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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023021999
(43)【公開日】2023-02-14
(54)【発明の名称】癌治療に対する応答を予測するためのバイオマーカー
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20230207BHJP
C12Q 1/06 20060101ALI20230207BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20230207BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230207BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230207BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230207BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230207BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20230207BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 Y
C12Q1/06
C12M1/34 B
C12M1/34 F
A61K39/395 N
A61K39/395 T
A61K39/395 U
A61P35/00
A61P43/00 121
A61K45/00
G01N33/53 D
C07K16/28
【審査請求】未請求
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022174604
(22)【出願日】2022-10-31
(62)【分割の表示】P 2022517281の分割
【原出願日】2021-09-07
(31)【優先権主張番号】P 2020150620
(32)【優先日】2020-09-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和２年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、「次世代治療・診断実現のための創薬基盤技術開発事業」「患者層別化マーカー探索技術の開発／がん免疫モニタリングによる患者層別化を行う基盤技術の開発」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】504013775
【氏名又は名称】学校法人 埼玉医科大学
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100143638
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷部 真久
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】各務 博
(57)【要約】 （修正有）
【課題】癌治療に対する応答を予測するためのバイオマーカー、およびそのバイオマーカーを用いる方法を提供すること。
【解決手段】本発明は、被験体から得られたサンプルにおける細胞亜集団の組成を、被験体における癌治療に対する応答を予測するための指標とする方法を提供する。被験体のＣＤ４＋Ｔ細胞集団中のＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋細胞亜集団の量を基準値と比較することによ
り、被験体における癌治療に対する応答を予測することができる。
【選択図】なし
【解決手段】本発明は、被験体から得られたサンプルにおける細胞亜集団の組成を、被験体における癌治療に対する応答を予測するための指標とする方法を提供する。被験体のＣＤ４＋Ｔ細胞集団中のＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋細胞亜集団の量を基準値と比較することによ
り、被験体における癌治療に対する応答を予測することができる。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、癌治療の効果予測の分野に関する。より詳細には、被験体に対する癌治療への応答性を被験体のＴ細胞組成に基づいて予測する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
癌治療においては、その癌患者の特性に応じて適切な治療法が選択されており、中でも癌免疫療法は、癌細胞の代謝等を標的とする従来の抗癌治療（アルキル化剤、白金製剤、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、微小管重合阻害剤、微小管脱重合阻害剤等）と比較し、副作用が少なく大きな効果を示すとして近年注目を集めている。癌免疫療法の中でも、抗ＰＤ－１免疫チェックポイント阻害は特に大きな関心を寄せられている治療である。
【0003】
抗ＰＤ－１抗体であるニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）は非小細胞肺癌の２次治療として従来の標準治療であったドセタキセルに対して全生存期間で大きな差をつけて勝利し、肺癌学会ガイドラインでも推奨度Ａの標準治療となっている（非特許文献１）。同じ抗ＰＤ－１抗体であるペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）は初回治療において従来の標準治療であった細胞傷害性抗癌剤に対して全生存期間で勝利しており（ただし、腫瘍細胞上ＰＤ－Ｌ１ ５０％以上発現の患者において）、今後、非小細胞肺癌標準治療となることが決定している。
【0004】
現在においては、抗ＰＤ－１抗体の効果は肺癌に留まらず、多くの癌腫で証明されつつあり、日本でも腎癌、尿路上皮癌、頭頚部癌、消化器癌、悪性リンパ腫、乳癌、小細胞肺癌、大腸癌、悪性胸膜中皮腫に対する保険適応となり、今後、肝細胞癌、卵巣癌、子宮頚癌でも適応となることが期待される。
【0005】
ところで、臨床的に極めて大きな成功を収めているように見える抗ＰＤ－１抗体であるが、実は大きな問題点をはらんでいる。無増悪生存期間（ＰＦＳ）のデータからは、ほぼすべての抗ＰＤ－１抗体臨床試験において３ヶ月以内に病勢増悪する「無効群」が認められる。一方、１年以上有効であった群は、それ以降ほとんど病勢増悪が認められず、治癒に近い状態を得ていることがわかる。これは、臨床効果において「無効群」「著効群」「中間群」というような３つの異なったサブグループが存在することを示唆しているが、これを予測するバイオマーカーは知られていない。ほぼすべての癌腫における標準治療となることが予想される抗ＰＤ－１抗体を、約４０％にものぼる無効群に投与することは、医学的のみならず医療経済の点からも問題となる。
【0006】
このような問題に対して、本発明者は既に、癌免疫療法（例えば、抗ＰＤ－１治療または抗ＰＤ－Ｌ１治療）に対する治療効果が進行（ＰＤ）、安定（ＳＤ）、奏効（完全奏効（ＣＲ）および部分奏効（ＰＲ））となる三群が、それぞれ異なる免疫状態を呈することを見出し、被験体に癌免疫療法を行った場合、その癌免疫療法に対する応答が、進行（ＰＤ）、安定（ＳＤ）または奏効（完全奏効（ＣＲ）および部分奏効（ＰＲ））のいずれかであることを予想する方法を提供している（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】特許第６６６４６８４号
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Ｂｒａｈｍｅｒ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１５； ３７３： １２３－１３５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明は、このような状況に鑑み、患者の免疫状態を評価することにより、当該患者に対する癌治療の効果を予測するためのマーカーを見出した。そして、被験体から得られたサンプルにおける細胞亜集団の組成を、当該被験体の癌治療に対する応答を予測するための指標として用いるため、従来知られていたものとは異なる細胞亜集団の組成が癌治療に対する応答を予測するための新たな指標となり得ることを見出した。
【0010】
具体的には、本発明者らは、ＣＤ４ Ｔ細胞全体に対するＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－細胞割合（好ましくは、ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－細胞割合）を測定することにより、癌治療に対する応答を予測するための従来の指標を超える予測性能を得ることが可能であること、さらにＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－細胞割合を用いてもＣＤ６２ＬｌｏｗＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－細胞割合と同等の予測性能を得ることができることを見出した。本発明は、癌治療に対する応答性が被験体におけるＴ細胞組成と関連しており、バイオマーカーとして利用し得るという本発明者らの発見に部分的に基づいてなされたものであり、本発明のバイオマーカーは感度、特異度とも極めて高く、また利便性も高い。
【0011】
本発明者らは、癌免疫療法（例えば、抗ＰＤ－１治療または抗ＰＤ－Ｌ１治療）による治療後の無増悪生存期間（ＰＦＳ）と特定のＴ細胞組成とが有意な相関を示すことを見出した。これにより、本発明の一実施形態では、被験体に癌免疫療法を行った場合、その癌免疫療法に対する応答を予測するための方法が提供される。また本発明者らは、例えば、放射線治療や分子標的薬による治療などの、癌免疫療法以外の癌治療による治療後の無増悪生存期間（ＰＦＳ）と特定のＴ細胞組成とが有意な相関を示すことを見出した。これにより、本発明の一実施形態では、被験体に癌治療を行った場合、その癌治療に対する応答を予測するための方法が提供される。
【0012】
したがって、本発明は以下を提供する。
（項目１） 被験体のＣＤ４＋Ｔ細胞集団中のＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋細胞亜集団の相対量
を、前記被験体の癌治療に対する応答を予測するための指標として用いる方法であって、
前記被験体由来のサンプル中の前記細胞亜集団の相対量を決定する工程を含み、
前記相対量を、前記被験体の癌治療に対する応答を予測するための指標として用いる、方法。
（項目２） 前記相対量と基準値との比較を、前記被験体の癌治療に対する応答を予測するための指標として用いる、項目１に記載の方法。
（項目３） 前記相対量と基準値との比較を、前記被験体の長期生存を予測するための指標として用いる、項目１または２に記載の方法。
（項目４） 前記相対量と無効群閾値との比較を、前記被験体が前記癌治療に対して無効群であるか否かを予測するための指標として用いる、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５） 前記ＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋細胞亜集団が、さらにＣＸＣＲ３＋細胞亜集団で
ある、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６） 前記ＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋細胞亜集団が、さらにＣＸＣＲ３-細胞亜集団である、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。
（項目７） 前記ＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋細胞亜集団が、さらにＦｏｘＰ３-細胞亜集団である、項目１～６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８） 前記ＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋細胞亜集団が、さらにＣＤ６２Ｌｌｏｗ細胞亜集
団である、項目１～７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９） 前記ＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋細胞亜集団が、さらにＣＤ４５ＲＡ－細胞亜集団
である、項目１～７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０） 前記癌治療は、がん免疫療法、放射線療法、分子標的薬治療、外科的手術、細胞移入、またはこれらの治療の任意の組み合わせを含む、項目１～９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１） 前記癌治療は、がん免疫療法である、項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２） 前記がん免疫療法は免疫チェックポイント阻害剤の投与を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３） 前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、およびＣＴＬＡ－４阻害剤からなる群から選択される阻害剤を含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４） 前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１阻害剤またはＰＤ－Ｌ１阻害剤と、ＣＴＬＡ－４阻害剤との組み合わせを含む、項目１２に記載の方法。
（項目１５） 前記ＰＤ－１阻害剤は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用を阻害する抗ＰＤ－１抗体である、項目１３または１４に記載の方法。
（項目１６） 前記ＰＤ－１阻害剤は、ニボルマブまたはペムブロリズマブを含む、項目１３～１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７） 前記ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用を阻害する抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、項目１３～１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８） 前記ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、デュルバルマブ、アテゾリズマブ、及びアベルマブを含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９） 前記ＣＴＬＡ－４阻害剤は、イピリムマブ、及びトレメリルマブを含む、項目１３～１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０） 前記無効群閾値が、無効群の検出についての感度および特異度を考慮して決定される、項目４～１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１） 前記無効群閾値が、無効群の検出について感度が約９０％超となるように決定される、項目４～２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２） 前記無効群閾値が、無効群の検出について特異度が約９０％超となるように決定される、項目４～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３） 前記細胞の相対量を、末梢血サンプルを用いて測定することを特徴とする、項目１～２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４） 前記相対量が前記基準値以上であることが、前記被験体が前記癌治療に対して応答することを示す、項目２～２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５） 被験体において癌を治療するための、免疫チェックポイント阻害剤を含む組成物であって、前記被験体は、項目１１～２４のいずれか一項に記載の方法によって、がん免疫療法に対して応答すると予測された被験体であることを特徴とする、組成物。
（項目２６） 前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、およびＣＴＬＡ－４阻害剤からなる群から選択される阻害剤を含む、項目２５に記載の組成物。
（項目２７） 前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１阻害剤またはＰＤ－Ｌ１阻害剤と、ＣＴＬＡ－４阻害剤との組み合わせを含む、項目２６に記載の組成物。
（項目２８） 前記ＰＤ－１阻害剤は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用を阻害する抗ＰＤ－１抗体である、項目２６または２７に記載の組成物。
（項目２９） 前記ＰＤ－１阻害剤は、ニボルマブまたはペムブロリズマブを含む、項目２６～２８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３０） 前記ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用を阻害する抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、項目２６～２７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３１） 前記ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、デュルバルマブ、アテゾリズマブまたはアベルマブを含む、項目３０に記載の組成物。
（項目３２） 前記ＣＴＬＡ－４阻害剤は、イピリムマブを含む、項目２６～３１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３３） ＣＤ４に対する検出剤、ＣＣＲ４に対する検出剤、およびＣＣＲ６に対する検出剤を含む、被験体の癌治療に対する応答を予測するためのキットであって、前記予測は、前記被験体のＣＤ４＋Ｔ細胞集団中のＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋細胞亜集団の相対量を
、前記被験体の癌治療に対する応答を予測するための指標として用いることによって行われる、キット。
（項目３４） 前記相対量と基準値との比較を、前記被験体の癌治療に対する応答を予測するための指標として用いる、項目３３に記載のキット。
（項目３５） 前記相対量と基準値との比較を、前記被験体の長期生存を予測するための指標として用いる、項目３３または３４に記載のキット。
（項目３６） 前記相対量と無効群閾値との比較を、前記被験体が前記癌治療に対して無効群であるか否かを予測するための指標として用いる、項目３３～３５のいずれか一項に記載のキット。
（項目３７） 前記検出剤が抗体である、項目３３～３６のいずれか一項に記載のキット。
（項目３８） さらにＣＸＣＲ３に対する検出剤を含む、項目３３～３７のいずれか一項に記載のキット。
（項目３９） 前記癌治療は、がん免疫療法、放射線療法、分子標的薬治療、外科的手術、細胞移入、またはこれらの治療の任意の組み合わせを含む、項目３３～３８のいずれか一項に記載のキット。
（項目４０） 前記癌治療は、がん免疫療法である、項目３３～３９のいずれか一項に記載のキット。
（項目１） 被験体のＣＤ４＋Ｔ細胞集団中のＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋細胞亜集団の相対量
を、前記被験体の癌治療に対する応答を予測するための指標として用いる方法であって、
前記被験体由来のサンプル中の前記細胞亜集団の相対量を決定する工程を含み、
前記相対量を、前記被験体の癌治療に対する応答を予測するための指標として用いる、方法。
（項目２） 前記相対量と基準値との比較を、前記被験体の癌治療に対する応答を予測するための指標として用いる、項目１に記載の方法。
（項目３） 前記相対量と基準値との比較を、前記被験体の長期生存を予測するための指標として用いる、項目１または２に記載の方法。
（項目４） 前記相対量と無効群閾値との比較を、前記被験体が前記癌治療に対して無効群であるか否かを予測するための指標として用いる、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５） 前記ＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋細胞亜集団が、さらにＣＸＣＲ３＋細胞亜集団で
ある、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６） 前記ＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋細胞亜集団が、さらにＣＸＣＲ３-細胞亜集団である、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。
（項目７） 前記ＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋細胞亜集団が、さらにＦｏｘＰ３-細胞亜集団である、項目１～６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８） 前記ＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋細胞亜集団が、さらにＣＤ６２Ｌｌｏｗ細胞亜集
団である、項目１～７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９） 前記ＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋細胞亜集団が、さらにＣＤ４５ＲＡ－細胞亜集団
