特開 2023-19711 多収化に有効なイネ科植物の新規な短稈遺伝子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023019711

(43)【公開日】2023-02-09

(54)【発明の名称】多収化に有効なイネ科植物の新規な短稈遺伝子

(51)【国際特許分類】

   A01H 6/46 20180101AFI20230202BHJP

   A01H 1/02 20060101ALI20230202BHJP

   A01H 5/04 20180101ALI20230202BHJP

   C12Q 1/6895 20180101ALI20230202BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20230202BHJP

【ＦＩ】

A01H6/46

A01H1/02 Z ZNA

A01H5/04

C12Q1/6895 Z

C12N15/09 Z

【審査請求】未請求

【請求項の数】13

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021124651

(22)【出願日】2021-07-29

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り １．ウェブサイトのアドレスｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ２．ａｅｐｌａｎ．ｃｏ．ｊｐ／ｍｂｓｊ２０２０／ 掲載日：令和２年１１月１９日 ２．第４３回日本分子生物学会年会 開催日：令和２年１２月４日 ３．ウェブサイトのアドレスｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎａｃｏｓ．ｃｏｍ／ｊｓｂ／０６／０６ＰＤＦ／１３９ａｂｓｔｒａｃｔ２０２１Ｓ．ｐｄｆ 掲載日：令和３年 ３月１５日 ４．一般社団法人日本育種学会第１３９回講演会要旨集（育種学研究 第２３巻 別冊１号，一般社団法人日本育種学会） 発行日：令和３年 ３月１９日 ５．一般社団法人日本育種学会第１３９回講演会 開催日：令和３年３月２１日

(71)【出願人】

【識別番号】304023318

【氏名又は名称】国立大学法人静岡大学

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(72)【発明者】

【氏名】富田 因則

【テーマコード（参考）】

2B030

4B063

【Ｆターム（参考）】

2B030AA02

2B030AB03

2B030AD04

2B030AD07

2B030CA05

4B063QA01

4B063QA13

4B063QQ04

4B063QQ42

4B063QR08

4B063QR32

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS25

4B063QS34

4B063QX02

(57)【要約】

【課題】耐倒伏性および生産性を兼ね備えた植物の作出に利用するための新規なイネ科植物短稈遺伝子を提供すること。
【解決手段】イネ科植物の第１染色体の５’短腕末端からの距離３．３～５．６Ｍｂの領域に存在するＤＮＡマーカーを検出することによって、ｄ６４遺伝子の存在を判別することを特徴とする、短稈イネ科植物の選抜方法等が提供される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

イネ科植物の第１染色体の５’短腕末端からの距離３．３～５．６Ｍｂの領域に存在するＤＮＡマーカーを検出することによって、ｄ６４遺伝子の存在を判別することを特徴とする、短稈イネ科植物の選抜方法。

【請求項2】

前記ＤＮＡマーカーがＲＭ１０１８３である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ＤＮＡマーカーが、イネ科植物の第１染色体の５’短腕末端から３，３８０，５４８塩基地点、５，５３４，５７１塩基地点、および５，５３８，０４７塩基地点からなる群から選択される地点にあるＳＮＰである、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記ＳＮＰが、３，３８０，５４８塩基地点におけるＴからＣへの置換、５，５３４，５７１塩基地点におけるＣからＧへの置換、および５，５３８，０４７塩基地点におけるＣからＴへの置換からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

短稈イネ科植物の作出方法であって、
（ａ）短稈の形質を有する第一の親イネ科植物と、第二の親イネ科植物とを交配して、雑種植物を得ること、
（ｂ）前記雑種植物間の交配、または前記雑種植物との戻し交配もしくは多系交配を行って、後代植物を得ること、
（ｃ）さらに、後代植物間の交配、または後代植物との戻し交配もしくは多系交配を繰り返し行ってもよく、
（ｄ）いずれかの世代または全ての世代の植物について、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法により短稈イネ科植物を選抜すること
を含む、方法。

【請求項6】

前記第一の親イネ科植物が、第１染色体の５’短腕末端から３，３８０，５４８塩基地点、５，５３４，５７１塩基地点、および５，５３８，０４７塩基地点からなる群から選択される１以上の位置に変異を含む短稈イネ科植物である、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記変異が、３，３８０，５４８塩基地点におけるＴからＣへの置換、５，５３４，５７１塩基地点におけるＣからＧへの置換、および５，５３８，０４７塩基地点におけるＣからＴへの置換からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記第二の親イネ科植物が、短稈の形質を有しないイネ科植物である、請求項５～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

第１染色体の５’短腕末端から３，３８０，５４８塩基地点、５，５３４，５７１塩基地点、および５，５３８，０４７塩基地点からなる群から選択される位置に変異が導入された、短稈イネ科植物。

【請求項10】

前記変異が、３，３８０，５４８塩基地点におけるＴからＣへの置換、５，５３４，５７１塩基地点におけるＣからＧへの置換、および５，５３８，０４７塩基地点におけるＣからＴへの置換からなる群から選択される、請求項９に記載の短稈イネ科植物。

【請求項11】

イネ科植物の第１染色体の５’短腕末端から３，３８０，５４８塩基地点、５，５３４，５７１塩基地点、および５，５３８，０４７塩基地点からなる群から選択される地点のＳＮＰを含むＤＮＡマーカー。

【請求項12】

前記ＳＮＰが、３，３８０，５４８塩基地点におけるＴからＣへの置換、５，５３４，５７１塩基地点におけるＣからＧへの置換、および５，５３８，０４７塩基地点におけるＣからＴへの置換からなる群から選択される、請求項１１に記載のＤＮＡマーカー。

【請求項13】

請求項１１または１２に記載のＤＮＡマーカーを検出するためのプローブまたはプライマー。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、多収化に有効なイネ科植物の新規な短稈遺伝子に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、激化する気候変動の下、度重なる台風の襲来によりイネの倒伏による収穫量の減少が問題となっており、イネの耐倒伏性強化または頑健化が求められている。イネの耐倒伏性強化や頑健化のために、短稈性を示す遺伝子としては六十種類ほど知られているが、そのほとんどは極矮性か粒が小さくなる等の特性を合わせ持つため、収穫量の増加にはつながらない。

