前記撮像装置へ送信する。このように、試料における対物レンズの焦点位置を照明光の光軸に平行な方向に変位させながら共焦点撮像を行うため、試料面が傾いている場合であっても、共焦点撮像により、視野内の部分的な輝度低下のない明瞭な画像の撮像をすることが可能である。顕微鏡システムの撮像方法は、複雑な構成を要しないため、機構設計上の制限を伴わない。顕微鏡システムの撮像方法は、一回の撮像により撮像画像を取得するため、撮像速度が著しく低下することもない。したがって、試料面が傾いている場合であっても、機構設計上の制限、及び撮像速度の著しい低下等を伴わずに、視野内の部分的な輝度低下のない明瞭な画像の撮像をすることが可能である。
【0018】
幾つかの実施形態に係るプログラムは、コンピュータを上記顕微鏡システムが備える処理装置として動作させる。このように、試料における対物レンズの焦点位置を照明光の光軸に平行な方向に変位させながら共焦点撮像を行うため、試料面が傾いている場合であっても、共焦点撮像により、視野内の部分的な輝度低下のない明瞭な画像の撮像をすることが可能である。プログラムは、複雑な構成を要しないため、機構設計上の制限を伴わない。プログラムは、一回の撮像により撮像画像を取得するため、撮像速度が著しく低下することもない。したがって、試料面が傾いている場合であっても、機構設計上の制限、及び撮像速度の著しい低下等を伴わずに、視野内の部分的な輝度低下のない明瞭な画像の撮像をすることが可能である。
【発明の効果】
【0019】
本開示の一実施形態によれば、試料面が傾いている場合であっても、機構設計上の制限、及び撮像速度の著しい低下等を伴わずに、視野内の部分的な輝度低下のない明瞭な試料の画像を撮像することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】一実施形態に係る顕微鏡システムの構成を示す図である。
【図3】被撮像サンプルの側面図を模式的に示す図である。
【図4】被撮像サンプルの側面図を模式的に示す図である。
【図5】被撮像サンプルの側面図を模式的に示す図である。
【図6】被撮像サンプルの奥行に応じた対物レンズの焦点位置の制御を模式的に示す図である。
【図7】顕微鏡システムが実行する撮像処理の動作を示すフローチャートである。
【図8】ウェルプレートの底面のたわみを模式的に示す図である。
【図9A】顕微鏡システムが実行する撮像処理の動作を示すフローチャートである。
【図9B】顕微鏡システムが実行する撮像処理の動作を示すフローチャートである。
【図10A】顕微鏡システムが実行する撮像処理の動作を示すフローチャートである。
【図10B】顕微鏡システムが実行する撮像処理の動作を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【0021】
＜比較例＞
特許文献１には、ニポウディスク方式共焦点スキャナの共焦点画像取り出しポートに接続される光学画像分離装置が記載されている。特許文献１の構成は、共焦点スキャナの共焦点画像取り出しポートから射出された試料からの戻り光をダイクロイックミラーにより複数の波長領域の光に分離する。これにより、特許文献１の構成は、任意に分離した波長領域毎又は複数の同一波長領域部分毎の共焦点画像を高速に取得することができる。
特許文献１には、ニポウディスク方式共焦点スキャナの共焦点画像取り出しポートに接続される光学画像分離装置が記載されている。特許文献１の構成は、共焦点スキャナの共焦点画像取り出しポートから射出された試料からの戻り光をダイクロイックミラーにより複数の波長領域の光に分離する。これにより、特許文献１の構成は、任意に分離した波長領域毎又は複数の同一波長領域部分毎の共焦点画像を高速に取得することができる。
【0022】
特許文献１の構成により共焦点撮像を行う場合、顕微鏡の撮像平面に対して試料面が合致している状態ならば、視野全体で一様な輝度の画像が得られる。しかしながら、顕微鏡の撮像平面に対して試料面が傾いている状態で共焦点撮像を行うと、その焦点深度の浅さから、視野の一部で撮像画像の輝度が著しく低下してしまう。
【0023】
撮像平面に対して試料面が傾いていても視野の一部での著しい輝度低下を防ぐために、特許文献２に記載の手法を用いて共焦点スキャナのピンホール径を拡大することで、試料面における焦点深度を拡大し、試料像の部分的な輝度低下を防ぐことが考えられる。しかしながら、この手法を用いる場合、ニポウディスクのピンホール列数が少なくなることによるスキャン速度の低下してしまう。また、ピンホール切替機構の追加により機構設計が制限され、機器コストが高くなってしまう。さらに、ピンホール径を拡大させることで、ＸＹＺ方向の分解能が低下する。ＸＹ方向は励起光束１１の光軸に直行する平面における互いに直交する２つの方向であり、Ｚ方向は励起光束１１の光軸に平行な方向である。
【0024】
また、特許文献３のように、試料からの蛍光信号を共焦点画像として取得する手段に加えて、試料からの蛍光信号を蛍光画像として取得する手段を切り替え可能に設け、撮像平面に対する試料面の傾きが著しい場合は、蛍光画像を取得することも考えられる。落射蛍光観察は、被写界深度が深いため、試料面が傾いていても、その深い被写界にて試料をとらえることができ、試料像の部分的な輝度低下を防ぐことができる。しかしながら、このような構成を採用すると、光路を切り替えるための機構を設けなければならず、機構設計が制限され、機器コストが高くなってしまう。また、共焦点光路と落射蛍光光路の軸ずれによる視野の不一致、及びその是正のための調整が必要となる。さらに、特許文献３の構成においては、共焦点光路におけるリレーレンズと落射蛍光光路におけるリレーレンズとの倍率の不一致による撮像倍率のずれ及びその是正のための画像処理が必要になる。
【0025】
また、特許文献４のように、試料のスライス像を共焦点画像として取得する共焦点スキャナと、顕微鏡の対物レンズの焦点位置を光軸方向に移動するアクチュエータを備え、試料の深さ方向のスライス画像を取得することができるように構成することも考えられる。しかしながら、特許文献４の構成では、ビデオレートカメラから出力されるビデオ信号を基に、対物レンズの駆動波形を生成するので、ビデオ信号を出力できるカメラが別途必要である。また、特許文献４の構成は、ビデオ信号というアナログ信号基に、対物レンズ駆動波形を生成する。そのため、対物レンズの駆動をステッピングモータ等で行う場合は、ビデオ信号のＡＤ（Analog-to-Digital）変換、対物レンズ駆動パターンの演算、及び対物レンズ駆動パターンのパルス波形への変換などが必要となり、タイムラグが発生するという欠点がある。
【0026】
＜実施形態＞
本開示の実施形態は、試料面が傾いている場合であっても、機構設計上の制限、及び撮像速度の著しい低下等を伴わずに、視野内の部分的な輝度低下のない明瞭な画像の撮像をすることが可能とする。
本開示の実施形態は、試料面が傾いている場合であっても、機構設計上の制限、及び撮像速度の著しい低下等を伴わずに、視野内の部分的な輝度低下のない明瞭な画像の撮像をすることが可能とする。
【0027】
以下、本開示の一実施形態について、図面を参照して説明する。各図面中、同一の構成又は機能を有する部分には、同一の符号を付している。本実施形態の説明において、同一の部分については、重複する説明を適宜省略又は簡略化する場合がある。
【0028】
図１は、本開示の一実施形態に係る顕微鏡システム１の構成を示す模式図である。顕微鏡システム１は、発光装置１０、顕微鏡２０、共焦点スキャナ３０、カメラ４０、及び処理装置５０を備える。
【0029】
図１において、発光装置１０は、照明光としての励起光束１１をウェルプレート６０に載置された試料（サンプル）６に向けて照射する。試料６には蛍光試薬が付加されており、励起光束１１が照射されると、試料６は被測定光としての蛍光信号１２を発する。
【0030】
顕微鏡２０は、対物レンズ２１、駆動装置２２、リレーレンズ２３、及び位置センサ２４を備える。対物レンズ２１及びリレーレンズ２３は無限遠補正光学系を構成し、発光装置１０から射出された励起光束１１、及び試料６から発せられた蛍光信号１２に対して光学的に作用する。駆動装置２２は、処理装置５０から送信される制御信号に基づき、対物レンズ２１を励起光束１１の光軸に対して平行な方向に変位させることが可能である。
