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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023025003
(43)【公開日】2023-02-21
(54)【発明の名称】抗ＰＤ－Ｌ１抗体とその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20230214BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230214BHJP
C07K 16/30 20060101ALI20230214BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230214BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230214BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230214BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230214BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230214BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230214BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20230214BHJP
A61P 31/20 20060101ALI20230214BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20230214BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20230214BHJP
A61K 47/18 20170101ALI20230214BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20230214BHJP
A61P 31/18 20060101ALI20230214BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20230214BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C12N15/63 Z
C07K16/30
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K39/395 T
A61K39/395 U
A61K39/395 S
A61P35/00
A61P35/02
A61P31/20
A61P31/14
A61K9/08
A61K47/18
A61K47/26
A61P31/18
C12P21/08
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022178282
(22)【出願日】2022-11-07
(62)【分割の表示】P 2019556600の分割
【原出願日】2018-04-18
(31)【優先権主張番号】PCT/US2017/028206
(32)【優先日】2017-04-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】516268356
【氏名又は名称】アール－ファーム・オーバーシーズ・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】Ｒ－Ｐｈａｒｍ Ｏｖｅｒｓｅａｓ， Ｉｎｃ．
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100157956
【弁理士】
【氏名又は名称】稲井 史生
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(72)【発明者】
【氏名】ヤン・ラブロフスキー
(72)【発明者】
【氏名】シュイ・ティン
(72)【発明者】
【氏名】セルゲイ・バルバショフ
(72)【発明者】
【氏名】アレクセイ・レピク
(72)【発明者】
【氏名】ミハイル・サムソノフ
(72)【発明者】
【氏名】ヴァシリー・イグナティエフ
(72)【発明者】
【氏名】ショレーナ・アルチュアゼ
(57)【要約】 （修正有）
【課題】完全ヒト抗ＰＤ－Ｌ１抗体、およびヒトＰＤ－Ｌ１の活性の調節に関連する疾患の治療または予防に該抗体を適用する方法を提供する。
【解決手段】特定の構造を有する抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合部分を提供する。開示される完全ヒト抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、腫瘍成長を顕著に阻害する一方で、活性化Ｔ細胞に結合することによりＴ細胞の活性を高めることができる。開示される完全ヒト抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－Ｌ１関連のがんおよびその他の関連疾患の診断および治療に使用することができる。
【選択図】図１７
【解決手段】特定の構造を有する抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合部分を提供する。開示される完全ヒト抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、腫瘍成長を顕著に阻害する一方で、活性化Ｔ細胞に結合することによりＴ細胞の活性を高めることができる。開示される完全ヒト抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－Ｌ１関連のがんおよびその他の関連疾患の診断および治療に使用することができる。
【選択図】図１７
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（１）配列番号１、２および３にそれぞれ対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖、ならびに配列番号４、５および６にそれぞれ対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖；
（２）配列番号７、８および９にそれぞれ対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖、ならびに配列番号１０、１１および１２にそれぞれ対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖；
（３）配列番号１３、１４および１５にそれぞれ対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖、ならびに配列番号１６、１７および１８にそれぞれ対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖；
（４）配列番号１、２および１９にそれぞれ対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖、ならびに配列番号４、５および６にそれぞれ対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖；
（５）配列番号７、２０および９にそれぞれ対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖、ならびに配列番号１０、１１および１２にそれぞれ対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖；ならびに
（６）配列番号１３、１４および１５にそれぞれ対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖、ならびに配列番号２１、１７および１８にそれぞれ対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖
からなる群から選択されるポリペプチドの群を含む、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合部分。
（２）配列番号７、８および９にそれぞれ対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖、ならびに配列番号１０、１１および１２にそれぞれ対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖；
（３）配列番号１３、１４および１５にそれぞれ対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖、ならびに配列番号１６、１７および１８にそれぞれ対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖；
（４）配列番号１、２および１９にそれぞれ対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖、ならびに配列番号４、５および６にそれぞれ対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖；
（５）配列番号７、２０および９にそれぞれ対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖、ならびに配列番号１０、１１および１２にそれぞれ対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖；ならびに
（６）配列番号１３、１４および１５にそれぞれ対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖、ならびに配列番号２１、１７および１８にそれぞれ対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖
からなる群から選択されるポリペプチドの群を含む、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合部分。
【請求項2】
以下の中から選択される配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその対応する抗原結合部分：配列番号４７、４９、５１、５３もしくは５４、または前記配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％同一である配列。
【請求項3】
以下の中から選択される配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその対応する抗原結合部分：配列番号４８、５０、５２、５５もしくは５６、または前記配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一である配列。
【請求項4】
抗体全体、二重特異性抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２またはＦｖに対応する、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその対応する抗原結合部分。
【請求項5】
重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間に連結ペプチドをさらに含むｓｃＦｖである、請求項４に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその対応する抗原結合部分。
【請求項6】
前記連結ペプチドが配列番号６７の配列を含む、請求項５に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその対応する抗原結合部分。
【請求項7】
重鎖定常領域が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよびＩｇＡを含む群から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその対応する抗原結合部分。
【請求項8】
重鎖定常領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む群から選択される、請求項７に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその対応する抗原結合部分。
【請求項9】
軽鎖定常領域がκ領域またはλ領域である、請求項６～８のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその対応する抗原結合部分。
【請求項10】
抗体重鎖可変領域をコードすることができる核酸配列を含む核酸分子であって、前記抗体重鎖可変領域が、
（ｉ）配列番号１～３；
（ｉｉ）配列番号７～９；
（ｉｉｉ）配列番号１３～１５；
（ｉｖ）配列番号１、２および１９；ならびに
（ｖ）配列番号７、２０および９
からなる群から選択されるアミノ酸配列の群を含む、核酸分子。
（ｉ）配列番号１～３；
（ｉｉ）配列番号７～９；
（ｉｉｉ）配列番号１３～１５；
（ｉｖ）配列番号１、２および１９；ならびに
（ｖ）配列番号７、２０および９
からなる群から選択されるアミノ酸配列の群を含む、核酸分子。
【請求項11】
前記抗体重鎖可変領域が以下の中から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の核酸分子：配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、および配列番号５４。
【請求項12】
抗体軽鎖可変領域をコードすることができる核酸配列を含む核酸分子であって、前記抗体軽鎖可変領域が：
（ｉ）配列番号４～６；
（ｉｉ）配列番号１０～１２；
（ｉｉｉ）配列番号１６～１８；ならびに
（ｉｖ）配列番号２１、１７、および１８
からなる群から選択されるアミノ酸配列の群を含む、核酸分子。
（ｉ）配列番号４～６；
（ｉｉ）配列番号１０～１２；
（ｉｉｉ）配列番号１６～１８；ならびに
（ｉｖ）配列番号２１、１７、および１８
からなる群から選択されるアミノ酸配列の群を含む、核酸分子。
【請求項13】
前記抗体重鎖可変領域が以下の中から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の核酸分子：配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５５、配列番号５６。
【請求項14】
抗体重鎖可変領域をコードすることができる核酸配列を含む核酸分子を含むベクターであって、前記抗体重鎖可変領域が：
（ｉ）配列番号１～３；
（ｉｉ）配列番号７～９；
（ｉｉｉ）配列番号１３～１５；
（ｉｖ）配列番号１、２および１９；ならびに
（ｖ）配列番号７、２０および９
からなる群から選択されるアミノ酸配列の群を含む、ベクター。
（ｉ）配列番号１～３；
（ｉｉ）配列番号７～９；
（ｉｉｉ）配列番号１３～１５；
（ｉｖ）配列番号１、２および１９；ならびに
（ｖ）配列番号７、２０および９
からなる群から選択されるアミノ酸配列の群を含む、ベクター。
【請求項15】
抗体軽鎖可変領域をコードすることができる核酸配列を含む核酸分子をさらに含み、前記抗体軽鎖可変領域が：
（ｉ）配列番号４～６；
（ｉｉ）配列番号１０～１２；
（ｉｉｉ）配列番号１６～１８；ならびに
（ｉｖ）配列番号２１、１７、および１８
からなる群より選択されるアミノ酸配列の群を含む、請求項１４に記載のベクター。
（ｉ）配列番号４～６；
（ｉｉ）配列番号１０～１２；
（ｉｉｉ）配列番号１６～１８；ならびに
（ｉｖ）配列番号２１、１７、および１８
からなる群より選択されるアミノ酸配列の群を含む、請求項１４に記載のベクター。
【請求項16】
配列番号８５のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号８７のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体、または抗体の抗原結合部分。
