▶ エスエヌアイピーアール・テクノロジーズ・リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023022046
(43)【公開日】2023-02-14
(54)【発明の名称】免疫調節のための微生物叢の選択的変更
(51)【国際特許分類】
A61K 38/46 20060101AFI20230207BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20230207BHJP
A61P 31/18 20060101ALI20230207BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230207BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230207BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20230207BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20230207BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230207BHJP
A61K 35/741 20150101ALI20230207BHJP
A61K 35/15 20150101ALI20230207BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20230207BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20230207BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230207BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20230207BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20230207BHJP
【ＦＩ】
A61K38/46
A61P31/12
A61P31/18
A61P35/00
A61P43/00 105
A61P37/02
A61P37/08
A61P29/00
A61K35/741
A61K35/15
A61K35/17
A61P43/00 121
A61P31/04
A61K39/395 N
A61K39/00 A
C12N15/09 110
【審査請求】有
【請求項の数】53
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022177822
(22)【出願日】2022-11-07
(62)【分割の表示】P 2021004241の分割
【原出願日】2021-01-14
(31)【優先権主張番号】1609811.3
(32)【優先日】2016-06-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(71)【出願人】
【識別番号】517386055
【氏名又は名称】エスエヌアイピーアール・テクノロジーズ・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＳＮＩＰＲ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ ＬＩＭＩＴＥＤ
(74)【代理人】
【識別番号】100173185
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 裕
(74)【代理人】
【識別番号】100162503
【弁理士】
【氏名又は名称】今野 智介
(74)【代理人】
【識別番号】100204582
【弁理士】
【氏名又は名称】大栗 由美
(72)【発明者】
【氏名】ジャスパー・クルーブ
(72)【発明者】
【氏名】モルテン・ソマー
(72)【発明者】
【氏名】クリスティアン・グレンダール
(72)【発明者】
【氏名】ルーベン・バスケス－ウリベ
(72)【発明者】
【氏名】エリック・ファン・デル・ヘルム
(57)【要約】 （修正有）
【課題】患者の微生物叢を変更することによって、患者の免疫細胞を調節する方法、対象の微生物叢を変更することによって、対象生物における処置または治療を調節する方法、ならびに細胞集団、システム、アレイ、細胞、ＲＮＡ、キットおよびこれをもたらす他の手段を提供する。
【解決手段】患者において疾病または症状を処置または軽減する方法において用いるための誘導型ヌクレアーゼシステムであって、該方法が、該システムの誘導型ヌクレアーゼを用いて患者の微生物叢を変更することにより患者において免疫細胞を調節することを含み、該疾病または症状が、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）により媒介されるか、または、患者において免疫細胞活性または免疫細胞集団を変更することにより処置または予防される、誘導型ヌクレアーゼシステムを提供する。
【選択図】なし
【解決手段】患者において疾病または症状を処置または軽減する方法において用いるための誘導型ヌクレアーゼシステムであって、該方法が、該システムの誘導型ヌクレアーゼを用いて患者の微生物叢を変更することにより患者において免疫細胞を調節することを含み、該疾病または症状が、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）により媒介されるか、または、患者において免疫細胞活性または免疫細胞集団を変更することにより処置または予防される、誘導型ヌクレアーゼシステムを提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
患者において疾病または症状を処置または軽減する方法において用いるための誘導型ヌ
クレアーゼシステムであって、該方法が、該システムの誘導型ヌクレアーゼを用いて患者
の微生物叢を変更することにより患者において免疫細胞を調節することを含み、該疾病ま
たは症状が、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）により媒介されるか、または、患者において免
疫細胞活性または免疫細胞集団を変更することにより処置または予防される、誘導型ヌク
レアーゼシステム。
クレアーゼシステムであって、該方法が、該システムの誘導型ヌクレアーゼを用いて患者
の微生物叢を変更することにより患者において免疫細胞を調節することを含み、該疾病ま
たは症状が、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）により媒介されるか、または、患者において免
疫細胞活性または免疫細胞集団を変更することにより処置または予防される、誘導型ヌク
レアーゼシステム。
【請求項2】
該方法が、該微生物叢中の第１の種の細胞のゲノムを誘導型ヌクレアーゼを用いて選択
的に標的化して該変更をもたらすことを含む、請求項１に記載のシステム。
的に標的化して該変更をもたらすことを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項3】
該選択的標的化が、（ｉ）前記第１の種と同じ門の種、または（ｉｉ）前記第１の種の
異なる株を標的とすることを回避する、請求項２に記載のシステム。
異なる株を標的とすることを回避する、請求項２に記載のシステム。
【請求項4】
該方法が、微生物叢において第２の細胞を標的とせずに第１の細胞を選択的に死滅させ
、第２の細胞が、（ｉ）第１の種の株に関連する株の細胞であるか、または（ｉｉ）第１
の種と異なり、かつ第１の種と系統学的に関連する種の細胞であり、第２の種または株が
、第１の細胞の種または株の１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列と少なくと
も８０％同一である１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を有し、微生物叢に
おける第２の細胞の増殖が、前記方法によって阻害されないか、または、前記第１の細胞
の増殖が、第２の細胞の少なくとも５倍の増殖阻害で阻害される、請求項１～３のいずれ
か一項に記載のシステム。
、第２の細胞が、（ｉ）第１の種の株に関連する株の細胞であるか、または（ｉｉ）第１
の種と異なり、かつ第１の種と系統学的に関連する種の細胞であり、第２の種または株が
、第１の細胞の種または株の１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列と少なくと
も８０％同一である１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を有し、微生物叢に
おける第２の細胞の増殖が、前記方法によって阻害されないか、または、前記第１の細胞
の増殖が、第２の細胞の少なくとも５倍の増殖阻害で阻害される、請求項１～３のいずれ
か一項に記載のシステム。
【請求項5】
（ａ）患者がヒト患者であり；
（ｂ）微生物叢が腸内微生物叢であり；
（ｃ）該方法が、誘導型ヌクレアーゼを用いて微生物叢において第１の種のゲノムを選択
的に標的化して該変更をもたらすことを含み；および
（ｄ）該方法が、微生物叢において第２の細胞を標的とせずに第１の細胞を選択的に死滅
させ、第２の細胞が、（ａ）第１の種の株に関連する株の細胞であるか、または（ｂ）第
１の種と異なり、かつ第１の種と系統学的に関連する種の細胞であり、第２の種または株
が、第１の細胞の種または株の１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列と少なく
とも８０％同一である１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を有する、
請求項１～３のいずれか一項に記載のシステム。
（ｂ）微生物叢が腸内微生物叢であり；
（ｃ）該方法が、誘導型ヌクレアーゼを用いて微生物叢において第１の種のゲノムを選択
的に標的化して該変更をもたらすことを含み；および
（ｄ）該方法が、微生物叢において第２の細胞を標的とせずに第１の細胞を選択的に死滅
させ、第２の細胞が、（ａ）第１の種の株に関連する株の細胞であるか、または（ｂ）第
１の種と異なり、かつ第１の種と系統学的に関連する種の細胞であり、第２の種または株
が、第１の細胞の種または株の１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列と少なく
とも８０％同一である１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を有する、
請求項１～３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項6】
患者において疾病または症状を治療または予防するための患者の養子細胞療法の方法に
おける使用のための、免疫細胞のエクスビボ集団であって、該方法が、
（ａ）該集団の細胞を患者に投与することを含む養子免疫細胞療法を患者において実行す
ること、ここで、該免疫細胞の投与は、患者において疾病または症状を処置することが可
能である；および
（ｂ）患者の腸内微生物叢において、第１の細菌種もしくは株、または、古細菌種もしく
は株の細胞の亜集団の相対的割合を変更し、それにより、患者において免疫細胞療法を調
節する変更された腸内微生物叢を産生すること；
を含み、ここで、ステップ（ｂ）は、患者の微生物叢に、前記免疫細胞集団と同時に、ま
たは連続して、抗細菌または抗古細菌誘導型ヌクレアーゼシステムを投与することにより
、第１の細胞の亜集団を標的化することによって実行され、それにより、第１の細胞が死
滅するか、該亜集団の増殖が低下し、それにより、患者の腸内微生物叢における前記亜集
団の割合を低減させる、免疫細胞のエクスビボ集団。
おける使用のための、免疫細胞のエクスビボ集団であって、該方法が、
（ａ）該集団の細胞を患者に投与することを含む養子免疫細胞療法を患者において実行す
ること、ここで、該免疫細胞の投与は、患者において疾病または症状を処置することが可
能である；および
（ｂ）患者の腸内微生物叢において、第１の細菌種もしくは株、または、古細菌種もしく
は株の細胞の亜集団の相対的割合を変更し、それにより、患者において免疫細胞療法を調
節する変更された腸内微生物叢を産生すること；
を含み、ここで、ステップ（ｂ）は、患者の微生物叢に、前記免疫細胞集団と同時に、ま
たは連続して、抗細菌または抗古細菌誘導型ヌクレアーゼシステムを投与することにより
、第１の細胞の亜集団を標的化することによって実行され、それにより、第１の細胞が死
滅するか、該亜集団の増殖が低下し、それにより、患者の腸内微生物叢における前記亜集
団の割合を低減させる、免疫細胞のエクスビボ集団。
【請求項7】
第１の細胞が、細菌または古細菌の細胞であり、例えばファーミキューテス門（Ｆｉｒ
ｍｉｃｕｔｅｓ）の細胞である、請求項２～６のいずれか一項に記載のシステムまたは集
団。
ｍｉｃｕｔｅｓ）の細胞である、請求項２～６のいずれか一項に記載のシステムまたは集
団。
【請求項8】
該方法が、第１の種の細胞の１つ以上の標的ゲノムまたはエピソームのヌクレオチド配
列を改変（例えば、切断および／または変異）することを含む、請求項２～７のいずれか
一項に記載のシステムまたは集団。
列を改変（例えば、切断および／または変異）することを含む、請求項２～７のいずれか
一項に記載のシステムまたは集団。
【請求項9】
第１の細胞が宿主細胞の集団を含み、該方法が宿主細胞において標的配列を改変するこ
とを含み、標的配列の改変が、
ａ．微生物叢を、宿主改変（ＨＭ）ｃｒＲＮＡをコードする操作された核酸配列の複数の
コピーと組み合わせること、および
ｂ．宿主細胞においてＨＭ－ｃｒＲＮＡを発現させること
により実行され、ここで、操作された各核酸配列は、個々の宿主細胞においてＣａｓヌク
レアーゼと作動可能であり、ＨＭ－ＣＲｌＳＰＲ／Ｃａｓシステムを形成し、かつ、該操
作された配列は、
（ｉ）ＨＭ－ｃｒＲＮＡをコードする、スペーサーおよびリピート配列；
（ｉｉ）宿主細胞の標的配列にハイブリダイズしてＣａｓヌクレアーゼを宿主細胞の標的
配列に誘導することができる配列を含む、ＨＭ－ｃｒＲＮＡ；
を含み、場合により、ＨＭ－システムは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ
配列を発現するＤＮＡ配列を含み、
それにより、ＨＭ－ｃｒＲＮＡは宿主細胞において宿主標的配列のＣａｓ改変を誘導し、
それにより、宿主細胞が死滅するか、宿主細胞集団の増殖が低下し、それにより、微生物
叢において前記第１の細胞の割合を低減させる、請求項２～８のいずれか一項に記載のシ
ステムまたは集団。
とを含み、標的配列の改変が、
ａ．微生物叢を、宿主改変（ＨＭ）ｃｒＲＮＡをコードする操作された核酸配列の複数の
コピーと組み合わせること、および
ｂ．宿主細胞においてＨＭ－ｃｒＲＮＡを発現させること
により実行され、ここで、操作された各核酸配列は、個々の宿主細胞においてＣａｓヌク
レアーゼと作動可能であり、ＨＭ－ＣＲｌＳＰＲ／Ｃａｓシステムを形成し、かつ、該操
作された配列は、
（ｉ）ＨＭ－ｃｒＲＮＡをコードする、スペーサーおよびリピート配列；
（ｉｉ）宿主細胞の標的配列にハイブリダイズしてＣａｓヌクレアーゼを宿主細胞の標的
配列に誘導することができる配列を含む、ＨＭ－ｃｒＲＮＡ；
を含み、場合により、ＨＭ－システムは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ
配列を発現するＤＮＡ配列を含み、
それにより、ＨＭ－ｃｒＲＮＡは宿主細胞において宿主標的配列のＣａｓ改変を誘導し、
それにより、宿主細胞が死滅するか、宿主細胞集団の増殖が低下し、それにより、微生物
叢において前記第１の細胞の割合を低減させる、請求項２～８のいずれか一項に記載のシ
ステムまたは集団。
【請求項10】
調節された免疫細胞が、患者の内因性細胞および／または（例えば養子細胞療法を介し
て）投与された細胞を含む、請求項１～５および７～９のいずれか一項に記載のシステム
。
て）投与された細胞を含む、請求項１～５および７～９のいずれか一項に記載のシステム
。
【請求項11】
ヌクレアーゼが、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼである、請求項１～１０のいずれか一項に
記載のシステムまたは集団。
記載のシステムまたは集団。
【請求項12】
システムが、操作されたＣＲｌＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＴＡＬＥＮシステム、メガヌ
クレアーゼシステムまたはジンクフィンガーシステムである、請求項１～１１のいずれか
一項に記載のシステムまたは集団。
クレアーゼシステムまたはジンクフィンガーシステムである、請求項１～１１のいずれか
一項に記載のシステムまたは集団。
【請求項13】
該方法が、患者において、（ｉ）ＴＨ１、Ｔｈ１７および／またはＴｒｅｇ細胞集団を
アップレギュレートするか、または、（ｉｉ）ＴＨ１、Ｔｈ１７および／またはＴｒｅｇ
細胞集団をダウンレギュレートする、請求項１～１２のいずれか一項に記載のシステムま
たは集団。
アップレギュレートするか、または、（ｉｉ）ＴＨ１、Ｔｈ１７および／またはＴｒｅｇ
細胞集団をダウンレギュレートする、請求項１～１２のいずれか一項に記載のシステムま
たは集団。
【請求項14】
該方法が、患者において疾病または症状の治療を調節する方法であって、
（ａ）患者において治療を実行すること；および
（ｂ）誘導型ヌクレアーゼを用いて微生物叢の前記変更を実行することにより、患者にお
いて腸内細菌の微生物叢ディスバイオシスを引き起こし、それにより、前記ディスバイオ
シスが、患者において免疫細胞の前記調節をおこなうことにより、患者において治療を調
節すること、
を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のシステムまたは集団。
（ａ）患者において治療を実行すること；および
（ｂ）誘導型ヌクレアーゼを用いて微生物叢の前記変更を実行することにより、患者にお
いて腸内細菌の微生物叢ディスバイオシスを引き起こし、それにより、前記ディスバイオ
シスが、患者において免疫細胞の前記調節をおこなうことにより、患者において治療を調
節すること、
を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のシステムまたは集団。
【請求項15】
該方法が、
（ａ）患者の免疫チェックポイントのアンタゴニズムまたはアゴニズムの治療を増強する
こと、場合により、治療は、イピリムマブ（すなわちＹＥＲＶＯＹ商標）、トレメリムマ
ブ、ニボルマブ（すなわちＯＰＤＩＶＯ商標）ペンブロリズマブ（すなわちＫＥＹＴＲＵ
ＤＡ商標）、ピディリズマブ、ＢＭＳ－９３６５５９、デュルバルマブおよびアテゾリズ
マブから選択される抗体を用いた抗体療法である；または
（ｂ）疾病または症状のワクチン療法を調節すること；または
（ｃ）疾病または症状の細胞療法（例えば、養子免疫細胞療法）を調節すること、場合に
より、細胞ベースの治療またはその副作用（例えば、サイトカイン放出症候群）を弱める
ために調節すること；または
（ｄ）患者においてがんの処置のためのＣＡＲ－ＴまたはＴＩＬ療法を調節すること；ま
たは
（ｅ）Ｔｈ２細胞サイトカイン放出によって媒介される患者における自己中毒を低減させ
ること、
を目的とする、請求項１～１４のいずれか一項に記載のシステムまたは集団。
（ａ）患者の免疫チェックポイントのアンタゴニズムまたはアゴニズムの治療を増強する
こと、場合により、治療は、イピリムマブ（すなわちＹＥＲＶＯＹ商標）、トレメリムマ
ブ、ニボルマブ（すなわちＯＰＤＩＶＯ商標）ペンブロリズマブ（すなわちＫＥＹＴＲＵ
ＤＡ商標）、ピディリズマブ、ＢＭＳ－９３６５５９、デュルバルマブおよびアテゾリズ
マブから選択される抗体を用いた抗体療法である；または
（ｂ）疾病または症状のワクチン療法を調節すること；または
（ｃ）疾病または症状の細胞療法（例えば、養子免疫細胞療法）を調節すること、場合に
より、細胞ベースの治療またはその副作用（例えば、サイトカイン放出症候群）を弱める
ために調節すること；または
（ｄ）患者においてがんの処置のためのＣＡＲ－ＴまたはＴＩＬ療法を調節すること；ま
たは
（ｅ）Ｔｈ２細胞サイトカイン放出によって媒介される患者における自己中毒を低減させ
ること、
を目的とする、請求項１～１４のいずれか一項に記載のシステムまたは集団。
【請求項16】
疾病または症状が、がん、自己免疫性の疾病または症状、炎症性の疾病または症状、ウ
イルス感染症（例えば、ヒト患者のＨＩＶ感染症）、アレルギー性の疾病または症状、ま
たは、ウイルス感染症により媒介されるか、または、引き起こされる疾病または症状であ
る、請求項１～１５のいずれか一項に記載のシステムまたは集団。
イルス感染症（例えば、ヒト患者のＨＩＶ感染症）、アレルギー性の疾病または症状、ま
たは、ウイルス感染症により媒介されるか、または、引き起こされる疾病または症状であ
る、請求項１～１５のいずれか一項に記載のシステムまたは集団。
【請求項17】
第１の細胞集団の増殖が、少なくとも５倍低下する、請求項２～１６のいずれか一項に
記載のシステムまたは集団。
記載のシステムまたは集団。
【請求項18】
微生物叢が、患者の腸内微生物叢である、請求項２～５および７～１０のいずれか一項
に記載のシステム。
に記載のシステム。
【請求項19】
該方法を実行して微生物叢を変更し、それにより患者においてパネート細胞を刺激し、
それにより免疫細胞が調節され、疾病または症状が処置または低減されることを目的とす
る、請求項１～１８のいずれか一項に記載のシステムまたは集団。
それにより免疫細胞が調節され、疾病または症状が処置または低減されることを目的とす
る、請求項１～１８のいずれか一項に記載のシステムまたは集団。
【請求項20】
請求項1～１９のいずれか一項に記載の方法を実行するための該請求項に記載のシステ
ムにおいて用いるための、誘導型ヌクレアーゼ；または、請求項１～１９のいずれか一項
に記載の方法を用いて患者において疾病または症状を治療するために患者へ投与するため
の、ＨＭ－ＣＲｌＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ｇＲＮＡ、ＨＭ－アレイもしくはＨＭ－ｃｒ
ＲＮＡ；または、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法を実行するために前記請求
項のＨＭ－ＣＲｌＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて用いるための、ＨＭ－アレイ、ｇＲＮ
ＡもしくはＨＭ－ｃｒＲＮＡ；または、該システム、ＨＭ－アレイ、ｇＲＮＡまたはＨＭ
－ｃｒＲＮＡを含む、またはコードする、第１の細胞に感染することができるか、または
第１の細胞を形質転換することができる、ベクター、例えば、バクテリオファージ、接合
性プラスミドもしくはトランスポゾン；または、該システム、ＨＭ－アレイ、ｇＲＮＡま
たはＨＭ－ｃｒＲＮＡを含む、またはコードする、医薬；ここで、場合により、ｇＲＮＡ
はシングルガイドＲＮＡである。
ムにおいて用いるための、誘導型ヌクレアーゼ；または、請求項１～１９のいずれか一項
に記載の方法を用いて患者において疾病または症状を治療するために患者へ投与するため
の、ＨＭ－ＣＲｌＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ｇＲＮＡ、ＨＭ－アレイもしくはＨＭ－ｃｒ
ＲＮＡ；または、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法を実行するために前記請求
項のＨＭ－ＣＲｌＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて用いるための、ＨＭ－アレイ、ｇＲＮ
ＡもしくはＨＭ－ｃｒＲＮＡ；または、該システム、ＨＭ－アレイ、ｇＲＮＡまたはＨＭ
－ｃｒＲＮＡを含む、またはコードする、第１の細胞に感染することができるか、または
第１の細胞を形質転換することができる、ベクター、例えば、バクテリオファージ、接合
性プラスミドもしくはトランスポゾン；または、該システム、ＨＭ－アレイ、ｇＲＮＡま
たはＨＭ－ｃｒＲＮＡを含む、またはコードする、医薬；ここで、場合により、ｇＲＮＡ
はシングルガイドＲＮＡである。
【請求項21】
患者において疾病または症状を処置または軽減する方法であって、請求項１～１９のい
ずれか一項に記載される、方法。
ずれか一項に記載される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明の分野
本発明は、患者の微生物叢を変更することにより患者の免疫細胞（患者の内因性細胞お
よび／または（例えば養子細胞療法を介して）投与された細胞）を調節する方法に関する
。本発明はまた、対象の微生物叢を変更することにより対象において処置または治療を調
節する方法に関する。本発明はまた、細胞集団、システム、キット、および、これをもた
らす他の手段に関する。一例では、誘導型核酸改変を用いたヒト腸内微生物叢中の特定の
種の有利な選択的標的化が、該変更をもたらすために実行される。
本発明は、患者の微生物叢を変更することにより患者の免疫細胞（患者の内因性細胞お
よび／または（例えば養子細胞療法を介して）投与された細胞）を調節する方法に関する
。本発明はまた、対象の微生物叢を変更することにより対象において処置または治療を調
節する方法に関する。本発明はまた、細胞集団、システム、キット、および、これをもた
らす他の手段に関する。一例では、誘導型核酸改変を用いたヒト腸内微生物叢中の特定の
種の有利な選択的標的化が、該変更をもたらすために実行される。
【背景技術】
【0002】
本発明の背景
免疫療法の１つのアプローチは、腫瘍を認識して攻撃する細胞表面抗原受容体（ＣＡＲ
）を発現するように、患者自身の（またはドナーの）免疫細胞を操作することを包含する
。養子細胞移入（ＡＣＴ）と呼ばれる、本アプローチは、今までのところ小規模な臨床試
験に限られていたが、これらの操作された免疫細胞を用いた処置は、進行がんの患者にお
いていくつかの顕著な反応をもたらしている。
免疫療法の１つのアプローチは、腫瘍を認識して攻撃する細胞表面抗原受容体（ＣＡＲ
）を発現するように、患者自身の（またはドナーの）免疫細胞を操作することを包含する
。養子細胞移入（ＡＣＴ）と呼ばれる、本アプローチは、今までのところ小規模な臨床試
験に限られていたが、これらの操作された免疫細胞を用いた処置は、進行がんの患者にお
いていくつかの顕著な反応をもたらしている。
【0003】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインと融合した、抗体由来の
標的化ドメインから成り、Ｔ細胞により発現された場合に、ＣＡＲの標的化ドメインによ
り決定される抗原特異性をＴ細胞に付与する。ＣＡＲは、抗体ベースの標的化ドメインが
利用可能である限り、Ｔ細胞のエフェクター機能を、細胞表面上に発現される任意のタン
パク質および非タンパク質標的に方向転換させることができる可能性がある。それによっ
て、本戦略は、標的細胞による抗原プロセシングおよび提示の必要性を回避し、炭水化物
などの非古典的Ｔ細胞標的に適用可能である。このＨＬＡ拘束性の回避は、ＣＡＲ Ｔ細
胞のアプローチが、養子Ｔ細胞療法の適用可能性を広げる一般的なツールとして使用でき
ることを意味する。例えば、Methods Mol Biol. 2012;907:645－66. doi: 10.1007/978－
1－61779－974－7_36, “Chimeric antigen receptors for T－cell based therapy”, C
headle EJ et al.を参照されたい。
標的化ドメインから成り、Ｔ細胞により発現された場合に、ＣＡＲの標的化ドメインによ
り決定される抗原特異性をＴ細胞に付与する。ＣＡＲは、抗体ベースの標的化ドメインが
利用可能である限り、Ｔ細胞のエフェクター機能を、細胞表面上に発現される任意のタン
パク質および非タンパク質標的に方向転換させることができる可能性がある。それによっ
て、本戦略は、標的細胞による抗原プロセシングおよび提示の必要性を回避し、炭水化物
などの非古典的Ｔ細胞標的に適用可能である。このＨＬＡ拘束性の回避は、ＣＡＲ Ｔ細
胞のアプローチが、養子Ｔ細胞療法の適用可能性を広げる一般的なツールとして使用でき
ることを意味する。例えば、Methods Mol Biol. 2012;907:645－66. doi: 10.1007/978－
1－61779－974－7_36, “Chimeric antigen receptors for T－cell based therapy”, C
headle EJ et al.を参照されたい。
【0004】
最初のＣＡＲ－Ｔ構築物は、ＰＮＡＳにおいて、免疫療法のパイオニアであるＺｅｌｉ
ｇ Ｅｓｈｈａｒにより、１９８９年の論文に記載された。ＣＡＲの構造には、今や、異
なる細胞タンパク質由来の異なるドメインのキメラである、膜貫通ポリペプチド鎖を含む
。例えば、ＣＡＲは、細胞内部分に（多くの場合、リンカーおよび／またはヒンジ領域に
よって）連結された細胞外部分を有し、免疫細胞、通常はＴ細胞の膜に該受容体を埋め込
むＣＡＲの膜貫通部分を有する。細胞外部分は、一般にはがん細胞の表面上の腫瘍関連抗
原（ＴＡＡ）である標的抗原を認識する抗体結合部位（通常、例えばマウスｍＡｂに由来
する、ｓｃＦｖの形態である）を含む。このようにして抗原認識は、ＭＨＣ拘束性の抗原
提示を必要とするＴＣＲに頼る必要性をなくし、結合親和性が比較的低い可能性がある。
ＣＡＲの細胞内部分は、典型的に、抗原が細胞外結合部位に結合した際の細胞内シグナル
伝達のための、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）ドメインを含む。後の世代のＣＡＲはまた、し
ばしば４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）またはＣＤ２８細胞内ドメインである、Ｔ細胞媒介応答
を増強するさらなるドメインを含む。ＣＡＲ結合部位のコグネイトの抗原リガンドに遭遇
すると、ＣＡＲは細胞内シグナリング伝達を活性化し、ＣＡＲ Ｔ細胞の活性化により腫
瘍細胞の死滅を促進することができる。
ｇ Ｅｓｈｈａｒにより、１９８９年の論文に記載された。ＣＡＲの構造には、今や、異
なる細胞タンパク質由来の異なるドメインのキメラである、膜貫通ポリペプチド鎖を含む
。例えば、ＣＡＲは、細胞内部分に（多くの場合、リンカーおよび／またはヒンジ領域に
よって）連結された細胞外部分を有し、免疫細胞、通常はＴ細胞の膜に該受容体を埋め込
むＣＡＲの膜貫通部分を有する。細胞外部分は、一般にはがん細胞の表面上の腫瘍関連抗
原（ＴＡＡ）である標的抗原を認識する抗体結合部位（通常、例えばマウスｍＡｂに由来
する、ｓｃＦｖの形態である）を含む。このようにして抗原認識は、ＭＨＣ拘束性の抗原
提示を必要とするＴＣＲに頼る必要性をなくし、結合親和性が比較的低い可能性がある。
ＣＡＲの細胞内部分は、典型的に、抗原が細胞外結合部位に結合した際の細胞内シグナル
伝達のための、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）ドメインを含む。後の世代のＣＡＲはまた、し
ばしば４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）またはＣＤ２８細胞内ドメインである、Ｔ細胞媒介応答
を増強するさらなるドメインを含む。ＣＡＲ結合部位のコグネイトの抗原リガンドに遭遇
すると、ＣＡＲは細胞内シグナリング伝達を活性化し、ＣＡＲ Ｔ細胞の活性化により腫
瘍細胞の死滅を促進することができる。
【0005】
大部分のＣＡＲ－Ｔはインビボで増殖するので、従来の意味での用量漸増（dose titra
tion）は困難であり、多くの場合、操作されたＴ細胞は「永遠に」活性であると考えられ
る－すなわち、ほとんどのこれまでのＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ臨床試験において、進行中の
Ｂ細胞無形成が見られた。このことは、ＣＡＲ Ｔ細胞のアプローチに重大な問題を提起
する。いくつかの観察されたリスクが、Discov Med. 2014 Nov;18(100):265－71, “Chal
lenges to chimeric antigen receptor (CAR)－T cell therapy for cancer”, Magee MS
& Snook AEで議論されており、本文献は、ＣＡＲ－Ｔ細胞処置後の最初の重大な有害事
象は、肺および肝臓へ転移性の結腸直腸がんの患者で生じたこと(Morgan et al., 2010)
を説明している。この患者は、上皮増殖因子受容体２（ＥＲＢＢ２、ＨＥＲ２）を標的と
する第三世代ＣＡＲを発現するＴ細胞で処置された。該ＣＡＲは、ＨＥＲ２陽性乳がんの
処置のためにＦＤＡで承認された４Ｄ５抗体由来のｓｃＦｖ（トラスツズマブ）を含有し
ていた（Zhao et al., 2009）。この患者は、１０１０ ＣＡＲ－Ｔ細胞の単回投与を受
けてから１５分以内に呼吸促迫を発症し、その後５日間にわたって複数回の心停止が起こ
り、最終的に死に至った。処置４時間後の血清解析では、サイトカインＩＦＮγ、ＧＭ－
ＣＳＦ、ＴＮＦα、ＩＬ－６、およびＩＬ－１０の顕著な増加が明らかとなった。ＣＡＲ
－Ｔ細胞は肺および腹部および縦隔リンパ節に見られたが、腫瘍転移には見られなかった
。研究者らは、毒性は、肺上皮におけるＨＥＲ２の認識に起因し、炎症性サイトカインを
放出して肺毒性を生みだし、および、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）をもたらして多
臓器不全を引き起こすと考えた（Morgan et al.,2010）。保守的な用量漸増（ｄｏｓｅ－
ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ）戦略の後に異なる抗体（ＦＲＰ５）由来の第二世代のＨＥＲ２を
標的とするＣＡＲを利用する試験が、他の研究者によって様々なＨＥＲ２＋悪性腫瘍に対
して現在進行中である（ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖの識別番号ＮＣＴ０１１
０９０９５、ＮＣＴ００８８９９５４、およびＮＣＴ００９０２０４４）。
tion）は困難であり、多くの場合、操作されたＴ細胞は「永遠に」活性であると考えられ
る－すなわち、ほとんどのこれまでのＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ臨床試験において、進行中の
Ｂ細胞無形成が見られた。このことは、ＣＡＲ Ｔ細胞のアプローチに重大な問題を提起
する。いくつかの観察されたリスクが、Discov Med. 2014 Nov;18(100):265－71, “Chal
lenges to chimeric antigen receptor (CAR)－T cell therapy for cancer”, Magee MS
& Snook AEで議論されており、本文献は、ＣＡＲ－Ｔ細胞処置後の最初の重大な有害事
象は、肺および肝臓へ転移性の結腸直腸がんの患者で生じたこと(Morgan et al., 2010)
を説明している。この患者は、上皮増殖因子受容体２（ＥＲＢＢ２、ＨＥＲ２）を標的と
する第三世代ＣＡＲを発現するＴ細胞で処置された。該ＣＡＲは、ＨＥＲ２陽性乳がんの
処置のためにＦＤＡで承認された４Ｄ５抗体由来のｓｃＦｖ（トラスツズマブ）を含有し
ていた（Zhao et al., 2009）。この患者は、１０１０ ＣＡＲ－Ｔ細胞の単回投与を受
けてから１５分以内に呼吸促迫を発症し、その後５日間にわたって複数回の心停止が起こ
り、最終的に死に至った。処置４時間後の血清解析では、サイトカインＩＦＮγ、ＧＭ－
ＣＳＦ、ＴＮＦα、ＩＬ－６、およびＩＬ－１０の顕著な増加が明らかとなった。ＣＡＲ
－Ｔ細胞は肺および腹部および縦隔リンパ節に見られたが、腫瘍転移には見られなかった
。研究者らは、毒性は、肺上皮におけるＨＥＲ２の認識に起因し、炎症性サイトカインを
放出して肺毒性を生みだし、および、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）をもたらして多
臓器不全を引き起こすと考えた（Morgan et al.,2010）。保守的な用量漸増（ｄｏｓｅ－
ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ）戦略の後に異なる抗体（ＦＲＰ５）由来の第二世代のＨＥＲ２を
標的とするＣＡＲを利用する試験が、他の研究者によって様々なＨＥＲ２＋悪性腫瘍に対
して現在進行中である（ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖの識別番号ＮＣＴ０１１
０９０９５、ＮＣＴ００８８９９５４、およびＮＣＴ００９０２０４４）。
【0006】
ＣＡＲ Ｔ細胞のテーマの一種は、抗体共役型Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）療法であり、
腫瘍特異的ＩｇＧのＦｃ領域に結合するＣＤ１６Ａ（ＦＣγＲＩＩＩＡ）を使用する（例
えば、ＷＯ２０１５／０５８０１８、ＵＳ２０１５１３９９４３を参照）。目的は、患者
に投与されるＩｇＧを用量設定することによって、インビボでのＣＡＲ Ｔ細胞活性のよ
り多くの制御を可能にすることである。しかしながら、ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＤ１６結合部
位は、患者の内因性ＩｇＧにも自由に結合し得、このことは、該アプローチの魅力を低下
させる。該アプローチはまた、体内のＩｇＧの本質的に長い半減期（ヒトＩｇＧではおよ
そ２０日間）を考慮する必要があり、ＣＡＲ細胞活性の制御を制限する可能性がある。進
行中の研究はこのリスクを評価し得る。
腫瘍特異的ＩｇＧのＦｃ領域に結合するＣＤ１６Ａ（ＦＣγＲＩＩＩＡ）を使用する（例
えば、ＷＯ２０１５／０５８０１８、ＵＳ２０１５１３９９４３を参照）。目的は、患者
に投与されるＩｇＧを用量設定することによって、インビボでのＣＡＲ Ｔ細胞活性のよ
り多くの制御を可能にすることである。しかしながら、ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＤ１６結合部
位は、患者の内因性ＩｇＧにも自由に結合し得、このことは、該アプローチの魅力を低下
させる。該アプローチはまた、体内のＩｇＧの本質的に長い半減期（ヒトＩｇＧではおよ
そ２０日間）を考慮する必要があり、ＣＡＲ細胞活性の制御を制限する可能性がある。進
行中の研究はこのリスクを評価し得る。
【0007】
ＣＡＲ－Ｔ細胞アプローチおよび他の細胞ベースのアプローチのような、免疫細胞ベー
スの治療を調節（ダウンレギュレートまたはアップレギュレート）する代替方法を提供す
ることが望ましいであろう。自己免疫性の、炎症性の、および感染性の疾病および症状な
どの、内因性免疫細胞により媒介される疾病および症状に対処する方法を提供することも
また、望ましいであろう。
スの治療を調節（ダウンレギュレートまたはアップレギュレート）する代替方法を提供す
ることが望ましいであろう。自己免疫性の、炎症性の、および感染性の疾病および症状な
どの、内因性免疫細胞により媒介される疾病および症状に対処する方法を提供することも
また、望ましいであろう。
【発明の概要】
【0008】
本発明の記載
本発明は、本明細書の特許請求の範囲に記載される、誘導型ヌクレアーゼ（guided nuc
lease）、宿主細胞改変型（ＨＭ）－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ｇＲＮＡ、ＨＭ－
アレイ、ＨＭ－ｃｒＲＮＡ、ＨＭ－Ｃａｓ、ＨＭ－ＴＡＬＥＮ、ＨＭ－メガヌクレアーゼ
、ＨＭ－ジンクフィンガー、および方法を提供する。
本発明は、本明細書の特許請求の範囲に記載される、誘導型ヌクレアーゼ（guided nuc
lease）、宿主細胞改変型（ＨＭ）－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ｇＲＮＡ、ＨＭ－
アレイ、ＨＭ－ｃｒＲＮＡ、ＨＭ－Ｃａｓ、ＨＭ－ＴＡＬＥＮ、ＨＭ－メガヌクレアーゼ
、ＨＭ－ジンクフィンガー、および方法を提供する。
【0009】
医療行為は、しばしば、患者に抗生物質を投与することを包含する。これらの処置は、
典型的には、多くのグラム陽性菌種または多くのグラム陰性種を、区別することなく標的
とする抗生物質、すなわち、広域スペクトル抗生物質の投与を包含し得る。同様に、農業
（ｆａｒｍｉｎｇ）や農耕（ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）における広域スペクトル抗生物質
の使用は、健康に有害であり、微生物耐性を発展させる可能性のある、これらの抗生物質
のヒトおよび動物の食物連鎖への侵入を含む、環境問題を提起する。むしろ、本発明は、
第１の微生物叢種または株の選択的標的化を包含する。本明細書の実施例に示されるよう
に、選択された種のゲノムを標的とし、一方で、同時に系統学的に関連する種および株を
温存する、誘導型ヌクレアーゼを用いて、特定の細菌種の選択的標的化が達成された。さ
らに、本発明は、以下でさらに論じるように、ヒトおよび動物における免疫機能を形成す
る際に微生物叢の細菌および古細菌が果たす役割を実証している。
典型的には、多くのグラム陽性菌種または多くのグラム陰性種を、区別することなく標的
とする抗生物質、すなわち、広域スペクトル抗生物質の投与を包含し得る。同様に、農業
（ｆａｒｍｉｎｇ）や農耕（ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）における広域スペクトル抗生物質
の使用は、健康に有害であり、微生物耐性を発展させる可能性のある、これらの抗生物質
のヒトおよび動物の食物連鎖への侵入を含む、環境問題を提起する。むしろ、本発明は、
第１の微生物叢種または株の選択的標的化を包含する。本明細書の実施例に示されるよう
に、選択された種のゲノムを標的とし、一方で、同時に系統学的に関連する種および株を
温存する、誘導型ヌクレアーゼを用いて、特定の細菌種の選択的標的化が達成された。さ
らに、本発明は、以下でさらに論じるように、ヒトおよび動物における免疫機能を形成す
る際に微生物叢の細菌および古細菌が果たす役割を実証している。
【0010】
従って、本発明は、患者の微生物叢を変更することにより患者の免疫細胞（患者の内因
性細胞および／または（例えば養子細胞療法を介して）投与された細胞）を調節する方法
に関する。一例では、微生物叢（例えば、腸内微生物叢）中の種の有利な選択的標的化が
、該変更をもたらすために実行される。選択的標的化は、例えば、同じ門の種など、また
は同じ種の異なる株などの、関連する種または株の標的化を避けることができる。
性細胞および／または（例えば養子細胞療法を介して）投与された細胞）を調節する方法
に関する。一例では、微生物叢（例えば、腸内微生物叢）中の種の有利な選択的標的化が
、該変更をもたらすために実行される。選択的標的化は、例えば、同じ門の種など、また
は同じ種の異なる株などの、関連する種または株の標的化を避けることができる。
【0011】
例えば、本発明は、微生物叢を変更することによって、患者および対象における、疾病
および症状の免疫細胞ベースまたは他の治療を調節すること、並びに、これをもたらすた
めのシステム、キット、および他の手段を提供する。
および症状の免疫細胞ベースまたは他の治療を調節すること、並びに、これをもたらすた
めのシステム、キット、および他の手段を提供する。
【0012】
例えば、本発明は、微生物叢を変更することによって、患者において疾病および症状を
処置または軽減することを提供し、ここで、該疾病および症状は、免疫細胞（例えば、Ｔ
細胞）により媒介されるか、または、患者の免疫細胞活性または免疫細胞集団を変更する
ことにより対処される疾病および症状である。実施形態は、がん、自己免疫性の疾病もし
くは症状、炎症性の疾病もしくは症状、ウイルス感染症（例えば、ヒト患者のＨＩＶ感染
症）、または、ウイルス感染症により媒介されるか、あるいは、引き起こされる疾病もし
くは症状である。
処置または軽減することを提供し、ここで、該疾病および症状は、免疫細胞（例えば、Ｔ
細胞）により媒介されるか、または、患者の免疫細胞活性または免疫細胞集団を変更する
ことにより対処される疾病および症状である。実施形態は、がん、自己免疫性の疾病もし
くは症状、炎症性の疾病もしくは症状、ウイルス感染症（例えば、ヒト患者のＨＩＶ感染
症）、または、ウイルス感染症により媒介されるか、あるいは、引き起こされる疾病もし
くは症状である。
【0013】
本発明はまた、対象の微生物叢を変更することにより対象生物（例えば、植物、酵母、
ヒト、または動物患者）における処置または治療を調節する方法に関する。治療の例は、
例えば、患者における疾病または症状の処置または予防のための、養子細胞療法、抗体療
法(例えば、免疫チェックポイント阻害)、放射線療法、化学療法である。
ヒト、または動物患者）における処置または治療を調節する方法に関する。治療の例は、
例えば、患者における疾病または症状の処置または予防のための、養子細胞療法、抗体療
法(例えば、免疫チェックポイント阻害)、放射線療法、化学療法である。
【0014】
第１の構成において、本発明は、
患者において疾病または症状の治療を調節する方法であって、
ａ．患者において治療を実行すること；および
ｂ．患者において腸内細菌の微生物叢ディスバイオシスを引き起こし、それにより、該デ
ィスバイオシスが、患者において免疫細胞を調節することにより、患者において治療を調
節すること、
を含む方法を提供する。
患者において疾病または症状の治療を調節する方法であって、
ａ．患者において治療を実行すること；および
ｂ．患者において腸内細菌の微生物叢ディスバイオシスを引き起こし、それにより、該デ
ィスバイオシスが、患者において免疫細胞を調節することにより、患者において治療を調
節すること、
を含む方法を提供する。
【0015】
第１の構成の別の局面では、本発明は、
ヒトまたは動物患者において疾病または症状の治療を調節する方法であって、
ａ．患者において治療を実行すること；および
ｂ．患者において細菌の（例えば、腸内細菌の）微生物叢ディスバイオシスを引き起こし
、それにより、該ディスバイオシスが、患者において免疫細胞を調節することにより、患
者において治療を調節すること；
を含む方法を提供し、
ここで、治療は養子免疫細胞療法（例えば、養子Ｔ細胞療法、例えば、患者へのＣＡＲ－
Ｔ細胞の投与）を含む、
を含む方法を提供する。
ヒトまたは動物患者において疾病または症状の治療を調節する方法であって、
ａ．患者において治療を実行すること；および
ｂ．患者において細菌の（例えば、腸内細菌の）微生物叢ディスバイオシスを引き起こし
、それにより、該ディスバイオシスが、患者において免疫細胞を調節することにより、患
者において治療を調節すること；
を含む方法を提供し、
ここで、治療は養子免疫細胞療法（例えば、養子Ｔ細胞療法、例えば、患者へのＣＡＲ－
Ｔ細胞の投与）を含む、
を含む方法を提供する。
【0016】
第１の構成の別の局面では、本発明は、
ヒトまたは動物患者において疾病または症状の治療を調節する方法であって、
ａ．患者において治療を実行すること；および
ｂ．患者において細菌の（例えば、腸内細菌の）微生物叢ディスバイオシスを引き起こし
、それにより、該ディスバイオシスが患者において治療を調節すること；
を含む方法を提供し、
ここで、治療は、患者に免疫チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－
１、抗ＣＴＬＡ４または抗ＴＩＭ３阻害剤、例えば、抗体）を投与することを含む。
ヒトまたは動物患者において疾病または症状の治療を調節する方法であって、
ａ．患者において治療を実行すること；および
ｂ．患者において細菌の（例えば、腸内細菌の）微生物叢ディスバイオシスを引き起こし
、それにより、該ディスバイオシスが患者において治療を調節すること；
を含む方法を提供し、
ここで、治療は、患者に免疫チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－
１、抗ＣＴＬＡ４または抗ＴＩＭ３阻害剤、例えば、抗体）を投与することを含む。
【0017】
第１の構成の別の局面では、本発明は、
ヒトまたは動物患者において疾病または症状の治療を調節する方法であって、
ａ．患者において治療を実行すること；および
ｂ．患者において細菌の（例えば、腸内細菌の）微生物叢ディスバイオシスを引き起こし
、それにより、該ディスバイオシスが患者において治療を調節すること;
を含む方法を提供し、
ここで、治療は、患者に抗体（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－１、抗ＣＴＬＡ４もしく
は抗ＴＩＭ３抗体；または、抗ＴＮＦａスーパーファミリーメンバー抗体、例えば、抗Ｔ
ＮＦａ、ＴＮＦＲ１もしくはＢＡＦＦ抗体；または、抗ＩＬ６Ｒもしくは抗ＩＬ－４Ｒａ
抗体；または、抗ＰＣＳＫ９抗体）を投与することを含む。
ヒトまたは動物患者において疾病または症状の治療を調節する方法であって、
ａ．患者において治療を実行すること；および
ｂ．患者において細菌の（例えば、腸内細菌の）微生物叢ディスバイオシスを引き起こし
、それにより、該ディスバイオシスが患者において治療を調節すること;
を含む方法を提供し、
ここで、治療は、患者に抗体（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－１、抗ＣＴＬＡ４もしく
は抗ＴＩＭ３抗体；または、抗ＴＮＦａスーパーファミリーメンバー抗体、例えば、抗Ｔ
ＮＦａ、ＴＮＦＲ１もしくはＢＡＦＦ抗体；または、抗ＩＬ６Ｒもしくは抗ＩＬ－４Ｒａ
抗体；または、抗ＰＣＳＫ９抗体）を投与することを含む。
【0018】
第１の構成の別の局面では、本発明は、
対象において処置を調節する方法であって、
ａ．対象において処置を実行すること；および
ｂ．対象において微生物叢ディスバイオシスを引き起こし、それにより、該ディスバイオ
シスが対象において処置を調節すること、
を含む方法を提供する。
対象において処置を調節する方法であって、
ａ．対象において処置を実行すること；および
ｂ．対象において微生物叢ディスバイオシスを引き起こし、それにより、該ディスバイオ
シスが対象において処置を調節すること、
を含む方法を提供する。
【0019】
一例では、対象または患者はヒトである。一例では、対象または患者は非ヒトである。
一例では、対象は植物であり、場合により、処置は、植物生長促進処置、生長抑制処置、
農薬処置、窒素固定促進処置、除草処置または肥料処置である。一例では、対象は酵母で
あり、場合により、処置は、酵母の増殖促進処置または増殖抑制処置である。
一例では、対象は植物であり、場合により、処置は、植物生長促進処置、生長抑制処置、
農薬処置、窒素固定促進処置、除草処置または肥料処置である。一例では、対象は酵母で
あり、場合により、処置は、酵母の増殖促進処置または増殖抑制処置である。
【0020】
一例では、調節は、対象または患者の、処置または治療を、増大、アップレギュレート
、ダウンレギュレート、阻害、増強、または、強化する。一例では、処置または治療は、
対象または患者において有効であり、処置または治療は、対象、患者、または、調節を受
けていないコントロール対象もしくは患者において、有効でないか、有効性が低下または
増加している。コントロールは、対象または患者と同じ種であり、場合により、同じ年齢
および／または性別である。一例では、細菌または古細菌の宿主細胞は、本発明の方法を
用いて、対象または患者において死滅させるか、またはその増殖が阻害され、コントロー
ルは、同じ細菌または古細菌の種の細胞を含み、該細胞は本発明の方法により死滅しない
か、または、増殖が阻害されない。
、ダウンレギュレート、阻害、増強、または、強化する。一例では、処置または治療は、
対象または患者において有効であり、処置または治療は、対象、患者、または、調節を受
けていないコントロール対象もしくは患者において、有効でないか、有効性が低下または
増加している。コントロールは、対象または患者と同じ種であり、場合により、同じ年齢
および／または性別である。一例では、細菌または古細菌の宿主細胞は、本発明の方法を
用いて、対象または患者において死滅させるか、またはその増殖が阻害され、コントロー
ルは、同じ細菌または古細菌の種の細胞を含み、該細胞は本発明の方法により死滅しない
か、または、増殖が阻害されない。
【0021】
一例では、ステップ（ａ）および（ｂ）は、同時に実行される。一例では、ステップ（
ａ）は、ステップ（ｂ）の前に実行される。一例では、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ
）の前に実行され、場合により、ステップ（ｂ）は（ａ）の後に再度実施される。
ａ）は、ステップ（ｂ）の前に実行される。一例では、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ
）の前に実行され、場合により、ステップ（ｂ）は（ａ）の後に再度実施される。
【0022】
ある実施形態では、本発明は、
植物または酵母において処置を調節する方法であって、
ａ．植物または酵母において処置を実行すること；および
ｂ．植物または酵母において細菌の微生物叢ディスバイオシスを引き起こし、それにより
、該ディスバイオシスが対象において処置を調節すること；
を含む方法を提供し、
ここで、該処置は、生長促進処置、生長抑制処置、農薬処置、窒素固定促進処置、除草処
置または肥料処置である。
植物または酵母において処置を調節する方法であって、
ａ．植物または酵母において処置を実行すること；および
ｂ．植物または酵母において細菌の微生物叢ディスバイオシスを引き起こし、それにより
、該ディスバイオシスが対象において処置を調節すること；
を含む方法を提供し、
ここで、該処置は、生長促進処置、生長抑制処置、農薬処置、窒素固定促進処置、除草処
置または肥料処置である。
【0023】
対象、患者、植物または酵母において、微生物のディスバイオシスを引き起こすことは
、一例では、対象、患者、植物または酵母の表面上に、例えば、葉の表面上（対象が植物
の場合）、または、皮膚、肺、眼または粘膜の表面上（対象または患者がヒトまたは動物
の場合）に、微生物のディスバイオシスを引き起こすことを含む。
、一例では、対象、患者、植物または酵母の表面上に、例えば、葉の表面上（対象が植物
の場合）、または、皮膚、肺、眼または粘膜の表面上（対象または患者がヒトまたは動物
の場合）に、微生物のディスバイオシスを引き起こすことを含む。
【0024】
本発明は、細菌のディスバイオシスを引き起こすことに代えて、または、加えて、ステ
ップ（ｂ）において、対象、患者、植物または酵母において、古細菌の微生物叢ディスバ
イオシスを引き起こすことを含む。
ップ（ｂ）において、対象、患者、植物または酵母において、古細菌の微生物叢ディスバ
イオシスを引き起こすことを含む。
【0025】
例えば、疾病または症状は、自己免疫性の疾病または症状（例えば、ＳＬＥ）であり、
治療は、それらのための処置、例えば、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバ
ーアンタゴニスト（例えば、ＢＥＮＬＹＳＴＡ（商標）またはそのジェネリック薬などの
抗Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）抗体）の投与である。例えば、疾病または症状は、炎症
性の疾病または症状（例えば、関節リウマチ、ＩＢＤ、クローン病、大腸炎、または乾癬
）であり、治療は、それらのための処置、例えば、サリルマブ、デュピルマブ、腫瘍壊死
因子リガンドスーパーファミリーメンバーアンタゴニスト（例えば、ＨＵＭＩＲＡ（商標
）、ＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標）、ＳＹＭＰＯＮＩ（商標）またはＥＮＢＲＥＬ（商標）ま
たはそのジェネリック薬などの、抗ＴＮＦα抗体またはトラップ）の投与である。例えば
、疾病または症状は、ウイルス感染症であるか、または、ウイルス感染症（例えば、ＨＩ
Ｖ感染症）により媒介され、治療は、それらのための処置、例えば、レトロウイルス薬ま
たは抗ＨＩＶワクチンの投与である。例えば、疾病または症状はがん（例えば、メラノー
マ、ＮＳＣＬＣ、乳がんまたは膵臓がん）であり、治療はそれらのための処置、例えば、
化学療法薬（例えば、抗ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＬＡＧ３、Ｏ
Ｘ４０、ＣＤ２８、ＢＴＬＡ、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＫＩＲ、ＴＩＭ－３、
ＶＩＳＴＡ、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＴＩＧＩＴまたはＳＩＲＰａ抗体などの、チェックポ
イント阻害剤またはアゴニスト抗体）の投与である。一例では、抗体は、ＣＴＬＡ４、Ｐ
Ｄ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＬＡＧ３、ＯＸ４０、ＣＤ２８、ＢＴＬＡ、ＣＤ１３
７、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＫＩＲ、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＴＩ
ＧＩＴおよびＳＩＲＰａから選択される第１および第２の標的に特異的に結合する二重特
異性抗体であり、例えば、第１の標的がＣＴＬＡ４であり、第２の標的がＬＡＧ３または
ＰＤ－１である。場合により、抗体は、ヒトγ１抗体であり、および／または、ＡＤＣＣ
またはＣＤＣについて増強されてよい。例えば、治療はワクチン療法であり、例えば、が
んワクチン療法、または、マラリア、ＨＩＶ感染症、結核感染症、コレラ、ネズミチフス
菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）感染症、クロストリジウム・ディ
フィシル（Ｃ ｄｉｆｉｃｉｌｅ）感染症、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔ
ｕｓｓｉｓ）感染症もしくは、クラミジア感染症などの、感染症または感染性の疾病の処
置または予防のためのワクチン療法である。
治療は、それらのための処置、例えば、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバ
ーアンタゴニスト（例えば、ＢＥＮＬＹＳＴＡ（商標）またはそのジェネリック薬などの
抗Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）抗体）の投与である。例えば、疾病または症状は、炎症
性の疾病または症状（例えば、関節リウマチ、ＩＢＤ、クローン病、大腸炎、または乾癬
）であり、治療は、それらのための処置、例えば、サリルマブ、デュピルマブ、腫瘍壊死
因子リガンドスーパーファミリーメンバーアンタゴニスト（例えば、ＨＵＭＩＲＡ（商標
）、ＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標）、ＳＹＭＰＯＮＩ（商標）またはＥＮＢＲＥＬ（商標）ま
たはそのジェネリック薬などの、抗ＴＮＦα抗体またはトラップ）の投与である。例えば
、疾病または症状は、ウイルス感染症であるか、または、ウイルス感染症（例えば、ＨＩ
Ｖ感染症）により媒介され、治療は、それらのための処置、例えば、レトロウイルス薬ま
たは抗ＨＩＶワクチンの投与である。例えば、疾病または症状はがん（例えば、メラノー
マ、ＮＳＣＬＣ、乳がんまたは膵臓がん）であり、治療はそれらのための処置、例えば、
化学療法薬（例えば、抗ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＬＡＧ３、Ｏ
Ｘ４０、ＣＤ２８、ＢＴＬＡ、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＫＩＲ、ＴＩＭ－３、
ＶＩＳＴＡ、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＴＩＧＩＴまたはＳＩＲＰａ抗体などの、チェックポ
イント阻害剤またはアゴニスト抗体）の投与である。一例では、抗体は、ＣＴＬＡ４、Ｐ
Ｄ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＬＡＧ３、ＯＸ４０、ＣＤ２８、ＢＴＬＡ、ＣＤ１３
７、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＫＩＲ、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＴＩ
ＧＩＴおよびＳＩＲＰａから選択される第１および第２の標的に特異的に結合する二重特
異性抗体であり、例えば、第１の標的がＣＴＬＡ４であり、第２の標的がＬＡＧ３または
ＰＤ－１である。場合により、抗体は、ヒトγ１抗体であり、および／または、ＡＤＣＣ
またはＣＤＣについて増強されてよい。例えば、治療はワクチン療法であり、例えば、が
んワクチン療法、または、マラリア、ＨＩＶ感染症、結核感染症、コレラ、ネズミチフス
菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）感染症、クロストリジウム・ディ
フィシル（Ｃ ｄｉｆｉｃｉｌｅ）感染症、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔ
ｕｓｓｉｓ）感染症もしくは、クラミジア感染症などの、感染症または感染性の疾病の処
置または予防のためのワクチン療法である。
【0026】
第１の構成のある実施形態は、
患者において疾病または症状の細胞療法を調節する方法であって、
ａ．細胞集団を患者に投与することを含み、該細胞の投与は、患者の疾病または症状を治
療することができる、患者において細胞療法を実行すること；および
ｂ．腸内細菌の微生物叢ディスバイオシスを患者において引き起こし、それにより、該デ
ィスバイオシスが患者において細胞療法を調節すること
を含む方法を提供する。
患者において疾病または症状の細胞療法を調節する方法であって、
ａ．細胞集団を患者に投与することを含み、該細胞の投与は、患者の疾病または症状を治
療することができる、患者において細胞療法を実行すること；および
ｂ．腸内細菌の微生物叢ディスバイオシスを患者において引き起こし、それにより、該デ
ィスバイオシスが患者において細胞療法を調節すること
を含む方法を提供する。
【0027】
一例では、細胞療法は、がんの処置のための、ＣＡＲ－ＴまたはＴＩＬ療法などの、養
子免疫細胞療法である。
子免疫細胞療法である。
【0028】
第２の構成において、本発明は、
疾病または症状が患者において免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）によって媒介されている患者
の疾患または状態のリスクを処置または軽減する方法であって、該方法は、該患者に腸内
細菌微生物叢ディスバイオシスを引き起こし、それにより、該ディスバイオシスが、患者
において免疫細胞（例えば、Ｔｈ１７細胞）を調節し、それにより患者における該疾病ま
たは症状のリスクを処置または軽減することを含む方法を、提供する。
疾病または症状が患者において免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）によって媒介されている患者
の疾患または状態のリスクを処置または軽減する方法であって、該方法は、該患者に腸内
細菌微生物叢ディスバイオシスを引き起こし、それにより、該ディスバイオシスが、患者
において免疫細胞（例えば、Ｔｈ１７細胞）を調節し、それにより患者における該疾病ま
たは症状のリスクを処置または軽減することを含む方法を、提供する。
【0029】
例えば、疾病または症状は、自己免疫性の疾病または症状（例えば、ＳＬＥ）、炎症性
の疾病または症状（例えば、関節リウマチ、ＩＢＤ、クローン病、大腸炎または乾癬）、
ウイルス感染症であるか、あるいは、ウイルス感染症（例えば、ＨＩＶ感染症）により媒
介される。
の疾病または症状（例えば、関節リウマチ、ＩＢＤ、クローン病、大腸炎または乾癬）、
ウイルス感染症であるか、あるいは、ウイルス感染症（例えば、ＨＩＶ感染症）により媒
介される。
【0030】
一例では、微生物叢ディスバイオシスは、微生物叢において１つ以上の標的細菌種を死
滅させることによって、あるいは、微生物叢において該古細菌の集団の増殖を阻害するこ
とによって、もたらされる。一例では、微生物叢ディスバイオシスは、微生物叢において
１つ以上の標的古細菌種を死滅させることによって、あるいは、微生物叢において該細菌
の集団の増殖を阻害することによって、もたらされる。
滅させることによって、あるいは、微生物叢において該古細菌の集団の増殖を阻害するこ
とによって、もたらされる。一例では、微生物叢ディスバイオシスは、微生物叢において
１つ以上の標的古細菌種を死滅させることによって、あるいは、微生物叢において該細菌
の集団の増殖を阻害することによって、もたらされる。
【0031】
第３の構成では、本発明は、
患者において疾病または症状の養子免疫細胞療法を調節する方法であって、
ａ．免疫細胞の集団を患者に投与することを含む、養子免疫細胞療法を患者において実行
すること、ここで、該免疫細胞の投与は、患者において疾病または症状を処置することが
可能である；および、
ｂ．患者の微生物叢（例えば、腸内微生物叢）において、第１の細菌種もしくは株、また
は、古細菌種もしくは株の細胞の亜集団の相対的割合を変更し、それにより、患者におい
て免疫細胞療法を調節する変更された微生物叢を産生すること、
を含む方法を提供する。
患者において疾病または症状の養子免疫細胞療法を調節する方法であって、
ａ．免疫細胞の集団を患者に投与することを含む、養子免疫細胞療法を患者において実行
すること、ここで、該免疫細胞の投与は、患者において疾病または症状を処置することが
可能である；および、
ｂ．患者の微生物叢（例えば、腸内微生物叢）において、第１の細菌種もしくは株、また
は、古細菌種もしくは株の細胞の亜集団の相対的割合を変更し、それにより、患者におい
て免疫細胞療法を調節する変更された微生物叢を産生すること、
を含む方法を提供する。
【0032】
第３の構成の別の局面では、本発明は、
ヒトまたは動物患者において疾病または症状の治療を調節する方法であって、
ａ．患者において治療を実行すること；および
ｂ．患者の微生物叢（例えば、腸内微生物叢）において、第１の細菌種もしくは株、また
は、古細菌種もしくは株の細胞の亜集団の相対的割合を変更し、それにより、患者におい
て治療を調節する、変更された微生物叢を産生すること；
を含む方法を提供し、
ここで、治療は、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－１、抗
ＣＴＬＡ４または抗ＴＩＭ３阻害剤、例えば、抗体）を投与することを含む。
ヒトまたは動物患者において疾病または症状の治療を調節する方法であって、
ａ．患者において治療を実行すること；および
ｂ．患者の微生物叢（例えば、腸内微生物叢）において、第１の細菌種もしくは株、また
は、古細菌種もしくは株の細胞の亜集団の相対的割合を変更し、それにより、患者におい
て治療を調節する、変更された微生物叢を産生すること；
を含む方法を提供し、
ここで、治療は、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－１、抗
ＣＴＬＡ４または抗ＴＩＭ３阻害剤、例えば、抗体）を投与することを含む。
【0033】
第３の構成の別の局面では、本発明は、
ヒトまたは動物患者において疾病または症状の治療を調節する方法であって、
ａ．患者において治療を実行すること；および
ｂ．患者の微生物叢（例えば、腸内微生物叢）において、第１の細菌種もしくは株、また
は、古細菌種もしくは株の細胞の亜集団の相対的割合を変更し、それにより、患者におい
て治療を調節する、変更された微生物叢を産生すること；
を含む方法を提供し、
ここで、治療は、抗体（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－１、抗ＣＴＬＡ４もしくは抗Ｔ
ＩＭ３抗体；または、抗ＴＮＦａスーパーファミリーメンバー抗体、例えば、抗ＴＮＦａ
、ＴＮＦＲ１もしくはＢＡＦＦ抗体；または、抗ＩＬ６Ｒもしくは抗ＩＬ－４Ｒａ抗体；
または、抗ＰＣＳＫ９抗体）を患者に投与することを含む。
ヒトまたは動物患者において疾病または症状の治療を調節する方法であって、
ａ．患者において治療を実行すること；および
ｂ．患者の微生物叢（例えば、腸内微生物叢）において、第１の細菌種もしくは株、また
は、古細菌種もしくは株の細胞の亜集団の相対的割合を変更し、それにより、患者におい
て治療を調節する、変更された微生物叢を産生すること；
を含む方法を提供し、
ここで、治療は、抗体（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－１、抗ＣＴＬＡ４もしくは抗Ｔ
ＩＭ３抗体；または、抗ＴＮＦａスーパーファミリーメンバー抗体、例えば、抗ＴＮＦａ
、ＴＮＦＲ１もしくはＢＡＦＦ抗体；または、抗ＩＬ６Ｒもしくは抗ＩＬ－４Ｒａ抗体；
または、抗ＰＣＳＫ９抗体）を患者に投与することを含む。
【0034】
第３の構成の別の局面では、本発明は、
対象において処置を調節する方法であって、
ａ．対象において処置を実行すること；および
ｂ．対象の微生物叢において、第１の細菌種もしくは株、または、古細菌種もしくは株の
細胞の亜集団の相対的割合を変更し、それにより該ディスバイオシスが対象において処置
を調節すること、
を含む方法を提供する。
対象において処置を調節する方法であって、
ａ．対象において処置を実行すること；および
ｂ．対象の微生物叢において、第１の細菌種もしくは株、または、古細菌種もしくは株の
細胞の亜集団の相対的割合を変更し、それにより該ディスバイオシスが対象において処置
を調節すること、
を含む方法を提供する。
【0035】
一例では、対象または患者はヒトである。一例では、対象または患者は非ヒト動物であ
る。一例では、対象は植物であり、場合により、処置は、植物生長促進処置、生長抑制処
置、農薬処置、窒素固定促進処置、除草処置または肥料処置である。一例では、対象は酵
母であり、場合により、処置は、酵母の増殖促進処置、または増殖抑制処置である。
る。一例では、対象は植物であり、場合により、処置は、植物生長促進処置、生長抑制処
置、農薬処置、窒素固定促進処置、除草処置または肥料処置である。一例では、対象は酵
母であり、場合により、処置は、酵母の増殖促進処置、または増殖抑制処置である。
【0036】
一例では、調節は、対象または患者の、処置または治療を、増大、アップレギュレート
、ダウンレギュレート、阻害、増強、または、強化する。一例では、一例では、処置また
は治療は、対象または患者において有効であり、処置または治療は、調節を受けていない
対象、患者、または、コントロール対象もしくは患者において、有効でないか、有効性が
低下または増加している。コントロールは、対象または患者と同じ種であり、場合により
、同じ年齢および／または性別である。一例では、細菌または古細菌の宿主細胞は、本発
明の方法を用いて、対象または患者において死滅させるか、またはその増殖が阻害され、
コントロールは、同じ細菌または古細菌の種の細胞を含み、該細胞は本発明の方法により
死滅しないか、または、増殖が阻害されない。
、ダウンレギュレート、阻害、増強、または、強化する。一例では、一例では、処置また
は治療は、対象または患者において有効であり、処置または治療は、調節を受けていない
対象、患者、または、コントロール対象もしくは患者において、有効でないか、有効性が
低下または増加している。コントロールは、対象または患者と同じ種であり、場合により
、同じ年齢および／または性別である。一例では、細菌または古細菌の宿主細胞は、本発
明の方法を用いて、対象または患者において死滅させるか、またはその増殖が阻害され、
コントロールは、同じ細菌または古細菌の種の細胞を含み、該細胞は本発明の方法により
死滅しないか、または、増殖が阻害されない。
【0037】
一例では、ステップ（ａ）および（ｂ）は、同時に実行される。一例では、ステップ（
ａ）は、ステップ（ｂ）の前に実行される。一例では、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ
）の前に実行され、場合により、ステップ（ｂ）は（ａ）の後に再度実施される。
ａ）は、ステップ（ｂ）の前に実行される。一例では、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ
）の前に実行され、場合により、ステップ（ｂ）は（ａ）の後に再度実施される。
【0038】
ある実施形態では、本発明は、
植物または酵母において処置を調節する方法であって、
ａ．植物または酵母において処置を実行すること；および
ｂ．植物または酵母の微生物叢において、第１の細菌種もしくは株、または、古細菌種も
しくは株の細胞の亜集団の相対的割合を変更し、それにより、植物または酵母において処
置を調節すること；
を含む方法を提供し、
ここで、該処置は、生長促進処置、生長抑制処置、農薬処置、窒素固定促進処置、除草処
置または肥料処置である。
植物または酵母において処置を調節する方法であって、
ａ．植物または酵母において処置を実行すること；および
ｂ．植物または酵母の微生物叢において、第１の細菌種もしくは株、または、古細菌種も
しくは株の細胞の亜集団の相対的割合を変更し、それにより、植物または酵母において処
置を調節すること；
を含む方法を提供し、
ここで、該処置は、生長促進処置、生長抑制処置、農薬処置、窒素固定促進処置、除草処
置または肥料処置である。
【0039】
対象、患者、植物または酵母において、細胞の亜集団の相対的割合を前記の通り変更す
ることは、一例では、対象、患者、植物または酵母の表面上に、例えば、葉の表面上（対
象が植物の場合）、または、皮膚、肺、眼または粘膜の表面上（対象または患者がヒトま
たは動物の場合）に、微生物のディスバイオシスを引き起こすことである。
ることは、一例では、対象、患者、植物または酵母の表面上に、例えば、葉の表面上（対
象が植物の場合）、または、皮膚、肺、眼または粘膜の表面上（対象または患者がヒトま
たは動物の場合）に、微生物のディスバイオシスを引き起こすことである。
【0040】
第１の細菌または古細菌の亜集団の割合は、増加または減少される。一例では、第１の
細菌種または株と、第２の細菌種または株との相対的比率が変更される（例えば、増加ま
たは減少される）；あるいは、第１の古細菌種または株と、第２の古細菌種または株との
相対的比率が変更される（例えば、増加または減少される）。
細菌種または株と、第２の細菌種または株との相対的比率が変更される（例えば、増加ま
たは減少される）；あるいは、第１の古細菌種または株と、第２の古細菌種または株との
相対的比率が変更される（例えば、増加または減少される）。
【0041】
一例では、養子免疫細胞療法は、がんの処置のためのＣＡＲ－Ｔ療法である。一例では
、養子免疫細胞療法は、がんの処置のためのＴＩＬ療法である。
、養子免疫細胞療法は、がんの処置のためのＴＩＬ療法である。
【0042】
第１または第３の構成の一例では、ステップ（ａ）の細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８
＋Ｔ細胞、Ｔｈ１細胞またはＴｈ１７細胞からなる群から選択される第１のタイプの細胞
であり、ステップ（ｂ）は患者においてそのタイプの細胞をアップレギュレートする。こ
れは、細胞ベースの治療を増強するのに有用である。別の例では、ステップ（ａ）の細胞
は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｈ１細胞またはＴｈ１７細胞からなる群から選
択される第１のタイプの細胞であり、ステップ（ｂ）は患者においてそのタイプの細胞を
ダウンレギュレートする。これは、細胞ベースの治療またはその副作用（例えば、ＣＲＳ
）を弱めるのに有用である。
＋Ｔ細胞、Ｔｈ１細胞またはＴｈ１７細胞からなる群から選択される第１のタイプの細胞
であり、ステップ（ｂ）は患者においてそのタイプの細胞をアップレギュレートする。こ
れは、細胞ベースの治療を増強するのに有用である。別の例では、ステップ（ａ）の細胞
は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｈ１細胞またはＴｈ１７細胞からなる群から選
択される第１のタイプの細胞であり、ステップ（ｂ）は患者においてそのタイプの細胞を
ダウンレギュレートする。これは、細胞ベースの治療またはその副作用（例えば、ＣＲＳ
）を弱めるのに有用である。
【0043】
ある実施形態では、ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）は、微生物叢（例えば、腸
内微生物叢）細菌および／または古細菌を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを用いた、細
菌または古細菌の微生物叢亜集団の選択的標的化を用いて、実行される。一例では、本方
法は、宿主細胞においてそれぞれの標的配列を切断して、標的配列を改変する、誘導型ヌ
クレアーゼ(例えば、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ)を用い、それにより、宿主細胞が死滅す
るか、宿主細胞集団の増殖が低下し、それにより、微生物叢における該亜集団の割合を低
減させることを含む。誘導型ヌクレアーゼ切断を実行するための好適なシステムは、例え
ば、操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼおよびジ
ンクフィンガーシステムである。
内微生物叢）細菌および／または古細菌を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを用いた、細
菌または古細菌の微生物叢亜集団の選択的標的化を用いて、実行される。一例では、本方
法は、宿主細胞においてそれぞれの標的配列を切断して、標的配列を改変する、誘導型ヌ
クレアーゼ(例えば、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ)を用い、それにより、宿主細胞が死滅す
るか、宿主細胞集団の増殖が低下し、それにより、微生物叢における該亜集団の割合を低
減させることを含む。誘導型ヌクレアーゼ切断を実行するための好適なシステムは、例え
ば、操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼおよびジ
ンクフィンガーシステムである。
【0044】
この目的のために、発明者らは、以下の特徴の１つ以上を伴った、腸内微生物叢におい
て天然に共生する細菌の混合共同体における、特定の細菌株の集団増殖阻害を初めて証明
したと信じている：
操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いた集団増殖阻害が、
・野生型細胞を標的とすること；
・野生型内因性Ｃａｓヌクレアーゼ活性を利用すること；
・必須および抗生物質耐性遺伝子を標的とすること；
・ここで、標的が野生型配列であること、
によること。
て天然に共生する細菌の混合共同体における、特定の細菌株の集団増殖阻害を初めて証明
したと信じている：
操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いた集団増殖阻害が、
・野生型細胞を標的とすること；
・野生型内因性Ｃａｓヌクレアーゼ活性を利用すること；
・必須および抗生物質耐性遺伝子を標的とすること；
・ここで、標的が野生型配列であること、
によること。
【0045】
発明者らは、以下の特徴を伴った、ヒト腸内微生物叢細菌の混合集団において、このこ
とを証明した：
・ヒト腸内微生物叢種の混合集団における、細菌増殖阻害を標的とすること；
・ここで、該集団が３つの異なる種を含むこと；
・これらの種の１つを選択的に死滅させ、他の種の細胞を温存すること；
・系統発生学的に近い他のヒト腸内細菌叢種の存在下での細胞増殖阻害を標的とし、該種
はこの阻害を免れる；
・ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）種および非ファーミキューテス門（Ｆ
ｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）種を含む、ヒト腸内微生物叢細菌の混合集団において、細胞増殖阻
害を標的とすること；
・ヒト腸内微生物叢細菌の混合集団において、特定のファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉ
ｃｕｔｅｓ）種の細胞増殖阻害を標的とし、一方で、異なるファーミキューテス門（Ｆｉ
ｒｍｉｃｕｔｅｓ）種を温存すること；
・ヒト腸内微生物叢細菌の混合集団において、特定のグラム陽性細菌株の細胞増殖阻害を
標的とし、一方で、異なるグラム陽性細菌種を温存すること；
・あるヒト腸内微生物叢細菌種を標的とし、一方で、片利共生のヒト腸内細菌種を温存す
ること；
・ヒト腸内微生物叢細菌種を標的とし、一方で、プロバイオティックヒト腸内細菌種を温
存すること；
・表面上のヒト腸内微生物叢細菌の混合集団において細胞増殖阻害を標的とすること；
・特定の細菌種単独で、または、ヒト腸内微生物叢細菌の共同体において、複数の他の細
菌種と混合された場合に、少なくとも１０倍の増殖阻害を達成すること；および
・特定のヒト腸内微生物叢細菌種の２つの異なる株の、少なくとも１０倍の増殖阻害を達
成すること。
とを証明した：
・ヒト腸内微生物叢種の混合集団における、細菌増殖阻害を標的とすること；
・ここで、該集団が３つの異なる種を含むこと；
・これらの種の１つを選択的に死滅させ、他の種の細胞を温存すること；
・系統発生学的に近い他のヒト腸内細菌叢種の存在下での細胞増殖阻害を標的とし、該種
はこの阻害を免れる；
・ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）種および非ファーミキューテス門（Ｆ
ｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）種を含む、ヒト腸内微生物叢細菌の混合集団において、細胞増殖阻
害を標的とすること；
・ヒト腸内微生物叢細菌の混合集団において、特定のファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉ
ｃｕｔｅｓ）種の細胞増殖阻害を標的とし、一方で、異なるファーミキューテス門（Ｆｉ
ｒｍｉｃｕｔｅｓ）種を温存すること；
・ヒト腸内微生物叢細菌の混合集団において、特定のグラム陽性細菌株の細胞増殖阻害を
標的とし、一方で、異なるグラム陽性細菌種を温存すること；
・あるヒト腸内微生物叢細菌種を標的とし、一方で、片利共生のヒト腸内細菌種を温存す
ること；
・ヒト腸内微生物叢細菌種を標的とし、一方で、プロバイオティックヒト腸内細菌種を温
存すること；
・表面上のヒト腸内微生物叢細菌の混合集団において細胞増殖阻害を標的とすること；
・特定の細菌種単独で、または、ヒト腸内微生物叢細菌の共同体において、複数の他の細
菌種と混合された場合に、少なくとも１０倍の増殖阻害を達成すること；および
・特定のヒト腸内微生物叢細菌種の２つの異なる株の、少なくとも１０倍の増殖阻害を達
成すること。
【0046】
本発明は、患者において疾病または症状を治療または予防するための患者の養子細胞療
法の方法における使用のための、免疫細胞のエクスビボ集団を提供し、該方法は、
ａ．該集団の細胞を患者に投与することを含む養子免疫細胞療法を患者において実行する
こと、ここで、該免疫細胞の投与は、患者において疾病または症状を処置することが可能
である；および
ｂ．腸内細菌の微生物叢ディスバイオシスを患者において引き起こし、それにより、該デ
ィスバイオシスが、患者において免疫細胞療法を調節し、該疾病または症状が処置または
予防されること：
を含む。
法の方法における使用のための、免疫細胞のエクスビボ集団を提供し、該方法は、
ａ．該集団の細胞を患者に投与することを含む養子免疫細胞療法を患者において実行する
こと、ここで、該免疫細胞の投与は、患者において疾病または症状を処置することが可能
である；および
ｂ．腸内細菌の微生物叢ディスバイオシスを患者において引き起こし、それにより、該デ
ィスバイオシスが、患者において免疫細胞療法を調節し、該疾病または症状が処置または
予防されること：
を含む。
【0047】
本発明は、患者において疾病または症状を治療または予防するための患者の養子細胞療
法の方法における使用のための、免疫細胞のエクスビボ集団を提供し、該方法は、
ａ．該集団の細胞を患者に投与することを含む養子免疫細胞療法を患者において実行する
こと、ここで、該免疫細胞の投与は、患者において疾病または症状を処置することが可能
である;および
ｂ．患者の腸内微生物叢において、第１の細菌種もしくは株、または、古細菌種もしくは
株の細胞の亜集団の相対的割合を変更し、それにより、患者において免疫細胞療法を調節
する変更された腸内微生物叢を産生すること、
を提供する。
本発明はまたは、本発明の方法を実行するための、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、アレ
イ、ｃＲＮＡおよびキットを提供する。
法の方法における使用のための、免疫細胞のエクスビボ集団を提供し、該方法は、
ａ．該集団の細胞を患者に投与することを含む養子免疫細胞療法を患者において実行する
こと、ここで、該免疫細胞の投与は、患者において疾病または症状を処置することが可能
である;および
ｂ．患者の腸内微生物叢において、第１の細菌種もしくは株、または、古細菌種もしくは
株の細胞の亜集団の相対的割合を変更し、それにより、患者において免疫細胞療法を調節
する変更された腸内微生物叢を産生すること、
を提供する。
本発明はまたは、本発明の方法を実行するための、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、アレ
イ、ｃＲＮＡおよびキットを提供する。
【0048】
本発明はまた、本方法を実施するためのシステム、キットおよび他の手段に関する。
【0049】
一例では、本明細書中の１つの構成上の任意の特徴は、本発明の異なる構成と組み合わ
されて、本明細書の１つ以上の特許請求の範囲においてこれらの組合せを含むことができ
る。
されて、本明細書の１つ以上の特許請求の範囲においてこれらの組合せを含むことができ
る。
【図面の簡単な説明】
【0050】
【0051】
【0052】
【0053】
【0054】
【0055】
【0056】
【0057】
【0058】
【0059】
【0060】
【0061】
【図12】図１２は、ｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ＣＲＩＳＰＲ－ＰｘｙｌＡまたはｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ＣＲＩＳＰＲ－ＰｌｄｈＡ＋ＸｙｌＡプラスミドのいずれかを有するＥ．ｃｏｌｉ、Ｌ．ｌａｃｔｉｓおよびＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの共培養物におけるＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの選択的増殖阻害を示す。ｐＢＡＶ１ＫＴ５ － ＸｙｌＲ － ＣＲＩＳＰＲ － ＰｘｙｌＡまたはｐＢＡＶ１ＫＴ５ － ＸｙｌＲ － ＣＲＩＳＰＲ － ＰｌｄｈＡ ＋ ＸｙｌＡプラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ（中央の列）の間で増殖の違いは観察されない。しかしながら、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（２．５μｌ／１ ＰＥＡを添加したＴＨ寒天プレート上で選択的に増殖させた）は、ｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ＣＲＩＳＰＲ－ＰｘｙｌＡ（強い）またはｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ＣＲＩＳＰＲ－ＰｌｄｈＡ（弱い）プラスミドの間で、予想通り形質転換効率の低下を示す。従って、細胞の混合集団における標的とするＳ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ亜集団の選択的増殖阻害を実証した。コロニー数は左下の角に記載した（上の行：＞１０００、＞１０００、６８：下の行：＞１０００、＞１０００、３２）。
【0062】
【0063】
【0064】
【0065】
【図16】図１６は、異なる選択培地上の、１０００倍希釈のスポットアッセイを示す。２．５ｇ／ｌのＰＥＡを有するＴＨは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ単独のための選択的培地である。マルトースを添加したマッコンキーは、グラム陰性菌と腸内桿菌を選択的に単離し、それらをマルトース発酵に基づいて区別するように設計された、細菌用の選択的かつ差次的（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）培養培地である。従って、ＴＯＰ１０ΔｍａｌＫ変異体は、プレート上に白いコロニーを形成し、一方Ｎｉｓｓｌｅは、ピンクのコロニーを形成する；ＡはＥ ｃｏｌｉ ΔｍａｌＫ、ＢはＥ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｉｌｅ、ＣはＢ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、ＤはＬ ｌａｃｔｉｓ、Ｅは混合培養液である；マッコンキー－のＢとＥの画像はピンクに見える；マッコンキー＋のＢとＥの画像はピンクに見える。
【0066】
【発明を実施するための形態】
【0067】
詳細な説明
以下の実施例において、増殖阻害を、ヒト腸内微生物叢細菌種の混合集団において、調
べた。共同体において、選択的に標的化された種（グラム陽性ファーミキューテス門（Ｆ
ｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）集団）の、１０倍を超える集団増殖阻害が達成され、非標的化共生
細菌が温存された。発明者らは、腸内微生物叢などの微生物叢を患者のin situで改変し
、それにより、微生物叢の変化に応答して患者において免疫細胞調節を可能にするための
、これの有用な適用を実現した。発明者らはまた、変化され得る微生物叢を含む、植物お
よび酵母などの対象において、処置を調節することに対する適用を実現した。発明者らは
、さらに、自己免疫性の疾病、炎症性の疾病およびウイルス感染症（例えば、ヒトのＨＩ
Ｖ感染症）などの、患者において免疫細胞ベースの治療を調節するため、または患者にお
いて免疫細胞媒介性の疾病または症状を治療または予防するための、実用化を実現した。
発明者らは、ヒトまたは動物の対象または患者において該調節をもたらすための、腸、皮
膚、膣、鼻、眼、肺、消化管、直腸、陰嚢、耳、皮膚または毛髪のディスバイオシスを引
き起こすことの実用化を実現した。
以下の実施例において、増殖阻害を、ヒト腸内微生物叢細菌種の混合集団において、調
べた。共同体において、選択的に標的化された種（グラム陽性ファーミキューテス門（Ｆ
ｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）集団）の、１０倍を超える集団増殖阻害が達成され、非標的化共生
細菌が温存された。発明者らは、腸内微生物叢などの微生物叢を患者のin situで改変し
、それにより、微生物叢の変化に応答して患者において免疫細胞調節を可能にするための
、これの有用な適用を実現した。発明者らはまた、変化され得る微生物叢を含む、植物お
よび酵母などの対象において、処置を調節することに対する適用を実現した。発明者らは
、さらに、自己免疫性の疾病、炎症性の疾病およびウイルス感染症（例えば、ヒトのＨＩ
Ｖ感染症）などの、患者において免疫細胞ベースの治療を調節するため、または患者にお
いて免疫細胞媒介性の疾病または症状を治療または予防するための、実用化を実現した。
発明者らは、ヒトまたは動物の対象または患者において該調節をもたらすための、腸、皮
膚、膣、鼻、眼、肺、消化管、直腸、陰嚢、耳、皮膚または毛髪のディスバイオシスを引
き起こすことの実用化を実現した。
【0068】
本明細書で用いられる場合、「ディスバイオシス」は、微生物叢（例えば、腸内微生物
叢）の、細菌および／または古細菌のバランスの変化を指す。該変化は、該方法を実行す
る前の（例えば、実行する直前、または、実行する前の１日未満の）バランスとの相対的
なものである。該変化は、（ｉ）微生物叢（例えば、腸内微生物叢）（例えば、Ｂ ｆｒ
ａｇａｌｉｓまたはｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ）における、第１の種（細菌または