【0031】
位置センサ２４は、例えば焦点検出方式により、試料６が載置されるウェルプレート（容器）６０のＺ方向の位置、例えば、ウェルプレート６０の予め定められた複数の基準点のＺ方向の位置を検出する。このような基準点には、ウェルプレート６０の底面の位置が含まれてもよい。位置センサ２４は、光源２４１、分光ミラー２４２，２４３、及び光センサ２４４を有する。位置センサ２４が検焦光２５を射出すると、検焦光２５は、分光ミラー２４２，２４３で反射されて、対物レンズ２１へ導かれる。分光ミラー２４２は、例えば、ハーフミラー又は偏光ビームスプリッタとしてもよい。分光ミラー２４３は、例えば、ダイクロイックミラーとしてもよい。検焦光２５は、対物レンズ２１によって集光され、ウェルプレート６０の底面に照射される。ウェルプレート６０の底面にて反射された検焦光２５は、対物レンズ２１を通って再び位置センサ２４に戻る。反射された検焦光２５は、位置センサ２４内の分光ミラー２４３を反射し、分光ミラー２４２を通過して、光センサ２４４にて検出される。光センサ２４４が検出した検焦光２５は、対物レンズ２１の焦点位置からの誤差を反映した焦点誤差信号として処理装置５０へ出力される。処理装置５０は、焦点誤差信号に基づき、ウェルプレート６０の基準点のＺ方向の位置を検出する。このように、位置センサ２４は、ウェルプレート６０の基準点に対物レンズ２１の焦点面が位置する対物レンズ２１のＺ方向の位置を検出し、その対物レンズ２１のＺ方向の位置に基づき基準点のＺ方向の位置を検出してもよい。なお、位置センサ２４は、非点収差方式の他、ナイフエッジ方式、共焦点方式、及び三角測量方式等の任意の焦点検出方式を用いて、ウェルプレート６０のＺ方向の位置を検出してもよい。
【0032】
共焦点スキャナ３０は、顕微鏡２０及び発光装置１０と光学的に接続される。例えば、共焦点スキャナ３０は、顕微鏡２０と発光装置１０とに取り付けられる。共焦点スキャナ３０は、ピンホールアレイディスク（以下「ニポウディスク」と称する。）３１、部材３２、マイクロレンズアレイディスク（以下「ＭＬディスク」と称する。）３３、ダイクロイックミラー（以下「ＤＭ」と称する。）３４、リレーレンズ３５、バンドパスフィルタ３６、及びリレーレンズ３７を備える。
【0033】
ＤＭ３４は、励起光束１１は透過し、所望の蛍光信号１２は反射するように設計されている。ＭＬディスク３３には、複数の集光光学素子（マイクロレンズ）が、例えば、らせん状に配設されている。ニポウディスク３１は、ＭＬディスク３３の複数の集光光学素子による励起光束１１の集光位置にそれぞれ配設された複数のピンホールを有する。共焦点スキャナ３０は、処理装置５０から送信される制御信号に基づき、モータ等により、ニポウディスク３１及びＭＬディスク３３を、互いに部材３２により機械的に連結された状態で、回転中心軸３９を中心に高速に回転させることができる。ここで、ニポウディスク３１上に形成された個々のピンホールが試料６の表面を掃引するように、個々のマイクロレンズとピンホールは配置されている。したがって、ニポウディスク３１は、照明光（励起光束１１）を試料６に対して走査する走査部として機能する。ニポウディスク３１は、複数のピンホールを、励起光束１１の光軸に対し略垂直の平面内で回転させる。なお、撮像動作中、ＭＬディスク３３とニポウディスク３１は常に回転している。
【0034】
ＭＬディスク３３を通過した励起光束１１の大部分がニポウディスク３１を通過する。そのため、共焦点スキャナ３０は、ニポウディスク３１を単独で使用する場合と比べて、ＭＬディスク３３及びニポウディスク３１を組み合わせて使用することにより、試料６への励起光束１１の照射強度が増大する。さらに、ニポウディスク３１におけるピンホール以外の部分での励起光束１１の反射が抑制される。したがって、試料６の像のＳＮ比（Signal-to-Noise Ratio）が増大する。
【0035】
励起光束１１は、ＭＬディスク３３により個別の光束に集光され、ＤＭ３４を透過後、ニポウディスク３１の個々のピンホールを通過する。励起光束１１は、顕微鏡２０のリレーレンズ２３を通過後、対物レンズ２１により、ウェルプレート６０のウェル（穴）に載置された試料６に集光される。
【0036】
前述のように、ウェルプレート６０の試料６の各々には蛍光試薬が付加されている。試料６の各々の蛍光試薬が発した蛍光信号１２は再び対物レンズ２１及びリレーレンズ２３を通過し、ニポウディスク３１の個々のピンホール上に集光される。
【0037】
ニポウディスク３１のピンホールを通過した蛍光信号１２はＤＭ３４で反射される。共焦点スキャナ３０は、ＤＭ３４で反射した蛍光信号１２を、撮像装置としてのカメラ４０の２次元センサ（撮像素子）４１に結像させる無限遠補正光学系のリレーレンズ３５及びリレーレンズ３７を有する。また、共焦点スキャナ３０は、リレーレンズ３５及びリレーレンズ３７の間に、バンドパスフィルタ３６を有する。バンドパスフィルタ３６は、蛍光信号１２に含まれる蛍光を選択的に透過させるバリアフィルタ（吸収フィルタ）により実現してもよい。
【0038】
ニポウディスク３１のピンホールが並んでいる平面と、試料６の表面と、カメラ４０の２次元センサ４１の受光面とは互いに光学的に共役な関係に配置されている。そのため、カメラ４０の２次元センサ４１上には試料６の光学的断面像、すなわち共焦点画像が結像される。また、前述のように、対物レンズ２１の駆動装置２２は、処理装置５０からの制御信号に基づき駆動して、対物レンズ２１を励起光束１１の光軸に平行な方向に変位させることができる。対物レンズ２１はリレーレンズ２３と無限遠補正光学系を構成するため、ニポウディスク３１及び２次元センサ４１の受光面との間で光学的に共役な関係を維持しながら、対物レンズ２１の変位により、試料６における対物レンズ２１の焦点面を変位させることができる。対物レンズ２１の焦点面は、顕微鏡２０の撮像平面を構成する。カメラ４０は処理装置５０からの露光信号に基づき、その２次元センサ４１の受光面に投影された像を指定の時間露光し、デジタル画像データに変換する。すなわち、カメラ４０は、処理装置５０からＯＮの露光信号を受信している間、露光を行って、２次元センサ４１に画像を形成する。デジタル画像データは処理装置５０へ転送され、処理装置５０の記憶部５２に保存される。
【0039】
処理装置５０は、顕微鏡システム１に含まれる各構成部と接続され、各構成部へ制御信号を送信することで顕微鏡システム１全体の動作を制御する。ただし、処理装置５０は、カメラ４０に対しては、露光信号を送信して、撮像時における露光を制御する。処理装置５０は、ユーザが顕微鏡システム１を操作して観察を行うためのユーザインタフェースも提供する。処理装置５０は、例えば、コンピュータ装置であり、ＰＣ（Personal Computer）、タブレットＰＣ、スマートフォン及びフィーチャーフォン等の携帯電話機、並びに携帯情報端末（ＰＤＡ：Personal Digital Assistant）等の任意の装置を含む。
【0040】
処理装置５０は、制御部５１、記憶部５２、及び入出力部５３を備える。制御部５１は、１つ以上のプロセッサを含む。一実施形態において「プロセッサ」は、汎用のプロセッサ、又は特定の処理に特化した専用のプロセッサであるが、これらに限定されない。制御部５１は、処理装置５０を構成する各構成部と通信可能に接続され、処理装置５０全体の動作を制御する。
【0041】
記憶部５２は、ＨＤＤ（Hard Disk Drive）、ＳＳＤ（Solid State Drive）、ＲＯＭ（Read-Only Memory）、及びＲＡＭ（Random Access Memory）を含む任意の記憶モジュールを含む。記憶部５２は、例えば、主記憶装置、補助記憶装置、及びキャッシュメモリとして機能してもよい。記憶部５２は、処理装置５０の動作に用いられる又は処理装置５０の動作の結果得られた任意の情報を記憶する。例えば、記憶部５２は、処理装置５０を動作させるためのシステムプログラム、及びアプリケーションプログラム等のプログラム、並びに、カメラ４０が撮像した撮像画像の画像データ等を記憶する。
【0042】