【請求項17】
配列番号８５および配列番号８７からなる群から選択される配列を有するポリペプチドをコードすることができる核酸配列を含む核酸分子。
【請求項18】
配列番号８６または配列番号８８の配列を含む、請求項１７に記載の核酸分子。
【請求項19】
配列番号８５および配列番号８７からなる群から選択される配列を有するポリペプチドをコードすることができる核酸を含む宿主細胞。
【請求項20】
配列番号８５の重鎖および配列番号８７の軽鎖を有する抗体、または抗体の抗原結合部分；ならびに医薬的に許容される賦形剤またはアジュバントを含む組成物。
【請求項21】
約５．９のｐＨを有する、約２７５ｍＭのセリン、約１０ｍＭのヒスチジンを含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項22】
約５．８のｐＨを有する、約０．０５％のポリソルベート８０、約１％のＤ－マンニトール、約１２０ｍＭのＬ－プロリン、約１００ｍＭのＬ－セリン、約１０ｍＭのＬ－ヒスチジン－ＨＣｌを含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項23】
ヒトＰＤ－Ｌ１の活性の調節に関連する疾患を治療または予防する必要がある患者に配列番号８５の重鎖および配列番号８７の軽鎖を有する抗体、または抗体の抗原結合部分を含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、ヒトＰＤ－Ｌ１の活性の調節に関連する疾患または状態を治療または予防する方法。
【請求項24】
前記疾患が肺がん、卵巣がん、結腸がん、結腸直腸がん、メラノーマ、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、肝臓がん、リンパ腫、血液悪性腫瘍、頭頸部がん、神経膠腫、胃がん、鼻咽頭がん、喉頭がん、子宮頸がん、子宮がんまたは骨肉腫である、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記疾患がＨＢＶ、ＨＣＶまたはＨＩＶ感染である、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、生物医学の分野に関連し、完全ヒト抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその医薬的使用に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｔ細胞が外因性抗原に反応するとき、休止Ｔリンパ球に２つのシグナルを提供するために抗原提示細胞（ＡＰＣ）が必要である：最初のシグナルは、ＴＣＲの助けによりＴ細胞がＭＨＣ分子に結合した抗原ペプチドを認識する際に生成され、その後、抗原認識シグナルがＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介して伝達される；そして、第２の信号は一連の共刺激分子によって提供される；そして、このようにして、Ｔ細胞は正常に活性化されることがあり、その結果、正常な免疫応答が生じる。これらの共刺激分子は、２番目の信号によって生じる効果に応じて、正の共刺激分子または負の共刺激分子のいずれかに分類することができ、正および負の共刺激信号の調節と、前記信号間の相対バランスは、体全体の免疫反応を通じて重要な調節の役割を果たす。
【0003】
ＰＤ－１はＣＤ２８受容体ファミリーのメンバーであり、前記ファミリーにはＣＴＬＡ４、ＣＤ２８、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡもまた含まれる。このファミリーの最初のメンバーであるＣＤ２８およびＩＣＯＳは、モノクローナル抗体を加えたときに発見され、Ｔ細胞増殖の増加として観察された［Hutloff et al. (1999) Nature 397: 263-266; Hansen et al. (1980) Immunogenics 10: 247-260］。ＰＤ－１のリガンドにはＰＤ－Ｌ１とＰＤ－Ｌ２が含まれ、受容体がリガンドに結合するとＴ細胞の活性化と関連サイトカインの分泌を下方制御することが研究結果によりすでに示されている［Freeman et al. (2000) J Exp Med 192: 1027-34; Latchman et al. (2001) Nat Immunol 2: 261-8; Carter et al. (2002) Eur J Immunol 32: 634-43; Ohigashi, et al. (2005) Clin Cancer Res 11: 2947-53］。
【0004】
ＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１）は、Ｂ７ファミリーに属する細胞表面糖タンパク質であり、ＩｇＶおよびＩｇＣ様領域、膜貫通領域、細胞質尾部領域を含む。１９９９年に対応する遺伝子が最初に発見およびクローン化され［Dong H, et al. (1999) Nat Med 5: 1365-1369］、糖タンパク質自体がＴ細胞受容体ＰＤ－１と相互作用し、免疫応答の負の調節において重要な役割を果たすと判断された。Ｔ細胞で発現するＰＤ－１に作用することに加えて、ＰＤ－Ｌ１は、Ｔ細胞で発現する場合、ＡＰＣ上でＣＤ８０と相互作用して負のシグナルを伝達し、Ｔ細胞阻害剤として機能することができる。マクロファージ系細胞で発現することに加えて、ＰＤ－Ｌ１は正常なヒト組織においても低レベルで発現するが、糖タンパク質は、例えば肺がん、卵巣がん、結腸がんおよびメラノーマを含む特定の腫瘍細胞株で比較的高い発現を示す［Iwai et al. (2002) PNAS 99: 12293-7; Ohigashi, et al. (2005) Clin Cancer Res 11: 2947-53］。腫瘍細胞におけるＰＤ－Ｌ１の発現の増加がＴ細胞アポトーシスを上昇させ、それにより、腫瘍細胞が免疫応答を回避するのに重要な役割を果たすことが、研究結果により示唆されている。研究者は、ＰＤ－Ｌ１遺伝子をトランスフェクトしたＰ８１５腫瘍細胞株が特定のＣＴＬ溶解に対してインビトロで耐性を示すことがあり、マウスに接種するとき、前記細胞がより高い腫瘍形成性および侵襲性を示し得ることを発見した。これらの生物学的特性は、ＰＤ－Ｌ１をブロックすることで反転させることができる。ＰＤ－１ノックアウトマウスでは、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１経路がブロックされ、接種された腫瘍細胞は腫瘍を形成することができない［Dong H et al. (2002) Nat Med 8: 793-800］。
【0005】
高い親和性でＰＤ－Ｌ１に結合することができ、したがってＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の結合をブロックすることができる抗ＰＤ－Ｌ１抗体が依然として必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明の特定の態様において、スクリーニングおよび親和性成熟と組み合わせた酵母ディスプレイシステムを利用して、良好な特異性および比較的高い親和性および安定性を示す完全ヒト抗ＰＤ－Ｌ１抗体を得て、それにより本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明の第１の態様は、以下の１つから選択されるＣＤＲ領域の群を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合部分に関する：
（１）配列番号１～３にそれぞれ対応する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに配列番号４～６にそれぞれ対応する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％を超えて同一である配列；
（２）配列番号７～９にそれぞれ対応する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに配列番号１０～１２にそれぞれ対応する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％を超えて同一である配列；
（３）配列番号１３～１５にそれぞれ対応する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに配列番号１６～１８にそれぞれ対応する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％を超えて同一である配列；
（４）配列番号１、２および１９にそれぞれ対応する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに配列番号４～６にそれぞれ対応する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％を超えて同一である配列；
（５）配列番号７、２０および９にそれぞれ対応する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに配列番号１０～１２にそれぞれ対応する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％を超えて同一である配列；
（６）配列番号１３～１５にそれぞれ対応する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに配列番号２１、１７および１８にそれぞれ対応する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％を超えて同一である配列。
（１）配列番号１～３にそれぞれ対応する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに配列番号４～６にそれぞれ対応する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％を超えて同一である配列；
（２）配列番号７～９にそれぞれ対応する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに配列番号１０～１２にそれぞれ対応する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％を超えて同一である配列；
（３）配列番号１３～１５にそれぞれ対応する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに配列番号１６～１８にそれぞれ対応する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％を超えて同一である配列；
（４）配列番号１、２および１９にそれぞれ対応する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに配列番号４～６にそれぞれ対応する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％を超えて同一である配列；
（５）配列番号７、２０および９にそれぞれ対応する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに配列番号１０～１２にそれぞれ対応する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％を超えて同一である配列；
（６）配列番号１３～１５にそれぞれ対応する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに配列番号２１、１７および１８にそれぞれ対応する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％を超えて同一である配列。
【0008】
本発明の第１の態様により構成される抗ＰＤ－Ｌ１抗体または対応する抗原結合部分のいずれか１つは、以下の１つから選択される重鎖可変領域フレームワーク領域の群もまた含む：
１）配列番号２２～２５にそれぞれ対応するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％を超えて同一である配列；
２）配列番号３０～３３にそれぞれ対応するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％を超えて同一である配列；
３）配列番号３８～４１にそれぞれ対応するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％を超えて同一である配列；
４）配列番号３０～３３にそれぞれ対応するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％を超えて同一である配列。
１）配列番号２２～２５にそれぞれ対応するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％を超えて同一である配列；
２）配列番号３０～３３にそれぞれ対応するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％を超えて同一である配列；
３）配列番号３８～４１にそれぞれ対応するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％を超えて同一である配列；
４）配列番号３０～３３にそれぞれ対応するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％を超えて同一である配列。
【0009】
本発明の第１の態様により構成される抗ＰＤ－Ｌ１抗体または対応する抗原結合部分のいずれか１つは、以下の１つから選択される軽鎖可変領域フレームワーク領域の群もまた含む：
１）配列番号２６～２９にそれぞれ対応するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％を超えて同一である配列；
２）配列番号３０～３３にそれぞれ対応するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％を超えて同一である配列；
３）配列番号３８～４１にそれぞれ対応するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％を超えて同一である配列；
４）配列番号３０～３３にそれぞれ対応するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％を超えて同一である配列。
１）配列番号２６～２９にそれぞれ対応するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％を超えて同一である配列；
２）配列番号３０～３３にそれぞれ対応するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％を超えて同一である配列；
３）配列番号３８～４１にそれぞれ対応するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％を超えて同一である配列；
４）配列番号３０～３３にそれぞれ対応するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％を超えて同一である配列。
【0010】
本発明の第１の態様により構成される抗ＰＤ－Ｌ１抗体または対応する抗原結合部分のいずれか１つは、以下の１つから選択される重鎖可変領域の群を含む：
１）配列番号４７、４９、５１、５３もしくは５４に対応する配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％同一である配列。
１）配列番号４７、４９、５１、５３もしくは５４に対応する配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％同一である配列。
【0011】
