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特開2023-2469抗ウイルス及び抗がんワクチンに用いる新規なｍＲＮＡ組成物及びその製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023002469
(43)【公開日】2023-01-10
(54)【発明の名称】抗ウイルス及び抗がんワクチンに用いる新規なｍＲＮＡ組成物及びその製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/10 20060101AFI20221227BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20221227BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20221227BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20221227BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20221227BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20221227BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221227BHJP
A61K 9/127 20060101ALI20221227BHJP
A61K 47/18 20060101ALI20221227BHJP
A61K 39/12 20060101ALI20221227BHJP
C12N 7/01 20060101ALN20221227BHJP
【ＦＩ】
C12N15/10 Z ZNA
C12N15/11 Z
A61K31/7105
A61P31/12
A61P37/04
A61K48/00
A61P35/00
A61K9/127
A61K47/18
A61K39/12
C12N7/01
【審査請求】未請求
【請求項の数】20
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022095318
(22)【出願日】2022-06-13
(31)【優先権主張番号】63/222,666
(32)【優先日】2021-07-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/209,969
(32)【優先日】2021-06-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/210,988
(32)【優先日】2021-06-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/213,258
(32)【優先日】2021-06-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】17/489,357
(32)【優先日】2021-09-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】508324396
【氏名又は名称】美洛生物科技股▲ふん▼有限公司
(71)【出願人】
【識別番号】505008028
【氏名又は名称】中央研究院
【氏名又は名称原語表記】ＡＣＡＤＥＭＩＡ ＳＩＮＩＣＡ
【住所又は居所原語表記】１２８ Ａｃａｄｅｍｉａ Ｒｏａｄ，Ｓｅｃｔｉｏｎ ２，Ｎａｎｋａｎｇ Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ
(74)【代理人】
【識別番号】110000176
【氏名又は名称】一色国際特許業務法人
(72)【発明者】
【氏名】林 希龍
(72)【発明者】
【氏名】沈 家寧
(72)【発明者】
【氏名】林 ▲イ▼秀
(72)【発明者】
【氏名】陳 守坤
(72)【発明者】
【氏名】呉 堂熙
(72)【発明者】
【氏名】王 梅榮
(57)【要約】 （修正有）
【課題】抗ウイルス及び抗がんワクチンの製造・開発に用いるｍＲＮＡ組成物及びその製造方法を提供する。
【解決手段】ｍＲＮＡ組成物及びその製造方法であって、少なくとも５’－ヘアピンメッセンジャーＲＮＡ（５ｈｍＲＮＡ）及び／又はメッセンジャーヘアピンメッセンジャーＲＮＡ（ｍｈｍＲＮＡ）、或いはその両者を含み、前記５ｈｍＲＮＡは、少なくとも所望のｍＲＮＡの５’－ＵＴＲ領域においてステムループＲＮＡ構造を含み、前記ｍｈｍＲＮＡは、少なくとも、両側に２つの同じ又は異なる目的のｍＲＮＡ配列を有するステムループＲＮＡ構造を含み、前記５ｈｍＲＮＡ及びｍｈｍＲＮＡは、少なくとも付加的なヘリカーゼ活性を有する新規なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）・ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）反応と改良された緩衝系によって生成される、組成物及び方法。
【選択図】なし
【解決手段】ｍＲＮＡ組成物及びその製造方法であって、少なくとも５’－ヘアピンメッセンジャーＲＮＡ（５ｈｍＲＮＡ）及び／又はメッセンジャーヘアピンメッセンジャーＲＮＡ（ｍｈｍＲＮＡ）、或いはその両者を含み、前記５ｈｍＲＮＡは、少なくとも所望のｍＲＮＡの５’－ＵＴＲ領域においてステムループＲＮＡ構造を含み、前記ｍｈｍＲＮＡは、少なくとも、両側に２つの同じ又は異なる目的のｍＲＮＡ配列を有するステムループＲＮＡ構造を含み、前記５ｈｍＲＮＡ及びｍｈｍＲＮＡは、少なくとも付加的なヘリカーゼ活性を有する新規なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）・ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）反応と改良された緩衝系によって生成される、組成物及び方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗ウイルス及び抗がんワクチンの製造・開発に用いる新規なｍＲＮＡ組成物及びその製造方法であって、
少なくとも５’－ヘアピンメッセンジャーＲＮＡ（５ｈｍＲＮＡ）及び／又はメッセンジャーヘアピンメッセンジャーＲＮＡ（ｍｈｍＲＮＡ）、或いはその両者を含み、前記５ｈｍＲＮＡは、少なくとも所望のｍＲＮＡの５’－ＵＴＲ領域においてステムループＲＮＡ構造を含み、前記ｍｈｍＲＮＡは、少なくとも、両側に２つの同じ又は異なる目的のｍＲＮＡ配列を有するステムループＲＮＡ構造を含み、前記５ｈｍＲＮＡ及びｍｈｍＲＮＡは、少なくとも付加的なヘリカーゼ活性を有する新規なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）・ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）反応と改良された緩衝系によって生成される、組成物及び方法。
少なくとも５’－ヘアピンメッセンジャーＲＮＡ（５ｈｍＲＮＡ）及び／又はメッセンジャーヘアピンメッセンジャーＲＮＡ（ｍｈｍＲＮＡ）、或いはその両者を含み、前記５ｈｍＲＮＡは、少なくとも所望のｍＲＮＡの５’－ＵＴＲ領域においてステムループＲＮＡ構造を含み、前記ｍｈｍＲＮＡは、少なくとも、両側に２つの同じ又は異なる目的のｍＲＮＡ配列を有するステムループＲＮＡ構造を含み、前記５ｈｍＲＮＡ及びｍｈｍＲＮＡは、少なくとも付加的なヘリカーゼ活性を有する新規なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）・ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）反応と改良された緩衝系によって生成される、組成物及び方法。
【請求項2】
前記５ｈｍＲＮＡは、主として５’－ステムループＲＮＡ及び３’－ｍＲＮＡの２つの部分から構成される、請求項１に記載の組成物及び方法。
【請求項3】
前記５’－ステムループＲＮＡは、少なくとも、好ましくは約１０～８００ヌクレオチドの長さを有する、完全又は不完全に一致した単一又は複数のヘアピン構造と、好ましくは約１～５００ヌクレオチド離れて存在し、前記ステムループ構造と次の３’－ｍＲＮＡの開始コドンの間に位置する短い配列とを有す、請求項２に記載の組成物及び方法。
【請求項4】
前記５’－ステムループＲＮＡ内の前記複数のヘアピン構造は、各２つのヘアピンＲＮＡ構造間に、好ましくは約２～５００ヌクレオチド離れて存在するスペーサー配列をさらに有す、請求項３に記載の組成物及び方法。
【請求項5】
前記３’－ｍＲＮＡは、少なくとも１つの所望のタンパク質又はペプチドをエンコードし、且つその３’末端に配列番号１又は配列番号２のいずれかを有す、請求項２に記載の組成物及び方法。
【請求項6】
前記５’－ステムループＲＮＡ構造は、さらに３’－ｍＲＮＡの翻訳を開始・強化する為の人工的リボソーム内部侵入部位（ＩＲＥＳ）模倣物として機能し得る、請求項２に記載の組成物及び方法。
【請求項7】
前記ｍｈｍＲＮＡは、５ｈｍＲＮＡの５’末端にさらなるｍＲＮＡ（５’－ｍＲＮＡ）配列を付加することによって形成され、前記ｍｈｍＲＮＡの前記ステムループＲＮＡ構造は最初の５’－ｍＲＮＡと次の３’－ｍＲＮＡの個々の翻訳を、それぞれ同じ又は異なるタンパク質／ペプチドに分離する中間セパレーターとして機能する、請求項１に記載の組成物及び方法。
【請求項8】
前記ステムループＲＮＡ構造は、さらに３’－ｍＲＮＡの翻訳を開始・強化する為の人工的リボソーム内部侵入部位（ＩＲＥＳ）模倣物として機能し得る、請求項７に記載の組成物及び方法。
【請求項9】
前記ｍｈｍＲＮＡの最初の５’－ｍＲＮＡは、トランスフェクト細胞において第２の３’－ｍＲＮＡ配列を増幅するためのウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）のようなＲＮＡレプリカーゼをエンコードし、トランスフェクト細胞におけるｍＲＮＡ自己増幅機構を得る、請求項７に記載の組成物及び方法。
【請求項10】
５ｈｍＲＮＡ及びｍｈｍＲＮＡの前記ステムループＲＮＡ構造は、少なくとも配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５及びこれらの組み合わせから選ばれる配列を含み得る、請求項１に記載の組成物及び方法。
【請求項11】
標的細胞にトランスフェクトされた後、５ｈｍＲＮＡとｍｈｍＲＮＡの両者は、少なくとも所望のタンパク質／ペプチドにさらに翻訳され、予め設計された所望の生物学的効果又は細胞機能を誘発することができ、前記生物学的効果又は細胞機能は、特異的免疫反応の誘発、ウイルス感染の予防、ウイルス複製／構築の抑制、及び／又は腫瘍／がん細胞の増殖の阻害、並びにがん細胞死の誘導を含むが、それらに限定されない、請求項１に記載の組成物及び方法。
【請求項12】
前記５ｈｍＲＮＡ及びｍｈｍＲＮＡは、トランスフェクト細胞においてさらに処理され、少なくとも特異的標的遺伝子を不活性化するのに有用なｓｈＲＮＡ及び／又はｐｉＲＮＡを少なくとも生成し得る、請求項１に記載の組成物及び方法。
【請求項13】
前記特異的標的遺伝子は、ウイルス及び／又はがん関連遺伝子などの様々な疾患関連細胞及び病原性遺伝子を含む、請求項１２に記載の組成物及び方法。
【請求項14】
前記ヘリカーゼ活性は、ＤＮＡ及びＲＮＡの両者の二次構造をほどくことができる、請求項１に記載の組成物及び方法。
【請求項15】
前記５ｈｍＲＮＡ及びｍｈｍＲＮＡの設計は、新規な薬学上及び治療上の応用、例えば、抗ウイルス及び／又は抗がん治療に用いるワクチン及び／又は医薬品の開発に有用である、請求項１に記載の組成物及び方法。
【請求項16】
前記５ｈｍＲＮＡ又はｍｈｍＲＮＡ、或いはその両者は、抗ウイルスワクチンの成分として使用される、請求項１に記載の組成物及び方法。
【請求項17】
前記５ｈｍＲＮＡ又はｍｈｍＲＮＡ、或いはその両者は、抗がん剤の成分として使用される、請求項１に記載の組成物及び方法。
【請求項18】
前記５ｈｍＲＮＡ又はｍｈｍＲＮＡ、或いはその両者は、少なくともｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでの細胞トランスフェクションのための送達剤とさらに混合される、請求項１に記載の組成物及び方法。
【請求項19】
前記送達剤は、グリシルグリセリン、リポソーム、ナノ粒子、リポソームナノ粒子、共役系分子、輸液製剤、遺伝子銃材料、エレクトロポレーション粒子、トランスポゾン、及びそれらの組み合わせを含む、請求項１８に記載の組成物及び方法。
【請求項20】
前記改良された緩衝系は、０．００１～１０ｍＭのベタイン（トリメチルグリシン、ＴＭＧ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、及び／又は３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、及び／又はそれらの組み合わせを添加した１×転写緩衝液を含む、請求項１に記載の組成物及び方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、一般に、ＲＮＡベースの抗ウイルス及び／又は抗がんワクチンや医薬品の開発・製造に有用である、新規なｍＲＮＡ組成物及びその製造方法に関する。こうして得られたｍＲＮＡは、予防用ワクチン及び／又は医薬品のみならず治療用ワクチン及び／又は医薬品の製造に使用することができる。本発明は、「５’－ヘアピンメッセンジャーＲＮＡ（５’－ｈａｉｒｐｉｎ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ，５ｈｍＲＮＡ）」及び「メッセンジャーヘアピンメッセンジャーＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ－ｈａｉｒｐｉｎ－ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ，ｍｈｍＲＮＡ）」の２種類の関連ｍＲＮＡ構築物を含む。簡潔に言えば、５ｈｍＲＮＡとｍｈｍＲＮＡの両者は、少なくともヘアピン様ステムループ構造を含む（即ち、完全又は不完全に一致した単一又は複数のヘアピンＲＮＡ）。５ｈｍＲＮＡは、少なくともタンパク質／ペプチドコーディングｍＲＮＡの５’－非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）においてステムループＲＮＡ構造を含み、ｍｈｍＲＮＡは、両側に２つのタンパク質／ペプチドコーディングｍＲＮＡ配列を有する中間ステムループＲＮＡ構造を含む。ｍｈｍＲＮＡにおいて、最初の５’－ｍＲＮＡは、好ましくは、トランスフェクト細胞において第２の３’－ｍＲＮＡを増幅するためのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）のようなＲＮＡレプリカーゼをエンコードする。標的細胞にトランスフェクトされた後、５ｈｍＲＮＡとｍｈｍＲＮＡの両者は、少なくとも予め設計された所望の生物学的効果又は細胞機能を誘導する為の所望のタンパク質／ペプチドにさらに翻訳され、、これらの生物学的効果又は細胞機能は、特異的免疫反応の誘発、ウイルス感染の予防、ウイルス複製の抑制、ウイルス構築の阻害、及び／又は腫瘍／がん細胞の増殖の阻害、並びにがん細胞死の誘導を含むが、それらに限定されない。高度に構造化された５ｈｍＲＮＡ及びｍｈｍＲＮＡを製造するために、新規なＰＣＲ－ＩＶＴ方法が開発され、特別に設計されたＲＮＡポリメラーゼとヘリカーゼの混合物の活性と合わせて使用されている。
【背景技術】
【0002】
ポリメラーゼ連鎖反応・ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＰＣＲ－ＩＶＴ）方法は、センスメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）及びアンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ）の製造に２０年以上にわたって広く使用されてきた（図１）。しかしながら、ヘアピン様ステムループ構造は原核生物ＲＮＡポリメラーゼの内因性転写終結シグナルであるため、ＩＶＴ反応はヘアピン様ＲＮＡの製造にはまだ有用ではない（ＭｃＤｏｗｅｌｌら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：８２２－８２５，１９９４）。その結果、原核生物関連ＲＮＡポリメラーゼを使用した従来のＰＣＲ－ＩＶＴ方法では、ヘアピン様ＲＮＡの生成効率が低いという問題を解決できない。
【0003】
ＰＣＲとＩＶＴとを組み合わせたＰＣＲ－ＩＶＴ方法を使用して、ｍＲＮＡ及び／又はＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドを製造することは、Ｌｉｎ氏らによって最初に報告された（Ｌｉｎ氏の米国特許第７，６６２，７９１号、第８，０８０，６５２号、第８，３７２，９６９号、及び第８，６０９，８３１号）。図１に示すように、Ｌｉｎ氏の方法では、まず、ＰＣＲ及び／又は逆転写（ＲＴ）を用いて、得られたＰＣＲ産物に特異的ＲＮＡプロモーター・プライマーを組み込むことにより、ＩＶＴのためのプロモーター駆動型ＤＮＡテンプレートを生成する。次に、ＩＶＴ反応を行って、ＤＮＡテンプレートから所望のＲＮＡ分子を生成し、増幅する（Ｌｉｎ氏ら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２２１：９３－１０１，２００３）。続いて、任意のＲＴ反応を行って、ＤＮＡ部分が所望のＲＮＡ（即ち、ｍＲＮＡ）を分解から保護するＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドを生成してもよい。ＤＮＡの保護の下、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドに対して、所望のＲＮＡ／ｍＲＮＡへの５’－キャップ及び／又は３’－ポリ（Ａ）尾部の付加など、さらなるｍＲＮＡ修飾を行うことができる（Ｌｉｎ ＳＬ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２２１：２８９－２９３，２００３）。その後、ＲＮａｓｅのないＤＮａｓｅ消化を行うことによってＤＮＡ部分を除去し、修飾後のＲＮＡ／ｍＲＮＡを送達剤と配合し、標的細胞に導入（トランスフェクション）して所望のタンパク質／ペプチドを生成することができる。或いは、所望のＲＮＡを細胞に導入して、ｐｉｗｉ相互作用（ＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ）ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）を生成して特異的標的遺伝子を不活性化（サイレンシング）してもよい（Ｌｉｎ氏の米国特許第８，３７２，９６９号及び第８，６０９，８３１号）。しかしながら、Ｌｉｎ氏の方法によれば、少なくとも特異的な生物学的及び細胞学的効果を誘発するためのｍＲＮＡ及びｐｉＲＮＡを生成することができるが、これらのｍＲＮＡ及びｐｉＲＮＡは、ヘアピン様又はヘアピン含有ＲＮＡではない。そのため、従来のＬｉｎ氏のＰＣＲ－ＩＶＴ方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヘアピン様ＲＮＡの生成効率が低いという問題を解決するための効果的な方法を開示していなかった。