古細菌の種）または株の割合の増加；（ｉｉ）第１の種と第２の種（例えば、Ｂ ｆｒａ
ｇａｌｉｓ対Ｃ ｄｉｆｉｃｉｌｅ、または、Ｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ対Ｅ ｃｏ
ｌｉもしくはＬ ｌａｃｔｉｓ）、同じ種の第１の株と第２の株、または、互いに異なる
第１の門と第２の門（例えば、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｔｅｓ）対ファ
ーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ））の相対的割合の増加；（ｉｉｉ）処置方法
の前には、微生物叢に含まれなかった種または株の添加；（ｉｖ）微生物叢における、第
１の種（細菌または古細菌の種）または株（例えば、 Ｃ ｄｉｆｉｃｉｌｅまたはＳ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の割合の減少；（ｖ）第１の種と第２の種（例えば、Ｂ ｆ
ｒａｇａｌｉｓ対Ｃ ｄｉｆｉｃｉｌｅ、または、Ｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ対Ｅ
ｃｏｌｉ もしくはＬ ｌａｃｔｉｓ）、同じ種の第１の株と第２の株、または、互いに
異なる第１の門と第２の門（例えば、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｔｅｓ）
対ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ））の相対的割合の減少；および（ｖｉ
）処置方法の前には、微生物叢に含まれなかった種または株の除去のうちの１つ以上であ
り得る。
叢）の、細菌および／または古細菌のバランスの変化を指す。該変化は、該方法を実行す
る前の（例えば、実行する直前、または、実行する前の１日未満の）バランスとの相対的
なものである。該変化は、（ｉ）微生物叢（例えば、腸内微生物叢）（例えば、Ｂ ｆｒ
ａｇａｌｉｓまたはｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ）における、第１の種（細菌または
古細菌の種）または株の割合の増加；（ｉｉ）第１の種と第２の種（例えば、Ｂ ｆｒａ
ｇａｌｉｓ対Ｃ ｄｉｆｉｃｉｌｅ、または、Ｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ対Ｅ ｃｏ
ｌｉもしくはＬ ｌａｃｔｉｓ）、同じ種の第１の株と第２の株、または、互いに異なる
第１の門と第２の門（例えば、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｔｅｓ）対ファ
ーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ））の相対的割合の増加；（ｉｉｉ）処置方法
の前には、微生物叢に含まれなかった種または株の添加；（ｉｖ）微生物叢における、第
１の種（細菌または古細菌の種）または株（例えば、 Ｃ ｄｉｆｉｃｉｌｅまたはＳ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の割合の減少；（ｖ）第１の種と第２の種（例えば、Ｂ ｆ
ｒａｇａｌｉｓ対Ｃ ｄｉｆｉｃｉｌｅ、または、Ｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ対Ｅ
ｃｏｌｉ もしくはＬ ｌａｃｔｉｓ）、同じ種の第１の株と第２の株、または、互いに
異なる第１の門と第２の門（例えば、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｔｅｓ）
対ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ））の相対的割合の減少；および（ｖｉ
）処置方法の前には、微生物叢に含まれなかった種または株の除去のうちの１つ以上であ
り得る。
【0069】
免疫システムが微生物叢の組成に及ぼす影響は、病気にかかりやすいように微生物群を
変えるいくつかの免疫不全によって示唆されている。例えば、Garrett et al．は、自然
免疫系と適応免疫系の両方の細胞における炎症性の応答を支配する転写因子T－bet（Tbx2
1によってコードされる）を欠くマウスを研究した(Cell. 2007 Oct 5;131(1):33－45, “
Communicable ulcerative colitis induced by T－bet deficiency in the innate immun
e system”, Garrett WS et al.)。適応免疫を欠くＲａｇ２－／－マウスにＴｂｘ２１－
／－マウスを交配させると、Ｔｂｘ２１－／－／Ｒａｇ２－／－子孫は微生物叢依存的に
潰瘍性大腸炎を発症した。驚くべきことに、この大腸炎の表現型は、Ｔｂｘ２１－／－／
Ｒａｇ２－／－微生物叢の養子移入により、野生型マウスに伝達可能であった。このこと
は、変化した微生物叢が、疾病を誘導するのに十分であることを実証した。免疫由来のデ
ィスバイオシスの別の例は、インフラマソーム成分ＮＬＲＰ６の上皮細胞発現が欠損して
いるマウスにおいて見られる。これらのマウスは、腸炎症性細胞の動員および化学的に誘
発される大腸炎への感受性の増加に関連するバクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔ
ｅｓ）のメンバーの存在量の増加を伴う変化した微生物叢を発生させる。
変えるいくつかの免疫不全によって示唆されている。例えば、Garrett et al．は、自然
免疫系と適応免疫系の両方の細胞における炎症性の応答を支配する転写因子T－bet（Tbx2
1によってコードされる）を欠くマウスを研究した(Cell. 2007 Oct 5;131(1):33－45, “
Communicable ulcerative colitis induced by T－bet deficiency in the innate immun
e system”, Garrett WS et al.)。適応免疫を欠くＲａｇ２－／－マウスにＴｂｘ２１－
／－マウスを交配させると、Ｔｂｘ２１－／－／Ｒａｇ２－／－子孫は微生物叢依存的に
潰瘍性大腸炎を発症した。驚くべきことに、この大腸炎の表現型は、Ｔｂｘ２１－／－／
Ｒａｇ２－／－微生物叢の養子移入により、野生型マウスに伝達可能であった。このこと
は、変化した微生物叢が、疾病を誘導するのに十分であることを実証した。免疫由来のデ
ィスバイオシスの別の例は、インフラマソーム成分ＮＬＲＰ６の上皮細胞発現が欠損して
いるマウスにおいて見られる。これらのマウスは、腸炎症性細胞の動員および化学的に誘
発される大腸炎への感受性の増加に関連するバクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔ
ｅｓ）のメンバーの存在量の増加を伴う変化した微生物叢を発生させる。
【0070】
個々の共生種が、異なるエフェクター機能を有する粘膜固有層Ｔリンパ球サブセットの
構成に影響を及ぼすことは明らかにされている。腸粘膜におけるホメオスタシスは、イン
ターフェロンγを生産するＴｈ１細胞、ＩＬ－１７ａ、ＩＬ－１７ｆおよびＩＬ－２２を
産生するＴｈ１７細胞、Ｔｈ２およびＴｈ１７細胞に似たサイトカインエフェクター特徴
を有する多様な天然のリンパ系細胞、並びに抗炎症性Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅ
ｇ）を含む、潜在的に炎症促進性である細胞間の、チェックおよびバランスのシステムに
よって維持されている。
構成に影響を及ぼすことは明らかにされている。腸粘膜におけるホメオスタシスは、イン
ターフェロンγを生産するＴｈ１細胞、ＩＬ－１７ａ、ＩＬ－１７ｆおよびＩＬ－２２を
産生するＴｈ１７細胞、Ｔｈ２およびＴｈ１７細胞に似たサイトカインエフェクター特徴
を有する多様な天然のリンパ系細胞、並びに抗炎症性Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅ
ｇ）を含む、潜在的に炎症促進性である細胞間の、チェックおよびバランスのシステムに
よって維持されている。
【0071】
本発明の特定の適用は、患者におけるＴｈ１７細胞集団の形成において見出される。こ
れらの細胞は、自己免疫性の、および、炎症性の疾患に関係づけられている。これらの細
胞は、Harrington LE, Hatton RD, Mangan PR, et al., “Interleukin 17－producing C
D41 effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and
2 lineages”, Nat Immunol. 2005;6(11): 1123－1132、および、Park H, Li Z, Yang X
O, et al., “A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by
producing interleukin 17”, Nat Immunol. 2005; 6(11):1133－1141に記載された。自
己免疫性の疾患の場合、Ｔｈ１７細胞の過剰活性化は、多発性硬化症、関節リウマチおよ
び乾癬の場合のように、不適切な量の炎症を引き起こし得る。Ｔｈ１７細胞はまた、粘膜
免疫の維持に必要であることが示されている。Ｔｈ１７細胞は、Ｔｒｅｇ細胞と比較した
遺伝子発現の増加に起因する遅発型喘息反応の発症に寄与し得る。
れらの細胞は、自己免疫性の、および、炎症性の疾患に関係づけられている。これらの細
胞は、Harrington LE, Hatton RD, Mangan PR, et al., “Interleukin 17－producing C
D41 effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and
2 lineages”, Nat Immunol. 2005;6(11): 1123－1132、および、Park H, Li Z, Yang X
O, et al., “A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by
producing interleukin 17”, Nat Immunol. 2005; 6(11):1133－1141に記載された。自
己免疫性の疾患の場合、Ｔｈ１７細胞の過剰活性化は、多発性硬化症、関節リウマチおよ
び乾癬の場合のように、不適切な量の炎症を引き起こし得る。Ｔｈ１７細胞はまた、粘膜
免疫の維持に必要であることが示されている。Ｔｈ１７細胞は、Ｔｒｅｇ細胞と比較した
遺伝子発現の増加に起因する遅発型喘息反応の発症に寄与し得る。
【0072】
ＨＩＶでは、Ｔｈ１７細胞集団の喪失が慢性感染の一因となり得る。腸内のＴｈ１７細
胞集団の枯渇は、腸管バリアを破壊し、微生物移行により腸から出る細菌の移動レベルを
増加させ、慢性ＨＩＶ感染症およびＡＩＤＳへの進行に寄与する。微生物移行は、細菌の
、腸管内腔の外からの、粘膜固有層内へ、リンパ節へ、およびさらに非リンパ組織への移
動をもたらす。それは、ＨＩＶの後期段階に全身で見られる一定の免疫活性化を引き起こ
し得る。腸内のＴｈ１７細胞集団の増加は、効果的な処置であり、かつ、おそらく予防的
でもあることが示されている。腸内の、全てのＣＤ４＋Ｔ細胞はＨＩＶによって重度に枯
渇されるが、特に腸内のＴＨ１７細胞の喪失は慢性の病原性ＨＩＶおよびＳＩＶ感染症の
徴候に関連している。微生物移行は、ＨＩＶの文脈において、慢性炎症および免疫活性化
に寄与する主要な因子である。ＳＩＶの非病原性の場合には、微生物移行は観察されない
。Ｔｈ１７細胞は、腸におけるＨＩＶ感染症の間に、腸内上皮バリアを維持することによ
って、重度ＨＩＶ感染症を予防する。それらの、高レベルのＣＣＲ５発現（ＨＩＶの共受
容体）のために、それらは優先的に感染して、枯渇する。従って、微生物移行は、Ｔｈ１
７細胞の枯渇を通して生じる。さらに、腸内のＴｈ１７細胞の喪失は、炎症性Ｔｈ１７細
胞とそれらの抗炎症性対応物であるＴｒｅｇ細胞との間のバランスの喪失につながる。Ｔ
ｒｅｇ細胞は、その免疫抑制特性のため、ＨＩＶに対する抗ウイルス応答を減少させ、病
因に寄与していると考えられている。Ｔｈ１７活性と比較してより高いＴｒｅｇ活性があ
り、ウイルスに対する免疫応答はあまり積極的および効果的ではない。Ｔｈ１７細胞の活
性を高めること（ｒｅｖｉｔａｌｉｚｉｎｇ）は、炎症の減少を含む、慢性感染症の徴候
を減少させることが示されており、高活性抗レトロウイルス処置（ＨＡＡＲＴ）に対する
応答が改善される。これは、重要な発見であり、微生物移行は一般的に、ＨＡＡＲＴへの
不応答をもたらす。患者は継続して徴候を示し、予想されるウイルス量の低減は示さない
。ＳＩＶ－アカゲザルモデルにおいて、、Ｔｈ１７分化および増殖を促進することが示さ
れたサイトカインであるＩＬ－２１を投与すると、Ｔｈ１７細胞集団を増加させることに
よって微生物移行が減少することが見出された。
胞集団の枯渇は、腸管バリアを破壊し、微生物移行により腸から出る細菌の移動レベルを
増加させ、慢性ＨＩＶ感染症およびＡＩＤＳへの進行に寄与する。微生物移行は、細菌の
、腸管内腔の外からの、粘膜固有層内へ、リンパ節へ、およびさらに非リンパ組織への移
動をもたらす。それは、ＨＩＶの後期段階に全身で見られる一定の免疫活性化を引き起こ
し得る。腸内のＴｈ１７細胞集団の増加は、効果的な処置であり、かつ、おそらく予防的
でもあることが示されている。腸内の、全てのＣＤ４＋Ｔ細胞はＨＩＶによって重度に枯
渇されるが、特に腸内のＴＨ１７細胞の喪失は慢性の病原性ＨＩＶおよびＳＩＶ感染症の
徴候に関連している。微生物移行は、ＨＩＶの文脈において、慢性炎症および免疫活性化
に寄与する主要な因子である。ＳＩＶの非病原性の場合には、微生物移行は観察されない
。Ｔｈ１７細胞は、腸におけるＨＩＶ感染症の間に、腸内上皮バリアを維持することによ
って、重度ＨＩＶ感染症を予防する。それらの、高レベルのＣＣＲ５発現（ＨＩＶの共受
容体）のために、それらは優先的に感染して、枯渇する。従って、微生物移行は、Ｔｈ１
７細胞の枯渇を通して生じる。さらに、腸内のＴｈ１７細胞の喪失は、炎症性Ｔｈ１７細
胞とそれらの抗炎症性対応物であるＴｒｅｇ細胞との間のバランスの喪失につながる。Ｔ
ｒｅｇ細胞は、その免疫抑制特性のため、ＨＩＶに対する抗ウイルス応答を減少させ、病
因に寄与していると考えられている。Ｔｈ１７活性と比較してより高いＴｒｅｇ活性があ
り、ウイルスに対する免疫応答はあまり積極的および効果的ではない。Ｔｈ１７細胞の活
性を高めること（ｒｅｖｉｔａｌｉｚｉｎｇ）は、炎症の減少を含む、慢性感染症の徴候
を減少させることが示されており、高活性抗レトロウイルス処置（ＨＡＡＲＴ）に対する
応答が改善される。これは、重要な発見であり、微生物移行は一般的に、ＨＡＡＲＴへの
不応答をもたらす。患者は継続して徴候を示し、予想されるウイルス量の低減は示さない
。ＳＩＶ－アカゲザルモデルにおいて、、Ｔｈ１７分化および増殖を促進することが示さ
れたサイトカインであるＩＬ－２１を投与すると、Ｔｈ１７細胞集団を増加させることに
よって微生物移行が減少することが見出された。
【0073】
本方法の一例では、ＩＬ－２１、ＩＬ－１５および／またはＩＬ－２は、細胞集団と共
に、患者に、順次または同時に投与される。このことは、患者において免疫細胞集団をさ
らに調製するのに、有用である。
に、患者に、順次または同時に投与される。このことは、患者において免疫細胞集団をさ
らに調製するのに、有用である。
【0074】
Yang et al.は、マウスにおけるＴｈ１７細胞の存在は、微生物叢を有するマウスにお
ける定着を必要とすることを発見した。セグメント細菌（ＳＦＢ）は、動物モデルにおい
て、Ｔｈ１７細胞を誘導し、Ｔｈ１７依存性の自己免疫性の疾病を促進するのに十分であ
った(Nature, 2014 Jun 5;510(7503):152－6. doi: 10.1038/nature13279. Epub 2014 Ap
r 13, “Focused specificity of intestinal Th17 cells towards commensal bacterial
antigens”, Yang Y et al.)。ＳＦＢは、回腸末端の腸上皮細胞を覆う粘液層に浸透で
きるようであり、それらは上皮細胞と密接に相互作用し、相互作用の部位で宿主細胞アク
チン重合を誘導し、おそらく、粘膜固有層内のＴｈ１７極性化環境をもたらすシグナル伝
達事象を誘導する。
ける定着を必要とすることを発見した。セグメント細菌（ＳＦＢ）は、動物モデルにおい
て、Ｔｈ１７細胞を誘導し、Ｔｈ１７依存性の自己免疫性の疾病を促進するのに十分であ
った(Nature, 2014 Jun 5;510(7503):152－6. doi: 10.1038/nature13279. Epub 2014 Ap
r 13, “Focused specificity of intestinal Th17 cells towards commensal bacterial
antigens”, Yang Y et al.)。ＳＦＢは、回腸末端の腸上皮細胞を覆う粘液層に浸透で
きるようであり、それらは上皮細胞と密接に相互作用し、相互作用の部位で宿主細胞アク
チン重合を誘導し、おそらく、粘膜固有層内のＴｈ１７極性化環境をもたらすシグナル伝
達事象を誘導する。
【0075】
一例では、第１の細菌は、セグメント細菌の１６ｓ ｒＤＮＡに、少なくとも８０、８
５、９０、９５、９６、９７、９８、または、９９％同一である、１６ｓ ｒＤＮＡ配列
を含む種または株の細菌である。ある実施形態では、本方法は第１の細菌の割合を増加さ
せ、ここで、患者におけるＴｈ１７細胞はアップレギュレートされ、例えば、疾病は、が
んまたはウイルス感染症（例えば、ＨＩＶ）である。ある実施形態では、本方法は、第１
の細菌の割合を減少させ、患者におけるＴｈ１７細胞はダウンレギュレートされ、例えば
、疾病または症状は自己免疫性または炎症性の疾病または症状であるか、あるいは、ＡＣ
Ｔを受けているがん患者においてＣＲＳのリスクを減少させるためである。
５、９０、９５、９６、９７、９８、または、９９％同一である、１６ｓ ｒＤＮＡ配列
を含む種または株の細菌である。ある実施形態では、本方法は第１の細菌の割合を増加さ
せ、ここで、患者におけるＴｈ１７細胞はアップレギュレートされ、例えば、疾病は、が
んまたはウイルス感染症（例えば、ＨＩＶ）である。ある実施形態では、本方法は、第１
の細菌の割合を減少させ、患者におけるＴｈ１７細胞はダウンレギュレートされ、例えば
、疾病または症状は自己免疫性または炎症性の疾病または症状であるか、あるいは、ＡＣ
Ｔを受けているがん患者においてＣＲＳのリスクを減少させるためである。
【0076】
一例では、本方法は、アレルギー性の疾病または症状、例えば喘息を、処置または予防
する。一例では、本方法は、ＩｇＥ媒介性の疾病または症状、例えば喘息を、処置または
予防する。
する。一例では、本方法は、ＩｇＥ媒介性の疾病または症状、例えば喘息を、処置または
予防する。
【0077】
一例では、本方法は、Ｔｈ２細胞のサイトカイン放出によって媒介される、患者の自己
中毒（ａｕｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を低減させる。
中毒（ａｕｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を低減させる。
【0078】
Lopez et al.は、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）／バクテロイデス門
（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）の比率の低減により特徴づけられる、腸のディスバイオ
シスが、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者において報告されることを発見した。彼
らの研究において、インビトロ培養物により、ＳＬＥ患者便サンプル（ＳＬＥ－Ｍ）から
単離された微生物叢が、健常なコントロール微生物叢よりも、リンパ球活性化およびナイ
ーブＣＤ４＋リンパ球からのＴｈ１７分化を、より大きく促進することを明らかにした。
Ｔｒｅｇ誘導細菌によるＳＬＥ－Ｍの濃縮は、２つのＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ菌株の混合物
がＴｈ１７／Ｔｈ１バランスを有意に低減させたが、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｂｉｆｉｄｕｍの補充はＣＤ４＋リンパ球過剰活性化を妨げたことを示した。患者サンプ
ルのエスビボ解析は、Ｔｈ１７およびＦｏｘｐ３＊ＩＬ－１７＋集団が増幅したこを示し
、Ｔｒｅｇ－Ｔｈ１７分化転換が可能であることが示唆された。さらに、糞便微生物叢の
分析は、健常なコントロールにおけるＩＬ－１７＋集団とファーミキューテス門（Ｆｉｒ
ｍｉｃｕｔｅｓ）との間に負の相関を明らかにしたが、ＳＬＥでは、この門は患者におい
てわずかに低減されたＴｈ１サイトカインであるＩＦＮγの血清レベルと直接相関した（
Sci Rep. 2016 Apr 5;6:24072. doi: 10.1038/srep24072, “Th17 responses and natura
l IgM antibodies are related to gut microbiota composition in systemic lupus ery
thematosus patients”, Lopez P et al.）。
（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）の比率の低減により特徴づけられる、腸のディスバイオ
シスが、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者において報告されることを発見した。彼
らの研究において、インビトロ培養物により、ＳＬＥ患者便サンプル（ＳＬＥ－Ｍ）から
単離された微生物叢が、健常なコントロール微生物叢よりも、リンパ球活性化およびナイ
ーブＣＤ４＋リンパ球からのＴｈ１７分化を、より大きく促進することを明らかにした。
Ｔｒｅｇ誘導細菌によるＳＬＥ－Ｍの濃縮は、２つのＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ菌株の混合物
がＴｈ１７／Ｔｈ１バランスを有意に低減させたが、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｂｉｆｉｄｕｍの補充はＣＤ４＋リンパ球過剰活性化を妨げたことを示した。患者サンプ
ルのエスビボ解析は、Ｔｈ１７およびＦｏｘｐ３＊ＩＬ－１７＋集団が増幅したこを示し
、Ｔｒｅｇ－Ｔｈ１７分化転換が可能であることが示唆された。さらに、糞便微生物叢の
分析は、健常なコントロールにおけるＩＬ－１７＋集団とファーミキューテス門（Ｆｉｒ
ｍｉｃｕｔｅｓ）との間に負の相関を明らかにしたが、ＳＬＥでは、この門は患者におい
てわずかに低減されたＴｈ１サイトカインであるＩＦＮγの血清レベルと直接相関した（
Sci Rep. 2016 Apr 5;6:24072. doi: 10.1038/srep24072, “Th17 responses and natura
l IgM antibodies are related to gut microbiota composition in systemic lupus ery
thematosus patients”, Lopez P et al.）。
【0079】
他の細菌が、Ｔｒｅｇの分化を指示することによって、またはＩＬ－１０発現を誘導す
ることによって、適応免疫システムの抗炎症性分枝（ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒ
ｙ ｂｒａｎｃｈ）を増強することが示されている。例えば、最初はマウス糞便から単離
され、主にＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属のクラスターＩＶおよびＸＩＶａに属する、４６の
マウスクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ）株の複雑なカクテルによるノトバイ
オートマウスの定着は、粘膜固有層および全身のＴｒｅｇの増幅をもたらす。
ることによって、適応免疫システムの抗炎症性分枝（ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒ
ｙ ｂｒａｎｃｈ）を増強することが示されている。例えば、最初はマウス糞便から単離
され、主にＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属のクラスターＩＶおよびＸＩＶａに属する、４６の
マウスクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ）株の複雑なカクテルによるノトバイ
オートマウスの定着は、粘膜固有層および全身のＴｒｅｇの増幅をもたらす。
【0080】
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓポリサッカライドＡ（ＰＳＡ）は、全身の
Ｔ細胞応答の発達に影響を与える。ＰＳＡを生産するＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓによる無菌マ
ウスでの定着は、ＰＳＡを欠くＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓを定着させたマウスと比較して、よ
り多くの循環ＣＤ４＋Ｔ細胞を生じる。ＰＳＡを生産するＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓはまた、
血液循環中のより高頻度のＴｈ１細胞を誘発する。これらの知見は共に、共生細菌が、粘
膜組織をはるかに越える、全体的な免疫への影響を有することを示している。
Ｔ細胞応答の発達に影響を与える。ＰＳＡを生産するＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓによる無菌マ
ウスでの定着は、ＰＳＡを欠くＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓを定着させたマウスと比較して、よ
り多くの循環ＣＤ４＋Ｔ細胞を生じる。ＰＳＡを生産するＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓはまた、
血液循環中のより高頻度のＴｈ１細胞を誘発する。これらの知見は共に、共生細菌が、粘
膜組織をはるかに越える、全体的な免疫への影響を有することを示している。
【0081】
Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉは酪酸を生産し、その経口投与はマウスのＴＮＢＳ誘導大
腸炎の重症度を低減させるめ、ＩＢＤ患者において見られるこの細菌の減少は興味深い。
一例では、第１の種は、酪酸生産細菌種（例えば、Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）であり
、微生物叢において、第１の種の割合は低減され、該方法は、患者においてエフェクター
Ｔ細胞、および／または、ヘルパーＴ細胞をダウンレギュレートし、それにより、前記疾
病または症状（例えば、自己免疫性または炎症性の疾病または症状、またはＣＲＳ）を治
療または予防する。
腸炎の重症度を低減させるめ、ＩＢＤ患者において見られるこの細菌の減少は興味深い。
一例では、第１の種は、酪酸生産細菌種（例えば、Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）であり
、微生物叢において、第１の種の割合は低減され、該方法は、患者においてエフェクター
Ｔ細胞、および／または、ヘルパーＴ細胞をダウンレギュレートし、それにより、前記疾
病または症状（例えば、自己免疫性または炎症性の疾病または症状、またはＣＲＳ）を治
療または予防する。
【0082】
古細菌は、伝統的に５つの門に分かれており、すなわち、Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａ
、Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ、Ｋｏｒａｒｃｈａｅｏｔａ、Ｎａｎｏａｒｃｈａｅｏｔ
ａおよびＴｈａｕｍａｒｃｈａｅｏｔａである。豊富な全ゲノムデータの増加に基づいて
（主に、環境分離菌由来）、古細菌の系統発生は最近見直されている。Ｋｏｒａｒｃｈａ
ｅｏｔａ、Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａ、Ｔｈａｕｍａｒｃｈａｅｏｔａおよび新たに提
案されたＡｉｇａｒｃｈａｅｏｔａの４つのグループが、１つの上門（いわゆる、ＴＡＣ
Ｋ上門）に含まれ、ＥｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａおよびＮａｎｏａｒｃｈａｅｏｔａは除
外されている。本発明の方法の第１の種は、本段落で述べた古細菌のいずれかであり得る
。
、Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ、Ｋｏｒａｒｃｈａｅｏｔａ、Ｎａｎｏａｒｃｈａｅｏｔ
ａおよびＴｈａｕｍａｒｃｈａｅｏｔａである。豊富な全ゲノムデータの増加に基づいて
（主に、環境分離菌由来）、古細菌の系統発生は最近見直されている。Ｋｏｒａｒｃｈａ
ｅｏｔａ、Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａ、Ｔｈａｕｍａｒｃｈａｅｏｔａおよび新たに提
案されたＡｉｇａｒｃｈａｅｏｔａの４つのグループが、１つの上門（いわゆる、ＴＡＣ
Ｋ上門）に含まれ、ＥｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａおよびＮａｎｏａｒｃｈａｅｏｔａは除
外されている。本発明の方法の第１の種は、本段落で述べた古細菌のいずれかであり得る
。
【0083】
Ｔ細胞は胸腺で成熟し、ＴＣＲ受容体（Ｔ細胞受容体）を発現し、その表面にＣＤ８糖
タンパク質を発現することができ、ＣＤ８＋Ｔ細胞（細胞傷害性）と呼ばれるか、または
ＣＤ４糖タンパク質を発現することができ、そのためＣＤ４細胞（ヘルパーＴ細胞）と呼
ばれるかのいずれかである。ＣＤ４＋細胞は、異なるサブセット、ＴＨ（Ｔヘルパー）１
、ＴＨ２、ＴＨ、Ｔｈ１７、Ｔｈ２２、Ｔｒｅｇ（制御性Ｔ細胞ｓ）およびＴｆｈ（濾胞
性ヘルパーＴ細胞ｓ）に分化し、これらは異なるサイトカインプロファイルにより特徴づ
けられる。これらの異なるＣＤ４＋サブセットは、Ｔ細胞の免疫およびエフェクター応答
機能において、重要な役割を果たす。全てのＣＤ４＋ＴＨサブセットは、特定のサイトカ
インにより、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞から分化し、ＴＨ１は、ＩＬ－１２およびＩＦＮ－
γ（炎症誘発性のサイトカインであり、ＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）の増加、サイトカイ
ン分泌の誘導、またはマクロファージの活性化などの、複数の役割を有する）により分化
し、Ｔｈ２はＩＬ－４により分化し、ＴｒｅｇはＩＬ－２およびＴＧＦ－βにより分化す
る。ＴＨサブセットはそれぞれ、特定のサイトカインを放出する、炎症誘発性または抗炎
症性の機能、生存または保護機能のいずれかを有し得る、特定のサイトカインを放出する
。例えば、ＴＨ１はＩＦＮ－γおよびＴＮＦを放出し、Ｔｈ２はＩＬ－４（Ｂ型リンパ球
の重要な生存因子）、ＩＬ－５およびＩＬ－１３を放出し、ＴＨ９はＩＬ－９を生産し、
ＴｒｅｇはＩＬ－１０（免疫抑制機能を有するサイトカインであり、Ｔｒｅｇの抑制機能
に必要なＦＯＸ３転写因子の発現を他の細胞上で維持する）およびＴＧＦ－βを分泌し、
Ｔｈ１７はＩＬ－１７（細菌および真菌に対する宿主防御において重要な役割を果たすサ
イトカイン）を生産する。
タンパク質を発現することができ、ＣＤ８＋Ｔ細胞（細胞傷害性）と呼ばれるか、または
ＣＤ４糖タンパク質を発現することができ、そのためＣＤ４細胞（ヘルパーＴ細胞）と呼
ばれるかのいずれかである。ＣＤ４＋細胞は、異なるサブセット、ＴＨ（Ｔヘルパー）１
、ＴＨ２、ＴＨ、Ｔｈ１７、Ｔｈ２２、Ｔｒｅｇ（制御性Ｔ細胞ｓ）およびＴｆｈ（濾胞
性ヘルパーＴ細胞ｓ）に分化し、これらは異なるサイトカインプロファイルにより特徴づ
けられる。これらの異なるＣＤ４＋サブセットは、Ｔ細胞の免疫およびエフェクター応答
機能において、重要な役割を果たす。全てのＣＤ４＋ＴＨサブセットは、特定のサイトカ
インにより、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞から分化し、ＴＨ１は、ＩＬ－１２およびＩＦＮ－
γ（炎症誘発性のサイトカインであり、ＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）の増加、サイトカイ
ン分泌の誘導、またはマクロファージの活性化などの、複数の役割を有する）により分化
し、Ｔｈ２はＩＬ－４により分化し、ＴｒｅｇはＩＬ－２およびＴＧＦ－βにより分化す
る。ＴＨサブセットはそれぞれ、特定のサイトカインを放出する、炎症誘発性または抗炎
症性の機能、生存または保護機能のいずれかを有し得る、特定のサイトカインを放出する
。例えば、ＴＨ１はＩＦＮ－γおよびＴＮＦを放出し、Ｔｈ２はＩＬ－４（Ｂ型リンパ球
の重要な生存因子）、ＩＬ－５およびＩＬ－１３を放出し、ＴＨ９はＩＬ－９を生産し、
ＴｒｅｇはＩＬ－１０（免疫抑制機能を有するサイトカインであり、Ｔｒｅｇの抑制機能
に必要なＦＯＸ３転写因子の発現を他の細胞上で維持する）およびＴＧＦ－βを分泌し、
Ｔｈ１７はＩＬ－１７（細菌および真菌に対する宿主防御において重要な役割を果たすサ
イトカイン）を生産する。
【0084】
本発明のある実施形態は、ＣＡＲ－Ｔおよび他の養子免疫療法（養子ＴＩＬ療法など）
を調節するための適用を見出した。いくつかの報告が、ＣＡＲ－Ｔおよび他の免疫細胞ベ
ースの治療を評価する際の重要な考慮事項である、ＣＤ４＋サブセットによって放出され
る異なるタイプのサイトカインの異なる役割を実証している。ＴＨ１およびＴＨ２ＣＤ４
＋Ｔ細胞サブセットサイトカインは、第２世代のＣＤ２８含有ＣＡＲ－Ｔによって生成さ
れる異なるタイプの細胞傷害性を促進することが示された。高レベルのＴＨ１サイトカイ
ンでは短期毒性が観察され、第２世代のＣＤ１９特異的ＣＡＲ－Ｔを受けた動物では高用
量のＴＨ２型サイトカインが慢性自己細胞傷害性を生じた。誘導性ＩＬ－１２を送達する
ように操作したＣＡＲ－Ｔ細胞は、腫瘍間質を調節してがんを破壊した。操作されたCAR
－T細胞によるＩＬ－１２放出は、マクロファージを動員することによって、抗がん活性
を上昇させた。ＣＡＲ－Ｔにより放出されたＩＬ－１２はまた、抑制細胞の再プログラミ
ングを誘導し、その阻害機能を逆転させ、臨床試験におけるその評価を示唆した。ＣＡＲ
－Ｔ療法の存続は、注入産物中のＣＤ４＋細胞の数およびセントラルメモリー細胞の数に
依存することが示された。ＣＤ８＋エフェクター細胞からではなく、セントラルメモリー
Ｔ細胞から単離されたＣＤ８＋クローンが、非ヒト霊長類モデルにおいて、養子Ｔ細胞移
入の間インビボで長期間存続し、このことは、効果的な養子免疫療法のための、特定のＴ
細胞サブセットの機能の重要性を示した。ＣＤ８＋サブセットとＣＤ４＋サブセットとの
組み合わせが、Ｔ細胞養子移入を顕著に増強したこともまた、示されている。ＣＤ４＋細
胞は、ＣＤ８＋記憶機能の発達を支持することが示され、免疫療法の治験におけるサブセ
ットおよび組み合わせの両方の重要性を実証した。いくつかの前臨床モデルは、効果的な
ＣＡＲ－Ｔ療法ための、異なるＴ細胞サブセットの利点を実証した：Ｔ記憶幹細胞表現型
細胞に最も近いＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋ＣＡＲ－Ｔ細胞は、より大きなＣＡＲ
－Ｔ細胞の抗腫瘍活性を生じた。ＣＤ８＋およびＣＤ４＋サブセットは共に、相乗的な抗
腫瘍ＣＡＲ－Ｔ活性を発現した。
を調節するための適用を見出した。いくつかの報告が、ＣＡＲ－Ｔおよび他の免疫細胞ベ
ースの治療を評価する際の重要な考慮事項である、ＣＤ４＋サブセットによって放出され
る異なるタイプのサイトカインの異なる役割を実証している。ＴＨ１およびＴＨ２ＣＤ４
＋Ｔ細胞サブセットサイトカインは、第２世代のＣＤ２８含有ＣＡＲ－Ｔによって生成さ
れる異なるタイプの細胞傷害性を促進することが示された。高レベルのＴＨ１サイトカイ
ンでは短期毒性が観察され、第２世代のＣＤ１９特異的ＣＡＲ－Ｔを受けた動物では高用
量のＴＨ２型サイトカインが慢性自己細胞傷害性を生じた。誘導性ＩＬ－１２を送達する
ように操作したＣＡＲ－Ｔ細胞は、腫瘍間質を調節してがんを破壊した。操作されたCAR
－T細胞によるＩＬ－１２放出は、マクロファージを動員することによって、抗がん活性
を上昇させた。ＣＡＲ－Ｔにより放出されたＩＬ－１２はまた、抑制細胞の再プログラミ
ングを誘導し、その阻害機能を逆転させ、臨床試験におけるその評価を示唆した。ＣＡＲ
－Ｔ療法の存続は、注入産物中のＣＤ４＋細胞の数およびセントラルメモリー細胞の数に
依存することが示された。ＣＤ８＋エフェクター細胞からではなく、セントラルメモリー
Ｔ細胞から単離されたＣＤ８＋クローンが、非ヒト霊長類モデルにおいて、養子Ｔ細胞移
入の間インビボで長期間存続し、このことは、効果的な養子免疫療法のための、特定のＴ
細胞サブセットの機能の重要性を示した。ＣＤ８＋サブセットとＣＤ４＋サブセットとの
組み合わせが、Ｔ細胞養子移入を顕著に増強したこともまた、示されている。ＣＤ４＋細
胞は、ＣＤ８＋記憶機能の発達を支持することが示され、免疫療法の治験におけるサブセ
ットおよび組み合わせの両方の重要性を実証した。いくつかの前臨床モデルは、効果的な
ＣＡＲ－Ｔ療法ための、異なるＴ細胞サブセットの利点を実証した：Ｔ記憶幹細胞表現型
細胞に最も近いＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋ＣＡＲ－Ｔ細胞は、より大きなＣＡＲ
－Ｔ細胞の抗腫瘍活性を生じた。ＣＤ８＋およびＣＤ４＋サブセットは共に、相乗的な抗
腫瘍ＣＡＲ－Ｔ活性を発現した。
【0085】
一例では、投与される細胞集団は、ＣＤ８＋ＣＡＲ－Ｔサブセットと、ＣＤ４＋ＣＡＲ
－Ｔサブセットとの組み合わせを含む、ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団である。
－Ｔサブセットとの組み合わせを含む、ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団である。
【0086】
本発明の一例では細胞療法は、養子Ｔ細胞療法であり、場合により、ＣＤ４＋Ｔ細胞、
ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｈ１細胞およびTh17細胞からなる群から選択される細胞が、患者に投
与される。一例では、細胞療法は、本発明の方法により増強され、例えば、がん細胞の免
疫細胞細胞傷害性が患者において増強されるか、または、疾病または症状の処置が増強さ
れる。一例では、細胞療法は、本発明の方法により低減され、例えば、例えば、がん細胞
の免疫細胞細胞傷害性が患者において低減されるか、または、（例えば、がん患者におい
て）ＣＲＳのリスクが低減される。従って、ある実施形態では、本方法は、患者において
サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）のリスクを低減または予防する。ある実施形態では、
本方法は、細胞療法の望まれない副作用（例えば、ＣＲＳなどの、ヒト患者におけるＣＡ
Ｒ－Ｔ療法の副作用）を低減または予防する。
ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｈ１細胞およびTh17細胞からなる群から選択される細胞が、患者に投
与される。一例では、細胞療法は、本発明の方法により増強され、例えば、がん細胞の免
疫細胞細胞傷害性が患者において増強されるか、または、疾病または症状の処置が増強さ
れる。一例では、細胞療法は、本発明の方法により低減され、例えば、例えば、がん細胞
の免疫細胞細胞傷害性が患者において低減されるか、または、（例えば、がん患者におい
て）ＣＲＳのリスクが低減される。従って、ある実施形態では、本方法は、患者において
サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）のリスクを低減または予防する。ある実施形態では、
本方法は、細胞療法の望まれない副作用（例えば、ＣＲＳなどの、ヒト患者におけるＣＡ
Ｒ－Ｔ療法の副作用）を低減または予防する。
【0087】
一例では、免疫細胞集団は、ＣＡＲ－Ｔ細胞、および／または、操作されたＴ細胞受容
体（ＴＣＲ）を発現するＴ細胞、および／または、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ、例えば、
操作されたＴＩＬ）を含む。ＷＯ２０１３０６３３６１、ＵＳ９１１３６１６、ＵＳ２０
１３０１０９０５３、ＵＳ２０１６００８１３１４およびＷＯ２０１６０４４７４５（こ
れらの開示は、本明細書に参照により組み込まれる）は、本発明において使用するための
細胞を生成するのに使用するための、ＣＡＲおよびＴＣＲを生成するための好適な遺伝子
導入のインビボのプラットフォームを記載する。免疫細胞集団は、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ
細胞および／またはＴＩＬなどの、操作された自家の、または同種の免疫細胞（移植片）
を含んでよく、例えば、ここで細胞および患者はヒトである。自家細胞の利点は、内因性
システムの調節が、自家細胞を移植した細胞の調節と同様に調整される可能性があること
である。ある実施形態では、投与された細胞および患者は、同じ種または株の細胞または
患者であり、例えば、ヒトまたはげっ歯類（例えば、マウス）であり、例えば、ＨＬＡま
たはＭＨＣ適合のドナー移植片およびレシピエント患者である。
体（ＴＣＲ）を発現するＴ細胞、および／または、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ、例えば、
操作されたＴＩＬ）を含む。ＷＯ２０１３０６３３６１、ＵＳ９１１３６１６、ＵＳ２０
１３０１０９０５３、ＵＳ２０１６００８１３１４およびＷＯ２０１６０４４７４５（こ
れらの開示は、本明細書に参照により組み込まれる）は、本発明において使用するための
細胞を生成するのに使用するための、ＣＡＲおよびＴＣＲを生成するための好適な遺伝子
導入のインビボのプラットフォームを記載する。免疫細胞集団は、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ
細胞および／またはＴＩＬなどの、操作された自家の、または同種の免疫細胞（移植片）
を含んでよく、例えば、ここで細胞および患者はヒトである。自家細胞の利点は、内因性
システムの調節が、自家細胞を移植した細胞の調節と同様に調整される可能性があること
である。ある実施形態では、投与された細胞および患者は、同じ種または株の細胞または
患者であり、例えば、ヒトまたはげっ歯類（例えば、マウス）であり、例えば、ＨＬＡま
たはＭＨＣ適合のドナー移植片およびレシピエント患者である。
【0088】
一例では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＴｈ１７細胞である。例えば、投与される
ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＩＣＯＳ細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体を含み、場合により
、該細胞は、Ｔｈ１７細胞である。ある実施形態では、投与されるＴ細胞は、ＣＤ８＋Ｃ
Ｄ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋ＣＡＲ－Ｔ細胞である。
ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＩＣＯＳ細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体を含み、場合により
、該細胞は、Ｔｈ１７細胞である。ある実施形態では、投与されるＴ細胞は、ＣＤ８＋Ｃ
Ｄ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋ＣＡＲ－Ｔ細胞である。
【0089】
マウスにおける養子移入実験は、Ｔｈ１７細胞が、Ｔｈ１極性細胞よりも高いインビボ
の生存率および自己再生能を有することを示している。それゆえ、一例では、Ｔｈ１７細
胞が、患者において調節され、例えば、アップレギュレートされ（例えば、患者において
増殖し）、あるいは、ダウンレギュレートされる。これらは、患者の内因性Ｔ細胞、およ
び／または、患者に投与された細胞、もしくはその子孫であってよい。ある実施形態では
、ＲＯＲγｔ発現Ｔｈ１７細胞がアップレギュレートされ、例えば、患者において増殖し
ている。ある実施形態では、１つ以上のＴｈ１７関連遺伝子、例えば、Ｒｏｒｃ、Ｉｌ２
２およびＩｌ２６の１つ以上の発現が、増加している。ある実施形態では、１つ以上のＴ
ｈ１関連遺伝子、例えば、Ｉｆｎｇ、ＴｎｆａおよびＴｂｘ２１（Ｔ－ｂｅｔ）の１つ以
上の発現が、増加している。ある実施形態では、この場合、疾病または症状はがんである
。
の生存率および自己再生能を有することを示している。それゆえ、一例では、Ｔｈ１７細
胞が、患者において調節され、例えば、アップレギュレートされ（例えば、患者において
増殖し）、あるいは、ダウンレギュレートされる。これらは、患者の内因性Ｔ細胞、およ
び／または、患者に投与された細胞、もしくはその子孫であってよい。ある実施形態では
、ＲＯＲγｔ発現Ｔｈ１７細胞がアップレギュレートされ、例えば、患者において増殖し
ている。ある実施形態では、１つ以上のＴｈ１７関連遺伝子、例えば、Ｒｏｒｃ、Ｉｌ２
２およびＩｌ２６の１つ以上の発現が、増加している。ある実施形態では、１つ以上のＴ
ｈ１関連遺伝子、例えば、Ｉｆｎｇ、ＴｎｆａおよびＴｂｘ２１（Ｔ－ｂｅｔ）の１つ以
上の発現が、増加している。ある実施形態では、この場合、疾病または症状はがんである
。
【0090】
一例では、Ｔｒｅｇ細胞は、患者において調節され、例えば、アップレギュレートされ
（例えば、患者において増殖し）、あるいは、ダウンレギュレートされる。これらは、患
者の内因性Ｔ細胞であってよく、および／または、患者に投与された細胞、もしくはその
子孫であってよい。ある実施形態では、この場合、疾病または症状は、Ｔｒｅｇ細胞がア
ップレギュレートされたときの自己免疫性の、炎症性の、または感染性の疾病または症状
である。
（例えば、患者において増殖し）、あるいは、ダウンレギュレートされる。これらは、患
者の内因性Ｔ細胞であってよく、および／または、患者に投与された細胞、もしくはその
子孫であってよい。ある実施形態では、この場合、疾病または症状は、Ｔｒｅｇ細胞がア
ップレギュレートされたときの自己免疫性の、炎症性の、または感染性の疾病または症状
である。
【0091】
一例では、ＣＤ４＋細胞は、患者において調節され、例えば、アップレギュレートされ
（例えば、患者において増殖し）、あるいは、ダウンレギュレートされる。これらは、患
者の内因性細胞および／または患者に投与された細胞、もしくはその子孫であってよい。
（例えば、患者において増殖し）、あるいは、ダウンレギュレートされる。これらは、患
者の内因性細胞および／または患者に投与された細胞、もしくはその子孫であってよい。
【0092】
一例では、ＣＤ８＋細胞は、患者において調節され、例えば、アップレギュレートされ
（例えば、患者において増殖し）、あるいは、ダウンレギュレートされる。これらは、患
者の内因性細胞および／または患者に投与された細胞、もしくはその子孫であってよい。
（例えば、患者において増殖し）、あるいは、ダウンレギュレートされる。これらは、患
者の内因性細胞および／または患者に投与された細胞、もしくはその子孫であってよい。
【0093】
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、患者において調節され、例えば、アップレギュレート
され（例えば、患者において増殖し）、あるいは、ダウンレギュレートされる。これらは
、患者の内因性細胞および／または患者に投与された細胞、もしくはその子孫であってよ
い。
され（例えば、患者において増殖し）、あるいは、ダウンレギュレートされる。これらは
、患者の内因性細胞および／または患者に投与された細胞、もしくはその子孫であってよ
い。
【0094】
一例では、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥ
Ｍ）、ステムセルメモリー細胞（ＴＳＣＭ）およびエフェクター細胞（Ｔｅｆｆ）の１つ
以上などのメモリー細胞が、微生物叢または患者においてアップレギュレートされ、場合
により、該細胞は、患者に投与される免疫細胞集団に含まれ、および／または、その子孫
である。ある実施形態では、メモリー細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋またはＣＤ２
５＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ１２７＋である。
Ｍ）、ステムセルメモリー細胞（ＴＳＣＭ）およびエフェクター細胞（Ｔｅｆｆ）の１つ
以上などのメモリー細胞が、微生物叢または患者においてアップレギュレートされ、場合
により、該細胞は、患者に投与される免疫細胞集団に含まれ、および／または、その子孫
である。ある実施形態では、メモリー細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋またはＣＤ２
５＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ１２７＋である。
【0095】
ある細胞集団のアップレギュレーションは、例えば、微生物叢または患者または対象に
おける、そのタイプ（例えば、種または株）の細胞の集団の大きさまたは割合の増加であ
ってよく、および／または、微生物叢または患者または対象における、そのタイプの細胞
の活性（例えば、細胞傷害性、エフェクター機能またはサプレッサー機能）の増加であっ
てよい。ある細胞集団のダウンレギュレーションは、例えば、微生物叢または患者または
対象における、そのタイプ（例えば、種または株）の細胞の集団の大きさまたは割合の減
少であってよく、および／または、微生物叢または患者または対象における、そのタイプ
の細胞の活性（例えば、細胞傷害性、エフェクター機能またはサプレッサー機能）の減少
であってよい。
おける、そのタイプ（例えば、種または株）の細胞の集団の大きさまたは割合の増加であ
ってよく、および／または、微生物叢または患者または対象における、そのタイプの細胞
の活性（例えば、細胞傷害性、エフェクター機能またはサプレッサー機能）の増加であっ
てよい。ある細胞集団のダウンレギュレーションは、例えば、微生物叢または患者または
対象における、そのタイプ（例えば、種または株）の細胞の集団の大きさまたは割合の減
少であってよく、および／または、微生物叢または患者または対象における、そのタイプ
の細胞の活性（例えば、細胞傷害性、エフェクター機能またはサプレッサー機能）の減少
であってよい。
【0096】
一例では、細胞療法集団は、ＣＡＲ－Ｔ細胞（すなわち、それぞれが、キメラ抗原受容
体（ＣＡＲ）を表面発現するように操作されたＴ細胞）を含む。あるいは、該細胞は、Ｃ
ＡＲ－ＴＩＬまたはＣＡＲ－ＮＫ細胞である。ＣＡＲは、標的抗原（例えば、腫瘍細胞抗
原）に結合するための細胞外受容体ドメイン、膜貫通部分、および、免疫細胞（例えば、
Ｔ細胞）においてシグナル伝達するための、１つ以上の（例えば、第１および第２の）シ
グナル伝達ドメインを含む細胞内部分を含む。好適な細胞内ドメインの例はよく知られて
おり、例えば、ＣＤ３ζドメインと、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＯＸ４０または４－１ＢＢシ
グナル伝達ドメインの１つ以上との組み合わせであって、例えば、ＩＣＯＳおよびＣＤ２
８、またはＩＣＯＳおよび４１－ＢＢ、ＣＤ２８および４１－ＢＢシグナル伝達ドメイン
の組み合わせである。
体（ＣＡＲ）を表面発現するように操作されたＴ細胞）を含む。あるいは、該細胞は、Ｃ
ＡＲ－ＴＩＬまたはＣＡＲ－ＮＫ細胞である。ＣＡＲは、標的抗原（例えば、腫瘍細胞抗
原）に結合するための細胞外受容体ドメイン、膜貫通部分、および、免疫細胞（例えば、
Ｔ細胞）においてシグナル伝達するための、１つ以上の（例えば、第１および第２の）シ
グナル伝達ドメインを含む細胞内部分を含む。好適な細胞内ドメインの例はよく知られて
おり、例えば、ＣＤ３ζドメインと、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＯＸ４０または４－１ＢＢシ
グナル伝達ドメインの１つ以上との組み合わせであって、例えば、ＩＣＯＳおよびＣＤ２
８、またはＩＣＯＳおよび４１－ＢＢ、ＣＤ２８および４１－ＢＢシグナル伝達ドメイン
の組み合わせである。
【0097】
場合により、細胞集団は、疾病（例えば、がん、自己免疫性の疾病、移植片拒絶、また
は移植片対宿主病（ＧｖＨＤ））の治療または予防のために患者に投与される移植片に含
まれ、あるいは、細胞または移植片は、該使用のためのものである。
は移植片対宿主病（ＧｖＨＤ））の治療または予防のために患者に投与される移植片に含
まれ、あるいは、細胞または移植片は、該使用のためのものである。
【0098】
一例では、患者はヒトであり、例えば、女性または男性である。
【0099】
一例では、患者またはヒトは、免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）の投与の前に、リ
ンパ球枯渇を受けている。
ンパ球枯渇を受けている。
【0100】
ＣＡＲおよびＣＡＲＴ細胞を生産する技術は、当業界で知られていて通例であり、本発
明において使用するための細胞を生産するために、一般的に適用することができる（例え
ば、本発明に適用可能な一般的方法として、ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１；ＵＳ８９０
６６８２、ＵＳ８９１１９９３、ＵＳ８９１６３８１、ＵＳ８９７５０７１、ＵＳ９１０
１５８４、ＵＳ９１０２７６０、ＵＳ９１０２７６１、ＵＳ９３２８１５６、ＵＳ９４６
４１４０、ＵＳ９４８１７２８、ＵＳ９４９９６２９、ＵＳ９５１８１２３、ＵＳ９５４
０４４５、ＵＳ２０１３０２８７７４８、ＵＳ２０１３０２８８３６８、ＵＳ２０１３０
３０９２５８、ＵＳ２０１４０１０６４４９、ＵＳ２０１４０３７００１７、ＵＳ２０１
５００５０７２９、ＵＳ２０１５００９３８２２、ＵＳ２０１５００９９２９９、ＵＳ２
０１５０１１８２０２、ＵＳ２０１６０１３０３５５、ＵＳ２０１６０１５９９０７、Ｕ
Ｓ２０１６０１９４４０４、ＵＳ２０１６０２０８０１２； J Immunother. 2009 Sep; 3
2(7): 689―702, doi: 10.1097/CJI.0b013e3181ac6138, “Construction and Pre－clin
ical Evaluation of an Anti－CD19 Chimeric Antigen Receptor”, James N. Kochender
fer et al；またＷＯ２０１４０１２００１およびＵＳ２０１５０２９０２４４を参照さ
れたい）。例えば、エレクトロポレーション、レトロウイルスベクターまたはレンチウイ
ルスベクターの使用は、当業者は知るところであろうが、ＣＡＲのエレメントをコードす
るヌクレオチド配列を、Ｔ－細胞、ＮＫ細胞、ＴＩＬまたは他の免疫細胞に導入して、Ｃ
ＡＲ－細胞を生産するために用いることができる。患者から単離された細胞（自家細胞サ
ンプル）、または、同種の別のドナーから単離された細胞（同種サンプル）は、遺伝子操
作されてＣＡＲをコードする配列を含む祖先細胞を提供するために、用いることができる
。細胞の増幅は、当業界で知られることであるが、該プロセスで用いることができる。例
えば、ＣＡＲ細胞を操作した後、通例の技術を用いて細胞集団を大量に増幅して、患者に
投与（例えば、注入（ｔｒａｎｓｆｕｓｅ））される移植片を生産することができる。患
者は、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。１つ以上のＣＡＲエレメントに対する（例えば
、１つ以上のシグナル伝達ドメインに対する）ヌクレオチド配列を、患者または別のドナ
ーから得た細胞を用いて、クローニングまたはシーケンシングすることができる。
明において使用するための細胞を生産するために、一般的に適用することができる（例え
ば、本発明に適用可能な一般的方法として、ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１；ＵＳ８９０
６６８２、ＵＳ８９１１９９３、ＵＳ８９１６３８１、ＵＳ８９７５０７１、ＵＳ９１０
１５８４、ＵＳ９１０２７６０、ＵＳ９１０２７６１、ＵＳ９３２８１５６、ＵＳ９４６
４１４０、ＵＳ９４８１７２８、ＵＳ９４９９６２９、ＵＳ９５１８１２３、ＵＳ９５４
０４４５、ＵＳ２０１３０２８７７４８、ＵＳ２０１３０２８８３６８、ＵＳ２０１３０
３０９２５８、ＵＳ２０１４０１０６４４９、ＵＳ２０１４０３７００１７、ＵＳ２０１
５００５０７２９、ＵＳ２０１５００９３８２２、ＵＳ２０１５００９９２９９、ＵＳ２
０１５０１１８２０２、ＵＳ２０１６０１３０３５５、ＵＳ２０１６０１５９９０７、Ｕ
Ｓ２０１６０１９４４０４、ＵＳ２０１６０２０８０１２； J Immunother. 2009 Sep; 3
2(7): 689―702, doi: 10.1097/CJI.0b013e3181ac6138, “Construction and Pre－clin
ical Evaluation of an Anti－CD19 Chimeric Antigen Receptor”, James N. Kochender
fer et al；またＷＯ２０１４０１２００１およびＵＳ２０１５０２９０２４４を参照さ
れたい）。例えば、エレクトロポレーション、レトロウイルスベクターまたはレンチウイ
ルスベクターの使用は、当業者は知るところであろうが、ＣＡＲのエレメントをコードす
るヌクレオチド配列を、Ｔ－細胞、ＮＫ細胞、ＴＩＬまたは他の免疫細胞に導入して、Ｃ
ＡＲ－細胞を生産するために用いることができる。患者から単離された細胞（自家細胞サ
ンプル）、または、同種の別のドナーから単離された細胞（同種サンプル）は、遺伝子操
作されてＣＡＲをコードする配列を含む祖先細胞を提供するために、用いることができる
。細胞の増幅は、当業界で知られることであるが、該プロセスで用いることができる。例
えば、ＣＡＲ細胞を操作した後、通例の技術を用いて細胞集団を大量に増幅して、患者に
投与（例えば、注入（ｔｒａｎｓｆｕｓｅ））される移植片を生産することができる。患
者は、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。１つ以上のＣＡＲエレメントに対する（例えば
、１つ以上のシグナル伝達ドメインに対する）ヌクレオチド配列を、患者または別のドナ
ーから得た細胞を用いて、クローニングまたはシーケンシングすることができる。
【0101】
例えば、ＣＡＲは、ヒトＣＤ３ζドメインである、第一の細胞内シグナル伝達ドメイン
を含み、患者に投与される細胞は、該ヒトＣＤ３ζドメインをコードする内因性ヌクレオ
チド配列を含む、ヒト細胞である。一例では、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインは、Ｗ
Ｏ２０１２０７９０００Ａ１に開示される配列番号２４のアミノ酸配列を含み、該配列は
、本発明における使用のために本明細書に明示的に組み込まれ、本明細書の１つ以上の特
許請求の範囲に含めることができる。一例では、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインは、
ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１に開示される配列番号１８の核酸配列によりコードされ、
該配列は、本発明における使用のために本明細書に明示的に組み込まれ、本明細書の1つ
以上の特許請求の範囲に含めることができる。
を含み、患者に投与される細胞は、該ヒトＣＤ３ζドメインをコードする内因性ヌクレオ
チド配列を含む、ヒト細胞である。一例では、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインは、Ｗ
Ｏ２０１２０７９０００Ａ１に開示される配列番号２４のアミノ酸配列を含み、該配列は
、本発明における使用のために本明細書に明示的に組み込まれ、本明細書の１つ以上の特
許請求の範囲に含めることができる。一例では、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインは、
ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１に開示される配列番号１８の核酸配列によりコードされ、
該配列は、本発明における使用のために本明細書に明示的に組み込まれ、本明細書の1つ
以上の特許請求の範囲に含めることができる。
【0102】
例えば、第１のシグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ２８ドメインであり、本発明の細胞
集団は、ヒトＣＤ２８ドメインをコードする内因性ヌクレオチド配列をそれぞれ含む、ヒ
ト細胞の集団である。
集団は、ヒトＣＤ２８ドメインをコードする内因性ヌクレオチド配列をそれぞれ含む、ヒ
ト細胞の集団である。
【0103】
例えば、第１のシグナル伝達ドメインは、ヒト４－１ＢＢドメインであり、本発明の細
胞集団は、ヒト４－１ＢＢドメインをコードする内因性ヌクレオチド配列をそれぞれ含む
、ヒト細胞の集団である。
胞集団は、ヒト４－１ＢＢドメインをコードする内因性ヌクレオチド配列をそれぞれ含む
、ヒト細胞の集団である。
【0104】
例えば、第１のシグナル伝達ドメインは、ヒトＯＸ４０ドメインであり、本発明の細胞
集団は、ヒトＯＸ４０ドメインをコードする内因性ヌクレオチド配列をそれぞれ含む、ヒ
ト細胞の集団である。
集団は、ヒトＯＸ４０ドメインをコードする内因性ヌクレオチド配列をそれぞれ含む、ヒ
ト細胞の集団である。
【0105】
一例では、第１のシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζドメインであり、第１および第２
の細胞内シグナル伝達ドメインは、単一の細胞（例えば、ヒト野生型細胞、または患者か
ら単離された細胞）に天然に共生せず、例えば、第２のドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ２７
、ＯＸ４０または４－１ＢＢドメインである。
の細胞内シグナル伝達ドメインは、単一の細胞（例えば、ヒト野生型細胞、または患者か
ら単離された細胞）に天然に共生せず、例えば、第２のドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ２７
、ＯＸ４０または４－１ＢＢドメインである。
【0106】
一例では、第１の細胞内ドメインは、ＣＤ３ζドメイン、ＣＤ２８ドメインまたは４－
１ＢＢドメインである。
１ＢＢドメインである。
【0107】
一例では、ＣＡＲは、抗原結合部位（例えば、ヒトであってよい抗体ｓｃＦｖ）；場合
によりヒンジ（例えば、ヒトＣＤ８αヒンジ）；膜貫通ドメイン（例えば、ヒトＣＤ８α
またはＣＤ２８膜貫通ドメイン）；およびヒトＣＤ３ζドメインを含む、操作された単一
ポリペプチドである。一例では、ＣＡＲは、２つ以上の前記ポリペプチドの複合体である
。場合により、ＣＡＲは、膜貫通ドメインと、ＣＤ３ζドメインとの間に、さらなる細胞
内シグナル伝達ドメイン（ｉ）を含む。場合により、ＣＡＲは、さらなる細胞内シグナル
伝達ドメインを含み、ＣＤ３ζドメインは、さらなるシグナル伝達ドメインと、膜貫通ド
メインとの間にある。一例では、さらなるシグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ２７ドメイ
ン、ＣＤ２８ドメイン、ＩＣＯＳドメイン、ＯＸ４０ドメイン、ＣＤ４０ドメイン、４－
１ＢＢドメイン、ＦｃεＲＩγドメイン、ＣＤ６４ドメインまたはＣＤ１６ドメインであ
る。代替としては、単一ポリペプチドの代わりに、ＣＡＲは、該ドメインを含む少なくと
も２つのポリペプチドの、操作された複合体を含む。
によりヒンジ（例えば、ヒトＣＤ８αヒンジ）；膜貫通ドメイン（例えば、ヒトＣＤ８α
またはＣＤ２８膜貫通ドメイン）；およびヒトＣＤ３ζドメインを含む、操作された単一
ポリペプチドである。一例では、ＣＡＲは、２つ以上の前記ポリペプチドの複合体である
。場合により、ＣＡＲは、膜貫通ドメインと、ＣＤ３ζドメインとの間に、さらなる細胞
内シグナル伝達ドメイン（ｉ）を含む。場合により、ＣＡＲは、さらなる細胞内シグナル
伝達ドメインを含み、ＣＤ３ζドメインは、さらなるシグナル伝達ドメインと、膜貫通ド
メインとの間にある。一例では、さらなるシグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ２７ドメイ
ン、ＣＤ２８ドメイン、ＩＣＯＳドメイン、ＯＸ４０ドメイン、ＣＤ４０ドメイン、４－
１ＢＢドメイン、ＦｃεＲＩγドメイン、ＣＤ６４ドメインまたはＣＤ１６ドメインであ
る。代替としては、単一ポリペプチドの代わりに、ＣＡＲは、該ドメインを含む少なくと
も２つのポリペプチドの、操作された複合体を含む。
【0108】
免疫細胞は、単独で、または、希釈剤と、および／またはＩＬ－２もしくは他のサイト
カインまたは細胞集団などの他の成分と組み合わせて、医薬組成物として投与されてよい
。
カインまたは細胞集団などの他の成分と組み合わせて、医薬組成物として投与されてよい
。
【0109】
ある実施形態では、免疫細胞（例えば、ＣＡＲ細胞またはＴＣＲを有する細胞）は、Ｔ
ＡＡに結合する細胞表面結合部位（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲにより提供される）を含
む。腫瘍抗原（ＴＡＡ）は、免疫応答、特にＴ細胞媒介性免疫応答を誘発する腫瘍細胞に
よって生産されるタンパク質である。抗原結合特異性の選択は、治療される特定のがんの
タイプに依存するであろう。腫瘍抗原は当業界でよく知られており、本発明のある実施形
態の文脈において、例えば、グリオーマ関連抗原, がん胎児抗原（ＣＥＡ）、β－ヒト絨
毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログ
ロブリン（ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｍ）、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡＩＸ、ヒトテロメラ
ーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸内カルボキシルエステラーゼ（ｉｎｔｅｓ
ｔｉｎａｌ ｃａｒｂｏｘｙｉ ｅｓｔｅｒａｓｅ）、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、Ｍ－Ｃ
ＳＦ、プロスターゼ（ｐｒｏｓｔａｓｅ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ
－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ｐ５３、プロステイン（ｐｒｏｓｔｅｉｎ）、ＰＳＭＡ
、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺がん腫瘍抗原－１（ＰＣＴ
Ａ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ，好中球エラスターゼ，エフリンＢ２、ＣＤ２２、イン
スリン増殖因子（ＩＧＦ）－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦ－Ｉ受容体およびメンテリンが含
まれる。
ＡＡに結合する細胞表面結合部位（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲにより提供される）を含
む。腫瘍抗原（ＴＡＡ）は、免疫応答、特にＴ細胞媒介性免疫応答を誘発する腫瘍細胞に
よって生産されるタンパク質である。抗原結合特異性の選択は、治療される特定のがんの
タイプに依存するであろう。腫瘍抗原は当業界でよく知られており、本発明のある実施形
態の文脈において、例えば、グリオーマ関連抗原, がん胎児抗原（ＣＥＡ）、β－ヒト絨
毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログ
ロブリン（ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｍ）、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡＩＸ、ヒトテロメラ
ーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸内カルボキシルエステラーゼ（ｉｎｔｅｓ
ｔｉｎａｌ ｃａｒｂｏｘｙｉ ｅｓｔｅｒａｓｅ）、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、Ｍ－Ｃ
ＳＦ、プロスターゼ（ｐｒｏｓｔａｓｅ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ
－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ｐ５３、プロステイン（ｐｒｏｓｔｅｉｎ）、ＰＳＭＡ
、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺がん腫瘍抗原－１（ＰＣＴ
Ａ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ，好中球エラスターゼ，エフリンＢ２、ＣＤ２２、イン
スリン増殖因子（ＩＧＦ）－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦ－Ｉ受容体およびメンテリンが含
まれる。
【0110】
一実施形態では、腫瘍抗原は、悪性腫瘍に関連する、１つ以上の抗原性がんエピトープ
を含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃のための標的抗原として働くことができる多くのタンパク
質を発現する。これらの分子には、メラノーマ中のＭＡＲＴ－１、チロシナーゼおよびＧ
Ｐ１００、並びに、前立腺がん中の前立腺酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）および前立腺
特異的抗原（ＰＳＡ）などの、組織特異的抗原が含まれるが、これらに限定されない。他
の標的分子は、がん遺伝子ＨＥＲ－２／ＮｅｕＥｒｂＢ－２などの、形質転換関連分子の
群に属する。標的抗原のさらに別の群は、がん胎児抗原（ＣＥＡ）などの腫瘍胎児性抗原
である。Ｂ細胞リンパ腫において、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンは、個々の
腫瘍に特有の、真に腫瘍特異的な免疫グロブリン抗原を構成する。ＣＤＩ９、ＣＤ２０お
よびＣＤ３７などのＢ細胞分化抗原は、Ｂ細胞リンパ種における標的抗原の他の候補であ
る。これらの抗原のいくつか（ＣＥＡ、ＨＥＲ－２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、イディオタイ
プ）は、モノクローナル抗体による受動免疫療法のための標的として用いられているが、
効果は限られる。１つ目の抗原または４つ目の結合部分は、これらのＴＡＡのいずれかで
あり得るか、またはこれらのＴＡＡのいずれかの抗原性配列であり得る。
を含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃のための標的抗原として働くことができる多くのタンパク
質を発現する。これらの分子には、メラノーマ中のＭＡＲＴ－１、チロシナーゼおよびＧ
Ｐ１００、並びに、前立腺がん中の前立腺酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）および前立腺
特異的抗原（ＰＳＡ）などの、組織特異的抗原が含まれるが、これらに限定されない。他
の標的分子は、がん遺伝子ＨＥＲ－２／ＮｅｕＥｒｂＢ－２などの、形質転換関連分子の
群に属する。標的抗原のさらに別の群は、がん胎児抗原（ＣＥＡ）などの腫瘍胎児性抗原
である。Ｂ細胞リンパ腫において、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンは、個々の
腫瘍に特有の、真に腫瘍特異的な免疫グロブリン抗原を構成する。ＣＤＩ９、ＣＤ２０お
よびＣＤ３７などのＢ細胞分化抗原は、Ｂ細胞リンパ種における標的抗原の他の候補であ
る。これらの抗原のいくつか（ＣＥＡ、ＨＥＲ－２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、イディオタイ
プ）は、モノクローナル抗体による受動免疫療法のための標的として用いられているが、
効果は限られる。１つ目の抗原または４つ目の結合部分は、これらのＴＡＡのいずれかで
あり得るか、またはこれらのＴＡＡのいずれかの抗原性配列であり得る。
【0111】
本発明のある実施形態では、ＴＡＡの非限定的な例には、以下が含まれる：ＭＡＲＴ－
ｌ／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ－１）、ｇｌＯＯ（Ｐｍｅｌ１７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ
－１、ＴＲＰ－２などの分化抗原、および、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＢＡＧＥ、Ｇ
ＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ｐｉ５などの腫瘍特異的多系列の抗原；ＣＥＡなどの過剰発
現の胚抗原；ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕなどの過剰発現したがん遺伝子および
変異した腫瘍抑制遺伝子；染色体転座に起因する特有の腫瘍抗原（例えば、ＢＣＲ－ＡＢ
Ｌ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、１ＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲ）；および、エプ
スタイン・バーウイルス抗原ＥＢＶＡ並びにヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６
およびＥ７が含まれる。他の、大きな、タンパク質ベースの抗原には、ＴＳＰ－１８０、
ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ＲＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ、ｐｌ８５ｅｒｂ
Ｂ２、ｐｌ８０ｅｒｂｒＢ－３、ｃ－ｍｅｔ、ｎｍ－２３Ｈｌ、ＰＳＡ、ＴＡＧ－７２、
ＣＡ１９－９、ＣＡ７２－４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ－ｒａｓ、βカテニン、Ｃ
ＤＫ４、Ｍｕｍ－１、ｐ１５、ｐ１６、４３－９Ｆ、５Ｔ４（７９１Ｔｇｐ７２｝αフェ
トプロテイン（α－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｍ）、ｂｅｔａ－ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡ
Ａ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５－３＼ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、
ＣＡ－５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｉ、ＣＯ－０２９、ＦＧＦ－５、Ｇ２５０、Ｇａ７
３３ＶＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ－１７５、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１
８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ－ＣＯ－１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ－９０＼Ｍａ
ｃ－２結合タンパク質Ａ、シクロフィリンＣ関連タンパク質、、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２
、ＴＬＰ、およびＴＰＳが含まれる。
ｌ／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ－１）、ｇｌＯＯ（Ｐｍｅｌ１７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ
－１、ＴＲＰ－２などの分化抗原、および、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＢＡＧＥ、Ｇ
ＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ｐｉ５などの腫瘍特異的多系列の抗原；ＣＥＡなどの過剰発
現の胚抗原；ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕなどの過剰発現したがん遺伝子および
変異した腫瘍抑制遺伝子；染色体転座に起因する特有の腫瘍抗原（例えば、ＢＣＲ－ＡＢ
Ｌ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、１ＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲ）；および、エプ
スタイン・バーウイルス抗原ＥＢＶＡ並びにヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６
およびＥ７が含まれる。他の、大きな、タンパク質ベースの抗原には、ＴＳＰ－１８０、
ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ＲＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ、ｐｌ８５ｅｒｂ
Ｂ２、ｐｌ８０ｅｒｂｒＢ－３、ｃ－ｍｅｔ、ｎｍ－２３Ｈｌ、ＰＳＡ、ＴＡＧ－７２、
ＣＡ１９－９、ＣＡ７２－４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ－ｒａｓ、βカテニン、Ｃ
ＤＫ４、Ｍｕｍ－１、ｐ１５、ｐ１６、４３－９Ｆ、５Ｔ４（７９１Ｔｇｐ７２｝αフェ
トプロテイン（α－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｍ）、ｂｅｔａ－ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡ
Ａ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５－３＼ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、
ＣＡ－５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｉ、ＣＯ－０２９、ＦＧＦ－５、Ｇ２５０、Ｇａ７
３３ＶＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ－１７５、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１
８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ－ＣＯ－１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ－９０＼Ｍａ
ｃ－２結合タンパク質Ａ、シクロフィリンＣ関連タンパク質、、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２
、ＴＬＰ、およびＴＰＳが含まれる。
【0112】
一実施形態では、ＣＡＲまたはＴＣＲは、ヒトＣＤ１９のための結合部位を含み、例え
ば、ＣＡＲについては、これは、抗体ＣＤ１９ｓｃＦＶにより提供され得、場合により、
抗ＣＤ１９ｓｃＦＶは、ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１に開示される配列番号１４により
コードされる。一実施形態では、抗ＣＤ１９ｓｃＦＶは、配列番号２０のアミノ酸配列を
含む。本段落の配列は、ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１に示されており、本発明での使用
のために、および、本明細書の１つ以上の請求項に包含され得るために、本明細書に明示
的に組み込まれる。
ば、ＣＡＲについては、これは、抗体ＣＤ１９ｓｃＦＶにより提供され得、場合により、
抗ＣＤ１９ｓｃＦＶは、ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１に開示される配列番号１４により
コードされる。一実施形態では、抗ＣＤ１９ｓｃＦＶは、配列番号２０のアミノ酸配列を
含む。本段落の配列は、ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１に示されており、本発明での使用
のために、および、本明細書の１つ以上の請求項に包含され得るために、本明細書に明示
的に組み込まれる。
【0113】
一実施形態では、ＣＡＲ内のドメインの１つと天然に結合する膜貫通ドメインが用いら
れる。いくつかの例では、膜貫通ドメインを選択するか、アミノ酸置換によっては改変し
て、これらのドメインの同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへの結合を
回避し、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にすることができる。
れる。いくつかの例では、膜貫通ドメインを選択するか、アミノ酸置換によっては改変し
て、これらのドメインの同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへの結合を
回避し、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にすることができる。
【0114】
膜貫通ドメインは、天然起源または合成起源のいずれかに由来してよい。起源が天然の
場合、該ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来してよい。
本発明において特に有用な膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のα、βまたはζ鎖、ＣＤ２８、
ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤＳ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３
、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７またはＣＤ１５４
に由来してよい（すなわち、少なくともこれらの膜貫通領域を含む）。あるいは、膜貫通
ドメインは合成であってよく、その場合、該ドメインは、ロイシンおよびバリンなどの疎
水性残基を主に含むであろう。場合により、フェニルアラニン、トリプトファン、および
バリンの三つ組が、合成膜貫通ドメインの各末端で見出されるであろう。
場合、該ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来してよい。
本発明において特に有用な膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のα、βまたはζ鎖、ＣＤ２８、
ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤＳ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３
、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７またはＣＤ１５４
に由来してよい（すなわち、少なくともこれらの膜貫通領域を含む）。あるいは、膜貫通
ドメインは合成であってよく、その場合、該ドメインは、ロイシンおよびバリンなどの疎
水性残基を主に含むであろう。場合により、フェニルアラニン、トリプトファン、および
バリンの三つ組が、合成膜貫通ドメインの各末端で見出されるであろう。
【0115】
場合により、短いオリゴペプチドの、またはポリペプチドのリンカー、好ましくは２か
～１０のアミノ酸長のリンカーが、ＣＡＲなどの免疫細胞膜貫通タンパク質の、膜貫通ド
メインと、細胞内部分との間の連結を形成する。グリシン－セリンダブレット（ｄｏｕｂ
ｌｅｔ）は、特に好適なリンカー（例えば、本明細書に開示される（Ｇ４Ｓ）ｎリンカー
）を提供する。
～１０のアミノ酸長のリンカーが、ＣＡＲなどの免疫細胞膜貫通タンパク質の、膜貫通ド
メインと、細胞内部分との間の連結を形成する。グリシン－セリンダブレット（ｄｏｕｂ
ｌｅｔ）は、特に好適なリンカー（例えば、本明細書に開示される（Ｇ４Ｓ）ｎリンカー
）を提供する。
【0116】
場合により、膜貫通ドメインは、配列番号１６の核酸配列によりコードされるＣＤ８膜
貫通ドメインである。一実施形態では、ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号２２のアミノ
酸配列を含む。本段落の配列は、ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１に示されており、本発明
での使用のために、および、本明細書の１つ以上の請求項に包含され得るために、本明細
書に明示的に組み込まれる。
貫通ドメインである。一実施形態では、ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号２２のアミノ
酸配列を含む。本段落の配列は、ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１に示されており、本発明
での使用のために、および、本明細書の１つ以上の請求項に包含され得るために、本明細
書に明示的に組み込まれる。
【0117】
いくつかの例では、膜貫通ドメインは、配列番号１５の核酸配列によりコードされる、
ＣＤ８ヒンジドメインを含む。一実施形態では、ＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号２１
のアミノ酸配列を含む。本段落の配列は、ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１に示されており
、本発明での使用のために、および、本明細書の１つ以上の請求項に包含され得るために
、本明細書に明示的に組み込まれる。
ＣＤ８ヒンジドメインを含む。一実施形態では、ＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号２１
のアミノ酸配列を含む。本段落の配列は、ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１に示されており
、本発明での使用のために、および、本明細書の１つ以上の請求項に包含され得るために
、本明細書に明示的に組み込まれる。
【0118】
患者に投与された細胞集団の細胞により発現される、膜貫通タンパク質の細胞内部分、
言い換えれば細胞内シグナル伝達ドメインは、膜貫通タンパク質を発現する免疫細胞の正
常なエフェクター機能（例えば、（例えば、Ｔエフェクター細胞に対して）細胞傷害性ま
たは、（Ｔ制御性細胞に対して）抑制を導くなどの、Ｔ細胞機能）のうち、少なくとも１
つの活性化を担う。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊な機能を指す。Ｔ細
胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解溶解活性またはヘルパー活性であってよく、
サイトカインの分泌を含む。従って、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エ
フェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特殊な機能を実行させるタンパク質の部分を指
す。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を使用することができるが、多くの場合、鎖
全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断された一部が使用される
範囲においては、この切断された一部は、エフェクター機能シグナルを伝達するのであれ
ば、完全な鎖の代わりに使用されてよい。従って、「シグナル伝達ドメイン」という用語
は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの切
断された一部を含むことを意味する。投薬された細胞の膜貫通タンパク質に用いる細胞内
シグナル伝達ドメインの例としては、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および、協調して作用して
抗原受容体の結合に続くシグナル伝達を開始する共受容の、細胞質側の配列、ならびにこ
れらの配列の任意の派生物（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）または変異体、および同じ機能的能
力を有する任意の合成配列を含む。
言い換えれば細胞内シグナル伝達ドメインは、膜貫通タンパク質を発現する免疫細胞の正
常なエフェクター機能（例えば、（例えば、Ｔエフェクター細胞に対して）細胞傷害性ま
たは、（Ｔ制御性細胞に対して）抑制を導くなどの、Ｔ細胞機能）のうち、少なくとも１
つの活性化を担う。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊な機能を指す。Ｔ細
胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解溶解活性またはヘルパー活性であってよく、
サイトカインの分泌を含む。従って、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エ
フェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特殊な機能を実行させるタンパク質の部分を指
す。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を使用することができるが、多くの場合、鎖
全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断された一部が使用される
範囲においては、この切断された一部は、エフェクター機能シグナルを伝達するのであれ
ば、完全な鎖の代わりに使用されてよい。従って、「シグナル伝達ドメイン」という用語
は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの切
断された一部を含むことを意味する。投薬された細胞の膜貫通タンパク質に用いる細胞内
シグナル伝達ドメインの例としては、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および、協調して作用して
抗原受容体の結合に続くシグナル伝達を開始する共受容の、細胞質側の配列、ならびにこ
れらの配列の任意の派生物（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）または変異体、および同じ機能的能
力を有する任意の合成配列を含む。
【0119】
ＴＣＲ単独で生成されたシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化には不十分であり、二次ま