本発明の第１の態様により構成される抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその対応する抗原結合部分のいずれか１つは、以下から選択される軽鎖可変領域の群を含む：
１）配列番号４８、５０、５２、５５もしくは５６に対応する配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％同一である配列。
１）配列番号４８、５０、５２、５５もしくは５６に対応する配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％同一である配列。
【0012】
本発明の第１の態様により構成される抗ＰＤ－Ｌ１抗体または対応する抗原結合部分のいずれか１つは、抗体全体、二重特異性抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２またはＦｖに対応する。
【0013】
本発明のいずれの例においても、本発明がｓｃＦｖにより構成される場合、連結ペプチドもまた、前述の抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合部分の重鎖および軽鎖可変領域の間に含まれる。
【0014】
本発明のいくつかの特定の例において、前述の連結ペプチドの配列は、配列番号６７に示される通りである。
【0015】
本発明の第１の態様により構成される抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその対応する抗原結合部分のいずれか１つの例は、抗体全体に対応する。
【0016】
重鎖定常領域が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよびＩｇＡを含む群から選択される、本発明の第１の態様によって構成される抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその対応する抗原結合部分のいずれか１つの例。
【0017】
本発明の特定の例において、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む群から選択される。
【0018】
本発明の特定の例において、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１に対応する。
【0019】
本発明の特定の例において、ＩｇＧ１アミノ酸配列は配列番号６８に示される通りである。
【0020】
軽鎖定常領域がκ領域またはλ領域である、本発明の第１の態様によって構成される抗ＰＤ－Ｌ１抗体または対応する抗原結合部分のいずれか１つ。
【0021】
本発明の特定の例において、κ軽鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号７０に示される通りである。
【0022】
本発明の特定の例において、λ軽鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号７２に示される通りである。
【0023】
本発明の第２の態様は、抗体重鎖可変領域をコードする核酸配列を含む核酸分子に関し、ここで、前述の抗体重鎖可変領域は、以下から選択されるアミノ酸配列の群を含む：
（ｉ）配列番号１～３；
（ｉｉ）配列番号７～９；
（ｉｉｉ）配列番号１３～１５；
（ｉｖ）配列番号１、２および１９；
（ｖ）配列番号７、２０および９；
（ｉ）配列番号１～３；
（ｉｉ）配列番号７～９；
（ｉｉｉ）配列番号１３～１５；
（ｉｖ）配列番号１、２および１９；
（ｖ）配列番号７、２０および９；
【0024】
本発明の第２の態様によって構成される核酸分子のいずれか１つであって、前述の抗体重鎖可変領域は、以下から選択される核酸配列の群を含む：配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５４、または前述の配列の１つのフレーム領域に含まれるアミノ酸の１つまたはいくつかを置換することによって作成される配列。
【0025】
本発明のいくつかの例において、前述の核酸は、配列番号５７～６１に示されるものから選択される配列を含む。
【0026】
本発明のいくつかの例において、前述の核酸は、抗体重鎖定常領域をコードする核酸配列もまた含み、前記重鎖定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよびＩｇＡを含む群から選択される。
【0027】
本発明のいくつかの例において、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む群から選択される。
【0028】
本発明の特定の例において、重鎖定常領域はＩｇＧ１に対応する。
【0029】
本発明の特定の例において、ＩｇＧ１核酸配列は配列番号６９に示される通りである。
【0030】
本発明の第３の態様は、抗体軽鎖可変領域をコードすることができる核酸配列を含む核酸分子に関し、ここで、前述の抗体軽鎖可変領域は、以下から選択されるアミノ酸配列の群を含む：
（ｉ）配列番号４～６；
（ｉｉ）配列番号１０～１２；
（ｉｉｉ）配列番号１６～１８；
（ｉｖ）配列番号２１、１７および１８。
（ｉ）配列番号４～６；
（ｉｉ）配列番号１０～１２；
（ｉｉｉ）配列番号１６～１８；
（ｉｖ）配列番号２１、１７および１８。
【0031】
本発明の第３の態様により構成される核酸分子のいずれか１つであって、前述の抗体軽鎖可変領域は、以下から選択される核酸配列の群を含む：配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５５、配列番号５６、または前述の配列の１つのフレーム領域に含まれるアミノ酸の１つまたはいくつかを置換することによって作成された配列。
【0032】
本発明のいくつかの態様において、前述の核酸は、配列番号６２～６６に示されるものから選択される配列を含む。
【0033】
本発明のいくつかの態様において、前述の核酸は、抗体軽鎖定常領域をコードすることができる核酸配列も含み、ここで、前記軽鎖定常領域は、κ領域またはλ領域である。
【0034】
本発明の特定の態様において、κ軽鎖定常領域の核酸配列は配列番号７０に示される通りである。
【0035】
本発明の特定の態様において、λ軽鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号７２に示される通りである。
【0036】
本発明の第４の態様は、本発明の第２または第３の態様により構成される核酸のいずれか１つを含むベクターに関する。
【0037】
本発明の第４の態様により構成されるベクターのいずれかは、本発明の第２の態様により構成される核酸のいずれか１つと、本発明の第３の態様により構成される核酸のいずれか１つを含む。
【0038】
本発明の第５の態様は、本発明の第２または第３の態様により構成される核酸のいずれか１つ、または本発明の第４の態様により構成されるベクターのいずれか１つを含む宿主細胞に関する。
【0039】
本発明の第６の態様は、本発明の第１の態様により構成される抗ＰＤ－Ｌ１抗体または対応する抗原結合部分のいずれか１つ、ならびに他の生物活性物質を含むコンジュゲートに関し、ここで、前述の抗ＰＤ－Ｌ１抗体または対応する抗原結合部分は、直接または連結断片を介して、別の生物活性物質にコンジュゲートされている。
【0040】
本発明のいくつかの態様では、前述のさらなる生物活性物質は、化学物質、毒素、ポリペプチド、酵素、同位体、サイトカインまたは直接もしくは間接的に細胞の増殖を阻害することができるかもしくは細胞を殺傷することができるか、そうでなければ細胞をアウリスタチンＭＭＡＥ（Ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ ＭＭＡＥ）、アウリスタチンＭＭＡＦ（Ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ ＭＭＡＦ）、メイタンシンＤＭ１（Ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ ＤＭ１）、メイタンシンＤＭ４（Ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ ＤＭ４）、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、デュオカルマイシンＭＧＢＡ（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ ＭＧＢＡ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、リシン、ジフテリア毒素およびその他の関連毒素、Ｉ１３１、インターロイキン、腫瘍壊死因子、ケモカイン、ナノ粒子などの免疫応答の活性化を介して阻害もしくは殺傷することができる他の個々の生物活性物質またはそれらの混合物を含む群から選択される。
【0041】
本発明の第７の態様は、本発明の第１の態様により構成される抗ＰＤ－Ｌ１抗体または対応する抗原結合部分のいずれか１つ、本発明の第２または第３の態様により構成される核酸のいずれか１つ、本発明の第４の態様により構成されるベクターのいずれか１つ、本発明の第５の態様により構成される宿主細胞のいずれか１つ、または本発明の第６の態様により構成されるコンジュゲートのいずれか１つ、ならびに任意の医薬的に許容されるベクターまたは賦形剤および任意の他の生物活性物質を含む組成物（医薬組成物など）に関する。
【0042】
本発明の第７の態様により構成される組成物のいずれか１つ（医薬組成物など）、前述のさらなる生物活性物質には、他の抗体、融合タンパク質または薬物（例えば、化学療法薬および放射線療法薬のような抗がん剤）が含まれるが、これらに限定されない。
【0043】
本発明はさらに、本発明の第１の態様により構成される抗ＰＤ－Ｌ１抗体または対応する抗原結合部分のいずれか１つを含む試薬または試薬キットに関し、前述の検出試薬または試薬キットは、ＰＤ－Ｌ１タンパク質またはその誘導体の有無を検出するために使用される。
【0044】
本発明はさらに、本発明の第１の態様により構成される抗ＰＤ－Ｌ１抗体または対応する抗原結合部分のいずれか１つを含む診断試薬または試薬キットに関し、ここで、前述の診断試薬または試薬キットはインビトロ（細胞や組織など）またはインビボ（ヒトやモデル動物など）でのＰＤ－Ｌ１関連疾患（例えば、高いＰＤ－Ｌ１発現を示すウイルス感染や、または高いＰＤ－Ｌ１発現を示す腫瘍の場合のような、腫瘍またはウイルス感染）の診断において使用される。
【0045】
本発明のいくつかの態様において、前述の抗ＰＤ－Ｌ１抗体または対応する抗原結合部分は、検出に使用することができるか、または別の試薬で検出することができる蛍光色素、化学物質、ポリペプチド、酵素、同位体、標識などにさらに結合される。
【0046】
本発明のいくつかの態様において、前述の腫瘍には、肺がん、卵巣がん、結腸がん、結腸直腸がん、メラノーマ、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、肝臓がん、リンパ腫、血液悪性腫瘍、頭頸部がん、神経膠腫、胃がん、鼻咽頭がん、喉頭がん、子宮頸がん、子宮がん、骨肉腫、甲状腺がん、前立腺がんが含まれるが、これらに限定されない。
【0047】
本発明のいくつかの態様において、前述のウイルス感染には、急性、亜急性または慢性のＨＢＶ、ＨＣＶまたはＨＩＶ感染が含まれるが、これらに限定されない。
【0048】
本発明はさらに、本発明の第１の態様によって構成される抗ＰＤ－Ｌ１抗体または対応する抗原結合部分のいずれか１つ、第２または第３の態様によって構成される核酸のいずれか１つ、本発明の第４の態様により構成されるベクターのいずれか１つ、本発明の第５の態様により構成される宿主細胞のいずれか１つ、本発明の第６の態様により構成されるコンジュゲートのいずれか１つ、または本発明の第７の態様によって構成される組成物のいずれか１つを使用して、ＰＤ－Ｌ１関連疾患（例えば、高いＰＤ－Ｌ１発現を示すウイルス感染や、または高いＰＤ－Ｌ１発現を示す腫瘍の場合のような、腫瘍またはウイルス感染）の予防または治療に使用される薬物を調製する用途に関する。
【0049】
本発明の特定の態様において、前述の腫瘍は、高レベルのＰＤ－Ｌ１発現を示す腫瘍などのＰＤ－Ｌ１関連腫瘍を指す。
【0050】
本発明の特定の態様において、前述の腫瘍には、肺がん、卵巣がん、結腸がん、結腸直腸がん、メラノーマ、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、肝臓がん、リンパ腫、血液悪性腫瘍、頭頸部がん、神経膠腫、胃がん、鼻咽頭がん、喉頭がん、子宮頸がん、子宮がん、骨肉腫、甲状腺がん、前立腺がんが含まれるが、これらに限定されない。
【0051】
本発明のいくつかの態様において、前述のウイルス感染には、急性、亜急性または慢性のＨＢＶ、ＨＣＶまたはＨＩＶ感染が含まれるが、これらに限定されない。
【0052】
本発明はさらに、本発明の第１の態様により構成される抗ＰＤ－Ｌ１抗体または対応する抗原結合部分のいずれか１つを使用して、ＰＤ－Ｌ１関連疾患（例えば、高いＰＤ－Ｌ１発現を示すウイルス感染や、または高いＰＤ－Ｌ１発現を示す腫瘍の場合のような、腫瘍またはウイルス感染）の診断のための試薬または試薬キットを調製する用途に関する。
【0053】
本発明のいくつかの態様において、前述の腫瘍は、高レベルのＰＤ－Ｌ１発現を示す腫瘍などのＰＤ－Ｌ１関連腫瘍を指す。
【0054】
本発明の特定の態様において、前述の腫瘍には、肺がん、卵巣がん、結腸がん、結腸直腸がん、メラノーマ、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、肝臓がん、リンパ腫、血液悪性腫瘍、頭頸部がん、神経膠腫、胃がん、鼻咽頭がん、喉頭がん、子宮頸がん、子宮がん、骨肉腫、甲状腺がん、前立腺がんが含まれるが、これらに限定されない。
【0055】
本発明のいくつかの態様において、前述のウイルス感染には、急性、亜急性または慢性のＨＢＶ、ＨＣＶまたはＨＩＶ感染が含まれるが、これらに限定されない。
【0056】
本発明のいくつかの態様において、前述の抗ＰＤ－Ｌ１抗体または対応する抗原結合部分は、検出に使用することができるか、または別の試薬で検出することができる蛍光色素、化学物質、ポリペプチド、酵素、同位体、標識などにさらに結合される。
【0057】
本発明はさらに、本発明の第１の態様により構成される抗ＰＤ－Ｌ１抗体または対応する抗原結合部分のいずれか１つを使用して、ＣＤ８０関連疾患の予防または治療のための薬物を調製する用途に関する。
【0058】
本発明の文脈において、上記で言及したＣＤ８０関連疾患には、高いＣＤ８０発現に関連する疾患が含まれる。
【0059】
本発明はさらに、ＰＤ－Ｌ１関連疾患（例えば、高いＰＤ－Ｌ１発現を示すウイルス感染や、または高いＰＤ－Ｌ１発現を示す腫瘍の場合のような、腫瘍またはウイルス感染）を予防または治療するために使用される方法に関し、前述の方法は、任意選択の放射線療法（Ｘ線照射など）の投与と組み合わせた、有効な予防または治療用量の本発明の第１の態様により構成される抗ＰＤ－Ｌ１抗体または対応する抗原結合部分のいずれか１つ、本発明の第２または第３の態様により構成される核酸のいずれか１つ、本発明の第４の態様により構成されるベクターのいずれか１つ、本発明の第５の態様により構成される宿主細胞のいずれか１つ、本発明の第６の態様により構成されるコンジュゲートのいずれか１つ、または本発明の第７の態様によって構成される組成物のいずれか１つを対象に与えることを含む。
【0060】
本発明のいくつかの態様において、前述の腫瘍は、高レベルのＰＤ－Ｌ１発現を示す腫瘍などのＰＤ－Ｌ１関連腫瘍を指す。
【0061】
本発明の特定の態様において、前述の腫瘍には、肺がん、卵巣がん、結腸がん、結腸直腸がん、メラノーマ、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、肝臓がん、リンパ腫、血液悪性腫瘍、頭頸部がん、神経膠腫、胃がん、鼻咽頭がん、喉頭がん、子宮頸がん、子宮がん、骨肉腫、甲状腺がん、前立腺がんが含まれるが、これらに限定されない。
【0062】
本発明のいくつかの態様において、前述のウイルス感染には、急性、亜急性または慢性のＨＢＶ、ＨＣＶまたはＨＩＶ感染が含まれるが、これらに限定されない。