【0004】
従来のｍＲＮＡの製造方法は、Ｌｉｎ氏のＰＣＲ－ＩＶＴの概念と方法の一部又は全部に大きく基づくものである（Ｌｉｎ氏の米国特許第７，６６２，７９１号、第８，０８０，６５２号、第８，３７２，９６９号及び第８，６０９，８３１号）。明らかに、当業者は、Ｌｉｎ氏の方法を使用して、ｍＲＮＡ及び／又はｍＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッド配列の一部又は全体をｉｎ ｖｉｔｒｏで生成することを容易に推知することができる。特に、商業用の半自動又は全自動ＩＶＴ装置にはＬｉｎ氏の概念及び方法に基づいて設計及び開発されたものもある。しかしながら、これらの従来のｍＲＮＡの製造方法及び装置は、ヘアピン様ＲＮＡの製造において存在する問題を解決するための有効な解決手段をまだ提供していなかった。この問題を解決するために、Ｌｉｎらは、原核生物（即ち、細菌）でのプラスミド駆動ＲＮＡ発現を使用する別の方法を開発した（Ｌｉｎ氏の米国特許第９，６３７，７４７号及び第９，７８３，８１１号）。これらの原核生物により生成したｍＲＮＡは、多数のヘアピン様ステムループ構造を含み得る。当該方法において、ヘアピンＲＮＡに起因する内因性転写終結の問題を解決するために、原核細胞を培養する培地に化学的転写誘導剤を添加することで、ヘアピン様ＲＮＡの生産率を顕著に増加させる（ＭｃＤｏｗｅｌｌら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：８２２－８２５，１９９４）。ただし、当該プラスミド駆動ＲＮＡ発現方法は原核細胞を必要とし、原核生物に限定される。
【0005】
ヘアピン様ＲＮＡ構造がｍＲＮＡの転写を阻害するだけでなく、５’－キャッピングや修飾などの特定のｍＲＮＡプロセシングをも阻害することが広く知られているため、ワクチン／医薬品の製造のためのヘアピン様又はヘアピン含有ｍＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏで生成することを当業者が推知することは合理的でない。従来の概念では、ｍＲＮＡにおいてヘアピン様構造が存在すれば、ｍＲＮＡからのタンパク質への翻訳さえも阻害されかねない。従って、高度に構造化されたＲＮＡの生成効率の低さがｍＲＮＡワクチンや医薬品の開発を大きく妨げている。
【0006】
本発明の重要な新規性のうちの１つは、５’末端又は中間ヘアピン／ステムループ含有ｍＲＮＡ構築物を生成し、使用することにより、ワクチン／医薬品の設計・開発を図ることにある。これに対して、従来のＰＣＲ－ＩＶＴ方法は、いずれもヘアピン様ＲＮＡの生成効率が低いという問題を解決できない。従って、高度に構造化されたＲＮＡの生成効率を高めるための改良されたＰＣＲ－ＩＶＴ方法は、非常に望まれている。
【発明の概要】
【0007】
本発明の原理は、新規な酵素ＰＣＲ－ＩＶＴ系を使用した「５’－ヘアピンメッセンジャーＲＮＡ（５ｈｍＲＮＡ）」及び／又は「メッセンジャーヘアピンメッセンジャーＲＮＡ（ｍｈｍＲＮＡ）」（図２）の製造と、薬学上及び治療上の適用、例えば抗ウイルス及び／又は抗がん治療に有効なワクチンや医薬品の設計及び開発のための５ｈｍＲＮＡ又はｍｈｍＲＮＡ或いはその両者の使用に基づく。この目的を達成するために、高効率なＰＣＲ－ＩＶＴ方法が重要である。これは、５ｈｍＲＮＡとｍｈｍＲＮＡの両者が高度に構造化されたｍＲＮＡであり、従来のＰＣＲ－ＩＶＴ方法では高度に構造化されたＲＮＡを有効に製造できないためである。明らかに、５ｈｍＲＮＡ／ｍｈｍＲＮＡを効率的に製造できるだけでなく、且つそのコストを削減し、より安価で有効なｍＲＮＡワクチン／医薬品を開発して公用化するために、高度に構造化されたＲＮＡを製造するための新規な方法が必要であると考えられる。
【0008】
従来、５’－ＵＴＲにヘアピンＲＮＡ構造が存在すると、ｍＲＮＡの転写を阻害するだけでなく、ｍＲＮＡからのタンパク質への翻訳も阻害することが広く知られているため、ワクチン／医薬品の製造のためのヘアピン様又はヘアピン含有ｍＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏで生成することを当業者が推知することは合理的でない。この問題を解決するために、本発明は、ＲＮＡポリメラーゼとヘリカーゼの混合物の活性を合わせた新規なＩＶＴシステムを採用した。ＩＶＴにヘリカーゼ活性を付加することで、ＤＮＡテンプレートとｍＲＮＡ産物の二次構造を著しく減少させ、高度に構造化されたｍＲＮＡをより効率的に製造することが可能となる。従って、ＩＶＴにおけるＲＮＡポリメラーゼとヘリカーゼの混合物の活性の効率を維持し、向上させるための改良された緩衝系も必要となる。興味深いことに、ヘリカーゼが原核生物の転写終結に関与している可能性があることを報告した先行研究が存在するが、本発明は、ＩＶＴ中のｍＲＮＡ製造においてヘリカーゼの全体的に異なった機能を示している。或いは、付加のヘリカーゼ活性を有するコロナウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）のような特定のウイルスレプリカーゼを使用して、同様に高度に構造化されたｍＲＮＡを製造できることを最近見出した。
【0009】
天然のリボソーム内部侵入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙｓｉｔｅ，ＩＲＥＳ）を使用して、ｍＲＮＡワクチンを開発することを提案した先行研究も存在する（Ｓｃｈｌａｋｅら，ＲＮＡ ｂｉｏｌｏｇｙ ９：１３１９－１３３０，２０１２； Ｋｏら，Ｊ． Ｍｉｃｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２９：１２７－１４０，２０１９）。しかしながら、これらの天然ＩＲＥＳは高度に構造化されたＲＮＡモチーフであるため、生産率が低く、その開発を大きく妨げている。この問題を解決するために、本明細書において、高度に構造化されたｍＲＮＡの生産率を顕著に増加さるだけでなく、その製造コストを低減させるのに有用である、新しいＲＮＡポリメラーゼとヘリカーゼの混合物の活性を合わせた新規なＰＣＲ－ＩＶＴ方法を提供する。これにより、本発明を使用して、従来のＩＲＥＳ含有ｍＲＮＡワクチン開発における生産率が低いという問題を解決することが可能となる。
【0010】
本発明により製造された５ｈｍＲＮＡ及びｍｈｍＲＮＡの構造において、５’－ヘアピン様ステムループＲＮＡ構造を特別に設計することにより、細胞内ＲＮＡプロセシング酵素を刺激してヘアピンを除去し、それに続く全てのｍＲＮＡ配列に５’－キャップを付加することがでるだけでなく、少なくともｓｉＲＮＡや前駆体マイクロＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）に類似した小さいヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を同時に生成することができ、この小さいヘアピンＲＮＡは、少なくとも細胞性遺伝子、ウイルス性遺伝子、及び／又はがん関連遺伝子などの特異的標的遺伝子を不活性化するという機能をさらに発揮することができる。なお、ＲＮＡプロセシング酵素は、全ての種類の５’－ヘアピン様ステムループＲＮＡ構造を処理できるわけではなく、特定の特別に設計された５’－ヘアピン様ステムループＲＮＡ構造のみを処理できる。さらに調査を進めた結果、いくつかの特別に設計されたステムループＲＮＡは、人工的リボソーム内部侵入部位（ＩＲＥＳ）として、次のキャップ構造の有無に関わらず、ｍＲＮＡの翻訳を開始・促進し得ることが示唆された。その結果、処理後と未処理のいずれの条件においても、これらの特別に設計されたステムループＲＮＡ構造は、次のｍＲＮＡからのタンパク質／ペプチド合成を容易に行うことができる。
【0011】
とある好ましい実施形態（図２）において、５ｈｍＲＮＡは、主に５’－ステムループＲＮＡ及び３’－ｍＲＮＡの２つの部分から構成される。原則として、５’－ステムループＲＮＡは、少なくとも、好ましくは約１０～８００ヌクレオチドの長さを有する、完全又は不完全に一致した単一又は複数のヘアピン構造と、好ましくは約１～５００ヌクレオチド離れて存在する、ステムループ構造と次の３’－ｍＲＮＡの開始コドンの間に位置する短い配列とを有す。５’－ステムループＲＮＡにおいて複数のヘアピン構造が存在する場合、ヘアピンＲＮＡ構造２つ毎の間にスペーサー配列を配置する必要があり、当該スペーサー配列の長さは、約２～５００ヌクレオチド離れていることが好ましい。例えば、配列番号３～配列番号１５に記載されるように、ヘアピン構造とスペーサーは、それぞれ同様な又は異なる配列を有してもよい。また、５’－ステムループＲＮＡは、３’－ｍＲＮＡの翻訳を開始・促進するための人工的ＩＲＥＳ模倣物として機能することができる。一方、３’－ｍＲＮＡは、所望のタンパク質又はペプチドを少なくとも１つエンコードし、且つその３’末端に５’－ＡＡＵＡＡＡ－３’（配列番号１）又は５’－ＡＡＵＵＡＡＡ－３’（配列番号２）配列のいずれかを含む。ｍＲＮＡ翻訳後に得られるタンパク質／ペプチドにより、少なくとも生物学的機能又は目的の効果を得ることができ、これらの生物学的機能又は目的の効果は、特異的免疫反応の誘発、ウイルス感染の予防、ウイルス構築の抑制、ウイルス複製の抑制及び／又は腫瘍／がん細胞の増殖の阻害、並びにがん細胞死の誘導を含むが、それらに限定されない。
【0012】
別の好ましい実施形態（図２）において、ｍｈｍＲＮＡは、５ｈｍＲＮＡの５’末端にさらなるｍＲＮＡ（５’－ｍＲＮＡ）配列を付加することによって形成される。その結果、ステムループＲＮＡは、最初の５’－ｍＲＮＡと次の３’－ｍＲＮＡの個々の翻訳を、それぞれ同様な又は異なるタンパク質／ペプチドに分離する中間セパレーターとして機能するようになる。さらに、５ｈｍＲＮＡと同様に、ステムループＲＮＡ構造は、細胞内ＲＮＡプロセシング酵素を刺激してヘアピンを除去し、３’－ｍＲＮＡに５’－キャップを付加し、且つ少なくともｓｈＲＮＡ及び／又はｐｉＲＮＡを生成して、少なくとも特異的標的遺伝子を不活性化（サイレンシング）してもよい。これらの標的遺伝子は、様々な疾患関連細胞及び／又は病原性遺伝子、例えば、細胞性、ウイルス性及び／又はがん関連遺伝子を含んでもよい。或いは、人工的ＩＲＥＳ様５’－ステムループＲＮＡ構造は、５’－ｍＲＮＡ又は３’－ｍＲＮＡ、或いは両者のいずれかの５’－ＵＴＲに位置し、それぞれ５’－ｍＲＮＡ及び／又は３’－ｍＲＮＡの翻訳を開始・促進することで、複数の所望のタンパク質／ペプチドの製造を可能にすることができる。
【0013】
第３の好ましい実施形態において、ｍｈｍＲＮＡの最初の５’－ｍＲＮＡは、トランスフェクト細胞において第２の３’－ｍＲＮＡを増幅するためのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）のようなＲＮＡレプリカーゼをエンコードする。このようなＲＮＡレプリカーゼ／ＲｄＲｐ発現ｍＲＮＡは、トランスフェクト細胞内で自己増幅することができるため、自己増幅ｍＲＮＡ（ｓａｍＲＮＡ）とも呼ばれる。標的細胞に導入された後、５ｈｍＲＮＡとｍｈｍＲＮＡの両者をさらに処理し、少なくとも所望のタンパク質／ペプチドに翻訳して、予め設計された所望の生物学的効果又は機能を誘発することができる。これらの生物学的効果又は細胞機能は、特異的免疫反応の誘導、ウイルス感染の予防、ウイルス複製／構築の抑制、及び／又は腫瘍／がん細胞の増殖の阻害、並びにがん細胞死の誘導を含むが、それらに限定されない。また、従来の米国特許第８，３７２，９６９号及び第８，６０９，８３１号（Ｌｉｎ氏）に記載されるように、ＲｄＲｐにｐｉＲＮＡを生成するためのテンプレートとしてｍＲＮＡを用いて、少なくとも特異的な遺伝子サイレンシング効果を得ることができる。例えば、得られたｍＲＮＡが標的ウイルス遺伝子をエンコードする場合、こうして得られたｐｉＲＮＡは、ウイルス遺伝子を不活性化し、ウイルス感染を防止するワクチンの開発に有用であると考えられる。
【0014】
５ｈｍＲＮＡ及びｍｈｍＲＮＡのステムループＲＮＡ構造は、以下に記載される単一又は複数のヘアピン様配列のうちの少なくとも１つをさらに含んでもよい。
【0015】
（１）５’－ＧＣＵＣＣＣＵＵＣＡ ＡＣＵＵＵＡＡＣＡＵ ＧＧＡＡＧＵＧＣＵＵ ＵＣＵＧＵＧＡＣＵＵ ＵＡＡＡＡＧＵＡＡＧ ＵＧＣＵＵＣＣＡＵＧ ＵＵＵＵＡＧＵＡＧＧ ＡＧＵ－３’ （７３－ｎｔ）（配列番号３）
（２）５’－ＣＣＵＵＵＧＣＵＵＵ ＡＡＣＡＵＧＧＧＧＧ ＵＡＣＣＵＧＣＵＧＵ ＧＵＧＡＡＡＣＡＡＡ ＡＧＵＡＡＧＵＧＣＵ ＵＣＣＡＵＧＵＵＵＣ ＡＧＵＧＧＡＧＧ－３’ （６８－ｎｔ）（配列番号４）
（３）５’－ＣＣＡＣＣＡＣＵＵＡ ＡＡＣＧＵＧＧＡＵＧ ＵＡＣＵＵＧＣＵＵＵ ＧＡＡＡＣＵＡＡＡＧ ＡＡＧＵＡＡＧＵＧＣ ＵＵＣＣＡＵＧＵＵＵ ＵＧＧＵＧＡＵＧＧ－３’ （６９－ｎｔ）（配列番号５）
（４）５’－ＣＣＵＣＵＡＣＵＵＵ ＡＡＣＡＵＧＧＡＧＧ ＣＡＣＵＵＧＣＵＧＵ ＧＡＣＡＵＧＡＣＡＡ ＡＡＡＵＡＡＧＵＧＣ ＵＵＣＣＡＵＧＵＵＵ ＧＡＧＵＧＵＧＧ－３’ （６８－ｎｔ）（配列番号６）
（５）５’－ＣＵＧＵＧＵＧＧＣＵ ＧＵＣＡＣＵＣＧＧＣ ＵＧＣＡＵＧＣＵＵＡ ＧＵＧＣＡＣＵＣＡＣ ＧＣＡＧ－３’（４４－ｎｔ）（配列番号７）
（６）５’－ＣＵＧＵＧＵＧＧＣＵ ＧＵＣＡＣＵＣＧＧＣ ＵＧＣＡＵＧＣＵＵＡ ＧＵＧＣＡＣＵＣＡＣ ＧＣＡＧＵＡＵＡＡＵ ＵＡＡＵＡＡＣＵＡＡ ＵＵＡＣＵ－３’ （６５－ｎｔ）（配列番号８）
（７）５’－ＧＵＣＧＵＵＧＡＣＡ ＧＧＡＣＡＣＧＡＧＵ ＡＡＣＵＣＧＵＣＵＡ ＵＣＵＵＣＵＧＣＡＧ ＧＣＵＧＣＵＵＡＣＧ ＧＵＵＵＣＧＵＣＣＧ ＵＧＵＵＧＣＡＧＣＣ ＧＡＵＣＡＵＣＡＧＣ ＡＣＡＵＣＵＡＧＧＵ ＵＵＣＧＵＣＣＧＧＧ ＵＧＵＧＡＣＣＧＡＡ ＡＧＧＵＡＡＧＡＵＧ ＧＡＧＡＧＣＣＵＵＧ ＵＣＣＣＵＧＧＵＵＵ ＣＡＡＣＧＡＧ－３’ （１４７－ｎｔ）（配列番号９）
（８）５’－ＡＡＵＵＡＵＡＡＡＵ ＵＡＣＣＡＧＡＵＧＡ ＵＵＵＵＡＣＡＧＧＣ ＵＧＣＧＵＵＡＵＡＧ ＣＵＵＧＧＡＡＵＵＣ ＵＡＡＣＡＡＵＣＵＵ ＧＡＵＵＣＵＡＡＧＧ ＵＵＧＧＵＧＧＵＡＡ ＵＵＡＵＡＡＵＵ－３’ （８８－ｎｔ）（配列番号１０）
（９）５’－ＣＡＣＡＡＡＵＡＵＵ ＡＣＣＡＧＡＵＣＣＡ ＵＣＡＡＡＡＣＣＡＡ ＧＣＡＡＧＡＧＧＵＣ ＡＵＵＵＡＵＵＧＡＡ ＧＡＵＣＵＡＣＵＵＵ ＵＣＡＡＣＡＡＡＧＵ ＧＡＣＡＣＵＵＧＣＡ ＧＡＵＧＣＵＧＧＣＵ ＵＣＡＵＣＡＡＡＣＡ ＡＵＡＵＧＧＵＧＡＵ ＵＧＣＣＵＵＧＧＵＧ ＡＵＡＵＵＧＣＵＧ－３’ （１２９－ｎｔ）（配列番号１１）
（１０）５’－ＧＣＡＡＡＡＡＵＧＵ ＧＡＵＣＵＵＧＣＵＵ ＧＵＡＡＡＵＡＣＡＡ ＵＵＵＵＧＡＧＡＧＧ ＵＵＡＡＵＡＡＡＵＵ ＡＣＡＡＧＵＡＧＵＧ ＣＵＡＵＵＵＵＵＧＵ ＡＵＵＵＡＧＧＵＵＡ ＧＣＵＡＵＵＵＡＧＣ ＵＵＵＡＣＧＵＵＣＣ ＡＧＧＡＵＧＣＣＵＡ ＧＵＧＧＣＡＧＣＣＣ ＣＡＣＡＡＵＡＵＣＣ ＡＧＧＡＡＧＣＣＣＵ ＣＵＣＵＧＣＧＧＵＵ ＵＵＵＣＡＧＡＵＵＣ ＧＵＵＡＧＵＣＧＡＡ ＡＡＡＣＣＵＡＡＧＡ ＡＡＵＵＵＡＡＵＧ－３’ （１８９－ｎｔ）（配列番号１２）
（１１）５’－ＣＡＣＵＣＣＣＣＵＧ ＵＧＡＧＧＡＣＵＡＣ ＵＧＵＣＵＵＣＡＣＧ ＣＡＧＡＡＡＧＣＧＵ ＣＵＡＧＣＣＡＵＧＧ ＣＧＵＵＡＧＵＡＵＧ ＡＧＵＧＵＣＧＵＧＣ ＡＧＣＣＵＣＣＡＧＧ ＡＣＣＣＣＣＣＣＵＣ ＣＣＧＧＧＡＧＡＧＣ ＣＡＵＡＧＵＧＧＵＣ ＵＧＣＧＧＡＡＣＣＧ ＧＵＧＡＧＵＡＣＡＣ ＣＧＧＡＡＵＵＧＣＣ ＡＧＧＡＣＧＡＣＣＧ ＧＧＵＣＣＵＵＵＣＵ ＵＧＧＡＵＣＡＡＣＣ ＣＧＣＵＣＡＡＵＧＣ ＣＵＧＧＡＧＡＵＵＵ ＧＧＧＣＧＵＧＣＣＣ ＣＣＧＣＧＡＧＡＣＵ ＧＣＵＡＧＣＣＧＡＧ ＵＡＧＵＧＵＵＧＧＧ ＵＣＧＣＧＡＡＡＧＧ ＣＣＵＵＧＵＧＧＵＡ ＣＵＧＣＣＵＧＡＵＧ ＧＧＵＧＣＵＵＧＣＧ ＡＧＵＧＣＣＣＣＧＧ ＧＡＧＧＵＣＵＣＧＵ ＡＧＡＣ－３’ （２９４－ｎｔ）（配列番号１３）
（１２）５’－ＧＧＡＣＡＣＧＡＧＵ ＡＡＣＵＣＧＵＣＵＡ ＵＣＵＵＣＵＧＣＡＧ ＧＣＵＧＣＵＵＡＣＧ ＧＵＵＵＣＧＵＣＣＧ ＵＧＵＵＧ－３’ （５５－ｎｔ）（配列番号１４）
（１３）５’－ＣＡＧＣＣＧＡＵＣＡ ＵＣＡＧＣＡＣＡＵＣ ＵＡＧＧＵＵＵＵＧＵ ＣＣＧＧＧＵＧＵＧＡ ＣＣＧＡＡＡＧＧＵＡ ＡＧ－３’ （５２－ｎｔ）（配列番号１５）
ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでの所望の標的細胞への５ｈｍＲＮＡ又はｍｈｍＲＮＡ、或いはその両者の送達を容易にするために、５ｈｍＲＮＡ及びｍｈｍＲＮＡは、グリシルグリセリン、リポソーム、ナノ粒子、リポソームナノ粒子、共役系分子、輸液製剤、遺伝子銃材料、電気穿孔粒子、トランスポゾン及びこれらの組み合わせから選ばれた少なくとも１つの送達剤と混合、結合（コンジュゲート）、カプセル化及び／又は配合することができる。
（２）５’－ＣＣＵＵＵＧＣＵＵＵ ＡＡＣＡＵＧＧＧＧＧ ＵＡＣＣＵＧＣＵＧＵ ＧＵＧＡＡＡＣＡＡＡ ＡＧＵＡＡＧＵＧＣＵ ＵＣＣＡＵＧＵＵＵＣ ＡＧＵＧＧＡＧＧ－３’ （６８－ｎｔ）（配列番号４）
（３）５’－ＣＣＡＣＣＡＣＵＵＡ ＡＡＣＧＵＧＧＡＵＧ ＵＡＣＵＵＧＣＵＵＵ ＧＡＡＡＣＵＡＡＡＧ ＡＡＧＵＡＡＧＵＧＣ ＵＵＣＣＡＵＧＵＵＵ ＵＧＧＵＧＡＵＧＧ－３’ （６９－ｎｔ）（配列番号５）
（４）５’－ＣＣＵＣＵＡＣＵＵＵ ＡＡＣＡＵＧＧＡＧＧ ＣＡＣＵＵＧＣＵＧＵ ＧＡＣＡＵＧＡＣＡＡ ＡＡＡＵＡＡＧＵＧＣ ＵＵＣＣＡＵＧＵＵＵ ＧＡＧＵＧＵＧＧ－３’ （６８－ｎｔ）（配列番号６）
（５）５’－ＣＵＧＵＧＵＧＧＣＵ ＧＵＣＡＣＵＣＧＧＣ ＵＧＣＡＵＧＣＵＵＡ ＧＵＧＣＡＣＵＣＡＣ ＧＣＡＧ－３’（４４－ｎｔ）（配列番号７）
（６）５’－ＣＵＧＵＧＵＧＧＣＵ ＧＵＣＡＣＵＣＧＧＣ ＵＧＣＡＵＧＣＵＵＡ ＧＵＧＣＡＣＵＣＡＣ ＧＣＡＧＵＡＵＡＡＵ ＵＡＡＵＡＡＣＵＡＡ ＵＵＡＣＵ－３’ （６５－ｎｔ）（配列番号８）
（７）５’－ＧＵＣＧＵＵＧＡＣＡ ＧＧＡＣＡＣＧＡＧＵ ＡＡＣＵＣＧＵＣＵＡ ＵＣＵＵＣＵＧＣＡＧ ＧＣＵＧＣＵＵＡＣＧ ＧＵＵＵＣＧＵＣＣＧ ＵＧＵＵＧＣＡＧＣＣ ＧＡＵＣＡＵＣＡＧＣ ＡＣＡＵＣＵＡＧＧＵ ＵＵＣＧＵＣＣＧＧＧ ＵＧＵＧＡＣＣＧＡＡ ＡＧＧＵＡＡＧＡＵＧ ＧＡＧＡＧＣＣＵＵＧ ＵＣＣＣＵＧＧＵＵＵ ＣＡＡＣＧＡＧ－３’ （１４７－ｎｔ）（配列番号９）
