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特開2023-20700牛伝染性リンパ腫の病勢の検査方法、プライマー、及び牛伝染性リンパ腫の病勢の検査キット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023020700
(43)【公開日】2023-02-09
(54)【発明の名称】牛伝染性リンパ腫の病勢の検査方法、プライマー、及び牛伝染性リンパ腫の病勢の検査キット
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20230202BHJP
C12Q 1/6886 20180101ALI20230202BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20230202BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20230202BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 Z ZNA
C12Q1/6886 Z
C12Q1/6869 Z
C12Q1/686 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】6
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021126204
(22)【出願日】2021-07-30
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】504159235
【氏名又は名称】国立大学法人 熊本大学
(71)【出願人】
【識別番号】598096991
【氏名又は名称】学校法人東京農業大学
(74)【代理人】
【識別番号】100106909
【弁理士】
【氏名又は名称】棚井 澄雄
(74)【代理人】
【識別番号】100126664
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 慎吾
(74)【代理人】
【識別番号】100188558
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100189337
【弁理士】
【氏名又は名称】宮本 龍
(72)【発明者】
【氏名】佐藤 賢文
(72)【発明者】
【氏名】松尾 美沙希
(72)【発明者】
【氏名】小林 朋子
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA07
4B063QA19
4B063QQ08
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS34
(57)【要約】
【課題】簡易かつ迅速に牛伝染性リンパ腫の病勢を評価可能な、牛伝染性リンパ腫の病勢の検査方法、前記検査方法に使用可能なプライマー、及び検査キットの提供。
【解決手段】（ａ）牛伝染性リンパ腫ウイルスに感染したホスト動物の感染細胞試料を調製する工程、（ｂ）感染細胞のゲノムＤＮＡを鋳型として、牛伝染性リンパ腫ウイルスのプロウイルスＤＮＡ及びホスト動物のゲノムＤＮＡの両方を含むゲノム境界領域のＤＮＡ断片を増幅する工程、（ｃ）ＤＮＡ断片のサンガーシーケンシングを行い、サンガーシーケンシングによるスペクトルデータを取得する工程、（ｄ）スペクトルデータに基づいて、ＤＮＡ断片における、プロウイルスＤＮＡに由来する領域と、ホスト動物のゲノムＤＮＡに由来する領域とを特定し、ホスト動物のゲノムＤＮＡに由来する領域のクローン性を判定する工程等、を含む牛伝染性リンパ腫の病勢の検査方法。
【選択図】なし
【解決手段】（ａ）牛伝染性リンパ腫ウイルスに感染したホスト動物の感染細胞試料を調製する工程、（ｂ）感染細胞のゲノムＤＮＡを鋳型として、牛伝染性リンパ腫ウイルスのプロウイルスＤＮＡ及びホスト動物のゲノムＤＮＡの両方を含むゲノム境界領域のＤＮＡ断片を増幅する工程、（ｃ）ＤＮＡ断片のサンガーシーケンシングを行い、サンガーシーケンシングによるスペクトルデータを取得する工程、（ｄ）スペクトルデータに基づいて、ＤＮＡ断片における、プロウイルスＤＮＡに由来する領域と、ホスト動物のゲノムＤＮＡに由来する領域とを特定し、ホスト動物のゲノムＤＮＡに由来する領域のクローン性を判定する工程等、を含む牛伝染性リンパ腫の病勢の検査方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）牛伝染性リンパ腫ウイルスに感染したホスト動物の感染細胞試料を調製する工程と、
（ｂ）前記感染細胞のゲノムＤＮＡを鋳型として、前記牛伝染性リンパ腫ウイルスのプロウイルスＤＮＡ及び前記ホスト動物のゲノムＤＮＡの両方を含むゲノム境界領域のＤＮＡ断片を増幅する工程と、
（ｃ）前記ＤＮＡ断片のサンガーシーケンシングを行い、前記サンガーシーケンシングによるスペクトルデータを取得する工程と、
（ｄ）前記スペクトルデータに基づいて、前記ＤＮＡ断片における、前記プロウイルスＤＮＡに由来する領域と、前記ホスト動物のゲノムＤＮＡに由来する領域とを特定し、前記ホスト動物のゲノムＤＮＡに由来する領域の均一性を判定する工程と、
（ｅ）前記ホスト動物のゲノムＤＮＡに由来する領域の均一性に基づいて、前記ホスト動物における牛伝染性リンパ腫の病勢を判定する工程と、
を含む、牛伝染性リンパ腫の病勢の検査方法。
（ｂ）前記感染細胞のゲノムＤＮＡを鋳型として、前記牛伝染性リンパ腫ウイルスのプロウイルスＤＮＡ及び前記ホスト動物のゲノムＤＮＡの両方を含むゲノム境界領域のＤＮＡ断片を増幅する工程と、
（ｃ）前記ＤＮＡ断片のサンガーシーケンシングを行い、前記サンガーシーケンシングによるスペクトルデータを取得する工程と、
（ｄ）前記スペクトルデータに基づいて、前記ＤＮＡ断片における、前記プロウイルスＤＮＡに由来する領域と、前記ホスト動物のゲノムＤＮＡに由来する領域とを特定し、前記ホスト動物のゲノムＤＮＡに由来する領域の均一性を判定する工程と、
（ｅ）前記ホスト動物のゲノムＤＮＡに由来する領域の均一性に基づいて、前記ホスト動物における牛伝染性リンパ腫の病勢を判定する工程と、
を含む、牛伝染性リンパ腫の病勢の検査方法。
【請求項2】
前記（ｂ）の工程において、下記（ｉ）～（ｉｖ）からなる群より選択される少なくとも１種のプライマーを用いる、請求項１に記載の牛伝染性リンパ腫の病勢の検査方法：
（ｉ）配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列を有するプライマー；
（ｉｉ）牛伝染性リンパ腫ウイルスのゲノムＤＮＡにおいて、配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列を含むプライマーが特異的にアニーリングする領域に、特異的にアニーリングするプライマー；
（ｉｉｉ）配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列において、１個又は複数個のヌクレオチドが、欠失、付加、又は置換されたヌクレオチド配列を有し、且つ牛伝染性リンパ腫ウイルスのゲノムＤＮＡに特異的にアニーリングするプライマー；及び
（ｉｖ）配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列と、９０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し、且つ牛伝染性リンパ腫ウイルスのゲノムＤＮＡに特異的にアニーリングするプライマー。
（ｉ）配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列を有するプライマー；
（ｉｉ）牛伝染性リンパ腫ウイルスのゲノムＤＮＡにおいて、配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列を含むプライマーが特異的にアニーリングする領域に、特異的にアニーリングするプライマー；
（ｉｉｉ）配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列において、１個又は複数個のヌクレオチドが、欠失、付加、又は置換されたヌクレオチド配列を有し、且つ牛伝染性リンパ腫ウイルスのゲノムＤＮＡに特異的にアニーリングするプライマー；及び
（ｉｖ）配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列と、９０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し、且つ牛伝染性リンパ腫ウイルスのゲノムＤＮＡに特異的にアニーリングするプライマー。
【請求項3】
前記（ｂ）の工程が、
（ｂ１）前記感染細胞のゲノムＤＮＡを鋳型として、前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングする第１のプライマーを用いて、ＤＮＡ伸長反応を行う工程と、
（ｂ２）前記（ｂ１）の工程で生成された第１のＤＮＡ断片を精製する工程と、
（ｂ３）前記第１のＤＮＡ断片に第１のアダプターを付加する工程と、
（ｂ４）前記第１のアダプターが付加された前記第１のＤＮＡ断片を鋳型として、前記第１のアダプターに特異的にアニーリングし、且つ第２のアダプターを含む第２のプライマーを用いて、ＤＮＡ伸長反応を行う工程と、
（ｂ５）前記（ｂ４）の工程で生成された第２のＤＮＡ断片を精製する工程と、
（ｂ６）前記（ｂ５）の工程で精製された第２のＤＮＡ断片を鋳型として、前記第２のＤＮＡ断片が含む前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングする第３のプライマーと、前記第２のアダプターに特異的にアニーリングする第４のプライマーを用いて、核酸増幅反応を行う工程と、
を含む、請求項１又は２に記載の牛伝染性リンパ腫の病勢の検査方法。
（ｂ１）前記感染細胞のゲノムＤＮＡを鋳型として、前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングする第１のプライマーを用いて、ＤＮＡ伸長反応を行う工程と、
（ｂ２）前記（ｂ１）の工程で生成された第１のＤＮＡ断片を精製する工程と、
（ｂ３）前記第１のＤＮＡ断片に第１のアダプターを付加する工程と、
（ｂ４）前記第１のアダプターが付加された前記第１のＤＮＡ断片を鋳型として、前記第１のアダプターに特異的にアニーリングし、且つ第２のアダプターを含む第２のプライマーを用いて、ＤＮＡ伸長反応を行う工程と、
（ｂ５）前記（ｂ４）の工程で生成された第２のＤＮＡ断片を精製する工程と、
（ｂ６）前記（ｂ５）の工程で精製された第２のＤＮＡ断片を鋳型として、前記第２のＤＮＡ断片が含む前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングする第３のプライマーと、前記第２のアダプターに特異的にアニーリングする第４のプライマーを用いて、核酸増幅反応を行う工程と、
を含む、請求項１又は２に記載の牛伝染性リンパ腫の病勢の検査方法。
【請求項4】
前記（ｂ）の工程が、前記（ｂ６）の工程の後、さらに、
（ｂ７）前記（ｂ６）の工程で得られた第３のＤＮＡ断片を鋳型として、前記第３のＤＮＡ断片が含む前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングする第５のプライマーと、前記第２のアダプターに特異的にアニーリングする第６のプライマーを用いて、核酸増幅反応を行う工程、
を含む、請求項３に記載の牛伝染性リンパ腫の病勢の検査方法。
（ｂ７）前記（ｂ６）の工程で得られた第３のＤＮＡ断片を鋳型として、前記第３のＤＮＡ断片が含む前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングする第５のプライマーと、前記第２のアダプターに特異的にアニーリングする第６のプライマーを用いて、核酸増幅反応を行う工程、
を含む、請求項３に記載の牛伝染性リンパ腫の病勢の検査方法。
【請求項5】
下記（ｉ）～（ｉｖ）からなる群より選択される少なくとも１種のプライマー：
（ｉ）配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列を有するプライマー；
（ｉｉ）牛伝染性リンパ腫ウイルスのプロウイルスＤＮＡにおいて、配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列を含むプライマーが特異的にアニーリングする領域に、特異的にアニーリングするプライマー；及び
（ｉｉｉ）配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列において、１個又は複数個のヌクレオチドが、欠失、付加、又は置換されたヌクレオチド配列を有し、且つ前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングするプライマー；及び
（ｉｖ）配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列と、９０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し、且つ前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングするプライマー。
（ｉ）配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列を有するプライマー；
（ｉｉ）牛伝染性リンパ腫ウイルスのプロウイルスＤＮＡにおいて、配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列を含むプライマーが特異的にアニーリングする領域に、特異的にアニーリングするプライマー；及び
（ｉｉｉ）配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列において、１個又は複数個のヌクレオチドが、欠失、付加、又は置換されたヌクレオチド配列を有し、且つ前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングするプライマー；及び
（ｉｖ）配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列と、９０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し、且つ前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングするプライマー。