【0063】
本発明はさらに、有効な予防または治療用量の本発明の第１の態様により構成される抗ＰＤ－Ｌ１抗体または対応する抗原結合部分のいずれか１つを対象に与えることを含む、ＣＤ８０関連疾患を予防または治療するために使用される方法に関する。
【0064】
本発明の文脈において、上記で言及したＣＤ８０関連疾患には、高いＣＤ８０発現に関連する疾患が含まれる。
【0065】
本発明は以下の本文でさらに記載される。
【0066】
本発明の文脈において、特に示さない限り、本文で使用される科学技術用語は、当業者により理解されるようなそれぞれの共通の意味に対応するものとする。さらに、タンパク質および核酸化学、分子生物学、細胞および組織培養、微生物学および免疫学関連の用語、ならびに本文で使用される実験室手順はすべて、それぞれの分野で広く採用されている用語および標準手順に対応する。しかしながら、関連用語の定義および説明を以下に提供して、本発明をさらに明確にする。
【0067】
本発明の文脈において、「抗体」という用語は、通常２対の同一ポリペプチド鎖［各対は１つの「軽」（Ｌ）鎖と１つの「重」（Ｈ）鎖を有する］からなる免疫グロブリン分子を指す。抗体の軽鎖は、κまたはλ軽鎖のいずれかに分類されることがある。重鎖は、μ、δ、γ、α、またはεのいずれかに分類することができ、それぞれの対応する抗体アイソタイプは、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして定義される。軽鎖と重鎖については、可変領域と定常領域はおよそ１２以上のアミノ酸「Ｊ」領域で接続される一方で、重鎖はおよそ３以上のアミノ酸「Ｄ」領域もまた含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖定常領域（ＣＨ）で構成されている。重鎖定常領域は、３つの構造ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）で構成されている。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成されている。軽鎖定常領域は、１つの構造ドメイン（ＣＬ）で構成されている。抗体の定常領域は、免疫系のさまざまな細胞（エフェクター細胞など）および古典的な補体系（Ｃ１ｑ）の第１のコンポーネントを含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）として知られる、より保存された領域で散在された、ばらつきの大きい領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）として知られる）にさらに細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４の順序で配置されている。各重鎖／軽鎖ペアの可変領域（ＶＨおよびＶＬ）は、それぞれ抗体の各結合部位を形成する。各領域または構造ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest［National Institutes of Health, Bethesda, Md (1987 and 1991)］またはChothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917およびChothia et al. (1989) Nature 342: 878-883により与えられた定義に従う。「抗体」という用語は、抗体を産生するために使用される方法に関して特定の制限を受けない。例えば、それには、特には組換え抗体、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体が含まれる。抗体は、例えばＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体を含む、異なるアイソタイプの抗体であり得る。
【0068】
本発明の文脈において、抗体の「抗原結合部分」とは、抗体の全長に沿った１つまたは複数の部分を指し、ここで、前記部分は、抗体が結合する同じ抗原（例えば、ＰＤ－Ｌ１）に結合する能力を維持し、インタクトな抗体と競合して、所与の抗原に特異的に結合する。一般的には、全文の引用を介してすべての目的について本明細書に組み込まれるFundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd edition, Raven Press, NY (1989)を参照されたい。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術または全体の抗体の酵素または化学的分解によって生成することができる。いくつかの例において、抗原結合部分には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ダイアボディおよび類似のポリペプチドが含まれ、これらは、ポリペプチド特異的抗原結合能力を付与することができる抗体の少なくとも一部を含む。
【0069】
本発明の文脈において、「Ｆｄ断片」という用語は、ＶＨおよびＣＨ１構造ドメインからなる抗体断片を指す；「Ｆｖ断片」という用語は、抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨ構造ドメインからなる抗体断片を指す；「ｄＡｂ断片」という用語は、ＶＨ構造ドメインから構成される抗体断片を指す［Ward et al., Nature 341: 544-546 (1989)］；「Ｆａｂ断片」という用語は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１構造ドメインから構成される抗体断片を指す；ならびに「Ｆ（ａｂ’）２断片」という用語は、ヒンジ領域のジスルフィド架橋を介して接続された２つのＦａｂ断片を含む抗体断片を指す。
【0070】
いくつかの場合において、抗体の抗原結合部分は単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）であり、ＶＬおよびＶＨ構造ドメインは、単一ポリペプチド鎖リンカーとして生成させることによりペアリングを介して一価分子を形成する［例えば、Bird et al., Science 242: 423-426 (1988) および Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988)を参照されたい］。そのようなｓｃＦｖ分子は、ＮＨ２－ＶＬ－コネクタ－ＶＨ－ＣＯＯＨまたはＮＨ２－ＶＨ－コネクタ－ＶＬ－ＣＯＯＨの一般構造を持つことができる。適切な従来のコネクタ（連結ペプチド）は、ＧＧＧＧＳアミノ酸配列の繰り返しまたはその変異体で構成されている。例えば、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）４を持つコネクタが使用できるが、変異体もまた使用できる［Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448］ 。本発明に使用することができる他のコネクタは、Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8: 725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31: 94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56: 3055-3061, Kipriyanov et al. (1999) , J. Mol. Biol. 293: 41-56 and Roovers et al. (2001) , Cancer Immunolに記載されている。本発明の一態様において、前述の連結ペプチドの配列は（ＧＧＧＧＳ）３である。
【0071】
いくつかの例において、抗体は、２つの異なる種類の抗原もしくは抗原エピトープにそれぞれ結合することができる二重特異性抗体によって構成され、一次抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖、またはその抗原結合部分、ならびに二次抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖、またはその抗原結合部分を含む。本発明のいくつかの態様において、前述の二重特異性抗体に含まれる一次抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖、またはその抗原結合部分は、本発明により構成される抗体または対応する抗原結合部分のいずれか１つに対応し得、前述の二重特異性抗体に含まれる二次抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖、またはその抗原結合部分は、異なる抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくは対応する抗原結合部分、または異なる抗原を標的とする抗体もしくは対応する抗原結合部分に対応し得る。
【0072】
いくつかの場合において、抗体はダイアボディ、すなわち二価抗体に対応し、ここで、ＶＨおよびＶＬ構造ドメインが単一のポリペプチド鎖で発現されるが、使用されるリンカーが短すぎるため、同じ鎖上の２つの構造ドメイン間でペアリングができず、そのことにより、構造ドメインを別の鎖の相補構造ドメインと強制的にペアリングさせ、２つの抗原結合部位が生じる［例えば、Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993), およびPoljak R.J. et al., Structure 2: 1121-1123 (1994)を参照されたい］。
【0073】
当業者に知られている従来の技術（例えば、組換えＤＮＡ技術または酵素的または化学的切断）を使用して、所定の抗体（モノクローナル抗体２Ｅ１２のような）から抗原結合部分（例えば、上記の抗体断片）を得て、抗体全体について使用されるものと同じ方法を使用して、抗体の抗原結合部分を選択的にスクリーニングすることができる。
【0074】
本発明の文脈において、上記の抗原結合部分には、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ダイアボディ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ二価分子、ｄＡｂおよび相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆａｂ’断片、ＦｖおよびＦ（ａｂ’）２断片が含まれる。
【0075】
本発明の文脈において、上記のＩｇＧ１重鎖定常領域には、Ｇ１ｍ（ｆ）、Ｇ１ｍ（ｚ）、Ｇ１ｍ（ｚ、ａ）およびＧ１ｍ（ｚ、ａ、ｘ）などのアロタイプが含まれる。本発明のいくつかの態様において、前述のＩｇＧ１重鎖定常領域はＧ１ｍ（ｆ）に対応する。
【0076】
本発明の文脈において、前述のκ軽鎖定常領域はＫｍ１、Ｋｍ１，２およびＫｍ３などのさまざまなアロタイプを含む。本発明のいくつかの態様において、前述のκ軽鎖定常領域はＫｍ３型領域に対応する。
【0077】
本発明の文脈において、前述のλ軽鎖定常領域はλＩ、λＩＩ、λＩＩＩおよびλＶＩなどのさまざまなアロタイプを含む。本発明のいくつかの態様において、前述のλ軽鎖定常領域はλＩＩ型領域に対応する。
【0078】
本発明に関する抗体核酸は、従来の遺伝子工学組換え技術または化学合成法を介しても得ることができる。一方で、本発明に関する抗体核酸の配列には、抗ＰＤ－Ｌ１抗体重鎖可変領域または抗体分子に属する部分核酸配列が含まれる。一方で、本発明に関する抗体核酸の配列には、抗ＰＤ－Ｌ１抗体軽鎖可変領域または抗体分子に属する部分核酸配列も含まれる。さらに別の一方で、本発明に関する抗体核酸の配列は、重鎖および軽鎖可変領域に属するＣＤＲ配列もさらに含む。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗原エピトープに結合する部位であり、本発明の文脈内で、ＣＤＲ配列はＩＭＧＴ／Ｖ－ＱＵＥＳＴ（http://imgt.cines.fr/textes/vquest/）を介して検証される。しかしながら、異なる解析法で得たＣＤＲ配列はわずかに異なる。
【0079】
本発明の一態様は、抗体Ｂ６０－５５、ＢＩＩ６１－６２、Ｂ５０－６、Ｂ６０、ＢＩＩ６１およびＢ５０重鎖および軽鎖可変領域配列をコードする核酸分子に関する。抗体Ｂ６０－５５、ＢＩＩ６１－６２、Ｂ５０－６、Ｂ６０、ＢＩＩ６１およびＢ５０重鎖可変領域配列をコードする核酸分子は、それぞれ配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号５９に対応する。抗体Ｂ６０－５５、ＢＩＩ６１－６２、Ｂ５０－６、Ｂ６０、ＢＩＩ６１、およびＢ５０軽鎖可変領域配列をコードする核酸分子は、それぞれ配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６２、配列番号６５および配列番号６６に対応する。本発明は、抗体Ｂ６０－５５、ＢＩＩ６１－６２、Ｂ５０－６、Ｂ６０、ＢＩＩ６１およびＢ５０重鎖および軽鎖可変領域配列をコードする核酸分子の変異体または類似体にも関する。
【0080】
他方で、本発明はまた、さまざまな分離された核酸分子変異体にも関する；具体的には、前記核酸変異体の配列は、以下の核酸配列と少なくとも７０％の類似性を示すはずである：配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号５９、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６２、配列番号６５および配列番号６６、ここで少なくとも７５％に達する類似性が好ましく、少なくとも８０％に達する類似性がより好ましく、少なくとも８５％に達する類似性がさらに好ましく、少なくとも９０％に達する類似性がさらにより好ましく、少なくとも９５％に達する類似性が最も好ましい。
【0081】
本発明はさらに、配列番号４７、４９、５１、５３、５４、および５１のアミノ酸配列の形で抗体Ｂ６０－５５、ＢＩＩ６１－６２、Ｂ５０－６、Ｂ６０、ＢＩＩ６１およびＢ５０重鎖可変領域配列をコードする、対応する分離された核酸分子に関する。本発明はまた、配列番号４８、５０、５２、４８、５５および５６のアミノ酸配列の形で抗体Ｂ６０－５５、ＢＩＩ６１－６２、Ｂ５０－６、Ｂ６０、ＢＩＩ６１、およびＢ５０軽鎖可変領域配列をコードする、対応する核酸分子にも関する。
【0082】
本発明は、前述の核酸分子を含む組換え発現ベクターに関し、さらに、前記分子で形質転換された宿主細胞に関する。さらに、本発明は、前述の核酸分子を含む宿主細胞の特定の条件下での培養、引き続き、本発明に記載の抗体を得るための分離に使用される方法に関する。
【0083】
抗体のアミノ酸配列
モノクローナル抗体ｍＡｂ Ｂ６０－５５、ＢＩＩ６１－６２、Ｂ５０－６、Ｂ６０、ＢＩＩ６１およびＢ５０重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、対応する核酸配列に由来してもよい。抗体ｍＡｂ Ｂ６０－５５、ＢＩＩ６１－６２、Ｂ５０－６、Ｂ６０、ＢＩＩ６１およびＢ５０重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４７、４９、５１、５３、５４および５１に対応する。抗体ｍＡｂ Ｂ６０－５５、ＢＩＩ６１－６２、Ｂ５０－６、Ｂ６０、ＢＩＩ６１およびＢ５０軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４８、５０、５２、４８、５５および５６に対応する。
モノクローナル抗体ｍＡｂ Ｂ６０－５５、ＢＩＩ６１－６２、Ｂ５０－６、Ｂ６０、ＢＩＩ６１およびＢ５０重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、対応する核酸配列に由来してもよい。抗体ｍＡｂ Ｂ６０－５５、ＢＩＩ６１－６２、Ｂ５０－６、Ｂ６０、ＢＩＩ６１およびＢ５０重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４７、４９、５１、５３、５４および５１に対応する。抗体ｍＡｂ Ｂ６０－５５、ＢＩＩ６１－６２、Ｂ５０－６、Ｂ６０、ＢＩＩ６１およびＢ５０軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４８、５０、５２、４８、５５および５６に対応する。
