特開 2023-22846 試料作製方法、凍結加圧装置および観察方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023022846

(43)【公開日】2023-02-16

(54)【発明の名称】試料作製方法、凍結加圧装置および観察方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 1/28 20060101AFI20230209BHJP

   G01N 1/42 20060101ALI20230209BHJP

【ＦＩ】

G01N1/28 G

G01N1/42

G01N1/28 F

【審査請求】有

【請求項の数】11

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2019211101

(22)【出願日】2019-11-22

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 令和１年１０月２３日、日本高圧力学会主催、第６０回高圧討論会にて発表。 令和１年１１月２１日、イオン液体研究会主催、第１０回イオン液体討論会にて発表。

(71)【出願人】

【識別番号】598123138

【氏名又は名称】学校法人 創価大学

(74)【代理人】

【識別番号】100120031

【弁理士】

【氏名又は名称】宮嶋 学

(74)【代理人】

【識別番号】100126099

【弁理士】

【氏名又は名称】反町 洋

(74)【代理人】

【識別番号】100130719

【弁理士】

【氏名又は名称】村越 卓

(74)【代理人】

【識別番号】110000420

【氏名又は名称】弁理士法人ＭＩＰ

(71)【出願人】

【識別番号】000134970

【氏名又は名称】株式会社ニチレイ

(74)【代理人】

【識別番号】100120031

【弁理士】

【氏名又は名称】宮嶋 学

(74)【代理人】

【識別番号】100126099

【弁理士】

【氏名又は名称】反町 洋

(74)【代理人】

【識別番号】100130719

【弁理士】

【氏名又は名称】村越 卓

(72)【発明者】

【氏名】清水 昭夫

(72)【発明者】

【氏名】佐谷 大史

【テーマコード（参考）】

2G052

【Ｆターム（参考）】

2G052AA24

2G052AA28

2G052AD32

2G052AD52

2G052DA25

2G052EB08

2G052EC01

2G052GA35

2G052JA03

2G052JA11

(57)【要約】

【課題】 氷晶の生成を抑制する試料作製方法、凍結加圧装置および観察方法を提供すること。
【解決手段】 空洞部と、空洞部の１つの面が開口した開口部とを有する第１の収容部材１１ａおよび第２の収容部材１１ｂからなる試料作製装置１０の内部の空間に、被観察物および水を入れて、空間に充填する工程と、第１の収容部材１１ａの開口部と、第２の収容部材１１ｂの開口部とを合わせて固定する工程と、試料作製装置１０を冷却する工程と、第１の収容部材１１ａおよび第２の収容部材１１ｂを分離して、冷却する工程によって凍結した被観察物を割断する工程とを含む。
【選択図】 図４

【特許請求の範囲】

【請求項1】

空洞部と、前記空洞部の１つの面が開口した開口部とを有する第１の部材および第２の部材からなる試料作製装置の内部の空間に、被観察物および水を入れて、前記空間に充填する工程と、
前記第１の部材の開口部と、前記第２の部材の開口部とを合わせて固定する工程と、
前記試料作製装置を冷却する工程と、
前記第１の部材および前記第２の部材を分離して、前記冷却する工程によって凍結した前記被観察物を割断する工程と
を含む、試料作製方法。

【請求項2】

前記充填する工程は、水中で行われることを特徴とする、請求項１に記載の試料作製方法。

【請求項3】

前記割断する工程は、前記第１の部材と前記第２の部材とが連結した部分を折ることで、前記第１の部材および前記第２の部材を分離することを特徴とする、請求項１または２に記載の試料作製方法。

【請求項4】

空洞部と、前記空洞部の１つの面が開口した開口部とを有する第１の収容部および第２の収容部と、
前記第１の収容部と前記第２の収容部とを固定する固定部と
を具備し、
前記第１の収容部の開口部と、前記第２の収容部の開口部とを合わせて、前記固定部によって固定して形成される空間を有する、
凍結加圧装置。

