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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023021745
(43)【公開日】2023-02-14
(54)【発明の名称】がん転移抑制のための医薬組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20230207BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230207BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20230207BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20230207BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230207BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20230207BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00
A61P43/00 105
A61P35/04 ZNA
A61P37/06
A61K39/395 D
A61K39/395 P
A61K39/395 T
A61K39/395 E
A61K39/395 G
C12N15/09 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】14
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021126801
(22)【出願日】2021-08-02
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り （１） 公開１ ▲１▼発行日： 令和３年（２０２１年）６月７日 ▲２▼刊行物： Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｕｎｅ ２０２１，Ｖｏｌｕｍｅ １２，Ａｒｔｉｃｌｅ ６６３１１５ ▲３▼公開者： 澁谷拓未、神山麻美、澤田寛隆、菊池健太、丸山真優、澤渡力慧、池田直輝、浅野謙一、黒滝大翼、田村智彦、米田敦子、今田啓介、佐藤荘、審良静男、田中正人、四元聡志 ▲４▼公開された発明の内容： 澁谷拓未、神山麻美、澤田寛隆、菊池健太、丸山真優、澤渡力慧、池田直輝、浅野謙一、黒滝大翼、田村智彦、米田敦子、今田啓介、佐藤荘、審良静男、田中正人、四元聡志が、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙにて、田中正人、浅野謙一、四元聡志、澁谷拓未および池田直輝が発明した、「がん転移抑制のための医薬組成物」に関する研究の一部を公開した。
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＴＲＩＴＯＮ
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和２年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、「次世代がん医療創生研究事業」「制御性単球を標的としたがんの進展・転移に対する治療法の開発」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】592068200
【氏名又は名称】学校法人東京薬科大学
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(72)【発明者】
【氏名】田中 正人
(72)【発明者】
【氏名】浅野 謙一
(72)【発明者】
【氏名】四元 聡志
(72)【発明者】
【氏名】澁谷 拓未
(72)【発明者】
【氏名】池田 直輝
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
【Ｆターム（参考）】
4C084AA17
4C084NA14
4C084ZB021
4C084ZB081
4C084ZB261
4C084ZC202
4C084ZC412
4C084ZC422
4C084ZC611
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB01
4C085BB11
4C085BB12
4C085BB22
4C085CC23
4C085EE01
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG06
4C085GG08
(57)【要約】
【課題】
がん転移を抑制するための医薬組成物を提供すること。
【解決手段】
Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球を有する対象に投与するための医薬組成物であって、マトリックスメタロプロテナーゼ－９（Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ９；ＭＭＰ－９）の活性を阻害する化合物を含む、医薬組成物。
【選択図】なし
がん転移を抑制するための医薬組成物を提供すること。
【解決手段】
Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球を有する対象に投与するための医薬組成物であって、マトリックスメタロプロテナーゼ－９（Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ９；ＭＭＰ－９）の活性を阻害する化合物を含む、医薬組成物。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球を有する対象に投与するための医薬組成物であって、
マトリックスメタロプロテナーゼ－９（Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ９；ＭＭＰ－９）の活性を阻害する化合物を含む、医薬組成物。
マトリックスメタロプロテナーゼ－９（Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ９；ＭＭＰ－９）の活性を阻害する化合物を含む、医薬組成物。
【請求項2】
前記ＭＭＰ－９の活性を阻害する化合物が、Ｌｃｎ２アンタゴニスト、ＣＤ８８アンタゴニスト、ＣＤ１５７アンタゴニスト、ＣＸＣＲ４アンタゴニストおよびＭＭＰ－９アンタゴニストからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
前記ＭＭＰ－９の活性を阻害する化合物が、
抗Ｌｃｎ２抗体、Ｌｃｎ２阻害剤、抗ＣＤ８８抗体、ＣＤ８８阻害剤、抗ＣＤ１５７抗体、ＣＤ１５７阻害剤、抗ＣＸＣＲ４抗体、ＣＸＣＲ４阻害剤、抗ＭＭＰ－９抗体およびＭＭＰ－９阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１または２に記載の医薬組成物。
抗Ｌｃｎ２抗体、Ｌｃｎ２阻害剤、抗ＣＤ８８抗体、ＣＤ８８阻害剤、抗ＣＤ１５７抗体、ＣＤ１５７阻害剤、抗ＣＸＣＲ４抗体、ＣＸＣＲ４阻害剤、抗ＭＭＰ－９抗体およびＭＭＰ－９阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項4】
がん転移を抑制および／または予防するための、請求項１～３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項5】
前記がん転移が、急性炎症または原発腫瘍に対する治療的介入によって生じたがん転移である、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項6】
前記原発腫瘍に対する治療的介入が、外科的切除、化学療法および放射線療法からなる群より選択される、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球を有する対象が、がん、炎症性疾患および自己免疫疾患からなる群より選択される少なくとも１つに罹患している、請求項１～６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項8】
前記Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球を有する対象が、ヒト、サル、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヒツジ、イヌおよびネコからなる群より選択される哺乳動物である、請求項１～７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項9】
ＭＭＰ－９活性化経路を阻害する組成物であって、
前記ＭＭＰ－９活性化経路は、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球、ＣＸＣＲ４およびＭＭＰ－９を含み、
前記組成物が、ＭＭＰ－９の活性を阻害する化合物を含む、組成物。
前記ＭＭＰ－９活性化経路は、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球、ＣＸＣＲ４およびＭＭＰ－９を含み、
前記組成物が、ＭＭＰ－９の活性を阻害する化合物を含む、組成物。
【請求項10】
前記ＭＭＰ－９活性化経路が、Ｌｃｎ２、ＣＤ８８およびＣＤ１５７から選択される少なくとも１つをさらに含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項11】
（ｉ）治療的介入前の対象の末梢血サンプル中の白血球に対するＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の割合Ｒ１を測定すること、
（ｉｉ）治療的介入後の前記対象の末梢血サンプル中の白血球に対するＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の割合Ｒ２を測定すること、
（ｉｉｉ）前記測定した割合Ｒ１と、前記測定した割合Ｒ２とを比較すること
を含む、がん転移のリスクの評価方法。
（ｉｉ）治療的介入後の前記対象の末梢血サンプル中の白血球に対するＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の割合Ｒ２を測定すること、
（ｉｉｉ）前記測定した割合Ｒ１と、前記測定した割合Ｒ２とを比較すること
を含む、がん転移のリスクの評価方法。
【請求項12】
前記（ｉ）および／または（ｉｉ）における測定はフローサイトメトリーによって行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
抗Ｌｃｎ２抗体、抗ＣＤ８８抗体、抗ＣＤ１５７抗体、抗ＣＸＣＲ４抗体および抗ＭＭＰ－９抗体から選択される少なくとも１つを含む、がん転移の可能性を予測するためのキット。
【請求項14】
ＭＭＰ－９を阻害する化合物を含む、組成物であって、
前記ＭＭＰ－９を阻害する化合物が、抗Ｌｃｎ２抗体、Ｌｃｎ２阻害剤、抗ＣＤ８８抗体、ＣＤ８８阻害剤、抗ＣＤ１５７抗体、ＣＤ１５７阻害剤、抗ＣＸＣＲ４抗体、ＣＸＣＲ４阻害剤、抗ＭＭＰ－９抗体およびＭＭＰ－９阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つである、組成物。
前記ＭＭＰ－９を阻害する化合物が、抗Ｌｃｎ２抗体、Ｌｃｎ２阻害剤、抗ＣＤ８８抗体、ＣＤ８８阻害剤、抗ＣＤ１５７抗体、ＣＤ１５７阻害剤、抗ＣＸＣＲ４抗体、ＣＸＣＲ４阻害剤、抗ＭＭＰ－９抗体およびＭＭＰ－９阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つである、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、がん転移抑制のための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
がん治療による全身および局所の炎症は、がん再発の重要な危険因子として認識されている。原発腫瘍の外科的切除、化学療法または放射線療法は、休眠癌細胞を覚醒させ、炎症を介して遠隔臓器に転移性増殖を誘発する可能性がある（非特許文献１～７）。また、これらのがん治療に加えて、細菌感染やタバコの煙への曝露による炎症が、がんの休眠逃避や転移を促進することも報告されている（非特許文献８および９）。好中球、マクロファージおよび単球など、このような免疫細胞は、炎症によって引き起こされる癌再発に関与している。
【0003】
近年、好中球は、炎症に関連する癌の進行および転移を促進する役割に関連して注目を集めている。例えば、好中球は、炎症誘発性サイトカインを産生することによって媒介される肺転移の促進において重要な役割を果たすことが報告されている（非特許文献１０）。具体的に、好中球細胞外トラップ（Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｐ；ＮＥＴ）は、癌細胞との相互作用を介して休眠癌細胞を覚醒させる。ＮＥＴはまた、循環腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ；ＣＴＣ）を捕捉し、転移の形成増加をもたらす（非特許文献９、１１および１２）。
【0004】
また、癌再発には好中球、単球、マクロファージも関与することが報告されている。ＣＤ１１ｂ＋マクロファージの枯渇は、乳癌細胞の肺転移を減少させる（非特許文献１３）。血管内皮増殖因子－Ａ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－Ａ；ＶＥＧＦ－Ａ）分泌マクロファージは、癌細胞の血管外漏出と肺転移とを促進する（非特許文献１４）。また、ＣＣＬ２－ＣＣＲ２軸により転移部位に動員された単球はマクロファージに分化し、癌細胞の血管外遊出や生存を促進することが報告されている（非特許文献１４および１５）。最近の報告では、好中球だけでなく単球も休眠癌細胞を覚醒させることが示されている（非特許文献７）。
【0005】
これらの報告を考慮すると、癌の進行および転移に関与する免疫細胞の種類は、おそらく炎症または実験モデルの状況に依存する。しかし、患者の実際の癌関連事象に関与する免疫細胞は十分には理解されていない。
【0006】
血中単球は、単核食細胞系の構成成分として炎症において重要な役割を果たしている。定常状態では、単球はマウスまたはヒトで、それぞれ２つまたは３つの亜集団からなる（非特許文献１６および１７）。古典的な単球、すなわち、マウスにおけるＬｙ６ＣｈｉＣＣＲ２＋ＣＸ３ＣＲ１－およびヒトにおけるＣＤ１４＋ＣＤ１６－は、ＣＣＲ２依存的な方法で、炎症部位に動員され、炎症促進免疫細胞として機能する（非特許文献１４、１８および１９）。対照的に、非古典的な単球、例えば、マウスにおけるＬｙ６ＣｌｏｗＣＣＲ２－ＣＸ３ＣＲ１＋およびヒトにおけるＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋は、Ｎｒ４Ａ依存的な方法でＬｙ６Ｃｈｉ単球と区別され、ホメオスタシスの間に血管系を巡回し、そして、がんの免疫監視に貢献する（非特許文献２０）。ヒトの中間型単球（intermediate monocyte）であるＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋は、Ｔ細胞の増殖および促進に関与することが示唆されている（非特許文献２１）。
【0007】
これらの単球サブセットは、組織傷害または癌において様々な免疫応答に協調的に関与すると考えられてきた。しかし近年、炎症時の単球産生を含む緊急造血または他の免疫応答において、広く研究されており、いくつかの報告において、定常状態ではほとんど観察されない骨髄（Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ；ＢＭ）由来の新規の非定型単球サブセットが同定されている。マウスでは、微生物刺激により誘導された炎症は、顆粒球－マクロファージ前駆細胞（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ；ＧＭＰｓ）に由来する好中球様Ｌｙ６Ｃｈｉ単球に生じるが、単球樹状細胞前駆体（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ；ＭＤＰｓ）には生じない（非特許文献２２および２３）。Ｃｅａｃａｍ１＋Ｍｓｒ＋Ｌｙ６Ｃｌｏｗ単球は、分離核含有異型単球（Ｓｅｇｒｅｇａｔｅｄ－ｎｕｃｌｅｕｓ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｔｙｐｉｃａｌ ｍｏｎｏｃｙｔｅ；ＳａｔＭ）と呼ばれ、ブレオマイシン投与マウスの肺内に出現し、線維化に関与する（非特許文献２４）。また、Ｌｙ６ＣｈｉＭＨＣＩＩｈｉＳｃａ－１ｈｉ単球は急性消化管感染マウスのＢＭに発生し、プロスタグランジンＥ２およびＩＬ－１０の産生を介して免疫反応を調節すると考えられている（非特許文献２５）。
【0008】
これらの報告は、単球の新規炎症関連サブセットが炎症に関連する癌の進行および転移を調節することができる可能性を示唆している。しかし、このような単球亜集団の詳細については不明のままであり、更なる研究が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Huang Q, Li F, Liu X, Li W, Shi W, Liu FF, et al. Caspase 3-mediated stimulation of tumor cell repopulation during cancer radiotherapy. Nat Med 2011;17:860-6
【非特許文献2】Panigrahy D, Gartung A, Yang J, Yang H, Gilligan MM, Sulciner ML, et al. Preoperative stimulation of resolution and inflammation blockade eradicates micrometastases. J Clin Invest 2019;129:2964-79
【非特許文献3】Sulciner ML, Serhan CN, Gilligan MM, Mudge DK, Chang J, Gartung A, et al. Resolvins suppress tumor growth and enhance cancer therapy. J Exp Med 2018;215:115-40
【非特許文献4】Gartung A, Yang J, Sukhatme VP, Bielenberg DR, Fernandes D, Chang J, et al. Suppression of chemotherapy-induced cytokine/lipid mediator surge and ovarian cancer by a dual COX-2/sEH inhibitor. Proc Natl Acad Sci U S A 2019;116:1698-703
【非特許文献5】Ananth AA, Tai LH, Lansdell C, Alkayyal AA, Baxter KE, Angka L, et al. Surgical Stress Abrogates Pre-Existing Protective T Cell Mediated Anti-Tumor Immunity Leading to Postoperative Cancer Recurrence. PLoS One 2016;11:e0155947
【非特許文献6】Lee JW, Shahzad MM, Lin YG, Armaiz-Pena G, Mangala LS, Han HD, et al. Surgical stress promotes tumor growth in ovarian carcinoma. Clin Cancer Res 2009;15:2695-702
【非特許文献7】Krall JA, Reinhardt F, Mercury OA, Pattabiraman DR, Brooks MW, Dougan M, et al. The systemic response to surgery triggers the outgrowth of distant immune-controlled tumors in mouse models of dormancy. Sci Transl Med 2018;10
【非特許文献8】Yan L, Cai Q, Xu Y. The ubiquitin-CXCR4 axis plays an important role in acute lung infection-enhanced lung tumor metastasis. Clin Cancer Res 2013;19:4706-16
【非特許文献9】Albrengues J, Shields MA, Ng D, Park CG, Ambrico A, Poindexter ME, et al. Neutrophil extracellular traps produced during inflammation awaken dormant cancer cells in mice. Science 2018;361
【非特許文献10】El Rayes T, Catena R, Lee S, Stawowczyk M, Joshi N, Fischbach C, et al. Lung inflammation promotes metastasis through neutrophil protease-mediated degradation of Tsp-1. Proc Natl Acad Sci U S A 2015;112:16000-5
【非特許文献11】Cools-Lartigue J, Spicer J, McDonald B, Gowing S, Chow S, Giannias B, et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis. J Clin Invest 2013
【非特許文献12】Yang L, Liu Q, Zhang X, Liu X, Zhou B, Chen J, et al. DNA of neutrophil extracellular traps promotes cancer metastasis via CCDC25. Nature 2020;583:133-8
【非特許文献13】Qian B, Deng Y, Im JH, Muschel RJ, Zou Y, Li J, et al. A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth. PLoS One 2009;4:e6562
【非特許文献14】Qian BZ, Li J, Zhang H, Kitamura T, Zhang J, Campion LR, et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature 2011;475:222-5
【非特許文献15】Zhao L, Lim SY, Gordon-Weeks AN, Tapmeier TT, Im JH, Cao Y, et al. Recruitment of a myeloid cell subset (CD11b/Gr1 mid) via CCL2/CCR2 promotes the development of colorectal cancer liver metastasis. Hepatology 2013;57:829-39
【非特許文献16】Wolf AA, Yanez A, Barman PK, Goodridge HS. The Ontogeny of Monocyte Subsets. Front Immunol 2019;10:1642
【非特許文献17】Kapellos TS, Bonaguro L, Gemund I, Reusch N, Saglam A, Hinkley ER, et al. Human Monocyte Subsets and Phenotypes in Major Chronic Inflammatory Diseases. Front Immunol 2019;10:2035
【非特許文献18】Tsou CL, Peters W, Si Y, Slaymaker S, Aslanian AM, Weisberg SP, et al. Critical roles for CCR2 and MCP-3 in monocyte mobilization from bone marrow and recruitment to inflammatory sites. J Clin Invest 2007;117:902-9
【非特許文献19】Serbina NV, Pamer EG. Monocyte emigration from bone marrow during bacterial infection requires signals mediated by chemokine receptor CCR2. Nat Immunol 2006;7:311-7
【非特許文献20】Hanna RN, Cekic C, Sag D, Tacke R, Thomas GD, Nowyhed H, et al. Patrolling monocytes control tumor metastasis to the lung. Science 2015;350:985-90
【非特許文献21】Mukherjee R, Kanti Barman P, Kumar Thatoi P, Tripathy R, Kumar Das B, Ravindran B. Non-Classical monocytes display inflammatory features: Validation in Sepsis and Systemic Lupus Erythematous. Sci Rep 2015;5:13886
【非特許文献22】Ikeda N, Asano K, Kikuchi K, Uchida Y, Ikegami H, Takagi R, et al. Emergence of immunoregulatory Ym1(+)Ly6C(hi) monocytes during recovery phase of tissue injury. Sci Immunol 2018;3
【非特許文献23】Yanez A, Coetzee SG, Olsson A, Muench DE, Berman BP, Hazelett DJ, et al. Granulocyte-Monocyte Progenitors and Monocyte-Dendritic Cell Progenitors Independently Produce Functionally Distinct Monocytes. Immunity 2017;47:890-902 e4
【非特許文献24】Satoh T, Nakagawa K, Sugihara F, Kuwahara R, Ashihara M, Yamane F, et al. Identification of an atypical monocyte and committed progenitor involved in fibrosis. Nature 2017;541:96-101
【非特許文献25】Askenase MH, Han SJ, Byrd AL, Morais da Fonseca D, Bouladoux N, Wilhelm C, et al. Bone-Marrow-Resident NK Cells Prime Monocytes for Regulatory Function during Infection. Immunity 2015;42:1130-42
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明は、がん転移を抑制するための医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者らはこれまでに、Ｙｍ１発現を特徴とするＧＭＰ由来異型Ｌｙ６Ｃ＋単球（Ｌｙ６Ｃ＋Ｙｍ１＋単球）が、組織損傷の回復期に骨髄で産生されることを報告した。これらの単球は、顆粒球といくつかの特徴を共有し、組織の修復と再生に寄与する免疫調節表現型を示す（参考文献２２）。本発明者らはさらに、好中球ではなく、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球が、原発腫瘍への治療的介入に伴う炎症によって引き起こされる転移の促進に寄与することを見出した。具体的に、原発腫瘍の治療的介入に伴う全身性および局所性の炎症は、時にマウスおよびヒトの転移性再発を促進するが、この過程にどのような種類の免疫細胞が関与しているかは不明のままであったところ、本発明者らは、組織修復促進Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球サブセットが、リポ多糖類の静脈注射または原発腫瘍の切除により誘導された全身性および局所性炎症の結果として拡大し、循環腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ；ＣＴＣ）に由来する肺転移を促進することを見出した。
【0012】
さらに、組織修復促進Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球サブセットの欠失は、マウスにおいて炎症により誘導された転移を抑制する一方で、組織修復促進Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球のナイーブマウスへの移入は、マウスの肺転移を促進することが見出された。
【0013】
本発明者らはまた、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球は、マトリックスメタロプロテナーゼ－９（Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ９；ＭＭＰ－９）およびＣＸＣケモカイン受容体４（ＣＸＣ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４；ＣＸＣＲ４）を高度に発現し、ＭＭＰ－９阻害剤およびＣＸＣＲ４拮抗剤はＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球促進肺転移を減少させることを見出した。これらの知見は、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球が、全身および局所炎症に関連するＣＴＣに由来する転移の治療標的細胞であることを示すものである。
【0014】
さらに、本発明者らは、Ｌｙ６Ｃ＋Ｙｍ１＋単球に高発現する表面マーカーを特定することに成功した。この知見は、上記ＭＭＰ－９およびＣＸＣＲ４に加え、かかる表面マーカーも、ＣＴＣ由来転移の治療標的となり得ることを示唆する。
【0015】
これらの知見は、組織修復の機序とがん転移が密接に関連していることを示すと共に、原発腫瘍に対する介入後の転移性再発に対する新規予測細胞バイオマーカー、および、がん転移における新規な治療標的を明らかにするものである。本発明は、これらの知見に基づき成されたものである。
【0016】
すなわち、本発明は以下のとおりである：
［１］Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球を有する対象に投与するための医薬組成物であって、
マトリックスメタロプロテナーゼ－９（Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ９；ＭＭＰ－９）の活性を阻害する化合物を含む、医薬組成物；
［２］前記ＭＭＰ－９の活性を阻害する化合物が、Ｌｃｎ２アンタゴニスト、ＣＤ８８アンタゴニスト、ＣＤ１５７アンタゴニスト、ＣＸＣＲ４アンタゴニストおよびＭＭＰ－９アンタゴニストからなる群より選択される少なくとも１つである、［１］に記載の医薬組成物；
［３］前記ＭＭＰ－９の活性を阻害する化合物が、
抗Ｌｃｎ２抗体、Ｌｃｎ２阻害剤、抗ＣＤ８８抗体、ＣＤ８８阻害剤、抗ＣＤ１５７抗体、ＣＤ１５７阻害剤、抗ＣＸＣＲ４抗体、ＣＸＣＲ４阻害剤、抗ＭＭＰ－９抗体およびＭＭＰ－９阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つである、［１］または［２］に記載の医薬組成物；
［４］がん転移を抑制および／または予防するための、［１］～［３］のいずれか１項に記載の医薬組成物；
［５］前記がん転移が、急性炎症または原発腫瘍に対する治療的介入によって生じたがん転移である、［４］に記載の医薬組成物；
［６］前記原発腫瘍に対する治療的介入が、外科的切除、化学療法および放射線療法からなる群より選択される、［５］に記載の医薬組成物；
［７］前記Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球を有する対象が、がん、炎症性疾患および自己免疫疾患からなる群より選択される少なくとも１つに罹患している、［１］～［６］のいずれか１項に記載の医薬組成物；