たは共刺激シグナルも必要であることが、知られている。したがって、Ｔ細胞活性化は、
２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列により媒介されると言える。すなわち、Ｔ
ＣＲを介して抗原依存性の一次活性化を開始する細胞質シグナル伝達配列（一次細胞質シ
グナル伝達ドメイン）と、抗原非依存的に作用して、二次または共刺激シグナルを提供す
る細胞質シグナル伝達配列（二次細胞質シグナル伝達ドメイン）である。一次細胞質シグ
ナル伝達配列は、刺激的方法、または、阻害的方法のいずれかで、ＴＣＲ複合体の一次活
性化を制御する。刺激的方法で作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容活性化
チロシンモチーフ、すなわち、ＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含んでよ
い。
たは共刺激シグナルも必要であることが、知られている。したがって、Ｔ細胞活性化は、
２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列により媒介されると言える。すなわち、Ｔ
ＣＲを介して抗原依存性の一次活性化を開始する細胞質シグナル伝達配列（一次細胞質シ
グナル伝達ドメイン）と、抗原非依存的に作用して、二次または共刺激シグナルを提供す
る細胞質シグナル伝達配列（二次細胞質シグナル伝達ドメイン）である。一次細胞質シグ
ナル伝達配列は、刺激的方法、または、阻害的方法のいずれかで、ＴＣＲ複合体の一次活
性化を制御する。刺激的方法で作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容活性化
チロシンモチーフ、すなわち、ＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含んでよ
い。
【0120】
一例では、第１のシグナル伝達ドメインは、一次細胞質シグナル伝達ドメイン（例えば
、ＣＤ３ζドメイン）である。一例では、第１のシグナル伝達ドメインは、二次細胞質シ
グナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ２８または４－１ＢＢドメイン）である。
、ＣＤ３ζドメイン）である。一例では、第１のシグナル伝達ドメインは、二次細胞質シ
グナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ２８または４－１ＢＢドメイン）である。
【0121】
一例では、第１のシグナル伝達ドメインは、１つ以上のＩＴＡＭを含む。
【0122】
本発明において特に有用な、好適なＩＴＡＭ含有一次細胞質シグナル伝達ドメインの例
には、ＴＣＲζ、ＦｃＲｇａｍｍａ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤＳ
、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するシグナル伝達ドメイ
ンが含まれる。本発明の膜貫通タンパク質における細胞質シグナル伝達分子が、ＣＤ３ζ
由来の細胞質シグナル伝達配列を含むことが、特に好ましい。
には、ＴＣＲζ、ＦｃＲｇａｍｍａ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤＳ
、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するシグナル伝達ドメイ
ンが含まれる。本発明の膜貫通タンパク質における細胞質シグナル伝達分子が、ＣＤ３ζ
由来の細胞質シグナル伝達配列を含むことが、特に好ましい。
【0123】
細胞内部分は、場合により、（例えば、第１のシグナル伝達ドメイン、またはさらなる
細胞内ドメインとして）共刺激分子のドメインを含む。共刺激分子は、抗原に対するリン
パ球（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）の効率的な応答に必要とされる抗原受容体または
そのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子の例には、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４
－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ
球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－
Ｈ３、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが含まれる。従って、これらおよ
び他の共刺激エレメントは、膜貫通タンパク質の細胞内部分における使用のための本発明
の範囲内である。
細胞内ドメインとして）共刺激分子のドメインを含む。共刺激分子は、抗原に対するリン
パ球（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）の効率的な応答に必要とされる抗原受容体または
そのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子の例には、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４
－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ
球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－
Ｈ３、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが含まれる。従って、これらおよ
び他の共刺激エレメントは、膜貫通タンパク質の細胞内部分における使用のための本発明
の範囲内である。
【0124】
細胞内部分ドメインは、１つ以上のリンカー、例えば、本明細書に開示される（Ｇ４Ｓ
）ｎリンカーにより、共に連結されていてよい。
）ｎリンカーにより、共に連結されていてよい。
【0125】
一実施形態では、細胞内部分は、ＣＤ３－ζのシグナル伝達ドメインと、ＣＤ２８のシ
グナル伝達ドメインとを含む。別の実施形態では、細胞内部分は、ＣＤ３－ζのシグナル
伝達ドメインと、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインとを含む。さらに別の実施形態では
、細胞内部分は、ＣＤ３－ζのシグナル伝達ドメインと、ＣＤ２８および４－１ＢＢのシ
グナル伝達ドメインとを含む。
グナル伝達ドメインとを含む。別の実施形態では、細胞内部分は、ＣＤ３－ζのシグナル
伝達ドメインと、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインとを含む。さらに別の実施形態では
、細胞内部分は、ＣＤ３－ζのシグナル伝達ドメインと、ＣＤ２８および４－１ＢＢのシ
グナル伝達ドメインとを含む。
【0126】
一実施形態では、細胞内部分は、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインと、ＣＤ３－ζの
シグナル伝達ドメインとを含み、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインは配列番号１７に記
載される核酸配列によりコードされ、ＣＤ３－ζのシグナル伝達ドメインは配列番号１８
に記載される核酸配列によりコードされる。本段落の配列は、ＷＯ２０１２０７９０００
Ａ１に示されており、本発明での使用のために、および、本明細書の１つ以上の請求項に
包含され得るために、本明細書に明示的に組み込まれる。
シグナル伝達ドメインとを含み、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインは配列番号１７に記
載される核酸配列によりコードされ、ＣＤ３－ζのシグナル伝達ドメインは配列番号１８
に記載される核酸配列によりコードされる。本段落の配列は、ＷＯ２０１２０７９０００
Ａ１に示されており、本発明での使用のために、および、本明細書の１つ以上の請求項に
包含され得るために、本明細書に明示的に組み込まれる。
【0127】
一実施形態では、細胞内部分は、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインと、ＣＤ３－ζの
シグナル伝達ドメインとを含み、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号２３の
アミノ酸配列を含み、ＣＤ３－ζのシグナル伝達ドメインは、配列番号２４のアミノ酸配
列を含む。本段落の配列は、ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１に示されており、本発明での
使用のために、および、本明細書の１つ以上の請求項に包含され得るために、本明細書に
明示的に組み込まれる。
シグナル伝達ドメインとを含み、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号２３の
アミノ酸配列を含み、ＣＤ３－ζのシグナル伝達ドメインは、配列番号２４のアミノ酸配
列を含む。本段落の配列は、ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１に示されており、本発明での
使用のために、および、本明細書の１つ以上の請求項に包含され得るために、本明細書に
明示的に組み込まれる。
【0128】
一実施形態では、細胞内部分は、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインと、ＣＤ３－ζの
シグナル伝達ドメインとを含み、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号２３に
記載されるアミノ酸配列を含み、ＣＤ３－ζのシグナル伝達ドメインは、配列番号２４に
記載されるアミノ酸配列を含む。本段落の配列は、ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１に示さ
れており、本発明での使用のために、および、本明細書の１つ以上の請求項に包含され得
るために、本明細書に明示的に組み込まれる。
シグナル伝達ドメインとを含み、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号２３に
記載されるアミノ酸配列を含み、ＣＤ３－ζのシグナル伝達ドメインは、配列番号２４に
記載されるアミノ酸配列を含む。本段落の配列は、ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１に示さ
れており、本発明での使用のために、および、本明細書の１つ以上の請求項に包含され得
るために、本明細書に明示的に組み込まれる。
【0129】
Ｔ細胞および他の免疫細胞の起源は、ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１、ＵＳ８９０６６
８２、ＵＳ８９１１９９３、ＵＳ８９１６３８１、ＵＳ８９７５０７１、ＵＳ９１０１５
８４、ＵＳ９１０２７６０、ＵＳ９１０２７６１、ＵＳ９３２８１５６、ＵＳ９４６４１
４０、ＵＳ９４８１７２８、ＵＳ９４９９６２９、ＵＳ９５１８１２３、ＵＳ９５４０４
４５、ＵＳ２０１３０２８７７４８、ＵＳ２０１３０２８８３６８、ＵＳ２０１３０３０
９２５８、ＵＳ２０１４０１０６４４９、ＵＳ２０１４０３７００１７、ＵＳ２０１５０
０５０７２９、ＵＳ２０１５００９３８２２、ＵＳ２０１５００９９２９９、ＵＳ２０１
５０１１８２０２、ＵＳ２０１６０１３０３５５、ＵＳ２０１６０１５９９０７、ＵＳ２
０１６０１９４４０４、ＵＳ２０１６０２０８０１２に開示されており、並びに、これら
を生成、活性化、および増幅する方法も開示されている。これらの開示は、本発明を実施
する際の可能性のある使用のために参照される。
８２、ＵＳ８９１１９９３、ＵＳ８９１６３８１、ＵＳ８９７５０７１、ＵＳ９１０１５
８４、ＵＳ９１０２７６０、ＵＳ９１０２７６１、ＵＳ９３２８１５６、ＵＳ９４６４１
４０、ＵＳ９４８１７２８、ＵＳ９４９９６２９、ＵＳ９５１８１２３、ＵＳ９５４０４
４５、ＵＳ２０１３０２８７７４８、ＵＳ２０１３０２８８３６８、ＵＳ２０１３０３０
９２５８、ＵＳ２０１４０１０６４４９、ＵＳ２０１４０３７００１７、ＵＳ２０１５０
０５０７２９、ＵＳ２０１５００９３８２２、ＵＳ２０１５００９９２９９、ＵＳ２０１
５０１１８２０２、ＵＳ２０１６０１３０３５５、ＵＳ２０１６０１５９９０７、ＵＳ２
０１６０１９４４０４、ＵＳ２０１６０２０８０１２に開示されており、並びに、これら
を生成、活性化、および増幅する方法も開示されている。これらの開示は、本発明を実施
する際の可能性のある使用のために参照される。
【0130】
本方法による処置または予防のためのがん
【0131】
治療され得るがんには、血管新生されないか、実質的に血管新生されない腫瘍、並びに
、血管新生された腫瘍が含まれる。がんは、非固形腫瘍（例えば、白血病およびリンパ腫
などの血液系腫瘍）を含むか、または固形腫瘍を含み得る。本発明で処置されるがんのタ
イプには、細胞種（細胞腫）、芽細胞腫、および肉腫（肉腫）、およびある種の白血病ま
たはリンパ系悪性腫瘍、良性および悪性腫瘍、悪性腫瘍（例えば、肉腫、細胞腫およびメ
ラノーマ）が含まれるが、これらに限定されない。成人腫瘍／がんおよび小児腫瘍／がん
もまた含まれる。
、血管新生された腫瘍が含まれる。がんは、非固形腫瘍（例えば、白血病およびリンパ腫
などの血液系腫瘍）を含むか、または固形腫瘍を含み得る。本発明で処置されるがんのタ
イプには、細胞種（細胞腫）、芽細胞腫、および肉腫（肉腫）、およびある種の白血病ま
たはリンパ系悪性腫瘍、良性および悪性腫瘍、悪性腫瘍（例えば、肉腫、細胞腫およびメ
ラノーマ）が含まれるが、これらに限定されない。成人腫瘍／がんおよび小児腫瘍／がん
もまた含まれる。
【0132】
血液がんは、血液または骨髄のがんである。血液性（または血行性）のがんの例には、
急性白血病（急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄白血病、および、骨髄芽
球性白血病、前骨髄球性（ｐｒｏｍｙｅｉｏｃｙｔｉｃ）白血病、骨髄単球性白血病、単
球性白血病、および赤白血病など）、慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性
骨髄性白血病、および慢性リンパ性白血病など）、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキ
ン病、非ホジキンリンパ腫（低悪性度および高悪性度の）、多発性骨髄腫，ワルデンスト
レーム高ガンマグロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、ヘアリー細胞白血病および
骨髄形成異常症を含む、白血病が含まれる。
急性白血病（急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄白血病、および、骨髄芽
球性白血病、前骨髄球性（ｐｒｏｍｙｅｉｏｃｙｔｉｃ）白血病、骨髄単球性白血病、単
球性白血病、および赤白血病など）、慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性
骨髄性白血病、および慢性リンパ性白血病など）、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキ
ン病、非ホジキンリンパ腫（低悪性度および高悪性度の）、多発性骨髄腫，ワルデンスト
レーム高ガンマグロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、ヘアリー細胞白血病および
骨髄形成異常症を含む、白血病が含まれる。
【0133】
固形腫瘍は、通常嚢胞または液体領域を含有しない、組織の異常な腫瘤である。固形腫
瘍は、良性または悪性であり得る。さまざまなタイプの固形腫瘍は、それらを形成する細
胞のタイプ（肉腫、細胞腫、およびリンパ腫など）について、名前が付けられている。肉
腫および細胞種などの固形腫瘍の例には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫，軟骨肉腫、骨
肉腫、および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結
腸がん，リンパ系腫瘍、膵臓がん、乳がん，肺がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞がん
、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺癌、汗腺がん，甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、褐色細
胞腫皮脂腺細胞腫、乳頭がん，乳頭状腺がん、髄様がん，気管支原性肺癌、腎細胞がん、
肝細胞がん，胆管細胞腫、絨毛がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、セミノー
マ、膀胱がん、メラノーマ、および中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍（例えば、神経膠腫（脳幹
神経膠腫および混合神経膠腫など）、神経膠芽腫（多形神経膠芽腫としても知られる）、
星細胞腫、中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫，胚細胞腫、髄芽腫、シュワン細胞腫、頭蓋咽
頭腫（ｃｒａｎｉｏｐｈａｒｙｏｇｉｏｍａ）、脳室上衣腫、松果体腫（ｐｉｎｅａｉｏ
ｍａ）、血管芽細胞腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）
、神経芽腫、網膜芽細胞腫および脳転移）が含まれる。
瘍は、良性または悪性であり得る。さまざまなタイプの固形腫瘍は、それらを形成する細
胞のタイプ（肉腫、細胞腫、およびリンパ腫など）について、名前が付けられている。肉
腫および細胞種などの固形腫瘍の例には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫，軟骨肉腫、骨
肉腫、および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結
腸がん，リンパ系腫瘍、膵臓がん、乳がん，肺がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞がん
、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺癌、汗腺がん，甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、褐色細
胞腫皮脂腺細胞腫、乳頭がん，乳頭状腺がん、髄様がん，気管支原性肺癌、腎細胞がん、
肝細胞がん，胆管細胞腫、絨毛がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、セミノー
マ、膀胱がん、メラノーマ、および中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍（例えば、神経膠腫（脳幹
神経膠腫および混合神経膠腫など）、神経膠芽腫（多形神経膠芽腫としても知られる）、
星細胞腫、中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫，胚細胞腫、髄芽腫、シュワン細胞腫、頭蓋咽
頭腫（ｃｒａｎｉｏｐｈａｒｙｏｇｉｏｍａ）、脳室上衣腫、松果体腫（ｐｉｎｅａｉｏ
ｍａ）、血管芽細胞腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）
、神経芽腫、網膜芽細胞腫および脳転移）が含まれる。
【0134】
一実施形態では、投与された細胞は、特定の癌を処置するように設計された第１の抗原
結合部位（例えば、ＣＡＲによって含まれる）を発現する。例えば、第１の抗原結合部位
は、ＣＤ１９に特異的に結合して、がんおよび疾患、例えば、前駆Ｂリンパ芽球性白血病
リンパ腫（ｐｒｅ－Ｂ ＡＬＬ）（小児適応症）、成人の急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）
、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、または同種骨髄移植後のサ
ルベージを処置するために用いられ得る。別の実施形態では、第１の部分または第１の結
合部位は、ＣＤ２２に特異的に結合して、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫を処置する。
結合部位（例えば、ＣＡＲによって含まれる）を発現する。例えば、第１の抗原結合部位
は、ＣＤ１９に特異的に結合して、がんおよび疾患、例えば、前駆Ｂリンパ芽球性白血病
リンパ腫（ｐｒｅ－Ｂ ＡＬＬ）（小児適応症）、成人の急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）
、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、または同種骨髄移植後のサ
ルベージを処置するために用いられ得る。別の実施形態では、第１の部分または第１の結
合部位は、ＣＤ２２に特異的に結合して、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫を処置する。
【0135】
一実施形態では、がんおよび疾患には、ｐｒｅ－Ｂ ＡＬＬ（小児適応症）、成人の急
性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫
、同種骨髄移植後のサルベージなどが含まれるがこれらに限定されず、ＣＤ１９、ＣＤ２
０、ＣＤ２２、およびＲＯＲ１のうち２つまたは３つを標的とする複数の架橋剤（ｂｒｉ
ｄｇｉｎｇ ａｇｅｎｔ）（または、単一の剤に含まれる複数の結合部分もしくは結合部
位）の組み合わせを用いて処置することができる。
性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫
、同種骨髄移植後のサルベージなどが含まれるがこれらに限定されず、ＣＤ１９、ＣＤ２
０、ＣＤ２２、およびＲＯＲ１のうち２つまたは３つを標的とする複数の架橋剤（ｂｒｉ
ｄｇｉｎｇ ａｇｅｎｔ）（または、単一の剤に含まれる複数の結合部分もしくは結合部
位）の組み合わせを用いて処置することができる。
【0136】
一例では、細胞は、異なる（例えば、その標的抗原において異なる（かつ、場合により
他の点では同一である））、第１および第２の膜貫通タンパク質（例えば、Ｔ細胞により
発現された、２つのＣＡＲまたは、１つのＣＡＲおよび操作されたＴＣＲ）を含む。同様
に、本発明は、例えば同一の移植片に含まれる、免疫細胞の混合物（例えば、ＣＡＲ細胞
の混合物）を用いてよく、ここで、混合物は、異なる（例えば、その標的抗原において異
なる（かつ、場合により他の点では同一である））膜貫通タンパク質（例えば、Ｔ細胞に
より発現された、２つのＣＡＲまたは、１つのＣＡＲおよび操作されたＴＣＲ）を含む細
胞を含む。これは、例えば、がんによる処置に対する抵抗を低下させるため、あるいは、
複数の標的抗原を表面発現するがん細胞などの細胞集団をより効果的に標的とするために
、有用であり得る。
他の点では同一である））、第１および第２の膜貫通タンパク質（例えば、Ｔ細胞により
発現された、２つのＣＡＲまたは、１つのＣＡＲおよび操作されたＴＣＲ）を含む。同様
に、本発明は、例えば同一の移植片に含まれる、免疫細胞の混合物（例えば、ＣＡＲ細胞
の混合物）を用いてよく、ここで、混合物は、異なる（例えば、その標的抗原において異
なる（かつ、場合により他の点では同一である））膜貫通タンパク質（例えば、Ｔ細胞に
より発現された、２つのＣＡＲまたは、１つのＣＡＲおよび操作されたＴＣＲ）を含む細
胞を含む。これは、例えば、がんによる処置に対する抵抗を低下させるため、あるいは、
複数の標的抗原を表面発現するがん細胞などの細胞集団をより効果的に標的とするために
、有用であり得る。
【0137】
一実施形態では、抗原結合部位は、メンテリンに特異的に結合して、中皮腫、膵臓がん
、卵巣がんを、処置または予防する。
、卵巣がんを、処置または予防する。
【0138】
一実施形態では、抗原結合部位は、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａに特異的に結合して、急性骨
髄白血病を、処置または予防する。
髄白血病を、処置または予防する。
【0139】
一実施形態では、抗原結合部位は、ｃ－Ｍｅｔに特異的に結合して、トリプルネガティ
ブ乳がんまたは非小細胞肺がんを、処置または予防する。
ブ乳がんまたは非小細胞肺がんを、処置または予防する。
【0140】
一実施形態では、抗原結合部位は、ＰＳＭＡに特異的に結合して、前立腺がんを、処置
または予防する。
または予防する。
【0141】
一実施形態では、抗原結合部位は、糖脂質Ｆ７７に特異的に結合して、前立腺がんを、
処置または予防する。
処置または予防する。
【0142】
一実施形態では、抗原結合部位は、ＥＧＦＲｖＩｌＩに特異的に結合して、膠芽腫（ｇ
ｌｉｏｂａｓｔｏｍａ）を、処置または予防する。
ｌｉｏｂａｓｔｏｍａ）を、処置または予防する。
【0143】
一実施形態では、抗原結合部位は、ＧＤ－２に特異的に結合して、神経芽腫またはメラ
ノーマを、処置または予防する。
ノーマを、処置または予防する。
【0144】
一実施形態では、抗原結合部位は、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲに特異的に結合して、骨
髄種、肉種、またはメラノーマを処置する。
髄種、肉種、またはメラノーマを処置する。
【0145】
一実施形態では、抗原結合部位は、ＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲに結合して、骨髄腫、肉腫
およびメラノーマを処置する。
およびメラノーマを処置する。
【0146】
特異的抗原結合は、インビトロで、２５℃または室温で、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ
）により決定される、１ｍＭ以下（例えば、１ｍＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下
、１ｎＭ以下、１００ｐＭ以下、または１０ｐＭ以下）のＫＤによる結合である。
）により決定される、１ｍＭ以下（例えば、１ｍＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下
、１ｎＭ以下、１００ｐＭ以下、または１０ｐＭ以下）のＫＤによる結合である。
【0147】
１つの例では、本方法を用いた前記処置は、疾病または症状、またはその徴候の進行を
低減させる。１つの例では、本方法を用いた前記処置は、例えば、少なくとも、１、２、
３、４または５年間、疾病または症状、またはその徴候の発生率を低減させる。
低減させる。１つの例では、本方法を用いた前記処置は、例えば、少なくとも、１、２、
３、４または５年間、疾病または症状、またはその徴候の発生率を低減させる。
【0148】
一例では、本方法は、哺乳動物、例えばヒト、男性または女性、または男児または女児
、またはヒト乳児（例えば、１、２、３または４歳未満）で、インビボで行われる。一例
では、患者は成人または小児のヒト患者である。
、またはヒト乳児（例えば、１、２、３または４歳未満）で、インビボで行われる。一例
では、患者は成人または小児のヒト患者である。
【0149】
ＣＡＲまたはＴＣＲは操作されている、すなわち、天然に存在しない部分とドメインの
組み合わせを含む。一例では、細胞療法は、標的細胞を標的とし、標的細胞はがん細胞で
あり、例えば、白血病細胞、リンパ腫細胞、腺がん細胞、または、がん幹細胞である。場
合により、投与される免疫細胞のＣＡＲまたはＴＣＲは、ヒトＣＤ１９（場合により、標
的細胞は、白血病細胞またはリンパ腫細胞である）、ＥｐＣＡＭ（場合により、標的細胞
は、肺がん細胞、胃腸がん細胞、腺癌、がん幹細胞である）、ＣＤ２０（場合により、標
的細胞は白血病細胞である）、ＭＣＳＰ（場合により、標的細胞はメラノーマ細胞である
）、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、シアリルＴｎ、ＣＤ１３３、ＣＤ３３（場合
により、標的細胞は、白血病細胞であり、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞であ
る）、ＰＭＳＡ、ＷＴ１、ＣＤ２２、Ｌ１ＣＡＭ、ＲＯＲ－１、ＭＵＣ－１６、ＣＤ３０
、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ｇｐＡ３３、ＴＡＧ－７２、ムチン、ＣＩＸ、ＧＤ２、ＧＤ３、
ＧＭ２、ＣＤ１２３、ＶＥＧＦＲ、インテグリン、ｃＭＥＴ、Ｈｅｒ１、Ｈｅｒ２、Ｈｅ
ｒ３、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ
３、ＣＤ６６ｅ、ＥｐｈＡ２，ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、
アンジオポエチン、メンテリン、糖脂質Ｆ７７またはテネイシンに、特異的に結合する。
組み合わせを含む。一例では、細胞療法は、標的細胞を標的とし、標的細胞はがん細胞で
あり、例えば、白血病細胞、リンパ腫細胞、腺がん細胞、または、がん幹細胞である。場
合により、投与される免疫細胞のＣＡＲまたはＴＣＲは、ヒトＣＤ１９（場合により、標
的細胞は、白血病細胞またはリンパ腫細胞である）、ＥｐＣＡＭ（場合により、標的細胞
は、肺がん細胞、胃腸がん細胞、腺癌、がん幹細胞である）、ＣＤ２０（場合により、標
的細胞は白血病細胞である）、ＭＣＳＰ（場合により、標的細胞はメラノーマ細胞である
）、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、シアリルＴｎ、ＣＤ１３３、ＣＤ３３（場合
により、標的細胞は、白血病細胞であり、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞であ
る）、ＰＭＳＡ、ＷＴ１、ＣＤ２２、Ｌ１ＣＡＭ、ＲＯＲ－１、ＭＵＣ－１６、ＣＤ３０
、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ｇｐＡ３３、ＴＡＧ－７２、ムチン、ＣＩＸ、ＧＤ２、ＧＤ３、
ＧＭ２、ＣＤ１２３、ＶＥＧＦＲ、インテグリン、ｃＭＥＴ、Ｈｅｒ１、Ｈｅｒ２、Ｈｅ
ｒ３、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ
３、ＣＤ６６ｅ、ＥｐｈＡ２，ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、
アンジオポエチン、メンテリン、糖脂質Ｆ７７またはテネイシンに、特異的に結合する。
【0150】
場合により、ＣＡＲは、ブリナツモマブまたは抗体ＨＤ３７のＣＤ１９結合部位、カツ
マキソマブのＥｐＣＡＭ結合部位、ＡＦＭ１１のＣＤ１９結合部位、Ｌｙｍｐｈｏｍｕｎ
のＣＤ２０結合部位、ＥｒｔｕｍａｘｏｍａｂのＨｅｒ２結合部位、ＡＭＧ２１１（ＭＥ
ＤＩ－５６５，ＭＴ１１１）のＣＥＡ結合部位、ＰａｓｏｔｕｘｉｚｕｍａｂのＰＳＭＡ
結合部位、ｓｏｌｉｔｏｍａｂのＥｐＣＡＭ結合部位、ＲＧ７２２１またはＲＧ７７１６
のＶＥＧＦまたはアンジオポエチン２結合部位、ＲＧ７５９７のＨｅｒ１またはＨｅｒ３
結合部位、ＭＭ１１１のＨｅｒ２またはＨｅｒ３結合部位、ＭＭ１４１のＩＧＦ１Ｒまた
はＨｅｒ３結合部位、ＭＧＤ００６のＣＤ１２３結合部位、ＭＧＤ００７のｇｐａ３３結
合部位、ＴＦ２のＣＥＡ結合部位、ＡＦＭ１３のＣＤ３０結合部位、ＡＦＭ１１のＣＤ１
９結合部位、および、ＬＹ３１６４５３０のＨｅｒ１またはｃＭｅｔ結合部位からなる群
から選択される、抗体の可変ドメインを含む。
マキソマブのＥｐＣＡＭ結合部位、ＡＦＭ１１のＣＤ１９結合部位、Ｌｙｍｐｈｏｍｕｎ
のＣＤ２０結合部位、ＥｒｔｕｍａｘｏｍａｂのＨｅｒ２結合部位、ＡＭＧ２１１（ＭＥ
ＤＩ－５６５，ＭＴ１１１）のＣＥＡ結合部位、ＰａｓｏｔｕｘｉｚｕｍａｂのＰＳＭＡ
結合部位、ｓｏｌｉｔｏｍａｂのＥｐＣＡＭ結合部位、ＲＧ７２２１またはＲＧ７７１６
のＶＥＧＦまたはアンジオポエチン２結合部位、ＲＧ７５９７のＨｅｒ１またはＨｅｒ３
結合部位、ＭＭ１１１のＨｅｒ２またはＨｅｒ３結合部位、ＭＭ１４１のＩＧＦ１Ｒまた
はＨｅｒ３結合部位、ＭＧＤ００６のＣＤ１２３結合部位、ＭＧＤ００７のｇｐａ３３結
合部位、ＴＦ２のＣＥＡ結合部位、ＡＦＭ１３のＣＤ３０結合部位、ＡＦＭ１１のＣＤ１
９結合部位、および、ＬＹ３１６４５３０のＨｅｒ１またはｃＭｅｔ結合部位からなる群
から選択される、抗体の可変ドメインを含む。
【0151】
場合により、ＣＡＲは、ＲｅｏＰｒｏ（商標）、アブシキシマブ、Ｒｉｔｕｘａｎ（商
標）、リツキシマブ、Ｚｅｎａｐａｘ（商標）、ダクリズマブ、Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（商標
）、バシリキシマブ、Ｓｙｎａｇｉｓ（商標）、パリビズマブ、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（商標
）、インフリキシマブ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）、トラスツズマブ、Ｍｙｌｏｔａｒ
ｇ（商標）、ゲムツズマブ、Ｃａｍｐａｔｈ（商標）、アレムツズマブ、Ｚｅｖａｌｉｎ
（商標）、イブリツモマブ、Ｈｕｍｉｒａ（商標）、アダリムマブ、Ｘｏｌａｉｒ（商標
）、オマリズマブ、Ｂｅｘｘａｒ（商標）、トシツモマブ、Ｒａｐｔｉｖａ（商標）、エ
ファリズマブ、Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標）、セツキシマブ、Ａｖａｓｔｉｎ（商標）、ベバ
シズマブ、Ｔｙｓａｂｒｉ（商標）、ナタリズマブ、Ａｃｔｅｍｒａ（商標）、トシリズ
マブ、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（商標）、パニツムマブ、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（商標）、ラニビズ
マブ、Ｓｏｌｉｒｉｓ（商標）、エクリズマブ、Ｃｉｍｚｉａ（商標）、セルトリズマブ
、Ｓｉｍｐｏｎｉ（商標）、ゴリムマブ、Ｉｌａｒｉｓ（商標）、カナキムマブ、Ｓｔｅ
ｌａｒａ（商標）、ウステキヌマブ、Ａｒｚｅｒｒａ（商標）、オファツムマブ、Ｐｒｏ
ｌｉａ（商標）、デノスマブ、Ｎｕｍａｘ（商標）、モタビズマブ、ＡＢＴｈｒａｘ（商
標）、ラキシバクマブ、Ｂｅｎｌｙｓｔａ（商標）、ベリムマブ、Ｙｅｒｖｏｙ（商標）
、イピリムマブ、Ａｄｃｅｔｒｉｓ（商標）、ブレンツキシマブ、Ｖｅｄｏｔｉｎ（商標
）、Ｐｅｒｊｅｔａ（商標）、ペルツズマブ、Ｋａｄｃｙｌａ（商標）、アドトラスツズ
マブ、Ｇａｚｙｖａ（商標）およびオビヌツズマブからなる群から選択される抗体の抗原
結合部位の可変ドメインを含む。
標）、リツキシマブ、Ｚｅｎａｐａｘ（商標）、ダクリズマブ、Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（商標
）、バシリキシマブ、Ｓｙｎａｇｉｓ（商標）、パリビズマブ、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（商標
）、インフリキシマブ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）、トラスツズマブ、Ｍｙｌｏｔａｒ
ｇ（商標）、ゲムツズマブ、Ｃａｍｐａｔｈ（商標）、アレムツズマブ、Ｚｅｖａｌｉｎ
（商標）、イブリツモマブ、Ｈｕｍｉｒａ（商標）、アダリムマブ、Ｘｏｌａｉｒ（商標
）、オマリズマブ、Ｂｅｘｘａｒ（商標）、トシツモマブ、Ｒａｐｔｉｖａ（商標）、エ
ファリズマブ、Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標）、セツキシマブ、Ａｖａｓｔｉｎ（商標）、ベバ
シズマブ、Ｔｙｓａｂｒｉ（商標）、ナタリズマブ、Ａｃｔｅｍｒａ（商標）、トシリズ
マブ、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（商標）、パニツムマブ、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（商標）、ラニビズ
マブ、Ｓｏｌｉｒｉｓ（商標）、エクリズマブ、Ｃｉｍｚｉａ（商標）、セルトリズマブ
、Ｓｉｍｐｏｎｉ（商標）、ゴリムマブ、Ｉｌａｒｉｓ（商標）、カナキムマブ、Ｓｔｅ
ｌａｒａ（商標）、ウステキヌマブ、Ａｒｚｅｒｒａ（商標）、オファツムマブ、Ｐｒｏ
ｌｉａ（商標）、デノスマブ、Ｎｕｍａｘ（商標）、モタビズマブ、ＡＢＴｈｒａｘ（商
標）、ラキシバクマブ、Ｂｅｎｌｙｓｔａ（商標）、ベリムマブ、Ｙｅｒｖｏｙ（商標）
、イピリムマブ、Ａｄｃｅｔｒｉｓ（商標）、ブレンツキシマブ、Ｖｅｄｏｔｉｎ（商標
）、Ｐｅｒｊｅｔａ（商標）、ペルツズマブ、Ｋａｄｃｙｌａ（商標）、アドトラスツズ
マブ、Ｇａｚｙｖａ（商標）およびオビヌツズマブからなる群から選択される抗体の抗原
結合部位の可変ドメインを含む。
【0152】
一例では、標的細胞は血液細胞、例えば、ヒトまたは動物の、幹細胞または骨髄細胞で
ある。場合により、標的細胞は、Ｂ細胞またはＴ細胞である。
ある。場合により、標的細胞は、Ｂ細胞またはＴ細胞である。
【0153】
一例では、ＣＡＲまたはＴＣＲは、自己免疫性の疾病の標的のための抗原結合部位を含
み、シグナル伝達は免疫細胞の細胞傷害活性または増殖をダウンレギュレートする。本明
細書で用いられる場合、「自己免疫性の疾病」という用語は、自己免疫応答の結果生じる
疾患として規定される。自己免疫性の疾病は、自己抗原に対する、不適切および過度な応
答の結果である。自己免疫性の疾病の例には、とりわけ、、アジソン病、円形脱毛症（ａ
ｌｏｐｅｃｉａ ｇｒｅａｔａ ａｒｅａｔａ）、強直性脊椎炎、自己免疫性の肝炎、自
己免疫性の耳下腺炎、クローン病、糖尿病（Ｉ型）、栄養障害型表皮水疱症、精巣上体炎
、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群（Ｇｕｉｌｌａｉｎ－Ｂａｒｒ ｓ
ｙｎｄｒｏｍｅ）、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症
筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症
、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、血管炎、白斑、粘液水腫、悪性貧血、潰
瘍性大腸炎が含まれるが、これらに限定されない。メモリーＴ細胞集団全体の範囲内で、
いくつかの異なる亜集団が記載されており、ケモカイン受容体ＣＣＲ７およびＬ－セレク
チン（ＣＤ６２Ｌ）の示差的発現によって認識され得る。ステムメモリーＴＳＣＭ細胞は
、ＣＤ４５ＲＯ－、ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋（Ｌ－セレクチン）、Ｃ
Ｄ２７＋、ＣＤ２８＋およびＩＬ－７Ｒα＋であるが、大量のＣＤ９５、ＩＬ－２Ｒβ、
ＣＸＣＲ３およびＬＦＡ－１も発現し、メモリー細胞特有の多数の機能的属性を示す。セ
ントラルメモリーＴＣＭ細胞は、Ｌ－セレクチンおよびＣＣＲ７を発現し、ＩＬ－２を分
泌するが、ＩＦＮγまたはＩＬ－４は分泌しない。しかしながら、エフェクターメモリー
ＴＥＭ細胞は、Ｌ－セレクチンまたはＣＣＲ７は発現しないが、エフェクターサイトカイ
ン様ＩＦＮγおよびＩＬ－４を生産する。ＴＳＣＭなどのメモリーＴ細胞は、ヒトにおい
て、操作された免疫細胞の持続する集団を確立するために、特に有用であり得る。
み、シグナル伝達は免疫細胞の細胞傷害活性または増殖をダウンレギュレートする。本明
細書で用いられる場合、「自己免疫性の疾病」という用語は、自己免疫応答の結果生じる
疾患として規定される。自己免疫性の疾病は、自己抗原に対する、不適切および過度な応
答の結果である。自己免疫性の疾病の例には、とりわけ、、アジソン病、円形脱毛症（ａ
ｌｏｐｅｃｉａ ｇｒｅａｔａ ａｒｅａｔａ）、強直性脊椎炎、自己免疫性の肝炎、自
己免疫性の耳下腺炎、クローン病、糖尿病（Ｉ型）、栄養障害型表皮水疱症、精巣上体炎
、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群（Ｇｕｉｌｌａｉｎ－Ｂａｒｒ ｓ
ｙｎｄｒｏｍｅ）、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症
筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症
、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、血管炎、白斑、粘液水腫、悪性貧血、潰
瘍性大腸炎が含まれるが、これらに限定されない。メモリーＴ細胞集団全体の範囲内で、
いくつかの異なる亜集団が記載されており、ケモカイン受容体ＣＣＲ７およびＬ－セレク
チン（ＣＤ６２Ｌ）の示差的発現によって認識され得る。ステムメモリーＴＳＣＭ細胞は
、ＣＤ４５ＲＯ－、ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋（Ｌ－セレクチン）、Ｃ
Ｄ２７＋、ＣＤ２８＋およびＩＬ－７Ｒα＋であるが、大量のＣＤ９５、ＩＬ－２Ｒβ、
ＣＸＣＲ３およびＬＦＡ－１も発現し、メモリー細胞特有の多数の機能的属性を示す。セ
ントラルメモリーＴＣＭ細胞は、Ｌ－セレクチンおよびＣＣＲ７を発現し、ＩＬ－２を分
泌するが、ＩＦＮγまたはＩＬ－４は分泌しない。しかしながら、エフェクターメモリー
ＴＥＭ細胞は、Ｌ－セレクチンまたはＣＣＲ７は発現しないが、エフェクターサイトカイ
ン様ＩＦＮγおよびＩＬ－４を生産する。ＴＳＣＭなどのメモリーＴ細胞は、ヒトにおい
て、操作された免疫細胞の持続する集団を確立するために、特に有用であり得る。
【0154】
本明細書の免疫細胞、標的細胞、または幹細胞は、一例では、ＴＳＣＭ、ＴＣＭまたは
ＴＥＭ細胞、例えば、ヒトＴＳＣＭ、ＴＣＭまたはＴＥＭ細胞であり得る。一例では、細
胞療法の免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）はそれぞれ、自己免疫性の疾病、炎症性の
疾病、ウイルス感染症、またはがんを患っているヒトの細胞の子孫であり、例えば、該ヒ
トは、リンパ性白血病、ＡＬＬ（例えば、Ｔ－ＡＬＬ）、ＣＬＬ（例えば、Ｂ細胞慢性リ
ンパ性白血病）または非ホジキンリンパ腫を患っている。該ヒトは、例えば、該患者また
はその親戚（例えば、兄弟または親）であってよい。
ＴＥＭ細胞、例えば、ヒトＴＳＣＭ、ＴＣＭまたはＴＥＭ細胞であり得る。一例では、細
胞療法の免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）はそれぞれ、自己免疫性の疾病、炎症性の
疾病、ウイルス感染症、またはがんを患っているヒトの細胞の子孫であり、例えば、該ヒ
トは、リンパ性白血病、ＡＬＬ（例えば、Ｔ－ＡＬＬ）、ＣＬＬ（例えば、Ｂ細胞慢性リ
ンパ性白血病）または非ホジキンリンパ腫を患っている。該ヒトは、例えば、該患者また
はその親戚（例えば、兄弟または親）であってよい。
【0155】
一例では、投与される免疫細胞は、シグナル伝達が増強されるように、操作されており
、ここで、シグナル伝達は、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳおよびＣＤ４０
シグナル伝達から選択される。
、ここで、シグナル伝達は、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳおよびＣＤ４０
シグナル伝達から選択される。
【0156】
場合により、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）は死滅する。一例では、各標的細胞は、腫
瘍細胞であり、本方法は、ヒトにおいて、がんのリスクを処置または低減し、あるいは、
がん進行のリスクを処置または低減する。
瘍細胞であり、本方法は、ヒトにおいて、がんのリスクを処置または低減し、あるいは、
がん進行のリスクを処置または低減する。
【0157】
場合により、ヒトはがんを有する。一例では、がんは血液がんである。一例では、ヒト
は、Ｂ細胞起源のがんを有する。一例では、ヒトは、Ｔ細胞起源のがんを有する。例えば
、がんは肺がん、メラノーマ、乳がん、前立腺がん、結腸がん、腎細胞がん、卵巣がん、
神経芽腫、横紋筋肉腫、白血病およびリンパ腫である。本発明に使用するのに好ましいが
んの標的は、Ｂ細胞起源のがんであり、特に急性リンパ性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ性白
血病またはＢ細胞非ホジキンリンパ腫を含む。一例では、がんはＴ細胞またはＢ細胞起源
のがんであり、例えば、リンパ性白血病、ＡＬＬ（例えば、Ｔ－ＡＬＬ）、ＣＬＬ（例え
ば、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病）、または非ホジキンリンパ腫である。場合により、投与
される免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－細胞）はそれぞれ、前記ヒトの免疫細胞の子孫であり
、例えば、該ヒトは、リンパ性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）
、ＡＬＬ（例えば、Ｔ－ＡＬＬまたはＢ－ＡＬＬ）、ＣＬＬ（例えば、Ｂ細胞慢性リンパ
性白血病）または非ホジキンリンパ腫を患っている。場合により、投与される免疫細胞（
例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）はそれぞれ、前記ヒトの自家細胞（例えば、Ｔ細胞）であるか
、該自家細胞の子孫である。本明細書で用いられる場合、用語「自家の」は、後に再導入
される個体と同一の個体に由来する任意の物質を指すことが意図されている。「同種の」
は、同じ種の異なる動物に由来するグラフトを指す。
は、Ｂ細胞起源のがんを有する。一例では、ヒトは、Ｔ細胞起源のがんを有する。例えば
、がんは肺がん、メラノーマ、乳がん、前立腺がん、結腸がん、腎細胞がん、卵巣がん、
神経芽腫、横紋筋肉腫、白血病およびリンパ腫である。本発明に使用するのに好ましいが
んの標的は、Ｂ細胞起源のがんであり、特に急性リンパ性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ性白
血病またはＢ細胞非ホジキンリンパ腫を含む。一例では、がんはＴ細胞またはＢ細胞起源
のがんであり、例えば、リンパ性白血病、ＡＬＬ（例えば、Ｔ－ＡＬＬ）、ＣＬＬ（例え
ば、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病）、または非ホジキンリンパ腫である。場合により、投与
される免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－細胞）はそれぞれ、前記ヒトの免疫細胞の子孫であり
、例えば、該ヒトは、リンパ性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）
、ＡＬＬ（例えば、Ｔ－ＡＬＬまたはＢ－ＡＬＬ）、ＣＬＬ（例えば、Ｂ細胞慢性リンパ
性白血病）または非ホジキンリンパ腫を患っている。場合により、投与される免疫細胞（
例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）はそれぞれ、前記ヒトの自家細胞（例えば、Ｔ細胞）であるか
、該自家細胞の子孫である。本明細書で用いられる場合、用語「自家の」は、後に再導入
される個体と同一の個体に由来する任意の物質を指すことが意図されている。「同種の」
は、同じ種の異なる動物に由来するグラフトを指す。
【0158】
場合により、投与される細胞（例えば、ＣＡＲ－細胞）はそれぞれ、ヒトの血液または
腫瘍サンプルに由来し、ステップ（ｃ）の前に、インビトロで活性化および増殖される。
「活性化」は、本明細書で用いられる場合、検出可能な細胞増殖を誘導するために十分に
刺激されたＴ細胞または他の免疫細胞の状態をいう。活性化はまた、誘導されたサイトカ
イン生産、および、検出可能なエフェクター機能とも、関連し得る。用語「活性化された
Ｔ細胞」は、とりわけ、細胞分裂をしているＴ細胞を指す。
腫瘍サンプルに由来し、ステップ（ｃ）の前に、インビトロで活性化および増殖される。
「活性化」は、本明細書で用いられる場合、検出可能な細胞増殖を誘導するために十分に
刺激されたＴ細胞または他の免疫細胞の状態をいう。活性化はまた、誘導されたサイトカ
イン生産、および、検出可能なエフェクター機能とも、関連し得る。用語「活性化された
Ｔ細胞」は、とりわけ、細胞分裂をしているＴ細胞を指す。
【0159】
ある実施形態では、ヒトは、自己免疫性の疾病を有し、投与される免疫細胞（例えば、
ＣＡＲ－細胞）は、アネルギー性であり、または、標的細胞と結合した場合の増殖および
／または細胞傷害活性が低下しており、それにより、細胞移植片細胞（および／またはそ
の子孫）は、前記自己免疫性の疾病をアップレギュレートする、前記ヒトの内因性免疫細
胞と競合する。
ＣＡＲ－細胞）は、アネルギー性であり、または、標的細胞と結合した場合の増殖および
／または細胞傷害活性が低下しており、それにより、細胞移植片細胞（および／またはそ
の子孫）は、前記自己免疫性の疾病をアップレギュレートする、前記ヒトの内因性免疫細
胞と競合する。
【0160】
本方法における免疫細胞の投与は、患者の血液への細胞注入によってよい。免疫細胞は
、患者に投与される増幅免疫細胞集団を生産するように、増幅されてよい。免疫細胞は、
患者に投与される活性化免疫細胞集団を生産するように、活性化されてよい。本明細書に
おける方法では、有効量の免疫細胞が投与される。本明細書で使用される「有効量」は、
疾病または症状を処置または予防するための治療的または予防的利益を提供する量を意味
する。
、患者に投与される増幅免疫細胞集団を生産するように、増幅されてよい。免疫細胞は、
患者に投与される活性化免疫細胞集団を生産するように、活性化されてよい。本明細書に
おける方法では、有効量の免疫細胞が投与される。本明細書で使用される「有効量」は、
疾病または症状を処置または予防するための治療的または予防的利益を提供する量を意味
する。
【0161】
本発明の方法のある実施形態において、方法は、患者への免疫細胞の投与の前に、リン
パ球枯渇を受けている患者（例えば、ヒト）のがんのリスクを処置または低減する。
パ球枯渇を受けている患者（例えば、ヒト）のがんのリスクを処置または低減する。
【0162】
一実施形態では、ヒトは、少なくとも１つの化学療法薬に耐性である。
【0163】
一実施形態では、慢性リンパ性白血病は、難治性のＣＤ１９＋白血病およびリンパ腫で
ある。
ある。
【0164】
本発明はまた、がんと診断されたヒトにおいて、遺伝子操作されたＴ細胞の存続する集
団を生成する方法を含み、ここで、投与される細胞はＴ細胞を含み、存続する集団はその
子孫を含む。一実施形態では、本方法は、ヒトにＴ細胞集団（例えば、ＣＡＲＴ細胞集団
）を投与することを含み、ここで、遺伝子操作されたＴ細胞の存続する集団は、投与後少
なくとも１ヵ月間、ヒト中に存続する。一実施形態では、遺伝子操作されたＴ細胞の存続
する集団は、メモリーＴ細胞を含む。一実施形態では、遺伝子操作されたＴ細胞の存続す
る集団は、投与後少なくとも３週間は、ヒト中に存続する。別の実施形態では、遺伝子操
作されたＴ細胞の存続する集団は、投与後少なくとも４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、７ヵ月、
８ヵ月、９ヵ月、１０ヵ月、１１ヵ月、１２ヵ月、２年、または３年の間、ヒト中に存続
する。
団を生成する方法を含み、ここで、投与される細胞はＴ細胞を含み、存続する集団はその
子孫を含む。一実施形態では、本方法は、ヒトにＴ細胞集団（例えば、ＣＡＲＴ細胞集団
）を投与することを含み、ここで、遺伝子操作されたＴ細胞の存続する集団は、投与後少
なくとも１ヵ月間、ヒト中に存続する。一実施形態では、遺伝子操作されたＴ細胞の存続
する集団は、メモリーＴ細胞を含む。一実施形態では、遺伝子操作されたＴ細胞の存続す
る集団は、投与後少なくとも３週間は、ヒト中に存続する。別の実施形態では、遺伝子操
作されたＴ細胞の存続する集団は、投与後少なくとも４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、７ヵ月、
８ヵ月、９ヵ月、１０ヵ月、１１ヵ月、１２ヵ月、２年、または３年の間、ヒト中に存続
する。
【0165】
一実施形態では、慢性リンパ性白血病が処置される。本発明はまた、がんと診断された
ヒトにおいて、操作されたＴ細胞またはＮＫ細胞の集団を増幅させる方法であって、投与
される細胞がＴ細胞および／またはＮＫ細胞を含み、増幅された集団がその子孫を含む方
法を提供する。
ヒトにおいて、操作されたＴ細胞またはＮＫ細胞の集団を増幅させる方法であって、投与
される細胞がＴ細胞および／またはＮＫ細胞を含み、増幅された集団がその子孫を含む方
法を提供する。
【0166】
場合により、自家のリンパ球の注入が、処置において用いられる。例えば、自家のＰＢ
ＭＣを、処置が必要な患者から回収し、ＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＣＡＲ膜貫通タンパク質を発
現するように操作し、当業界で知られる方法を用いて活性化および増幅して、その後、ス
テップ（ａ）において患者に注入して戻す。一例では、投与される細胞は、多能性または
多分化能である。該幹細胞は、ヒトの細胞に発達することができない。ある実施形態では
、該幹細胞は、ヒトの胚または接合子に発達することができない。
ＭＣを、処置が必要な患者から回収し、ＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＣＡＲ膜貫通タンパク質を発
現するように操作し、当業界で知られる方法を用いて活性化および増幅して、その後、ス
テップ（ａ）において患者に注入して戻す。一例では、投与される細胞は、多能性または
多分化能である。該幹細胞は、ヒトの細胞に発達することができない。ある実施形態では
、該幹細胞は、ヒトの胚または接合子に発達することができない。
【0167】
一例では、投与される細胞集団は、例えば、ヒトの自家細胞または同種細胞である、骨
髄幹細胞を含む。
髄幹細胞を含む。
【0168】
一例では、投与される細胞集団は、例えば、ヒトの自家細胞または同種細胞である、造
血幹細胞を含む。
血幹細胞を含む。
【0169】
微生物叢の調節
医療行為は、しばしば、患者に抗生物質を投与することを包含する。 これらの処置は
、典型的には、多くのグラム陽性菌種または多くのグラム陰性種を、区別することなく標
的とする抗生物質、すなわち、広域スペクトル抗生物質の投与を包含し得る。同様に、農
業（ｆａｒｍｉｎｇ）や農耕（ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）における広域スペクトル抗生物
質の使用は、健康に有害であり、微生物耐性を発展させる可能性のある、これらの抗生物
質のヒトおよび動物の食物連鎖への侵入を含む、環境問題を提起する。むしろ、一例では
、本発明は、微生物叢の第１の微生物の（例えば、細菌または古細菌の）種または株の、
選択的標的化を包含する。本明細書の実施例に示されるように、特定の細菌種の選択的標
的化は、選択された種のゲノムを標的とするの誘導型ヌクレアーゼを用いて達成されてい
るが、同時に、関連する種および株、並びに、共存する種（実施例においては、ヒト腸内
微生物叢に共存する種）を温存する。従って、１つの例では、ディスバイオシスを引き起
こすステップ、または、ステップ（ｂ）は、微生物叢亜集団の第１の細胞を死滅すること
、または、微生物叢亜集団に含まれる第１の細胞のゲノムを標的とする誘導型ヌクレアー
ゼ（例えば、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ）を用いることにより前記亜集団の増殖を阻害す
ることを含む。誘導型ヌクレアーゼ標的化を実行するための好適なシステムは、例えば、
操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼおよびジンク
フィンガーシステムである。例として、共同体における、選択されたヒト腸内微生物叢細
菌種のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介ガイド標的化が、本明細書の実施例において実証されて
いる。該標的化は、標的の種または株のＤＮＡのヌクレアーゼ切断を生みだし、例えば、
微生物叢における標的の種の相対的割合を低減させ、あるいは、微生物叢における前記種
の亜集団の増殖を阻害する。本方法における種の選択的標的化は、一般に、微生物叢にお
ける、細菌および/または古細菌種の相対的割合の変化の、より細かい制御を可能にする
のに有利である。このように、本発明は、ＴＨ１、ＴＨ１７および／またはＴｒｅｇ細胞
などの特定の免疫細胞集団のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーション、ま
たは本明細書に記載される微生物叢を調節する他の結果に影響を及ぼすことを目的として
、微生物叢を改変する能力を提供する。
医療行為は、しばしば、患者に抗生物質を投与することを包含する。 これらの処置は
、典型的には、多くのグラム陽性菌種または多くのグラム陰性種を、区別することなく標
的とする抗生物質、すなわち、広域スペクトル抗生物質の投与を包含し得る。同様に、農
業（ｆａｒｍｉｎｇ）や農耕（ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）における広域スペクトル抗生物
質の使用は、健康に有害であり、微生物耐性を発展させる可能性のある、これらの抗生物
質のヒトおよび動物の食物連鎖への侵入を含む、環境問題を提起する。むしろ、一例では
、本発明は、微生物叢の第１の微生物の（例えば、細菌または古細菌の）種または株の、
選択的標的化を包含する。本明細書の実施例に示されるように、特定の細菌種の選択的標
的化は、選択された種のゲノムを標的とするの誘導型ヌクレアーゼを用いて達成されてい
るが、同時に、関連する種および株、並びに、共存する種（実施例においては、ヒト腸内
微生物叢に共存する種）を温存する。従って、１つの例では、ディスバイオシスを引き起
こすステップ、または、ステップ（ｂ）は、微生物叢亜集団の第１の細胞を死滅すること
、または、微生物叢亜集団に含まれる第１の細胞のゲノムを標的とする誘導型ヌクレアー
ゼ（例えば、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ）を用いることにより前記亜集団の増殖を阻害す
ることを含む。誘導型ヌクレアーゼ標的化を実行するための好適なシステムは、例えば、
操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼおよびジンク
フィンガーシステムである。例として、共同体における、選択されたヒト腸内微生物叢細
菌種のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介ガイド標的化が、本明細書の実施例において実証されて
いる。該標的化は、標的の種または株のＤＮＡのヌクレアーゼ切断を生みだし、例えば、
微生物叢における標的の種の相対的割合を低減させ、あるいは、微生物叢における前記種
の亜集団の増殖を阻害する。本方法における種の選択的標的化は、一般に、微生物叢にお
ける、細菌および/または古細菌種の相対的割合の変化の、より細かい制御を可能にする
のに有利である。このように、本発明は、ＴＨ１、ＴＨ１７および／またはＴｒｅｇ細胞
などの特定の免疫細胞集団のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーション、ま
たは本明細書に記載される微生物叢を調節する他の結果に影響を及ぼすことを目的として
、微生物叢を改変する能力を提供する。
【0170】
一例では、第１の細胞集団増殖は、該ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）より前の
増殖と比較して、少なくとも５倍低下している。本方法は、腸表面での、第１の細胞集団
増殖を阻害することを含んでよい。本方法は、植物（例えば、葉および／または茎）表面
での、第１の細胞集団増殖を阻害することを含んでよい。
増殖と比較して、少なくとも５倍低下している。本方法は、腸表面での、第１の細胞集団
増殖を阻害することを含んでよい。本方法は、植物（例えば、葉および／または茎）表面
での、第１の細胞集団増殖を阻害することを含んでよい。
【0171】
あるいは、対象に適用される代わりに、処置は、環境または土壌に適用され（例えば、
処置は、肥料、植物生長促進または阻害、除草剤、または、農薬の処置である）、ここで
、処置は本発明によって調節される。
処置は、肥料、植物生長促進または阻害、除草剤、または、農薬の処置である）、ここで
、処置は本発明によって調節される。
【0172】
腸内微生物叢または他の微生物叢において、細菌および古細菌の変化をいかにして決定
するかは、当業者には、明らかであろう。例えば、これは、処置前および処置後に、患者
の糞便サンプルを解析することにより、行われ得る。各サンプルにおける異なる種または
株のタイプ、および、処置前および処置後の種または株の割合を決定してよい。１６ｓリ
ボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ（１６ｓ ｒＤＮＡ）の従来の分析を用いて、例えば
種を同定することが可能である。これに加えて、または、これに代えて、標準的な生化学
テストを、株または種を同定するために用いることができ、例えば、染色、運動性試験、
血清学的試験、ファージ分類、（例えば、Ｋｉｒｂｙ Ｂａｕｒディスク拡散法を用いた
）識別ディスク試験（ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｄｉｓｃ ｔｅｓｔｉｎｇ）の１
つ以上もまた包含する。生化学テストは、（ａ）カタラーゼテスト、（ｂ）コアグラーゼ
テスト、（ｃ）オキシダーゼテスト、（ｄ）糖発酵テスト、（ｅ）インドールテスト、（
ｆ）クエン酸テスト、および（ｇ）ウレアーゼテストの１つ以上を包含してよい。相対的
割合は、各サンプルから（本明細書の実施例のように）寒天プレート上のコロニーを増殖
させ、コロニー数を計測することにより、決定してよい。
するかは、当業者には、明らかであろう。例えば、これは、処置前および処置後に、患者
の糞便サンプルを解析することにより、行われ得る。各サンプルにおける異なる種または
株のタイプ、および、処置前および処置後の種または株の割合を決定してよい。１６ｓリ
ボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ（１６ｓ ｒＤＮＡ）の従来の分析を用いて、例えば
種を同定することが可能である。これに加えて、または、これに代えて、標準的な生化学
テストを、株または種を同定するために用いることができ、例えば、染色、運動性試験、
血清学的試験、ファージ分類、（例えば、Ｋｉｒｂｙ Ｂａｕｒディスク拡散法を用いた
）識別ディスク試験（ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｄｉｓｃ ｔｅｓｔｉｎｇ）の１
つ以上もまた包含する。生化学テストは、（ａ）カタラーゼテスト、（ｂ）コアグラーゼ
テスト、（ｃ）オキシダーゼテスト、（ｄ）糖発酵テスト、（ｅ）インドールテスト、（
ｆ）クエン酸テスト、および（ｇ）ウレアーゼテストの１つ以上を包含してよい。相対的
割合は、各サンプルから（本明細書の実施例のように）寒天プレート上のコロニーを増殖
させ、コロニー数を計測することにより、決定してよい。
【0173】
一例では、ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）は、微生物叢、例えば腸内微生物叢
における、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｂ ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ）の割合を増
加させる。
における、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｂ ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ）の割合を増
加させる。
【0174】
一例では、ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）は、微生物叢、例えば腸内微生物叢
における、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｂ ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ）の割合を減
少させる。一例では、ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）は、微生物叢、例えば腸内
微生物叢における、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）に対するバクテロイ
デス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）の割合を増加させる。一例では、ディスバイオシ
スまたはステップ（ｂ）は、微生物叢、例えば腸内微生物叢における、ファーミキューテ
ス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）に対するバクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ
）の割合を減少させる。
における、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｂ ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ）の割合を減
少させる。一例では、ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）は、微生物叢、例えば腸内
微生物叢における、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）に対するバクテロイ
デス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）の割合を増加させる。一例では、ディスバイオシ
スまたはステップ（ｂ）は、微生物叢、例えば腸内微生物叢における、ファーミキューテ
ス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）に対するバクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ
）の割合を減少させる。
【0175】
蓄積した証拠は、Ｔｒｅｇ細胞の誘導においてクラスターＩＶおよびＸＩＶａに属する
ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．の共生株の役
割を支持する。例えば、Lopez et al.を参照されたい。一例では、ディスバイオシスまた
はステップ（ｂ）は、腸内微生物叢において、１つ以上のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種また
は株（例えば、一例では、それぞれの種はクラスターＩＶまたはＸＩＶａＣｌｏｓｔｒｉ
ｄｉｕｍ種である）の割合を低減する。一例では、ディスバイオシスまたはステップ（ｂ
）は、腸内微生物叢において、１つ以上のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種または株（例えば、
一例では、それぞれの種はクラスターＩＶまたはＸＩＶａ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種で
ある）の割合を増加させる。
ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．の共生株の役
割を支持する。例えば、Lopez et al.を参照されたい。一例では、ディスバイオシスまた
はステップ（ｂ）は、腸内微生物叢において、１つ以上のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種また
は株（例えば、一例では、それぞれの種はクラスターＩＶまたはＸＩＶａＣｌｏｓｔｒｉ
ｄｉｕｍ種である）の割合を低減する。一例では、ディスバイオシスまたはステップ（ｂ
）は、腸内微生物叢において、１つ以上のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種または株（例えば、
一例では、それぞれの種はクラスターＩＶまたはＸＩＶａ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種で
ある）の割合を増加させる。
【0176】
一例では、ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）は、腸内微生物叢において、Ｂｉｆ
ｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、Ｂ ｂｉｆｉｄｕｍ）の割合を低減させる。一例で
は、ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）は、腸内微生物叢において、腸内微生物叢に
おいての割合を増加させる。
ｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、Ｂ ｂｉｆｉｄｕｍ）の割合を低減させる。一例で
は、ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）は、腸内微生物叢において、腸内微生物叢に
おいての割合を増加させる。
【0177】
例えば、ヒト腸内微生物叢を選択的に変更することによって、本発明は、ＣＡＲ－Ｔま
たは他のＡＣＴ処置のアップレギュレーションを提供する（例えば、変化した微生物叢は
、ＣＡＲ－ＴまたはＡＣＴ投与を受けた患者においてＴｒｅｇ細胞をダウンレギュレート
し、および／または、該患者においてＴＨ１および／またはＴＨ１７細胞をアップレギュ
レートし、これらの細胞は、例えば、ＣＡＲ－ＴまたはＡＣＴ移植片に含まれている）。
Ｔｒｅｇ細胞のダウンレギュレーションは、患者においてエフェクターＴ細胞および／ま
たはヘルパーＴ細胞の抑制を低減させ、それによって、がんまたは他の疾患を媒介する細
胞に対する、ＣＡＲ－ＴまたはＡＣＴ細胞傷害性、または他の望ましい活性を増強し得る
。ＴＨ１および／またはＴＨ１７細胞のアップレギュレーションは、エフェクターＴ細胞
の活性を増加させ、それによって、がんまたは他の疾患を媒介する細胞に対する、ＣＡＲ
－ＴまたはＡＣＴ細胞傷害性、または他の望ましい活性を増強し得る。
たは他のＡＣＴ処置のアップレギュレーションを提供する（例えば、変化した微生物叢は
、ＣＡＲ－ＴまたはＡＣＴ投与を受けた患者においてＴｒｅｇ細胞をダウンレギュレート
し、および／または、該患者においてＴＨ１および／またはＴＨ１７細胞をアップレギュ
レートし、これらの細胞は、例えば、ＣＡＲ－ＴまたはＡＣＴ移植片に含まれている）。
Ｔｒｅｇ細胞のダウンレギュレーションは、患者においてエフェクターＴ細胞および／ま
たはヘルパーＴ細胞の抑制を低減させ、それによって、がんまたは他の疾患を媒介する細
胞に対する、ＣＡＲ－ＴまたはＡＣＴ細胞傷害性、または他の望ましい活性を増強し得る
。ＴＨ１および／またはＴＨ１７細胞のアップレギュレーションは、エフェクターＴ細胞
の活性を増加させ、それによって、がんまたは他の疾患を媒介する細胞に対する、ＣＡＲ
－ＴまたはＡＣＴ細胞傷害性、または他の望ましい活性を増強し得る。
【0178】
別の例では、微生物叢の変更は、ＣＡＲ－Ｔまたは他のＡＣＴ処置を弱めるためのスイ
ッチとして用いられ得る（例えば、変化した微生物叢は、ＣＡＲ－ＴまたはＡＣＴ投与を
受けた患者においてＴｒｅｇ細胞をアップレギュレートし、および／または、該患者にお
いてＴＨ１および／またはＴＨ１７細胞をダウンレギュレートし、これらの細胞は、例え
ば、ＣＡＲ－ＴまたはＡＣＴ移植片に含まれている）。Ｔｒｅｇ細胞のアップレギュレー
ションは、患者においてエフェクターＴ細胞および／またはヘルパーＴ細胞の抑制を増加
させ、それによって、サイトカイン放出を促進するＣＡＲ－ＴもしくはＡＣＴの能力、ま
たは他の望ましくない活性を低減し得る。ＴＨ１および／またはＴＨ１７細胞のダウンレ
ギュレーションは、エフェクターＴ細胞活性を減少させ、それにより、サイトカイン放出
を促進するＣＡＲ－ＴもしくはＡＣＴの能力、または他の望ましくない活性を低減し得る
。これは、患者における、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）のリスクを制限するのに有
用であり得る。本発明の方法を用いた患者の腸内微生物叢のその後のさらなる改変は、目
の前の疾病または症状（例えば、血液がんなどの、がん）に対処するためにこれをもう一
度使用することが望ましい場合に、ＣＡＲ－ＴまたはＡＣＴ処置をアップレギュレートす
るために行うことができる。この例では、メモリーＴ細胞ＣＡＲ－ＴまたはＡＣＴ集団は
、より初期の治療から、患者に存在し得、本発明による微生物叢の変更を用いたアップレ
ギュレーションは、メモリーＴ細胞をアップレギュレートして、エフェクター細胞および
／またはヘルパー細胞に分化させ、疾病または症状に対処し得る。従って、１つの例では
、本発明の細胞療法は、免疫メモリー細胞（例えば、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ
）および／またはステムセルメモリー細胞（ＴＳＣＭ）などの、メモリーＴ細胞）を含む
免疫細胞集団を投与することを含み、および／または、投与される集団は、最初の微生物
叢の変更の後にこれらのメモリー細胞を産生する細胞を含む。
ッチとして用いられ得る（例えば、変化した微生物叢は、ＣＡＲ－ＴまたはＡＣＴ投与を
受けた患者においてＴｒｅｇ細胞をアップレギュレートし、および／または、該患者にお
いてＴＨ１および／またはＴＨ１７細胞をダウンレギュレートし、これらの細胞は、例え
ば、ＣＡＲ－ＴまたはＡＣＴ移植片に含まれている）。Ｔｒｅｇ細胞のアップレギュレー
ションは、患者においてエフェクターＴ細胞および／またはヘルパーＴ細胞の抑制を増加
させ、それによって、サイトカイン放出を促進するＣＡＲ－ＴもしくはＡＣＴの能力、ま
たは他の望ましくない活性を低減し得る。ＴＨ１および／またはＴＨ１７細胞のダウンレ
ギュレーションは、エフェクターＴ細胞活性を減少させ、それにより、サイトカイン放出
を促進するＣＡＲ－ＴもしくはＡＣＴの能力、または他の望ましくない活性を低減し得る
。これは、患者における、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）のリスクを制限するのに有
用であり得る。本発明の方法を用いた患者の腸内微生物叢のその後のさらなる改変は、目
の前の疾病または症状（例えば、血液がんなどの、がん）に対処するためにこれをもう一
度使用することが望ましい場合に、ＣＡＲ－ＴまたはＡＣＴ処置をアップレギュレートす
るために行うことができる。この例では、メモリーＴ細胞ＣＡＲ－ＴまたはＡＣＴ集団は
、より初期の治療から、患者に存在し得、本発明による微生物叢の変更を用いたアップレ
ギュレーションは、メモリーＴ細胞をアップレギュレートして、エフェクター細胞および
／またはヘルパー細胞に分化させ、疾病または症状に対処し得る。従って、１つの例では
、本発明の細胞療法は、免疫メモリー細胞（例えば、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ
）および／またはステムセルメモリー細胞（ＴＳＣＭ）などの、メモリーＴ細胞）を含む
免疫細胞集団を投与することを含み、および／または、投与される集団は、最初の微生物
叢の変更の後にこれらのメモリー細胞を産生する細胞を含む。
【0179】
本発明の１つの局面は、患者における細胞ベースの治療を調節することに対する有用性
を認識するが、別の局面は、例えば患者のＴ細胞または他の免疫細胞によって媒介される
、自己免疫疾患および炎症性の疾病および症状などの、患者における細胞媒介性の疾患お
よび症状を調節（すなわち、処置または予防）することに対する有用性を認識する。さら
なる局面では、本発明は、疾病または症状の別の治療を調節（例えば、増強）するための
手段として有用性を認識する。例えば、疾病または症状を治療または予防するために、抗
体または抗ウイルス薬による治療を増強する、または、実施するための手段として有用性
を認識する。例えば、薬は、（例えば、メラノーマまたはＮＳＣＬＣなどのがんを処置ま
たは予防するための）免疫チェックポイントのアンタゴニストまたはアゴニストであるこ
とができる。「治療を実施する」ことによって、患者が薬に応答しないか、応答が不十分
であり、本発明による微生物叢の変更（例えば、本明細書に記載される、細菌または古細
菌の種の選択的誘導型ヌクレアーゼ標的化を用いた微生物叢の変更）が患者による薬への
応答（または改善された応答）をもたらすことが、企図される。例えば、本発明の方法は
、ＨＩＶ感染症を患う患者において、Ｔｈ１７細胞をアップレギュレートする。一局面で
は、これは、患者の抗レトロウイルス、または抗ＨＩＶワクチン療法を増強する。Ｔｈ１
７細胞は、患者の内因性細胞であるか、または、患者のＡＣＴにより提供された細胞であ
ってよい。別の例では、本発明の方法は、がん（例えば、メラノーマまたはＮＳＣＬＣな
どの肺癌）を患う患者において、Ｔｈ１７細胞をアップレギュレートする。一局面では、
これは、患者の免疫チェックポイントのアンタゴニズムまたはアゴニズムの治療を増強す
る。Ｔｈ１７細胞は、患者の内因性細胞であるか、または、患者のＡＣＴにより提供され
た細胞であってよい。例えば、治療は、イピリムマブ（すなわち、ＹＥＲＶＯＹ商標）、
トレメリムマブ、ニボルマブ（すなわち、ＯＰＤＩＶＯ商標）、ペンブロリズマブ（すな
わち、ＫＥＹＴＲＵＤＡ商標）、ピディリズマブ、ＢＭＳ－９３６５５９、デュルバルマ
ブおよびアテゾリズマブから選択した抗体を用いた抗体療法である。
を認識するが、別の局面は、例えば患者のＴ細胞または他の免疫細胞によって媒介される
、自己免疫疾患および炎症性の疾病および症状などの、患者における細胞媒介性の疾患お
よび症状を調節（すなわち、処置または予防）することに対する有用性を認識する。さら
なる局面では、本発明は、疾病または症状の別の治療を調節（例えば、増強）するための
手段として有用性を認識する。例えば、疾病または症状を治療または予防するために、抗
体または抗ウイルス薬による治療を増強する、または、実施するための手段として有用性
を認識する。例えば、薬は、（例えば、メラノーマまたはＮＳＣＬＣなどのがんを処置ま
たは予防するための）免疫チェックポイントのアンタゴニストまたはアゴニストであるこ
とができる。「治療を実施する」ことによって、患者が薬に応答しないか、応答が不十分
であり、本発明による微生物叢の変更（例えば、本明細書に記載される、細菌または古細
菌の種の選択的誘導型ヌクレアーゼ標的化を用いた微生物叢の変更）が患者による薬への
応答（または改善された応答）をもたらすことが、企図される。例えば、本発明の方法は
、ＨＩＶ感染症を患う患者において、Ｔｈ１７細胞をアップレギュレートする。一局面で
は、これは、患者の抗レトロウイルス、または抗ＨＩＶワクチン療法を増強する。Ｔｈ１
７細胞は、患者の内因性細胞であるか、または、患者のＡＣＴにより提供された細胞であ
ってよい。別の例では、本発明の方法は、がん（例えば、メラノーマまたはＮＳＣＬＣな
どの肺癌）を患う患者において、Ｔｈ１７細胞をアップレギュレートする。一局面では、
これは、患者の免疫チェックポイントのアンタゴニズムまたはアゴニズムの治療を増強す
る。Ｔｈ１７細胞は、患者の内因性細胞であるか、または、患者のＡＣＴにより提供され
た細胞であってよい。例えば、治療は、イピリムマブ（すなわち、ＹＥＲＶＯＹ商標）、
トレメリムマブ、ニボルマブ（すなわち、ＯＰＤＩＶＯ商標）、ペンブロリズマブ（すな
わち、ＫＥＹＴＲＵＤＡ商標）、ピディリズマブ、ＢＭＳ－９３６５５９、デュルバルマ
ブおよびアテゾリズマブから選択した抗体を用いた抗体療法である。
【0180】
本発明は、植物、酵母、環境、土壌、ヒトまたは動物の微生物叢において、第１の細胞
を標的化するか、または、細菌または古細菌の細胞集団の増殖を阻害することにより前記
ディスバイオシスを引き起こすか、または、細胞の１つ以上の亜集団の相対的割合を変更
するために（例えば、ヒトの腸内微生物叢における、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏ
ｉｄｅｔｅｓ）（例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍ
ｉｃｕｔｅｓ）および／またはグラム陽性またはグラム陰性細菌の割合の変更のために）
、本発明の方法において用いられる、誘導型ヌクレアーゼシステム（例えば、操作された
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼおよびジンクフィンガー
システム）、アレイ（例えば、ＣＲＩＳＰＲアレイ）、ＣＲＩＳＰＲアレイ、ｃＲＮＡ、
ｇＲＮＡおよびベクター（例えば、前記システムの成分を含むファージ）に関する。本発
明は、例えば、宿主細菌細胞（例えば、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ
）細胞、または、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）細胞、または宿主古細
菌細胞）の１つ以上の標的ゲノムまたはエピソームのヌクレオチド配列を改変（例えば、
切断および／または変異）することを包含する。一例では、第１の細菌は、病原性腸内細
菌である。
を標的化するか、または、細菌または古細菌の細胞集団の増殖を阻害することにより前記
ディスバイオシスを引き起こすか、または、細胞の１つ以上の亜集団の相対的割合を変更
するために（例えば、ヒトの腸内微生物叢における、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏ
ｉｄｅｔｅｓ）（例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍ
ｉｃｕｔｅｓ）および／またはグラム陽性またはグラム陰性細菌の割合の変更のために）
、本発明の方法において用いられる、誘導型ヌクレアーゼシステム（例えば、操作された
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼおよびジンクフィンガー
システム）、アレイ（例えば、ＣＲＩＳＰＲアレイ）、ＣＲＩＳＰＲアレイ、ｃＲＮＡ、
ｇＲＮＡおよびベクター（例えば、前記システムの成分を含むファージ）に関する。本発
明は、例えば、宿主細菌細胞（例えば、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ
）細胞、または、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）細胞、または宿主古細
菌細胞）の１つ以上の標的ゲノムまたはエピソームのヌクレオチド配列を改変（例えば、
切断および／または変異）することを包含する。一例では、第１の細菌は、病原性腸内細
菌である。
【0181】
２つの主な腸内微生物の門、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）および
ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）のそれぞれのレベルが、ヒトおよび無菌
マウスの両方において、肥満症と関連していることを指摘した多数の研究がある。これら
の研究の著者等は、糖代謝が重要な因子であると推測している。彼らは、肥満症患者の微
生物叢は、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の細菌がより豊富であり、バ
クテロテデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）の細菌がより少ないことを観察し、彼ら
は、この細菌混合物が、（反対の割合を有する）痩身個体の微生物叢よりも、所与の食餌
からエネルギーを抽出することに、より効率的であり得ると推論する。いくつかの研究に
おいて、彼らは、肥満症患者の体重が減少するにつれて、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅ
ｒｏｉｄｅｔｅｓ）の相対的存在量が増加すること、さらに、肥満マウスの微生物が無菌
マウスに移されると、これらのマウスは、痩せたマウスからの微生物叢を受け取ったコン
トロール群よりも脂肪が多くなるこが見出した。例えば、Turnbaugh, P. J., R. E. Ley,
M. A. Mahowald, V. Magrini, E. R. Mardis, and J. I. Gordon. 2006, " An obesity
－associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest ", Nature
444:1027―1131を参照されたい。さらなる局面において、本発明は、例えば、微生物叢
においてバクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）の、ファーミキューテス門（
Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）に対する比率を増加させることによって、患者の抗肥満症の治療
を増強するための手段としての有用性を認識する。
ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）のそれぞれのレベルが、ヒトおよび無菌
マウスの両方において、肥満症と関連していることを指摘した多数の研究がある。これら
の研究の著者等は、糖代謝が重要な因子であると推測している。彼らは、肥満症患者の微
生物叢は、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の細菌がより豊富であり、バ
クテロテデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）の細菌がより少ないことを観察し、彼ら
は、この細菌混合物が、（反対の割合を有する）痩身個体の微生物叢よりも、所与の食餌
からエネルギーを抽出することに、より効率的であり得ると推論する。いくつかの研究に
おいて、彼らは、肥満症患者の体重が減少するにつれて、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅ
ｒｏｉｄｅｔｅｓ）の相対的存在量が増加すること、さらに、肥満マウスの微生物が無菌
マウスに移されると、これらのマウスは、痩せたマウスからの微生物叢を受け取ったコン
トロール群よりも脂肪が多くなるこが見出した。例えば、Turnbaugh, P. J., R. E. Ley,
M. A. Mahowald, V. Magrini, E. R. Mardis, and J. I. Gordon. 2006, " An obesity
－associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest ", Nature
444:1027―1131を参照されたい。さらなる局面において、本発明は、例えば、微生物叢
においてバクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）の、ファーミキューテス門（
Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）に対する比率を増加させることによって、患者の抗肥満症の治療
を増強するための手段としての有用性を認識する。
【0182】
場合により、第１の細胞は、異なる株または種の細胞の存在下にあり、該異なる細胞は
、エンテロバクター科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、または、ヒトに対し
て（例えばヒトの腸内で）プロバイオティック（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ）、片利共生（ｃｏ
ｍｍｅｎｓａｌ）、もしくは相利共生（ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ）の細菌である。一例では、
第１の細胞はそれぞれ、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）であり、例えば
、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの細胞である。
、エンテロバクター科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、または、ヒトに対し
て（例えばヒトの腸内で）プロバイオティック（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ）、片利共生（ｃｏ
ｍｍｅｎｓａｌ）、もしくは相利共生（ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ）の細菌である。一例では、
第１の細胞はそれぞれ、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）であり、例えば
、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの細胞である。
【0183】
一例では、本発明は、同じ種、または、異なる種にもかかわらず系統学的に関連する種
（１６ｓ ｒＤＮＡによって示される）の第２の関連株を標的としないが、微生物叢の標
的微生物を選択的に死滅させるか、ダウンレギュレートすることができる。例えば、微生
物叢は、第２の細菌種または株、または、古細菌種または株の細胞を含み、第２の種また
は株は、第１の細胞種または株の１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列に、少
なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一である１６ｓリボ
ソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を有し、微生物叢における第２の細胞の増殖は、前
記方法によって阻害されない。ある実施形態では、第２の株または種の増殖は阻害されな
いか、あるいは、前記第１の細胞の増殖は、第２の細胞の少なくとも２倍、３倍、４倍、
５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、５０倍、１００倍または１０００倍の増殖阻害
によって、阻害される。
（１６ｓ ｒＤＮＡによって示される）の第２の関連株を標的としないが、微生物叢の標
的微生物を選択的に死滅させるか、ダウンレギュレートすることができる。例えば、微生
物叢は、第２の細菌種または株、または、古細菌種または株の細胞を含み、第２の種また
は株は、第１の細胞種または株の１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列に、少
なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一である１６ｓリボ
ソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を有し、微生物叢における第２の細胞の増殖は、前
記方法によって阻害されない。ある実施形態では、第２の株または種の増殖は阻害されな
いか、あるいは、前記第１の細胞の増殖は、第２の細胞の少なくとも２倍、３倍、４倍、
５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、５０倍、１００倍または１０００倍の増殖阻害
によって、阻害される。
【0184】
本方法の一局面において、ディスバイオシスを引き起こすことまたはステップ（ｂ）は
、患者の微生物叢（例えば、腸内微生物叢）において第１の細胞（宿主細胞）の亜集団の
割合を変更し、それにより、患者において免疫細胞療法を調節する変更された腸内微生物