【請求項5】

前記空洞部は、前記開口部に向かって狭くなることを特徴とする、請求項４に記載の凍結加圧装置。

【請求項6】

前記第１の収容部および前記第２の収容部は、それぞれが前記固定部と一体として構成されることを特徴とする、請求項４または５に記載の凍結加圧装置。

【請求項7】

前記第２の収容部は、開口部の反対側に開いたテーパ部を有し、前記テーパ部に対応する形状を具備するネジによって、前記第１の収容部と前記第２の収容部とを固定することを特徴とする、請求項４または５に記載の凍結加圧装置。

【請求項8】

前記第１の収容部の開口部と、前記第２の収容部の開口部との間にガスケットを挿入して、前記固定部によって固定することを特徴とする、請求項４～７のいずれか１項に記載の凍結加圧装置。

【請求項9】

前記ガスケットの材料が銅であることを特徴とする、請求項８に記載の凍結加圧装置。

【請求項10】

前記ガスケットは、印加された圧力に応じて着色されることを特徴とする、請求項８に記載の凍結加圧装置。

【請求項11】

空洞部と、前記空洞部の１つの面が開口した開口部とを有する第１の部材および第２の部材からなる試料作製装置の内部の空間に、被観察物および水を入れて、前記空間に充填する工程と、
前記第１の部材の開口部と、前記第２の部材の開口部とを合わせて固定する工程と、
前記試料作製装置を冷却する工程と、
前記第１の部材および前記第２の部材を分離して、前記冷却する工程によって凍結した前記被観察物を割断する工程と、
前記割断する工程によって割断された前記被観察物の割断面を観察する工程と
を含む、観察方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、試料作製方法、凍結加圧装置および観察方法に関する。

【背景技術】

【0002】

食品、植物、微小生物、細胞などといった水分含有量の多い物質を被観察物として顕微鏡で観察する場合において、当該被観察物を凍結させて、切断することで、観察用の試料を作製する、凍結割断試料作製技術が知られている（例えば、特許文献１など）。

【0003】

しかしながら、被観察物に含まれる水分が凍結する際に氷晶が生成され、被観察物が破壊されるため、適切な観察ができないという問題があった。このような被観察物の破壊を抑制するため、有機溶媒などによって氷晶の生成を抑制する方法なども提案されているが、有機溶媒が被観察物に影響を及ぼすことがあり、やはり適切な観察には向かなかった。

【0004】

この点につき、非特許文献１や特許文献２などには、氷晶の生成を抑制する凍結技術が開示されている。ここで、非特許文献１に開示されている走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）での観察用の試料を作製する方法について、図１０を以て説明する。図１０は、従来技術における観察用試料の作製の概略を示す図である。

【0005】

非特許文献１に記載されている従来技術では、図１０（ａ）に示すような平板型試料作製装置５０を用いて、凍結割断試料を作製する。従来技術における平板型試料作製装置５０は、図１０（ｂ）に示すように、２つの平板型収容部材５１ａ，５１ｂに分割可能に構成される。平板型収容部材５１ａ，５１ｂは、上部が開放された窪みを有し、２つを連結することで、図１０（ａ）のような試料作製領域が形成される。

【0006】

図１０（ｃ）～（ｅ）は、凍結割断試料作製方法の各工程を示している。まず、図１０（ｃ）のように、平板型試料作製装置５０の窪み部分に被観察物と水を入れて、窪み部分を水で満たす。このとき、観察対象となる部位が、平板型収容部材５１ａ，５１ｂの境界に配置されるように、被観察物を配置する。

【0007】

その後、図１０（ｄ）に示すように、平板型試料作製装置５０を冷却し、被観察物や水を凍結させる。平板型試料作製装置５０を冷却する方法としては、冷却した金属ブロックを平板型試料作製装置５０に当接させる方法が挙げられる。このとき、平板型試料作製装置５０内の水は、外側の部分から凍結し、未凍結の水と被観察物とを内包しながらさらに冷却が進む。したがって、水や被観察物の水分が凍結する際に、体積の膨張が押さえ付けられ、氷晶の生成が抑制される。

【0008】

平板型試料作製装置５０の内容物を凍結させたあと、図１０（ｅ）に示すように、平板型収容部材５１ａ，５１ｂを分割する。平板型収容部材５１ａ，５１ｂは、窪み部分のうち、他方の平板型収容部材５１と連結する箇所が細くなっていることから、平板型収容部材５１を分割する際に被観察物が割断しやすい構造となっている。このようにして割断された被観察物は、真空乾燥後、オスミウムでコーティングされ、顕微鏡観察用の試料となる。