【0003】

有益な短稈遺伝子としては、現在、ｓｄ１およびｄ６０（特許文献１）が知られているが、遺伝的多様性を拡大する育種の理念に鑑みると、現在の限られた短稈遺伝子源とは別に、新たな短稈遺伝子源を探索する必要がある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特許第６０５６０４２号明細書

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、耐倒伏性および生産性を兼ね備えた植物の作出に利用するための新規なイネ短稈遺伝子を提供することを課題とした。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者は、日本晴を親にし、短稈を受け継ぐ「黄金晴」と、伊勢神宮で台風直撃の際に唯一倒伏しなかった変異種「イセヒカリ」の短稈遺伝子について、遺伝学的およびゲノム科学的に分析した。その結果、新規な短稈遺伝子を見出し、「ｄ６４」と命名した。

【0007】

したがって、本願発明は、以下の実施態様を含む。
［１］イネ科植物の第１染色体の５’短腕末端からの距離３．３～５．６Ｍｂの領域に存在するＤＮＡマーカーを検出することによって、ｄ６４遺伝子の存在を判別することを特徴とする、短稈イネ科植物の選抜方法。
［２］前記ＤＮＡマーカーがＲＭ１０１８３である、［１］に記載の方法。
［３］前記ＤＮＡマーカーが、イネ科植物の第１染色体の５’短腕末端から３，３８０，５４８塩基地点、５，５３４，５７１塩基地点、および５，５３８，０４７塩基地点からなる群から選択される地点にあるＳＮＰである、［１］に記載の方法。
［４］前記ＳＮＰが、３，３８０，５４８塩基地点におけるＴからＣへの置換、５，５３４，５７１塩基地点におけるＣからＧへの置換、および５，５３８，０４７塩基地点におけるＣからＴへの置換からなる群から選択される、［３］に記載の方法。
［５］短稈イネ科植物の作出方法であって、
（ａ）短稈の形質を有する第一の親イネ科植物と、第二の親イネ科植物とを交配して、雑種植物を得ること、
（ｂ）前記雑種植物間の交配、または前記雑種植物との戻し交配もしくは多系交配を行って、後代植物を得ること、
（ｃ）さらに、後代植物間の交配、または後代植物との戻し交配もしくは多系交配を繰り返して行ってもよく、
（ｄ）いずれかの世代または全ての世代の植物について、［１］～［４］のいずれか１項に記載の方法により短稈イネ科植物を選抜すること
を含む、方法。
［６］前記第一の親イネ科植物が、第１染色体の５’短腕末端から３，３８０，５４８塩基地点、５，５３４，５７１塩基地点、および５，５３８，０４７塩基地点からなる群から選択される１以上の位置に変異を含む短稈イネ科植物である、［５］に記載の方法。
［７］前記変異が、３，３８０，５４８塩基地点におけるＴからＣへの置換、５，５３４，５７１塩基地点におけるＣからＧへの置換、および５，５３８，０４７塩基地点におけるＣからＴへの置換からなる群から選択される、［６］に記載の方法。
［８］前記第二の親イネ科植物が、短稈の形質を有しないイネ科植物である、［５］～［７］のいずれか１項に記載の方法。
［９］第１染色体の５’短腕末端から３，３８０，５４８塩基地点、５，５３４，５７１塩基地点、および５，５３８，０４７塩基地点からなる群から選択される位置に変異が導入された、短稈イネ科植物。
［１０］前記変異が、３，３８０，５４８塩基地点におけるＴからＣへの置換、５，５３４，５７１塩基地点におけるＣからＧへの置換、および５，５３８，０４７塩基地点におけるＣからＴへの置換からなる群から選択される、［９］に記載の短稈イネ科植物。
［１１］イネ科植物の第１染色体の５’短腕末端から３，３８０，５４８塩基地点、５，５３４，５７１塩基地点、および５，５３８，０４７塩基地点からなる群から選択される地点のＳＮＰを含むＤＮＡマーカー。
［１２］前記ＳＮＰが、３，３８０，５４８塩基地点におけるＴからＣへの置換、５，５３４，５７１塩基地点におけるＣからＧへの置換、および５，５３８，０４７塩基地点におけるＣからＴへの置換からなる群から選択される、［１１］に記載のＤＮＡマーカー。
［１３］［１１］または［１２］に記載のＤＮＡマーカーを検出するためのプローブまたはプライマー。

【発明の効果】

【0008】

本発明によると、イネ科植物の第１染色体上にあるＤＮＡマーカーを使用してｄ６４遺伝子の存在を判別することにより、短稈イネ科植物を容易に選抜することができる。該短稈イネ科植物は、背丈がコシヒカリよりも低く、粒の大きさがコシヒカリと同等であり、かつ、穂数がコシヒカリよりも多いという有益な特徴を有することが分かった。したがって、本発明によれば、耐倒伏性に優れ、かつ、多収性であるイネ科植物を得ることができる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】全ゲノム解析により得られた、二重短稈コシヒカリ（コシヒカリｓｄ１ｄ６４）における第１染色体上のｓｄ１とｄ６４の位置関係を示すＳＮＰ頻度分布を示す。