処理装置５０の機能は、本実施形態に係る顕微鏡システム１を機能させるために用いられうるプログラム（コンピュータプログラム）を、制御部５１に含まれるプロセッサで実行することにより実現され得る。すなわち、処理装置５０の機能は、ソフトウェアにより実現されうる。プログラムは、処理装置５０の動作に含まれるステップの処理をコンピュータに実行させることで、各ステップの処理に対応する機能をコンピュータに実現させる。すなわち、プログラムは、コンピュータを本実施形態に係る処理装置５０として機能させるためのプログラムである。
【0043】
プログラムは、コンピュータで読み取り可能な記録媒体に記録しておくことができる。コンピュータで読み取り可能な記録媒体は、例えば、磁気記録装置、光ディスク、光磁気記録媒体、又は半導体メモリである。プログラムの流通は、例えば、プログラムを記録したＤＶＤ（Digital Versatile Disc）又はＣＤ－ＲＯＭ（Compact Disc ROM）などの可搬型記録媒体を販売、譲渡、又は貸与することによって行うことができる。プログラムをサーバのストレージに格納しておき、ネットワークを介して、サーバから他のコンピュータにプログラムを転送することにより、プログラムは流通されてもよい。プログラムはプログラムプロダクトとして提供されてもよい。
【0044】
コンピュータは、例えば、可搬型記録媒体に記録されたプログラム又はサーバから転送されたプログラムを、一旦、主記憶装置に格納する。そして、コンピュータは、主記憶装置に格納されたプログラムをプロセッサで読み取り、読み取ったプログラムに従った処理をプロセッサで実行する。コンピュータは、可搬型記録媒体から直接プログラムを読み取り、プログラムに従った処理を実行してもよい。コンピュータは、コンピュータにサーバからプログラムが転送される度に、逐次、受け取ったプログラムに従った処理を実行してもよい。このような処理は、サーバからコンピュータへのプログラムの転送を行わず、実行指示及び結果取得のみによって機能を実現する、いわゆるＡＳＰ（Application Service Provider）型のサービスによって実行されてもよい。プログラムには、電子計算機による処理の用に供する情報であってプログラムに準ずるものが含まれる。例えば、コンピュータに対する直接の指令ではないがコンピュータの処理を規定する性質を有するデータは、「プログラムに準ずるもの」に該当する。
【0045】
処理装置５０の一部又は全ての機能が、制御部５１に含まれる専用回路により実現されてもよい。すなわち、処理装置５０の一部又は全ての機能が、ハードウェアにより実現されてもよい。また、処理装置５０は単一の情報処理装置により実現されてもよいし、複数の情報処理装置の協働により実現されてもよい。
【0046】
入出力部５３は、ユーザの操作を受け付けて操作に基づく情報を入力する入力部、並びに、処理装置５０の演算結果及びカメラ４０が撮像した撮像画像等を出力する出力部を備える。入力部は、例えば、物理キー、静電容量キー、ポインティングディバイス、出力部のディスプレイと一体的に設けられたタッチスクリーン、又は音声入力を受け付けるマイク等である。出力部は、例えば、情報を画像で出力するディスプレイ、又は情報を音声で出力するスピーカ等である。
【0047】
上記のような構成を有する顕微鏡システム１は、対物レンズ２１の焦点面を試料６に対して励起光束１１の光軸に平行な方向に変位させながら撮像を行うことで、試料６に傾きがある場合であっても視野全体でピントが合った画像を撮像することを可能にする。
【0048】
【0049】
【0050】
フレーム６１は樹脂製であり、試料面となる底面６２は薄板の樹脂製又は薄板のガラス製であるのが一般的である。そのため、フレーム６１成形時のひずみ（数１００μｍ程度）を原因としたフレーム６１のたわみにより、ウェルプレート６０が顕微鏡２０の試料台に対して水平に設置されず、その結果、顕微鏡２０の焦点面に対して試料面が傾く場合がある。また、底面６２成形時のひずみ（数１０μｍ程度）を原因として、底面６２がたわむことにより、顕微鏡２０の焦点面に対して試料面が傾く場合もある。
【0051】
図３～図５は、被撮像サンプル６３の側面図を模式的に示す図である。図３では、細胞の培養面６４が水平に設けられており、被撮像サンプル６３の培養面６４と顕微鏡２０の対物レンズ２１の焦点面６５が適合している。したがって、このような状態で撮像を行うと、カメラ４０は、視野全体でピントが合った画像を取得する。
【0052】
図４では、対物レンズ２１の焦点面６５に対して細胞の培養面６４が傾いている。そのため、このままの状態で撮像を行うと、視野の一部の輝度が著しく低下した画像が取得される。図５では、多数の被撮像サンプル６３が集まって、厚みを持った塊６６を形成している。そのため、顕微鏡２０の焦点面６５が塊６６の中心を通過する状態で共焦点顕微鏡により撮像を行うと、厚みを持った塊６６の一部分しか撮像画像に反映することができないことになる。
【0053】
図６は、本実施形態に係る顕微鏡システム１が実行する、被撮像サンプル６３の奥行に応じた対物レンズ２１の焦点位置の制御を模式的に示す図である。図６において、被撮像サンプル６３の培養面６４は焦点面に対して傾いている。そこで、処理装置５０は、試料６に対する対物レンズ２１の焦点の相対位置を、励起光束１１の光軸に平行な方向に変位させながら、カメラ４０による撮像を行うように制御する。具体的には、本実施形態では、処理装置５０は、試料６を動かさずに、駆動装置２２が対物レンズ２１を変位させながら、カメラ４０による撮像を行うように制御する。対物レンズ２１の変位幅７１は、励起光束１１の光軸に平行な方向における、ウェルプレート６０において試料６が分布する範囲の幅としてもよい。図６の右に示すように、処理装置５０は、時間ｔの経過に伴い、試料６に対する対物レンズ２１の焦点の相対位置を等速度で変位させている間に、カメラ４０へ露光信号を送信して露光させてもよい。これにより、試料６が分布する奥行方向の範囲をカバーした画像を撮像することができ、明瞭な撮像画像を取得することが可能である。
【0054】
（実施例１）
次に、図７及び図８を参照して、顕微鏡システム１の動作の実施例１を説明する。図７は、顕微鏡システム１が実行する撮像処理の動作を示すフローチャートである。図８は、ウェルプレート６０の底面６２のたわみを模式的に示す図である。図７及び図８を参照して説明する顕微鏡システム１の動作は実施例１に係る撮像方法の一つに相当する。図７の各ステップの動作は、処理装置５０の制御部５１の制御に基づき実行される。本実施形態に係る撮像方法をコンピュータに実行させるためのプログラムは、図７に示す各ステップを含む。以下の処理の前提として、試料６を載置するウェルプレート６０が測定を行うための測定位置に設定されている。
次に、図７及び図８を参照して、顕微鏡システム１の動作の実施例１を説明する。図７は、顕微鏡システム１が実行する撮像処理の動作を示すフローチャートである。図８は、ウェルプレート６０の底面６２のたわみを模式的に示す図である。図７及び図８を参照して説明する顕微鏡システム１の動作は実施例１に係る撮像方法の一つに相当する。図７の各ステップの動作は、処理装置５０の制御部５１の制御に基づき実行される。本実施形態に係る撮像方法をコンピュータに実行させるためのプログラムは、図７に示す各ステップを含む。以下の処理の前提として、試料６を載置するウェルプレート６０が測定を行うための測定位置に設定されている。
【0055】
ステップＳ００１において、制御部５１は、顕微鏡システム１による撮像に関する測定条件の設定をユーザから受け付ける。このような測定条件としては、例えば、以下のものが挙げられる。
・試料６に対する対物レンズ２１の焦点の相対位置の変位幅Δｚa（対物レンズ２１の焦点位置の移動範囲）
・露光時間Ｔexp
・撮像を実行するウェルプレート６０上のＸＹ位置のリスト
ここで、変位幅Δｚaは、例えば１０μｍ～数１００μｍであり、試料６の厚み並びにウェルプレート６０の傾き及びたわみを加味した試料６が存在するＺ方向（励起光束１１の光軸に平行な方向）の範囲を示す値である。露光時間Ｔexpは５０ｍｓ～１ｓ程度の値としてもよい。また、制御部５１は、ウェルプレート６０の寸法情報の入力を受け付けてもよい。
・試料６に対する対物レンズ２１の焦点の相対位置の変位幅Δｚa（対物レンズ２１の焦点位置の移動範囲）
・露光時間Ｔexp
・撮像を実行するウェルプレート６０上のＸＹ位置のリスト