【請求項6】
請求項５に記載のプライマーを含む、牛伝染性リンパ腫の病勢の検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、牛伝染性リンパ腫の病勢の検査方法、プライマー、及び牛伝染性リンパ腫の病勢の検査キットに関する。
【背景技術】
【0002】
牛は、牛乳及び食肉などの重要な食料資源である。近年、日本の肉用牛及び乳製品の質の高さが世界的にも評価されており、日本のみならず海外でもその需要が年々増加している。世界的にも、酪農及び肉用牛の生産は、畜産業界の中でも、極めて大きなシェアを占めている。
【0003】
牛伝染性リンパ腫ウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ：ＢＬＶ）は、牛のＢリンパ球に感染するウイルスである。ＢＬＶは、一部の感染牛でリンパ腫を引き起こす病原性を有する。６０～７０％の感染牛は無症状で病気を発症しないが、３０％の感染牛で持続性リンパ球増多症を発症し、数％の感染牛でリンパ腫を発症する。
【0004】
近年、日本ではＢＬＶの感染率、及び伝染性リンパ腫の発症数ともに増加傾向にあり、その対策の必要性が増している。日本では、ＢＬＶ感染だけでリンパ腫を発症していない牛は、食肉として市場に流通する。しかしながら、と畜検査時に伝染性リンパ腫の発症を認めると家畜伝染病予防法の規定により全部廃棄となる。そのため、伝染性リンパ腫の発症は、生産農家にとって大きな経済的損失をもたらす。
【0005】
伝染性リンパ腫の発症を検知するためには、正確な診断が必要である。しかしながら、重要な問題にも関わらず、伝染性リンパ腫の診断は、獣医師による肉眼的又は触知によるリンパ節腫大の有無の確認により行われているのが現状である。そのため、診断精度は高くない。
【0006】
ＢＬＶ感染牛の検査方法としては、ＢＬＶのプロウイルス量を定量する核酸検査法が用いられている（例えば、特許文献１）。しかしながら、ＢＬＶのプロウイルスＤＮＡ量は、ＢＬＶ感染細胞数を反映するが、腫瘍化した細胞数を評価することはできない。
【0007】
また、次世代シーケンサー解析により、ＢＬＶ感染細胞のクローナリティを評価する方法が提案されている（非特許文献１）。しかしながら、次世代シーケンサーは、高価であり、汎用性が低い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】特開２０１９－１８０３５１号公報
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Nicolas A. Gillet et al., Massive Depletion of Bovine Leukemia Virus Proviral Clones Located in Genomic Transcriptionally Active Sites during Primary Infection. PLoS Pathog. 2013;9(10):e1003687.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
上記のように、ＢＬＶのプロウイルスを定量する方法は、腫瘍化した細胞数を定量することができず、牛伝染性リンパ腫の病勢を評価することはできない。また、次世代シーケンサー解析を用いる方法は、高コストであり、実用的に用いることは困難である。
そのため、簡易かつ迅速に牛伝染性リンパ腫の病勢を評価可能な検査技術が求められている。
そのため、簡易かつ迅速に牛伝染性リンパ腫の病勢を評価可能な検査技術が求められている。
【0011】
そこで、本発明は、簡易かつ迅速に牛伝染性リンパ腫の病勢を評価可能な、牛伝染性リンパ腫の病勢の検査方法、前記検査方法に使用可能なプライマー、及び検査キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明は以下の態様を含む。
［１］（ａ）牛白血病牛伝染性リンパ腫ウイルスに感染したホスト動物の感染細胞試料を調製する工程と、（ｂ）前記感染細胞のゲノムＤＮＡを鋳型として、前記牛白血病牛伝染性リンパ腫ウイルスのプロウイルスＤＮＡ及び前記ホスト動物のゲノムＤＮＡの両方を含むゲノム境界領域のＤＮＡ断片を増幅する工程と、（ｃ）前記ＤＮＡ断片のサンガーシーケンシングを行い、前記サンガーシーケンシングによるスペクトルデータを取得する工程と、（ｄ）前記スペクトルデータに基づいて、前記ＤＮＡ断片における、前記プロウイルスＤＮＡに由来する領域と、前記ホスト動物のゲノムＤＮＡに由来する領域とを特定し、前記ホスト動物のゲノムＤＮＡに由来する領域の均一性を判定する工程と、（ｅ）前記ホスト動物のゲノムＤＮＡに由来する領域の均一性に基づいて、前記ホスト動物における牛伝染性リンパ腫の病勢を判定する工程と、を含む、牛伝染性リンパ腫の病勢の検査方法。
［２］前記（ｂ）の工程において、下記（ｉ）～（ｉｖ）からなる群より選択される少なくとも１種のプライマーを用いる、［１］に記載の牛伝染性リンパ腫の病勢の検査方法：（ｉ）配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列を有するプライマー；（ｉｉ）牛白血病牛伝染性リンパ腫ウイルスのゲノムＤＮＡにおいて、配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列を含むプライマーが特異的にアニーリングする領域に、特異的にアニーリングするプライマー；（ｉｉｉ）配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列において、１個又は複数個のヌクレオチドが、欠失、付加、又は置換されたヌクレオチド配列を有し、且つ牛白血病牛伝染性リンパ腫ウイルスのゲノムＤＮＡに特異的にアニーリングするプライマー；及び（ｉｖ）配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列と、９０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し、且つ牛白血病牛伝染性リンパ腫ウイルスのゲノムＤＮＡに特異的にアニーリングするプライマー。
［３］前記（ｂ）の工程が、（ｂ１）前記感染細胞のゲノムＤＮＡを鋳型として、前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングする第１のプライマーを用いて、ＤＮＡ伸長反応を行う工程と、（ｂ２）前記（ｂ１）の工程で生成された第１のＤＮＡ断片を精製する工程と、（ｂ３）前記第１のＤＮＡ断片に第１のアダプターを付加する工程と、（ｂ４）前記第１のアダプターが付加された前記第１のＤＮＡ断片を鋳型として、前記第１のアダプターに特異的にアニーリングし、且つ第２のアダプターを含む第２のプライマーを用いて、ＤＮＡ伸長反応を行う工程と、（ｂ５）前記（ｂ４）の工程で生成された第２のＤＮＡ断片を精製する工程と、（ｂ６）前記（ｂ５）の工程で精製された第２のＤＮＡ断片を鋳型として、前記第２のＤＮＡ断片が含む前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングする第３のプライマーと、前記第２のアダプターに特異的にアニーリングする第４のプライマーを用いて、核酸増幅反応を行う工程と、を含む、［１］又は［２］に記載の牛伝染性リンパ腫の病勢の検査方法。
［４］前記（ｂ）の工程が、前記（ｂ６）の工程の後、さらに、（ｂ７）前記（ｂ６）の工程で得られた第３のＤＮＡ断片を鋳型として、前記第３のＤＮＡ断片が含む前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングする第５のプライマーと、前記第２のアダプターに特異的にアニーリングする第６のプライマーを用いて、核酸増幅反応を行う工程を含む、［３］に記載の牛伝染性リンパ腫の病勢の検査方法。
［５］下記（ｉ）～（ｉｖ）からなる群より選択される少なくとも１種のプライマー：（ｉ）配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列を有するプライマー；（ｉｉ）牛白血病牛伝染性リンパ腫ウイルスのプロウイルスＤＮＡにおいて、配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列を含むプライマーが特異的にアニーリングする領域に、特異的にアニーリングするプライマー；及び（ｉｉｉ）配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列において、１個又は複数個のヌクレオチドが、欠失、付加、又は置換されたヌクレオチド配列を有し、且つ前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングするプライマー；及び（ｉｖ）配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列と、９０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し、且つ前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングするプライマー。
［６］［５］に記載のプライマーを含む、牛伝染性リンパ腫の病勢の検査キット。
［１］（ａ）牛白血病牛伝染性リンパ腫ウイルスに感染したホスト動物の感染細胞試料を調製する工程と、（ｂ）前記感染細胞のゲノムＤＮＡを鋳型として、前記牛白血病牛伝染性リンパ腫ウイルスのプロウイルスＤＮＡ及び前記ホスト動物のゲノムＤＮＡの両方を含むゲノム境界領域のＤＮＡ断片を増幅する工程と、（ｃ）前記ＤＮＡ断片のサンガーシーケンシングを行い、前記サンガーシーケンシングによるスペクトルデータを取得する工程と、（ｄ）前記スペクトルデータに基づいて、前記ＤＮＡ断片における、前記プロウイルスＤＮＡに由来する領域と、前記ホスト動物のゲノムＤＮＡに由来する領域とを特定し、前記ホスト動物のゲノムＤＮＡに由来する領域の均一性を判定する工程と、（ｅ）前記ホスト動物のゲノムＤＮＡに由来する領域の均一性に基づいて、前記ホスト動物における牛伝染性リンパ腫の病勢を判定する工程と、を含む、牛伝染性リンパ腫の病勢の検査方法。
［２］前記（ｂ）の工程において、下記（ｉ）～（ｉｖ）からなる群より選択される少なくとも１種のプライマーを用いる、［１］に記載の牛伝染性リンパ腫の病勢の検査方法：（ｉ）配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列を有するプライマー；（ｉｉ）牛白血病牛伝染性リンパ腫ウイルスのゲノムＤＮＡにおいて、配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列を含むプライマーが特異的にアニーリングする領域に、特異的にアニーリングするプライマー；（ｉｉｉ）配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列において、１個又は複数個のヌクレオチドが、欠失、付加、又は置換されたヌクレオチド配列を有し、且つ牛白血病牛伝染性リンパ腫ウイルスのゲノムＤＮＡに特異的にアニーリングするプライマー；及び（ｉｖ）配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列と、９０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し、且つ牛白血病牛伝染性リンパ腫ウイルスのゲノムＤＮＡに特異的にアニーリングするプライマー。
［３］前記（ｂ）の工程が、（ｂ１）前記感染細胞のゲノムＤＮＡを鋳型として、前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングする第１のプライマーを用いて、ＤＮＡ伸長反応を行う工程と、（ｂ２）前記（ｂ１）の工程で生成された第１のＤＮＡ断片を精製する工程と、（ｂ３）前記第１のＤＮＡ断片に第１のアダプターを付加する工程と、（ｂ４）前記第１のアダプターが付加された前記第１のＤＮＡ断片を鋳型として、前記第１のアダプターに特異的にアニーリングし、且つ第２のアダプターを含む第２のプライマーを用いて、ＤＮＡ伸長反応を行う工程と、（ｂ５）前記（ｂ４）の工程で生成された第２のＤＮＡ断片を精製する工程と、（ｂ６）前記（ｂ５）の工程で精製された第２のＤＮＡ断片を鋳型として、前記第２のＤＮＡ断片が含む前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングする第３のプライマーと、前記第２のアダプターに特異的にアニーリングする第４のプライマーを用いて、核酸増幅反応を行う工程と、を含む、［１］又は［２］に記載の牛伝染性リンパ腫の病勢の検査方法。
［４］前記（ｂ）の工程が、前記（ｂ６）の工程の後、さらに、（ｂ７）前記（ｂ６）の工程で得られた第３のＤＮＡ断片を鋳型として、前記第３のＤＮＡ断片が含む前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングする第５のプライマーと、前記第２のアダプターに特異的にアニーリングする第６のプライマーを用いて、核酸増幅反応を行う工程を含む、［３］に記載の牛伝染性リンパ腫の病勢の検査方法。
［５］下記（ｉ）～（ｉｖ）からなる群より選択される少なくとも１種のプライマー：（ｉ）配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列を有するプライマー；（ｉｉ）牛白血病牛伝染性リンパ腫ウイルスのプロウイルスＤＮＡにおいて、配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列を含むプライマーが特異的にアニーリングする領域に、特異的にアニーリングするプライマー；及び（ｉｉｉ）配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列において、１個又は複数個のヌクレオチドが、欠失、付加、又は置換されたヌクレオチド配列を有し、且つ前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングするプライマー；及び（ｉｖ）配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列と、９０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し、且つ前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングするプライマー。