【0009】

図１０を以て説明した従来技術のように、凍結時に加圧することで氷晶の生成を抑制した試料を作製することができる。しかしながら、非特許文献１などの従来技術においては、冷却速度が１０Ｋ／ｓの急速な冷却が必要であり、また、１ｍｍ以下（０．０６ミリリットル程度）の小さな被観察物でしか、試料を作製することができなかった。

【0010】

そのため、氷晶の生成を抑制する凍結割断試料作製技術において、さらなる利便性の向上が求められていた。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

本発明は、上記従来技術における課題に鑑みてなされたものであり、氷晶の生成を抑制する試料作製方法、凍結加圧装置および観察方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0012】

すなわち、本発明によれば、
空洞部と、前記空洞部の１つの面が開口した開口部とを有する第１の部材および第２の部材からなる試料作製装置の内部の空間に、被観察物および水を入れて、前記空間に充填する工程と、
前記第１の部材の開口部と、前記第２の部材の開口部とを合わせて固定する工程と、
前記試料作製装置を冷却する工程と、
前記第１の部材および前記第２の部材を分離して、前記冷却する工程によって凍結した前記被観察物を割断する工程と
を含む、試料作製方法が提供される。

【発明の効果】

【0013】

本発明によれば、氷晶の生成を抑制する試料作製方法、凍結加圧装置および観察方法が提供できる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】本実施形態の試料作製装置の構造を示す斜視図。

【図2】本実施形態の試料作製装置を構成する収容部材の構造を示す図。

【図3】本実施形態の試料作製装置を構成する固定部材の構造を示す図。

【図4】本実施形態における観察用試料の作製を説明する図。

【図5】本実施形態において作製された試料のＳＥＭ画像およびその比較例。

【図6】本実施形態の試料作製装置を構成する収容部材の第１の変形例を示す図。

【図7】本実施形態の試料作製装置を構成する収容部材の第２の変形例を示す図。

【図8】本実施形態の試料作製装置を構成する収容部材の第３の変形例および固定部材の変形例を示す図。

【図9】本実施形態の試料作製装置を構成する収容部材の第３の変形例および固定部材の変形例を示す図。

【図10】従来技術における観察用試料の作製の概略を示す図。

【発明を実施するための形態】

【0015】

以下、本発明を、実施形態をもって説明するが、本発明は後述する実施形態に限定されるものではない。なお、以下に参照する各図においては、共通する要素について同じ符号を用い、適宜その説明を省略するものとする。

【0016】

また、以下に説明する実施形態では、微小生物を被観察物として、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察するための試料を作製する場合を例示しているが、特に実施形態を限定するものではない。したがって、微小生物以外にも、食品、植物、細胞、ゲル状物などを被観察物としてもよく、さらにその応用として、化学、製薬などの分野において適用してもよい。また、観察装置についても、ＳＥＭ以外の装置であってもよい。

【0017】

図１は、本実施形態の試料作製装置１０の構造を示す斜視図である。本実施形態の試料作製装置１０は、収容部と固定部から構成され、図１に示すように、被観察物および水を収容する第１の収容部材１１ａおよび第２の収容部材１１ｂと、第１の収容部材１１ａおよび第２の収容部材１１ｂを固定する固定部材１２およびネジ１３とを具備する。なお、第１の収容部材１１ａおよび第２の収容部材１１ｂを組み合わせることで、密閉された空間を形成することができる。また、図１では、固定のためのネジ１３は、六角穴付きボルトが例として図示されているが、特に実施形態を限定するものではない。以下に説明する実施形態では、試料作製装置１０に収容された被観察物および水をまとめて「内容物」として参照する場合がある。

【0018】

図１に示した試料作製装置１０を冷却し、収容した内容物を凍結させ、割断することで、氷晶の生成を抑制した顕微鏡観察用の試料を作製することができる。以下に、図１に示した本実施形態の試料作製装置１０を構成する各部について、図２および図３を以て説明する。図２は、本実施形態の試料作製装置１０を構成する収容部材１１の構造を示す図であり、図３は、本実施形態の試料作製装置１０を構成する固定部材１２の構造を示す図である。