である、項目１～７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０） 前記癌治療は、がん免疫療法、放射線療法、分子標的薬治療、外科的手術、細胞移入、またはこれらの治療の任意の組み合わせを含む、項目１～９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１） 前記癌治療は、がん免疫療法である、項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２） 前記がん免疫療法は免疫チェックポイント阻害剤の投与を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３） 前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、およびＣＴＬＡ－４阻害剤からなる群から選択される阻害剤を含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４） 前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１阻害剤またはＰＤ－Ｌ１阻害剤と、ＣＴＬＡ－４阻害剤との組み合わせを含む、項目１２に記載の方法。
（項目１５） 前記ＰＤ－１阻害剤は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用を阻害する抗ＰＤ－１抗体である、項目１３または１４に記載の方法。
（項目１６） 前記ＰＤ－１阻害剤は、ニボルマブまたはペムブロリズマブを含む、項目１３～１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７） 前記ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用を阻害する抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、項目１３～１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８） 前記ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、デュルバルマブ、アテゾリズマブ、及びアベルマブを含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９） 前記ＣＴＬＡ－４阻害剤は、イピリムマブ、及びトレメリルマブを含む、項目１３～１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０） 前記無効群閾値が、無効群の検出についての感度および特異度を考慮して決定される、項目４～１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１） 前記無効群閾値が、無効群の検出について感度が約９０％超となるように決定される、項目４～２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２） 前記無効群閾値が、無効群の検出について特異度が約９０％超となるように決定される、項目４～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３） 前記細胞の相対量を、末梢血サンプルを用いて測定することを特徴とする、項目１～２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４） 前記相対量が前記基準値以上であることが、前記被験体が前記癌治療に対して応答することを示す、項目２～２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５） 被験体において癌を治療するための、免疫チェックポイント阻害剤を含む組成物であって、前記被験体は、項目１１～２４のいずれか一項に記載の方法によって、がん免疫療法に対して応答すると予測された被験体であることを特徴とする、組成物。
（項目２６） 前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、およびＣＴＬＡ－４阻害剤からなる群から選択される阻害剤を含む、項目２５に記載の組成物。
（項目２７） 前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１阻害剤またはＰＤ－Ｌ１阻害剤と、ＣＴＬＡ－４阻害剤との組み合わせを含む、項目２６に記載の組成物。
（項目２８） 前記ＰＤ－１阻害剤は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用を阻害する抗ＰＤ－１抗体である、項目２６または２７に記載の組成物。
（項目２９） 前記ＰＤ－１阻害剤は、ニボルマブまたはペムブロリズマブを含む、項目２６～２８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３０） 前記ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用を阻害する抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、項目２６～２７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３１） 前記ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、デュルバルマブ、アテゾリズマブまたはアベルマブを含む、項目３０に記載の組成物。
（項目３２） 前記ＣＴＬＡ－４阻害剤は、イピリムマブを含む、項目２６～３１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３３） ＣＤ４に対する検出剤、ＣＣＲ４に対する検出剤、およびＣＣＲ６に対する検出剤を含む、被験体の癌治療に対する応答を予測するためのキットであって、前記予測は、前記被験体のＣＤ４＋Ｔ細胞集団中のＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋細胞亜集団の相対量を
、前記被験体の癌治療に対する応答を予測するための指標として用いることによって行われる、キット。
（項目３４） 前記相対量と基準値との比較を、前記被験体の癌治療に対する応答を予測するための指標として用いる、項目３３に記載のキット。
（項目３５） 前記相対量と基準値との比較を、前記被験体の長期生存を予測するための指標として用いる、項目３３または３４に記載のキット。
（項目３６） 前記相対量と無効群閾値との比較を、前記被験体が前記癌治療に対して無効群であるか否かを予測するための指標として用いる、項目３３～３５のいずれか一項に記載のキット。
（項目３７） 前記検出剤が抗体である、項目３３～３６のいずれか一項に記載のキット。
（項目３８） さらにＣＸＣＲ３に対する検出剤を含む、項目３３～３７のいずれか一項に記載のキット。
（項目３９） 前記癌治療は、がん免疫療法、放射線療法、分子標的薬治療、外科的手術、細胞移入、またはこれらの治療の任意の組み合わせを含む、項目３３～３８のいずれか一項に記載のキット。
（項目４０） 前記癌治療は、がん免疫療法である、項目３３～３９のいずれか一項に記載のキット。
【0013】
本開示において、上記の１つまたは複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。本開示のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
【0014】
なお、上記した以外の本開示の特徴及び顕著な作用・効果は、以下の発明の実施形態の項及び図面を参照することで、当業者にとって明確となる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図4】図４は、本発明の一実施形態において、ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ （Ｔｈ１／１７）とＣＤ６２ＬｌｏｗＣＸＣＲ３－ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ （ＣＣＲ６ ＳＰ）の２つのクラスターと、無憎悪生存期間との相関関係を示すグラフである。図４右がＣＤ６２ＬｌｏｗＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ （Ｔｈ１／１７）とＣＤ６２ＬｌｏｗＣＸＣＲ３－ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ （ＣＣＲ６ ＳＰ）の２つのクラスターを合わせたものであり、図４左は％ＣＤ６２Ｌｌｏｗ／ＣＤ４＋と無憎悪生存期間との相関関係を示すグラフである。
【図6】図６は、本発明の一実施形態において、フローサイトメトリー解析（Ｆｏｒｔｅｓｓａ）を用いて得た％ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－／ＣＤ４＋と無憎悪生存期間との相関関係、およびＣｙＴＯＦを用いて得た％ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－／ＣＤ４＋と無憎悪生存期間との相関関係の、それぞれの相関関係を示すグラフである。
【図12】図１２は、本発明の一実施形態において、ＣＤ４＋Ｔ細胞中のＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－細胞の比率の、全生存期間を予測するための指標としての性能を示すグラフである。閾値を変化させた場合の感度と特異度をプロットしたものが右のパネルである。プロットした点の下の領域の面積は０．９６２８であり、非常に優れたマーカーであることが理解される。
【発明を実施するための形態】
【0016】
以下、本開示を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【0017】
以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。
【0018】
本明細書において、「約」とは、後に続く数値の±１０％を意味する。
【0019】
本明細書において、「バイオマーカー」とは、通常の生物学的過程、病理学的過程、もしくは治療的介入に対する薬理学的応答の指標として、客観的に測定され評価される特性をいう。
【0020】
本明細書において「がん」または「癌」は、互換可能に用いられ、異型性が強く、増殖が正常細胞より速く、周囲組織に破壊性に浸潤し得あるいは転移をおこし得る悪性腫瘍またはそのような悪性腫瘍が存在する状態をいう。本発明においては、癌は固形癌および造血器腫瘍を含み、例えば非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腎癌、ホジキン病、頭頸部癌、乳癌、胃癌、悪性黒色腫、大腸癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、消化管間質腫瘍、膵神経内分泌種腫瘍、皮膚癌などを含むがそれらに限定されない。
【0021】
本明細書において、「がん免疫療法」または「癌免疫療法」とは、生物の有する免疫機構などの生体防御機構を用いて癌を治療する方法をいう。
【0022】
本明細書において、「抗腫瘍免疫応答」とは、生体内の腫瘍に対する任意の免疫応答をいう。
【0023】
本明細書において、「相関」するとは、２つの事象が統計学的に有意な相関関係を有することをいう。例えば、「Ａと相関するＢの相対量」とは、事象Ａが発生した場合に、Ｂの相対量が統計学的に有意に影響を受ける（例えば、増加ないし減少すること）ことをいう。
【0024】
本明細書において、「免疫活性化」とは、免疫機能の体内における異物を排除する機能が増大することを指し、免疫機能において正に作用する任意の因子（例えば、免疫細胞またはサイトカイン）の量の増大によって示され得る。
【0025】
本明細書において、「細胞亜集団」とは、多様な特性の細胞を含む細胞集団中の、何らかの共通する特徴を有する任意の細胞の集合を指す。特定の名称が当技術分野で知られているものについては、かかる用語を用いて特定の細胞亜集団に言及することもでき、任意の性質（例えば、細胞表面マーカーの発現）を記載して特定の細胞亜集団に言及することもできる。
【0026】
本明細書において、細胞に関する用語「相対量」は、「割合」と互換可能に使用される。代表的には、用語「相対量」および「割合」は、特定の細胞集団（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団）を形成する細胞の数に対する、所期の細胞亜集団（例えば、ＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋細胞亜集団）を形成する細胞の数を意味する。
【0027】
本明細書において、「感度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）」とは、被験体の集団の中から所期の特徴を有する被験体を選択する場合において、被験体集団に含まれる所期の特徴を有する総被験体数に対する、選択された対象中の所期の特徴を有する被験体数の割合をいう。例えば、被検体の集団に含まれる所期の特徴を有する被検体が全て選択された場合には感度は１００％であり、被検体の集団に含まれる所期の特徴を有する被検体の半数が選択された場合には感度は５０％であり、被検体の集団に含まれる所期の特徴を有する被検体が全く選択されなかった場合には感度は０％である。感度は、例えば、（選択された対象中の所期の特徴を有する被験体数）／（被験体集団に含まれる所期の特徴を有する総被験体数）として決定される。感度が高い判定は、ある状態（例えば、がん免疫療法の結果、長期生存である）である被験体を見つけ出したい場合に、そのような被験体が確実にそのような状態として判定され易いことを意味する。
【0028】
本明細書において、「特異度（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）」とは、被験体の集団の中から所期の特徴を有する被験体を選択する場合において、選択された対象の総数に対する、選択された対象中の所期の特徴を有する被験体数の割合をいう。例えば、被検体集団の中から選択された候補が全て所期の特徴を有する場合には特異度は１００％であり、被検体集団の中から選択された候補の半数が所期の特徴を有する場合には特異度は５０％であり、被検体集団の中から選択された候補の全てが所期の特徴を有さない場合には特異度は０％である。例えば、特異度は、（選択された対象中の所期の特徴を有する被験体数）／（選択された対象の総数）として決定される。特異度が高い判定は、ある状態（例えば、がん免疫療法に対して奏効群である）ではない被験体が、誤ってそうではない状態（例えば、がん免疫療法の結果、長期生存である）として判定される確率が低いことを意味する。
【0029】
本明細書において、「無増悪生存期間（ＰＦＳ）」とは、治療中または治療後に癌が進行せず安定した状態である期間をいう。すなわち病勢が進行していない期間となる。本明細書においては、臨床的に癌が進行せず安定した状態、または病勢が進行していないと判断される期間であれば「無増悪生存期間（ＰＦＳ）」に含まれる。
【0030】
本明細書において、「無効群」とは、がん治療を受けた場合の治療効果が、ＲＥＣＩＳＴ ｖｅｒ１．１に従って判定した場合に、治療開始後約９週までの早期に病勢増悪（ＰＤ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ）と判定される被験体の群をいう。無効群は、ＰＤ群、進行群、ＮＲ（Ｎｏｎ－ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）とも称され、本明細書において互換的に使用される。
【0031】
本明細書において、「部分奏効群」とは、がん治療を受けた場合の治療効果が、ＲＥＣＩＳＴ ｖｅｒ１．１に従って判定した場合に、部分奏効（ＰＲ：Ｐａｒｔｉａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）と判定される被験体の群をいう。部分奏効群は、ＰＲ群とも称され、本明細書において互換的に使用される。
【0032】
本明細書において、「相対値」とは、ある値について、他の値を比較の対象として算出される値をいう。
【0033】
本明細書において使用される場合、用語「検出剤」とは、広義には、目的の物質（例えば、細胞表面マーカーなど）を検出できるあらゆる因子をいう。
【0034】
本明細書において、ある細胞亜集団の「量」とは、ある細胞の絶対数と、細胞集団における割合の相対量とを包含する。
【0035】
本明細書において、「基準」または「基準値」とは、本明細書に記載されるマーカーの量の増減を決定するための比較対象となる量を指す。ある処置（例えば、がん免疫療法）の前後でのある量の増減を決定する場合、例えば、「基準値」としては処置の前における当該量が挙げられる。また基準または基準値としては、ある数量（例えば、無憎悪生存期間）を示すことがわかっている所定の細胞の量または相対量をとることもできる。
【0036】
本明細書において、「閾値」とは、ある変化する値に対して設定される値であって、変化する値がそれ以上であるか、またはそれ以下である場合に何らかの意味付けを与える値をいう。本明細書において、カットオフ（ｃｕｔ－ｏｆｆ）値とも称される。
【0037】
本明細書において、「無効群閾値」とは、所与の被検体の集団において、無効群と、安定群＋奏効群とを識別するために使用される閾値をいう。無効群閾値は、所与の被検体の集団における無効群を選択する場合に、所定の感度および特異度を達成するように選択される。
【0038】
本明細書において、「奏効群閾値」とは、所与の被検体の集団において、あるいは、無効群閾値を用いて所与の被検体の集団から無効群を除いた集団において、安定群と奏効群とを識別するために使用される閾値をいう。奏効閾値は、所与の被検体の集団において、あるいは、無効群閾値を用いて所与の被検体の集団から無効群を除いた集団において、奏効群を選択する場合に、所定の感度および特異度を達成するように選択される。
【0039】
本明細書において「長期生存」とは、無増悪生存期間が一定期間以上であることを示し、長期生存者とは、例えばニボルマブ療法後一定期間以上にわたり増悪が生じない患者をいう。長期生存であると推定された患者は、癌免疫療法による長期にわたる応答性が予測されるため、臨床医は、癌免疫療法を最小限で（例えば一回の投与で）終了すべきと判断することができる。また本明細書において、長期生存であると判断できる期間は、特に限られるものではなく、患者の属性（年齢、性別、既往歴など）、癌の種類、投薬状況または治療歴などに応じて、異なるものであってもよい。例えば、５００日以上、４００日以上、３００日以上、１５０日以上などとしてもよく、また高齢者における長期生存と判断できる期間は、若齢者における長期生存と判断できる期間よりも短いものであってもよく、他の疾患を併発している患者における長期生存と判断できる期間は、そうではない患者における長期生存と判断できる期間よりも短いものであってもよい。
【0040】
本明細書において「フローサイトメトリー」とは、液体中に懸濁する細胞、個体およびその他の生物粒子の粒子数、個々の物理的・化学的・生物学的性状を計測する技術をいう。フローサイトメトリーの結果は、代表的には、ＦＳＣをＸ軸に、ＳＳＣをＹ軸にとったドットプロットとして表現され得る。各細胞は図の中の一つのドット（点）で示されており、それらの位置は、ＦＳＣとＳＳＣとの相対値によって決められる。比較的サイズが小さく内部構造が単純なリンパ球は左下部に、サイズが大きく内部に顆粒を持つ顆粒球は右上部に、またサイズは大きいが内部構造が単純な単球はリンパ球と顆粒球の間に、それぞれお互いに分離した集団を作って表示される。またフローサイトメトリーの結果は、ヒストグラムやドットプロットなどで表すことができる。
【0041】
本明細書において、「エフェクター細胞」とは、抗原刺激を受けていないナイーブ細胞が分化して実際に免疫に関わる働きを得た免疫細胞をいい、特にヒトのヘルパーＴ細胞では主にＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７の３種類が知られている。それぞれインターフェロンγ（ＩＦＮγ）やインターロイキン１７（ＩＬ－１７）など特徴的なサイトカインを放出することができる。またＴｈ１はＴ－ｂｅｔを、Ｔｈ２はＧＡＴＡ－３を発現するなど、各Ｔｈサブセットに特徴的な転写因子が存在するが、Ｔ－ｂｅｔとＧＡＴＡ－３の両方を発現している細胞も存在し、そのような細胞は「Ｔｈ１／Ｔｈ２」または「Ｔｈ１／２」と表現される。本明細書において「Ｔｈ１／Ｔｈ１７」または「Ｔｈ１／１７」はＴｈ１に特徴的なＴ－ｂｅｔと、Ｔｈ１７に特徴的なＲＯＲγｔの両方を発現している。
【0042】
またＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７などのエフェクター細胞は、発現するケモカインレセプター（ＣＣＲ）の種類によっても分類することができ、例えばＴｈ１はＣＸＣＲ３を、Ｔｈ２はＣＣＲ４を、Ｔｈ１７はＣＣＲ４及びＣＣＲ６を、それぞれ発現している。Ｔｈサブセットの分類は例えば図１（AnnualReviewofImmunology, Vol. 34:317-334 Heterogeneity of Human CD4+ T CellsAgainstMicrobes,Fig.1）のように表すことができる。本明細書において「Ｔｈ１／Ｔｈ１７」または「Ｔｈ１／１７」はＴｈ１に特徴的なＣＸＣＲ３と、Ｔｈ１７に特徴的な２つのＣＣＲのうちＣＣＲ６を発現している。また本明細書において、ＣＣＲ６ ＳＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ）とは、ＣＣＲによるＴｈタイプ分類において従来は分類されていなかったタイプであり、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、及びＣＸＣＲ３のうちＣＣＲ６のみを発現するＴｈサブセットである。また本明細書において、ＴＰ（ｔｒｉｐｌｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ）とは、ＣＣＲによるＴｈタイプ分類において従来は分類されていなかったタイプであり、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、及びＣＸＣＲ３の３つを発現するＴｈサブセットである。
【0043】
本明細書において、「癌治療」とは、癌患者に対して腫瘍を除去または縮小させるために行われる任意の治療を指し、がん免疫療法、放射線療法、分子標的薬治療、外科的手術、細胞移入、またはこれらの治療の任意の組み合わせなどを含むがこれらに限られるものではない。