【図2】ｄ６４を移入したコシヒカリ（コシヒカリｄ６４）、ｓｄ１を移入したコシヒカリ、二重短稈コシヒカリ（コシヒカリｓｄ１ｄ６４）と、コシヒカリの比較を示す。

【図3】ｄ６４を移入したコシヒカリ（コシヒカリｄ６４）、ｓｄ１を移入したコシヒカリ、二重短稈コシヒカリ（コシヒカリｓｄ１ｄ６４）、およびコシヒカリの写真である。

【発明を実施するための形態】

【0010】

新規な短稈遺伝子ｄ６４は、以下の方法で見出された。コシヒカリと黄金晴との交雑Ｆ_２において黄金晴型短稈個体とコシヒカリ型長稈個体が１：３に分離した。一方、ｓｄ１を有するコシヒカリ同質遺伝子系統である「コシヒカリｓｄ１」（ヒカリ新世紀）と黄金晴との交雑Ｆ_２、およびコシヒカリｓｄ１とイセヒカリとの交雑Ｆ_２では、コシヒカリｓｄ１よりさらに低い二重短稈型が分離した。したがって、ｓｄ１とは異なる短稈遺伝子の存在が分かり、「ｄ６４」と命名した。さらに、イセヒカリと黄金晴との交雑Ｆ_２では稈長が分離しなかったことから、これらの品種は同じ短稈遺伝子ｄ６４を持つことが分かった。

【0011】

続いて、上記の交雑Ｆ_２においてそれぞれ、黄金晴型短稈個体、黄金晴由来二重短稈個体およびイセヒカリ由来二重短稈個体を選抜して、ｄ６４以外がコシヒカリゲノムに置換されるようにコシヒカリおよびコシヒカリｓｄ１への６回の戻し交雑を行い、９９．２％がコシヒカリゲノムに置換された「コシヒカリｄ６４－ｋ」、「コシヒカリｓｄ１ｄ６４－ｋ」および「コシヒカリｓｄ１ｄ６４－ｉ」を育成した。また、晩生・短稈品種であるイセヒカリに由来する晩生遺伝子Ｈｄ１６のみを移入した同質遺伝子系統「コシヒカリＨｄ１６」も育成した。次いで、コシヒカリの遺伝的背景を持つこれらの同質遺伝子系統の全ゲノム解析を行い、「コシヒカリＨｄ１６」にはなく、「コシヒカリｄ６４－ｋ」、「コシヒカリｓｄ１ｄ６４－ｋ」および「コシヒカリｓｄ１ｄ６４－ｉ」にのみ共通して存在し、かつ日本晴起源のＳＮＰ（Single Nucleotide Polymorphism：一塩基多型）を探索した。その結果、上記の要件を満たすＳＮＰは、第１染色体の短腕末端部の３箇所および第７染色体の１箇所に絞られた。さらに、これらの候補ＳＮＰの付近にある既知のＤＮＡマーカーと黄金晴型短稈との連鎖を調べたところ、第１染色体上のＳＳＲマーカーＲＭ１０１８３（３．７４５Ｍｂ）が黄金晴型短稈と強く連鎖していた。このことから、第１染色体の短腕末端部の３箇所のＳＮＰ、すなわち、第１染色体の５’短腕末端から３，３８０，５４８塩基地点、５，５３４，５７１塩基地点、および５，５３８，０４７塩基地点にあるＳＮＰがｄ６４の原因となることが分かった。このうち、３，３８０，５４９塩基地点は、転写因子Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢをコードする遺伝子領域に含まれることから、ｄ６４は、Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ遺伝子の変異と関連することが予想される。

【0012】

したがって、ｄ６４は、イネ科植物の第１染色体の５’短腕末端からの距離３．３～５．６Ｍｂの領域に座乗する短稈遺伝子である。本明細書において、「短稈遺伝子」とは、イネ科植物の短稈化をもたらす遺伝子、またはイネ科植物の短稈化に関与する遺伝子をいう。

【0013】

ｄ６４遺伝子は、例えば、第１染色体の５’短腕末端から３，３８０，５４８塩基地点、５，５３４，５７１塩基地点、および５，５３８，０４７塩基地点からなる群から選択される１以上の地点に変異を含む塩基配列を有する。本明細書において「変異」には、置換、欠失および挿入が含まれる。例えば、上記変異は、ｄ６４を有しないイネ科植物のゲノム配列と比べて、上記３，３８０，５４８塩基地点におけるＴ（チミン）からＣ（シトシン）、Ｇ（グアニン）またはＡ（アデニン）への置換、上記５，５３４，５７１塩基地点におけるＣからＧ、ＡまたはＴへの置換、および上記５，５３８，０４７塩基地点におけるＣからＴ、ＧまたはＡへの置換からなる群から選択される１以上の変異であってもよい。好ましくは、上記変異は、ｄ６４を有しないイネ科植物のゲノム配列と比べて、上記３，３８０，５４８塩基地点におけるＴからＣへの置換、上記５，５３４，５７１塩基地点におけるＣからＧへの置換、および上記５，５３８，０４７塩基地点におけるＣからＴへの置換からなる群から選択される１以上の変異であってもよい。

【0014】

本明細書において、「ｄ６４を有しないイネ科植物」または「ｄ６４遺伝子を有しない系統」としては、例えば、コシヒカリ、ひとめぼれ、つや姫、キヌヒカリ等が挙げられる。

【0015】

本発明の一態様として、イネ科植物の第１染色体の５’短腕末端からの距離３．３～５．６Ｍｂの領域に存在するＤＮＡマーカーを検出することによって、ｄ６４遺伝子の存在を判別することを特徴とする、短稈イネ科植物の選抜方法（以下、「本発明の短稈イネ科植物の選抜方法」ともいう）が提供される。

【0016】

本明細書において、「短稈イネ科植物」とは、背丈が短縮されたイネ科植物をいい、好ましくは、穂の長さおよび籾の大きさは正常であるが、背丈が短縮されたイネ科植物をいう。また、「イネ科植物」には、限定するものではないが、イネ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、ライムギ、キビ、アワ、ヒエ、トウモロコシ、シコクビエ、モロコシ等が包含される。イネには、栽培種および野生種が含まれ、好ましくは栽培イネ、例えば限定するものではないが、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．に属する種々の品種および系統を用いることができる。