【0019】

まず、図２の収容部材１１について説明する。図２（ａ）は、収容部材１１の投影図を示している。図２（ａ）上段は、収容部材１１の上面図を示し、図２（ａ）下段は、収容部材１１を図２（ａ）上段のＡ－Ａ’線で切断した断面図を示している。また、図２（ｂ）左図は、収容部材１１の斜視図を示し、図２（ｂ）右図は、収容部材１１を切断した断面の斜視図を示している。

【0020】

図２の各図に示すように、収容部材１１は、被観察物などを収容する空洞部と、空洞部の１面が開口した開口部とを具備した構造である。また、収容部材１１の空洞部には、図２に示すように、収容した被観察物の位置を固定しやすくするための窪みを設けてもよい。

【0021】

本実施委形態の試料作製装置１０は、２つの収容部材１１ａ，１１ｂの開口部を合わせて固定することで、各収容部材１１ａ，１１ｂの空洞部が連結し、被観察物および水を収容するための１つの閉じた空間（以下、単に「空間」として参照する）が形成される。この空間は、内容物で内部が充填され、密閉されているため、凍結時における内容物の膨張が収容部材１１の内壁によって押さえ付けられ、内容物を加圧することができる。これによって、被観察物の氷晶の生成を抑制することができる。

【0022】

なお、本実施形態の試料作製装置１０を構成する第１の収容部材１１ａおよび第２の収容部材１１ｂの形状は、必ずしも同一でなくてもよく、それぞれ異なる形状で構成されてもよい。

【0023】

また、収容部材１１の空洞部の大きさは、内容物を充分に凍結できる程度であれば特に限定されないが、一例として開口部の直径を８ｍｍ程度、深さを４ｍｍ程度とすることで、特許文献２や非特許文献１などの従来技術に比べて、格段に大きな被観察物であっても試料を作製することができる。

【0024】

次に、図３の固定部材１２について説明する。図３（ａ）は、固定部材１２の投影図を示している。また、図３（ｂ）は、固定部材１２の斜視図を示している。

【0025】

図３の各図に示すように、本実施形態の固定部材１２は、枠型形状の部材であり、上部に貫通したネジ穴が設けられている。本実施形態の試料作製装置１０は、固定部材１２の枠内に、開口部を合わせた２つの収容部材１１ａ，１１ｂを収め、ネジ１３で締めることで、各収容部材１１ａ，１１ｂを密閉して固定することができる（図１参照）。

【0026】

なお、固定部材１２の形状は、図３に示すような枠型形状に限定されない。すなわち、固定部材１２は、開口部を合わせた２つの収容部材１１ａ，１１ｂを、ネジ１３を占めることによって上方および下方から押さえ付けられる構造であればよく、例えば、「コの字」形状の固定部材１２であってもよい。

【0027】

また、説明する実施形態に係る試料作製装置１０を構成する各部材は、構造がシンプルであるため、製造時における加工が容易であり、製造コストの面でも優れる。

【0028】

以上、図１～３に示した構造の試料作製装置１０によって、氷晶の生成を抑制した試料を作製することができる。次に、本実施形態の試料作製装置１０による凍結割断試料の作製について、図４を以て説明する。図４は、本実施形態における観察用試料の作製を説明する図である。本実施形態における試料の作製は、図４（ａ）～（ｃ）の順序で行われる。

【0029】

まず、図４（ａ）に示すように、投入工程および固定工程を行う。すなわち、投入工程では、第１の収容部材１１ａおよび第２の収容部材１１ｂに、被観察物および水を入れ、第１の収容部材１１ａおよび第２の収容部材１１ｂの空洞部を内容物で充填する。なお、試料に不純物が混入するのを防ぐため、充填される水は、純水または超純水とすることが好ましい（説明する実施形態における「水」の用語は、純水および超純水をも含むものとする）。

【0030】

投入工程の後、固定工程では、第１の収容部材１１ａの開口部と、第２の収容部材１１ｂの開口部とを合わせて、固定部材１２の内部に収め、ネジ１３で締めつけることで、第１の収容部材１１ａおよび第２の収容部材１１ｂを固定する。これによって、図１に示したような形態の試料作製装置１０が構成される。