（８）５’－ＡＡＵＵＡＵＡＡＡＵ ＵＡＣＣＡＧＡＵＧＡ ＵＵＵＵＡＣＡＧＧＣ ＵＧＣＧＵＵＡＵＡＧ ＣＵＵＧＧＡＡＵＵＣ ＵＡＡＣＡＡＵＣＵＵ ＧＡＵＵＣＵＡＡＧＧ ＵＵＧＧＵＧＧＵＡＡ ＵＵＡＵＡＡＵＵ－３’ （８８－ｎｔ）（配列番号１０）
（９）５’－ＣＡＣＡＡＡＵＡＵＵ ＡＣＣＡＧＡＵＣＣＡ ＵＣＡＡＡＡＣＣＡＡ ＧＣＡＡＧＡＧＧＵＣ ＡＵＵＵＡＵＵＧＡＡ ＧＡＵＣＵＡＣＵＵＵ ＵＣＡＡＣＡＡＡＧＵ ＧＡＣＡＣＵＵＧＣＡ ＧＡＵＧＣＵＧＧＣＵ ＵＣＡＵＣＡＡＡＣＡ ＡＵＡＵＧＧＵＧＡＵ ＵＧＣＣＵＵＧＧＵＧ ＡＵＡＵＵＧＣＵＧ－３’ （１２９－ｎｔ）（配列番号１１）
（１０）５’－ＧＣＡＡＡＡＡＵＧＵ ＧＡＵＣＵＵＧＣＵＵ ＧＵＡＡＡＵＡＣＡＡ ＵＵＵＵＧＡＧＡＧＧ ＵＵＡＡＵＡＡＡＵＵ ＡＣＡＡＧＵＡＧＵＧ ＣＵＡＵＵＵＵＵＧＵ ＡＵＵＵＡＧＧＵＵＡ ＧＣＵＡＵＵＵＡＧＣ ＵＵＵＡＣＧＵＵＣＣ ＡＧＧＡＵＧＣＣＵＡ ＧＵＧＧＣＡＧＣＣＣ ＣＡＣＡＡＵＡＵＣＣ ＡＧＧＡＡＧＣＣＣＵ ＣＵＣＵＧＣＧＧＵＵ ＵＵＵＣＡＧＡＵＵＣ ＧＵＵＡＧＵＣＧＡＡ ＡＡＡＣＣＵＡＡＧＡ ＡＡＵＵＵＡＡＵＧ－３’ （１８９－ｎｔ）（配列番号１２）
（１１）５’－ＣＡＣＵＣＣＣＣＵＧ ＵＧＡＧＧＡＣＵＡＣ ＵＧＵＣＵＵＣＡＣＧ ＣＡＧＡＡＡＧＣＧＵ ＣＵＡＧＣＣＡＵＧＧ ＣＧＵＵＡＧＵＡＵＧ ＡＧＵＧＵＣＧＵＧＣ ＡＧＣＣＵＣＣＡＧＧ ＡＣＣＣＣＣＣＣＵＣ ＣＣＧＧＧＡＧＡＧＣ ＣＡＵＡＧＵＧＧＵＣ ＵＧＣＧＧＡＡＣＣＧ ＧＵＧＡＧＵＡＣＡＣ ＣＧＧＡＡＵＵＧＣＣ ＡＧＧＡＣＧＡＣＣＧ ＧＧＵＣＣＵＵＵＣＵ ＵＧＧＡＵＣＡＡＣＣ ＣＧＣＵＣＡＡＵＧＣ ＣＵＧＧＡＧＡＵＵＵ ＧＧＧＣＧＵＧＣＣＣ ＣＣＧＣＧＡＧＡＣＵ ＧＣＵＡＧＣＣＧＡＧ ＵＡＧＵＧＵＵＧＧＧ ＵＣＧＣＧＡＡＡＧＧ ＣＣＵＵＧＵＧＧＵＡ ＣＵＧＣＣＵＧＡＵＧ ＧＧＵＧＣＵＵＧＣＧ ＡＧＵＧＣＣＣＣＧＧ ＧＡＧＧＵＣＵＣＧＵ ＡＧＡＣ－３’ （２９４－ｎｔ）（配列番号１３）
（１２）５’－ＧＧＡＣＡＣＧＡＧＵ ＡＡＣＵＣＧＵＣＵＡ ＵＣＵＵＣＵＧＣＡＧ ＧＣＵＧＣＵＵＡＣＧ ＧＵＵＵＣＧＵＣＣＧ ＵＧＵＵＧ－３’ （５５－ｎｔ）（配列番号１４）
（１３）５’－ＣＡＧＣＣＧＡＵＣＡ ＵＣＡＧＣＡＣＡＵＣ ＵＡＧＧＵＵＵＵＧＵ ＣＣＧＧＧＵＧＵＧＡ ＣＣＧＡＡＡＧＧＵＡ ＡＧ－３’ （５２－ｎｔ）（配列番号１５）
ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでの所望の標的細胞への５ｈｍＲＮＡ又はｍｈｍＲＮＡ、或いはその両者の送達を容易にするために、５ｈｍＲＮＡ及びｍｈｍＲＮＡは、グリシルグリセリン、リポソーム、ナノ粒子、リポソームナノ粒子、共役系分子、輸液製剤、遺伝子銃材料、電気穿孔粒子、トランスポゾン及びこれらの組み合わせから選ばれた少なくとも１つの送達剤と混合、結合（コンジュゲート）、カプセル化及び／又は配合することができる。
【0016】
５ｈｍＲＮＡ及び／又はｍｈｍＲＮＡをワクチンや医薬品として使用する利点としては、（１）ｉｎ ｖｉｔｒｏで５’－キャップを付加する必要がなく、コストを削減し、汚染を減らすこと、（２）ステムループＲＮＡ構造によって十分に保護されているより安定したｍＲＮＡ産物を得られること、（３）細胞内ＲＮＡプロセシング酵素によってステムループ構造を除去した後にトランスフェクト細胞内で１００％キャップされたｍＲＮＡを形成すること、（４）ｍＲＮＡからのタンパク質／ペプチド合成を開始・促進するための人工的ＩＲＥＳ様モチーフ／模倣物をさらに処理してもよいこと、（５）エンコードされた複製／ＲｄＲｐ活性を有する自己増幅ｍＲＮＡを形成すること、（６）自己増幅ｍＲＮＡに由来するタンパク質／ペプチドの高収量をもたらすこと、（７）少なくともウイルス及び／又はがん関連遺伝子などの対象とする特異的標的遺伝子を不活性化するのに有用なｓｈＲＮＡ及び／又はｐｉＲＮＡを少なくとも共発現させることが挙げられる。その結果、これらの新規な５ｈｍＲＮＡ及びｍｈｍＲＮＡ組成物は、新規な薬学上及び治療上の適用、例えば、抗ウイルス及び／又は抗がん治療に用いるワクチンや医薬品の設計及び開発に有用であると考えられる。
【0017】
Ａ．定義
本発明を理解しやすくするために、いくつかの用語は以下のように定義される：
本発明を理解しやすくするために、いくつかの用語は以下のように定義される：
【0018】
核酸（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）：デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）の一本鎖又は二本鎖のポリマーである。
【0019】
ヌクレオチド（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）：糖部分（ペントース（ｐｅｎｔｏｓｅ））、リン酸塩（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、及び窒素含有複素環塩基（ｎｉｔｒｏｇｅｎｏｕｓ ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ ｂａｓｅ）から構成されたデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）のモノマー単位である。当該塩基は、グリコシド炭素（ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃ ｃａｒｂｏｎ、当該ペントースの１’の炭素）を介して、当該糖部分に結合されており、当該塩基と糖の組み合わせはヌクレオシド（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）である。当該ペントースの３’位又は５’位に結合された少なくとも１つのリン酸を有するヌクレオシドは、ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）である。デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）とリボ核酸（ＲＮＡ）はそれぞれ、異なるタイプのヌクレオチド単位、即ち、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドからなる。
【0020】
オリゴヌクレオチド（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）：２個以上、好ましくは３個より多く、そして通常は１０個以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及び／又はリボ核酸（ＲＮＡ）のモノマー単位からなる分子である。１３個以上のヌクレオチドモノマーを含むオリゴヌクレオチドは通常ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とも呼ばれる。オリゴヌクレオチドの正確な長さは種々の要素に依存するが、当該オリゴヌクレオチドの最も好適な機能又は用途に依存する。オリゴヌクレオチドは、化学合成、ＤＮＡ複製、ＲＮＡ転写、逆転写、又はそれらの組み合わせを含むあらゆる方法で生成できる。
【0021】
ヌクレオチド類似体（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇ）：Ａ（アデニン）、Ｔ（チミン）、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）又はＵ（ウラシル）ヌクレオチドとは構造的に異なっているが、核酸分子内の通常のヌクレオチドを置換可能な程度に十分に類似しているプリン（ｐｕｒｉｎｅ）又はピリミジン（ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）ヌクレオチドである。
【0022】
核酸組成物（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）：核酸組成物（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）とはオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドであり、例えば、一本鎖又は二本鎖分子構造を有するＤＮＡ又はＲＮＡ配列、又はＤＮＡ／ＲＮＡ配列の混合物である。
【0023】
遺伝子（Ｇｅｎｅ）：そのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの配列がＲＮＡ及び／又はポリペプチド（タンパク質）をコードする核酸組成物である。遺伝子は、ＲＮＡ又はＤＮＡであってもよい。遺伝子は、ノンコーディングＲＮＡ、例えば小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、及びそれらのＲＮＡ前駆体と誘導体をエンコードし得る。或いは、遺伝子は、タンパク質／ペプチドの合成に必須のタンパク質コーディングＲＮＡ、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）及びその前駆体と誘導体をエンコードし得る。場合によっては、遺伝子は、少なくともｍｉｃｒｏＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ配列も含むタンパク質コーディングＲＮＡをコードし得る。
【0024】
一次ＲＮＡ転写産物（Ｐｒｉｍａｒｙ ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）：いかなるＲＮＡプロセッシング又は修飾も無しに、遺伝子から直接転写されるＲＮＡ配列である。
【0025】
前駆体メッセンジャーＲＮＡ（Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ，ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）：タンパク質コーディング遺伝子の一次ＲＮＡ転写物であり、転写と呼ばれる細胞機構を介して真核生物における真核ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ－ＩＩ）メカニズムにより生成される。前駆体メッセンジャーＲＮＡの配列は、５’末端非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）、３’末端非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）、エキソン（ｅｘｏｎ）及びイントロン（ｉｎｔｒｏｎ）を含んでいる。
【0026】
イントロン（Ｉｎｔｒｏｎ）：非タンパク質リーディングフレームをエンコードする遺伝子転写産物配列の一部又は複数の部分であり、例えば、インフレームイントロン（ｉｎ－ｆｒａｍｅ ｉｎｔｒｏｎ）、５’末端非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）及び３’末端非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）が挙げられる。
【0027】
エキソン（Ｅｘｏｎ）：タンパク質リーディングフレーム（ｃＤＮＡ）をエンコードする遺伝子転写産物配列の一部又は複数の部分であり、例えば、細胞遺伝子、成長因子、インスリン、抗体及びそれらの類似物／ホモログ並びに誘導体に用いる相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）が挙げられる。
【0028】
メッセンジャーＲＮＡ（Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ，ｍＲＮＡ）：前駆体メッセンジャーＲＮＡのエキソンのアセンブリであり、メッセンジャーＲＮＡは、細胞内のＲＮＡスプライシング機構（例えばスプライセオソーム）によるイントロンの除去の後に形成され、ペプチド／タンパク質合成のためのタンパク質コーディングＲＮＡとして使用される。当該メッセンジャーＲＮＡによりエンコードされるペプチド／タンパク質は、酵素、成長因子、インスリン、抗体及びそれらの類似物／ホモログと誘導体を含むが、それらに限定されない。
【0029】
相補的デオキシリボ核酸（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ，ｃＤＮＡ）：一本鎖又は二本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であり、ｍＲＮＡ配列に相補的な配列を含み、イントロン配列をまったく含んでいない。
【0030】
センス（Ｓｅｎｓｅ）：配列順序及び組成は相同ｍＲＮＡと同じである核酸分子である。センスの構造形態は、「＋」、「ｓ」又は「ｓｅｎｓｅ」の符号で示される。
【0031】
アンチセンス（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）：各ｍＲＮＡ分子に相補的な核酸分子である。アンチセンスの構造形態は、「－」符号、或いは、ＤＮＡ又はＲＮＡの前に「ａ」又は「ａｎｔｉｓｅｎｓｅ」を付けて示され、例えば、「ａＤＮＡ」又は「ａＲＮＡ」が挙げられる。
【0032】
塩基対（Ｂａｓｅ Ｐａｉｒ，ｂｐ）：二本鎖ＤＮＡ分子に存在するアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）との対関係（ｐａｒｔｎｅｒｓｈｉｐ）、又はシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）との対関係である。ＲＮＡにおいて、ウラシル（Ｕ）がチミン（Ｔ）を置換する。一般に、当該対関係は、水素結合によりなされている。例えば、センスヌクレオチド配列「５’－Ａ－Ｔ－Ｃ－Ｇ－Ｕ－３’」は、そのアンチセンス配列「５’－Ａ－Ｃ－Ｇ－Ａ－Ｔ－３’」と完全塩基対関係を形成できる。
【0033】
５’末端（５’－ｅｎｄ）：１つのヌクレオチドの５’－水酸基がホスホジエステル結合により、次のヌクレオチドの３’－水酸基に結合された連続したヌクレオチドの５’位においてヌクレオチドが欠けている末端である。１つ以上のリン酸塩のような他の官能基が当該末端に存在し得る。
【0034】
３’末端（３’－ｅｎｄ）：１つのヌクレオチドの５’－水酸基がホスホジエステル結合により、次のヌクレオチドの３’－水酸基に結合された連続したヌクレオチドの３’位においてヌクレオチドが欠けている末端である。当該末端に他の官能基、最も多くの場合は水酸基が存在し得る。
【0035】
テンプレート（Ｔｅｍｐｌａｔｅ）：核酸ポリメラーゼにより複製された核酸分子である。テンプレートは、ポリメラーゼによって、一本鎖、二本鎖又は部分的な二本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡのいずれであってもよい。合成されたコピーは、当該テンプレート、当該二本鎖テンプレート又は部分的な二本鎖のテンプレートの少なくとも一方の鎖に相補的である。ＲＮＡとＤＮＡの両者は、５’末端から３’末端の方向に合成される。核酸二本鎖体（ｄｕｐｌｅｘ）の２本の鎖は、これらの２本の鎖の５’末端が当該二本鎖体のと相対する末端となるように常に整列されている（また必然的に、これらの２本の鎖の３’末端も同様である）。
【0036】
核酸テンプレート（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｅｍｐｌａｔｅ）：二本鎖ＤＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子、ハイブリッド分子（例えば、ＤＮＡ－ＲＮＡ又はＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド）、或いは、一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子である。
【0037】
保存（Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）：ヌクレオチド配列と予め選択された（参照）配列の正確な相補物（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）とが非ランダムにハイブリダイズする場合、当該ヌクレオチド配列は当該予め選択された配列に対して保存されている。
【0038】
相同（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）又は相同性（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ）：ポリヌクレオチドと遺伝子又はｍＲＮＡ配列との間の類似性を示す用語である。核酸配列は、例えば、所定の遺伝子又はｍＲＮＡ配列に対して部分的に又は完全に相同性を有し得る。相同性は、類似するヌクレオチド数がヌクレオチド総数に占める割合で示されてもよい。
【0039】
相補的（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）又は相補性（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｏｒ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）：上記「塩基対（ｂｐ）」の規則に準じて関連付けられる２つのポリヌクレオチド（即ち、ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡの配列）の間のマッチング塩基対関係に基づいて使用される用語である。例えば、配列「５’－Ａ－Ｇ－Ｔ－３’」は、配列「５’－Ａ－Ｃ－Ｔ－３’」のみならず、「５’－Ａ－Ｃ－Ｕ－３’」に対しても相補的である。相補性は、２つのＤＮＡの鎖の間、或いは、１つのＤＮＡの鎖と１つのＲＮＡの鎖との間、或いは、２つのＲＮＡの鎖の間のいずれにもあり得る。相補性は、「部分的」、「完全」又は「全体」であってもよい。部分的相補性又は相補は、一部の核酸塩基のみがこれらの塩基対規則に従って対合するときにのみ現れる。完全又は全体的な相補性又は相補は、塩基がこれらの核酸の鎖の間で完全に又は完璧に対合するときに現れる。核酸の鎖の間の相補性の度合いは、核酸の鎖の間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に顕著に影響する。これは、増幅反応、及び核酸の間の結合に依存する検知方法において、特に重要である。相補率（ｐｅｒｃｅｎｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ又はｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）は、当該核酸の一本の鎖のうち全塩基数に対するミスマッチ塩基数を指す。従って、５０％の相補率は、塩基の半分がミスマッチであり、半分が一致していることを意味する。核酸の２本の鎖の塩基数が違っている場合でも、核酸の２本の鎖が相補的となり得る。この場合に、相補性は、一部の長い鎖と短い鎖の間に起こり、そのうち、当該長い鎖の当該一部の塩基と短い鎖の塩基が対をなす。