［６］［５］に記載のプライマーを含む、牛伝染性リンパ腫の病勢の検査キット。
【発明の効果】
【0013】
本発明によれば、簡易かつ迅速に牛伝染性リンパ腫の病勢を評価可能な、牛伝染性リンパ腫の病勢の検査方法、前記検査方法に使用可能なプライマー、及び検査キットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】伝染性リンパ腫発症牛と非発症牛における感染細胞の状態を説明する図である。
【図2】１実施形態の検査方法の原理を説明する模式図である。
【図3】１実施形態の検査方法の工程（ｂ）の一例を示す模式図である。
【図4】伝染性リンパ腫非発症牛、リンパ球増多症牛、及び伝染性リンパ腫発症牛におけるゲノム境界領域のホスト側ＤＮＡの均一性を評価した結果を示す図である。Ａは、サンガーシーケンシングのスペクトルデータを示す。Ｂは、サンガーシーケンシングのスペクトルデータをＥｄｉｔＲで解析した結果を示す。
【図5】伝染性リンパ腫非発症牛、リンパ球増多症牛、及び伝染性リンパ腫発症牛におけるゲノム境界領域のホスト側ＤＮＡの均一性を評価した結果を示す図である。Ａは、サンガーシーケンシングのスペクトルデータをＥｄｉｔＲで解析した結果を示す。Ｂは、次世代シーケンサー（Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ：ＮＧＳ）解析により、感染細胞の均一性を評価した結果を示す。
【図6】経時的に、ＢＬＶ感染牛のゲノム境界領域のホスト側ＤＮＡの均一性を評価した結果を示す図である。「ＮＧＳ解析」は、ＮＧＳ解析による感染細胞の均一性を評価した結果を示す。「ＰＶＬ（％）」は、リアルタイムＰＣＲによるプロウイルス量の定量結果を示す。「ＩＳ」は、ＢＬＶプロウイルスの挿入サイト数を示す。
【図10】１２症例の伝染性リンパ腫発症牛、及び１１症例の伝染性リンパ腫非発症牛若しくはリンパ球増多症牛において、ゲノム境界領域のホスト側ＤＮＡの均一性を評価した結果を示す図である。ＮＧＳ解析による多様性評価結果と、クローンインデックス値とを併記した。
【図11】伝染性リンパ腫発症牛と伝染性リンパ腫非発症牛との間で、クローンインデックス値を比較したグラフを示す。
【図12】伝染性リンパ腫発症牛と伝染性リンパ腫非発症牛との間で、ＢＬＶプロウイルス量を比較したグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【0015】
［定義］
「ホスト動物」とは、ＢＬＶの感染対象となる動物をいう。ＢＬＶのホスト動物は、ＢＬＶが感染可能であれば、特に限定されない。ホスト動物は、非ヒト動物であり、例えば、牛、水牛、カピバラ、羊等が挙げられるが、これらに限定されない。
「感染細胞」とは、ＢＬＶのプロウイルスがホスト動物のゲノムＤＮＡに組み込まれたホスト動物の細胞をいう。
「牛伝染性リンパ腫の病勢」とは、牛伝染性リンパ腫の発症状態をいう。典型的には、牛伝染性リンパ腫を発症すると、リンパ腫が発生する。「牛伝染性リンパ腫の病勢の検査」には、牛伝染性リンパ腫の発症状態を判定すること、及び牛伝染性リンパ腫の発症リスクを判定すること、を包含する。
「ホスト動物」とは、ＢＬＶの感染対象となる動物をいう。ＢＬＶのホスト動物は、ＢＬＶが感染可能であれば、特に限定されない。ホスト動物は、非ヒト動物であり、例えば、牛、水牛、カピバラ、羊等が挙げられるが、これらに限定されない。
「感染細胞」とは、ＢＬＶのプロウイルスがホスト動物のゲノムＤＮＡに組み込まれたホスト動物の細胞をいう。
「牛伝染性リンパ腫の病勢」とは、牛伝染性リンパ腫の発症状態をいう。典型的には、牛伝染性リンパ腫を発症すると、リンパ腫が発生する。「牛伝染性リンパ腫の病勢の検査」には、牛伝染性リンパ腫の発症状態を判定すること、及び牛伝染性リンパ腫の発症リスクを判定すること、を包含する。
【0016】
「ゲノム境界領域」とは、感染細胞のゲノムＤＮＡにおいて、ホスト動物ゲノムＤＮＡに組み込まれたＢＬＶプロウイルスのＤＮＡと、ホスト動物ゲノムＤＮＡと、が連結している領域をいう。ゲノム境界領域では、ＢＬＶプロウイルスのＤＮＡと、ホスト動物ゲノムＤＮＡとの両方が存在する。ゲノム境界領域におけるＢＬＶプロウイルスのＤＮＡを、「プロウイルス側ＤＮＡ」又は「プロウイルス側配列」という場合がある。ゲノム境界領域におけるホスト動物ゲノムのＤＮＡを、「ホスト側ＤＮＡ」又は「ホスト側配列」という場合がある。
【0017】
「サンガーシーケンシング」とは、サンガー法（Sanger, F., et al. (1975)）の原理に基づく配列解析をいう。サンガー法では、ｄｄＮＴＰ（２’，３’－ジデオキシヌクレオチド）によるＤＮＡ鎖伸長反応の停止を利用する。ＤＮＡポリメラーゼは、４種類のヌクレオチド（ｄＮＴＰ：ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ）の存在下で、ＤＮＡ鎖を伸長する。ＤＮＡ鎖伸長反応を、ｄｄＮＴＰ（２’，３’－ジデオキシヌクレオチド；ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ）の存在下で行うと、ｄｄＮＴＰが取り込まれたところでＤＮＡ伸長反応が停止する。これにより、１塩基毎に長さが異なる様々な鎖長のＤＮＡ断片が得られる。これらのＤＮＡ断片の３’末端には、ｄｄＮＴＰが取り込まれている。ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＴＰ、及びｄｄＣＴＰをそれぞれ異なる蛍光色素で標識しておくと、蛍光色素を識別することで、前記ＤＮＡ断片の３’末端に取り込まれたｄｄＮＴＰを識別することができる。この３’末端に取り込まれたｄｄＮＴＰの種類を読み取ることで、配列解析を行うことができる。
【0018】
「サンガーシーケンシング反応」とは、４種のｄＮＴＰ、及び各蛍光色素で標識された４種のｄｄＮＴＰの存在下で、ＤＮＡ伸長反応を行う反応をいう。
「サンガーシーケンシング用シーケンサー」とは、サンガーシーケンシング反応により得られた反応物から、配列データを取得する機能を備えたシーケンサーをいう。サンガーシーケンシング用シーケンサーでは、サンガーシーケンシング反応により得られたＤＮＡ断片を鎖長毎に分離し、各鎖長のＤＮＡ断片の３’末端に存在するｄｄＮＴＰを蛍光色素により識別することにより、配列データを取得する。
「サンガーシーケンシング用シーケンサー」とは、サンガーシーケンシング反応により得られた反応物から、配列データを取得する機能を備えたシーケンサーをいう。サンガーシーケンシング用シーケンサーでは、サンガーシーケンシング反応により得られたＤＮＡ断片を鎖長毎に分離し、各鎖長のＤＮＡ断片の３’末端に存在するｄｄＮＴＰを蛍光色素により識別することにより、配列データを取得する。
【0019】
「サンガーシーケンシングによるスペクトルデータ」（以下、単に「スペクトルデータ」ともいう）とは、サンガーシーケンシング反応の反応物を、サンガーシーケンシング用シーケンサーで分析することで得られる蛍光スペクトルデータをいう。サンガーシーケンシング用シーケンサーでは、ＤＮＡ鎖長毎に蛍光標識を識別し、鎖長の短い順から蛍光シグナルを配列した蛍光スペクトルデータとして出力する。単一配列のＤＮＡ断片のサンガーシーケンシングを行った場合、同じ鎖長の３’末端に取り込まれるｄｄＮＴＰは同一であり、同一の蛍光標識が検出される。そのため、スペクトルデータの波形は略単一となる。一方、一部の配列が異なるＤＮＡ断片のサンガーシーケンシングを行った場合、スペクトルデータは、配列が異なる位置では、複数のピークが混在する波形となる。
【0020】
「特異的にアニーリング」するとは、核酸増幅反応で通常用いられるアニーリング条件において、アニーリング対象のヌクレオチド配列にアニーリングし、それ以外のヌクレオチド配列にはアニーリングしないことをいう。核酸増幅反応で通常用いられるアニーリング条件としては、例えば、塩濃度１．５～２．５ｍＭ、アニーリング温度５０～７０℃が挙げられる。アニーリング温度は、プライマーのＴｍ値に基づいて設定してもよい。例えば、Ｔｍ値から２～３度程度低い温度をアニーリング温度として設定してもよい。
【0021】
ヌクレオチド配列どうしの配列同一性は、２つのヌクレオチド配列を、対応するヌクレオチドが最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除くヌクレオチド配列全体に対する一致したヌクレオチドの割合として求められる。ヌクレオチド配列同士の配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。例えば、ヌクレオチド配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＮにより得られたアライメントを元にした計算によって得ることができる。
【0022】
[牛伝染性リンパ腫の病勢の検査方法]
本開示の第１の態様は、牛伝染性リンパ腫の病勢の検査方法である。１実施形態において、本開示の検査方法は、下記（ａ）～（ｅ）の工程を含む。
（ａ）牛伝染性リンパ腫ウイルスに感染したホスト動物の感染細胞試料を調製する工程。
（ｂ）前記感染細胞のゲノムＤＮＡを鋳型として、前記牛伝染性リンパ腫ウイルスのプロウイルスＤＮＡ及び前記ホスト動物のゲノムＤＮＡの両方を含むゲノム境界領域のＤＮＡ断片を増幅する工程。
（ｃ）前記ＤＮＡ断片のサンガーシーケンシングを行い、前記サンガーシーケンシングによるスペクトルデータを取得する工程。
（ｄ）前記スペクトルデータに基づいて、前記ＤＮＡ断片における、前記プロウイルスＤＮＡに由来する領域と、前記ホスト動物のゲノムＤＮＡに由来する領域とを特定し、前記ホスト動物のゲノムＤＮＡに由来する領域の均一性を判定する工程。
（ｅ）前記ホスト動物のゲノムＤＮＡに由来する領域の均一性に基づいて、前記ホスト動物における牛伝染性リンパ腫の病勢を判定する工程。
本開示の第１の態様は、牛伝染性リンパ腫の病勢の検査方法である。１実施形態において、本開示の検査方法は、下記（ａ）～（ｅ）の工程を含む。
（ａ）牛伝染性リンパ腫ウイルスに感染したホスト動物の感染細胞試料を調製する工程。
（ｂ）前記感染細胞のゲノムＤＮＡを鋳型として、前記牛伝染性リンパ腫ウイルスのプロウイルスＤＮＡ及び前記ホスト動物のゲノムＤＮＡの両方を含むゲノム境界領域のＤＮＡ断片を増幅する工程。
（ｃ）前記ＤＮＡ断片のサンガーシーケンシングを行い、前記サンガーシーケンシングによるスペクトルデータを取得する工程。
（ｄ）前記スペクトルデータに基づいて、前記ＤＮＡ断片における、前記プロウイルスＤＮＡに由来する領域と、前記ホスト動物のゲノムＤＮＡに由来する領域とを特定し、前記ホスト動物のゲノムＤＮＡに由来する領域の均一性を判定する工程。
（ｅ）前記ホスト動物のゲノムＤＮＡに由来する領域の均一性に基づいて、前記ホスト動物における牛伝染性リンパ腫の病勢を判定する工程。
【0023】
牛伝染性リンパ腫ウイルス（ＢＬＶ）は、レトロウイルス科デルタレトロウイルス属に分類され、伝染性牛伝染性リンパ腫の原因となるウイルスである。ＢＬＶが、ホスト動物に感染すると、ホスト動物の細胞のゲノムＤＮＡに、ＢＬＶのプロウイルスが組込まれる。ＢＬＶは、主に、Ｂリンパ球に感染する。ホスト動物ゲノムＤＮＡにおいて、ＢＬＶプロウイルスが組込まれる位置は、特に限定されていない。そのため、感染細胞により、ＢＬＶプロウイルスの挿入位置は異なり得る。
【0024】
図１は、ホスト動物におけるＢＬＶ感染細胞の状態を示す模式図である。図１に示す感染細胞集団は、伝染性リンパ腫非発症動物及び伝染性リンパ腫発症動物のいずれにおいても、感染細胞の割合は１００％である。
一方、伝染性リンパ腫の病勢が進んでいない状態（伝染性リンパ腫非発症）の場合、ＢＬＶプロウイルスの挿入位置が異なる多様な感染細胞が存在する。しかし、伝染性リンパ腫を発症し、特定の感染細胞が腫瘍性に増殖すると、感染細胞の多様性が失われる。そのため、伝染性リンパ腫発症動物では、特定の感染細胞にほぼ占有された状態となる。図１には、ＮＧＳ解析による感染細胞の多様性評価結果の典型例を併記している。典型的なＮＧＳ解析結果では、伝染性リンパ腫非発症動物では感染細胞の多様性が高く、伝染性リンパ腫発症動物では単一クローンの感染細胞で占められる。
一方、伝染性リンパ腫の病勢が進んでいない状態（伝染性リンパ腫非発症）の場合、ＢＬＶプロウイルスの挿入位置が異なる多様な感染細胞が存在する。しかし、伝染性リンパ腫を発症し、特定の感染細胞が腫瘍性に増殖すると、感染細胞の多様性が失われる。そのため、伝染性リンパ腫発症動物では、特定の感染細胞にほぼ占有された状態となる。図１には、ＮＧＳ解析による感染細胞の多様性評価結果の典型例を併記している。典型的なＮＧＳ解析結果では、伝染性リンパ腫非発症動物では感染細胞の多様性が高く、伝染性リンパ腫発症動物では単一クローンの感染細胞で占められる。
【0025】
図２は、１実施形態の検査方法の原理を説明する図である。伝染性リンパ腫非発症動物では、ＢＬＶプロウイルスの挿入位置が異なる多様な感染細胞が存在する。ＢＬＶプロウイルスの配列は既知であるため、ＢＬＶプロウイルス配列から、ＢＬＶプロウイルスのホスト動物ゲノムにおける挿入位置を特定することができる。
ＢＬＶプロウイルスＤＮＡとホスト動物ゲノムＤＮＡとのゲノム境界領域において、プロウイルス側ＤＮＡは各感染細胞で共通である。一方、ホスト側ＤＮＡは、プロウイルスの挿入位置に応じて異なっている。
伝染性リンパ腫非発症動物では、感染細胞の多様性が高いため、ゲノム境界領域におけるホスト側ＤＮＡには多様性がある。そのため、サンガーシーケンシングによるスペクトルデータは、ホスト側ＤＮＡでは、各ヌクレオチド位置において、各塩基に対応する４種の蛍光色素ピークが混在した波形となる。
伝染性リンパ腫発症動物では、感染細胞のクローン性が高いため、ゲノム境界領域におけるホスト側ＤＮＡには多様性がない。そのため、サンガーシーケンシングによるスペクトルデータは、ホスト側ＤＮＡでも、各ヌクレオチド位置において、略単一の塩基に対応する蛍光色素ピークが形成される波形となる。
ＢＬＶプロウイルスＤＮＡとホスト動物ゲノムＤＮＡとのゲノム境界領域において、プロウイルス側ＤＮＡは各感染細胞で共通である。一方、ホスト側ＤＮＡは、プロウイルスの挿入位置に応じて異なっている。