【0044】
（癌免疫療法）
癌免疫療法とは、生物の有する生体防御機構を用いて癌を治療する方法である。癌免疫療法には、大きく分けて、癌に対する免疫機能を強化することによる癌免疫療法と、癌の免疫回避機能を阻害することによる癌免疫療法が存在する。さらに、癌免疫療法には、体内での免疫機能を賦活化する能動免疫療法と、体外で免疫機能を賦活化させた、または増殖させた免疫細胞を体内に戻すことによる受動免疫療法とがある。本発明のバイオマーカーは、ＣＤ４＋Ｔ細胞免疫全体のバランスを評価するものであり、腫瘍免疫そのものを全体的に評価するものであると考えられるため、癌免疫療法全般の治療効果を広く予測することが可能なものであると考えられる。
癌免疫療法とは、生物の有する生体防御機構を用いて癌を治療する方法である。癌免疫療法には、大きく分けて、癌に対する免疫機能を強化することによる癌免疫療法と、癌の免疫回避機能を阻害することによる癌免疫療法が存在する。さらに、癌免疫療法には、体内での免疫機能を賦活化する能動免疫療法と、体外で免疫機能を賦活化させた、または増殖させた免疫細胞を体内に戻すことによる受動免疫療法とがある。本発明のバイオマーカーは、ＣＤ４＋Ｔ細胞免疫全体のバランスを評価するものであり、腫瘍免疫そのものを全体的に評価するものであると考えられるため、癌免疫療法全般の治療効果を広く予測することが可能なものであると考えられる。
【0045】
癌免疫療法の例としては、非特異的免疫賦活薬、サイトカイン療法、がんワクチン療法、樹状細胞療法、養子免疫療法、非特異的リンパ球療法、がん抗原特異的Ｔ細胞療法、抗体療法、免疫チェックポイント阻害療法などが挙げられる。限定されるものではないが、本発明のバイオマーカーは、特に、免疫チェックポイント阻害療法の治療効果を正確に予測するものであることが本明細書の実施例において実証されている。
【0046】
免疫チェックポイント阻害剤の代表的な例は、ＰＤ－１阻害剤である。ＰＤ－１阻害剤としては、抗ＰＤ－１抗体であるニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ；オプジーボＴＭとして販売されている）およびペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）が挙げられるがこれらに限定されない。１つの好ましい実施形態では、ニボルマブが対象として選択され得る。理論に束縛されることを望まないが、ニボルマブを用いた療法が好ましい一つの理由としては、本発明のバイオマーカーを用いると、応答性の被験者と非応答性被験者とを明確に識別することができることが実施例において示されており、特に、特定の閾値により明確に応答性と非応答性とを区別することができることが判明しているからである。もちろん、他のＰＤ－１阻害剤についても同程度に本発明のバイオマーカーを利用することができると考えられる。
【0047】
本発明においては、ＰＤ－Ｌ１阻害剤およびＣＴＬＡ－４阻害剤もまたＰＤ－１阻害剤と同様に使用することが可能である。
【0048】
抗ＰＤ－１抗体は、ＰＤ－１シグナルによるＴ細胞活性化の抑制を解除することによって抗癌効果を奏するものと考えられている。抗ＰＤ－Ｌ１抗体もまた、ＰＤ－１シグナルによるＴ細胞活性化の抑制を解除することによって抗癌効果を奏するものと考えられている。ＰＤ－１がＴ細胞機能を阻害するメカニズムは完全には解明されていないものの、ＰＤ－１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ １）とＰＤ－Ｌ１あるいはＰＤ－Ｌ２とが相互作用すると、ＰＤ－１の細胞質ドメインにチロシン脱リン酸化酵素の一種であるＳＨＰ－１，２がリクルートされ、Ｔ細胞受容体シグナル伝達タンパク質であるＺＡＰ７０を不活性化させることにより、Ｔ細胞の活性化が抑制されると考えられている（Ｏｋａｚａｋｉ，Ｔ．，Ｃｈｉｋｕｍａ，Ｓ．，Ｉｗａｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．：Ａ ｒｈｅｏｓｔａｔ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ： ｔｈｅ ｕｎｉｑｕｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ＰＤ－１ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４，１２１２－１２１８（２０１３））。これは、ＩＴＳＭモチーフという部分にＳＨＰ－１，２がリクルートされ、近傍のＴ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒのｐｒｏｘｉｍａｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｋｉｎａｓｅを脱リン酸化することによると考えられ、換言すると、抗原刺激を受けたＴ細胞からこの「抗原刺激を受けた」という記憶を消してしまうともいうことができる。
【0049】
ＰＤ－１は、がん組織に浸潤しているキラーＴ細胞およびナチュラルキラー細胞において高レベルで発現している。また、腫瘍上のＰＤ－Ｌ１によって、ＰＤ－１によるＰＤ－１シグナルを介する免疫応答が減弱していると考えられている。ＰＤ－Ｌ１によって、このＰＤ－１シグナルを介する免疫応答が減弱するが、抗ＰＤ－１抗体によってＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用および／または相互作用によって生じるシグナル伝達を阻害すると、抗腫瘍免疫応答の増強効果が得られる。
【0050】
免疫チェックポイント阻害剤の他の例としては、ＰＤ－Ｌ１阻害剤（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１抗体であるアベルマブ、デュルバルマブまたはアテゾリズマブ）が挙げられる。
【0051】
ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、上記のＰＤ－１経路をＰＤ－Ｌ１の側に結合して阻害し、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用および／または相互作用によって生じるシグナル伝達を阻害し、抗腫瘍免疫応答を生じさせる。したがって、理論に束縛されることを望まないが本発明のバイオマーカーを用いると、ＰＤ－１経路を阻害する療法（例えば、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体）に対して応答性の被験者と非応答性被験者とを明確に識別することができるといえる。
【0052】
免疫チェックポイント阻害剤の他の例としては、ＣＴＬＡ－４阻害剤（例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体であるイピリムマブまたはトレメリルマブ）が挙げられる。
【0053】
ＣＴＬＡ－４阻害剤は、Ｔ細胞を活性化し、抗腫瘍免疫応答を生じさせる。Ｔ細胞は、表面のＣＤ２８が、ＣＤ８０またはＣＤ８６と相互作用することによって活性化される。しかしながら、一旦活性化されたＴ細胞であっても、表面に発現したＣＴＬＡ－４（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ－ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ４）が、ＣＤ８０またはＣＤ８６と、ＣＤ２８よりも高い親和性で優先的に相互作用し、それによって活性化が抑制されると考えられている。ＣＴＬＡ－４阻害剤は、ＣＴＬＡ－４を阻害することによって、ＣＤ２８とＣＤ８０またはＣＤ８６との相互作用が阻害されることを防ぐことによって、抗腫瘍免疫応答を生じさせる。
【0054】
さらなる実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＴＩＭ－３（Ｔ－ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ ｍｕｃｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－３）、ＬＡＧ－３（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ－３）、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ５（ＶＩＳＴＡ）、またはＴＩＧＩＴ（Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｗｉｔｈ Ｉｇ ａｎｄ ＩＴＩＭ ｄｏｍａｉｎ）などの免疫チェックポイントタンパク質を標的としてもよい。
【0055】
上記のような免疫チェックポイントは、自己組織への免疫応答を抑制していると考えられるが、ウイルスなどの抗原が生体内に長期間存在する場合にもＴ細胞に免疫チェックポイントが増加する。腫瘍組織についても、生体内に長期間存在する抗原となっているため、これらの免疫チェックポイントによって抗腫瘍免疫応答を回避していると考えられ、上記のような免疫チェックポイント阻害剤は、このような回避機能を無効化し、抗腫瘍効果を奏する。理論に拘束されるものではないが、本発明のバイオマーカーは、ヒトの抗腫瘍免疫応答全体のバランスを評価するものであって、このような免疫チェックポイント阻害剤の治療効果を正確に予測するための指標として使用できるものと考えられる。
【0056】
本発明の１つの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤を含む組成物が提供される。免疫チェックポイント阻害剤を含む組成物は、本発明のバイオマーカーによって評価して選択した被験体に投与されることにより、顕著に高確率で治療効果を得ることができる。
【0057】
本発明の免疫チェックポイント阻害剤を含む組成物は、通常、全身的または局所的に、経口または非経口の形で投与される。
【0058】
投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、通常、例えば、成人一人あたり、１回につき、０．１ｍｇから１００ｍｇの範囲で、１日１回から数回経口投与されるか、または成人一人あたり、１回につき、０．０１ｍｇから３０ｍｇの範囲で、１日１回から数回非経口投与（好ましくは、静脈内投与）されるか、または１日１時間から２４時間の範囲で静脈内に持続投与される。もちろん、投与量は種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、また範囲を越えて必要な場合もある。
【0059】
免疫チェックポイント阻害剤を含む組成物は、投与にあたり、経口投与のための内服用固形剤、内服用液剤、および非経口投与のための注射剤、外用剤、坐剤等の剤形をとり得る。経口投与のための内服用固形剤には、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等が含まれる。カプセル剤には、ハードカプセルおよびソフトカプセルが含まれる。
【0060】
本発明の組成物は、必要に応じて、１またはそれ以上の活性成分（例えば、免疫チェックポイントタンパク質に対する抗体）がそのままか、または賦形剤（ラクトース、マンニトール、グルコース、微結晶セルロース、デンプン等）、結合剤（ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等）、崩壊剤（繊維素グリコール酸カルシウム等）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム等）、安定剤、溶解補助剤（グルタミン酸、アスパラギン酸等）等と混合され、常法に従って製剤化して用いられる。また、必要によりコーティング剤（白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等）で被覆していてもよいし、また２以上の層で被覆していてもよい。さらにゼラチンのような吸収されうる物質のカプセルも包含される。
【0061】
本発明の組成物は、経口投与のために内服用液剤として製剤化される場合、薬学的に許容される水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤等を含む。このような液剤においては、ひとつまたはそれ以上の活性物質が、一般的に用いられる希釈剤（精製水、エタノールまたはそれらの混液等）に溶解、懸濁または乳化される。さらにこの液剤は、湿潤剤、懸濁化剤、乳化剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、保存剤、緩衝剤等を含有していてもよい。
【0062】
非経口投与のための注射剤としては、溶液、懸濁液、乳濁液および用時溶剤に溶解または懸濁して用いる固形の注射剤を包含する。注射剤は、ひとつまたはそれ以上の活性物質を溶剤に溶解、懸濁または乳化させて用いられる。溶剤として、例えば注射用蒸留水、生理食塩水、植物油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノールのようなアルコール類等およびそれらの組み合わせが用いられる。さらにこの注射剤は、安定剤、溶解補助剤（グルタミン酸、アスパラギン酸、ポリソルベート８０（登録商標）等）、懸濁化剤、乳化剤、無痛化剤、緩衝剤、保存剤等を含んでいてもよい。これらは最終工程において滅菌するか無菌操作法によって調製される。また無菌の固形剤、例えば凍結乾燥品を製造し、その使用前に無菌化または無菌の注射用蒸留水または他の溶剤に溶解して使用することもできる。
【0063】
（癌）
本発明において対象とされる癌としては、メラノーマ（悪性黒色腫）、非小細胞肺癌、腎細胞癌、悪性リンパ腫（ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫）、頭頸部癌、泌尿器科癌（膀胱癌、尿路上皮癌、前立腺癌）、小細胞肺癌、胸腺癌、胃癌、食道癌、胃食道接合部癌、肝癌（肝細胞癌、肝内胆管細胞癌）、原発性脳腫瘍（膠芽腫、中枢神経系原発リンパ腫）、悪性胸膜中皮腫、婦人科癌（卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、）、軟部肉腫、胆道癌、多発性骨髄腫、乳癌、大腸癌などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
本発明において対象とされる癌としては、メラノーマ（悪性黒色腫）、非小細胞肺癌、腎細胞癌、悪性リンパ腫（ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫）、頭頸部癌、泌尿器科癌（膀胱癌、尿路上皮癌、前立腺癌）、小細胞肺癌、胸腺癌、胃癌、食道癌、胃食道接合部癌、肝癌（肝細胞癌、肝内胆管細胞癌）、原発性脳腫瘍（膠芽腫、中枢神経系原発リンパ腫）、悪性胸膜中皮腫、婦人科癌（卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、）、軟部肉腫、胆道癌、多発性骨髄腫、乳癌、大腸癌などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【0064】
（細胞の分画・分離）
Ｔ細胞の分画・分離のためのサンプルは、常法によって、被験体から適切に採取することができる。例えば、被験体の末梢血、骨髄、腫瘍組織、造血組織、脾臓、正常組織、リンパ液等から行うことができる。末梢血からのサンプル採取は、非侵襲的で簡便であるため、有利であり得る。
Ｔ細胞の分画・分離のためのサンプルは、常法によって、被験体から適切に採取することができる。例えば、被験体の末梢血、骨髄、腫瘍組織、造血組織、脾臓、正常組織、リンパ液等から行うことができる。末梢血からのサンプル採取は、非侵襲的で簡便であるため、有利であり得る。
【0065】
被験体のサンプル中のＴ細胞の組成は、当業者が常法によって測定することができる。通常には、サンプル中の目的とする細胞亜集団を規定するマーカー（例えば、ＣＤ４）について、陽性である細胞の数を、フローサイトメトリーなどを用いて測定することが可能である。細胞集団の組成の測定は、フローサイトメトリーを用いることが一般的であるが、その他にも、細胞を含むサンプルに対する免疫染色、抗体アレイを用いる方法、細胞を含むサンプル中でのタンパク質発現分析（例えば、ウエスタンブロット、質量分析、ＨＰＬＣなど）、細胞を含むサンプル中でのｍＲＮＡ発現分析（例えば、マイクロアレイ、次世代シークエンシングなど）などを用いて行ってもよい。
【0066】
ＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ Ｔ細胞亜集団や、ＣＸＣＲ３－ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ Ｔ細胞亜集団等の細胞亜集団のそれぞれの細胞数を計測するには、全体の細胞からそれぞれの細胞の亜集団以外の細胞を実験的に除いておいて求めてもよい。例えば、ＣＤ４＋ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌアイソレーションキット、ヒト（Ｍｉｌｉｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）などのように、所定の抗体を用いることなく、末梢血から目的のＴ細胞亜集団に相当する細胞を分離してもよい。例えば、ＣＤ４＋ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌアイソレーションキット、ヒト（Ｍｉｌｉｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いると、ＣＤ４抗体とＣＤ６２Ｌ抗体を用いずに、末梢血からＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ Ｔ細胞亜集団に相当する細胞を分離することができる。全体の生細胞数を数えて記録しておき、またこのキットを用いて得られた細胞数を数え、記録することができる。またＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌアイソレーションキット、ヒト（Ｍｉｌｉｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いると、抗ＦｏｘＰ３抗体を用いずにＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞亜集団に相当する細胞の数を求めることができる。ＦｏｘＰ３は細胞内の核に局在するので、核内の分子を染色するためのステップを省く利点がある。同様なキットとして、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｄｉｍ／－Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌアイソレーションキット、ヒト（Ｍｉｌｉｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）、ＣＤ２５＋ＣＤ４９ｄ－Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌアイソレーションキット、ヒト（Ｍｉｌｉｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）も選択できる。本発明の一実施形態においては、目的のＴ細胞亜集団のそれぞれの細胞数を計測することができるものであれば、いずれのキットも使用できる。
【0067】
また、抗体を用いなくてもよい。抗体は、個々の細胞に発現している分子を特異的に認識して結合できるものであって、さらに抗体が細胞表面上、または細胞内で発現している分子に結合しているときに発色できるようにして検出し、発色している細胞の数を計測する。ここで、それらの細胞表面上、または細胞内で発現している分子はタンパク質であるので、そのタンパク質を発現している場合にはそれをコードしているｍＲＮＡも細胞内にできている。すなわち、個々の細胞内のｍＲＮＡを調べて、注目しているタンパク質分子をコードしているｍＲＮＡの有無を調べればよい。これを可能にしているのが、シングル・セルの遺伝子発現解析、つまり１細胞レベルのｍＲＮＡ解析である。単細胞の遺伝子発現解析としては、たとえば、１）Ｑｕａｒｔｚ－Ｓｅｑにより次世代シーケンシングを行う方法、２）Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃ１ ＳｙｓｔｅｍやＩＣＥＬＬ８ ＳＩｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍを用いて細胞を単離してＳＭＡＲＴ－Ｓｅｑ ｖ４でライブラリー調製する方法、３）セルソーターで細胞を分離し、Ａｍｂｉｏｎ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ－ｔｏ－ＣＴキットを用い定量ＰＣＲで計測する方法、４）ＣｙＴＯＦ ＳＹＳＴＥＭ（Ｈｅｌｉｏｓ社）などが挙げられる。
【0068】
すなわち、血液を取得し、生細胞数を数え、セルソーター等で細胞を分離する。分離した個々の細胞に対し、例えば、Ａｍｂｉｏｎ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ－ｔｏ－ＣＴキットを用い、特定の遺伝子について発現量を定量ＰＣＲ法の装置で計測することができる。その結果に基づいて、個々の細胞がＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ Ｔ細胞亜集団や、ＣＸＣＲ３－ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ Ｔ細胞亜集団のどの亜集団に該当するかを調べて、それぞれの亜集団に該当した細胞の数を数えることもできる。発現を調べる遺伝子の候補としては、αβＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、ＦｏｘＰ３、ＳＴＡＴ５、ＦｏｘＯ１、ＦｏｘＯ３、ＩＬ－１０、ＴＧＦｂｅｔａ、ＩＬ－３５、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４４、ＩＬ－７Ｒ（ＣＤ１２７）、ＩＬ－１５Ｒ、ＣＣＲ７、ＢＬＩＭＰ１、などがあるが、これらに限られるものではなく、目的の細胞亜集団に応じて適宜変更可能である。
【0069】
本発明における、細胞亜集団の割合の測定、または基準値や閾値との比較は、規定されたシグナルを有する標準サンプルを用いて行ってもよい。所定の細胞亜集団に対応する蛍光シグナルを生じるように調製された標準（例えば、蛍光色素を付着させた粒子）と、細胞集団を含むサンプルとの間でのシグナルを比較し、標準との比較によって、サンプル中の細胞亜集団の量または割合を測定することができる。また、所定の基準値や閾値に対応する蛍光シグナルを生じるように調製された標準（例えば、蛍光色素を付着させた粒子）と、細胞集団を含むサンプルとの間でのシグナルを比較し、標準との比較によって、サンプル中のＴ細胞組成における本発明のマーカーの有無もしくは量を判定することが可能である。