［８］前記Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球を有する対象が、ヒト、サル、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヒツジ、イヌおよびネコからなる群より選択される哺乳動物である、［１］～［７］のいずれか１項に記載の医薬組成物；
［９］ＭＭＰ－９活性化経路を阻害する組成物であって、
前記ＭＭＰ－９活性化経路は、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球、ＣＸＣＲ４およびＭＭＰ－９を含み、
前記組成物が、ＭＭＰ－９の活性を阻害する化合物を含む、組成物；
［１０］前記ＭＭＰ－９活性化経路が、Ｌｃｎ２、ＣＤ８８およびＣＤ１５７から選択される少なくとも１つをさらに含む、［９］に記載の組成物；
［１１］（ｉ）治療的介入前の対象の末梢血サンプル中の白血球に対するＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の割合Ｒ１を測定すること、
（ｉｉ）治療的介入後の前記対象の末梢血サンプル中の白血球に対するＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の割合Ｒ２を測定すること、
（ｉｉｉ）前記測定した割合Ｒ１と、前記測定した割合Ｒ２とを比較すること
を含む、がん転移のリスクの評価方法；
［１２］前記（ｉ）および／または（ｉｉ）における測定はフローサイトメトリーによって行われる、［１１］に記載の方法；
［１３］抗Ｌｃｎ２抗体、抗ＣＤ８８抗体、抗ＣＤ１５７抗体、抗ＣＸＣＲ４抗体および抗ＭＭＰ－９抗体から選択される少なくとも１つを含む、がん転移の可能性を予測するためのキット；
［１４］ＭＭＰ－９を阻害する化合物を含む、組成物であって、
前記ＭＭＰ－９を阻害する化合物が、抗Ｌｃｎ２抗体、Ｌｃｎ２阻害剤、抗ＣＤ８８抗体、ＣＤ８８阻害剤、抗ＣＤ１５７抗体、ＣＤ１５７阻害剤、抗ＣＸＣＲ４抗体、ＣＸＣＲ４阻害剤、抗ＭＭＰ－９抗体およびＭＭＰ－９阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つである、組成物。
［１］Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球を有する対象に投与するための医薬組成物であって、
マトリックスメタロプロテナーゼ－９（Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ９；ＭＭＰ－９）の活性を阻害する化合物を含む、医薬組成物；
［２］前記ＭＭＰ－９の活性を阻害する化合物が、Ｌｃｎ２アンタゴニスト、ＣＤ８８アンタゴニスト、ＣＤ１５７アンタゴニスト、ＣＸＣＲ４アンタゴニストおよびＭＭＰ－９アンタゴニストからなる群より選択される少なくとも１つである、［１］に記載の医薬組成物；
［３］前記ＭＭＰ－９の活性を阻害する化合物が、
抗Ｌｃｎ２抗体、Ｌｃｎ２阻害剤、抗ＣＤ８８抗体、ＣＤ８８阻害剤、抗ＣＤ１５７抗体、ＣＤ１５７阻害剤、抗ＣＸＣＲ４抗体、ＣＸＣＲ４阻害剤、抗ＭＭＰ－９抗体およびＭＭＰ－９阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つである、［１］または［２］に記載の医薬組成物；
［４］がん転移を抑制および／または予防するための、［１］～［３］のいずれか１項に記載の医薬組成物；
［５］前記がん転移が、急性炎症または原発腫瘍に対する治療的介入によって生じたがん転移である、［４］に記載の医薬組成物；
［６］前記原発腫瘍に対する治療的介入が、外科的切除、化学療法および放射線療法からなる群より選択される、［５］に記載の医薬組成物；
［７］前記Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球を有する対象が、がん、炎症性疾患および自己免疫疾患からなる群より選択される少なくとも１つに罹患している、［１］～［６］のいずれか１項に記載の医薬組成物；
［８］前記Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球を有する対象が、ヒト、サル、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヒツジ、イヌおよびネコからなる群より選択される哺乳動物である、［１］～［７］のいずれか１項に記載の医薬組成物；
［９］ＭＭＰ－９活性化経路を阻害する組成物であって、
前記ＭＭＰ－９活性化経路は、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球、ＣＸＣＲ４およびＭＭＰ－９を含み、
前記組成物が、ＭＭＰ－９の活性を阻害する化合物を含む、組成物；
［１０］前記ＭＭＰ－９活性化経路が、Ｌｃｎ２、ＣＤ８８およびＣＤ１５７から選択される少なくとも１つをさらに含む、［９］に記載の組成物；
［１１］（ｉ）治療的介入前の対象の末梢血サンプル中の白血球に対するＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の割合Ｒ１を測定すること、
（ｉｉ）治療的介入後の前記対象の末梢血サンプル中の白血球に対するＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の割合Ｒ２を測定すること、
（ｉｉｉ）前記測定した割合Ｒ１と、前記測定した割合Ｒ２とを比較すること
を含む、がん転移のリスクの評価方法；
［１２］前記（ｉ）および／または（ｉｉ）における測定はフローサイトメトリーによって行われる、［１１］に記載の方法；
［１３］抗Ｌｃｎ２抗体、抗ＣＤ８８抗体、抗ＣＤ１５７抗体、抗ＣＸＣＲ４抗体および抗ＭＭＰ－９抗体から選択される少なくとも１つを含む、がん転移の可能性を予測するためのキット；
［１４］ＭＭＰ－９を阻害する化合物を含む、組成物であって、
前記ＭＭＰ－９を阻害する化合物が、抗Ｌｃｎ２抗体、Ｌｃｎ２阻害剤、抗ＣＤ８８抗体、ＣＤ８８阻害剤、抗ＣＤ１５７抗体、ＣＤ１５７阻害剤、抗ＣＸＣＲ４抗体、ＣＸＣＲ４阻害剤、抗ＭＭＰ－９抗体およびＭＭＰ－９阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つである、組成物。
【発明の効果】
【0017】
本発明によれば、がん転移を抑制する医薬組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1A】種々のＴＬＲリガンド（ＬＰＳ、ＣｐＧ－ＯＤＮおよびＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）が転移進行に及ぼす影響を解析するための実験デザインを示す図である。
【図1B】種々のＴＬＲリガンド（ＬＰＳ、ＣｐＧ－ＯＤＮおよびＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））で処理したマウスの肺の代表的な画像を示す図である。
【図1C】種々のＴＬＲリガンド（ＬＰＳ、ＣｐＧ－ＯＤＮおよびＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））で処理したマウスの肺転移数の定量的集計を示す図である。
【図1D】Ｂ１６メラノーマ細胞特異的遺伝子であるＰｒｅｍｅｌａｎｏｓｏｍｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｐｍｅｌ）およびＤｏｐａｃｈｒｏｍｅ ｔａｕｔｏｍｅｒａｓｅ（Ｄｃｔ）遺伝子のｍＲＮＡ発現量を示す図である。
【図1E】転移進行に対するＡｎｔｉ－Ｌｙ６Ｇ ｍＡｂおよびＡｎｔｉ－Ｇｒ－１ ｍＡｂの効果を試験するために用いた実験デザインを示す図である。
【図1F】Ａｎｔｉ－Ｌｙ６Ｇ ｍＡｂを注射したマウスの肺の代表的な画像および肺転移数を示す図である。
【図1G】Ａｎｔｉ－Ｇｒ－１ ｍＡｂを注射したマウスの肺の代表的な画像および肺転移数を示す図である。
【図1H】転移進行に対するＣＤ２０４細胞の寄与を検証するために用いられた実験デザインを示す図である。
【図1I】各マウスの肺転移数の定量的集計を示す図である。
【図1J】各マウスにおけるＰｍｅｌ遺伝子およびＤｃｔ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を示す図である。
【図1K】マウスにおける炎症性サイトカイン（ＩＬ－６およびＴＮＦ－α）の産生を示す図である。
【図1L】転移進行に対する単球移入の効果を検証するために用いられた実験デザインを示す図である。
【図1M】ナイーブマウスまたはＬＰＳ注射マウスから単離した単球を静脈注射したナイーブマウスにおける肺転移数の定量的集計を示す図である。
【図1N】ナイーブマウスまたはＬＰＳ注射マウスから単離した単球を静脈注射したナイーブマウスにおける肺転移巣を示す図である。
【図1O】ナイーブマウスまたはＬＰＳ注射マウスから単離した単球を静脈注射したナイーブマウスにおけるＰｍｅｌ遺伝子およびＤｃｔ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を示す図である。
【図1P】ＬＰＳの静脈内投与（ｉ．ｖ．）および鼻腔内投与（ｉ．ｎ．）による、肺におけるＮＥＴ形成の特異的マーカー（シトルリン化ヒストンＨ３）のウェスタンブロット分析を示す図である。
【図1Q】ＬＰＳ処理（静脈内投与（ｉ．ｖ．）および鼻腔内投与（ｉ．ｎ．）による）ＷＴマウス由来の肺切片の免疫組織化学画像を示す図である。
【図2A】ＷＴマウスまたはＹｍ１－Ｖｅｎｕｓマウスにおける肺細胞のフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図2B】Ｌｙ６Ｃ＋単球の絶対数を示す図である。
【図2C】Ｙｍ１+Ｌｙ６Ｃ＋単球の絶対数を示す図である。
【図2D】転移進行に対するＹｍ１＋細胞の寄与を検証するために用いられた実験デザインを示す図である。
【図2E】マウスの肺の代表的な画像および肺転移数を示す図である。
【図2F】マウスにおけるＰｍｅｌ遺伝子およびＤｃｔ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を示す図である。
【図2G】Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球（Ｙｍ１＋Ｍｏ）またはＹｍ１－Ｌｙ６Ｃ＋単球（Ｙｍ１－Ｍｏ）の移入が移入進行に及ぼす影響を試験するために使用された実験的デザインを示す図である。
【図2H】ＢＭ内のＹｍ１＋ＭｏまたはＹｍ１－Ｍｏの同定で、肺の転移を解析した図である。
【図2I】各マウスの肺の代表的な画像および肺転移数を示す図である。
【図2J】各マウスにおけるＰｍｅｌ遺伝子およびＤｃｔ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を示す図である。
【図3A】肺におけるＹｍ１＋ＭｏおよびＹｍ１－Ｍｏの表面マーカーの発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す図である。
【図3B】主成分分析（ＰＣＡ）の結果を示す図である。
【図3C】ボルケーノプロットを示す図である。
【図3D】遺伝子発現をヒートマップで示した図である。
【図3E】Ｙｍ１＋ＭｏおよびＹｍ１－Ｍｏにおける各遺伝子のｍＲＮＡの発現量を示す図である。
【図4A】単球の培養上清のゼラチンザイモグラフィー。未処理またはＬＰＳ処理のＷＴマウス（左）から分離したＬｙ６Ｃ＋単球、あるいはＬＰＳ処理のＹｍ１－Ｖｅｎｕｓマウス（右）から分離したＹｍ１＋またはＹｍ１－Ｌｙ６Ｃ＋単球（右）の培養上清のゼラチナーゼ活性の測定結果を示す図である。
【図4B】ナイーブまたはＬＰＳ処理ＷＴマウスから単離したＬｙ６Ｃ＋単球の培養上清存在下での癌細胞の浸潤アッセイを示す図である。
【図4C】転移の初期ポイントに注射されたＭＭＰ－９阻害剤の効果を検証するために用いられた実験デザインである。
【図4D】マウスにおける肺転移数を示す図である。
【図4E】マウスにおけるＰｍｅｌ遺伝子およびＤｃｔ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を示す図である。
【図4F】マウスにおける肺転移数を示す図である。
【図4G】マウスにおけるＰｍｅｌ遺伝子およびＤｃｔ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を示す図である。
【図4H】Ｌｃｎ２－／－単球の培養上清のゼラチンザイモグラフィーＬＰＳ処理したｌ Ｌｃｎ２＋／－またはＬｃｎ２－／－マウスから単離したＬｙ６Ｃ＋単球の培養上清のゼラチナーゼ活性の測定結果を示す図である。
【図4I】Ｌｃｎ２＋／－注射Ｌｃｎ２－／－注射による肺転移数を示す図である。
【図5A】末梢血中のＬｙ６Ｃ＋単球中のＹｍ１＋細胞の割合を示すフローサイトメトリープロファイルを示す図である。
【図5B】原発腫瘍の外科的切除後の、末梢血中の白血球中のＬｙ６Ｃ＋単球の割合（上）およびＬｙ６Ｃ＋単球中のＹｍ１＋細胞の割合（下）を示す図である。
【図5C】原発腫瘍への放射線暴露後の、末梢血中の白血球中のＬｙ６Ｃ＋単球の割合（上）およびＬｙ６Ｃ＋単球中のＹｍ１＋細胞の割合（下）の割合を示す図である。
【図5D】腫瘍切除後の肺転移数を示す図である。
【図5E】腫瘍切除後の肺転移に対する免疫細胞欠失の影響を示す図である。
【図6A】ナイーブもしくはＬＰＳ処理マウスから単離した末梢血Ｌｙ６Ｃ＋単球、またはＢ１６細胞表面のＣＸＣＲ４発現を示す図である。
【図6B】ＣＸＣＲ４アンタゴニストによる処理によるＬｙ６Ｃ＋単球の肺蓄積の阻害を示す図である。
【図6C】腫瘍切除による転移進行に対するＣＸＣＲ４拮抗剤（ＡＭＤ３１００）治療の効果を検証するために用いた実験デザインを示す図である。
【図6D】ＣＸＣＲ４拮抗剤（ＡＭＤ３１００）治療後の肺転移数を示す図である。
【図7A】ＬＰＳ処理マウスの肺における免疫細胞のフローサイトメーター分析を示す図である。
【図7B】ＬＰＳ処理マウスの肺における免疫細胞の絶対数を示す図である。
【図8】枯渇抗体で処理されたＷＴマウスのフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図9】ＣＤ２０４－ＤＴＲマウスの末梢血のフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図10A】移入された単球および腫瘍細胞の分布を示す図である。
【図10B】肺における、移入されたＢ１６細胞の数（左）および移入されたナイーブＭｏまたはＬＰＳ Ｍｏの数（右）を示す図である。
【図11A】がん細胞およびＬＰＳを、または、がん細胞のみを注射されたＷＴマウスおよびＹｍ１－Ｖｅｎｕｓマウスにおける肺細胞のフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図11B】肺におけるＹｍ１－Ｖｅｎｕｓ＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の絶対数を示す図である。
【図12】ＤＴ処理したＹｍ１－ＤＴＲ－Ｖｅｎｕｓマウスの末梢血のフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図13】ＲＮＡ－ｓｅｑ分析による、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球およびＹｍ１－Ｌｙ６Ｃ＋単球の遺伝子発現プロファイル示す図である。
【図14A】ＭＭＰ－９阻害剤の連続投与が肺転移進行に及ぼす影響を解析するための実験デザインを示す図である。
【図14B】マウスにおける肺転移数を示す図である。
【図14C】マウスにおけるＰｍｅｌ遺伝子およびＤｃｔ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を示す図である。
【図15A】Ｙｍ１－Ｖｅｎｕｓ陽性単球とＹｍ１－Ｖｅｎｕｓ陰性単球との間での抗原の発現差を示す図である。
【図15B】定常状態とＬＰＳ投与４８時間後の野生型マウスの骨髄の好中球（Ｌｙ６Ｇ陽性）、Ｌｙ６Ｃ陽性Ｙｍ１陽性単球およびＬｙ６Ｃ陽性Ｙｍ１陰性単球における、ＣＤ８８およびＣＤ１５７の発現量をフローサイトメトリーで解析した結果を示す図である。
【図15C】ＬＰＳ投与４８時間後の後の野生型マウスの骨髄細胞における、Ｙｍ１発現量のフローサイトメトリー解析結果である。
【図15D】ＣＤ８８／ＣＤ１５７の２つのマーカーにより分取したＹｍ１陽性制御性単球の遺伝子発現解析結果を示す図である。
【0019】
本発明の第１の側面は、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球を有する対象に投与するための医薬組成物に関し、当該医薬組成物は、マトリックスメタロプロテナーゼ－９（Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ９；ＭＭＰ－９）の活性を阻害する化合物を含む。ここで、「Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球」は、Ｙｍ１遺伝子およびＬｙ６Ｃ遺伝子を発現している単球をいい、「Ｙｍ１を発現したＬｙ６Ｃ＋単球」、「Ｙｍ１およびＬｙ６Ｃを発現した単球」および「Ｙｍ１陽性Ｌｙ６Ｃ陽性単球」と同義である。本単球において、典型的には、Ｙｍ１は単球の内部に発現し、Ｌｙ６Ｃは単球表面に発現する。好ましい態様において、「Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球」は、Ｙｍ１遺伝子およびＬｙ６Ｃ遺伝子に関し、これらの遺伝子およびタンパク質の両方を発現している。
【0020】
本明細書において、各マーカー遺伝子の発現は、遺伝子およびタンパク質のいずれに基づいて確認してもよい。マーカー遺伝子の発現は、当該分野で公知の技術を用いて確認することができ、例えば、ｑＰＣＲにより、そのマーカー遺伝子の発現量を測定することによって確認することができる。
【0021】
本明細書において、「Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球を有する対象」とは、Ｙｍ１およびＬｙ６Ｃを発現した単球を有する対象をいう。具体的に、当該対象は、Ｙｍ１が発現していることが確認されたＬｙ６Ｃ陽性単球を有している。Ｙｍ１は典型的には、Ｌｙ６Ｃ＋単球内に発現している。Ｌｙ６Ｃ＋単球のＹｍ１の発現は、当該分野で既知の方法、例えば、免疫細胞染色およびＲＴ－ＰＣＲによって検出することができる。また、Ｙｍ１の発現は、細胞固定および細胞内染色を行った後、フローサイトメトリーによって検出することも可能である。「Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球を有する対象」において、Ｌｙ６Ｃ＋単球におけるＹｍ１の発現レベルは、健康な対象、急性炎症のない対象または治療的介入がない対象と比較して、例えば１．０倍超、好ましくは１．２倍以上、より好ましくは１．５倍以上、さらにより好ましくは２．０倍、さらにより好ましくは３．０倍以上、さらにより好ましくは４．０倍以上、さらにより好ましくは５．０倍以上、さらにより好ましくは６．０倍以上、さらにより好ましくは７．０倍以上、上昇している。
【0022】
本明細書において、単球に発現する、マーカー遺伝子には、そのホモログが含まれるものとする。「Ｙｍ１およびＬｙ６Ｃを発現した単球」は具体的には、Ｙｍ１遺伝子またはそのホモログ、および、Ｌｙ６Ｃ遺伝子またはそのホモログを発現した単球を指す。本明細書で言及する他のマーカー遺伝子についても同様に、そのマーカー遺伝子の範囲には、そのホモログも包含されるものとする。
【0023】
本明細書において、特定の遺伝子の「ホモログ」は、該特定の遺伝子のヌクレオチド配列、または該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列と特定の相同性を有する実体を意味する。ここで、配列に関し、「相同性」、「同一性」および「配列同一性」の語は互換可能に使用される。「配列同一性」の割合は、具体的には、当業者に周知のアラインメントアルゴリズムを用いて２つの遺伝子のヌクレオチド配列またはこれらをコードするタンパク質のアミノ酸配列を整列させた後に、これら２つの配列間で同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の割合をいう。
【0024】
特定の遺伝子の「ホモログ」は、当該遺伝子のコードするタンパク質のアミノ酸配列に対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列同一性を有する。配列同一性はまた、類似の化学的特性および／または機能を有するアミノ酸残基の観点から考慮してもよい。
【0025】
上記アライメントには、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４ Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １ ｐ３８７）、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９ Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版、第１８章）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３～４１０）、ＤＮＡＳＩＳＴＭ（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）等のコンピュータプログラムを使用できるが、これらに限定されない。
【0026】
「対象」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物である。本明細書において、「哺乳動物」の語は、哺乳動物に分類されるあらゆる動物を指すために使用され、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヒツジ、イヌおよびネコが含まれるが、これらに限定されない。本明細書において、望ましい哺乳動物はヒトである。
【0027】
本発明にかかる医薬組成物は、典型的には、がん転移を抑制および／または予防するための医薬組成物である。
【0028】
本明細書において「抑制」および「予防」の語は共に、治療および予防策の両方を包含するが、好ましくは、がんの転移を予防すること、遅らせること、および軽減することを包含するものとする。がん転移に関し、「抑制」および「予防」の語には、がんの病巣の数の減少、病巣の範囲の縮小、病巣の数および範囲の安定化（すなわち、増加および拡大させない）、病巣の数および範囲の増加または拡大の減速ならびに遅延が含まれるが、これらに限定されない。
【0029】
がん転移の「抑制」または「予防」は、当該分野で公知の方法に従って評価することができる。例えば、結節の数、がん細胞の局在、および、がん細胞に高発現する遺伝子を指標として評価することができる。結節の数およびがん細胞の局在は、例えば、組織染色および画像診断を用いて評価することができる。また、がん細胞に高発現している遺伝子は、例えば、免疫蛍光染色法、および、ＲＴ－ＰＣＲ法によって確認することができる。
【0030】
「ＭＭＰ－９の活性を阻害する化合物」の語は、最も広い意味で使用され、ＭＭＰ－９の活性化を引き起こす経路（以下、「ＭＭＰ－９活性化経路」とも称する。）に関与する化合物および細胞のいずれか１つ以上の生物学的活性を阻害する化合物が含まれるものとする。
【0031】
本明細書において、「ＭＭＰ－９活性化経路」は、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球と、ＭＭＰ－９とを含むものである。「ＭＭＰ－９活性化経路」は、好ましくは、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球と、ＣＸＣＲ４と、ＭＭＰ－９とを含むものである。より具体的には、「ＭＭＰ－９活性化経路」は、Ｙｍ１を発現したＬｙ６Ｃ＋単球が、ＣＸＣＲ４を介して浸潤し、浸潤した部位において、ＭＭＰ－９を分泌することを含む経路をいう。
【0032】
本明細書において、「ＭＭＰ－９活性化経路」の語は「転移カスケード」と同義である。当該経路は、Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｌｃｎ２）をさらに含んでもよい。Ｌｃｎ２は、ＭＭＰ－９を安定化することによってＭＭＰ－９の活性を増強する作用を有する。
【0033】
本発明者らは、さらに、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球が、ＣＤ８８およびＣＤ１５７を表面に高発現していることを見出した（図１５Ａ～１５Ｄ）。よって、一態様において、「ＭＭＰ－９活性化経路」は、ＣＤ８８およびＣＤ１５７から選択される少なくとも１つをさらに含む。別の一態様において、「ＭＭＰ－９活性化経路」は、ＣＤ８８およびＣＤ１５７の双方をさらに含む。
【0034】
「ＭＭＰ－９」は、細胞外マトリックス成分に対する生体内分解酵素の一種であり、活性中心に金属イオンが配座しているタンパク質分解酵素である。ＭＭＰ－９は、「ゼラチナーゼＢ」とも称される。ＭＭＰ－９は、組織、細胞および血中に存在し、細胞外マトリックスの構成成分であるゼラチン、ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲンおよびエラスチンを分解する活性を有し、癌の浸潤および転移に関与する。一般的に、ＭＭＰ－９は、好中球、マクロファージ、トロボブラスト、破骨細胞、癌細胞、Ｔ－リンパ球等によって産生されるが、本発明が対象とする「ＭＭＰ－９」は、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球によって産生されるＭＭＰ－９である。
【0035】
本明細書において、「ＭＭＰ－９の活性を阻害する化合物」は、ＭＭＰ－９の活性を直接的に阻害する化合物に限られず、一連の経路（例えば、「ＭＭＰ－９活性化経路」または「転移カスケード」）において、間接的に、ＭＭＰ９の活性を阻害する化合物も含む。例えば、ある化合物が、「ＭＭＰ－９活性化経路」の上流に存在する標的を阻害することによって、上記経路の下流においてＭＭＰ－９活性が阻害される場合、この化合物は直接的にはＭＭＰ－９の活性を阻害しないが、間接的にＭＭＰ－９の活性を阻害することにより、本明細書においては、「ＭＭＰ－９の活性を阻害する化合物」と定義される。ＭＭＰ－９の活性を間接的に阻害する化合物としては、例えば、後述のＣＤ８８アンタゴニストおよびＣＤ１５７アンタゴニストが挙げられる。
【0036】
「ＭＭＰ－９の活性を阻害する化合物」には、上記の化合物および細胞の少なくとも１つの活性を阻害する化合物が包含され、例えば、Ｙｍ１アンタゴニスト、Ｌｃｎ２アンタゴニスト、ＣＤ８８アンタゴニスト、ＣＤ１５７アンタゴニスト、ＣＸＣＲ４アンタゴニストおよびＭＭＰ－９アンタゴニストが挙げられる。一態様において、「ＭＭＰ－９の活性を阻害する化合物」は、Ｙｍ１アンタゴニスト、Ｌｃｎ２アンタゴニスト、ＣＤ８８アンタゴニスト、ＣＤ１５７アンタゴニスト、ＣＸＣＲ４アンタゴニストおよびＭＭＰ－９アンタゴニストからなる群より選択される少なくとも１つである。好ましい態様において、「ＭＭＰ－９の活性を阻害する化合物」は、Ｌｃｎ２アンタゴニスト、ＣＤ８８アンタゴニスト、ＣＤ１５７アンタゴニスト、ＣＸＣＲ４アンタゴニストおよびＭＭＰ－９アンタゴニストからなる群より選択される少なくとも１つである。
【0037】
本明細書において、「アンタゴニスト」の語は、最も広い意味で使用される。「アンタゴニスト」は分子であり、作用の基となるメカニズムに関わらず、部分的にまたは完全に標的分子の生物学的活性を遮断、阻害、中和、防御および／または干渉するものである。
【0038】
先述のとおり、本発明者らは、組織修復促進Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球サブセットが、リポ多糖類の静脈注射または原発腫瘍の切除により誘導された全身性および局所性炎症の結果として拡大し、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）に由来する肺転移を促進することを見出した。また、組織修復促進Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球のナイーブマウスへの移入によって、マウスの肺転移が促進されること、および、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球は、ＭＭＰ－９およびＣＸＣＲ４を高度に発現することを見出した（ＭＭＰ－９については図４Ａ、ＣＸＣＲ４については図６Ａ）。本知見は、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球、ＭＭＰ－９およびＣＸＣＲ４が、転移に関与することを示すものである。
【0039】
本知見は、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球は、先述の転移カスケードのいずれかの地点を阻害することで、ＣＴＣ由来の転移を抑制することができることを示唆する。本発明者らが得た知見は、悪液質を発症した対象の処置において、ＭＭＰ－９の活性化を引き起こす経路（「ＭＭＰ－９活性化経路」）を標的にすることの有用性を示すものである。したがって、「ＭＭＰ－９の活性化を引き起こす経路に関与する化合物」の語には、例えば、Ｙｍ１、Ｌｃｎ２、ＣＤ８８、ＣＤ１５７、ＣＸＣＲ４、ＳＤＦ－１およびＭＭＰ－９などが含まれる。また、「ＭＭＰ－９の活性化を引き起こす経路に関与する細胞」の語には、例えば、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球、並びに、ＣＸＣＲ４、ＳＤＦ－１およびＭＭＰ－９のいずれかを発現または産生する細胞などが含まれる。
【0040】
（Ｙｍ１アンタゴニスト）
「Ｙｍ１アンタゴニスト」に関連して、標的分子である「Ｙｍ１」の「生物学的活性」とは、例えば、Ｙｍ１がリガンドと結合する能力、および、Ｙｍ１を表面に発現する単球においてＭＭＰ－９の産生を誘導する能力である。Ｙｍ１アンタゴニストは、例えば、Ｙｍ１を特異的に認識して結合し、免疫系細胞の活性化による抗体依存性細胞傷害（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；ＡＤＣＣ）活性、補体依存性細胞傷害（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；ＣＤＣ）活性および抗体依存性細胞貪食（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ；ＡＤＣＰ）活性を誘導する能力、ならびに、Ｙｍ１を発現した単球によるＭＭＰ－９産生を阻害または遮断する能力に基づいて同定され得る。
「Ｙｍ１アンタゴニスト」に関連して、標的分子である「Ｙｍ１」の「生物学的活性」とは、例えば、Ｙｍ１がリガンドと結合する能力、および、Ｙｍ１を表面に発現する単球においてＭＭＰ－９の産生を誘導する能力である。Ｙｍ１アンタゴニストは、例えば、Ｙｍ１を特異的に認識して結合し、免疫系細胞の活性化による抗体依存性細胞傷害（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；ＡＤＣＣ）活性、補体依存性細胞傷害（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；ＣＤＣ）活性および抗体依存性細胞貪食（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ；ＡＤＣＰ）活性を誘導する能力、ならびに、Ｙｍ１を発現した単球によるＭＭＰ－９産生を阻害または遮断する能力に基づいて同定され得る。
【0041】
Ｙｍ１アンタゴニストは例えば、Ｙｍ１を表面に発現した単球を、試験化合物の存在下および不存在下でインキュベートし、エフェクター細胞あるいは補体を含む血清をさらに加えてインキュベートし、細胞障害に伴って培養上清中に遊離する物質、例えばＬＤＨなどを測定することによって同定することができる。試験化合物が無い場合と比較して試験化合物が有る場合の方が、細胞障害に伴って遊離する物質の濃度が高ければ、その試験化合物はＹｍ１アンタゴニストである。また、Ｙｍ１アンタゴニストは例えば、Ｙｍ１を表面に発現した単球を、試験化合物の存在下および不存在下でインキュベートし、細胞培養物上清のＭＭＰ－９レベルを、例えばＥＬＩＳＡによって、モニタリングすることができ、試験化合物が無い場合と比較して試験化合物が有る場合の方が、ＭＭＰ－９レベルが低ければ、その試験化合物はＹｍ１アンタゴニストである。他の方法として、試験化合物による処理の前後でリアルタイムＲＴ－ＰＣＲを用いて、Ｙｍ１を発現する組織におけるＭＭＰ－９ ｍＲＮＡの発現をモニタリングすることもできる。試験化合物存在下でＭＭＰ－９ ｍＲＮＡレベルが減少することは、その化合物がＹｍ１アンタゴニストであることを示す。
【0042】
「Ｙｍ１アンタゴニスト」の例には、天然Ｙｍ１ポリペプチド全体もしくは天然Ｙｍ１ポリペプチドサブユニットに対する中和抗体、免疫グロブリン定常領域配列と融合したＹｍ１サブユニットを含む免疫付着因子、小分子、天然Ｙｍ１ポリペプチド全体もしくは天然Ｙｍ１ポリペプチドサブユニットに結合するアプタマー、天然Ｙｍ１ポリペプチド全体もしくはそのサブユニットをコードする遺伝子の翻訳および転写の少なくとも一方を阻害することのできる核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、デコイおよびリボザイム）などが含まれるが、これらに限定されない。
【0043】