【0017】

「ＤＮＡマーカー」とは、遺伝分析のための目印（マーカー）として利用することができる、個体または系統によって塩基配列に違いが見られるＤＮＡ多型を意味し、例えば、ＲＦＬＰ（制限酵素ＤＮＡ断片長多型）、ＡＦＬＰ（増幅断片長多型）、ＳＳＲ（単純反復配列）、ＳＴＳ（配列タグ部位）、ＳＮＰ（一塩基多型）、ＲＡＰＤ（ランダム増幅断片多型）などの種類がある。既知のＤＮＡマーカーは、例えば、公開データベースから検索することができる。

【0018】

本発明の短稈イネ科植物の選抜方法における「第１染色体の５’短腕末端からの距離３．３～５．６Ｍｂの領域に存在するＤＮＡマーカー」は、例えば、ｄ６４遺伝子と低い組換え価（例えば１５％以下、好ましくは１０％以下）で連鎖するＤＮＡマーカーである。該ＤＮＡマーカーは、例えば、ｄ６４遺伝子を有する系統とｄ６４遺伝子を有しない系統との交雑Ｆ_２を展開し、ｄ６４ホモ型Ｆ_２個体から得たゲノムＤＮＡに対し、特異的なパターンを示す第１染色体上の５’短腕末端からの距離３．３～５．６Ｍｂの領域に存在するＤＮＡマーカーを見出し、該特異的なパターンを示したＤＮＡマーカーについて組換え価を求めることによって得ることができる。またさらに、該特異的なパターンを示したＤＮＡマーカーについて、戻し交雑によりゲノム置換率を求め、低い置換率、例えば５０％以下の置換率のものをＤＮＡマーカーとして用いてもよい。なお、組換え価は以下の式によって求められる。
組換え価（％）＝（組換え型配偶子数／全配偶子数）×１００

【0019】

上記ＤＮＡマーカーとして、例えば、ＲＭ１０１８３を用いることができる。Ｍ１０１８３は、第１染色体の５’短腕末端からの距離３．７４５ＭｂにあるＳＳＲマーカーである。

【0020】

また、本発明の短稈イネ科植物の選抜方法における「第１染色体の５’短腕末端からの距離３．３～５．６Ｍｂの領域に存在するＤＮＡマーカー」の別の例として、イネ科植物の第１染色体の５’短腕末端から３，３８０，５４８塩基地点、５，５３４，５７１塩基地点、および５，５３８，０４７塩基地点からなる群から選択される１以上の地点にあるＳＮＰを用いることができる。該ＤＮＡマーカーのさらなる例として、ｄ６４を有しないイネ科植物のゲノム配列と比べて、第１染色体の５’短腕末端から３，３８０，５４８塩基地点におけるＴからＣ、ＧまたはＡへの置換、第１染色体の５’短腕末端から５，５３４，５７１塩基地点におけるＣからＧ、ＡまたはＴへの置換、および第１染色体の５’短腕末端から５，５３８，０４７塩基地点におけるＣからＴ、ＧまたはＡへの置換からなる群から選択される１以上のＳＮＰを含むＤＮＡマーカーを用いることができる。該ＤＮＡマーカーのまたさらなる例としては、ｄ６４を有しないイネ科植物のゲノム配列と比べて、第１染色体の５’短腕末端から３，３８０，５４８塩基地点におけるＴからＣへの置換、第１染色体の５’短腕末端から５，５３４，５７１塩基地点におけるＣからＧへの置換、および第１染色体の５’短腕末端から５，５３８，０４７塩基地点におけるＣからＴへの置換からなる群から選択される１、２または３個のＳＮＰを用いることができる。これらのＳＮＰマーカーは、新規なＤＮＡマーカーである。

【0021】

したがって、本発明の別の態様として、イネ科植物の第１染色体の５’短腕末端から３，３８０，５４８塩基地点、５，５３４，５７１塩基地点、および５，５３８，０４７塩基地点からなる群から選択される地点のＳＮＰを含む、ｄ６４遺伝子の存在を判別するためのＤＮＡマーカー（以下、「本発明のＤＮＡマーカー」ともいう）が提供される。本発明のＤＮＡマーカーの一例として、ｄ６４を有しないイネ科植物のゲノム配列と比べて、第１染色体の５’短腕末端から３，３８０，５４８塩基地点におけるＴからＣ、ＧまたはＡへの置換、第１染色体の５’短腕末端から５，５３４，５７１塩基地点におけるＣからＧ、ＡまたはＴへの置換、および第１染色体の５’短腕末端から５，５３８，０４７塩基地点におけるＣからＴ、ＧまたはＡへの置換からなる群から選択されるＳＮＰを含むＤＮＡマーカーが提供される。本発明のＤＮＡマーカーのさらなる例として、ｄ６４を有しないイネ科植物のゲノム配列と比べて、第１染色体の５’短腕末端から３，３８０，５４８塩基地点におけるＴからＣへの置換、第１染色体の５’短腕末端から５，５３４，５７１塩基地点におけるＣからＧへの置換、および第１染色体の５’短腕末端から５，５３８，０４７塩基地点におけるＣからＴへの置換からなる群から選択されるＳＮＰを含むＤＮＡマーカーが提供される。

【0022】

本発明の短稈イネ科植物の選抜方法における「検出」とは、ＤＮＡマーカーを検出するための当該分野で常套の方法を用いて実施すればよく、使用されるＤＮＡマーカーの種類に応じて当業者が適当に選択することができる。例えば、ＰＣＲ法、サザンブロッティング法、ＡＦＬＰ法などが挙げられる。

【0023】

ＳＳＲマーカーの場合は、例えば、各ＳＳＲに特異的なプライマーを用いて、検体から抽出したＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行い、増幅産物の長さを検出することにより、検体が目的遺伝子を有するか否かを判断することができる。