叢を産生することを含み、ここで、該亜集団は前記第１の種または株の宿主細胞を含み、
本方法は、宿主細胞においてそれぞれの標的配列を切断して、標的配列を改変する、誘導
型ヌクレアーゼ (例えば、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ)を用い、それにより、宿主細胞が
死滅するか、宿主細胞集団の増殖が低下し、それにより、微生物叢における該亜集団の割
合を低減させることを含む。誘導型ヌクレアーゼ切断を実行するための好適なシステムは
、例えば、操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼお
よびジンクフィンガーシステムである例として、共同体における、選択されたヒト腸内微
生物叢細菌種の、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介ガイド切断が、本明細書の実施例で実証され
ている。
、患者の微生物叢（例えば、腸内微生物叢）において第１の細胞（宿主細胞）の亜集団の
割合を変更し、それにより、患者において免疫細胞療法を調節する変更された腸内微生物
叢を産生することを含み、ここで、該亜集団は前記第１の種または株の宿主細胞を含み、
本方法は、宿主細胞においてそれぞれの標的配列を切断して、標的配列を改変する、誘導
型ヌクレアーゼ (例えば、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ)を用い、それにより、宿主細胞が
死滅するか、宿主細胞集団の増殖が低下し、それにより、微生物叢における該亜集団の割
合を低減させることを含む。誘導型ヌクレアーゼ切断を実行するための好適なシステムは
、例えば、操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼお
よびジンクフィンガーシステムである例として、共同体における、選択されたヒト腸内微
生物叢細菌種の、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介ガイド切断が、本明細書の実施例で実証され
ている。
【0185】
一例では、標的配列の改変は、
ａ．微生物叢を、宿主改変（ＨＭ）ｃｒＲＮＡをコードする操作された核酸配列の複数の
コピーと組み合わせること、および
ｂ．宿主細胞においてＨＭ－ｃｒＲＮＡを発現させること、
によって実行され、
ここで、操作された各核酸配列は、個々の宿主細胞においてＣａｓヌクレアーゼと作動可
能であり、ＨＭ－ＣＲｌＳＰＲ／Ｃａｓシステムを形成し、かつ、該操作された配列は、
（ｉ）ＨＭ－ｃｒＲＮＡをコードする、スペーサーおよびリピート配列；
（ｉｉ）宿主細胞の標的配列にハイブリダイズしてＣａｓヌクレアーゼを宿主細胞の標的
配列に誘導することができる配列を含む、ＨＭ－ｃｒＲＮＡ；
を含み、場合により、ＨＭ－システムは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ
配列を発現するＤＮＡ配列を含み、
それにより、ＨＭ－ｃｒＲＮＡは宿主細胞において宿主標的配列のＣａｓ改変を誘導し、
それにより、宿主細胞が死滅するか、宿主細胞集団の増殖が低下し、それにより、微生物
叢において前記第１の細胞の割合を低減させる。
ａ．微生物叢を、宿主改変（ＨＭ）ｃｒＲＮＡをコードする操作された核酸配列の複数の
コピーと組み合わせること、および
ｂ．宿主細胞においてＨＭ－ｃｒＲＮＡを発現させること、
によって実行され、
ここで、操作された各核酸配列は、個々の宿主細胞においてＣａｓヌクレアーゼと作動可
能であり、ＨＭ－ＣＲｌＳＰＲ／Ｃａｓシステムを形成し、かつ、該操作された配列は、
（ｉ）ＨＭ－ｃｒＲＮＡをコードする、スペーサーおよびリピート配列；
（ｉｉ）宿主細胞の標的配列にハイブリダイズしてＣａｓヌクレアーゼを宿主細胞の標的
配列に誘導することができる配列を含む、ＨＭ－ｃｒＲＮＡ；
を含み、場合により、ＨＭ－システムは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ
配列を発現するＤＮＡ配列を含み、
それにより、ＨＭ－ｃｒＲＮＡは宿主細胞において宿主標的配列のＣａｓ改変を誘導し、
それにより、宿主細胞が死滅するか、宿主細胞集団の増殖が低下し、それにより、微生物
叢において前記第１の細胞の割合を低減させる。
【0186】
あるいは、ＨＭ－ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡ（ｇＲ
ＮＡ）に含まれる。操作された各核酸配列は、それぞれのベクターに含まれており、各ベ
クターは、場合により、プラスミド（例えば、宿主細胞に移行できる接合性プラスミド）
、ファージ、ファージミド、またはプロファージである。ファージは、前記宿主細胞に感
染することができる。
ＮＡ）に含まれる。操作された各核酸配列は、それぞれのベクターに含まれており、各ベ
クターは、場合により、プラスミド（例えば、宿主細胞に移行できる接合性プラスミド）
、ファージ、ファージミド、またはプロファージである。ファージは、前記宿主細胞に感
染することができる。
【0187】
一例では、宿主細胞の内因性Ｃａｓヌクレアーゼが、標的ヌクレオチド配列の改変のた
めに用いられる。ある実施形態では、それゆえ、各ベクターは、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ
９）ヌクレアーゼをコードする配列を欠いている。内因性Ｃａｓヌクレアーゼを利用する
ことによって、本発明の実施形態は、内因性Ｃａｓヌクレアーゼ活性を使用する（すなわ
ち、ヌクレアーゼ活性を活性化または増強するために、あらかじめ宿主細胞の遺伝子改変
を行う必要がない）。従って、一例では、Ｃａｓヌクレアーゼは、宿主細胞の野生型遺伝
子にコードされている。一例では、ヌクレアーゼは活性であり、宿主細胞における内因性
Ｃａｓヌクレアーゼ（または、Ｃａｓヌクレアーゼ遺伝子）リプレッサーを阻害すること
なく、細胞の死滅または増殖低下を達成する。従って、本発明は、あらかじめ操作する必
要なく、野生型細菌集団に対処して、効果的なＣａｓ媒介性の細胞の死滅または増殖低下
をもたらすことができる。従って、該集団は、その野生型環境にある場合（例えば、植物
、酵母、環境、土壌、ヒト、または動物のマイクロバイオームに含まれる場合）、ｃＲＮ
Ａにさらすことができる。
めに用いられる。ある実施形態では、それゆえ、各ベクターは、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ
９）ヌクレアーゼをコードする配列を欠いている。内因性Ｃａｓヌクレアーゼを利用する
ことによって、本発明の実施形態は、内因性Ｃａｓヌクレアーゼ活性を使用する（すなわ
ち、ヌクレアーゼ活性を活性化または増強するために、あらかじめ宿主細胞の遺伝子改変
を行う必要がない）。従って、一例では、Ｃａｓヌクレアーゼは、宿主細胞の野生型遺伝
子にコードされている。一例では、ヌクレアーゼは活性であり、宿主細胞における内因性
Ｃａｓヌクレアーゼ（または、Ｃａｓヌクレアーゼ遺伝子）リプレッサーを阻害すること
なく、細胞の死滅または増殖低下を達成する。従って、本発明は、あらかじめ操作する必
要なく、野生型細菌集団に対処して、効果的なＣａｓ媒介性の細胞の死滅または増殖低下
をもたらすことができる。従って、該集団は、その野生型環境にある場合（例えば、植物
、酵母、環境、土壌、ヒト、または動物のマイクロバイオームに含まれる場合）、ｃＲＮ
Ａにさらすことができる。
【0188】
一例では、ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは、粘膜、腸内、経口、鼻腔内、直腸内、または頬
側投与により、ヒトまたは非ヒト動物患者へ投与するためのものである（あるいは、投与
される）。
側投与により、ヒトまたは非ヒト動物患者へ投与するためのものである（あるいは、投与
される）。
【0189】
場合により、前駆Ｃａｓヌクレアーゼは、各第１の細胞の、内因性タイプＩＩ ＣＲＩ
ＳＰＲ／Ｃａｓシステムによって提供される。場合により、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、また
は、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するＤＮＡ配列は、各宿主細胞に内因性である。場合に
より、各標的配列は、それぞれの宿主細胞の抗生物質耐性遺伝子、病原性遺伝子 または
必須遺伝子に含まれ、例えば、標的配列は、宿主細胞間で同一である。場合により、操作
された核酸配列は抗生物質組成物に含まれ、該配列は、抗生物質製剤（第１の抗生剤）と
組み合わせられ、また、一例では、標的配列は抗生物質耐性遺伝子に含まれ、抗生物質は
前記第１の抗生剤である。抗生物質組成物は、患者または対象に投与され、前記ディスバ
イオシスまたはステップ（ｂ）をもたらす。
ＳＰＲ／Ｃａｓシステムによって提供される。場合により、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、また
は、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するＤＮＡ配列は、各宿主細胞に内因性である。場合に
より、各標的配列は、それぞれの宿主細胞の抗生物質耐性遺伝子、病原性遺伝子 または
必須遺伝子に含まれ、例えば、標的配列は、宿主細胞間で同一である。場合により、操作
された核酸配列は抗生物質組成物に含まれ、該配列は、抗生物質製剤（第１の抗生剤）と
組み合わせられ、また、一例では、標的配列は抗生物質耐性遺伝子に含まれ、抗生物質は
前記第１の抗生剤である。抗生物質組成物は、患者または対象に投与され、前記ディスバ
イオシスまたはステップ（ｂ）をもたらす。
【0190】
場合により、各宿主細胞は、目的のＨＭ配列をコードする遊離末端を有するデオキシリ
ボ核酸鎖（ＨＭ－ＤＮＡ）を含み、および／または、ここで、該方法は、ＨＭ－ＤＮＡを
コードする当該配列を宿主細胞に含み、ＨＭ－ＤＮＡは、ＨＭ－ＤＮＡを宿主ゲノムに（
例えば、染色体の部位またはエピソームの部位に）挿入するための標的配列の内部または
隣接する配列にそれぞれ相同な１つまたは複数の配列を含む。
ボ核酸鎖（ＨＭ－ＤＮＡ）を含み、および／または、ここで、該方法は、ＨＭ－ＤＮＡを
コードする当該配列を宿主細胞に含み、ＨＭ－ＤＮＡは、ＨＭ－ＤＮＡを宿主ゲノムに（
例えば、染色体の部位またはエピソームの部位に）挿入するための標的配列の内部または
隣接する配列にそれぞれ相同な１つまたは複数の配列を含む。
【0191】
本発明はまた、本発明の処置または予防方法を実行するために第１の細胞（宿主細胞）
に導入するためのベクターを提供し、各ベクターは、内因性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステ
ムを含む細菌または古細菌宿主細胞を改変するための操作された核酸ベクターであって、
該ベクターは、ディスバイオシスを引き起こすのに用いるための、または、本方法のステ
ップ（ｂ）において用いるための、複数の異なるｃｒＲＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）を発現
するための核酸配列を含み、場合により、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸配列を欠
き、
ここで、第１の前記ｃｒＲＮＡは、前記宿主細胞において第１の核酸配列にハイブリダイ
ズすることができ、第２の前記ｃｒＲＮＡは、前記宿主細胞において第２の核酸配列にハ
イブリダイズすることができ、ここで、前記第２の配列は前記第１の配列と異なり；かつ
ａ．第１の配列は抗生物質耐性遺伝子（またはそのＲＮＡ）に含まれており、第２の配列
は抗生物質耐性遺伝子（またはそのＲＮＡ）に含まれており、場合により、これらの遺伝
子は異なり、
ｂ．第１の配列は抗生物質耐性遺伝子（またはそのＲＮＡ）に含まれており、第２の配列
は必須遺伝子または病原性遺伝子（またはそのＲＮＡ）に含まれており、
ｃ．第１の配列は必須遺伝子（またはそのＲＮＡ）に含まれており、第２の配列は、必須
遺伝子または病原性遺伝子（またはそのＲＮＡ）に含まれており、あるいは、
ｄ．第１の配列は病原性遺伝子（またはそのＲＮＡ）に含まれており、第２の配列は必須
遺伝子または病原性遺伝子（またはそのＲＮＡ）に含まれている。
に導入するためのベクターを提供し、各ベクターは、内因性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステ
ムを含む細菌または古細菌宿主細胞を改変するための操作された核酸ベクターであって、
該ベクターは、ディスバイオシスを引き起こすのに用いるための、または、本方法のステ
ップ（ｂ）において用いるための、複数の異なるｃｒＲＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）を発現
するための核酸配列を含み、場合により、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸配列を欠
き、
ここで、第１の前記ｃｒＲＮＡは、前記宿主細胞において第１の核酸配列にハイブリダイ
ズすることができ、第２の前記ｃｒＲＮＡは、前記宿主細胞において第２の核酸配列にハ
イブリダイズすることができ、ここで、前記第２の配列は前記第１の配列と異なり；かつ
ａ．第１の配列は抗生物質耐性遺伝子（またはそのＲＮＡ）に含まれており、第２の配列
は抗生物質耐性遺伝子（またはそのＲＮＡ）に含まれており、場合により、これらの遺伝
子は異なり、
ｂ．第１の配列は抗生物質耐性遺伝子（またはそのＲＮＡ）に含まれており、第２の配列
は必須遺伝子または病原性遺伝子（またはそのＲＮＡ）に含まれており、
ｃ．第１の配列は必須遺伝子（またはそのＲＮＡ）に含まれており、第２の配列は、必須
遺伝子または病原性遺伝子（またはそのＲＮＡ）に含まれており、あるいは、
ｄ．第１の配列は病原性遺伝子（またはそのＲＮＡ）に含まれており、第２の配列は必須
遺伝子または病原性遺伝子（またはそのＲＮＡ）に含まれている。
【0192】
各ベクターは、上述の通り、例えば、宿主細胞に感染することができるファージ、また
は、宿主細胞に導入することができる接合性プラスミドであってよい。一例では、ベクタ
ーは、抗生物質製剤（例えば、βラクタム抗生剤）と組み合わせられる。
は、宿主細胞に導入することができる接合性プラスミドであってよい。一例では、ベクタ
ーは、抗生物質製剤（例えば、βラクタム抗生剤）と組み合わせられる。
【0193】
第１の細胞（宿主細胞）はそれぞれ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｅ
ｃｏｌｉ、ＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ宿主細胞であっ
てよい。一例では、第１の細胞（宿主細胞）はそれぞれ、ファーミキューテス門（Ｆｉｒ
ｍｉｃｕｔｅｓ）細胞であり、例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ、ＬｉｓｔｅｒｉａまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ細胞である。
ｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｅ
ｃｏｌｉ、ＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ宿主細胞であっ
てよい。一例では、第１の細胞（宿主細胞）はそれぞれ、ファーミキューテス門（Ｆｉｒ
ｍｉｃｕｔｅｓ）細胞であり、例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ、ＬｉｓｔｅｒｉａまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ細胞である。
【0194】
一例では、操作された各核酸配列は、宿主細胞におけるそれぞれのｃｒＲＮＡの発現ま
たは生産のための配列Ｒ１－Ｓ１－Ｒ１’を含み（例えば、シングルガイドＲＮＡに含ま
れる）、（ｉ）式中、Ｒ１は第１のＣＲＩＳＰＲリピートであり、Ｒ１’は第２のＣＲＩ
ＳＰＲであり、Ｒ１またはＲ１’は任意であり；かつ（ｉｉ）Ｓ１は、前記標的配列に９
５％以上同一であるヌクレオチド配列を含むか、またはこれから成る第１のＣＲＩＳＰＲ
スペーサーである。
たは生産のための配列Ｒ１－Ｓ１－Ｒ１’を含み（例えば、シングルガイドＲＮＡに含ま
れる）、（ｉ）式中、Ｒ１は第１のＣＲＩＳＰＲリピートであり、Ｒ１’は第２のＣＲＩ
ＳＰＲであり、Ｒ１またはＲ１’は任意であり；かつ（ｉｉ）Ｓ１は、前記標的配列に９
５％以上同一であるヌクレオチド配列を含むか、またはこれから成る第１のＣＲＩＳＰＲ
スペーサーである。
【0195】
一例では、Ｒ１およびＲ１’は、それぞれ、宿主細胞種のＣＲＩＳＰＲアレイの第１お
よび第２のリピート配列に、少なくとも９５％同一である。一例では、Ｒ１およびＲ１’
は、それぞれ、前記種、例えば前記種の前記宿主細胞の、のＣＲＩＳＰＲアレイの、第１
（最も５’側）および第２（第１のリピートの３’側すぐ）のリピート配列に、少なくと
も９５％（例えば、９６、９７、９８、９９または１００％）同一である。一例では、Ｒ
１およびＲ１’は、タイプＩＩＣａｓ９ヌクレアーゼ（例えば、Ｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ、Ｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＳ ａｕｒｅｕｓのＣａｓ９）またはタイプＩＣａ
ｓ３と共に機能して、前記宿主細胞において標的を改変する。
よび第２のリピート配列に、少なくとも９５％同一である。一例では、Ｒ１およびＲ１’
は、それぞれ、前記種、例えば前記種の前記宿主細胞の、のＣＲＩＳＰＲアレイの、第１
（最も５’側）および第２（第１のリピートの３’側すぐ）のリピート配列に、少なくと
も９５％（例えば、９６、９７、９８、９９または１００％）同一である。一例では、Ｒ
１およびＲ１’は、タイプＩＩＣａｓ９ヌクレアーゼ（例えば、Ｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ、Ｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＳ ａｕｒｅｕｓのＣａｓ９）またはタイプＩＣａ
ｓ３と共に機能して、前記宿主細胞において標的を改変する。
【0196】
一局面では、実施例の実験例により実証されているように、本方法は以下の使用を包含
する。
する。
【0197】
第１の細胞（宿主細胞）集団の野生型内因性Ｃａｓヌクレアーゼ活性の、前記集団の増
殖を阻害するための使用であって、各宿主細胞は、野生型Ｃａｓヌクレアーゼ活性を有す
る内因性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを有し、該使用は該集団の宿主細胞を形質転換す
ることを含み、ここで、各形質転換宿主細胞は、宿主細胞において宿主改変（ＨＭ）ｃＲ
ＮＡまたはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を提供するために遺伝子操作されたヌクレオチド配
列で形質転換され、ＨＭ－ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは、内因性Ｃａｓを標的に誘導するた
めに宿主細胞標的プロトスペーサー配列とハイブリダイズすることができる配列を含み、
ここでｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは、前記野生型ヌクレアーゼ活性を有する宿主細胞の内因
性Ｃａｓヌクレアーゼとコグネイトであり、宿主細胞の形質転換後、集団の増殖が阻害さ
れる、使用を包含する。
殖を阻害するための使用であって、各宿主細胞は、野生型Ｃａｓヌクレアーゼ活性を有す
る内因性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを有し、該使用は該集団の宿主細胞を形質転換す
ることを含み、ここで、各形質転換宿主細胞は、宿主細胞において宿主改変（ＨＭ）ｃＲ
ＮＡまたはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を提供するために遺伝子操作されたヌクレオチド配
列で形質転換され、ＨＭ－ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは、内因性Ｃａｓを標的に誘導するた
めに宿主細胞標的プロトスペーサー配列とハイブリダイズすることができる配列を含み、
ここでｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは、前記野生型ヌクレアーゼ活性を有する宿主細胞の内因
性Ｃａｓヌクレアーゼとコグネイトであり、宿主細胞の形質転換後、集団の増殖が阻害さ
れる、使用を包含する。
【0198】
「コグネイトの」とは、内因性Ｃａｓが、ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡと作動可能であり
、宿主細胞の標的へと誘導されることを意図している。当業者であれば、このＣａｓ誘導
が、一般的に、細菌および古細菌細胞における、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性の特徴であり
、例えば、内因性の活性野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを有する細菌または古細菌
の細胞における、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性の特徴であることは、理解するであろ
う。
、宿主細胞の標的へと誘導されることを意図している。当業者であれば、このＣａｓ誘導
が、一般的に、細菌および古細菌細胞における、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性の特徴であり
、例えば、内因性の活性野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを有する細菌または古細菌
の細胞における、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性の特徴であることは、理解するであろ
う。
【0199】
「野生型」Ｃａｓ活性とは、当業者には明らかであろうが、内因性Ｃａｓが操作された
Ｃａｓではないこと、または、細胞が内因性Ｃａｓ活性を抑制解除するように操作されて
はいないことを意図している。これは、Ｃａｓヌクレアーゼ活性が天然に抑制されている
特定の細菌とは対照的である（すなわち、野生型Ｃａｓヌクレアーゼ活性は存在しないか
、または本発明に有用な野生型Ｃａｓヌクレアーゼ活性は存在せず、反対に、in situで
野生型宿主細胞に対処することに適用可能であり、例えば、内因性Ｃａｓ活性が細胞集団
増殖阻害をもたらすために利用できる場合が挙げられる）。
Ｃａｓではないこと、または、細胞が内因性Ｃａｓ活性を抑制解除するように操作されて
はいないことを意図している。これは、Ｃａｓヌクレアーゼ活性が天然に抑制されている
特定の細菌とは対照的である（すなわち、野生型Ｃａｓヌクレアーゼ活性は存在しないか
、または本発明に有用な野生型Ｃａｓヌクレアーゼ活性は存在せず、反対に、in situで
野生型宿主細胞に対処することに適用可能であり、例えば、内因性Ｃａｓ活性が細胞集団
増殖阻害をもたらすために利用できる場合が挙げられる）。
【0200】
以下の実施例では、固体表面上の細菌集団（グラム陽性ファーミキューテス門（Ｆｉｒ
ｍｉｃｕｔｅｓ））において、阻害を調べた。宿主細胞集団の増殖の、１０倍を超える阻
害が達成された。標的化は、抗生物質耐性遺伝子および必須遺伝子を対象とした。表面上
の宿主細胞増殖を阻害する本発明の能力の実証は、実施形態において、重要かつ望ましく
、ここで、本発明はヒトまたは動物対象において本明細書に開示される微生物叢によって
媒介または引き起こされる疾病または症状を処置または予防するためのものである。該微
生物叢は、典型的には、対象の組織（例えば、腸組織）と接触しており、従って、表面上
の微生物叢の細菌種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓが例示される）の増殖を阻害する活性
の実証は、この有用性を支持すると我々は信じている。 植物表面の微生物叢の標的化も
また、望ましい適用である。
ｍｉｃｕｔｅｓ））において、阻害を調べた。宿主細胞集団の増殖の、１０倍を超える阻
害が達成された。標的化は、抗生物質耐性遺伝子および必須遺伝子を対象とした。表面上
の宿主細胞増殖を阻害する本発明の能力の実証は、実施形態において、重要かつ望ましく
、ここで、本発明はヒトまたは動物対象において本明細書に開示される微生物叢によって
媒介または引き起こされる疾病または症状を処置または予防するためのものである。該微
生物叢は、典型的には、対象の組織（例えば、腸組織）と接触しており、従って、表面上
の微生物叢の細菌種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓが例示される）の増殖を阻害する活性
の実証は、この有用性を支持すると我々は信じている。 植物表面の微生物叢の標的化も
また、望ましい適用である。
【0201】
一例では、第１の細胞（宿主細胞）集団の増殖の阻害は、前記の操作されたヌクレオチ
ド配列にさらされていない同じ種または株の細胞の増殖と比較して、少なくとも、２、３
、４、５、６、７、８、９または１０倍である。例えば、増殖阻害は、宿主細胞の第１の
サンプル（単独、または混合細菌集団であって、例えば、処置後の患者の微生物叢または
糞便サンプル）の細菌のコロニー数が、宿主細胞の第２のサンプル（単独、または混合細
菌集団であって、例えば、処置前の患者の微生物叢または糞便サンプル）のコロニー数と
比較して、少なくとも、２、３、４、５、６、７、８、９または１０倍低いことにより示
され、ここで、第１の細胞は、前記操作されたヌクレオチド配列により形質転換されてい
るが、第２のサンプルは、前記操作されたヌクレオチド配列に曝されていない。ある実施形態では、コロニー数は、第１のサンプルが操作された配列にさらされてから、１２、２４、３６、または４８時間後に決定される。ある実施形態では、コロニーは、インビトロで（例えば、ペトリ皿にて）固体寒天上で増殖する。それゆえ、増殖阻害は、第１の細胞または集団（宿主細胞または集団）の増殖の低下（処置なし、すなわち、コントロールサンプルの増殖と比較して１００％を下回る増殖）により示され得ること、または、該増殖の完全な消失であり得ることは、理解されるであろう。一例では、宿主細胞集団の増殖は、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または９５％低下し、すなわち、所定の期間にわたって（例えば、宿主細胞におけるｃＲＮＡまたはｇＲＮＡ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーなどの組み合わせ後の２４時間または４８時間）、宿主細胞集団の増殖が、前記ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡ等に曝されていないが、前記所定の期間継続して同じ条件に置かれたコントロール宿主細胞集団の増殖と比較して、少なくとも当該パーセント低い。一例では、増殖の低下率は、前記期間の終わり（例えば、コントロールサンプルの対数増殖期中期の時点）に各集団のサンプルのコロニー数を比較することによって決定される。例えば、テスト集団を、Ｏ時間にｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡ等に曝した後、テスト集団およびコントロール集団のサンプルを採取して、各サンプルを寒天プレート上にプレーティングし、前記所定の期間、同一条件下でインキュベートする。所定の期間の終わりに、各サンプルのコロニー数をカウントして、増減率を計算する（すなわち、テストコロニー数をコントロールコロニー数で除して、１００を掛け、その結果を１００から引いて増殖低下率を求める）。倍数差は、コントロールコロニー数を、テストコロニー数で除して、計算する。
ド配列にさらされていない同じ種または株の細胞の増殖と比較して、少なくとも、２、３
、４、５、６、７、８、９または１０倍である。例えば、増殖阻害は、宿主細胞の第１の
サンプル（単独、または混合細菌集団であって、例えば、処置後の患者の微生物叢または
糞便サンプル）の細菌のコロニー数が、宿主細胞の第２のサンプル（単独、または混合細
菌集団であって、例えば、処置前の患者の微生物叢または糞便サンプル）のコロニー数と
比較して、少なくとも、２、３、４、５、６、７、８、９または１０倍低いことにより示
され、ここで、第１の細胞は、前記操作されたヌクレオチド配列により形質転換されてい
るが、第２のサンプルは、前記操作されたヌクレオチド配列に曝されていない。ある実施形態では、コロニー数は、第１のサンプルが操作された配列にさらされてから、１２、２４、３６、または４８時間後に決定される。ある実施形態では、コロニーは、インビトロで（例えば、ペトリ皿にて）固体寒天上で増殖する。それゆえ、増殖阻害は、第１の細胞または集団（宿主細胞または集団）の増殖の低下（処置なし、すなわち、コントロールサンプルの増殖と比較して１００％を下回る増殖）により示され得ること、または、該増殖の完全な消失であり得ることは、理解されるであろう。一例では、宿主細胞集団の増殖は、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または９５％低下し、すなわち、所定の期間にわたって（例えば、宿主細胞におけるｃＲＮＡまたはｇＲＮＡ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーなどの組み合わせ後の２４時間または４８時間）、宿主細胞集団の増殖が、前記ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡ等に曝されていないが、前記所定の期間継続して同じ条件に置かれたコントロール宿主細胞集団の増殖と比較して、少なくとも当該パーセント低い。一例では、増殖の低下率は、前記期間の終わり（例えば、コントロールサンプルの対数増殖期中期の時点）に各集団のサンプルのコロニー数を比較することによって決定される。例えば、テスト集団を、Ｏ時間にｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡ等に曝した後、テスト集団およびコントロール集団のサンプルを採取して、各サンプルを寒天プレート上にプレーティングし、前記所定の期間、同一条件下でインキュベートする。所定の期間の終わりに、各サンプルのコロニー数をカウントして、増減率を計算する（すなわち、テストコロニー数をコントロールコロニー数で除して、１００を掛け、その結果を１００から引いて増殖低下率を求める）。倍数差は、コントロールコロニー数を、テストコロニー数で除して、計算する。
【0202】
集団の増殖阻害は、集団における第１の細胞（宿主細胞）の増殖数における低下により
示され得る。これは、ヌクレアーゼによる細胞の死滅および／または標的プロトスペーサ
ー配列に対するヌクレアーゼの作用による宿主細胞増殖（分裂および／または細胞増殖）
のダウンレギュレーションによる可能性がある。本明細書に開示される処置または予防の
ある実施形態では、ヒトまたは動物対象の宿主細胞負荷が減少し、それによって疾病また
は症状が処置される（例えば、軽減または除去される）か、または予防される（すなわち
、対象が疾病または症状を発症するリスクが軽減または除去される。）
示され得る。これは、ヌクレアーゼによる細胞の死滅および／または標的プロトスペーサ
ー配列に対するヌクレアーゼの作用による宿主細胞増殖（分裂および／または細胞増殖）
のダウンレギュレーションによる可能性がある。本明細書に開示される処置または予防の
ある実施形態では、ヒトまたは動物対象の宿主細胞負荷が減少し、それによって疾病また
は症状が処置される（例えば、軽減または除去される）か、または予防される（すなわち
、対象が疾病または症状を発症するリスクが軽減または除去される。）
【0203】
一例では、野生型宿主細胞内因性Ｃａｓ９またはｃｆｐ１活性が用いられる。一例では
、野生型宿主細胞内因性Ｃａｓ３および／またはＣＡＳＣＡＤＥ活性が用いられる。操作
されたヌクレオチド配列は、外因性のＣａｓヌクレアーゼをコードする配列と組み合わせ
てはならない。場合により、前記Ｃａｓヌクレアーゼはニッカーゼである。
、野生型宿主細胞内因性Ｃａｓ３および／またはＣＡＳＣＡＤＥ活性が用いられる。操作
されたヌクレオチド配列は、外因性のＣａｓヌクレアーゼをコードする配列と組み合わせ
てはならない。場合により、前記Ｃａｓヌクレアーゼはニッカーゼである。
【0204】
一例では、前記宿主細胞の細菌コロニーの形成は、前記ディスバイオシスまたはステッ
プ（ｂ）に続いて阻害される。一例では、宿主細胞の増殖は、前記ディスバイオシスまた
はステップ（ｂ）に続いて阻害される。一例では、宿主細胞は、前記ディスバイオシスま
たはステップ（ｂ）に続いて死滅する。
プ（ｂ）に続いて阻害される。一例では、宿主細胞の増殖は、前記ディスバイオシスまた
はステップ（ｂ）に続いて阻害される。一例では、宿主細胞は、前記ディスバイオシスま
たはステップ（ｂ）に続いて死滅する。
【0205】
別の局面において、本方法は、疾病または症状を処置または予防するための前記ディス
バイオシスを引き起こすことまたはステップ（ｂ）のための、患者へ投与するための医薬
をエクスビボで生産することを含み、該医薬は改変された混合細菌集団（例えば、１つ以
上のヒトドナーまたは前記患者の糞便または腸内微生物叢から得られる）を含み、該改変
された集団は、患者に投与され、前記ディスバイオシスを引き起こすか、または、ステッ
プ（ｂ）において患者の腸内微生物叢における種または株のバランスを変更し、それによ
り、腸内微生物叢における第１の細胞の割合を変更する。改変された混合集団は、本明細
書に記載される誘導型ヌクレアーゼ改変技術を用いて、エクスビボで生産され得る。従っ
て、例えば、本方法は、例えば、本明細書に開示される代謝性の、またはＧＩの症状また
は疾病の処置または予防のための医薬の生産のために、混合集団において、特定のファー
ミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）亜集団の割合を低減し、バクテロイデス門（Ｂ
ａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）を温存するために用いられ得る。このように、本発明は、ヒ
トまたは動物における、これらの使用または、当該処置または予防のための、改変された
細菌移植片（例えば、改変された糞便移植片）の医薬を使用するとができる。例えば、本
方法は、医薬的使用（例えば、代謝性の症状（肥満症または糖尿病）または、消化管の症
状（例えば、本明細書に記載の任意の当該症状）、またはがん（例えば、消化管がん）の
処置または予防）のためにヒトまたは動物に投与するための、改変された細菌コレクショ
ンを生産するために、１つ以上の微生物叢をインビトロで改変するのに用いられ得る。一
例では、本明細書に記載される操作された各核酸配列を含むファージまたはプラスミドベ
クターによる細菌細胞の形質転換が、インビトロで実行されるか、または、操作されたヌ
クレオチド配列が、宿主細胞にエレクトロポレーションされる核酸に含まれる。一例では
、核酸はＲＮＡ（例えば、ｇＲＮＡのコピー）である。別の例では、核酸は、宿主細胞に
おいて発現するための、ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードするＤＮＡである。
バイオシスを引き起こすことまたはステップ（ｂ）のための、患者へ投与するための医薬
をエクスビボで生産することを含み、該医薬は改変された混合細菌集団（例えば、１つ以
上のヒトドナーまたは前記患者の糞便または腸内微生物叢から得られる）を含み、該改変
された集団は、患者に投与され、前記ディスバイオシスを引き起こすか、または、ステッ
プ（ｂ）において患者の腸内微生物叢における種または株のバランスを変更し、それによ
り、腸内微生物叢における第１の細胞の割合を変更する。改変された混合集団は、本明細
書に記載される誘導型ヌクレアーゼ改変技術を用いて、エクスビボで生産され得る。従っ
て、例えば、本方法は、例えば、本明細書に開示される代謝性の、またはＧＩの症状また
は疾病の処置または予防のための医薬の生産のために、混合集団において、特定のファー
ミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）亜集団の割合を低減し、バクテロイデス門（Ｂ
ａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）を温存するために用いられ得る。このように、本発明は、ヒ
トまたは動物における、これらの使用または、当該処置または予防のための、改変された
細菌移植片（例えば、改変された糞便移植片）の医薬を使用するとができる。例えば、本
方法は、医薬的使用（例えば、代謝性の症状（肥満症または糖尿病）または、消化管の症
状（例えば、本明細書に記載の任意の当該症状）、またはがん（例えば、消化管がん）の
処置または予防）のためにヒトまたは動物に投与するための、改変された細菌コレクショ
ンを生産するために、１つ以上の微生物叢をインビトロで改変するのに用いられ得る。一
例では、本明細書に記載される操作された各核酸配列を含むファージまたはプラスミドベ
クターによる細菌細胞の形質転換が、インビトロで実行されるか、または、操作されたヌ
クレオチド配列が、宿主細胞にエレクトロポレーションされる核酸に含まれる。一例では
、核酸はＲＮＡ（例えば、ｇＲＮＡのコピー）である。別の例では、核酸は、宿主細胞に
おいて発現するための、ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードするＤＮＡである。
【0206】
従って、一例では、本発明は、本発明の方法において用いられる植物、酵母、環境、土
壌、ヒトまたは動物対象に含まれる野生型細菌宿主細胞の集団において、宿主細胞改変（
ＨＭ）ｃＲＮＡまたはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を提供するための操作されたヌクレオチ
ド配列提供し、該ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは、Ｃａｓを標的に誘導するための宿主細胞標
的プロトスペーサー配列にハイブリダイズすることができる配列を含み、該ｃＲＮＡまた
はｇＲＮＡは、野生型ヌクレアーゼ活性を有する内因性宿主細胞Ｃａｓヌクレアーゼにコ
グネイトであり、宿主細胞の形質転換後に、集団の増殖が阻害され、かつ、疾病または症
状が処置または予防されるか、あるいは、治療または処置が調節される。
壌、ヒトまたは動物対象に含まれる野生型細菌宿主細胞の集団において、宿主細胞改変（
ＨＭ）ｃＲＮＡまたはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を提供するための操作されたヌクレオチ
ド配列提供し、該ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは、Ｃａｓを標的に誘導するための宿主細胞標
的プロトスペーサー配列にハイブリダイズすることができる配列を含み、該ｃＲＮＡまた
はｇＲＮＡは、野生型ヌクレアーゼ活性を有する内因性宿主細胞Ｃａｓヌクレアーゼにコ
グネイトであり、宿主細胞の形質転換後に、集団の増殖が阻害され、かつ、疾病または症
状が処置または予防されるか、あるいは、治療または処置が調節される。
【0207】
一例では、操作されたヌクレオチド配列は、ＨＭ－ＣＲＩＳＰＲアレイを含む。一例で
は、操作されたヌクレオチド配列は、シングルガイドＲＮＡをコードする。一例では、操
作されたヌクレオチド配列は、ガイドＲＮＡ（例えば、シングルガイドＲＮＡ）、または
、ｃｒＲＮＡである。一例では、操作された配列は宿主細胞に感染することができるバク
テリオファージに含まれており、ここで、形質転換は、バクテリオファージによる宿主細
胞の形質導入を含む。バクテリオファージは、本明細書に記載されるファージであり得る
。一例では、操作されたヌクレオチド配列は、宿主細胞を形質転換することができるプラ
スミド（例えば、接合性プラスミド）に含まれる。該プラスミドは、本明細書に記載され
るプラスミドであり得る。一例では、操作されたヌクレオチド配列は、宿主細胞に、およ
び／または、宿主細胞間を、移行することができるトランスポゾンに含まれる。トランス
ポゾンは、本明細書に記載されるトランスポゾンであり得る。
は、操作されたヌクレオチド配列は、シングルガイドＲＮＡをコードする。一例では、操
作されたヌクレオチド配列は、ガイドＲＮＡ（例えば、シングルガイドＲＮＡ）、または
、ｃｒＲＮＡである。一例では、操作された配列は宿主細胞に感染することができるバク
テリオファージに含まれており、ここで、形質転換は、バクテリオファージによる宿主細
胞の形質導入を含む。バクテリオファージは、本明細書に記載されるファージであり得る
。一例では、操作されたヌクレオチド配列は、宿主細胞を形質転換することができるプラ
スミド（例えば、接合性プラスミド）に含まれる。該プラスミドは、本明細書に記載され
るプラスミドであり得る。一例では、操作されたヌクレオチド配列は、宿主細胞に、およ
び／または、宿主細胞間を、移行することができるトランスポゾンに含まれる。トランス
ポゾンは、本明細書に記載されるトランスポゾンであり得る。
【0208】
本発明の方法はいずれも、細胞においてｃＲＮＡまたはｇＲＮＡを生産するために、宿
主細胞を核酸で形質転換することを含む。例えば、操作されたヌクレオチド配列を含むベ
クターまたは核酸は、経口的に、静脈内に、局所的に、眼に、鼻腔内に、吸入により、直
腸投与により、または本明細書で開示される任意の他の投与経路により、または他の方法
で、患者に投与され、ここで、投与は、第１の細胞（宿主細胞）を、ベクターまたは核酸
で形質転換する。
主細胞を核酸で形質転換することを含む。例えば、操作されたヌクレオチド配列を含むベ
クターまたは核酸は、経口的に、静脈内に、局所的に、眼に、鼻腔内に、吸入により、直
腸投与により、または本明細書で開示される任意の他の投与経路により、または他の方法
で、患者に投与され、ここで、投与は、第１の細胞（宿主細胞）を、ベクターまたは核酸
で形質転換する。
【0209】
一例では、第１の細胞は、患者または対象の微生物叢において、第２の細菌と混合され
る。場合により、第２の細菌種は、以下の実施例に示されるように、Ｅ ｃｏｌｉ、Ｌ
ｌａｃｔｉｓまたはＳ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓであり、ヒトおよび動物の腸内微生物
叢において、相利共生的に共存する株である。実施例はまた、グラム陽性細菌およびグラ
ム陰性細菌の混合集団における標的化に対処している。さらに、実施例は、ファーミキュ
ーテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の集団（Ｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、および、
エンテロバクター科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）の集団（Ｅ ｃｏｌｉ）
に対処しており、これらは共に、ヒトの微生物叢に見られる。エンテロバクター科（Ｅｎ
ｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）の他の例は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎ
ｉａ ｐｅｓｔｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｅｎ
ｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、ＳｅｒｒａｔｉａおよびＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒである。
る。場合により、第２の細菌種は、以下の実施例に示されるように、Ｅ ｃｏｌｉ、Ｌ
ｌａｃｔｉｓまたはＳ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓであり、ヒトおよび動物の腸内微生物
叢において、相利共生的に共存する株である。実施例はまた、グラム陽性細菌およびグラ
ム陰性細菌の混合集団における標的化に対処している。さらに、実施例は、ファーミキュ
ーテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の集団（Ｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、および、
エンテロバクター科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）の集団（Ｅ ｃｏｌｉ）
に対処しており、これらは共に、ヒトの微生物叢に見られる。エンテロバクター科（Ｅｎ
ｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）の他の例は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎ
ｉａ ｐｅｓｔｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｅｎ
ｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、ＳｅｒｒａｔｉａおよびＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒである。
【0210】
一例では、症状または疾病は、代謝性の、または胃腸の疾病または症状であり、例えば
、肥満症、ＩＢＤ、ＩＢＳ、クローン病または潰瘍性大腸炎である。一例では、症状また
は疾病は、がんであり、例えば、固形腫瘍、すなわち、ＧＩがん（例えば、胃がん）、肝
臓がん、または膵臓がんである。一例では、症状は、抗生物質（例えば、本明細書に開示
される任意の抗生物質）に耐性であるか、応答性が低下している。
、肥満症、ＩＢＤ、ＩＢＳ、クローン病または潰瘍性大腸炎である。一例では、症状また
は疾病は、がんであり、例えば、固形腫瘍、すなわち、ＧＩがん（例えば、胃がん）、肝
臓がん、または膵臓がんである。一例では、症状は、抗生物質（例えば、本明細書に開示
される任意の抗生物質）に耐性であるか、応答性が低下している。
【0211】
一例では、各第１の細胞（宿主細胞）は、細胞における前記ＨＭ－ｃｒＲＮＡの生産に
おいて、操作された配列で作動可能な内因性ＲＮａｓｅＩＩＩを含む。代替としては、１
つ以上のベクターが、宿主細胞におけるＲＮａｓｅＩＩＩの発現のために、該ＲＮａｓｅ
ＩＩＩをコードするヌクレオチド配列を含む。
おいて、操作された配列で作動可能な内因性ＲＮａｓｅＩＩＩを含む。代替としては、１
つ以上のベクターが、宿主細胞におけるＲＮａｓｅＩＩＩの発現のために、該ＲＮａｓｅ
ＩＩＩをコードするヌクレオチド配列を含む。
【0212】
一例では、必須遺伝子（標的を含む）は、細胞のＤＮＡポリメラーゼを含む。これは、
以下に例示されている。
以下に例示されている。
【0213】
一例では、ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡは、ＮＧＧ、ＮＡＧ、ＮＧＡ、ＮＧＣ、ＮＧＧＮＧ
、ＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＡＧＡＡＷプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、例えば
、ＡＡＡＧＡＡＡまたはＴＡＡＧＡＡＡ ＰＡＭ（これらの配列は、５’から３’の方向
で記載されている）に隣接する、宿主細胞の標的プロトスペーサー配列にハイブリダイズ
することができる配列を含む。ある実施形態では、ＰＡＭは、プロトスペーサー配列の３
’末端に直接隣接している。一例では、ＣａｓはＳ ａｕｒｅｕｓ、Ｓ ｔｈｅｒｏｍｏ
ｐｈｉｌｕｓまたはＳ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓである。一例では、Ｃａｓは、Ｃｐｆ
１であり、および／または、ＰＡＭは、ＴＴＮまたはＣＴＡである。
、ＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＡＧＡＡＷプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、例えば
、ＡＡＡＧＡＡＡまたはＴＡＡＧＡＡＡ ＰＡＭ（これらの配列は、５’から３’の方向
で記載されている）に隣接する、宿主細胞の標的プロトスペーサー配列にハイブリダイズ
することができる配列を含む。ある実施形態では、ＰＡＭは、プロトスペーサー配列の３
’末端に直接隣接している。一例では、ＣａｓはＳ ａｕｒｅｕｓ、Ｓ ｔｈｅｒｏｍｏ
ｐｈｉｌｕｓまたはＳ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓである。一例では、Ｃａｓは、Ｃｐｆ
１であり、および／または、ＰＡＭは、ＴＴＮまたはＣＴＡである。
【0214】
一例では、操作されたヌクレオチド配列またはベクターはそれぞれ、前記ｃｒＲＮＡま
たはｇＲＮＡをコードする前記ＣＲＩＳＰＲアレイまたは配列を含み、さらに、抗生物質
耐性遺伝子（例えば、カナマイシン耐性）を含み、ここで、ＨＭ－ｃｒＲＮＡまたはｇＲ
ＮＡは、抗生物質耐性遺伝子を標的としない。一例では、標的配列は、宿主細胞の抗生物
質耐性遺伝子に含まれており、該抗生物質は、第１の抗生物質（例えば、カナマイシン）
とは異なる。このように、操作された配列またはベクターは、それ自身を標的とせずに、
宿主を標的とすることができる。宿主細胞を、第１の抗生物質にさらすことによって（例
えば、患者に対して、経口的に、または、静脈内に投与することによって）、ポジティブ
選択圧によって操作された配列またはベクターの保持を促進することができる。なぜなら
、第１の抗生物質耐性遺伝子を含む細胞は、第１の抗生物質の存在下で生存に有利になる
であろうからである（操作された配列またはベクターによって形質転換されていない宿主
細胞が、第１の抗生物質に耐性でない場合）。従って、ある例では、以下を提供する：宿
主細胞におけるｃＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする配列の維持を促進するための、第１
の（宿主）細胞集団を前記抗生物質（例えば、カナマイシン）および前記操作された配列
またはベクターに曝露することを含む本発明の方法；あるいは、本発明の操作された配列
、アレイまたはベクターは前記抗生物質と組み合わされている。
たはｇＲＮＡをコードする前記ＣＲＩＳＰＲアレイまたは配列を含み、さらに、抗生物質
耐性遺伝子（例えば、カナマイシン耐性）を含み、ここで、ＨＭ－ｃｒＲＮＡまたはｇＲ
ＮＡは、抗生物質耐性遺伝子を標的としない。一例では、標的配列は、宿主細胞の抗生物
質耐性遺伝子に含まれており、該抗生物質は、第１の抗生物質（例えば、カナマイシン）
とは異なる。このように、操作された配列またはベクターは、それ自身を標的とせずに、
宿主を標的とすることができる。宿主細胞を、第１の抗生物質にさらすことによって（例
えば、患者に対して、経口的に、または、静脈内に投与することによって）、ポジティブ
選択圧によって操作された配列またはベクターの保持を促進することができる。なぜなら
、第１の抗生物質耐性遺伝子を含む細胞は、第１の抗生物質の存在下で生存に有利になる
であろうからである（操作された配列またはベクターによって形質転換されていない宿主
細胞が、第１の抗生物質に耐性でない場合）。従って、ある例では、以下を提供する：宿
主細胞におけるｃＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする配列の維持を促進するための、第１
の（宿主）細胞集団を前記抗生物質（例えば、カナマイシン）および前記操作された配列
またはベクターに曝露することを含む本発明の方法；あるいは、本発明の操作された配列
、アレイまたはベクターは前記抗生物質と組み合わされている。
【0215】
一例では、ｃＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする配列は、宿主細胞の種において作動可
能な構成的プロモーター（例えば、強力なプロモーター）、または、誘導性プロモーター
の下にある。
能な構成的プロモーター（例えば、強力なプロモーター）、または、誘導性プロモーター
の下にある。
【0216】
一例では、当該またはそれぞれの第一の（宿主）細胞はグラム陽性細胞である。別の例
では、当該またはそれぞれの第一の（宿主）細胞はグラム陽性細胞である。
では、当該またはそれぞれの第一の（宿主）細胞はグラム陽性細胞である。
【0217】
本発明はまた、本方法を実行した後に患者から腸内微生物叢を単離することによって、
または、本方法を実行した後に患者から糞便サンプルを単離することによって、本方法に
より得られる微生物叢細菌のエクスビボ混合集団を提供する。一例では、混合集団は、医
薬的使用または栄養的使用のための容器に入っている。例えば、容器は滅菌容器であり、
例えば、吸入器、鼻腔内送達装置であり、または、シリンジまたは静脈注射用針に連結さ
れている。一例では、混合集団は、疾病または症状（例えば、本明細書中に開示される疾
病または症状）を処置するために、そのマイクロバイオームを生息させるための、ヒトま
たは動物への投与に有用である。
または、本方法を実行した後に患者から糞便サンプルを単離することによって、本方法に
より得られる微生物叢細菌のエクスビボ混合集団を提供する。一例では、混合集団は、医
薬的使用または栄養的使用のための容器に入っている。例えば、容器は滅菌容器であり、
例えば、吸入器、鼻腔内送達装置であり、または、シリンジまたは静脈注射用針に連結さ
れている。一例では、混合集団は、疾病または症状（例えば、本明細書中に開示される疾
病または症状）を処置するために、そのマイクロバイオームを生息させるための、ヒトま
たは動物への投与に有用である。
【0218】
本明細書において、一例では、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓは、ｃａｃｃａｅ、ｃａｐｉｌ
ｌｏｓｕｓ、ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ、ｃｏｐｒｏｃｏｌａ、ｃｏｐｒｏｐｈ
ｉｌｕｓ、ｃｏｐｒｏｓｕｉｓ、ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ、ｄｏｒｅｉ、ｅｇｇｅｒｔｈｉ
ｉ、ｆａｅｃｉｓ、ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ，ｆｌｕｘｕｓ、ｆｒａｇａｌｉｓ、ｉｎｔｅ
ｓｔｉｎａｌｉｓ、ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ、ｎｏｒｄｉｉ、ｏｌｅｉｃｉｐｌ
ｅｎｕｓ、ｏｒａｌｉｓ、ｏｖａｔｕｓ、ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｉｌｕｓ、ｐｌｅｂｅｉｕ
ｓ、ｓｔｅｒｃｏｒｉｓ、ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、ｖ
ｕｌｇａｔｕｓおよびｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓから選択される種である。例えば、Ｂ
ａｃｔｅｒｏｉｄｅｓは、ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎである。一例では、第１の
（宿主細胞）集団または第２の細菌は、複数の異なるバクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏ
ｉｄｅｔｅｓ）の種、または、複数のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種（例えば、Ｂ ｔｈｅｔ
ａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎおよびＢ ｆｒａｇａｌｉｓ）、または、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄ
ｅｓおよびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ種を含む。本明細書において、一例では、Ｐｒｅｖｏｔ
ｅｌｌａは、ｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、ｂｉｖｉａ、ｂｕｃｃａｅ、頬側ｉｓ、ｃｏｐｒｉ、
ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ、ｏｒｉｓ、ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ、ｔａｎｎｅｒａｅ、
ｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓ およびｖｅｒｏｒａｌｉｓから選択される種である。あるいは、
第１の細胞（宿主細胞）または第２の細菌は、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔ
ｅｓ）の細胞であり、例えば、Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ、Ａｃｅｔａｎａｅｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｅｔｉｔｏｍａｃｕｌｕｍ、Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ、Ａｎａｅｒ
ｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｎａｅｒｏｆｉｌｕｍ、Ａｎａｅｒｏｓｉｎｕｓ、Ａｎａｅｒｏｓｔ
ｉｐｅｓ、Ａｎａｅｒｏｖｏｒａｘ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕ
ｍ、Ｃａｐｒａｃｏｃｃｕｓ、Ｄｅｈａｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ、Ｄｏｒ
ｅａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｔｈａｎｏｌｉｇｅｎｅｎｓ、Ｆａｅｃａｌｉｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｒａｃｉｌｉｂａｃｔｅｒ、Ｇｕｇｇ
ｅｎｈｅｉｍｅｌｌａ、Ｈｅｓｐｅｌｌｉａ、Ｌａｃｈｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃ
ｈｎｏｓｐｉｒａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、Ｍｅｇａｍ
ｏｎａｓ、Ｍｏｒｙｅｌｌａ、Ｍｉｔｓｕｏｋｅｌｌａ、Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｏ
ｘｏｂａｃｔｅｒ、Ｐａｐｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ、Ｐｒｏｐｒｉｏｎｉｓｐｉｒａ，Ｐｓ
ｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｐｓｅｕｄｏｒａｍｉｂａｃｔｅｒ、Ｒｏｓｅｂｕ
ｒｉａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｒｃｉｎａ、Ｓｅｉｎｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｕｔ
ｔｌｅｗｏｒｔｈｉａ、Ｓｐｏｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｏｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｃｏｃ
ｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｉｌｌｕｓ、ＴｕｒｉｂａｃｔｅｒおよびＷｅｉｓｅｌｌａ
から選択される１つ以上のファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）を含むか、こ
れらから成る。一例では、第１の細胞（宿主細胞）または第２の細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉ
ｄｉｕｍ（例えば、ｄｉｆｉｃｉｌｅ）細胞を含むか、これらから成る（また、場合によ
り、他の亜集団はＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ
）細胞から成る）。一例では、第１の細胞（宿主細胞）または第２の細菌は、Ｅｎｔｅｒ
ｏｃｏｃｃｕｓ細胞を含むか、これらから成る（また、場合により、他の細胞はＢａｃｔ
ｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）細胞からなる）。一例で
は、第１の細胞（宿主細胞）または第２の細菌は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ細胞を含む
か、これらから成る（また、場合により、他の細胞はＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、
ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）細胞からなる）。一例では、第１の細胞（宿主細胞
）または第２の細菌は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ細胞を含むか、これらから成る（また
、場合により、他の細胞はＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉ
ｃｒｏｎ）細胞からなる）。一例では、第１の細胞（宿主細胞）または第２の細菌は、Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細胞を含むか、これらから成る（また、場合により、他の細胞
はＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）細胞からなる
）。一例では、第１の細胞（宿主細胞）または第２の細菌は、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ細胞を含むか、これらから成る（また、場合により、他の細胞はＢａｃｔｅｒｏ
ｉｄｅｓ（例えば、ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）細胞からなる）。例えば、Ｆａ
ｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍは、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉ
ｔｚｉｉ（例えば、Ａ２－１６５、Ｌ２－６、Ｍ２１／２またはＳＬ３／３）である。
ｌｏｓｕｓ、ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ、ｃｏｐｒｏｃｏｌａ、ｃｏｐｒｏｐｈ
ｉｌｕｓ、ｃｏｐｒｏｓｕｉｓ、ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ、ｄｏｒｅｉ、ｅｇｇｅｒｔｈｉ
ｉ、ｆａｅｃｉｓ、ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ，ｆｌｕｘｕｓ、ｆｒａｇａｌｉｓ、ｉｎｔｅ
ｓｔｉｎａｌｉｓ、ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ、ｎｏｒｄｉｉ、ｏｌｅｉｃｉｐｌ
ｅｎｕｓ、ｏｒａｌｉｓ、ｏｖａｔｕｓ、ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｉｌｕｓ、ｐｌｅｂｅｉｕ
ｓ、ｓｔｅｒｃｏｒｉｓ、ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、ｖ
ｕｌｇａｔｕｓおよびｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓから選択される種である。例えば、Ｂ
ａｃｔｅｒｏｉｄｅｓは、ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎである。一例では、第１の
（宿主細胞）集団または第２の細菌は、複数の異なるバクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏ
ｉｄｅｔｅｓ）の種、または、複数のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種（例えば、Ｂ ｔｈｅｔ
ａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎおよびＢ ｆｒａｇａｌｉｓ）、または、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄ
ｅｓおよびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ種を含む。本明細書において、一例では、Ｐｒｅｖｏｔ
ｅｌｌａは、ｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、ｂｉｖｉａ、ｂｕｃｃａｅ、頬側ｉｓ、ｃｏｐｒｉ、
ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ、ｏｒｉｓ、ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ、ｔａｎｎｅｒａｅ、
ｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓ およびｖｅｒｏｒａｌｉｓから選択される種である。あるいは、
第１の細胞（宿主細胞）または第２の細菌は、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔ
ｅｓ）の細胞であり、例えば、Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ、Ａｃｅｔａｎａｅｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｅｔｉｔｏｍａｃｕｌｕｍ、Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ、Ａｎａｅｒ
ｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｎａｅｒｏｆｉｌｕｍ、Ａｎａｅｒｏｓｉｎｕｓ、Ａｎａｅｒｏｓｔ
ｉｐｅｓ、Ａｎａｅｒｏｖｏｒａｘ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕ
ｍ、Ｃａｐｒａｃｏｃｃｕｓ、Ｄｅｈａｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ、Ｄｏｒ
ｅａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｔｈａｎｏｌｉｇｅｎｅｎｓ、Ｆａｅｃａｌｉｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｒａｃｉｌｉｂａｃｔｅｒ、Ｇｕｇｇ
ｅｎｈｅｉｍｅｌｌａ、Ｈｅｓｐｅｌｌｉａ、Ｌａｃｈｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃ
ｈｎｏｓｐｉｒａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、Ｍｅｇａｍ
ｏｎａｓ、Ｍｏｒｙｅｌｌａ、Ｍｉｔｓｕｏｋｅｌｌａ、Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｏ
ｘｏｂａｃｔｅｒ、Ｐａｐｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ、Ｐｒｏｐｒｉｏｎｉｓｐｉｒａ，Ｐｓ
ｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｐｓｅｕｄｏｒａｍｉｂａｃｔｅｒ、Ｒｏｓｅｂｕ
ｒｉａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｒｃｉｎａ、Ｓｅｉｎｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｕｔ
ｔｌｅｗｏｒｔｈｉａ、Ｓｐｏｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｏｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｃｏｃ
ｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｉｌｌｕｓ、ＴｕｒｉｂａｃｔｅｒおよびＷｅｉｓｅｌｌａ
から選択される１つ以上のファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）を含むか、こ
れらから成る。一例では、第１の細胞（宿主細胞）または第２の細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉ
ｄｉｕｍ（例えば、ｄｉｆｉｃｉｌｅ）細胞を含むか、これらから成る（また、場合によ
り、他の亜集団はＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ
）細胞から成る）。一例では、第１の細胞（宿主細胞）または第２の細菌は、Ｅｎｔｅｒ
ｏｃｏｃｃｕｓ細胞を含むか、これらから成る（また、場合により、他の細胞はＢａｃｔ
ｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）細胞からなる）。一例で
は、第１の細胞（宿主細胞）または第２の細菌は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ細胞を含む
か、これらから成る（また、場合により、他の細胞はＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、
ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）細胞からなる）。一例では、第１の細胞（宿主細胞
）または第２の細菌は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ細胞を含むか、これらから成る（また
、場合により、他の細胞はＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉ
ｃｒｏｎ）細胞からなる）。一例では、第１の細胞（宿主細胞）または第２の細菌は、Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細胞を含むか、これらから成る（また、場合により、他の細胞
はＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）細胞からなる
）。一例では、第１の細胞（宿主細胞）または第２の細菌は、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ細胞を含むか、これらから成る（また、場合により、他の細胞はＢａｃｔｅｒｏ
ｉｄｅｓ（例えば、ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）細胞からなる）。例えば、Ｆａ
ｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍは、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉ
ｔｚｉｉ（例えば、Ａ２－１６５、Ｌ２－６、Ｍ２１／２またはＳＬ３／３）である。
【0219】
一例では、第１の細胞（宿主細胞）または第２の細菌は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
細胞（場合によりＳ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよび／またはｐｙｏｇｅｎｅｓ細胞）
からなり、第２の細菌は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉ
ｃｒｏｎ）および／またはエンテロバクター科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ
）（例えば、Ｅ ｃｏｌｉ）細胞からなる。
細胞（場合によりＳ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよび／またはｐｙｏｇｅｎｅｓ細胞）
からなり、第２の細菌は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉ
ｃｒｏｎ）および／またはエンテロバクター科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ
）（例えば、Ｅ ｃｏｌｉ）細胞からなる。
【0220】
一例では、第１の細胞（宿主細胞）は、ヒト、動物（例えば、非ヒト動物）、または植
物の、感染性の疾病の病原体である。
物の、感染性の疾病の病原体である。
【0221】
一例では、第１の細胞（宿主細胞）は、ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、Ｅ ｃｏｌｉ
Ｏ１５７：Ｈ７またはＯ１０４：Ｈ４）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ（例えば、ｄｙｓｅｎｔｅ
ｒｉａｅ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、ｔｙｐｈｉまたはｅｎｔｅｒｉｃａ、例え
ば、ｓｅｒｏｔｙｐｅ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、例えば、ＤＴ １０４）、Ｅｒｗｉｎ
ｉａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ（例えば、ｐｅｓｔｉｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ、
Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ（例えば、ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
（例えば、ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ（例えば、ｇｏｎｎｏｒｒｈｏ
ｅａまたはｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ（例えば、ｐｅｒｔｕｓ
ｓｕｓ）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ（例えば、ｐｙｌｏｒｉ）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ（例
えば、ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏ
ｃｏｃｃｕｓ（例えば、ａｕｒｅｕｓ、例えば、ＭＲＳＡ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ（例えば、ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃ
ｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（例えば、ｄｉｆｉｃｉｌｅまたはｂｏｔｕｌｉｎｕｍ
）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、ａｍｙｃｏｌａｔｕｍ）、Ｍｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、結核）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ（例えば、ｂ
ｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏ
ｂａｃｔｅｒ（例えば、ｊｅｊｕｎｉ）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ（例えば、ｐｎｅｕｍｏ
ｎｉａｅ）、Ｆｒａｎｋｉａ、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｓｈｅｗ
ａｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｐｒｏ
ｖｉｄｅｎｃｉａ、Ｂｒｏｃｈｏｔｈｒｉｘ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅ
ｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、
Ｖｉｂｒｉｏ（例えば、コレラ、例えば、Ｏ１３９、またはｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）、Ｈ
ａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ（例えば、ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、Ｂｒｕｃｅｌｌａ（例えば、
ａｂｏｒｔｕｓ）、Ｆｒａｎｃｉｓｃｅｌｌａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｅｒｌｉｃｈ
ｉａ（例えば、ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ（例えば、ｐｎｅｕｍｏ
ｎｉａｅ）、Ｐａｒａｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、ｆａｅ
ｃａｌｉｓまたはｆａｃｅｉｍ、例えば、リネゾイド耐性）、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓおよ
びＡｃｉｎｅｔｏｅｂａｃｔｅｒ（例えば、ｂａｕｍａｎｎｉｉ、例えば、多剤耐性の）
の種から選択される。
Ｏ１５７：Ｈ７またはＯ１０４：Ｈ４）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ（例えば、ｄｙｓｅｎｔｅ
ｒｉａｅ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、ｔｙｐｈｉまたはｅｎｔｅｒｉｃａ、例え
ば、ｓｅｒｏｔｙｐｅ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、例えば、ＤＴ １０４）、Ｅｒｗｉｎ
ｉａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ（例えば、ｐｅｓｔｉｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ、
Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ（例えば、ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
（例えば、ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ（例えば、ｇｏｎｎｏｒｒｈｏ
ｅａまたはｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ（例えば、ｐｅｒｔｕｓ
ｓｕｓ）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ（例えば、ｐｙｌｏｒｉ）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ（例
えば、ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏ
ｃｏｃｃｕｓ（例えば、ａｕｒｅｕｓ、例えば、ＭＲＳＡ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ（例えば、ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃ
ｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（例えば、ｄｉｆｉｃｉｌｅまたはｂｏｔｕｌｉｎｕｍ
）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、ａｍｙｃｏｌａｔｕｍ）、Ｍｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、結核）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ（例えば、ｂ
ｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏ
ｂａｃｔｅｒ（例えば、ｊｅｊｕｎｉ）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ（例えば、ｐｎｅｕｍｏ
ｎｉａｅ）、Ｆｒａｎｋｉａ、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｓｈｅｗ
ａｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｐｒｏ
ｖｉｄｅｎｃｉａ、Ｂｒｏｃｈｏｔｈｒｉｘ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅ
ｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、
Ｖｉｂｒｉｏ（例えば、コレラ、例えば、Ｏ１３９、またはｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）、Ｈ
ａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ（例えば、ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、Ｂｒｕｃｅｌｌａ（例えば、
ａｂｏｒｔｕｓ）、Ｆｒａｎｃｉｓｃｅｌｌａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｅｒｌｉｃｈ
ｉａ（例えば、ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ（例えば、ｐｎｅｕｍｏ
ｎｉａｅ）、Ｐａｒａｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、ｆａｅ
ｃａｌｉｓまたはｆａｃｅｉｍ、例えば、リネゾイド耐性）、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓおよ
びＡｃｉｎｅｔｏｅｂａｃｔｅｒ（例えば、ｂａｕｍａｎｎｉｉ、例えば、多剤耐性の）
の種から選択される。
【0222】
一例では、第１の細胞（宿主細胞）は、例えば、メチシリン、バンコマイシン耐性およ
びテイコプラニンから選択される抗生物質に耐性である、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓ細胞である。
びテイコプラニンから選択される抗生物質に耐性である、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓ細胞である。
【0223】
一例では、第１の細胞（宿主細胞）は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｕｒｏｇｉｎｏ
ｓａ細胞であり、例えばセファロスポリン（例えば、セフタジジム）、カルバペネム（例
えばイミペネムまたはメロペネム）、フルオロキノロン、アミノグリコシド（例えばゲン
タマイシンまたはトブラマイシン）およびコリスチンから選択される抗生物質に耐性であ
る。
ｓａ細胞であり、例えばセファロスポリン（例えば、セフタジジム）、カルバペネム（例
えばイミペネムまたはメロペネム）、フルオロキノロン、アミノグリコシド（例えばゲン
タマイシンまたはトブラマイシン）およびコリスチンから選択される抗生物質に耐性であ
る。
【0224】
一例では、第１の細胞（宿主細胞）は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ（例えば、ｐｎｅｕｍｏ
ｎｉａｅ）細胞であり、例えば、カルバペネムに耐性である。
ｎｉａｅ）細胞であり、例えば、カルバペネムに耐性である。
【0225】
一例では、第１の細胞（宿主細胞）は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｏｃｕｓ（例えば、ｐｎｅ
ｕｍｏｎｉａｅまたはｐｙｏｇｅｎｅｓ）細胞であり、例えば、エリスロマイシン、クリ
ンダマイシン、βラクタム、マクロライド、アモキシシリン、アジスロマイシンおよびペ
ニシリンから選択される抗生物質に耐性である。
ｕｍｏｎｉａｅまたはｐｙｏｇｅｎｅｓ）細胞であり、例えば、エリスロマイシン、クリ
ンダマイシン、βラクタム、マクロライド、アモキシシリン、アジスロマイシンおよびペ
ニシリンから選択される抗生物質に耐性である。
【0226】
一例では、第１の細胞（宿主細胞）は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、ｓｅｒｏｔｙ
ｐｅ Ｔｙｐｈｉ）細胞であり、例えば、セフトリアキソン、アジスロマイシンおよびシ
プロフロキサシンから選択される抗生物質に耐性である。
ｐｅ Ｔｙｐｈｉ）細胞であり、例えば、セフトリアキソン、アジスロマイシンおよびシ
プロフロキサシンから選択される抗生物質に耐性である。
【0227】
一例では、第１の細胞（宿主細胞）はＳｈｉｇｅｌｌａ細胞であり、例えば、シプロフ
ロキサシンおよびアジスロマイシンから選択される抗生物質に耐性である。
ロキサシンおよびアジスロマイシンから選択される抗生物質に耐性である。
【0228】
一例では、第１の細胞（宿主細胞）は、ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕ
ｌｏｓｉｓ細胞であり、例えば、イソニアシド（ＩＮＨ）、リファンピシン（ＲＭＰ）、
フルオロキノロン、アミカシン、カナマイシンおよびカプレオマイシンに対する耐性から
選択される抗生物質に耐性である。
ｌｏｓｉｓ細胞であり、例えば、イソニアシド（ＩＮＨ）、リファンピシン（ＲＭＰ）、
フルオロキノロン、アミカシン、カナマイシンおよびカプレオマイシンに対する耐性から
選択される抗生物質に耐性である。
【0229】
一例では、第１の細胞（宿主細胞）は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ細胞であり、例えば
、バンコマイシン耐性である。
、バンコマイシン耐性である。
【0230】
全ての宿主細胞がエンテロバクター科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）細胞
であり、セファロスポリンおよびカルバペネムから選択される抗生物質に耐性である、請
求項１３に記載の方法。
であり、セファロスポリンおよびカルバペネムから選択される抗生物質に耐性である、請
求項１３に記載の方法。
【0231】
一例では、第１の細胞（宿主細胞）はＥ．ｃｏｌｉ細胞であり、例えば、トリメトプリ
ム、ニトロフラントイン（ｉｔｒｏｆｕｒａｎｔｏｉｎ）、セファレキシンおよびアモキ
シシリンから選択される抗生物質に耐性である。
ム、ニトロフラントイン（ｉｔｒｏｆｕｒａｎｔｏｉｎ）、セファレキシンおよびアモキ
シシリンから選択される抗生物質に耐性である。
【0232】
一例では、第１の細胞（宿主細胞）は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（例えば、ｄｉｆｉｃ
ｉｌｅ）細胞であり、例えば、フルオロキノロン抗生物質およびカルバペネムから選択さ
れる抗生物質に耐性である。
ｉｌｅ）細胞であり、例えば、フルオロキノロン抗生物質およびカルバペネムから選択さ
れる抗生物質に耐性である。
【0233】
一例では、第１細胞（宿主細胞）は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｎｏｒｒｈｏｅａ細
胞であり、例えば、セフィキシム（例えば、経口セファロスポリン）、セフトリアキソン
（注射用セファロスポリン）、アジスロマイシンおよびテトラサイクリンから選択される
抗生物質に耐性である。
胞であり、例えば、セフィキシム（例えば、経口セファロスポリン）、セフトリアキソン
（注射用セファロスポリン）、アジスロマイシンおよびテトラサイクリンから選択される
抗生物質に耐性である。
【0234】
一例では、第１の細胞（宿主細胞）は、Ａｃｉｎｅｔｏｅｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎ
ｎｉｉ 細胞であり、例えば、βラクタム、メロペネムおよびカルバペネムから選択され
る抗生物質に耐性である。
ｎｉｉ 細胞であり、例えば、βラクタム、メロペネムおよびカルバペネムから選択され
る抗生物質に耐性である。
【0235】
一例では、第１の細胞（宿主細胞）は、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ細胞であり、例え
ば、シプロフロキサシンおよびアジスロマイシンから選択される抗生物質に耐性である。
ば、シプロフロキサシンおよびアジスロマイシンから選択される抗生物質に耐性である。
【0236】
一例では、第２の種または株は、ヒト腸内片利共生種または株、および／または、ヒト
腸内プロバイオティック種または株である。
腸内プロバイオティック種または株である。
【0237】
一例では、第２の種または株は、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）（
例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）であり、場合により、宿主細胞はグラム陽性細菌細胞
である。
例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）であり、場合により、宿主細胞はグラム陽性細菌細胞
である。
【0238】
一例では、第１の細胞は、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の細胞であ
る。
る。
【0239】
一例では、前記ディスバイオシスを引き起こすことまたはステップ（ｂ）は、患者の微
生物叢に、前記免疫細胞集団と同時に、または連続して、抗細菌剤または抗古細菌剤を投
与することにより、第１の細胞の亜集団を標的化することによって実行され、それにより
、第１の細胞が死滅するか、該亜集団の増殖が低下し、それにより、患者の腸内微生物叢
における前記亜集団の割合を低減させる。
生物叢に、前記免疫細胞集団と同時に、または連続して、抗細菌剤または抗古細菌剤を投
与することにより、第１の細胞の亜集団を標的化することによって実行され、それにより
、第１の細胞が死滅するか、該亜集団の増殖が低下し、それにより、患者の腸内微生物叢
における前記亜集団の割合を低減させる。
【0240】
一例では、本方法は、第１の（宿主）細胞集団の増殖を、前記誘導型ヌクレアーゼ（例
えば、Ｃａｓ）の改変を受けていない宿主細胞のコントロール集団の増殖と比較して、少
なくとも５、１０、２０、５０、または１００倍低下させる。
えば、Ｃａｓ）の改変を受けていない宿主細胞のコントロール集団の増殖と比較して、少
なくとも５、１０、２０、５０、または１００倍低下させる。
【0241】
一例では、本方法は、腸表面における宿主細胞集団の増殖を阻害する。
【0242】
一例では、各宿主細胞について、本システムは、（ｉ）～（ｉｖ）に記載の成分を含む
：
（ｉ）Ｃａｓヌクレアーゼをコードする、少なくとも１つの核酸配列；
（ｉｉ）ＨＭ－ｃｒＲＮＡをコードするスペーサーおよびリピート配列を含む操作された
ＨＭ－ＣＲＩＳＰＲアレイであって、該ＨＭ－ｃｒＲＮＡは、宿主細胞の標的配列にハイ