【0084】
一方で、本発明により提供される抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号４７、４９、５１、５３、５４および５１で与えられる配列と少なくとも７０％の類似性を示すはずであり、類似性は少なくとも８０％に達することが好ましく、類似性は少なくとも８５％に達することがより好ましく、類似性は少なくとも９０％に達することがさらにより好ましく、類似性は少なくとも９５％に達することが最も好ましい。
【0085】
一方で、本発明により提供される抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号４８、５０、５２、４８、５５および５６に示される配列と少なくとも７０％の類似性を示すはずであり、類似性は少なくとも８０％に達することが好ましく、類似性は少なくとも８５％に達することがより好ましく、類似性は少なくとも９０％に達することがさらにより好ましく、類似性は少なくとも９５％に達することが最も好ましい。
【0086】
抗体Ｂ６０－５５、ＢＩＩ６１－６２、Ｂ５０－６、Ｂ６０、ＢＩＩ６１およびＢ５０の重鎖および軽鎖可変領域のＣＤＲアミノ酸配列は次のように決定される：抗体Ｂ６０－５５の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１～３に対応する。抗体Ｂ６０－５５の軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４～６に対応する。
【0087】
抗体ＢＩＩ６１－６２の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号７～９に対応する。抗体ＢＩＩ６１－６２の軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１０～１２に対応する。
【0088】
抗体Ｂ５０－６の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１３～１５に対応する。抗体Ｂ５０－６の軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１６～１８に対応する。
【0089】
一方で、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片の重鎖のＣＤＲに含まれるアミノ酸配列は、配列番号１～３、７～９、１３～１５、１９および２０の１つまたは複数のアミノ酸の変異、付加または欠失を介して得てもよい。好ましくは、変異、付加または欠失に供されるアミノ酸の数は３を超えてはならない。より好ましくは、変異、付加または欠失に供されるアミノ酸の数は２を超えてはならない。最も好ましくは、変異、付加または欠失に供されるアミノ酸の数は１を超えてはならない。
【0090】
一方で、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片の軽鎖のＣＤＲに含まれるアミノ酸配列は、配列番号４～６、１０～１２、１６～１８、および２１の１つまたは複数のアミノ酸の変異、追加、または欠失を介して得てもよい。好ましくは、変異、付加、または欠失に供されるアミノ酸の数は３を超えてはならない。より好ましくは、変異、付加または欠失に供されるアミノ酸の数は２を超えてはならない。最も好ましくは、変異、付加または欠失に供されるアミノ酸の数は１を超えてはならない。
【0091】
抗体Ｂ６０－５５、ＢＩＩ６１－６２、Ｂ５０－６、Ｂ６０、ＢＩＩ６１およびＢ５０の重鎖および軽鎖可変領域のＦＲアミノ酸配列は次のように決定される：抗体Ｂ６０－５５およびＢ６０の重鎖可変領域のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列は、それぞれ配列番号２２～２５に対応する。軽鎖可変領域のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列は、それぞれ配列番号２６～２９に対応する。
【0092】
抗体ＢＩＩ６１－６２の重鎖可変領域のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列は、それぞれ配列番号３０～３３に対応する。軽鎖可変領域のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列は、それぞれ配列番号３４～３７に対応する。
【0093】
抗体Ｂ５０－６およびＢ５０の重鎖可変領域のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列は、それぞれ配列番号３８～４１に対応する。軽鎖可変領域のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列は、それぞれ配列番号４２～４５に対応する。
【0094】
抗体ＢＩＩ６１の重鎖可変領域のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列は、それぞれ配列番号３０～３３に対応する。軽鎖可変領域のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列は、それぞれ配列番号３４、４６、３６、３７に対応する。
【0095】
一方で、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖可変領域のＦＲに含まれるアミノ酸配列は、配列番号２２～４６の１つまたは複数のアミノ酸の変異、付加、または欠失を介して得てもよい。好ましくは、変異、付加または欠失に供されるアミノ酸の数は３を超えてはならない。より好ましくは、変異、付加または欠失に供されるアミノ酸の数は２を超えてはならない。最も好ましくは、変異、付加または欠失に供されるアミノ酸の数は１を超えてはならない。
【0096】
前述の抗体、ＣＤＲ、またはフレーム領域に含まれるアミノ酸の変異、付加、または欠失後に得られる変異体は、ヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する能力を依然として保持するはずである。本発明は、抗原結合部分のそのような変異体もまた含む。
【0097】
前述の抗体の変異体は、配列番号８５の完全な重鎖および配列番号８７の完全な軽鎖を有する抗体Ｂ６０－５５－１であり、重鎖のＣ末端の末端リジン残基は無くてもよい。Ｂ６０－５５－１の重鎖は、配列番号８６の核酸配列を利用することにより発現させることができる。核酸配列は、発現細胞株へのさらなる組み込みのために発現ベクターに組み込むことができる。Ｂ６０－５５－１の軽鎖は、配列番号８８の核酸配列を利用することにより発現させることができる。核酸配列は、発現細胞株へのさらなる組み込みのために発現ベクターに組み込むことができる。
【0098】
Ｂ６０－５５－１抗体は、医薬的に許容される賦形剤またはアジュバントを添加することにより、医薬組成物として製剤化できる。組成物は、約２７５ｍＭのセリン、約１０ｍＭのヒスチジンを含み、約５．９のｐＨ値を有し得る。組成物は、約０．０５％のポリソルベート８０、約１％のＤ－マンニトール、約１２０ｍＭのＬ－プロリン、約１００ｍＭのＬ－セリン、約１０ｍＭのＬ－ヒスチジン－ＨＣｌを含み、約５．８のｐＨを有し得る。
【0099】
本発明により構成されるモノクローナル抗体変異体は、従来の遺伝子工学法により得ることができる。当業者は、核酸変異を用いてＤＮＡ分子を修飾する方法を十分にわかっている。さらに、重鎖および軽鎖の変異体をコードする核酸分子もまた化学合成を介して得ることができる。
【0100】
本発明の文脈において、配列同一性および配列類似性パーセンテージを決定するために使用されるアルゴリズムの例には、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０が含まれ、これらはそれぞれAltschul et al. (1977) Nucl. Acid. Res. 25: 3389-3402およびAltschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410に記載されている。例えば、文献において与えられるパラメータまたはデフォルトパラメータを使用して、本発明により構成されるアミノ酸配列のパーセンテージ類似性をＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０を使用して決定することができる。ＢＬＡＳＴ分析を実行できるソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を介して一般の任意のメンバーが得ることができる。
【0101】
本発明の文脈において、上記の所与のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列には、本文中で概説された方法（例えば、標準パラメータを用いたＢＬＡＳＴ分析）が使用される場合、本発明により構成されるポリペプチド配列と少なくとも７０％同一であると決定される配列など、前記アミノ酸配列と基本的に同一であるポリペプチド配列が含まれ、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上を示す配列が好ましい。
【0102】
本発明の文脈において、「ベクター」という用語は、特定のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、前記タンパク質の発現を可能にする核酸送達媒体のタイプを指す。ベクターは、宿主細胞の形質転換、形質導入またはトランスフェクション後に前記宿主細胞内にそれが運ぶ、遺伝物質成分の発現を可能にする。例えば、ベクターには以下が含まれる：プラスミド；ファージミド；コスミド；酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）のような人工染色体；λファージまたはＭ１３ファージなどのバクテリオファージおよび動物ウイルス。ベクターとして使用される動物ウイルスの例には、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルスなど）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が含まれる。ベクターには、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択エレメント、レポーター遺伝子を含む、いくつかの発現制御エレメントが含まれてもよい。さらに、ベクターには複製起点が含まれてもよい。ベクターはまた、ウイルス粒子、リポソームまたはタンパク質コートなどの細胞への侵入を促進する成分を含んでもよいが、前記成分は上記物質に限定されない。
【0103】
本発明の文脈において、「宿主細胞」という用語は、大腸菌もしくは枯草菌などの原核細胞、酵母細胞もしくはアスペルギルスなどの真菌細胞、ショウジョウバエＳ２細胞もしくはＳｆ９などの昆虫細胞、または線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳ０細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ ２９３細胞もしくは他のヒト細胞などの動物細胞を含む、多くの異なる細胞型を含む、ベクターが導入される細胞を指す。
【0104】
本発明により構成される抗体断片は、抗体分子全体の加水分解を介して得ることができる［Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Methods 24: 107-117 (1992)およびBrennan et al., Science 229: 81 (1985)を参照されたい］。さらに、これらの抗体断片は、組換え宿主細胞によって直接生成することもできる［Hudson, Curr. Opin. Immunol. 11: 548-557 (1999); Little et al., Immunol. Today, 21: 364-370 (2000)においてレビューされる］。例えば、Ｆａｂ’断片は、大腸菌細胞から直接得られるか、または化学的に結合してＦ（ａｂ’）２断片を形成することができる［Carter et al., Bio/Technology, 10: 163-167 (1992)］。別の例として、ＧＣＮ４ロイシンジッパーを使用した連結を介してＦ（ａｂ’）２断片を得ることができる。さらに、Ｆｖ、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ’）２断片も、組換え宿主細胞培養培地から直接、単離できる。当業者は、抗体断片の生成についての他の技術を十分にわかっているであろう。
【0105】
本発明の文脈において、「特異的結合」という用語は、抗体と対応する抗原との間で起こる反応など、２つの分子の間のランダムでない結合反応を指す。ここで、一次抗原に結合する抗体の二次抗原に対する結合親和性は非常に弱いか、または検出不能である。特定の態様において、所与の抗原に特異的な抗体は、≦１０－５Ｍ（例えば、１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、または１０－１０Ｍ）の親和性（ＫＤ）で前記抗原に結合し、ここでＫＤは解離速度の結合速度に対する比（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を指し、この量は当業者がよく知る方法で測定することができる。
【0106】
本発明のいくつかの態様において、本発明により構成される抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、同時にマウスＰＤ－Ｌ１にも結合することができるが、ＰＤ－Ｌ２またはＢ７Ｈ３には結合しない。
【0107】
本発明のいくつかの態様において、本発明により構成される抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ｈＰＤ－Ｌ１にｈＰＤ－１に対して競合的に結合することができる。
【0108】
本発明の文脈において、ＰＤ－Ｌ１関連疾患には、例えば、ＰＤ－Ｌ１に関与する腫瘍およびウイルス感染、特に高レベルのＰＤ－Ｌ１発現に関連する腫瘍およびウイルス感染が含まれる。
【0109】
本発明のいくつかの態様では、前述の腫瘍には、肺がん、卵巣がん、結腸がん、結腸直腸がん、メラノーマ、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、肝臓がん、リンパ腫、血液悪性腫瘍、頭頸部がん、神経膠腫、胃がん、鼻咽頭がん、喉頭がん、子宮頸がん、子宮がん、骨肉腫、甲状腺がん、前立腺がんが含まれるが、これらに限定されない。
【0110】
本発明のいくつかの態様において、前述のウイルス感染には、急性、亜急性または慢性のＨＢＶ、ＨＣＶまたはＨＩＶ感染が含まれるが、これらに限定されない。
【0111】
本発明の文脈において、２０の従来のアミノ酸およびそれらの略語は従来の用法に従う。Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))を参照されたい。
【発明の効果】
【0112】
本発明は、酵母ディスプレイ技術をスクリーニングおよび親和性成熟を組み合わせて使用して、良好な特異性および比較的高い親和性および安定性を示す完全ヒト抗ＰＤ－Ｌ１抗体を得る。ここで、前記抗体はヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合することができ、または、同時にマウスＰＤ－Ｌ１にも結合することができるが、Ｂ７Ｈ３またはＰＤ－Ｌ２には結合しない；また、前記抗体は、活性化されたＴ細胞に結合して、Ｔ細胞の活性化をさらに増強し、腫瘍成長の顕著な阻害をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【0113】