ここで、変位幅Δｚaは、例えば１０μｍ～数１００μｍであり、試料６の厚み並びにウェルプレート６０の傾き及びたわみを加味した試料６が存在するＺ方向（励起光束１１の光軸に平行な方向）の範囲を示す値である。露光時間Ｔexpは５０ｍｓ～１ｓ程度の値としてもよい。また、制御部５１は、ウェルプレート６０の寸法情報の入力を受け付けてもよい。
【0056】
ＸＹ位置は、ウェルプレート６０における位置である。図８のように、ＸＹ位置は、例えば、ｉを１以上ｍ以下の整数、ｊを１以上ｎ以下の整数として、（ｘi，ｙj）と表すことができる。ｘi，ｙjの各々は、例えば、図２Ａに示すように、ウェル６８を特定するＡ、Ｂ、Ｃ、・・・、及び、１、２、３、・・・に対応付けてもよい。ウェルプレート６０に傾き及びゆがみが生じていない場合、ＸＹ位置（ｘi，ｙj）の各々についてのウェルプレート６０の底面６２のＺ方向の位置は同一であるが、傾き又はゆがみが生じた場合、ＸＹ位置（ｘi，ｙj）の各々についてのウェルプレート６０の底面６２のＺ方向の位置は同一でなくなる。図８のように、ＸＹ位置（ｘi，ｙj）におけるウェルプレート６０の底面６２のＺ方向の位置をｚi,jと表す。
【0057】
ステップＳ００２において、制御部５１は、顕微鏡システム１の各構成要素を制御して、各構成要素の位置合わせを行い、最初の撮像を実行するＸＹ位置の試料６が励起光束１１による撮像範囲に位置するようにウェルプレート６０をＸＹ方向に移動させる。以下、制御部５１は、ステップＳ００１で設定を受け付けたリストに含まれるＸＹ位置の各々について、ステップＳ００３～Ｓ００９の処理を実行する。以下、処理対象のＸＹ位置を（ｘi，ｙj）と表す。
【0058】
ステップＳ００３において、制御部５１は、駆動装置２２を制御し、対物レンズ２１をＺ方向に移動させながら、位置センサ２４の信号を読み取り、対物レンズ２１の焦点が、ウェルプレート６０の底面６２に一致する対物レンズ２１の位置ｚ0(i,j)を検索する。
【0059】
ステップＳ００４において、制御部５１は、駆動装置２２を制御し、ステップＳ００３で検索した位置ｚ0(i,j)に対物レンズ２１を移動させる。
【0060】
ステップＳ００５において、制御部５１は、発光装置１０から励起光束１１を射出しながらＭＬディスク３３及びニポウディスク３１を回転するように、共焦点スキャナ３０及び発光装置１０を制御する。これにより、励起光束１１は、ＭＬディスク３３により個別の光束に集光され、ＤＭ３４を透過後、ニポウディスク３１の個々のピンホールを通過し、顕微鏡２０の対物レンズ２１により、ウェルプレート６０のウェル６８に載置された試料６に集光される。励起光束１１により試料６の蛍光試薬が発した蛍光信号１２は、再び対物レンズ２１を通り、ニポウディスク３１の個々のピンホール上に集光される。個々のピンホールを通過した蛍光信号１２はＤＭ３４で反射され、リレーレンズ３５，３７を通り、バンドパスフィルタ３６を介してカメラ４０に結像されるよう共焦点スキャナ３０の開口部（共焦点画像取り出しポート）から射出される。一方で、制御部５１は、対物レンズ２１をｚ0(i,j)からｚ0(i,j)＋Δｚaへ、例えば等速度で移動させながら、カメラ４０にて露光時間Ｔexpだけ露光し、画像を取得する。具体的には、制御部５１は、駆動装置２２へ制御信号を送信することで駆動装置２２に対物レンズ２１を変位させながら、カメラ４０へ露光信号を送信して２次元センサ４１に露光させて撮像を行わせる。
【0061】
上記の対物レンズ２１の駆動とカメラ４０の露光が終了したら、ステップＳ００６において、制御部５１は発光装置１０からの励起光束１１の射出を終了する。
【0062】
ステップＳ００７において、制御部５１は、カメラ４０にて取得された画像データを、処理装置５０の記憶部５２に転送する。
【0063】
ステップＳ００８において、制御部５１は、ステップＳ００１でユーザによって指定された撮像を実行するすべてのＸＹ位置に対する撮像が終了したか否かを判断する。撮像を実行するすべてのＸＹ位置に対する撮像が終了していない場合、すなわち、ユーザによって指定されたＸＹ位置のうち撮像済みでないものが存在する場合（ステップＳ００８でＮＯ）、制御部５１は、ステップＳ００９へ進む。撮像を実行するすべてのＸＹ位置において撮像が終了した場合（ステップＳ００８でＹＥＳ）、制御部５１は、一連の動作を終了する。
【0064】
ステップＳ００９において、制御部５１は、次の撮像を実行するＸＹ位置の試料６が励起光束１１による撮像範囲に位置するようにウェルプレート６０をＸＹ方向に移動させ、ステップＳ００３戻る。
【0065】
以上のように、実施例１において、制御部５１は、撮影を実行するＸＹ位置（ｘi，ｙj）におけるウェルプレート６０の底面６２に対応する対物レンズ２１の位置ｚ0(i,j)を検出する。そして、制御部５１は、その位置ｚ0(i,j)からユーザにより設定されたＺ方向の変位幅Δｚaだけ対物レンズ２１をｚ方向に移動しながら試料６を撮影する。このように、実施例１においては、試料６における対物レンズ２１の焦点位置を励起光束１１の光軸に平行な方向に変位させながら共焦点撮像を行う。このため、試料面が傾いている場合であっても、共焦点撮像により、視野内の部分的な輝度低下のない明瞭な画像の撮像をすることが可能である。また、顕微鏡システム１は、複雑な構成を要しないため、機構設計上の制限を伴わない。顕微鏡システム１は、一回の撮像により撮像画像を取得するため、撮像速度が著しく低下することもない。したがって、試料面が傾いている場合であっても、機構設計上の制限、及び撮像速度の著しい低下等を伴わずに、視野内の部分的な輝度低下のない明瞭な画像の撮像をすることが可能である。
【0066】
（実施例２）
次に、図８、図９Ａ、及び図９Ｂを参照して、顕微鏡システム１の動作の実施例２を説明する。実施例１では、ウェルプレート６０における各ＸＹ位置について、ウェルプレート６０の底面６２の位置を検出し、その底面６２の位置からユーザが設定した変位幅Δｚaだけ変位させながら撮像を行う例を説明した。本実施例では、各ＸＹ位置におけるウェルプレート６０の局所的な傾きに応じた試料６が存在する範囲の変位幅Δｚc(i,j)を検出し、それを反映した撮像範囲において撮像を行う例を説明する。図９Ａ及び図９Ｂは、顕微鏡システム１が実行する撮像処理の動作を示すフローチャートである。図９Ａ及び図９Ｂを参照して説明する顕微鏡システム１の動作は実施例２に係る撮像方法の一つに相当する。図９Ａ及び図９Ｂの各ステップの動作は、処理装置５０の制御部５１の制御に基づき実行される。本実施形態に係る撮像方法をコンピュータに実行させるためのプログラムは、図９Ａ及び図９Ｂに示す各ステップを含む。以下の処理の前提として、試料６を載置するウェルプレート６０が測定を行うための測定位置に設定されている。
次に、図８、図９Ａ、及び図９Ｂを参照して、顕微鏡システム１の動作の実施例２を説明する。実施例１では、ウェルプレート６０における各ＸＹ位置について、ウェルプレート６０の底面６２の位置を検出し、その底面６２の位置からユーザが設定した変位幅Δｚaだけ変位させながら撮像を行う例を説明した。本実施例では、各ＸＹ位置におけるウェルプレート６０の局所的な傾きに応じた試料６が存在する範囲の変位幅Δｚc(i,j)を検出し、それを反映した撮像範囲において撮像を行う例を説明する。図９Ａ及び図９Ｂは、顕微鏡システム１が実行する撮像処理の動作を示すフローチャートである。図９Ａ及び図９Ｂを参照して説明する顕微鏡システム１の動作は実施例２に係る撮像方法の一つに相当する。図９Ａ及び図９Ｂの各ステップの動作は、処理装置５０の制御部５１の制御に基づき実行される。本実施形態に係る撮像方法をコンピュータに実行させるためのプログラムは、図９Ａ及び図９Ｂに示す各ステップを含む。以下の処理の前提として、試料６を載置するウェルプレート６０が測定を行うための測定位置に設定されている。
【0067】
ステップＳ１０１において、制御部５１は、顕微鏡システム１による撮像に関する測定条件の設定をユーザから受け付ける。このような測定条件としては、例えば、以下のものが挙げられる。
・試料６に対する対物レンズ２１の焦点の相対位置の変位幅Δｚb（対物レンズ２１の焦点位置の移動範囲）
・露光時間Ｔexp
・撮像を実行するウェルプレート６０上のＸＹ位置のリスト