【0070】
本発明において、特定のマーカーについて、ｈｉｇｈ（高発現）またはｌｏｗ（低発現）を判定する場合、当業者は、当技術分野で一般的に用いられている発現強度の分類基準を用いて行うことができる。例えば、ＣＤ６２Ｌについて、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ６２Ｌ抗体を用いた場合の１０Ｅ２のシグナルに対応するシグナル強度を境界として、ＣＤ６２ＬｌｏｗとＣＤ６２Ｌｈｉｇｈとを明瞭に分割することが可能である（ＷＯ２０１８／１４７２９１）。
【0071】
本発明の一実施形態において、当業者は、示される細胞の表面マーカーを適切に識別して、細胞を分画または計数することが可能である。
【0072】
ＣＤ４ Ｔ細胞は、エフェクター細胞として幾つかの分化状態に変化することが知られている。ＩＦＮγを主に産生し細胞性免疫に強く関わるＴｈ１や、ＩＬ４、ＩＬ－５を主に産生しアレルギーに関わるＴｈ２、また自己免疫疾患などに関わることが知られ、ＩＬ－１７を産生するＴｈ１７などがある。それぞれに分化したＣＤ４ Ｔ細胞は特徴的なケモカインレセプター（ＣＣＲ）を発現することが知られており、発現するＣＣＲの種類によってＴｈタイプを分類することができる。ヒトＣＤ４ Ｔ細胞のＴｈ分化はマウスなどに比べると複雑であることが知られており、例えば、図１のように分類することができる（AnnualReviewof Immunology, Vol. 34:317-334 Heterogeneity of HumanCD4+ T CellsAgainstMicrobes, Fig.1）。
【0073】
（好ましい実施形態）
本発明の一局面において、被験体のＣＤ４＋Ｔ細胞集団中のＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋細胞
亜集団の相対量を、前記被験体の癌治療に対する応答を予測するための指標として用いる方法が提供される。一実施形態において、本発明の方法は、前記被験体由来のサンプル中の前記細胞亜集団の相対量を決定する工程を含み、前記相対量と基準値との比較を、前記被験体の癌治療に対する応答を予測するための指標として用いる。他の実施形態において、前記相対量と基準値との比較を、前記被験体の長期生存を予測するための指標として用いる。
本発明の一局面において、被験体のＣＤ４＋Ｔ細胞集団中のＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋細胞
亜集団の相対量を、前記被験体の癌治療に対する応答を予測するための指標として用いる方法が提供される。一実施形態において、本発明の方法は、前記被験体由来のサンプル中の前記細胞亜集団の相対量を決定する工程を含み、前記相対量と基準値との比較を、前記被験体の癌治療に対する応答を予測するための指標として用いる。他の実施形態において、前記相対量と基準値との比較を、前記被験体の長期生存を予測するための指標として用いる。
【0074】
本発明の他の局面において、被験体のＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋ＣＤ４＋Ｔ細胞亜集団の量
を、前記被験体の癌治療に対する応答を予測するための指標として用いる方法が提供される。一実施形態において、本発明の方法は、前記被験体由来のサンプル中の前記細胞亜集団の量を決定する工程を含み、前記量と基準値との比較を、前記被験体の癌治療に対する応答を予測するための指標として用いる。他の実施形態において、前記量と基準値との比較を、前記被験体の長期生存を予測するための指標として用いる。
を、前記被験体の癌治療に対する応答を予測するための指標として用いる方法が提供される。一実施形態において、本発明の方法は、前記被験体由来のサンプル中の前記細胞亜集団の量を決定する工程を含み、前記量と基準値との比較を、前記被験体の癌治療に対する応答を予測するための指標として用いる。他の実施形態において、前記量と基準値との比較を、前記被験体の長期生存を予測するための指標として用いる。
【0075】
本発明の局面において、被験体のＣＤ４＋Ｔ細胞集団中のＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋細胞亜
集団の相対量を、前記被験体の癌治療に対する応答を予測するための指標として用いる方法であって、前記被験体由来のサンプル中の前記細胞亜集団の相対量と無効群閾値との比較を、前記被験体が前記癌治療に対して無効群であるか否かを予測するための指標として用いる方法が提供される。
集団の相対量を、前記被験体の癌治療に対する応答を予測するための指標として用いる方法であって、前記被験体由来のサンプル中の前記細胞亜集団の相対量と無効群閾値との比較を、前記被験体が前記癌治療に対して無効群であるか否かを予測するための指標として用いる方法が提供される。
【0076】
本発明の他の局面において、被験体のＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋ＣＤ４＋Ｔ細胞亜集団の量
を、前記被験体の癌治療に対する応答を予測するための指標として用いる方法であって、前記被験体由来のサンプル中の前記細胞亜集団の量と無効群閾値との比較を、前記被験体が前記癌治療に対して無効群であるか否かを予測するための指標として用いる方法が提供される。
を、前記被験体の癌治療に対する応答を予測するための指標として用いる方法であって、前記被験体由来のサンプル中の前記細胞亜集団の量と無効群閾値との比較を、前記被験体が前記癌治療に対して無効群であるか否かを予測するための指標として用いる方法が提供される。
【0077】
本発明の一実施形態において、前記量または相対量が無効群閾値以上であることによって、前記被験体が前記癌治療に対して無効群ではないことを示すことができる。また他の実施形態において、前記量または相対量が基準値以上であることによって、前記被験体が前記癌治療に対して応答すること、または癌治療後の長期の無増悪生存期間を示すことができる。
【0078】
また本発明の他の局面において、被験体のＣＤ４＋Ｔ細胞集団中のＣＣＲ４-ＣＣＲ６
＋細胞亜集団の相対量を、前記被験体のがん免疫療法に対する応答を予測するための指標として用いる方法が提供される。一実施形態において、本発明の方法は、前記被験体由来のサンプル中の前記細胞亜集団の相対量を決定する工程を含み、前記相対量と基準値との比較を、前記被験体のがん免疫療法に対する応答を予測するための指標として用いる。他の実施形態において、前記相対量と基準値との比較を、前記被験体の長期生存を予測するための指標として用いる。
＋細胞亜集団の相対量を、前記被験体のがん免疫療法に対する応答を予測するための指標として用いる方法が提供される。一実施形態において、本発明の方法は、前記被験体由来のサンプル中の前記細胞亜集団の相対量を決定する工程を含み、前記相対量と基準値との比較を、前記被験体のがん免疫療法に対する応答を予測するための指標として用いる。他の実施形態において、前記相対量と基準値との比較を、前記被験体の長期生存を予測するための指標として用いる。
【0079】
本発明の他の局面において、被験体のＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋ＣＤ４＋Ｔ細胞亜集団の量
を、前記被験体のがん免疫療法に対する応答を予測するための指標として用いる方法が提供される。一実施形態において、本発明の方法は、前記被験体由来のサンプル中の前記細胞亜集団の量を決定する工程を含み、前記量と基準値との比較を、前記被験体のがん免疫療法に対する応答を予測するための指標として用いる。他の実施形態において、前記量と基準値との比較を、前記被験体の長期生存を予測するための指標として用いる。
を、前記被験体のがん免疫療法に対する応答を予測するための指標として用いる方法が提供される。一実施形態において、本発明の方法は、前記被験体由来のサンプル中の前記細胞亜集団の量を決定する工程を含み、前記量と基準値との比較を、前記被験体のがん免疫療法に対する応答を予測するための指標として用いる。他の実施形態において、前記量と基準値との比較を、前記被験体の長期生存を予測するための指標として用いる。
【0080】
本発明の局面において、被験体のＣＤ４＋Ｔ細胞集団中のＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋細胞亜
集団の相対量を、前記被験体のがん免疫療法に対する応答を予測するための指標として用いる方法であって、前記被験体由来のサンプル中の前記細胞亜集団の相対量と無効群閾値との比較を、前記被験体が前記がん免疫療法に対して無効群であるか否かを予測するための指標として用いる方法が提供される。
集団の相対量を、前記被験体のがん免疫療法に対する応答を予測するための指標として用いる方法であって、前記被験体由来のサンプル中の前記細胞亜集団の相対量と無効群閾値との比較を、前記被験体が前記がん免疫療法に対して無効群であるか否かを予測するための指標として用いる方法が提供される。
【0081】
本発明の他の局面において、被験体のＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋ＣＤ４＋Ｔ細胞亜集団の量
を、前記被験体のがん免疫療法に対する応答を予測するための指標として用いる方法であって、前記被験体由来のサンプル中の前記細胞亜集団の量と無効群閾値との比較を、前記被験体が前記がん免疫療法に対して無効群であるか否かを予測するための指標として用いる方法が提供される。
を、前記被験体のがん免疫療法に対する応答を予測するための指標として用いる方法であって、前記被験体由来のサンプル中の前記細胞亜集団の量と無効群閾値との比較を、前記被験体が前記がん免疫療法に対して無効群であるか否かを予測するための指標として用いる方法が提供される。
【0082】
本発明の一実施形態において、前記量または相対量が無効群閾値以上であることによって、前記被験体が前記がん免疫療法に対して無効群ではないことを示すことができる。また他の実施形態において、前記量または相対量が基準値以上であることによって、前記被験体が前記がん免疫療法に対して応答すること、または癌免疫療法後の長期の無増悪生存期間を示すことができる。
【0083】
本発明においては、実施例において示されるように、被験体のＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋Ｃ
Ｄ４＋Ｔ細胞亜集団の量またはその相対量が、癌免疫療法、放射線治療、および分子標的薬投与などの癌治療後の無増悪生存期間に比例することが見出されている。そのため、一実施形態においては、被験体のＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋ＣＤ４＋Ｔ細胞亜集団の量またはそ
の相対量が多いことが、当該被験体が癌免疫療法（特に、免疫チェックポイント阻害剤による癌免疫療法）、放射線治療、分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療に対して応答性であると予測することができる。
Ｄ４＋Ｔ細胞亜集団の量またはその相対量が、癌免疫療法、放射線治療、および分子標的薬投与などの癌治療後の無増悪生存期間に比例することが見出されている。そのため、一実施形態においては、被験体のＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋ＣＤ４＋Ｔ細胞亜集団の量またはそ
の相対量が多いことが、当該被験体が癌免疫療法（特に、免疫チェックポイント阻害剤による癌免疫療法）、放射線治療、分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療に対して応答性であると予測することができる。
【0084】
したがって、本発明において、細胞亜集団量を適切な基準と比較し、比較によって被験体におけるがん免疫療法、放射線治療、分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療における長期生存（例えば、がん免疫療法後に５００日以上の無増悪生存期間）を予測することもできる。例えば、サンプルにおける細胞亜集団の量が、無増悪生存期間として５００日を示すＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋ＣＤ４＋Ｔ細胞亜集団の量に相当する基準より増加し
ていることは、被験体においてがん免疫療法、放射線治療、分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療における長期生存が予測されることを示し得る。あるいは、サンプルにおける細胞亜集団の量が、基準より増加していないことは、被験体においてがん免疫療法、放射線治療、分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療における長期生存が予測されないことを示し得る。
ていることは、被験体においてがん免疫療法、放射線治療、分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療における長期生存が予測されることを示し得る。あるいは、サンプルにおける細胞亜集団の量が、基準より増加していないことは、被験体においてがん免疫療法、放射線治療、分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療における長期生存が予測されないことを示し得る。
【0085】
基準または基準値としては、例えば、がん免疫療法、放射線治療、分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療前の被験体のサンプルにおける対応する細胞亜集団の量が挙げられるが、これに限定されるものではない。このほか、基準としては、がん免疫療法、放射線治療、分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療を受けていない被験体のサンプルから実験的に算出した値などを用いることも可能である。また基準または基準値としては、所定の無増悪生存期間を示す値を採用することもできる。
【0086】
基準と比べて増加していることは、がん免疫療法後の細胞亜集団量が、基準を超える量であるか、基準の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０％を超えて増加しているか、あるいは基準の１．５倍、２倍、３倍、５倍を超えて増加していることによって示され得る。典型的には、基準の値を超えていれば、基準と比べて増加していると考えられる。基準が実験的に算出されている場合、基準値から見て適切な誤差を超える増加が観察された場合に、基準と比べて増加しているとすることができる。適切な誤差としては、例えば、１標準偏差、２標準偏差、３標準偏差、またはそれら超が挙げられる。
【0087】
被験体のＣＤ４＋Ｔ細胞集団中の本発明の特定の細胞亜集団の相対量を、長期生存群の検出、無効群の検出、奏効群の検出、および／または安定群の検出のために使用し得る。これらの群の検出は、被験体のＣＤ４＋Ｔ細胞集団中の本発明の特定の細胞亜集団の相対量を、閾値と比較することによって達成され得る。
【0088】
この閾値は、感度および特異度を考慮して決定することができる。感度および特異度は、長期生存群の検出、無効群の検出、奏効群の検出、または安定群の検出についての感度および特異度であり得る。１つの実施形態において、本発明のバイオマーカーは、感度、特異度とも１００％となる閾値を設定することができる。本発明のバイオマーカーとして記載される指標の２つ以上を用いる場合、それらの指標についてそれぞれ閾値を定めることができ、必要な場合には、第１の閾値、第２の閾値、第３の閾値、第４の閾値のようにして区別して用いることができる。
【0089】
閾値は、長期生存群の検出、無効群の検出、奏効群の検出、または安定群の検出について感度が約９０％超となるように決定され得る。別の実施形態では、閾値が、無効群の検出、奏効群の検出、または安定群の検出について感度が約１００％となるように決定され得る。さらに別の実施形態では、閾値は、無効群の検出、奏効群の検出、または安定群の検出について特異度が約９０％超となるように決定され得る。さらに別の実施形態では、閾値は、無効群の検出、奏効群の検出、または安定群の検出について特異度が約１００％となるように決定され得る。
【0090】
本発明のバイオマーカーは、ＣＤ４＋Ｔ細胞、樹状細胞、および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含めた抗腫瘍免疫応答全体のバランスを評価するものであり、腫瘍免疫そのものを全体的に評価するものであると考えられる。そのため、本発明の方法は、幅広い癌腫に対して有効なものであるということができる。また本発明は、抗腫瘍免疫応答全体のバランスを評価するものであることから、ＰＤ－１やＰＤ－Ｌ１に対する免疫チェックポイント阻害剤のみならず、他の免疫チェックポイントに対して作用する抗癌治療に対しても有効であることが予測される。また放射線治療や分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療についても、生体内の抗腫瘍免疫と協働して腫瘍を治癒するものであるため、抗腫瘍免疫の状態を評価し得る本発明のバイオマーカーやそれを用いた方法により、がん免疫療法以外の癌治療にも有効であるといえる。
【0091】
また本発明のＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋細胞亜集団、ＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋ＣＸＣＲ３＋細胞亜集団、またはＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋ＣＸＣＲ３－細胞亜集団などの特定の細胞集団は、
その細胞集団が多く存在する場合には、本来抗腫瘍効果を発揮するのに十分なＴ細胞免疫が準備されていると評価することができるものであるため、その治療対象となる患者が罹患している癌種は特に限られるものではない。癌としては固形癌や造血器腫瘍のいずれであってもよく、例えば非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腎癌、ホジキン病、頭頸部癌、乳癌、胃癌、悪性黒色腫、大腸癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、消化管間質腫瘍、膵神経内分泌種腫瘍、皮膚癌など、いわゆる抗腫瘍免疫が関連して治療する癌に対する癌治療の効果を予測することができる。
その細胞集団が多く存在する場合には、本来抗腫瘍効果を発揮するのに十分なＴ細胞免疫が準備されていると評価することができるものであるため、その治療対象となる患者が罹患している癌種は特に限られるものではない。癌としては固形癌や造血器腫瘍のいずれであってもよく、例えば非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腎癌、ホジキン病、頭頸部癌、乳癌、胃癌、悪性黒色腫、大腸癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、消化管間質腫瘍、膵神経内分泌種腫瘍、皮膚癌など、いわゆる抗腫瘍免疫が関連して治療する癌に対する癌治療の効果を予測することができる。
【0092】
理論に拘束されることは望まないが、抗ＰＤ－１抗体に代表される免疫チェックポイント阻害薬の抗腫瘍効果は、担癌宿主に予め存在しているＴ細胞免疫の状態により決定される。これを利用して、特許第６６６４６８４号では、末梢血Ｔ細胞クラスター解析を行うことで得られる％ＣＤ６２Ｌｌｏｗ／ＣＤ４＋ＣＤ３＋Ｔ細胞が、ＰＤ－１阻害薬治療の短期的奏効の有無、無増悪生存期間、全生存期間を予測することを可能にしている。この性能は、ＣＤ６２Ｌと同じ二次リンパ組織へのホーミング分子であるＣＣＲ７を用いても再現することはできず、約１２０種類に分類したＴ細胞クラスターによる予測性能解析でも、％ＣＤ６２Ｌｌｏｗ／ＣＤ４＋ＣＤ３＋Ｔ細胞を凌ぐものはなかった。
【0093】
他方で、上記のとおり、ＣＤ４ Ｔ細胞は、エフェクター細胞として幾つかの分化状態に変化することが知られている。ＩＦＮγを主に産生し細胞性免疫に強く関わるＴｈ１や、ＩＬ４、ＩＬ－５を主に産生しアレルギーに関わるＴｈ２、また自己免疫疾患などに関わることが知られ、ＩＬ－１７を産生するＴｈ１７などがある。それぞれに分化したＣＤ４ Ｔ細胞は特徴的なケモカインレセプター（ＣＣＲ）を発現することが知られており、発現するＣＣＲの種類によってＴｈタイプを分類することができる。ヒトＣＤ４ Ｔ細胞のＴｈ分化はマウスなどに比べると複雑であることが知られており、例えば、図１のように分類することができる（AnnualReviewof Immunology, Vol. 34:317-334 Heterogeneity of HumanCD4+ T CellsAgainstMicrobes, Fig.1）。
【0094】
本発明では、ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ３＋Ｔ細胞が抗腫瘍免疫と強く相関することを利用し、ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ３＋Ｔ細胞をさらにＣＣＲタイプによりＴｈ分類して、抗腫瘍効果と最も強く相関するＴｈクラスターを解析することで、新たなバイオマーカーを得ている。一実施形態において、抗腫瘍効果を評価する数値としてＰｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ治療後の無増悪生存期間（ＰＦＳ）を用いている。
【0095】
また上記のとおり、本発明の方法は、ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ３＋Ｔ細胞の中でも特定のＴｈクラスターの存在量を通じて、被験体における抗腫瘍免疫の状態を評価することができるものである。免疫状態はその被験者に対する治療の効果に関連するものであるため、本発明の方法によって、がん免疫療法のみならず、放射線治療や分子標的薬投与、および外科的手術による癌治療に対する効果を予測することができる。
【0096】
本発明の一実施形態においては、ＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋細胞亜集団に加えて、さらにＣ