【0031】

なお、好ましい実施形態では、図４（ａ）に示す投入工程および固定工程は、水中で行うこととしてもよい。これによって、試料作製装置１０の密閉された空間に空気が入らず、空間内部が水で充填されるため、膨張による加圧を効果的に行うことができる。

【0032】

また、密閉された空間の気密性を向上させるために、第１の収容部材１１ａおよび第２の収容部材１１ｂを固定する際に、各収容部材１１の間には、ガスケットを挿入してもよい。ガスケットの材料には、特に制限はないが、例えば感圧紙や銅などとすることができる。印加された圧力に応じて着色される感圧紙（例えば、富士フィルム社製「プレスケール（登録商標）」など）をガスケットに用いることで、固定工程において第１の収容部材１１ａおよび第２の収容部材１１ｂが適当な圧力で固定されていることを視覚的に把握することができる。また、銅製のガスケットを挿入することで、後述する冷却工程における熱伝導を向上でき、効率的な冷却を行うことができる。特に銅製のガスケットを挿入した場合には、感圧紙を用いた場合に比べて、氷晶の生成がより効果的に抑制されていることが確認された。

【0033】

投入工程および固定工程のあと、図４（ｂ）に示すように冷却工程を行い、試料作製装置１０の内容物を凍結させる。図４（ｂ）は、試料作製装置１０の第１の収容部材１１ａおよび第２の収容部材１１ｂを拡大した断面図である。図４（ｂ）に示すように、試料作製装置１０の密閉された空間は、内容物で充填され、内部が満たされている。したがって、試料作製装置１０が冷却されて、内容物が凍結されると、凍結に伴う内容物の膨張によって、内部が加圧される。これによって、氷晶の生成を抑制することができる。

【0034】

なお、冷却工程における試料作製装置１０を冷却する方法は、特に限定されず、種々の方法を採用することができる。冷却方法の一例として、試料作製装置１０を液体窒素に浸漬する方法が挙げられるが、液体窒素以外の冷却材料を用いてもよい。

【0035】

冷却工程によって内容物を凍結させたあと、図４（ｃ）に示す割断工程を行う。割断工程では、試料作製装置１０の固定を外し、第１の収容部材１１ａおよび第２の収容部材１１ｂを分離する。また、凍結によって膨張した氷は、収容部の内壁に押さえられているため、割断工程では、第１の収容部材１１ａおよび第２の収容部材１１ｂを把持し、連結部分を折るようにして分離させることで、凍結した被観察物が割断され、割断面を露出させることができる。なお、各収容部材１１を分離しやするするために、連結部分に刃を入れ、氷に切れ目を入れてから割断してもよい。割断工程によって露出した割断面は、顕微鏡観察における観察面となる。その後、被測定物を真空乾燥させ、オスミウムコーティングを行うことで、ＳＥＭ観察用試料として完成し、ＳＥＭによる観察を行うことができる。

【0036】

図４において説明した各工程によって、水分を含む被観察物であっても、氷晶の生成によるダメージを抑制して観察用試料を作製することができる。また、図１０に示した従来技術などでは、１ｍｍ以下（０．０６ミリリットル程度）の小さな被観察物の試料しか作製できなかったが、本実施形態の試料作製では、０．４ミリリットル以上の比較的大きな被観察物であっても観察用試料を作製することができる。さらに、本実施形態における試料作製の冷却工程では、図１０に示した従来技術などよりも遅い冷却速度であっても、氷晶の生成を抑制することができる。

【0037】

図５は、本実施形態において作製された試料のＳＥＭ画像およびその比較例である。図５における試料は、２％寒天ゲルを被観察物として凍結し割断したものである。図５（Ａ）および（ａ－１）～（ａ－３）は、２％寒天ゲルを本実施形態の方法で凍結し、割断して作製された試料を、ＳＥＭで観察した画像である。また、図５（Ｂ）および（ｂ－１）～（ｂ－３）は、本実施形態との比較例であり、２％寒天ゲルを液体窒素に浸漬させ、ＳＥＭで観察した画像である。