伝染性リンパ腫非発症動物では、感染細胞の多様性が高いため、ゲノム境界領域におけるホスト側ＤＮＡには多様性がある。そのため、サンガーシーケンシングによるスペクトルデータは、ホスト側ＤＮＡでは、各ヌクレオチド位置において、各塩基に対応する４種の蛍光色素ピークが混在した波形となる。
伝染性リンパ腫発症動物では、感染細胞のクローン性が高いため、ゲノム境界領域におけるホスト側ＤＮＡには多様性がない。そのため、サンガーシーケンシングによるスペクトルデータは、ホスト側ＤＮＡでも、各ヌクレオチド位置において、略単一の塩基に対応する蛍光色素ピークが形成される波形となる。
【0026】
したがって、ゲノム境界領域のスペクトルデータを取得することにより、感染細胞の多様性を評価することができる。また、感染細胞の多様性から、伝染性リンパ腫の病勢を評価することができる。
なお、本明細書では、工程（ｂ）で得らえるＤＮＡ断片において、ホスト動物ゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列を有する領域をホスト動物ゲノムＤＮＡ又はホスト側ＤＮＡという場合がある。工程（ｂ）で得らえるＤＮＡ断片において、ＢＬＶプロウイルスＤＮＡのヌクレオチド配列を有する領域をＢＬＶプロウイルスＤＮＡ又はプロウイルス側ＤＮＡという場合がある。
なお、本明細書では、工程（ｂ）で得らえるＤＮＡ断片において、ホスト動物ゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列を有する領域をホスト動物ゲノムＤＮＡ又はホスト側ＤＮＡという場合がある。工程（ｂ）で得らえるＤＮＡ断片において、ＢＬＶプロウイルスＤＮＡのヌクレオチド配列を有する領域をＢＬＶプロウイルスＤＮＡ又はプロウイルス側ＤＮＡという場合がある。
【0027】
＜工程（ａ）＞
工程（ａ）では、牛伝染性リンパ腫ウイルス（ＢＬＶ）に感染したホスト動物の感染細胞試料を調製する。
工程（ａ）では、牛伝染性リンパ腫ウイルス（ＢＬＶ）に感染したホスト動物の感染細胞試料を調製する。
【0028】
ホスト動物がＢＬＶに感染しているか否かは、公知の方法で確認することができる。例えば、ＢＬＶのプロウイルスに特異的にアニーリングするプライマーを用いてＢＬＶプロウイルスのＤＮＡを増幅する方法；ＢＬＶのタンパク質に特異的に結合する抗体を用いて
ＢＬＶを検出する方法等が挙げられる。
ＢＬＶを検出する方法等が挙げられる。
【0029】
ＢＬＶは、主にＢ細胞に感染するため、通常、ホスト動物から血液を採取することにより、感染細胞試料を得ることができる。血液は、例えば、密度勾配遠心方等を用いて、単核細胞成分を分離してもよい。
【0030】
感染細胞試料を調製後、感染細胞からゲノムＤＮＡを抽出してもよい。ゲノムＤＮＡの抽出は公知の方法で行うことができる。あるいは、感染細胞を破砕した細胞破砕液を調製し、工程（ｂ）に供してもよい。
【0031】
＜工程（ｂ）＞
工程（ｂ）では、感染細胞のゲノムＤＮＡを鋳型として、牛伝染性リンパ腫ウイルス（ＢＬＶ）のプロウイルスＤＮＡ及びホスト動物のゲノムＤＮＡの両方を含むゲノム境界領域のＤＮＡ断片を増幅する。
工程（ｂ）では、感染細胞のゲノムＤＮＡを鋳型として、牛伝染性リンパ腫ウイルス（ＢＬＶ）のプロウイルスＤＮＡ及びホスト動物のゲノムＤＮＡの両方を含むゲノム境界領域のＤＮＡ断片を増幅する。
【0032】
ゲノム境界領域において、ホスト側ＤＮＡは通常不明である。一方、ＢＬＶプロウイルス側ＤＮＡは既知である。そのため、ゲノム境界領域におけるプロウイルス側ＤＮＡに特異的にアニーリングするプライマーを用いることにより、ゲノム境界領域のＤＮＡ断片を増幅することができる。
【0033】
ゲノム境界領域は、ＢＬＶプロウイルスの３’末端側に設定してもよく、５’末端側に設定してもよい。１実施形態において、ゲノム境界領域は、ＢＬＶプロウイルスの３’末端側に設定する。ゲノム境界領域を、ＢＬＶプロウイルスの３’末端側に設定することにより、プロウイルス側ＤＮＡに特異的にアニーリングするフォワードプライマーを用いて、ホスト側ＤＮＡ方向にＤＮＡ伸長反応を行うことができる。ＤＮＡ伸長反応により得られたＤＮＡ鎖は、３’末端にアダプターを付加してもよい。３’末端にアダプターを付加することにより、当該アダプターに特異的にアニーリングするリバースプライマーと、プロウイルス側ＤＮＡに特異的にアニーリングするフォワードプライマーとを用いて、ゲノム境界領域の核酸増幅反応を行うことができる。
アダプター配列は、特に限定されず、任意のものを用いることができる。ゲノム境界領域のＤＮＡ断片を特異的に増幅するために、アダプターは、プロウイルス及びホスト動物ゲノムに存在しない配列を有することが好ましい。アダプター配列を付加する前又は付加した後に、ＤＮＡ断片を精製してもよい。この場合、アダプター配列には、プロウイルス及びホスト動物ゲノムに存在する配列を用いてもよい。アダプター配列としては、例えば、ポリＡ配列等が挙げられる。
アダプター配列は、特に限定されず、任意のものを用いることができる。ゲノム境界領域のＤＮＡ断片を特異的に増幅するために、アダプターは、プロウイルス及びホスト動物ゲノムに存在しない配列を有することが好ましい。アダプター配列を付加する前又は付加した後に、ＤＮＡ断片を精製してもよい。この場合、アダプター配列には、プロウイルス及びホスト動物ゲノムに存在する配列を用いてもよい。アダプター配列としては、例えば、ポリＡ配列等が挙げられる。
【0034】
（プライマー）
工程（ｂ）で用いるプライマーは、ゲノム境界領域のプロウイルス側配列に基づいて設計することができる。ＢＬＶは、全ゲノムが解読されており、ＮＣＢＩ等の配列データベースに登録されている。そのため、それらの配列データベースから、ＢＬＶゲノム配列及びプロウイルス配列を取得することができる。
工程（ｂ）で用いるプライマーは、ゲノム境界領域のプロウイルス側配列に基づいて設計することができる。ＢＬＶは、全ゲノムが解読されており、ＮＣＢＩ等の配列データベースに登録されている。そのため、それらの配列データベースから、ＢＬＶゲノム配列及びプロウイルス配列を取得することができる。
【0035】
ゲノム境界領域のプロウイルス側ＤＮＡに特異的にアニーリングするフォワードプライマーとしては、例えば、下記（ｉ）～（ｉｖ）のプライマーが挙げられる。
（ｉ）配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列を有するプライマー。
（ｉｉ）牛伝染性リンパ腫ウイルスのプロウイルスＤＮＡにおいて、配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列を含むプライマーが特異的にアニーリングする領域に、特異的にアニーリングするプライマー。
（ｉｉｉ）配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列において、１個又は複数個のヌクレオチドが、欠失、付加、又は置換されたヌクレオチド配列を有し、且つ前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングするプライマー。
（ｉｖ）配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列と、９０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し、且つ前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングするプライマー。
（ｉ）配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列を有するプライマー。
（ｉｉ）牛伝染性リンパ腫ウイルスのプロウイルスＤＮＡにおいて、配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列を含むプライマーが特異的にアニーリングする領域に、特異的にアニーリングするプライマー。
（ｉｉｉ）配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列において、１個又は複数個のヌクレオチドが、欠失、付加、又は置換されたヌクレオチド配列を有し、且つ前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングするプライマー。
（ｉｖ）配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列と、９０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し、且つ前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングするプライマー。
【0036】
前記（ｉ）～（ｉｖ）のプライマーは、ＢＬＶプロウイルスの３’ＬＴＲ又はその直近領域に特異的にアニーリング可能なプライマーである。（ｉ）～（ｉｖ）のプライマーは、公知のＢＬＶが共通して有する配列に特異的にアニーリングすることができる。そのため、幅広い範囲のＢＬＶに適用することができる。
【0037】
前記（ｉｉｉ）において、「複数個」としては、例えば、２～６個、２～５個、２～３個、又は２個が挙げられる。
前記（ｉｖ）において、配列同一性としては、例えば、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上が挙げられる。
前記（ｉｖ）において、配列同一性としては、例えば、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上が挙げられる。
【0038】
プライマーの長さは、特に限定されず、核酸伸長反応で通常用いられる長さとすることができる。プライマーの長さの下限値としては、例えば、１５ｍｅｒ以上、１６ｍｅｒ以上、１７ｍｅｒ以上、１８ｍｅｒ以上、又は１９ｍｅｒ以上が挙げられる。プライマーの長さの上限値としては、例えば、３０ｍｅｒ以下、２９ｍｅｒ以下、２８ｍｅｒ以下、２７ｍｅｒ以下、２６ｍｅｒ以下、又は２５ｍｅｒ以下が挙げられる。これらの上限値及び下限値は任意に組合せ可能である。
【0039】
（工程（ｂ）の例）
工程（ｂ）は、ＤＮＡ伸長反応、ＤＮＡ断片の精製、ネステッドＰＣＲ等の公知の手法を組み合わせて実施してもよい。
図３は、工程（ｂ）の一例を説明する模式図である。図３に示す方法では、工程（ｂ）は、以下の（ｂ１）～（ｂ７）の工程を含む。
（ｂ１）前記感染細胞のゲノムＤＮＡを鋳型として、前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングする第１のプライマーを用いて、ＤＮＡ伸長反応を行う工程。
（ｂ２）前記（ｂ１）の工程で生成された第１のＤＮＡ断片を精製する工程。
（ｂ３）前記第１のＤＮＡ断片に第１のアダプターを付加する工程。
（ｂ４）前記第１のアダプターが付加された前記第１のＤＮＡ断片を鋳型として、前記第１のアダプターに特異的にアニーリングし、且つ第２のアダプターを含む第２のプライマーを用いて、ＤＮＡ伸長反応を行う工程。
（ｂ５）前記（ｂ４）の工程で生成された第２のＤＮＡ断片を精製する工程。
（ｂ６）前記（ｂ５）の工程で精製された第２のＤＮＡ断片を鋳型として、前記第２のＤＮＡ断片が含む前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングする第３のプライマーと、前記第２のアダプターに特異的にアニーリングする第４のプライマーを用いて、核酸増幅反応を行う工程。
（ｂ７）前記（ｂ６）の工程で得られた第３のＤＮＡ断片を鋳型として、前記第３のＤＮＡ断片が含む前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングする第５のプライマーと、前記第２のアダプターに特異的にアニーリングする第６のプライマーを用いて、核酸増幅反応を行う工程。
工程（ｂ）は、ＤＮＡ伸長反応、ＤＮＡ断片の精製、ネステッドＰＣＲ等の公知の手法を組み合わせて実施してもよい。
図３は、工程（ｂ）の一例を説明する模式図である。図３に示す方法では、工程（ｂ）は、以下の（ｂ１）～（ｂ７）の工程を含む。
（ｂ１）前記感染細胞のゲノムＤＮＡを鋳型として、前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングする第１のプライマーを用いて、ＤＮＡ伸長反応を行う工程。
（ｂ２）前記（ｂ１）の工程で生成された第１のＤＮＡ断片を精製する工程。
（ｂ３）前記第１のＤＮＡ断片に第１のアダプターを付加する工程。
（ｂ４）前記第１のアダプターが付加された前記第１のＤＮＡ断片を鋳型として、前記第１のアダプターに特異的にアニーリングし、且つ第２のアダプターを含む第２のプライマーを用いて、ＤＮＡ伸長反応を行う工程。
（ｂ５）前記（ｂ４）の工程で生成された第２のＤＮＡ断片を精製する工程。
（ｂ６）前記（ｂ５）の工程で精製された第２のＤＮＡ断片を鋳型として、前記第２のＤＮＡ断片が含む前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングする第３のプライマーと、前記第２のアダプターに特異的にアニーリングする第４のプライマーを用いて、核酸増幅反応を行う工程。
（ｂ７）前記（ｂ６）の工程で得られた第３のＤＮＡ断片を鋳型として、前記第３のＤＮＡ断片が含む前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングする第５のプライマーと、前記第２のアダプターに特異的にアニーリングする第６のプライマーを用いて、核酸増幅反応を行う工程。
【0040】
工程（ｂ１）：
工程（ｂ１）では、感染細胞のゲノムＤＮＡを鋳型として、プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングする第１のプライマーを用いて、ＤＮＡ伸長反応を行い、一本鎖ＤＮＡ断片を得る。
工程（ｂ１）では、感染細胞のゲノムＤＮＡを鋳型として、プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングする第１のプライマーを用いて、ＤＮＡ伸長反応を行い、一本鎖ＤＮＡ断片を得る。
【0041】
図３中、第１のプライマーはＦ１で表される。第１のプライマーＦ１は、ゲノム境界領域のプロウイルス側ＤＮＡに特異的にアニーリングするフォワードプライマーである。第１のプライマーＦ１は、プロウイルス側ＤＮＡにアニーリングし、ホスト側ＤＮＡへのＤＮＡ伸長反応の起点となる。図３の例では、第１のプライマーＦ１は、プロウイルスＤＮＡの３’ＬＴＲ直近の領域にアニーリングする。