【図1】精製した抗ｈＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖによるｈＰＤ－Ｌ１／ｈＰＤ－１リガンド受容体結合の阻害。Ｘ軸はＥＧＦＰ蛍光強度を表し、Ｙ軸はＳＡ－ＰＥ蛍光強度を表す。Ａはブランク対照に対応し、Ｂは陰性対照に対応し、ＣはＢ５０ ｓｃＦｖに対応し、ＤはＢ６０ ｓｃＦｖに対応し、ＥはＢＩＩ６１ ｓｃＦｖに対応する。
【図2】親和性成熟スクリーニング後のｈＰＤ－Ｌ１酵母に対する親和性の増加を示す酵母ここで、Ｘ軸はｍｙｃの蛍光強度を表し（全抗体断片を発現する酵母に対応するｍｙｃ陽性）、Ｙ軸は抗原結合能を示す蛍光強度ＳＡ－ＡＰＣを表す。
【図3-1】親和性成熟後に得られた抗体がｈＰＤ－１と競合してｈＰＤ－Ｌ１に結合する能力の比較ここで、横軸は抗体濃度に対応し（単位：ｎｇ／ｍｌ）、縦軸はＯＤ値に対応する。Ａ）ＢＩＩ６１－６２とＢＩＩ６１の比較を示す、Ｂ）Ｂ５０とＢ５０－６の比較を示す、Ｃ）Ｂ６０とＢ６０－５５の比較を示す。
【図3-2】親和性成熟後に得られた抗体がｈＰＤ－１と競合してｈＰＤ－Ｌ１に結合する能力の比較ここで、横軸は抗体濃度に対応し（単位：ｎｇ／ｍｌ）、縦軸はＯＤ値に対応する。Ａ）ＢＩＩ６１－６２とＢＩＩ６１の比較を示す、Ｂ）Ｂ５０とＢ５０－６の比較を示す、Ｃ）Ｂ６０とＢ６０－５５の比較を示す。
【図4】抗ｈＰＤ－Ｌ１抗体およびｈＰＤ－Ｌ１結合能のＥＬＩＳＡ測定ここで、横軸は抗体濃度に対応し（単位：ｎｇ／ｍｌ）、縦軸はＯＤ値に対応する。
【図5-1】抗ｈＰＤ－Ｌ１およびｈＰＤ－１の、ｈＰＤ－Ｌ１との競合結合の競合ＥＬＩＳＡ測定ここで、横軸は抗体濃度に対応し（単位：ｎｇ／ｍｌ）、縦軸はＯＤ値に対応する。グラフ＃５はＢＩＩ６１－６２ ｍＡｂに対応し、グラフ＃２はＢ５０－６ ｍＡｂに対応し、グラフ＃３はＢ６０－５５ ｍＡｂに対応する。
【図5-2】抗ｈＰＤ－Ｌ１およびｈＰＤ－１の、ｈＰＤ－Ｌ１との競合結合の競合ＥＬＩＳＡ測定ここで、横軸は抗体濃度に対応し（単位：ｎｇ／ｍｌ）、縦軸はＯＤ値に対応する。グラフ＃５はＢＩＩ６１－６２ ｍＡｂに対応し、グラフ＃２はＢ５０－６ ｍＡｂに対応し、グラフ＃３はＢ６０－５５ ｍＡｂに対応する。
【図6】ｈＰＤ－Ｌ１の抗ｈＰＤ－Ｌ１およびＣＤ８０競合結合の競合ＥＬＩＳＡ測定
【図7-1】抗ｈＰＤ－Ｌ１抗体特異性の検出ここで、Ｘ軸はＥＧＦＰ蛍光強度を表し、Ｙ軸は対応する抗体結合の蛍光強度を表し、Ａはブランク対照に対応し、Ｂは陰性対照に対応し、ＣはＢＩＩ６１－６２ ｍＡｂに対応し、ＤはＢ６０－５５ ｍＡｂに対応し、ＥはＢ５０－６ ｍＡｂに対応する；（１）はｈＰＤ－Ｌ１－ＥＧＦＰタンパク質に対応し、（２）はｈＢ７Ｈ３－ＥＧＦＰに対応し、（３）はｈＰＤ－Ｌ２－ＥＧＦＰタンパク質に対応する。
【図7-2】抗ｈＰＤ－Ｌ１抗体特異性の検出ここで、Ｘ軸はＥＧＦＰ蛍光強度を表し、Ｙ軸は対応する抗体結合の蛍光強度を表し、Ａはブランク対照に対応し、Ｂは陰性対照に対応し、ＣはＢＩＩ６１－６２ ｍＡｂに対応し、ＤはＢ６０－５５ ｍＡｂに対応し、ＥはＢ５０－６ ｍＡｂに対応する；（１）はｈＰＤ－Ｌ１－ＥＧＦＰタンパク質に対応し、（２）はｈＢ７Ｈ３－ＥＧＦＰに対応し、（３）はｈＰＤ－Ｌ２－ＥＧＦＰタンパク質に対応する。
【図7-3】抗ｈＰＤ－Ｌ１抗体特異性の検出ここで、Ｘ軸はＥＧＦＰ蛍光強度を表し、Ｙ軸は対応する抗体結合の蛍光強度を表し、Ａはブランク対照に対応し、Ｂは陰性対照に対応し、ＣはＢＩＩ６１－６２ ｍＡｂに対応し、ＤはＢ６０－５５ ｍＡｂに対応し、ＥはＢ５０－６ ｍＡｂに対応する；（１）はｈＰＤ－Ｌ１－ＥＧＦＰタンパク質に対応し、（２）はｈＢ７Ｈ３－ＥＧＦＰに対応し、（３）はｈＰＤ－Ｌ２－ＥＧＦＰタンパク質に対応する。
【図8-1】抗ｈＰＤ－Ｌ１抗体とｍＰＤ－Ｌ１結合能。ここで、Ｘ軸はＥＧＦＰ蛍光強度を表し、Ｙ軸は対応する抗体結合の蛍光強度を表す。Ａはブランク対照に対応し、Ｂは陰性対照に対応し、ＣはＢ６０－５５ ｍＡｂに対応し、ＤはＢＩＩ６１－６２ ｍＡｂに対応し、ＥはＢ５０－６ ｍＡｂに対応する；（１）はｈＰＤ－Ｌ１－ＥＧＦＰタンパク質に対応し、（２）はｍＰＤ－Ｌ１－ＥＧＦＰタンパク質に対応する。
【図8-2】抗ｈＰＤ－Ｌ１抗体とｍＰＤ－Ｌ１結合能。ここで、Ｘ軸はＥＧＦＰ蛍光強度を表し、Ｙ軸は対応する抗体結合の蛍光強度を表す。Ａはブランク対照に対応し、Ｂは陰性対照に対応し、ＣはＢ６０－５５ ｍＡｂに対応し、ＤはＢＩＩ６１－６２ ｍＡｂに対応し、ＥはＢ５０－６ ｍＡｂに対応する；（１）はｈＰＤ－Ｌ１－ＥＧＦＰタンパク質に対応し、（２）はｍＰＤ－Ｌ１－ＥＧＦＰタンパク質に対応する。
【図9】抗ｈＰＤ－Ｌ１抗体とカニクイザルＰＤ－Ｌ１の結合能力
【図10】抗ｈＰＤ－Ｌ１抗体によるＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化
【図11】腫瘍成長における抗ｈＰＤ－Ｌ１抗体Ｂ５０－６の阻害活性
【図12】腫瘍成長における抗ｈＰＤ－Ｌ１抗体Ｂ６０－５５およびＢＩＩ６１－６２の阻害活性ここで、Ａは、３ ｍｇ／ｋｇの用量を使用した場合の腫瘍成長のＢＩＩ６１－６２ ｍＡｂおよびＢ６０－５５阻害に対応する；Ｂは異なる用量を使用した場合の腫瘍成長におけるＢＩＩ６１－６２ ｍＡｂの阻害効果に対応する。
【図13】Ｂ６０－５５と抗体２．４１Ｈ９０Ｐの安定性の比較ここで、Ａは経時的なＢ６０－５５および抗体２．４１Ｈ９０ＰのＩＣ５０値に対応する。Ｂは経時的な抗体二量体の割合に対応する；ＣはＢ６０－５５加速安定性試験で得られた競合ＥＬＩＳＡ結果に対応する。
【図14】ＣａＰｕｒｅ－ＨＡでのＢ６０－５５－１のクロマトグラフィー；Ｂ６０－５５－１保持時間は約４５分である。
【図15】ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬ（Ｔｏｓｏｈ）カラムでの精製Ｂ６０－５５－１のサイズ排除クロマトグラフィー分析。
【図16】精製Ｂ５０－５５－１のクマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析：レーン１－還元条件下、レーン２－非還元条件下、レーン３－分子量マーカー。
【図17】ＳＰＲ測定の代替捕捉アプローチ：パネルＡ － 抗ヒトＩｇＧは抗体を捕捉するようにチップ上に固定化し；Ｂ６０－５５－１またはアテゾリズマブ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）を固定した抗体によって捕捉し、さまざまな濃度のＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓリガンドを適用した。パネルＢ － ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ融合タンパク質をセンサーチップ上に直接固定し、さまざまな濃度のＢ６０－５５－１またはアテゾリズマブを適用した。パネルＣ － ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ融合タンパク質およびＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓの両方の相互作用を調査するために、Ｂ６０－５５－１またはアテゾリズマブをチップ上に直接固定化した； ＰＤ－Ｌ１－ＨｉｓタグまたはＰＤ－Ｌ１－Ｆｃの濃度範囲を適用した。
【図18】ＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓタグリガンドの固定した比較薬抗体アテゾリズマブまたはＢ６０－５５－１への結合のセンサーグラム；アプローチは左パネルに模式的に示されており、キネティックパラメータは表にまとめた；抗ヒト捕捉抗体をセンサーチップに固定し、アテゾリズマブまたはＢ６０－５５－１を捕捉した後、さまざまな濃度のＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓリガンドを続けた：パネルＡ － アテゾリズマブの結果；パネルＢ － Ｂ６０－５５－１の結果。
【図19】固定したＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ融合タンパク質へのアテゾリズマブまたはＢ６０－５５－１の結合のセンサーグラム；アプローチは左パネルに模式的に示されており、キネティックパラメータは表にまとめた；さまざまな濃度のＢ６０－５５－１またはアテゾリズマブをチップに適用した。パネルＡ － アテゾリズマブの結果；パネルＢ － Ｂ６０－５５－１の結果。
【図20】ＰＤ－Ｌ１－ＨｉｓまたはＰＤ－Ｌ１－Ｆｃの固定化Ｂ６０－５５－１への結合のセンサーグラム；アプローチは左パネルに模式的に示されており、キネティックパラメータは表にまとめた。
【図21】ＰＤ－Ｌ１－ＨｉｓまたはＰＤ－Ｌ１－Ｆｃの固定化アテゾリズマブへの結合のセンサーグラム；アプローチは左パネルに模式的に示されており、キネティックパラメータは表にまとめた。
【図22】Ｂ６０－５５－１とアテゾリズマブは、Ｐｒｏｍｅｇａ ＡＤＣＣ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｂｉｏａｓｓａｙ Ｋｉｔの対照抗体と比較してＡＤＣＣ活性を有さない。
【図23】Ｃ１ｑへのＢ６０－５５－１およびアテゾリズマブ結合の評価。
【図24】ＭＬＲアッセイにおけるＴ細胞活性化に対するＢ６０－５５－１および比較薬抗体の濃度依存効力。
【図25】薬物治療に際しての体重変化；矢印は投与時間を示す。
【図26】薬物治療に際しての腫瘍容量阻害；矢印は投与時間を示す。
【図27】グループ分け（ｎ＝８）後、２９日間の観察期間中の３つのグループにおける個々の腫瘍成長。
【図28】投与後２９日目の腫瘍重量阻害。
【図29】以下の表７に示す実験計画からの３つの試験グループの平均腫瘍容量。
【図30】以下の表７において示されている実験計画の２１日目と４１日目での３つの試験グループの平均腫瘍容量；各日の３つのカラムは、グループ１（左）、２（中央）、３（右）に対応している。
【発明を実施するための形態】
【0114】
以下のセクションでは、本発明の態様を以下の例を介してさらに説明する；しかしながら、当業者によって理解されるべきであるように、以下の例は本発明を説明するためにのみ使用されるのであって、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。以下の例で指定されていない条件は、従来使用されている条件または製造業者が推奨する条件に設定されよう。製造業者が指定されていない試薬または機器はすべて、市販の標準製品に対応する。
【実施例0115】
組換えヒトＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－１発現および関連ＥＧＦＰ細胞の調製。
ヒトＰＤ－Ｌ１の細胞外ドメインのアミノ酸配列は、タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔに含まれるＰＤ－Ｌ１（Ｑ９ＮＺＱ７）のアミノ酸配列（すなわち、Ｑ９ＮＺＱ７に含まれる残基１から残基２３８の配列）に基づいて得られた；ＩｇＧ１－Ｆｃの構造ドメインのアミノ酸配列は、タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔに含まれるヒト免疫グロブリンｇａｍｍａ１（ＩｇＧ１）（Ｐ０１８５７）の定常領域のアミノ酸配列に基づいて得られた（すなわち、Ｐ０１８５７に含まれる残基１０４から残基３３０の配列）；および、ＩｇＧ１－Ｆｃの構造ドメインのアミノ酸配列は、タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔに含まれるヒト免疫グロブリンｇａｍｍａ１（ＩｇＧ１）（Ｐ０１８６８）の定常領域のアミノ酸配列に基づいて得られた（すなわち、Ｐ０１８６８に含まれる残基９８から残基３２４の配列）。オンラインツールＤＮＡｗｏｒｋｓ（http://helixweb.nih.gov/dnaworks/）を使用して、対応コードするＤＮＡ配列を設計し、ｈＰＤ－Ｌ１－ＦｃおよびｈＰＤ－Ｌ１－ｍｕＦｃ融合タンパク質遺伝子を得て、同じ方法を使用してｈＰＤ－１－Ｆｃ遺伝子を得た。増強した緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）のアミノ酸配列（Ｃ５ＭＫＹ７）、ならびにヒトＰＤ－Ｌ１のアミノ酸配列（Ｑ９ＮＺＱ７）、マウスＰＤ－Ｌ１のアミノ酸配列（Ｑ９ＥＰ７３）およびヒトのアミノ酸配列ＰＤ－１（Ｑ１５１１６）は、タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔに含まれる情報に基づいて得られた。オンラインツールＤＮＡｗｏｒｋｓ（http://helixweb.nih.gov/dnaworks/）を使用して、対応コードするＤＮＡ配列を設計し、ＰＤ－Ｌ１－ＥＧＦＰ融合タンパク質遺伝子を得て、同じ方法を使用してｈＰＤ－１－ＥＧＦＰおよびｍＰＤ－Ｌ１－ＥＧＦＰ遺伝子を得た。対応するＤＮＡ断片は、人工合成によって得られた。合成した遺伝子配列は、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ製のＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで二重切断され、市販のベクターｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ－ＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｖ８６３－２０）にクローンし、その後、プラスミドが正確に構築されて組換えプラスミドＤＮＡ；すなわち、ｐｃＤＮＡ４－ｈＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ、ｐｃＤＮＡ４－ｈＰＤ－Ｌ１－ｍｕＦｃ、ｐｃＤＮＡ４－ｈＰＤ１－Ｆｃ、ｐｃＤＮＡ４－ｈＰＤ－Ｌ１－ＥＧＦＰ、ｐｃＤＮＡ４－ｈＰＤ１－ＥＧＦＰおよびｐｃＤＮＡ４－ｍＰＤ－Ｌ１－ＥＧＦＰが得られたことを確認するために配列決定を行った。
ヒトＰＤ－Ｌ１の細胞外ドメインのアミノ酸配列は、タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔに含まれるＰＤ－Ｌ１（Ｑ９ＮＺＱ７）のアミノ酸配列（すなわち、Ｑ９ＮＺＱ７に含まれる残基１から残基２３８の配列）に基づいて得られた；ＩｇＧ１－Ｆｃの構造ドメインのアミノ酸配列は、タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔに含まれるヒト免疫グロブリンｇａｍｍａ１（ＩｇＧ１）（Ｐ０１８５７）の定常領域のアミノ酸配列に基づいて得られた（すなわち、Ｐ０１８５７に含まれる残基１０４から残基３３０の配列）；および、ＩｇＧ１－Ｆｃの構造ドメインのアミノ酸配列は、タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔに含まれるヒト免疫グロブリンｇａｍｍａ１（ＩｇＧ１）（Ｐ０１８６８）の定常領域のアミノ酸配列に基づいて得られた（すなわち、Ｐ０１８６８に含まれる残基９８から残基３２４の配列）。オンラインツールＤＮＡｗｏｒｋｓ（http://helixweb.nih.gov/dnaworks/）を使用して、対応コードするＤＮＡ配列を設計し、ｈＰＤ－Ｌ１－ＦｃおよびｈＰＤ－Ｌ１－ｍｕＦｃ融合タンパク質遺伝子を得て、同じ方法を使用してｈＰＤ－１－Ｆｃ遺伝子を得た。増強した緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）のアミノ酸配列（Ｃ５ＭＫＹ７）、ならびにヒトＰＤ－Ｌ１のアミノ酸配列（Ｑ９ＮＺＱ７）、マウスＰＤ－Ｌ１のアミノ酸配列（Ｑ９ＥＰ７３）およびヒトのアミノ酸配列ＰＤ－１（Ｑ１５１１６）は、タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔに含まれる情報に基づいて得られた。オンラインツールＤＮＡｗｏｒｋｓ（http://helixweb.nih.gov/dnaworks/）を使用して、対応コードするＤＮＡ配列を設計し、ＰＤ－Ｌ１－ＥＧＦＰ融合タンパク質遺伝子を得て、同じ方法を使用してｈＰＤ－１－ＥＧＦＰおよびｍＰＤ－Ｌ１－ＥＧＦＰ遺伝子を得た。対応するＤＮＡ断片は、人工合成によって得られた。合成した遺伝子配列は、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ製のＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで二重切断され、市販のベクターｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ－ＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｖ８６３－２０）にクローンし、その後、プラスミドが正確に構築されて組換えプラスミドＤＮＡ；すなわち、ｐｃＤＮＡ４－ｈＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ、ｐｃＤＮＡ４－ｈＰＤ－Ｌ１－ｍｕＦｃ、ｐｃＤＮＡ４－ｈＰＤ１－Ｆｃ、ｐｃＤＮＡ４－ｈＰＤ－Ｌ１－ＥＧＦＰ、ｐｃＤＮＡ４－ｈＰＤ１－ＥＧＦＰおよびｐｃＤＮＡ４－ｍＰＤ－Ｌ１－ＥＧＦＰが得られたことを確認するために配列決定を行った。