ブリダイズして前記Ｃａｓを宿主細胞における標的に誘導して標的配列を改変する配列を
含む；
（ｉｉｉ）任意のｔｒａｃｒＲＮＡ配列、または、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するＤＮ
Ａ配列；
（ｉｖ）ここで、本システムの前記成分は、宿主細胞と宿主細胞を形質転換する少なくと
も１つの核酸ベクターとの間で分割され、それによってＨＭ － ｃｒＲＮＡはＣａｓを標
的に誘導して、宿主細胞における宿主標的配列を改変する；および
ここで、該標的配列はＣａｓにより改変され、それにより、宿主細胞が死滅するか、宿主
細胞の増殖が低下する；
本方法は、（ｉｖ）のベクターを宿主細胞へ導入することおよび宿主細胞において前記Ｈ
Ｍ－ｃｒＲＮＡを発現することを含み、ＨＭ－ｃＲＮＡが宿主細胞の標的配列にハイブリ
ダイズしてＣａｓを宿主細胞における標的に誘導して標的配列を改変することを可能にし
、それにより、宿主細胞が死滅するか、宿主細胞の増殖が低下し、それにより、微生物叢
における前記亜集団の割合を変更する。
：
（ｉ）Ｃａｓヌクレアーゼをコードする、少なくとも１つの核酸配列；
（ｉｉ）ＨＭ－ｃｒＲＮＡをコードするスペーサーおよびリピート配列を含む操作された
ＨＭ－ＣＲＩＳＰＲアレイであって、該ＨＭ－ｃｒＲＮＡは、宿主細胞の標的配列にハイ
ブリダイズして前記Ｃａｓを宿主細胞における標的に誘導して標的配列を改変する配列を
含む；
（ｉｉｉ）任意のｔｒａｃｒＲＮＡ配列、または、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するＤＮ
Ａ配列；
（ｉｖ）ここで、本システムの前記成分は、宿主細胞と宿主細胞を形質転換する少なくと
も１つの核酸ベクターとの間で分割され、それによってＨＭ － ｃｒＲＮＡはＣａｓを標
的に誘導して、宿主細胞における宿主標的配列を改変する；および
ここで、該標的配列はＣａｓにより改変され、それにより、宿主細胞が死滅するか、宿主
細胞の増殖が低下する；
本方法は、（ｉｖ）のベクターを宿主細胞へ導入することおよび宿主細胞において前記Ｈ
Ｍ－ｃｒＲＮＡを発現することを含み、ＨＭ－ｃＲＮＡが宿主細胞の標的配列にハイブリ
ダイズしてＣａｓを宿主細胞における標的に誘導して標的配列を改変することを可能にし
、それにより、宿主細胞が死滅するか、宿主細胞の増殖が低下し、それにより、微生物叢
における前記亜集団の割合を変更する。
【0243】
一例では、成分（ｉ）は、各宿主細胞に内因性である。
【0244】
一例では、各ベクターは、ウイルスまたはファージである。
【0245】
一例では、各標的配列は、ＮＮＡＧＡＡＷまたはＮＧＧＮＧプロトスペーサー隣接モチ
ーフ(PAM)に隣接している。
ーフ(PAM)に隣接している。
【0246】
一例では、あるいは、ＨＭ－ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、シングルガイドＲ
ＮＡ（ｇＲＮＡ）に含まれ、本方法は、前記ｇＲＮＡを宿主細胞に導入すること、または
、宿主細胞において該ｇＲＮＡを発現することを含む。
ＮＡ（ｇＲＮＡ）に含まれ、本方法は、前記ｇＲＮＡを宿主細胞に導入すること、または
、宿主細胞において該ｇＲＮＡを発現することを含む。
【0247】
一例では、微生物叢は、第２の細菌または古細菌の種を含み、第１および第２の種はそ
れぞれ同じ門の種（例えば、共にファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）種）で
あり、第２の細菌の増殖はＨＭ－システムによって阻害されないか；または、微生物叢が
第２の細菌または古細菌の株を含み、第１および第２の細菌または古細菌はそれぞれ同じ
種の株であり、第２の細菌または古細菌の増殖はＨＭ－システムによって阻害されない。
れぞれ同じ門の種（例えば、共にファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）種）で
あり、第２の細菌の増殖はＨＭ－システムによって阻害されないか；または、微生物叢が
第２の細菌または古細菌の株を含み、第１および第２の細菌または古細菌はそれぞれ同じ
種の株であり、第２の細菌または古細菌の増殖はＨＭ－システムによって阻害されない。
【0248】
一例では、微生物叢は、第２の細菌種を含み、第１および第２の種はそれぞれグラム陽
性種であり、第２の細菌の増殖はＨＭ－システムによって阻害されない。
性種であり、第２の細菌の増殖はＨＭ－システムによって阻害されない。
【0249】
一例では、各標的配列は、宿主細胞の、抗生物質耐性遺伝子、病原性遺伝子、または必
須遺伝子に含まれる。
須遺伝子に含まれる。
【0250】
一例では、各第１の細胞は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｅ ｃｏｌ
ｉ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、ＶｉｂｒｉｏまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ細胞であ
る。
ｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｅ ｃｏｌ
ｉ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、ＶｉｂｒｉｏまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ細胞であ
る。
【0251】
一例では、ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）は、腸のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（
例えば、Ｂ ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ）により患者のパネート細胞を刺激するこ
とを含み、ここで、ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）により産生された変化した微
生物叢は、ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）の前の微生物叢と比較して、増加した
割合のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓの第１の細菌を含み、それにより、パネート細胞が刺激さ
れ、細胞療法が調節される。
例えば、Ｂ ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ）により患者のパネート細胞を刺激するこ
とを含み、ここで、ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）により産生された変化した微
生物叢は、ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）の前の微生物叢と比較して、増加した
割合のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓの第１の細菌を含み、それにより、パネート細胞が刺激さ
れ、細胞療法が調節される。
【0252】
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓは、パネート細胞タンパク質の発現に影響を及ぼし得る。小腸
陰窩には、死滅して絨毛から失われる上皮細胞を絶えず補充する働きをする幹細胞がある
。パネート細胞（好中球に類似する免疫系細胞）は、これらの幹細胞に隣接しており、多
くの抗菌分子（デフェンシン）を陰窩の内腔に分泌することにより、微生物から幹細胞を
保護しており、これらの保護効果が、絨毛に移動した成熟細胞にまで及ぶことも可能であ
る。動物モデルにおいて、Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎは、特定の病原性生物
（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）を死滅することができる抗
菌性のパネート細胞タンパク質（Ａｎｇ４）の生産を刺激することができる。Ｌｉｓｔｅ
ｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは強力なＴＨ１細胞誘導因子であり、したがって、
これは、本発明の特定の局面においてパネート細胞を刺激することによって、ＴＨ１から
ＴＨ１７などの他の細胞型へ免疫を歪めるために有用であり得る。これは、本発明の免疫
細胞療法を増加または増強させるために有用であり得る。例えば、これは、本発明は、Ｔ
ｈ１７ベースの細胞療法（例えば、ＣＡＲ－Ｔｈ１７細胞）を患者に投与することを含む
場合に、有用であり得る。
陰窩には、死滅して絨毛から失われる上皮細胞を絶えず補充する働きをする幹細胞がある
。パネート細胞（好中球に類似する免疫系細胞）は、これらの幹細胞に隣接しており、多
くの抗菌分子（デフェンシン）を陰窩の内腔に分泌することにより、微生物から幹細胞を
保護しており、これらの保護効果が、絨毛に移動した成熟細胞にまで及ぶことも可能であ
る。動物モデルにおいて、Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎは、特定の病原性生物
（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）を死滅することができる抗
菌性のパネート細胞タンパク質（Ａｎｇ４）の生産を刺激することができる。Ｌｉｓｔｅ
ｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは強力なＴＨ１細胞誘導因子であり、したがって、
これは、本発明の特定の局面においてパネート細胞を刺激することによって、ＴＨ１から
ＴＨ１７などの他の細胞型へ免疫を歪めるために有用であり得る。これは、本発明の免疫
細胞療法を増加または増強させるために有用であり得る。例えば、これは、本発明は、Ｔ
ｈ１７ベースの細胞療法（例えば、ＣＡＲ－Ｔｈ１７細胞）を患者に投与することを含む
場合に、有用であり得る。
【0253】
一例では、ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）は、患者において腸Ｂａｃｔｅｒｏ
ｉｄｅｓ（例えば、Ｂ ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ）に対する免疫応答を発達させ
ることを含み、ここで、ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）により産生された変化し
た微生物叢は、ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）の前の微生物叢と比較して、増加
した割合のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓの第１の細菌を含み、それにより、細胞療法が調節さ
れる。
ｉｄｅｓ（例えば、Ｂ ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ）に対する免疫応答を発達させ
ることを含み、ここで、ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）により産生された変化し
た微生物叢は、ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）の前の微生物叢と比較して、増加
した割合のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓの第１の細菌を含み、それにより、細胞療法が調節さ
れる。
【0254】
一例では、ディスバイオシスまたはステップ（ｂ）は、患者の腸内微生物叢において、
第１の細胞の相対的割合または前記亜集団を変更し、それにより、患者において免疫細胞
療法を調節する変更された腸内微生物叢を産生することを含み、ここで、ディスバイオシ
スまたはステップ（ｂ）は、亜集団に含まれる第１の細胞のゲノムを標的とする誘導型ヌ
クレアーゼを用いることにより、前記亜集団の第１の細胞を死滅させるか、前記亜集団の
増殖を阻害することを含む。
第１の細胞の相対的割合または前記亜集団を変更し、それにより、患者において免疫細胞
療法を調節する変更された腸内微生物叢を産生することを含み、ここで、ディスバイオシ
スまたはステップ（ｂ）は、亜集団に含まれる第１の細胞のゲノムを標的とする誘導型ヌ
クレアーゼを用いることにより、前記亜集団の第１の細胞を死滅させるか、前記亜集団の
増殖を阻害することを含む。
【0255】
本発明はまた、本発明の方法を用いて、患者において疾病または症状を治療するために
患者へ投与するための、細菌または古細菌の移植片を提供する。場合により、移植片は、
前記第１の種の細胞を含む。場合により、移植片は、前記第２の種の細胞を含む（かつ、
例えば、第１の種の細胞を含まない）。
患者へ投与するための、細菌または古細菌の移植片を提供する。場合により、移植片は、
前記第１の種の細胞を含む。場合により、移植片は、前記第２の種の細胞を含む（かつ、
例えば、第１の種の細胞を含まない）。
【0256】
本発明はまた、本発明の方法を用いて、それらの処置を調節するために、対象（例えば
、植物または酵母）または土壌もしくは環境に投与するための、細菌または古細菌の移植
片を提供する。場合により、移植片は、前記第１の種の細胞を含む。場合により、移植片
は、前記第１の種の細胞を含む。場合により、移植片は、前記第２の種の細胞を含む（か
つ、例えば、第１の種の細胞を含まない）。
、植物または酵母）または土壌もしくは環境に投与するための、細菌または古細菌の移植
片を提供する。場合により、移植片は、前記第１の種の細胞を含む。場合により、移植片
は、前記第１の種の細胞を含む。場合により、移植片は、前記第２の種の細胞を含む（か
つ、例えば、第１の種の細胞を含まない）。
【0257】
一例では、酵母は、同じ種または株の酵母細胞の集団を含む。例えば、酵母は、微生物
叢に含まれ、例えば、酵母は、微生物叢の細胞の亜集団を含み、例えば、標的細胞は、微
生物叢にまた含まれる、細菌または古細菌細胞である。ある実施形態では、本方法は、標
的細胞（例えば、細菌）を死滅させるか、微生物叢に含まれる標的細胞亜集団の増殖を低
下させ、ここでは、微生物叢における標的細胞による１つ以上の化学物質またはメッセン
ジャーの放出（または濃度）が低下する。例えば、微生物叢の微生物（例えば、細菌）に
おいて、クオラムセンシングを媒介する、１つ以上の化学物質またはメッセンジャーが低
下する。このことは、微生物叢における、標的細胞および／または他の微生物細胞集団の
増殖を形成するのに有用であり得る。一例では、１つ以上の化学物質またはメッセンジャ
ーは、酵母の増殖を阻害するか、酵母を死滅させ、従って、微生物叢における化学物質ま
たはメッセンジャーの放出または濃度の低下は、微生物叢における酵母の増殖および／ま
たは維持の促進に有利である。これらの例のある実施形態では、処置は、酵母の栄養法、
または増殖促進物質による酵母の処置である（例えば、ここで、酵母は食糧または飲料製
造用であり、あるいは、例えば抗体などのバイオテクノロジー製品または医薬品の製造用
であり、例えば、酵母はＳａｃｃｈａｒａｏｍｙｃｅｓである）。別の例では、化学物質
またはメッセンジャーが酵母の増殖を促進し、ここで、酵母の処置は、酵母殺菌剤（例え
ば、殺真菌薬）による処置である。これは、酵母が望ましくない場合（例えば、望ましく
ないカビである場合）に、死滅処置の有効性を促進する。一例では、対象が植物の場合、
１つ以上の化学物質またはメッセンジャーが植物の生長を阻害するか、植物を死滅させる
ため、微生物叢における化学物質またはメッセンジャーの放出または濃度の低減が、植物
の生長の促進、および／または、植物の死滅の阻害に有利である。これらの例のある実施
形態では、処置は、植物の栄養法であるか、または、肥料または窒素固定剤による酵母の
処置である。ある実施形態では、処置は、植物の農薬処置であり、例えば、標的の微生物
叢細胞の存在下で阻害または低減される処置である。
叢に含まれ、例えば、酵母は、微生物叢の細胞の亜集団を含み、例えば、標的細胞は、微
生物叢にまた含まれる、細菌または古細菌細胞である。ある実施形態では、本方法は、標
的細胞（例えば、細菌）を死滅させるか、微生物叢に含まれる標的細胞亜集団の増殖を低
下させ、ここでは、微生物叢における標的細胞による１つ以上の化学物質またはメッセン
ジャーの放出（または濃度）が低下する。例えば、微生物叢の微生物（例えば、細菌）に
おいて、クオラムセンシングを媒介する、１つ以上の化学物質またはメッセンジャーが低
下する。このことは、微生物叢における、標的細胞および／または他の微生物細胞集団の
増殖を形成するのに有用であり得る。一例では、１つ以上の化学物質またはメッセンジャ
ーは、酵母の増殖を阻害するか、酵母を死滅させ、従って、微生物叢における化学物質ま
たはメッセンジャーの放出または濃度の低下は、微生物叢における酵母の増殖および／ま
たは維持の促進に有利である。これらの例のある実施形態では、処置は、酵母の栄養法、
または増殖促進物質による酵母の処置である（例えば、ここで、酵母は食糧または飲料製
造用であり、あるいは、例えば抗体などのバイオテクノロジー製品または医薬品の製造用
であり、例えば、酵母はＳａｃｃｈａｒａｏｍｙｃｅｓである）。別の例では、化学物質
またはメッセンジャーが酵母の増殖を促進し、ここで、酵母の処置は、酵母殺菌剤（例え
ば、殺真菌薬）による処置である。これは、酵母が望ましくない場合（例えば、望ましく
ないカビである場合）に、死滅処置の有効性を促進する。一例では、対象が植物の場合、
１つ以上の化学物質またはメッセンジャーが植物の生長を阻害するか、植物を死滅させる
ため、微生物叢における化学物質またはメッセンジャーの放出または濃度の低減が、植物
の生長の促進、および／または、植物の死滅の阻害に有利である。これらの例のある実施
形態では、処置は、植物の栄養法であるか、または、肥料または窒素固定剤による酵母の
処置である。ある実施形態では、処置は、植物の農薬処置であり、例えば、標的の微生物
叢細胞の存在下で阻害または低減される処置である。
【0258】
一例では、植物は、農作物（例えば、小麦、大麦、禾穀類または家畜用飼料植物）、果
樹（例えば、リンゴ、オレンジ、シトラス（ｃｉｔｒｕｓ）、ライム、レモン、ラズベリ
ー、イチゴ、ベリーまたはバナナの植物）、サトウキビの植物、香辛料の植物、庭の植物
、野菜の植物、草、木または顕花植物である。例えば、植物は、塊茎植物、例えば、ジャ
ガイモまたはサツマイモである（例えば、かつ、第１の、宿主、または標的細菌はＰｅｃ
ｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃｕｍ細胞であり、場合により、処置はそ
の収穫物（例えば、ジャガイモ収穫物）の植物の保管（例えば、冷蔵）、洗浄、殺虫剤も
しくは除草剤処置、施肥、または水分補給である）。例えば、植物はタバコ植物である（
例えば、かつ、第１の、宿主、または標的細菌はＲａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅ
ａｒｕｍ細胞であり、場合により、処置ははその収穫物（例えば、タバコ葉収穫物）の植
物の保管（例えば、冷蔵）、洗浄、殺虫剤もしくは除草剤処置、施肥、または水分補給で
ある）。
樹（例えば、リンゴ、オレンジ、シトラス（ｃｉｔｒｕｓ）、ライム、レモン、ラズベリ
ー、イチゴ、ベリーまたはバナナの植物）、サトウキビの植物、香辛料の植物、庭の植物
、野菜の植物、草、木または顕花植物である。例えば、植物は、塊茎植物、例えば、ジャ
ガイモまたはサツマイモである（例えば、かつ、第１の、宿主、または標的細菌はＰｅｃ
ｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃｕｍ細胞であり、場合により、処置はそ
の収穫物（例えば、ジャガイモ収穫物）の植物の保管（例えば、冷蔵）、洗浄、殺虫剤も
しくは除草剤処置、施肥、または水分補給である）。例えば、植物はタバコ植物である（
例えば、かつ、第１の、宿主、または標的細菌はＲａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅ
ａｒｕｍ細胞であり、場合により、処置ははその収穫物（例えば、タバコ葉収穫物）の植
物の保管（例えば、冷蔵）、洗浄、殺虫剤もしくは除草剤処置、施肥、または水分補給で
ある）。
【0259】
一例では、対象は、原生動物（ｐｒｏｔｏｚｏａ）である。一例では、対象または患者
は魚類である。一例では、対象または患者は鳥類である。一例では、対象または患者は爬
虫類である。一例では、対象または患者はクモである。一例では、対象は酵母細胞（例え
ば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ細胞）である。一例では、対象または患者は動物（例え
ば、げっ歯類、マウスまたはラット）である。一例では、対象または患者は（例えば、胎
児である、または胎児でない）ヒトである。一例では、対象または患者は、ペットの動物
（例えば、トリ、ウマ、イヌ、ネコまたはウサギ）である。一例では、対象または患者は
昆虫（例えば、卵、幼虫、または蛹などのライフサイクルの任意の段階の昆虫、例えば、
飛ぶ虫、這う虫、または甲虫）である。一例では、対象または患者は、頭足類または線形
動物である。一例では、対象または患者は、植物または動物の害虫である。一例では、動
物またはヒトの処置は、栄養処置、疾病または症状の治療、疾病または症状の予防、眼の
処置、農薬処置、場の処置、局所的処置、または消化の処置であってよい。一例では、本
方法は、病原体（例えば、病原性の寄生虫、原生動物、ウイルスまたは細菌）に対する対
象または患者の免疫を増強する。一例では、処置または治療は、ヒトまたは動物に実施さ
れる併用処置または併用治療であり、ここで、ヒトまたは動物には、第１の医薬が、第２
の医薬または放射線と組み合わせて投与される。第１および／または第２の医薬は、抗体
療法または免疫細胞移植片（例えば、ＣＡＲ－ＴまたはＴＩＬ移植片）療法であってよい
（また、本発明の免疫調節の局面は、これらの治療を調節するのに有利であってよい）。
一例では、それぞれの医薬または処置は、表２から選択される。
は魚類である。一例では、対象または患者は鳥類である。一例では、対象または患者は爬
虫類である。一例では、対象または患者はクモである。一例では、対象は酵母細胞（例え
ば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ細胞）である。一例では、対象または患者は動物（例え
ば、げっ歯類、マウスまたはラット）である。一例では、対象または患者は（例えば、胎
児である、または胎児でない）ヒトである。一例では、対象または患者は、ペットの動物
（例えば、トリ、ウマ、イヌ、ネコまたはウサギ）である。一例では、対象または患者は
昆虫（例えば、卵、幼虫、または蛹などのライフサイクルの任意の段階の昆虫、例えば、
飛ぶ虫、這う虫、または甲虫）である。一例では、対象または患者は、頭足類または線形
動物である。一例では、対象または患者は、植物または動物の害虫である。一例では、動
物またはヒトの処置は、栄養処置、疾病または症状の治療、疾病または症状の予防、眼の
処置、農薬処置、場の処置、局所的処置、または消化の処置であってよい。一例では、本
方法は、病原体（例えば、病原性の寄生虫、原生動物、ウイルスまたは細菌）に対する対
象または患者の免疫を増強する。一例では、処置または治療は、ヒトまたは動物に実施さ
れる併用処置または併用治療であり、ここで、ヒトまたは動物には、第１の医薬が、第２
の医薬または放射線と組み合わせて投与される。第１および／または第２の医薬は、抗体
療法または免疫細胞移植片（例えば、ＣＡＲ－ＴまたはＴＩＬ移植片）療法であってよい
（また、本発明の免疫調節の局面は、これらの治療を調節するのに有利であってよい）。
一例では、それぞれの医薬または処置は、表２から選択される。
【0260】
一例では、疾病または症状は、糖尿病（例えば、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病、インスリン
抵抗性糖尿病（例えば、インスリン抵抗性ＩＩ型糖尿病））、糖尿病患者または前糖尿病
患者におけるインスリン抵抗性の発症、または糖尿病患者または前糖尿病患者におけるイ
ンスリン応答性の低下である。場合により、さらにこの例では、標的とされる第１の細胞
または宿主細胞は、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｃｏｐｒｉ細胞またはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅ
ｓ ｖｕｌｇａｔｕｓ細胞である。ある実施形態では、患者においてＰｒｅｖｏｔｅｌｌ
ａ ｃｏｐｒｉ細胞およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｖｕｌｇａｔｕｓ細胞の両方が標的
とされ（すなわち、本明細書に記載されるように、死滅し、および／または、集団の増殖
が低下し、または移植片投与後に微生物叢において低下し）、ここで前記疾病または症状
は、処置または予防される。
抵抗性糖尿病（例えば、インスリン抵抗性ＩＩ型糖尿病））、糖尿病患者または前糖尿病
患者におけるインスリン抵抗性の発症、または糖尿病患者または前糖尿病患者におけるイ
ンスリン応答性の低下である。場合により、さらにこの例では、標的とされる第１の細胞
または宿主細胞は、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｃｏｐｒｉ細胞またはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅ
ｓ ｖｕｌｇａｔｕｓ細胞である。ある実施形態では、患者においてＰｒｅｖｏｔｅｌｌ
ａ ｃｏｐｒｉ細胞およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｖｕｌｇａｔｕｓ細胞の両方が標的
とされ（すなわち、本明細書に記載されるように、死滅し、および／または、集団の増殖
が低下し、または移植片投与後に微生物叢において低下し）、ここで前記疾病または症状
は、処置または予防される。
【0261】
本発明はまた、本発明の方法を用いて、患者において疾病または症状を治療するために
患者へ投与するための、ＨＭ－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＨＭ－アレイ、またはＨ
Ｍ－ｃｒＲＮＡを提供する。
患者へ投与するための、ＨＭ－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＨＭ－アレイ、またはＨ
Ｍ－ｃｒＲＮＡを提供する。
【0262】
本発明はまた、患者の養子細胞療法のための免疫細胞のエクスビボ集団を含むキットを
提供し、ここで、キットはさらに、移植片、システム、アレイ、またはｃｒＲＮＡを含み
、場合により、免疫細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞、操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現
するＴ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）およびＮＫ細胞から選択される。
提供し、ここで、キットはさらに、移植片、システム、アレイ、またはｃｒＲＮＡを含み
、場合により、免疫細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞、操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現
するＴ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）およびＮＫ細胞から選択される。
【0263】
可動遺伝因子（ＭＧＥ）
一例では、各ベクターは、可動遺伝因子（ＭＧＥ）を含む、または可動遺伝因子（ＭＧ
Ｅ）からなる核酸ベクターであり、ここで、ＭＧＥは、宿主細胞のゲノムまたは宿主細胞
内のウイルス（例えば、プロファージ）のゲノムの標的配列を改変するための、伝達起点
（ｏｒｉＴ）およびＣＲＩＳＰＲアレイを含む。ＭＧＥの例は、ＩＣＥ、トランスポゾン
、プラスミドおよびバクテリオファージである。伝達起点（ｏｒｉＴ）は、接合中にそれ
を含むＤＮＡを細菌宿主からレシピエントに伝達するのに必要な短い配列（例、最大５０
０ｂｐ）である。ｏｒｉＴはシス作用性であり、伝達されているＤＮＡと同じＤＮＡ上に
あり、そのＤＮＡと共に伝達される。典型的な伝達起点は、機能的に規定された３つのド
メイン：ニッキングドメイン、伝達ドメイン、および終結ドメインを含む。
一例では、各ベクターは、可動遺伝因子（ＭＧＥ）を含む、または可動遺伝因子（ＭＧ
Ｅ）からなる核酸ベクターであり、ここで、ＭＧＥは、宿主細胞のゲノムまたは宿主細胞
内のウイルス（例えば、プロファージ）のゲノムの標的配列を改変するための、伝達起点
（ｏｒｉＴ）およびＣＲＩＳＰＲアレイを含む。ＭＧＥの例は、ＩＣＥ、トランスポゾン
、プラスミドおよびバクテリオファージである。伝達起点（ｏｒｉＴ）は、接合中にそれ
を含むＤＮＡを細菌宿主からレシピエントに伝達するのに必要な短い配列（例、最大５０
０ｂｐ）である。ｏｒｉＴはシス作用性であり、伝達されているＤＮＡと同じＤＮＡ上に
あり、そのＤＮＡと共に伝達される。典型的な伝達起点は、機能的に規定された３つのド
メイン：ニッキングドメイン、伝達ドメイン、および終結ドメインを含む。
【0264】
本発明のための好適なＩＣＥおよび、好適なｏｒｉＴのための起源を提供する、ＩＣＥ
ｂｅｒｇデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｄｂ－ｍｍｌ．ｓｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／ＩＣＥ
ｂｅｒｇ／）が参照される。一例では、ＩＣＥはグループ１～２８から選択されるＩＣＥ
を含むＩＣＥファミリーの一員であり、あるいは、ｏｒｉＴは当該ファミリーの一員のｏ
ｒｉＴである：１＝ＳＸＴ／Ｒ３９１；２＝Ｔｎ９１６；３＝Ｔｎ４３７１；４＝ＣＴｎ
ＤＯＴ／ＥＲＬ；５＝ＩＣＥｃｌｃ；６＝ＩＣＥＢｓ１；７＝ＩＣＥＨｉｎ１０５６；８
＝ＰＡＰＩ－１；９＝ＩＣＥＭｌＳｙｍ（Ｒ７Ａ）；１０＝ＩＣＥＳｔ１；１１＝ＳＰＩ
－７；１２＝ＩＣＥ６０１３；１３＝ＩＣＥＫｐ１；１４＝ＴｎＧＢＳ１；１５＝Ｔｎ５
２５３；１６＝ＩＣＥＳａ２６０３；１７＝ＩＣＥＹｅ１；１８＝１０２７０－ＲＤ．２
；１９＝Ｔｎ１２０７．３；２０＝Ｔｎ１８０６；２１＝ＩＣＥＡ５６３２；２２＝ＩＣ
ＥＦ－Ｉ／ＩＩ；２３＝ＩＣＥＡＰＧ２；２４＝ＩＣＥＭ；２５＝１０２７０－ＲＤ．１
；２６＝Ｔｎ５８０１；２７＝ＰＰＩ－１；２８＝ＩＣＥＦ－ＩＩＩ。ファミリーの説明
は、ＩＣＥｂｅｒｇデータベースにある。例えば、Ｔｎ９１６ファミリーは、Roberts et
al (2009)により規定された（Trends Microbiol. 2009 Jun;17(6):251－8. doi: 10.101
6/j.tim.2009.03.002. Epub 2009 May 20; "A modular master on the move: the Tn916
family of mobile genetic elements", Roberts A, Mullany P）。Ｔｎ９１６ファミリー
に属する因子は、次の基準により規定されている：それらは、Roberts et alにより示さ
れた一般的な組織を有していなければならず、かつＤＮＡレベルで元のＴｎ９１６と配列
および構造が類似しているコア領域（接合および調節モジュール）を有していなければな
らない。例外は、以前にこのファミリーに分類されていたＴｎ１５４９などの接合性トラ
ンスポゾンや、対応する参考文献に記載されているような高度のタンパク質類似性を有す
るトランスポゾンである。場合により、ＩＣＥはトランスポゾンであり、例えば、接合性
トランスポゾンである。一例では、ＭＧＥは、機能性ヘルパーエレメントの存在下で可動
性（ｍｏｂｉｌｉｓａｂｌｅ）である、可動性トランスポゾンであり、場合により、該ト
ランスポゾンは、前記ヘルパーエレメントと組み合わせられる。
ｂｅｒｇデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｄｂ－ｍｍｌ．ｓｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／ＩＣＥ
ｂｅｒｇ／）が参照される。一例では、ＩＣＥはグループ１～２８から選択されるＩＣＥ
を含むＩＣＥファミリーの一員であり、あるいは、ｏｒｉＴは当該ファミリーの一員のｏ
ｒｉＴである：１＝ＳＸＴ／Ｒ３９１；２＝Ｔｎ９１６；３＝Ｔｎ４３７１；４＝ＣＴｎ
ＤＯＴ／ＥＲＬ；５＝ＩＣＥｃｌｃ；６＝ＩＣＥＢｓ１；７＝ＩＣＥＨｉｎ１０５６；８
＝ＰＡＰＩ－１；９＝ＩＣＥＭｌＳｙｍ（Ｒ７Ａ）；１０＝ＩＣＥＳｔ１；１１＝ＳＰＩ
－７；１２＝ＩＣＥ６０１３；１３＝ＩＣＥＫｐ１；１４＝ＴｎＧＢＳ１；１５＝Ｔｎ５
２５３；１６＝ＩＣＥＳａ２６０３；１７＝ＩＣＥＹｅ１；１８＝１０２７０－ＲＤ．２
；１９＝Ｔｎ１２０７．３；２０＝Ｔｎ１８０６；２１＝ＩＣＥＡ５６３２；２２＝ＩＣ
ＥＦ－Ｉ／ＩＩ；２３＝ＩＣＥＡＰＧ２；２４＝ＩＣＥＭ；２５＝１０２７０－ＲＤ．１
；２６＝Ｔｎ５８０１；２７＝ＰＰＩ－１；２８＝ＩＣＥＦ－ＩＩＩ。ファミリーの説明
は、ＩＣＥｂｅｒｇデータベースにある。例えば、Ｔｎ９１６ファミリーは、Roberts et
al (2009)により規定された（Trends Microbiol. 2009 Jun;17(6):251－8. doi: 10.101
6/j.tim.2009.03.002. Epub 2009 May 20; "A modular master on the move: the Tn916
family of mobile genetic elements", Roberts A, Mullany P）。Ｔｎ９１６ファミリー
に属する因子は、次の基準により規定されている：それらは、Roberts et alにより示さ
れた一般的な組織を有していなければならず、かつＤＮＡレベルで元のＴｎ９１６と配列
および構造が類似しているコア領域（接合および調節モジュール）を有していなければな
らない。例外は、以前にこのファミリーに分類されていたＴｎ１５４９などの接合性トラ
ンスポゾンや、対応する参考文献に記載されているような高度のタンパク質類似性を有す
るトランスポゾンである。場合により、ＩＣＥはトランスポゾンであり、例えば、接合性
トランスポゾンである。一例では、ＭＧＥは、機能性ヘルパーエレメントの存在下で可動
性（ｍｏｂｉｌｉｓａｂｌｅ）である、可動性トランスポゾンであり、場合により、該ト
ランスポゾンは、前記ヘルパーエレメントと組み合わせられる。
【0265】
場合により、ベクターはプラスミドであり、場合により、ここで、ＭＧＥはプラスミド
に含まれるトランスポゾンである。例えば、トランスポゾンは接合性トランスポゾンであ
る。一例では、トランスポゾンは、可動性トランスポゾンである（例えば、プラスミドが
コードする１つ以上の因子を用いて、例えば、プラスミドのトランスポゾン配列の外側の
遺伝子により、可動性である）。場合により、トランスポゾンはＩ型トランスポゾンであ
る。場合により、トランスポゾンは、ＩＩ型トランスポゾンである。場合により、ベクタ
ーｏｒｉＴは、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）（例えば、Ｂａｃｔｅ
ｒｏｉｄａｌｅｓもしくはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）またはＰｒｅｖｏｔｅｌｌａトラン
スポゾンのｏｒｉＴである。これは、第１の細胞（宿主細胞）がそれぞれバクテロイデス
門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）（例えば、ＢａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓまたはＢａｃ
ｔｅｒｏｉｄｅｓ）またはＰｒｅｖｏｔｅｌｌａである場合に有用である。場合により、
ベクターｏｒｉＴは、ＣＴｎＤｏｔ、ＣＴｎＥＲＬ ＳＸＴ／Ｒ３９１、Ｔｎ９１６また
はＴｎ４３７１ファミリーのトランスポゾンｏｒｉＴである。
に含まれるトランスポゾンである。例えば、トランスポゾンは接合性トランスポゾンであ
る。一例では、トランスポゾンは、可動性トランスポゾンである（例えば、プラスミドが
コードする１つ以上の因子を用いて、例えば、プラスミドのトランスポゾン配列の外側の
遺伝子により、可動性である）。場合により、トランスポゾンはＩ型トランスポゾンであ
る。場合により、トランスポゾンは、ＩＩ型トランスポゾンである。場合により、ベクタ
ーｏｒｉＴは、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）（例えば、Ｂａｃｔｅ
ｒｏｉｄａｌｅｓもしくはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）またはＰｒｅｖｏｔｅｌｌａトラン
スポゾンのｏｒｉＴである。これは、第１の細胞（宿主細胞）がそれぞれバクテロイデス
門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）（例えば、ＢａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓまたはＢａｃ
ｔｅｒｏｉｄｅｓ）またはＰｒｅｖｏｔｅｌｌａである場合に有用である。場合により、
ベクターｏｒｉＴは、ＣＴｎＤｏｔ、ＣＴｎＥＲＬ ＳＸＴ／Ｒ３９１、Ｔｎ９１６また
はＴｎ４３７１ファミリーのトランスポゾンｏｒｉＴである。
【0266】
場合により、本方法は、患者の微生物叢を、第２の細胞内で作動可能であるが、第１の
（宿主）細胞内で作動できない、または、機能が低下する抗毒素遺伝子を含む、毒素－抗
毒素モジュールを含むベクターまたはＭＧＥ（例えば、上述の）に曝すことを含む。従っ
て、第１の細胞が死滅し、第２の細胞は温存され、それにより、患者の微生物叢において
第１の細胞の割合を変更する。
（宿主）細胞内で作動できない、または、機能が低下する抗毒素遺伝子を含む、毒素－抗
毒素モジュールを含むベクターまたはＭＧＥ（例えば、上述の）に曝すことを含む。従っ
て、第１の細胞が死滅し、第２の細胞は温存され、それにより、患者の微生物叢において
第１の細胞の割合を変更する。
【0267】
ＳＰＬＩＴ ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳシステム
一局面では、第１の細胞（宿主細胞）の内因性Ｃａｓが利用され、宿主細胞に導入され
たベクター（例えば、ファージ）に含まれる操作された配列と共に作動する。本局面は、
外因性の配列を運搬する能力が限られているウイルスやファージなどのベクターにおいて
、スペースを確保するのに有利である。スペースを確保することによって、より標的指向
性の高いスペーサーまたはアレイを含むことができ、宿主の抵抗を回避するのに有用であ
る。例えば、特にｓｐＣａｓ９またはｓａＣａｓ９などのかさ高いＣａｓ配列にとっては
、内因性Ｃａｓエンドヌクレアーゼを利用することは、それをベクター内でコードするよ
りも有利である。さらに、非宿主起源由来のいくつかの外因性のＣａｓでみられるような
、互換性が劣る可能性はない。ウイルス、例えばファージゲノムサイズを縮小させる能力
はまた、宿主細胞の取り込み（宿主細胞におけるウイルスの感染および／または維持）を
促進するのに有益であり得る。いくつかの例において、ベクター（例えばファージ）によ
る宿主への侵入が、宿主が侵入する核酸と戦おうとして、宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性
をアップレギュレートし得る（宿主Ｃａｓヌクレアーゼの発現増加を含む）ことが利点で
ある。しかしながら、これはまた、宿主Ｃａｓによって認識されるｃＲＮＡまたはｇＲＮ
Ａを使用する場合、本発明と共に使用するための内因性Ｃａｓを提供するのにも有用であ
る。本発明が宿主ＣＲＩＳＰＲアレイを標的とするｃＲＮＡまたはｇＲＮＡを包含する場
合、これは、次いで、それ自身のＣＲＩＳＰＲシステムを不活性化するためにそれ自身の
Ｃａｓヌクレアーゼを使用する「自殺」宿主細胞と同様に、宿主ＣＲＩＳＰＲアレイ自体
の不活性化を促進する。
一局面では、第１の細胞（宿主細胞）の内因性Ｃａｓが利用され、宿主細胞に導入され
たベクター（例えば、ファージ）に含まれる操作された配列と共に作動する。本局面は、
外因性の配列を運搬する能力が限られているウイルスやファージなどのベクターにおいて
、スペースを確保するのに有利である。スペースを確保することによって、より標的指向
性の高いスペーサーまたはアレイを含むことができ、宿主の抵抗を回避するのに有用であ
る。例えば、特にｓｐＣａｓ９またはｓａＣａｓ９などのかさ高いＣａｓ配列にとっては
、内因性Ｃａｓエンドヌクレアーゼを利用することは、それをベクター内でコードするよ
りも有利である。さらに、非宿主起源由来のいくつかの外因性のＣａｓでみられるような
、互換性が劣る可能性はない。ウイルス、例えばファージゲノムサイズを縮小させる能力
はまた、宿主細胞の取り込み（宿主細胞におけるウイルスの感染および／または維持）を
促進するのに有益であり得る。いくつかの例において、ベクター（例えばファージ）によ
る宿主への侵入が、宿主が侵入する核酸と戦おうとして、宿主ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性
をアップレギュレートし得る（宿主Ｃａｓヌクレアーゼの発現増加を含む）ことが利点で
ある。しかしながら、これはまた、宿主Ｃａｓによって認識されるｃＲＮＡまたはｇＲＮ
Ａを使用する場合、本発明と共に使用するための内因性Ｃａｓを提供するのにも有用であ
る。本発明が宿主ＣＲＩＳＰＲアレイを標的とするｃＲＮＡまたはｇＲＮＡを包含する場
合、これは、次いで、それ自身のＣＲＩＳＰＲシステムを不活性化するためにそれ自身の
Ｃａｓヌクレアーゼを使用する「自殺」宿主細胞と同様に、宿主ＣＲＩＳＰＲアレイ自体
の不活性化を促進する。
【0268】
従って、ベクターは、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）をコードする配列を欠
いていてよい。
いていてよい。
【0269】
場合により、内因性の第１の細胞（宿主細胞）システムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９シ
ステムである。場合により、ヌクレアーゼは、タイプＩＣａｓヌクレアーゼである。場合
により、ヌクレアーゼは、タイプＩＩＣａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）である。
場合により、ヌクレアーゼは、タイプＩＩＩＣａｓヌクレアーゼである。
ステムである。場合により、ヌクレアーゼは、タイプＩＣａｓヌクレアーゼである。場合
により、ヌクレアーゼは、タイプＩＩＣａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）である。
場合により、ヌクレアーゼは、タイプＩＩＩＣａｓヌクレアーゼである。
【0270】
さらによりスペースを節約するために、場合により、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列はベクター
により提供されないが、内因性宿主細胞ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのｔｒａｃｒＲＮ
Ａ配列であり、ここでｔｒａｃｒＲＮＡは、その後の宿主細胞内の標的へのＣａｓの誘導
のための成熟ｃｒＲＮＡへのプロセシングのために、細胞内のＨＭ－ｃｒＲＮＡとハイブ
リダイズすることができる。
により提供されないが、内因性宿主細胞ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのｔｒａｃｒＲＮ
Ａ配列であり、ここでｔｒａｃｒＲＮＡは、その後の宿主細胞内の標的へのＣａｓの誘導
のための成熟ｃｒＲＮＡへのプロセシングのために、細胞内のＨＭ－ｃｒＲＮＡとハイブ
リダイズすることができる。
【0271】
一般的に適用可能な特徴
以下の特徴は、本発明の任意の構成（例えば、任意のその局面、実施形態、コンセプト
、段落、または実施例における）に適用される。
以下の特徴は、本発明の任意の構成（例えば、任意のその局面、実施形態、コンセプト
、段落、または実施例における）に適用される。
【0272】
一例では、標的配列は、染色体の配列、内因性宿主細胞の配列、野生型宿主細胞の配列
、非ウイルス染色体宿主細胞の配列、および／または非ファージ配列であり（すなわち、
これらの１つ以上またま全て）、例えば、標的配列は、宿主細胞染色体に含まれる抗生物
質耐性遺伝子または必須遺伝子などの、野生型宿主染色体細胞配列である。一例では、標
的配列は、宿主細胞プラスミド配列であり、例えば、抗生物質耐性遺伝子配列である。
、非ウイルス染色体宿主細胞の配列、および／または非ファージ配列であり（すなわち、
これらの１つ以上またま全て）、例えば、標的配列は、宿主細胞染色体に含まれる抗生物
質耐性遺伝子または必須遺伝子などの、野生型宿主染色体細胞配列である。一例では、標
的配列は、宿主細胞プラスミド配列であり、例えば、抗生物質耐性遺伝子配列である。
【0273】
一例では、少なくとも２つの標的配列が、Ｃａｓにより改変され、例えば、抗生物質耐
遺伝子および必須遺伝子である。このような複数の標的化は、エスケープ変異体宿主細胞
の進化を低減させるのに有用であり得る。
遺伝子および必須遺伝子である。このような複数の標的化は、エスケープ変異体宿主細胞
の進化を低減させるのに有用であり得る。
【0274】
一例では、Ｃａｓは野生型内因性宿主細胞Ｃａｓヌクレアーゼである。一例では、各宿
主細胞は、恒常的Ｃａｓヌクレアーゼ活性、例えば、恒常的野生型Ｃａｓヌクレアーゼ活
性を有する。一例では、宿主細胞は細菌細胞である。別の例では、宿主細胞は古細菌細胞
である。内因性Ｃａｓの使用は、ベクターのｃＲＮＡまたはｇＲＮＡにおいてスペースを
確保することを可能にするために、有利である。例えば、タイプＩＩＣＲＩＳＰＲ／Ｃａ
ｓシステムが本発明において宿主細胞の改変のために用いられる場合において、タイプＩ
ＩＣａｓ９ヌクレオチド配列は大きく宿主細胞の内因性Ｃａｓの代替の使用は、有利であ
る。最も一般的に用いられるＣａｓ９は、４．２キロベース（ｋｂ）と測定され、Ｓ ｐ
ｙｏｇｅｎｅｓに由来する。これは効率的なヌクレアーゼであるが、その分子の長さは、
ベクターがどれだけの遺伝物質を収容することができるかという限界を押し上げ、生きて
いる動物の組織および本明細書に記載の他の設定において、ＣＲＩＳＰＲを使用すること
に対する障壁を作り出す(F.A. Ran et al., “In vivo genome editing using Staphyloc
occus aureus Cas9,” Nature, doi:10.1038/nature14299, 2015参照)。従って、ある実
施形態では、本発明のベクターは、ＡＡＶベクターであるか、またはＡＡＶベクター以下
の外因性ＤＮＡ挿入能力を有し、Ｃａｓは宿主細胞の内因性Ｃａｓであり、ここで細胞は
細菌細胞または古細菌細胞である。Ｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９（ＵｎｉＰ
ｒｏｔＫＢ－Ｇ３ＥＣＲ１（ＣＡＳ９＿ＳＴＲＴＲ））ヌクレオチド配列は、１．４ｋｂ
のサイズを有する。
主細胞は、恒常的Ｃａｓヌクレアーゼ活性、例えば、恒常的野生型Ｃａｓヌクレアーゼ活
性を有する。一例では、宿主細胞は細菌細胞である。別の例では、宿主細胞は古細菌細胞
である。内因性Ｃａｓの使用は、ベクターのｃＲＮＡまたはｇＲＮＡにおいてスペースを
確保することを可能にするために、有利である。例えば、タイプＩＩＣＲＩＳＰＲ／Ｃａ
ｓシステムが本発明において宿主細胞の改変のために用いられる場合において、タイプＩ
ＩＣａｓ９ヌクレオチド配列は大きく宿主細胞の内因性Ｃａｓの代替の使用は、有利であ
る。最も一般的に用いられるＣａｓ９は、４．２キロベース（ｋｂ）と測定され、Ｓ ｐ
ｙｏｇｅｎｅｓに由来する。これは効率的なヌクレアーゼであるが、その分子の長さは、
ベクターがどれだけの遺伝物質を収容することができるかという限界を押し上げ、生きて
いる動物の組織および本明細書に記載の他の設定において、ＣＲＩＳＰＲを使用すること
に対する障壁を作り出す(F.A. Ran et al., “In vivo genome editing using Staphyloc
occus aureus Cas9,” Nature, doi:10.1038/nature14299, 2015参照)。従って、ある実
施形態では、本発明のベクターは、ＡＡＶベクターであるか、またはＡＡＶベクター以下
の外因性ＤＮＡ挿入能力を有し、Ｃａｓは宿主細胞の内因性Ｃａｓであり、ここで細胞は
細菌細胞または古細菌細胞である。Ｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９（ＵｎｉＰ
ｒｏｔＫＢ－Ｇ３ＥＣＲ１（ＣＡＳ９＿ＳＴＲＴＲ））ヌクレオチド配列は、１．４ｋｂ
のサイズを有する。
【0275】
一例では、ベクターはウイルスベクターである。ウイルスベクターは、特に限られた外
因性ＤＮＡ挿入能力を有するので、ウイルスパッケージング能力を考慮する必要がある。
コートタンパク質およびポリメラーゼを発現させるためなどの、不可欠なウイルス機能を
コードする配列のために余地を残す必要がある。一例では、ベクターはファージベクター
、ＡＡＶ、またはレンチウイルスベクターである。ファージベクターは、宿主が細菌細胞
である場合には有用である。
因性ＤＮＡ挿入能力を有するので、ウイルスパッケージング能力を考慮する必要がある。
コートタンパク質およびポリメラーゼを発現させるためなどの、不可欠なウイルス機能を
コードする配列のために余地を残す必要がある。一例では、ベクターはファージベクター
、ＡＡＶ、またはレンチウイルスベクターである。ファージベクターは、宿主が細菌細胞
である場合には有用である。
【0276】
「操作された」という用語の使用により、本発明の、アレイ、配列、ベクター、ｃＲＮ
Ａ、ｇＲＮＡ、ＭＧＥまたは他の構成、コンセプト、局面、実施形態、段落、または実施
例などが、天然に生じるものではないことは、当業者にとって、容易に明らかとなるであ
ろう。例えば、該ＭＧＥ、ベクター、配列またはアレイは、ＭＧＥ、ベクター、配列、ま
たはアレイの、他の配列または成分と一緒に天然には見出されない１つ以上の配列または
成分を含む。例えば、該アレイまたは配列は、宿主細胞に対して組み換え、人工、合成ま
たは外因性（すなわち、非内因性である、または野生型でない）である。
Ａ、ｇＲＮＡ、ＭＧＥまたは他の構成、コンセプト、局面、実施形態、段落、または実施
例などが、天然に生じるものではないことは、当業者にとって、容易に明らかとなるであ
ろう。例えば、該ＭＧＥ、ベクター、配列またはアレイは、ＭＧＥ、ベクター、配列、ま
たはアレイの、他の配列または成分と一緒に天然には見出されない１つ以上の配列または
成分を含む。例えば、該アレイまたは配列は、宿主細胞に対して組み換え、人工、合成ま
たは外因性（すなわち、非内因性である、または野生型でない）である。
【0277】
一例では、本発明のアレイまたは配列は、単離された（例えば、宿主細胞から単離され
た）アレイまたは配列の操作されたバージョンである。一例では、操作されたアレイまた
は配列は、細胞内で天然に見出されるＣａｓエンドヌクレアーゼをコードする配列と組み
合わせられていない。
た）アレイまたは配列の操作されたバージョンである。一例では、操作されたアレイまた
は配列は、細胞内で天然に見出されるＣａｓエンドヌクレアーゼをコードする配列と組み
合わせられていない。
【0278】
研究により、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌ
による感染を予防する役割を有することが示唆されている。潜在的な病原体の侵入および
増殖を制限する免疫応答の発達は、Ｂ ｆｒａｇｉｌｉｓに大きく依存している。また、
パネート細胞タンパク質は、Ｂ ｔｈｅｔａｉｏｔｏｍｉｃｒｏｎによる刺激に応答して
、抗菌ペプチドを生産し得、これらの分子は、病原体が腸に定着することを予防し得る。
さらに、Ｂ ｔｈｅｔａｉｏｔｏｍｉｃｒｏｎは、パネート細胞に殺菌性レクチン、Ｒｅ
ｇＩＩＩを生産させることができ、ＲｅｇＩＩＩはグラム陽性生物のペプチドグリカンに
結合することによってその抗菌作用を発揮する。従って、患者の微生物叢において、Ｂａ
ｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、ｔｈｅｔａｉｏｔｏｍｉｃｒｏｎおよび／またはｆｒａｇ
ａｌｉｓ）の割合を増加させるための構成のいずれかにおける本発明の使用は、ヒトもし
くは非ヒト動物の腸における集団の病原性細菌の定着を制限するのに有用である。
による感染を予防する役割を有することが示唆されている。潜在的な病原体の侵入および
増殖を制限する免疫応答の発達は、Ｂ ｆｒａｇｉｌｉｓに大きく依存している。また、
パネート細胞タンパク質は、Ｂ ｔｈｅｔａｉｏｔｏｍｉｃｒｏｎによる刺激に応答して
、抗菌ペプチドを生産し得、これらの分子は、病原体が腸に定着することを予防し得る。
さらに、Ｂ ｔｈｅｔａｉｏｔｏｍｉｃｒｏｎは、パネート細胞に殺菌性レクチン、Ｒｅ
ｇＩＩＩを生産させることができ、ＲｅｇＩＩＩはグラム陽性生物のペプチドグリカンに
結合することによってその抗菌作用を発揮する。従って、患者の微生物叢において、Ｂａ
ｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、ｔｈｅｔａｉｏｔｏｍｉｃｒｏｎおよび／またはｆｒａｇ
ａｌｉｓ）の割合を増加させるための構成のいずれかにおける本発明の使用は、ヒトもし
くは非ヒト動物の腸における集団の病原性細菌の定着を制限するのに有用である。
【0279】
Hooper et alは、Ｂ ｔｈｅｔａｉｏｔｏｍｉｃｒｏｎがフコースリプレッサー遺伝子
によって媒介される複雑な相互作用における腸内フコシル化と、シグナル伝達システムを
改変できることを実証した。転写解析を用いて、Ｂ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ
が、栄養素の吸収、粘膜のバリア強化、および血管新生因子の生産に関わる遺伝子を含む
、様々な宿主遺伝子の発現を調節できることが実証された。
によって媒介される複雑な相互作用における腸内フコシル化と、シグナル伝達システムを
改変できることを実証した。転写解析を用いて、Ｂ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ
が、栄養素の吸収、粘膜のバリア強化、および血管新生因子の生産に関わる遺伝子を含む
、様々な宿主遺伝子の発現を調節できることが実証された。
【0280】
場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）は、グラム陰性細菌（
例えば、ｓｐｉｒｉｌｌａまたは ｖｉｂｒｉｏ）である。場合により、宿主（すなわち
、第１および／または第２の細菌）はグラム陽性細菌である。場合により、宿主（すなわ
ち、第１および／または第２の細菌）は、ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ
、ｓｐｉｒｏｃｈｅｔｅまたはｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍである。場合により、宿主（
すなわち、第１および／または第２の細菌）は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、
ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）宿主である。場合により、宿主（す
なわち、第１および／または第２の細菌）は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、
ａｕｒｅｕｓ、例えば、ＭＲＳＡ）宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１およ
び／または第２の細菌）は、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、Ｏ１５７：Ｈ７）宿主であり、例え
ば、ここで、Ｃａｓはベクターによりコードされるか、または、内因性宿主Ｃａｓヌクレ
アーゼ活性は抑制解除されている。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第
２の細菌）は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えば、ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）宿主である。
場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）は、Ｖｉｂｒｏ（例えば
、ｃｈｏｌｅｒａｅ（例えば、Ｏ１３９）またはｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）宿主である。場
合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ（
例えば、ｇｏｎｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）宿主である。場合
により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ（
例えば、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／
または第２の細菌）は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ（例えば、ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）宿主
である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）はＳｈｉｇｅｌ
ｌａ（例えば、ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）宿主である。場合により、宿主（すなわち、第
１および／または第２の細菌）は、Ｂｒｕｃｅｌｌａ（例えば、ａｂｏｒｔｕｓ）宿主で
ある。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）はＦｒａｎｃｉｓ
ｅｌｌａ宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）は
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または
第２の細菌）はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主である。場合により、宿主（すなわち、
第１および／または第２の細菌）はＥｒｗｉｎｉａ宿主である。場合により、宿主（すな
わち、第１および／または第２の細菌）はＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ（例えば、ｐｎｅｕｍｏ
ｐｈｉｌａ）宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌
）はＬｉｓｔｅｒｉａ（例えば、ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）宿主である。場合により
、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）はＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ（例
えば、ｊｅｊｕｎｉ）宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第
２の細菌）はＹｅｒｓｉｎｉａ（例えば、ｐｅｓｔｉｓ）宿主である。場合により、宿主
（すなわち、第１および／または第２の細菌）は、Ｂｏｒｅｌｉａ（例えば、ｂｕｒｇｄ
ｏｒｆｅｒｉ）宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細
菌）はＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ（例えば、ｐｙｌｏｒｉ）宿主である。場合により、宿
主（すなわち、第１および／または第２の細菌）はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（例えば、ｄ
ｉｆｉｃｉｌｅまたはｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）宿主である。場合により、宿主（すなわち、
第１および／または第２の細菌）は、Ｅｒｌｉｃｈｉａ（例えば、ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉ
ｓ）宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）は、Ｓ
ａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、ｔｙｐｈｉまたはｅｎｔｅｒｉｃａ、例えば、ｓｅｒｏｔ
ｙｐｅ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、例えば、ＤＴ １０４）宿主である。場合により、宿
主（すなわち、第１および／または第２の細菌）は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ（例えば、ｐｎ
ｅｕｍｏｎｉａｅ）宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２
の細菌）は、Ｐａｒａｃｈｌａｍｙｄｉａ宿主である。場合により、宿主（すなわち、第
１および／または第２の細菌）は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、ａｍｙｃ
ｏｌａｔｕｍ）宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細
菌）は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ（例えば、ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）宿主である。場合によ
り、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ（
例えば、ｆａｅｃａｌｉｓまたはｆａｅｃｉｍ、例えば、リネゾイド耐性）宿主である。
場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａ
ｃｔｅｒ（例えば、ｂａｕｍａｎｎｉｉ、例えば、多剤耐性）宿主である。
例えば、ｓｐｉｒｉｌｌａまたは ｖｉｂｒｉｏ）である。場合により、宿主（すなわち
、第１および／または第２の細菌）はグラム陽性細菌である。場合により、宿主（すなわ
ち、第１および／または第２の細菌）は、ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ
、ｓｐｉｒｏｃｈｅｔｅまたはｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍである。場合により、宿主（
すなわち、第１および／または第２の細菌）は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、
ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）宿主である。場合により、宿主（す
なわち、第１および／または第２の細菌）は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、
ａｕｒｅｕｓ、例えば、ＭＲＳＡ）宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１およ
び／または第２の細菌）は、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、Ｏ１５７：Ｈ７）宿主であり、例え
ば、ここで、Ｃａｓはベクターによりコードされるか、または、内因性宿主Ｃａｓヌクレ
アーゼ活性は抑制解除されている。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第
２の細菌）は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えば、ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）宿主である。
場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）は、Ｖｉｂｒｏ（例えば
、ｃｈｏｌｅｒａｅ（例えば、Ｏ１３９）またはｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）宿主である。場
合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ（
例えば、ｇｏｎｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）宿主である。場合
により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ（
例えば、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／
または第２の細菌）は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ（例えば、ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）宿主
である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）はＳｈｉｇｅｌ
ｌａ（例えば、ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）宿主である。場合により、宿主（すなわち、第
１および／または第２の細菌）は、Ｂｒｕｃｅｌｌａ（例えば、ａｂｏｒｔｕｓ）宿主で
ある。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）はＦｒａｎｃｉｓ
ｅｌｌａ宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）は
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または
第２の細菌）はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主である。場合により、宿主（すなわち、
第１および／または第２の細菌）はＥｒｗｉｎｉａ宿主である。場合により、宿主（すな
わち、第１および／または第２の細菌）はＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ（例えば、ｐｎｅｕｍｏ
ｐｈｉｌａ）宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌
）はＬｉｓｔｅｒｉａ（例えば、ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）宿主である。場合により
、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）はＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ（例
えば、ｊｅｊｕｎｉ）宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第
２の細菌）はＹｅｒｓｉｎｉａ（例えば、ｐｅｓｔｉｓ）宿主である。場合により、宿主
（すなわち、第１および／または第２の細菌）は、Ｂｏｒｅｌｉａ（例えば、ｂｕｒｇｄ
ｏｒｆｅｒｉ）宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細
菌）はＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ（例えば、ｐｙｌｏｒｉ）宿主である。場合により、宿
主（すなわち、第１および／または第２の細菌）はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（例えば、ｄ
ｉｆｉｃｉｌｅまたはｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）宿主である。場合により、宿主（すなわち、
第１および／または第２の細菌）は、Ｅｒｌｉｃｈｉａ（例えば、ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉ
ｓ）宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）は、Ｓ
ａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、ｔｙｐｈｉまたはｅｎｔｅｒｉｃａ、例えば、ｓｅｒｏｔ
ｙｐｅ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、例えば、ＤＴ １０４）宿主である。場合により、宿
主（すなわち、第１および／または第２の細菌）は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ（例えば、ｐｎ
ｅｕｍｏｎｉａｅ）宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２
の細菌）は、Ｐａｒａｃｈｌａｍｙｄｉａ宿主である。場合により、宿主（すなわち、第
１および／または第２の細菌）は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、ａｍｙｃ
ｏｌａｔｕｍ）宿主である。場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細
菌）は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ（例えば、ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）宿主である。場合によ
り、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ（
例えば、ｆａｅｃａｌｉｓまたはｆａｅｃｉｍ、例えば、リネゾイド耐性）宿主である。
場合により、宿主（すなわち、第１および／または第２の細菌）は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａ
ｃｔｅｒ（例えば、ｂａｕｍａｎｎｉｉ、例えば、多剤耐性）宿主である。
【0281】
例えばｔｒａｃｒＲＮＡを使用しないタイプのＣａｓシステムの場合、ｔｒａｃｒＲＮ
Ａ配列を本発明のアレイまたはベクターから除くことができる。
Ａ配列を本発明のアレイまたはベクターから除くことができる。
【0282】
一例では、標的に誘導されるＣａｓはエキソヌクレアーゼである。場合により、本明細
書で言及されるニッカーゼは、ダブルニッカーゼである。ニッカーゼの例は、Ｃａｓ９ニ
ッカーゼであり、すなわち、２つのヌクレアーゼドメインのうちの一方（ＲｕｖＣドメイ
ンおよび／またはＨＮＨドメインのいずれか）が不活性化されているＣａｓ９である。
書で言及されるニッカーゼは、ダブルニッカーゼである。ニッカーゼの例は、Ｃａｓ９ニ
ッカーゼであり、すなわち、２つのヌクレアーゼドメインのうちの一方（ＲｕｖＣドメイ
ンおよび／またはＨＮＨドメインのいずれか）が不活性化されているＣａｓ９である。
【0283】
本明細書におけるベクターＤＮＡの使用についての言及はまた、別の実施形態において
、文脈が許す場合に、必要な変更を加えてベクターＲＮＡに適用することもできる。例え
ば、ベクターがＲＮＡベクターである場合である。したがって、本発明の全ての特徴は開
示された代替形態であり、文脈が許す場合に、本明細書中でベクターＤＮＡを指す場合に
は「ＤＮＡ」の代わりに「ＲＮＡ」として読まれるべきである。一例では、当該またはそ
れぞれのベクターはまた、逆転写酵素をコードする。
、文脈が許す場合に、必要な変更を加えてベクターＲＮＡに適用することもできる。例え
ば、ベクターがＲＮＡベクターである場合である。したがって、本発明の全ての特徴は開
示された代替形態であり、文脈が許す場合に、本明細書中でベクターＤＮＡを指す場合に
は「ＤＮＡ」の代わりに「ＲＮＡ」として読まれるべきである。一例では、当該またはそ
れぞれのベクターはまた、逆転写酵素をコードする。
【0284】
一例では、当該またはそれぞれのアレイまたは操作されたヌクレオチド配列は、ナノ粒
子ベクターによって、または、リポソーム中で、提供される。
子ベクターによって、または、リポソーム中で、提供される。
【0285】
一例では、Ｃａｓは切断用のＣａｓヌクレアーゼ、遮断用の不活性化型Ｃａｓ（ｄｅａ
ｄ Ｃａｓ）（ｄＣａｓ）、または標的を活性化するための転写活性化因子に結合したｄ
Ｃａｓである。
ｄ Ｃａｓ）（ｄＣａｓ）、または標的を活性化するための転写活性化因子に結合したｄ
Ｃａｓである。
【0286】
一例では、当該またはそれぞれのアレイまたは操作された配列は、宿主におけるｃｒＲ
ＮＡまたはｇＲＮＡの転写に機能的である外因性プロモーターを含む。
ＮＡまたはｇＲＮＡの転写に機能的である外因性プロモーターを含む。
【0287】
ある実施形態において、アレイまたは操作された配列は、ヴィロファージベクターに含
まれ、宿主は、あるいは、細胞に感染することができるウイルスである。例えば、宿主は
、アメーバ細胞に感染し得る大きなウイルスである。例えば、宿主は、スプートニクウイ
ルス（Ｓｐｕｔｎｉｋ ｖｉｒｕｓ）、ピソウイルス（Ｐｉｔｈｏｖｉｒｕｓ）、ミミウ
イルス（ｍｉｍｉｖｉｒｕｓ）、ママウイルス（ｍａｍａｖｉｒｕｓ）、メガウイルス（
Ｍｅｇａｖｉｒｕｓ）、またはパンドラウイルス（Ｐａｎｄｏｒａｖｉｒｕｓ）であり、
例えば、ここで、宿主ウイルスは水中に存在する。本実施形態の一例では、本発明は水処
理または下水処理（例えば浄化処理、例えば水路、河川、湖、池または海の処理）のため
のものである。
まれ、宿主は、あるいは、細胞に感染することができるウイルスである。例えば、宿主は
、アメーバ細胞に感染し得る大きなウイルスである。例えば、宿主は、スプートニクウイ
ルス（Ｓｐｕｔｎｉｋ ｖｉｒｕｓ）、ピソウイルス（Ｐｉｔｈｏｖｉｒｕｓ）、ミミウ
イルス（ｍｉｍｉｖｉｒｕｓ）、ママウイルス（ｍａｍａｖｉｒｕｓ）、メガウイルス（
Ｍｅｇａｖｉｒｕｓ）、またはパンドラウイルス（Ｐａｎｄｏｒａｖｉｒｕｓ）であり、
例えば、ここで、宿主ウイルスは水中に存在する。本実施形態の一例では、本発明は水処
理または下水処理（例えば浄化処理、例えば水路、河川、湖、池または海の処理）のため
のものである。
【0288】
ある実施形態において、当該またはそれぞれのベクターまたは操作された配列は、ΦΝ
Μ１ファージであるか、これに含まれ、例えば、ここで、宿主細胞は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ
（例えば、ＭＲＳＡ）細胞である。
Μ１ファージであるか、これに含まれ、例えば、ここで、宿主細胞は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ
（例えば、ＭＲＳＡ）細胞である。
【0289】
例えば、本方法は、哺乳動物対象、例えば、ヒト、げっ歯類、マウスまたはラットに実
施される。例えば、本方法は脊椎動物、爬虫類、鳥類または魚類に実施される。
施される。例えば、本方法は脊椎動物、爬虫類、鳥類または魚類に実施される。
【0290】
細胞集団は、１回以上の投与で、患者に投与することができる。例えば、本方法は、抗
菌剤を投与して前記ディスバイオシスを引き起こすこと、または、細菌移植片を患者に投
与して前記ディスバイオシスを引き起こすことを含む。
菌剤を投与して前記ディスバイオシスを引き起こすこと、または、細菌移植片を患者に投
与して前記ディスバイオシスを引き起こすことを含む。
【0291】
本方法が細胞療法を軽減する場合、該療法を、例えば細胞療法の望まれない副作用（例
えば、ＣＲＳなどの、ヒト患者におけるＣＡＲ－Ｔ療法の副作用）を軽減または予防する
ために、ダウンレギュレート、緩和または停止させることができる。本方法が細胞療法を
上昇させる場合、該療法を、例えば標的細胞に対する細胞傷害性を増強させるために、ア
ップレギュレート、増強、または開始させることができる。
えば、ＣＲＳなどの、ヒト患者におけるＣＡＲ－Ｔ療法の副作用）を軽減または予防する
ために、ダウンレギュレート、緩和または停止させることができる。本方法が細胞療法を
上昇させる場合、該療法を、例えば標的細胞に対する細胞傷害性を増強させるために、ア
ップレギュレート、増強、または開始させることができる。
【0292】
本方法は、疾病または症状を、処置または予防する（すなわち、そのリスクを低減する
）。これは、完全なまたは部分的な、処置または予防であってよく、すなわち、疾病／症
状またはその徴候の軽減であるが、完全な軽減でなくてよく；あるいは、疾病／症状また
はその徴候のリスクの軽減であるが、完全な予防でなくてよい。同様に、本方法は、疾病
もしくは症状または治療の望ましくない徴候（例えば、ＣＲＳ）を処置または予防する（
すなわち、そのリスクを軽減する）。
）。これは、完全なまたは部分的な、処置または予防であってよく、すなわち、疾病／症
状またはその徴候の軽減であるが、完全な軽減でなくてよく；あるいは、疾病／症状また
はその徴候のリスクの軽減であるが、完全な予防でなくてよい。同様に、本方法は、疾病
もしくは症状または治療の望ましくない徴候（例えば、ＣＲＳ）を処置または予防する（
すなわち、そのリスクを軽減する）。
【0293】
コンセプト
１．患者において疾病または症状の養子免疫細胞療法を調節する方法であって、
ａ．免疫細胞の集団を患者に投与することを含む、養子免疫細胞療法を患者において実行
すること、ここで、該免疫細胞の投与は、患者において疾病または症状を処置することが
可能である；および、
ｂ．患者において細菌微生物叢（例えば、腸内微生物叢）ディスバイオシスを引き起こし
、それにより、前記ディスバイオシスが患者において免疫細胞療法を調節すること
を含む方法。
２．患者において疾病または症状の養子免疫細胞療法を調節する方法であって、
ａ．免疫細胞の集団を患者に投与することを含む、養子免疫細胞療法を患者において実行
すること、ここで、該免疫細胞の投与は、患者において疾病または症状を処置することが
可能である；および、
ｂ．患者の微生物叢（例えば、腸内微生物叢）において、第１の細菌種もしくは株、また
は、古細菌種もしくは株の細胞の亜集団の相対的割合を変更し、それにより、患者におい
て免疫細胞療法を調節する変更された微生物叢を産生すること
を含む方法。
３．ステップ（ｂ）が、抗細菌剤または抗古細菌剤を、患者の微生物叢に、免疫細胞集団
と同時に、または連続して投与することにより、第１の細胞の亜集団を標的化することに
より実行され、それにより、第１の細胞が死滅するか、該亜集団の増殖が低下し、それに
より、患者の微生物叢における前記亜集団の割合を低減させる、コンセプト２の方法。
４．細胞療法が養子Ｔ細胞療法である、コンセプト１～３のいずれかに記載の方法。
５．ステップ（ａ）において、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｈ１細胞およびＴｈ
１７細胞からなる群から選択される細胞が患者に投与される、コンセプト４に記載の方法
。
６．患者においてＴｈ１７細胞が調節される、コンセプト４または５に記載の方法。
７．患者においてＴｒｅｇ細胞が調節される、コンセプト４、５または６に記載の方法。
８．細胞療法が増強される、コンセプト１～７のいずれかに記載の方法。
９．患者においてＴｈ１７細胞がアップレギュレートされ、および／または、患者におい
てＴｒｅｇ細胞がダウンレギュレートされる、コンセプト１～８のいずれかに記載の方法
。
１０．患者においてＣＤ４＋Ｔ細胞がアップレギュレートされる、コンセプト１～９のい
ずれかに記載の方法。
１１．患者においてＣＤ８＋Ｔ細胞がアップレギュレートされる、コンセプト１～１０の
いずれかに記載の方法。
１２．患者においてセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞
（ＴＥＭ）、ステムセルメモリー細胞（ＴＳＣＭ）およびエフェクター細胞（Ｔｅｆｆ）
の１つ以上がアップレギュレートされ、ここで、該細胞が、ステップ（ａ）で投与される
免疫細胞集団に含まれる、および／または、それらの子孫である、コンセプト１～１１の
いずれかに記載の方法。
１３．細胞療法が低減される、コンセプト１～７のいずれかに記載の方法。
１４．患者においてサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）のリスクを低減または予防する、
コンセプト１３に記載の方法。
１５．患者においてＴｈ１７細胞がダウンレギュレートされ、および／または、患者にお
いてＴｒｅｇ細胞がアップレギュレートされる、コンセプト１～７、１３および１４のい
ずれかに記載の方法。
１６．患者においてＣＤ４＋Ｔ細胞がダウンレギュレートされる、コンセプト１～７、お
よび、１３～１５のいずれかに記載の方法。
１７．患者においてＣＤ８＋Ｔ細胞がダウンレギュレートされる、コンセプト１～７、お
よび、１３～１６のいずれかに記載の方法。
１８．患者においてセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞
（ＴＥＭ）、ステムセルメモリー細胞（ＴＳＣＭ）およびエフェクター細胞（Ｔｅｆｆ）
の１つ以上がダウンレギュレートされ、ここで、該細胞が、ステップ（ａ）で投与される
免疫細胞集団に含まれる、および／または、それらの子孫である、コンセプト１～７およ
び１３～１７のいずれかに記載の方法。
１９．免疫細胞集団が、ＣＡＲ－Ｔ細胞、および／または、操作されたＴ細胞受容体（Ｔ
ＣＲ）を発現するＴ細胞、および／または、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、コンセ
プト１～１８のいずれかに記載の方法。
２０．免疫細胞集団が、操作された自家の、または同種の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、Ｎ
Ｋ細胞および／またはＴＩＬを含む、コンセプト１～１９のいずれかに記載の方法。
２１．Ｔ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＴｈ１７細胞である、コンセプト１９または２０
に記載の方法。
２２．ステップ（ｂ）が、微生物叢において、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、Ｂ ｆ
ｒａｇａｌｉｓおよび／またはＢ ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ）の割合を増加させ
る、コンセプト１～２１のいずれかに記載の方法。
２３．ステップ（ｂ）が、微生物叢において、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、Ｂ ｆ
ｒａｇａｌｉｓおよび／またはＢ ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ） の割合を減少さ
せる、コンセプト１～２１のいずれかに記載の方法。
２４．ステップ（ｂ）が、微生物叢において、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅ
ｔｅｓ）の、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）に対する割合を増加させる
、コンセプト１～２３のいずれかに記載の方法。
２５．ステップ（ｂ）が、微生物叢において、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅ
ｔｅｓ）の、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）に対する割合を減少させる
、コンセプト１～２３のいずれかに記載の方法。
２６．ステップ（ｂ）が、微生物叢において、１つ以上のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種また
は株（例えば、各種は、クラスターＩＶまたはＸＩＶａのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種であ
る）の割合を低減させる、コンセプト１～２５のいずれかに記載の方法。
２７．ステップ（ｂ）が、微生物叢において、１つ以上のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種また
は株（例えば、各種は、クラスターＩＶまたはＸＩＶａのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種であ
る）の割合を増加させる、コンセプト１～２５のいずれかに記載の方法。
２８．ステップ（ｂ）が、微生物叢において、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば
、Ｂ ｂｉｆｉｄｕｍ）の割合を低減させる、コンセプト１～２７のいずれかに記載の方
法。
２９．ステップ（ｂ）が、微生物叢において、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば
、Ｂ ｂｉｆｉｄｕｍ）の割合を増加させる、コンセプト１～２７のいずれかに記載の方
法。
３０．ステップ（ｂ）が、患者の微生物叢において、第１の細胞の相対的割合または前記
亜集団を変更し、それにより、患者において免疫細胞療法を調節する変化した微生物叢を
産生することを含み、ここで、該亜集団は前記第１の種または株の宿主細胞を含む方法で
あって、
ａ．微生物叢を、宿主改変（ＨＭ）ｃｒＲＮＡをコードする操作された核酸配列の複数の
コピーと組み合わせること、および
ｂ．宿主細胞においてＨＭ－ｃｒＲＮＡを発現させること
を含む方法であって、
ここで、操作された各核酸配列は、個々の宿主細胞においてＣａｓヌクレアーゼと作動可
能であり、ＨＭ－ＣＲｌＳＰＲ／Ｃａｓシステムを形成し、かつ、該操作された配列が、
(iii)ＨＭ－ｃｒＲＮＡをコードする、スペーサーおよびリピート配列;
(iv)宿主細胞の標的配列にハイブリダイズしてＣａｓヌクレアーゼを宿主細胞の標的配列
に誘導することができる配列を含む、ＨＭ－ｃｒＲＮＡ;
を含み、場合により、ＨＭ－システムは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ
配列を発現するＤＮＡ配列を含み、
それにより、ＨＭ－ｃｒＲＮＡは宿主細胞において宿主標的配列のＣａｓ改変を誘導し、
、それにより、宿主細胞が死滅するか、宿主細胞集団の増殖が低下し、それにより、微生
物叢における該亜集団の割合を低減させる、コンセプト１～２９のいずれかに記載の方法
。
３１．標的ヌクレオチド配列の改変のために、宿主細胞の内因性Ｃａｓヌクレアーゼを用
いることを含む、コンセプト３０の方法。
３２．前記Ｃａｓ改変を受けていない宿主細胞のコントロール集団の増殖と比較して、少
なくとも５倍、宿主細胞集団の増殖を低下させることを含む、コンセプト３０または３１
に記載の方法。
３３．腸表面上の宿主細胞集団の増殖を阻害することを含む、コンセプト３０～３２のい
ずれかに記載の方法。
３４．微生物叢が、第２の細菌種または株、または、古細菌種または株の細胞を含み、第
２の種または株が、宿主細胞の種または株の１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ
配列に少なくとも８０％同一である１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を有
し、微生物叢における第２の細胞の増殖が前記ＨＭ－システムにより阻害されない、コン
セプト３０～３３のいずれかに記載の方法。
３５．第２の種または株が、ヒト腸内片利共生種または株、および／または、ヒト腸内プ
ロバイオティック種または株である、コンセプト３４に記載の方法。
３６．第２の種または株が、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）（例えば
、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）であり、場合により、宿主細胞が、グラム陽性細菌細胞であ
る、コンセプト３４または３５に記載の方法。
３７．第１の細胞が、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の細胞である、コ
ンセプト３０～３６のいずれかに記載の方法。
３８．各宿主細胞について、該システムが、（ｉ）～（ｉｖ）に記載の成分を含む、コン
セプト３０～３７のいずれかに記載の方法：
（ｉ）Ｃａｓヌクレアーゼをコードする、少なくとも１つの核酸配列；
（ｉｉ）ＨＭ－ｃｒＲＮＡをコードするスペーサー配列およびリピートを含む操作された
ＨＭ－ＣＲＩＳＰＲアレイであって、該ＨＭ－ｃｒＲＮＡは、宿主細胞の標的配列にハイ
ブリダイズして前記Ｃａｓを宿主細胞における標的に誘導して標的配列を改変する配列を
含む；
（ｉｉｉ）任意のｔｒａｃｒＲＮＡ配列、または、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するＤＮ
Ａ配列；
（ｉｖ）ここで、本システムの前記成分は、宿主細胞と宿主細胞を形質転換する少なくと
も１つの核酸ベクターとの間で分割され、それによってＨＭ－ｃｒＲＮＡはＣａｓを標的
に誘導して、宿主細胞における宿主標的配列を改変する；および
ここで、該標的配列はＣａｓにより改変され、それにより、宿主細胞が死滅するか、宿主
細胞の増殖が低下する；
本方法は、（ｉｖ）のベクターを宿主細胞へ導入することおよび宿主細胞において前記Ｈ
Ｍ－ｃｒＲＮＡを発現することを含み、ＨＭ－ｃＲＮＡが宿主細胞の標的配列にハイブリ
ダイズしてＣａｓを宿主細胞における標的に誘導して標的配列を改変することを可能にし
、それにより、宿主細胞が死滅するか、宿主細胞の増殖が低下し、それにより、微生物叢
における前記亜集団の割合を変更する。
３９．成分（ｉ）が、各宿主細胞に対して内因性である、コンセプト３８に記載の方法。
４０．各ベクターが、ウイルスまたはファージである、コンセプト３８または３９に記載
の方法。
４１．各標的配列が、隣接するＮＮＡＧＡＡＷまたはＮＧＧＮＧのプロトスペーサー隣接
モチーフ（ＰＡＭ）である、コンセプト３０～４０のいずれかに記載の方法。
４２．代わりに、ＨＭ－ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが、シングルガイドＲＮＡ（
ｇＲＮＡ）に含まれ、前記ｇＲＮＡを宿主細胞に導入すること、または、宿主細胞におい
て該ｇＲＮＡを発現することを含む、コンセプト３０～４１のいずれかに記載の方法。
４３．微生物叢が、第２の細菌または古細菌の種を含み、第１および第２の種はそれぞれ
同じ門の種（例えば、共にファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）種）であり、
第２の細菌の増殖はＨＭ－システムによって阻害されない；あるいは、微生物叢が、第２
の細菌または古細菌の株を含み、第１および第２の細菌または古細菌はそれぞれ同じ種の
株であり、第２の細菌または古細菌の増殖はＨＭ－システムによって阻害されない、コン
セプト３０～３５および３７～４２のいずれかに記載の方法。
４４．微生物叢が第２の細菌種を含み、第１および第２の種のぞれぞれが、グラム陽性種
であり、第２の細菌の増殖がＨＭ－システムによって阻害されない、コンセプト３０～４
３のいずれかに記載の方法。
４５．各標的配列が、宿主細胞の、抗生物質耐性遺伝子、病原性遺伝子または必須遺伝子
に含まれる、コンセプト３０～３３のいずれかに記載の方法。
４６．各第１の細胞が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｅ ｃｏｌｉ、Ｄ
ｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、ＶｉｂｒｉｏまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ細胞である、コ
ンセプト１～４５のいずれかに記載の方法。
４７．ステップ（ｂ）が、腸のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、Ｂ ｔｈｅｔａｉｏｔ
ａｍｉｃｒｏｎ）により患者のパネート細胞を刺激することを含み、ステップ（ｂ）によ
り産生された変化した微生物叢が、ステップ（ｂ）より前の微生物叢と比較して、割合が
増加したＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓである第１の細菌を含み、それにより、パネート細胞が
刺激され、細胞療法が調節される、コンセプト１～４６のいずれかに記載の方法。
４８．ステップ（ｂ）が、患者において腸のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、Ｂ ｔｈ
ｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ）に対する免疫応答を発達させることを含み、ステップ（ｂ
）により産生された変化した微生物叢が、ステップ（ｂ）より前の微生物叢と比較して、
割合が増加したＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓである第１の細菌を含み、それにより、細胞療法
が調節される、コンセプト１～４７のいずれかに記載の方法。
４９．ステップ（ｂ）が、患者の微生物叢において、第１の細胞の相対的割合または前記
亜集団を変更し、それにより、患者において免疫細胞療法を調節する変更された腸内微生
物叢を産生することを含み、ステップ（ｂ）が、亜集団に含まれる第１の細胞のゲノムを
標的とする誘導型ヌクレアーゼを用いることにより、前記亜集団の第１の細胞を死滅させ
るか、前記亜集団の増殖を阻害することを含む、コンセプト１～４８のいずれかに記載の
方法。
５０．コンセプト１～４９のいずれかに記載の方法を用いて、患者において疾病または症
状を治療するために患者へ投与するための、細菌または古細菌の移植片であって、場合に
より前記第１の種の細胞を含む移植片。
５１．コンセプト１～４９のいずれかに記載の方法を用いて、患者において疾病または症
状を治療するために患者へ投与するための、コンセプト３０～４５のいずれかに記載され
る、ＨＭ－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＨＭ－アレイまたはＨＭ－ｃｒＲＮＡ。
５２．さらに、コンセプト５０または５１の移植片、システム、アレイまたはｃｒＲＮＡ
を含み、場合により免疫細胞がＣＡＲ－Ｔ細胞、操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発
現するＴ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）およびＮＫ細胞から選択される、患者の養子
細胞療法のための免疫細胞のエクスビボ集団を含むキット。
１．患者において疾病または症状の養子免疫細胞療法を調節する方法であって、
ａ．免疫細胞の集団を患者に投与することを含む、養子免疫細胞療法を患者において実行
すること、ここで、該免疫細胞の投与は、患者において疾病または症状を処置することが
可能である；および、
ｂ．患者において細菌微生物叢（例えば、腸内微生物叢）ディスバイオシスを引き起こし
、それにより、前記ディスバイオシスが患者において免疫細胞療法を調節すること
を含む方法。
２．患者において疾病または症状の養子免疫細胞療法を調節する方法であって、
ａ．免疫細胞の集団を患者に投与することを含む、養子免疫細胞療法を患者において実行
すること、ここで、該免疫細胞の投与は、患者において疾病または症状を処置することが
可能である；および、
ｂ．患者の微生物叢（例えば、腸内微生物叢）において、第１の細菌種もしくは株、また
は、古細菌種もしくは株の細胞の亜集団の相対的割合を変更し、それにより、患者におい
て免疫細胞療法を調節する変更された微生物叢を産生すること
を含む方法。
３．ステップ（ｂ）が、抗細菌剤または抗古細菌剤を、患者の微生物叢に、免疫細胞集団
と同時に、または連続して投与することにより、第１の細胞の亜集団を標的化することに
より実行され、それにより、第１の細胞が死滅するか、該亜集団の増殖が低下し、それに
より、患者の微生物叢における前記亜集団の割合を低減させる、コンセプト２の方法。
４．細胞療法が養子Ｔ細胞療法である、コンセプト１～３のいずれかに記載の方法。
５．ステップ（ａ）において、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｈ１細胞およびＴｈ
１７細胞からなる群から選択される細胞が患者に投与される、コンセプト４に記載の方法
。
６．患者においてＴｈ１７細胞が調節される、コンセプト４または５に記載の方法。
７．患者においてＴｒｅｇ細胞が調節される、コンセプト４、５または６に記載の方法。
８．細胞療法が増強される、コンセプト１～７のいずれかに記載の方法。
９．患者においてＴｈ１７細胞がアップレギュレートされ、および／または、患者におい
てＴｒｅｇ細胞がダウンレギュレートされる、コンセプト１～８のいずれかに記載の方法
。
１０．患者においてＣＤ４＋Ｔ細胞がアップレギュレートされる、コンセプト１～９のい
ずれかに記載の方法。
１１．患者においてＣＤ８＋Ｔ細胞がアップレギュレートされる、コンセプト１～１０の
いずれかに記載の方法。
１２．患者においてセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞
（ＴＥＭ）、ステムセルメモリー細胞（ＴＳＣＭ）およびエフェクター細胞（Ｔｅｆｆ）
の１つ以上がアップレギュレートされ、ここで、該細胞が、ステップ（ａ）で投与される
免疫細胞集団に含まれる、および／または、それらの子孫である、コンセプト１～１１の
いずれかに記載の方法。
１３．細胞療法が低減される、コンセプト１～７のいずれかに記載の方法。
１４．患者においてサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）のリスクを低減または予防する、
コンセプト１３に記載の方法。
１５．患者においてＴｈ１７細胞がダウンレギュレートされ、および／または、患者にお
いてＴｒｅｇ細胞がアップレギュレートされる、コンセプト１～７、１３および１４のい
ずれかに記載の方法。
１６．患者においてＣＤ４＋Ｔ細胞がダウンレギュレートされる、コンセプト１～７、お
よび、１３～１５のいずれかに記載の方法。
１７．患者においてＣＤ８＋Ｔ細胞がダウンレギュレートされる、コンセプト１～７、お
よび、１３～１６のいずれかに記載の方法。
１８．患者においてセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞
（ＴＥＭ）、ステムセルメモリー細胞（ＴＳＣＭ）およびエフェクター細胞（Ｔｅｆｆ）
の１つ以上がダウンレギュレートされ、ここで、該細胞が、ステップ（ａ）で投与される
免疫細胞集団に含まれる、および／または、それらの子孫である、コンセプト１～７およ
び１３～１７のいずれかに記載の方法。
１９．免疫細胞集団が、ＣＡＲ－Ｔ細胞、および／または、操作されたＴ細胞受容体（Ｔ
ＣＲ）を発現するＴ細胞、および／または、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、コンセ
プト１～１８のいずれかに記載の方法。
２０．免疫細胞集団が、操作された自家の、または同種の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、Ｎ
Ｋ細胞および／またはＴＩＬを含む、コンセプト１～１９のいずれかに記載の方法。
２１．Ｔ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＴｈ１７細胞である、コンセプト１９または２０
に記載の方法。
２２．ステップ（ｂ）が、微生物叢において、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、Ｂ ｆ
ｒａｇａｌｉｓおよび／またはＢ ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ）の割合を増加させ
る、コンセプト１～２１のいずれかに記載の方法。
２３．ステップ（ｂ）が、微生物叢において、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、Ｂ ｆ
ｒａｇａｌｉｓおよび／またはＢ ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ） の割合を減少さ
せる、コンセプト１～２１のいずれかに記載の方法。
２４．ステップ（ｂ）が、微生物叢において、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅ
ｔｅｓ）の、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）に対する割合を増加させる
、コンセプト１～２３のいずれかに記載の方法。
２５．ステップ（ｂ）が、微生物叢において、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅ
ｔｅｓ）の、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）に対する割合を減少させる
、コンセプト１～２３のいずれかに記載の方法。
２６．ステップ（ｂ）が、微生物叢において、１つ以上のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種また
は株（例えば、各種は、クラスターＩＶまたはＸＩＶａのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種であ
る）の割合を低減させる、コンセプト１～２５のいずれかに記載の方法。
２７．ステップ（ｂ）が、微生物叢において、１つ以上のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種また
は株（例えば、各種は、クラスターＩＶまたはＸＩＶａのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種であ
る）の割合を増加させる、コンセプト１～２５のいずれかに記載の方法。
２８．ステップ（ｂ）が、微生物叢において、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば
、Ｂ ｂｉｆｉｄｕｍ）の割合を低減させる、コンセプト１～２７のいずれかに記載の方
法。
２９．ステップ（ｂ）が、微生物叢において、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば
、Ｂ ｂｉｆｉｄｕｍ）の割合を増加させる、コンセプト１～２７のいずれかに記載の方
法。
３０．ステップ（ｂ）が、患者の微生物叢において、第１の細胞の相対的割合または前記
亜集団を変更し、それにより、患者において免疫細胞療法を調節する変化した微生物叢を
産生することを含み、ここで、該亜集団は前記第１の種または株の宿主細胞を含む方法で
あって、
ａ．微生物叢を、宿主改変（ＨＭ）ｃｒＲＮＡをコードする操作された核酸配列の複数の
コピーと組み合わせること、および
ｂ．宿主細胞においてＨＭ－ｃｒＲＮＡを発現させること
を含む方法であって、
ここで、操作された各核酸配列は、個々の宿主細胞においてＣａｓヌクレアーゼと作動可
能であり、ＨＭ－ＣＲｌＳＰＲ／Ｃａｓシステムを形成し、かつ、該操作された配列が、
(iii)ＨＭ－ｃｒＲＮＡをコードする、スペーサーおよびリピート配列;
(iv)宿主細胞の標的配列にハイブリダイズしてＣａｓヌクレアーゼを宿主細胞の標的配列
に誘導することができる配列を含む、ＨＭ－ｃｒＲＮＡ;
を含み、場合により、ＨＭ－システムは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ
配列を発現するＤＮＡ配列を含み、
それにより、ＨＭ－ｃｒＲＮＡは宿主細胞において宿主標的配列のＣａｓ改変を誘導し、
、それにより、宿主細胞が死滅するか、宿主細胞集団の増殖が低下し、それにより、微生
物叢における該亜集団の割合を低減させる、コンセプト１～２９のいずれかに記載の方法
。
３１．標的ヌクレオチド配列の改変のために、宿主細胞の内因性Ｃａｓヌクレアーゼを用
いることを含む、コンセプト３０の方法。
３２．前記Ｃａｓ改変を受けていない宿主細胞のコントロール集団の増殖と比較して、少
なくとも５倍、宿主細胞集団の増殖を低下させることを含む、コンセプト３０または３１
に記載の方法。
３３．腸表面上の宿主細胞集団の増殖を阻害することを含む、コンセプト３０～３２のい
ずれかに記載の方法。
３４．微生物叢が、第２の細菌種または株、または、古細菌種または株の細胞を含み、第
２の種または株が、宿主細胞の種または株の１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ
配列に少なくとも８０％同一である１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を有
し、微生物叢における第２の細胞の増殖が前記ＨＭ－システムにより阻害されない、コン
セプト３０～３３のいずれかに記載の方法。
３５．第２の種または株が、ヒト腸内片利共生種または株、および／または、ヒト腸内プ
ロバイオティック種または株である、コンセプト３４に記載の方法。
３６．第２の種または株が、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）（例えば
、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）であり、場合により、宿主細胞が、グラム陽性細菌細胞であ
る、コンセプト３４または３５に記載の方法。
３７．第１の細胞が、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の細胞である、コ
ンセプト３０～３６のいずれかに記載の方法。
３８．各宿主細胞について、該システムが、（ｉ）～（ｉｖ）に記載の成分を含む、コン
セプト３０～３７のいずれかに記載の方法：
（ｉ）Ｃａｓヌクレアーゼをコードする、少なくとも１つの核酸配列；
（ｉｉ）ＨＭ－ｃｒＲＮＡをコードするスペーサー配列およびリピートを含む操作された
ＨＭ－ＣＲＩＳＰＲアレイであって、該ＨＭ－ｃｒＲＮＡは、宿主細胞の標的配列にハイ
ブリダイズして前記Ｃａｓを宿主細胞における標的に誘導して標的配列を改変する配列を
含む；
（ｉｉｉ）任意のｔｒａｃｒＲＮＡ配列、または、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するＤＮ
Ａ配列；
（ｉｖ）ここで、本システムの前記成分は、宿主細胞と宿主細胞を形質転換する少なくと
も１つの核酸ベクターとの間で分割され、それによってＨＭ－ｃｒＲＮＡはＣａｓを標的
に誘導して、宿主細胞における宿主標的配列を改変する；および
ここで、該標的配列はＣａｓにより改変され、それにより、宿主細胞が死滅するか、宿主
細胞の増殖が低下する；
本方法は、（ｉｖ）のベクターを宿主細胞へ導入することおよび宿主細胞において前記Ｈ
Ｍ－ｃｒＲＮＡを発現することを含み、ＨＭ－ｃＲＮＡが宿主細胞の標的配列にハイブリ
ダイズしてＣａｓを宿主細胞における標的に誘導して標的配列を改変することを可能にし
、それにより、宿主細胞が死滅するか、宿主細胞の増殖が低下し、それにより、微生物叢
における前記亜集団の割合を変更する。
３９．成分（ｉ）が、各宿主細胞に対して内因性である、コンセプト３８に記載の方法。
４０．各ベクターが、ウイルスまたはファージである、コンセプト３８または３９に記載
の方法。
４１．各標的配列が、隣接するＮＮＡＧＡＡＷまたはＮＧＧＮＧのプロトスペーサー隣接
モチーフ（ＰＡＭ）である、コンセプト３０～４０のいずれかに記載の方法。
４２．代わりに、ＨＭ－ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが、シングルガイドＲＮＡ（
ｇＲＮＡ）に含まれ、前記ｇＲＮＡを宿主細胞に導入すること、または、宿主細胞におい
て該ｇＲＮＡを発現することを含む、コンセプト３０～４１のいずれかに記載の方法。
４３．微生物叢が、第２の細菌または古細菌の種を含み、第１および第２の種はそれぞれ
同じ門の種（例えば、共にファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）種）であり、
第２の細菌の増殖はＨＭ－システムによって阻害されない；あるいは、微生物叢が、第２
の細菌または古細菌の株を含み、第１および第２の細菌または古細菌はそれぞれ同じ種の
株であり、第２の細菌または古細菌の増殖はＨＭ－システムによって阻害されない、コン
セプト３０～３５および３７～４２のいずれかに記載の方法。
４４．微生物叢が第２の細菌種を含み、第１および第２の種のぞれぞれが、グラム陽性種
であり、第２の細菌の増殖がＨＭ－システムによって阻害されない、コンセプト３０～４
３のいずれかに記載の方法。
４５．各標的配列が、宿主細胞の、抗生物質耐性遺伝子、病原性遺伝子または必須遺伝子
に含まれる、コンセプト３０～３３のいずれかに記載の方法。
４６．各第１の細胞が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｅ ｃｏｌｉ、Ｄ
ｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、ＶｉｂｒｉｏまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ細胞である、コ
ンセプト１～４５のいずれかに記載の方法。
４７．ステップ（ｂ）が、腸のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、Ｂ ｔｈｅｔａｉｏｔ
ａｍｉｃｒｏｎ）により患者のパネート細胞を刺激することを含み、ステップ（ｂ）によ
り産生された変化した微生物叢が、ステップ（ｂ）より前の微生物叢と比較して、割合が
増加したＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓである第１の細菌を含み、それにより、パネート細胞が
刺激され、細胞療法が調節される、コンセプト１～４６のいずれかに記載の方法。
４８．ステップ（ｂ）が、患者において腸のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、Ｂ ｔｈ
ｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ）に対する免疫応答を発達させることを含み、ステップ（ｂ
）により産生された変化した微生物叢が、ステップ（ｂ）より前の微生物叢と比較して、
割合が増加したＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓである第１の細菌を含み、それにより、細胞療法
が調節される、コンセプト１～４７のいずれかに記載の方法。
４９．ステップ（ｂ）が、患者の微生物叢において、第１の細胞の相対的割合または前記
亜集団を変更し、それにより、患者において免疫細胞療法を調節する変更された腸内微生
物叢を産生することを含み、ステップ（ｂ）が、亜集団に含まれる第１の細胞のゲノムを
標的とする誘導型ヌクレアーゼを用いることにより、前記亜集団の第１の細胞を死滅させ
るか、前記亜集団の増殖を阻害することを含む、コンセプト１～４８のいずれかに記載の
方法。
５０．コンセプト１～４９のいずれかに記載の方法を用いて、患者において疾病または症
状を治療するために患者へ投与するための、細菌または古細菌の移植片であって、場合に
より前記第１の種の細胞を含む移植片。
５１．コンセプト１～４９のいずれかに記載の方法を用いて、患者において疾病または症
状を治療するために患者へ投与するための、コンセプト３０～４５のいずれかに記載され
る、ＨＭ－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＨＭ－アレイまたはＨＭ－ｃｒＲＮＡ。
５２．さらに、コンセプト５０または５１の移植片、システム、アレイまたはｃｒＲＮＡ
を含み、場合により免疫細胞がＣＡＲ－Ｔ細胞、操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発
現するＴ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）およびＮＫ細胞から選択される、患者の養子
細胞療法のための免疫細胞のエクスビボ集団を含むキット。
【0294】
局面
１．患者において疾病または症状を治療または予防するための、患者の養子細胞療法の方
法における使用のための、免疫細胞のエクスビボ集団であって、該方法が、
ａ．該集団の細胞を患者に投与することを含む養子免疫細胞療法を患者において実行する
こと、ここで、該免疫細胞の投与は、患者において疾病または症状を処置することが可能
である；および
ｂ．腸内細菌の微生物叢ディスバイオシスを患者において引き起こし、それにより、該デ
ィスバイオシスが患者において免疫細胞療法を調節し、該疾病または症状が処置または予
防されること；
を含む、免疫細胞のエクスビボ集団。
２．患者において疾病または症状を治療または予防するための、以下を含む、患者の養子
細胞療法の方法における使用のための、免疫細胞のエクスビボ集団。
ａ．該集団の細胞を患者に投与することを含む養子免疫細胞療法を患者において実行する
こと、ここで、該免疫細胞の投与は、患者において疾病または症状を処置することが可能
である；および
ｂ．患者の腸内微生物叢において、第１の細菌種もしくは株、または、古細菌種もしくは
株の細胞の亜集団の相対的割合を変更し、それにより、患者において免疫細胞療法を調節
する変更された腸内微生物叢を産生すること。
３．ステップ（ｂ）が、抗細菌剤または抗古細菌剤(例えば、誘導型ヌクレアーゼ)を、患
者の微生物叢に、前記免疫細胞集団と同時に、または連続して投与することにより、第１
の細胞の亜集団を標的化することにより実行され、それにより、第１の細胞が死滅するか
、該亜集団の増殖が低下し、それにより、患者の腸内微生物叢における前記亜集団の割合
を低減させる、局面２の免疫細胞集団。
４．細胞療法が養子Ｔ細胞療法である、局面１～３のいずれかに記載の免疫細胞集団。
５．ステップ（ａ）において、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｈ１細胞およびＴｈ
１７細胞からなる群から選択される細胞が患者に投与される、局面４の免疫細胞集団。
６．患者においてＴｈ１７細胞が調節される、局面４または５に記載の免疫細胞集団。
７．患者においてＴｒｅｇ細胞が調節される、局面４、５または６に記載の免疫細胞集団
。
８．細胞療法が増強される、局面１～７のいずれかに記載の免疫細胞集団。
９．患者においてＴｈ１７細胞がアップレギュレートされ、および／または、患者におい
てＴｒｅｇ細胞がダウンレギュレートされる、局面１～８のいずれかに記載の免疫細胞集
団。
１０．患者においてＣＤ４＋Ｔ細胞がアップレギュレートされる、局面１～９のいずれか
に記載の免疫細胞集団。
１１．患者においてＣＤ８＋Ｔ細胞がアップレギュレートされる、局面１～１０のいずれ
かに記載の免疫細胞集団。
１２．患者においてセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞
（ＴＥＭ）、ステムセルメモリー細胞（ＴＳＣＭ）およびエフェクター細胞（Ｔｅｆｆ）
の１つ以上がアップレギュレートされ、ここで、該細胞が、ステップ（ａ）で投与される
る免疫細胞集団に含まれる、および／または、それらの子孫である、局面１～１１のいず
れかに記載の免疫細胞集団。
１３．細胞療法が低減される、局面１～７のいずれかに記載の免疫細胞集団。
１４．該方法が、患者においてサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）のリスクを低減または
予防する、局面１３に記載の免疫細胞集団。
１５．患者においてＴｈ１７細胞がダウンレギュレートされ、および／または、患者にお
いてＴｒｅｇ細胞がアップレギュレートされる、局面１～７、１３および１４のいずれか
に記載の免疫細胞集団。
１６．患者においてＣＤ４＋Ｔ細胞がダウンレギュレートされる、局面１～７および１３
～１５のいずれかに記載の免疫細胞集団。
１７．患者においてＣＤ８＋Ｔ細胞がダウンレギュレートされる、局面１～７および１３
～１６のいずれかに記載の免疫細胞集団。
１８．患者においてセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞
（ＴＥＭ）、ステムセルメモリー細胞（ＴＳＣＭ）およびエフェクター細胞（Ｔｅｆｆ）
の１つ以上がダウンレギュレートされ、ここで、該細胞が、ステップ（ａ）で投与される
免疫細胞集団に含まれる、および／または、それらの子孫である、局面１～７および１３
～１７のいずれかに記載の免疫細胞集団。
１９．免疫細胞集団が、ＣＡＲ－Ｔ細胞および／または操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ
）を発現するＴ細胞および／または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、または、これら
から成る、局面１～１８のいずれかに記載の免疫細胞集団。
２０．免疫細胞集団が、操作された自家の、または同種の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、Ｎ
Ｋ細胞および／またはＴＩＬを含む、またはこれらから成る、局面１～１９のいずれかに
記載の免疫細胞集団。
２１．Ｔ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＴｈ１７細胞である、局面１９または２０に記載
の免疫細胞集団。
２２．ステップ（ｂ）が、腸内微生物叢において、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、Ｂ
ｆｒａｇａｌｉｓおよび／またはＢ ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ）の割合を増加
させる、局面１～２１のいずれかに記載の免疫細胞集団。
２３．ステップ（ｂ）が、腸内微生物叢において、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、Ｂ
ｆｒａｇａｌｉｓおよび／またはＢ ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ）の割合を減少
させる、局面１～２１のいずれかに記載の免疫細胞集団。
２４．ステップ（ｂ）が、腸内微生物叢において、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉ
ｄｅｔｅｓ）の、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）に対する割合を増加さ
せる、局面１～２３のいずれかに記載の免疫細胞集団。
２５．ステップ（ｂ）が、腸内微生物叢において、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉ
ｄｅｔｅｓ）の、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）に対する割合を減少さ
せる、局面１～２３のいずれかに記載の免疫細胞集団。
２６．ステップ（ｂ）が、腸内微生物叢において、１つ以上のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種
または株（例えば、各種は、クラスターＩＶまたはＸＩＶａのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種
である）の割合を低減させる、局面１～２５のいずれかに記載の免疫細胞集団。
２７．ステップ（ｂ）が、腸内微生物叢において、１つ以上のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種
または株（例えば、各種は、クラスターＩＶまたはＸＩＶａのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種
である）の割合を増加させる、局面１～２５のいずれかに記載の免疫細胞集団。
２８．ステップ（ｂ）が、腸内微生物叢において、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例
えば、Ｂ ｂｉｆｉｄｕｍ）の割合を低減させる、局面１～２７のいずれかに記載の免疫
細胞集団。
２９．ステップ（ｂ）が、腸内微生物叢において、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例
えば、Ｂ ｂｉｆｉｄｕｍ）の割合を増加させる、局面１～２７のいずれかに記載の免疫
細胞集団。
３０．ステップ（ｂ）が、患者の微生物叢において、第１の細胞の相対的割合または前記
亜集団を変更し、それにより、患者において免疫細胞療法を調節する変化した微生物叢を
産生することを含み、ここで、該亜集団は前記第１の種または株の宿主細胞を含む方法で
あって、
ａ．微生物叢を、宿主改変（ＨＭ）ｃｒＲＮＡをコードする操作された核酸配列の複数の
コピーと組み合わせること、および
ｂ．宿主細胞においてＨＭ－ｃｒＲＮＡを発現させること
を含む方法であって、
ここで、操作された各核酸配列は、個々の宿主細胞においてＣａｓヌクレアーゼと作動可
能であり、ＨＭ－ＣＲｌＳＰＲ／Ｃａｓシステムを形成し、かつ、該操作された配列が、
(iii)ＨＭ－ｃｒＲＮＡをコードする、スペーサーおよびリピート配列;
(iv)宿主細胞の標的配列にハイブリダイズしてＣａｓヌクレアーゼを宿主細胞の標的配列
に誘導することができる配列を含む、ＨＭ－ｃｒＲＮＡ;
を含み、場合により、ＨＭ－システムは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ
配列を発現するＤＮＡ配列を含み、
それにより、ＨＭ－ｃｒＲＮＡは宿主細胞において宿主標的配列のＣａｓ改変を誘導し、
、それにより、宿主細胞が死滅するか、宿主細胞集団の増殖が低下し、,それにより、微
生物叢における該亜集団の割合を低減させる、局面１～２９のいずれかに記載の免疫細胞
集団。
３１．標的ヌクレオチド配列の改変のために、宿主細胞の内因性Ｃａｓヌクレアーゼを用
いることを含む、局面３０の免疫細胞集団。
３２．前記Ｃａｓ改変を受けていない宿主細胞のコントロール集団の増殖と比較して、少
なくとも５倍、宿主細胞集団の増殖を低下させることを含む、局面３０または３１に記載
の免疫細胞集団。
３３．腸表面上の宿主細胞集団の増殖を阻害することを含む、局面３０～３２のいずれか
に記載の免疫細胞集団。
３４．微生物叢が、第２の細菌種または株、または、古細菌種または株の細胞を含み、第
２の種または株が、宿主細胞の種または株の１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ
配列に少なくとも８０％同一である１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を有
し、微生物叢における第２の細胞の増殖が前記ＨＭ－システムにより阻害されない、局面
３０～３３のいずれかに記載の免疫細胞集団。
３５．第２の種または株が、ヒト腸内片利共生種または株、および／または、ヒト腸内プ
ロバイオティック種または株である、局面３４に記載の免疫細胞集団。
３６．第２の種または株が、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）（例えば
、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）であり、場合により、宿主細胞が、グラム陽性細菌細胞であ
る、局面３４または３５に記載の免疫細胞集団。
３７．第１の細胞が、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の細胞である、局
面３０～３６のいずれかに記載の免疫細胞集団。
３８．各宿主細胞について、該システムが、（ｉ）～（ｉｖ）に記載の成分を含む、局面
３０～３７のいずれかに記載の免疫細胞集団：
（ｉ）Ｃａｓヌクレアーゼをコードする、少なくとも１つの核酸配列；
（ｉｉ）ＨＭ－ｃｒＲＮＡをコードするスペーサー配列およびリピートを含む操作された
ＨＭ－ＣＲＩＳＰＲアレイであって、該ＨＭ－ｃｒＲＮＡは、宿主細胞の標的配列にハイ
ブリダイズして前記Ｃａｓを宿主細胞における標的に誘導して標的配列を改変する配列を
含む；
（ｉｉｉ）任意のｔｒａｃｒＲＮＡ配列、または、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するＤＮ
Ａ配列；
（ｉｖ）ここで、本システムの前記成分は、宿主細胞と宿主細胞を形質転換する少なくと
も１つの核酸ベクターとの間で分割され、それによってＨＭ－ｃｒＲＮＡはＣａｓを標的
に誘導して、宿主細胞における宿主標的配列を改変する；および
ここで、該標的配列はＣａｓにより改変され、それにより、宿主細胞が死滅するか、宿主
細胞の増殖が低下する；
本方法は、（ｉｖ）のベクターを宿主細胞へ導入することおよび宿主細胞において前記Ｈ
Ｍ－ｃｒＲＮＡを発現することを含み、ＨＭ－ｃＲＮＡが宿主細胞の標的配列にハイブリ
ダイズしてＣａｓを宿主細胞における標的に誘導して標的配列を改変することを可能にし
、それにより、宿主細胞が死滅するか、宿主細胞の増殖が低下し、それにより、微生物叢
における前記亜集団の割合を変更する。
３９．成分（ｉ）が、各宿主細胞に対して内因性である、局面３８に記載の免疫細胞集団
。
４０．各ベクターが、ウイルスまたはファージである、局面３８または３９に記載の免疫
細胞集団。
４１．各標的配列が、隣接するＮＮＡＧＡＡＷまたはＮＧＧＮＧのプロトスペーサー隣接
モチーフ（ＰＡＭ）である、局面３０～４０のいずれかに記載の免疫細胞集団。
４２．代わりに、ＨＭ－ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが、シングルガイドＲＮＡ（
ｇＲＮＡ）に含まれ、本方法が、前記ｇＲＮＡを宿主細胞に導入すること、または、宿主
細胞において該ｇＲＮＡを発現することを含む、局面３０～４１のいずれかに記載の免疫
細胞集団。
４３．微生物叢が、第２の細菌または古細菌の種を含み、第１および第２の種はそれぞれ
同じ門の種（例えば、共にファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）種）であり、
第２の細菌の増殖はＨＭ－システムによって阻害されない；あるいは、微生物叢が、第２
の細菌または古細菌の株を含み、第１および第２の細菌または古細菌はそれぞれ同じ種の
株であり、第２の細菌または古細菌の増殖はＨＭ－システムによって阻害されない、局面
３０～３５および３７～４２のいずれかに記載の免疫細胞集団。
４４．微生物叢が第２の細菌種を含み、第１および第２の種のぞれぞれが、グラム陽性種
であり、第２の細菌の増殖がＨＭ－システムによって阻害されない、局面３０～４３のい
ずれかに記載の免疫細胞集団。
４５．各標的配列が、宿主細胞の、抗生物質耐性遺伝子、病原性遺伝子または必須遺伝子
に含まれる、局面３０～４４のいずれかに記載の免疫細胞集団。
４６．各第１の細胞が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｅ ｃｏｌｉ、Ｄ
ｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、ＶｉｂｒｉｏまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ細胞である、局
面１～４５のいずれかに記載の方法。
４７．ステップ（ｂ）が、腸のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、Ｂ ｔｈｅｔａｉｏｔ
ａｍｉｃｒｏｎ）により患者のパネート細胞を刺激することを含み、ステップ（ｂ）によ
り産生された変化した微生物叢が、ステップ（ｂ）より前の微生物叢と比較して、割合が
増加したＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓである第１の細菌を含み、それにより、パネート細胞が
刺激され、細胞療法が調節される、局面１～４６のいずれかに記載の免疫細胞集団。
４８．ステップ（ｂ）が、患者において腸のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、Ｂ ｔｈ
ｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ）に対する免疫応答を発達させることを含み、ステップ（ｂ
）により産生された変化した微生物叢が、ステップ（ｂ）より前の微生物叢と比較して、
割合が増加したＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓである第１の細菌を含み、それにより、細胞療法
が調節される、局面１～４７のいずれかに記載の免疫細胞集団。
４９．ステップ（ｂ）が、患者の腸内微生物叢において、第１の細胞の相対的割合または
前記亜集団を変更し、それにより、患者において免疫細胞療法を調節する変更された腸内
微生物叢を産生することを含み、ステップ（ｂ）が、亜集団に含まれる第１の細胞のゲノ
ムを標的とする誘導型ヌクレアーゼを用いることにより、前記亜集団の第１の細胞を死滅
させるか、前記亜集団の増殖を阻害することを含む、局面１～４８のいずれかに記載の免
疫細胞集団。
５０．局面１～４９のいずれかに記載の方法を用いて、患者において疾病または症状を治
療するために患者へ投与するための、細菌または古細菌の移植片であって、場合により前
記第１の種の細胞を含む移植片。
５１．局面１～４９のいずれかに記載の方法を用いて、患者において疾病または症状を治
療するために患者へ投与するための、局面３０～４５のいずれかに記載される、ＨＭ－Ｃ
ＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＨＭ－アレイまたはＨＭ－ｃｒＲＮＡ。
５２．さらに、局面５０または５１の移植片、システム、アレイまたはｃｒＲＮＡを含み
、場合により免疫細胞がＣＡＲ－Ｔ細胞、操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する
Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）およびＮＫ細胞から選択される、前記疾病または症
状を処置するための患者の養子細胞療法のための、局面１～４９のいずれかに記載の、免
疫細胞のエクスビボ集団を含むキット。
１．患者において疾病または症状を治療または予防するための、患者の養子細胞療法の方
法における使用のための、免疫細胞のエクスビボ集団であって、該方法が、
ａ．該集団の細胞を患者に投与することを含む養子免疫細胞療法を患者において実行する
こと、ここで、該免疫細胞の投与は、患者において疾病または症状を処置することが可能
である；および
ｂ．腸内細菌の微生物叢ディスバイオシスを患者において引き起こし、それにより、該デ
ィスバイオシスが患者において免疫細胞療法を調節し、該疾病または症状が処置または予
防されること；
を含む、免疫細胞のエクスビボ集団。
２．患者において疾病または症状を治療または予防するための、以下を含む、患者の養子
細胞療法の方法における使用のための、免疫細胞のエクスビボ集団。
ａ．該集団の細胞を患者に投与することを含む養子免疫細胞療法を患者において実行する
こと、ここで、該免疫細胞の投与は、患者において疾病または症状を処置することが可能
である；および
ｂ．患者の腸内微生物叢において、第１の細菌種もしくは株、または、古細菌種もしくは
株の細胞の亜集団の相対的割合を変更し、それにより、患者において免疫細胞療法を調節
する変更された腸内微生物叢を産生すること。
３．ステップ（ｂ）が、抗細菌剤または抗古細菌剤(例えば、誘導型ヌクレアーゼ)を、患
者の微生物叢に、前記免疫細胞集団と同時に、または連続して投与することにより、第１
の細胞の亜集団を標的化することにより実行され、それにより、第１の細胞が死滅するか
、該亜集団の増殖が低下し、それにより、患者の腸内微生物叢における前記亜集団の割合
を低減させる、局面２の免疫細胞集団。
４．細胞療法が養子Ｔ細胞療法である、局面１～３のいずれかに記載の免疫細胞集団。
５．ステップ（ａ）において、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｈ１細胞およびＴｈ
１７細胞からなる群から選択される細胞が患者に投与される、局面４の免疫細胞集団。
６．患者においてＴｈ１７細胞が調節される、局面４または５に記載の免疫細胞集団。
７．患者においてＴｒｅｇ細胞が調節される、局面４、５または６に記載の免疫細胞集団
。
８．細胞療法が増強される、局面１～７のいずれかに記載の免疫細胞集団。
９．患者においてＴｈ１７細胞がアップレギュレートされ、および／または、患者におい
てＴｒｅｇ細胞がダウンレギュレートされる、局面１～８のいずれかに記載の免疫細胞集
団。
１０．患者においてＣＤ４＋Ｔ細胞がアップレギュレートされる、局面１～９のいずれか
に記載の免疫細胞集団。
１１．患者においてＣＤ８＋Ｔ細胞がアップレギュレートされる、局面１～１０のいずれ
かに記載の免疫細胞集団。
１２．患者においてセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞
（ＴＥＭ）、ステムセルメモリー細胞（ＴＳＣＭ）およびエフェクター細胞（Ｔｅｆｆ）
の１つ以上がアップレギュレートされ、ここで、該細胞が、ステップ（ａ）で投与される
る免疫細胞集団に含まれる、および／または、それらの子孫である、局面１～１１のいず
れかに記載の免疫細胞集団。
１３．細胞療法が低減される、局面１～７のいずれかに記載の免疫細胞集団。
１４．該方法が、患者においてサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）のリスクを低減または
予防する、局面１３に記載の免疫細胞集団。
１５．患者においてＴｈ１７細胞がダウンレギュレートされ、および／または、患者にお
いてＴｒｅｇ細胞がアップレギュレートされる、局面１～７、１３および１４のいずれか
に記載の免疫細胞集団。
１６．患者においてＣＤ４＋Ｔ細胞がダウンレギュレートされる、局面１～７および１３
～１５のいずれかに記載の免疫細胞集団。
１７．患者においてＣＤ８＋Ｔ細胞がダウンレギュレートされる、局面１～７および１３
～１６のいずれかに記載の免疫細胞集団。
１８．患者においてセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞
（ＴＥＭ）、ステムセルメモリー細胞（ＴＳＣＭ）およびエフェクター細胞（Ｔｅｆｆ）
の１つ以上がダウンレギュレートされ、ここで、該細胞が、ステップ（ａ）で投与される
免疫細胞集団に含まれる、および／または、それらの子孫である、局面１～７および１３
～１７のいずれかに記載の免疫細胞集団。
１９．免疫細胞集団が、ＣＡＲ－Ｔ細胞および／または操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ
）を発現するＴ細胞および／または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、または、これら
から成る、局面１～１８のいずれかに記載の免疫細胞集団。
２０．免疫細胞集団が、操作された自家の、または同種の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、Ｎ
Ｋ細胞および／またはＴＩＬを含む、またはこれらから成る、局面１～１９のいずれかに
記載の免疫細胞集団。
２１．Ｔ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＴｈ１７細胞である、局面１９または２０に記載
の免疫細胞集団。
２２．ステップ（ｂ）が、腸内微生物叢において、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、Ｂ
ｆｒａｇａｌｉｓおよび／またはＢ ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ）の割合を増加
させる、局面１～２１のいずれかに記載の免疫細胞集団。
２３．ステップ（ｂ）が、腸内微生物叢において、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、Ｂ
ｆｒａｇａｌｉｓおよび／またはＢ ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ）の割合を減少
させる、局面１～２１のいずれかに記載の免疫細胞集団。
２４．ステップ（ｂ）が、腸内微生物叢において、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉ
ｄｅｔｅｓ）の、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）に対する割合を増加さ
せる、局面１～２３のいずれかに記載の免疫細胞集団。
２５．ステップ（ｂ）が、腸内微生物叢において、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉ
ｄｅｔｅｓ）の、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）に対する割合を減少さ
せる、局面１～２３のいずれかに記載の免疫細胞集団。
２６．ステップ（ｂ）が、腸内微生物叢において、１つ以上のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種
または株（例えば、各種は、クラスターＩＶまたはＸＩＶａのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種
である）の割合を低減させる、局面１～２５のいずれかに記載の免疫細胞集団。
２７．ステップ（ｂ）が、腸内微生物叢において、１つ以上のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種
または株（例えば、各種は、クラスターＩＶまたはＸＩＶａのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種
である）の割合を増加させる、局面１～２５のいずれかに記載の免疫細胞集団。
２８．ステップ（ｂ）が、腸内微生物叢において、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例
えば、Ｂ ｂｉｆｉｄｕｍ）の割合を低減させる、局面１～２７のいずれかに記載の免疫
細胞集団。
２９．ステップ（ｂ）が、腸内微生物叢において、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例
えば、Ｂ ｂｉｆｉｄｕｍ）の割合を増加させる、局面１～２７のいずれかに記載の免疫
細胞集団。
３０．ステップ（ｂ）が、患者の微生物叢において、第１の細胞の相対的割合または前記
亜集団を変更し、それにより、患者において免疫細胞療法を調節する変化した微生物叢を
産生することを含み、ここで、該亜集団は前記第１の種または株の宿主細胞を含む方法で
あって、
ａ．微生物叢を、宿主改変（ＨＭ）ｃｒＲＮＡをコードする操作された核酸配列の複数の
コピーと組み合わせること、および
ｂ．宿主細胞においてＨＭ－ｃｒＲＮＡを発現させること
を含む方法であって、
ここで、操作された各核酸配列は、個々の宿主細胞においてＣａｓヌクレアーゼと作動可
能であり、ＨＭ－ＣＲｌＳＰＲ／Ｃａｓシステムを形成し、かつ、該操作された配列が、
(iii)ＨＭ－ｃｒＲＮＡをコードする、スペーサーおよびリピート配列;
(iv)宿主細胞の標的配列にハイブリダイズしてＣａｓヌクレアーゼを宿主細胞の標的配列
に誘導することができる配列を含む、ＨＭ－ｃｒＲＮＡ;
を含み、場合により、ＨＭ－システムは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ
配列を発現するＤＮＡ配列を含み、
それにより、ＨＭ－ｃｒＲＮＡは宿主細胞において宿主標的配列のＣａｓ改変を誘導し、
、それにより、宿主細胞が死滅するか、宿主細胞集団の増殖が低下し、,それにより、微
生物叢における該亜集団の割合を低減させる、局面１～２９のいずれかに記載の免疫細胞
集団。
３１．標的ヌクレオチド配列の改変のために、宿主細胞の内因性Ｃａｓヌクレアーゼを用
いることを含む、局面３０の免疫細胞集団。
３２．前記Ｃａｓ改変を受けていない宿主細胞のコントロール集団の増殖と比較して、少
なくとも５倍、宿主細胞集団の増殖を低下させることを含む、局面３０または３１に記載
の免疫細胞集団。
３３．腸表面上の宿主細胞集団の増殖を阻害することを含む、局面３０～３２のいずれか
に記載の免疫細胞集団。
３４．微生物叢が、第２の細菌種または株、または、古細菌種または株の細胞を含み、第
２の種または株が、宿主細胞の種または株の１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ
配列に少なくとも８０％同一である１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を有
し、微生物叢における第２の細胞の増殖が前記ＨＭ－システムにより阻害されない、局面
３０～３３のいずれかに記載の免疫細胞集団。
３５．第２の種または株が、ヒト腸内片利共生種または株、および／または、ヒト腸内プ
ロバイオティック種または株である、局面３４に記載の免疫細胞集団。
３６．第２の種または株が、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）（例えば
、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）であり、場合により、宿主細胞が、グラム陽性細菌細胞であ
る、局面３４または３５に記載の免疫細胞集団。
３７．第１の細胞が、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の細胞である、局
面３０～３６のいずれかに記載の免疫細胞集団。
３８．各宿主細胞について、該システムが、（ｉ）～（ｉｖ）に記載の成分を含む、局面
３０～３７のいずれかに記載の免疫細胞集団：
（ｉ）Ｃａｓヌクレアーゼをコードする、少なくとも１つの核酸配列；
（ｉｉ）ＨＭ－ｃｒＲＮＡをコードするスペーサー配列およびリピートを含む操作された
ＨＭ－ＣＲＩＳＰＲアレイであって、該ＨＭ－ｃｒＲＮＡは、宿主細胞の標的配列にハイ
ブリダイズして前記Ｃａｓを宿主細胞における標的に誘導して標的配列を改変する配列を
含む；
（ｉｉｉ）任意のｔｒａｃｒＲＮＡ配列、または、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するＤＮ
Ａ配列；
（ｉｖ）ここで、本システムの前記成分は、宿主細胞と宿主細胞を形質転換する少なくと
も１つの核酸ベクターとの間で分割され、それによってＨＭ－ｃｒＲＮＡはＣａｓを標的
に誘導して、宿主細胞における宿主標的配列を改変する；および
ここで、該標的配列はＣａｓにより改変され、それにより、宿主細胞が死滅するか、宿主
細胞の増殖が低下する；
本方法は、（ｉｖ）のベクターを宿主細胞へ導入することおよび宿主細胞において前記Ｈ
Ｍ－ｃｒＲＮＡを発現することを含み、ＨＭ－ｃＲＮＡが宿主細胞の標的配列にハイブリ
ダイズしてＣａｓを宿主細胞における標的に誘導して標的配列を改変することを可能にし
、それにより、宿主細胞が死滅するか、宿主細胞の増殖が低下し、それにより、微生物叢
における前記亜集団の割合を変更する。
３９．成分（ｉ）が、各宿主細胞に対して内因性である、局面３８に記載の免疫細胞集団
。
４０．各ベクターが、ウイルスまたはファージである、局面３８または３９に記載の免疫
細胞集団。
４１．各標的配列が、隣接するＮＮＡＧＡＡＷまたはＮＧＧＮＧのプロトスペーサー隣接
モチーフ（ＰＡＭ）である、局面３０～４０のいずれかに記載の免疫細胞集団。
４２．代わりに、ＨＭ－ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが、シングルガイドＲＮＡ（
ｇＲＮＡ）に含まれ、本方法が、前記ｇＲＮＡを宿主細胞に導入すること、または、宿主
細胞において該ｇＲＮＡを発現することを含む、局面３０～４１のいずれかに記載の免疫
細胞集団。
４３．微生物叢が、第２の細菌または古細菌の種を含み、第１および第２の種はそれぞれ
同じ門の種（例えば、共にファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）種）であり、
第２の細菌の増殖はＨＭ－システムによって阻害されない；あるいは、微生物叢が、第２
の細菌または古細菌の株を含み、第１および第２の細菌または古細菌はそれぞれ同じ種の
株であり、第２の細菌または古細菌の増殖はＨＭ－システムによって阻害されない、局面
３０～３５および３７～４２のいずれかに記載の免疫細胞集団。
４４．微生物叢が第２の細菌種を含み、第１および第２の種のぞれぞれが、グラム陽性種
であり、第２の細菌の増殖がＨＭ－システムによって阻害されない、局面３０～４３のい
ずれかに記載の免疫細胞集団。
４５．各標的配列が、宿主細胞の、抗生物質耐性遺伝子、病原性遺伝子または必須遺伝子
に含まれる、局面３０～４４のいずれかに記載の免疫細胞集団。
４６．各第１の細胞が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｅ ｃｏｌｉ、Ｄ
ｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、ＶｉｂｒｉｏまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ細胞である、局
面１～４５のいずれかに記載の方法。
４７．ステップ（ｂ）が、腸のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、Ｂ ｔｈｅｔａｉｏｔ
ａｍｉｃｒｏｎ）により患者のパネート細胞を刺激することを含み、ステップ（ｂ）によ
り産生された変化した微生物叢が、ステップ（ｂ）より前の微生物叢と比較して、割合が
増加したＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓである第１の細菌を含み、それにより、パネート細胞が
刺激され、細胞療法が調節される、局面１～４６のいずれかに記載の免疫細胞集団。
４８．ステップ（ｂ）が、患者において腸のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、Ｂ ｔｈ
ｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ）に対する免疫応答を発達させることを含み、ステップ（ｂ
）により産生された変化した微生物叢が、ステップ（ｂ）より前の微生物叢と比較して、
割合が増加したＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓである第１の細菌を含み、それにより、細胞療法
が調節される、局面１～４７のいずれかに記載の免疫細胞集団。
４９．ステップ（ｂ）が、患者の腸内微生物叢において、第１の細胞の相対的割合または
前記亜集団を変更し、それにより、患者において免疫細胞療法を調節する変更された腸内
微生物叢を産生することを含み、ステップ（ｂ）が、亜集団に含まれる第１の細胞のゲノ
ムを標的とする誘導型ヌクレアーゼを用いることにより、前記亜集団の第１の細胞を死滅
させるか、前記亜集団の増殖を阻害することを含む、局面１～４８のいずれかに記載の免
疫細胞集団。
５０．局面１～４９のいずれかに記載の方法を用いて、患者において疾病または症状を治
療するために患者へ投与するための、細菌または古細菌の移植片であって、場合により前
記第１の種の細胞を含む移植片。
５１．局面１～４９のいずれかに記載の方法を用いて、患者において疾病または症状を治
療するために患者へ投与するための、局面３０～４５のいずれかに記載される、ＨＭ－Ｃ
ＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＨＭ－アレイまたはＨＭ－ｃｒＲＮＡ。
５２．さらに、局面５０または５１の移植片、システム、アレイまたはｃｒＲＮＡを含み
、場合により免疫細胞がＣＡＲ－Ｔ細胞、操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する
Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）およびＮＫ細胞から選択される、前記疾病または症
状を処置するための患者の養子細胞療法のための、局面１～４９のいずれかに記載の、免
疫細胞のエクスビボ集団を含むキット。
【0295】
場合により、宿主細胞、第１の細胞、第２の細胞、または混合細菌集団は、ヒトまたは
非ヒト動物対象に含まれ、例えば、該集団は、腸内の微生物叢、皮膚の微生物叢、口腔の
微生物叢、喉の微生物叢、毛髪の微生物叢、腋窩の微生物叢、膣の微生物叢、直腸の微生
物叢、肛門の微生物叢、眼の微生物叢、鼻の微生物叢、舌の微生物叢、肺の微生物叢、肝
臓の微生物叢、腎臓の微生物叢、生殖器の微生物叢、陰茎の微生物叢、陰嚢の微生物叢、
乳腺の微生物叢、耳の微生物叢、尿道の微生物叢、口唇の微生物叢、臓器の微生物叢また
は歯の微生物叢に含まれる。場合により、混合細菌集団は、植物に（例えば、タバコ、農
作物、果樹、野菜、またはタバコに、例えば、植物の表面上に、または、植物内に含有さ
れて）または環境に（例えば、土壌または水中または水路または水溶液（ａｃｑｕｅｏｕ
ｓ ｌｉｑｕｉｄ）に）含まれる。
非ヒト動物対象に含まれ、例えば、該集団は、腸内の微生物叢、皮膚の微生物叢、口腔の
微生物叢、喉の微生物叢、毛髪の微生物叢、腋窩の微生物叢、膣の微生物叢、直腸の微生
物叢、肛門の微生物叢、眼の微生物叢、鼻の微生物叢、舌の微生物叢、肺の微生物叢、肝
臓の微生物叢、腎臓の微生物叢、生殖器の微生物叢、陰茎の微生物叢、陰嚢の微生物叢、
乳腺の微生物叢、耳の微生物叢、尿道の微生物叢、口唇の微生物叢、臓器の微生物叢また
は歯の微生物叢に含まれる。場合により、混合細菌集団は、植物に（例えば、タバコ、農
作物、果樹、野菜、またはタバコに、例えば、植物の表面上に、または、植物内に含有さ
れて）または環境に（例えば、土壌または水中または水路または水溶液（ａｃｑｕｅｏｕ
ｓ ｌｉｑｕｉｄ）に）含まれる。
【0296】
場合により、ヒトまたは動物の対象または患者の、疾病または症状は、以下から選択さ
れる。
（ａ）神経変性の疾病または症状；
（ｂ）脳の疾病または症状；
（ｃ）中枢神経系（ＣＮＳ）の疾病または症状；
（ｄ）記憶喪失または記憶障害；
（ｅ）心臓または循環器の疾病または症状、例えば、心臓発作、脳卒中または心房細動；
（ｆ）肝臓の疾病または症状；
（ｇ）腎臓の疾病または症状、例えば、慢性腎臓病（ＣＫＤ）；
（ｈ）膵臓の疾病または症状；
（ｉ）肺の疾病または症状、例えば、嚢胞性線維症またはＣＯＰＤ；
（ｊ）胃腸の疾病または症状；
（ｋ）喉または口腔の疾病または症状；
（ｌ）眼の疾病または症状；
（ｍ）生殖器の疾病または症状、例えば、陰唇、陰茎または陰嚢の疾病または症状；
（ｎ）性行為感染性疾病または症状、例えば、淋病、ＨＩＶ感染症、梅毒またはクラミジ
ア感染症；
（ｏ）耳の疾病または症状；
（ｐ）皮膚の疾病または症状；
（ｑ）心臓の疾病または症状；
（ｒ）鼻の疾病または症状
（ｓ）血液性の疾病または症状、例えば、貧血、例えば、慢性病の貧血またはがん；
（ｔ）ウイルス感染症；
（ｕ）病原性細菌感染症；
（ｖ）がん；
（ｗ）自己免疫性の疾病または症状、例えば、ＳＬＥ；
（ｘ）炎症性の疾病または症状、例えば、関節リウマチ、乾癬、湿疹、喘息、潰瘍性大腸
炎、大腸炎、クローン病またはＩＢＤ；
（ｙ）自閉症；
（ｚ）ＡＤＨＤ；
（ａａ）双極性障害；
（ｂｂ）ＡＬＳ［筋萎縮性側索硬化症］；
（ｃｃ）骨関節炎；
（ｄｄ）先天性または発達の欠損または症状；
（ｅｅ）流産；
（ｆｆ）血液凝固の症状；
（ｇｇ）気管支炎；
（ｈｈ）ドライ型またはウェット型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）；
（ｉｉ）血管新生（例えば、腫瘍の、または眼の中の）；
（ｊｊ）かぜ；
（ｋｋ）てんかん；
（ｌｌ）線維症、例えば、肝臓または肺の線維症；
（ｍｍ）真菌症または症状、例えば、鵞口瘡；
（ｎｎ）代謝性の疾病または症状、例えば、肥満症、食欲不振、糖尿病、Ｉ型またはＩＩ
型糖尿病．
（ｏｏ）潰瘍、例えば、胃潰瘍または皮膚潰瘍；
（ｐｐ）皮膚乾燥；
（ｑｑ）シェーグレン症候群；
（ｒｒサイトカインストーム；
（ｓｓ）難聴、聴覚消失または聴覚障害；
（ｔｔ）代謝が遅いまたは速い（すなわち、対象の体重、性別および年齢の平均よりも遅
いまたは速い）；
（ｕｕ）受胎障害、例えば、不妊症または低受胎能；
（ｖｖ）黄疸；
（ｗｗ）発疹；
（ｘｘ）川崎病；
（ｙｙ）ライム病；
（ｚｚ）アレルギー、例えば、ナッツ、草、花粉、イエダニ、ネコまたはイヌの毛または
フケのアレルギー；
（ａａａ）マラリア、腸チフス熱、結核またはコレラ；
（ｂｂｂ）鬱；
（ｃｃｃ）精神障害；
（ｄｄｄ）小頭症；
（ｅｅｅ）栄養失調；
（ｆｆｆ）結膜炎；
（ｇｇｇ）肺炎；
（ｈｈｈ）肺塞栓症；
（ｉｉｉ）肺高血圧症；
（ｊｊｊ）骨の疾患；
（ｋｋｋ）敗血症または敗血症性ショック；
（ｌｌｌ）副鼻腔炎（Ｓｉｎｕｓｉｔｕｓ）；
（ｍｍｍ）ストレス（例えば、職業ストレス）；
（ｎｎｎ）地中海貧血症、貧血、フォン・ヴィルブランド病、または血友病；
（ｏｏｏ）帯状疱疹または口唇ヘルペス；
（ｐｐｐ）月経；
（ｑｑｑ）精子数減少
れる。
（ａ）神経変性の疾病または症状；
（ｂ）脳の疾病または症状；
（ｃ）中枢神経系（ＣＮＳ）の疾病または症状；
（ｄ）記憶喪失または記憶障害；
（ｅ）心臓または循環器の疾病または症状、例えば、心臓発作、脳卒中または心房細動；
（ｆ）肝臓の疾病または症状；
（ｇ）腎臓の疾病または症状、例えば、慢性腎臓病（ＣＫＤ）；
（ｈ）膵臓の疾病または症状；
（ｉ）肺の疾病または症状、例えば、嚢胞性線維症またはＣＯＰＤ；
（ｊ）胃腸の疾病または症状；
（ｋ）喉または口腔の疾病または症状；
（ｌ）眼の疾病または症状；
（ｍ）生殖器の疾病または症状、例えば、陰唇、陰茎または陰嚢の疾病または症状；
（ｎ）性行為感染性疾病または症状、例えば、淋病、ＨＩＶ感染症、梅毒またはクラミジ
ア感染症；
（ｏ）耳の疾病または症状；
（ｐ）皮膚の疾病または症状；
（ｑ）心臓の疾病または症状；
（ｒ）鼻の疾病または症状
（ｓ）血液性の疾病または症状、例えば、貧血、例えば、慢性病の貧血またはがん；
（ｔ）ウイルス感染症；
（ｕ）病原性細菌感染症；
（ｖ）がん；
（ｗ）自己免疫性の疾病または症状、例えば、ＳＬＥ；
（ｘ）炎症性の疾病または症状、例えば、関節リウマチ、乾癬、湿疹、喘息、潰瘍性大腸
炎、大腸炎、クローン病またはＩＢＤ；
（ｙ）自閉症；
（ｚ）ＡＤＨＤ；
（ａａ）双極性障害；
（ｂｂ）ＡＬＳ［筋萎縮性側索硬化症］；
（ｃｃ）骨関節炎；
（ｄｄ）先天性または発達の欠損または症状；
（ｅｅ）流産；
（ｆｆ）血液凝固の症状；
（ｇｇ）気管支炎；
（ｈｈ）ドライ型またはウェット型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）；
（ｉｉ）血管新生（例えば、腫瘍の、または眼の中の）；
（ｊｊ）かぜ；
（ｋｋ）てんかん；
（ｌｌ）線維症、例えば、肝臓または肺の線維症；
（ｍｍ）真菌症または症状、例えば、鵞口瘡；
（ｎｎ）代謝性の疾病または症状、例えば、肥満症、食欲不振、糖尿病、Ｉ型またはＩＩ
型糖尿病．
（ｏｏ）潰瘍、例えば、胃潰瘍または皮膚潰瘍；
（ｐｐ）皮膚乾燥；
（ｑｑ）シェーグレン症候群；
（ｒｒサイトカインストーム；
（ｓｓ）難聴、聴覚消失または聴覚障害；
（ｔｔ）代謝が遅いまたは速い（すなわち、対象の体重、性別および年齢の平均よりも遅
いまたは速い）；
（ｕｕ）受胎障害、例えば、不妊症または低受胎能；
（ｖｖ）黄疸；
（ｗｗ）発疹；
（ｘｘ）川崎病；
（ｙｙ）ライム病；
（ｚｚ）アレルギー、例えば、ナッツ、草、花粉、イエダニ、ネコまたはイヌの毛または
フケのアレルギー；
（ａａａ）マラリア、腸チフス熱、結核またはコレラ；
（ｂｂｂ）鬱；
（ｃｃｃ）精神障害；
（ｄｄｄ）小頭症；
（ｅｅｅ）栄養失調；
（ｆｆｆ）結膜炎；
（ｇｇｇ）肺炎；
（ｈｈｈ）肺塞栓症；
（ｉｉｉ）肺高血圧症；
（ｊｊｊ）骨の疾患；
（ｋｋｋ）敗血症または敗血症性ショック；
（ｌｌｌ）副鼻腔炎（Ｓｉｎｕｓｉｔｕｓ）；
（ｍｍｍ）ストレス（例えば、職業ストレス）；
（ｎｎｎ）地中海貧血症、貧血、フォン・ヴィルブランド病、または血友病；
（ｏｏｏ）帯状疱疹または口唇ヘルペス；
（ｐｐｐ）月経；
（ｑｑｑ）精子数減少
【0297】
本方法により処置または予防する、神経変性または中枢神経系（ＣＮＳ）の疾病または
症状
症状
【0298】
一例では、神経変性または中枢神経系（ＣＮＳ）の疾病または症状は、ルツハイマー病
、腰筋症（ｇｅｒｉｏｐｓｙｃｈｏｓｉｓ）、ダウン症候群、パーキンソン病、クロイツ
フェルト・ヤコブ病、糖尿病性ニューロパチー、パーキンソン症候群、ハンチントン病、
マシャド・ジョセフ病、筋萎縮性側索硬化症、糖尿病性ニューロパチー、およびクロイツ
フェルト・ヤコブ病（Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ－Ｊａｋｏｂｄ
ｉｓｅａｓｅ）からなる群から選択される。例えば、該疾病はアルツハイマー病である。
例えば、該疾病は、パーキンソン症候群である。
、腰筋症（ｇｅｒｉｏｐｓｙｃｈｏｓｉｓ）、ダウン症候群、パーキンソン病、クロイツ
フェルト・ヤコブ病、糖尿病性ニューロパチー、パーキンソン症候群、ハンチントン病、
マシャド・ジョセフ病、筋萎縮性側索硬化症、糖尿病性ニューロパチー、およびクロイツ
フェルト・ヤコブ病（Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ－Ｊａｋｏｂｄ
ｉｓｅａｓｅ）からなる群から選択される。例えば、該疾病はアルツハイマー病である。
例えば、該疾病は、パーキンソン症候群である。
【0299】
一例では、本発明の方法は、中枢神経系（ＣＮＳ）または神経変性の疾病または症状の
処置のために、ヒトまたは動物対象に実行され、本方法は、対象においてＴｒｅｇ細胞の
ダウンレギュレーションを引き起こし、それにより、全身性単球由来マクロファージおよ
び／Ｔｒｅｇ細胞の、脈絡叢を通った対象の脳への移行を促進し、それにより、疾病また
は症状（例えば、アルツハイマー病）が処置、予防され、あるいは、その進行が軽減され
る。ある実施形態では、本方法は、対象の中枢神経系（ＣＮＳ）システム（例えば、脳内
および／またはＣＳＦの）において、ＩＦＮ－γの増加を引き起こす。一例では、本方法
は、神経線維を回復させ、および／または、神経線維の損傷の進行を低減させる。一例で
は、本方法は、神経ミエリンを回復させ、および／または、神経ミエリン損傷の進行を低
減させる。一例では、本発明の方法は、ＷＯ２０１５１３６５４１に開示された疾病また
は症状を、処置または予防し、および／または、本方法は、ＷＯ２０１５１３６５４１に
開示された方法と共に用いられ得る（当該文書の開示は、その全体が参照により本明細書
に組み込まれ、例えば、当該方法、疾病、症状および中枢神経系（ＣＮＳ）および神経変
性の疾病および症状の処置および／または予防をもたらすために対象に投与され得る潜在
的治療薬（例えば、当該文書に開示される抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＴＩＭ３、また
は他の抗体などの、免疫チェックポイント阻害剤などの薬）の開示を提供することを目的
とする）。
処置のために、ヒトまたは動物対象に実行され、本方法は、対象においてＴｒｅｇ細胞の
ダウンレギュレーションを引き起こし、それにより、全身性単球由来マクロファージおよ
び／Ｔｒｅｇ細胞の、脈絡叢を通った対象の脳への移行を促進し、それにより、疾病また
は症状（例えば、アルツハイマー病）が処置、予防され、あるいは、その進行が軽減され
る。ある実施形態では、本方法は、対象の中枢神経系（ＣＮＳ）システム（例えば、脳内
および／またはＣＳＦの）において、ＩＦＮ－γの増加を引き起こす。一例では、本方法
は、神経線維を回復させ、および／または、神経線維の損傷の進行を低減させる。一例で
は、本方法は、神経ミエリンを回復させ、および／または、神経ミエリン損傷の進行を低
減させる。一例では、本発明の方法は、ＷＯ２０１５１３６５４１に開示された疾病また
は症状を、処置または予防し、および／または、本方法は、ＷＯ２０１５１３６５４１に
開示された方法と共に用いられ得る（当該文書の開示は、その全体が参照により本明細書
に組み込まれ、例えば、当該方法、疾病、症状および中枢神経系（ＣＮＳ）および神経変
性の疾病および症状の処置および／または予防をもたらすために対象に投与され得る潜在
的治療薬（例えば、当該文書に開示される抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＴＩＭ３、また
は他の抗体などの、免疫チェックポイント阻害剤などの薬）の開示を提供することを目的
とする）。
【0300】
本方法により処置または予防するがん
【0301】
処置され得るがんには、血管形成されていない、または実質的に血管形成されていない
腫瘍、ならびに、血管形成腫瘍が含まれる。がんは、非固形腫瘍（血液系腫瘍など、例え
ば、白血病およびリンパ腫）を含んでよく、あるいは、固形腫瘍を含んでもよい。本発明
で処置されるがんのタイプには、細胞腫、芽細胞腫、および肉腫、およびある種の白血病
、またはリンパ系悪性腫瘍、良性および悪性腫瘍、および悪性病変（ｍａｌｉｇｎａｎｃ
ｙ）（例えば、肉腫、細胞腫、およびメラノーマ）が含まれるが、これらに限定されない
。成人腫瘍／がんおよび小児腫瘍／がんもまた含まれる。
腫瘍、ならびに、血管形成腫瘍が含まれる。がんは、非固形腫瘍（血液系腫瘍など、例え
ば、白血病およびリンパ腫）を含んでよく、あるいは、固形腫瘍を含んでもよい。本発明
で処置されるがんのタイプには、細胞腫、芽細胞腫、および肉腫、およびある種の白血病
、またはリンパ系悪性腫瘍、良性および悪性腫瘍、および悪性病変（ｍａｌｉｇｎａｎｃ
ｙ）（例えば、肉腫、細胞腫、およびメラノーマ）が含まれるが、これらに限定されない
。成人腫瘍／がんおよび小児腫瘍／がんもまた含まれる。
【0302】
血液がんは、血液または骨髄のがんである。血液性（または血行性）のがんの例には、
急性白血病（急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄白血病、および、骨髄芽
球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、および赤白血病など
（ｐｒｏｍｙｅｉｏｃｙｔｉｃ））、慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性
骨髄性白血病、および慢性リンパ性白血病など）、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキ
ン病、非ホジキンリンパ腫（低悪性度および高悪性度の）、多発性骨髄腫，ワルデンスト
レーム高ガンマグロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、ヘアリー細胞白血病および
骨髄形成異常症を含む、白血病が含まれる。
急性白血病（急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄白血病、および、骨髄芽
球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、および赤白血病など
（ｐｒｏｍｙｅｉｏｃｙｔｉｃ））、慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性
骨髄性白血病、および慢性リンパ性白血病など）、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキ
ン病、非ホジキンリンパ腫（低悪性度および高悪性度の）、多発性骨髄腫，ワルデンスト
レーム高ガンマグロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、ヘアリー細胞白血病および
骨髄形成異常症を含む、白血病が含まれる。
【0303】
固形腫瘍は、通常嚢胞または液体領域を含有しない、組織の異常な腫瘤である。固形腫
瘍は良性または悪性であることができる。さまざまなタイプの固形腫瘍は、それらを形成
する細胞のタイプ（肉腫、細胞腫、およびリンパ腫など）について、名前が付けられてい
る。肉腫および細胞種などの固形腫瘍の例には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉
腫、骨肉腫、および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉
腫、結腸がん，リンパ系腫瘍、膵臓がん、乳がん，肺がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細
胞がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺癌、汗腺がん，甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、
褐色細胞腫皮脂腺細胞腫、乳頭がん，乳頭状腺がん、髄様がん，気管支原性肺癌、腎細胞
がん、肝細胞がん，胆管細胞腫、絨毛がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、セ
ミノーマ、膀胱がん、メラノーマ、および中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍（例えば、神経膠腫
（脳幹神経膠腫および混合神経膠腫など）、神経膠芽腫（多形神経膠芽腫としても知られ
る）、星細胞腫、中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫，胚細胞腫、髄芽腫、シュワン細胞腫、
頭蓋咽頭腫（ｃｒａｎｉｏｐｈａｒｙｏｇｉｏｍａ）、脳室上衣腫、松果体腫（ｐｉｎｅ
ａｉｏｍａ）、血管芽細胞腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏ
ｍａ）、神経芽腫、網膜芽細胞腫および脳転移）が含まれる。
瘍は良性または悪性であることができる。さまざまなタイプの固形腫瘍は、それらを形成
する細胞のタイプ（肉腫、細胞腫、およびリンパ腫など）について、名前が付けられてい
る。肉腫および細胞種などの固形腫瘍の例には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉
腫、骨肉腫、および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉
腫、結腸がん，リンパ系腫瘍、膵臓がん、乳がん，肺がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細
胞がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺癌、汗腺がん，甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、
褐色細胞腫皮脂腺細胞腫、乳頭がん，乳頭状腺がん、髄様がん，気管支原性肺癌、腎細胞
がん、肝細胞がん，胆管細胞腫、絨毛がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、セ
ミノーマ、膀胱がん、メラノーマ、および中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍（例えば、神経膠腫
（脳幹神経膠腫および混合神経膠腫など）、神経膠芽腫（多形神経膠芽腫としても知られ
る）、星細胞腫、中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫，胚細胞腫、髄芽腫、シュワン細胞腫、
頭蓋咽頭腫（ｃｒａｎｉｏｐｈａｒｙｏｇｉｏｍａ）、脳室上衣腫、松果体腫（ｐｉｎｅ
ａｉｏｍａ）、血管芽細胞腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏ
ｍａ）、神経芽腫、網膜芽細胞腫および脳転移）が含まれる。
【0304】
本方法により処置または予防する自己免疫性の疾病
・急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）
・急性壊死性出血性白質脳炎
・アジソン病
・無ガンマグロブリン血症
・円形脱毛症
・アミロイドーシス
・強直性脊椎炎
・抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎
・抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）
・自己免疫性の血管浮腫
・自己免疫性の再生不良性貧血
・自己免疫性の自律神経障害
・自己免疫性の肝炎
・自己免疫性の高脂血症
・自己免疫性の免疫不全
・自己免疫性の内耳疾病（ＡＩＥＤ）
・自己免疫性の心筋炎
・自己免疫性の卵巣炎
・自己免疫性の膵炎
・自己免疫性の網膜症
・自己免疫性の血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）
・自己免疫性の甲状腺疾患
・自己免疫性のじんま疹
・軸索およびニューロンのニューロパシー
・バロ病
・ベーチェット病
・水疱性類天疱瘡
・心筋症
・キャッスルマン病
・セリアック病
・シャガス病
・慢性疲労症候群
・慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）
・慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）
・チャーグ・ストラウス症候群
・瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡
・クローン病
・コーガン症候群
・寒冷凝集素症
・先天性心ブロック
・コクサッキー心筋炎
・ＣＲＥＳＴ症
・本態性混合型クリオグロブリン血症
・脱髄性ニューロパシー
・ヘルペス状皮膚炎
・皮膚筋炎
・デビック病（視神経脊髄炎）
・円盤状ループス
・ドレッスラー症候群
・子宮内膜症
・好酸球性食道炎
・好酸球性筋膜炎
・結節性紅斑
・実験的アレルギー性脳脊髄炎
・エバンス症候群
・線維筋痛症
・線維性肺胞炎
・巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）
・巨細胞性心筋炎
・糸球体腎炎
・グッドパスチャー症候群
・多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）（以前はウェゲナー肉芽腫症と呼ばれた）
・グレーブス病
・ギラン・バレー症候群
・橋本脳炎
・橋本甲状腺炎
・溶血性貧血
・ヘノッホ・シェーンライン紫斑病
・妊娠性疱疹
・低ガンマグロブリン血症
・特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）
・ＩｇＡ腎症
・ＩｇＧ４関連硬化性疾病
・免疫調節性リポタンパク質
・封入体筋炎
・間質性膀胱炎
・若年性関節炎
・若年性糖尿病（１型糖尿病）
・若年性筋炎
・川崎症候群
・ランバート・イートン症候群
・白血球破砕性血管炎
・扁平苔癬
・硬化性苔癬
・木質性結膜炎
・線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）
・ループス（ＳＬＥ）
・ライム病、慢性
・メニエール病
・顕微鏡的多発血管炎
・混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）
・モーレン潰瘍
・ムッハ・ハーベルマン病
・多発性硬化症
・重症筋無力症
・筋炎
・ナルコレプシー
・視神経脊髄炎（デビック病）
・好中球減少症
・眼の瘢痕性類天疱瘡
・視神経炎
・回帰性リウマチ
・ＰＡＮＤＡＳ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓに関連する小児自己免疫性精神神経疾患）
・傍腫瘍性小脳変性症
・発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）
・Ｐａｒｒｙ Ｒｏｍｂｅｒｇ症候群
・パーソネージ・ターナー症候群
・毛様体扁平部炎（周辺部ぶどう膜炎）
・天疱瘡
・末梢神経障害
・静脈周囲脳脊髄炎
・悪性貧血
・ＰＯＥＭＳ症候群
・結節性多発動脈炎
・多腺性自己免疫症候群Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型
・リウマチ性多発筋痛
・多発性筋炎
・心筋梗塞後症候群
・心膜切開後症候群
・プロゲステロン皮膚炎
・一次胆汁性肝硬変
・一次硬化性胆管炎
・乾癬
・乾癬性関節炎
・特発性肺線維症
・壊疽性膿皮症
・赤芽球癆
・レイノー現象
・反応性関節炎
・反射性交感神経性ジストロフィー
・ライター症候群
・再発性多発軟骨炎
・下肢静止不能症候群
・後腹膜線維症
・リウマチ熱
・関節リウマチ
・サルコイドーシス
・シュミット症候群
・強膜炎
・強皮症
・シェーグレン症候群
・精子および精巣の自己免疫性疾患（Ｓｐｅｍ＆ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ ａｕｔｏｉｍｍ
ｕｎｉｔｙ）
・全身硬直症候群
・亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）
・スザック症候群
・交感性眼炎
・高安動脈炎
・側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎
・血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）
・トロサ・ハント症候群
・横断性脊髄炎
・１型糖尿病
・潰瘍性大腸炎
・未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）
・ぶどう膜炎
・血管炎
・小水疱水疱性皮膚病
・白斑
・ウェゲナー肉芽腫症（現在は多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）と呼ばれる）
・急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）
・急性壊死性出血性白質脳炎
・アジソン病
・無ガンマグロブリン血症
・円形脱毛症
・アミロイドーシス
・強直性脊椎炎
・抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎
・抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）
・自己免疫性の血管浮腫
・自己免疫性の再生不良性貧血
・自己免疫性の自律神経障害
・自己免疫性の肝炎
・自己免疫性の高脂血症
・自己免疫性の免疫不全
・自己免疫性の内耳疾病（ＡＩＥＤ）
・自己免疫性の心筋炎
・自己免疫性の卵巣炎
・自己免疫性の膵炎
・自己免疫性の網膜症
・自己免疫性の血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）
・自己免疫性の甲状腺疾患
・自己免疫性のじんま疹
・軸索およびニューロンのニューロパシー
・バロ病
・ベーチェット病
・水疱性類天疱瘡
・心筋症
・キャッスルマン病
・セリアック病
・シャガス病
・慢性疲労症候群
・慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）
・慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）
・チャーグ・ストラウス症候群
・瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡
・クローン病
・コーガン症候群
・寒冷凝集素症
・先天性心ブロック
・コクサッキー心筋炎
・ＣＲＥＳＴ症
・本態性混合型クリオグロブリン血症
・脱髄性ニューロパシー
・ヘルペス状皮膚炎
・皮膚筋炎
・デビック病（視神経脊髄炎）
・円盤状ループス
・ドレッスラー症候群
・子宮内膜症
・好酸球性食道炎
・好酸球性筋膜炎
・結節性紅斑
・実験的アレルギー性脳脊髄炎
・エバンス症候群
・線維筋痛症
・線維性肺胞炎
・巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）
・巨細胞性心筋炎
・糸球体腎炎
・グッドパスチャー症候群
・多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）（以前はウェゲナー肉芽腫症と呼ばれた）
・グレーブス病
・ギラン・バレー症候群
・橋本脳炎
・橋本甲状腺炎
・溶血性貧血
・ヘノッホ・シェーンライン紫斑病
・妊娠性疱疹
・低ガンマグロブリン血症
・特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）
・ＩｇＡ腎症
・ＩｇＧ４関連硬化性疾病
・免疫調節性リポタンパク質
・封入体筋炎
・間質性膀胱炎
・若年性関節炎
・若年性糖尿病（１型糖尿病）
・若年性筋炎
・川崎症候群
・ランバート・イートン症候群
・白血球破砕性血管炎
・扁平苔癬
・硬化性苔癬
・木質性結膜炎
・線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）
・ループス（ＳＬＥ）
・ライム病、慢性
・メニエール病
・顕微鏡的多発血管炎
・混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）
・モーレン潰瘍
・ムッハ・ハーベルマン病
・多発性硬化症
・重症筋無力症
・筋炎
・ナルコレプシー
・視神経脊髄炎（デビック病）
・好中球減少症
・眼の瘢痕性類天疱瘡
・視神経炎
・回帰性リウマチ
・ＰＡＮＤＡＳ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓに関連する小児自己免疫性精神神経疾患）
・傍腫瘍性小脳変性症
・発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）
・Ｐａｒｒｙ Ｒｏｍｂｅｒｇ症候群
・パーソネージ・ターナー症候群
・毛様体扁平部炎（周辺部ぶどう膜炎）
・天疱瘡
・末梢神経障害
・静脈周囲脳脊髄炎
・悪性貧血
・ＰＯＥＭＳ症候群
・結節性多発動脈炎
・多腺性自己免疫症候群Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型
・リウマチ性多発筋痛
・多発性筋炎
・心筋梗塞後症候群
・心膜切開後症候群
・プロゲステロン皮膚炎
・一次胆汁性肝硬変
・一次硬化性胆管炎
・乾癬
・乾癬性関節炎
・特発性肺線維症
・壊疽性膿皮症
・赤芽球癆
・レイノー現象
・反応性関節炎
・反射性交感神経性ジストロフィー
・ライター症候群
・再発性多発軟骨炎
・下肢静止不能症候群
・後腹膜線維症
・リウマチ熱
・関節リウマチ
・サルコイドーシス
・シュミット症候群
・強膜炎
・強皮症
・シェーグレン症候群
・精子および精巣の自己免疫性疾患（Ｓｐｅｍ＆ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ ａｕｔｏｉｍｍ
ｕｎｉｔｙ）
・全身硬直症候群
・亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）
・スザック症候群
・交感性眼炎
・高安動脈炎
・側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎
・血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）
・トロサ・ハント症候群
・横断性脊髄炎
・１型糖尿病
・潰瘍性大腸炎
・未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）
・ぶどう膜炎
・血管炎
・小水疱水疱性皮膚病
・白斑
・ウェゲナー肉芽腫症（現在は多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）と呼ばれる）
【0305】
本方法により処置または予防する炎症性の疾病
・アルツハイマー病
・強直性脊椎炎
・関節炎（骨関節炎、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬性関節炎）
・喘息
・アテローム動脈硬化症
・クローン病
・大腸炎
・皮膚炎
・腸憩室炎
・線維筋痛症
・肝炎
・過敏性腸症候群（ＩＢＳ）
・全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）
・腎炎
・パーキンソン病
・潰瘍性大腸炎
・アルツハイマー病
・強直性脊椎炎
・関節炎（骨関節炎、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬性関節炎）
・喘息
・アテローム動脈硬化症
・クローン病
・大腸炎
・皮膚炎
・腸憩室炎
・線維筋痛症
・肝炎
・過敏性腸症候群（ＩＢＳ）
・全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）
・腎炎
・パーキンソン病
・潰瘍性大腸炎
【0306】
一例では（例えば、混合細菌集団を包含する本発明の方法において）、宿主細胞（また
は第１の細胞または第２の細胞）の属または種は、表１に列挙した属または種から選択さ
れる。本発明の実施例において、Ｃａｓ（例えば、タイプＩ、ＩＩまたはＩＩＩなどのＣ
ａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ３またはＣａｓ９）は、表１に列挙した属または種か
ら選択された属または種の細菌に含まれるＣａｓであり、かつ、場合により、宿主細胞（
または第１の細胞または第２の細胞）は、同一の属または種の細胞である。この一例では
、Ｃａｓは前記宿主細胞（または第１または第２の細胞）に内因性であり、このことは、
内因性Ｃａｓが標的配列の改変に用いられる本明細書の実施形態にとって有用である。こ
の場合、ＨＭ－アレイは、前記細胞、属または種のリピート配列に少なくとも９０、９５
、９６、９７、９８または９９％同一（または１００％同一）である、１つ以上のリピー
トヌクレオチド（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）配列を含み得、それにより、Ｃａｓは該細
胞において１つ以上の標的配列を改変するためにＨＭ－アレイによってコードされるｃＲ
ＮＡと作動可能である。一例では、ＣａｓはタイプＩＣａｓであり、タイプＩＣＡＳＣＡ
ＤＥと共に用いられ、ここで、Ｃａｓ３およびＣＡＳＣＡＤＥの１つまたは両方が、宿主
細胞または第１の細胞に内因性であるか、あるいは、ベクター媒介性である（すなわち、
宿主細胞または第１の細胞に外因性である）。
は第１の細胞または第２の細胞）の属または種は、表１に列挙した属または種から選択さ
れる。本発明の実施例において、Ｃａｓ（例えば、タイプＩ、ＩＩまたはＩＩＩなどのＣ
ａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ３またはＣａｓ９）は、表１に列挙した属または種か
ら選択された属または種の細菌に含まれるＣａｓであり、かつ、場合により、宿主細胞（
または第１の細胞または第２の細胞）は、同一の属または種の細胞である。この一例では
、Ｃａｓは前記宿主細胞（または第１または第２の細胞）に内因性であり、このことは、
内因性Ｃａｓが標的配列の改変に用いられる本明細書の実施形態にとって有用である。こ
の場合、ＨＭ－アレイは、前記細胞、属または種のリピート配列に少なくとも９０、９５
、９６、９７、９８または９９％同一（または１００％同一）である、１つ以上のリピー
トヌクレオチド（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）配列を含み得、それにより、Ｃａｓは該細
胞において１つ以上の標的配列を改変するためにＨＭ－アレイによってコードされるｃＲ
ＮＡと作動可能である。一例では、ＣａｓはタイプＩＣａｓであり、タイプＩＣＡＳＣＡ
ＤＥと共に用いられ、ここで、Ｃａｓ３およびＣＡＳＣＡＤＥの１つまたは両方が、宿主
細胞または第１の細胞に内因性であるか、あるいは、ベクター媒介性である（すなわち、
宿主細胞または第１の細胞に外因性である）。
【0307】
一例では、本発明の方法は、微生物叢において第１の細胞を選択的に死滅する一方で、
第２の細胞は標的とせず、例えば、第２の細胞は、（ａ）第１の種の株に関連する株の細