第１のプライマーとしては、例えば、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有するプライマー、及びその改変プライマー（例えば、前記（ｉｉ）～（ｉｖ））が挙げられる。
第１のプライマーとしては、例えば、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有するプライマー、及びその改変プライマー（例えば、前記（ｉｉ）～（ｉｖ））が挙げられる。
【0042】
第１のプライマーＦ１は、後の工程でＤＮＡ断片を精製するために、結合対の第１要素で標識化してもよい。「結合対」とは、互いに結合する２つの分子（１対の分子）をいう。結合対の「第１要素」とは、結合対を構成する１対の分子のうちの一方の分子をいう。結合対の「第２要素」とは、結合対を構成する１対の分子のうちの他方の分子をいう。結合対の例としては、例えば、ビオチン若しくはその誘導体及びアビジン若しくはその誘導体（ストレプトアビジン、ニュートラアビジン等）；抗原及び抗体若しくは抗体断片；リガンド及び受容体等が挙げられる。１実施形態において、第１のプライマーＦ１は、ビオチン標識されている。
【0043】
ＤＮＡ伸長反応は、公知の方法により行うことができる。ゲノムＤＮＡの切断処理等を行ってもよい。切断処理は、制限酵素による切断、ＤＮＡ伸長反応に用いる反応液は、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ、第１のプライマー、及び感染細胞のゲノムＤＮＡ、及びマグネシウム塩等を含むことができる。ＤＮＡ伸長反応は、プレ変性（例えば、９４～９８℃、１～５分）を行った後、変性（例えば、９４～９８℃、５～２０秒）、及び伸長（例えば、７０～７５℃、３０～１００秒）のサイクルを繰り返すことにより、行うことができる。ＤＮＡ伸長反応の結果、プロウイルス側ＤＮＡとホスト側ＤＮＡとを含む第１のＤＮＡ断片が生成される。第１のＤＮＡ断片は、ＤＮＡ伸長反応後に変性することにより、１本鎖ＤＮＡとして取得してもよい。
【0044】
工程（ｂ２）：
工程（ｂ２）では、前記（ｂ１）の工程で生成された第１のＤＮＡ断片を精製する。
工程（ｂ２）では、前記（ｂ１）の工程で生成された第１のＤＮＡ断片を精製する。
【0045】
第１のＤＮＡ断片の精製は、公知の方法で行うことができる。例えば、市販のＤＮＡ精製カラムを用いることができる。第１のＤＮＡ断片の精製を行うことにより、未反応の第１のプライマー及び感染細胞のゲノムＤＮＡを除去することができる。
【0046】
工程（ｂ３）：
工程（ｂ３）では、第１のＤＮＡ断片に第１のアダプターを付加する。
工程（ｂ３）では、第１のＤＮＡ断片に第１のアダプターを付加する。
【0047】
第１のアダプターは、任意のものを用いることができる。第１のＤＮＡ断片に対する第１のアダプターの付加は、公知の方法により行うことができる。１実施形態において、第１のアダプターは、通常、第１のＤＮＡ断片の３’末端に付加される。
第１のアダプターとしては、例えば、ポリＡ配列が挙げられる。第１のアダプターとしてのポリＡ配列は、例えば、ＴｄＴ（Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、及びｄＡＴＰを用いて、第１のＤＮＡ断片の３’末端に付加することができる。ＴｄＴは、１本鎖又は２本鎖ＤＮＡの３’－ＯＨ末端にデオキシヌクレオチドを付加する反応を触媒する。第１のＤＮＡ断片の３’末端に対するポリＡ付加反応の反応液は、例えば、ｄＡＴＰ、ＴｄＴ、第１のＤＮＡ断片、及びコバルト塩等を含むことができる。ポリＡ付加反応に用いる第１のＤＮＡ断片は、１本鎖ＤＮＡであってもよい。ポリＡ付加反応の反応温度としては、例えば、３０～４０℃、又は３５～４０℃等が挙げられる。一例として、反応温度は３７℃である。反応時間は、特に限定されないが、例えば、１０～６０分、１５～５０分、又は２０～４０分等が挙げられる。前記反応液において、ｄＡＴＰに替えてｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ若しくはｄＧＴＰを用いることにより、第１のＤＮＡ断片の３’末端に、第１のアダプターとしてポリＴ配列、ポリＣ配列若しくはポリＧ配列を付加することができる。
第１のアダプターとしては、例えば、ポリＡ配列が挙げられる。第１のアダプターとしてのポリＡ配列は、例えば、ＴｄＴ（Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、及びｄＡＴＰを用いて、第１のＤＮＡ断片の３’末端に付加することができる。ＴｄＴは、１本鎖又は２本鎖ＤＮＡの３’－ＯＨ末端にデオキシヌクレオチドを付加する反応を触媒する。第１のＤＮＡ断片の３’末端に対するポリＡ付加反応の反応液は、例えば、ｄＡＴＰ、ＴｄＴ、第１のＤＮＡ断片、及びコバルト塩等を含むことができる。ポリＡ付加反応に用いる第１のＤＮＡ断片は、１本鎖ＤＮＡであってもよい。ポリＡ付加反応の反応温度としては、例えば、３０～４０℃、又は３５～４０℃等が挙げられる。一例として、反応温度は３７℃である。反応時間は、特に限定されないが、例えば、１０～６０分、１５～５０分、又は２０～４０分等が挙げられる。前記反応液において、ｄＡＴＰに替えてｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ若しくはｄＧＴＰを用いることにより、第１のＤＮＡ断片の３’末端に、第１のアダプターとしてポリＴ配列、ポリＣ配列若しくはポリＧ配列を付加することができる。
【0048】
工程（ｂ４）：
工程（ｂ４）では、第１のアダプターが付加された第１のＤＮＡ断片を鋳型として、第１のアダプターに特異的にアニーリングし、且つ第２のアダプターを含む第２のプライマーを用いて、ＤＮＡ伸長反応を行う。
工程（ｂ４）では、第１のアダプターが付加された第１のＤＮＡ断片を鋳型として、第１のアダプターに特異的にアニーリングし、且つ第２のアダプターを含む第２のプライマーを用いて、ＤＮＡ伸長反応を行う。
【0049】
図３中、第２のプライマーはＲ１で表される。第２のプライマーＲ１は、第１のアダプターに特異的にアニーリングするリバースプライマーである。第２のプライマーＲ１は、第１のアダプターに特異的にアニーリングする配列（以下、「第１アダプターアニーリング配列」という）を含む。例えば、第２のプライマーは、第１のアダプターの相補配列を含む。第１のアダプターがポリＡ配列である場合、第２のプライマーはポリＴ配列を含む。
【0050】
第２のプライマーＲ１は、第１アダプターアニーリング配列に加えて、第２のアダプターを含む。第２のプライマーＲ１において、第２のアダプターは、第１アダプターアニーリング配列の５’末端側に存在する。第２のアダプターは、特に限定されず、任意のものを用いることができる。核酸増幅反応中の非特異的増幅を防止するために、第２のアダプターは、ゲノム境界領域に存在する配列を含まないことが好ましい。第２のアダプターは、後述の工程（ｂ６）の核酸増幅反応で用いるアダプター配列ＡＤＰ１と、工程（ｂ７）の核酸増幅反応で用いるアダプター配列ＡＤＰ２とを含んでいてもよい。
【0051】
ＤＮＡ伸長反応は、公知の方法で行うことができる。ＤＮＡ伸長反応は、プレ変性（例えば、９４～９８℃、１～５分）を行った後、変性（例えば、９４～９８℃、５～２０秒）、アニーリング（例えば、４０～６０℃、４０～１００秒）、及び伸長（例えば、７０～７５℃、３０～１００秒）のサイクルを繰り返すことにより、行うことができる。サイクル数は、１回であってもよい。ＤＮＡ伸長反応の結果、プロウイルス側ＤＮＡ、ホスト側ＤＮＡ、第１のアダプター配列、及び第２のアダプター配列を含む第２のＤＮＡ断片が生成される。
【0052】
工程（ｂ５）：
工程（ｂ５）では、前記（ｂ４）の工程で生成された第２のＤＮＡ断片を精製する。
工程（ｂ５）では、前記（ｂ４）の工程で生成された第２のＤＮＡ断片を精製する。
【0053】
第２のＤＮＡ断片の精製は、任意の方法で行うことができる。第１のプライマーとして、結合対の第１要素で標識されたプライマーを用いた場合には、当該結合対の第２要素との結合作用を利用して、第２のＤＮＡを精製することができる。例えば、第１のプライマーとしてビオチン標識したプライマーを用いた場合には、アビジン若しくはその誘導体（ストレプトアビジン、ニュートラアビジン等）で表面修飾した磁気ビーズ等を用いて第２のＤＮＡ断片の精製を行うことができる。
【0054】
工程（ｂ６）：
工程（ｂ６）では、前記（ｂ５）の工程で精製された第２のＤＮＡ断片を鋳型として、前記第２のＤＮＡ断片が含むプロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングする第３のプライマーと、第２のアダプターに特異的にアニーリングする第４のプライマーを用いて、核酸増幅反応を行う。
工程（ｂ６）では、前記（ｂ５）の工程で精製された第２のＤＮＡ断片を鋳型として、前記第２のＤＮＡ断片が含むプロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングする第３のプライマーと、第２のアダプターに特異的にアニーリングする第４のプライマーを用いて、核酸増幅反応を行う。
【0055】
図３中、第３のプライマーはＦ２で表される。第３のプライマーＦ２は、第２のＤＮＡ断片が含むプロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングするフォワードプライマーである。第３のプライマーＦ２は、第１のプライマーＦ１と同じであってもよく、異なっていてもよい。非特異的な増幅により生成するＤＮＡ断片を排除する観点から、第３のプライマーＦ２は、第１のプライマーＦ１と異なっていることが好ましい。第３のプライマーＦ１が、第１のプライマーＦ１とは異なる場合、第３のプライマーＦ２は、第１のプライマーＦ１のアニーリング位置よりも３’側の領域に、特異的にアニーリングすることが好ましい。
第３のプライマーとしては、例えば、配列番号２に記載のヌクレオチド配列を有するプライマー、及びその改変プライマー（例えば、前記（ｉｉ）～（ｉｖ））が挙げられる。
第３のプライマーとしては、例えば、配列番号２に記載のヌクレオチド配列を有するプライマー、及びその改変プライマー（例えば、前記（ｉｉ）～（ｉｖ））が挙げられる。
【0056】
図３中、第４のプライマーはＲ２で表される。第４のプライマーＲ２は、第２のアダプターのアダプター配列ＡＤＰ１に特異的にアニーリングするリバースプライマーである。１実施形態において、第４のプライマーＲ２は、アダプター配列ＡＤＰ１の相補配列を含む。
【0057】
核酸増幅反応は、公知の方法により行うことができる。核酸増幅反応に用いる反応液は、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ、第３のプライマーＦ２、第４のプライマーＲ２、工程（ｂ５）で精製した第２のＤＮＡ断片、及びマグネシウム塩等を含むことができる。
【0058】
核酸増幅反応は、公知の方法で行うことができる。核酸増幅反応は、プレ変性（例えば、９４～９８℃、１～５分）を行った後、変性（例えば、９４～９８℃、５～２０秒）、アニーリング（例えば、４０～６０℃、４０～１００秒）、及び伸長（例えば、７０～７５℃、３０～１００秒）のサイクルを繰り返すことにより、行うことができる。あるいは、核酸増幅反応は、変性（例えば、９４～９８℃、５～２０秒）、及び伸長（例えば、７０～７５℃、３０～１００秒）のサイクルを繰り返すことにより、行ってもよい。サイクル数は、例えば、１０～５０回とすることができる。核酸増幅反応の結果、プロウイルス側ＤＮＡ、ホスト側ＤＮＡ、及び第２のアダプターを含む第３のＤＮＡ断片が生成される。
【0059】
工程（ｂ７）：
工程（ｂ７）では、前記（ｂ６）の工程で得られた第３のＤＮＡ断片を鋳型として、前記第３のＤＮＡ断片が含むプロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングする第５のプライマーと、第２のアダプターに特異的にアニーリングする第６のプライマーを用いて、核酸増幅反応を行う。
工程（ｂ７）では、前記（ｂ６）の工程で得られた第３のＤＮＡ断片を鋳型として、前記第３のＤＮＡ断片が含むプロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングする第５のプライマーと、第２のアダプターに特異的にアニーリングする第６のプライマーを用いて、核酸増幅反応を行う。
【0060】
図３中、第５のプライマーはＦ３で表される。第５のプライマーＦ３は、第３のＤＮＡ断片が含むプロウイルスＤＮＡ配列に特異的にアニーリングするフォワードプライマーである。第５のプライマーとしては、例えば、配列番号３に記載のヌクレオチド配列を有するプライマー、及びその改変プライマー（例えば、前記（ｉｉ）～（ｉｖ））が挙げられる。
【0061】
図３中、第６のプライマーはＲ３で表される。第６のプライマーＲ３は、第２のアダプターのアダプター配列ＡＤＰ２に特異的にアニーリングするリバースプライマーである。第２のアダプターにおいて、アダプター配列ＡＤＰ２は、アダプター配列ＡＤＰ１よりも３’側に位置する。１実施形態において、第４のプライマーＲ３は、アダプター配列ＡＤＰ２の相補配列を含む。
【0062】
核酸増幅反応は、公知の方法により行うことができる。核酸増幅反応に用いる反応液は、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ、第５のプライマーＦ３、第６のプライマーＲ３、第３のＤＮＡ断片、及びマグネシウム塩等を含むことができる。
【0063】
核酸増幅反応は、公知の方法で行うことができる。核酸増幅反応は、プレ変性（例えば、９４～９８℃、１～５分）を行った後、変性（例えば、９４～９８℃、５～２０秒）、アニーリング（例えば、４０～６０℃、４０～１００秒）、及び伸長（例えば、７０～７５℃、３０～１００秒）のサイクルを繰り返すことにより、行うことができる。あるいは、核酸増幅反応は、変性（例えば、９４～９８℃、５～２０秒）、及び伸長（例えば、７０～７５℃、３０～１００秒）のサイクルを繰り返すことにより、行ってもよい。サイクル数は、例えば、１０～５０回とすることができる。核酸増幅反応の結果、プロウイルス側ＤＮＡ、ホスト側ＤＮＡ、及びアダプターＡＤＰ２を含む第４のＤＮＡ断片が生成される。
【0064】
工程（ｂ１）～（ｂ７）は、一部の工程を省略してもよい。省略可能な工程としては、例えば、工程（ｂ２）、工程（ｂ５）、工程（ｂ６）、工程（ｂ７）等が挙げられる。
【0065】
＜工程（ｃ）＞