ここで、変位幅Δｚbは、例えば１０μｍ～数１００μｍであり、試料６の厚みに基づいてユーザが入力するＺ方向の幅を示す値である。露光時間Ｔexpは５０ｍｓ～１ｓ程度の値としてもよい。また、制御部５１は、ウェルプレート６０の寸法情報の入力を受け付けてもよい。
・試料６に対する対物レンズ２１の焦点の相対位置の変位幅Δｚb（対物レンズ２１の焦点位置の移動範囲）
・露光時間Ｔexp
・撮像を実行するウェルプレート６０上のＸＹ位置のリスト
ここで、変位幅Δｚbは、例えば１０μｍ～数１００μｍであり、試料６の厚みに基づいてユーザが入力するＺ方向の幅を示す値である。露光時間Ｔexpは５０ｍｓ～１ｓ程度の値としてもよい。また、制御部５１は、ウェルプレート６０の寸法情報の入力を受け付けてもよい。
【0068】
ステップＳ１０２において、制御部５１は、撮像を実行するウェルプレート６０のＸＹ位置のリストに基づき、プレスキャンを実行するＸＹ位置（ｘ1，ｙ1）～（ｘm，ｙn）を設定する。
【0069】
ステップＳ１０３において、制御部５１は、顕微鏡システム１の各構成要素を制御して、各構成要素の位置合わせを行い、最初のプレスキャンを実行するＸＹ位置の試料６が励起光束１１による撮像範囲に位置するようにウェルプレート６０をＸＹ方向に移動させる。プレスキャンとは、各ＸＹ位置（ｘi，ｙj）において、対物レンズ２１の焦点がウェルプレート６０の底面６２に一致するＺ方向の位置ｚ0(i,j)を検索する動作である。以下、制御部５１は、ステップＳ１０２で設定したＸＹ位置の各々について、ステップＳ１０４～Ｓ１０６の処理を実行する。以下、処理対象のＸＹ位置を（ｘi，ｙj）と表す。
【0070】
ステップＳ１０４において、制御部５１は、駆動装置２２を制御し、対物レンズ２１をＺ方向に移動させながら、位置センサ２４の信号を読み取り、対物レンズ２１の焦点が、ウェルプレート６０の底面６２に一致する対物レンズ２１のＺ方向の位置ｚ0(i,j)を検索する。ここで、位置ｚ0(i,j)は、ＸＹ位置（ｘi，ｙj）に対する対物レンズ２１のＺ方向の位置である。
【0071】
ステップＳ１０５において、制御部５１は、プレスキャンを実行するすべてのＸＹ位置（ｘi，ｙj）においてｚ0(i,j)の検索が終了したかを判断する。プレスキャンを実行するすべてのＸＹ位置に対するプレスキャンが終了していない場合、すなわち、ユーザによって指定されたＸＹ位置のうちプレスキャンが終了していないものが存在する場合（ステップＳ１０５でＮＯ）、制御部５１は、ステップＳ１０６へ進む。プレスキャンを実行するすべてのＸＹ位置においてプレスキャンが終了した場合（ステップＳ１０５でＹＥＳ）、制御部５１は、ステップ１０７に進む。
【0072】
ステップＳ１０６において、制御部５１は、次のプレスキャンを実行するＸＹ位置の試料６が励起光束１１による撮像範囲に位置するようにウェルプレート６０をＸＹ方向に移動させ、ステップＳ１０４に戻る。
【0073】
ステップＳ１０７において、制御部５１は、プレスキャン結果（ｘ1，ｙ1，ｚ0(1,1)）～（ｘm，ｙn，ｚ0(m,n)）を元に、撮像を実行する各ＸＹ位置（ｘi，ｙj）におけるウェルプレート６０の底面６２の傾きｇｒａｄ（ｚi,j）を算出する。傾きｇｒａｄ（ｚi,j）はＸ方向の傾きを示すｇｒａｄ（ｚi,j）xとＹ方向の傾きを示すｇｒａｄ（ｚi,j）yとを有するベクトル量となる。ｇｒａｄ（ｚi,j）x及びｇｒａｄ（ｚi,j）yは例えば次の式１により算出されてもよい。
［式１］
ｇｒａｄ（ｚi,j）x＝（ｚi+1,j－ｚi-1,j）／（ｘi+1－ｘi-1）
ｇｒａｄ（ｚi,j）y＝（ｚi,j+1－ｚi,j-1）／（ｙj+1－ｙj-1）
［式１］
ｇｒａｄ（ｚi,j）x＝（ｚi+1,j－ｚi-1,j）／（ｘi+1－ｘi-1）
ｇｒａｄ（ｚi,j）y＝（ｚi,j+1－ｚi,j-1）／（ｙj+1－ｙj-1）
【0074】
ステップＳ１０８において、制御部５１は、撮像を実行するＸＹ位置におけるウェルプレート６０の底面６２の傾きｇｒａｄ（ｚi,j）とカメラ４０の２次元センサ４１のサイズを元に撮像を実行する各ＸＹ位置における撮像Ｚ範囲Δｚc(i,j)を算出する。ここで、Δｚc(i,j)はウェルプレート６０の傾きによる試料６が存在するＺ方向の範囲である。例えば、２次元センサ４１が長方形を有し、Ｘ方向の撮影範囲に対応する長さがＬ1、Ｙ方向の撮影範囲に対応する長さがＬ2であるとする。この場合、Ｘ方向の傾きによるＺ方向の変位量は、Ｌ1×ｇｒａｄ（ｚi,j）xとなる。Ｙ方向の傾きによるＺ方向の変位量は、Ｌ2×ｇｒａｄ（ｚi,j）yとなる。したがって、制御部５１は、例えば、次の式２により撮像Ｚ範囲Δｚc(i,j)を算出してもよい。
［式２］
Δｚc(i,j)＝Ｌ1×ｇｒａｄ（ｚi,j）x＋Ｌ2×ｇｒａｄ（ｚi,j）y
［式２］
Δｚc(i,j)＝Ｌ1×ｇｒａｄ（ｚi,j）x＋Ｌ2×ｇｒａｄ（ｚi,j）y
【0075】
ステップＳ１０９において、制御部５１は、顕微鏡システム１の各構成要素を制御して、各構成要素の位置合わせを行い、最初の撮像を実行するＸＹ位置の試料６が励起光束１１による撮像範囲に位置するようにウェルプレート６０をＸＹ方向に移動させる。以下、制御部５１は、ステップＳ００１で設定を受け付けたリストに含まれるＸＹ位置の各々について、ステップＳ１１０～Ｓ１１６の処理を実行する。以下、処理対象のＸＹ位置を（ｘi，ｙj）と表す。
【0076】
ステップＳ１１０において、制御部５１は、駆動装置２２を制御し、対物レンズ２１をＺ方向に移動させながら、位置センサ２４の信号を読み取り、対物レンズ２１の焦点が、ウェルプレート６０の底面６２に一致する位置ｚ0(i,j)を検索する。
【0077】
ステップＳ１１１において、制御部５１は、駆動装置２２を制御し、ステップＳ１１０で検索した位置ｚ0(i,j)に対物レンズ２１を移動させる。
【0078】
ステップＳ１１２において、制御部５１は、発光装置１０から励起光束１１を射出しながらＭＬディスク３３及びニポウディスク３１を回転するように、共焦点スキャナ３０及び発光装置１０を制御する。これにより、励起光束１１は、ＭＬディスク３３により個別の光束に集光され、ＤＭ３４を透過後、ニポウディスク３１の個々のピンホールを通過し、顕微鏡２０の対物レンズ２１により、ウェルプレート６０のウェル６８に載置された試料６に集光される。励起光束１１により試料６の蛍光試薬が発した蛍光信号１２は、再び対物レンズ２１を通り、ニポウディスク３１の個々のピンホール上に集光される。個々のピンホールを通過した蛍光信号１２はＤＭ３４で反射され、リレーレンズ３５，３７を通り、バンドパスフィルタ３６を介してカメラ４０に結像されるよう共焦点スキャナ３０の開口部（共焦点画像取り出しポート）から射出される。一方で、制御部５１は、対物レンズ２１をｚ0(i,j)からｚ0(i,j)＋Δｚb＋Δｚc(i,j)へ、例えば等速度で移動させながら、カメラ４０にて露光時間Ｔexpだけ露光し、画像を取得する。具体的には、制御部５１は、駆動装置２２へ制御信号を送信することで駆動装置２２に対物レンズ２１を変位させながら、カメラ４０へ露光信号を送信して２次元センサ４１に露光させて撮像を行わせる。
【0079】
上記の対物レンズ２１の駆動とカメラ４０の露光が終了したら、ステップＳ１１３において、制御部５１は発光装置１０からの励起光束１１の射出を終了する。
【0080】
ステップＳ１１４において、制御部５１は、カメラ４０にて取得された画像データを、処理装置５０の記憶部５２に転送する。
【0081】
ステップＳ１１５において、制御部５１は、ステップＳ１０１でユーザによって指定された撮像を実行するすべてのＸＹ位置に対する撮像が終了したか否かを判断する。撮像を実行するすべてのＸＹ位置に対する撮像が終了していない場合、すなわち、ユーザによって指定されたＸＹ位置のうち撮像済でないものが存在する場合（ステップＳ１１５でＮＯ）、制御部５１は、ステップＳ１１６へ進む。撮像を実行するすべてのＸＹ位置において撮像が終了した場合（ステップＳ１１５でＹＥＳ）、制御部５１は、一連の動作を終了する。
【0082】
ステップＳ１１６において、制御部５１は、次の撮像を実行するＸＹ位置の試料６が励起光束１１による撮像範囲に位置するようにウェルプレート６０をＸＹ方向に移動させ、ステップＳ１１３に戻る。
【0083】