【0024】

ＳＮＰマーカーの場合は、例えば、ＳＮＰアレルごとに特異的にハイブリダイズするプローブを設計し、該プローブの末端をＳＮＰアレルごとに異なる蛍光色素およびクエンチャーで修飾し、該プローブより外側に設計したプライマーを用いてＰＣＲ法により検出することができる。該プライマーの伸長反応によってプローブが分解されて、蛍光色素とクエンチャーが離れることにより発せられる蛍光を測定することにより、アレル特異的な蛍光の増幅曲線を得、検体がどのＳＮＰアレルを持つかを判断することができる。蛍光色素としては、限定するものではないが、例えば、ＦＡＭ、ＨＥＸ等が使用される。アレル特異的なプローブ、およびプライマーは、検体のゲノム情報に基づいて、当業者が適宜設計することができる。ＳＮＰマーカーは、既知の方法で検出することができ、例えば、限定するものではないが、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法、一塩基伸長法、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法等を用いることができる。

【0025】

したがって、本発明の別の態様として、本発明のＤＮＡマーカーを検出するためのプローブまたはプライマーが提供される。このようなプローブおよびプライマーは、当該分野で既知の方法により容易に設計および作製することができる。例えば、限定するものではないが、ＳＮＰを含む約１７ｂｐに結合する蛍光色素付きプローブと、ＳＮＰの前後約１００ｂｐ離れて結合する約２０ｂｐのプライマー対が提供される。

【0026】

本発明の短稈イネ科植物の選抜方法は、例えば、新規な短稈イネ科植物を作出するための育種方法に利用される。かかる育種方法としては、当該分野で既知の一般的な方法が挙げられる。したがって、本発明の一態様として、短稈イネ科植物の作出方法であって、
（ａ）短稈の形質を有する第一の親イネ科植物と、第二の親イネ科植物とを交配して、雑種植物を得ること、
（ｂ）前記雑種植物間の交配、または前記雑種植物との戻し交配もしくは多系交配を行って、後代植物を得ること、
（ｃ）さらに、後代植物間の交配、または後代植物との戻し交配もしくは多系交配を繰り返し行ってもよく、
（ｄ）いずれかの世代または全ての世代の植物について、本発明の短稈イネ科植物の選抜方法によって短稈イネ科植物を選抜すること
を含む、方法（以下、「本発明の短稈イネ科植物の作出方法」ともいう）が提供される。

【0027】

本発明の短稈イネ科植物の作出方法において、「短稈の形質を有する第一の親イネ科植物」として、ｄ６４を有するイネ科植物が用いられる。ｄ６４を有するイネ科植物の例としては、限定するものではないが、黄金晴、イセヒカリ、日本晴、および本発明の短稈イネ科植物の選抜方法により選抜して得られる短稈イネ科植物が挙げられる。さらに、ｄ６４を有するイネ科植物として、第１染色体の５’短腕末端から３，３８０，５４８塩基地点、５，５３４，５７１塩基地点、および５，５３８，０４７塩基地点からなる群から選択される１以上の位置に変異を含む短稈イネ科植物を用いることができる。前記変異は、ｄ６４を有しないイネ科植物のゲノム配列と比べて決定される。例えば、限定するものではないが、ｄ６４を有しないイネ科植物のゲノム配列と比べて、第１染色体の５’短腕末端から３，３８０，５４８塩基地点におけるＴからＣ、ＧまたはＡへの置換、第１染色体の５’短腕末端から５，５３４，５７１塩基地点におけるＣからＧ、ＡまたはＴへの置換、および第１染色体の５’短腕末端から５，５３８，０４７塩基地点におけるＣからＴ、ＧまたはＡへの置換からなる群から選択される変異を含む短稈イネ科植物を用いてよい。例えば、ｄ６４を有しないイネ科植物のゲノム配列と比べて、第１染色体の５’短腕末端から３，３８０，５４８塩基地点におけるＴからＣへの置換、第１染色体の５’短腕末端から５，５３４，５７１塩基地点におけるＣからＧへの置換、および第１染色体の５’短腕末端から５，５３８，０４７塩基地点におけるＣからＴへの置換からなる群から選択される変異を含む短稈イネ科植物を用いてもよい。

【0028】

本発明の短稈イネ科植物の作出方法において、「第二の親イネ科植物」としては、いずれのイネ科植物であってもよく、特に限定されない。例えば、短稈の形質を有しないイネ科植物を第二の親イネ科植物として用いてもよい。短稈の形質を有しないイネ科植物としては、限定するものではないが、コシヒカリ、ひとめぼれ、つや姫、キヌヒカリ等が挙げられる。あるいは、短稈の形質を有するイネ科植物を第二の親イネ科植物として用いてもよく、かかる短稈イネ科植物としては、ｄ６４を有するイネ科植物、ｄ６４以外の短稈遺伝子を有するイネ科植物、ｄ６４とそれ以外の短稈遺伝子の２以上の短稈遺伝子を有するイネ科植物、または短稈の形質の原因が分かっていない短稈イネ科植物であってもよい。ｄ６４以外の短稈遺伝子としては、例えば、限定するものではないが、ｓｄ１、ｄ６０等が挙げられる。

【0029】

本発明の短稈イネ科植物の作出方法では、第一親植物と第二親植物との交配によりＦ_１雑種植物を得た後、前記Ｆ_１雑種植物間の交配、または前記Ｆ_１雑種植物との戻し交配もしくは多系交配を行って後代植物を得る。さらに、前記後代植物間の交配、または前記後代植物との戻し交配もしくは多系交配を行って更なる後代植物を得てもよく、またさらに、前記更なる後代植物間の交配、または前記更なる後代植物との戻し交配もしくは多系交配を行ってもよい。このように、後代植物間の交配、および後代植物との戻し交配および多系交配は繰り返し行ってもよく、その回数は特に限定されず、当業者により適宜決定すればよい。

【0030】

戻し交配においては、片方の親植物として、第一または第二の親イネ科植物、あるいは第一または第二の親イネ科植物以外のイネ科植物を用いる。多系交配においては、片方の親植物として、第一または第二の親イネ科植物以外のイネ科植物を用いる。「第一または第二の親イネ科植物以外のイネ科植物」としては、第一または第二の親イネ科植物と異なるイネ科植物であれば特に限定されず、いずれのイネ科植物であってもよい。戻し交配および多系交配において、親植物の種類はいくつ含んでいてもよく、親植物の数は限定されない。