工程（ｃ）では、前記工程（ｂ）で得られたＤＮＡ断片のサンガーシーケンシングを行い、前記サンガーシーケンシングによるスペクトルデータを取得する。
工程（ｃ）では、前記工程（ｂ）で得られたＤＮＡ断片のサンガーシーケンシングを行い、前記サンガーシーケンシングによるスペクトルデータを取得する。
【0066】
ＤＮＡ断片のサンガーシーケンシングは、公知の方法により行うことができる。例えば、サンガーシーケンシング用シーケンサーに付属の説明書に従って、サンガーシーケンシングを行うことができる。例えば、サンガーシーケンシングは、工程（ｂ）で得られたＤＮＡ断片のサンガーシーケンシング反応を行い、その反応液をサンガーシーケンシング用シーケンサーで分析することにより、行うことができる。サンガーシーケンシングにより、ｄｄＮＴＰの標識蛍光色素のスペクトルデータ（サンガーシーケンシングによるスペクトルデータ）を取得することができる。サンガーシーケンシング反応は、例えば、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｙｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）等を用いて行うことができる。サンガーシーケンシング用シーケンサーとしては、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０シリーズジェネティックアナライザ、３５００シリーズジェネティックアナライザ、及び３７３０シリーズジェネティックアナライザ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）等が挙げられる。
【0067】
＜工程（ｄ）＞
工程（ｄ）では、工程（ｃ）で得られたスペクトルデータに基づいて、前記ＤＮＡ断片における、プロウイルスＤＮＡに由来する領域（プロウイルス側ＤＮＡ）と、ホスト動物のゲノムＤＮＡに由来する領域とを特定し、ホスト動物のゲノムＤＮＡに由来する領域（ホスト側ＤＮＡ）の均一性を判定する。
工程（ｄ）では、工程（ｃ）で得られたスペクトルデータに基づいて、前記ＤＮＡ断片における、プロウイルスＤＮＡに由来する領域（プロウイルス側ＤＮＡ）と、ホスト動物のゲノムＤＮＡに由来する領域とを特定し、ホスト動物のゲノムＤＮＡに由来する領域（ホスト側ＤＮＡ）の均一性を判定する。
【0068】
工程（ｃ）で得られたスペクトルデータから、ゲノム境界領域のＤＮＡ断片の配列を決定することができる。プロウイルス側ＤＮＡの配列は既知であるため、プロウイルス側ＤＮＡの配列に基づいて、プロウイルス側ＤＮＡとホスト側ＤＮＡとの境界を決定することができる。
【0069】
ホスト側ＤＮＡの配列は、ホスト動物ゲノムへのプロウイルスの挿入位置により異なる。ホスト側ＤＮＡの均一性が高い場合、スペクトルデータは、略単一の蛍光色素（蛍光色素に対応する塩基）により形成されるピークが連続した波形となる。一方、ホスト側ＤＮＡの均一性が低い場合、スペクトルデータは、各ヌクレオチド位置において、複数の蛍光色素（蛍光色素に対応する塩基）のピークが混在した波形となる（図２参照）。したがって、ホスト側ＤＮＡのスペクトルデータの波形から、ホスト側ＤＮＡの均一性を判定することができる。
【0070】
ホスト側ＤＮＡの均一性は、各蛍光色素（蛍光色素に対応する塩基）の波形に基づいて算出される数値に基づいて判定してもよい。例えば、各ヌクレオチド位置において、最大ピーク面積を有するピークの面積に対する、他のピークの合計面積の比を算出し、ホスト側ＤＮＡの均一性の判定に用いてもよい。
ホスト側ＤＮＡの均一性は、スペクトルデータを処理するプログラム等を用いて数値化してもよい。そのようなプログラムとしては、例えば、ＥｄｉｔＲ（Mitchell G. Kluesner et al., CRISPR J. 2018 Jun 1; 1(3): 239-250.）等が挙げられる。ＥｄｉｔＲは、スペクトルデータから、「クローンインデックス値」を算出する。このクローンインデックス値を用いて、ホスト側ＤＮＡの均一性を判定してもよい。クローンインデックス値が大きいほど、ＤＮＡの均一性が高いことを示す。
ホスト側ＤＮＡの均一性は、スペクトルデータを処理するプログラム等を用いて数値化してもよい。そのようなプログラムとしては、例えば、ＥｄｉｔＲ（Mitchell G. Kluesner et al., CRISPR J. 2018 Jun 1; 1(3): 239-250.）等が挙げられる。ＥｄｉｔＲは、スペクトルデータから、「クローンインデックス値」を算出する。このクローンインデックス値を用いて、ホスト側ＤＮＡの均一性を判定してもよい。クローンインデックス値が大きいほど、ＤＮＡの均一性が高いことを示す。
【0071】
＜工程（ｅ）＞
工程（ｅ）では、ホスト動物のゲノムＤＮＡに由来する領域（ホスト側ＤＮＡ）の均一性に基づいて、ホスト動物における牛伝染性リンパ腫の病勢を判定する。
工程（ｅ）では、ホスト動物のゲノムＤＮＡに由来する領域（ホスト側ＤＮＡ）の均一性に基づいて、ホスト動物における牛伝染性リンパ腫の病勢を判定する。
【0072】
ゲノム境界領域におけるホスト側ＤＮＡの均一性が高い場合、ホスト動物における牛伝染性リンパ腫の病勢が進んでいると判定することができる。一方、ゲノム境界領域におけるホスト側ＤＮＡの均一性が低い場合、ホスト動物における牛伝染性リンパ腫の病勢が進んでいないと判定することができる。
【0073】
例えば、ＥｄｉｔＲにより取得したホスト側ＤＮＡのクローンインデックス値が、０．５以上、０．６以上、０．７以上、０．８以上、０．８５以上、０．９以上、０．９５以上、又は１．０以上である場合、ホスト動物は牛伝染性リンパ腫を発症していると判断してもよい。
また、例えば、ホスト側ＤＮＡのクローンインデックス値が、０．０５以上、０．１以上、０．１５以上、０．２以上、０．２５以上、又は０．３以上である場合、ホスト動物は牛伝染性リンパ腫を発症するリスクが高まっていると判定してもよい。
また、例えば、ホスト側ＤＮＡのクローンインデックス値が、０．０５以上、０．１以上、０．１５以上、０．２以上、０．２５以上、又は０．３以上である場合、ホスト動物は牛伝染性リンパ腫を発症するリスクが高まっていると判定してもよい。
【0074】
本開示の検査方法では、牛伝染性リンパ腫の病勢判定に、ゲノム境界領域のサンガーシーケンシングにより得られるスペクトルデータを利用する。そのため、ＮＧＳ解析と比較して、低コストで、簡易、且つ迅速に、牛伝染性リンパ腫の病勢を判定することができる。
上記（ｉ）～（ｉｖ）からなる群より選択されるプライマーを用いて、工程（ｂ）を行うことにより、現在知られているほぼ全てのＢＬＶに適用することができる。また、正確に、牛伝染性リンパ腫の病勢判定を行うことができる。
上記（ｉ）～（ｉｖ）からなる群より選択されるプライマーを用いて、工程（ｂ）を行うことにより、現在知られているほぼ全てのＢＬＶに適用することができる。また、正確に、牛伝染性リンパ腫の病勢判定を行うことができる。
【0075】
［プライマー］
本開示の第２の態様は、下記（ｉ）～（ｉｖ）からなる群より選択される少なくとも１種のプライマーである。
（ｉ）配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列を有するプライマー。
（ｉｉ）牛伝染性リンパ腫ウイルスのプロウイルスＤＮＡにおいて、配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列を含むプライマーが特異的にアニーリングする領域に、特異的にアニーリングするプライマー。
（ｉｉｉ）配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列において、１個又は複数個のヌクレオチドが、欠失、付加、又は置換されたヌクレオチド配列を有し、且つ前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングするプライマー。
（ｉｖ）配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列と、９０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し、且つ前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングするプライマー。
本開示の第２の態様は、下記（ｉ）～（ｉｖ）からなる群より選択される少なくとも１種のプライマーである。
（ｉ）配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列を有するプライマー。
（ｉｉ）牛伝染性リンパ腫ウイルスのプロウイルスＤＮＡにおいて、配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列を含むプライマーが特異的にアニーリングする領域に、特異的にアニーリングするプライマー。
（ｉｉｉ）配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列において、１個又は複数個のヌクレオチドが、欠失、付加、又は置換されたヌクレオチド配列を有し、且つ前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングするプライマー。
（ｉｖ）配列番号１、２、又は３に記載のヌクレオチド配列と、９０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し、且つ前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングするプライマー。
【0076】
（ｉ）～（ｉｖ）のプライマーは、上記工程（ｂ）で例示したものと同様である。プライマーは、ホスホロアミダイタト法等の公知の固相合成法により合成することができる。
【0077】
［検査キット］
本開示の第３の態様は、前記第２の態様のプライマーを含む、牛伝染性リンパ腫の病勢の検査キットである。
本開示の第３の態様は、前記第２の態様のプライマーを含む、牛伝染性リンパ腫の病勢の検査キットである。
【0078】
検査キットは、前記（ｉ）～（ｉｖ）からなる群より選択されるプライマーを１種のみ含んでもよく、２種以上含んでもよい。
検査キットが含むプライマーの組合せとしては、以下の組み合わせが挙げられる。
検査キットが含むプライマーの組合せとしては、以下の組み合わせが挙げられる。
【0079】
（Ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有するプライマー；牛伝染性リンパ腫ウイルスのプロウイルスＤＮＡにおいて、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むプライマーが特異的にアニーリングする領域に、特異的にアニーリングするプライマー；配列番号１に記載のヌクレオチド配列において、１個又は複数個のヌクレオチドが、欠失、付加、又は置換されたヌクレオチド配列を有し、且つ前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングするプライマー；又は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列と、９０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し、且つ前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングするプライマーと、
（Ｂ）配列番号２に記載のヌクレオチド配列を有するプライマー；牛伝染性リンパ腫ウイルスのプロウイルスＤＮＡにおいて、配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むプライマーが特異的にアニーリングする領域に、特異的にアニーリングするプライマー；配列番号２に記載のヌクレオチド配列において、１個又は複数個のヌクレオチドが、欠失、付加、又は置換されたヌクレオチド配列を有し、且つ前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングするプライマー；又は、配列番号２に記載のヌクレオチド配列と、９０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し、且つ前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングするプライマーと、
の組み合わせ。
（Ｂ）配列番号２に記載のヌクレオチド配列を有するプライマー；牛伝染性リンパ腫ウイルスのプロウイルスＤＮＡにおいて、配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むプライマーが特異的にアニーリングする領域に、特異的にアニーリングするプライマー；配列番号２に記載のヌクレオチド配列において、１個又は複数個のヌクレオチドが、欠失、付加、又は置換されたヌクレオチド配列を有し、且つ前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングするプライマー；又は、配列番号２に記載のヌクレオチド配列と、９０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し、且つ前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングするプライマーと、
の組み合わせ。
【0080】
前記（Ａ）のプライマーと、
（Ｃ）配列番号３に記載のヌクレオチド配列を有するプライマー；牛伝染性リンパ腫ウイルスのプロウイルスＤＮＡにおいて、配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含むプライマーが特異的にアニーリングする領域に、特異的にアニーリングするプライマー；配列番号３に記載のヌクレオチド配列において、１個又は複数個のヌクレオチドが、欠失、付加、又は置換されたヌクレオチド配列を有し、且つ前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングするプライマー；又は、配列番号３に記載のヌクレオチド配列と、９０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し、且つ前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングするプライマーと、