ここで、天然Ｙｍ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、当該分野で既知のデータベースから取得することができる。天然Ｙｍ１ポリペプチドのアミノ酸配列としては例えば、
・Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ-ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ３ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ，ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿０３４０２２．２）
が挙げられる。Ｙｍ１アンタゴニストには、このような配列を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体およびその断片や、当該配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体およびその断片などが含まれる。
・Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ-ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ３ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ，ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿０３４０２２．２）
が挙げられる。Ｙｍ１アンタゴニストには、このような配列を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体およびその断片や、当該配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体およびその断片などが含まれる。
【0044】
天然Ｙｍ１ポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列としては例えば、
・Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ－ｌｉｋｅ ３（Ｃｈｉｌ３），ｍＲＮＡ； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＭ＿００９８９２．３
が挙げられる。Ｙｍ１アンタゴニストには、
・上記のようなアミノ配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
・上記のようなアミノ配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
・上記のような塩基配列を有する遺伝子、
・上記のような塩基配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有する塩基配列を有する遺伝子
の翻訳および転写の少なくとも一方を阻害することのできる核酸分子などが含まれる。
・Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ－ｌｉｋｅ ３（Ｃｈｉｌ３），ｍＲＮＡ； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＭ＿００９８９２．３
が挙げられる。Ｙｍ１アンタゴニストには、
・上記のようなアミノ配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
・上記のようなアミノ配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
・上記のような塩基配列を有する遺伝子、
・上記のような塩基配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有する塩基配列を有する遺伝子
の翻訳および転写の少なくとも一方を阻害することのできる核酸分子などが含まれる。
【0045】
「Ｙｍ１アンタゴニスト」には、例えば、抗体および抗体フラグメントならびに低分子化合物が含まれる。Ｙｍ１アンタゴニストは、例えば、抗Ｙｍ１抗体およびＹｍ１阻害剤である。
【0046】
（Ｌｃｎ２アンタゴニスト）
「Ｌｃｎ２」は、Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ－２、Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ Ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｚｉａｔｅｄ Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ（ＮＧＡＬ）、２４ｐ３またはＮｅｕｔｒｏｐｈｉｌ Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ（ＮＬ）としても知られる分泌型糖タンパク質である。Ｌｃｎ２は、ストレスタンパク質としても機能し、先天性免疫反応、分化、腫瘍発生および細胞の生存などの多様な細胞プロセスに関与する。「Ｌｃｎ２アンタゴニスト」に関連して、標的分子である「Ｌｃｎ２」の「生物学的活性」とは、例えば、ＭＭＰ－９を安定化させることによりＭＭＰ－９活性を維持する能力である。Ｌｃｎ２アンタゴニストは、例えば、Ｌｃｎ２を特異的に認識して結合し、ＭＭＰ－９のゼラチナーゼ活性を阻害する能力に基づいて同定され得る。
「Ｌｃｎ２」は、Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ－２、Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ Ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｚｉａｔｅｄ Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ（ＮＧＡＬ）、２４ｐ３またはＮｅｕｔｒｏｐｈｉｌ Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ（ＮＬ）としても知られる分泌型糖タンパク質である。Ｌｃｎ２は、ストレスタンパク質としても機能し、先天性免疫反応、分化、腫瘍発生および細胞の生存などの多様な細胞プロセスに関与する。「Ｌｃｎ２アンタゴニスト」に関連して、標的分子である「Ｌｃｎ２」の「生物学的活性」とは、例えば、ＭＭＰ－９を安定化させることによりＭＭＰ－９活性を維持する能力である。Ｌｃｎ２アンタゴニストは、例えば、Ｌｃｎ２を特異的に認識して結合し、ＭＭＰ－９のゼラチナーゼ活性を阻害する能力に基づいて同定され得る。
【0047】
Ｌｃｎ２アンタゴニストは例えば、Ｌｃｎ２を発現した細胞、または、Ｌｃｎ２をコートしたプレートを、試験化合物の存在下および不存在下でインキュベートし、ＭＭＰ－９をさらに加えてインキュベートし、ＭＭＰ－９のゼラチナーゼ活性を測定することによって同定することができる。試験化合物が無い場合と比較して試験化合物が有る場合の方が、ゼラチナーゼ活性が低ければ、その試験化合物はＬｃｎ２アンタゴニストである。
【0048】
「Ｌｃｎ２アンタゴニスト」の例には、天然Ｌｃｎ２ポリペプチド全体もしくは天然Ｌｃｎ２ポリペプチドサブユニットに対する中和抗体、免疫グロブリン定常領域配列と融合したＣＸＣＲ４サブユニットを含む免疫付着因子、小分子、天然Ｌｃｎ２ポリペプチド全体もしくは天然Ｌｃｎ２ポリペプチドサブユニットに結合するアプタマー、天然Ｌｃｎ２ポリペプチド全体もしくはそのサブユニットをコードする遺伝子の翻訳および転写の少なくとも一方を阻害することのできる核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、デコイおよびリボザイム）などが含まれるが、これらに限定されない。
【0049】
ここで、天然Ｌｃｎ２ポリペプチドのアミノ酸配列は、当該分野で既知のデータベースから取得することができる。天然Ｌｃｎ２ポリペプチドのアミノ酸配列としては例えば、
・Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ，ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿０３２５１７、
・Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ，ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿００５５５５
が挙げられる。Ｌｃｎ２には、このような配列を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体およびその断片や、当該配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体およびその断片などが含まれる。
・Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ，ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿０３２５１７、
・Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ，ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿００５５５５
が挙げられる。Ｌｃｎ２には、このような配列を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体およびその断片や、当該配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体およびその断片などが含まれる。
【0050】
天然Ｌｃｎ２ポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列としては例えば、
・Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ ２（Ｌｃｎ２），ｍＲＮＡ； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＭ＿００８４９１、
・Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ ２（Ｌｃｎ２），ｍＲＮＡ； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＭ＿００５５６４
が挙げられる。Ｌｃｎ２アンタゴニストには、
・上記のようなアミノ配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
・上記のようなアミノ配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
・上記のような塩基配列を有する遺伝子、
・上記のような塩基配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有する塩基配列を有する遺伝子
の翻訳および転写の少なくとも一方を阻害することのできる核酸分子などが含まれる。
・Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ ２（Ｌｃｎ２），ｍＲＮＡ； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＭ＿００８４９１、
・Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ ２（Ｌｃｎ２），ｍＲＮＡ； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＭ＿００５５６４
が挙げられる。Ｌｃｎ２アンタゴニストには、
・上記のようなアミノ配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
・上記のようなアミノ配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
・上記のような塩基配列を有する遺伝子、
・上記のような塩基配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有する塩基配列を有する遺伝子
の翻訳および転写の少なくとも一方を阻害することのできる核酸分子などが含まれる。
【0051】
「Ｌｃｎ２アンタゴニスト」には、例えば、抗体および抗体フラグメントならびに低分子化合物が含まれる。Ｌｃｎ２アンタゴニストは、例えば、抗Ｌｃｎ２抗体およびＬｃｎ２阻害剤である。
【0052】
（ＣＤ８８アンタゴニスト）
「ＣＤ８８」は、本発明者らによって、上記Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の表面に高発現することが確認された（図１５Ａ～１５Ｄ）。ＣＤ８８（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ８８）は、Ｃ５ａのＧタンパク質共役型受容体であり、補体成分５ａ受容体1（Ｃ５ＡＲ１）としても既知である。ＣＤ８８は、補体受容体として機能する。「ＣＤ８８アンタゴニスト」に関連して、標的分子である「ＣＤ８８」の「生物学的活性」とは、例えば、炎症反応、肥満、発達および癌を調節する能力である。ＣＤ８８アンタゴニストは、例えば、ＣＤ８８を特異的に認識して結合し、細胞内へのカルシウムイオンの流入、細胞遊走および活性酸素産生を抑制する能力に基づいて同定され得る。ＣＤ８８アンタゴニストは、本発明者らが見出した転移カスケードの上流に存在する、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の表面に発現したＣＤ８８を阻害することによって、当該単球のＭＭＰ－９の産生を誘導する能力を低下させ、本カスケードの下流におけるＭＭＰ－９の活性を間接的に阻害する。ＣＤ８８アンタゴニストの一例として、抗ＣＤ８８抗体は、例えばＡＤＣＣによりＹｍ１＋単球を除去し、ＭＭＰ－９の産生を阻害し得る。
「ＣＤ８８」は、本発明者らによって、上記Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の表面に高発現することが確認された（図１５Ａ～１５Ｄ）。ＣＤ８８（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ８８）は、Ｃ５ａのＧタンパク質共役型受容体であり、補体成分５ａ受容体1（Ｃ５ＡＲ１）としても既知である。ＣＤ８８は、補体受容体として機能する。「ＣＤ８８アンタゴニスト」に関連して、標的分子である「ＣＤ８８」の「生物学的活性」とは、例えば、炎症反応、肥満、発達および癌を調節する能力である。ＣＤ８８アンタゴニストは、例えば、ＣＤ８８を特異的に認識して結合し、細胞内へのカルシウムイオンの流入、細胞遊走および活性酸素産生を抑制する能力に基づいて同定され得る。ＣＤ８８アンタゴニストは、本発明者らが見出した転移カスケードの上流に存在する、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の表面に発現したＣＤ８８を阻害することによって、当該単球のＭＭＰ－９の産生を誘導する能力を低下させ、本カスケードの下流におけるＭＭＰ－９の活性を間接的に阻害する。ＣＤ８８アンタゴニストの一例として、抗ＣＤ８８抗体は、例えばＡＤＣＣによりＹｍ１＋単球を除去し、ＭＭＰ－９の産生を阻害し得る。
【0053】
ＣＤ８８アンタゴニストは例えば、ＣＤ８８を表面に発現した細胞を、試験化合物の存在下および不存在下でインキュベートし、ｆＭＬＰ、ＰＡＦまたはＩＬ－８をさらに加えてインキュベートし、ＣＤ８８を表面に発現した細胞の、細胞内へのカルシウムイオンの流入、細胞遊走および活性酸素産生を測定することによって同定することができる。試験化合物が無い場合と比較して試験化合物が有る場合の方が、細胞内へのカルシウムイオンの流入、細胞遊走および活性酸素産生が低ければ、その試験化合物はＣＤ８８アンタゴニストである。
【0054】
「ＣＤ８８アンタゴニスト」の例には、天然ＣＤ８８ポリペプチド全体もしくは天然ＣＤ８８ポリペプチドサブユニットに対する中和抗体、免疫グロブリン定常領域配列と融合したＣＤ８８サブユニットを含む免疫付着因子、小分子、天然ＣＤ８８ポリペプチド全体もしくは天然ＣＤ８８ポリペプチドサブユニットに結合するアプタマー、天然ＣＤ８８ポリペプチド全体もしくはそのサブユニットをコードする遺伝子の翻訳および転写の少なくとも一方を阻害することのできる核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、デコイおよびリボザイム）などが含まれるが、これらに限定されない。
【0055】
ここで、天然ＣＤ８８ポリペプチドのアミノ酸配列は、当該分野で既知のデータベースから取得することができる。天然ＣＤ８８ポリペプチドのアミノ酸配列としては例えば、
・Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ Ｃ５ａ ａｎａｐｈｙｌａｔｏｘｉｎ ｃｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １，ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿００１１６７０２１、
・Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ Ｃ５ａ ａｎａｐｈｙｌａｔｏｘｉｎ ｃｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １，ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿０３１６０３、
・Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｃ５ａ ａｎａｐｈｙｌａｔｏｘｉｎ ｃｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １ ｉｓｏｆｏｒｍ Ｘ１，ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＸＰ＿００５２５９２４７
が挙げられる。ＣＤ８８アンタゴニストには、このような配列を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体およびその断片や、当該配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体およびその断片などが含まれる。
・Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ Ｃ５ａ ａｎａｐｈｙｌａｔｏｘｉｎ ｃｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １，ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿００１１６７０２１、
・Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ Ｃ５ａ ａｎａｐｈｙｌａｔｏｘｉｎ ｃｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １，ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿０３１６０３、
・Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｃ５ａ ａｎａｐｈｙｌａｔｏｘｉｎ ｃｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １ ｉｓｏｆｏｒｍ Ｘ１，ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＸＰ＿００５２５９２４７
が挙げられる。ＣＤ８８アンタゴニストには、このような配列を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体およびその断片や、当該配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体およびその断片などが含まれる。
【0056】
天然ＣＤ８８ポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列としては例えば、
・Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ５ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １（Ｃ５ａｒ１），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｖａｒｉａｎｔ ２，ｍＲＮＡ； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＭ＿００１１７３５５０、
・Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ５ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １（Ｃ５ａｒ１），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｖａｒｉａｎｔ １，ｍＲＮＡ； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＭ＿００７５７７、
・Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｃ５ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １（Ｃ５ＡＲ１），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｖａｒｉａｎｔ Ｘ１，ｍＲＮＡ； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＸＭ＿００５２５９１９０
が挙げられる。ＣＤ８８アンタゴニストには、
・上記のようなアミノ配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
・上記のようなアミノ配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
・上記のような塩基配列を有する遺伝子、
・上記のような塩基配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有する塩基配列を有する遺伝子
の翻訳および転写の少なくとも一方を阻害することのできる核酸分子などが含まれる。
・Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ５ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １（Ｃ５ａｒ１），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｖａｒｉａｎｔ ２，ｍＲＮＡ； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＭ＿００１１７３５５０、
・Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ５ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １（Ｃ５ａｒ１），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｖａｒｉａｎｔ １，ｍＲＮＡ； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＭ＿００７５７７、
・Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｃ５ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １（Ｃ５ＡＲ１），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｖａｒｉａｎｔ Ｘ１，ｍＲＮＡ； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＸＭ＿００５２５９１９０
が挙げられる。ＣＤ８８アンタゴニストには、
・上記のようなアミノ配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
・上記のようなアミノ配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
・上記のような塩基配列を有する遺伝子、
・上記のような塩基配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有する塩基配列を有する遺伝子
の翻訳および転写の少なくとも一方を阻害することのできる核酸分子などが含まれる。
【0057】
「ＣＤ８８アンタゴニスト」には、例えば、抗体および抗体フラグメントならびに低分子化合物が含まれる。ＣＤ８８アンタゴニストは、例えば、抗ＣＤ８８抗体およびＣＤ８８阻害剤である。公知のＣＤ８８阻害剤として、例えば、Ａｖａｃｏｐａｎ（ＣＣＸ１６８）、ＰＭＸ２０５およびＰＭＸ５３が挙げられる。
【0058】
（ＣＤ１５７アンタゴニスト）
「ＣＤ１５７」は、ＣＤ８８と同様、本発明者らによって、上記Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の表面に高発現することが確認された（図１５Ａ～１５Ｄ）。ＣＤ１５７は、糖鎖に富むグリコシル－ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合型膜タンパクである。「ＣＤ１５７アンタゴニスト」に関連して、標的分子である「ＣＤ１５７」の「生物学的活性」とは、例えば、β－ＮＡＤ＋をＡＤＰリボースに変換する能力、ならびに、細胞の生存、分化および接着を調節する能力である。ＣＤ１５７アンタゴニストは、例えば、ＣＤ１５７を特異的に認識して結合し、免疫系細胞の活性化によるＡＤＣＣ活性を誘導する能力に基づいて同定され得る。ＣＤ１５７アンタゴニストは、本発明者らが見出した転移カスケードの上流に存在する、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の表面に高発現したＣＤ１５７を阻害することによって、当該単球のＭＭＰ－９の産生を誘導する能力を低下させ、本カスケードの下流におけるＭＭＰ－９の活性を間接的に阻害する。ＣＤ１５７アンタゴニストの一例として、抗ＣＤ１５７抗体は、例えばＡＤＣＣによりＹｍ１＋単球を除去し、ＭＭＰ－９の産生を阻害し得る。
「ＣＤ１５７」は、ＣＤ８８と同様、本発明者らによって、上記Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の表面に高発現することが確認された（図１５Ａ～１５Ｄ）。ＣＤ１５７は、糖鎖に富むグリコシル－ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合型膜タンパクである。「ＣＤ１５７アンタゴニスト」に関連して、標的分子である「ＣＤ１５７」の「生物学的活性」とは、例えば、β－ＮＡＤ＋をＡＤＰリボースに変換する能力、ならびに、細胞の生存、分化および接着を調節する能力である。ＣＤ１５７アンタゴニストは、例えば、ＣＤ１５７を特異的に認識して結合し、免疫系細胞の活性化によるＡＤＣＣ活性を誘導する能力に基づいて同定され得る。ＣＤ１５７アンタゴニストは、本発明者らが見出した転移カスケードの上流に存在する、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の表面に高発現したＣＤ１５７を阻害することによって、当該単球のＭＭＰ－９の産生を誘導する能力を低下させ、本カスケードの下流におけるＭＭＰ－９の活性を間接的に阻害する。ＣＤ１５７アンタゴニストの一例として、抗ＣＤ１５７抗体は、例えばＡＤＣＣによりＹｍ１＋単球を除去し、ＭＭＰ－９の産生を阻害し得る。
【0059】
ＣＤ１５７アンタゴニストは例えば、ＣＤ１５７を表面に発現した細胞を、試験化合物の存在下および不存在下でインキュベートし、天然ＣＤ１５７ポリペプチドサブユニットに対する抗体およびＮＫ細胞をさらに加えてインキュベートし、ＣＤ１５７を表面に発現した細胞に対するＮＫ細胞のＡＤＣＣ活性を測定することによって同定することができる。試験化合物が無い場合と比較して試験化合物が有る場合の方が、ＡＤＣＣ活性が低ければ、その試験化合物はＣＤ１５７アンタゴニストである。
【0060】
「ＣＤ１５７アンタゴニスト」の例には、天然ＣＤ１５７ポリペプチド全体もしくは天然ＣＤ１５７ポリペプチドサブユニットに対する中和抗体、免疫グロブリン定常領域配列と融合したＣＤ１５７サブユニットを含む免疫付着因子、小分子、天然ＣＤ１５７ポリペプチド全体もしくは天然ＣＤ８８ＣＤ１５７ポリペプチドサブユニットに結合するアプタマー、天然ＣＤ１５７ポリペプチド全体もしくはそのサブユニットをコードする遺伝子の翻訳および転写の少なくとも一方を阻害することのできる核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、デコイおよびリボザイム）などが含まれるが、これらに限定されない。
【0061】
ここで、天然ＣＤ１５７ポリペプチドのアミノ酸配列は、当該分野で既知のデータベースから取得することができる。天然ＣＤ１５７ポリペプチドのアミノ酸配列としては例えば、
・Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ／ｃｙｃｌｉｃ ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ２ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ，ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿０３３８９３、
・Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ／ｃｙｃｌｉｃ ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ２ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ，ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿００４３２５
が挙げられる。ＣＤ１５７アンタゴニストには、このような配列を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体およびその断片や、当該配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体およびその断片などが含まれる。
・Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ／ｃｙｃｌｉｃ ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ２ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ，ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿０３３８９３、
・Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ／ｃｙｃｌｉｃ ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ２ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ，ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿００４３２５
が挙げられる。ＣＤ１５７アンタゴニストには、このような配列を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体およびその断片や、当該配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体およびその断片などが含まれる。
【0062】
天然ＣＤ１５７ポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列としては例えば、
・Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ １（Ｂｓｔ１），ｍＲＮＡ； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＭ＿００９７６３、
・Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ １（ＢＳＴ１），ｍＲＮＡ； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＭ＿００４３３４
が挙げられる。ＣＤ１５７アンタゴニストには、