【0038】

まず、図５（Ａ）および（ａ－１）～（ａ－３）について説明する。図５（Ａ）は、本実施形態の方法によって作製された試料全体のＳＥＭ画像である。また、図５（ａ－１）～（ａ－３）は、それぞれ図５（Ａ）中の１～３の位置を拡大したＳＥＭ画像である。図５（ａ－１）は、試料の外側近傍のＳＥＭ画像であり、わずかに寒天の網目構造がダメージを受けていることが観察された。図５（ａ－２）は、試料表面から１ｍｍ程度内側の部分のＳＥＭ画像であり、寒天特有の良好な網目構造が観察された。また、図５（ａ－３）は、試料の中央付近のＳＥＭ画像であり、寒天特有の良好な網目構造が観察された。すなわち、本実施形態の方法によって作製された試料のいずれの部位においても、寒天に特有の網目構造が観察され、特に、図５（ａ－２）および（ａ－３）では、良好な網目構造が観察されたことから、本実施形態の方法によって、凍結時における氷晶の生成が抑制されていることが確認された。

【0039】

次に、図５（Ｂ）および（ｂ－１）～（ｂ－３）について説明する。図５（Ｂ）は、２％寒天ゲルを液体窒素に浸漬させることで作製された試料のＳＥＭ画像である。また、図５（ｂ－１）～（ｂ－３）は、それぞれ図５（Ｂ）中の１～３の位置を拡大したＳＥＭ画像であり、図５（ｂ－１）は、試料の外側近傍を、図５（ｂ－２）は、試料表面から１ｍｍ程度内側の部分を、図５（ａ－３）は、試料の中央付近を、それぞれ示している。図５（ｂ－１）、（ｂ－２）に示すように、２％寒天ゲルを液体窒素に浸漬させて作製した試料の外周に近い部位は、氷晶の生成による被観察物へのダメージが確認された。また、図５（ｂ－３）に示すように、試料の中央付近では、寒天の網目構造がみられるが、網目が比較的大きいことから、氷晶の生成が認められ、被観察物へのダメージが確認された。

【0040】

図５に示したように、本実施形態の方法で作製した試料は、寒天特有の網目構造が確認され、氷晶の生成が抑制されていることを確認した。したがって、本実施形態の方法によって、水分の含有量が多い被観察物であっても、氷晶の生成を抑制して試料を作製できたことが確認できた。

【0041】

ここまでに説明した実施形態では、図２に例示した形状の収容部材１１で以て説明した。しかしながら、収容部材１１の形状は、図２に示したものに限定されず、例えば、以下に示す各変形例のような形状であってもよい。

【0042】

まず、第１の変形例について説明する。図６は、本実施形態の試料作製装置１０を構成する収容部材１１の第１の変形例を示す図である。図６（ａ）は、収容部材１１の第１の変形例の上面投影図および側面断面の投影図であり、図６（ｂ）は、斜視図および断面斜視図である。図６に示すように、第１の変形例における収容部材１１は、空洞部が開口部に向かって狭くなる形状である。このような形状とすることで、第１の収容部材１１ａの開口部と、第２の収容部材１１ｂの開口部とが連結する面積が小さくなることから、各収容部材１１を分離しやすくでき、割断工程を容易に行うことができる。

【0043】

次に、第２の変形例について説明する。図７は、本実施形態の試料作製装置１０を構成する収容部材１１の第２の変形例を示す図である。図７（ａ）は、収容部材１１の第２の変形例の上面投影図および側面断面の投影図であり、図７（ｂ）は、第２の変形例に係る収容部材１１によって構成される試料作製装置１０の斜視図である。図７に示す第２の変形例に係る収容部材１１は、本実施形態の収容部と固定部とを一体として構成された形状である。

【0044】

図７（ａ）に示すように、第２の変形例の収容部材１１は、図２などで説明した空洞部および開口部を備え、さらに、開口部の開口面にフランジ部を具備する。フランジ部には、同一円周上に等配された穴が設けられている。フランジ部は、固定部材１２に相当する機能を有し、固定工程においてネジ留めされることで、第１の収容部材１１ａおよび第２の収容部材１１ｂを固定することができる。なお、フランジ部の穴の位置や数は、図７に示したものに限定されず、任意とすることができる。また、フランジ部の穴は、タッピング処理されたネジ穴であってもよい。