【0040】
相補的塩基（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｔａｒｙ Ｂａｓｅｓ）：ＤＮＡ又はＲＮＡが二本鎖構造を採用するとき、通常は対になっているヌクレオチドである。
【0041】
相補的ヌクレオチド配列（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｔａｒｙ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）：ＤＮＡ又はＲＮＡの一本鎖分子におけるヌクレオチド配列であり、２つの鎖の間で引き続く水素結合により特異的にハイブリダイズするもう１つの一本鎖に十分に相補的である配列である。
【0042】
ハイブリダイズ（Ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）及びハイブリダイゼーション（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）：塩基対により複合体を形成するのに十分相補的なヌクレオチド配列間の、二本鎖の形成である。プライマー（又はスプライステンプレート）が標的（テンプレート）と「ハイブリダイズ」する場合、ハイブリダイズで形成された複合体（又はハイブリッド）が十分に安定であり、ＤＮＡ合成を開始するために、ＤＮＡポリメラーゼにより必要とされるプライミング機能を提供する。競合的に阻害できる（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ）二つの相補的ポリヌクレオチドの間には、特異的な（即ち、非ランダム的な）相互作用が存在する。
【0043】
転写後の遺伝子サイレンシング（Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）：ｍＲＮＡ分解又は翻訳抑制（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）レベルでの標的遺伝子のノックアウト（ｋｎｏｃｋｏｕｔ）効果又はノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）効果であり、通常、外来／ウイルスＤＮＡ、又はＲＮＡ導入遺伝子、又は低分子抑制性ＲＮＡのいずれかにより引き起こされる。
【0044】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）：真核細胞における転写後の遺伝子サイレンシングのメカニズムであり、低分子抑制性ＲＮＡ分子、例えばマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により引き起こされ得る。これらの低分子ＲＮＡ分子は通常、遺伝子サイレンサーとして機能し、これらの低分子ＲＮＡに対して完全に又は部分的に相補的である細胞内遺伝子の発現を干渉する。
【0045】
遺伝子サイレンシング効果（Ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ）：遺伝子機能が抑制された後の細胞反応であり、細胞周期の減衰（ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）、Ｇ０／Ｇ１チェックポイント停止（Ｇ０／Ｇ１－ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ａｒｒｅｓｔ）、腫瘍抑制、抗腫瘍生成、がん細胞アポトーシス、及びそれらの組み合わせを含むが、それらに限定されない。
【0046】
ノンコーディングＲＮＡ（Ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ）：細胞内翻訳メカニズムによるペプチド又はタンパク質の合成に用いることができないＲＮＡ転写産物である。ノンコーディングＲＮＡは、長い及び短い調節性ＲＮＡ分子、例えばマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及び二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含む。これらの調節性ＲＮＡ分子は通常、遺伝子サイレンサーとして機能し、細胞内における、これらのノンコーディングＲＮＡに完全に又は部分的に相補的な遺伝子の発現を干渉する。
【0047】
マイクロＲＮＡ（ＭｉｃｒｏＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ）：当該マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）に対して部分的に相補的である標的遺伝子の転写産物に結合可能な一本鎖ＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは通常、長さが約１７～２７個のオリゴヌクレオチドであり、当該ｍｉＲＮＡとその標的ｍＲＮＡとの間の相補性に従い、細胞内ｍＲＮＡ標的物を直接分解するか、或いはその標的ｍＲＮＡのタンパク質翻訳を直接抑制するかのいずれかを行うことができる。天然のｍｉＲＮＡは、殆ど全ての真核細胞内から発見され、抗ウイルス感染の防御機能を有するとともに、動植物の発育期間における遺伝子発現の制御を可能にする。
【0048】
前駆体マイクロＲＮＡ（Ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）：標的遺伝子、又は配列が当該（これらの）マイクロＲＮＡの配列に相補的な遺伝子を不活性化（サイレンシング）することができる１つ又は複数のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を生成するために細胞内ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼＲＮａｓｅＩＩＩと相互作用するための、ステムアーム（ｓｔｅｍ－ａｒｍ）及びステムループ（ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ）領域を含んでいるヘアピン様一本鎖ＲＮＡである。前駆体マイクロＲＮＡのステムアームは、完全に（１００％）又は部分的に（ミスマッチ）ハイブリダイズされた二本鎖体のいずれかを形成する一方、ステムループはサイクル又はヘアピンループ構造形態を形成すべくステムアーム二本鎖体の一方の端部に連結されている。しかしながら、本発明において、前駆体マイクロＲＮＡは一次マイクロＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）を含んでもよい。
【0049】
低分子干渉ＲＮＡ（Ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ）：サイズが約１８～２７個の完全な塩基対のリボヌクレオチド二本鎖体であり、かつ殆ど完全に相補的である標的遺伝子の転写産物を分解することができる短い二本鎖ＲＮＡである。
【0050】
小ヘアピン又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（Ｓｍａｌｌ ｈａｉｒｐｉｎ ｏｒ ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ，ｓｈＲＮＡ）：ヘアピン様構造を形成するために、一致していない（ｕｎｍａｔｃｈｅｄ）ループ又はバブルオリゴヌクレオチドで分割された、一対の部分的に又は完全に一致したステムアームヌクレオチド配列の対を含む一本鎖ＲＮＡである。多くの天然ｍｉＲＮＡは、小さいヘアピン様ＲＮＡ前駆体、即ち、前駆体マイクロＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）に由来する。
【0051】
ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）：異なる遺伝子環境に移動又は滞在できる組換え型ＤＮＡ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，ｒＤＮＡ）のような組換え型核酸組成物である。一般的に、別の核酸が有効にそれに連結されている。当該ベクターは細胞において自己複製することが可能であり、この場合には、当該ベクター及び付接されるセグメントが複製される。一種の好ましいベクターはエピソーム（ｅｐｉｓｏｍｅ）であり、即ち、染色体外（ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）での複製が可能な核酸分子である。好ましいベクターは、自己複製、並びに核酸の発現が可能なものである。一つ以上のポリペプチドをエンコードする遺伝子及び／又はノンコーディングＲＮＡ遺伝子の発現を誘導できるベクターは、ここでは「発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）」又は「発現コンピテントベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ－ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｖｅｃｔｏｒ）」と呼ばれる。特に重要なベクターは、逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）を使用して、得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡのクローニングを可能にする。ベクターの成分は、ウイルスプロモーター又はＩＩ型（ｔｙｐｅ－ＩＩ）のＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ－ＩＩ又はｐｏｌ－２）プロモーター、又はその両者、Ｋｏｚａｋコンセンサス翻訳開始位（Ｋｏｚａｋ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）、ポリアデニル化シグナル（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌｓ）、複数の制限／クローニング部位（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ／ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）、ｐＵＣ複製開始点（ｐＵＣ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、複製可能な（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ－ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）原核細胞内の少なくとも１つの抗生物質耐性遺伝子を発現するためのＳＶ４０初期プロモーター（ＳＶ４０ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、哺乳類細胞内の複製のための選択性ＳＶ４０複製開始点（ＳＶ４０ ｏｒｉｇｉｎ）、及び／又はテトラサイクリン応答因子を含んでもよい。ベクターの構造は、プラスミド、ウイルスベクター、トランスポゾン、レトロトランスポゾン、ＤＮＡ導入遺伝子、ジャンピング遺伝子、及びそれらの組み合わせからなる群から選ばれる、直鎖状、或いは環形の一本鎖又は二本鎖ＤＮＡであってもよい。
【0052】
プロモーター（Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）：ポリメラーゼ分子により識別され、又はそれに結合され、ＲＮＡ転写を開始させる核酸である。本発明の目的に応じて、プロモーターは、既知のポリメラーゼ結合位置、エンハンサーとその類似物、及び所望のポリメラーゼを使用してＲＮＡ転写産物の合成を開始可能な任意の配列であってもよい。
【0053】
制限部位（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｓｉｔｅ）：制限酵素切断のためのＤＮＡモチーフである。これらの制限部位は、ＡａｔＩＩ、ＡｃｃＩ、ＡｆｌＩＩ／ＩＩＩ、ＡｇｅＩ、ＡｐａＩ／ＬＩ、ＡｓｅＩ、Ａｓｐ７１８Ｉ、ＢａｍＨＩ、ＢｂｅＩ、ＢｃｌＩ／ＩＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｓｍＩ、Ｂｓｐ１２０Ｉ、ＢｓｐＨＩ／ＬＵ１１Ｉ／１２０Ｉ、ＢｓｒＩ／ＢＩ／ＧＩ、ＢｓｓＨＩＩ／ＳＩ、ＢｓｔＢＩ／Ｕ１／ＸＩ、ＣｌａＩ、Ｃｓｐ６Ｉ、ＤｐｎＩ、ＤｒａＩ／ＩＩ、ＥａｇＩ、Ｅｃｌ１３６ＩＩ、ＥｃｏＲＩ／ＲＩＩ／４７ＩＩＩ／ＲＶ、ＥｈｅＩ、ＦｓｐＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎＰＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｉｎｆＩ、ＨｐａＩ／ＩＩ、ＫａｓＩ、ＫｐｎＩ、ＭａｅＩＩ／ＩＩＩ、ＭｆｅＩ、ＭｌｕＩ、ＭｓｃＩ、ＭｓｅＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＮｇｏＭＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＮｓｉＩ、ＰｍｌＩ、Ｐｐｕ１０Ｉ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩ／ＩＩ、ＲｓａＩ、ＳａｃＩ／ＩＩ、ＳａｌＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＳｍａＩ、ＳｎａＢＩ、ＳｐｈＩ、ＳｓｐＩ、ＳｔｕＩ、ＴａｉＩ、ＴａｑＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ、ＸｍａＩの切断位置を含むが、それらに限定されない。
【0054】
シストロン（Ｃｉｓｔｒｏｎ）：アミノ酸残基の配列をコードするＤＮＡ分子内のヌクレオチド配列であり、上流及び下流ＤＮＡ発現制御要素を含む。
【0055】
ＲＮＡプロセシング（ＲＮＡ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）：ＲＮＡの成熟、修飾、及び分解に関与する細胞メカニズムであり、ＲＮＡスプライシング、イントロン切除、エキソソーム消化（ｅｘｏｓｏｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）、ナンセンス変異依存分解（ｎｏｎｓｅｎｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｃａｙ，ＮＭＤ）、ＲＮＡエディティング、ＲＮＡプロセシング、５’キャッピング、３’－ポリ（Ａ）テーリング、及びそれらの組み合わせを含む。
【0056】
遺伝子送達（Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）：ポリソーム（ｐｏｌｙｓｏｍａｌ）トランスフェクション、リポソームトランスフェクション、化学（ナノ粒子）トランスフェクション、電気穿孔法、ウイルス感染、ＤＮＡ組換え、トランスポゾン挿入、ジャンピング遺伝子挿入、マイクロインジェクション、遺伝子銃による浸透、及びそれらの組み合わせからなる群から選ばれる遺伝子工学方法である。
【0057】
遺伝子工学（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）：ＤＮＡ制限及び接合、相同性遺伝子の組換え、トランスジーンの組み込み、トランスポゾン挿入、ジャンピング遺伝子の組み込み、レトロウイルス感染、及びそれらの組み合わせからなる群から選ばれるＤＮＡ組換え方法である。
【0058】
腫瘍抑制（Ｔｕｍｏｒ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）：細胞周期の減衰、Ｇ０／Ｇ１チェックポイント停止、腫瘍抑制、抗腫瘍発生、がん細胞アポトーシス、及びそれらの組み合わせを含むが、それらに限定されない細胞の抗腫瘍及び抗がんメカニズムである。
【0059】
標的細胞（Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｃｅｌｌ）：体細胞、組織、幹細胞、生殖細胞、奇形腫細胞、腫瘍細胞、がん細胞、ウイルスに感染した細胞及びそれらの組み合わせからなる群から選ばれる単一又は複数のヒト細胞である。
【0060】
癌組織（Ｃａｎｃｅｒｏｕｓ Ｔｉｓｓｕｅ）：皮膚癌、前立腺癌、乳癌、肝臓癌、肺癌、脳腫瘍／癌、リンパ腫、血液癌、及びそれらの組み合わせからなる群に由来する腫瘍組織である。
【0061】
抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ）：予め選択されたリガンドに結合可能な受容体をコードする予め選択された保存ドメイン構造を有するペプチド又はタンパク質分子である。
【0062】
薬学上及び／又は治療上の適用（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ／ｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）：幹細胞の生成、幹細胞の研究及び／又は療法の開発、癌治療、疾患処理、傷口治癒処理と組織再生処理、薬物収量と食物供給の向上、及びそれらの組み合わせに適用する生物医学的利用及び／又は装置である。
【0063】
原核生物又は原核細胞（Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅ ｏｒ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ Ｃｅｌｌ）：細菌のような、明らかな膜結合（ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｂｏｕｎｄ）の細胞核が欠如しており、且つＤＮＡの連続鎖（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｓｔｒａｎｄ）としてその遺伝物質を有する単細胞生物である。
【0064】
真核生物又は真核細胞（Ｅｕｋａｒｙｏｔｅ ｏｒ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｃｅｌｌ）：酵母菌、植物、動物といった、その細胞が膜結合の細胞核及びその他の構造（細胞小器官）を含有する単細胞又は多細胞生物である。