【0031】

例えば、短稈の形質を有しないイネ科植物を「第一または第二の親イネ科植物以外のイネ科植物」として用いてもよい。短稈の形質を有しないイネ科植物としては、限定するものではないが、コシヒカリ、ひとめぼれ、つや姫、キヌヒカリ等が挙げられる。あるいは、短稈の形質を有するイネ科植物を「第一または第二の親イネ科植物以外のイネ科植物」として用いてもよく、かかる短稈イネ科植物としては、ｄ６４を有するイネ科植物、ｄ６４以外の短稈遺伝子を有するイネ科植物、ｄ６４とそれ以外の短稈遺伝子の２以上の短稈遺伝子を有するイネ科植物、または短稈の形質の原因が分かっていない短稈イネ科植物であってもよい。ｄ６４以外の短稈遺伝子としては、例えば、限定するものではないが、ｓｄ１、ｄ６０等が挙げられる。

【0032】

戻し交配を複数回行う場合、反復親として、同じ親イネ科植物を用いてもよいし、または異なる親イネ科植物を用いてもよく、当業者が適宜選択することができる。

【0033】

本発明の短稈イネ科植物の作出方法において、本発明の短稈イネ科植物の選抜方法による選抜は、上記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）によって得られるいずれの世代において行ってもよい。選抜された短稈イネ科植物は、次の交配に用いられる。本発明の短稈イネ科植物の選抜方法による選抜の回数を増やすことにより、例えば全ての世代において当該選抜を行うことにより、より正確な短稈イネ科植物の選抜が可能となり、より効率良く短稈イネ科植物を得ることができる。

【0034】

さらに、本発明の一態様として、ｄ６４遺伝子が導入された新規な短稈イネ科植物（以下、「本発明の短稈イネ科植物」ともいう）が提供される。本発明の短稈イネ科植物は、例えば、第１染色体の５’短腕末端から３，３８０，５４８塩基地点、５，５３４，５７１塩基地点、および５，５３８，０４７塩基地点からなる群から選択される位置に変異が導入された、短稈イネ科植物である。前記変異は、例えば、１塩基の変異であってもよい。例えば、前記変異は、ｄ６４を有しないイネ科植物のゲノム配列と比べて、第１染色体の５’短腕末端から３，３８０，５４８塩基地点におけるＴからＣ、ＧまたはＡへの置換、第１染色体の５’短腕末端から５，５３４，５７１塩基地点におけるＣからＧ、ＡまたはＴへの置換、および第１染色体の５’短腕末端から５，５３８，０４７塩基地点におけるＣからＴ、ＧまたはＡへの置換からなる群から選択される変異であってもよい。またさらに、前記変異は、例えば、ｄ６４を有しないイネ科植物のゲノム配列と比べて、第１染色体の５’短腕末端から３，３８０，５４８塩基地点におけるＴからＣへの置換、第１染色体の５’短腕末端から５，５３４，５７１塩基地点におけるＣからＧへの置換、および第１染色体の５’短腕末端から５，５３８，０４７塩基地点におけるＣからＴへの置換からなる群から選択される変異であってもよい。

【0035】

さらなる例として、本発明の短稈イネ科植物に導入された変異は、第１染色体の５’短腕末端から３，３８０，５４８塩基地点、５，５３４，５７１塩基地点、および５，５３８，０４７塩基地点からなる群から選択される地点を含む２塩基～数十塩基の領域の置換、挿入または欠失であってもよい。

【0036】

変異の導入は、当該分野で常用されるいずれの方法によって行ってもよい。例えば、交雑によって行ってもよく、または遺伝子工学的方法によって行ってもよい。交雑による変異導入は、例えば、本発明の短稈イネ科植物の作出方法によって達成することができる。遺伝子工学的方法としては、限定するものではないが、例えば、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ゲノム編集等が挙げられる。

【0037】

さらに、本発明の短稈イネ科植物は、例えば、第１染色体の５’短腕末端から３，３８０，５４８塩基地点、５，５３４，５７１塩基地点、および５，５３８，０４７塩基地点からなる群から選択される地点を含む１塩基～数十塩基の領域を含む遺伝子の発現が抑制された、短稈イネ科植物であってもよい。ここで「抑制」とは、該遺伝子の発現が無いこと、または該遺伝子の発現が抑制されない対照と比べて、その発現量が減少することを意味する。遺伝子の発現の抑制は、当該分野で常用されるいずれの方法で行ってもよく、限定するものではないが、例えば、アンチセンス法、突然変異誘発法、ＲＮＡ干渉法等が挙げられる。

【0038】

本発明の短稈イネ科植物は、コシヒカリと比べて、穂の長さおよび粒の大きさは変わらないが、背丈が短縮されている。好ましくは、本発明の短稈イネ科植物はさらに、穂数が増加している。例えば、本発明の短稈イネ科植物は、コシヒカリと比べて、稈長が約１０％～３０％短く、穂数が約２０％～５０％増加する。例えば、本発明の短稈イネ科植物は、コシヒカリと比べて、稈長が約３ｃｍ～１０ｃｍ短く、穂数が約２．５本～５．５本増加する。したがって、本発明の短稈イネ科植物は、耐倒伏性および生産性に優れている。

【0039】

本発明の短稈イネ科植物は、ｄ６４に加えて、ｄ６４以外の短稈遺伝子が導入されていてもよい。ｄ６４以外の短稈遺伝子としては、例えば、限定するものではないが、ｓｄ１、ｄ６０等が挙げられる。本発明の短稈イネ科植物にｄ６４以外の短稈遺伝子が導入されている場合、好ましくは、稈長がさらに短縮される。