【0045】

第２の変形例に係る収容部材１１は、図７（ｂ）左図のように組み合わせることで、試料作製装置１０を構成する。すなわち、フランジ部付きの収容部材１１を、第１の収容部材１１ａおよび第２の収容部材１１ｂとして、開口部およびフランジ部の穴を合わせ、ネジ１３およびナット１３ａで固定する。これによって、図７（ｂ）右図のような形態の試料作製装置１０とすることができる。第２の変形例に係る収容部材１１を用いることで、固定部材１２が不要な試料作製装置１０とすることができる。

【0046】

次に第３の変形例について説明する。図８および図９は、本実施形態の試料作製装置１０を構成する収容部材１１の第３の変形例および固定部材１２の変形例を示す図である。

【0047】

収容部材１１の第３の変形例は、図８（ａ）および（ｂ）に示すように、台１の収容部材１１ａと第２の収容部材１１ｂとで異なる形状である。すなわち、第１の収容部材１１ａは、図２に示した収容部材１１と同様の形状である。なお、第１の収容部材１１ａには、図８（ａ）に示すように、後述するようにピン１４を挿入するための穴を設けることが好ましい。また、第２の収容部材１１ｂは、図８（ｂ）に示すように、図２に示した収容部材１１にテーパ状の穴が設けられており、開口部からテーパ部まで貫通した形状である。なお、固定部材１２は、図８（ｃ）に示すように、図３に示したものと同様の形状であるが、図８（ａ）に示した収容部材１１ａのピン挿入穴に対応する穴が設けられていてもよい。

【0048】

上述した各収容部材１１および固定部材１２を用いた試料作製装置１０は、図９（ａ）に示すように構成される。図９（ａ）は、図８に示した各部材を用いた試料作製装置１０における、投入工程・固定工程を示している。ここで、収容部材１１および固定部材１２を固定するためのネジは、図９（ａ）に示すように、先端にテーパ形状を有するネジ１３’（以下、「テーパ付きネジ１３’」として参照する）を用いる。テーパ付きネジ１３’は、先端部のテーパ形状が第２の収容部材１１ｂのテーパ部に対応する形状であり、固定工程において、テーパ付きネジ１３’のテーパ部と、第２の収容部材１１ｂのテーパ部分とが密着する。

【0049】

図９（ｂ）は、試料作製装置１０の断面図である。なお、図９（ｂ）では、被観察物や水などが省略して図示されている点に留意されたい。図９（ｂ）に示すように、テーパ付きネジ１３’を用いることによって、収容部材１１ａおよび１１ｂを固定するとともに、空間を密閉することができ、冷却工程における加圧を可能とする。また、第１の収容部材１１ａと、固定部材１２とにピン１４を挿入することで、各部材のズレを防止することができる。

【0050】

図８および図９に示した形態の試料作製装置１０を用いることによって、各工程の作業性を向上することができる。

【0051】

以上に説明した本発明の実施形態によれば、氷晶の生成を抑制する試料作製方法、凍結加圧装置および観察方法を提供することができる。また、本実施形態は、簡易な構成で以て氷晶の生成を抑制できることから、コスト低減にも寄与し得る。さらに、従来技術よりも格段に大きな試料を作製することができる。

【0052】

以上、本発明について実施形態をもって説明してきたが、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、当業者が推考しうる実施態様の範囲内において、本発明の作用・効果を奏する限り、本発明の範囲に含まれるものである。また、説明した実施形態に係る試料作製装置は、観察用試料を作製するための用途に供されるものに限定されず、水の凍結によって内容物を加圧するため装置などであってもよい。

【符号の説明】

【0053】

１０…試料作製装置、
１１…収容部材、
１２…固定部材、
１３…ネジ、
１３’…テーパ付きネジ、
１３ａ…ナット、
１４…ピン、
５０…平板型試料作製装置、
５１…平板型収容部材

【先行技術文献】

【特許文献】

【0054】

【特許文献1】特開２０１３－２５３９５７号公報

【特許文献2】特開２０１４－２５７３２号公報

【非特許文献】

【0055】

【非特許文献1】太田裕彦 et al. (2011)：冷却水を使用した新しいSEM試料作製用凍結乾燥法．医学生物学電子顕微鏡技術学会誌，25(1):9-13.

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】