ＸＣＲ３＋細胞亜集団を用いることも可能である。かかる細胞亜集団は、ＣＣＲ４-ＣＣ
Ｒ６＋ＣＸＣＲ３＋となり、Ｔｈタイプで分類するとＴｈ１／１７に分類される。
ＸＣＲ３＋細胞亜集団を用いることも可能である。かかる細胞亜集団は、ＣＣＲ４-ＣＣ
Ｒ６＋ＣＸＣＲ３＋となり、Ｔｈタイプで分類するとＴｈ１／１７に分類される。
【0097】
本発明の一実施形態においては、ＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋細胞亜集団に加えて、さらにＣ
ＸＣＲ３-細胞亜集団を用いることも可能である。かかる細胞亜集団は、ＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋ＣＸＣＲ３-となり、Ｔｈタイプで分類するとＣＣＲ６ ＳＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｐｏ
ｓｉｔｉｖｅ）に分類される。
ＸＣＲ３-細胞亜集団を用いることも可能である。かかる細胞亜集団は、ＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋ＣＸＣＲ３-となり、Ｔｈタイプで分類するとＣＣＲ６ ＳＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｐｏ
ｓｉｔｉｖｅ）に分類される。
【0098】
さらに本発明の他の一実施形態においては、ＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋細胞亜集団に加えて
、さらにＦｏｘＰ３-細胞亜集団を用いることも可能である。かかる細胞亜集団は、ＣＣ
Ｒ４-ＣＣＲ６＋ＦｏｘＰ３-となり、Ｔｈタイプで分類するとＴｈ１／１７とＣＣＲ６ ＳＰとを組み合わせたものとなる。
、さらにＦｏｘＰ３-細胞亜集団を用いることも可能である。かかる細胞亜集団は、ＣＣ
Ｒ４-ＣＣＲ６＋ＦｏｘＰ３-となり、Ｔｈタイプで分類するとＴｈ１／１７とＣＣＲ６ ＳＰとを組み合わせたものとなる。
【0099】
さらに本発明の他の一実施形態においては、ＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋細胞亜集団に加えて
、さらにＣＤ６２Ｌｌｏｗ細胞亜集団を用いることも可能である。またはＣＣＲ４-ＣＣ
Ｒ６＋細胞亜集団に加えて、さらにＣＤ４５ＲＡ－細胞亜集団を用いることも可能である。
、さらにＣＤ６２Ｌｌｏｗ細胞亜集団を用いることも可能である。またはＣＣＲ４-ＣＣ
Ｒ６＋細胞亜集団に加えて、さらにＣＤ４５ＲＡ－細胞亜集団を用いることも可能である。
【0100】
本発明では、上記のとおり、ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ３＋Ｔ細胞が抗腫瘍免疫と強く相関することを利用し、ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ３＋Ｔ細胞をさらにＣＣＲタイプによりＴｈ分類して、抗腫瘍効果と最も強く相関するＴｈクラスターを解析することで、新たなバイオマーカーを得ている。そして本発明者らは、このＣＤ６２Ｌｌｏｗという形質の意義を調べるため、ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ＲＮＡｓｅｑによるＴＣＲレパトア解析を行っている。その結果、末梢血循環中ＣＤ６２Ｌｌｏｗ分画は、極めて選択性の高い僅かなクローンで構成されており、放射線治療でがん抗原を放出させた後に増加するのは、ＣＤ６２ＬｌｏｗＴ細胞クローンのみであったことがわかっている。このことから、本発明者らは、ＣＤ６２ＬｌｏｗＴ細胞はがん抗原特異的Ｔ細胞クローンで構成され、生体内における抗腫瘍効果を発揮するための重要な役割を担っていることを見出した。
【0101】
また本発明は、図２に示すようなＣｙＴＯＦのｖｉＳＮＥ解析によってＣＤ４＋細胞をマッピングした場合に、ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＤ４＋Ｔ細胞に含まれる５種類のＴｈ分類（Ｔｈ１、Ｔｈ１／１７、Ｔｈ１７、ＣＣＲ６ ＳＰ、ＴＰ）のうち、どのクラスターが抗腫瘍免疫に重要であるのかを見出している。理論に拘束されることを望まないが、がん抗原放出に反応しクローン増殖するＴ細胞はＣＤ６２ＬｌｏｗＣＤ４＋Ｔ細胞にしか見出されないことから、ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＤ４＋Ｔ細胞に含まれる５種類のＴｈ分類のいずれかが抗腫瘍効果を担うものとなる。そのため、本発明の一局面において、ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＤ４＋Ｔ細胞に含まれる５種類のＴｈ分類の中から、それぞれの癌種やそれに対する治療法に応じた免疫状態を適切に評価することができるクラスターまたは細胞亜集団を選択して、その細胞亜集団の存在量や相対量を用いて、被験体の癌治療に対する応答を予測するための指標として用いる方法を提供することができる。
【0102】
本発明では、実施例に示すとおり、ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ ＣＤ４＋とＣＤ６２ＬｌｏｗＣＸＣＲ３－ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ ＣＤ４＋の２つのクラスターが無増悪生存期間と有意な相関を示すことを見出している。理論に拘束されることは望まないが、ＣｙＴＯＦのｖｉＳＮＥ解析では、図２に示すとおり、この２つのクラスターは隣在しており、各種分子発現が近似しているクラスターと考えられる。Ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ＲＮＡｓｅｑを用いた結果でも、異なる遺伝子発現を持ちながら近似した遺伝子発現パターンを有していることが判明している。一方、この２つのクラスターは、Ｔｈ１、Ｔｈ１７細胞とは遺伝子発現パターンが異なっている（図１５）。したがって、この２つのクラスターは、Ｔｈ１、Ｔｈ１７細胞とは異なりながら、お互いに近似した細胞機能を発揮する分化状態にあると考えられる。また本発明では、実施例に示すとおり、ＣＤ４＋細胞全体に対するＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－及びＣＸＣＲ３－ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－の細胞比率は、ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－、ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＸＣＲ３－ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－及びＣＤ６２Ｌｌｏｗ ＣＤ４＋細胞割合との間に有意な相関を示すことを見出しており（図１６）、これにより、ＣＤ６２Ｌを用いずに、ＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－及びＣＸＣＲ３－ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－の細胞比率を用いても、ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ＣＤ４＋、及びＣＤ６２ＬｌｏｗＣＸＣＲ３－ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ＣＤ４＋細胞割合と同等の予測性能を得ることが可能であることを見出した。
【0103】
抗腫瘍免疫応答においては、Ｔ細胞組成が重要であると考えられるところ、ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ ＣＤ４＋細胞、ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＸＣＲ３－ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ ＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＤ４＋Ｔ細胞の中でも特有な遺伝子発現パターンを有し、他のＣＤ６２ＬｌｏｗＣＤ４＋Ｔ細胞とはＴ細胞レセプターｃｌｏｎｏｔｙｐｅも異なっている。ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ ＣＤ４＋細胞、ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＸＣＲ３－ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ ＣＤ４＋細胞に特有な遺伝子発現は、樹状細胞などの抗原提示細胞を介したＣＤ８＋ Ｔ細胞のプライミング、遊走能、腫瘍浸潤能、殺細胞機能をヘルプするのに必須なＣＤ４＋ Ｔ細胞機能を担い、特有なｃｌｏｎｏｔｙｐｅはがん抗原特異性を有するものと考えられる。このような細胞機能と抗原特異性を有するＣＤ６２ＬｌｏｗＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ ＣＤ４＋細胞、および／またはＣＤ６２ＬｌｏｗＣＸＣＲ３－ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ ＣＤ４＋細胞が準備されていなければ、免疫チェックポイント阻害薬を投与しても、抗腫瘍免疫応答を十分に行うことができない。そのため、ＣＤ４＋Ｔ細胞中のＣＤ６２ＬｌｏｗＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ ＣＤ４＋細胞、および／またはＣＤ６２ＬｌｏｗＣＸＣＲ３－ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ ＣＤ４＋細胞の割合は、免疫チェックポイント阻害薬による抗腫瘍効果を予測する指標となる。本発明では、数理学的ネットワーク解析の結果、同様なＣＣＲ発現パターンを示すがＣＤ６２Ｌを発現するＣＤ６２ＬｈｉｇｈＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－細胞、および／またはＣＤ６２ＬｈｉｇｈＣＸＣＲ３－ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－細胞のＣＤ４＋Ｔ細胞に対する割合がＣＤ６２ＬｌｏｗＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ＣＤ４＋細胞、および／またはＣＤ６２ＬｌｏｗＣＸＣＲ３－ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ＣＤ４＋細胞割合と一定の相関関係を有することを見出した。この結果、ＣＤ４＋細胞におけるＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－及びＣＸＣＲ３－ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－全体の細胞の和であるＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋細胞亜集団の量または相対量か
ら、同等の予測性能を備えたまま、免疫チェックポイント阻害薬を含む癌治療による抗腫瘍効果を予測する指標となり得ることを示している。
ら、同等の予測性能を備えたまま、免疫チェックポイント阻害薬を含む癌治療による抗腫瘍効果を予測する指標となり得ることを示している。
【0104】
本発明の一局面において、本発明は、癌治療（例えば、免疫チェックポイント阻害剤による治療）に対する応答を予測するための指標を探索または決定する方法であって、
・当該癌治療前の被験体のＣＤ６２ＬｌｏｗＣＤ４＋Ｔ細胞における亜集団と、当該被験体の癌治療に対する応答とを相関させる工程と、
・この相関に基づいて、当該癌治療と相関する亜集団を、当該癌治療に対する応答の予測のための指標とする工程と
を包含し得る。好ましい実施形態において、この亜集団は、５種類のＴｈ分類、すなわちＴｈ１（ＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６－ＣＣＲ４－）、Ｔｈ１／１７（ＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－）、Ｔｈ１７（ＣＸＣＲ３－ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４＋）、ＣＣＲ６ ＳＰ（ＣＸＣＲ３－ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－）、ＴＰ（ＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４＋）であり得る。
・当該癌治療前の被験体のＣＤ６２ＬｌｏｗＣＤ４＋Ｔ細胞における亜集団と、当該被験体の癌治療に対する応答とを相関させる工程と、
・この相関に基づいて、当該癌治療と相関する亜集団を、当該癌治療に対する応答の予測のための指標とする工程と
を包含し得る。好ましい実施形態において、この亜集団は、５種類のＴｈ分類、すなわちＴｈ１（ＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６－ＣＣＲ４－）、Ｔｈ１／１７（ＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－）、Ｔｈ１７（ＣＸＣＲ３－ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４＋）、ＣＣＲ６ ＳＰ（ＣＸＣＲ３－ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－）、ＴＰ（ＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４＋）であり得る。
【0105】
すなわち、上記のとおり本発明は、ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＤ４＋Ｔ細胞に含まれる５種類のＴｈ分類の中から、それぞれの癌種やそれに対する治療法に応じた免疫状態を適切に評価することができるクラスターまたは細胞亜集団を選択して、その細胞亜集団の存在量や相対量を用いて、被験体の癌治療に対する応答を予測するための指標として用いる方法を提供することができる。５種類のＴｈ分類に加えて、あるいは、これらの代替的に、それぞれの癌種やそれに対する治療法に応じた免疫状態を適切に評価することができるクラスターまたは細胞亜集団としては、ＣＤ６２ＬｈｉｇｈＣＤ４＋Ｔ細胞に含まれる６種類のＴｈ分類、すなわち、ＣＤ６２ＬｈｉｇｈＴｈ１（ＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ４－ＣＣＲ６－）細胞亜集団、ＣＤ６２ＬｈｉｇｈＴｈ１／１７（ＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ４－ＣＣＲ６＋）細胞亜集団、ＣＤ６２ＬｈｉｇｈＣＣＲ６ ＳＰ（ＣＸＣＲ３－ＣＣＲ４－ＣＣＲ６＋）細胞亜集団、ＣＤ６２ＬｈｉｇｈＴｈ１７（ＣＸＣＲ３－ＣＣＲ４＋ＣＣＲ６＋）細胞亜集団、ＣＤ６２ＬｈｉｇｈＴｈ２（ＣＸＣＲ３－ＣＣＲ４＋ＣＣＲ６－）細胞亜集団、ＣＤ６２ＬｈｉｇｈＴＮ（ＣＸＣＲ３－ＣＣＲ４－ＣＣＲ６－）細胞亜集団がある。
【0106】
さらに、Ｔｈ分類亜集団に加えることで免疫状態を適切に評価することができるエフェクターＣＤ４＋ Ｔ細胞亜集団として、ＣＣＲ７＋ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＤ４＋Ｔ細胞亜集団、ＰＤ１＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＤ４＋Ｔ細胞亜集団、ＬＡＧ－３＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＤ４＋Ｔ細胞亜集団、ＣＤ４５ＲＡ－Ｆｏｘｐ３－ＣＤ４＋Ｔ細胞亜集団を、制御性Ｔ細胞亜集団として、ＣＤ１２７＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞亜集団、ＣＤ４５ＲＡ－Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞亜集団、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞亜集団を、エフェクターＣＤ８＋ Ｔ細胞亜集団として、ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＤ８＋Ｔ細胞亜集団を、それぞれ挙げることができる。
【0107】
（キット）
本発明の１つの局面において、被験体のがん免疫療法、放射線治療、分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療に対する応答を予測するための、細胞表面マーカーに対する検出剤を含むキットが提供される。被検体のＴ細胞が発現するこれらの細胞表面マーカーが、被験体のがん免疫療法、放射線治療、分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療に対する長期無増悪生存に関係することが本発明者によって見出された。これにより、これらの細胞表面マーカーに対する検出剤を含むキットが、がん免疫療法、放射線治療、分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療に対する長期無増悪生存の予測に有用であることが理解される。かかるキットは、本明細書に記載される細胞亜集団を検出するために適切な分子に対する１または複数の検出剤を含み得る。このような検出剤の組み合わせを、被験体のＴ細胞組成の決定に用いることができる。このようなキットは、被験体における、本明細書に記載される新規なバイオマーカーとしての特定の細胞亜集団の割合の測定に用いることができる。
本発明の１つの局面において、被験体のがん免疫療法、放射線治療、分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療に対する応答を予測するための、細胞表面マーカーに対する検出剤を含むキットが提供される。被検体のＴ細胞が発現するこれらの細胞表面マーカーが、被験体のがん免疫療法、放射線治療、分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療に対する長期無増悪生存に関係することが本発明者によって見出された。これにより、これらの細胞表面マーカーに対する検出剤を含むキットが、がん免疫療法、放射線治療、分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療に対する長期無増悪生存の予測に有用であることが理解される。かかるキットは、本明細書に記載される細胞亜集団を検出するために適切な分子に対する１または複数の検出剤を含み得る。このような検出剤の組み合わせを、被験体のＴ細胞組成の決定に用いることができる。このようなキットは、被験体における、本明細書に記載される新規なバイオマーカーとしての特定の細胞亜集団の割合の測定に用いることができる。
【0108】
本発明の一実施形態において、本発明のキットは、被験体のＣＤ４＋Ｔ細胞集団中のＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋細胞亜集団の相対量と、基準値との比較を、当該被験体のがん免疫療
法、放射線治療、分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療に対する応答を予測するための指標として用いることによって、被験体の癌免疫療法、放射線治療、分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療に対する応答を予測することができる。他の実施形態において、本発明のキットは、被験体のＣＤ４＋Ｔ細胞集団中のＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋
細胞亜集団の相対量と、無効群閾値との比較を、当該被験体が癌免疫療法、放射線治療、分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療に対して無効群であるか否かの指標として用いることによって、被験体の癌免疫療法、放射線治療、分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療に対する応答を予測することができる。
法、放射線治療、分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療に対する応答を予測するための指標として用いることによって、被験体の癌免疫療法、放射線治療、分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療に対する応答を予測することができる。他の実施形態において、本発明のキットは、被験体のＣＤ４＋Ｔ細胞集団中のＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋
細胞亜集団の相対量と、無効群閾値との比較を、当該被験体が癌免疫療法、放射線治療、分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療に対して無効群であるか否かの指標として用いることによって、被験体の癌免疫療法、放射線治療、分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療に対する応答を予測することができる。
【0109】
本発明の一実施形態において、本発明のキットは、ＣＤ４、ＣＣＲ４、およびＣＣＲ６に対する検出剤を含むことができ、他の実施形態において、本発明のキットはさらにＣＸＣＲ３、ＣＤ６２Ｌに対する検出剤を含むこともできる。１つの実施形態では、検出剤は抗体である。好ましくは、抗体は適切に標識されマーカーの検出を容易にする。
【0110】
１つの実施形態では、被験体のＴ細胞の組成は、被験体から得られたサンプル中のＴ細胞の組成であり、好ましくは、サンプルは、末梢血サンプルである。本発明において提供されるバイオマーカーは、末梢血サンプルを使用して測定することができるものであるため、非侵襲的、安価で経時的に施行可能という、臨床応用における大きな優位性を有している。
【0111】
１つの実施形態では、がん免疫療法は、免疫チェックポイント阻害剤の投与を含む。本発明のバイオマーカーは、特に、このようながん免疫療法に対する被験体の応答を正確に予測することができる。