の組み合わせ。
（Ｃ）配列番号３に記載のヌクレオチド配列を有するプライマー；牛伝染性リンパ腫ウイルスのプロウイルスＤＮＡにおいて、配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含むプライマーが特異的にアニーリングする領域に、特異的にアニーリングするプライマー；配列番号３に記載のヌクレオチド配列において、１個又は複数個のヌクレオチドが、欠失、付加、又は置換されたヌクレオチド配列を有し、且つ前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングするプライマー；又は、配列番号３に記載のヌクレオチド配列と、９０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し、且つ前記プロウイルスＤＮＡに特異的にアニーリングするプライマーと、
の組み合わせ。
【0081】
前記（Ｂ）のプライマーと、前記（Ｃ）のプライマーと、の組み合わせ。
前記（Ａ）のプライマーと、前記（Ｂ）のプライマーと、前記（Ｃ）のプライマーと、の組み合わせ。
前記（Ａ）のプライマーと、前記（Ｂ）のプライマーと、前記（Ｃ）のプライマーと、の組み合わせ。
【0082】
検査キットは、前記プライマーに加えて、他の構成を含んでもよい。他の構成としては、例えば、アダプター、前記アダプターに特異的にアニーリングするプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＴｄＴ、反応バッファー、マグネシウム塩、使用説明書等が挙げられる。
【0083】
本開示の検査キットは、前記第１の態様の検査方法に用いることができる。
【実施例0084】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0085】
［検査方法］
＜プライマーの設計＞
プライマーは、以下の方針に基づいて設計した。
（１）ＢＬＶゲノムの末端領域のＤＮＡ配列にアニーリングするプライマーを設計する必要がある。ＢＬＶゲノムは、両末端にＬＴＲ（Ｌｏｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｐｅａｔ）を有しているため、それらを区別する必要がある。
そこで、３’ＬＴＲの直近にプライマーを設計し、３’ＬＴＲからホストゲノムのジャンクションまで増幅させることで、５’ＬＴＲと区別することとした。
＜プライマーの設計＞
プライマーは、以下の方針に基づいて設計した。
（１）ＢＬＶゲノムの末端領域のＤＮＡ配列にアニーリングするプライマーを設計する必要がある。ＢＬＶゲノムは、両末端にＬＴＲ（Ｌｏｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｐｅａｔ）を有しているため、それらを区別する必要がある。
そこで、３’ＬＴＲの直近にプライマーを設計し、３’ＬＴＲからホストゲノムのジャンクションまで増幅させることで、５’ＬＴＲと区別することとした。
【0086】
（２）ゲノム境界領域のホスト側配列の均一性をサンガーシーケンシングにより得られたスペクトルデータから判断するため、非特異的な増幅は避ける必要がある。
そこで、ネステッドＰＣＲを行って特異度を上げることとした。そのため、複数のプライマーセットを設計した。
そこで、ネステッドＰＣＲを行って特異度を上げることとした。そのため、複数のプライマーセットを設計した。
【0087】
（３）特定のＢＬＶ株ではなく、ＢＬＶ全般に適用するためには、幅広い範囲のＢＬＶのゲノムＤＮＡに共通して使用可能なプライマーを設計する必要がある。
そこで、ＮＣＢＩ等の配列データベースから合計５８個のＢＬＶのゲノム配列を取得した。これらのゲノム配列を比較解析し、直近を含む３’ＬＴＲ配列の中で、これらのゲノム配列に共通する配列を選択した。
そこで、ＮＣＢＩ等の配列データベースから合計５８個のＢＬＶのゲノム配列を取得した。これらのゲノム配列を比較解析し、直近を含む３’ＬＴＲ配列の中で、これらのゲノム配列に共通する配列を選択した。
【0088】
（４）ＰＣＲによる増幅が可能なプライマーとする必要があるが、直近を含む３’ＬＴＲ配列は非常にＧＣリッチであった。
そこで、（３）で選択した共通配列の中から、ＧＣの％比率が４０～６０％程度であるプライマー候補配列を選択した。
そこで、（３）で選択した共通配列の中から、ＧＣの％比率が４０～６０％程度であるプライマー候補配列を選択した。
【0089】
上記の結果、表１に示す「Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ－ＢＬＶ－Ｆ１」、「ＢＬＶ－Ｆ２」、及び「ＢＬＶ－Ｆ３」の３種のプライマーを設計した。
【0090】
＜ＤＮＡ試料の調製＞
ＤＮＡ試料の調製は、牛血液からＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、製造者の説明書に従い行った。具体的には、下記の通りに行った。
ａ）２００μＬの血液試料に、２０μＬのＱＩＡＧＥＮ Ｐｒｏｔｅｎａｓｅを添加した。
ｂ）各チューブをよく撹拌した後、２００μＬのＢｕｆｆｅｒ ＡＬを添加した。
ｃ）５６℃で１０分間反応させた後、各サンプルに２００μＬのエタノールを加え、１５秒間ボルテックス撹拌した。次いで、各チューブをスピンダウンして溶液を底に収集した。
ｄ）各チューブから３００μＬを採取して、ラベルを貼ったＱＩＡｑｕｉｃｋカラムに移した。
ｅ）８０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
ｆ）上清を除去した。
ｇ）ＱＩＡａｍｐ Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎ カラムに、５００μＬのＢｕｆｆｅｒ ＡＷ１を添加した。
ｈ）８０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
ｉ）上清を除去した。
ｊ）ＱＩＡａｍｐ Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎ カラムに、５００μＬのＢｕｆｆｅｒ ＡＷ２を添加した。
ｋ）１４０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。
ｌ）ＱＩＡａｍｐ Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎカラムを、新しい１．５ｍＬチューブに入れた。
ｍ）１００μＬのＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｕｆｆｅｒ ＡＥ）をＱＩＡａｍｐ Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎカラムの中央に添加し、１分間遠心分離した後、－２０℃で保存した。
ＤＮＡ試料の調製は、牛血液からＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、製造者の説明書に従い行った。具体的には、下記の通りに行った。
ａ）２００μＬの血液試料に、２０μＬのＱＩＡＧＥＮ Ｐｒｏｔｅｎａｓｅを添加した。
ｂ）各チューブをよく撹拌した後、２００μＬのＢｕｆｆｅｒ ＡＬを添加した。
ｃ）５６℃で１０分間反応させた後、各サンプルに２００μＬのエタノールを加え、１５秒間ボルテックス撹拌した。次いで、各チューブをスピンダウンして溶液を底に収集した。
ｄ）各チューブから３００μＬを採取して、ラベルを貼ったＱＩＡｑｕｉｃｋカラムに移した。
ｅ）８０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
ｆ）上清を除去した。
ｇ）ＱＩＡａｍｐ Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎ カラムに、５００μＬのＢｕｆｆｅｒ ＡＷ１を添加した。
ｈ）８０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
ｉ）上清を除去した。
ｊ）ＱＩＡａｍｐ Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎ カラムに、５００μＬのＢｕｆｆｅｒ ＡＷ２を添加した。
ｋ）１４０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。
ｌ）ＱＩＡａｍｐ Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎカラムを、新しい１．５ｍＬチューブに入れた。
ｍ）１００μＬのＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｕｆｆｅｒ ＡＥ）をＱＩＡａｍｐ Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎカラムの中央に添加し、１分間遠心分離した後、－２０℃で保存した。
【0091】
＜サンガーシーケンシング用試料の調製＞
使用したプライマーを表１に示す。
使用したプライマーを表１に示す。
【0092】
【表1】
【0093】
（１）１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の合成
表２に示す反応液を調製し、表３に示す条件で、ＤＮＡ伸長反応を行った。次いで、サーマルサイクラーの温度を４℃に低下させた後、サーマルサイクラーからチューブを取出し、短時間の遠心分離を行った。
表２に示す反応液を調製し、表３に示す条件で、ＤＮＡ伸長反応を行った。次いで、サーマルサイクラーの温度を４℃に低下させた後、サーマルサイクラーからチューブを取出し、短時間の遠心分離を行った。
【0094】
【表2】
【0095】
【表3】
【0096】
（２）カラム精製
ｓｓＤＮＡの精製は、Ｍｏｎａｒｃｈ ＰＣＲ ＆ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（ＮＥＷ Ｅｎｇｌａｎｄ ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、製造者の説明書に従い行った。具体的には、下記の通りに行った。
ｓｓＤＮＡの精製は、Ｍｏｎａｒｃｈ ＰＣＲ ＆ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（ＮＥＷ Ｅｎｇｌａｎｄ ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、製造者の説明書に従い行った。具体的には、下記の通りに行った。
【0097】
ａ）５０μＬのｓｓＤＮＡ試料に、２５０μＬのＢｕｆｆｅｒ ＰＢを添加した（体積比５：１）。
ｂ）各チューブをピペッティングによりよく撹拌した。
ｃ）ＱＩＡｑｕｉｃｋカラム（ＱＩＡＧＥＮ）と２ｍＬ採血管にラベルを貼った。
ｄ）各チューブから３００μＬを採取して、ラベルを貼ったＱＩＡｑｕｉｃｋカラムに移し、２ｍＬ採血管の中に入れた。
ｅ）１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
ｆ）上清を除去した。
ｇ）ＱＩＡｑｕｉｃｋカラムに、７３０μＬのＢｕｆｆｅｒ ＰＥを添加した。
ｈ）１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
ｉ）上清を除去し、同じ採血管にＱＩＡｑｕｉｃｋカラムを戻した。
ｊ）１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
ｋ）ＱＩＡｑｕｉｃｋカラムを採血管から取り出し、新しい１．５ｍＬ ｌｏｗ－ｂｉｎｄエッペンドルフチューブにＱＩＡｑｕｉｃｋカラムを入れた。
ｌ）３０μＬのＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｕｆｆｅｒ ＥＢ）をＱＩＡｑｕｉｃｋ ｍｅｍｂｒａｎｅの中央に添加し、１分間遠心分離した。
ｍ）２０℃で保存した。
ｂ）各チューブをピペッティングによりよく撹拌した。
ｃ）ＱＩＡｑｕｉｃｋカラム（ＱＩＡＧＥＮ）と２ｍＬ採血管にラベルを貼った。
ｄ）各チューブから３００μＬを採取して、ラベルを貼ったＱＩＡｑｕｉｃｋカラムに移し、２ｍＬ採血管の中に入れた。
ｅ）１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
ｆ）上清を除去した。
ｇ）ＱＩＡｑｕｉｃｋカラムに、７３０μＬのＢｕｆｆｅｒ ＰＥを添加した。
ｈ）１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
ｉ）上清を除去し、同じ採血管にＱＩＡｑｕｉｃｋカラムを戻した。
ｊ）１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
ｋ）ＱＩＡｑｕｉｃｋカラムを採血管から取り出し、新しい１．５ｍＬ ｌｏｗ－ｂｉｎｄエッペンドルフチューブにＱＩＡｑｕｉｃｋカラムを入れた。
ｌ）３０μＬのＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｕｆｆｅｒ ＥＢ）をＱＩＡｑｕｉｃｋ ｍｅｍｂｒａｎｅの中央に添加し、１分間遠心分離した。
ｍ）２０℃で保存した。
【0098】
（３）ＰｏｌｙＡ－ｔａｉｌｉｎｇ
表４に示す反応液で、３７℃で３０分間インキュベートし、ＰｏｌｙＡ－ｔａｉｌｉｎｇを行った。
表４に示す反応液で、３７℃で３０分間インキュベートし、ＰｏｌｙＡ－ｔａｉｌｉｎｇを行った。
【0099】
【表4】
【0100】
（４）２本鎖ＤＮＡの合成
表５に示す反応液を調製し、表６に示す条件で、核酸増幅反応を行った。次いで、サーマルサイクラーの温度を４℃に低下させた後、サーマルサイクラーからチューブを取出し、短時間の遠心分離を行った。
表５に示す反応液を調製し、表６に示す条件で、核酸増幅反応を行った。次いで、サーマルサイクラーの温度を４℃に低下させた後、サーマルサイクラーからチューブを取出し、短時間の遠心分離を行った。
【0101】
【表5】
【0102】
【表6】
【0103】
（５）アビジンビーズ精製
２本鎖ＤＮＡの精製は、ＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅＴＭ（登録商標） ＭＳ３００／ストレプトアビジン（ＪＳＲライフサイエンス）を用いて、製造者の説明書に従い行った。