以上のように、実施例２に係る顕微鏡システム１は、実施例１の処理に加え、プレスキャンを行って、各ＸＹ位置におけるウェルプレート６０の局所的な傾きを検出する。そして、顕微鏡システム１は、ウェルプレート６０の局所的な傾きに応じた試料６が存在する範囲の変位幅Δｚc(i,j)を検出し、それを反映した撮像範囲において撮像を行う。したがって、本実施例によれば、撮像を実施するＸＹ位置におけるウェルプレート６０の傾きとそれによる試料６が存在するＺ方向の範囲を予測することができるため、過不足のない撮像Ｚ範囲を設定して撮像を行うことが可能となる。
【0084】
（実施例３）
次に、図８、図１０Ａ、及び図１０Ｂを参照して、顕微鏡システム１の動作の実施例３を説明する。実施例２では、プレスキャンを行ってウェルプレート６０における各ＸＹ位置について、ウェルプレート６０の局所的な傾きに応じた変位幅Δｚc(i,j)を検出し、次に、再度、各ＸＹ位置のスキャンを行って、各ＸＹ位置における試料６の撮像を行う例を説明した。本実施例では、１回のスキャンの中で、各ＸＹ位置におけるウェルプレート６０の局所的な傾きに応じた変位幅Δｚc(i,j)の検出と、試料６の撮像とを実行する例を説明する。図１０Ａ及び図１０Ｂは、顕微鏡システム１が実行する撮像処理の動作を示すフローチャートである。図１０Ａ及び図１０Ｂを参照して説明する顕微鏡システム１の動作は実施例３に係る撮像方法の一つに相当する。図１０Ａ及び図１０Ｂの各ステップの動作は、処理装置５０の制御部５１の制御に基づき実行される。本実施形態に係る撮像方法をコンピュータに実行させるためのプログラムは、図１０Ａ及び図１０Ｂに示す各ステップを含む。以下の処理の前提として、試料６を載置するウェルプレート６０が測定を行うための測定位置に設定されている。
次に、図８、図１０Ａ、及び図１０Ｂを参照して、顕微鏡システム１の動作の実施例３を説明する。実施例２では、プレスキャンを行ってウェルプレート６０における各ＸＹ位置について、ウェルプレート６０の局所的な傾きに応じた変位幅Δｚc(i,j)を検出し、次に、再度、各ＸＹ位置のスキャンを行って、各ＸＹ位置における試料６の撮像を行う例を説明した。本実施例では、１回のスキャンの中で、各ＸＹ位置におけるウェルプレート６０の局所的な傾きに応じた変位幅Δｚc(i,j)の検出と、試料６の撮像とを実行する例を説明する。図１０Ａ及び図１０Ｂは、顕微鏡システム１が実行する撮像処理の動作を示すフローチャートである。図１０Ａ及び図１０Ｂを参照して説明する顕微鏡システム１の動作は実施例３に係る撮像方法の一つに相当する。図１０Ａ及び図１０Ｂの各ステップの動作は、処理装置５０の制御部５１の制御に基づき実行される。本実施形態に係る撮像方法をコンピュータに実行させるためのプログラムは、図１０Ａ及び図１０Ｂに示す各ステップを含む。以下の処理の前提として、試料６を載置するウェルプレート６０が測定を行うための測定位置に設定されている。
【0085】
ステップＳ２０１において、制御部５１は、顕微鏡システム１による撮像に関する測定条件の設定をユーザから受け付ける。このような測定条件としては、例えば、以下のものが挙げられる。
・試料６に対する対物レンズ２１の焦点の相対位置の変位幅Δｚb、Δｚd（対物レンズ２１の焦点位置の移動範囲）
・露光時間Ｔexp
・撮像を実行するウェルプレート６０上のＸＹ位置のリスト（ｘ1，ｙ1）～（ｘm，ｙn）
ここで、変位幅Δｚbは例えば１０μｍ～数１００μｍであり、試料６の厚みに基づいてユーザが入力するＺ方向の幅を示す値である。変位幅Δｚdは例えば数μｍ～数１０μｍであり、撮像を実施するＸＹ位置におけるウェルプレート６０の傾きによる試料６が存在するＺ方向の範囲をユーザが予想して入力する値である。露光時間Ｔexpは５０ｍｓ～１ｓ程度の値としてもよい。また、制御部５１は、ウェルプレート６０の寸法情報の入力を受け付けてもよい。
・試料６に対する対物レンズ２１の焦点の相対位置の変位幅Δｚb、Δｚd（対物レンズ２１の焦点位置の移動範囲）
・露光時間Ｔexp
・撮像を実行するウェルプレート６０上のＸＹ位置のリスト（ｘ1，ｙ1）～（ｘm，ｙn）
ここで、変位幅Δｚbは例えば１０μｍ～数１００μｍであり、試料６の厚みに基づいてユーザが入力するＺ方向の幅を示す値である。変位幅Δｚdは例えば数μｍ～数１０μｍであり、撮像を実施するＸＹ位置におけるウェルプレート６０の傾きによる試料６が存在するＺ方向の範囲をユーザが予想して入力する値である。露光時間Ｔexpは５０ｍｓ～１ｓ程度の値としてもよい。また、制御部５１は、ウェルプレート６０の寸法情報の入力を受け付けてもよい。
【0086】
ステップＳ２０２において、制御部５１は、撮像を実行する最初のＸＹ位置の試料６が励起光束１１による撮像範囲に位置するようにウェルプレート６０をＸＹ方向に移動させる。以下、制御部５１は、ステップＳ２０１で設定を受け付けたＸＹ位置の各々について、ステップＳ２０３～Ｓ２１３の処理を実行する。以下、処理対象のＸＹ位置を（ｘi，ｙj）と表す。以下、制御部５１は、（ｘ1，ｙ1）、（ｘ2，ｙ1）、・・・、（ｘm，ｙ1）、（ｘ1，ｙ2）、（ｘ2，ｙ2）、・・・、（ｘm，ｙ2）、・・・、（ｘ1，ｙn）、（ｘ2，ｙn）、・・・、（ｘm，ｙn）の順に処理を実行する例を説明するが、これ以外の順に処理を実行してもよい。
【0087】
ステップＳ２０３において、制御部５１は、駆動装置２２を制御し、対物レンズ２１をＺ方向に移動させながら、位置センサ２４の信号を読み取り、対物レンズ２１の焦点が、ウェルプレート６０の底面６２に一致する対物レンズ２１のＺ方向の位置ｚ0(i,j)を検索する。ここで、位置ｚ0(i,j)は、ＸＹ位置（ｘi，ｙj）に対する対物レンズ２１のＺ方向の位置である。
【0088】
ステップＳ２０４において、制御部５１は、現在のＸＹ位置（ｘi，ｙj）に対して、近傍のＸＹ位置（ｘi-1，ｙj）、（ｘi，ｙj-1）における、対物レンズ２１の焦点がウェル６８の底面６２に一致する対物レンズ２１の位置ｚ0(i-1,j)及びｚ0(i,j-1)が既知であるかを判断する。例えば、（ｘ1，ｙ1）、（ｘ2，ｙ1）、・・・、（ｘm，ｙ1）、（ｘ1，ｙ2）、（ｘ2，ｙ2）、・・・、（ｘm，ｙ2）、・・・、（ｘ1，ｙn）、（ｘ2，ｙn）、・・・、（ｘm，ｙn）の順に処理を実行する場合、ｉ＞１かつｊ＞１の場合、（ｘi-1，ｙj）及び（ｘi，ｙj-1）における処理は終了しているため、ｚ0(i-1,j)及びｚ0(i,j-1)は既知である。既知である場合（ステップＳ２０４でＹＥＳ）、制御部５１はステップＳ２０６に進む。既知でない場合（ステップＳ２０４でＮＯ）、制御部５１はステップＳ２０５に進む。
【0089】
ステップＳ２０５において、制御部５１は、撮像時のＺスキャン範囲の要素のうち、撮像を実施するＸＹ位置（ｘi，ｙj）におけるウェルプレート６０の傾きとそれによる試料６が存在するＺ方向の範囲であるΔｚc(i,j)として、ステップＳ２０１でユーザが指定したΔｚdと決定する。そして、制御部５１は、ステップＳ２０８へ進む。
【0090】
ステップＳ２０６において、制御部５１は、現在のＸＹ位置（ｘi，ｙj）のウェルプレート６０の底面６２の傾きｇｒａｄ（ｚi,j）を算出する。制御部５１は、例えば、次の式３により、ｇｒａｄ（ｚi,j）x及びｇｒａｄ（ｚi,j）yを算出してもよい。
［式３］
ｇｒａｄ（ｚi,j）x＝（ｚi,j－ｚi-1,j）／（ｘi－ｘi-1）
ｇｒａｄ（ｚi,j）y＝（ｚi,j－ｚi,j-1）／（ｙj－ｙj-1）
［式３］
ｇｒａｄ（ｚi,j）x＝（ｚi,j－ｚi-1,j）／（ｘi－ｘi-1）
ｇｒａｄ（ｚi,j）y＝（ｚi,j－ｚi,j-1）／（ｙj－ｙj-1）
【0091】
ステップＳ２０７において、制御部５１は、ｇｒａｄ（ｚi,j）とカメラ４０の２次元センサ４１のサイズをもとに、ＸＹ位置（ｘi，ｙj）における撮像Ｚ範囲Δｚc(i,j)を算出する。例えば、２次元センサ４１が、Ｘ方向の撮影範囲に対応する長さＬ1、Ｙ方向の撮影範囲に対応する長さＬ2を有する長方形である場合、図９ＡのＳ１０８と同様に、制御部５１は、次の式４により撮像Ｚ範囲Δｚc(i,j)を算出してもよい。
［式４］
Ｌ1×ｇｒａｄ（ｚi,j）x＋Ｌ2×ｇｒａｄ（ｚi,j）y
そして、制御部５１は、ステップＳ２０８へ進む。
［式４］
Ｌ1×ｇｒａｄ（ｚi,j）x＋Ｌ2×ｇｒａｄ（ｚi,j）y
そして、制御部５１は、ステップＳ２０８へ進む。