【0065】
転写誘導剤（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｉｎｄｕｃｅｒ）：原核細胞におけるｐｏｌ－２又はＰｏｌ－２類プロモーターからの真核ＲＮＡ及び／又は遺伝子転写を誘導及び／又は促進し得る化学剤である。例えば、転写誘導剤は、３－モルホリノプロパン－１－スルホン酸（ＭＯＰＳ）、エタノール及び／又はグリセリン、並びにその機能類似体、例えばマンニトール、２－（Ｎ－モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、又はそれらの混合物に類似する化学構造を含むが、それらに限定されない。
【0066】
Ｂ．組成物及び適用
抗ウイルス及び抗がんワクチンの製造・開発に用いる新規なｍＲＮＡ組成物及びその製造方法であって、少なくとも５’－ヘアピンメッセンジャーＲＮＡ（５ｈｍＲＮＡ）及び／又はメッセンジャーヘアピンメッセンジャーＲＮＡ（ｍｈｍＲＮＡ）、或いはその両者を含み、上記５ｈｍＲＮＡは、少なくともタンパク質／ペプチドコーディングｍＲＮＡの５’－ＵＴＲ領域においてステムループＲＮＡ構造を含み、上記ｍｈｍＲＮＡは、両側に２つの同じ又は異なるｍＲＮＡ配列を有する中間ステムループＲＮＡ構造を含む。
抗ウイルス及び抗がんワクチンの製造・開発に用いる新規なｍＲＮＡ組成物及びその製造方法であって、少なくとも５’－ヘアピンメッセンジャーＲＮＡ（５ｈｍＲＮＡ）及び／又はメッセンジャーヘアピンメッセンジャーＲＮＡ（ｍｈｍＲＮＡ）、或いはその両者を含み、上記５ｈｍＲＮＡは、少なくともタンパク質／ペプチドコーディングｍＲＮＡの５’－ＵＴＲ領域においてステムループＲＮＡ構造を含み、上記ｍｈｍＲＮＡは、両側に２つの同じ又は異なるｍＲＮＡ配列を有する中間ステムループＲＮＡ構造を含む。
【0067】
ヘアピン様ＲＮＡの生成効率が低さを克服するために、５ｈｍＲＮＡ及びｍｈｍＲＮＡは、新しく発明されたＲＮＡポリメラーゼとヘリカーゼの混合物の活性を合わせた新規なＰＣＲ－ＩＶＴ方法と改良されたＩＶＴ緩衝系を用いて製造される。また、標的細胞への５ｈｍＲＮＡ又はｍｈｍＲＮＡ、或いはその両者の送達を容易にするために、５ｈｍＲＮＡ及びｍｈｍＲＮＡは、少なくともグリシルグリセリン、リポソーム、ナノ粒子、リポソームナノ粒子、共役系分子、輸液製剤、遺伝子銃材料、トランスポゾン、電気穿孔粒子、及びこれらの組み合わせから選ばれる送達剤とさらに混合、結合（コンジュゲート）、カプセル化及び／又は配合することができる。
【0068】
とある好ましい実施形態において、５ｈｍＲＮＡは、主として５’－ステムループＲＮＡ及び３’－ｍＲＮＡの２つの部分から構成される（図２）。構造上、５’－ステムループＲＮＡは、少なくとも、好ましくは約１０～８００ヌクレオチドの長さを有する、完全又は不完全に一致した単一又は複数のヘアピン構造と、好ましくは約１～５００ヌクレオチド離れて存在し、ステムループ構造と次の３’－ｍＲＮＡの開始コドンとの間に位置する短い配列とを含む。５’－ステムループＲＮＡにおいて複数のヘアピン構造が存在する場合、ヘアピンＲＮＡ構造２つ毎の間にスペーサー配列を配置する必要があり、当該スペーサー配列の長さは、約２～５００ヌクレオチド離れれていることが好ましい。ヘアピン構造とスペーサーは、それぞれ同じ配列を有してもよいし、異なる配列を有してもよい。また、５’－ステムループＲＮＡは、さらに３’－ｍＲＮＡの翻訳を開始・促進するための人工的ＩＲＥＳ様模倣物として機能し、所望のタンパク質・ペプチド製造を可能にする。他方、３’－ｍＲＮＡは、少なくとも１つの所望のタンパク質又はペプチドをコードし、且つその３’末端の近傍に細胞内ポリ（Ａ）テーリング機構を誘導するための５’－ＡＡＵＡＡＡ－３’（配列番号１）又は５’－ＡＡＵＵＡＡＡ－３’（配列番号２）配列のいずれかを含む。
【0069】
別の好ましい実施形態において、ｍｈｍＲＮＡは、５ｈｍＲＮＡの５’末端にさらなるｍＲＮＡ（５’－ｍＲＮＡ）配列を付加することによって形成される。その結果、ステムループＲＮＡは、最初の５’－ｍＲＮＡと次の３’－ｍＲＮＡの個々の翻訳を、それぞれ同じ又は異なるタンパク質／ペプチドに分離する中間セパレーターとして機能するようになる。さらに、５ｈｍＲＮＡと同様に、ステムループＲＮＡ構造は、細胞内ＲＮＡプロセシング酵素を刺激して３’－ｍＲＮＡに５’－キャップを付加するだけでなく、少なくともｓｈＲＮＡ及び／又はｐｉＲＮＡを生成して、少なくとも特異的標的遺伝子を不活性化し得る。これらの特異的標的遺伝子は、様々な疾患関連細胞及び／又は病原性遺伝子、例えばウイルス及び／又はがん関連遺伝子を含んでもよい。或いは、付加のＩＲＥＳ様５’－ステムループＲＮＡ構造は、５’－ｍＲＮＡ又は３’－ｍＲＮＡ、或いはその両者のいずれかの５’－ＵＴＲに位置し、５’－ｍＲＮＡ及び／又は３’－ｍＲＮＡの翻訳を開始・促進することで、複数の所望のタンパク質／ペプチドの製造を可能にする。
【0070】
第３の好ましい実施形態（図２）において、ｍｈｍＲＮＡの最初の５’－ｍＲＮＡは、トランスフェクト細胞において第２の３’－ｍＲＮＡを増幅するためのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）のようなＲＮＡレプリカーゼをエンコードする。このようなＲＮＡレプリカーゼ／ＲｄＲｐ発現ｍｈｍＲＮＡは、トランスフェクト細胞内で自己増幅可能である。標的細胞にトランスフェクトされた後、５ｈｍＲＮＡとｍｈｍＲＮＡの両者をさらに処理し、少なくとも所望のタンパク質／ペプチドに翻訳して、予め設計された所望の生物学的効果又は細胞機能を誘発することができ、これらの生物学的効果又は細胞機能は、特異的免疫反応の誘導、ウイルス感染の予防、ウイルス複製／構築の抑制、及び／又は腫瘍／がん細胞の増殖の阻害、並びにがん細胞死の誘導を含むが、それらに限定されない。その結果、このような新規な５ｈｍＲＮＡ及びｍｈｍＲＮＡ組成物は、新規な薬学上及び治療上への適用、例えば、抗ウイルス及び／又は抗がん治療に用いるワクチン及び／又は医薬品を設計・開発するのに非常に有用であると考えられる。
【0071】
５ｈｍＲＮＡ及びｍｈｍＲＮＡのステムループＲＮＡ構造は、少なくとも配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、．．．、配列番号１５及び／又はそれらの組み合わせから選ばれる配列を含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【0072】
明確に言うと、以下で説明される図面は本発明を例示・説明するためのものであり、制限的する為のものではない。
【0073】
【図1】ＰＣＲ－ＩＶＴ方法の段階的な手順を示す図である。ｍＲＮＡの製造において、当該ＰＣＲ－ＩＶＴ方法の一部又は全体の手順に従って、所望のｍＲＮＡ産物の単一又は複数のサイクルの増幅を行うことができる。
【図2】５ｈｍＲＮＡ及びｍｈｍＲＮＡの設計構造を示す図である。
【図3】設計された赤色蛍光ＲＧＦＰをコードする５ｈｍＲＮＡの構造例を示す図である。図示するように、当該ＲＧＦＰをコードする５ｈｍＲＮＡのステムループＲＮＡ構造は、コードされたＲＧＦＰ ｍＲＮＡの５’－ＵＴＲに位置する配列番号１４／１５と、配列番号３と、配列番号４と、配列番号５との組み合わせを含む。ここでは、あくまでも一例として挙げられ、本発明を限定するものではないが、ステムループＲＮＡ構造は、任意のヘアピン様ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、前駆体マイクロＲＮＡ及び／又はＩＲＥＳ様ＲＮＡ構造で置き換えられ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｖｏで所望の生物学的効果又は細胞機能を誘導できることが理解される。同様に、エンコードされたＲＧＦＰ ｍＲＮＡはまた、得られるタンパク質／ペプチドの機能に応じて、他の任意の所望のタンパク質／ペプチドコーディングｍＲＮＡで置き換えられ、少なくともｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｖｏで所望の生物学的効果又は細胞機能を誘発し得る。
【図4】新規なヘリカーゼ活性を用いた本発明のＰＣＲ－ＩＶＴ方法によって作製したプロモーター組み込み型ＰＣＲ産物とその誘導体５ｈｍＲＮＡを示す図である。ＰＣＲ産物の開始量が増加するについて、増幅される５ｈｍＲＮＡの分子がそれに比例して、用量依存的に増加する。従って、３０～２０００倍の最適な生成速度に達することができ、１ｍＬのＩＶＴ反応（０．６～０．９ ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ）あたり最大０．６～０．９ｍｇのｍＲＮＡを製造することが可能となる。
【図5】ｉｎ ｖｉｔｒｏでＤｒｏｓｈａ様ＲＮａｓｅＩＩＩ酵素活性（Ａｍｂｉｏｎ ＲＮａｓｅ ＩＩＩ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（サーモフィッシャーサイエンティフィック），マサチューセッツ州，米国）によって処理された後に、ＰＣＲ－ＩＶＴ方法によって作製した５ｈｍＲＮＡ（即ち、ＲＧＦＰをコードする５ｈｍＲＮＡ）配列のヘアピン様／ＩＲＥＳ様ステムループＲＮＡ構造を示す図である。この例に示すように、Ｄｒｏｓｈａで処理されたヘアピン様ＲＮＡ構造は、設計されたＩＲＥＳ様ステムループＲＮＡと、ｍｉＲ－３０２ｂ、ｍｉＲ－３０２ｃ及びｍｉＲ－３０２ａの前駆体とを含む。ｍｉＲ－３０２ａ、ｍｉＲ－３０２ｂ及びｍｉＲ－３０２ｃは、抗がん治療に有用な腫瘍抑制因子マイクロＲＮＡであることが知られている。
【図6】本発明のＰＣＲ－ＩＶＴ方法によって作製した５ｈｍＲＮＡ（図３から）でトランスフェクトされたＡ５４９細胞におけるＲＧＦＰタンパク質（赤色蛍光色）の産生を示す図であり、トランスフェクト細胞において５ｍＲＮＡから所望のタンパク質／ペプチドを産生して、設計された生物学的効果及び／又は細胞効果をもたらすことができることを示す。エンコードされたＲＧＦＰ ｍＲＮＡは、５ｈｍＲＮＡ及びｍｈｍＲＮＡ内の他の任意のタンパク質／ペプチドコーディングｍＲＮＡ配列で置き換えられ、目的とする異なる生物学的効果又は細胞機能をもたらすことができると考えられる。
【図7】抗ウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９）５ｈｍＲＮＡのノーザンブロット分析結果を示す図である。
【図8】抗ウイルスｍｈｍＲＮＡのノーザンブロット分析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例0074】
１．ヒト細胞培養及びＩｎ ＶｉｔｒｏにおけるＲＮＡトランスフェクション
角化細胞の培養において、皮膚組織から角化細胞を分離し、適切な抗生物質の存在下において、３７℃で５％の二酸化炭素の条件で、ヒト角化細胞増殖添加剤（ＨＫＧＳ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州カールスバッド）が添加されたＥｐｉＬｉｆｅ無血清（ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ）の細胞培養液において培養した。細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ溶液に１分間曝露して、フェノールレッドのないＤＭＥＭ培養液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で一回リンスすることにより、細胞増殖が５０％～６０％の密集度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）に達し、更に、た後、ＨＫＧＳ添加剤を含む新鮮なＥｐｉＬｉｆｅ培養液において、これらの分離された細胞を１：１０で希釈した状態で再播種した。ヒト癌及び正常細胞株ＭＣＦ７、ＨｅｐＧ２、Ａ５４９及びＢＥＡＳ－２Ｂをアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ，ロックビル，メリーランド州）又は発明者の共同研究者らから取得し、製造者の指示した条件で培養した。ＲＮＡトランスフェクションにおいて、０．５～５００μｇの分離されたｍＲＮＡ（即ち、５ｈｍＲＮＡ又はｍｈｍＲＮＡ）を０．５ｍｌの新鮮なＥｐｉＬｉｆｅ培養液に溶解させ、１～５０μｌのＩｎ－ＶｉｖｏＪｅｔＰＥＩトランスフェクション試薬と混合した。１０～３０分間の培養を経て、当該混合液を５０％～６０％の密集度に達した細胞培養液に添加した。細胞の種類に応じて、培地を１２～４８時間ごとに再洗浄した。トランスフェクションの効率を向上させるために、このトランスフェクションの手順を繰り返してもよい。トランスフェクションの結果を、それぞれ図６及び図９に示した。
角化細胞の培養において、皮膚組織から角化細胞を分離し、適切な抗生物質の存在下において、３７℃で５％の二酸化炭素の条件で、ヒト角化細胞増殖添加剤（ＨＫＧＳ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州カールスバッド）が添加されたＥｐｉＬｉｆｅ無血清（ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ）の細胞培養液において培養した。細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ溶液に１分間曝露して、フェノールレッドのないＤＭＥＭ培養液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で一回リンスすることにより、細胞増殖が５０％～６０％の密集度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）に達し、更に、た後、ＨＫＧＳ添加剤を含む新鮮なＥｐｉＬｉｆｅ培養液において、これらの分離された細胞を１：１０で希釈した状態で再播種した。ヒト癌及び正常細胞株ＭＣＦ７、ＨｅｐＧ２、Ａ５４９及びＢＥＡＳ－２Ｂをアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ，ロックビル，メリーランド州）又は発明者の共同研究者らから取得し、製造者の指示した条件で培養した。ＲＮＡトランスフェクションにおいて、０．５～５００μｇの分離されたｍＲＮＡ（即ち、５ｈｍＲＮＡ又はｍｈｍＲＮＡ）を０．５ｍｌの新鮮なＥｐｉＬｉｆｅ培養液に溶解させ、１～５０μｌのＩｎ－ＶｉｖｏＪｅｔＰＥＩトランスフェクション試薬と混合した。１０～３０分間の培養を経て、当該混合液を５０％～６０％の密集度に達した細胞培養液に添加した。細胞の種類に応じて、培地を１２～４８時間ごとに再洗浄した。トランスフェクションの効率を向上させるために、このトランスフェクションの手順を繰り返してもよい。トランスフェクションの結果を、それぞれ図６及び図９に示した。
【0075】
２．新規なＰＣＲ－ＩＶＴプロトコル
製造者が指示に従って、約０．０１ｎｇ～１０マイクログラム（μｇ）の分離されたｍＲＮＡを２０～５０μＬのＲＴ反応（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴキット，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，マサチューセッツ州，米国）に加えることにより、所望のｍＲＮＡの逆転写（ＲＴ）を行った。ｍＲＮＡの量に応じて、ＲＴ反応混合物の１×ＲＴ緩衝液中には、ｍＲＮＡ、約０．０１～２０ｎｍｏｌｅのＲＴプライマー、及び適量のｄＮＴＰと逆転写酵素が含まれる。次に、所望のｍＲＮＡの構造や長さに応じて、ＲＴ反応を４６～６５℃で１～３時間インキュベートし、少なくともＰＣＲの以降のステップのための相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）テンプレートを作製した。ＲＴプライマーの設計において、一例として、それぞれ所望のＣＯＶＩＤ－１９ウイルスｍＲＮＡ配列のＲＴの５’－ＣＡＧＴＴＣＣＡＡＴ ＴＧＴＧＡＡＧＡＴＴ ＣＴＣ－３’（配列番号１６）と、目的とする別の抗がんマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）ステムループ含有赤色蛍光タンパク質（ＲＧＦＰ）をコードするｍＲＮＡ（即ち、ＲＧＦＰをコードする５ｈｍＲＮＡ）のＲＴの別の５’－ＣＴＧＡＴＧＡＣＧ ＴＴＣＴＣＡＧＴＧＣ－３’（配列番号１７）（図３）を用いるが、この例に限定されない。
製造者が指示に従って、約０．０１ｎｇ～１０マイクログラム（μｇ）の分離されたｍＲＮＡを２０～５０μＬのＲＴ反応（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴキット，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，マサチューセッツ州，米国）に加えることにより、所望のｍＲＮＡの逆転写（ＲＴ）を行った。ｍＲＮＡの量に応じて、ＲＴ反応混合物の１×ＲＴ緩衝液中には、ｍＲＮＡ、約０．０１～２０ｎｍｏｌｅのＲＴプライマー、及び適量のｄＮＴＰと逆転写酵素が含まれる。次に、所望のｍＲＮＡの構造や長さに応じて、ＲＴ反応を４６～６５℃で１～３時間インキュベートし、少なくともＰＣＲの以降のステップのための相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）テンプレートを作製した。ＲＴプライマーの設計において、一例として、それぞれ所望のＣＯＶＩＤ－１９ウイルスｍＲＮＡ配列のＲＴの５’－ＣＡＧＴＴＣＣＡＡＴ ＴＧＴＧＡＡＧＡＴＴ ＣＴＣ－３’（配列番号１６）と、目的とする別の抗がんマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）ステムループ含有赤色蛍光タンパク質（ＲＧＦＰ）をコードするｍＲＮＡ（即ち、ＲＧＦＰをコードする５ｈｍＲＮＡ）のＲＴの別の５’－ＣＴＧＡＴＧＡＣＧ ＴＴＣＴＣＡＧＴＧＣ－３’（配列番号１７）（図３）を用いるが、この例に限定されない。
【0076】