・上記のようなアミノ配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
・上記のようなアミノ配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
・上記のような塩基配列を有する遺伝子、
・上記のような塩基配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有する塩基配列を有する遺伝子
の翻訳および転写の少なくとも一方を阻害することのできる核酸分子などが含まれる。
・Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ １（Ｂｓｔ１），ｍＲＮＡ； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＭ＿００９７６３、
・Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ １（ＢＳＴ１），ｍＲＮＡ； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＭ＿００４３３４
が挙げられる。ＣＤ１５７アンタゴニストには、
・上記のようなアミノ配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
・上記のようなアミノ配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
・上記のような塩基配列を有する遺伝子、
・上記のような塩基配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有する塩基配列を有する遺伝子
の翻訳および転写の少なくとも一方を阻害することのできる核酸分子などが含まれる。
【0063】
「ＣＤ１５７アンタゴニスト」には、例えば、抗体および抗体フラグメントならびに低分子化合物が含まれる。ＣＤ１５７アンタゴニストは、例えば、抗ＣＤ１５７抗体およびＣＤ１５７阻害剤である。公知のＣＤ１５７阻害剤として、例えば、ＭＥＮ１１１２（メナリニ社製）が挙げられる。
【0064】
（ＣＸＣＲ４アンタゴニスト）
「ＣＸＣＲ４」は、ＣＸＣモチーフ型ケモカイン受容体４であり、ＦｕｓｉｎまたはＣＤ１８４としても既知である。ＣＸＣＲ４は、細胞膜を７回貫通するＧタンパク共役受容体（ＧＰＣＲ）である。ＣＸＣＲ４の生理的リガンドとしては、ＣＸＣケモカインの一種であり、単球およびリンパ球の遊走を誘導するＳｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ－１（ＳＤＦ－１）が挙げられる。ＣＸＣＲ４は、好中球、単球、樹状細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞および血小板に発現する。
「ＣＸＣＲ４」は、ＣＸＣモチーフ型ケモカイン受容体４であり、ＦｕｓｉｎまたはＣＤ１８４としても既知である。ＣＸＣＲ４は、細胞膜を７回貫通するＧタンパク共役受容体（ＧＰＣＲ）である。ＣＸＣＲ４の生理的リガンドとしては、ＣＸＣケモカインの一種であり、単球およびリンパ球の遊走を誘導するＳｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ－１（ＳＤＦ－１）が挙げられる。ＣＸＣＲ４は、好中球、単球、樹状細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞および血小板に発現する。
【0065】
「ＣＸＣＲ４アンタゴニスト」に関連して、標的分子である「ＣＸＣＲ４」の「生物学的活性」とは、例えば、ＳＤＦ－１と結合する能力である。ＣＸＣＲ４アンタゴニストは、例えば、ＣＸＣＲ４を特異的に認識して結合し、免疫系細胞の活性化によるＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性およびＡＤＣＰ活性を誘導する能力、ならびに、ＳＤＦ－１との結合によって誘導される単球およびリンパ球の遊走を阻害または遮断する能力に基づいて同定され得る。
【0066】
ＣＸＣＲ４アンタゴニストは例えば、ＣＸＣＲ４を表面に発現した細胞、または、ＣＸＣＲ４タンパク質をコートしたプレートを、試験化合物の存在下および不存在下でインキュベートし、ＳＤＦ－１（ＣＸＣＬ１２）をさらに加えてインキュベートし、ＣＸＣＲ４を表面に発現した細胞およびＣＸＣＲ４タンパク質への、ＳＤＦ－１（ＣＸＣＬ１２）の結合を測定することによって同定することができる。試験化合物が無い場合と比較して試験化合物が有る場合の方が、ＳＤＦ－１（ＣＸＣＬ１２）の結合レベルが低ければ、その試験化合物はＣＸＣＲ４アンタゴニストである。
【0067】
「ＣＸＣＲ４アンタゴニスト」の例には、天然ＣＸＣＲ４ポリペプチド全体もしくは天然ＣＸＣＲ４ポリペプチドサブユニットに対する中和抗体、免疫グロブリン定常領域配列と融合したＣＸＣＲ４サブユニットを含む免疫付着因子、小分子、天然ＣＸＣＲ４ポリペプチド全体もしくは天然ＣＸＣＲ４ポリペプチドサブユニットに結合するアプタマー、天然ＣＸＣＲ４ポリペプチド全体もしくはそのサブユニットをコードする遺伝子の翻訳および転写の少なくとも一方を阻害することのできる核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、デコイおよびリボザイム）などが含まれるが、これらに限定されない。
【0068】
ここで、天然ＣＸＣＲ４ポリペプチドのアミノ酸配列は、当該分野で既知のデータベースから取得することができる。天然ＣＸＣＲ４ポリペプチドのアミノ酸配列としては例えば、
・Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ Ｃ－Ｘ－Ｃ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ ４ ｉｓｏｆｏｒｍ １，ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿０３４０４１．２、
・Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ Ｃ－Ｘ－Ｃ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ ４ ｉｓｏｆｏｒｍ ２，ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿００１３４３４３８．１、
・Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓＣ－Ｘ－Ｃ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ ４ ｉｓｏｆｏｒｍ ａ，ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿００１００８５４０、
・Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｃ－Ｘ－Ｃ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ ４ ｉｓｏｆｏｒｍ ｂ，ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿００３４５８、
・Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｃ－Ｘ－Ｃ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ ４ ｉｓｏｆｏｒｍ ｃ，ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿００１３３４９８５、
・Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｃ－Ｘ－Ｃ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ ４ ｉｓｏｆｏｒｍ ｄ，ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿００１３３４９８８、
・Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｃ－Ｘ－Ｃ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ ４ ｉｓｏｆｏｒｍ ｅ，ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿００１３３４９８９
が挙げられる。したがって、ＣＸＣＲ４アンタゴニストには、このような配列を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体およびその断片や、当該配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体およびその断片などが含まれる。
・Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ Ｃ－Ｘ－Ｃ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ ４ ｉｓｏｆｏｒｍ １，ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿０３４０４１．２、
・Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ Ｃ－Ｘ－Ｃ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ ４ ｉｓｏｆｏｒｍ ２，ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿００１３４３４３８．１、
・Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓＣ－Ｘ－Ｃ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ ４ ｉｓｏｆｏｒｍ ａ，ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿００１００８５４０、
・Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｃ－Ｘ－Ｃ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ ４ ｉｓｏｆｏｒｍ ｂ，ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿００３４５８、
・Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｃ－Ｘ－Ｃ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ ４ ｉｓｏｆｏｒｍ ｃ，ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿００１３３４９８５、
・Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｃ－Ｘ－Ｃ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ ４ ｉｓｏｆｏｒｍ ｄ，ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿００１３３４９８８、
・Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｃ－Ｘ－Ｃ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ ４ ｉｓｏｆｏｒｍ ｅ，ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿００１３３４９８９
が挙げられる。したがって、ＣＸＣＲ４アンタゴニストには、このような配列を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体およびその断片や、当該配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体およびその断片などが含まれる。
【0069】
天然ＣＸＣＲ４ポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列としては例えば、
・Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ－Ｘ－Ｃ ｍｏｔｉｆ） ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４（Ｃｘｃｒ４），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｖａｒｉａｎｔ １，ｍＲＮＡ； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＭ＿００９９１１、
・Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ－Ｘ－Ｃ ｍｏｔｉｆ） ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４（Ｃｘｃｒ４），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｖａｒｉａｎｔ ２，ｍＲＮＡ； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＭ＿００１３５６５０９、
・Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｃ－Ｘ－Ｃ ｍｏｔｉｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＸＣＲ４），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｖａｒｉａｎｔ １，ｍＲＮＡ； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＭ＿００１００８５４０、
・Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｃ－Ｘ－Ｃ ｍｏｔｉｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＸＣＲ４），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｖａｒｉａｎｔ ２，ｍＲＮＡ； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＭ＿００３４６７、
・Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｃ－Ｘ－Ｃ ｍｏｔｉｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＸＣＲ４），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｖａｒｉａｎｔ ３，ｍＲＮＡ； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＭ＿００１３４８０５６、
・Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｃ－Ｘ－Ｃ ｍｏｔｉｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＸＣＲ４），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｖａｒｉａｎｔ ４，ｍＲＮＡ； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＭ＿００１３４８０５９、
・Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｃ－Ｘ－Ｃ ｍｏｔｉｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＸＣＲ４），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｖａｒｉａｎｔ ５，ｍＲＮＡ； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＭ＿００１３４８０６０
が挙げられる。ＣＸＣＲ４アンタゴニストには、
・上記のようなアミノ配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
・上記のようなアミノ配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
・上記のような塩基配列を有する遺伝子、
・上記のような塩基配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有する塩基配列を有する遺伝子
の翻訳および転写の少なくとも一方を阻害することのできる核酸分子などが含まれる。
・Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ－Ｘ－Ｃ ｍｏｔｉｆ） ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４（Ｃｘｃｒ４），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｖａｒｉａｎｔ １，ｍＲＮＡ； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＭ＿００９９１１、
・Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ－Ｘ－Ｃ ｍｏｔｉｆ） ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４（Ｃｘｃｒ４），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｖａｒｉａｎｔ ２，ｍＲＮＡ； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＭ＿００１３５６５０９、
・Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｃ－Ｘ－Ｃ ｍｏｔｉｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＸＣＲ４），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｖａｒｉａｎｔ １，ｍＲＮＡ； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＭ＿００１００８５４０、
・Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｃ－Ｘ－Ｃ ｍｏｔｉｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＸＣＲ４），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｖａｒｉａｎｔ ２，ｍＲＮＡ； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＭ＿００３４６７、
・Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｃ－Ｘ－Ｃ ｍｏｔｉｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＸＣＲ４），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｖａｒｉａｎｔ ３，ｍＲＮＡ； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＭ＿００１３４８０５６、
・Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｃ－Ｘ－Ｃ ｍｏｔｉｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＸＣＲ４），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｖａｒｉａｎｔ ４，ｍＲＮＡ； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＭ＿００１３４８０５９、
・Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｃ－Ｘ－Ｃ ｍｏｔｉｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＸＣＲ４），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｖａｒｉａｎｔ ５，ｍＲＮＡ； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＭ＿００１３４８０６０
が挙げられる。ＣＸＣＲ４アンタゴニストには、
・上記のようなアミノ配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
・上記のようなアミノ配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
・上記のような塩基配列を有する遺伝子、
・上記のような塩基配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有する塩基配列を有する遺伝子
の翻訳および転写の少なくとも一方を阻害することのできる核酸分子などが含まれる。
【0070】
「ＣＸＣＲ４アンタゴニスト」には、例えば、抗体および抗体フラグメントならびに低分子化合物が含まれる。ＣＸＣＲ４アンタゴニストは、例えば、抗ＣＸＣＲ４抗体およびＣＸＣＲ４阻害剤である。公知のＣＸＣＲ４阻害剤として、例えば、オクタヒドロクロライド（ＣＡＳ：１５５１４８－３１－５、Ｐｌｅｘａｆｏｒ、ＡＭＤ３１００）が挙げられる。
【0071】
（ＭＭＰ－９アンタゴニスト）
ＭＭＰ－９は、細胞増殖因子の細胞外ドメイン分泌を制御するマトリックスメタロプロテナーゼである。「ＭＭＰ－９アンタゴニスト」に関連して、標的分子である「ＭＭＰ－９」の「生物学的活性」とは、例えば、細胞外マトリックスの構成成分を分解する能力である。ＭＭＰ－９アンタゴニストは、例えば、ＭＭＰ－９を特異的に認識して結合し、ＭＭＰ－９のゼラチナーゼ活性を抑制する能力に基づいて同定され得る。
ＭＭＰ－９は、細胞増殖因子の細胞外ドメイン分泌を制御するマトリックスメタロプロテナーゼである。「ＭＭＰ－９アンタゴニスト」に関連して、標的分子である「ＭＭＰ－９」の「生物学的活性」とは、例えば、細胞外マトリックスの構成成分を分解する能力である。ＭＭＰ－９アンタゴニストは、例えば、ＭＭＰ－９を特異的に認識して結合し、ＭＭＰ－９のゼラチナーゼ活性を抑制する能力に基づいて同定され得る。
【0072】
ＭＭＰ－９アンタゴニストは例えば、ＭＭＰ－９タンパク質をコートしたプレートを、試験化合物の存在下および不存在下でインキュベートし、ゼラチナーゼ活性を測定することによって同定することができる。試験化合物が無い場合と比較して試験化合物が有る場合の方が、ゼラチナーゼ活性レベルが低ければ、その試験化合物はＭＭＰ－９アンタゴニストである。
【0073】
「ＭＭＰ－９アンタゴニスト」の例には、天然ＭＭＰ－９ポリペプチド全体もしくは天然ＭＭＰ－９ポリペプチドサブユニットに対する中和抗体、免疫グロブリン定常領域配列と融合したＭＭＰ－９サブユニットを含む免疫付着因子、小分子、天然ＭＭＰ－９ポリペプチド全体もしくは天然ＭＭＰ－９ポリペプチドサブユニットに結合するアプタマー、天然ＭＭＰ－９ポリペプチド全体もしくはそのサブユニットをコードする遺伝子の翻訳および転写の少なくとも一方を阻害することのできる核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、デコイおよびリボザイム）などが含まれるが、これらに限定されない。
【0074】
ここで、天然ＭＭＰ－９ポリペプチドのアミノ酸配列は、当該分野で既知のデータベースから取得することができる。天然ＭＭＰ－９ポリペプチドのアミノ酸配列としては例えば、
・Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－９ ｐｒｅｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿０３８６２７、
・Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－９ ｐｒｅｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿００４９８５
が挙げられる。ＭＭＰ－９アンタゴニストには、このような配列を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体およびその断片や、当該配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体およびその断片などが含まれる。
・Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－９ ｐｒｅｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿０３８６２７、
・Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－９ ｐｒｅｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿００４９８５
が挙げられる。ＭＭＰ－９アンタゴニストには、このような配列を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体およびその断片や、当該配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体およびその断片などが含まれる。
【0075】
天然ＭＭＰ－９ポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列としては例えば、
・Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ９（Ｍｍｐ９），ｍＲＮＡ； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＭ＿０１３５９９、
・Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ９（Ｍｍｐ９），ｍＲＮＡ； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＭ＿００４９９４
が挙げられる。ＭＭＰ－９アンタゴニストには、
・上記のようなアミノ配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
・上記のようなアミノ配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
・上記のような塩基配列を有する遺伝子、
・上記のような塩基配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有する塩基配列を有する遺伝子
の翻訳および転写の少なくとも一方を阻害することのできる核酸分子などが含まれる。
・Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ９（Ｍｍｐ９），ｍＲＮＡ； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＭ＿０１３５９９、
・Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ９（Ｍｍｐ９），ｍＲＮＡ； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＭ＿００４９９４
が挙げられる。ＭＭＰ－９アンタゴニストには、
・上記のようなアミノ配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
・上記のようなアミノ配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
・上記のような塩基配列を有する遺伝子、
・上記のような塩基配列と一定の配列同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の配列同一性）を有する塩基配列を有する遺伝子
の翻訳および転写の少なくとも一方を阻害することのできる核酸分子などが含まれる。
【0076】
「ＭＭＰ－９アンタゴニスト」には、例えば、抗体および抗体フラグメントならびに低分子化合物が含まれる。ＭＭＰ－９アンタゴニストは、例えば、抗ＭＭＰ－９抗体およびＭＭＰ－９阻害剤である。公知のＭＭＰ－９阻害剤として、例えば、ＳＢ－３ＣＴ（ＣＡＳ：２９２６０５－１４－２）、ＡＧ－Ｌ－６６０８５（ＣＡＳ １１７７７４９－５８－４）およびレプトマイシンＢ（ＬＭＢ）（ＣＡＳ：８７０８１－３５－４）が挙げられる。
【0077】
本明細書において、「抗体」の語は最も広い意味で使用され、特にモノクローナル抗体（例えば中和抗体および作動性抗体）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）および抗体フラグメントが含まれる。目的とする生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体には、キメラ抗体および当該抗体のフラグメントが含まれる。キメラ抗体は、重鎖あるいは軽鎖もしくはその両方の一部分が、特定の種由来の抗体、あるいは特定の抗体クラスあるいはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるかまたは相同であり、残りの鎖は別の種由来の抗体ならびにこのような抗体のフラグメント、あるいは別の抗体クラスあるいはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるもしくは相同であるものである（米国特許第４，８１６，５６７号明細書； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５、１９８４）。さらにモノクローナル抗体には、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含む、「ヒト化」抗体またはフラグメントが含まれ、当該フラグメントとしては、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、その他抗体の抗原結合部分配列が挙げられるがこれらに限定されない。一態様において、ヒト化抗体は、受容者のＣＤＲ由来の残基が、所望の特異性、親和性、能力を持つ非ヒト種（供与体抗体）のＣＤＲ由来の残基に置き換わっているヒト免疫グロブリン（受容者抗体）であってもよい。非ヒト種の例には、マウスもしくはラット、ウサギ等がある。一例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖ、ＦＲ残基は、非ヒトの対応する残基に置換されている。ヒト化抗体は受容者抗体に導入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列にもみられない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は、抗体の性能を向上させる目的で行われる。一般に、ヒト化抗体は実質的にあらゆる、１つ以上、典型的には２つの可変ドメインを含み、ここで、全てのもしくは実質的に全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に相当し、且つ全ての、もしくは実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である。また最適なヒト化抗体は免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含み、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域を含む。ヒト化抗体には霊長類化抗体が含まれてもよい。詳細は、当該分野で公知の文献、例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２－５２５（１９８６）およびＲｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３－３２９（１９９８）などに記載される。
【0078】
「抗体フラグメント」には、全長抗体の一部分、一般的にはその抗原結合領域または可変領域が含まれる。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片；単一鎖抗体分子；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。
【0079】