２本鎖ＤＮＡの精製は、ＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅＴＭ（登録商標） ＭＳ３００／ストレプトアビジン（ＪＳＲライフサイエンス）を用いて、製造者の説明書に従い行った。
【0104】
ＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅＴＭ ＭＳ３００／ストレプトアビジンへのビオチン化ＤＮＡの固定に用いた試薬及び機器を以下に示す。
ａ）Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（２ｘ）：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４） ｗｉｔｈ １ｍＭ ＥＤＴＡ，２Ｍ ＮａＣｌ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０
ｂ）機器：磁性分離器、ボルテックスチューブミキサー、チューブローター
ａ）Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（２ｘ）：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４） ｗｉｔｈ １ｍＭ ＥＤＴＡ，２Ｍ ＮａＣｌ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０
ｂ）機器：磁性分離器、ボルテックスチューブミキサー、チューブローター
【0105】
具体的には、下記の通りに行った。
ｉ）マイクロチューブにラベルを貼った。
ｉｉ）ＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅＴＭ ＭＳ３００／ストレプトアビジンをボルテックスミキサーで懸濁し、３０μの懸濁液（すなわち、１ｍｇビーズ）をマイクロチューブに入れた。
ｉｉｉ）マグネティックチューブスタンドに、チューブを１分間以上置き、上清を注意深く除去した。
ｉｖ）２００μＬの１ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを添加し、ボルテックスミキサーを用いて、ビーズを懸濁した。次いで、ｉｉｉ）と同様にして上清を除去した。
ｖ）ビオチン化ＤＮＡ溶液及び等量の２ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒをマイクロチューブに添加し、ボルテックスミキサーでビーズを懸濁した。
ｖｉ）チューブローターを用いて、室温で１０分間、チューブを回転させた。
ｖｉｉ）ｉｉｉ）と同様にして上清を除去した。
ｖｉｉｉ）２００μＬの１ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを用いてビーズを洗浄し、ボルテックスミキサーでビーズを懸濁した。
ｉｘ）ｉｉｉ）と同様にして上清を除去した。
ｘ）ｖｉｉｉ）及びｉｘ）を合計３回繰り返した。
ｘｉ）５０μＬ蒸留水でビーズを懸濁し、使用するまで２～８度で保存した。
ｉ）マイクロチューブにラベルを貼った。
ｉｉ）ＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅＴＭ ＭＳ３００／ストレプトアビジンをボルテックスミキサーで懸濁し、３０μの懸濁液（すなわち、１ｍｇビーズ）をマイクロチューブに入れた。
ｉｉｉ）マグネティックチューブスタンドに、チューブを１分間以上置き、上清を注意深く除去した。
ｉｖ）２００μＬの１ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを添加し、ボルテックスミキサーを用いて、ビーズを懸濁した。次いで、ｉｉｉ）と同様にして上清を除去した。
ｖ）ビオチン化ＤＮＡ溶液及び等量の２ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒをマイクロチューブに添加し、ボルテックスミキサーでビーズを懸濁した。
ｖｉ）チューブローターを用いて、室温で１０分間、チューブを回転させた。
ｖｉｉ）ｉｉｉ）と同様にして上清を除去した。
ｖｉｉｉ）２００μＬの１ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを用いてビーズを洗浄し、ボルテックスミキサーでビーズを懸濁した。
ｉｘ）ｉｉｉ）と同様にして上清を除去した。
ｘ）ｖｉｉｉ）及びｉｘ）を合計３回繰り返した。
ｘｉ）５０μＬ蒸留水でビーズを懸濁し、使用するまで２～８度で保存した。
【0106】
（６）１回目のＰＣＲ（Ｆｉｒｓｔ ＰＣＲ）
表７に示す反応液を調製し、表８に示す条件で、核酸増幅反応を行った。次いで、サーマルサイクラーの温度を４℃に低下させた後、サーマルサイクラーからチューブを取出し、短時間の遠心分離を行った。
表７に示す反応液を調製し、表８に示す条件で、核酸増幅反応を行った。次いで、サーマルサイクラーの温度を４℃に低下させた後、サーマルサイクラーからチューブを取出し、短時間の遠心分離を行った。
【0107】
【表7】
【0108】
【表8】
【0109】
（７）２回目のＰＣＲ（Ｓｅｃｏｎｄ ＰＣＲ）
表９に示す反応液を調製し、表１０に示す条件で、核酸増幅反応を行った。次いで、サーマルサイクラーの温度を４℃に低下させた後、サーマルサイクラーからチューブを取出し、２０℃で保存した。
表９に示す反応液を調製し、表１０に示す条件で、核酸増幅反応を行った。次いで、サーマルサイクラーの温度を４℃に低下させた後、サーマルサイクラーからチューブを取出し、２０℃で保存した。
【0110】
【表9】
【0111】
【表10】
【0112】
＜サンガーシーケンシング＞
サンガーシーケンシングは、株式会社ＦＡＳＭＡＣに委託した。サンガーシーケンシング用シーケンサーとして、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ又はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３０ｘｌ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いた。サンガーシーケンシング反応は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。
サンガーシーケンシングは、株式会社ＦＡＳＭＡＣに委託した。サンガーシーケンシング用シーケンサーとして、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ又はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３０ｘｌ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いた。サンガーシーケンシング反応は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。
【0113】
＜実施例１＞
伝染性リンパ腫非発症牛、リンパ球増多症牛（伝染性リンパ腫非発症牛）、及び伝染性リンパ腫発症牛から血液試料を採取した。採取した血液試料からＤＮＡ試料を調製し、上記［検査方法］に従い、各塩基に対応する蛍光色素のスペクトルデータを得た。前記スペクトルデータをＥｄｉｔＲ（Mitchell G. Kluesner et al., CRISPR J. 2018 Jun 1; 1(3): 239-250.）を用いて解析し、クローンインデックスを得た。
伝染性リンパ腫非発症牛、リンパ球増多症牛（伝染性リンパ腫非発症牛）、及び伝染性リンパ腫発症牛から血液試料を採取した。採取した血液試料からＤＮＡ試料を調製し、上記［検査方法］に従い、各塩基に対応する蛍光色素のスペクトルデータを得た。前記スペクトルデータをＥｄｉｔＲ（Mitchell G. Kluesner et al., CRISPR J. 2018 Jun 1; 1(3): 239-250.）を用いて解析し、クローンインデックスを得た。
【0114】
結果を図４に示す。図４において、Ａは、サンガーシーケンシングにより得られたスペクトルデータを示す。Ｂは、ＥｄｉｔＲによるスペクトルデータの解析結果と、クローンインデックス値を示す。Ｂにおいて、「ｓｉｇｎａｌ」は、シグナルピーク（最大面積を有するピーク）のピーク面積を示し、「ｎｏｉｓｅ」は、シグナルピーク以外のピークのピーク面積を示す。
【0115】
図４に示すように、伝染性リンパ腫非発症牛では、クローンインデックス値が低く、感染細胞のクローン化が進んでいなかった。リンパ球増多症牛では、伝染性リンパ腫非発症牛と比較して、クローンインデックス値が高く、感染細胞のクローン化が進んでいた。伝染性リンパ腫発症牛では、クローンインデックス値が１を超えており、感染細胞はほぼ単一クローンになっていると考えられた。
【0116】
＜実施例２＞
実施例１で調製したＤＮＡ試料を用いて、次世代シーケンサー（ＮＧＳ）解析を行った。ＮＧＳ解析により、ＢＬＶのプロウイルスＤＮＡとホスト動物のゲノムＤＮＡのゲノム境界領域におけるホスト動物のゲノムＤＮＡ配列の多様性を分析した。
実施例１で調製したＤＮＡ試料を用いて、次世代シーケンサー（ＮＧＳ）解析を行った。ＮＧＳ解析により、ＢＬＶのプロウイルスＤＮＡとホスト動物のゲノムＤＮＡのゲノム境界領域におけるホスト動物のゲノムＤＮＡ配列の多様性を分析した。
【0117】
結果を図５に示す。図５において、Ａは、実施例１で得られたＥｄｉｔＲによる解析結果とクローンインデックス値を示す。Ｂは、ＮＧＳ解析により得られたゲノム境界領域におけるホスト動物のゲノムＤＮＡ配列の多様性を示す。
【0118】
図５に示すように、ＮＧＳ解析結果は、伝染性リンパ腫非発症牛、及びリンパ球増多症牛、伝染性リンパ腫発症牛の順で、感染細胞のクローン化が進んでいた。伝染性リンパ腫発症牛では、ゲノム境界領域のホスト動物ＤＮＡは１００％同一配列だった。これらの結果は、実施例１で得られたクローンインデックス値と一致した。
【0119】
＜実施例３＞
ＢＬＶに感染した牛から、２０１５年及び２０１７年に血液試料を採取した。また、伝染性リンパ腫発症時（２０１８年）に、２箇所の腫瘍から組織試料を採取した。採取した血液試料又は組織試料からＤＮＡ試料を調製し、上記［検査方法］に従い、サンガーシーケンシングによるスペクトルデータを得た。前記スペクトルデータを、ＥｄｉｔＲを用いて解析し、クローンインデックスを得た。さらに、同じＤＮＡ試料を用いて、ＮＧＳ解析を行った。また、同じＤＮＡ試料を用いて、リアルタイムＰＣＲにより、ＢＬＶのプロウイルス量を定量した。ＢＬＶ感染牛の４症例について同様の分析を行った。
ＢＬＶに感染した牛から、２０１５年及び２０１７年に血液試料を採取した。また、伝染性リンパ腫発症時（２０１８年）に、２箇所の腫瘍から組織試料を採取した。採取した血液試料又は組織試料からＤＮＡ試料を調製し、上記［検査方法］に従い、サンガーシーケンシングによるスペクトルデータを得た。前記スペクトルデータを、ＥｄｉｔＲを用いて解析し、クローンインデックスを得た。さらに、同じＤＮＡ試料を用いて、ＮＧＳ解析を行った。また、同じＤＮＡ試料を用いて、リアルタイムＰＣＲにより、ＢＬＶのプロウイルス量を定量した。ＢＬＶ感染牛の４症例について同様の分析を行った。
【0120】
【0121】
図６～９に示すいずれの症例も、２０１７年の方が２０１５年よりもクローン化が進んでいた。腫瘍（Ｔｕｍｏｒ（１）、Ｔｕｍｏｒ（２））では、２０１７年よりもさらにクローン化が進んでいた。図８及び図９の症例では、腫瘍は、ほぼ同一の感染細胞で占められていた。クローンインデックス値の結果は、ＮＧＳ解析結果と同様の傾向を示した。プロウイルス量（ＰＶＬ（％））は、病勢とは必ずしも一致していなかった。
【0122】
＜実施例４＞
１２症例の伝染性リンパ腫発症牛の腫瘍から組織試料を採取した。また、１１症例の伝染性リンパ腫非発症牛若しくはリンパ球増多症牛の血液試料を採取した。前記組織試料又は血液試料からＤＮＡ試料を調製し、上記［検査方法］に従い、サンガーシーケンシングによるスペクトルデータを得た。前記スペクトルデータを、ＥｄｉｔＲを用いて解析し、クローンインデックスを得た。さらに、同じＤＮＡ試料を用いて、ＮＧＳ解析を行った。
１２症例の伝染性リンパ腫発症牛の腫瘍から組織試料を採取した。また、１１症例の伝染性リンパ腫非発症牛若しくはリンパ球増多症牛の血液試料を採取した。前記組織試料又は血液試料からＤＮＡ試料を調製し、上記［検査方法］に従い、サンガーシーケンシングによるスペクトルデータを得た。前記スペクトルデータを、ＥｄｉｔＲを用いて解析し、クローンインデックスを得た。さらに、同じＤＮＡ試料を用いて、ＮＧＳ解析を行った。
【0123】
結果を図１０に示す。図１０において、各バーは各症例のＮＧＳ解析結果を示す。ＮＧＳ解析結果を示すバーの上部に、その症例から得られたクローンインデックス値を示した。図１０に示すように、クローンインデックス値とＮＧＳ解析結果は同様の傾向を示した。伝染性リンパ腫発症牛では、クローン化が進んでいた。伝染性リンパ腫非発症牛又はリンパ球増多症牛では、多様性が高かった。
【0124】
＜実施例５＞
図１１に、複数の伝染性リンパ腫発症牛及び伝染性リンパ腫非発症牛から得たクローンインデックス値をプロットした結果を示す。伝染性リンパ腫発症牛と伝染性リンパ腫非発症牛との間で、クローンインデックス値に有意差（ｐ≦０．０００８３，ウィルコクソンの順位和検定）が認められた。
図１１に、複数の伝染性リンパ腫発症牛及び伝染性リンパ腫非発症牛から得たクローンインデックス値をプロットした結果を示す。伝染性リンパ腫発症牛と伝染性リンパ腫非発症牛との間で、クローンインデックス値に有意差（ｐ≦０．０００８３，ウィルコクソンの順位和検定）が認められた。
【0125】
図１２に、複数の伝染性リンパ腫発症牛及び伝染性リンパ腫非発症牛の血液試料において、ＢＬＶのプロウイルス量をリアルタイムＰＣＲで定量した結果を示す。プロウイルス量は、伝染性リンパ腫非発症牛の方が高い傾向があり、病勢とは一致していなかった。
【0126】
以上の結果から、本検査方法により得られる結果は牛伝染性リンパ腫の病勢と一致していることが確認された。そのため、本検査方法により、牛伝染性リンパ腫の病勢を検査できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【0127】
本発明によれば、簡易かつ迅速に牛伝染性リンパ腫の病勢を評価可能な、牛伝染性リンパ腫の病勢の検査方法、前記検査方法に使用可能なプライマー、及び検査キットが提供される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】