次に、製造者が指示に基づき、約０．０１ｐｇ～１０μｇのＲＴに由来するｃＤＮＡを５０μＬのＰＣＲ混合物（Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｅｎｚｙｍｅキット，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，マサチューセッツ州，米国）に添加することにより、ポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）を行った。そして、所望のＤＮＡとプライマーの構造や長さに応じて、ＰＣＲ混合物を最初に９４℃で５～２０サイクルの変性で１分間インキュベートし、３０～５５℃で３０秒～１分間アニーリングし、そして７２℃で１～３分間伸長させた。続いて、得られたＰＣＲ産物の構造や長さに応じて、変性（９４℃で１分間）、アニーリング（５０～５５℃で３０秒間）、及び伸長（７２℃で１～３分間）という一連のステップによって、さらに１０～２０サイクルのＰＣＲを行った。最後に、得られたＰＣＲ産物をＩＶＴのテンプレートとして使用した。一例として、ウイルスプロモーター含有ＤＮＡテンプレートを増幅するために、５’－ＧＡＴＡＴＣＴＡＡＴ ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ ＡＴＡＧＧＧＡＧ ＧＴＡＴＧＴＡＣＴ ＴＧＧＴＡＧＴＴ－３’（配列番号１８）と配列番号１６（約１２．５ｋヌクレオチド（ｎｔ）のＣＯＶＩＤ－１９ ＲｄＲｐ／ヘリカーゼ／Ｓタンパク質コーディングｍｈｍＲＮＡを増幅するために用いられる（結果を図８に示す））からなる１対のプライマー、並びに５’－ＧＡＴＡＴＣＴＡＡＴ ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ ＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣ ＴＡＧＴＧＡＴＧＴＴ ＣＴＴＧＴＴＡＡＣＡ ＡＣＴ－３’（配列番号１９）と配列番号１６（約２．８ｋ－ｎｔのＣＯＶＩＤ－１９ Ｓ ２タンパク質コーディング５ｈｍＲＮＡを増幅するために用いられる（結果を図７に示す））からなる別の対のペアプライマーを含む２組のＰＣＲプライマーを設計したが、この例に限定されない。また、プロモーター含有フォワードプライマー５’－ＧＡＴＡＴＣＴＡＡＴ ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ ＡＴＡＧＧＧＡＧ ＧＴＡＴＧＴＡＣＴ ＴＧＧＴＡＧＴＴ－３’（配列番号２０）と配列番号１７（結果を図４、５に示す）とを含む別の対のＰＣＲプライマーを使用して、抗がんｍｉＲＮＡステムループ含有ＲＧＦＰをコードするＤＮＡテンプレート（即ち、ＲＧＦＰをコードする５ｈｍＲＮＡ）を増幅した。主たる設計において、全ての設計されたフォワードＰＣＲプライマーは、少なくともＩＶＴの保存プロモーター配列（Ｔ７、Ｔ３、及び／又はＳＰ６プロモーター配列が挙げられるが、これらに限定されない）、特に５’－ＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡ ＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ ＧＧＡＧＡ－３’（配列番号２１）をエンコードした。さらに、フォワードプロモーター・プライマーの３’末端には、ＰＣＲ産物に少なくともヘアピン様ステムループ構造又は少なくともＩＲＥＳ様ステムループ構造のいずれかを挿入するための制限部位が少なくとも存在してもよい。
【0077】
ｍＲＮＡの製造において、得られたＰＣＲ産物にプロモーター・プライマーが組み込まれているため、当該ＰＣＲ産物をテンプレートとし、改良されたＩＶＴ反応を行って、所望のｍＲＮＡ配列を増幅することができる。ＩＶＴ反応混合物の１×転写緩衝液中に、０．０１ ｎｇ～１０ μｇのＰＣＲ産物、０．１～１０ Ｕのヘリカーゼ（Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ，ＮＹ）、及び適量のＮＴＰとＲＮＡポリメラーゼ（即ち、Ｔ７、Ｔ３、又はＳＰ６）を含む。製造者の指示に基づき、使用したＲＮＡポリメラーゼに応じて、１×転写緩衝液の内容物を調整することができる。さらに、当該１×転写緩衝液中に、０．００１～１０ ｍＭのベタイン（トリメチルグリシン、ＴＭＧ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、及び／又は３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）及び／又はそれらの組み合わせをさらに含んでもよい。これにより、ヘアピンやＩＲＥＳなどの高度に構造化されたＲＮＡ／ＤＮＡ配列の変性を容易にすることができる。次に、使用したＲＮＡポリメラーゼの安定性や活性に応じて、ＩＶＴ反応を３７℃で１～６時間インキュベートした。当該改良された新規なＩＶＴ反応では、ヘアピン様及びＩＲＥＳ様ステムループ構造のようなＲＮＡ／ＤＮＡ二次構造の巻き戻しを容易にし、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヘアピン様ＲＮＡの生成効率が低いという問題を解決するために、少なくともさらなるヘリカーゼ酵素を添加した。なお、ヘリカーゼ酵素は、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖の両者の二次構造を巻き戻すことができる。
【0078】
３．ＲＮＡ精製、ノーザンブロット分析及びＲＮＡ配列決定
製造者の指示に従って、ｍｉｒＶａｎａ（登録商標）ＲＮＡ分離キット（Ａｍｂｉｏｎ，テキサス州オースティン）により所望のｍＲＮＡ（１０μｇ）を分離した。そして、１５％のＴＢＥ－尿素ポリアクリルアミドゲル又は３．５％の低融点アガロースゲル電気泳動でさらに当該ｍＲＮＡを精製する。ノーザンブロット分析では、当該ゲル分画されたＲＮＡをナイロン膜にエレクトロブロッティングした。そして、ｍＲＮＡの所望の標的配列に相補的な［ＬＮＡ］－ＤＮＡプローブにより、ラベル（標識）化することで、ｍＲＮＡ及びそのＩＶＴテンプレート（ＰＣＲ産物）を検知した。当該プローブは、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製され、かつ、色素標識ヌクレオチド類似体又は［32Ｐ］－ｄＡＴＰ（＞３０００Ｃｉ／ｍＭ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，イリノイ州アーリントンハイツ）の存在下で、ターミナルトランスフェラーゼ（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，２０ ｕｎｉｔｓ）で２０分間テール標識（ｔａｉｌ－ｌａｂｅｌｅｄ）された。ｍＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ配列決定において、設計された配列番号２１と、配列番号１６又は配列番号１７のいずれかをプライマーとして用いて、それぞれｍＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ配列の５’末端及び３’末端からＲＮＡ配列を別々に決定した。
製造者の指示に従って、ｍｉｒＶａｎａ（登録商標）ＲＮＡ分離キット（Ａｍｂｉｏｎ，テキサス州オースティン）により所望のｍＲＮＡ（１０μｇ）を分離した。そして、１５％のＴＢＥ－尿素ポリアクリルアミドゲル又は３．５％の低融点アガロースゲル電気泳動でさらに当該ｍＲＮＡを精製する。ノーザンブロット分析では、当該ゲル分画されたＲＮＡをナイロン膜にエレクトロブロッティングした。そして、ｍＲＮＡの所望の標的配列に相補的な［ＬＮＡ］－ＤＮＡプローブにより、ラベル（標識）化することで、ｍＲＮＡ及びそのＩＶＴテンプレート（ＰＣＲ産物）を検知した。当該プローブは、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製され、かつ、色素標識ヌクレオチド類似体又は［32Ｐ］－ｄＡＴＰ（＞３０００Ｃｉ／ｍＭ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，イリノイ州アーリントンハイツ）の存在下で、ターミナルトランスフェラーゼ（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，２０ ｕｎｉｔｓ）で２０分間テール標識（ｔａｉｌ－ｌａｂｅｌｅｄ）された。ｍＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ配列決定において、設計された配列番号２１と、配列番号１６又は配列番号１７のいずれかをプライマーとして用いて、それぞれｍＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ配列の５’末端及び３’末端からＲＮＡ配列を別々に決定した。
【0079】
４．タンパク質抽出とウエスタンブロット分析
製造者の指示に従い、プロテアーゼ抑制剤、ロイペプチン、ＴＬＣＫ、ＴＡＭＥ及びＰＭＳＦが補充されたＣｅｌＬｙｔｉｃ－Ｍ溶解／抽出試薬（ＣｅｌＬｙｔｉｃ－Ｍ ｌｙｓｉｓ／ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ，Ｓｉｇｍａ）により細胞（１，０００，０００個）を溶解させた。そして、１２，０００ｒｐｍ、４℃で当該溶解液を２０分間遠心分離し、遠心分離された上澄液が得られた。改良されたＳＯＦＴｍａｘタンパク質測定パッケージにより、Ｅ－ｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＣＡ）上でタンパク質濃度を測定した。還元（＋５０ｍＭ ＤＴＴ）及び非還元（ＤＴＴなし）の条件で、３０μｇの細胞溶解産物をＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプル緩衝液にそれぞれ添加し、６％～８％のポリアクリルアミドゲルに入れる前に、３分間沸騰させた。そして、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）でタンパク質を解析し、その後、タンパク質をニトロセルロース膜にエレクトロブロッティングし、当該膜をオデッセーブッロキング試薬（Ｏｄｙｓｓｅｙ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ，Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ネブラスカ州リンカーン）において培養し、室温で２時間保管した。次に、当該試薬に一次抗体を添加し、当該混合物を４℃で保管し作用させた。一晩の培養を経た後、ＴＢＳ－Ｔで当該膜を三回リンスし、そして、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０反応性染料（１：２，０００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を結合したヒツジ抗マウスＩｇＧ（ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ）二次抗体に、室温で１時間曝露した。ＴＢＳ－Ｔで三回追加リンスした後、Ｌｉ－Ｃｏｒオデッセー赤外線映像装置及びオデッセーソフトウェアｖ．１０（Ｌｉ－Ｃｏｒ）を使用して、免疫ブロットの蛍光スキャン及び映像分析を実施した。
製造者の指示に従い、プロテアーゼ抑制剤、ロイペプチン、ＴＬＣＫ、ＴＡＭＥ及びＰＭＳＦが補充されたＣｅｌＬｙｔｉｃ－Ｍ溶解／抽出試薬（ＣｅｌＬｙｔｉｃ－Ｍ ｌｙｓｉｓ／ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ，Ｓｉｇｍａ）により細胞（１，０００，０００個）を溶解させた。そして、１２，０００ｒｐｍ、４℃で当該溶解液を２０分間遠心分離し、遠心分離された上澄液が得られた。改良されたＳＯＦＴｍａｘタンパク質測定パッケージにより、Ｅ－ｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＣＡ）上でタンパク質濃度を測定した。還元（＋５０ｍＭ ＤＴＴ）及び非還元（ＤＴＴなし）の条件で、３０μｇの細胞溶解産物をＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプル緩衝液にそれぞれ添加し、６％～８％のポリアクリルアミドゲルに入れる前に、３分間沸騰させた。そして、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）でタンパク質を解析し、その後、タンパク質をニトロセルロース膜にエレクトロブロッティングし、当該膜をオデッセーブッロキング試薬（Ｏｄｙｓｓｅｙ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ，Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ネブラスカ州リンカーン）において培養し、室温で２時間保管した。次に、当該試薬に一次抗体を添加し、当該混合物を４℃で保管し作用させた。一晩の培養を経た後、ＴＢＳ－Ｔで当該膜を三回リンスし、そして、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０反応性染料（１：２，０００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を結合したヒツジ抗マウスＩｇＧ（ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ）二次抗体に、室温で１時間曝露した。ＴＢＳ－Ｔで三回追加リンスした後、Ｌｉ－Ｃｏｒオデッセー赤外線映像装置及びオデッセーソフトウェアｖ．１０（Ｌｉ－Ｃｏｒ）を使用して、免疫ブロットの蛍光スキャン及び映像分析を実施した。
【0080】
５．免疫染色分析
細胞／組織サンプルを１００％メタノール中で４℃で３０分間固定し、次に４％パラホルムアルデヒド（１×ＰＢＳ，ｐＨ ７．４）中で２０℃で１０分間固定した。その後、０．１～０．２５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む１×ＰＢＳで当該サンプルを１０分間培養し、１×ＰＢＳで３回、５分間洗浄した。免疫染色において、一次抗体は、抗ＤｓＲｅｄ／ＲＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，カリフォルニア州）及び抗ＣＯＶＩＤ－１９ Ｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）モノクローナル抗体を含むが、これらに限定されない。染料で標識されたヒツジ抗ウサギ（ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ）又はウマ抗マウス（ｈｏｒｓｅ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ）抗体を二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，カールズバッド，カリフォルニア州）として使用した。Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ映像処理プログラム（Ｎｉｋｏｎ）を用いた蛍光８０ｉ顕微鏡定量分析システムの下、１００×又は２００×の拡大倍率で結果を検証及び分析した。陽性の結果を図６及び図９に示した。
細胞／組織サンプルを１００％メタノール中で４℃で３０分間固定し、次に４％パラホルムアルデヒド（１×ＰＢＳ，ｐＨ ７．４）中で２０℃で１０分間固定した。その後、０．１～０．２５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む１×ＰＢＳで当該サンプルを１０分間培養し、１×ＰＢＳで３回、５分間洗浄した。免疫染色において、一次抗体は、抗ＤｓＲｅｄ／ＲＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，カリフォルニア州）及び抗ＣＯＶＩＤ－１９ Ｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）モノクローナル抗体を含むが、これらに限定されない。染料で標識されたヒツジ抗ウサギ（ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ）又はウマ抗マウス（ｈｏｒｓｅ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ）抗体を二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，カールズバッド，カリフォルニア州）として使用した。Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ映像処理プログラム（Ｎｉｋｏｎ）を用いた蛍光８０ｉ顕微鏡定量分析システムの下、１００×又は２００×の拡大倍率で結果を検証及び分析した。陽性の結果を図６及び図９に示した。
【0081】
６．Ｉｎ Ｖｉｖｏにおける形質導入アッセイ
製造者の指示に従って、実施例２及び３で得られた分離したｍＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを、Ｉｎ－ＶｉｖｏＪｅｔＰＥＩトランスフェクション試薬などの適量の送達剤とよく混合して、目的に応じて動物の血脈又は筋肉に注射した。当該送達剤を所望の５ｈｍＲＮＡ又はｍｈｍＲＮＡと混合、結合（コンジュゲート）、カプセル化又は配合することにより、５ｈｍＲＮＡ又はｍｈｍＲＮＡを分解から保護し、且つｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでの目的とする特異的標的細胞への５ｈｍＲＮＡ又はｍｈｍＲＮＡの送達を容易にした。
製造者の指示に従って、実施例２及び３で得られた分離したｍＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを、Ｉｎ－ＶｉｖｏＪｅｔＰＥＩトランスフェクション試薬などの適量の送達剤とよく混合して、目的に応じて動物の血脈又は筋肉に注射した。当該送達剤を所望の５ｈｍＲＮＡ又はｍｈｍＲＮＡと混合、結合（コンジュゲート）、カプセル化又は配合することにより、５ｈｍＲＮＡ又はｍｈｍＲＮＡを分解から保護し、且つｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでの目的とする特異的標的細胞への５ｈｍＲＮＡ又はｍｈｍＲＮＡの送達を容易にした。
【0082】
７．統計分析
免疫染色、ウエスタンブロット及びノーザンブロットの分析について、７５％よりも大きいシグナル強度変化をいずれも陽性結果とみなし、これらの結果は、分析後、平均値±標準差（ｍｅａｎ±ＳＥ）で表す。データの統計分析は、一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）で行われた。主たる効果が有意である場合、ダネットの多重比較検定（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｐｏｓｔ－ｈｏｃ ｔｅｓｔ）は対照群と顕著な差異がある群（グループ）を識別するのに用いられる。２つの処理群の間を一対ごとに比較するために、両側スチューデントＴ検定（ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ ｔｅｓｔ）を使用した。２つ以上の治療群を含む実験については、ＡＮＯＶＡの後に、多重範囲検定（ｐｏｓｔ－ｈｏｃｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒａｎｇｅ ｔｅｓｔ）を実施した。ｐ＜０．０５の確率値は統計学的に有意であると考えた。全てのｐ値は両側試験にて決定した。