【0116】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用して、実験室で培養した樹状細胞（ＤＣ細胞）からヒトＰＤ－Ｌ２およびＢ７Ｈ３遺伝子を増幅した（前記ＤＣ細胞は、ＰＢＭＣから単離された単核細胞のＴＮＦ－α成熟により得られた）。使用した遺伝子増幅プライマーは以下の通りである：
ＰＤＬ２－Ｆ ＨｉｎｄＩＩＩ：GCGCAAGCTTGCCACCATGATCTTCCTCCTGCTAATG（配列番号７４）、
ＰＤＬ２－Ｒ ＥｃｏＩ：
GCCGAATTCGATAGCACTGTTCACTTCCCTC（配列番号７５）；
ｈＢ７Ｈ３－Ｆ ＨｉｎｄＩＩＩ：GCGCAAGCTTGCCACCATGCTGCGTCGGCGGGGCAGC（配列番号７６）；
ｈＢ７Ｈ３－Ｒ ＢａｍＨＩ：GCGCGAATTCGGCTATTTCTTGTCCATCATCTTC（配列番号７７）
ＰＤＬ２－Ｆ ＨｉｎｄＩＩＩ：GCGCAAGCTTGCCACCATGATCTTCCTCCTGCTAATG（配列番号７４）、
ＰＤＬ２－Ｒ ＥｃｏＩ：
GCCGAATTCGATAGCACTGTTCACTTCCCTC（配列番号７５）；
ｈＢ７Ｈ３－Ｆ ＨｉｎｄＩＩＩ：GCGCAAGCTTGCCACCATGCTGCGTCGGCGGGGCAGC（配列番号７６）；
ｈＢ７Ｈ３－Ｒ ＢａｍＨＩ：GCGCGAATTCGGCTATTTCTTGTCCATCATCTTC（配列番号７７）
【0117】
次いで、得られたＰＣＲ産物をＦｅｒｍｅｎｔａｓ ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩを使用して二重切断し、前もって構築されたｐｃＤＮＡ４－ｈＰＤ－Ｌ１－ＥＧＦＰにクローニング後、プラスミドが正確に構築され組換えプラスミドＤＮＡ；すなわち、ｐｃＤＮＡ４－ｈＰＤ－Ｌ２－ＥＧＦＰおよびｐｃＤＮＡ４－ｈＢ７Ｈ３－ＥＧＦＰが得られたことを確認するために配列決定を行った。
【0118】
対応するＥＧＦＰ組換えプラスミドをＨＥＫ２９３［ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１５７３（商標）］細胞にトランスフェクトし、ｈＰＤ－Ｌ１、ｍＰＤ－Ｌ１、ｈＰＤ－Ｌ２およびｈＢ７Ｈ３の発現を確認するためにトランスフェクションの４８時間後に蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を実行した。
【0119】
タンパク質産生のために、ｐｃＤＮＡ４－ｈＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ、ｐｃＤＮＡ４－ｈＰＤ－Ｌ１－ｍｕＦｃ、およびｐｃＤＮＡ４－ｈＰＤ１－Ｆｃを一時的にＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。組換え発現プラスミドをＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地に希釈し、形質転換に必要なＰＥＩ（ポリエチレンイミン）溶液に加えた後、各プラスミド／ＰＥＩ混合物をそれぞれ別々に細胞懸濁液に加え、３７℃、１０％ＣＯ２および９０ｒｐｍで培養した；同時に、５０μｇ／Ｌのインスリン様成長因子（ＩＧＦ－１）の補充添加が行われた。その４時間後、ＥＸ２９３培地、２ｍＭグルタミン、および５０μｇ／Ｌ ＩＧＦ－１の補充添加を行い、１３５ｒｐｍで培養を継続した。さらに２４時間後、３．８ｍＭバルプロ酸ナトリウム（ＶＰＡ）を添加した。５～６日間の培養後、一過性発現培養液の上清を回収し、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーを使用して一次精製し、以下の例に使用するためにｈＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ、ｈＰＤ－Ｌ１－ｍｕＦｃおよびｈＰＤ－１－Ｆｃタンパク質サンプルを得た。このようにして得られたタンパク質サンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用した予備試験に供し、標的バンドが明らかに見られた。
【実施例0120】
酵母ディスプレイライブラリーにおける抗ｈＰＤ－Ｌ１抗体のスクリーニング、クローニング発現および同定。
酵母ディスプレイ技術を使用して、ＰＤ－Ｌ１についての完全ヒト抗体をスクリーニングした。２１人の健康なヒト対象から得られた脾臓およびリンパ節ＩｇＭおよびＩｇＧ ｃＤＮＡに含まれるＶＨおよびＶＬ遺伝子のクローニングを行って、ｓｃＦＶ酵母ディスプレイライブラリーを構築した（ＶＨとＶＬ間の連結配列は連結ペプチド
GGGGSGGGGSGGGGS（配列番号６７）
および連結ペプチドであった）ライブラリーのストレージ容量は５×１０８であった。１０倍容量の酵母ライブラリーを起こし、その表面に抗体が発現するように酵母を誘導した。１００ｎＭのビオチン化ｈＰＤ－Ｌ１抗原磁気ビーズを使用して２ラウンドの濃縮を行い、その後、抗ｍｙｃ抗体とビオチン化ｈＰＤ－Ｌ１フローソーティングを使用してさらに２ラウンドの濃縮を行った。このようにして得られた酵母をプレーティングし、単一クローンを採った。増幅および発現の誘導に供されたモノクローナル酵母は、抗ｍｙｃ抗体ならびにビオチン化ｈＰＤ－Ｌ１または対照抗原ｈＰＤ－１を使用した染色分析にさらに供され、抗原－陽性または対照－陰性である酵母は陽性酵母として評価された。
酵母ディスプレイ技術を使用して、ＰＤ－Ｌ１についての完全ヒト抗体をスクリーニングした。２１人の健康なヒト対象から得られた脾臓およびリンパ節ＩｇＭおよびＩｇＧ ｃＤＮＡに含まれるＶＨおよびＶＬ遺伝子のクローニングを行って、ｓｃＦＶ酵母ディスプレイライブラリーを構築した（ＶＨとＶＬ間の連結配列は連結ペプチド
GGGGSGGGGSGGGGS（配列番号６７）
および連結ペプチドであった）ライブラリーのストレージ容量は５×１０８であった。１０倍容量の酵母ライブラリーを起こし、その表面に抗体が発現するように酵母を誘導した。１００ｎＭのビオチン化ｈＰＤ－Ｌ１抗原磁気ビーズを使用して２ラウンドの濃縮を行い、その後、抗ｍｙｃ抗体とビオチン化ｈＰＤ－Ｌ１フローソーティングを使用してさらに２ラウンドの濃縮を行った。このようにして得られた酵母をプレーティングし、単一クローンを採った。増幅および発現の誘導に供されたモノクローナル酵母は、抗ｍｙｃ抗体ならびにビオチン化ｈＰＤ－Ｌ１または対照抗原ｈＰＤ－１を使用した染色分析にさらに供され、抗原－陽性または対照－陰性である酵母は陽性酵母として評価された。
【0121】
ＦＡＣＳによって確認した酵母クローンを、以下のＰＣＲプライマーを使用した酵母コロニーＰＣＲおよび配列決定に供した：
ｐＮＬ６－Ｆ：
GTACGAGCTAAAAGTACAGTG（配列番号７８）；
ｐＮＬ６－Ｒ：
TAGATACCCATACGACGTTC（配列番号７９）；
ここで、使用された配列決定プライマーはｐＮＬ６－Ｒであった。配列決定後に得られた配列結果は、ＢｉｏＥｄｉｔソフトウェアパッケージを使用したアライメント解析に供した。
ｐＮＬ６－Ｆ：
GTACGAGCTAAAAGTACAGTG（配列番号７８）；
ｐＮＬ６－Ｒ：
TAGATACCCATACGACGTTC（配列番号７９）；
ここで、使用された配列決定プライマーはｐＮＬ６－Ｒであった。配列決定後に得られた配列結果は、ＢｉｏＥｄｉｔソフトウェアパッケージを使用したアライメント解析に供した。
【0122】
上記のように得られた単鎖抗体ｓｃＦｖ遺伝子と以前に得られたＩｇＧ１－Ｆｃ遺伝子を融合し、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ酵素の二重切断を使用して市販ベクターｐＥＥ６．４（Ｌｏｎｚａ）にクローニングし、その後、標準的な分子クローニング手順に従ってクローニングおよびプラスミドミニプレップを行った。抽出されたプラスミドをＨＥＫ２９３細胞で一時的に発現し、プロテインＡカラムを使用して精製した。
【0123】
ｈＰＤ－Ｌ１－ＥＧＦＰ細胞を０．５％ＰＢＳ－ＢＳＡ緩衝液に再懸濁し、その後、前述の精製抗ｈＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ抗体を加え、一方で同時に、２μｇのｈＩｇＧＩタンパク質を陰性対照として使用し、ｈＰＤ－１－Ｆｃを陽性対照に加え、対応する対照を確立した。使用した二次抗体は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅの抗ｈＩｇ－ＰＥであった。染色が完了した後、フローサイトメトリーで検出を行った。上記の方法を使用して、細胞表面ＰＤ－Ｌ１抗原に結合できる抗体を同定した。
【0124】
ｈＰＤ－Ｌ１－ＥＧＦＰ細胞を０．５％ＰＢＳ－ＢＳＡ緩衝液に再懸濁し、その後、前述の精製抗ｈＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ抗体を添加し、一方で同時に、２μｇのｈＩｇＧ１タンパク質を陰性対照として使用して陰性対照を確立した；０．３μｇのｈＰＤ－１－Ｆｃ－ビオチンをすべてのサンプルに加え、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅからのＳＡ－ＰＥを二次抗体として使用した；染色が完了した後、フローサイトメトリーで検出を行い、結果を図１に示す。上記の方法を使用して、細胞表面ＰＤ－Ｌ１抗原とＰＤ－１結合をブロックできる抗体を特定した。
【0125】
スクリーニングと同定の後、好ましい特性を示した３つの抗体株が得られた：Ｂ５０、Ｂ６０およびＢＩＩ６１。結果からわかるように、３つの抗ｈＰＤ－Ｌ１抗体株すべてがｈＰＤ－１受容体との結合をブロックすることができた。
【0126】
連結ペプチド配列
GGGGSGGGGSGGGGS（配列番号６７）
は前述の抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域の間に含まれていた。
GGGGSGGGGSGGGGS（配列番号６７）
は前述の抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域の間に含まれていた。
【0127】
Ｂ５０重鎖可変領域のアミノ酸配列は：
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSTKAAWYWIRQSPSRGLEWLGRTYFRSKWYNDYADSVKSRLTINPDTSKNQFSLQLKSVSPEDTAVYYCARGQYTAFDIWGQGTMVTVSS（配列番号５１）；
ここで、下線部はＣＤＲ１、２および３を構成し、それぞれ配列番号１３～１５に対応し、非下線部はＦＲ１、２、３および４を構成し、それぞれ配列番号３８～４１に対応する；
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSTKAAWYWIRQSPSRGLEWLGRTYFRSKWYNDYADSVKSRLTINPDTSKNQFSLQLKSVSPEDTAVYYCARGQYTAFDIWGQGTMVTVSS（配列番号５１）；
ここで、下線部はＣＤＲ１、２および３を構成し、それぞれ配列番号１３～１５に対応し、非下線部はＦＲ１、２、３および４を構成し、それぞれ配列番号３８～４１に対応する；
【0128】
対応するＤＮＡ配列は：
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCACCAAGGCTGCTTGGTACTGGATCAGGCAGTCCCTTCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTTCCGGTCCAAGTGGTATAATGACTATGCCGACTCTGTGAAAAGTCGATTAACCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAATTAAGTCTGTGAGTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGGGCAATACACTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA（配列番号５９）；
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCACCAAGGCTGCTTGGTACTGGATCAGGCAGTCCCTTCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTTCCGGTCCAAGTGGTATAATGACTATGCCGACTCTGTGAAAAGTCGATTAACCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAATTAAGTCTGTGAGTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGGGCAATACACTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA（配列番号５９）；
【0129】
軽鎖可変領域のアミノ酸配列は：
QSALIQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYDLVSWYQQYPGQAPRLIIYEVIKRPSGISDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYAGRRLHGVFGGGTQLTVL（配列番号５６）；
ここで、下線部はＣＤＲ１、２および３を構成し、それぞれ配列番号２１、１７および１８に対応し、非下線部はＦＲ１、２、３および４を構成し、それぞれ配列番号４２～４５に対応する；
QSALIQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYDLVSWYQQYPGQAPRLIIYEVIKRPSGISDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYAGRRLHGVFGGGTQLTVL（配列番号５６）；
ここで、下線部はＣＤＲ１、２および３を構成し、それぞれ配列番号２１、１７および１８に対応し、非下線部はＦＲ１、２、３および４を構成し、それぞれ配列番号４２～４５に対応する；
【0130】
ならびに対応するＤＮＡ配列は：
CAGTCTGCTCTGATTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCCCCTGGACAGTCGATCACTATCTCCTGTACTGGCACCAGTAGTGATGTTGGAGGTTATGACCTTGTCTCCTGGTACCAACAGTACCCGGCCAAGCCCCCAGACTCATCATTTATGAGGTCATTAAGCGGCCCTCAGGGATTTCTGATCGCTTCTCTGGTTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACAATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGCTGATTATTATTGCAGCTCATATGCAGGTAGACGTCTTCATGGTGTGTTCGGAGGAGGCACCCAGCTGACCGTCCTC（配列番号６６）
CAGTCTGCTCTGATTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCCCCTGGACAGTCGATCACTATCTCCTGTACTGGCACCAGTAGTGATGTTGGAGGTTATGACCTTGTCTCCTGGTACCAACAGTACCCGGCCAAGCCCCCAGACTCATCATTTATGAGGTCATTAAGCGGCCCTCAGGGATTTCTGATCGCTTCTCTGGTTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACAATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGCTGATTATTATTGCAGCTCATATGCAGGTAGACGTCTTCATGGTGTGTTCGGAGGAGGCACCCAGCTGACCGTCCTC（配列番号６６）
【0131】
Ｂ６０重鎖可変領域のアミノ酸配列は：
QVQLVQSGAEVKKPASSVKVSCTASGGSFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTTKYAQRFQGRVTITADESTTTAYMELSSLISDDTALYYCTTSRGFSYGWFDYWGQGTLVTVSS（配列番号５３）；
ここで、下線部はＣＤＲ１、２および３を構成し、それぞれ配列番号１、２および１９に対応し、非下線部はＦＲ１、２、３および４を構成し、それぞれ配列番号２２～２５に対応する；
QVQLVQSGAEVKKPASSVKVSCTASGGSFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTTKYAQRFQGRVTITADESTTTAYMELSSLISDDTALYYCTTSRGFSYGWFDYWGQGTLVTVSS（配列番号５３）；
ここで、下線部はＣＤＲ１、２および３を構成し、それぞれ配列番号１、２および１９に対応し、非下線部はＦＲ１、２、３および４を構成し、それぞれ配列番号２２～２５に対応する；
【0132】
対応するＤＮＡ配列は：
CAGGTCCAGCTTGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGCGTCCTCGGTCAAAGTCTCCTGCACGGCTTCTGGCGGCTCCTTCAGCACCTATGCTATCAGTTGGGTGCGACAGGCTCCTGGACAGGGCTTGAATGGATGGGCGGGATCATCCCCATCTTTGGTACAACTAAGTACGCACAGAGGTTCCAGGGCAGGGTCACGATTACCGCGGACGAATCGACGACCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCTGATATCTGACGACACGGCCCTGTATTATTGTACGACGTCTCGTGGATTCAGCTATGGCTGGTTTGACTACTGGGGCCAGGGTACCCTGGTCACCGTCTCCTCA（配列番号６０）；
CAGGTCCAGCTTGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGCGTCCTCGGTCAAAGTCTCCTGCACGGCTTCTGGCGGCTCCTTCAGCACCTATGCTATCAGTTGGGTGCGACAGGCTCCTGGACAGGGCTTGAATGGATGGGCGGGATCATCCCCATCTTTGGTACAACTAAGTACGCACAGAGGTTCCAGGGCAGGGTCACGATTACCGCGGACGAATCGACGACCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCTGATATCTGACGACACGGCCCTGTATTATTGTACGACGTCTCGTGGATTCAGCTATGGCTGGTTTGACTACTGGGGCCAGGGTACCCTGGTCACCGTCTCCTCA（配列番号６０）；
【0133】
軽鎖可変領域のアミノ酸配列は：
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVGIHLAWYQQKLGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPRTFGQGTKVEIK（配列番号４８）；
ここで、下線部はＣＤＲ１、２および３を構成し、それぞれ配列番号４～６に対応し、非下線部はＦＲ１、２、３および４を構成し、それぞれ配列番号２６～２９に対応する；
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVGIHLAWYQQKLGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPRTFGQGTKVEIK（配列番号４８）；
ここで、下線部はＣＤＲ１、２および３を構成し、それぞれ配列番号４～６に対応し、非下線部はＦＲ１、２、３および４を構成し、それぞれ配列番号２６～２９に対応する；
【0134】
ならびに対応するＤＮＡ配列は：
GAAATTGTAATGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGTAGGGCCAGTCAGAGTGTTGGCATACACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACTTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGTAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTTCTTTACCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA（配列番号６２）
GAAATTGTAATGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGTAGGGCCAGTCAGAGTGTTGGCATACACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACTTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGTAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTTCTTTACCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA（配列番号６２）
【0135】
ＢＩＩ６１重鎖可変領域のアミノ酸配列は：
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSASWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYDDYAVSVKSRISINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSQGRYFVNYGMDVWGQGTTVTVSS（配列番号５４）；
ここで、下線部はＣＤＲ１、２０および３を構成し、それぞれ配列番号７、２および９に対応し、非下線部はＦＲ１、２、３および４を構成し、それぞれ配列番号３０～３３に対応する。
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSASWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYDDYAVSVKSRISINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSQGRYFVNYGMDVWGQGTTVTVSS（配列番号５４）；
ここで、下線部はＣＤＲ１、２０および３を構成し、それぞれ配列番号７、２および９に対応し、非下線部はＦＲ１、２、３および４を構成し、それぞれ配列番号３０～３３に対応する。
【0136】
対応するＤＮＡ配列は：
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTTCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATATTACAGGTCCAAATGGTATGATGATTATGCAGTATCTGTGAAAAGTCGAATCAGCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAAGCCAGGGACGATATTTTGTCAACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA（配列番号６１）；
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTTCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATATTACAGGTCCAAATGGTATGATGATTATGCAGTATCTGTGAAAAGTCGAATCAGCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAAGCCAGGGACGATATTTTGTCAACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA（配列番号６１）；
【0137】
軽鎖可変領域のアミノ酸配列は：
DIRLTQSPSSLSASVGDRITITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSG SGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQSYFTPRGITFGPGTKVDIK（配列番号５５）；
ここで、下線部はＣＤＲ１、２および３を構成し、それぞれ配列番号１０～１２に対応し、非下線部はＦＲ１、２、３および４を構成し、それぞれ配列番号３４、４６、３６および３７に対応する；
DIRLTQSPSSLSASVGDRITITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSG SGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQSYFTPRGITFGPGTKVDIK（配列番号５５）；
ここで、下線部はＣＤＲ１、２および３を構成し、それぞれ配列番号１０～１２に対応し、非下線部はＦＲ１、２、３および４を構成し、それぞれ配列番号３４、４６、３６および３７に対応する；
【0138】
対応するＤＮＡ配列は：
GACATCCGGTTGACCCAGTCTCCATCTTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAATCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGTTATTTAAATTGGTATCAACAGAAACCAGGGAAAGCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATGTTGCAACTACTACTGTCAACAGAGTTACTTTACCCCCCGCGGGATCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATA TCAAA（配列番号６５）
GACATCCGGTTGACCCAGTCTCCATCTTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAATCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGTTATTTAAATTGGTATCAACAGAAACCAGGGAAAGCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATGTTGCAACTACTACTGTCAACAGAGTTACTTTACCCCCCGCGGGATCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATA TCAAA（配列番号６５）
【実施例0139】
抗ｈＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ親和性改善酵母ライブラリーの構築。
テンプレートとしてｐＥＥ６．４－Ｂ５０－Ｆｃ、ｐＥＥ６．４－Ｂ６０－ＦｃおよびｐＥＥ６．４－ＢＩＩ６１－Ｆｃプラスミド、ならびに：
ｐＥＥ６．４－Ｆ：
TCTGGTGGTGGTGGTTCTGCTAGC（配列番号８０）および
ｃＭｙｃ－ＢＢＸｈｏＩ：GCCAGATCTCGAGCTATTACAAGTCTTCTTCAGAAATAAGCTTTTGTTCTAGAATTCCG（配列番号８１）
をプライマーとして使用して、標準ＰＣＲ反応をそれぞれ行った。ＰＣＲ産物を精製し、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＮｈｅＩおよびＢｇｌＩＩを用いて市販のｐＣＴ３０２ベクター市販（ａｄｄｇｅｎｅ：＃４１８４５）にクローニングして、組換えプラスミドｐＣＴ３０２－Ｂ５０、ｐＣＴ３０２－Ｂ６０およびｐＣＴ３０２－ＢＩＩ６１を得た。次に、Ginger et al. (2006) Nat Protoc 1(2):755-68に詳述されている方法に基づいて、エラープローンＰＣＲを使用し、ｓｃＦｖランダム変異ＰＣＲ産物を得た。使用したプライマーは：
Ｔ７プロショート：
TAATACGACTCACTATAGGG（配列番号８２）および
スプライス４／Ｌ：
GGCAGCCCCATAAACACACAGTAT（配列番号８３）
テンプレートとしてｐＥＥ６．４－Ｂ５０－Ｆｃ、ｐＥＥ６．４－Ｂ６０－ＦｃおよびｐＥＥ６．４－ＢＩＩ６１－Ｆｃプラスミド、ならびに：
ｐＥＥ６．４－Ｆ：
TCTGGTGGTGGTGGTTCTGCTAGC（配列番号８０）および
ｃＭｙｃ－ＢＢＸｈｏＩ：GCCAGATCTCGAGCTATTACAAGTCTTCTTCAGAAATAAGCTTTTGTTCTAGAATTCCG（配列番号８１）
をプライマーとして使用して、標準ＰＣＲ反応をそれぞれ行った。ＰＣＲ産物を精製し、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＮｈｅＩおよびＢｇｌＩＩを用いて市販のｐＣＴ３０２ベクター市販（ａｄｄｇｅｎｅ：＃４１８４５）にクローニングして、組換えプラスミドｐＣＴ３０２－Ｂ５０、ｐＣＴ３０２－Ｂ６０およびｐＣＴ３０２－ＢＩＩ６１を得た。次に、Ginger et al. (2006) Nat Protoc 1(2):755-68に詳述されている方法に基づいて、エラープローンＰＣＲを使用し、ｓｃＦｖランダム変異ＰＣＲ産物を得た。使用したプライマーは：
Ｔ７プロショート：
TAATACGACTCACTATAGGG（配列番号８２）および
スプライス４／Ｌ：
GGCAGCCCCATAAACACACAGTAT（配列番号８３）
【0140】
このようにして得られたＰＣＲ産物はＦｅｒｍｅｎｔａｓ ＧｅｎｅＪＥＴ ＤＮＡ精製キットを使用して精製し、エタノール沈殿により１μｇ／μｌを超える濃度に濃縮した。Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩを使用して市販ベクターｐＣＴ３０２を二重切断し、同時にＦｅｒｍｅｎｔａｓ ＦａｓｔＡＰ脱リン酸化酵素を使用してベクターの脱リン酸化を行い、その後Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＧｅｎｅＪＥＴ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して精製を再び行い、エタノール沈殿を行って、産物を１μｇ／μｌを超える濃度に濃縮した。酵母の電気形質転換およびインビボ組換えをGinger et al. (2006) Nat. Protoc. 1(2): 755-68に記載された方法に従って行い、親和性成熟酵母ライブラリーを得た。