【0092】
ステップＳ２０８において、制御部５１は、駆動装置２２を制御し、ステップＳ２０３で検索した位置ｚ0(i,j)に対物レンズ２１を移動させる。
【0093】
ステップＳ２０９において、制御部５１は、発光装置１０から励起光束１１を射出しながらＭＬディスク３３及びニポウディスク３１を回転するように、共焦点スキャナ３０及び発光装置１０を制御する。これにより、励起光束１１は、ＭＬディスク３３により個別の光束に集光され、ＤＭ３４を透過後、ニポウディスク３１の個々のピンホールを通過し、顕微鏡２０の対物レンズ２１により、ウェルプレート６０のウェル６８に載置された試料６に集光される。励起光束１１により試料６の蛍光試薬が発した蛍光信号１２は、再び対物レンズ２１を通り、ニポウディスク３１の個々のピンホール上に集光される。個々のピンホールを通過した蛍光信号１２はＤＭ３４で反射され、リレーレンズ３５，３７を通り、バンドパスフィルタ３６を介してカメラ４０に結像されるよう共焦点スキャナ３０の開口部（共焦点画像取り出しポート）から射出される。一方で、制御部５１は、対物レンズ２１をｚ0(i,j)からｚ0(i,j)＋Δｚb＋Δｚc(i,j)へ、例えば等速度で移動させながら、カメラ４０にて露光時間Ｔexpだけ露光し、画像を取得する。具体的には、制御部５１は、駆動装置２２へ制御信号を送信することで駆動装置２２に対物レンズ２１を変位させながら、カメラ４０へ露光信号を送信して２次元センサ４１に露光させて撮像を行わせる。
【0094】
上記の対物レンズ２１の駆動とカメラ４０の露光が終了したら、ステップＳ２１０において、制御部５１は発光装置１０からの励起光束１１の射出を終了する。
【0095】
ステップＳ２１１において、制御部５１は、カメラ４０にて取得された画像データを、処理装置５０の記憶部５２に転送する。
【0096】
ステップＳ２１２において、制御部５１は、ステップＳ２０１でユーザによって指定された撮像を実行するすべてのＸＹ位置に対する撮像が終了したか否かを判断する。撮像を実行するすべてのＸＹ位置に対する撮像が終了していない場合、すなわち、ユーザによって指定されたＸＹ位置のうち撮像が終了していないものが存在する場合（ステップＳ２１２でＮＯ）、制御部５１は、ステップＳ２１３へ進む。撮像を実行するすべてのＸＹ位置において撮像が終了した場合（ステップＳ２１２でＹＥＳ）、制御部５１は、一連の動作を終了する。
【0097】
ステップＳ２１３において、制御部５１は、次の撮像を実行するＸＹ位置の試料６が励起光束１１によるＸＹ方向の撮像範囲に位置するようにウェルプレート６０を移動させ、ステップＳ２０３戻る。
【0098】
以上のように、実施例３に係る顕微鏡システム１は、プレスキャンを行わずに、撮像動作を実行しながら、撮像を実施するＸＹ位置におけるウェルプレート６０の局所的な傾きを反映した試料６が存在するＺ方向の変位幅Δｚc(i,j)を算出する。したがって、実施例３によれば、過不足のない撮像Ｚ範囲を設定して、その撮像Ｚ範囲における撮像を高速に行うことが可能である。
【0099】
また、処理装置５０は、試料６に対する対物レンズ２１の焦点の相対位置を、ユーザが指定する速度にて、等速度で変位させながら、カメラ４０による撮像を行うように、顕微鏡２０及びカメラ４０を制御してもよい。このように、撮像中は、試料６に対する対物レンズ２１の焦点の相対位置を等速度で変位させるため、撮像中に対物レンズ２１に対する試料６の相対位置が励起光束１１の光軸に直行する方向（ＸＹ方向）に移動して、撮像画像が乱れることを防ぐことができる。
【0100】
また、処理装置５０は、試料６に対する対物レンズ２１の焦点の相対位置を変位させる速度は、ユーザが指定する露光時間Ｔexpと相対位置の変位幅Δｚaを元に決定してもよい。
【0101】
以上のように、本実施形態において、観察対象となる試料６の像を取得する顕微鏡システム１は、発光装置１０、顕微鏡２０、共焦点スキャナ３０、カメラ４０、及び処理装置５０を備える。発光装置１０は、励起光束１１を照射する。共焦点スキャナ３０は、励起光束１１を試料６に対して走査する走査部を有する。顕微鏡２０は、共焦点スキャナ３０により走査された励起光束１１による像を試料６に投影する対物レンズ２１、及び、試料６が載置されるウェルプレート６０の対物レンズ２１の焦点位置に対する位置を検出する位置センサ２４を有する。カメラ４０は、撮像面が走査部に対して共役の位置に配置され、励起光束１１が照射された試料６からの蛍光信号１２を検出する。処理装置５０は、顕微鏡２０及びカメラ４０の動作を制御する。ここで、処理装置５０は、ウェルプレート６０の対物レンズ２１の焦点位置に対する位置に基づいて、試料６に対する対物レンズ２１の焦点の相対位置を、励起光束１１の光軸に平行な方向に変位させながら、カメラ４０による撮像を行うための制御信号を、顕微鏡２０及びカメラ４０へ送信する。このように、本実施形態に係る顕微鏡システム１は、試料６における対物レンズ２１の焦点位置を励起光束１１の光軸に平行な方向に変位させながら共焦点撮像を行う。そのため、顕微鏡システム１は、試料面が傾いている場合であっても、共焦点撮像により、視野内の部分的な輝度低下のない明瞭な画像の撮像をすることが可能である。また、顕微鏡システム１は、複雑な構成を要しないため、機構設計上の制限を伴わない。さらに、顕微鏡システム１は、一回の撮像により撮像画像を取得するため、演算及び記憶に関して大きな負荷を必要としたり、撮像速度を著しく低下させたりすることもない。したがって、試料面が傾いている場合であっても、機構設計上の制限、及び撮像速度の著しい低下等を伴わずに、視野内の部分的な輝度低下のない明瞭な画像の撮像をすることが可能である。
【0102】
また、共焦点スキャナ３０は、走査部として、複数のピンホールが配設されたピンホールディスクを回転して、発光装置１０から照射された励起光束１１を試料６に対して走査する。対物レンズ２１は、共焦点スキャナ３０により走査された励起光束１１による複数のピンホールの像を試料６に投影する。カメラ４０は、撮像面が、複数のピンホールに対して共役の位置に配置される。このように、顕微鏡システム１は、ＭＬディスク３３とニポウディスク３１を高速で回転させることにより、試料６の共焦点画像をカメラ４０の２次元センサ４１の受光面上に短時間で形成することができる。したがって、多数の被検査試料をマトリックス状に並べたウェルプレート６０を、顕微鏡２０と共焦点スキャナ３０に対して、励起光束１１の光軸に垂直な方向に相対的に変位させながら試料全数の共焦点画像を高速に取り込むことが可能である。
【0103】
また、顕微鏡２０は、対物レンズ２１を励起光束１１の光軸に平行な方向に変位させることが可能な駆動装置２２を備える。処理装置５０は、駆動装置２２が対物レンズ２１を変位させながら、カメラ４０による撮像を行うように、顕微鏡２０及びカメラ４０を制御する。
【0104】
また、処理装置５０は、試料６に対する対物レンズ２１の焦点の相対位置を等速度で変位させながら、カメラ４０による撮像を行うように、顕微鏡２０及びカメラ４０を制御してもよい。このように、撮像中は、試料６に対する対物レンズ２１の焦点の相対位置を等速度で変位させるため、撮像中に対物レンズ２１に対する試料６の相対位置が励起光束１１の光軸に直行する方向に移動して、撮像画像が乱れることを防ぐことができる。
【0105】
また、処理装置５０は、容器の対物レンズ２１の焦点位置に対する位置に基づき、カメラ４０による撮像を行う間における、試料６に対する対物レンズ２１の焦点の相対位置の変位幅を決定する。処理装置５０は、試料６に対する対物レンズ２１の焦点の相対位置を、決定された変位幅だけ変位させながら、カメラ４０による撮像を行うように、顕微鏡２０及びカメラ４０を制御する。このように、処理装置５０は、容器の顕微鏡２０の対物レンズ２１に対する位置に基づき、撮像を行う間における、試料６に対する対物レンズ２１の焦点の相対位置の変位幅を決定する。したがって、試料６に対する対物レンズ２１の焦点の相対位置を適切に変位させて撮像を行い、明瞭な画像を取得することができる。
【0106】