「モノクローナル抗体」の語は、実質的に均質な抗体、すなわち母集団を含むそれぞれの抗体がわずかに存在してもよい天然に生じ得る変異を除いて同等であるような母集団から得られる抗体を指す。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位を指向する。更に、典型的には異なる決定基（エピトープ）に向けられた異なる抗体を含む慣用の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に向けられている。
【0080】
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」の語は、配列特異的な方法で標的遺伝子の転写または翻訳、もしくはその両方を阻害することができる核酸分子として定義される。「アンチセンス」の語は、その核酸が標的遺伝子のコーディング（「センス」）遺伝子配列に対して相補的であることを指す。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ワトソン－クリック塩基結合によって逆平行方向に新生ｍＲＮＡとハイブリダイズする。標的ｍＲＮＡ鋳型と結合することによって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、コードされているタンパク質の翻訳の達成を阻害する。この語には特に「リボザイム」と呼ばれるアンチセンス薬剤が含まれ、これは自然自己スプライシング活性を持つ配列を加えることによって標的ＲＮＡの触媒切断を誘導するように設計されたものである（例えば、Ｗ ａｒｚｏｃｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ ２４：２６７－２８１［１９９７］参照）。
【0081】
一態様において、ＭＭＰ－９の活性を阻害する化合物は、抗Ｙｍ１抗体、Ｙｍ１阻害剤、抗Ｌｃｎ２抗体、Ｌｃｎ２阻害剤、抗ＣＸＣＲ４抗体、ＣＸＣＲ４阻害剤、抗ＭＭＰ－９抗体、ＭＭＰ－９阻害剤、抗ＣＤ８８抗体、ＣＤ８８阻害剤、抗ＣＤ１５７抗体およびＣＤ１５７阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つである。好ましい態様において、ＭＭＰ－９の活性を阻害する化合物は、抗Ｌｃｎ２抗体、Ｌｃｎ２阻害剤、抗ＣＸＣＲ４抗体、ＣＸＣＲ４阻害剤、抗ＭＭＰ－９抗体、ＭＭＰ－９阻害剤、抗ＣＤ８８抗体、ＣＤ８８阻害剤、抗ＣＤ１５７抗体およびＣＤ１５７阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つである。
【0082】
好ましい態様において、がん転移が、急性炎症または原発腫瘍に対する治療的介入によって生じたがん転移である。ここで、原発腫瘍に対する治療的介入は、例えば、外科的切除、化学療法および放射線療法からなる群より選択され、好ましくは、外科的切除、より好ましくは、原発腫瘍の切除である。
【0083】
一態様において、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球を有する対象は、がん、炎症性疾患および自己免疫疾患からなる群より選択される少なくとも１つに罹患している。別の一態様において、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球を有する対象は、がんに罹患している。
【0084】
本発明に係る医薬組成物には、典型的には、製薬上に許容される添加剤、例えば、当該分野で既知の賦形剤、結合剤、滑沢剤、溶剤、希釈剤、安定化剤、等張化剤などを含んでよい。賦形剤としては、例えば澱粉、乳糖、メチルセルロース、結晶セルロース、合成珪酸アルミニウムなど、結合剤としては、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなど、滑沢剤としては、例えばタルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムなど、等張化剤としては塩化ナトリウム、ブドウ糖、グリセロール、マンニトールなどが用いられる。
【0085】
本発明に係る医薬組成物は、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、注射剤、液剤、坐剤などに製剤化され、例えば、経口、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内により投与することができる。本発明に係る医薬組成物の投与量は、対象の年齢、体重、病状などによって異なる。
【0086】
本発明にかかる組成物は、更なる医薬組成物と組み合わせた、組合せ剤として用いられてもよい。組合せ剤に関し、それぞれの医薬組成物における成分（すなわち、第１の有効成分および第２の有効成分）は、一緒に、順々にまたは個別に、１つの組み合わせ単位剤形または個別の２つの単位剤形で投与されてもよい。治療有効量の、本発明にかかる組合せ剤の各有効成分が、同時に、個別に、または、任意の順序で、順次にもしくは連続して投与されてもよい。組合せ剤において、第１の有効成分および前記第２の有効成分が複数のユニットで存在してもよい。組合せ剤には、例えば、それぞれの有効成分と使用指示とを含むキットも含まれる。
【0087】
本発明の第２の側面は、ＭＭＰ－９活性化経路を阻害する組成物に関し、該ＭＭＰ－９活性化経路は、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球、ＣＸＣＲ４およびＭＭＰ－９を含み、前記組成物は、ＭＭＰ－９の活性を阻害する化合物を含む。好ましい態様において、前記ＭＭＰ－９活性化経路は、Ｌｃｎ２、ＣＤ８８およびＣＤ１５７から選択される少なくとも１つをさらに含む。
【0088】
本発明の第３の側面は、がん転移のリスクの評価方法に関し、当該方法は、
（ｉ）治療的介入前の対象の末梢血サンプル中の白血球に対するＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の割合Ｒ１を測定すること、
（ｉｉ）治療的介入後の前記対象の末梢血サンプル中の白血球に対するＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の割合Ｒ２を測定すること、
（ｉｉｉ）前記測定した割合Ｒ１と、前記測定した割合Ｒ２とを比較すること
を含む、がん転移のリスクの評価方法を含む。一態様において、工程（ｉｉｉ）における比較において、割合Ｒ２が割合Ｒ１よりも増加している場合、がん転移の可能性が存在すると同定する。
（ｉ）治療的介入前の対象の末梢血サンプル中の白血球に対するＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の割合Ｒ１を測定すること、
（ｉｉ）治療的介入後の前記対象の末梢血サンプル中の白血球に対するＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の割合Ｒ２を測定すること、
（ｉｉｉ）前記測定した割合Ｒ１と、前記測定した割合Ｒ２とを比較すること
を含む、がん転移のリスクの評価方法を含む。一態様において、工程（ｉｉｉ）における比較において、割合Ｒ２が割合Ｒ１よりも増加している場合、がん転移の可能性が存在すると同定する。
【0089】
本明細書において、がん転移のリスクの評価には、例えば、がん転移の可能性の評価、がん転移のリスクの予測、および、がん転移の可能性の予測と同義に使用される。
【0090】
前記（ｉ）および／または（ｉｉ）における測定は、典型的には、フローサイトメトリーによって行われる。好ましい態様において、前記（ｉ）および（ｉｉ）の双方における測定が、フローサイトメトリーによって行われる。
【0091】
上記がん転移のリスクの評価方法は、対象におけるがんの予後の観察に使用することができる。
【0092】
本発明の別の側面は、がん転移の可能性を予測するためのキットに関する。当該キットは、がん転移の可能性を評価または予測するためのキットである。本キットは、例えば、抗Ｌｃｎ２抗体、抗ＣＤ８８抗体、抗ＣＤ１５７抗体、抗ＣＸＣＲ４抗体および抗ＭＭＰ－９抗体から選択される少なくとも１つを含む。当該キットを使用する場合、対象の末梢血サンプル中の白血球に対するＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の割合を検出することができる。好ましくは、治療的介入前の対象の末梢血サンプル中の白血球に対するＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の割合Ｒ１と、治療的介入後の前記対象の末梢血サンプル中の白血球に対するＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の割合Ｒ２とを比較することを含んでよい。
【0093】
本発明のさらに別の側面は、ＭＭＰ－９を阻害する化合物を含む組成物に関する。当該組成物において、ＭＭＰ－９を阻害する化合物は、抗Ｌｃｎ２抗体、Ｌｃｎ２阻害剤、抗ＣＤ８８抗体、ＣＤ８８阻害剤、抗ＣＤ１５７抗体、ＣＤ１５７阻害剤、抗ＣＸＣＲ４抗体、ＣＸＣＲ４阻害剤、抗ＭＭＰ－９抗体およびＭＭＰ－９阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つである。当該組成物において、ＭＭＰ－９を阻害する化合物は、複数を組み合わせて含んでもよい。かかる組成物は、例えば、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の検出に使用されてもよい。
【0094】
以上、本発明を実施するための形態を例示したが、上記実施形態はあくまでも例として示されるものであり、発明の範囲を限定することを意図するものではない。上記実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置換、変更を行うことができる。以下、更なる説明の目的として実施例を記載するが、本発明は当該実施例に限定されるものではない。
【実施例0095】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【0096】
＜方法＞
（マウス）
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、ＣＬＥＡ Ｊａｐａｎ，Ｉｎｃ．ＣＤ２０４－ＤＴＲノックインマウス（参考文献３２）、Ｙｍ１－ＤＴＲノックインマウス、Ｙｍ１－Ｖｅｎｕｓマウス、およびＬｃｎ２－／－マウスから得た（参考文献２２および４０）。ここに記載したマウスを用いた実験はすべて、東京薬科大学生命科学動物使用委員会（Ｌ１８－２２、Ｌ１８－２３、Ｌ１９－２０、Ｌ１９－２１、Ｌ２０－１７およびＬ２０－１８）の承認を受け、適用されるガイドラインおよび規則に従って実施した。
（マウス）
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、ＣＬＥＡ Ｊａｐａｎ，Ｉｎｃ．ＣＤ２０４－ＤＴＲノックインマウス（参考文献３２）、Ｙｍ１－ＤＴＲノックインマウス、Ｙｍ１－Ｖｅｎｕｓマウス、およびＬｃｎ２－／－マウスから得た（参考文献２２および４０）。ここに記載したマウスを用いた実験はすべて、東京薬科大学生命科学動物使用委員会（Ｌ１８－２２、Ｌ１８－２３、Ｌ１９－２０、Ｌ１９－２１、Ｌ２０－１７およびＬ２０－１８）の承認を受け、適用されるガイドラインおよび規則に従って実施した。
【0097】
（試薬）
炎症の誘発には、リポ多糖類（ＬＰＳ； Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｏ１１１：Ｂ４)（Ｓｉｇｍａ)、ＣｐＧモチーフを含む合成オリゴヌクレオチドであるＣｐＧ－ＯＤＮ（ＯＤＮ１６６８; Ｈｏｋｋａｉｄｏ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｃｉｅｎｃｅ)、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた。単球および／または好中球の枯渇には、抗Ｇｒ－１（クローンＲＢ６‐８Ｃ５、自家精製）または抗Ｌｙ６Ｇ（クローン１Ａ８; ＢｉｏＸＣｅｌｌ)を用いた。ＭＭＰ－９活性の阻害にはＳＢ－３ＣＴ（東京化学工業）を、ＣＸＣＲ４の阻害にはＡＭＤ３１００（シグマ）を用いた。た。ジフテリア毒素（ＤＴ）はシグマから購入した。血清中のＩＬ－６およびＴＮＦ－α濃度の検出のために、ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ（商標）標準セットをＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社から購入した。
炎症の誘発には、リポ多糖類（ＬＰＳ； Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｏ１１１：Ｂ４)（Ｓｉｇｍａ)、ＣｐＧモチーフを含む合成オリゴヌクレオチドであるＣｐＧ－ＯＤＮ（ＯＤＮ１６６８; Ｈｏｋｋａｉｄｏ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｃｉｅｎｃｅ)、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた。単球および／または好中球の枯渇には、抗Ｇｒ－１（クローンＲＢ６‐８Ｃ５、自家精製）または抗Ｌｙ６Ｇ（クローン１Ａ８; ＢｉｏＸＣｅｌｌ)を用いた。ＭＭＰ－９活性の阻害にはＳＢ－３ＣＴ（東京化学工業）を、ＣＸＣＲ４の阻害にはＡＭＤ３１００（シグマ）を用いた。た。ジフテリア毒素（ＤＴ）はシグマから購入した。血清中のＩＬ－６およびＴＮＦ－α濃度の検出のために、ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ（商標）標準セットをＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社から購入した。
【0098】
細胞表面マーカー発現の解析には、以下のＡｂｓを用いた：抗ＣＤ１１ｂ－ＰＥ（クローンＭ１／７０）、抗ＣＤ６２Ｌ－ＰＥ（クローンＭＥＬ－１４）、抗Ｆ４／８０－ＰＥ（クローンＲＭ８）、抗Ｃ５ａＲ－ＰＥ（クローン２０／７０）、抗ＭＨＣ－ＩＩ－ＰＥ（クローンＭ５．１１４．１５．２）、抗ＶＣＡＭ１－ＰＥ（クローン４２９（ＭＶＣＡＭ．Ａ））、抗Ｌｙ６Ｇ－ＰＥ（クローン１Ａ８）、抗ＣＸＣＲ４－ＡＰＣ（Ｌ２７６Ｆ１２）、および抗Ｔｒｅｍｌ４－ＰＥ（クローン１６Ｅ５）。抗ＰＤ－Ｌ１-ＰＥ（クローンＭＩＨ５）はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。抗ＣＤ２０４－ＰＥ（クローンＲＥＡ１４８）はＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社から購入した。抗ＣＸＣＲ２－ＡＰＣ（クローン２４２２１６）および抗ＣＣＲ２－ＡＰＣ（クローン４７５３０１Ｒ）は、Ｒ＆Ｄシステムズ社から購入した。抗ＣＤ１３１－ＰＥ（クローンＪＯＲＯ５０）は、ＢＤバイオサイエンスから購入した。
【0099】
（細胞株）
マウスメラノーマ細胞株Ｂ１６Ｆ１０（理研セルバンク、茨城、日本）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１００単位／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地で、５％ＣＯ２加湿培養器中、３７℃で維持した。
マウスメラノーマ細胞株Ｂ１６Ｆ１０（理研セルバンク、茨城、日本）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１００単位／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地で、５％ＣＯ２加湿培養器中、３７℃で維持した。
【0100】
（細胞の調製）
ＢＭ単球は、セルソーターまたはＭｏｎｏｃｙｔｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ (＃１３０－１００－６２９ Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）により単離した。セルソーターを用いたＢＭ単球単離のために、ＷＴ－又はＹｍ１－Ｖｅｎｕｓマウス由来のＢＭ細胞を抗ＣＤ１６／３２（クローン９３）とインキュベートした後、ビオチン化抗－Ｌｉｎ (ＣＤ４（クローンＧＫ１．５）、ＣＤ８（クローン５３－６．７）、Ｂ２２０（ＲＡ３－６Ｂ２）、ＮＫ１．１（クローンＰＫ１３６）、Ｌｙ６Ｇ（クローン１Ａ８）及びＴｅｒ１１９（クローンＴＥＲ－１１９））抗体をＭＡＣＳ緩衝生理食塩水（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ ７．２；２ｍＭ ＥＤＴＡ；０．５％ウシ血清アルブミン）中でカクテルとインキュベートし、続いて抗ビオチンマイクロビーズ（＃１３０－０９０－４８５ ＭＬｉｎ＋細胞を、磁気選別（オートＭＡＣＳプロセパレーター、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ)によって枯渇させた。Ｌｉｎ細胞を、抗ＣＤ４５．２－ＰＥ－Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローン１０４）、抗Ｌｙ６Ｇ－ＡＰＣ （ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローン１Ａ８）、抗ＣＤ１１５－Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローンＡＦＳ９８）および抗Ｌｙ６Ｃ－ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローンＨＫ１．４）抗体で染色し、次いでセルソーター（ＳＨ８００、ＳＯＮＹ、またはＡｒｉａＩＩＩ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって分画した。
ＢＭ単球は、セルソーターまたはＭｏｎｏｃｙｔｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ (＃１３０－１００－６２９ Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）により単離した。セルソーターを用いたＢＭ単球単離のために、ＷＴ－又はＹｍ１－Ｖｅｎｕｓマウス由来のＢＭ細胞を抗ＣＤ１６／３２（クローン９３）とインキュベートした後、ビオチン化抗－Ｌｉｎ (ＣＤ４（クローンＧＫ１．５）、ＣＤ８（クローン５３－６．７）、Ｂ２２０（ＲＡ３－６Ｂ２）、ＮＫ１．１（クローンＰＫ１３６）、Ｌｙ６Ｇ（クローン１Ａ８）及びＴｅｒ１１９（クローンＴＥＲ－１１９））抗体をＭＡＣＳ緩衝生理食塩水（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ ７．２；２ｍＭ ＥＤＴＡ；０．５％ウシ血清アルブミン）中でカクテルとインキュベートし、続いて抗ビオチンマイクロビーズ（＃１３０－０９０－４８５ ＭＬｉｎ＋細胞を、磁気選別（オートＭＡＣＳプロセパレーター、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ)によって枯渇させた。Ｌｉｎ細胞を、抗ＣＤ４５．２－ＰＥ－Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローン１０４）、抗Ｌｙ６Ｇ－ＡＰＣ （ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローン１Ａ８）、抗ＣＤ１１５－Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローンＡＦＳ９８）および抗Ｌｙ６Ｃ－ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローンＨＫ１．４）抗体で染色し、次いでセルソーター（ＳＨ８００、ＳＯＮＹ、またはＡｒｉａＩＩＩ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって分画した。
【0101】
肺における単球および腫瘍細胞の数の分析のため、仕分けられた単球およびＢ１６細胞を、製造のプロトコールに従って、それぞれＰＫＨ－２６（赤色蛍光）およびＰＫＨ－６７（緑色蛍光）（シグマ）で染色した。肺細胞の単離のために、肺を断片化し、消化液（０．２Ｕ／ｍＬリベラーゼＴＬ (＃５４０１０２０００１、ロシュ社）、ＨＢＳＳ中のＤＮａｓｅ Ｉ １μｇ／ｍＬ（＃ＤＮ２５、シグマ社））を含む円錐管に移した。サンプルを２５分間攪拌下、３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、細胞をピペッティングにより分散させ、遠心分離によりペレット化した。その後、細胞をＭＡＣＳ緩衝液で洗浄した。赤血球を枯渇させるために、細胞をＢＤ Ｐｈａｒｍ Ｌｙｓｅ（商標）－Ｌｙｓｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ （ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で処理した後、ＭＡＣＳ緩衝液で洗浄した。末梢血単核球の分析のために、末梢血をＥＤＴＡ含有チューブで採取した。その後、ＢＤ Ｐｈａｒｍ Ｌｙｓｅ（商標）－Ｌｙｓｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで赤血球を溶解した。
【0102】
（実験的転移アッセイ）
Ｂ１６細胞（１×１０５細胞）を、ＷＴマウス、ＣＤ２０４‐ＤＴＲマウスまたはＹｍ１‐ＤＴＲマウスに静脈内注射し、肺転移を作製した。Ｂ１６の肺転移を反映する結節数を目視で計測した。肺におけるメラノーマ関連ｍＲＮＡ発現を評価するため、製造業者のプロトコールに従い、ＦａｖｏｒＰｒｅｐ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎ （Ｆａｖｏｒｇｅｎ）でスナップ凍結肺組織由来の全ＲＮＡを抽出した。ｑＲＴ－ＰＣＲ用に、ｃＤＮＡをＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて合成した。ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）で、ｑＲＴ－ＰＣＲをｃＤＮＡ上で行った。発現レベルは１８ｓリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）に対して標準化した。以下のプライマーを各遺伝子に使用した:
Ｂ１６細胞（１×１０５細胞）を、ＷＴマウス、ＣＤ２０４‐ＤＴＲマウスまたはＹｍ１‐ＤＴＲマウスに静脈内注射し、肺転移を作製した。Ｂ１６の肺転移を反映する結節数を目視で計測した。肺におけるメラノーマ関連ｍＲＮＡ発現を評価するため、製造業者のプロトコールに従い、ＦａｖｏｒＰｒｅｐ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎ （Ｆａｖｏｒｇｅｎ）でスナップ凍結肺組織由来の全ＲＮＡを抽出した。ｑＲＴ－ＰＣＲ用に、ｃＤＮＡをＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて合成した。ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）で、ｑＲＴ－ＰＣＲをｃＤＮＡ上で行った。発現レベルは１８ｓリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）に対して標準化した。以下のプライマーを各遺伝子に使用した:
【表1】
【0103】
腫瘍切除による実験的転移アッセイのために、１×１０6のＢ１６細胞をＷＴマウスの背部皮下に移植した。移植の６または７日後に、麻酔下のマウスに、皮膚切開を通して腫瘍組織切除を行った。２４時間後、Ｂ１６細胞（１×１０5細胞）を静注し、肺転移を生じた。Ｂ１６の肺転移は上記のように推定された。
【0104】
（Ｘ線照射）
Ｂ１６細胞（１×１０6 細胞）をＷＴマウスの背部皮下に移植した。移植後７～８日目に、麻酔下のマウスを、移植された腫瘍を露出させることができるように特注のハーネスに固定したが、身体の残りは３．５ｃｍの鉛により遮蔽した。マウスをＦａｘｉｔｒｏｎ ＣＰ‐１６０照射器(Ｆａｘｉｔｒｏｎ Ｘ―ｒａｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ)で照射した。
Ｂ１６細胞（１×１０6 細胞）をＷＴマウスの背部皮下に移植した。移植後７～８日目に、麻酔下のマウスを、移植された腫瘍を露出させることができるように特注のハーネスに固定したが、身体の残りは３．５ｃｍの鉛により遮蔽した。マウスをＦａｘｉｔｒｏｎ ＣＰ‐１６０照射器(Ｆａｘｉｔｒｏｎ Ｘ―ｒａｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ)で照射した。
【0105】
（定量ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ））
Ｙｍ１＋ＭｏまたはＹｍ１－ＭｏにおけるｍＲＮＡレベルの解析のために、仕分けられたＹｍ１＋またはＹｍ１－Ｍｏ ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに変換し、上記のようにｃＤＮＡ上でｑＲＴ－ＰＣＲを実施した。発現レベルは１８ｓ ｒＲＮＡに正規化した。以下のプライマー配列を各遺伝子に使用した。
Ｙｍ１＋ＭｏまたはＹｍ１－ＭｏにおけるｍＲＮＡレベルの解析のために、仕分けられたＹｍ１＋またはＹｍ１－Ｍｏ ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに変換し、上記のようにｃＤＮＡ上でｑＲＴ－ＰＣＲを実施した。発現レベルは１８ｓ ｒＲＮＡに正規化した。以下のプライマー配列を各遺伝子に使用した。
【表2】
【0106】
（ＲＮＡシークエンシング）
選別した細胞を溶解し、それらの全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）で抽出した。全ＲＮＡの５００ピコグラムを、ＳＭＡＲＴ―Ｓｅｑ ｖ４超低入力ＲＮＡキット（ＴＡＫＡＲＡ）およびネクステラＸＴ ＤＮＡライブラリー調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて、ＲＮＡ配列解析のためのＤＮＡライブラリー調製に供した。シークエンシングは、ＮｅｘｔＳｅｑ ５００シークエンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用い、７５ｂｐの一端読影モードで行った。１００万読取りあたりのエキソンのキロベースあたりの断片（ＦＰＫＭ）を有するデータを、配列読取りのマッピング後のさらなる分析に用いた。ＡｌｔＡｎａｌｙｚｅを用いてＲＮＡ配列決定のＰＣＡ解析を行った。Ｒパッケージｌｉｍｍａを用いて、差次的に発現する遺伝子を同定した。ＰＣＡ解析のために、ＢＭナイーブ単球、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃｈｉ単球およびＹｍ１－Ｌｙ６Ｃｈｉ単球のＲＮＡシーケンスデータを、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓデータベース（アクセッション番号ＧＳＥ１１８０３２）（参考文献２２）から検索した。
選別した細胞を溶解し、それらの全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）で抽出した。全ＲＮＡの５００ピコグラムを、ＳＭＡＲＴ―Ｓｅｑ ｖ４超低入力ＲＮＡキット（ＴＡＫＡＲＡ）およびネクステラＸＴ ＤＮＡライブラリー調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて、ＲＮＡ配列解析のためのＤＮＡライブラリー調製に供した。シークエンシングは、ＮｅｘｔＳｅｑ ５００シークエンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用い、７５ｂｐの一端読影モードで行った。１００万読取りあたりのエキソンのキロベースあたりの断片（ＦＰＫＭ）を有するデータを、配列読取りのマッピング後のさらなる分析に用いた。ＡｌｔＡｎａｌｙｚｅを用いてＲＮＡ配列決定のＰＣＡ解析を行った。Ｒパッケージｌｉｍｍａを用いて、差次的に発現する遺伝子を同定した。ＰＣＡ解析のために、ＢＭナイーブ単球、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃｈｉ単球およびＹｍ１－Ｌｙ６Ｃｈｉ単球のＲＮＡシーケンスデータを、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓデータベース（アクセッション番号ＧＳＥ１１８０３２）（参考文献２２）から検索した。
【0107】
（ウェスタンブロット法）
肺を、プロテナーゼ阻害剤（＃１１８３６１４５００１、ロシュ）と共にＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ 、ｐＨ７．４、１％ ＮＰ－４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１% ＳＤＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中で、３８００ｒｐｍで４サイクル、および１サイクル当たり０．２秒間、ホモジナイザー（Ｂｉｏｐｒｅｐ－６、Ａｌｌｓｈｅｎｇ、杭州、中国）で徹底的に均質化した。１０ｍｇの組織には、５００μＬのＲＩＰＡ緩衝液を用いた。氷上で３０分後、サンプルを１０，０００×ｇで２０分間、４℃で遠心分離し、上清中のタンパク質濃度を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイ（＃２３２２５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定した。各試料からの等量のタンパク質をＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動に負荷し、分離し、ＰＶＤＦ膜上に移した。イムノブロットをブロッキング緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の５％スキムミルク）と０．１% Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＴ）とで６０分間室温でインキュベートし、抗シトルリン化ヒストンＨ３（＃ａｂ５１０３、Ａｂｃａｍ）または抗ＧＡＰＤＨ ｍＡｂ－ＨＲＰ－ＤｉｒｅｃＴ（＃Ｍ１７１－７、Ｍｅｄｉｃａｌ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ)で、４℃で一夜プローブした。次に、免疫ブロットをＰＢＳＴ中で５分間３回洗浄し、ブロック緩衝液中でポリクローナルヤギ抗ウサギＩｇＧ－ＨＲＰ（＃Ｐ０４４８、Ｄａｋｏ）と３０分間インキュベートし、再びＰＢＳＴ中で３回洗浄した。免疫検出はＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標） Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ＰＬＵＳ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ (＃３４５８０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて行った。
肺を、プロテナーゼ阻害剤（＃１１８３６１４５００１、ロシュ）と共にＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ 、ｐＨ７．４、１％ ＮＰ－４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１% ＳＤＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中で、３８００ｒｐｍで４サイクル、および１サイクル当たり０．２秒間、ホモジナイザー（Ｂｉｏｐｒｅｐ－６、Ａｌｌｓｈｅｎｇ、杭州、中国）で徹底的に均質化した。１０ｍｇの組織には、５００μＬのＲＩＰＡ緩衝液を用いた。氷上で３０分後、サンプルを１０，０００×ｇで２０分間、４℃で遠心分離し、上清中のタンパク質濃度を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイ（＃２３２２５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定した。各試料からの等量のタンパク質をＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動に負荷し、分離し、ＰＶＤＦ膜上に移した。イムノブロットをブロッキング緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の５％スキムミルク）と０．１% Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＴ）とで６０分間室温でインキュベートし、抗シトルリン化ヒストンＨ３（＃ａｂ５１０３、Ａｂｃａｍ）または抗ＧＡＰＤＨ ｍＡｂ－ＨＲＰ－ＤｉｒｅｃＴ（＃Ｍ１７１－７、Ｍｅｄｉｃａｌ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ)で、４℃で一夜プローブした。次に、免疫ブロットをＰＢＳＴ中で５分間３回洗浄し、ブロック緩衝液中でポリクローナルヤギ抗ウサギＩｇＧ－ＨＲＰ（＃Ｐ０４４８、Ｄａｋｏ）と３０分間インキュベートし、再びＰＢＳＴ中で３回洗浄した。免疫検出はＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標） Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ＰＬＵＳ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ (＃３４５８０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて行った。