【0040】

下記の実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

【実施例0041】

実施例１：短稈遺伝子ｄ６４の検出
コシヒカリと黄金晴の交雑Ｆ_２を育成し、全個体について稈長を調査したところ、黄金晴型短稈個体とコシヒカリ型長稈個体が１：３に分離した。また、コシヒカリｓｄ１とイセヒカリの交雑Ｆ_２、およびコシヒカリｓｄ１と黄金晴の交雑Ｆ_２を育成したところ、コシヒカリｓｄ１よりさらに低い二重短稈型が分離した。さらに、イセヒカリと黄金晴の交雑Ｆ_２を育成したところ、稈長が分離しなかった。したがって、イセヒカリと黄金晴には、ｓｄ１とは異なる共通の短稈遺伝子が存在することが分かった。この短稈遺伝子を「ｄ６４」と命名した。

【0042】

なお、コシヒカリｓｄ１は、「ヒカリ新世紀」として登録された短稈品種であり、コシヒカリの極早生変異系統関東７９号（ｅ１保有）と十石（ｓｄ１保有）との交雑Ｆ_４で固定した出穂期がコシヒカリ型でｓｄ１ホモ型の短稈系統を１回親、コシヒカリを反復親とする１４回の戻し交雑により育成された。このコシヒカリｓｄ１を実施例２および３にも用いた。

【0043】

さらに、コシヒカリｓｄ１とイセヒカリとの交雑Ｆ_２で分離した二重短稈個体を１回親にして、コシヒカリを２回反復親とし、コシヒカリｓｄ１を４回反復親とする計６回の戻し交雑を行った。ここでは、コシヒカリｓｄ１（ＢＣ_８Ｆ_４）を用いた。その結果、ｓｄ１コシヒカリ＊４／／コシヒカリ＊２／［コシヒカリｓｄ１×イセヒカリＦ_２二重短稈型］のＢＣ_６Ｆ_２では、稈長が約４７～５１ｃｍでｓｄ１コシヒカリと同程度のｓｄ１ホモ型短稈個体、さらに短稈で稈長が約３５～４０ｃｍの二重短稈個体、およびその中間型個体が理論比に適合する１９ ｓｄ１ホモ型短稈型：２７中間型：１４二重短稈型＝１：２：１に分離した（χ^２＝６．４２、０．０１＜Ｐ＜０．０２５）。したがって、イセヒカリにはｓｄ１とは異なる短稈遺伝子ｄ６４が確かに存在していることが確認できた。

【実施例0044】

実施例２：短稈遺伝子ｄ６４のマッピング
（１）短稈遺伝子ｄ６４または晩生遺伝子Ｈｄ１６を移入した同質遺伝子系統の育成
コシヒカリ×黄金晴の交雑Ｆ_２、コシヒカリｓｄ１×黄金晴の交雑Ｆ_２、およびコシヒカリｓｄ１×イセヒカリの交雑Ｆ_２において、黄金晴型短稈個体、黄金晴由来二重短稈個体、およびイセヒカリ由来二重短稈個体を選抜し、ｄ６４以外がコシヒカリゲノムに置換されるように、コシヒカリを２回反復親およびコシヒカリｓｄ１を４回反復親とする計６回の戻し交雑を行い、９９．２％がコシヒカリゲノムに置換された「コシヒカリｄ６４－ｋ」、「コシヒカリｓｄ１ｄ６４－ｋ」、および「コシヒカリｓｄ１ｄ６４－ｉ」を育成した。さらに、コシヒカリ×イセヒカリの交雑Ｆ_２において晩生型個体を選抜し、コシヒカリへの６回の戻し交雑を行って、９９．２％がコシヒカリゲノムに置換された「コシヒカリＨｄ１６」を育成した。コシヒカリＨｄ１６は、コシヒカリより約１４日晩生化した。

【0045】

（２）全ゲノム解析
上記（１）で育成したコシヒカリの遺伝的背景を持つ４種類の同質遺伝子系統「コシヒカリｄ６４－ｋ」、「コシヒカリｓｄ１ｄ６４－ｋ」および「コシヒカリｓｄ１ｄ６４－ｉ」、および「コシヒカリｓｄ１」の葉からゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡの抽出は常法にしたがって行った。抽出した各系統由来のゲノムＤＮＡに、Ｎｅｘｔｅｒａトランスポゾンでタグ付けしつつピークが約５００ｂｐになるように断片化して、全ゲノムＤＮＡライブラリーを作製した後、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００（Illumina, Inc.製）で解読した。

【0046】

得られた解読リードをＦａｓｔＱＣでクオリティチェックし、Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃでアダプター配列およびクオリティスコア２０未満のリードを除去し、ＦａｓｔＱＣで再度クオリティチェックを行った。その後、研究室内で別途作製したコシヒカリのゲノム配列を参照配列に用いてＢＷＡまたはＢｏｗｔｉｅ２でアライメントした。ＳＡＭｔｏｏｌｓで複数箇所にアライメントされたセカンダリーアライメントを除去し、Ｐｉｃａｒｄでライブラリー作製過程のＰＣＲで増幅された重複配列を除去した後、ＧＡＴＫ Ｒｅａｌｉｇｎｅｒ Ｔａｒｇｅｔ Ｃｒｅａｔｏｒ、ＧＡＴＫ Ｉｎｄｅｌ Ｒｅａｌｉｇｎｅｒで欠失・挿入付近のリードについて再アライメントを行い、ＧＡＴＫ Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ Ｃａｌｌｅｒでバリアントコール後、クオリティーの低いＳＮＰを除いたＶＣＦファイルを作出した。かくして、上記の各系統についてコシヒカリゲノムに対するＳＮＰの頻度分布が得られた。