ここで、実施例２、３のように、処理装置５０は、容器の対物レンズ２１の焦点位置に対する位置に基づき、容器の例えば底面６２の局所的な傾きを検出してもよい。さらに、処理装置５０は、検出した容器の局所的な傾きに基づいて、カメラ４０による撮像を行う間における、試料６に対する対物レンズ２１の焦点の相対位置の変位幅を決定してもよい。このように容器の局所的な傾きを利用することで、過不足なく変位幅を決定して、試料６に対する対物レンズ２１の焦点の相対位置を変位させて撮像を行うことが可能である。
【0107】
また、実施例３のように、処理装置５０は、容器の例えば底面６２の局所的な傾きを検出してそれに応じた変位幅を決定する処理と、局所的な傾きを検出した位置における試料６を撮影する処理とを交互に行って、容器に載置された複数の試料の各々を撮像してもよい。このように、変位幅の決定と試料６の撮影とを交互に行って複数の試料の各々を撮像することで、撮影を行う各ＸＹ位置における変位幅を決定するためのプレスキャンを行うことなく、スキャンを１回行うだけで、容器の局所的な傾きに応じた過不足ない変位を伴う撮影を高速に行うことが可能である。
【0108】
また、処理装置５０は、試料６に対する対物レンズ２１の焦点の相対位置を、ユーザにより指定された変位幅だけ変位させながら、カメラ４０による撮像を行うように、顕微鏡２０及びカメラ４０を制御してもよい。このように、処理装置５０は、試料６に対する対物レンズ２１の焦点の相対位置を、ユーザにより指定された変位幅だけ変位させながら撮像を行う。したがって、試料６に対する対物レンズ２１の焦点の相対位置を適切に変位させて撮像を行い、明瞭な画像を取得することができる。
【0109】
また、処理装置５０は、容器の対物レンズ２１の焦点位置に対する位置に基づき、カメラ４０による撮像を行う間における、試料６に対する対物レンズ２１の焦点の相対位置の変位幅である第１の変位幅を決定してもよい。さらに、処理装置５０は、ユーザにより指定された、試料６に対する対物レンズ２１の焦点の相対位置の変位幅である第２の変位幅を取得してもよい。その上で、処理装置５０は、試料６に対する対物レンズ２１の焦点の相対位置を、第１の変位幅及び第２の変位幅のいずれか小さい変位幅だけ変位させながら、カメラ４０による撮像を行うように、顕微鏡２０及びカメラ４０を制御してもよい。このように、処理装置５０は、容器の顕微鏡２０の対物レンズ２１に対する位置に基づき決定された変位幅、及び、ユーザにより指定された変位幅のいずれか小さい変位幅だけ、試料６に対する対物レンズ２１の焦点の相対位置を変位させながら撮像を行ってもよい。したがって、試料６に対する対物レンズ２１の焦点の相対位置を適切に変位させて撮像を行い、明瞭な画像を取得することができる。
【0110】
なお、処理装置５０は、試料６が載置されるウェルプレート６０の寸法情報に基づいて、試料６の撮像の開始時及び終了時における、試料６に対する対物レンズ２１の焦点の相対位置である開始位置及び終了位置を決定してもよい。さらに、処理装置５０は、試料６に対する対物レンズ２１の焦点の相対位置を開始位置から終了位置まで変位させながら、カメラ４０による撮像を行うように、顕微鏡２０及びカメラ４０を制御してもよい。このように、処理装置５０は、試料６が載置される容器の寸法情報に基づいて、撮像を行う際の、試料６に対する対物レンズ２１の焦点の開始位置及び終了位置を決定する。したがって、試料６に対する対物レンズ２１の焦点の相対位置を適切に変位させて撮像を行い、明瞭な画像を取得することができる。
【0111】
また、図７では、ステップＳ５で、制御部５１は、ステップＳ４で算出された移動範囲の長さと、ステップＳ１でユーザにより設定された移動範囲の長さとを比較し、いずれか短い方の移動範囲を選択する例を説明したが、このような構成に限られない。例えば、制御部５１は、ステップＳ４で算出された移動範囲と、ステップＳ１でユーザにより設定された移動範囲との両方に含まれる範囲、あるいは、少なくともいずれかに含まれる範囲を選択してもよい。
【0112】
なお、上記実施形態では、ニポウディスク３１に、部材３２によりＭＬディスク３３が機械的に接続されている場合の例を説明したが、ＭＬディスク３３及び部材３２は設けなくてもよい。また、上記実施形態では、顕微鏡システム１には撮像系としては共焦点撮像系が存在し、撮像のためのカメラ４０は１つ存在する構成を説明したが、このような構成に限られない。例えば、顕微鏡システム１は、落射照明光学系を有していてもよいし、複数のカメラ４０で同時に複数の蛍光波長を撮像できるようにしてもよい。
【0113】
また、上記実施形態では、試料６に対する対物レンズ２１の焦点の相対位置を変位させるために、試料６は変位せずに、駆動装置２２により対物レンズ２１を変位させる例を説明したが、このような構成に限られない。例えば、ウェルプレート６０、あるいは、対物レンズ２１及びウェルプレート６０の両方を励起光束１１の光軸に平行な方向に移動させてもよい。
【0114】
また、上記実施形態では、試料６が載置される容器としてウェルプレート６０を用いる例を説明したが、これに代えて、例えば、ペトリディッシュ、細胞培養フラスコ、スライドガラス、又はカバーガラスチャンバ―等の他の試料容器が用いられてもよい。また、試料６の撮像が行われている間に、対物レンズ２１の焦点面の駆動装置２２の駆動状態は等速となるように駆動パターンが設定されることが好ましいが、そうでなくてもよい。また、試料６の撮像が行われている間の、対物レンズ２１の焦点面の変位の方向は、試料６と対物レンズ２１との距離が小さくなる方向と大きくなる方向とのいずれでもよい。
【0115】
また、図６を参照した説明では、試料６の撮像が行われている間の、対物レンズ２１の焦点面の変位は一方向に一回のみ行う場合の例を説明したが、これに限られない。例えば、焦点面は、往復して変位したり、複数回変位したりしてもよい。また、図１は、顕微鏡２０が、倒立顕微鏡である場合の例を示しているが、顕微鏡２０は正立顕微鏡等の他の構成でもよい。
【0116】
また、処理装置５０は、対物レンズ２１の変位の下端の位置を、ウェルプレート６０の設計情報に基づいて決定してもよい。あるいは、処理装置５０は、位置センサ２４にて、ウェルプレート６０の底面６２の位置を検出して決定してもよい。
【0117】
本開示は上述の実施形態に限定されるものではない。例えば、ブロック図に記載の複数のブロックは統合されてもよいし、又は１つのブロックは分割されてもよい。フローチャートに記載の複数のステップは、記述に従って時系列に実行する代わりに、各ステップを実行する装置の処理能力に応じて、又は必要に応じて、並列的に又は異なる順序で実行されてもよい。その他、本開示の趣旨を逸脱しない範囲での変更が可能である。
【符号の説明】
【0118】
１ 顕微鏡システム
６ 試料
１０ 発光装置
１１ 励起光束
１２ 蛍光信号
２０ 顕微鏡
２１ 対物レンズ
２２ 駆動装置
２３ リレーレンズ
２４ 位置センサ
２４１ 光源
２４２ 分光ミラー
２４３ 分光ミラー
２４４ 光センサ
３０ 共焦点スキャナ
３１ ピンホールアレイディスク（ニポウディスク）
３２ 部材
３３ マイクロレンズアレイディスク
３４ ダイクロイックミラー
３５ リレーレンズ
３６ バンドパスフィルタ
３７ リレーレンズ
３９ 回転中心軸
４０ カメラ
４１ ２次元センサ
５０ 処理装置
５１ 制御部
５２ 記憶部
５３ 入出力部
６０ ウェルプレート
６１ フレーム
６２ 底面
６３ 被撮像サンプル
６４ 細胞培養面
６５ 撮像平面
６６ 被撮像サンプル
６８ ウェル
７１ 撮像Ｚ幅
６ 試料
１０ 発光装置
１１ 励起光束
１２ 蛍光信号
２０ 顕微鏡
２１ 対物レンズ
２２ 駆動装置
２３ リレーレンズ
２４ 位置センサ
２４１ 光源
２４２ 分光ミラー
２４３ 分光ミラー
２４４ 光センサ
３０ 共焦点スキャナ
３１ ピンホールアレイディスク（ニポウディスク）
３２ 部材
３３ マイクロレンズアレイディスク
３４ ダイクロイックミラー
３５ リレーレンズ
３６ バンドパスフィルタ
３７ リレーレンズ
３９ 回転中心軸
４０ カメラ
４１ ２次元センサ
５０ 処理装置
５１ 制御部
５２ 記憶部
５３ 入出力部
６０ ウェルプレート
６１ フレーム
６２ 底面
６３ 被撮像サンプル
６４ 細胞培養面
６５ 撮像平面
６６ 被撮像サンプル
６８ ウェル
７１ 撮像Ｚ幅
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】