【0108】
（免疫組織化学）
肺を採取し、ＯＣＴ化合物（ＳＥＣＴＩＯＮ－ＬＡＢ、日本）に包埋した。切削表面を粘着フィルム(Ｃｒｙｏｆｉｌｍ ｔｙｐｅ ＩＩＣ９、ＳＥＣＴＩＯＮ－ＬＡＢ、Ｊａｐａｎ）で、凍結区間（５μｍ）をミクロトーム（ＣＭ３０５０Ｓ Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で調製した。得られた切片を１００% ＥｔＯＨで１０秒間、４% ＰＦＡ/ＰＢＳ（－）で１０秒間ポスト固定し、ＰＢＳ（－）で２０秒間洗浄し、ＴＮＢ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ (０．１Ｍ Ｔｒｉｚｍａ Ｂａｓｅ、ｐＨ７．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．５％（ｗ/ｖ）遮断試薬（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＦＰ１０２０））と室温で１時間インキュベートした。次いで、切片を、抗シトルリン化ヒストンＨ３抗体（１／２５０）、またはＭＰＯ抗体（＃ＡＦ３６６７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１／１００）とともに、ＴＮＢブロック緩衝液中で室温１時間インキュベートした。ＰＢＳ（－）による３回の洗浄後、切片をロバ抗ウサギＩｇＧ－Ｃｙ３（＃４０６４０２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１／１０００）、またはロバ抗ヤギＩｇＧ－Ａｌｅｘａ ４８８（＃７０５－５４５－００３、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１／１０００）とともに、ＴＮＢ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ中で室温の暗所で１時間インキュベートした。ＰＢＳ（－）で２回、水で１回洗浄した後、切片をＤＡＰＩで対比染色し、スライドを装着媒体(ＦｌｕｏｒＳａｖｅ Ｒｅａｇｅｎｔ、３４５７８９、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ)を用いてカバースリップで覆った。
肺を採取し、ＯＣＴ化合物（ＳＥＣＴＩＯＮ－ＬＡＢ、日本）に包埋した。切削表面を粘着フィルム(Ｃｒｙｏｆｉｌｍ ｔｙｐｅ ＩＩＣ９、ＳＥＣＴＩＯＮ－ＬＡＢ、Ｊａｐａｎ）で、凍結区間（５μｍ）をミクロトーム（ＣＭ３０５０Ｓ Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で調製した。得られた切片を１００% ＥｔＯＨで１０秒間、４% ＰＦＡ/ＰＢＳ（－）で１０秒間ポスト固定し、ＰＢＳ（－）で２０秒間洗浄し、ＴＮＢ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ (０．１Ｍ Ｔｒｉｚｍａ Ｂａｓｅ、ｐＨ７．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．５％（ｗ/ｖ）遮断試薬（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＦＰ１０２０））と室温で１時間インキュベートした。次いで、切片を、抗シトルリン化ヒストンＨ３抗体（１／２５０）、またはＭＰＯ抗体（＃ＡＦ３６６７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１／１００）とともに、ＴＮＢブロック緩衝液中で室温１時間インキュベートした。ＰＢＳ（－）による３回の洗浄後、切片をロバ抗ウサギＩｇＧ－Ｃｙ３（＃４０６４０２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１／１０００）、またはロバ抗ヤギＩｇＧ－Ａｌｅｘａ ４８８（＃７０５－５４５－００３、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１／１０００）とともに、ＴＮＢ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ中で室温の暗所で１時間インキュベートした。ＰＢＳ（－）で２回、水で１回洗浄した後、切片をＤＡＰＩで対比染色し、スライドを装着媒体(ＦｌｕｏｒＳａｖｅ Ｒｅａｇｅｎｔ、３４５７８９、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ)を用いてカバースリップで覆った。
【0109】
（ゼラチンザイモグラフィー）
単球からの調整培地（５×１０６ 細胞／ｍＬ、プラスチック上で２４時間増殖させたアドバンストＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む２４ウェルプレート中）を、負荷緩衝液（０．１２５Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ６．８、４% ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルー）と４：１の比率で混合した。その後、サンプルをＮｏｖｅｘ（商標）１０％ザイモグラムプラス（ゼラチン）タンパク質ゲル（＃ＺＹ００１０２ＢＯＸ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に装填した。電気泳動後、ゲルを水で２回洗浄し、洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ７．５、０．０１６% ＮａＮ３、２．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、５ｍＭ ＣａＣｌ２、１μＭ ＺｎＣｌ２）中、室温で３０分間インキュベートした。次に、３７℃で１０分間インキュベーション緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．０１６％ＮａＮ３、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、５ｍＭ ＣａＣｌ２、１μＭ ＺｎＣｌ２）でゲルをリンスし、３７℃で１６時間、インキュベーション緩衝液中でインキュベートした。ゲルを０．５％クマシーブルーＲ－２５０（＃０３１－１７９２２、和光；４０％エタノール及び１０％酢酸で希釈）で染色し、４０％エタノール及び１０％酢酸で脱色した。
単球からの調整培地（５×１０６ 細胞／ｍＬ、プラスチック上で２４時間増殖させたアドバンストＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む２４ウェルプレート中）を、負荷緩衝液（０．１２５Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ６．８、４% ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルー）と４：１の比率で混合した。その後、サンプルをＮｏｖｅｘ（商標）１０％ザイモグラムプラス（ゼラチン）タンパク質ゲル（＃ＺＹ００１０２ＢＯＸ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に装填した。電気泳動後、ゲルを水で２回洗浄し、洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ７．５、０．０１６% ＮａＮ３、２．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、５ｍＭ ＣａＣｌ２、１μＭ ＺｎＣｌ２）中、室温で３０分間インキュベートした。次に、３７℃で１０分間インキュベーション緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．０１６％ＮａＮ３、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、５ｍＭ ＣａＣｌ２、１μＭ ＺｎＣｌ２）でゲルをリンスし、３７℃で１６時間、インキュベーション緩衝液中でインキュベートした。ゲルを０．５％クマシーブルーＲ－２５０（＃０３１－１７９２２、和光；４０％エタノール及び１０％酢酸で希釈）で染色し、４０％エタノール及び１０％酢酸で脱色した。
【0110】
（侵入アッセイ）
ＬＰＳ処理ＷＴまたはＹｍ１－Ｖｅｎｕｓマウスから選別したＬｙ６Ｃ＋単球（２または５×１０６／ｍＬ）を無血清培地（Ａｄｖａｎｃｅｄ‐ＲＰＭＩ１６４０、サーモフィッシャーサイエンティフィック）で３７℃、５％ ＣＯ２で２４時間インキュベートした。培養上清を遠心した（１０，０００×ｇ、４℃で３０分）。侵入アッセイのために上清を採取した。ヒトメラノーマ細胞株Ａ３７５（ＡＴＣＣ－ＣＲＬ－１６１９、１×１０６／ｍＬ）を無血清培地（ＲＰＭＩ１６４０、和光）に懸濁し、単球培養上清の有無にかかわらず、マトリゲル（コーニング社、バイオコート３５４４８０）でコーティングした２４ウェルトランスウェルチャンバーの上部チャンバーに添加した。下のチャンバーには、化学誘引物質として０．１％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０が含まれていた。分析は、３７℃、５％ ＣＯ２で２４時間実施した。インキュベーション終了時、フィルター上面の非侵入細胞を機械的に除去した。マトリゲルと８μｍ孔膜を移動した侵入細胞を４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで５分間固定し、０．１％クリスタルバイオレット（ＷＡＫＯ）で２０分間染色した。侵入細胞の割合は、ＢＺ－Ｘ７１０ソフトウェア（Ｋｅｙｅｎｃｅ）を用いて算出した。
ＬＰＳ処理ＷＴまたはＹｍ１－Ｖｅｎｕｓマウスから選別したＬｙ６Ｃ＋単球（２または５×１０６／ｍＬ）を無血清培地（Ａｄｖａｎｃｅｄ‐ＲＰＭＩ１６４０、サーモフィッシャーサイエンティフィック）で３７℃、５％ ＣＯ２で２４時間インキュベートした。培養上清を遠心した（１０，０００×ｇ、４℃で３０分）。侵入アッセイのために上清を採取した。ヒトメラノーマ細胞株Ａ３７５（ＡＴＣＣ－ＣＲＬ－１６１９、１×１０６／ｍＬ）を無血清培地（ＲＰＭＩ１６４０、和光）に懸濁し、単球培養上清の有無にかかわらず、マトリゲル（コーニング社、バイオコート３５４４８０）でコーティングした２４ウェルトランスウェルチャンバーの上部チャンバーに添加した。下のチャンバーには、化学誘引物質として０．１％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０が含まれていた。分析は、３７℃、５％ ＣＯ２で２４時間実施した。インキュベーション終了時、フィルター上面の非侵入細胞を機械的に除去した。マトリゲルと８μｍ孔膜を移動した侵入細胞を４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで５分間固定し、０．１％クリスタルバイオレット（ＷＡＫＯ）で２０分間染色した。侵入細胞の割合は、ＢＺ－Ｘ７１０ソフトウェア（Ｋｅｙｅｎｃｅ）を用いて算出した。
【0111】
（統計）
分散分析（ＡＮＯＶＡ）とその後の多重比較、またはプリズム（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア、ＣＡ）によるｔ検定のいずれかによってデータを分析した。Ｐ値＜０．０５を有意とみなした。
分散分析（ＡＮＯＶＡ）とその後の多重比較、またはプリズム（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア、ＣＡ）によるｔ検定のいずれかによってデータを分析した。Ｐ値＜０．０５を有意とみなした。
【0112】
（Ｙｍ１陽性制御性単球選択的に発現する表面マーカーの同定）
Ｙｍ１－Ｖｅｎｕｓマウスから、ＬＰＳ投与４８時間後の骨髄細胞を回収し、１ｘＰｈａｒｍＬｙｓｅ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で赤血球を溶血した。残りの白血球を、抗ＣＤ１１５抗体、抗Ｌｙ６Ｃ抗体、抗Ｌｙ６Ｇ抗体および抗ＣＤ１１ｂ抗体と、約２５０種類のパネル抗体（ＬＥＧＥＮＤＳＣｒｅｅｎ Ｍｏｕｓｅ ＰＥ Ｋｉｔ）で染色し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で解析した。死細胞は７－ＡＡＤ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で除去した。Ｌｙ６Ｇ陰性Ｌｙ６Ｃ陽性単球を、さらにＹｍ１－Ｖｅｎｕｓ陽性単球とＹｍ１－Ｖｅｎｕｓ陰性単球に分けた。
Ｙｍ１－Ｖｅｎｕｓマウスから、ＬＰＳ投与４８時間後の骨髄細胞を回収し、１ｘＰｈａｒｍＬｙｓｅ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で赤血球を溶血した。残りの白血球を、抗ＣＤ１１５抗体、抗Ｌｙ６Ｃ抗体、抗Ｌｙ６Ｇ抗体および抗ＣＤ１１ｂ抗体と、約２５０種類のパネル抗体（ＬＥＧＥＮＤＳＣｒｅｅｎ Ｍｏｕｓｅ ＰＥ Ｋｉｔ）で染色し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で解析した。死細胞は７－ＡＡＤ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で除去した。Ｌｙ６Ｇ陰性Ｌｙ６Ｃ陽性単球を、さらにＹｍ１－Ｖｅｎｕｓ陽性単球とＹｍ１－Ｖｅｎｕｓ陰性単球に分けた。
【0113】
野生型マウスの骨髄細胞を、抗ＣＤ１１５抗体、抗Ｌｙ６Ｃ抗体、抗Ｌｙ６Ｇ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＤ８８抗体および抗ＣＤ１５７抗体で染色した。定常状態とＬＰＳ投与４８時間後の野生型マウスの骨髄の好中球（Ｌｙ６Ｇ陽性）、Ｌｙ６Ｃ陽性Ｙｍ１陽性単球、Ｌｙ６Ｃ陽性Ｙｍ１陰性単球における、ＣＤ８８およびＣＤ１５７の発現量をフローサイトメトリーで解析した（図１５Ｂ）。この項で使用した抗体および７－ＡＡＤはＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した。
【0114】
野生型マウスにＬＰＳを投与し、４８時間後の骨髄細胞を、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗Ｌｙ６Ｇ抗体、抗Ｌｙ６Ｃ抗体、抗ＣＤ１１５抗体、抗ＣＤ８８抗体、抗ＣＤ１５７抗体およびＥＭＡで染色した。Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍバッファー（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で細胞を固定、透徹した。それらの細胞をビオチン結合抗Ｙｍ１抗体、続けてＰＥ標識ストレプトアビジンと反応させ、Ｙｍ１発現量をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ Ｖｅｒｓ）で解析した（図１５Ｃ）。
【0115】
ＬＰＳ投与４８時間後の骨髄から、ＣＤ８８／ＣＤ１５７二重陽性単球（ｄｏｕｂｌｅ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ，ＤＰ）および二重陰性単球（ｄｏｕｂｌｅ－ｎｅｇａｔｉｖｅ，ＤＮ）を分取し、Ｙｍ１遺伝子（Ｃｈｉｌ３）およびその他のＹｍ１陽性単球関連遺伝子（Ｍｍｐ９）、Ｍ１関連遺伝子（Ｎｏｓ２、Ｔｎｆ、Ｉｌ６）、Ｍ２関連遺伝子（Ａｒｇ１、Ｉｌ１０）の発現レベルをＰＣＲで定量した（図１５Ｄ）。
【0116】
＜結果＞
図１の説明
図１Ａ～１Ｄ：ＴＬＲリガンドの肺転移に及ぼす影響
（図１Ａ）ＴＬＲリガンドが転移進行に及ぼす影響を解析するための実験デザイン。ＷＴマウスにＰＢＳ（Ｃｔｒｌ)、ＬＰＳ２０μｇ、ＣｐＧ－ＯＤＮ（ＣｐＧ）１００μｇ、またはＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）１００μｇのいずれかを注射し、６時間後にＢ１６細胞（１ｘ１０５細胞）をｉ．ｖ．注射した。８日目の転移について肺を分析した。
（図１Ｂ）８日目の肺の代表的な画像。
（図１Ｃ）８日目の肺転移数の定量的集計。
（図１Ｄ）Ｂ１６メラノーマ細胞特異的遺伝子のｍＲＮＡ発現量をｑＲＴ－ＰＣＲ法で測定し、対照肺と比較して倍率変化として示した。平均値をＳＤで示す。一元配置分散分析後にダネット検定、ｎ＝５～９（ＣおよびＤ）。**** Ｐ＜０．００１；ｎ.ｓ.、有意差なし。各記号は個々の動物を表している。
図１の説明
図１Ａ～１Ｄ：ＴＬＲリガンドの肺転移に及ぼす影響
（図１Ａ）ＴＬＲリガンドが転移進行に及ぼす影響を解析するための実験デザイン。ＷＴマウスにＰＢＳ（Ｃｔｒｌ)、ＬＰＳ２０μｇ、ＣｐＧ－ＯＤＮ（ＣｐＧ）１００μｇ、またはＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）１００μｇのいずれかを注射し、６時間後にＢ１６細胞（１ｘ１０５細胞）をｉ．ｖ．注射した。８日目の転移について肺を分析した。
（図１Ｂ）８日目の肺の代表的な画像。
（図１Ｃ）８日目の肺転移数の定量的集計。
（図１Ｄ）Ｂ１６メラノーマ細胞特異的遺伝子のｍＲＮＡ発現量をｑＲＴ－ＰＣＲ法で測定し、対照肺と比較して倍率変化として示した。平均値をＳＤで示す。一元配置分散分析後にダネット検定、ｎ＝５～９（ＣおよびＤ）。**** Ｐ＜０．００１；ｎ.ｓ.、有意差なし。各記号は個々の動物を表している。
【0117】
図１Ｅ～１Ｇ：肺転移に対する免疫細胞欠失の影響
(図１Ｅ）転移進行に対する抗Ｇｒ－１ ｍＡｂおよび抗Ｌｙ６Ｇ ｍＡｂの効果を試験するために用いた実験デザイン。ＷＴマウスに１日目にＬＰＳ２０μｇを注射し、６時間後にＢ１６細胞（１×１０５細胞）をｉ．ｖ．注射した。好中球単独（抗Ｌｙ６Ｇ）、または単球と好中球（抗Ｇｒ－１）の欠失のために、指定されたｍＡｂまたはＰＢＳ（対照（Ｃｔｒｌ））の５０μｇ／日を０日目から８日目までこれらのマウスに注射した。転移に関し、Ｄａｙ ８に肺を分析した。
（図１Ｆおよび１Ｇ）肺転移個数の定量的集計（左）および肺転移の効果の代表的な画像（右）。平均値をＳＤで示す。対応のない両側ｔ検定、ｎ＝４（図１Ｆおよび１Ｇ）。** Ｐ＜０．０１；ｎ.ｓ.、有意差なし。各記号は個々の動物を表している。
(図１Ｅ）転移進行に対する抗Ｇｒ－１ ｍＡｂおよび抗Ｌｙ６Ｇ ｍＡｂの効果を試験するために用いた実験デザイン。ＷＴマウスに１日目にＬＰＳ２０μｇを注射し、６時間後にＢ１６細胞（１×１０５細胞）をｉ．ｖ．注射した。好中球単独（抗Ｌｙ６Ｇ）、または単球と好中球（抗Ｇｒ－１）の欠失のために、指定されたｍＡｂまたはＰＢＳ（対照（Ｃｔｒｌ））の５０μｇ／日を０日目から８日目までこれらのマウスに注射した。転移に関し、Ｄａｙ ８に肺を分析した。
（図１Ｆおよび１Ｇ）肺転移個数の定量的集計（左）および肺転移の効果の代表的な画像（右）。平均値をＳＤで示す。対応のない両側ｔ検定、ｎ＝４（図１Ｆおよび１Ｇ）。** Ｐ＜０．０１；ｎ.ｓ.、有意差なし。各記号は個々の動物を表している。
【0118】
図１Ｈ～１Ｊ：ＣＤ２０４－ＤＴＲマウスにおける肺転移数の減少
（図１Ｈ）転移進行に対するＣＤ２０４細胞の寄与を検証するために用いられる実験デザイン。ＷＴおよびＣＤ２０４－ＤＴＲマウスにＬＰＳ２０μｇを静脈内注射した。６時間後、Ｂ１６細胞を静脈内注射し、続いて１日目と４日目にＤＴ(５００ｎｇ／注射）をｉ．ｐ．注射した。９日目に肺の転移を分析した。
（図１Ｉ）９日目の肺転移数の定量的集計。
（図１Ｊ）肺における指定された遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルは、ＤＴ処理ＷＴマウスの肺に対する相対比較として示される。平均値をＳＤで示す。対応のない両側ｔ検定、n = ５（ＪおよびＫ）。** Ｐ＜０．０１; ＊Ｐ ＜０．０５。各記号は個々の動物を表している。
(図１Ｋ）ＷＴマウスに抗Ｇｒ‐１ ｍＡｂ (５０μｇ／注射）を－２４と０時間で腹腔内（ｉ．ｐ．）注射し、０時間でＬＰＳを静脈内注射した。ＬＰＳ注射の１、３、６、２０時間後に血清を採取した。血清サイトカイン濃度はＥＬＩＳＡで測定した。平均値をＳＤで示す。各時点における対応のない両側ｔ検定、ＬＰＳ注射との比較、ｎ＝３～４。**Ｐ＜０．０１; ＊Ｐ＜０．０５; ｎ.ｓ.、有意差なし。
（図１Ｈ）転移進行に対するＣＤ２０４細胞の寄与を検証するために用いられる実験デザイン。ＷＴおよびＣＤ２０４－ＤＴＲマウスにＬＰＳ２０μｇを静脈内注射した。６時間後、Ｂ１６細胞を静脈内注射し、続いて１日目と４日目にＤＴ(５００ｎｇ／注射）をｉ．ｐ．注射した。９日目に肺の転移を分析した。
（図１Ｉ）９日目の肺転移数の定量的集計。
（図１Ｊ）肺における指定された遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルは、ＤＴ処理ＷＴマウスの肺に対する相対比較として示される。平均値をＳＤで示す。対応のない両側ｔ検定、n = ５（ＪおよびＫ）。** Ｐ＜０．０１; ＊Ｐ ＜０．０５。各記号は個々の動物を表している。
(図１Ｋ）ＷＴマウスに抗Ｇｒ‐１ ｍＡｂ (５０μｇ／注射）を－２４と０時間で腹腔内（ｉ．ｐ．）注射し、０時間でＬＰＳを静脈内注射した。ＬＰＳ注射の１、３、６、２０時間後に血清を採取した。血清サイトカイン濃度はＥＬＩＳＡで測定した。平均値をＳＤで示す。各時点における対応のない両側ｔ検定、ＬＰＳ注射との比較、ｎ＝３～４。**Ｐ＜０．０１; ＊Ｐ＜０．０５; ｎ.ｓ.、有意差なし。
【0119】
図１Ｌ～１Ｏ：ＬＰＳ Ｍｏ移入マウスの肺転移数の増加
（図１Ｌ）転移進行に対する単球移入の効果を検証するために用いられる実験デザイン。ＷＴマウスに、ナイーブマウス（ナイーブＭｏ）またはＬＰＳ処理マウス(ＬＰＳ Ｍｏ) (５ｘ１０５細胞）のいずれかから調製した進行ＲＰＭＩ１６４０（Ｃｔｒｌ）またはＬｙ６Ｃ＋単球を静脈内に移入した。２４時間後、Ｂ１６細胞を静脈注射した。Ｄａｙ ８に肺転移の有無を解析した。
（図１Ｍ）Ｄａｙ ８の肺転移個数の定量的集計。
（図１Ｎ）肺の代表的な画像。
（図１Ｏ）肺における示された遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルは、対照肺と比較して倍率変化として示される。平均値をＳＤで示す。一元配置分散分析後にＤｕｎｎｅｔｔ検定、ｎ＝６－１０（ＭおよびＯ）。**** Ｐ＜０．００１; ** Ｐ＜０．０１; ｎ.ｓ.、有意差なし。各記号は個々の動物を表している。
（図１Ｌ）転移進行に対する単球移入の効果を検証するために用いられる実験デザイン。ＷＴマウスに、ナイーブマウス（ナイーブＭｏ）またはＬＰＳ処理マウス(ＬＰＳ Ｍｏ) (５ｘ１０５細胞）のいずれかから調製した進行ＲＰＭＩ１６４０（Ｃｔｒｌ）またはＬｙ６Ｃ＋単球を静脈内に移入した。２４時間後、Ｂ１６細胞を静脈注射した。Ｄａｙ ８に肺転移の有無を解析した。
（図１Ｍ）Ｄａｙ ８の肺転移個数の定量的集計。
（図１Ｎ）肺の代表的な画像。
（図１Ｏ）肺における示された遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルは、対照肺と比較して倍率変化として示される。平均値をＳＤで示す。一元配置分散分析後にＤｕｎｎｅｔｔ検定、ｎ＝６－１０（ＭおよびＯ）。**** Ｐ＜０．００１; ** Ｐ＜０．０１; ｎ.ｓ.、有意差なし。各記号は個々の動物を表している。
【0120】
図１Ｐおよび１Ｑ：ＬＰＳの鼻腔内（ｉ．ｎ．）注射は肺におけるＮＥＴ形成を誘導するが、ｉ．ｖ．注射は誘導しない。ＷＴマウスにＬＰＳ（それぞれ２０または１０μｇ）をｉ．ｖ．またはｉ．ｎ．注射した。２４時間後、肺を分析した。
（図１Ｐ）ＬＰＳ投与マウスの肺におけるヒストンＨ３（ｃｉｔＨ３）のシトルリン化のウェスタンブロット解析肺組織のウェスタンブロット分析を、材料および方法に記載されているように実施した。
（図１Ｑ）ＬＰＳ処理ＷＴマウス由来の肺切片の免疫組織化学画像は、ＬＰＳで処理したマウスの肺におけるミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ：緑）、ｃｉｔＨ３（赤）、およびＤＡＰＩ（青）の代表的な免疫染色を示す。元の倍率、×２０（上部パネル）、×１００（下部パネル）。示されたデータは２つの独立した実験の代表である。
（図１Ｐ）ＬＰＳ投与マウスの肺におけるヒストンＨ３（ｃｉｔＨ３）のシトルリン化のウェスタンブロット解析肺組織のウェスタンブロット分析を、材料および方法に記載されているように実施した。
（図１Ｑ）ＬＰＳ処理ＷＴマウス由来の肺切片の免疫組織化学画像は、ＬＰＳで処理したマウスの肺におけるミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ：緑）、ｃｉｔＨ３（赤）、およびＤＡＰＩ（青）の代表的な免疫染色を示す。元の倍率、×２０（上部パネル）、×１００（下部パネル）。示されたデータは２つの独立した実験の代表である。
【0121】
図２の説明
図２Ａ～２Ｃ：ＷＴ(青色の陰影部分）またはＹｍ１－Ｖｅｎｕｓマウス（赤色）における肺細胞のフローサイトメトリー分析。ＰＢＳ（Ｃｔｒｌ）、ＬＰＳ、ＣｐＧ、またはＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を、ＷＴまたはＹｍ１－Ｖｅｎｕｓマウスに静脈注射した。４８時間後、肺細胞をＣＤ４５．２、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ、Ｌｙ６Ｇ、ＭＨＣＩＩおよびＬｙ６Ｃについて染色し、図７Ａに記載されているようにフローサイトメーターによって分析した。ＣＤ４５．２＋ＣＤ１１ｃ－ＣＤ１１ｂ＋ＭＨＣＩＩ－Ｌｙ６Ｃ＋細胞（Ｒ１；Ｌｙ６Ｃ＋単球）またはＣＤ４５．２＋ＣＤ１１ｃ－ＣＤ１１ｂ＋ＭＨＣＩＩ－Ｌｙ６Ｃ＋細胞（Ｒ２；Ｌｙ６Ｃ－単球）のＹｍ１－細胞のパーセンテージを示している（図２Ａ）。Ｌｙ６Ｃ＋単球（図２Ｂ）とＹｍ１+Ｌｙ６Ｃ＋単球（図２Ｃ）の絶対数（ｌｕｎｇ 単位）。平均値をＳＤで示す。一元配置分散分析後にＤｕｎｎｅｔｔ検定、ｎ＝３～５。****Ｐ＜０．００１; ***Ｐ＜０．００５; **Ｐ＜０．０１;ｎ.ｓ.、有意差なし。
図２Ａ～２Ｃ：ＷＴ(青色の陰影部分）またはＹｍ１－Ｖｅｎｕｓマウス（赤色）における肺細胞のフローサイトメトリー分析。ＰＢＳ（Ｃｔｒｌ）、ＬＰＳ、ＣｐＧ、またはＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を、ＷＴまたはＹｍ１－Ｖｅｎｕｓマウスに静脈注射した。４８時間後、肺細胞をＣＤ４５．２、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ、Ｌｙ６Ｇ、ＭＨＣＩＩおよびＬｙ６Ｃについて染色し、図７Ａに記載されているようにフローサイトメーターによって分析した。ＣＤ４５．２＋ＣＤ１１ｃ－ＣＤ１１ｂ＋ＭＨＣＩＩ－Ｌｙ６Ｃ＋細胞（Ｒ１；Ｌｙ６Ｃ＋単球）またはＣＤ４５．２＋ＣＤ１１ｃ－ＣＤ１１ｂ＋ＭＨＣＩＩ－Ｌｙ６Ｃ＋細胞（Ｒ２；Ｌｙ６Ｃ－単球）のＹｍ１－細胞のパーセンテージを示している（図２Ａ）。Ｌｙ６Ｃ＋単球（図２Ｂ）とＹｍ１+Ｌｙ６Ｃ＋単球（図２Ｃ）の絶対数（ｌｕｎｇ 単位）。平均値をＳＤで示す。一元配置分散分析後にＤｕｎｎｅｔｔ検定、ｎ＝３～５。****Ｐ＜０．００１; ***Ｐ＜０．００５; **Ｐ＜０．０１;ｎ.ｓ.、有意差なし。
【0122】
図２Ｄ～２Ｆ：Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球非存在下における肺転移個数の減少。
（図２Ｄ）転移進行に対するＹｍ１＋細胞の寄与を検証するために用いられる実験デザイン。ＷＴ－およびＹｍ１－ＤＴＲマウスにＬＰＳを静脈内注射した。６時間後、Ｂ１６細胞を静脈内注射し、続いて１日目と４日目にＤＴ(５００ｎｇ／注射）をｉ．ｐ．注射した。９日目に肺の転移を分析した。
（図２Ｅ）肺の転移個数の定量的集計（左）、肺転移の代表的な画像（右）。
（図２Ｆ）肺における示された遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルは、ＤＴ処理ＷＴマウスの肺との相対比較として示される。平均値をＳＤで示す。対応のない両側ｔ検定、ｎ＝９～１０。**Ｐ ＜０．０１; *Ｐ＜０．０５．各記号は個々の動物を表している。
（図２Ｄ）転移進行に対するＹｍ１＋細胞の寄与を検証するために用いられる実験デザイン。ＷＴ－およびＹｍ１－ＤＴＲマウスにＬＰＳを静脈内注射した。６時間後、Ｂ１６細胞を静脈内注射し、続いて１日目と４日目にＤＴ(５００ｎｇ／注射）をｉ．ｐ．注射した。９日目に肺の転移を分析した。
（図２Ｅ）肺の転移個数の定量的集計（左）、肺転移の代表的な画像（右）。
（図２Ｆ）肺における示された遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルは、ＤＴ処理ＷＴマウスの肺との相対比較として示される。平均値をＳＤで示す。対応のない両側ｔ検定、ｎ＝９～１０。**Ｐ ＜０．０１; *Ｐ＜０．０５．各記号は個々の動物を表している。
【0123】
図２Ｇ～２Ｊ：Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球移入マウスの肺転移個数の増加。
（図２Ｇ）Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋またはＹｍ１－Ｌｙ６Ｃ＋単球（それぞれＹｍ１＋ＭｏまたはＹｍ１－Ｍｏ）の移入が転移進行に及ぼす影響を試験するために使用される実験的デザイン。Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋とＹｍ１－Ｌｙ６Ｃ＋単球を、ＬＰＳ（２０μｇ）処理の４８時間後にＹｍ１－ＶｅｎｕｓマウスのＢＭからソートした。ＷＴマウスに、Ａｄｖａｎｃｅｄ－ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｃｔｒｌ）、Ｙｍ１＋ＭｏまたはＹｍ１－Ｍｏ（５ｘ１０５細胞）を静脈内注射した。２４時間後、Ｂ１６細胞（１×１０5細胞）を静脈内注射した。９日目、肺の転移を解析した。
（図２Ｈ）セルソートのため、ＢＭにおけるＹｍ１＋ＭｏまたはＹｍ１－Ｍｏを同定した。試料を生きたＣＤ４５．２＋細胞でプレゲートした。
（図２Ｉ）肺転移個数の定量的集計（左）、肺転移の代表画像（右）。
（図２Ｊ）肺における示された遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルは、対照肺と比較して倍率変化として示される。平均値をＳＤで示す。一元配置分散分析後にＤｕｎｎｅｔｔ検定、n = ５－７（図２Ｉおよび２Ｊ）。**** Ｐ＜０．００１; *** Ｐ＜０．００５; ** Ｐ＜０．０１; ｎ.ｓ.、有意差なし。各記号は個々の動物を表している。
（図２Ｇ）Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋またはＹｍ１－Ｌｙ６Ｃ＋単球（それぞれＹｍ１＋ＭｏまたはＹｍ１－Ｍｏ）の移入が転移進行に及ぼす影響を試験するために使用される実験的デザイン。Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋とＹｍ１－Ｌｙ６Ｃ＋単球を、ＬＰＳ（２０μｇ）処理の４８時間後にＹｍ１－ＶｅｎｕｓマウスのＢＭからソートした。ＷＴマウスに、Ａｄｖａｎｃｅｄ－ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｃｔｒｌ）、Ｙｍ１＋ＭｏまたはＹｍ１－Ｍｏ（５ｘ１０５細胞）を静脈内注射した。２４時間後、Ｂ１６細胞（１×１０5細胞）を静脈内注射した。９日目、肺の転移を解析した。
（図２Ｈ）セルソートのため、ＢＭにおけるＹｍ１＋ＭｏまたはＹｍ１－Ｍｏを同定した。試料を生きたＣＤ４５．２＋細胞でプレゲートした。
（図２Ｉ）肺転移個数の定量的集計（左）、肺転移の代表画像（右）。
（図２Ｊ）肺における示された遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルは、対照肺と比較して倍率変化として示される。平均値をＳＤで示す。一元配置分散分析後にＤｕｎｎｅｔｔ検定、n = ５－７（図２Ｉおよび２Ｊ）。**** Ｐ＜０．００１; *** Ｐ＜０．００５; ** Ｐ＜０．０１; ｎ.ｓ.、有意差なし。各記号は個々の動物を表している。
【0124】
図３の説明
（図３Ａ）Ｙｍ１－ＶｅｎｕｓマウスにＬＰＳ（２０μｇ）を静脈内注射した。４８時間後、肺におけるＹｍ１＋ ＭｏまたはＹｍ１－ Ｍｏの表面マーカーの発現をフローサイトメトリーで解析した。黒い線はアイソタイプコントロールを示す。
（図３Ｂ～３Ｄ）肺とＢＭにおけるＹｍ１＋ＭｏまたはＹｍ１－Ｍｏの遺伝子発現プロファイルを、ＲＮＡ配列解析により網羅的に比較した。図３ＢはＰＣＡの結果を、図３Ｃはボルケーノプロットを、図３Ｄは発現遺伝子のヒートマップを示す。