【0047】

その結果、ｓｄ１は、「コシヒカリｓｄ１」の第１染色体短腕末端から３８，２６７，１４９～３８，２７０，２３３ｂｐの領域（ミスセンス変異のＳＮＰ Ｇ→Ｔ：３８，２６７，５１０地点）にあることを確認した。ｓｄ１を取り囲むように、ＳＮＰのクラスターが３６，９７７，３３６～３８，８６３，１９３ｂｐに分布し、そのほかの領域ではコシヒカリゲノムと全域でほぼ同質であった。また、「コシヒカリｄ６４ｓｄ１」では、ｓｄ１は、第１染色体短腕末端から３８，２６７，１４９～３８，２７０，２３３ｂｐの領域（ミスセンス変異のＳＮＰ Ｇ→Ｔ：３８，２６７，５１０地点）にあり、ｓｄ１を取り囲むように、ＳＮＰのクラスターが３４，６１６，５９８～３８，８６３，１９３ｂｐに分布していた。全ゲノム解析により得られた、二重短稈コシヒカリ（コシヒカリｓｄ１ｄ６４－ｉ）における第１染色体上のｓｄ１とｄ６４の位置関係を示すＳＮＰ頻度分布を図１に示す。

【0048】

得られた各系統におけるコシヒカリゲノムに対するＳＮＰ頻度分布に基づいて、「コシヒカリＨｄ１６」に無く、「コシヒカリｄ６４－ｋ」、「コシヒカリｓｄ１ｄ６４－ｋ」および「コシヒカリｓｄ１ｄ６４－ｉ」に共通して特異的に存在するＳＮＰを探索した。その結果、第１染色体、第４染色体、第７染色体、第９染色体および第１０染色体に計８箇所のＳＮＰが見出された。さらに、日本晴ゲノムでアライメントして、これらのＳＮＰのなかで日本晴と共通するＳＮＰを探索した。日本晴は、黄金晴の親である短稈品種であり、全ゲノム配列が公開されている。その結果、日本晴起源でｄ６４同質遺伝子系統に特異的なＳＮＰは、第１染色体の短腕末端部の３箇所および第７染色体の１箇所に絞られた。

【0049】

このうち、第１染色体の短腕末端部の３箇所のＳＮＰは、第１染色体の５’短腕末端から３，３８０，５４８塩基地点、５，５３４，５７１塩基地点、および５，５３８，０４７塩基地点にあり、コシヒカリとｄ６４同質遺伝子系統との間で、それぞれ、５’短腕末端から３，３８０，５４８塩基地点で「Ｔ→Ｃ」、５，５３４，５７１塩基地点で「Ｃ→Ｇ」、および５，５３８，０４７塩基地点で「Ｃ→Ｔ」の変異が起こっていることが分かった。

【0050】

（３）連鎖解析によるｄ６４遺伝子座の特定
上記の候補ＳＮＰの付近にある既知のＳＳＲマーカーと、黄金晴型短稈との連鎖を調べた。実験は以下のように行った。

【0051】

コシヒカリ×黄金晴Ｆ_２で分離した短稈（ｄ６４ホモ型）個体の葉サンプルをセラミックビーズ（ＹＴＺボール）が入った２ｍＬ粉砕専用チューブＣＫ２８に入れ、液体窒素に浸漬して１分間凍結した。ビーズ式高速細胞破砕装置Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ ２４（Bertin Instruments社製）で６５００回転２０秒×２、インターバル１２０秒で粉砕した。チューブにＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）５００μｌ注入し、５５℃の恒温槽にて３０分間インキュベートした。クロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を５００μｌ注入し、１０分間揺とうさせた後、５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心して上澄みを、オートクレーブで滅菌済みの新しい１．５ｍｌチューブに分取した。これに３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．８）を５０μｌ、イソプロパノール５００μｌを加え、ＤＮＡを凝集させた。これを５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心して沈殿させ、上澄みを捨てて、７０％エタノールを３００μｌ入れ、５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心した。遠心後、上澄みを捨て風乾させ、滅菌純水を１００μｌ注入した。

【0052】

上記のように抽出したＤＮＡサンプルを用いて、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲプログラムは、９５℃で２分初期熱変性をした後、熱変性９５℃で３０秒、アニーリング温度５２℃で３０秒、伸長反応７２℃で３０秒を３５サイクル行った後、７２℃で５分維持した。プライマーは、ＰＭ１０１３２、ＲＭ１０１８３、ＲＭ３０３５のセットを用い、３か所で連鎖解析を行った。各プライマーセットを表１に示す。ＰＭ１０１３２は第１染色体上の短腕末端から２．５２５Ｍｂの地点にあるＳＳＲマーカーであり、ＲＭ１０１８３は第１染色体上の短腕末端から３．７４５Ｍｂの地点にあるＳＳＲマーカーであり、ＲＭ３０３５は第１染色体上の短腕末端から５．１５１Ｍｂの地点にあるＳＳＲマーカーである。

【0053】

【表1】

【0054】

ＰＣＲ産物をＤＮＡ／ＲＮＡキャピラリー電気泳動装置ＱＩＡｘｃｅｌ（QIAGEN製）のゲルカートリッジＱＩＡｘｃｅｌ ＤＮＡ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｋｉｔ（２４００）に装填した。アライメントマーカーとして、ＱＸ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｍａｒｋｅｒ１５／１ｋｂ、ＤＮＡサイズマーカーとして、ＱＸ ＤＮＡ Ｓｉｚｅ Ｍａｒｋｅｒ ｐＵＣ１８／Ｈａｅｌｌｌを使用した。泳動条件は、サンプル注入を５ｋｖで１０秒、電気泳動を５ｋｖで３２０～４２０秒行った。

【0055】

連鎖解析の結果、ＲＭ１０１３２では組換え価４０％、ＲＭ１０１８３では組換え価７．１％、ＲＭ３０３５では組換え価は４５％であり、ＲＭ１０１８３で特に強く連鎖していた。したがって、（２）で得られた候補ＳＮＰのうち第１染色体の短腕末端部の３箇所のＳＮＰが、特に第１染色体の５’短腕末端から３，３８０，５４８塩基地点にあるＳＮＰが、ｄ６４に関与することが確認できた。