胞であるか、または（ｂ）第１の種と異なり、かつ第１の種と系統学的に関連する種の細
胞であり、第２の種または株が、第１の細胞の種または株の１６ｓリボソームＲＮＡをコ
ードするＤＮＡ配列と少なくとも８０％同一である１６ｓリボソームＲＮＡをコードする
ＤＮＡ配列を有する。ある実施形態では、第１の細胞は、表１から選択された第１の種の
細胞であり、かつ、第２の細胞は、表１から選択された異なる種の細胞である。一例では
、該種は、同じ属の種であり、または、異なる属の種である。
第２の細胞は標的とせず、例えば、第２の細胞は、（ａ）第１の種の株に関連する株の細
胞であるか、または（ｂ）第１の種と異なり、かつ第１の種と系統学的に関連する種の細
胞であり、第２の種または株が、第１の細胞の種または株の１６ｓリボソームＲＮＡをコ
ードするＤＮＡ配列と少なくとも８０％同一である１６ｓリボソームＲＮＡをコードする
ＤＮＡ配列を有する。ある実施形態では、第１の細胞は、表１から選択された第１の種の
細胞であり、かつ、第２の細胞は、表１から選択された異なる種の細胞である。一例では
、該種は、同じ属の種であり、または、異なる属の種である。
【0308】
本明細書に記載された特定の実施形態は例示として示されており、本発明の限定として
示されていないことは理解されるであろう。本発明の主たる特徴は、本発明の範囲を逸脱
することなく、様々な実施形態に採用することができる。当業者であれが、本明細書に記
載の特定の手順に対する多数の均等物を認識するか、または日常的な研究のみを用いて確
認することができるであろう。これらの均等物は本発明の範囲内にあると考えられ、特許
請求の範囲により包含される。本明細書中で言及されている全ての刊行物および特許出願
は、本発明が関係する当業者の技術レベルを示している。すべての刊行物および特許出願
ならびにすべての同等の米国特許出願および特許は、まるで各刊行物または特許出願が参
照により組み込まれることが、具体的かつ個別に示されたのと同程度に、参照により本明
細書に組み込まれる。特許請求の範囲および／または明細書中で「含む」という用語と一
緒に使用される場合の「ａ」または「ａｎ」という単語の使用は、「１つ」を意味し得る
が、「１つ以上」、「少なくとも一つ」、および「１つまたはそれより多い」の意味とも
一致する。請求項における用語「または」の使用は、本開示は、代替物および「および／
または」のみを指す規定を支持するが、代替物のみを指すように明示的に示されていない
限り、または代替物が相互に排他的でない限り、「および／または」を意味するために使
用される。本出願を通して、「約」という用語は、ある値が、その値を決定するために使
用されている装置、方法にとって固有の誤差の変動、または研究対象間に存在する変動を
含むことを示すために使用されている。
示されていないことは理解されるであろう。本発明の主たる特徴は、本発明の範囲を逸脱
することなく、様々な実施形態に採用することができる。当業者であれが、本明細書に記
載の特定の手順に対する多数の均等物を認識するか、または日常的な研究のみを用いて確
認することができるであろう。これらの均等物は本発明の範囲内にあると考えられ、特許
請求の範囲により包含される。本明細書中で言及されている全ての刊行物および特許出願
は、本発明が関係する当業者の技術レベルを示している。すべての刊行物および特許出願
ならびにすべての同等の米国特許出願および特許は、まるで各刊行物または特許出願が参
照により組み込まれることが、具体的かつ個別に示されたのと同程度に、参照により本明
細書に組み込まれる。特許請求の範囲および／または明細書中で「含む」という用語と一
緒に使用される場合の「ａ」または「ａｎ」という単語の使用は、「１つ」を意味し得る
が、「１つ以上」、「少なくとも一つ」、および「１つまたはそれより多い」の意味とも
一致する。請求項における用語「または」の使用は、本開示は、代替物および「および／
または」のみを指す規定を支持するが、代替物のみを指すように明示的に示されていない
限り、または代替物が相互に排他的でない限り、「および／または」を意味するために使
用される。本出願を通して、「約」という用語は、ある値が、その値を決定するために使
用されている装置、方法にとって固有の誤差の変動、または研究対象間に存在する変動を
含むことを示すために使用されている。
【0309】
本明細書および特許請求の範囲で使用されているように、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」（
および「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」などの任意の形式のｃｏｍｐ
ｒｉｓｉｎｇ）、「ｈａｖｉｎｇ」（および「ｈａｖｅ」および「ｈａｓ」などの任意の
形式のｈａｖｉｎｇ）、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」（および「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」および「
ｉｎｃｌｕｄｅ」などのあらゆる形式のｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、または「ｃｏｎｔａｉｎ
ｉｎｇ」（および「ｃｏｎｔａｉｎｓ」および「ｃｏｎｔａｉｎ」などのあらゆる形式の
ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）という単語は、包括的またはオープンエンドであり、さらなる、
記載されていないエレメントまたは方法のステップを除外するものではない。
および「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」などの任意の形式のｃｏｍｐ
ｒｉｓｉｎｇ）、「ｈａｖｉｎｇ」（および「ｈａｖｅ」および「ｈａｓ」などの任意の
形式のｈａｖｉｎｇ）、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」（および「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」および「
ｉｎｃｌｕｄｅ」などのあらゆる形式のｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、または「ｃｏｎｔａｉｎ
ｉｎｇ」（および「ｃｏｎｔａｉｎｓ」および「ｃｏｎｔａｉｎ」などのあらゆる形式の
ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）という単語は、包括的またはオープンエンドであり、さらなる、
記載されていないエレメントまたは方法のステップを除外するものではない。
【0310】
本明細書で使用される場合、「またはそれらの組み合わせ」または同様の用語は、その
用語の前に列挙された項目のすべての順列および組み合わせを指す。例えば、「A、B、C
、またはそれらの組み合わせ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、またはＡＢＣのうち
の少なくとも１つを含むことを意図しており、特定の文脈で順序が重要な場合は、ＢＡ、
ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣまたはＣＡＢもまた含むことを意図してい
る。この例を続けると、ＢＢ、ＡＡＡ、ＭＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ
、ＣＡＢＡＢＢなど、１つ以上の項目または用語の繰り返しを含む組み合わせが明確に含
まれる。当業者であれば、文脈から他に明らかでない限り、典型的には任意の組み合わせ
における項目または用語の数に制限がないことを、理解するであろう。
用語の前に列挙された項目のすべての順列および組み合わせを指す。例えば、「A、B、C
、またはそれらの組み合わせ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、またはＡＢＣのうち
の少なくとも１つを含むことを意図しており、特定の文脈で順序が重要な場合は、ＢＡ、
ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣまたはＣＡＢもまた含むことを意図してい
る。この例を続けると、ＢＢ、ＡＡＡ、ＭＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ
、ＣＡＢＡＢＢなど、１つ以上の項目または用語の繰り返しを含む組み合わせが明確に含
まれる。当業者であれば、文脈から他に明らかでない限り、典型的には任意の組み合わせ
における項目または用語の数に制限がないことを、理解するであろう。
【0311】
文脈から明らかでない限り、本開示の任意の部分は、本開示の任意の他の部分と組み合
わせて読むことができる。
わせて読むことができる。
【0312】
本明細書に開示され特許請求されている全ての組成物および／または方法は、本開示に
照らして過度の実験をすることなく製造および実行することができる。本発明の組成物お
よび方法は好ましい実施形態に関して記載されているが、組成物および／または方法、な
らびに本明細書に記載の方法の工程または方法の工程の順序において、本発明の概念、精
神および範囲から逸脱することなく、変形が適用され得ることは当業者に明らかであろう
。当業者に明らかなこれらの類似の代替物および改変物はすべて、添付の特許請求の範囲
によって規定される本発明の精神、範囲および概念の範囲内にあるとみなされる。
照らして過度の実験をすることなく製造および実行することができる。本発明の組成物お
よび方法は好ましい実施形態に関して記載されているが、組成物および／または方法、な
らびに本明細書に記載の方法の工程または方法の工程の順序において、本発明の概念、精
神および範囲から逸脱することなく、変形が適用され得ることは当業者に明らかであろう
。当業者に明らかなこれらの類似の代替物および改変物はすべて、添付の特許請求の範囲
によって規定される本発明の精神、範囲および概念の範囲内にあるとみなされる。
【0313】
本発明は、以下の非限定的な実施例において、さらに詳細に記載されている。
【実施例0314】
実施例１：野生型内因性Ｃａｓを利用することによる、特定の微生物叢細菌集団の増殖阻
害
１．材料および方法
１．１．株
害
１．材料および方法
１．１．株
【0315】
本実施例および実施例２および３の過程では、以下の株を用いた：Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ
１６５５、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ ＬＭＤ－９（ＡＴＣＣ ＢＡＡ－４９１、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉ
ａ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＳＭ ２０６１７（
Ｔ）（ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｌａｃｔｉｓ ＭＧ１３６３および Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ
Ｃｌａｒｋｅ １９２４ ＤＳＭ ２０５２３（ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、
Ｇｅｒｍａｎｙ）。
１６５５、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ ＬＭＤ－９（ＡＴＣＣ ＢＡＡ－４９１、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉ
ａ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＳＭ ２０６１７（
Ｔ）（ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｌａｃｔｉｓ ＭＧ１３６３および Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ
Ｃｌａｒｋｅ １９２４ ＤＳＭ ２０５２３（ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、
Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【0316】
培地選択および遺伝子構築物の試験の過程では、異なるＳｔｒｅｐｔｏｃｃｏｃｉ株を
用いた。適合性のある増殖要件のために、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ ＬＭＤ－９（ＡＴＣＣ ＢＡＡ－４９１）およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０が考えられた。全ての株は、他に示されない限り、好気的条件下お
よび３７度で、Ｔｏｄｄ－Ｈｅｗｉｔｔ ｂｒｏｔｈ（ＴＨ）（Ｔ１４３８ Ｓｉｇｍａ
－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で培養した。株は、－８０度で、２５％グリセロール中で保存した
。
用いた。適合性のある増殖要件のために、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ ＬＭＤ－９（ＡＴＣＣ ＢＡＡ－４９１）およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０が考えられた。全ての株は、他に示されない限り、好気的条件下お
よび３７度で、Ｔｏｄｄ－Ｈｅｗｉｔｔ ｂｒｏｔｈ（ＴＨ）（Ｔ１４３８ Ｓｉｇｍａ
－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で培養した。株は、－８０度で、２５％グリセロール中で保存した
。
【0317】
１．２．分化増殖培地（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉａ）
全ての株を、３７度で２０時間、ＴＨ培地上で増殖させた。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｕｓのための選択培地は、３ｇ／ｌの２－フェニルエタノール（ＰＥＡ）を添加したＴＨ
培地であった。ＰＥＡを培地に添加し、１５ｐｓｉで、１５分間１２１℃、オートクレー
ブ処理した。寒天プレートは、対応する培地に１．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）寒天を添加する
ことにより調製した。選択またはプラスミド維持のために必要な場合、３０μｇ／ｍｌの
カナマイシンをＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株およびＥ．ｃｏｌｉの両方に使用し、５
００μｇ／ｍｌをＳ．ｍｕｔａｎｓに使用した。
全ての株を、３７度で２０時間、ＴＨ培地上で増殖させた。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｕｓのための選択培地は、３ｇ／ｌの２－フェニルエタノール（ＰＥＡ）を添加したＴＨ
培地であった。ＰＥＡを培地に添加し、１５ｐｓｉで、１５分間１２１℃、オートクレー
ブ処理した。寒天プレートは、対応する培地に１．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）寒天を添加する
ことにより調製した。選択またはプラスミド維持のために必要な場合、３０μｇ／ｍｌの
カナマイシンをＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株およびＥ．ｃｏｌｉの両方に使用し、５
００μｇ／ｍｌをＳ．ｍｕｔａｎｓに使用した。
【0318】
いくつかの場合では、株およびプラスミドに応じて、ＰＥＡを添加して培地上での増殖
を見るには、最大４８時間のより長い培養が、必要とされ得る。用いる生物の生存率を制
御するためには、並行してコントロールＴＨ寒天培地を行わなければならない。
１．３．クローニング
を見るには、最大４８時間のより長い培養が、必要とされ得る。用いる生物の生存率を制
御するためには、並行してコントロールＴＨ寒天培地を行わなければならない。
１．３．クローニング
【0319】
Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（登録商標）Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＴＯＰ１
０ケミカルコンピテント細胞）をすべてのサブクローニング手順に使用した。Ｐｈｕｓｉ
ｏｎポリメラーゼを用いてＰＣＲを行った。製造元のプロトコールに従って、全てのＰＣ
Ｒ産物を、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－ＮａｇｅｌのＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＧｅｌおよびＰＣＲ
Ｃｌｅａｎ－ｕｐにより精製した。精製した断片を、総量３４μｌ中に１μｌの酵素を
含む１×ＦＤ緩衝液において、制限酵素ＤｐｎＩで分解した。製造元のプロトコールに従
って、分解反応物を再び、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－ＮａｇｅｌのＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ Ｇｅ
ｌおよびＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐで精製した。製造元（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ
ｌａｂ）のプロトコールに従って、１０μｌの反応液中で、ギブソン・アセンブリを行っ
た。
０ケミカルコンピテント細胞）をすべてのサブクローニング手順に使用した。Ｐｈｕｓｉ
ｏｎポリメラーゼを用いてＰＣＲを行った。製造元のプロトコールに従って、全てのＰＣ
Ｒ産物を、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－ＮａｇｅｌのＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＧｅｌおよびＰＣＲ
Ｃｌｅａｎ－ｕｐにより精製した。精製した断片を、総量３４μｌ中に１μｌの酵素を
含む１×ＦＤ緩衝液において、制限酵素ＤｐｎＩで分解した。製造元のプロトコールに従
って、分解反応物を再び、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－ＮａｇｅｌのＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ Ｇｅ
ｌおよびＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐで精製した。製造元（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ
ｌａｂ）のプロトコールに従って、１０μｌの反応液中で、ギブソン・アセンブリを行っ
た。
【0320】
製造元の説明書に従い、Ｑｉａｇｅｎキットを用いて、プラスミドＤＮＡを調製した。
グラム陽性株に対する改変は、細胞溶解を促進するために０．５％グリシンおよびリゾチ
ームを添加した培地中で細菌を増殖させることを含んだ。
グラム陽性株に対する改変は、細胞溶解を促進するために０．５％グリシンおよびリゾチ
ームを添加した培地中で細菌を増殖させることを含んだ。
【0321】
１．４．形質転換
１．４．１ エレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞および形質転換
市販のエレクトロコンピテント細胞（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴｈｅｒｍｏＦｉ
ｓｃｈｅｒ ＴＯＰ１０ ケミカルコンピテントＥ． ｃｏｌｉ）を、クローニングおよ
び実験に用いた。エレクトロポレーションは、標準設定を用いて行った：Ｅｌｅｃｔｒｏ
Ｃｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ（ＢＴＸ Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ
ＥＣＭ６３０）を用いて１８００Ｖ、２５μＦおよび２００Ωで行った。パルスの後、１
ｍｌのＬＢ－ＳＯＣ培地を添加し、細胞を３７℃で１時間インキュベートした。形質転換
細胞を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する、ＬＢ寒天培地にプレーティングした
。
１．４．１ エレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞および形質転換
市販のエレクトロコンピテント細胞（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴｈｅｒｍｏＦｉ
ｓｃｈｅｒ ＴＯＰ１０ ケミカルコンピテントＥ． ｃｏｌｉ）を、クローニングおよ
び実験に用いた。エレクトロポレーションは、標準設定を用いて行った：Ｅｌｅｃｔｒｏ
Ｃｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ（ＢＴＸ Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ
ＥＣＭ６３０）を用いて１８００Ｖ、２５μＦおよび２００Ωで行った。パルスの後、１
ｍｌのＬＢ－ＳＯＣ培地を添加し、細胞を３７℃で１時間インキュベートした。形質転換
細胞を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する、ＬＢ寒天培地にプレーティングした
。
【0322】
１．４．２ エレクトロコンピテントＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ細胞の調製
エレクトロポレーションプロトコールは、Somkuti and Steinberg, 1988から改変した
。４０ｍＭのＤＬ－スレオニン（Ｔ８３７５ Ｓｉｇｍａ － Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加し
たＴＨ Ｂｒｏｔｈ中のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの一晩
培養した培養液を、５ｍｌの同じ培地中で１００倍希釈し、０．３～０．５の間のＯＤ６
００まで増殖させた（播種後約２．５時間）。細胞を、１０，０００×ｇ、４℃で１０分
間遠心分離することにより回収し、５ｍｌの氷冷洗浄バッファー（０．５Ｍショ糖＋１０
％グリセロール）で３回洗浄した。細胞を洗浄後、エレクトロポレーションバッファー（
０．５Ｍショ糖、１０％グリセロールおよび１ｍＭ ＭｇＣｌ２）にＯＤ６００が１５～
３０になるように懸濁した。エレクトロポレーションバッファー中の細胞は、使用するま
で、４℃で保存され得るか（１時間以内）、あるいは、エッペンドルフチューブに５０μ
ｌずつ分注し、液体窒素中で凍結し、後で使用するために－８０℃で保管され得る。
エレクトロポレーションプロトコールは、Somkuti and Steinberg, 1988から改変した
。４０ｍＭのＤＬ－スレオニン（Ｔ８３７５ Ｓｉｇｍａ － Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加し
たＴＨ Ｂｒｏｔｈ中のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの一晩
培養した培養液を、５ｍｌの同じ培地中で１００倍希釈し、０．３～０．５の間のＯＤ６
００まで増殖させた（播種後約２．５時間）。細胞を、１０，０００×ｇ、４℃で１０分
間遠心分離することにより回収し、５ｍｌの氷冷洗浄バッファー（０．５Ｍショ糖＋１０
％グリセロール）で３回洗浄した。細胞を洗浄後、エレクトロポレーションバッファー（
０．５Ｍショ糖、１０％グリセロールおよび１ｍＭ ＭｇＣｌ２）にＯＤ６００が１５～
３０になるように懸濁した。エレクトロポレーションバッファー中の細胞は、使用するま
で、４℃で保存され得るか（１時間以内）、あるいは、エッペンドルフチューブに５０μ
ｌずつ分注し、液体窒素中で凍結し、後で使用するために－８０℃で保管され得る。
【0323】
１．４．３ Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ細胞のエレクトロポレーション
１μｌの精製プラスミドＤＮＡを、５０μｌの細胞懸濁液に添加し、予冷した２ｍｍギ
ャップのエレクトロポレーションキュベットでエレクトロポレーションを実施した。エレ
クトロポレーションの設定は、Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ（Ｂ
ＴＸ Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ＥＣＭ６３０）を用いて、２５００Ｖ、２
５μＦおよび２００Ωであった。電気パルスの直後に、１ｍｌのＴＨ ｂｒｏｔｈを細胞
に添加し、懸濁液を氷上で１０分間保存し、続いて、細胞を３７℃で３時間インキュベー
トした。耐性遺伝子が発現するのを待った後、細胞を３０μｇ／ｍのカナマイシンを含有
するＴＨ－寒天プレート上にプレーティングした。構築物に応じて、コロニーは、３７℃
で１２時間～４８時間インキュベーションする間に出現した。
１μｌの精製プラスミドＤＮＡを、５０μｌの細胞懸濁液に添加し、予冷した２ｍｍギ
ャップのエレクトロポレーションキュベットでエレクトロポレーションを実施した。エレ
クトロポレーションの設定は、Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ（Ｂ
ＴＸ Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ＥＣＭ６３０）を用いて、２５００Ｖ、２
５μＦおよび２００Ωであった。電気パルスの直後に、１ｍｌのＴＨ ｂｒｏｔｈを細胞
に添加し、懸濁液を氷上で１０分間保存し、続いて、細胞を３７℃で３時間インキュベー
トした。耐性遺伝子が発現するのを待った後、細胞を３０μｇ／ｍのカナマイシンを含有
するＴＨ－寒天プレート上にプレーティングした。構築物に応じて、コロニーは、３７℃
で１２時間～４８時間インキュベーションする間に出現した。
【0324】
１．５．ＸｙｌＳプラスミドの構築
本研究に使用したすべてのプラスミドは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒ
ｉｓの潜在プラスミドｐＷＶ０１に由来する広宿主域発現ベクターであるｐＢＡＶ１Ｋ
－ Ｔ５に基づいており（Ｂｒｙｋｓｉｎ＆Ｍａｔｓｕｍｕｒａ、２０１０）、ギブソン
法を使用して他のフラグメントとアセンブルするためのオーバーハングを含むものを用い
て主鎖を増幅した。
本研究に使用したすべてのプラスミドは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒ
ｉｓの潜在プラスミドｐＷＶ０１に由来する広宿主域発現ベクターであるｐＢＡＶ１Ｋ
－ Ｔ５に基づいており（Ｂｒｙｋｓｉｎ＆Ｍａｔｓｕｍｕｒａ、２０１０）、ギブソン
法を使用して他のフラグメントとアセンブルするためのオーバーハングを含むものを用い
て主鎖を増幅した。
【0325】
ＸｙｌＲリプレッサーの前にプロモーターｇｙｒＡをクローニングすることにより、キ
シロース誘導性システムを構築した（図１）。XylRリプレッサーは、ギブソン・アセンブ
リのためのオーバーハングを含むリバースプライマー、並びに、ｇｙｒＡプロモーター（
Xie et al.2011）およびｐＢＡＶ１ＫＴ５主鎖にアセンブルするための対応するオーバー
ハングを導入するのに使用されるウルトラマー（ｕｌｔｒａｍｅｒ）であるフォワードプ
ライマーで、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｕｂｔｉｌｉｓ株ＳＣＫ６ (Zhang et al. 2011)から
増幅した。得られた断片を、ｐＣＬ００２から増幅されたｍＣｈｅｒｒｙ（未発表の研究
）に、Ｐｌｄｈａ＋ＰｘｙｌＡハイブリッドプロモーターを含むウルトラマーで隣接させ
た（Xie et al.2013）。得られた３つのＰＣＲ産物は、製造元の説明書に従い、Ｇｉｂｓ
ｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（登録商標）（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）中で
アセンブルした。該産物を、最後に、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０エレクトロコンピテント
細胞に形質転換した。図１参照。
シロース誘導性システムを構築した（図１）。XylRリプレッサーは、ギブソン・アセンブ
リのためのオーバーハングを含むリバースプライマー、並びに、ｇｙｒＡプロモーター（
Xie et al.2011）およびｐＢＡＶ１ＫＴ５主鎖にアセンブルするための対応するオーバー
ハングを導入するのに使用されるウルトラマー（ｕｌｔｒａｍｅｒ）であるフォワードプ
ライマーで、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｕｂｔｉｌｉｓ株ＳＣＫ６ (Zhang et al. 2011)から
増幅した。得られた断片を、ｐＣＬ００２から増幅されたｍＣｈｅｒｒｙ（未発表の研究
）に、Ｐｌｄｈａ＋ＰｘｙｌＡハイブリッドプロモーターを含むウルトラマーで隣接させ
た（Xie et al.2013）。得られた３つのＰＣＲ産物は、製造元の説明書に従い、Ｇｉｂｓ
ｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（登録商標）（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）中で
アセンブルした。該産物を、最後に、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０エレクトロコンピテント
細胞に形質転換した。図１参照。
【0326】
１．６． ＣＲＩＳＰＲアレイプラスミドの設計および構築
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓは４つの異なるＣＲＩＳＰＲ
システムを有し（Sapranauskas, et al. 2011）、本研究ではタイプＩＩＣＲＩＳＰＲ１
（ＳＴ１－ＣＲＩＳＰＲ）システムを選択した。標的配列の設計は、ＬＭＤ－９（Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ：ＣＰ０００４１９．１）の入手可能なゲノム配列に基づいた。ＳＴ１－ＣＲＩ
ＳＰＲアレイは、キシロース誘導性プロモーター(Xie et al. 2013)の支配下に、ＣＲＩ
ＳＰＲアレイリピートおよびスペーサーのみを含有し、その後ろに、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃｉ ｓｐｅｃｉｅｓの強力な構成的プロモーター(Sorg et al. 2014)の支配下に対応
するｔｒａｃｒＲＮＡを含有するように、設計した（図２、配列番号）。
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓは４つの異なるＣＲＩＳＰＲ
システムを有し（Sapranauskas, et al. 2011）、本研究ではタイプＩＩＣＲＩＳＰＲ１
（ＳＴ１－ＣＲＩＳＰＲ）システムを選択した。標的配列の設計は、ＬＭＤ－９（Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ：ＣＰ０００４１９．１）の入手可能なゲノム配列に基づいた。ＳＴ１－ＣＲＩ
ＳＰＲアレイは、キシロース誘導性プロモーター(Xie et al. 2013)の支配下に、ＣＲＩ
ＳＰＲアレイリピートおよびスペーサーのみを含有し、その後ろに、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃｉ ｓｐｅｃｉｅｓの強力な構成的プロモーター(Sorg et al. 2014)の支配下に対応
するｔｒａｃｒＲＮＡを含有するように、設計した（図２、配列番号）。
【0327】
ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの成熟において役割を果たし、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ内因性ＲＮａｓｅＩＩＩによってプロセシングされ、ｃｒＲＮＡと複合体を形成
する。本複合体は、エンドヌクレアーゼＳＴ１－Ｃａｓ９のためのガイドとして機能する
(Horvath & Barrangou, 2010)。キシロース誘導性プロモーターからの合成アレイの転写
後、内因性Ｃａｓ９およびＲＮＡｓｅはそれを機能的ｇＲＮＡにプロセシングするであろ
う。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体が、標的部分で、二重鎖切断を引き起こすであろう。
ｉｌｕｓ内因性ＲＮａｓｅＩＩＩによってプロセシングされ、ｃｒＲＮＡと複合体を形成
する。本複合体は、エンドヌクレアーゼＳＴ１－Ｃａｓ９のためのガイドとして機能する
(Horvath & Barrangou, 2010)。キシロース誘導性プロモーターからの合成アレイの転写
後、内因性Ｃａｓ９およびＲＮＡｓｅはそれを機能的ｇＲＮＡにプロセシングするであろ
う。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体が、標的部分で、二重鎖切断を引き起こすであろう。
【0328】
該アレイの設計は、ＧＣ含有量が高い２つの特異的標的配列およびｔｒａｃｒＲＮＡの
縮小された部分（すなわち、完全ではないｔｒａｃｒＲＮＡ配列）を使用しており、該部
分は、ｃｒＲＮＡの適切な成熟に必要ではないことが示唆されている(Horvath & Barrang
ou, 2010)。
縮小された部分（すなわち、完全ではないｔｒａｃｒＲＮＡ配列）を使用しており、該部
分は、ｃｒＲＮＡの適切な成熟に必要ではないことが示唆されている(Horvath & Barrang
ou, 2010)。
【0329】
２つの標的は、必須遺伝子（ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニットα）および抗生物
質耐性遺伝子（ｔｅｔＡ様遺伝子）（配列番号）であった。
質耐性遺伝子（ｔｅｔＡ様遺伝子）（配列番号）であった。
【0330】
プライマーを用いて、ｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ＰｌｄｈＡ主鎖を増幅した。ＣＲ
ＩＳＰＲアレイｇＢｌｏｃｋおよびオーバーハングを有する該主鎖を、製造元（ＮｅｗＥ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）の説明書に従い、Ｇｉｂｓｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ
（登録商標）中でアセンブルした。該産物を、最後に、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０エレク
トロコンピテント細胞に形質転換した。
ＩＳＰＲアレイｇＢｌｏｃｋおよびオーバーハングを有する該主鎖を、製造元（ＮｅｗＥ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）の説明書に従い、Ｇｉｂｓｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ
（登録商標）中でアセンブルした。該産物を、最後に、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０エレク
トロコンピテント細胞に形質転換した。
【0331】
１．７．Ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｏｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＬＭＤ－９における
キシロース誘導性システムの特徴付け
一晩培養した定常期の培養液を、対応する抗生剤を含むＴＨｂｒｏｔｈに１：１００で
希釈した。対数増殖期中期の細胞を、様々な濃度のＤ－（＋）－キシロース（０、０．０
０１、０．０１、０．１、０．５および１％ｗｔ／ｖｏｌ）で誘導して、細胞培養液を培
地中で直接測定して、培地の自己蛍光の程度を、細胞懸濁液または懸濁バッファー（ＰＢ
Ｓバッファー）上で評価した。２０μｌの細胞培養液サンプルを、平底の９６ウェルプレ
ート上のＰＢＳバッファーで１／１０に希釈した。細胞懸濁液または培地の蛍光を、プレ
ートリーダーで読んだ。５５８ｎｍの励起波長および６１２ｎｍでの発光を用いてｍＣｈ
ｅｒｒｙ蛍光を測定した。再懸濁した細胞の吸光度を、ＯＤ６００ｎｍで測定した。各実
験について最低３回の独立した生物学的反復試験を行った。
キシロース誘導性システムの特徴付け
一晩培養した定常期の培養液を、対応する抗生剤を含むＴＨｂｒｏｔｈに１：１００で
希釈した。対数増殖期中期の細胞を、様々な濃度のＤ－（＋）－キシロース（０、０．０
０１、０．０１、０．１、０．５および１％ｗｔ／ｖｏｌ）で誘導して、細胞培養液を培
地中で直接測定して、培地の自己蛍光の程度を、細胞懸濁液または懸濁バッファー（ＰＢ
Ｓバッファー）上で評価した。２０μｌの細胞培養液サンプルを、平底の９６ウェルプレ
ート上のＰＢＳバッファーで１／１０に希釈した。細胞懸濁液または培地の蛍光を、プレ
ートリーダーで読んだ。５５８ｎｍの励起波長および６１２ｎｍでの発光を用いてｍＣｈ
ｅｒｒｙ蛍光を測定した。再懸濁した細胞の吸光度を、ＯＤ６００ｎｍで測定した。各実
験について最低３回の独立した生物学的反復試験を行った。
【0332】
１．８．Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓにおけるＣＲＩＳＰＲアレイの活性化
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩおよびをｔｅｔＡ標的とす
るＣＲＩＳＰＲアレイを含有するプラスミドおよびを共に有する、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ ＬＭＤ－９およびＥ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０を、プラスミド維持のための３０
μg／ｍｌのカナマイシンを添加した３ｍｌの培養液中で一晩増殖させた。翌日、９６ウ
ェルのディープウェルプレートに、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを添加した新鮮なＴＨ
培地中で一晩培養した培養液を１００倍希釈して、５００μｌ接種した。対数増殖期中期
の細胞培養液を、１％キシロースで誘導した。死滅効果はＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
およびＥ．ｃｏｌｉ単独で試験した。試験した各株および条件について、ネガティブコン
トロールをキシロースなしで維持した。細胞をＯＤ約０．５まで増殖させ、次にＴＨ培地
中で１０倍段階希釈し、９６ウェルレプリケーター（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ Ｌｉ
ｑｕｉｄａｔｏｒ（商標）９６）を使用して５μＬの体積の液滴を、ＴＨ寒天プレート上
およびｇ／ｌのＰＥＡを添加したＴＨ寒天プレート上にスポットした。プレートを、３７
℃で２４時間インキュベートして、コロニー形成率（ＣＦＵ）を３回測定から計算した。
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩおよびをｔｅｔＡ標的とす
るＣＲＩＳＰＲアレイを含有するプラスミドおよびを共に有する、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ ＬＭＤ－９およびＥ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０を、プラスミド維持のための３０
μg／ｍｌのカナマイシンを添加した３ｍｌの培養液中で一晩増殖させた。翌日、９６ウ
ェルのディープウェルプレートに、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを添加した新鮮なＴＨ
培地中で一晩培養した培養液を１００倍希釈して、５００μｌ接種した。対数増殖期中期
の細胞培養液を、１％キシロースで誘導した。死滅効果はＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
およびＥ．ｃｏｌｉ単独で試験した。試験した各株および条件について、ネガティブコン
トロールをキシロースなしで維持した。細胞をＯＤ約０．５まで増殖させ、次にＴＨ培地
中で１０倍段階希釈し、９６ウェルレプリケーター（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ Ｌｉ
ｑｕｉｄａｔｏｒ（商標）９６）を使用して５μＬの体積の液滴を、ＴＨ寒天プレート上
およびｇ／ｌのＰＥＡを添加したＴＨ寒天プレート上にスポットした。プレートを、３７
℃で２４時間インキュベートして、コロニー形成率（ＣＦＵ）を３回測定から計算した。
【0333】
２．結果
２．１ 増殖条件および選択培地
本発明者らは、最初に、共培養実験に使用することを計画した全ての菌株について増殖
を支持するであろう細菌株および培養プロトコールを確立することに着手した。本発明者
らは、３７℃のＴＨブロス中でＥ．ｃｏｌｉと同様の増殖を支持することができたＳ．
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＬＭＤ－９を使用した（図３）。
２．１ 増殖条件および選択培地
本発明者らは、最初に、共培養実験に使用することを計画した全ての菌株について増殖
を支持するであろう細菌株および培養プロトコールを確立することに着手した。本発明者
らは、３７℃のＴＨブロス中でＥ．ｃｏｌｉと同様の増殖を支持することができたＳ．
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＬＭＤ－９を使用した（図３）。
【0334】
混合培養液から異なる細菌を区別することは、異なる種の細胞数を決定するために重要
である。マッコンキー寒天培地を用いると、大腸菌を選択的に増殖させることが可能であ
るが、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの選択的増殖のための特定の培地は存在しない。Ｐ
ＥＡ寒天培地はグラム陰性菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からグラム陽性菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ）を単離するために使用される選択培地である。さらに、本発明者らは、異なる
濃度のＰＥＡが他のグラム陽性菌の増殖を部分的に阻害することを見出した。これにより
、本研究で使用した他のグラム陽性菌の間の選択が可能になる（図４）。３ｇ／ｌのＰＥ
Ａは、Ｅ．ｃｏｌｉの増殖を制限しながら、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＬＭＤ－９
を選択的に増殖させることが証明された。３ｇ／ｌのＰＥＡは、Ｅ．ｃｏｌｉの増殖を制
限しながら、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＬＭＤ－９を選択的に増殖させることが証
明された。
である。マッコンキー寒天培地を用いると、大腸菌を選択的に増殖させることが可能であ
るが、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの選択的増殖のための特定の培地は存在しない。Ｐ
ＥＡ寒天培地はグラム陰性菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からグラム陽性菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ）を単離するために使用される選択培地である。さらに、本発明者らは、異なる
濃度のＰＥＡが他のグラム陽性菌の増殖を部分的に阻害することを見出した。これにより
、本研究で使用した他のグラム陽性菌の間の選択が可能になる（図４）。３ｇ／ｌのＰＥ
Ａは、Ｅ．ｃｏｌｉの増殖を制限しながら、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＬＭＤ－９
を選択的に増殖させることが証明された。３ｇ／ｌのＰＥＡは、Ｅ．ｃｏｌｉの増殖を制
限しながら、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＬＭＤ－９を選択的に増殖させることが証
明された。
【0335】
２．２．誘導システムの設計と検証
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種の誘導システムは、以前は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇ
ａｔｅｒｉｕｍキシロースオペロン（図５）に基づいて、異種のキシロース誘導カセット
（Ｘｙｌ－Ｓ）を作成することによって開発されていた。ｘｙｌＲおよびｘｙｌＡプロモ
ーターを、それぞれ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの恒常的に発現されるｇｙｒＡおよびｌｄｈプロ
モーターで置換した。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種に対するこの発現カセットは、異な
る種間で、感度および発現レベルに違いがあったが、該システムはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓでは試験しなかった（Xie et al. 2013）。従って、発明者らは、最初に、Ｓ．
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓにおいてキシロース誘導カセットを検証することに着手した。
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種の誘導システムは、以前は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇ
ａｔｅｒｉｕｍキシロースオペロン（図５）に基づいて、異種のキシロース誘導カセット
（Ｘｙｌ－Ｓ）を作成することによって開発されていた。ｘｙｌＲおよびｘｙｌＡプロモ
ーターを、それぞれ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの恒常的に発現されるｇｙｒＡおよびｌｄｈプロ
モーターで置換した。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種に対するこの発現カセットは、異な
る種間で、感度および発現レベルに違いがあったが、該システムはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓでは試験しなかった（Xie et al. 2013）。従って、発明者らは、最初に、Ｓ．
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓにおいてキシロース誘導カセットを検証することに着手した。
【0336】
誘導カセットの代替バージョンを、ｘｙｌＲプロモーターをＳ．ｍｕｔａｎｓのｇｙｒ
Ａプロモーターと置き換えるだけで、内因性Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍのｘｙｌＡプロモ
ーターをそのままにして構築した。キシロース誘導性システムの設計中に、Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍに見いだされる天然型ＰＸｙｌＡプロモーターと、ＰＸｙｌ
Ａプロモーターのリプレッサー結合部位と融合した高度に保存されたプロモーターＰｌｄ
ｈａのハイブリッドプロモーターの、両方のバージョンの誘導性プロモーターを検討した
（図５）。キシロースを代謝すると報告されているＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種はごく
わずかであるため、他のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種におけるｘｙｌＡプロモーターを
認識するための調節機構の存在はありそうもない。従って、我々は両方のキシロース誘導
システムを構築したが、Ｐｌｄｈａ ＋ ＸｙｌＡシステムを用いたｍＣｈｅｒｒｙの誘
導性のみを試験した。
Ａプロモーターと置き換えるだけで、内因性Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍのｘｙｌＡプロモ
ーターをそのままにして構築した。キシロース誘導性システムの設計中に、Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍに見いだされる天然型ＰＸｙｌＡプロモーターと、ＰＸｙｌ
Ａプロモーターのリプレッサー結合部位と融合した高度に保存されたプロモーターＰｌｄ
ｈａのハイブリッドプロモーターの、両方のバージョンの誘導性プロモーターを検討した
（図５）。キシロースを代謝すると報告されているＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種はごく
わずかであるため、他のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種におけるｘｙｌＡプロモーターを
認識するための調節機構の存在はありそうもない。従って、我々は両方のキシロース誘導
システムを構築したが、Ｐｌｄｈａ ＋ ＸｙｌＡシステムを用いたｍＣｈｅｒｒｙの誘
導性のみを試験した。
【0337】
キシロースによるｍＣｈｅｒｒｙ誘導発現を決定するために、プラスミド（ｐＢＡＶ１
ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐｌｄｈａ＋ＸｙｌＡ）を有する細胞の対数増殖期
中期の培養液を、異なる濃度のキシロースで誘導した。誘導の６時間後に、培養液中のｍ
Ｃｈｅｒｒｙ蛍光を測定し、プラスミドを保持している細胞において、全体的にかなり高
い発現レベルが観察された（図６）。キシロースが添加されていない培養液においても、
該システムが相当なレベルの基礎発現を示したことは注目に値する。これは、該システム
が「リーキー（ｌｅａｋｙ）」であることを意味しており、死滅アレイ（ｋｉｌｌ－ａｒ
ｒａｙ）の場合、該システムがキシロースで誘導される前であっても細胞死を招く可能性
がある。しかしながら、本研究の後の過程において、我々はプラスミドバージョンの両方
（ｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐｌｄｈａ＋ＸｙｌＡおよびｐＢＡＶ
１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＰｘｙｌＡ）を用いた。
ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐｌｄｈａ＋ＸｙｌＡ）を有する細胞の対数増殖期
中期の培養液を、異なる濃度のキシロースで誘導した。誘導の６時間後に、培養液中のｍ
Ｃｈｅｒｒｙ蛍光を測定し、プラスミドを保持している細胞において、全体的にかなり高
い発現レベルが観察された（図６）。キシロースが添加されていない培養液においても、
該システムが相当なレベルの基礎発現を示したことは注目に値する。これは、該システム
が「リーキー（ｌｅａｋｙ）」であることを意味しており、死滅アレイ（ｋｉｌｌ－ａｒ
ｒａｙ）の場合、該システムがキシロースで誘導される前であっても細胞死を招く可能性
がある。しかしながら、本研究の後の過程において、我々はプラスミドバージョンの両方
（ｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐｌｄｈａ＋ＸｙｌＡおよびｐＢＡＶ
１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＰｘｙｌＡ）を用いた。
【0338】
２．３ ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９アレイの設計
ＣＲＩＳＰＲアレイのゲノムを標的とするスペーサーがＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
ＬＭＤ－９の死を引き起こす可能性があるかどうかを決定するために、我々は既に構築
した２つのキシロース誘導性システム（ｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ－
Ｐｌｄｈａ＋ＸｙｌＡおよびｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＰｘｙｌＡ
）に、設計したＣＲＩＳＰＲアレイを挿入した。これらのプラスミドにおいて、ｍＣｈｅ
ｒｒｙを、ＣＲＩＳＰＲアレイを含有するｇＢｌｏｃｋで置換した（図７）。Ｐｌｄｈａ
＋ＸｙｌＡプロモーターを有する変異体は、ＰｘｙｌＡを有する変異体よりも強く、かつ
、より高い基礎活性を有することが予想された（Xie et al.2013）。
ＣＲＩＳＰＲアレイのゲノムを標的とするスペーサーがＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
ＬＭＤ－９の死を引き起こす可能性があるかどうかを決定するために、我々は既に構築
した２つのキシロース誘導性システム（ｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ－
Ｐｌｄｈａ＋ＸｙｌＡおよびｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＰｘｙｌＡ
）に、設計したＣＲＩＳＰＲアレイを挿入した。これらのプラスミドにおいて、ｍＣｈｅ
ｒｒｙを、ＣＲＩＳＰＲアレイを含有するｇＢｌｏｃｋで置換した（図７）。Ｐｌｄｈａ
＋ＸｙｌＡプロモーターを有する変異体は、ＰｘｙｌＡを有する変異体よりも強く、かつ
、より高い基礎活性を有することが予想された（Xie et al.2013）。
【0339】
２．４． 内因性Ｃａｓ９を用いた細菌集団の増殖の阻害
Ｅ．ｃｏｌｉでプラスミドを構築した後、該プラスミドをＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓに形質転換した。これにより、特定の細菌種の細胞の死を引き起こす可能性があるかど
うかを決定することができるであろう。興味深いことに、強いＰｌｄｈ＋ＸｙｌＡハイブ
リッドプロモーターを含有するプラスミドにさらされたＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの
細菌宿主集団サイズ（寒天プレート上で細菌を増殖させて、コロニー数をカウントするこ
とによって示される）は、弱い、正常なＰｘｙｌＡプロモーターを含有するプラスミドに
さらされたＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓと比較して１０倍小さかった（図８；強力なア
レイ発現を有する５２個のコロニー対弱いアレイ発現を有する５５６個のコロニー、１０
．７倍の差）。これら２つの株は、同じバッチのエレクトロコンピテントＳ．ｔｈｅｒｍ
ｏｐｈｉｌｕｓ細胞を用いて同時に形質転換された。これは、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｕｓ遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲアレイを保有するプラスミドが、内因性Ｃａｓヌク
レアーゼおよびＲＮａｓｅＩＩＩを使用して細胞を死滅させることができ、それによって
集団の増殖を１０倍阻害できることを示唆している。
Ｅ．ｃｏｌｉでプラスミドを構築した後、該プラスミドをＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓに形質転換した。これにより、特定の細菌種の細胞の死を引き起こす可能性があるかど
うかを決定することができるであろう。興味深いことに、強いＰｌｄｈ＋ＸｙｌＡハイブ
リッドプロモーターを含有するプラスミドにさらされたＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの
細菌宿主集団サイズ（寒天プレート上で細菌を増殖させて、コロニー数をカウントするこ
とによって示される）は、弱い、正常なＰｘｙｌＡプロモーターを含有するプラスミドに
さらされたＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓと比較して１０倍小さかった（図８；強力なア
レイ発現を有する５２個のコロニー対弱いアレイ発現を有する５５６個のコロニー、１０
．７倍の差）。これら２つの株は、同じバッチのエレクトロコンピテントＳ．ｔｈｅｒｍ
ｏｐｈｉｌｕｓ細胞を用いて同時に形質転換された。これは、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｕｓ遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲアレイを保有するプラスミドが、内因性Ｃａｓヌク
レアーゼおよびＲＮａｓｅＩＩＩを使用して細胞を死滅させることができ、それによって
集団の増殖を１０倍阻害できることを示唆している。
【0340】
我々は、ＰｘｙｌＡプロモーターを含むプラスミドによって形質転換された宿主細胞に
おける弱いアレイ発現が、強力なプロモータープラスミドを用いた場合よりはるかに少な
いにもかかわらず、ある程度の細胞の死滅をもたらしたと予想する。我々は、強力なアレ
イ発現の活性が、いずれのアレイをコードするプラスミドにも曝露されていないＳ ｔｈ
ｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（腸内微生物叢から直接分離された細菌など）と比較された場合、
観察された１０倍阻害よりも大きい集団増殖阻害が決定されるであろうと我々は予想する
。したがって、我々は、内因性Ｃａｓヌクレアーゼを利用するための宿主細胞におけるア
レイ（またはシングルガイドＲＮＡ）発現は、本明細書に記載の環境的、医学的および他
の状況において標的宿主細胞の効果的な増殖阻害を提供するために有用であろうと信じて
いる。抗生物質の同時投与はまた、特に１つ以上の抗生物質耐性遺伝子を標的とする場合
に、増殖阻害を増強するのに有用であろう。
おける弱いアレイ発現が、強力なプロモータープラスミドを用いた場合よりはるかに少な
いにもかかわらず、ある程度の細胞の死滅をもたらしたと予想する。我々は、強力なアレ
イ発現の活性が、いずれのアレイをコードするプラスミドにも曝露されていないＳ ｔｈ
ｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（腸内微生物叢から直接分離された細菌など）と比較された場合、
観察された１０倍阻害よりも大きい集団増殖阻害が決定されるであろうと我々は予想する
。したがって、我々は、内因性Ｃａｓヌクレアーゼを利用するための宿主細胞におけるア
レイ（またはシングルガイドＲＮＡ）発現は、本明細書に記載の環境的、医学的および他
の状況において標的宿主細胞の効果的な増殖阻害を提供するために有用であろうと信じて
いる。抗生物質の同時投与はまた、特に１つ以上の抗生物質耐性遺伝子を標的とする場合
に、増殖阻害を増強するのに有用であろう。
【0341】
３．考察および展望
本研究において、内因性Ｃａｓ９システムを用いてＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを特
異的に死滅させるためのＣＲＩＳＰＲアレイの設計に着手した。死滅シグナルを制御する
ために、我々はＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに適用することができる誘導システムを適
用しようとした。Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来のキシロース誘導性ＸｙｌＲシステムは
、既にＳ．ｍｕｔａｎｓにおいて適用されているが（Xie, 2013）、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓにおいては適用されていない。本研究では、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに
おいて、設計したＸｙｌＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐｌｄｈａ回路（ｃｉｒｃｕｉｔ）を用い
てｘｙｌＲ誘導システムの機能性を検証した。我々は、０．１％ｗｔ／ｖｏｌが、Ｓ．ｔ
ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓにおいてＸｙｌＲシステムを完全に誘導するのに十分であること
を見出した（図６）。
本研究において、内因性Ｃａｓ９システムを用いてＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを特
異的に死滅させるためのＣＲＩＳＰＲアレイの設計に着手した。死滅シグナルを制御する
ために、我々はＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに適用することができる誘導システムを適
用しようとした。Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来のキシロース誘導性ＸｙｌＲシステムは
、既にＳ．ｍｕｔａｎｓにおいて適用されているが（Xie, 2013）、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓにおいては適用されていない。本研究では、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに
おいて、設計したＸｙｌＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐｌｄｈａ回路（ｃｉｒｃｕｉｔ）を用い
てｘｙｌＲ誘導システムの機能性を検証した。我々は、０．１％ｗｔ／ｖｏｌが、Ｓ．ｔ
ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓにおいてＸｙｌＲシステムを完全に誘導するのに十分であること
を見出した（図６）。
【0342】
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓとＥ．ｃｏｌｉとを共培養する場合に存在量を観察する
ために、３ｇ／ｌのＰＥＡを培養培地に添加することにより、Ｅ．ｃｏｌｉの増殖を制限
しながらＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを選択的に増殖させることを確立した（図４）。
ために、３ｇ／ｌのＰＥＡを培養培地に添加することにより、Ｅ．ｃｏｌｉの増殖を制限
しながらＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを選択的に増殖させることを確立した（図４）。
【0343】
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＬＭＤ－９ゲノムにおいてＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ
サブユニットおよびｔｅｔＡ様遺伝子を標的とするＳＴ１－ＣＲＩＳＰＲアレイを、キシ
ロース誘導性プロモーター（Xie et al. 2013）支配下に置いた。これらの領域を標的と
することは、二重鎖切断を引き起こし、それゆえにＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの生存
率を制限するはずである（図９）。操作されたアレイは、コードされたＣＲＩＳＰＲアレ
イをプロセシングするための内因性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ装置を用いてＳ．ｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓゲノムを標的とするように設計されているので、該アレイは、Ｅ．ｃｏｌｉ
などの無関係な株の増殖に影響を及ぼさないと予想され、そのゲノム上に見出し得る同様
の標的にさえ、影響を及ぼさないと予想される。実施例３で論じるように、このことは混
合細菌集団（ヒト微生物叢の局面を模倣する）において試験することに成功した。
サブユニットおよびｔｅｔＡ様遺伝子を標的とするＳＴ１－ＣＲＩＳＰＲアレイを、キシ
ロース誘導性プロモーター（Xie et al. 2013）支配下に置いた。これらの領域を標的と
することは、二重鎖切断を引き起こし、それゆえにＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの生存
率を制限するはずである（図９）。操作されたアレイは、コードされたＣＲＩＳＰＲアレ
イをプロセシングするための内因性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ装置を用いてＳ．ｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓゲノムを標的とするように設計されているので、該アレイは、Ｅ．ｃｏｌｉ
などの無関係な株の増殖に影響を及ぼさないと予想され、そのゲノム上に見出し得る同様
の標的にさえ、影響を及ぼさないと予想される。実施例３で論じるように、このことは混
合細菌集団（ヒト微生物叢の局面を模倣する）において試験することに成功した。
【0344】
表面上での宿主細胞増殖を阻害する能力の実証は、本発明がヒトまたは動物対象におい
て本明細書中に開示される微生物叢によって媒介または引き起こされる疾病または症状を
治療または予防することを目的とした実施形態において、重要かつ望ましい。これらの微
生物叢は、典型的には対象の組織（例えば、腸組織）と接触しており、従って、表面上で
の微生物叢細菌種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓにより例示される）の増殖を阻害する活
性の実証が、この実用性を指示すると信じている。
て本明細書中に開示される微生物叢によって媒介または引き起こされる疾病または症状を
治療または予防することを目的とした実施形態において、重要かつ望ましい。これらの微
生物叢は、典型的には対象の組織（例えば、腸組織）と接触しており、従って、表面上で
の微生物叢細菌種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓにより例示される）の増殖を阻害する活
性の実証が、この実用性を指示すると信じている。
【0345】
実施例２：異なる株における、特定の微生物叢細菌集団の増殖阻害
実施例１は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＬＭＤ－９の
特異的な増殖阻害を実証した。ここに、増殖阻害が、第二の株：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＳＭ ２０６１７においても得られ得ることを実証
する。実施例１に記載した方法を、それゆえ、後者の株に適用した（ただし、Ｓ．ｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＳＭ ２０６１７の選択培地は、２．５ｇ／ｌの２－フェニルエ
タノール（ＰＥＡ）を添加したＴＨ培地であったことを除く）。
実施例１は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＬＭＤ－９の
特異的な増殖阻害を実証した。ここに、増殖阻害が、第二の株：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＳＭ ２０６１７においても得られ得ることを実証
する。実施例１に記載した方法を、それゆえ、後者の株に適用した（ただし、Ｓ．ｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＳＭ ２０６１７の選択培地は、２．５ｇ／ｌの２－フェニルエ
タノール（ＰＥＡ）を添加したＴＨ培地であったことを除く）。
【0346】
ＣＲＩＳＰＲアレイプラスミドで形質転換したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＳＭ ２０６１７を、回復のために３７℃で３時間、液体培地中でイ
ンキュベートして、カナマイシン耐性の発現を可能にした。回復期間の後、細胞の死を誘
導するために、細胞を１％キシロースの存在下で、およびコントロールとしてキシロース
なしで、異なる選択培地中にプレーティングした（図１０）。（１）キシロース誘導によ
りＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの増殖を阻害することができ（「強い」プロモーターは
、コントロールの約１０倍）、（２）「強い」システム（ｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－
ＣＲＩＳＰＲ－ＰｌｄｈＡ）は「弱い」システム（ｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ＣＲＩ
ＳＰＲ－ＰｘｙｌＡ）よりもより増殖低下をもたらすことが明らかである。
ｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＳＭ ２０６１７を、回復のために３７℃で３時間、液体培地中でイ
ンキュベートして、カナマイシン耐性の発現を可能にした。回復期間の後、細胞の死を誘
導するために、細胞を１％キシロースの存在下で、およびコントロールとしてキシロース
なしで、異なる選択培地中にプレーティングした（図１０）。（１）キシロース誘導によ
りＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの増殖を阻害することができ（「強い」プロモーターは
、コントロールの約１０倍）、（２）「強い」システム（ｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－
ＣＲＩＳＰＲ－ＰｌｄｈＡ）は「弱い」システム（ｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ＣＲＩ
ＳＰＲ－ＰｘｙｌＡ）よりもより増殖低下をもたらすことが明らかである。
【0347】
実施例３：異なる微生物叢の種の混合共同体における、選択的細菌集団増殖阻害
次に、これらの種の混合集団における、特定の細菌種の選択的増殖阻害を実証した。ヒ
トおよび動物の腸内微生物叢に見出される種を選択した（Ｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
ＤＳＭ ２０６１７（Ｔ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓおよびＥ ｃ
ｏｌｉ）。これがＳ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの種の選択的死滅の能力に影響を与える
かどうかを確かめるために２つのグラム陽性種（Ｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＬ
ｌａｃｔｉｓ）を含めた；さらに、複雑さを増すために（および、微生物叢の状況をよ
り厳密に模倣するために）、Ｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに系統学的に関連する種（２
つの種間の１６ｓリボソームＲＮＡの高い配列同一性によって示される）であるがゆえに
Ｌ ｌａｃｔｉｓを選択した。Ｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＬ ｌａｃｔｉｓは
共に、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）である。さらに、微生物叢を模倣
するために、ヒト片利共生腸内種（Ｅ ｃｏｌｉ）を含めた。
次に、これらの種の混合集団における、特定の細菌種の選択的増殖阻害を実証した。ヒ
トおよび動物の腸内微生物叢に見出される種を選択した（Ｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
ＤＳＭ ２０６１７（Ｔ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓおよびＥ ｃ
ｏｌｉ）。これがＳ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの種の選択的死滅の能力に影響を与える
かどうかを確かめるために２つのグラム陽性種（Ｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＬ
ｌａｃｔｉｓ）を含めた；さらに、複雑さを増すために（および、微生物叢の状況をよ
り厳密に模倣するために）、Ｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに系統学的に関連する種（２
つの種間の１６ｓリボソームＲＮＡの高い配列同一性によって示される）であるがゆえに
Ｌ ｌａｃｔｉｓを選択した。Ｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＬ ｌａｃｔｉｓは
共に、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）である。さらに、微生物叢を模倣
するために、ヒト片利共生腸内種（Ｅ ｃｏｌｉ）を含めた。
【0348】
１．材料および方法
実施例１で設定した方法を用いた（ただし、選択培地が、２．５ｇ／ｌの２－フェニル
エタノール（ＰＥＡ）を添加したＴＨ培地であることを除く）。
実施例１で設定した方法を用いた（ただし、選択培地が、２．５ｇ／ｌの２－フェニル
エタノール（ＰＥＡ）を添加したＴＨ培地であることを除く）。
【0349】
１．１ エレクトロコンピテントＬ．ｌａｃｔｉｓ細胞の調製
０．５Ｍショ糖および１％グリシンを添加したＴＨ培地中のＬ．ｌａｃｔｉｓの一晩培
養した培養液を、５ｍｌの同じ培地中で１００倍希釈し、０．２～０．７の間のＯＤ６０
０まで３０℃で増殖させた（播種後約２時間）。
細胞を、７０００×ｇ、４℃、５分間で回収し、５ｍｌの氷冷洗浄バッファー（０．５Ｍ
ショ糖＋１０％グリセロール）で３回洗浄した。細胞を洗浄後、エレクトロポレーション
バッファー（０．５Ｍショ糖、１０％グリセロールおよび１ｍＭ ＭｇＣｌ２）にＯＤ６
００が１５～３０になるように懸濁した。エレクトロポレーションバッファー中の細胞は
、使用するまで、４℃で保存されたか（１時間以内）、あるいは、エッペンドルフチュー
ブに５０μｌずつ分注し、液体窒素中で凍結し、後で使用するために－８０℃で保管され
た。全ての種に対するエレクトロポレーションの条件は、実施例１に記載した通りであっ
た。
０．５Ｍショ糖および１％グリシンを添加したＴＨ培地中のＬ．ｌａｃｔｉｓの一晩培
養した培養液を、５ｍｌの同じ培地中で１００倍希釈し、０．２～０．７の間のＯＤ６０
０まで３０℃で増殖させた（播種後約２時間）。
細胞を、７０００×ｇ、４℃、５分間で回収し、５ｍｌの氷冷洗浄バッファー（０．５Ｍ
ショ糖＋１０％グリセロール）で３回洗浄した。細胞を洗浄後、エレクトロポレーション
バッファー（０．５Ｍショ糖、１０％グリセロールおよび１ｍＭ ＭｇＣｌ２）にＯＤ６
００が１５～３０になるように懸濁した。エレクトロポレーションバッファー中の細胞は
、使用するまで、４℃で保存されたか（１時間以内）、あるいは、エッペンドルフチュー
ブに５０μｌずつ分注し、液体窒素中で凍結し、後で使用するために－８０℃で保管され
た。全ての種に対するエレクトロポレーションの条件は、実施例１に記載した通りであっ
た。
【0350】
１．２ ＣＲＩＳＰＲアレイの活性化：共同体実験。
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＤＳＭ ２０６１７、Ｌ．ｌａｃｔｉｓＭＧ１３６３お
よびＥ．ｃｏｌｉＴＯＰ１０を、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤＮＡポリメラーゼＩ
ＩＩおよびｔｅｔＡを標的とするＣＲＩＳＰＲアレイを含有するプラスミドで遺伝子形質
転換した。形質転換の後、全ての細胞を単独で、および、共培養で、３７℃で３時間増殖
させ、プラスミド中にコードされた抗生物質耐性を発現させるための回復を可能にした。
ＣＲＩＳＰＲでコードされた増殖阻害の読み取りとして形質転換効率を使用することとし
た。それゆえ、細胞を回復させた後に、培養液をＴＨ培地にプレーティングした。ＴＨ培
地にはＰＥＡを添加し、マッコンキー寒天培地には全てカナマイシンを添加し、１％キシ
ロースで誘導した。
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＤＳＭ ２０６１７、Ｌ．ｌａｃｔｉｓＭＧ１３６３お
よびＥ．ｃｏｌｉＴＯＰ１０を、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤＮＡポリメラーゼＩ
ＩＩおよびｔｅｔＡを標的とするＣＲＩＳＰＲアレイを含有するプラスミドで遺伝子形質
転換した。形質転換の後、全ての細胞を単独で、および、共培養で、３７℃で３時間増殖
させ、プラスミド中にコードされた抗生物質耐性を発現させるための回復を可能にした。
ＣＲＩＳＰＲでコードされた増殖阻害の読み取りとして形質転換効率を使用することとし
た。それゆえ、細胞を回復させた後に、培養液をＴＨ培地にプレーティングした。ＴＨ培
地にはＰＥＡを添加し、マッコンキー寒天培地には全てカナマイシンを添加し、１％キシ
ロースで誘導した。
【0351】
２．結果
２．０ Ｌ．ｌａｃｔｉｓ、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの間の系
統発生的距離
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＬ．ｌａｃｔｉｓの１６Ｓ ｒＲＮＡをコードす
るＤＮＡ配列における計算される配列類似性は８３．３％と決定された。以下の１６S配
列を用いた：Ｅ．ｃｏｌｉ：ＡＢ０３０９１８．１、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ：Ａ
Ｙ１８８３５４．１、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ：ＡＢ０３０９１８。
配列はニードル（ｎｅｅｄｌｅ）(http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucl
eotide.html)で、以下のパラメーターを用いてアライメントした：－ｇａｐｏｐｅｎ１０
．０－ｇａｐｅｘｔｅｎｄ０．５－ｅｎｄｏｐｅｎ１０．０－ｅｎｄｅｘｔｅｎｄ０．５
－ａｆｏｒｍａｔ３ｐａｉｒ－ｓｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ１－ｓｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ２。
図１１は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｌａｃｔｉｓおよびＥ．ｃｏｌｉ由来の
１６Ｓ配列の最尤系統樹を示している。
２．０ Ｌ．ｌａｃｔｉｓ、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの間の系
統発生的距離
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＬ．ｌａｃｔｉｓの１６Ｓ ｒＲＮＡをコードす
るＤＮＡ配列における計算される配列類似性は８３．３％と決定された。以下の１６S配
列を用いた：Ｅ．ｃｏｌｉ：ＡＢ０３０９１８．１、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ：Ａ
Ｙ１８８３５４．１、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ：ＡＢ０３０９１８。
配列はニードル（ｎｅｅｄｌｅ）(http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucl
eotide.html)で、以下のパラメーターを用いてアライメントした：－ｇａｐｏｐｅｎ１０
．０－ｇａｐｅｘｔｅｎｄ０．５－ｅｎｄｏｐｅｎ１０．０－ｅｎｄｅｘｔｅｎｄ０．５
－ａｆｏｒｍａｔ３ｐａｉｒ－ｓｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ１－ｓｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ２。
図１１は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｌａｃｔｉｓおよびＥ．ｃｏｌｉ由来の
１６Ｓ配列の最尤系統樹を示している。
【0352】
２．１増殖条件および選択培地
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＬ．ｌａｃｔｉｓは一般的に多くの発酵食品やヨ
ーグルトに一緒に使用されている。これらは、宿主と密接な関係を形成する腸内微生物で
あることが一般的に知られていること、および、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＬ
．ｌａｃｔｉｓの１６ＳリボソームＲＮＡ領域の以前の特徴付けで、これらの生物が系統
学的に密接に関連していることを示したこと（Ludwig et al。、1995）から、これらの株
を選択した。同時に、Ｅ．ｃｏｌｉもまた、腸微生物群集においても一般的に見られるの
で、我々の混合集団共培養実験のためにＥ．ｃｏｌｉの増殖もまた評価した。最初に、我
々が共培養実験に使用することを計画した全ての菌株の増殖を支持するであろう、細菌株
および培養プロトコールを確立することに着手した。我々は、全ての株が３７℃でのＴＨ
ブロス中での増殖を支持することができることを見出した（図３）。
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＬ．ｌａｃｔｉｓは一般的に多くの発酵食品やヨ
ーグルトに一緒に使用されている。これらは、宿主と密接な関係を形成する腸内微生物で
あることが一般的に知られていること、および、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＬ
．ｌａｃｔｉｓの１６ＳリボソームＲＮＡ領域の以前の特徴付けで、これらの生物が系統
学的に密接に関連していることを示したこと（Ludwig et al。、1995）から、これらの株
を選択した。同時に、Ｅ．ｃｏｌｉもまた、腸微生物群集においても一般的に見られるの
で、我々の混合集団共培養実験のためにＥ．ｃｏｌｉの増殖もまた評価した。最初に、我
々が共培養実験に使用することを計画した全ての菌株の増殖を支持するであろう、細菌株
および培養プロトコールを確立することに着手した。我々は、全ての株が３７℃でのＴＨ
ブロス中での増殖を支持することができることを見出した（図３）。
【0353】
混合培養液から異なる細菌を区別することは、異なる種の細胞数を決定するために重要
である。マッコンキー寒天培地を用いると、大腸菌を選択的に増殖させることが可能であ
るが、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの選択的増殖のための特定の培地は存在しない。Ｐ
ＥＡ寒天培地はグラム陰性菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からグラム陽性菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ）を単離するために使用される選択培地である。さらに、異なる濃度のＰＥＡが
異なるグラム陽性菌および株の増殖を部分的に阻害し、これにより、本研究で使用した他
のグラム陽性細菌の間の選択が可能になる。２．５ｇ／ｌのＰＥＡの使用は、Ｌ．ｌａｃ
ｔｉｓおよびＥ．ｃｏｌｉの増殖を制限しながら、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを選択
的に増殖させることが証明された。
である。マッコンキー寒天培地を用いると、大腸菌を選択的に増殖させることが可能であ
るが、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの選択的増殖のための特定の培地は存在しない。Ｐ
ＥＡ寒天培地はグラム陰性菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からグラム陽性菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ）を単離するために使用される選択培地である。さらに、異なる濃度のＰＥＡが
異なるグラム陽性菌および株の増殖を部分的に阻害し、これにより、本研究で使用した他
のグラム陽性細菌の間の選択が可能になる。２．５ｇ／ｌのＰＥＡの使用は、Ｌ．ｌａｃ
ｔｉｓおよびＥ．ｃｏｌｉの増殖を制限しながら、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを選択
的に増殖させることが証明された。
【0354】
全ての株を、カナマイシン選択マーカーを有するｐＢＡＶ１ＫＴ５のベクター主鎖を用
いたプラスミドで形質転換した；我々は、プラスミドを維持しながら細胞を増殖させるの
に、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを添加した培地を用いることは十分であることを見出
した。
いたプラスミドで形質転換した；我々は、プラスミドを維持しながら細胞を増殖させるの
に、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを添加した培地を用いることは十分であることを見出
した。
【0355】
２．３ 混合集団における形質転換および選択的増殖阻害
我々は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ、およびＥ．ｃｏｌｉを、
ＣＲＩＳＰＲアレイを含むプラスミドで形質転換し、それら全ての細菌種を等分に組み合
わせた共同体で培養した。これにより、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓにおいて細胞の死
を特異的に引き起こす可能性があるかどうかを判断できるであろう。全ての種を、ｐＢＡ
Ｖ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ＣＲＩＳＰＲ－ＰＸｙｌＡまたはｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－
ＣＲＩＳＰＲ－Ｐｌｄｈａ＋ＸｙｌＡプラスミドのいずれかで形質転換した。
我々は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ、およびＥ．ｃｏｌｉを、
ＣＲＩＳＰＲアレイを含むプラスミドで形質転換し、それら全ての細菌種を等分に組み合
わせた共同体で培養した。これにより、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓにおいて細胞の死
を特異的に引き起こす可能性があるかどうかを判断できるであろう。全ての種を、ｐＢＡ
Ｖ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ＣＲＩＳＰＲ－ＰＸｙｌＡまたはｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－
ＣＲＩＳＰＲ－Ｐｌｄｈａ＋ＸｙｌＡプラスミドのいずれかで形質転換した。
【0356】
図１２は、ｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ＣＲＩＳＰＲ－ＰｘｙｌＡまたはｐＢＡＶ１
ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ＣＲＩＳＰＲ－ＰｌｄｈＡ＋ＸｙｌＡプラスミドのいずれかを有する
Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｌ．ｌａｃｔｉｓおよびＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの共培養物におけ
るＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの選択的増殖阻害を示す。ｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ
－ＣＲＩＳＰＲ－ＰｘｙｌＡまたはｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｐｌｄ
ｈＡ＋ＸｙｌＡプラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ（中央の列）の間で増殖の違いは観察さ
れない。しかしながら、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（２．５μｌ／１ＰＥＡを添加し
たＴＨ寒天プレート上で選択的に増殖させた、最後の列）は、ｐＢＡＶ１ＫＴ５－Ｘｙｌ
Ｒ－ＣＲＩＳＰＲ－ＰｘｙｌＡ（強い）またはｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ＣＲＩＳＰ
Ｒ－ＰｌｄｈＡ（弱い）プラスミドの間で、予想通り形質転換効率の低下を示す。従って
、細胞の混合集団における標的とするＳ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ亜集団の選択的増殖
阻害を実証した。
ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ＣＲＩＳＰＲ－ＰｌｄｈＡ＋ＸｙｌＡプラスミドのいずれかを有する
Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｌ．ｌａｃｔｉｓおよびＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの共培養物におけ
るＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの選択的増殖阻害を示す。ｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ
－ＣＲＩＳＰＲ－ＰｘｙｌＡまたはｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｐｌｄ
ｈＡ＋ＸｙｌＡプラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ（中央の列）の間で増殖の違いは観察さ
れない。しかしながら、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（２．５μｌ／１ＰＥＡを添加し
たＴＨ寒天プレート上で選択的に増殖させた、最後の列）は、ｐＢＡＶ１ＫＴ５－Ｘｙｌ
Ｒ－ＣＲＩＳＰＲ－ＰｘｙｌＡ（強い）またはｐＢＡＶ１ＫＴ５－ＸｙｌＲ－ＣＲＩＳＰ
Ｒ－ＰｌｄｈＡ（弱い）プラスミドの間で、予想通り形質転換効率の低下を示す。従って
、細胞の混合集団における標的とするＳ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ亜集団の選択的増殖
阻害を実証した。
【0357】
参考文献
１．Barrangou, R., Fremaux, C., Deveau, H., Richards, M., Patrick Boyaval, Moine
au, S., … Horvath, P. (2007). CRISPRProvides Acquired Resistance Against Viruse
s in Prokaryotes. Science, 315(March), 1709―1712.