【0112】
本発明の好ましい実施形態では、被験体ががん免疫療法、放射線治療、分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療に対して応答しないことが示される場合、例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団中のＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋細胞亜集団の量または相対量が基準値未満の場
合に、追加の治療を行うべきことが検討される。この場合、追加の治療として、投与されているがん免疫療法に加えて、がん免疫療法ではない治療（例えば、化学療法、放射線療法、外科的手順、温熱療法など）を行うか、さらなるがん免疫療法（例えば、免疫チェックポイント阻害薬、養子細胞移入など）を行うことができる。代表的には、既に投与されている免疫チェックポイント阻害薬に対して、他の化学療法薬または第２の免疫チェックポイント阻害薬の併用を検討し得る。組み合わせる治療については、本願明細書に記載の任意の治療が行われ得る。
合に、追加の治療を行うべきことが検討される。この場合、追加の治療として、投与されているがん免疫療法に加えて、がん免疫療法ではない治療（例えば、化学療法、放射線療法、外科的手順、温熱療法など）を行うか、さらなるがん免疫療法（例えば、免疫チェックポイント阻害薬、養子細胞移入など）を行うことができる。代表的には、既に投与されている免疫チェックポイント阻害薬に対して、他の化学療法薬または第２の免疫チェックポイント阻害薬の併用を検討し得る。組み合わせる治療については、本願明細書に記載の任意の治療が行われ得る。
【0113】
１つの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１阻害剤またはＰＤ－Ｌ１阻害剤を含む。ＰＤ－１阻害剤としては、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の相互作用（例えば、結合）を阻害する抗ＰＤ－１抗体、例えば、ニボルマブ、ペムブロリズマブなどの抗ＰＤ－１抗体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＰＤ－Ｌ１阻害剤としては、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の相互作用（例えば、結合）を阻害する抗ＰＤ－Ｌ１抗体、例えば、デュルバルマブ、アテゾリズマブ、アベルマブなどの抗ＰＤ－Ｌ１抗体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0114】
本発明のさらなる局面は、被験体のＴ細胞の組成を用いて被験体のがん免疫療法、放射線治療、分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療に対する応答を予測し、がんを有する被験体を治療する方法を提供する。あるいは、特定のＴ細胞の組成を有する被験体において、がんを治療する方法、またはそのための組成物を提供する。がん免疫療法、特に免疫チェックポイント阻害療法は、被験体ごとの応答性の差が大きいことが知られており、本発明のバイオマーカーによって被験体を選択してがん免疫療法を施すことは、腫瘍縮小などの治療効果が奏される確率を顕著に高めることができる。
【0115】
上記のものを含めた本明細書に記載の方法を用いて、癌免疫療法、放射線治療、分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療に対して応答することが示された被験体に、癌免疫療法、放射線治療、分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療を施すことができる。癌免疫療法は、本明細書に記載の任意のものであり得る。
【0116】
本発明の別の実施形態において、がんを有する被験体を治療する方法であって、該被験体由来のサンプル中の、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団中のＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋細胞亜集団の相対
量を決定する工程と、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団中のＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋細胞亜集団の相対量
が基準値よりも高い場合に、前記被験体が、がん免疫療法、放射線治療、分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療に対して応答すると判定する工程と、前記被験体ががん免疫療法、放射線治療、分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療に対して応答すると判定された場合に、前記被験体に前記がん免疫療法、放射線治療、分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療を施す工程とを含む、方法が提供される。
量を決定する工程と、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団中のＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋細胞亜集団の相対量
が基準値よりも高い場合に、前記被験体が、がん免疫療法、放射線治療、分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療に対して応答すると判定する工程と、前記被験体ががん免疫療法、放射線治療、分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療に対して応答すると判定された場合に、前記被験体に前記がん免疫療法、放射線治療、分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療を施す工程とを含む、方法が提供される。
【0117】
本発明の別の局面は、がん免疫療法に対して応答すると予測された被験体においてがんを治療するための、免疫チェックポイント阻害剤を含む組成物である。本発明においてまた、添付文書と、免疫チェックポイント阻害剤とを含む製品が提供され得る。添付文書は、本明細書に記載される方法のいずれか１つまたは複数の工程に従って免疫チェックポイント阻害剤を使用するための指示を記載したものであってよい。
【0118】
本発明の１つの実施形態は、がん免疫療法に対して応答すると予測された被験体においてがんを治療するための、免疫チェックポイント阻害剤を含む組成物であって、前記被験体は、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団中のＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋細胞亜集団の相対量が基準値以上で
あることを特徴とする、組成物である。
あることを特徴とする、組成物である。
【0119】
１つの実施形態では、組成物は、ＰＤ－１阻害剤を含む。ＰＤ－１阻害剤は、例えば、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との結合を阻害する抗ＰＤ－１抗体であり、例えば、ニボルマブまたはペムブロリズマブであり得る。他の実施形態では、組成物は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤を含む。ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、例えば、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との結合を阻害する抗ＰＤ－Ｌ１抗体であり、例えば、デュルバルマブ、アテゾリズマブまたはアベルマブであり得る。これらの免疫チェックポイント阻害剤を含む組成物は、本発明のバイオマーカーによって選択した被験体に投与した場合、特に高い確率で治療効果を奏すると考えられる。本発明の組成物は、任意の他の薬剤と併用されてもよい。
【0120】
本発明の一実施形態において、がん免疫療法、放射線治療、分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療を受けた被験体における細胞亜集団の組成を、がん免疫療法、放射線治療、分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療に対する応答を予測するための指標とする方法が提供される。方法は、サンプルにおける細胞亜集団の組成を分析する工程を含み得る。細胞亜集団の組成の分析は、本明細書に記載されるか、または当業者にとって公知である任意の方法によって行うことが可能である。方法は、インビトロまたはインシリコのものであってもよい。本発明の１つの実施形態において、細胞亜集団の量と適切な基準との比較により、被験体における免疫活性化の有無が示される。特に、細胞亜集団は、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団中のＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋細胞亜集団を用いることができる。
【0121】
（細胞療法およびそのための目的の細胞の増殖）
本発明者は、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団中の、ＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋細胞亜集団、ＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋ＣＸＣＲ３＋細胞亜集団、またはＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋ＣＸＣＲ３－細胞亜集団
など特定の細胞集団の割合と、がん免疫療法（特に、がん免疫チェックポイント阻害剤によるがん免疫療法）、放射線治療、分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療の応答との間に明確な相関関係があること、具体的には、がん免疫チェックポイント阻害剤による抗腫瘍効果が発揮されるためには、抗腫瘍効果を発揮するＴ細胞である特定の細胞亜集団を多く含むことが必須であることを見出した。
本発明者は、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団中の、ＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋細胞亜集団、ＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋ＣＸＣＲ３＋細胞亜集団、またはＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋ＣＸＣＲ３－細胞亜集団
など特定の細胞集団の割合と、がん免疫療法（特に、がん免疫チェックポイント阻害剤によるがん免疫療法）、放射線治療、分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療の応答との間に明確な相関関係があること、具体的には、がん免疫チェックポイント阻害剤による抗腫瘍効果が発揮されるためには、抗腫瘍効果を発揮するＴ細胞である特定の細胞亜集団を多く含むことが必須であることを見出した。
【0122】
理論に拘束されるものではないが、この知見から、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団中に、ＣＲ４-
ＣＣＲ６＋細胞亜集団（特に、ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋細胞亜集団）、Ｃ
ＣＲ４-ＣＣＲ６＋ＣＸＣＲ３＋細胞亜集団（特に、ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋ＣＸＣＲ３＋細胞亜集団）、またはＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋ＣＸＣＲ３－細胞亜集団（特
に、ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋ＣＸＣＲ３－細胞亜集団）など特定の細胞集
団を多く含む癌患者の場合には、本来抗腫瘍効果を発揮するのに十分なＴ細胞免疫が準備されながら、免疫チェックポイント分子発現による抗原認識シグナルの減弱により免疫回避されているものと理解される。他方、これらの特定の細胞集団を多く含まない患者では、免疫チェックポイント阻害剤によって免疫逃避機構をブロックしたとしても、ＣＤ８＋Ｔ細胞機能をヘルプすることができるＣＤ４＋ Ｔ細胞機能の回復を望むことができず、結果として満足な抗腫瘍効果が発揮されないと考えられる。
ＣＣＲ６＋細胞亜集団（特に、ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋細胞亜集団）、Ｃ
ＣＲ４-ＣＣＲ６＋ＣＸＣＲ３＋細胞亜集団（特に、ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋ＣＸＣＲ３＋細胞亜集団）、またはＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋ＣＸＣＲ３－細胞亜集団（特
に、ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋ＣＸＣＲ３－細胞亜集団）など特定の細胞集
団を多く含む癌患者の場合には、本来抗腫瘍効果を発揮するのに十分なＴ細胞免疫が準備されながら、免疫チェックポイント分子発現による抗原認識シグナルの減弱により免疫回避されているものと理解される。他方、これらの特定の細胞集団を多く含まない患者では、免疫チェックポイント阻害剤によって免疫逃避機構をブロックしたとしても、ＣＤ８＋Ｔ細胞機能をヘルプすることができるＣＤ４＋ Ｔ細胞機能の回復を望むことができず、結果として満足な抗腫瘍効果が発揮されないと考えられる。
【0123】
以上より、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団中に、ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋細胞亜集
団、ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋ＣＸＣＲ３＋細胞亜集団、もしくはＣＤ６２
ＬｌｏｗＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋ＣＸＣＲ３－細胞亜集団、またはＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋細胞亜集団、ＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋ＣＸＣＲ３＋細胞亜集団、もしくはＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋ＣＸＣＲ３－細胞亜集団など特定の細胞集団が少なく、そのために免疫チェックポイント阻害剤による抗腫瘍効果が発揮されない患者に対しては、これらの特定の細胞集団を投与することによって免疫チェックポイント阻害剤による抗腫瘍効果を発揮／増強することが可能であると考えられる。
団、ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋ＣＸＣＲ３＋細胞亜集団、もしくはＣＤ６２
ＬｌｏｗＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋ＣＸＣＲ３－細胞亜集団、またはＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋細胞亜集団、ＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋ＣＸＣＲ３＋細胞亜集団、もしくはＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋ＣＸＣＲ３－細胞亜集団など特定の細胞集団が少なく、そのために免疫チェックポイント阻害剤による抗腫瘍効果が発揮されない患者に対しては、これらの特定の細胞集団を投与することによって免疫チェックポイント阻害剤による抗腫瘍効果を発揮／増強することが可能であると考えられる。
【0124】
したがって、本発明のさらなる局面は、特定の細胞を移入することによって、がん免疫療法の治療効果を改善、または維持・継続するための方法、またはそのための組成物である。
【0125】
ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、および／またはＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋ＣＤ４＋Ｔ細胞が、がん免疫療法、放射線治療、分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療に対する被験体の応答に重要であることが見出され、そのようなＴ細胞を用いることで、被験体のがん免疫療法、放射線治療、分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療に対する応答性を改善または維持することができると考えられる。本発明の１つの実施形態は、ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＣＲ
４-ＣＣＲ６＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む組成物である。ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋ＣＤ４＋Ｔ細胞もしくはＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、またはそれを含む組成
物は、がん免疫療法、放射線治療、分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療と併用するために有用である。
４-ＣＣＲ６＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む組成物である。ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋ＣＤ４＋Ｔ細胞もしくはＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、またはそれを含む組成
物は、がん免疫療法、放射線治療、分子標的薬投与、および外科的手術などの癌治療と併用するために有用である。
【0126】
例えば、ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む組成物の製造方法は、ヒト由来のＴ細胞集団からＣＤ６２ＬｌｏｗＣＣＲ４－ＣＣＲ６＋ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＣＲ４－ＣＣＲ６＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を純化する工程を含み得る。純化する工程は、ＣＣＲ６＋ＣＤ４＋Ｔ細胞からＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ細胞やＣＣＲ４＋細胞を除去すること（ネガティブセレクション）を含んでよい。ＣＣＲ４－ＣＣＲ６＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗体および／または磁気ビーズ、ソーティング法などを用いてネガティブセレクションによって純化することは、使用しようとする細胞上に、抗体や磁気ビーズ等の夾雑物が残らないため好ましい。ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＣＲ４－ＣＣＲ６＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ細胞、ＣＣＲ４＋細胞をネガティブセレクションした細胞群からＣＣＲ６＋細胞をソーティングによりポジティブセレクションすることで得られる。
【0127】
Ｔリンパ球は、公知の技術に従って収集して、フローサイトメトリーおよび／または免疫磁気選択などの抗体への親和結合などの公知の技術により濃縮し、または枯渇させることができる。濃縮および／または枯渇ステップ後、所望のＴリンパ球のインビトロ増殖は、公知の技術（Ｒｉｄｄｅｌｌらの米国特許第６，０４０，１７７号に記載されたものが挙げられるが、それらに限定されない）または当業者に明らかであろうそれらのバリエーションに従って実行することができる。
【0128】
例えば、所望のＴ細胞集団または亜集団を、インビトロで最初のＴリンパ球集団を培地へ加え、その後、その培地へフィーダー細胞を加え（例えば、生じる細胞集団が、増殖されるべき最初の集団における１個のＴリンパ球に対して少なくとも約５個、１０個、２０個、または４０個、またはそれ以上のフィーダー細胞を含有するように）、その培養物を（例えば、Ｔ細胞の数を増加させるのに十分な時間）インキュベートすることにより増殖させてもよい。培養物は、典型的には、Ｔリンパ球の成長に適している温度などの条件下でインキュベートすることができる。ヒトＴリンパ球の成長について、例えば、温度は、一般的には、少なくとも摂氏約２５度、好ましくは少なくとも約３０度、より好ましくは約３７度であろう。
【0129】
細胞は、本明細書で記載される、または当技術分野で周知の方法に従って、分離および／または増殖したのち、必要に応じて保存し、その後被験体に投与することができる。
【0130】
本発明の細胞を含む組成物における目的の細胞（例えば、ＣＣＲ４-ＣＣＲ６＋ＣＤ４
＋Ｔ細胞）の量は、意図される効果を奏するように当業者が適切に決定することができるが、例えば、少なくとも２ｘ１０８個、好ましくは少なくとも６ｘ１０８個、より好ましくは少なくとも２ｘ１０９個であり得る。
＋Ｔ細胞）の量は、意図される効果を奏するように当業者が適切に決定することができるが、例えば、少なくとも２ｘ１０８個、好ましくは少なくとも６ｘ１０８個、より好ましくは少なくとも２ｘ１０９個であり得る。
【0131】
本明細書に記載される細胞を含む組成物は、目的の細胞（例えば、ＣＣＲ４-ＣＣＲ６