免疫染色、ウエスタンブロット及びノーザンブロットの分析について、７５％よりも大きいシグナル強度変化をいずれも陽性結果とみなし、これらの結果は、分析後、平均値±標準差（ｍｅａｎ±ＳＥ）で表す。データの統計分析は、一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）で行われた。主たる効果が有意である場合、ダネットの多重比較検定（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｐｏｓｔ－ｈｏｃ ｔｅｓｔ）は対照群と顕著な差異がある群（グループ）を識別するのに用いられる。２つの処理群の間を一対ごとに比較するために、両側スチューデントＴ検定（ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ ｔｅｓｔ）を使用した。２つ以上の治療群を含む実験については、ＡＮＯＶＡの後に、多重範囲検定（ｐｏｓｔ－ｈｏｃｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒａｎｇｅ ｔｅｓｔ）を実施した。ｐ＜０．０５の確率値は統計学的に有意であると考えた。全てのｐ値は両側試験にて決定した。
【0083】
［参考文献］
1.Ｌｉｎ Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇらによる米国特許第７，６６２，７９１号
2.Ｌｉｎ Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇらによる米国特許第８，０８０，６５２号
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4.Ｌｉｎ Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ及びＹｉｎｇ ＳＹによる米国特許第８，６０９，８３１号
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8.Ｌｉｎ Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇによる米国仮特許出願第６０／２９０，９０２号
9.Ｌｉｎ Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ及びＪｉ Ｈ；Ｒｅｐｌｉｃａｓｅ ｃｙｃｌｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ＷＯ２００２／０９２７７４
10.Ｌｉｎ Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ；Ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｂｒａｒｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ＲＮＡ－ＰＣＲ－ｄｅｒｉｖｅｄ ＲＮＡｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２２１：２８９－２９３，２００３．
11.Ｌｉｎ Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ ａｎｄ Ｊｉ Ｈ； ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｉｎ－ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２２１：９３－１０１，２００３．
12.ＭｃＤｏｗｅｌｌら．； Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｂｙ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｒａｔｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：８２２－８２５，１９９４．
13.Ｓｃｈｌａｋｅら．； Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｍＲＮＡ－Ｖａｃｃｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ． ＲＮＡ ｂｉｏｌｏｇｙ ９：１３１９－１３３０，２０１２．
14.Ｋｏら．； Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ ＲＮＡ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｌａｔｆｏｒｍ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｂｙ Ｖｉｒａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅｓ． Ｊ． Ｍｉｃｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２９：１２７－１４０，２０１９．
［配列表］
（１）一般情報：
（ｉｉｉ）配列の総数：２１
（２）配列番号１についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：６塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＲＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１：
ＡＡＵＡＡＡ ６
（２）配列番号２についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：７塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＲＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：２：
ＡＡＵＵＡＡＡ ７
（２）配列番号３についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：７３塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：ヘアピン
（ｉｉ）配列の種類：ＲＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号３：
ＧＣＵＣＣＣＵＵＣＡ ＡＣＵＵＵＡＡＣＡＵ ＧＧＡＡＧＵＧＣＵＵ ＵＣＵＧＵＧＡＣＵＵ ＵＡＡＡＡＧＵＡＡＧ ＵＧＣＵＵＣＣＡＵＧ ＵＵＵＵＡＧＵＡＧＧ ＡＧＵ ７３
（２）配列番号４についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：６８塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：ヘアピン
（ｉｉ）配列の種類：ＲＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号４：
ＣＣＵＵＵＧＣＵＵＵ ＡＡＣＡＵＧＧＧＧＧ ＵＡＣＣＵＧＣＵＧＵ ＧＵＧＡＡＡＣＡＡＡ ＡＧＵＡＡＧＵＧＣＵ ＵＣＣＡＵＧＵＵＵＣ ＡＧＵＧＧＡＧＧ ６８
（２）配列番号５についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：６９塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：ヘアピン
（ｉｉ）配列の種類：ＲＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：５：
ＣＣＡＣＣＡＣＵＵＡ ＡＡＣＧＵＧＧＡＵＧ ＵＡＣＵＵＧＣＵＵＵ ＧＡＡＡＣＵＡＡＡＧ ＡＡＧＵＡＡＧＵＧＣ ＵＵＣＣＡＵＧＵＵＵ ＵＧＧＵＧＡＵＧＧ ６９
（２）配列番号６についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：６８塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：ヘアピン
（ｉｉ）配列の種類：ＲＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：６：
ＣＣＵＣＵＡＣＵＵＵ ＡＡＣＡＵＧＧＡＧＧ ＣＡＣＵＵＧＣＵＧＵ ＧＡＣＡＵＧＡＣＡＡ ＡＡＡＵＡＡＧＵＧＣ ＵＵＣＣＡＵＧＵＵＵ ＧＡＧＵＧＵＧＧ ６８
（２）配列番号７についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：４４塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：ステムループ
（ｉｉ）配列の種類：ＲＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：７：
ＣＵＧＵＧＵＧＧＣＵ ＧＵＣＡＣＵＣＧＧＣ ＵＧＣＡＵＧＣＵＵＡ ＧＵＧＣＡＣＵＣＡＣ ＧＣＡＧ ４４
（２）配列番号８についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：６５塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：ステムループ
（ｉｉ）配列の種類：ＲＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：８：
ＣＵＧＵＧＵＧＧＣＵ ＧＵＣＡＣＵＣＧＧＣ ＵＧＣＡＵＧＣＵＵＡ ＧＵＧＣＡＣＵＣＡＣ ＧＣＡＧＵＡＵＡＡＵ ＵＡＡＵＡＡＣＵＡＡ ＵＵＡＣＵ ６５
（２）配列番号９についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：１４７塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：ステムループ
（ｉｉ）配列の種類：ＲＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：９：
ＧＵＣＧＵＵＧＡＣＡ ＧＧＡＣＡＣＧＡＧＵ ＡＡＣＵＣＧＵＣＵＡ ＵＣＵＵＣＵＧＣＡＧ ＧＣＵＧＣＵＵＡＣＧ ＧＵＵＵＣＧＵＣＣＧ ＵＧＵＵＧＣＡＧＣＣ ＧＡＵＣＡＵＣＡＧＣ ＡＣＡＵＣＵＡＧＧＵ ＵＵＣＧＵＣＣＧＧＧ ＵＧＵＧＡＣＣＧＡＡ ＡＧＧＵＡＡＧＡＵＧ ＧＡＧＡＧＣＣＵＵＧ ＵＣＣＣＵＧＧＵＵＵ ＣＡＡＣＧＡＧ １４７
（２）配列番号１０についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：８８塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：ステムループ
（ｉｉ）配列の種類：ＲＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１０：
ＡＡＵＵＡＵＡＡＡＵ ＵＡＣＣＡＧＡＵＧＡ ＵＵＵＵＡＣＡＧＧＣ ＵＧＣＧＵＵＡＵＡＧ ＣＵＵＧＧＡＡＵＵＣ ＵＡＡＣＡＡＵＣＵＵ ＧＡＵＵＣＵＡＡＧＧ ＵＵＧＧＵＧＧＵＡＡ ＵＵＡＵＡＡＵＵ ８８
（２）配列番号１１についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：１２９塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：複数のステムループ
（ｉｉ）配列の種類：ＲＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１１：
ＣＡＣＡＡＡＵＡＵＵ ＡＣＣＡＧＡＵＣＣＡ ＵＣＡＡＡＡＣＣＡＡ ＧＣＡＡＧＡＧＧＵＣ ＡＵＵＵＡＵＵＧＡＡ ＧＡＵＣＵＡＣＵＵＵ ＵＣＡＡＣＡＡＡＧＵ ＧＡＣＡＣＵＵＧＣＡ ＧＡＵＧＣＵＧＧＣＵ ＵＣＡＵＣＡＡＡＣＡ ＡＵＡＵＧＧＵＧＡＵ ＵＧＣＣＵＵＧＧＵＧ ＡＵＡＵＵＧＣＵＧ １２９
（２）配列番号１２についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：１８９塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：複数のステムループ
（ｉｉ）配列の種類：ＲＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１２：
ＧＣＡＡＡＡＡＵＧＵ ＧＡＵＣＵＵＧＣＵＵ ＧＵＡＡＡＵＡＣＡＡ ＵＵＵＵＧＡＧＡＧＧ ＵＵＡＡＵＡＡＡＵＵ ＡＣＡＡＧＵＡＧＵＧ ＣＵＡＵＵＵＵＵＧＵ ＡＵＵＵＡＧＧＵＵＡ ＧＣＵＡＵＵＵＡＧＣ ＵＵＵＡＣＧＵＵＣＣ ＡＧＧＡＵＧＣＣＵＡ ＧＵＧＧＣＡＧＣＣＣ ＣＡＣＡＡＵＡＵＣＣ ＡＧＧＡＡＧＣＣＣＵ ＣＵＣＵＧＣＧＧＵＵ ＵＵＵＣＡＧＡＵＵＣ ＧＵＵＡＧＵＣＧＡＡ ＡＡＡＣＣＵＡＡＧＡ ＡＡＵＵＵＡＡＵＧ １８９
（２）配列番号１３についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：２９４塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：複数のステムループ
（ｉｉ）配列の種類：ＲＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１３：
ＣＡＣＵＣＣＣＣＵＧ ＵＧＡＧＧＡＣＵＡＣ ＵＧＵＣＵＵＣＡＣＧ ＣＡＧＡＡＡＧＣＧＵ ＣＵＡＧＣＣＡＵＧＧ ＣＧＵＵＡＧＵＡＵＧ ＡＧＵＧＵＣＧＵＧＣ ＡＧＣＣＵＣＣＡＧＧ ＡＣＣＣＣＣＣＣＵＣ ＣＣＧＧＧＡＧＡＧＣ ＣＡＵＡＧＵＧＧＵＣ ＵＧＣＧＧＡＡＣＣＧ ＧＵＧＡＧＵＡＣＡＣ ＣＧＧＡＡＵＵＧＣＣ ＡＧＧＡＣＧＡＣＣＧ ＧＧＵＣＣＵＵＵＣＵ ＵＧＧＡＵＣＡＡＣＣ ＣＧＣＵＣＡＡＵＧＣ ＣＵＧＧＡＧＡＵＵＵ ＧＧＧＣＧＵＧＣＣＣ ＣＣＧＣＧＡＧＡＣＵ ＧＣＵＡＧＣＣＧＡＧ ＵＡＧＵＧＵＵＧＧＧ ＵＣＧＣＧＡＡＡＧＧ ＣＣＵＵＧＵＧＧＵＡ ＣＵＧＣＣＵＧＡＵＧ ＧＧＵＧＣＵＵＧＣＧ ＡＧＵＧＣＣＣＣＧＧ ＧＡＧＧＵＣＵＣＧＵ ＡＧＡＣ ２９４
（２）配列番号１４についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：５５塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：ステムループ
（ｉｉ）配列の種類：ＲＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１４：
ＧＧＡＣＡＣＧＡＧＵ ＡＡＣＵＣＧＵＣＵＡ ＵＣＵＵＣＵＧＣＡＧ ＧＣＵＧＣＵＵＡＣＧ ＧＵＵＵＣＧＵＣＣＧ ＵＧＵＵＧ ５５
（２）配列番号１５についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：５２塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：ステムループ
（ｉｉ）配列の種類：ＲＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１５：
ＣＡＧＣＣＧＡＵＣＡ ＵＣＡＧＣＡＣＡＵＣ ＵＡＧＧＵＵＵＵＧＵ ＣＣＧＧＧＵＧＵＧＡ ＣＣＧＡＡＡＧＧＵＡ ＡＧ ５２
（２）配列番号１６についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：２３塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＹＥＳ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１６：
ＣＡＧＴＴＣＣＡＡＴ ＴＧＴＧＡＡＧＡＴＴ ＣＴＣ ２３
（２）配列番号１７についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：２０塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＹＥＳ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１７：
ＣＴＴＧＡＴＧＡＣＧ ＴＴＣＴＣＡＧＴＧＣ ２０
（２）配列番号１８についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：４８塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１８：
ＧＡＴＡＴＣＴＡＡＴ ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ ＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧ ＧＴＡＴＧＧＴＡＣＴ ＴＧＧＴＡＧＴＴ ４８
（２）配列番号１９についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：５３塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１９：
ＧＡＴＡＴＣＴＡＡＴ ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ ＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣ ＴＡＧＴＧＡＴＧＴＴ ＣＴＴＧＴＴＡＡＣＡ ＡＣＴ ５３
（２）配列番号２０についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：４８塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：２０：
ＧＡＴＡＴＣＴＡＡＴ ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ ＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧ ＧＴＡＴＧＧＴＡＣＴ ＴＧＧＴＡＧＴＴ ４８
（２）配列番号２１についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：２５塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：２１：
ＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡ ＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ ＧＧＡＧＡ ２５
1.Ｌｉｎ Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇらによる米国特許第７，６６２，７９１号
2.Ｌｉｎ Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇらによる米国特許第８，０８０，６５２号
3.Ｙｉｎｇ ＳＹ及びＬｉｎ Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇによる米国特許第８，３７２，９６９号
4.Ｌｉｎ Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ及びＹｉｎｇ ＳＹによる米国特許第８，６０９，８３１号
5.Ｌｉｎ Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇらによる米国特許第９，６３７，７４７号
6.Ｌｉｎ Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇらによる米国特許第９，７８３，８１１号
7.Ｌｉｎ Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇによる米国仮特許出願第６０／２２２，４７９号
8.Ｌｉｎ Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇによる米国仮特許出願第６０／２９０，９０２号
9.Ｌｉｎ Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ及びＪｉ Ｈ；Ｒｅｐｌｉｃａｓｅ ｃｙｃｌｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ＷＯ２００２／０９２７７４
10.Ｌｉｎ Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ；Ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｂｒａｒｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ＲＮＡ－ＰＣＲ－ｄｅｒｉｖｅｄ ＲＮＡｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２２１：２８９－２９３，２００３．
11.Ｌｉｎ Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ ａｎｄ Ｊｉ Ｈ； ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｉｎ－ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２２１：９３－１０１，２００３．
12.ＭｃＤｏｗｅｌｌら．； Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｂｙ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｒａｔｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：８２２－８２５，１９９４．
13.Ｓｃｈｌａｋｅら．； Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｍＲＮＡ－Ｖａｃｃｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ． ＲＮＡ ｂｉｏｌｏｇｙ ９：１３１９－１３３０，２０１２．
14.Ｋｏら．； Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ ＲＮＡ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｌａｔｆｏｒｍ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｂｙ Ｖｉｒａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅｓ． Ｊ． Ｍｉｃｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２９：１２７－１４０，２０１９．
［配列表］
（１）一般情報：
（ｉｉｉ）配列の総数：２１
（２）配列番号１についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：６塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＲＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１：
ＡＡＵＡＡＡ ６
（２）配列番号２についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：７塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＲＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：２：
ＡＡＵＵＡＡＡ ７
（２）配列番号３についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：７３塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：ヘアピン
（ｉｉ）配列の種類：ＲＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号３：
ＧＣＵＣＣＣＵＵＣＡ ＡＣＵＵＵＡＡＣＡＵ ＧＧＡＡＧＵＧＣＵＵ ＵＣＵＧＵＧＡＣＵＵ ＵＡＡＡＡＧＵＡＡＧ ＵＧＣＵＵＣＣＡＵＧ ＵＵＵＵＡＧＵＡＧＧ ＡＧＵ ７３
（２）配列番号４についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：６８塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：ヘアピン
（ｉｉ）配列の種類：ＲＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号４：
ＣＣＵＵＵＧＣＵＵＵ ＡＡＣＡＵＧＧＧＧＧ ＵＡＣＣＵＧＣＵＧＵ ＧＵＧＡＡＡＣＡＡＡ ＡＧＵＡＡＧＵＧＣＵ ＵＣＣＡＵＧＵＵＵＣ ＡＧＵＧＧＡＧＧ ６８
（２）配列番号５についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：６９塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：ヘアピン
（ｉｉ）配列の種類：ＲＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：５：
ＣＣＡＣＣＡＣＵＵＡ ＡＡＣＧＵＧＧＡＵＧ ＵＡＣＵＵＧＣＵＵＵ ＧＡＡＡＣＵＡＡＡＧ ＡＡＧＵＡＡＧＵＧＣ ＵＵＣＣＡＵＧＵＵＵ ＵＧＧＵＧＡＵＧＧ ６９
（２）配列番号６についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：６８塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：ヘアピン
（ｉｉ）配列の種類：ＲＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：６：
ＣＣＵＣＵＡＣＵＵＵ ＡＡＣＡＵＧＧＡＧＧ ＣＡＣＵＵＧＣＵＧＵ ＧＡＣＡＵＧＡＣＡＡ ＡＡＡＵＡＡＧＵＧＣ ＵＵＣＣＡＵＧＵＵＵ ＧＡＧＵＧＵＧＧ ６８
（２）配列番号７についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：４４塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：ステムループ
（ｉｉ）配列の種類：ＲＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：７：
ＣＵＧＵＧＵＧＧＣＵ ＧＵＣＡＣＵＣＧＧＣ ＵＧＣＡＵＧＣＵＵＡ ＧＵＧＣＡＣＵＣＡＣ ＧＣＡＧ ４４
（２）配列番号８についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：６５塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：ステムループ
（ｉｉ）配列の種類：ＲＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：８：
ＣＵＧＵＧＵＧＧＣＵ ＧＵＣＡＣＵＣＧＧＣ ＵＧＣＡＵＧＣＵＵＡ ＧＵＧＣＡＣＵＣＡＣ ＧＣＡＧＵＡＵＡＡＵ ＵＡＡＵＡＡＣＵＡＡ ＵＵＡＣＵ ６５
（２）配列番号９についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：１４７塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：ステムループ
（ｉｉ）配列の種類：ＲＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：９：
ＧＵＣＧＵＵＧＡＣＡ ＧＧＡＣＡＣＧＡＧＵ ＡＡＣＵＣＧＵＣＵＡ ＵＣＵＵＣＵＧＣＡＧ ＧＣＵＧＣＵＵＡＣＧ ＧＵＵＵＣＧＵＣＣＧ ＵＧＵＵＧＣＡＧＣＣ ＧＡＵＣＡＵＣＡＧＣ ＡＣＡＵＣＵＡＧＧＵ ＵＵＣＧＵＣＣＧＧＧ ＵＧＵＧＡＣＣＧＡＡ ＡＧＧＵＡＡＧＡＵＧ ＧＡＧＡＧＣＣＵＵＧ ＵＣＣＣＵＧＧＵＵＵ ＣＡＡＣＧＡＧ １４７
（２）配列番号１０についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：８８塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：ステムループ
（ｉｉ）配列の種類：ＲＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１０：
ＡＡＵＵＡＵＡＡＡＵ ＵＡＣＣＡＧＡＵＧＡ ＵＵＵＵＡＣＡＧＧＣ ＵＧＣＧＵＵＡＵＡＧ ＣＵＵＧＧＡＡＵＵＣ ＵＡＡＣＡＡＵＣＵＵ ＧＡＵＵＣＵＡＡＧＧ ＵＵＧＧＵＧＧＵＡＡ ＵＵＡＵＡＡＵＵ ８８
（２）配列番号１１についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：１２９塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：複数のステムループ
（ｉｉ）配列の種類：ＲＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１１：
ＣＡＣＡＡＡＵＡＵＵ ＡＣＣＡＧＡＵＣＣＡ ＵＣＡＡＡＡＣＣＡＡ ＧＣＡＡＧＡＧＧＵＣ ＡＵＵＵＡＵＵＧＡＡ ＧＡＵＣＵＡＣＵＵＵ ＵＣＡＡＣＡＡＡＧＵ ＧＡＣＡＣＵＵＧＣＡ ＧＡＵＧＣＵＧＧＣＵ ＵＣＡＵＣＡＡＡＣＡ ＡＵＡＵＧＧＵＧＡＵ ＵＧＣＣＵＵＧＧＵＧ ＡＵＡＵＵＧＣＵＧ １２９
（２）配列番号１２についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：１８９塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：複数のステムループ
（ｉｉ）配列の種類：ＲＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１２：
ＧＣＡＡＡＡＡＵＧＵ ＧＡＵＣＵＵＧＣＵＵ ＧＵＡＡＡＵＡＣＡＡ ＵＵＵＵＧＡＧＡＧＧ ＵＵＡＡＵＡＡＡＵＵ ＡＣＡＡＧＵＡＧＵＧ ＣＵＡＵＵＵＵＵＧＵ ＡＵＵＵＡＧＧＵＵＡ ＧＣＵＡＵＵＵＡＧＣ ＵＵＵＡＣＧＵＵＣＣ ＡＧＧＡＵＧＣＣＵＡ ＧＵＧＧＣＡＧＣＣＣ ＣＡＣＡＡＵＡＵＣＣ ＡＧＧＡＡＧＣＣＣＵ ＣＵＣＵＧＣＧＧＵＵ ＵＵＵＣＡＧＡＵＵＣ ＧＵＵＡＧＵＣＧＡＡ ＡＡＡＣＣＵＡＡＧＡ ＡＡＵＵＵＡＡＵＧ １８９
（２）配列番号１３についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：２９４塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：複数のステムループ
（ｉｉ）配列の種類：ＲＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１３：
ＣＡＣＵＣＣＣＣＵＧ ＵＧＡＧＧＡＣＵＡＣ ＵＧＵＣＵＵＣＡＣＧ ＣＡＧＡＡＡＧＣＧＵ ＣＵＡＧＣＣＡＵＧＧ ＣＧＵＵＡＧＵＡＵＧ ＡＧＵＧＵＣＧＵＧＣ ＡＧＣＣＵＣＣＡＧＧ ＡＣＣＣＣＣＣＣＵＣ ＣＣＧＧＧＡＧＡＧＣ ＣＡＵＡＧＵＧＧＵＣ ＵＧＣＧＧＡＡＣＣＧ ＧＵＧＡＧＵＡＣＡＣ ＣＧＧＡＡＵＵＧＣＣ ＡＧＧＡＣＧＡＣＣＧ ＧＧＵＣＣＵＵＵＣＵ ＵＧＧＡＵＣＡＡＣＣ ＣＧＣＵＣＡＡＵＧＣ ＣＵＧＧＡＧＡＵＵＵ ＧＧＧＣＧＵＧＣＣＣ ＣＣＧＣＧＡＧＡＣＵ ＧＣＵＡＧＣＣＧＡＧ ＵＡＧＵＧＵＵＧＧＧ ＵＣＧＣＧＡＡＡＧＧ ＣＣＵＵＧＵＧＧＵＡ ＣＵＧＣＣＵＧＡＵＧ ＧＧＵＧＣＵＵＧＣＧ ＡＧＵＧＣＣＣＣＧＧ ＧＡＧＧＵＣＵＣＧＵ ＡＧＡＣ ２９４
（２）配列番号１４についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：５５塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：ステムループ
（ｉｉ）配列の種類：ＲＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１４：
ＧＧＡＣＡＣＧＡＧＵ ＡＡＣＵＣＧＵＣＵＡ ＵＣＵＵＣＵＧＣＡＧ ＧＣＵＧＣＵＵＡＣＧ ＧＵＵＵＣＧＵＣＣＧ ＵＧＵＵＧ ５５
（２）配列番号１５についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：５２塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：ステムループ
（ｉｉ）配列の種類：ＲＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１５：
ＣＡＧＣＣＧＡＵＣＡ ＵＣＡＧＣＡＣＡＵＣ ＵＡＧＧＵＵＵＵＧＵ ＣＣＧＧＧＵＧＵＧＡ ＣＣＧＡＡＡＧＧＵＡ ＡＧ ５２
（２）配列番号１６についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：２３塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＹＥＳ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１６：
ＣＡＧＴＴＣＣＡＡＴ ＴＧＴＧＡＡＧＡＴＴ ＣＴＣ ２３
（２）配列番号１７についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：２０塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＹＥＳ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１７：
ＣＴＴＧＡＴＧＡＣＧ ＴＴＣＴＣＡＧＴＧＣ ２０
（２）配列番号１８についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：４８塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１８：
ＧＡＴＡＴＣＴＡＡＴ ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ ＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧ ＧＴＡＴＧＧＴＡＣＴ ＴＧＧＴＡＧＴＴ ４８
（２）配列番号１９についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：５３塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１９：
ＧＡＴＡＴＣＴＡＡＴ ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ ＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣ ＴＡＧＴＧＡＴＧＴＴ ＣＴＴＧＴＴＡＡＣＡ ＡＣＴ ５３
（２）配列番号２０についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：４８塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：２０：
ＧＡＴＡＴＣＴＡＡＴ ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ ＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧ ＧＴＡＴＧＧＴＡＣＴ ＴＧＧＴＡＧＴＴ ４８
（２）配列番号２１についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ：２５塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖型：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ
（Ａ）記載：／ｄｅｓｃ＝「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」
（ｉｉｉ）ハイポセティイカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：２１：
ＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡ ＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ ＧＧＡＧＡ ２５
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】
【外国語明細書】