２．Bryksin, A. V, & Matsumura, I. (2010). Rational design of a plasmid origin t
hat replicates efficiently in both gram－positive and gram－negative bacteria. P
loS One, 5(10), e13244.
３．Chan CTY, Lee JW, Cameron DE, Bashor CJ, Collins JJ: “Deadman” and “Passc
ode” microbial kill switches for bacterial containment. Nat Chem Biol 2015, 12(
December):1―7.
４．Horvath, P., Romero, D. A., Coute－Monvoisin, A.－C., Richards, M., Deveau,
H., Moineau, S., … Barrangou, R. (2008). Diversity, activity, and evolution of
CRISPR loci in Streptococcus thermophilus. Journal of Bacteriology, 190(4), 1401
―12.
５．Ludwig, E. S., Klipper, R., Magrum L., Wose C., & Stackebrandt, E. (1985). T
he phylogenetic position of Streptococcus and Enterococcus. Journul of Gencwl Mi
crohiologj., 131, 543―55 1.
６．Mercenier, A. (1990). Molecular genetics of Streptococcus thermophilus. FEMS
Microbiology Letters, 87(1－2), 61―77.
７．Samarzija, D., Antunac, N., & Havranek, J. (2001). Taxonomy, physiology and
growth of Lactococcus lactis: a review. Mljekarstvo, 51(1), 35―48. Retrieved fr
om
８．Sapranauskas, R., Gasiunas, G., Fremaux, C., Barrangou, R., Horvath, P., & S
iksnys, V. (2011). The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides imm
unity in Escherichia coli. Nucleic Acids Research, 39(21), 9275―9282.
９．Somkuti, G. A., & Steinberg, D. H. (1988). Genetic transformation of Strepto
coccus thermophilus by electroporation. Biochimie, 70(4), 579―585
１０．Sorg, R. A., Kuipers, O. P., & Veening, J.－W. (2014). Gene expression pla
tform for synthetic biology in the human pathogen Streptococcus pneumoniae. ACS
Synthetic Biology, 4(3), 228―239.
１１．Suvorov, a. (1988). Transformation of group A streptococci by electroporat
ion. FEMS Microbiology Letters, 56(1), 95―99.
１２．Xie, Z., Qi, F., & Merritt, J. (2013). Development of a tunable wide－rang
e gene induction system useful for the study of streptococcal toxin－antitoxin s
ystems. Applied and Environmental Microbiology, 79(20), 6375―84.
１３．Zhang, X. Z., & Zhang, Y. H. P. (2011). Simple, fast and high－efficiency
transformation system for directed evolution of cellulase in Bacillus subtilis.
Microbial Biotechnology, 4(1), 98―105.
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s in Prokaryotes. Science, 315(March), 1709―1712.
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hat replicates efficiently in both gram－positive and gram－negative bacteria. P
loS One, 5(10), e13244.
３．Chan CTY, Lee JW, Cameron DE, Bashor CJ, Collins JJ: “Deadman” and “Passc
ode” microbial kill switches for bacterial containment. Nat Chem Biol 2015, 12(
December):1―7.
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H., Moineau, S., … Barrangou, R. (2008). Diversity, activity, and evolution of
CRISPR loci in Streptococcus thermophilus. Journal of Bacteriology, 190(4), 1401
―12.
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growth of Lactococcus lactis: a review. Mljekarstvo, 51(1), 35―48. Retrieved fr
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unity in Escherichia coli. Nucleic Acids Research, 39(21), 9275―9282.
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coccus thermophilus by electroporation. Biochimie, 70(4), 579―585
１０．Sorg, R. A., Kuipers, O. P., & Veening, J.－W. (2014). Gene expression pla
tform for synthetic biology in the human pathogen Streptococcus pneumoniae. ACS
Synthetic Biology, 4(3), 228―239.
１１．Suvorov, a. (1988). Transformation of group A streptococci by electroporat
ion. FEMS Microbiology Letters, 56(1), 95―99.
１２．Xie, Z., Qi, F., & Merritt, J. (2013). Development of a tunable wide－rang
e gene induction system useful for the study of streptococcal toxin－antitoxin s
ystems. Applied and Environmental Microbiology, 79(20), 6375―84.
１３．Zhang, X. Z., & Zhang, Y. H. P. (2011). Simple, fast and high－efficiency
transformation system for directed evolution of cellulase in Bacillus subtilis.
Microbial Biotechnology, 4(1), 98―105.
【0358】
実施例４：混合腸内微生物叢集団におけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｉｃｉｌｅの
比率の変更
細菌の比率の変更は、混合腸内微生物叢サンプル中のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆ
ｉｃｉｌｅ細菌のノックダウンを参照して記載されている本実施例に従って行われるであ
ろう。該サンプルは、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓおよびメトロニダゾール（ＭＴＺ）耐性Ｃ
ｄｉｆｉｃｉｌｅ株６３０亜集団を含有するであろう。エクスビボで、該混合集団を、
ＣＲＩＳＰＲアレイを含むように操作されているキャリア細菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ Ｌａ － １４および／またはＬａ － ５）の集団と組み合
わせる。
比率の変更
細菌の比率の変更は、混合腸内微生物叢サンプル中のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆ
ｉｃｉｌｅ細菌のノックダウンを参照して記載されている本実施例に従って行われるであ
ろう。該サンプルは、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓおよびメトロニダゾール（ＭＴＺ）耐性Ｃ
ｄｉｆｉｃｉｌｅ株６３０亜集団を含有するであろう。エクスビボで、該混合集団を、
ＣＲＩＳＰＲアレイを含むように操作されているキャリア細菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ Ｌａ － １４および／またはＬａ － ５）の集団と組み合
わせる。
【0359】
各ＣＲＩＳＰＲアレイは、キャリア細菌およびＣ ｄｉｆｉｃｉｌｅ細胞と互換性のあ
るプラスミドに含まれている。該アレイは、ｏｒｉＴ、ｉｎｔＤＯＴ配列、ｔｅｔＱ－ｒ
ｔｅＡ－ｒｔｅＢオペロン、ｒｔｅＣおよびオペロンｘｉｓ２ｃ－ｘｉｓ２ｄ－ｏｒｆ３
－ｅｘｃもまた含むＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ ＣＴｎ
Ｄｏｔトランスポゾンに含まれる。ある実験では、ｍｏｂおよびｔｒａオペロンは除かれ
る（その代わりに、トランスポゾンがキャリア細菌と組み合わされた混合物中で移送され
るＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓの細胞によって供給されるオペロンに依存する）。別の実験で
は、ｍｏｂおよびｔｒａオペロンがトランスポゾンに含まれている。
るプラスミドに含まれている。該アレイは、ｏｒｉＴ、ｉｎｔＤＯＴ配列、ｔｅｔＱ－ｒ
ｔｅＡ－ｒｔｅＢオペロン、ｒｔｅＣおよびオペロンｘｉｓ２ｃ－ｘｉｓ２ｄ－ｏｒｆ３
－ｅｘｃもまた含むＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ ＣＴｎ
Ｄｏｔトランスポゾンに含まれる。ある実験では、ｍｏｂおよびｔｒａオペロンは除かれ
る（その代わりに、トランスポゾンがキャリア細菌と組み合わされた混合物中で移送され
るＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓの細胞によって供給されるオペロンに依存する）。別の実験で
は、ｍｏｂおよびｔｒａオペロンがトランスポゾンに含まれている。
【0360】
細胞質膜を横切るタンパク質移行は、全ての細菌において必須の過程である。その中核
にＡＴＰａｓｅであるＳｅｃＡ、および膜チャネルであるＳｅｃＹＥＧを含むＳｅｃシス
テムは、このタンパク質輸送の大部分を担っています。第２の並行するＳｅｃシステムが
、多くのグラム陽性種において記載されている。この付属の（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ）Ｓｅ
ｃシステムは、活性化ＡＴＰａｓｅの第２のコピー、ＳｅｃＡ２の存在を特徴としており
、研究されているところでは、ＳｅｃＡ２はＳｅｃ基質のサブセットの移行を担っている
。多くの病原性のグラム陽性種と共通して、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌ
ｅは２コピーのＳｅｃＡを持っている。表層タンパク質（ＳＬＰ）およびさらには細胞壁
タンパク質（ＣｗｐＶ）の排出はＳｅｃＡ２に依存している。ＳＬＰの細胞質前駆体Ｓｌ
ｐＡおよび他の細胞壁タンパク質の蓄積は、細胞壁における成熟ＳＬＰのレベルの減少と
同時に、ドミナントネガティブなｓｅｃＡ１またはｓｅｃＡ２対立遺伝子を発現する細胞
において観察される。さらに、ＳｅｃＡ１またはＳｅｃＡ２のドミナントネガティブ対立
遺伝子またはアンチセンスＲＮＡのいずれかのノックダウンの発現は、増殖を劇的に損な
い、このことは両方のＳｅｃシステムがＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに必須であることを示し
ている。
にＡＴＰａｓｅであるＳｅｃＡ、および膜チャネルであるＳｅｃＹＥＧを含むＳｅｃシス
テムは、このタンパク質輸送の大部分を担っています。第２の並行するＳｅｃシステムが
、多くのグラム陽性種において記載されている。この付属の（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ）Ｓｅ
ｃシステムは、活性化ＡＴＰａｓｅの第２のコピー、ＳｅｃＡ２の存在を特徴としており
、研究されているところでは、ＳｅｃＡ２はＳｅｃ基質のサブセットの移行を担っている
。多くの病原性のグラム陽性種と共通して、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌ
ｅは２コピーのＳｅｃＡを持っている。表層タンパク質（ＳＬＰ）およびさらには細胞壁
タンパク質（ＣｗｐＶ）の排出はＳｅｃＡ２に依存している。ＳＬＰの細胞質前駆体Ｓｌ
ｐＡおよび他の細胞壁タンパク質の蓄積は、細胞壁における成熟ＳＬＰのレベルの減少と
同時に、ドミナントネガティブなｓｅｃＡ１またはｓｅｃＡ２対立遺伝子を発現する細胞
において観察される。さらに、ＳｅｃＡ１またはＳｅｃＡ２のドミナントネガティブ対立
遺伝子またはアンチセンスＲＮＡのいずれかのノックダウンの発現は、増殖を劇的に損な
い、このことは両方のＳｅｃシステムがＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに必須であることを示し
ている。
【0361】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株６３０（流行型Ｘ）は、４，２９０，２５２ｂｐ（Ｇ＋Ｃ含
有量＝２９．０６％）の単一環状染色体および７，８８１ｂｐ（Ｇ＋Ｃ含有量＝２７．９
％）の環状プラスミドを有する。全ゲノムの配列決定がなされ、ゲノムの１１％が接合性
トランスポゾンなどの可動遺伝因子からなることが見出された。これらのエレメントは、
その抗微生物剤耐性、病原性、宿主相互作用および表面構造の生産に関与する遺伝子をＣ
．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに提供する。例えば、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのｃｄｅＡ遺伝子は
多剤排出ポンプを生産し、これは多剤および毒性化合物排出（ＭＡＴＥ）ファミリーの既
知の排出トランスポーターと相同であることが示された。このタンパク質は、細胞からの
薬物のエネルギー依存性およびナトリウム結合型排出を促進する。さらに、Ｃ．ｄｉｆｆ
ｉｃｉｌｅのｃｍｅ遺伝子は、他の細菌において多剤耐性を与えることが示されている。
有量＝２９．０６％）の単一環状染色体および７，８８１ｂｐ（Ｇ＋Ｃ含有量＝２７．９
％）の環状プラスミドを有する。全ゲノムの配列決定がなされ、ゲノムの１１％が接合性
トランスポゾンなどの可動遺伝因子からなることが見出された。これらのエレメントは、
その抗微生物剤耐性、病原性、宿主相互作用および表面構造の生産に関与する遺伝子をＣ
．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに提供する。例えば、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのｃｄｅＡ遺伝子は
多剤排出ポンプを生産し、これは多剤および毒性化合物排出（ＭＡＴＥ）ファミリーの既
知の排出トランスポーターと相同であることが示された。このタンパク質は、細胞からの
薬物のエネルギー依存性およびナトリウム結合型排出を促進する。さらに、Ｃ．ｄｉｆｆ
ｉｃｉｌｅのｃｍｅ遺伝子は、他の細菌において多剤耐性を与えることが示されている。
【0362】
該アレイは、Ｃ ｄｉｆｉｃｉｌｅ細胞の必須遺伝子（ＳｅｃＡ２）において、ある配
列を標的とするための、Ｒ１－Ｓ１－Ｒ１’ＣＲＩＳＰＲユニット（２つのＣＲＩＳＰＲ
リピートが隣接するスペーサー）を含む。別の実験では、標的化は、ＭＴＺおよび場合に
よっては１つ以上の他の抗Ｃ ｄｉｆｉｃｉｌｅ抗生物質の存在下での、ｃｄｅＡ遺伝子
に対するものである。各スペーサー（Ｓ）は、ＳｅｃＡまたはｃｄＡ遺伝子の２０ｍｅｒ
のヌクレオチド配列を含み、ここで、該配列は、リピート配列にコグネイトなＣ ｄｉｆ
ｉｃｉｌｅ株６３０ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのＰＡＭを含む。各リピートは、Ｃ
ｄｉｆｉｃｉｌｅ株５３０リピートに同一である。
列を標的とするための、Ｒ１－Ｓ１－Ｒ１’ＣＲＩＳＰＲユニット（２つのＣＲＩＳＰＲ
リピートが隣接するスペーサー）を含む。別の実験では、標的化は、ＭＴＺおよび場合に
よっては１つ以上の他の抗Ｃ ｄｉｆｉｃｉｌｅ抗生物質の存在下での、ｃｄｅＡ遺伝子
に対するものである。各スペーサー（Ｓ）は、ＳｅｃＡまたはｃｄＡ遺伝子の２０ｍｅｒ
のヌクレオチド配列を含み、ここで、該配列は、リピート配列にコグネイトなＣ ｄｉｆ
ｉｃｉｌｅ株６３０ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのＰＡＭを含む。各リピートは、Ｃ
ｄｉｆｉｃｉｌｅ株５３０リピートに同一である。
【0363】
該リピートは、混合集団におけるＣ ｄｉｆｉｃｉｌｅ細胞に内因性であるＣａｓと共
に機能する。細菌の混合集団は、Ｃ ｄｉｆｉｃｉｌｅ感染症に罹患しているヒト患者の
便サンプルから、エクスビボサンプルとして回収される。混合集団をインビトロでキャリ
ア細菌と混合し、テトラサイクリンの存在下で腸の条件を模倣するために、好気的条件下
で、３７℃でインキュベートする。ＣＲＩＳＰＲアレイを含有するトランスポゾンは、混
合物中のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓおよびＣ ｄｉｆｉｃｉｌｅ細胞に移行すると予想され
る。さらに、さらに、後者の細胞中の標的部位はＣａｓヌクレアーゼ作用によって切断さ
れ、それによって混合集団中のＣ ｄｉｆｉｃｉｌｅの割合を低減させる（そしてＣ ｄ
ｉｆｉｃｉｌｅに対するＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓの割合が増加する）と予想される。
に機能する。細菌の混合集団は、Ｃ ｄｉｆｉｃｉｌｅ感染症に罹患しているヒト患者の
便サンプルから、エクスビボサンプルとして回収される。混合集団をインビトロでキャリ
ア細菌と混合し、テトラサイクリンの存在下で腸の条件を模倣するために、好気的条件下
で、３７℃でインキュベートする。ＣＲＩＳＰＲアレイを含有するトランスポゾンは、混
合物中のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓおよびＣ ｄｉｆｉｃｉｌｅ細胞に移行すると予想され
る。さらに、さらに、後者の細胞中の標的部位はＣａｓヌクレアーゼ作用によって切断さ
れ、それによって混合集団中のＣ ｄｉｆｉｃｉｌｅの割合を低減させる（そしてＣ ｄ
ｉｆｉｃｉｌｅに対するＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓの割合が増加する）と予想される。
【0364】
その後の実験では、キャリア細菌を含む飲料が生産され、これは、制酸剤の有無にかか
わらず、数日間連続して１～２回ヒト患者によって消費される。該患者にはまた、処置の
期間にテトラサイクリンが投与される。便解析により、便サンプル中のＣ ｄｉｆｉｃｉ
ｌｅの割合が低減する（そしてＣ ｄｉｆｉｃｉｌｅに対するＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓの
比率が増加する）ことが明らかになるだろうと予想される。
わらず、数日間連続して１～２回ヒト患者によって消費される。該患者にはまた、処置の
期間にテトラサイクリンが投与される。便解析により、便サンプル中のＣ ｄｉｆｉｃｉ
ｌｅの割合が低減する（そしてＣ ｄｉｆｉｃｉｌｅに対するＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓの
比率が増加する）ことが明らかになるだろうと予想される。
【0365】
実施例５：ベクターにコードされた、混合細菌共同体における種および株の選択的増殖阻
害のためのシステム
実施例３において、驚くべきことに、異なる種の混合共同体における選択的集団増殖阻
害のために宿主細菌における内因性Ｃａｓヌクレアーゼ活性を利用する可能性を確立した
。次に、異なる種の混合共同体における選択的集団増殖阻害のために、代わりにベクター
にコードされたＣａｓ活性を使用する可能性を探った。３つの異なる種の混合集団におけ
る特定の細菌種の選択的増殖阻害を実証し、そしてさらに標的細菌とは別の株を含んだ選
択的増殖阻害を実証した。驚くべきことに、所定の標的種のうちの標的株のみの選択的増
殖阻害を示すことができた。さらに、該別の株は、ベクターにコードされたＣＲＩＳＰＲ
／Ｃａｓシステムによって標的とされず、ヒトまたは動物の腸内微生物叢エレメントを模
倣した混合細菌共同体におけるこれらのベクター媒介性システムの細かな特異性を確立す
るのに望ましかった。
害のためのシステム
実施例３において、驚くべきことに、異なる種の混合共同体における選択的集団増殖阻
害のために宿主細菌における内因性Ｃａｓヌクレアーゼ活性を利用する可能性を確立した
。次に、異なる種の混合共同体における選択的集団増殖阻害のために、代わりにベクター
にコードされたＣａｓ活性を使用する可能性を探った。３つの異なる種の混合集団におけ
る特定の細菌種の選択的増殖阻害を実証し、そしてさらに標的細菌とは別の株を含んだ選
択的増殖阻害を実証した。驚くべきことに、所定の標的種のうちの標的株のみの選択的増
殖阻害を示すことができた。さらに、該別の株は、ベクターにコードされたＣＲＩＳＰＲ
／Ｃａｓシステムによって標的とされず、ヒトまたは動物の腸内微生物叢エレメントを模
倣した混合細菌共同体におけるこれらのベクター媒介性システムの細かな特異性を確立す
るのに望ましかった。
【0366】
ヒトおよび動物の腸内微生物叢で見出された種を選択した（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓおよびＥ ｃｏｌｉ）。ヒト片
利共生腸内種であるＥ．ｃｏｌｉの２つの株を含んだ。密接に関連した株ではあるが、一
方の株では標的死滅に使用できるが、もう一方の株では標的死滅に使用できない配列の違
いを有する株を、区別できるかどうかを確認することは興味深いと考えた。これは、微生
物叢中のＥ ｃｏｌｉのいくつかの株が望ましく、一方で他の株は望ましくなく（例えば
、ヒトまたは動物に対して病原性である）、したがって、その株をノックダウンするＣａ
ｓ改変の標的となり得るため、興味深かった。
ｔｉｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓおよびＥ ｃｏｌｉ）。ヒト片
利共生腸内種であるＥ．ｃｏｌｉの２つの株を含んだ。密接に関連した株ではあるが、一
方の株では標的死滅に使用できるが、もう一方の株では標的死滅に使用できない配列の違
いを有する株を、区別できるかどうかを確認することは興味深いと考えた。これは、微生
物叢中のＥ ｃｏｌｉのいくつかの株が望ましく、一方で他の株は望ましくなく（例えば
、ヒトまたは動物に対して病原性である）、したがって、その株をノックダウンするＣａ
ｓ改変の標的となり得るため、興味深かった。
【0367】
１．材料および方法
１．１．プラスミドおよび株
表７および表８を参照されたい。全ての株は、他に示されない限り、好気的条件下でＴ
ｏｄｄ－Ｈｅｗｉｔｔ ｂｒｏｔｈ（ＴＨ）（Ｔ１４３８ Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ
）において、３７℃で培養した。株は、－８０℃で、２５％グリセロールで保管した。
１．１．プラスミドおよび株
表７および表８を参照されたい。全ての株は、他に示されない限り、好気的条件下でＴ
ｏｄｄ－Ｈｅｗｉｔｔ ｂｒｏｔｈ（ＴＨ）（Ｔ１４３８ Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ
）において、３７℃で培養した。株は、－８０℃で、２５％グリセロールで保管した。
【0368】
自己標的化ｓｇＲＮＡ－Ｃａｓ９複合体は、テオフィリンリボスイッチおよびＡｒａＣ
／ＰＢＡＤ発現システムによってそれぞれ厳密に調節された。Ｅ．ｃｏｌｉ内で安定に運
ばれるためには、Ｃａｓ９の厳密な調節が望ましい。プラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉのＫ－
１２株を標的とするシングルガイドＤＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と共に、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の外因性のＣａｓ９を含んでいた。したがって、Ｋ－１２
由来株ＴＯＰ１０は、システムが活性化されたときに二本鎖自己切断およびその結果とし
ての死を受けやすかった。ＮｉｓｓｌｅなどのＥ．ｃｏｌｉ株は同じ標的配列を持ってい
ないため、ｓｇＲＮＡ－Ｃａｓ９活性の影響を受けなかった。実施例９において用いた配
列を示す、以下の表９～１１を参照されたい。標的細胞に保存され、複数のコピー（７コ
ピー）で存在する標的配列（リボソームＲＮＡをコードする配列）を選択した。これによ
り、宿主細胞ゲノムを複数の場所で切断する確率が増加し、シングルｇＲＮＡデザインを
用いた死滅を促進した。
／ＰＢＡＤ発現システムによってそれぞれ厳密に調節された。Ｅ．ｃｏｌｉ内で安定に運
ばれるためには、Ｃａｓ９の厳密な調節が望ましい。プラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉのＫ－
１２株を標的とするシングルガイドＤＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と共に、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の外因性のＣａｓ９を含んでいた。したがって、Ｋ－１２
由来株ＴＯＰ１０は、システムが活性化されたときに二本鎖自己切断およびその結果とし
ての死を受けやすかった。ＮｉｓｓｌｅなどのＥ．ｃｏｌｉ株は同じ標的配列を持ってい
ないため、ｓｇＲＮＡ－Ｃａｓ９活性の影響を受けなかった。実施例９において用いた配
列を示す、以下の表９～１１を参照されたい。標的細胞に保存され、複数のコピー（７コ
ピー）で存在する標的配列（リボソームＲＮＡをコードする配列）を選択した。これによ
り、宿主細胞ゲノムを複数の場所で切断する確率が増加し、シングルｇＲＮＡデザインを
用いた死滅を促進した。
【0369】
図１３は、ｓｐＣａｓ９の発現およびリボソームＲＮＡサブユニット１６ｓを標的とす
る自己標的化ｓｇＲＮＡを制御する調節因子を示す。
る自己標的化ｓｇＲＮＡを制御する調節因子を示す。
【0370】
１．２． 分化増殖培地
全ての株は、３７度で２０時間、ＴＨ培地上で増殖させた。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのため
の選択培地は、２．５ｇ／ｌの２－フェニルエタノール（ＰＥＡ）を添加したＴＨ培地で
あった。ＰＥＡを培地に添加し、１５ｐｓｉで、１５分間１２１℃、オートクレーブ処理
した。寒天プレートは、対応する培地に１．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）寒天を添加することに
より調製した。
全ての株は、３７度で２０時間、ＴＨ培地上で増殖させた。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのため
の選択培地は、２．５ｇ／ｌの２－フェニルエタノール（ＰＥＡ）を添加したＴＨ培地で
あった。ＰＥＡを培地に添加し、１５ｐｓｉで、１５分間１２１℃、オートクレーブ処理
した。寒天プレートは、対応する培地に１．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）寒天を添加することに
より調製した。
【0371】
１．３． クローニング
Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（登録商標）Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＴＯＰ１
０ケミカルコンピテント細胞）をすべてのサブクローニング手順に使用した。Ｐｈｕｓｉ
ｏｎ（商標）ポリメラーゼを用いてＰＣＲを行った。製造元のプロトコールに従って、全
てのＰＣＲ産物を、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ（商標）のＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ（商
標）ＧｅｌおよびＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐにより精製した。精製した断片を、総量３４
μｌ中に１μｌの酵素を含む１×ＦＤ緩衝液において、制限酵素ＤｐｎＩで分解した。製
造元のプロトコールに従って、分解反応物を再び、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－ＮａｇｅｌのＮｕ
ｃｌｅｏｓｐｉｎ ＧｅｌおよびＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐで精製した。製造元（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）のプロトコールに従って、１０μｌの反応液中で、ギブ
ソン・アセンブリを行った。製造元の説明書に従い、Ｑｉａｇｅｎキットを用いて、プラ
スミドＤＮＡを調製した。グラム陽性株に対する改変は、細胞溶解を促進するために０．
５％グリシンおよびリゾチームを添加した培地中で細菌を増殖させることを含んだ。
Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（登録商標）Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＴＯＰ１
０ケミカルコンピテント細胞）をすべてのサブクローニング手順に使用した。Ｐｈｕｓｉ
ｏｎ（商標）ポリメラーゼを用いてＰＣＲを行った。製造元のプロトコールに従って、全
てのＰＣＲ産物を、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ（商標）のＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ（商
標）ＧｅｌおよびＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐにより精製した。精製した断片を、総量３４
μｌ中に１μｌの酵素を含む１×ＦＤ緩衝液において、制限酵素ＤｐｎＩで分解した。製
造元のプロトコールに従って、分解反応物を再び、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－ＮａｇｅｌのＮｕ
ｃｌｅｏｓｐｉｎ ＧｅｌおよびＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐで精製した。製造元（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）のプロトコールに従って、１０μｌの反応液中で、ギブ
ソン・アセンブリを行った。製造元の説明書に従い、Ｑｉａｇｅｎキットを用いて、プラ
スミドＤＮＡを調製した。グラム陽性株に対する改変は、細胞溶解を促進するために０．
５％グリシンおよびリゾチームを添加した培地中で細菌を増殖させることを含んだ。
【0372】
１．４． 形質転換
１．４．１ エレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞および形質転換
市販のエレクトロコンピテント細胞（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴｈｅｒｍｏＦｉ
ｓｃｈｅｒ ＴＯＰ１０ケミカルコンピテントＥ．ｃｏｌｉ）を、クローニングおよび実
験に用いた。エレクトロポレーションは、標準設定を用いて行った: Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｃ
ｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ（ＢＴＸ Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ＥＣ
Ｍ６３０）を用いて１８００Ｖ、２５μＦおよび２００Ωで行った。パルスの後、１ｍｌ
のＬＢ－ＳＯＣ培地を添加し、細胞を３７℃で１時間インキュベートした。形質転換細胞
を、対応する抗生物質を含有する、ＬＢ寒天培地にプレーティングした。
１．４．１ エレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞および形質転換
市販のエレクトロコンピテント細胞（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴｈｅｒｍｏＦｉ
ｓｃｈｅｒ ＴＯＰ１０ケミカルコンピテントＥ．ｃｏｌｉ）を、クローニングおよび実
験に用いた。エレクトロポレーションは、標準設定を用いて行った: Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｃ
ｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ（ＢＴＸ Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ＥＣ
Ｍ６３０）を用いて１８００Ｖ、２５μＦおよび２００Ωで行った。パルスの後、１ｍｌ
のＬＢ－ＳＯＣ培地を添加し、細胞を３７℃で１時間インキュベートした。形質転換細胞
を、対応する抗生物質を含有する、ＬＢ寒天培地にプレーティングした。
【0373】
１．５． Ｅ．ｃｏｌｉおよび共同体実験における、ｓｇＲＮＡ－Ｃａｓ９の活性化
Ｋ－１２由来株および他の細菌のリボソームＲＮＡコードする配列を標的とするｓｇＲ
ＮＡを含むプラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉＴＯＰ１０およびＮｉｓｓｌｅをいずれも、
３ｍｌのＴＨ ｂｒｏｔｈ中で一晩増殖させた。翌日、細胞をＯＤ約０．５まで希釈し、
次にＴＨ培地中で１０倍段階希釈し、９６ウェルレプリケーター（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏ
ｌｅｄｏ Ｌｉｑｕｉｄａｔｏｒ（商標）９６）を使用して４μＬの体積の液滴を、ＴＨ
寒天プレート上、誘導因子（１％アラビノースおよび２ｍＭテオフィリン）を添加したＴ
Ｈ寒天プレート上、２．５ｇ／ｌのＰＥＡを添加したＴＨ寒天プレート上、および１％マ
ルトースを添加したマッコンキー寒天培地上にスポットした。プレートを、３７℃で２４
時間インキュベートして、コロニー形成率（ＣＦＵ）を３回測定から計算した。プレート
を２７℃で２０時間インキュベートして、コロニー形成率（ＣＦＵ）を３回測定から計算
した。
Ｋ－１２由来株および他の細菌のリボソームＲＮＡコードする配列を標的とするｓｇＲ
ＮＡを含むプラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉＴＯＰ１０およびＮｉｓｓｌｅをいずれも、
３ｍｌのＴＨ ｂｒｏｔｈ中で一晩増殖させた。翌日、細胞をＯＤ約０．５まで希釈し、
次にＴＨ培地中で１０倍段階希釈し、９６ウェルレプリケーター（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏ
ｌｅｄｏ Ｌｉｑｕｉｄａｔｏｒ（商標）９６）を使用して４μＬの体積の液滴を、ＴＨ
寒天プレート上、誘導因子（１％アラビノースおよび２ｍＭテオフィリン）を添加したＴ
Ｈ寒天プレート上、２．５ｇ／ｌのＰＥＡを添加したＴＨ寒天プレート上、および１％マ
ルトースを添加したマッコンキー寒天培地上にスポットした。プレートを、３７℃で２４
時間インキュベートして、コロニー形成率（ＣＦＵ）を３回測定から計算した。プレート
を２７℃で２０時間インキュベートして、コロニー形成率（ＣＦＵ）を３回測定から計算
した。
【0374】
２．結果
２．１ 外因性のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを用いたＥ．ｃｏｌｉ株の特異的標的
化
最初に、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０とＮｉｓｓｌｅの両方に死滅システムを導入するこ
とにより、該システムが２つのＥ．ｃｏｌｉ株を区別できるかどうかを最初に試験した。
２．１ 外因性のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを用いたＥ．ｃｏｌｉ株の特異的標的
化
最初に、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０とＮｉｓｓｌｅの両方に死滅システムを導入するこ
とにより、該システムが２つのＥ．ｃｏｌｉ株を区別できるかどうかを最初に試験した。
【0375】
２．１ 混合培養液における外因性のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを用いたＥ．ｃｏ
ｌｉの標的化
一晩培養した培養液の段階希釈を、両方のE．ｃｏｌｉ株、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｌ
．ｌａｃｔｉｓについて２回、そして混合培養液について３回行った。全ての株を、誘導
因子の有無で、選択プレートにおいて、３７℃で２０時間増殖させた。該システムの誘導
は、他の細菌は無傷のまま、ｓｇＲＮＡ－Ｃａｓ９のＫ－１２由来株の標的化を活性化す
る。
ｌｉの標的化
一晩培養した培養液の段階希釈を、両方のE．ｃｏｌｉ株、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｌ
．ｌａｃｔｉｓについて２回、そして混合培養液について３回行った。全ての株を、誘導
因子の有無で、選択プレートにおいて、３７℃で２０時間増殖させた。該システムの誘導
は、他の細菌は無傷のまま、ｓｇＲＮＡ－Ｃａｓ９のＫ－１２由来株の標的化を活性化す
る。
【0376】
混合培養液から異なる細菌を区別することは、異なる種の細胞数を決定しそして種の特
異的除去を決定するために重要である。マッコンキー寒天培地はＥ．ｃｏｌｉを選択的に
増殖させ、ＰＥＡ寒天培地はグラム陰性菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からグラム陽性菌（Ｂ．ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ）を単離するために使用される選択培地である。さらに、本発明者らは、異
なる濃度のＰＥＡが他のグラム陽性菌の増殖を部分的に阻害することを見出した。２．５
ｇ／ｌのＰＥＡは、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＬ．ラクティスの増殖を制限しながら、Ｂ．ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓを選択的に増殖させることがわかった。
異的除去を決定するために重要である。マッコンキー寒天培地はＥ．ｃｏｌｉを選択的に
増殖させ、ＰＥＡ寒天培地はグラム陰性菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からグラム陽性菌（Ｂ．ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ）を単離するために使用される選択培地である。さらに、本発明者らは、異
なる濃度のＰＥＡが他のグラム陽性菌の増殖を部分的に阻害することを見出した。２．５
ｇ／ｌのＰＥＡは、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＬ．ラクティスの増殖を制限しながら、Ｂ．ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓを選択的に増殖させることがわかった。
【0377】
図１４は、誘導性の、外因性の、ベクター媒介性のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムによ
るＥ．ｃｏｌｉ株の特異的標的化を示す。ｓｇＲＮＡはＫ－１２由来のＥ．ｃｏｌｉ株、
Ｅ．ｃｏｌｉＴＯＰ１０のゲノムを標的とし、一方試験した他のＥ．ｃｏｌｉ株は影響を
受けなかった。
るＥ．ｃｏｌｉ株の特異的標的化を示す。ｓｇＲＮＡはＫ－１２由来のＥ．ｃｏｌｉ株、
Ｅ．ｃｏｌｉＴＯＰ１０のゲノムを標的とし、一方試験した他のＥ．ｃｏｌｉ株は影響を
受けなかった。
【0378】
図１５は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムの誘導なしのＴＨ寒天培地中の本研究で用
いた個々の細菌種および混合培養液の段階希釈によるスポットアッセイを示す。
いた個々の細菌種および混合培養液の段階希釈によるスポットアッセイを示す。
【0379】
図１６、異なる選択培地上の１０００倍希釈のスポットアッセイを示す。２．５ｇ／ｌ
のＰＥＡを有するＴＨは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ単独のための選択的培地である。マルト
ースを添加したマッコンキーは、グラム陰性菌と腸内桿菌を選択的に単離し、それらをマ
ルトース発酵に基づいて区別するように設計された、細菌用の選択的かつ差次的（ｄｉｆ
ｆｅｒｅｎｔｉａｌ）培養培地である。従って、ＴＯＰ１０ΔｍａｌＫ変異体は、プレー
ト上に白いコロニーを形成し、一方Ｎｉｓｓｌｅは、ピンクのコロニーを形成する；Ａは
Ｅ ｃｏｌｉ ΔｍａｌＫ、ＢはＥ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｉｌｅ、ＣはＢ ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ、ＤはＬ ｌａｃｔｉｓ、Ｅは混合培養液である；マッコンキー－のＢとＥの画像は
ピンクに見える；マッコンキー＋のＢとＥの画像はピンクに見える。図１７は、本研究で
使用した細菌の異なる培地および選択プレート上での選択的増殖を示す。明らかに、混合
集団において標的Ｅ ｃｏｌｉ株（図１７のｘ軸上の「Ｅ ｃｏｌｉ」）を選択的に死滅
させたが、他の関連株（「Ｅ ｃｏｌｉ－Ｎｉｓｓｌｅ」）は同じようには死滅しないこ
とがわかった。混合集団における標的株の死滅は、本実験において１０００倍であった。
のＰＥＡを有するＴＨは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ単独のための選択的培地である。マルト
ースを添加したマッコンキーは、グラム陰性菌と腸内桿菌を選択的に単離し、それらをマ
ルトース発酵に基づいて区別するように設計された、細菌用の選択的かつ差次的（ｄｉｆ
ｆｅｒｅｎｔｉａｌ）培養培地である。従って、ＴＯＰ１０ΔｍａｌＫ変異体は、プレー
ト上に白いコロニーを形成し、一方Ｎｉｓｓｌｅは、ピンクのコロニーを形成する；Ａは
Ｅ ｃｏｌｉ ΔｍａｌＫ、ＢはＥ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｉｌｅ、ＣはＢ ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ、ＤはＬ ｌａｃｔｉｓ、Ｅは混合培養液である；マッコンキー－のＢとＥの画像は
ピンクに見える；マッコンキー＋のＢとＥの画像はピンクに見える。図１７は、本研究で
使用した細菌の異なる培地および選択プレート上での選択的増殖を示す。明らかに、混合
集団において標的Ｅ ｃｏｌｉ株（図１７のｘ軸上の「Ｅ ｃｏｌｉ」）を選択的に死滅
させたが、他の関連株（「Ｅ ｃｏｌｉ－Ｎｉｓｓｌｅ」）は同じようには死滅しないこ
とがわかった。混合集団における標的株の死滅は、本実験において１０００倍であった。
【0380】
参考文献
１．Zhang, X. Z., & Zhang, Y. H. P. (2011). Simple, fast and high-efficiency tra
nsformation system for directed evolution of cellulase in Bacillus subtilis. Mic
robial Biotechnology, 4(1), 98－105. http://doi.org/10.1111/j.1751-7915.2010.002
30.x
２．Wegmann, U., O’Connell-Motherway, M., Zomer, A., Buist, G., Shearman, C., C
anchaya, C., … Kok, J. (2007). Complete genome sequence of the prototype lactic
acid bacterium Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363. Journal of Bacteriolo
gy, 189(8), 3256－70. http://doi.org/10.1128/JB.01768-06
１．Zhang, X. Z., & Zhang, Y. H. P. (2011). Simple, fast and high-efficiency tra
nsformation system for directed evolution of cellulase in Bacillus subtilis. Mic
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30.x
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anchaya, C., … Kok, J. (2007). Complete genome sequence of the prototype lactic
acid bacterium Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363. Journal of Bacteriolo
gy, 189(8), 3256－70. http://doi.org/10.1128/JB.01768-06
【0381】
【表1-1】
【0382】
【表1-2】
【0383】
【表1-3】
【0384】
【表1-4】
【0385】
【表1-5】
【0386】
【表1-6】
【0387】
【表1-7】
【0388】
【表1-8】
【0389】
【表1-9】
【0390】
【表1-10】
【0391】
【表1-11】
【0392】
【表1-12】
【0393】
【表1-13】
【0394】
【表1-14】
【0395】
【表1-15】
【0396】
【表1-16】
【0397】
【表1-17】
【0398】
【表1-18】
【0399】
【表1-19】
【0400】
【表1-20】
【0401】
【表1-21】
【0402】
【表1-22】
【0403】
【表1-23】
【0404】
【表2-1】
【0405】
【表2-2】
【0406】
【表2-3】
【0407】
【表2-4】
【0408】
【表2-5】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【手続補正書】
【提出日】2022-12-08
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
患者において疾病または症状を処置または軽減する方法において用いるための誘導型ヌクレアーゼシステムであって、該方法が、該システムの誘導型ヌクレアーゼを用いて患者の微生物叢を変更することにより患者において免疫細胞を調節することを含み、該疾病または症状が、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）により媒介されるか、または、患者において免疫細胞活性または免疫細胞集団を変更することにより処置または予防される、誘導型ヌクレアーゼシステム。
【請求項2】
該方法が、該微生物叢中の第１の種の細胞のゲノムを誘導型ヌクレアーゼを用いて選択的に標的化して該変更をもたらすことを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項3】
該選択的標的化が、（ｉ）前記第１の種と同じ門の種、または（ｉｉ）前記第１の種の異なる株を標的とすることを回避する、請求項２に記載のシステム。
【請求項4】
該方法が、微生物叢において第２の細胞を標的とせずに第１の細胞を選択的に死滅させ、第２の細胞が、（ｉ）第１の種の株に関連する株の細胞であるか、または（ｉｉ）第１の種と異なり、かつ第１の種と系統学的に関連する種の細胞であり、第２の種または株が、第１の細胞の種または株の１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列と少なくとも８０％同一である１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を有し、微生物叢における第２の細胞の増殖が、前記方法によって阻害されないか、または、前記第１の細胞の増殖が、第２の細胞の少なくとも５倍の増殖阻害で阻害される、請求項１～３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項5】
（ａ）患者がヒト患者であり；
（ｂ）微生物叢が腸内微生物叢であり；
（ｃ）該方法が、誘導型ヌクレアーゼを用いて微生物叢において第１の種のゲノムを選択的に標的化して該変更をもたらすことを含み；および
（ｄ）該方法が、微生物叢において第２の細胞を標的とせずに第１の細胞を選択的に死滅させ、第２の細胞が、（ａ）第１の種の株に関連する株の細胞であるか、または（ｂ）第１の種と異なり、かつ第１の種と系統学的に関連する種の細胞であり、第２の種または株が、第１の細胞の種または株の１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列と少なくとも８０％同一である１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を有する、
請求項１～３のいずれか一項に記載のシステム。
（ｂ）微生物叢が腸内微生物叢であり；
（ｃ）該方法が、誘導型ヌクレアーゼを用いて微生物叢において第１の種のゲノムを選択的に標的化して該変更をもたらすことを含み；および
（ｄ）該方法が、微生物叢において第２の細胞を標的とせずに第１の細胞を選択的に死滅させ、第２の細胞が、（ａ）第１の種の株に関連する株の細胞であるか、または（ｂ）第１の種と異なり、かつ第１の種と系統学的に関連する種の細胞であり、第２の種または株が、第１の細胞の種または株の１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列と少なくとも８０％同一である１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を有する、
請求項１～３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項6】
患者において疾病または症状を治療または予防するための患者の養子細胞療法の方法における使用のための、免疫細胞のエクスビボ集団であって、該方法が、
（ａ）該集団の細胞を患者に投与することを含む養子免疫細胞療法を患者において実行すること、ここで、該免疫細胞の投与は、患者において疾病または症状を処置することが可能である；および
（ｂ）患者の腸内微生物叢において、第１の細菌種もしくは株、または、古細菌種もしくは株の細胞の亜集団の相対的割合を変更し、それにより、患者において免疫細胞療法を調節する変更された腸内微生物叢を産生すること；
を含み、ここで、ステップ（ｂ）は、患者の微生物叢に、前記免疫細胞集団と同時に、または連続して、抗細菌または抗古細菌誘導型ヌクレアーゼシステムを投与することにより、第１の細胞の亜集団を標的化することによって実行され、それにより、第１の細胞が死滅するか、該亜集団の増殖が低下し、それにより、患者の腸内微生物叢における前記亜集団の割合を低減させる、免疫細胞のエクスビボ集団。
（ａ）該集団の細胞を患者に投与することを含む養子免疫細胞療法を患者において実行すること、ここで、該免疫細胞の投与は、患者において疾病または症状を処置することが可能である；および
（ｂ）患者の腸内微生物叢において、第１の細菌種もしくは株、または、古細菌種もしくは株の細胞の亜集団の相対的割合を変更し、それにより、患者において免疫細胞療法を調節する変更された腸内微生物叢を産生すること；
を含み、ここで、ステップ（ｂ）は、患者の微生物叢に、前記免疫細胞集団と同時に、または連続して、抗細菌または抗古細菌誘導型ヌクレアーゼシステムを投与することにより、第１の細胞の亜集団を標的化することによって実行され、それにより、第１の細胞が死滅するか、該亜集団の増殖が低下し、それにより、患者の腸内微生物叢における前記亜集団の割合を低減させる、免疫細胞のエクスビボ集団。
【請求項7】
第１の細胞が、細菌または古細菌の細胞であり、例えばファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の細胞である、請求項２～６のいずれか一項に記載のシステムまたは集団。
【請求項8】
該方法が、第１の種の細胞の１つ以上の標的ゲノムまたはエピソームのヌクレオチド配列を改変（例えば、切断および／または変異）することを含む、請求項２～７のいずれか一項に記載のシステムまたは集団。
【請求項9】
第１の細胞が宿主細胞の集団を含み、該方法が宿主細胞において標的配列を改変することを含み、標的配列の改変が、
ａ．微生物叢を、宿主改変（ＨＭ）ｃｒＲＮＡをコードする操作された核酸配列の複数のコピーと組み合わせること、および
ｂ．宿主細胞においてＨＭ－ｃｒＲＮＡを発現させること
により実行され、ここで、操作された各核酸配列は、個々の宿主細胞においてＣａｓヌクレアーゼと作動可能であり、ＨＭ－ＣＲｌＳＰＲ／Ｃａｓシステムを形成し、かつ、該操作された配列は、
（ｉ）ＨＭ－ｃｒＲＮＡをコードする、スペーサーおよびリピート配列；
（ｉｉ）宿主細胞の標的配列にハイブリダイズしてＣａｓヌクレアーゼを宿主細胞の標的配列に誘導することができる配列を含む、ＨＭ－ｃｒＲＮＡ；
を含み、場合により、ＨＭ－システムは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するＤＮＡ配列を含み、
それにより、ＨＭ－ｃｒＲＮＡは宿主細胞において宿主標的配列のＣａｓ改変を誘導し、それにより、宿主細胞が死滅するか、宿主細胞集団の増殖が低下し、それにより、微生物叢において前記第１の細胞の割合を低減させる、請求項２～８のいずれか一項に記載のシステムまたは集団。
ａ．微生物叢を、宿主改変（ＨＭ）ｃｒＲＮＡをコードする操作された核酸配列の複数のコピーと組み合わせること、および
ｂ．宿主細胞においてＨＭ－ｃｒＲＮＡを発現させること
により実行され、ここで、操作された各核酸配列は、個々の宿主細胞においてＣａｓヌクレアーゼと作動可能であり、ＨＭ－ＣＲｌＳＰＲ／Ｃａｓシステムを形成し、かつ、該操作された配列は、
（ｉ）ＨＭ－ｃｒＲＮＡをコードする、スペーサーおよびリピート配列；
（ｉｉ）宿主細胞の標的配列にハイブリダイズしてＣａｓヌクレアーゼを宿主細胞の標的配列に誘導することができる配列を含む、ＨＭ－ｃｒＲＮＡ；
を含み、場合により、ＨＭ－システムは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するＤＮＡ配列を含み、
それにより、ＨＭ－ｃｒＲＮＡは宿主細胞において宿主標的配列のＣａｓ改変を誘導し、それにより、宿主細胞が死滅するか、宿主細胞集団の増殖が低下し、それにより、微生物叢において前記第１の細胞の割合を低減させる、請求項２～８のいずれか一項に記載のシステムまたは集団。
【請求項10】
調節された免疫細胞が、患者の内因性細胞および／または（例えば養子細胞療法を介して）投与された細胞を含む、請求項１～５および７～９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項11】
ヌクレアーゼが、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼである、請求項１～１０のいずれか一項に記載のシステムまたは集団。
【請求項12】
システムが、操作されたＣＲｌＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＴＡＬＥＮシステム、メガヌクレアーゼシステムまたはジンクフィンガーシステムである、請求項１～１１のいずれか一項に記載のシステムまたは集団。
【請求項13】
該方法が、患者において、（ｉ）ＴＨ１、Ｔｈ１７および／またはＴｒｅｇ細胞集団をアップレギュレートするか、または、（ｉｉ）ＴＨ１、Ｔｈ１７および／またはＴｒｅｇ細胞集団をダウンレギュレートする、請求項１～１２のいずれか一項に記載のシステムまたは集団。
【請求項14】
該方法が、患者において疾病または症状の治療を調節する方法であって、
（ａ）患者において治療を実行すること；および
（ｂ）誘導型ヌクレアーゼを用いて微生物叢の前記変更を実行することにより、患者において腸内細菌の微生物叢ディスバイオシスを引き起こし、それにより、前記ディスバイオシスが、患者において免疫細胞の前記調節をおこなうことにより、患者において治療を調節すること、
を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のシステムまたは集団。
（ａ）患者において治療を実行すること；および
（ｂ）誘導型ヌクレアーゼを用いて微生物叢の前記変更を実行することにより、患者において腸内細菌の微生物叢ディスバイオシスを引き起こし、それにより、前記ディスバイオシスが、患者において免疫細胞の前記調節をおこなうことにより、患者において治療を調節すること、
を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のシステムまたは集団。
【請求項15】
該方法が、
（ａ）患者の免疫チェックポイントのアンタゴニズムまたはアゴニズムの治療を増強すること、場合により、治療は、イピリムマブ（すなわちＹＥＲＶＯＹ商標）、トレメリムマブ、ニボルマブ（すなわちＯＰＤＩＶＯ商標）ペンブロリズマブ（すなわちＫＥＹＴＲＵＤＡ商標）、ピディリズマブ、ＢＭＳ－９３６５５９、デュルバルマブおよびアテゾリズマブから選択される抗体を用いた抗体療法である；または
（ｂ）疾病または症状のワクチン療法を調節すること；または
（ｃ）疾病または症状の細胞療法（例えば、養子免疫細胞療法）を調節すること、場合により、細胞ベースの治療またはその副作用（例えば、サイトカイン放出症候群）を弱めるために調節すること；または
（ｄ）患者においてがんの処置のためのＣＡＲ－ＴまたはＴＩＬ療法を調節すること；または
（ｅ）Ｔｈ２細胞サイトカイン放出によって媒介される患者における自己中毒を低減させること、
を目的とする、請求項１～１４のいずれか一項に記載のシステムまたは集団。
（ａ）患者の免疫チェックポイントのアンタゴニズムまたはアゴニズムの治療を増強すること、場合により、治療は、イピリムマブ（すなわちＹＥＲＶＯＹ商標）、トレメリムマブ、ニボルマブ（すなわちＯＰＤＩＶＯ商標）ペンブロリズマブ（すなわちＫＥＹＴＲＵＤＡ商標）、ピディリズマブ、ＢＭＳ－９３６５５９、デュルバルマブおよびアテゾリズマブから選択される抗体を用いた抗体療法である；または
（ｂ）疾病または症状のワクチン療法を調節すること；または
（ｃ）疾病または症状の細胞療法（例えば、養子免疫細胞療法）を調節すること、場合により、細胞ベースの治療またはその副作用（例えば、サイトカイン放出症候群）を弱めるために調節すること；または
（ｄ）患者においてがんの処置のためのＣＡＲ－ＴまたはＴＩＬ療法を調節すること；または
（ｅ）Ｔｈ２細胞サイトカイン放出によって媒介される患者における自己中毒を低減させること、
を目的とする、請求項１～１４のいずれか一項に記載のシステムまたは集団。
【請求項16】
疾病または症状が、がん、自己免疫性の疾病または症状、炎症性の疾病または症状、ウイルス感染症（例えば、ヒト患者のＨＩＶ感染症）、アレルギー性の疾病または症状、または、ウイルス感染症により媒介されるか、または、引き起こされる疾病または症状である、請求項１～１５のいずれか一項に記載のシステムまたは集団。
【請求項17】
第１の細胞集団の増殖が、少なくとも５倍低下する、請求項２～１６のいずれか一項に記載のシステムまたは集団。
【請求項18】
微生物叢が、患者の腸内微生物叢である、請求項２～５および７～１０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項19】
該方法を実行して微生物叢を変更し、それにより患者においてパネート細胞を刺激し、それにより免疫細胞が調節され、疾病または症状が処置または低減されることを目的とする、請求項１～１８のいずれか一項に記載のシステムまたは集団。
【請求項20】
請求項1～１９のいずれか一項に記載の方法を実行するための該請求項に記載のシステムにおいて用いるための、誘導型ヌクレアーゼ；または、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法を用いて患者において疾病または症状を治療するために患者へ投与するための、ＨＭ－ＣＲｌＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ｇＲＮＡ、ＨＭ－アレイもしくはＨＭ－ｃｒＲＮＡ；または、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法を実行するために前記請求項のＨＭ－ＣＲｌＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて用いるための、ＨＭ－アレイ、ｇＲＮＡもしくはＨＭ－ｃｒＲＮＡ；または、該システム、ＨＭ－アレイ、ｇＲＮＡまたはＨＭ－ｃｒＲＮＡを含む、またはコードする、第１の細胞に感染することができるか、または第１の細胞を形質転換することができる、ベクター、例えば、バクテリオファージ、接合性プラスミドもしくはトランスポゾン；または、該システム、ＨＭ－アレイ、ｇＲＮＡまたはＨＭ－ｃｒＲＮＡを含む、またはコードする、医薬；ここで、場合により、ｇＲＮＡはシングルガイドＲＮＡである。
【請求項21】
患者において疾病または症状を処置または軽減する方法であって、請求項１～１９のいずれか一項に記載される、方法。
【請求項22】
ヒト患者において疾病または症状を処置または軽減する方法において用いるための誘導型ヌクレアーゼシステムを含む組成物であって、該疾病または症状が癌であり、該方法が、患者に免疫チェックポイントのアンタゴニスト治療を投与すること、および該システムの誘導型ヌクレアーゼを用いて患者の腸内微生物叢を変更することにより患者において免疫細胞をアップレギュレートすることを含み、該治療が増強され、該疾病または症状が、患者において免疫細胞活性または免疫細胞集団を変更することにより処置または予防され、免疫チェックポイントのアンタゴニストがチェックポイント阻害抗体であり、該変更することが、微生物叢の第１の細菌種の細胞の選択的標的化を含み、該標的化が、標的化された種のＤＮＡのヌクレアーゼ切断を生みだし、微生物叢における種の相対的割合を低減させ、あるいは、微生物叢における前記種の亜集団の増殖を阻害し、該方法が、微生物叢において第１の細菌細胞を選択的に死滅する一方で、第２の細菌細胞は標的とせず、誘導型ヌクレアーゼシステムが操作された宿主改変（ＨＭ）－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであり、第１の細胞が宿主細胞の集団を含み、該方法が宿主細胞において標的配列を改変することを含み、標的配列改変が、
ａ．微生物叢を、宿主改変（ＨＭ）ｃｒＲＮＡをコードする操作された核酸配列の複数のコピーと組み合わせること、および
ｂ．宿主細胞においてＨＭ－ｃｒＲＮＡを発現させること
により実行され、ここで、操作された各核酸配列は、個々の宿主細胞においてＣａｓヌクレアーゼと作動可能であり、ＨＭ－ＣＲｌＳＰＲ／Ｃａｓシステムを形成し、かつ、該操作された配列は、
（ｉ）ＨＭ－ｃｒＲＮＡをコードする、スペーサーおよびリピート配列；
（ｉｉ）宿主細胞の標的配列にハイブリダイズしてＣａｓヌクレアーゼを宿主細胞の標的配列に誘導することができる配列を含む、ＨＭ－ｃｒＲＮＡ；
を含み、かつ、場合により、ＨＭ－システムはｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するＤＮＡ配列を含み、
それにより、ＨＭ－ｃｒＲＮＡは宿主細胞において宿主標的配列のＣａｓ改変を誘導し、それにより、宿主細胞が死滅するか、または、宿主細胞集団の増殖が低下し、それにより、微生物叢において前記第１の細胞の割合を低減させ、かつ、第２の細胞が、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓまたはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞、場合により、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａまたはＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ細胞である、組成物。
ａ．微生物叢を、宿主改変（ＨＭ）ｃｒＲＮＡをコードする操作された核酸配列の複数のコピーと組み合わせること、および
ｂ．宿主細胞においてＨＭ－ｃｒＲＮＡを発現させること
により実行され、ここで、操作された各核酸配列は、個々の宿主細胞においてＣａｓヌクレアーゼと作動可能であり、ＨＭ－ＣＲｌＳＰＲ／Ｃａｓシステムを形成し、かつ、該操作された配列は、
（ｉ）ＨＭ－ｃｒＲＮＡをコードする、スペーサーおよびリピート配列；
（ｉｉ）宿主細胞の標的配列にハイブリダイズしてＣａｓヌクレアーゼを宿主細胞の標的配列に誘導することができる配列を含む、ＨＭ－ｃｒＲＮＡ；
を含み、かつ、場合により、ＨＭ－システムはｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を発現するＤＮＡ配列を含み、
それにより、ＨＭ－ｃｒＲＮＡは宿主細胞において宿主標的配列のＣａｓ改変を誘導し、それにより、宿主細胞が死滅するか、または、宿主細胞集団の増殖が低下し、それにより、微生物叢において前記第１の細胞の割合を低減させ、かつ、第２の細胞が、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓまたはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞、場合により、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａまたはＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ細胞である、組成物。
【請求項23】
第２の細胞が、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓである、請求項２２に記載の使用のための組成物。
【請求項24】
第２の細胞が、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓである、請求項２２に記載の使用のための組成物。
【請求項25】
第２の細胞が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍである、請求項２２に記載の使用のための組成物。
【請求項26】
第２の細胞が、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａである、請求項２２に記載の使用のための組成物。
【請求項27】
第２の細胞が、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍである、請求項２２に記載の使用のための組成物。
【請求項28】
第２の細胞が、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓである、請求項２２に記載の使用のための組成物。
【請求項29】
第２の細胞が、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍである、請求項２２に記載の使用のための組成物。
【請求項30】
請求項２２－２９のいずれか一項に記載の使用のための組成物であって、該方法が、第１の細胞の１つ以上の標的ゲノムのまたはエピソームのヌクレオチド配列を改変することを含む、組成物。
【請求項31】
請求項３０に記載の使用のための組成物であって、該方法が、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）細胞の１つ以上の標的ゲノムのまたはエピソームのヌクレオチド配列を切断することを含む、組成物。
【請求項32】
請求項２２－３０のいずれか一項に記載の使用のための組成物であって、該第１の細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である、組成物。
【請求項33】
請求項２２－３０のいずれか一項に記載の使用のための組成物であって、該第１の細胞が、Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ細胞である、組成物。
【請求項34】
請求項２２－３３のいずれか一項に記載の使用のための組成物であって、さらに、前記第２の細胞の細胞を含む患者に細菌移植片を投与することを含む、組成物。
【請求項35】
請求項２２－３４のいずれか一項に記載の使用のための組成物であって、抗体が、イピリムマブ（またはＹＥＲＶＯＹ
商標
）、トレメリムマブ、ニボルマブ（またはＯＰＤＩＶＯ
商標
）、ペンブロリズマブ（またはＫＥＹＴＲＵＤＡ
商標
）、ピディリズマブ、ＢＭＳ－９３６５５９、デュルバルマブおよびアテゾリズマブから選択される、組成物。
【請求項36】
請求項２２－３５のいずれか一項に記載の使用のための組成物であって、アップレギュレートされた免疫細胞が、（ｉ）ＣＤ４
＋
細胞；（ｉｉ）ＣＤ８
＋
細胞；（ｉｉｉ）ＴＨ１７細胞；または（ｉｖ）ＴＨ１細胞；または（ｖ）メモリー細胞、場合により、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔ
ＣＭ
）、エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔ
ＥＭ
）、ステムセルメモリー細胞（Ｔ
ＳＣＭ
）およびエフェクター細胞（Ｔ
ｅｆｆ
）の１つ以上である、組成物。
【請求項37】
請求項２２－３６のいずれか一項に記載の使用のための組成物であって、チェックポイント阻害抗体が、抗ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＬＡＧ３、ＯＸ４０、ＣＤ２８、ＢＴＬＡ、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＫＩＲ、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＴＩＧＩＴまたはＳＩＲＰａ抗体である、組成物。
【請求項38】
チェックポイント阻害抗体が、抗ＣＴＬＡ４抗体である、請求項３７に記載の使用のための組成物。
【請求項39】
チェックポイント阻害抗体が、抗ＰＤ－１抗体である、請求項３７に記載の使用のための組成物。
【請求項40】
チェックポイント阻害抗体が、抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項３７に記載の使用のための組成物。
【請求項41】
請求項２２－４０のいずれか一項に記載の使用のための組成物であって、第２の細菌細胞が、第１の細菌細胞の１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列と少なくとも８０％同一である１６ｓリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を有し、微生物叢における第２の細胞の増殖が、前記方法によって阻害されない、組成物。
【請求項42】
請求項４１に記載の使用のための組成物であって、前記第１の細胞の増殖が、第２の細胞の少なくとも１０倍の増殖阻害で阻害される、組成物。
【請求項43】
請求項２２－４２のいずれか一項に記載の使用のための組成物であって、第２の細菌細胞が、ヒト腸内片利共生株および／またはヒト腸内プロバイオティック株である、組成物。
【請求項44】
請求項２２－４３のいずれか一項に記載の使用のための組成物であって、アップレギュレートされた免疫細胞が、患者の内因性細胞および／または（例えば養子細胞療法を介して）投与された細胞を含む、組成物。
【請求項45】
請求項２２－４４のいずれか一項に記載の使用のための組成物であって、ヌクレアーゼが、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼである、組成物。
【請求項46】
癌治療の改変における使用のための細菌移植片であって、癌治療が、患者に免疫チェックポイントアンタゴニストまたはアゴニスト治療を投与することを含み、使用が、
（ｉ）患者において治療を実行すること；および
（ｉｉ）患者において腸内細菌の微生物叢ディスバイオシスを引き起こし、それにより、該ディスバイオシスが患者において癌治療を調節する細菌移植片を、患者に投与すること
を含み；
ここで、細菌移植片が、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ細胞を含む、細菌移植片。
（ｉ）患者において治療を実行すること；および
（ｉｉ）患者において腸内細菌の微生物叢ディスバイオシスを引き起こし、それにより、該ディスバイオシスが患者において癌治療を調節する細菌移植片を、患者に投与すること
を含み；
ここで、細菌移植片が、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ細胞を含む、細菌移植片。
【請求項47】
治療が、イピリムマブ（すなわちＹＥＲＶＯＹ
商標
）、トレメリムマブ、ニボルマブ（すなわちＯＰＤＩＶＯ
商標
）、ペンブロリズマブ（すなわちＫＥＹＴＲＵＤＡ
商標
）、ピディリズマブ、ＢＭＳ－９３６５５９、デュルバルマブおよびアテゾリズマブから選択される抗体を用いた抗体療法である、請求項４６に記載の使用のための細菌移植片。
【請求項48】
治療が増強され、かつ免疫細胞がアップレギュレートされる、請求項４６または４７に記載の使用のための細菌移植片。
【請求項49】
アップレギュレートされた免疫細胞が、
（ｉ）ＣＤ４ ＋ 細胞；
（ｉｉ）ＣＤ８ ＋ 細胞；
（ｉｉｉ）Ｔ Ｈ １７細胞；または
（ｉｖ）Ｔ Ｈ １細胞；または
（ｖ）メモリー細胞、所望により、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔ ＣＭ ）、エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔ ＥＭ ）、ステムセルメモリー細胞（Ｔ ＳＣＭ ）およびエフェクター細胞（Ｔ ｅｆｆ ）の１つ以上
である、請求項４８に記載の使用のための細菌移植片。
（ｉ）ＣＤ４ ＋ 細胞；
（ｉｉ）ＣＤ８ ＋ 細胞；
（ｉｉｉ）Ｔ Ｈ １７細胞；または
（ｉｖ）Ｔ Ｈ １細胞；または
（ｖ）メモリー細胞、所望により、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔ ＣＭ ）、エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔ ＥＭ ）、ステムセルメモリー細胞（Ｔ ＳＣＭ ）およびエフェクター細胞（Ｔ ｅｆｆ ）の１つ以上
である、請求項４８に記載の使用のための細菌移植片。
【請求項50】
アンタゴニストまたはアゴニストが、チェックポイント阻害剤またはアゴニスト抗体、所望により、抗ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＬＡＧ３、ＯＸ４０、ＣＤ２８、ＢＴＬＡ、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＫＩＲ、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＴＩＧＩＴまたはＳＩＲＰａ抗体である、請求項４６－４９のいずれか一項に記載の使用のための細菌移植片。
【請求項51】
治療が、免疫チェックポイント阻害剤を投与することを含み、所望により、阻害剤が、抗ＰＤ－Ｌ１または抗ＰＤ－１または抗ＣＴＬＡ４である、請求項４６－５０のいずれか一項に記載の使用のための細菌移植片。
【請求項52】
アップレギュレートされた免疫細胞が、患者の内因性細胞および／または（例えば養子細胞療法を介して）投与された細胞を含む、請求項４６－５１のいずれか一項に記載の使用のための細菌移植片。
【請求項53】
Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ細胞およびＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、ＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓまたはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞の一つ以上を含む、請求項４６－５２のいずれか一項に記載の使用のための細菌移植片。
【外国語明細書】