＋ＣＤ４＋細胞）に加えて、薬学的に許容しうるキャリアもしくは賦形剤を含み得る。本明細書において「薬学的に許容しうる」は、動物、そしてより詳細にはヒトにおける使用のため、政府の監督官庁に認可されたか、あるいは薬局方または他の一般的に認められる薬局方に列挙されていることを意味する。本明細書において使用される「キャリア」は、治療剤を一緒に投与する、培養液、移入液、潅流液、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。本発明の細胞を含む組成物は、細胞を主成分として含むため、キャリアとしては、培養液、移入液、潅流液などの、細胞を維持し得るものが好ましい。例えば、医薬組成物を静脈内投与する場合は、生理食塩水および水性デキストロースが好ましいキャリアである。好ましくは、生理食塩水溶液、並びに水性デキストロースおよびグリセロール溶液が、注射可能溶液の液体キャリアとして使用される。医薬を経口投与する場合は、水が好ましいキャリアである。適切な賦形剤には、軽質無水ケイ酸、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等が含まれる。組成物は、望ましい場合、少量の湿潤剤または乳化剤、あるいはｐＨ緩衝剤もまた含有することも可能である。これらの組成物は、溶液、懸濁物、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル、粉末、持続放出配合物等の形を取ることも可能である。伝統的な結合剤およびキャリア、例えばトリグリセリドを用いて、組成物を座薬として配合することも可能である。経口配合物は、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン・ナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的キャリアを含むことも可能である。適切なキャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ， Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｒｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｕ．Ｓ．Ａ）に記載される。このような組成物は、患者に適切に投与する形を提供するように、適切な量のキャリアと一緒に、治療有効量の療法剤、好ましくは精製型のものを含有する。配合物は、投与様式に適していなければならない。これらのほか、例えば、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等を含んでいてもよい。
＋ＣＤ４＋細胞）に加えて、薬学的に許容しうるキャリアもしくは賦形剤を含み得る。本明細書において「薬学的に許容しうる」は、動物、そしてより詳細にはヒトにおける使用のため、政府の監督官庁に認可されたか、あるいは薬局方または他の一般的に認められる薬局方に列挙されていることを意味する。本明細書において使用される「キャリア」は、治療剤を一緒に投与する、培養液、移入液、潅流液、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。本発明の細胞を含む組成物は、細胞を主成分として含むため、キャリアとしては、培養液、移入液、潅流液などの、細胞を維持し得るものが好ましい。例えば、医薬組成物を静脈内投与する場合は、生理食塩水および水性デキストロースが好ましいキャリアである。好ましくは、生理食塩水溶液、並びに水性デキストロースおよびグリセロール溶液が、注射可能溶液の液体キャリアとして使用される。医薬を経口投与する場合は、水が好ましいキャリアである。適切な賦形剤には、軽質無水ケイ酸、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等が含まれる。組成物は、望ましい場合、少量の湿潤剤または乳化剤、あるいはｐＨ緩衝剤もまた含有することも可能である。これらの組成物は、溶液、懸濁物、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル、粉末、持続放出配合物等の形を取ることも可能である。伝統的な結合剤およびキャリア、例えばトリグリセリドを用いて、組成物を座薬として配合することも可能である。経口配合物は、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン・ナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的キャリアを含むことも可能である。適切なキャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ， Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｒｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｕ．Ｓ．Ａ）に記載される。このような組成物は、患者に適切に投与する形を提供するように、適切な量のキャリアと一緒に、治療有効量の療法剤、好ましくは精製型のものを含有する。配合物は、投与様式に適していなければならない。これらのほか、例えば、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等を含んでいてもよい。
【0132】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ｅｔ
ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．ＡｓｓｏｃｉａｔＥＳａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ： Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ｅｔ
ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．ＡｓｓｏｃｉａｔＥＳａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ： Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【0133】
本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つの値」の「範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。
【0134】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【0135】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例0136】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。したがって、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【0137】
（実施例１：抗ＰＤ－１抗体の治療効果とＴ細胞集団組成）
１．目的
本実施例では、ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ３＋Ｔ細胞が抗腫瘍免疫と強く相関することを利用し（特許第６６６４６８４号）、ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ３＋Ｔ細胞をさらにＣＣＲタイプによりＴｈ分類して、抗腫瘍効果と最も強く相関するＴｈクラスターを解析した。
１．目的
本実施例では、ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ３＋Ｔ細胞が抗腫瘍免疫と強く相関することを利用し（特許第６６６４６８４号）、ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＤ４＋ＣＤ３＋Ｔ細胞をさらにＣＣＲタイプによりＴｈ分類して、抗腫瘍効果と最も強く相関するＴｈクラスターを解析した。
【0138】
２．方法および材料
Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ治療を受ける前の患者由来の末梢血からバキュティナスピッツＴＭを用いて単核球を分離し、凍結保存した（液体窒素）。保存された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いて、フローサイトメトリーおよびマスサイトメトリー解析を行った。抗腫瘍効果を評価する数値としては、Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ治療後の無増悪生存期間（ＰＦＳ）を用いた。
Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ治療を受ける前の患者由来の末梢血からバキュティナスピッツＴＭを用いて単核球を分離し、凍結保存した（液体窒素）。保存された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いて、フローサイトメトリーおよびマスサイトメトリー解析を行った。抗腫瘍効果を評価する数値としては、Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ治療後の無増悪生存期間（ＰＦＳ）を用いた。
【0139】
３．結果
図３にマスサイトメトリー（ＣｙＴＯＦＴＭ）によるマッピング解析の結果を示した。その結果、以下の表１のようなＴｈクラスターによりＣＤ６２Ｌｌｏｗ分画とＣＤ６２ＬｈｉｇｈＣＤ４５ＲＡ－分画が構成されていることが判明した。ＣＤ６２ＬｈｉｇｈＣＤ４５ＲＡ＋分画はエフェクター分化していないナイーブ細胞群と考えられ、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ４、及びＣＣＲ６の発現は認められなかった（表１）。
図３にマスサイトメトリー（ＣｙＴＯＦＴＭ）によるマッピング解析の結果を示した。その結果、以下の表１のようなＴｈクラスターによりＣＤ６２Ｌｌｏｗ分画とＣＤ６２ＬｈｉｇｈＣＤ４５ＲＡ－分画が構成されていることが判明した。ＣＤ６２ＬｈｉｇｈＣＤ４５ＲＡ＋分画はエフェクター分化していないナイーブ細胞群と考えられ、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ４、及びＣＣＲ６の発現は認められなかった（表１）。
【0140】
【表1】
【0141】
ＣＤ６２Ｌｌｏｗ分画（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）の中で無増悪生存期間（ＰＦＳ）と有意な相関を示したのは、ＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ （Ｔｈ１／１７）とＣＸＣＲ３－ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ （ＣＣＲ６ ＳＰ）の２つであった（表２）。
【0142】
【表2】
【0143】
ＣｙＴＯＦのｖｉＳＮＥ解析では、この２つのクラスターは隣在しており各種分子発現が近似しているクラスターと考えられた。この２つのクラスターを足し合わせた細胞比率は、Ｐ＜０．０００１，ｒ２＝０．９０８３（図４）と極めて良くＰＦＳと相関していた（ディスカバリーコホートとして非小細胞肺癌１３症例の結果）。この数値は、％ＣＤ６２Ｌｌｏｗ／ＣＤ４＋との相関を上回っていた。なお、ＣＤ６２Ｌｌｏｗ分画は、表１で示したＴｈクラスターで構成されることから、％Ｔｈ１／１７＋％ＣＣＲ６ ＳＰ＝％ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－と変換することが可能であることが判明した。
【0144】
ＣＤ６２ＬｈｉｇｈＣＤ４５ＲＡ－分画（ｃｅｎｔｒａｌ ｍｅｍｏｒｙ）にも、Ｔｈ１／１７およびＣＣＲ６ ＳＰタイプのクラスターが存在することから、ナイーブ細胞を除いたＣＤ４５ＲＡ－分画全体におけるＴｈクラスター割合とＰＦＳの相関を解析したところ、やはりＴｈ１／１７とＣＣＲ６ ＳＰクラスターとＰＦＳは良好に相関した（表２）。最も良い相関を示したのは、Ｔｈ１／１７とＣＣＲ６ ＳＰクラスターを足し合わせた細胞割合であった。
【0145】
ＣＤ６２ＬｈｉｇｈＣＤ４５ＲＡ＋ナイーブ ＣＤ４ Ｔ細胞分画には全く分化したＴｈクラスターが認められず、ＣＤ６２Ｌｌｏｗ分画、ＣＤ６２ＬｈｉｇｈＣＤ４５ＲＡ－分画にも表１に示されるＴｈクラスターのみで構成されることから、ＣＤ４＋ＣＤ３＋ Ｔ細胞全体におけるＴｈ１／１７とＣＣＲ６ ＳＰクラスターを足し合わせた細胞割合は、近似的に％ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－／ＣＤ４＋で示されることが判明した。実際に、％ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－／ＣＤ４＋とＰＦＳとの相関関係は、Ｐ＜０．０００１，ｒ２＝０．７９２０となり、％ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－／ＣＤ４＋に比べてｒ２で劣るものの、％ＣＤ６２Ｌｌｏｗ／ＣＤ４＋とＰＦＳとの相関係数と遜色ない数値であった（図５）。なお、通常のフローサイトメトリー解析を用いて得た％ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－／ＣＤ４＋も、ＣｙＴＯＦにより得られた数値と相関し、ＰＦＳと（Ｐ＝０．０００２，ｒ２＝０．８００３）相関した（図６）。
【0146】
ペムブロリズマブ治療後変化を解析したところ、奏効例のみでＴｈ１／１７、ＣＣＲ６ ＳＰ細胞割合の有意な増加が認められた。
【0147】
以上の結果から、Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ治療前のＰＢＭＣ解析の結果、Ｔｈ１／１７とＣＣＲ６ ＳＰ ＣＤ４＋Ｔ細胞クラスターのみに、ＰＦＳとの相関が認められたことがわかった。また、％ＣＤ６２Ｌｌｏｗ ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－／ＣＤ４＋は、％ＣＤ６２Ｌｌｏｗ／ＣＤ４＋を上回る、極めて良好なＰＦＳとの相関を示すことがわかった。さらに、％ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－／ＣＤ４＋も、％ＣＤ６２Ｌｌｏｗ／ＣＤ４＋と同程度の、ＰＦＳとの相関を示すことがわかった。
【0148】
またペムブロリズマブ単剤治療後の無増悪生存期間とＣｙＴＯＦによるＴｈ解析結果の相関を調べたところ、以下の表３及び図７に示すとおり、Ｔｈ１／１７とＣＣＲ６ ＳＰ ＣＤ４＋Ｔ細胞クラスターはペムブロリズマブ単剤治療後の無増悪生存期間と高い相関を示した。
【0149】
【表3】
【0150】
また％ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＤ４とＣｙＴＯＦによる％Ｔｈクラスターの相関を調べたところ、以下の表４に示すとおり、Ｔｈ１／１７およびＣＣＲ６ ＳＰ細胞クラスターの存在比は、ＣＤ６２Ｌｌｏｗ細胞クラスターの存在比と相関していた（図８、９）。
【0151】
【表4】
【0152】
４．結果の意義
本実施例において、ＣＤ４ Ｔ細胞全体に対するＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－細胞割合を測定することにより、ＣＤ６２Ｌを用いる場合よりも簡便に、ＣＤ６２Ｌｌｏｗ ＣＤ４＋細胞割合と同等の予測性能を得ることが可能であることを発見した。血液検体として、ファイコール分離などを行うことなくｆｉｘａｔｉｏｎを行うだけの簡便な検体を用いても解析が可能であり、全世界で解析することが可能となる。
本実施例において、ＣＤ４ Ｔ細胞全体に対するＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－細胞割合を測定することにより、ＣＤ６２Ｌを用いる場合よりも簡便に、ＣＤ６２Ｌｌｏｗ ＣＤ４＋細胞割合と同等の予測性能を得ることが可能であることを発見した。血液検体として、ファイコール分離などを行うことなくｆｉｘａｔｉｏｎを行うだけの簡便な検体を用いても解析が可能であり、全世界で解析することが可能となる。
【0153】
５．考察
Ｔ－ｂｅｔ＋Ｔｈ１タイプ（ＣＸＣＲ３＋）ＣＤ４ Ｔ細胞が抗腫瘍免疫に重要であることが報告されてきたが、本発明により、ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－という従来定義されたことがないＴｈ分画の重要性が明らかになった。ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－分画の中でＣＸＣＲ３＋であるクラスターはＴ－ｂｅｔを発現するためＴ－ｂｅｔ＋分画の重要性を否定するものではないが、ＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ４－ＣＣＲ６－というｃｌａｓｓｉｃａｌなＴｈ１分画が抗腫瘍効果と関連を持たないことは大きな発見であった。
Ｔ－ｂｅｔ＋Ｔｈ１タイプ（ＣＸＣＲ３＋）ＣＤ４ Ｔ細胞が抗腫瘍免疫に重要であることが報告されてきたが、本発明により、ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－という従来定義されたことがないＴｈ分画の重要性が明らかになった。ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－分画の中でＣＸＣＲ３＋であるクラスターはＴ－ｂｅｔを発現するためＴ－ｂｅｔ＋分画の重要性を否定するものではないが、ＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ４－ＣＣＲ６－というｃｌａｓｓｉｃａｌなＴｈ１分画が抗腫瘍効果と関連を持たないことは大きな発見であった。
【0154】
ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－分画には、ＣＣＲ７陰性と陽性細胞がいずれも含まれている。したがって、ヒトのＴ細胞分類に良く使用されるＣＣＲ７とＣＤ４５ＲＡのみを用いて解析した場合に、このクラスターを同定することは不可能であった。
【0155】
また、マウスを用いて本発明者のようにＣＤ６２Ｌの細胞分画をさらに検討するというアプローチを採ったとしても、マウスＴ細胞はＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７にそれぞれ分化し、Ｔｈ１／１７分画をほとんど持たないため、ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－分画の重要性を解析することが不可能であった。
【0156】
本発明では、ヒトＣＤ６２ＬｌｏｗＣＤ４ Ｔ細胞クラスターをさらに詳細に解析したことが、ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ ＣＤ４ Ｔ細胞クラスターの抗腫瘍免疫における重要性発見の基盤となっている。
【0157】
（実施例２：Ｔｈクラスターと全生存期間との相関関係）
実施例１のとおり、Ｔｈクラスターの中でも、Ｔｈ１／１７とＣＣＲ６ ＳＰ ＣＤ４＋Ｔ細胞クラスターはペムブロリズマブ単剤治療後の無増悪生存期間と高い相関を示すことがわかった。そこでＴｈクラスターと全生存期間との相関関係を調べた。その結果を図１０に示す。図１０に示されるとおり、Ｔｈ１／１７とＣＣＲ６ ＳＰ ＣＤ４＋Ｔ細胞クラスターは無増悪生存期間のみならず全生存期間と良好に相関することがわかった。
実施例１のとおり、Ｔｈクラスターの中でも、Ｔｈ１／１７とＣＣＲ６ ＳＰ ＣＤ４＋Ｔ細胞クラスターはペムブロリズマブ単剤治療後の無増悪生存期間と高い相関を示すことがわかった。そこでＴｈクラスターと全生存期間との相関関係を調べた。その結果を図１０に示す。図１０に示されるとおり、Ｔｈ１／１７とＣＣＲ６ ＳＰ ＣＤ４＋Ｔ細胞クラスターは無増悪生存期間のみならず全生存期間と良好に相関することがわかった。
【0158】
また３５症例の肺癌でフローサイトメトリーを用いて解析した結果、ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ＣＤ４Ｔ細胞クラスターは、図１１に示すように、他の従来のマーカーと比較しても、無増悪生存期間および全生存期間と高い相関を示すことがわかった。
【0159】
（実施例３：感度および特異度による評価）
ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ＣＤ４Ｔ細胞クラスターについて、長期生存症例を予測する性能をＲＯＣ解析によって評価し、その感度および特異度の結果を図１２に示した。ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ＣＤ４＋比率を用いた場合、４．４を閾値とすると感度１００％、特異度７７．３％というかなり良好なバイオマーカーであることがわかった（図１２）。
ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ＣＤ４Ｔ細胞クラスターについて、長期生存症例を予測する性能をＲＯＣ解析によって評価し、その感度および特異度の結果を図１２に示した。ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ＣＤ４＋比率を用いた場合、４．４を閾値とすると感度１００％、特異度７７．３％というかなり良好なバイオマーカーであることがわかった（図１２）。
【0160】
（実施例４：局所進行非小細胞肺癌化学放射線治療後ＰＦＳ）
続いて、局所進行非小細胞肺癌患者において、化学放射線治療後のＰＦＳをＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ ＣＤ４Ｔ細胞クラスターの存在量によって予測することができるかどうかを調べた。治療前のＴｈ１／１７（ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ＣＸＣＲ３＋）分画の存在量とＰＦＳとの相関結果を図１３示した。図１３に示されるとおり、ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ ＣＤ４Ｔ細胞の存在量は化学放射線治療後のＰＦＳと極めてよく相関することがわかった。このことからも、ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ ＣＤ４Ｔ細胞クラスターは、被験者の免疫状態を広く反映するものであるため、免疫チェックポイント阻害剤による治療の予後予測だけではなく、放射線治療後の予後予測もすることができることがわかった。