（図３Ｅ）Ｙｍ１＋ＭｏおよびＹｍ１－ＭｏでのｍＲＮＡの発現量。Ｙｍ１－ＶｅｎｕｓマウスにＬＰＳ(２０μｇ）を静脈内注射し、６時間後にＢ１６細胞（１×１０５細胞）を静脈内注射した。Ｙｍ１＋ＭｏおよびＹｍ１－Ｍｏは、ＬＰＳ処置後４８時間にＹｍ１－ＶｅｎｕｓマウスのＢＭから選別した。ｍＲＮＡレベルの発現を分析した。平均値をＳＤで示す。対応のない両側ｔ検定、ｎ＝３。**** Ｐ＜０．００１; ***Ｐ＜０．００５、*Ｐ＜０．０５。
（図３Ａ）Ｙｍ１－ＶｅｎｕｓマウスにＬＰＳ（２０μｇ）を静脈内注射した。４８時間後、肺におけるＹｍ１＋ ＭｏまたはＹｍ１－ Ｍｏの表面マーカーの発現をフローサイトメトリーで解析した。黒い線はアイソタイプコントロールを示す。
（図３Ｂ～３Ｄ）肺とＢＭにおけるＹｍ１＋ＭｏまたはＹｍ１－Ｍｏの遺伝子発現プロファイルを、ＲＮＡ配列解析により網羅的に比較した。図３ＢはＰＣＡの結果を、図３Ｃはボルケーノプロットを、図３Ｄは発現遺伝子のヒートマップを示す。
（図３Ｅ）Ｙｍ１＋ＭｏおよびＹｍ１－ＭｏでのｍＲＮＡの発現量。Ｙｍ１－ＶｅｎｕｓマウスにＬＰＳ(２０μｇ）を静脈内注射し、６時間後にＢ１６細胞（１×１０５細胞）を静脈内注射した。Ｙｍ１＋ＭｏおよびＹｍ１－Ｍｏは、ＬＰＳ処置後４８時間にＹｍ１－ＶｅｎｕｓマウスのＢＭから選別した。ｍＲＮＡレベルの発現を分析した。平均値をＳＤで示す。対応のない両側ｔ検定、ｎ＝３。**** Ｐ＜０．００１; ***Ｐ＜０．００５、*Ｐ＜０．０５。
【0125】
図４の説明
（図４Ａ）単球の培養上清のゼラチンザイモグラフィー。未処理またはＬＰＳ処理のＷＴマウス（左）から分離したＬｙ６Ｃ＋単球、あるいはＬＰＳ処理のＹｍ１－Ｖｅｎｕｓマウス（右）から分離したＹｍ１＋またはＹｍ１－Ｌｙ６Ｃ＋単球（右）を２４時間培養した。培養上清のゼラチナーゼ活性を測定した。実験を２回繰り返し、同様の結果を得た。
（図４Ｂ）ナイーブまたはＬＰＳ処理ＷＴマウスから単離したＬｙ６Ｃ＋単球の培養上清存在下での癌細胞の浸潤アッセイ平均値をＳＤで示す。一元配置分散分析後にＴｕｋｅｙ検定、ｎ＝３。＊Ｐ＜０．０５; ｎ.ｓ.、有意差なし。各記号は個々の動物由来培養上清を表す。
（図４Ａ）単球の培養上清のゼラチンザイモグラフィー。未処理またはＬＰＳ処理のＷＴマウス（左）から分離したＬｙ６Ｃ＋単球、あるいはＬＰＳ処理のＹｍ１－Ｖｅｎｕｓマウス（右）から分離したＹｍ１＋またはＹｍ１－Ｌｙ６Ｃ＋単球（右）を２４時間培養した。培養上清のゼラチナーゼ活性を測定した。実験を２回繰り返し、同様の結果を得た。
（図４Ｂ）ナイーブまたはＬＰＳ処理ＷＴマウスから単離したＬｙ６Ｃ＋単球の培養上清存在下での癌細胞の浸潤アッセイ平均値をＳＤで示す。一元配置分散分析後にＴｕｋｅｙ検定、ｎ＝３。＊Ｐ＜０．０５; ｎ.ｓ.、有意差なし。各記号は個々の動物由来培養上清を表す。
【0126】
図４Ｃ～４Ｅ：ＬＰＳ促進転移進行に対するＭＭＰ－９阻害薬の効果。
（図４Ｃ）転移の初期ポイントに注射されたＭＭＰ－９阻害薬の効果を検証するために用いられた実験デザイン。ＷＴマウスに０日目にＬＰＳ２０μｇを注射し、６時間後にＢ１６細胞（１×１０５細胞）をｉ．ｖ．注射した。これらのマウスに１０% ＤＭＳＯ／ＰＢＳ(阻害剤（－））またはＭＭＰ－９阻害剤（ＳＢ‐３ＣＴ、２５０μｇ）をＤａｙ－１、Ｄａｙ０、Ｄａｙ１に注射した。Ｄａｙ９に肺転移の有無を解析した。
（図４Ｄ）肺転移個数の定量的集計。
（図４Ｅ）肺における示された遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルは、対照肺と比較して倍率変化として示される。平均値をＳＤで示す。対応のない両側ｔ検定、ｎ＝３。**Ｐ＜０．０１; *Ｐ＜０．０５．各記号は個々の動物を表している。
（図４Ｃ）転移の初期ポイントに注射されたＭＭＰ－９阻害薬の効果を検証するために用いられた実験デザイン。ＷＴマウスに０日目にＬＰＳ２０μｇを注射し、６時間後にＢ１６細胞（１×１０５細胞）をｉ．ｖ．注射した。これらのマウスに１０% ＤＭＳＯ／ＰＢＳ(阻害剤（－））またはＭＭＰ－９阻害剤（ＳＢ‐３ＣＴ、２５０μｇ）をＤａｙ－１、Ｄａｙ０、Ｄａｙ１に注射した。Ｄａｙ９に肺転移の有無を解析した。
（図４Ｄ）肺転移個数の定量的集計。
（図４Ｅ）肺における示された遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルは、対照肺と比較して倍率変化として示される。平均値をＳＤで示す。対応のない両側ｔ検定、ｎ＝３。**Ｐ＜０．０１; *Ｐ＜０．０５．各記号は個々の動物を表している。
【0127】
図４Ｆ～４Ｇ：ＬＰＳ Ｍｏ移入により促進される転移に対するＭＭＰ－９阻害薬の効果。ＷＴマウスに－１日目にＬＰＳ処理マウス(ＬＰＳ Ｍｏ)から調製したＬｙ６Ｃ＋単球（５ｘ１０５細胞）を静脈内に移入した。２４時間後、Ｂ１６細胞を静脈注射した。これらのマウスに１０% ＤＭＳＯ/ＰＢＳ (阻害剤（－））またはＭＭＰ－９阻害剤（ＳＢ－３ＣＴ、２５０μｇ）をＤａｙ－１、Ｄａｙ０、Ｄａｙ１に注射した。９日目に肺の転移を分析した。
（図４Ｆ）９日目の肺転移数の定量的集計。
（図４Ｇ）肺における指定された遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを、対照肺との相対比較として示す。平均値をＳＤで示す。対応のない両側ｔ検定、ｎ＝３。*Ｐ＜０．０５; ｎ.ｓ.、有意差なし。各記号は個々の動物を表している。
（図４Ｈ）Ｌｃｎ２－／－単球の培養上清のゼラチンザイモグラフィーＬＰＳ処理したｌ Ｌｃｎ２＋／－またはＬｃｎ２－／－マウスから単離したＬｙ６Ｃ＋単球を２４時間培養した。培養上清のゼラチナーゼ活性を測定した。実験を２回繰り返し、同様の結果を得た。
（図４Ｉ）Ｌｃｎ２－／－注射による肺内転移巣の減少。ＬＰＳ ＭｏはＬＰＳ (２０μｇ）注射４８時間後にＬｃｎ２＋／－またはＬｃｎ２－／－マウスのＢＭから調製し、これらの単球をＷＴマウスに静脈内移入した。２４時間後、Ｂ１６細胞（１×１０５細胞）を静脈内注射した。９日目に肺の転移を分析した。平均値を示す。対応のない両側ｔ検定、ｎ＝６。*Ｐ＜００．０５。各記号は個々の動物を表している。
（図４Ｆ）９日目の肺転移数の定量的集計。
（図４Ｇ）肺における指定された遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを、対照肺との相対比較として示す。平均値をＳＤで示す。対応のない両側ｔ検定、ｎ＝３。*Ｐ＜０．０５; ｎ.ｓ.、有意差なし。各記号は個々の動物を表している。
（図４Ｈ）Ｌｃｎ２－／－単球の培養上清のゼラチンザイモグラフィーＬＰＳ処理したｌ Ｌｃｎ２＋／－またはＬｃｎ２－／－マウスから単離したＬｙ６Ｃ＋単球を２４時間培養した。培養上清のゼラチナーゼ活性を測定した。実験を２回繰り返し、同様の結果を得た。
（図４Ｉ）Ｌｃｎ２－／－注射による肺内転移巣の減少。ＬＰＳ ＭｏはＬＰＳ (２０μｇ）注射４８時間後にＬｃｎ２＋／－またはＬｃｎ２－／－マウスのＢＭから調製し、これらの単球をＷＴマウスに静脈内移入した。２４時間後、Ｂ１６細胞（１×１０５細胞）を静脈内注射した。９日目に肺の転移を分析した。平均値を示す。対応のない両側ｔ検定、ｎ＝６。*Ｐ＜００．０５。各記号は個々の動物を表している。
【0128】
図５の説明
図５Ａ～５Ｂ：腫瘍切除後のＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の頻度の増加。Ｂ１６細胞（１ｘ１０６細胞）をＹｍ１‐Ｖｅｎｕｓマウスの脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）接種した。７日後、手術により原発腫瘍を摘出した。
（図５Ａ）末梢血中の単球の頻度を指定された時点で分析した。９日目のＬｙ６Ｃ＋単球中のＹｍ１＋細胞の割合の代表的なフローサイトメトリープロファイル。
（図５Ｂ）腫瘍切除後の、末梢血中の白血球中のＬｙ６Ｃ＋単球の割合（上）およびＬｙ６Ｃ＋単球中のＹｍ１＋細胞の割合（下）。対応のない両側ｔ検定、ｎ＝５～６。****Ｐ＜０．００１; *Ｐ＜０．０５; ｎ.ｓ.、有意差なし。
図５Ａ～５Ｂ：腫瘍切除後のＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の頻度の増加。Ｂ１６細胞（１ｘ１０６細胞）をＹｍ１‐Ｖｅｎｕｓマウスの脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）接種した。７日後、手術により原発腫瘍を摘出した。
（図５Ａ）末梢血中の単球の頻度を指定された時点で分析した。９日目のＬｙ６Ｃ＋単球中のＹｍ１＋細胞の割合の代表的なフローサイトメトリープロファイル。
（図５Ｂ）腫瘍切除後の、末梢血中の白血球中のＬｙ６Ｃ＋単球の割合（上）およびＬｙ６Ｃ＋単球中のＹｍ１＋細胞の割合（下）。対応のない両側ｔ検定、ｎ＝５～６。****Ｐ＜０．００１; *Ｐ＜０．０５; ｎ.ｓ.、有意差なし。
【0129】
（図５Ｃ）原発腫瘍への放射線照射後の、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の頻度増加Ｂ１６細胞（１ｘ１０６細胞）をＹｍ１‐Ｖｅｎｕｓマウスの脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）接種した。７～８日後、照射なしまたは３０Ｇｙ照射の２つの治療群のいずれかに動物を無作為に割り付けた。末梢血中の単球の頻度を指定された時点で分析した。末梢血中の白血球中のＬｙ６Ｃ＋単球の割合（上）およびＬｙ６Ｃ＋単球中のＹｍ１＋細胞の割合（下）。対応のない両側ｔ検定、ｎ＝６。***Ｐ＜０．００５；ｎ.ｓ.、有意差なし。各記号は個々の動物を表している。
（図５Ｄ）腫瘍切除後の肺転移数の増加。Ｂ１６細胞（１ｘ１０6細胞）をＷＴマウスの脇腹に皮下接種した。７日後、原発腫瘍を摘出した後、２４時間後にＢ１６細胞（１×１０5細胞）を静注した。１６日目に肺の転移を分析した。肺転移数の量的要約。平均値をＳＤで示す。一元配置分散分析後にＤｕｎｎｅｔｔ検定、ｎ＝７～８。**Ｐ＜０．０１；*Ｐ＜０．０５；ｎ.ｓ.、有意差なし。各記号は個々の動物を表している。
（図５Ｅ）腫瘍切除後の肺転移に対する免疫細胞欠失の影響。Ｂ１６細胞（１ｘ１０６細胞）をＷＴマウスの脇腹に皮下接種した。７日後、原発腫瘍を摘出した後、２４時間後にＢ１６細胞（１×１０５細胞）を静注した。Ｌｙ６Ｃ＋単球および好中球（抗Ｇｒ－１）、または好中球のみ（抗Ｌｙ６Ｇ）を欠失させるために、指定されたｍＡｂまたはＰＢＳを５０μｇ／日、６日目から１５日目までこれらのマウスに注射した。１６日目に肺の転移を分析した。肺転移数の量的要約。平均値をＳＤで示す。一元配置分散分析後にＤｕｎｎｅｔｔ検定、ｎ＝６～１１。****Ｐ＜０．００１; **Ｐ＜０．０１；*Ｐ＜０．０５；ｎ.ｓ.、有意差なし。各記号は個々の動物を表している。
（図５Ｄ）腫瘍切除後の肺転移数の増加。Ｂ１６細胞（１ｘ１０6細胞）をＷＴマウスの脇腹に皮下接種した。７日後、原発腫瘍を摘出した後、２４時間後にＢ１６細胞（１×１０5細胞）を静注した。１６日目に肺の転移を分析した。肺転移数の量的要約。平均値をＳＤで示す。一元配置分散分析後にＤｕｎｎｅｔｔ検定、ｎ＝７～８。**Ｐ＜０．０１；*Ｐ＜０．０５；ｎ.ｓ.、有意差なし。各記号は個々の動物を表している。
（図５Ｅ）腫瘍切除後の肺転移に対する免疫細胞欠失の影響。Ｂ１６細胞（１ｘ１０６細胞）をＷＴマウスの脇腹に皮下接種した。７日後、原発腫瘍を摘出した後、２４時間後にＢ１６細胞（１×１０５細胞）を静注した。Ｌｙ６Ｃ＋単球および好中球（抗Ｇｒ－１）、または好中球のみ（抗Ｌｙ６Ｇ）を欠失させるために、指定されたｍＡｂまたはＰＢＳを５０μｇ／日、６日目から１５日目までこれらのマウスに注射した。１６日目に肺の転移を分析した。肺転移数の量的要約。平均値をＳＤで示す。一元配置分散分析後にＤｕｎｎｅｔｔ検定、ｎ＝６～１１。****Ｐ＜０．００１; **Ｐ＜０．０１；*Ｐ＜０．０５；ｎ.ｓ.、有意差なし。各記号は個々の動物を表している。
【0130】
図６の説明
（図６Ａ）ナイーブまたはＬＰＳ処理マウス、またはＢ１６細胞から単離した末梢血Ｌｙ６Ｃ＋単球上の表面ＣＸＣＲ４の発現。黒い線はアイソタイプコントロールを示す。
（図６Ｂ）ＣＸＣＲ４アンタゴニストによる処理によるＬｙ６Ｃ＋単球の肺蓄積の阻害。ＷＴマウスにＬＰＳ（２０μｇ）を静脈内注射し、ＡＭＤ３１００（５ｍｇ／ｋｇ、ＬＰＳ注射の１時間前と２４時間後）またはＰＢＳ（阻害剤（－））をｉ．ｐ．処理した。平均値をＳＤで示す。一元配置分散分析後にＤｕｎｎｅｔｔ検定、ｎ＝４。***Ｐ＜０．００５；**Ｐ＜０．０１；*Ｐ＜０．０５；ｎ.ｓ.、有意差なし。各記号は個々の動物を表す。
（図６Ａ）ナイーブまたはＬＰＳ処理マウス、またはＢ１６細胞から単離した末梢血Ｌｙ６Ｃ＋単球上の表面ＣＸＣＲ４の発現。黒い線はアイソタイプコントロールを示す。
（図６Ｂ）ＣＸＣＲ４アンタゴニストによる処理によるＬｙ６Ｃ＋単球の肺蓄積の阻害。ＷＴマウスにＬＰＳ（２０μｇ）を静脈内注射し、ＡＭＤ３１００（５ｍｇ／ｋｇ、ＬＰＳ注射の１時間前と２４時間後）またはＰＢＳ（阻害剤（－））をｉ．ｐ．処理した。平均値をＳＤで示す。一元配置分散分析後にＤｕｎｎｅｔｔ検定、ｎ＝４。***Ｐ＜０．００５；**Ｐ＜０．０１；*Ｐ＜０．０５；ｎ.ｓ.、有意差なし。各記号は個々の動物を表す。
【0131】
図６Ｃ～６Ｄ：腫瘍切除後の肺転移に対するＣＸＣＲ４アンタゴニストの効果。
（図６Ｃ）腫瘍切除による転移進行に対するＡＭＤ３１００治療の効果を検証するために用いた実験デザイン。Ｂ１６細胞（１ｘ１０６細胞）をＷＴマウスの脇腹に皮下接種した。６日後、原発腫瘍を摘出した後、２４時間後にＢ１６細胞（１×１０5細胞）を静注した。ＡＭＤ３１００（５ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳ(阻害剤（－））をこれらのマウスに７、９、１１、１３、および１５日目に注射した。Ｄａｙ １６に肺転移の有無を解析した。
（図６Ｄ）肺転移個数の定量的集計。平均値をＳＤで示す。対応のない両側ｔ検定、ｎ＝１０－１１。*Ｐ＜０．０５．各記号は個々の動物を表している。
（図６Ｃ）腫瘍切除による転移進行に対するＡＭＤ３１００治療の効果を検証するために用いた実験デザイン。Ｂ１６細胞（１ｘ１０６細胞）をＷＴマウスの脇腹に皮下接種した。６日後、原発腫瘍を摘出した後、２４時間後にＢ１６細胞（１×１０5細胞）を静注した。ＡＭＤ３１００（５ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳ(阻害剤（－））をこれらのマウスに７、９、１１、１３、および１５日目に注射した。Ｄａｙ １６に肺転移の有無を解析した。
（図６Ｄ）肺転移個数の定量的集計。平均値をＳＤで示す。対応のない両側ｔ検定、ｎ＝１０－１１。*Ｐ＜０．０５．各記号は個々の動物を表している。
【0132】
図７の説明
（図７Ａ）フローサイトメトリーによる肺の免疫細胞の同定。肺免疫細胞のゲート戦略サンプルを生きたＣＤ４５．２＋細胞でプレゲートした。Ｌｙ６Ｃ＋単球（Ｒ１）、Ｌｙ６Ｃ－単球（Ｒ２）、好中球（Ｒ３）および肺胞マクロファージ（Ｒ４）を同定するため、Ｌｙ６Ｃ、Ｌｙ６Ｇ、ＭＨＣＩＩ、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１１ｃ発現をフローサイトメトリーにより評価した。ＰＢＳ注射Ｙｍ１‐Ｖｅｎｕｓマウス由来の肺免疫細胞の代表的解析を示した。
（図７Ｂ）ＬＰＳ投与マウスの肺における免疫細胞の絶対数。ＷＴマウスをＬＰＳ（２０μｇ）で静注し、６時間後にＢ１６細胞（１ｘ１０５細胞）をｉ．ｖ．注射した。指定された時点で、フローサイトメトリーにより肺の免疫細胞数を計測した。平均値をＳＤで示す。各時点における対応のない両側ｔ検定、がん細胞注入との比較、ｎ＝３～４。***Ｐ＜０．００５; **Ｐ＜０．０１；*Ｐ＜０．０５。
（図７Ａ）フローサイトメトリーによる肺の免疫細胞の同定。肺免疫細胞のゲート戦略サンプルを生きたＣＤ４５．２＋細胞でプレゲートした。Ｌｙ６Ｃ＋単球（Ｒ１）、Ｌｙ６Ｃ－単球（Ｒ２）、好中球（Ｒ３）および肺胞マクロファージ（Ｒ４）を同定するため、Ｌｙ６Ｃ、Ｌｙ６Ｇ、ＭＨＣＩＩ、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１１ｃ発現をフローサイトメトリーにより評価した。ＰＢＳ注射Ｙｍ１‐Ｖｅｎｕｓマウス由来の肺免疫細胞の代表的解析を示した。
（図７Ｂ）ＬＰＳ投与マウスの肺における免疫細胞の絶対数。ＷＴマウスをＬＰＳ（２０μｇ）で静注し、６時間後にＢ１６細胞（１ｘ１０５細胞）をｉ．ｖ．注射した。指定された時点で、フローサイトメトリーにより肺の免疫細胞数を計測した。平均値をＳＤで示す。各時点における対応のない両側ｔ検定、がん細胞注入との比較、ｎ＝３～４。***Ｐ＜０．００５; **Ｐ＜０．０１；*Ｐ＜０．０５。
【0133】
図８の説明
除去抗体処理ＷＴマウスのフローサイトメトリー分析ＷＴマウスにＰＢＳ（Ｃｔｒｌ)、抗Ｌｙ６Ｇ ｍＡｂまたは抗Ｇｒ１ｍＡｂ（５０μｇ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。２４時間後、末梢血中のＬｙ６Ｃ＋単球（Ｒ１）、Ｌｙ６Ｃ－単球（Ｒ２）および好中球（Ｒ３）を同定するため、Ｌｙ６Ｃ、ＣＤ１１５およびＬｙ６Ｇ発現をフローサイトメトリーにより評価した。
除去抗体処理ＷＴマウスのフローサイトメトリー分析ＷＴマウスにＰＢＳ（Ｃｔｒｌ)、抗Ｌｙ６Ｇ ｍＡｂまたは抗Ｇｒ１ｍＡｂ（５０μｇ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。２４時間後、末梢血中のＬｙ６Ｃ＋単球（Ｒ１）、Ｌｙ６Ｃ－単球（Ｒ２）および好中球（Ｒ３）を同定するため、Ｌｙ６Ｃ、ＣＤ１１５およびＬｙ６Ｇ発現をフローサイトメトリーにより評価した。
【0134】
図９の説明
ＣＤ２０４－ＤＴＲマウス由来の末梢血のフローサイトメトリー分析。ＣＤ２０４－ＤＴＲ マウスにＤＴ（５００ｎｇ）を腹腔内投与した。２４時間後、フローサイトメトリーにより末梢血中のＬｙ６Ｃ＋単球（Ｒ１）、Ｌｙ６Ｃ－単球（Ｒ２）、好中球（Ｒ３）を同定した。
ＣＤ２０４－ＤＴＲマウス由来の末梢血のフローサイトメトリー分析。ＣＤ２０４－ＤＴＲ マウスにＤＴ（５００ｎｇ）を腹腔内投与した。２４時間後、フローサイトメトリーにより末梢血中のＬｙ６Ｃ＋単球（Ｒ１）、Ｌｙ６Ｃ－単球（Ｒ２）、好中球（Ｒ３）を同定した。
【0135】
図１０の説明
肺におけるナイーブまたはＬＰＳ ＭｏおよびＢ１６細胞の数。
（図１０Ａ）肺における移入された単球（赤矢印）と腫瘍細胞（緑矢印）の分布。ＷＴマウスにＰＫＨ２６標識ナイーブＭｏまたはＬＰＳ Ｍｏ（１ｘ１０６細胞）をｉ．ｖ．注射した。９０分後、ＷＴマウスにＰＫＨ６７標識Ｂ１６細胞（１ｘ１０６細胞）をｉ．ｖ．注射した。さらに９０分後、肺の凍結切片を蛍光顕微鏡下で観察した。元の倍率はｘ１０。
(図１０Ｂ)図１０Ａの肺におけるＢ１６細胞数（左）、移入ナイーブＭｏおよびＬＰＳ Ｍｏ（右）。対応のない両側ｔ検定、ｎ＝５～６、ｎ．ｓ．、有意差なし。各記号は個々の動物を表す。
肺におけるナイーブまたはＬＰＳ ＭｏおよびＢ１６細胞の数。
（図１０Ａ）肺における移入された単球（赤矢印）と腫瘍細胞（緑矢印）の分布。ＷＴマウスにＰＫＨ２６標識ナイーブＭｏまたはＬＰＳ Ｍｏ（１ｘ１０６細胞）をｉ．ｖ．注射した。９０分後、ＷＴマウスにＰＫＨ６７標識Ｂ１６細胞（１ｘ１０６細胞）をｉ．ｖ．注射した。さらに９０分後、肺の凍結切片を蛍光顕微鏡下で観察した。元の倍率はｘ１０。
(図１０Ｂ)図１０Ａの肺におけるＢ１６細胞数（左）、移入ナイーブＭｏおよびＬＰＳ Ｍｏ（右）。対応のない両側ｔ検定、ｎ＝５～６、ｎ．ｓ．、有意差なし。各記号は個々の動物を表す。
【0136】
図１１の説明
ＬＰＳの有無で癌細胞を注入したＷＴマウス（青色の影の部分）またはＹｍ１－Ｖｅｎｕｓマウス（赤色）における肺細胞のフローサイトメトリー解析。
（図１１Ａ）ＷＴマウスまたはＹｍ１－ＶｅｎｕｓマウスにＬＰＳをｉ．ｖ．注射した後、Ｂ１６細胞をｉ．ｖ．注射した。４８時間後、図７Ａに示すとおり肺細胞を染色した。数字は、ＣＤ４５．２＋ＣＤ１１ｃ－ＣＤ１１ｂ＋ＭＨＣＩＩ－Ｌｙ６Ｃ＋細胞（Ｒ１；Ｌｙ６Ｃ＋単球、Ｒ２；Ｌｙ６Ｃ－単球）におけるＹｍ１＋細胞の割合を示す。
(図１１Ｂ）図１１Ａの肺におけるＹｍ１－Ｖｅｎｕｓ＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の絶対数平均値をＳＤで示す。対応のない両側ｔ検定、ｎ＝５～７。****Ｐ＜０．００１．
ＬＰＳの有無で癌細胞を注入したＷＴマウス（青色の影の部分）またはＹｍ１－Ｖｅｎｕｓマウス（赤色）における肺細胞のフローサイトメトリー解析。
（図１１Ａ）ＷＴマウスまたはＹｍ１－ＶｅｎｕｓマウスにＬＰＳをｉ．ｖ．注射した後、Ｂ１６細胞をｉ．ｖ．注射した。４８時間後、図７Ａに示すとおり肺細胞を染色した。数字は、ＣＤ４５．２＋ＣＤ１１ｃ－ＣＤ１１ｂ＋ＭＨＣＩＩ－Ｌｙ６Ｃ＋細胞（Ｒ１；Ｌｙ６Ｃ＋単球、Ｒ２；Ｌｙ６Ｃ－単球）におけるＹｍ１＋細胞の割合を示す。
(図１１Ｂ）図１１Ａの肺におけるＹｍ１－Ｖｅｎｕｓ＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の絶対数平均値をＳＤで示す。対応のない両側ｔ検定、ｎ＝５～７。****Ｐ＜０．００１．
【0137】
図１２の説明
ＤＴ処理Ｙｍ１－ＤＴＲ－Ｖｅｎｕｓマウスのフローサイトメトリー分析。Ｙｍ１－ＤＴＲ－ＶｅｎｕｓマウスにＤＴを腹腔内注射した。４８時間後、末梢血中のＬｙ６Ｃ＋単球（Ｒ１）をフローサイトメトリーで解析した。ＤＴ注射はＹｍ１Ｖｅｎｕｓ＋Ｌｙ６Ｃ＋単球を特異的に欠失させた。
ＤＴ処理Ｙｍ１－ＤＴＲ－Ｖｅｎｕｓマウスのフローサイトメトリー分析。Ｙｍ１－ＤＴＲ－ＶｅｎｕｓマウスにＤＴを腹腔内注射した。４８時間後、末梢血中のＬｙ６Ｃ＋単球（Ｒ１）をフローサイトメトリーで解析した。ＤＴ注射はＹｍ１Ｖｅｎｕｓ＋Ｌｙ６Ｃ＋単球を特異的に欠失させた。
【0138】
図１３の説明
ＬＰＳ注射Ｙｍ１－Ｖｅｎｕｓマウス由来のＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球またはＹｍ１-Ｌｙ６Ｃ＋単球の遺伝子発現プロファイルを、ＲＮＡ－ｓｅｑ解析により網羅的に比較した。
ＬＰＳ注射Ｙｍ１－Ｖｅｎｕｓマウス由来のＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球またはＹｍ１-Ｌｙ６Ｃ＋単球の遺伝子発現プロファイルを、ＲＮＡ－ｓｅｑ解析により網羅的に比較した。
【0139】
図１４の説明
ＭＭＰ－９阻害薬の連続注射は、ＬＰＳ促進肺転移を抑制する。
（図１４Ａ）ＭＭＰ－９阻害薬の連続注射の効果を検証するために用いられる実験デザイン。ＷＴマウスに０日目にＬＰＳ２０μｇを注射し、６時間後にＢ１６細胞（１ｘ１０５細胞）をｉ．ｖ．注射した。これらのマウスは、１０% ＤＭＳＯ／ＰＢＳ(阻害剤（－））またはＭＭＰ－９阻害剤（ＳＢ－３ＣＴ，２５０μｇ）をＤａｙ －１～８で毎日注入した。９日目に肺の転移を分析した。
（図１４Ｂ）肺転移個数の定量的集計。
（図１４Ｃ）図１４Ｂの肺におけるｍＲＮＡ発現レベル。指定された遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルをｑＲＴ－ＰＣＲにより測定し、対照肺と比較して倍率変化として示す。平均値をＳＤで示す。対応のない両側ｔ検定、ｎ＝８～９、**** Ｐ＜０．００１; ** Ｐ＜０．０１。各記号は個々の動物を表す。
ＭＭＰ－９阻害薬の連続注射は、ＬＰＳ促進肺転移を抑制する。
（図１４Ａ）ＭＭＰ－９阻害薬の連続注射の効果を検証するために用いられる実験デザイン。ＷＴマウスに０日目にＬＰＳ２０μｇを注射し、６時間後にＢ１６細胞（１ｘ１０５細胞）をｉ．ｖ．注射した。これらのマウスは、１０% ＤＭＳＯ／ＰＢＳ(阻害剤（－））またはＭＭＰ－９阻害剤（ＳＢ－３ＣＴ，２５０μｇ）をＤａｙ －１～８で毎日注入した。９日目に肺の転移を分析した。
（図１４Ｂ）肺転移個数の定量的集計。
（図１４Ｃ）図１４Ｂの肺におけるｍＲＮＡ発現レベル。指定された遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルをｑＲＴ－ＰＣＲにより測定し、対照肺と比較して倍率変化として示す。平均値をＳＤで示す。対応のない両側ｔ検定、ｎ＝８～９、**** Ｐ＜０．００１; ** Ｐ＜０．０１。各記号は個々の動物を表す。
【0140】
図１５の説明
Ｙｍ１発現量とＣＤ８８およびＣＤ１５７の発現量との正相関
（図１５Ａ）Ｌｙ６Ｇ陰性Ｌｙ６Ｃ陽性単球を、さらにＹｍ１－Ｖｅｎｕｓ陽性単球とＹｍ１－Ｖｅｎｕｓ陰性単球とに分け、２単球間で発現差のある表面抗原（右図太字の抗原）を選別した。
（図１５Ｂ）定常状態とＬＰＳ投与４８時間後の野生型マウスの骨髄の好中球（Ｌｙ６Ｇ陽性）、Ｌｙ６Ｃ陽性Ｙｍ１陽性単球およびＬｙ６Ｃ陽性Ｙｍ１陰性単球における、ＣＤ８８およびＣＤ１５７の発現量をフローサイトメトリーで解析した結果である。この図は、ＣＤ８８／ＣＤ１５７が、Ｖｅｎｕｓ陽性単球選択的に発現するマーカーであることを示す。ナイーブＹｍ１－Ｖｅｎｕｓマウスの骨髄にはＹｍ１－Ｖｅｎｕｓ陽性単球はほとんど存在しなかったが（上段）、ＬＰＳ投与４８時間後の骨髄ではＹｍ１－Ｖｅｎｕｓ陽性単球が著明に増加した（約３０％、下段）。Ｙｍ１－Ｖｅｎｕｓ陽性単球は大部分がＣＤ８８／ＣＤ１５７二重陽性（約６０％）であったのに対し、Ｙｍ１－Ｖｅｎｕｓ陰性単球の多くは、これらのマーカーに関して陰性であった。本結果から、ＣＤ８８分子およびＣＤ１５７分子が、Ｙｍ１陽性単球に選択的に高発現することが証明された。
（図１５Ｃ）ＬＰＳ投与４８時間後の後の野生型マウスの骨髄細胞における、Ｙｍ１発現量のフローサイトメトリー解析結果である。ナイーブ野生型マウスの骨髄にはＹｍ１陽性単球はほとんど存在しなかったが（上段）、ＬＰＳ投与４８時間後の骨髄では、Ｙｍ１陽性単球が増加すること、ならびに、それらの単球がＣＤ８８およびＣＤ１５７を高発現することが示された（下段）。本結果から、Ｙｍ１発現量と、ＣＤ８８およびＣＤ１５７の発現量とが正の相関関係を有することが示された。
（図１５Ｄ）ＣＤ８８／ＣＤ１５７の２つのマーカーにより分取したＹｍ１陽性制御性単球の遺伝子発現解析結果を示す図である。ＣＤ８８／ＣＤ１５７の２つのマーカーを用いて、Ｙｍ１陽性制御性単球を効率よく分取し、遺伝子発現解析できることが示された。また、ＬＰＳ投与４８時間後の骨髄から、ＣＤ８８／ＣＤ１５７二重陽性単球（ｄｏｕｂｌｅ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ，ＤＰ）および二重陰性単球（ｄｏｕｂｌｅ－ｎｅｇａｔｉｖｅ，ＤＮ）を分取し、Ｙｍ１遺伝子（Ｃｈｉｌ３）およびその他のＹｍ１陽性単球関連遺伝子（Ｍｍｐ９）、Ｍ１関連遺伝子（Ｎｏｓ２、Ｔｎｆ、Ｉｌ６）、Ｍ２関連遺伝子（Ａｒｇ１、Ｉｌ１０）の発現レベルをＰＣＲで定量した結果、ＤＰ（黒のバー）はＤＮ（白のバー）に比べ、Ｃｈｉｌ３発現レベルおよびＹｍ１陽性単球関連遺伝子（Ｍｍｐ９）が顕著に高いことが示された。
Ｙｍ１発現量とＣＤ８８およびＣＤ１５７の発現量との正相関
（図１５Ａ）Ｌｙ６Ｇ陰性Ｌｙ６Ｃ陽性単球を、さらにＹｍ１－Ｖｅｎｕｓ陽性単球とＹｍ１－Ｖｅｎｕｓ陰性単球とに分け、２単球間で発現差のある表面抗原（右図太字の抗原）を選別した。
（図１５Ｂ）定常状態とＬＰＳ投与４８時間後の野生型マウスの骨髄の好中球（Ｌｙ６Ｇ陽性）、Ｌｙ６Ｃ陽性Ｙｍ１陽性単球およびＬｙ６Ｃ陽性Ｙｍ１陰性単球における、ＣＤ８８およびＣＤ１５７の発現量をフローサイトメトリーで解析した結果である。この図は、ＣＤ８８／ＣＤ１５７が、Ｖｅｎｕｓ陽性単球選択的に発現するマーカーであることを示す。ナイーブＹｍ１－Ｖｅｎｕｓマウスの骨髄にはＹｍ１－Ｖｅｎｕｓ陽性単球はほとんど存在しなかったが（上段）、ＬＰＳ投与４８時間後の骨髄ではＹｍ１－Ｖｅｎｕｓ陽性単球が著明に増加した（約３０％、下段）。Ｙｍ１－Ｖｅｎｕｓ陽性単球は大部分がＣＤ８８／ＣＤ１５７二重陽性（約６０％）であったのに対し、Ｙｍ１－Ｖｅｎｕｓ陰性単球の多くは、これらのマーカーに関して陰性であった。本結果から、ＣＤ８８分子およびＣＤ１５７分子が、Ｙｍ１陽性単球に選択的に高発現することが証明された。
（図１５Ｃ）ＬＰＳ投与４８時間後の後の野生型マウスの骨髄細胞における、Ｙｍ１発現量のフローサイトメトリー解析結果である。ナイーブ野生型マウスの骨髄にはＹｍ１陽性単球はほとんど存在しなかったが（上段）、ＬＰＳ投与４８時間後の骨髄では、Ｙｍ１陽性単球が増加すること、ならびに、それらの単球がＣＤ８８およびＣＤ１５７を高発現することが示された（下段）。本結果から、Ｙｍ１発現量と、ＣＤ８８およびＣＤ１５７の発現量とが正の相関関係を有することが示された。
（図１５Ｄ）ＣＤ８８／ＣＤ１５７の２つのマーカーにより分取したＹｍ１陽性制御性単球の遺伝子発現解析結果を示す図である。ＣＤ８８／ＣＤ１５７の２つのマーカーを用いて、Ｙｍ１陽性制御性単球を効率よく分取し、遺伝子発現解析できることが示された。また、ＬＰＳ投与４８時間後の骨髄から、ＣＤ８８／ＣＤ１５７二重陽性単球（ｄｏｕｂｌｅ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ，ＤＰ）および二重陰性単球（ｄｏｕｂｌｅ－ｎｅｇａｔｉｖｅ，ＤＮ）を分取し、Ｙｍ１遺伝子（Ｃｈｉｌ３）およびその他のＹｍ１陽性単球関連遺伝子（Ｍｍｐ９）、Ｍ１関連遺伝子（Ｎｏｓ２、Ｔｎｆ、Ｉｌ６）、Ｍ２関連遺伝子（Ａｒｇ１、Ｉｌ１０）の発現レベルをＰＣＲで定量した結果、ＤＰ（黒のバー）はＤＮ（白のバー）に比べ、Ｃｈｉｌ３発現レベルおよびＹｍ１陽性単球関連遺伝子（Ｍｍｐ９）が顕著に高いことが示された。
【0141】
１．がん転移の促進因子
炎症は、癌転移を促進する最も重要な因子の一つである（参考文献２、７～１１および２６～２８）。転移カスケードには、隣接組織への癌細胞の浸潤、血管内への侵入、血液循環中での生存、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の血管外遊出、および、その後の遠隔部位での伸長など、複数の過程が関与している（参考文献２９）。これらのステップの中で、遠隔部位でのＣＴＣの伸長は、実験的転移モデル（参考文献８、１０、１１、２７、２８および３０）において全身性炎症により増強されることが証明された。しかし、ＣＴＣに由来する炎症誘発性転移の正確な機序は不明のままである。これらの機序を探るべく、まず、実験的転移モデルにおいて転移促進の観点から、異なるＴｏｌｌ様受容体（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＴＬＲ）リガンドにより誘導されるいくつかの型の全身性炎症を比較した（図１Ａ）。マウスを異なるＴＬＲリガンドで処理し、続いてＢ１６メラノーマ細胞の静脈内（ｉ．ｖ．）注射を行った。これまでの報告（参考文献８、１０および２８）と一致して、リポ多糖（ＬＰＳ）を尾静脈から全身注射すると、肺のＣＴＣに由来するＢ１６メラノーマ細胞の転移巣の形成が促進された（図１Ｂおよび１Ｃ）。Ｂ１６メラノーマ細胞に高発現するＰｒｅｍｅｌａｎｏｓｏｍｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｐｍｅｌ）およびＤｏｐａｃｈｒｏｍｅ ｔａｕｔｏｍｅｒａｓｅ（Ｄｃｔ）遺伝子のｍＲＮＡ発現量から、いずれもＢ１６メラノーマ細胞に高発現しており（参考文献３１）、ＬＰＳ投与マウスの肺では有意に上昇しており（図１Ｄ）、肺におけるＢ１６メラノーマ細胞の増殖が示された。一方、ＣｐＧ－ＯＤＮまたはＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は、転移に対して無視できる効果しか示さなかったことから（図１Ｂ～１Ｄ）、全身性炎症による転移の増強は炎症の様式に依存することが示された。
炎症は、癌転移を促進する最も重要な因子の一つである（参考文献２、７～１１および２６～２８）。転移カスケードには、隣接組織への癌細胞の浸潤、血管内への侵入、血液循環中での生存、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の血管外遊出、および、その後の遠隔部位での伸長など、複数の過程が関与している（参考文献２９）。これらのステップの中で、遠隔部位でのＣＴＣの伸長は、実験的転移モデル（参考文献８、１０、１１、２７、２８および３０）において全身性炎症により増強されることが証明された。しかし、ＣＴＣに由来する炎症誘発性転移の正確な機序は不明のままである。これらの機序を探るべく、まず、実験的転移モデルにおいて転移促進の観点から、異なるＴｏｌｌ様受容体（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＴＬＲ）リガンドにより誘導されるいくつかの型の全身性炎症を比較した（図１Ａ）。マウスを異なるＴＬＲリガンドで処理し、続いてＢ１６メラノーマ細胞の静脈内（ｉ．ｖ．）注射を行った。これまでの報告（参考文献８、１０および２８）と一致して、リポ多糖（ＬＰＳ）を尾静脈から全身注射すると、肺のＣＴＣに由来するＢ１６メラノーマ細胞の転移巣の形成が促進された（図１Ｂおよび１Ｃ）。Ｂ１６メラノーマ細胞に高発現するＰｒｅｍｅｌａｎｏｓｏｍｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｐｍｅｌ）およびＤｏｐａｃｈｒｏｍｅ ｔａｕｔｏｍｅｒａｓｅ（Ｄｃｔ）遺伝子のｍＲＮＡ発現量から、いずれもＢ１６メラノーマ細胞に高発現しており（参考文献３１）、ＬＰＳ投与マウスの肺では有意に上昇しており（図１Ｄ）、肺におけるＢ１６メラノーマ細胞の増殖が示された。一方、ＣｐＧ－ＯＤＮまたはＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は、転移に対して無視できる効果しか示さなかったことから（図１Ｂ～１Ｄ）、全身性炎症による転移の増強は炎症の様式に依存することが示された。
【0142】
炎症状態での転移には、好中球および単球が関与することが報告されている（参考文献７および９～１１）。実際に、炎症の初期（ＬＰＳの全身注射後１～２日目）には、好中球および単球の両方が肺に蓄積した（図７Ａおよび７Ｂ）。そこで、炎症による転移促進における好中球および単球の役割に着目した。抗Ｌｙ６Ｇモノクローナル抗体（ｍＡｂ）注射による好中球の枯渇は、肺転移に影響を及ぼさなかったが（図１ＥおよびＦならびに図８）、一方、Ｌｙ６Ｃ－単球ではなく、好中球およびＬｙ６Ｃ＋単球の両方を枯渇させる抗Ｇｒ－１ ｍＡｂは転移形成を抑制したことから（図１Ｇおよび図８）、好中球ではなく、Ｌｙ６Ｃ＋単球が、ＬＰＳの全身注射によって誘発された転移促進に寄与したことが示唆された。
【0143】
本発明者らはこれまでに、ＣＤ２０４－ＤＴＲマウス（参考文献３２）において、ＢＭおよび末梢血単球は、クラスＡスカベンジャー受容体（参考文献３２）であるＣＤ２０４を高発現し、好中球ではなくＬｙ６Ｃ＋単球およびＬｙ６Ｃ－単球の両方がジフテリアトキシン（ＤＴ）注射によって末梢血中で特異的に欠失していることを報告している（図９）。これらのマウスでは、ＤＴ注入（図１Ｈ～１Ｊ)によって転移性病巣の数が減少し、単球が肺転移の促進に寄与していることを示した。抗Ｇｒ－１ ｍＡｂを注入してもＬＰＳによる炎症性サイトカイン産生は増加せず（図１Ｋ）、抗Ｇｒ－１ ｍＡｂによる転移抑制は炎症性サイトカイン産生抑制に起因しないことが示された。
【0144】
近年、Ａｌｂｒｅｎｇｕｅｓらは、マウスにＬＰＳを鼻腔内（ｉ．ｎ．）注射した場合、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）が、休眠癌細胞の覚醒と肺の転移性病変の増殖とに重要な役割を果たすことを報告した（参考文献９）。そこで、肺におけるＮＥＴ形成に関してＬＰＳ投与のｉ．ｎ．経路とｉ．ｖ．経路とを比較した。本発明者らが、これまでに報告したように、ＬＰＳのｉ．ｎ．注射は、肺におけるＮＥＴ形成の特異的マーカーであるヒストンＨ３のシトルリン化を誘導した。一方で、尾静脈を介したＬＰＳの注入は、肺におけるＮＥＴ形成を誘導しなかった（図１ＰおよびＱ）。これらの結果は、ＮＥＴ形成がＬＰＳの全身注射の場合、炎症誘導転移促進に起因しないことを示唆する。
【0145】
ＣＴＣに由来する全身性炎症誘導転移におけるＬｙ６Ｃ＋単球の役割をさらに確認するために、ナイーブマウスまたはＬＰＳ注射マウスのいずれかからＬｙ６Ｃ＋単球を精製し、ナイーブマウスにこれらの単球を静脈注射した。その後、がん細胞を注入した（図１Ｌ）。図１Ｍ～１Ｏに示すように、ＬＰＳを注射したマウス（ＬＰＳ Ｍｏ)由来のＬｙ６Ｃ＋単球は肺における転移巣の形成を促進したが、ナイーブマウス（ナイーブＭｏ）由来のＬｙ６Ｃ＋単球は促進しなかった。これらの細胞の注入後すぐに、肺における転移単球およびＢ１６細胞の数を計測した。しかし、ナイーブＭｏ移入マウスとＬＰＳ Ｍｏ移入マウスでは肺におけるこれらの細胞の細胞数に有意差は認められず（図１０）、ナイーブＭｏとＬＰＳ Ｍｏとの間で、肺における機能的差異が示唆された。まとめると、ＬＰＳの全身注射は、Ｌｙ６Ｃ＋単球に転移を促進する能力を付与する。
【0146】
以上より、全身性炎症によって加速される肺転移は、好中球ではなく、Ｌｙ６Ｃｈｉ単球によって促進されることが示された。
【0147】
２．転移に寄与する単球サブセット
次に、ＬＰＳで処理したマウスにおけるＬｙ６Ｃ＋単球の特性を明らかにすることを試みた。本発明者らはこれまでに、Ｙｍ１の高発現によって特徴付けられるＬｙ６Ｃ＋単球の亜集団を同定している（参考文献２２）。Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球は、ＬＰＳ投与や組織障害によって引き起こされる全身性炎症の回復フェーズにおいて、ＢＭにおいて大幅に拡大した。傷害部位に浸潤したこれらの単球は、免疫調節および組織修復表現型を示した。まず、Ｙｍ１‐Ｖｅｎｕｓマウスを用いて、全身性炎症後の肺におけるＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の蓄積をモニターした。Ｙｍ１－ＶｅｎｕｓマウスにＬＰＳを注入すると、多数のＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球が肺に蓄積した（図２Ａ～２Ｃ）。さらに、ＣｐＧ－ＯＤＮまたはＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（図２Ａ～２Ｃ）のいずれかを注入したマウスの肺に少数のＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球が見つかったが（図２Ａ～２Ｃ）、いずれも肺における転移形成には影響を及ぼさなかった（図１Ｂ～２Ｄ）。また、ＬＰＳと癌細胞の両方を注入したマウスにもＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の数の増加が見られた（図１１ＡおよびＢ）。これは、肺転移におけるＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の役割を示唆している。
次に、ＬＰＳで処理したマウスにおけるＬｙ６Ｃ＋単球の特性を明らかにすることを試みた。本発明者らはこれまでに、Ｙｍ１の高発現によって特徴付けられるＬｙ６Ｃ＋単球の亜集団を同定している（参考文献２２）。Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球は、ＬＰＳ投与や組織障害によって引き起こされる全身性炎症の回復フェーズにおいて、ＢＭにおいて大幅に拡大した。傷害部位に浸潤したこれらの単球は、免疫調節および組織修復表現型を示した。まず、Ｙｍ１‐Ｖｅｎｕｓマウスを用いて、全身性炎症後の肺におけるＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の蓄積をモニターした。Ｙｍ１－ＶｅｎｕｓマウスにＬＰＳを注入すると、多数のＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球が肺に蓄積した（図２Ａ～２Ｃ）。さらに、ＣｐＧ－ＯＤＮまたはＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（図２Ａ～２Ｃ）のいずれかを注入したマウスの肺に少数のＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球が見つかったが（図２Ａ～２Ｃ）、いずれも肺における転移形成には影響を及ぼさなかった（図１Ｂ～２Ｄ）。また、ＬＰＳと癌細胞の両方を注入したマウスにもＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の数の増加が見られた（図１１ＡおよびＢ）。これは、肺転移におけるＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の役割を示唆している。
【0148】
本発明者らはこれまでに、Ｙｍ１発現細胞をＤＴ注射により欠失させたＹｍ１－ＤＴＲマウスを作成した（図１２）。図２Ｄ～２Ｆに示すように、１日目と４日目のＹｍ１陽性細胞の一過性欠失は、ＬＰＳ注射によって誘導された肺転移を有意に抑制した。さらに、ＣＴＣに由来する転移の促進におけるＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の役割を明らかにするため、ＬＰＳ処理したＹｍ１－ＶｅｎｕｓマウスのＢＭからＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球またはＹｍ１－Ｌｙ６Ｃ＋単球を精製し、それらの細胞をナイーブマウスに注入した。その後、がん細胞を注入した（図２Ｇおよび２Ｈ）。Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の注射は、Ｙｍ１－Ｌｙ６Ｃ＋単球の注射と比較して、肺内に多数の転移巣を生じた（図２Ｉおよび２Ｊ）。Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球は肺転移を促進することが明らかになった。
【0149】
以上より、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球サブセットが、肺転移に重要な役割を果たすことが示された。
【0150】
３．Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球により発現される転移関連遺伝子
Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球による転移促進の根底にあるメカニズムの解明のため、全身性炎症中に肺内に蓄積したＹｍ１－Ｖｅｎｕｓ＋Ｌｙ６Ｃ＋単球サブ集団の特性決定を試みた。フローサイトメトリー解析の結果、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球サブ集団は、Ｙｍ１－Ｌｙ６Ｃ＋単球サブ集団と同レベルの、単球表面マーカーを発現していることがわかった（図３Ａ）。次いで、ＲＮＡシークエンシング分析により、ＬＰＳ処理マウス由来のＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球サブ集団とＹｍ１－Ｌｙ６Ｃ＋単球サブ集団との間でｍＲＮＡ発現プロファイルを包括的に比較した。ＰＣＡ解析の結果、２つの単球サブセットは肺への浸潤後に明らかな遺伝子発現の差を示すことが明らかになった（図３Ｂ）。さらに、肺単球サブセットの遺伝子発現は、既報のＢＭ単球サブセット（参考文献２２)とは明らかに異なっていた（図３Ｂ）。Ｍ２マクロファージ（参考文献３３）のマーカーとして知られるＣｈｉ３ｌ３（Ｙｍ１コード遺伝子）は、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球で高発現しているが、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球は、他のどのＭ２遺伝子も高発現しなかった（図１３）。興味深いことに、Ｍｍｐ９、Ｖｅｇｆ、Ｃｏｘ２、Ｉｌ１ｂなどのいくつかの転移関連遺伝子（参考文献３４）の発現はＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球で亢進していたが、Ｉｌ１ｂを除く炎症性サイトカインの発現量は２つのサブセット間で差がなかった（図３Ｃおよび３Ｄならびに図７）。これらの遺伝子に加えて、Ｌｃｎ２も、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球で高発現していた。Ｌｃｎ２は、ＭＭＰ－９を安定化させることによりＭＭＰ－９活性を亢進させることが報告されている（参考文献３５）。Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球におけるこれらの高発現は、ＰＣＲ解析によっても確認された（図３Ｅ）。
Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球による転移促進の根底にあるメカニズムの解明のため、全身性炎症中に肺内に蓄積したＹｍ１－Ｖｅｎｕｓ＋Ｌｙ６Ｃ＋単球サブ集団の特性決定を試みた。フローサイトメトリー解析の結果、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球サブ集団は、Ｙｍ１－Ｌｙ６Ｃ＋単球サブ集団と同レベルの、単球表面マーカーを発現していることがわかった（図３Ａ）。次いで、ＲＮＡシークエンシング分析により、ＬＰＳ処理マウス由来のＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球サブ集団とＹｍ１－Ｌｙ６Ｃ＋単球サブ集団との間でｍＲＮＡ発現プロファイルを包括的に比較した。ＰＣＡ解析の結果、２つの単球サブセットは肺への浸潤後に明らかな遺伝子発現の差を示すことが明らかになった（図３Ｂ）。さらに、肺単球サブセットの遺伝子発現は、既報のＢＭ単球サブセット（参考文献２２)とは明らかに異なっていた（図３Ｂ）。Ｍ２マクロファージ（参考文献３３）のマーカーとして知られるＣｈｉ３ｌ３（Ｙｍ１コード遺伝子）は、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球で高発現しているが、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球は、他のどのＭ２遺伝子も高発現しなかった（図１３）。興味深いことに、Ｍｍｐ９、Ｖｅｇｆ、Ｃｏｘ２、Ｉｌ１ｂなどのいくつかの転移関連遺伝子（参考文献３４）の発現はＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球で亢進していたが、Ｉｌ１ｂを除く炎症性サイトカインの発現量は２つのサブセット間で差がなかった（図３Ｃおよび３Ｄならびに図７）。これらの遺伝子に加えて、Ｌｃｎ２も、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球で高発現していた。Ｌｃｎ２は、ＭＭＰ－９を安定化させることによりＭＭＰ－９活性を亢進させることが報告されている（参考文献３５）。Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球におけるこれらの高発現は、ＰＣＲ解析によっても確認された（図３Ｅ）。
【0151】
以上より、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球は、転移関連遺伝子を発現することが示された。
【0152】
４．Ｌｙ６Ｃ＋単球促進肺転移におけるＭＭＰ－９
ＭＭＰ－９は、癌細胞の浸潤および転移に重要な役割を果たしているため（参考文献３６～３９）、次いで、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球による転移促進におけるＭＭＰ－９の役割を調べることを試みた。まず、精製Ｌｙ６Ｃ＋単球の培養上清中のＭＭＰ－９のタンパク質レベルを、ゼラチンザイモグラフィーを用いて調べた。ＬＰＳ Ｍｏの培養上清では、ナイーブＭｏと比較して、ＭＭＰ－９の潜在型であるｐｒｏＭＭＰ－９のタンパク質レベルが高かった（図４Ａ）。また、ＬＰＳ ＭｏのＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球は、ＬＰＳ ＭｏのＹｍ１－Ｌｙ６Ｃ＋単球よりも、ｐｒｏＭＭＰ－９のより高いタンパクレベルを示すことが確認された（図４Ａ）。次に、ＬＰＳ Ｍｏの培養上清がｉｎ ｖｉｔｒｏで癌細胞浸潤を促進するかどうかについて、Ｍａｔｒｉｇｅｌ浸潤アッセイを用いて検証した。ＬＰＳ Ｍｏの培養上清は、ナイーブＭｏと比較して癌細胞浸潤の有意な増加を誘導した（図４Ｂ）。次いで、転移に対するＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球由来ＭＭＰ－９の生体内での寄与を検証した。ＭＭＰ－９阻害薬の連続注射はＬＰＳ促進肺転移を抑制した（図１４）。しかし、これまでの報告では、ＭＭＰ－９は細胞外マトリックスリモデリング（ＥＣＭ）を介して肺の休眠癌細胞の覚醒を誘導するだけでなく、転移後期における腫瘍増殖の伸長も誘導することが示唆されている（参考文献９）。したがって、ｉｎ ｖｉｖｏでＭＭＰ－９酵素活性を阻害するのは初期の時点のみであるため、ＷＴマウスにＭＭＰ－９阻害剤をＤａｙ－１、０、１のみ注射した（図４Ｃ）。これらの時点でＷＴマウスに阻害薬を投与すると、転移巣の数も抑制された（図４ＤおよびＥ）。ＬＰＳ Ｍｏを注入した場合の転移促進効果も阻害剤の早期注入により打ち消された（図４ＦおよびＧ）。さらに、リポカリン２（Ｌｃｎ２）欠損マウス（参考文献４０）を用いて、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球由来ＭＭＰ－９が転移の進行の原因であることを確認した。上記のとおり、Ｌｃｎ２はＭＭＰ－９の安定性を担っていることが報告されている（参考文献３５）。実際、Ｌｃｎ２－／－ ＬＰＳ ＭｏのＭＭＰ－９のタンパクレベルは、Ｌｃｎ２＋/－ ＬＰＳ Ｍｏのタンパクレベルよりも低かった（図４Ｈ）。Ｌｃｎ２－／－ ＬＰＳ Ｍｏ注射により、Ｌｃｎ２＋／－ ＬＰＳ Ｍｏ注射の場合と比較して、肺内の転移性病巣の数が減少した（図４Ｉ）。以上の結果を総合すると、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球由来ＭＭＰ－９は、肺転移の促進に強い影響を及ぼすことが示された。すなわち、ＭＭＰ－９はＬｙ６Ｃ＋単球促進肺転移に必須であることが示された。
ＭＭＰ－９は、癌細胞の浸潤および転移に重要な役割を果たしているため（参考文献３６～３９）、次いで、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球による転移促進におけるＭＭＰ－９の役割を調べることを試みた。まず、精製Ｌｙ６Ｃ＋単球の培養上清中のＭＭＰ－９のタンパク質レベルを、ゼラチンザイモグラフィーを用いて調べた。ＬＰＳ Ｍｏの培養上清では、ナイーブＭｏと比較して、ＭＭＰ－９の潜在型であるｐｒｏＭＭＰ－９のタンパク質レベルが高かった（図４Ａ）。また、ＬＰＳ ＭｏのＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球は、ＬＰＳ ＭｏのＹｍ１－Ｌｙ６Ｃ＋単球よりも、ｐｒｏＭＭＰ－９のより高いタンパクレベルを示すことが確認された（図４Ａ）。次に、ＬＰＳ Ｍｏの培養上清がｉｎ ｖｉｔｒｏで癌細胞浸潤を促進するかどうかについて、Ｍａｔｒｉｇｅｌ浸潤アッセイを用いて検証した。ＬＰＳ Ｍｏの培養上清は、ナイーブＭｏと比較して癌細胞浸潤の有意な増加を誘導した（図４Ｂ）。次いで、転移に対するＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球由来ＭＭＰ－９の生体内での寄与を検証した。ＭＭＰ－９阻害薬の連続注射はＬＰＳ促進肺転移を抑制した（図１４）。しかし、これまでの報告では、ＭＭＰ－９は細胞外マトリックスリモデリング（ＥＣＭ）を介して肺の休眠癌細胞の覚醒を誘導するだけでなく、転移後期における腫瘍増殖の伸長も誘導することが示唆されている（参考文献９）。したがって、ｉｎ ｖｉｖｏでＭＭＰ－９酵素活性を阻害するのは初期の時点のみであるため、ＷＴマウスにＭＭＰ－９阻害剤をＤａｙ－１、０、１のみ注射した（図４Ｃ）。これらの時点でＷＴマウスに阻害薬を投与すると、転移巣の数も抑制された（図４ＤおよびＥ）。ＬＰＳ Ｍｏを注入した場合の転移促進効果も阻害剤の早期注入により打ち消された（図４ＦおよびＧ）。さらに、リポカリン２（Ｌｃｎ２）欠損マウス（参考文献４０）を用いて、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球由来ＭＭＰ－９が転移の進行の原因であることを確認した。上記のとおり、Ｌｃｎ２はＭＭＰ－９の安定性を担っていることが報告されている（参考文献３５）。実際、Ｌｃｎ２－／－ ＬＰＳ ＭｏのＭＭＰ－９のタンパクレベルは、Ｌｃｎ２＋/－ ＬＰＳ Ｍｏのタンパクレベルよりも低かった（図４Ｈ）。Ｌｃｎ２－／－ ＬＰＳ Ｍｏ注射により、Ｌｃｎ２＋／－ ＬＰＳ Ｍｏ注射の場合と比較して、肺内の転移性病巣の数が減少した（図４Ｉ）。以上の結果を総合すると、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球由来ＭＭＰ－９は、肺転移の促進に強い影響を及ぼすことが示された。すなわち、ＭＭＰ－９はＬｙ６Ｃ＋単球促進肺転移に必須であることが示された。
【0153】
５．Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球による腫瘍切除により誘発される転移の促進
癌では、原発腫瘍の切除が高頻度の腫瘍休眠逃避と転移再発の引き金となることが報告されている（参考文献４１～４３）。マウスでは、手術に伴う炎症が、別個の腫瘍の伸長を引き起こすか、または、転移を促進する（参考文献２および７）。そこでまず、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球が腫瘍切除後の転移性病巣の成立に関与するか否かを検討した。Ｂ１６細胞を皮下接種した。皮下腫瘍は切除により除去し、続いて切除の２４時間後にＢ１６細胞の静脈内注射を行った。図５Ａおよび５Ｂに示すように、Ｌｙ６Ｃ＋単球の全てではなく、一部のＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球が、腫瘍切除後２日間で劇的に増加した。原発巣の切除に加え、原発巣への放射線暴露が癌転移を促進することはすでに報告されている（参考文献４４および４５）。予想された通り、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の増加は、放射線療法を行った担癌マウスでも認められた（図５Ｃ）。さらに、腫瘍の切除により、血中循環がん細胞（ＣＴＣ）に由来する転移が促進されることを見出した（図５Ｄ）。次に、切除により誘発される転移促進の原因となる免疫細胞の同定を試みた。図５Ｅに示すように、抗Ｌｙ６Ｇ ｍＡｂは転移に影響を及ぼさなかった。一方、抗Ｇｒ－１ ｍＡｂは転移形成を抑制した。これらの結果から、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球は、腫瘍切除または腫瘍への放射線曝露により誘導される転移の促進に寄与すると結論づけられた。
癌では、原発腫瘍の切除が高頻度の腫瘍休眠逃避と転移再発の引き金となることが報告されている（参考文献４１～４３）。マウスでは、手術に伴う炎症が、別個の腫瘍の伸長を引き起こすか、または、転移を促進する（参考文献２および７）。そこでまず、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球が腫瘍切除後の転移性病巣の成立に関与するか否かを検討した。Ｂ１６細胞を皮下接種した。皮下腫瘍は切除により除去し、続いて切除の２４時間後にＢ１６細胞の静脈内注射を行った。図５Ａおよび５Ｂに示すように、Ｌｙ６Ｃ＋単球の全てではなく、一部のＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球が、腫瘍切除後２日間で劇的に増加した。原発巣の切除に加え、原発巣への放射線暴露が癌転移を促進することはすでに報告されている（参考文献４４および４５）。予想された通り、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の増加は、放射線療法を行った担癌マウスでも認められた（図５Ｃ）。さらに、腫瘍の切除により、血中循環がん細胞（ＣＴＣ）に由来する転移が促進されることを見出した（図５Ｄ）。次に、切除により誘発される転移促進の原因となる免疫細胞の同定を試みた。図５Ｅに示すように、抗Ｌｙ６Ｇ ｍＡｂは転移に影響を及ぼさなかった。一方、抗Ｇｒ－１ ｍＡｂは転移形成を抑制した。これらの結果から、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球は、腫瘍切除または腫瘍への放射線曝露により誘導される転移の促進に寄与すると結論づけられた。
【0154】
以上より、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球は、腫瘍切除により誘発される肺転移の促進に寄与することが示された。
【0155】
６．ＣＸＣＲ４シグナル伝達の抑制による転移の減少
肺転移の促進に、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球がｉｎ ｓｉｔｕで蓄積することが重要であると考えられている。Ｃｈｏｎｇらは、Ｌｙ６Ｃｈｉ単球の肺蓄積がＬＰＳ誘発炎症状態においてＣＸＣＲ４－ＣＸＣＬ１２シグナル伝達系に依存することを報告している（参考文献４６）。実際、ＣＸＣＲ４の発現はＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球で観察されたが、Ｂ１６細胞では観察されなかった（図６Ａ）。ＣＸＣＲ４アンタゴニストであるＡＭＤ３１００は、全身性炎症に関連するＬｙ６Ｃ＋単球の肺での蓄積を阻害したが、好中球の蓄積は阻害しなかった（図６Ｂ）。
肺転移の促進に、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球がｉｎ ｓｉｔｕで蓄積することが重要であると考えられている。Ｃｈｏｎｇらは、Ｌｙ６Ｃｈｉ単球の肺蓄積がＬＰＳ誘発炎症状態においてＣＸＣＲ４－ＣＸＣＬ１２シグナル伝達系に依存することを報告している（参考文献４６）。実際、ＣＸＣＲ４の発現はＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球で観察されたが、Ｂ１６細胞では観察されなかった（図６Ａ）。ＣＸＣＲ４アンタゴニストであるＡＭＤ３１００は、全身性炎症に関連するＬｙ６Ｃ＋単球の肺での蓄積を阻害したが、好中球の蓄積は阻害しなかった（図６Ｂ）。
【0156】
次いで、ＡＭＤ３１００が原発腫瘍切除の外科的切除により促進される肺転移を抑制するかどうかを検討した。ＡＭＤ３１００処理により肺転移促進は抑制された（図６ＣおよびＤ)。これらの知見は、ＣＸＣＲ４が、癌に対する外科的介入に関連する肺転移を制御するための新規治療標的であることを示唆する。ここで、肺転移の制御は、潜在的転移臓器におけるＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の蓄積を阻害することにより行われる。
【0157】
以上より、ＣＸＣＲ４シグナル伝達の抑制はＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球による肺転移を減少させることが示された。
【0158】
＜考察＞
本研究により、好中球ではなく、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球が原発腫瘍へのインターベンションに伴う炎症誘発肺転移を促進することが実証された。Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の肺における蓄積の阻害またはＭＭＰ９の阻害は肺転移を減少させ、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球が転移の治療標的であることを示唆した。
本研究により、好中球ではなく、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球が原発腫瘍へのインターベンションに伴う炎症誘発肺転移を促進することが実証された。Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の肺における蓄積の阻害またはＭＭＰ９の阻害は肺転移を減少させ、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球が転移の治療標的であることを示唆した。
【0159】
近年の報告では、マウスの炎症に関連する転移におけるＮＥＴの重要な役割が強調されている。例えば、ＬＰＳの鼻腔内注射は、著しい好中球動員を誘発し、多数のＮＥＴ形成を検出し、肺転移を促進すること（参考文献９）、腹膜炎が誘発されると肝臓でＮＥＴが形成され、肝転移が起こりやすくなること（参考文献１１）、および、ＤＮａｓｅや好中球エラスターゼ阻害剤でＮＥＴ形成を抑制することにより、肺および肝転移が抑制さること（参考文献１１）が報告されている。これらの実験モデルにおいて、炎症は局所感染または組織損傷によって誘発される。
【0160】
しかしながら、原発腫瘍から離れた部位では、このような局所炎症は、担癌患者では起こらないようである。本研究では、好中球ではなく、新規な単球サブセットが、原発腫瘍切除または放射線暴露に起因する炎症関連転移の進行に重要な役割を果たすことを実証した。
【0161】
この種の炎症では好中球が肺に動員されたが、この部位でＮＥＴ形成はほとんど起こらなかった。これらの結果は、炎症の状況が転移促進を主に担う免疫細胞の種類を決定することを示しており、転移予防のための治療標的細胞は癌患者の実態に応じて慎重に選択する必要があることを示唆している。
【0162】
近年の報告により、ＢＭでは特定の炎症刺激に応答して機能的に異なる単球サブセットが分化していることが示されている（参考文献１６、２３および２５）。この単球サブセットは顆粒球－単球前駆細胞（ＧＭＰ）から分化し、顆粒球といくつかの特徴を共有している。このコンセプトに沿って、本発明者らは、これまでに、免疫調節性Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球が組織傷害の回復期にＢＭのＧＢＰから生産され、組織修復に伴う炎症反応に寄与したことを報告している（参考文献２２）。組織損傷後の組織修復および創傷治癒は、実質細胞の再生、ＥＣＭリモデリングおよび血管新生を含む複数の過程からなることが既知である（参考文献４７）。これらの過程は、腫瘍の進行および転移にも寄与する（参考文献３０）。例えば、創傷応答遺伝子の高発現は、ヒトにおける転移のリスクを増加させることが報告されている（参考文献４８）。また、傷害組織におけるＥＣＭリモデリングに重要な分子であるＭＭＰの増加は、癌患者の全生存率の低さと相関している（参考文献４９）。実際、ＭＭＰ９欠損マウスではＢ１６Ｆ１０の肺転移が減少したことが報告されている（参考文献３９）。創傷組織における血管の再生に関しては、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の産生を誘導して血管新生を促進する低酸素誘導因子α（ＨＩＦ１ａ）によって低酸素状態が検出される（参考文献５０）。癌組織においても同様の機序が当てはまり、ＶＥＧＦあるいはＶＥＧＦ受容体に対する中和抗体が肺転移を抑制することが報告されている（参考文献５１および５２）。この点で、組織修復過程は、がんの進行および転移と共通の特徴を有する。
【0163】
原発腫瘍の切除を受ける患者は、術後１２～１８カ月で、急激にピークに達する転移再発のリスクに直面する（参考文献４１～４３）。早期の転移再燃の原因については議論があるが、近年の報告では、切除によって誘発される全身性炎症がマウスの遠隔休眠腫瘍の伸長を誘発することが示されており、Ｌｙ６Ｃｈｉ単球が伸長誘導に必須のエフェクター細胞であることが示唆されている（参考文献７）。しかし、切除により誘導される腫瘍進行にどのような単球サブセットが関与しているかは不明なままであった。本発明者らは、免疫調節性Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球が、ＭＭＰ－９およびＣＸＣＲ４依存的にＣＴＣの肺転移を促進することを示した。Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球が分泌するＭＭＰ－９は、細胞外基質を分解し、がん細胞の転移組織への浸潤を促進する可能性がある。
【0164】
以上より、免疫制御性Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球を標的とした治療法を開発することで、切除後の転移性再発の危険性を低減できることが示唆された。
【0165】
癌治療において、転移の予測および予防は極めて重要な臨床課題である。これまでの報告では、腫瘍における創傷応答シグネチャーの高発現から、ヒトにおける不良な患者生存および転移のリスク増加を予測できることが示唆されている（参考文献４８）。本発明者らは、末梢血中のＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球数の急激な上昇を、肺転移早期に見出した。Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球の出現が、創傷治癒または組織修復の初期の段階に関与することを考慮すると、原発腫瘍に対する外科的処置後の末梢血中のこれらの単球のモニターは、転移に対する有益な予測細胞バイオマーカーとなる可能性がある。このため、マウスＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃ＋単球のヒトにおけるカウンターパートを特定することが望まれる。
【0166】
単細胞ＲＮＡ配列決定を使用した最近の研究では、健康なヒト末梢血中の４つの単球集団が明らかになった（参考文献５３）。さらに、癌患者では、単球性骨髄由来抑制細胞が免疫応答の主要な負の調節因子として浮上している（参考文献５４～５６）。いずれにせよ、炎症に関連する新規で非定型的な単球サブセットの出現の推定は、転移に対する治療戦略の開発に重要である。
【0167】
（参考文献）
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図1G】
【図1H】
【図1I】
【図1J】
【図1K】
【図1L】
【図1M】
【図1N】
【図1O】
【図1P】
【図1Q】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図2G】
【図2H】
【図2I】
【図2J】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図4G】
【図4H】
【図4I】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図15D】
【配列表】