続いて、局所進行非小細胞肺癌患者において、化学放射線治療後のＰＦＳをＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ ＣＤ４Ｔ細胞クラスターの存在量によって予測することができるかどうかを調べた。治療前のＴｈ１／１７（ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ＣＸＣＲ３＋）分画の存在量とＰＦＳとの相関結果を図１３示した。図１３に示されるとおり、ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ ＣＤ４Ｔ細胞の存在量は化学放射線治療後のＰＦＳと極めてよく相関することがわかった。このことからも、ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ ＣＤ４Ｔ細胞クラスターは、被験者の免疫状態を広く反映するものであるため、免疫チェックポイント阻害剤による治療の予後予測だけではなく、放射線治療後の予後予測もすることができることがわかった。
【0161】
（実施例５：ＥＧＦＲ－ＴＫＩ効果予測）
続いて、局所進行非小細胞肺癌患者において、ＥＧＦＲ－ＴＫＩ治療後のＰＦＳをＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ ＣＤ４Ｔ細胞クラスターの存在量によって予測することができるかどうかを調べた。治療前のＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－分画の存在量とＰＦＳとの相関結果を図１４示した。図１４に示されるとおり、ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ ＣＤ４Ｔ細胞の存在量はＥＧＦＲ－ＴＫＩ治療後のＰＦＳと極めてよく相関することがわかった。このことからも、ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ ＣＤ４Ｔ細胞クラスターは、被験者の免疫状態を広く反映するものであるため、免疫チェックポイント阻害剤による治療の予後予測だけではなく、分子標的治療薬での治療後の予後予測もすることができることがわかった。分子標的治療薬であっても免疫との共同作業で腫瘍をコントロールしているため、ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ ＣＤ４Ｔ細胞クラスターによって免疫の状態を評価することにより、予後を予測することができる。
続いて、局所進行非小細胞肺癌患者において、ＥＧＦＲ－ＴＫＩ治療後のＰＦＳをＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ ＣＤ４Ｔ細胞クラスターの存在量によって予測することができるかどうかを調べた。治療前のＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－分画の存在量とＰＦＳとの相関結果を図１４示した。図１４に示されるとおり、ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ ＣＤ４Ｔ細胞の存在量はＥＧＦＲ－ＴＫＩ治療後のＰＦＳと極めてよく相関することがわかった。このことからも、ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ ＣＤ４Ｔ細胞クラスターは、被験者の免疫状態を広く反映するものであるため、免疫チェックポイント阻害剤による治療の予後予測だけではなく、分子標的治療薬での治療後の予後予測もすることができることがわかった。分子標的治療薬であっても免疫との共同作業で腫瘍をコントロールしているため、ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ ＣＤ４Ｔ細胞クラスターによって免疫の状態を評価することにより、予後を予測することができる。
【0162】
（実施例６：癌免疫療法の治療効果を改善または維持継続する細胞療法）
がん免疫療法による治療を開始する前に、被験体の末梢血サンプルからＣＤ６２ＬｌｏｗＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ＣＤ４＋Ｔ細胞を純化し、液体窒素下に凍結保存する。凍結保存したＣＤ６２ＬｌｏｗＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ＣＤ４＋Ｔ細胞を解凍し、ｅｘ ｖｉｖｏで疑似抗原刺激を与えた後ＩＬ２存在下に培養することで増殖させる。同一患者の末梢血ＣＤ１６＋細胞をＧＭＣＳＦとＩＬ４存在下に培養することで得た樹状細胞と放射線照射した患者がん細胞を共培養し、がん抗原取り込みを行う。がん抗原を取り込んだ樹状細胞とｅｘ ｖｉｖｏで増殖したＣＤ６２ＬｌｏｗＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ＣＤ４＋Ｔ細胞を共培養することにより、がん抗原特異的サイトカイン産生を評価する。
がん免疫療法による治療を開始する前に、被験体の末梢血サンプルからＣＤ６２ＬｌｏｗＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ＣＤ４＋Ｔ細胞を純化し、液体窒素下に凍結保存する。凍結保存したＣＤ６２ＬｌｏｗＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ＣＤ４＋Ｔ細胞を解凍し、ｅｘ ｖｉｖｏで疑似抗原刺激を与えた後ＩＬ２存在下に培養することで増殖させる。同一患者の末梢血ＣＤ１６＋細胞をＧＭＣＳＦとＩＬ４存在下に培養することで得た樹状細胞と放射線照射した患者がん細胞を共培養し、がん抗原取り込みを行う。がん抗原を取り込んだ樹状細胞とｅｘ ｖｉｖｏで増殖したＣＤ６２ＬｌｏｗＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ＣＤ４＋Ｔ細胞を共培養することにより、がん抗原特異的サイトカイン産生を評価する。
【0163】
このｅｘ ｖｉｖｏで増殖したＣＤ６２ＬｌｏｗＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ＣＤ４＋Ｔ細胞は、がん免疫療法の効果の維持を目的として、その効果が不十分であるかまたは減弱した場合に、患者に経静脈的投与される。
【0164】
被験体ががん免疫療法に対して応答性であることが判定されている場合、例えば、ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率が高い場合には、Ｎｉｖｏｌｕｍａｂのような抗ＰＤ－１抗体による治療などのがん免疫療法を施す。治療中に被験体のＣＤ４＋Ｔ細胞組成をモニタリングする。
【0165】
ここで、被験体のＣＤ４＋Ｔ細胞組成において、ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ＣＤ４＋Ｔ細胞比率等の指標が低下し、応答性ではない免疫状態となった場合には、ｅｘ ｖｉｖｏで増殖させたＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ＣＤ４＋Ｔ細胞を移入することで、元の免疫状態に戻し、がん免疫療法の効果を持続させる。
【0166】
ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ＣＤ４＋Ｔ細胞のみを培養して移入することで保存・培養コストを抑えることができ、抗ＰＤ－１抗体等の免疫チェックポイント阻害剤のみを２週間ごとに継続するよりも経済的である。
【0167】
また、被験体のＣＤ４＋Ｔ細胞組成において、ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ＣＤ４＋Ｔ細胞比率等の指標が低く、応答性ではないと判定された被験体に、被験体から単離してｅｘ ｖｉｖｏで増殖させたＣＣＲ６＋ＣＣＲ４－ＣＤ４＋Ｔ細胞を移入することで、応答性の免疫状態に変化させ、その後、Ｎｉｖｏｌｕｍａｂのような抗ＰＤ－１抗体によるがん免疫療法を施す。これにより、従来は抗ＰＤ－１抗体によるがん免疫療法の恩恵を受けられなかった被験体においても、がん免疫療法の抗腫瘍免疫応答を生じさせることができる。
【0168】
（実施例７：Ｔｈ１／１７およびＣＣＲ６ ＳＰのＰＦＳ相関）
実施例１に示したとおり、Ｔｈクラスターの中でも、Ｔｈ１／１７とＣＣＲ６ ＳＰ ＣＤ４＋Ｔ細胞クラスターが無増悪生存期間と高い相関を示すことがわかった。この点について、図２を模式図化し、さらに各区画に発現しているケモカインレセプターを表にまとめたものが図１７である。この図からも明らかなとおり、破線で囲っている部分がＣＤ６２Ｌｌｏｗの細胞集団であり、この中には、ケモカインレセプターの発現が異なる４つのクラスター（Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ）が存在することがわかる。この中の区画ＤがＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ４－ＣＣＲ６＋で表されるＴｈ１／１７であり、区画ＨがＣＸＣＲ３－ＣＣＲ４－ＣＣＲ６＋で表されるＣＣＲ６ ＳＰである。
実施例１に示したとおり、Ｔｈクラスターの中でも、Ｔｈ１／１７とＣＣＲ６ ＳＰ ＣＤ４＋Ｔ細胞クラスターが無増悪生存期間と高い相関を示すことがわかった。この点について、図２を模式図化し、さらに各区画に発現しているケモカインレセプターを表にまとめたものが図１７である。この図からも明らかなとおり、破線で囲っている部分がＣＤ６２Ｌｌｏｗの細胞集団であり、この中には、ケモカインレセプターの発現が異なる４つのクラスター（Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ）が存在することがわかる。この中の区画ＤがＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ４－ＣＣＲ６＋で表されるＴｈ１／１７であり、区画ＨがＣＸＣＲ３－ＣＣＲ４－ＣＣＲ６＋で表されるＣＣＲ６ ＳＰである。
【0169】
上記のとおり、この４つのクラスターの中で、どれが抗腫瘍効果と関連するのかを調べるため、無増悪生存期間との相関を確認すると、Ｔｈ１／１７とＣＣＲ６ ＳＰが重要であることがわかっている。それを確認した結果を図１８に示す。図１８では、ケモカインレセプター発現に基づく末梢血ＣＤ４＋Ｔ細胞クラスターの抗ＰＤ－１抗体治療後のＰＦＳ相関を一覧にしている。すべてのＣＤ４＋Ｔ細胞クラスターについて、ＰＤ－１阻害剤治療効果との相関を解析した。多重性を避けるため、ＦＤＲは０．０５とし、これより小さいＰ値を有意とした。この図からもわかるとおり、Ｔｈ１およびＴｈ１７クラスター細胞数は、ＰＦＳおよびＯＳのいずれとも有意に相関しなかった。ＣＤ６２Ｌｌｏｗの細胞集団においては、Ｔｈ１／１７およびＣＣＲ６ ＳＰ Ｔ細胞クラスターという２つのＣＤ４＋Ｔ細胞クラスターが、ＰＦＳおよびＯＳと有意な正の相関を示した。
【0170】
このＴｈ１／１７とＣＣＲ６ ＳＰという２つの末梢血ＣＤ４＋Ｔ細胞クラスターについて、遺伝子発現解析とメチローム（メチル化）解析を行った結果が図１９である。遺伝子発現については、その類似性を探るため、ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＤ４＋画分に見られる４つのＴｈクラスターの遺伝子発現を用いて、疑似時間解析を行った（図１９左）。その結果、ＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ４－ＣＣＲ６＋（Ｔｈ１／１７）クラスターとＣＸＣＲ３－ＣＣＲ４－ＣＣＲ６＋（ＣＣＲ６ ＳＰ）クラスターは、Ｔｈ１とＴｈ１７を疑似時間で最も離れた位置に配置した場合、Ｔｈ１とＴｈ１７の間の位置の真ん中に別のノードを形成していた。これは、この２つのクラスターが、遺伝子発現プロファイルの観点から見て、Ｔｈ１とＴｈ１７の中間的な性質を持つ独立したクラスターである可能性を示している。同様に、６人の患者の遺伝子発現プロファイルを階層的にクラスタリングすると、ＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ４－ＣＣＲ６＋（Ｔｈ１／１７）とＣＸＣＲ３－ＣＣＲ４－ＣＣＲ６＋（ＣＣＲ６ ＳＰ）の間のユークリッド距離が最も近いことがわかった。Ｔ細胞の遺伝子発現を調節する２つの大きな要因は、ＴＣＲシグナルに影響される活性化状態と、主にＤＮＡメチル化に起因する分化状態である。疑似時間解析で観察された遺伝子発現パターンの違いが分化状態に対応しているかどうかを調べるために、ＣＤ６２ＬｌｏｗＣＤ４＋Ｔ細胞から選別した４つのＴ細胞クラスターを用いてメチローム解析を行った（図１９右）。メチロームの結果をもとにクラスタリング解析を行ったところ、Ｔｈ１とＴｈ１７のクラスターは離れており、これらのクラスターとは別にＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ４－ＣＣＲ６＋（Ｔｈ１／１７）クラスターが存在しており、疑似時間解析の結果と一致した（図１９右）。ＣＸＣＲ３－ＣＣＲ４－ＣＣＲ６＋（ＣＣＲ６ ＳＰ）クラスターは、Ｔｈ１７クラスターとＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ４－ＣＣＲ６＋クラスターの中間に位置していた。
【0171】
上記のとおり、ディスカバリーコホートとして非小細胞肺癌１３症例の結果、Ｔｈ１／１７とＣＣＲ６ ＳＰは無増悪生存期間と相関することがわかっているが（図４）、Ｔｈ１／１７とＣＣＲ６ ＳＰという２つの末梢血ＣＤ４＋Ｔ細胞クラスターのＰＦＳ予測性能について、バリデーションコホートとして、非小細胞肺癌初回治療および既治療症例を用いてさらに確認した。
【0172】
バリデーションコホートにおいて、Ｔｈ１／１７（ＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ４－ＣＣＲ６＋）とＣＣＲ６ ＳＰ（ＣＸＣＲ３－ＣＣＲ４－ＣＣＲ６＋）のＴ細胞クラスターの合計であるＣＤ６２Ｌｌｏｗ ＣＣＲ４－ＣＣＲ６＋ ＣＤ４＋Ｔ細胞メタクラスターは、ＰＦＳと強い相関を示した（図２０ａ、ｂ、Ｐ＜０．０００１、ｒ＝０．９５９９）。さらに、免疫チェックポイント阻害剤による治療のタイミングによってＴｈ１／１７とＣＣＲ６ ＳＰのＰＦＳとの相関に変化が見られるかどうかを確認するため、未治療の非小細胞肺がん患者にペムブロリズマブを投与した場合と、既治療の非小細胞肺がん患者にペムブロリズマブまたはニボルマブを投与した場合とで、Ｔｈ１／１７とＣＣＲ６ ＳＰのＰＦＳとの相関を調べた。具体的に、未治療の非小細胞肺がん患者にペムブロリズマブを投与した場合と、既治療の非小細胞肺がん患者にペムブロリズマブまたはニボルマブを投与した場合の２つのバリデーションコホートを用いて、Ｔｈ１／１７およびＣＣＲ６ ＳＰ Ｔ細胞クラスターとＣＤ６２Ｌｌｏｗ ＣＣＲ４－ＣＣＲ６＋ ＣＤ４＋Ｔ細胞メタクラスターが、免疫チェックポイント阻害療法後の臨床転帰と相関するかどうかを調べた。２つのバリデーションコホートは、ＰＤ－Ｌ１ ＴＰＳが５０％以上で、最初にペムブロリズマブを投与されたＮＳＣＬＣ患者と、腫瘍のＰＤ－Ｌ１発現にかかわらずペムブロリズマブまたはニボルマブを投与された既治療患者とした。２つのバリデーションコホートで得られたＣＤ６２Ｌｌｏｗ ＣＣＲ４－ＣＣＲ６＋ ＣＤ４＋Ｔ細胞メタクラスターとＰＦＳの相関関係を示す回帰直線は、ｙ－ｉｎｔｅｒｃｅｐｔおよびｓｌｏｐｅのいずれにおいてもディスカバリーコホートで観察されたものとの有意差を示さなかった。ペムブロリズマブで一次治療を受けたグループでは、Ｔｈ１およびＴｈ１７とＰＦＳおよびＯＳとの有意な相関は見られなかった。しかし、ＣＤ６２Ｌｌｏｗ ＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ４－ＣＣＲ６＋およびＣＸＣＲ３－ＣＣＲ４－ＣＣＲ６＋ ＣＤ４＋Ｔ細胞クラスターは、有意な相関を示した。ＣＤ６２Ｌｌｏｗ ＣＣＲ４－ＣＣＲ６＋ ＣＤ４＋Ｔ細胞メタクラスターは、治療前の末梢血において、疾患進行群に比べて有意に増加していたが、Ｔｈ１およびＴｈ１７には差がなかった。ＣＤ６２Ｌｌｏｗ ＣＣＲ４－ＣＣＲ６＋ＣＤ４＋Ｔ細胞メタクラスターは、ＲＯＣ曲線解析において、２００日以上のＰＦＳを有意に予測し、曲線下面積（ＡＵＣ）は０．８６５であった（図２０ｃ）。ＣＤ６２Ｌｌｏｗ ＣＣＲ４－ＣＣＲ６＋ ＣＤ４＋ Ｔ細胞メタクラスターは、ＰＦＳだけでなく、ＯＳとも有意に相関していた（図２０ｄ）。ＰＤ－１阻害療法の抗腫瘍効果は、ＣＤ６２Ｌｌｏｗ ＣＣＲ４－ＣＣＲ６＋ ＣＤ４＋ Ｔ細胞メタクラスターに依存していることから、ＣＤ６２Ｌｌｏｗ Ｔｈ１／１７ Ｔ細胞クラスターとＣＤ６２Ｌｌｏｗ ＣＣＲ６ ＳＰ Ｔ細胞クラスターが協力して抗腫瘍免疫を媒介していると考えられる。なお、Ｔｈ１／１７とＣＣＲ６ ＳＰ以外のクラスターも含むＣＤ６２Ｌｌｏｗ全体の細胞集団でもＰＦＳとの相関は確認できたが、これと比べると、Ｔｈ１／１７とＣＣＲ６ ＳＰのみを取り出した場合には、さらに高いＰＦＳとの相関を得ることができた（図示せず）。これは、ＣＤ６２Ｌｌｏｗ全体の細胞集団は、Ｔｈ１／１７とＣＣＲ６ ＳＰのみの場合に特に、抗腫瘍効果と関連するクラスターだけを含んでいるため、ＰＦＳとの相関が高くなったと考えられる。
【0173】
次に、末梢血ではなく、腫瘍微小環境におけるＣＤ４Ｔ細胞のＰＦＳとの相関を調べた。芯針生検、経気管支生検、外科生検で得られた腫瘍標本（ｎ＝４６）を、サイトケラチン、ＣＤ４、ＣＤ８、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＦｏｘＰ３で染色した。サイトケラチン＋腫瘍細胞の検出に基づき、マルチカラーアナライザー（ＯＰＡＬＴＭ）を用いて、腫瘍周囲の間質と腫瘍内の１０，０００個の細胞を自動的にカウントした。結果を図２１に示した。図２１の上部に示した写真は、腫瘍内および間質においてＣＤ４、ＣＤ８、ＰＤ－１などの分子がどの程度存在しているかを調べるため、各分子を染色した写真である。腫瘍微小環境（ＴＭＥ）へのＴ細胞の浸潤を調べると、腫瘍微小環境における免疫細胞数の反復相関解析では、腫瘍周囲の間質に存在するＣＤ８＋細胞およびＣＤ４＋細胞の数とＰＦＳおよびＯＳとの間に有意な相関関係が認められたが、多重比較解析では、腫瘍周囲の間質に存在するＣＤ４＋Ｔ細胞に最も有意な相関関係が認められた（図２１左下および右下）。
【0174】
さらに、ＰＤ－１阻害剤の抗腫瘍効果と相関する末梢血中に見出されたＣＤ４＋Ｔ細胞クラスターと、他の末梢血Ｔ細胞クラスターや腫瘍微小環境中のＴ細胞の存在との関係を明らかにするために、多重比較解析とネットワーク解析を行った。これにより、末梢血および腫瘍微小環境（ＴＭＥ）における各細胞クラスターの数が、どのような関係で連動しているかについて調べることができる。末梢血中のＴ細胞クラスターとＴＭＥ中の免疫細胞のネットワーク解析を行った結果が図２２である。この図においては、ある細胞の数が完全に連動して変動する場合には１．００で示され、連動が低くなるにつれて、数字が小さくなる。この図からもわかるとおり、末梢血中のＴｈ１／１７とＣＣＲ６ ＳＰとを合わせた細胞数と、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）中のＣＤ４＋細胞数は、ネットワーク解析結果が０．９２で示され、末梢血中のＴｈ１／１７とＣＣＲ６ ＳＰを合わせたクラスターがＣＤ４＋細胞の腫瘍微小環境への浸潤と強く関連していることがわかった。一方、Ｔｈ１細胞は腫瘍微小環境のＣＤ８＋Ｔ細胞と直接関連していた。このように、末梢血中のＴｈ１／１７とＣＣＲ６ ＳＰを合わせたクラスターはＣＤ４＋Ｔ細胞の腫瘍微小環境への浸潤を促進し、ＣＤ６２Ｌｌｏｗ Ｔｈ１細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤を促進していた。また、ネットワーク解析の結果、末梢血中のＴｈ１／１７とＣＣＲ６ ＳＰを合わせたクラスターは、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７－エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞（ＴＥＭＲＡ）の頻度と正の相関関係があることも明らかになった。このことから、末梢血のＴｈ１／１７とＣＣＲ６ ＳＰを確認することで、腫瘍内のＣＤ４＋細胞の状態を把握することができることがわかった。
【0175】
続いて、手術前の末梢血における細胞クラスターと、手術によって腫瘍組織を取り除いた後の末梢血の細胞クラスターとを比較した。結果を図２３に示す。手術によって腫瘍組織がなくなった場合に、末梢血においても減少している細胞クラスターは、腫瘍の存在によって増加した細胞クラスターと考えることができる。図２３に示されるとおり、ＣＤ６２Ｌｌｏｗ細胞は手術前（ｐｒｅ）と比べて手術後（ｐｏｓｔ）では末梢血における細胞数が減少しており、中でも特にＴｈ１／１７とＣＣＲ６ ＳＰについては、手術後にその細胞数が顕著に減少していることがわかった。このことからも、Ｔｈ１／１７とＣＣＲ６ ＳＰは、腫瘍と関連している細胞クラスターであることがわかる。
【0176】
（注記）
以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願及び他の文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は、日本国特許庁に２０２０年９月８日に出願された特願２０２０－１５０６２０に対して優先権主張をするものであり、その内容はその全体があたかも本願の内容を構成するのと同様に参考として援用される。
以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願及び他の文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は、日本国特許庁に２０２０年９月８日に出願された特願２０２０－１５０６２０に対して優先権主張をするものであり、その内容はその全体があたかも本願の内容を構成するのと同様に参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【0177】
本発明において提供されるバイオマーカーは、簡便、安価、正確にがん免疫チェックポイント阻害剤による応答を予測することに利用でき、医学的、社会的に必須である。本発明は、全世界、全癌腫において必要な技術と考えられ、極めて大きな市場的価値を有しているものと考えられる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
