特開2023-2571IP Force 特許公報全文掲載

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本願発明は、肝炎、肝線維症、および肝硬変を予防または処置するための組成物に関する。具体的には、本願発明は、生物学的に活性なタンパク質およびＦＧＦ２１変異体タンパク質を含む融合タンパク質；および肝炎、肝線維症、および肝硬変を予防または処置するために有効である融合タンパク質を含む医薬組成物

要約特許出願時に添付された[要約書]

【課題】肝炎、肝線維症、および肝硬変を予防または処置するための組成物を提供する。
【解決手段】（１）野生型線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）タンパク質のＮ－末端から位置９８から１０１でのアミノ酸の、ＥＩＲＰのアミノ酸配列（配列番号：６８）での置換；（２）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ－末端から位置１７０から１７４でのアミノ酸の、ＴＧＬＥＡＶのアミノ酸配列（配列番号：６９）での置換等の変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を含む、ＦＧＦ２１変異体タンパク質を含む融合タンパク質；および免疫グロブリンのＦｃ領域を含む、医薬組成物である。
【選択図】図１３Ａ

この発明についての権利主張の範囲[特許請求の範囲]

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この特許公報に記載されている図面[図面の簡単な説明]から抜粋

【図1A】 図１Ａは、ヒトβ－クロトーが過剰発現されるＨＥＫ２９３細胞系を使用して、ＦＧＦ２１変異体タンパク質を含む融合タンパク質（以下、「ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質」）としての、ＤＦＤ４、ＤＦＤ５、ＤＦＤ６、ＤＦＤ７、ＤＦＤ９、およびＤＦＤ１３のインビトロ活性を示すグラフである。ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質は、変異の導入のために、活性において有意な減少を示さなかった。
【図1B】 図１Ｂは、ヒトβ－クロトーが過剰発現されるＨＥＫ２９３細胞系を使用して、ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質を含む融合タンパク質としての、ＤＦＤ６、ＤＦＤ１３、ＤＦＤ１８、ＤＦＤ７２、ＤＦＤ７３およびＤＦＤ７４のインビトロ活性を示すグラフである。ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質は、変異の導入のために、活性において有意な減少を示さなかった。
【図1C】 図１Ｃは、ヒトβ－クロトーが過剰発現されるＨＥＫ２９３細胞系を使用して、ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質を含む融合タンパク質としての、ＤＦＤ６およびＤＦＤ６（大腸菌）のインビトロ活性を示すグラフである。ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質は、変異の導入のために、活性において有意な減少を示さなかった。
【図2A】 図２Ａは、ヒトβ－クロトーが過剰発現されるＨＥＫ２９３細胞系を使用して、ＦＧＦ２１のＮ－末端およびＦｃ領域を連結するリンカーが導入されたＦＧＦ２１変異体融合タンパク質としての、ＤＦＤ３およびＤＦＤ４のインビトロ活性を示すグラフである。ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質は、わずかな違いがリンカー配列に依存して活性において示されたが、活性において有意な減少を示さなかった。
【図2B】 図２Ｂは、ヒトβ－クロトーが過剰発現されるＨＥＫ２９３細胞系を使用して、ＦＧＦ２１のＮ－末端およびＦｃ領域を連結するリンカーが導入されたＦＧＦ２１変異体融合タンパク質としての、ＤＦＤ１およびＤＦＤ１３のインビトロ活性を示すグラフである。ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質は、わずかな違いがリンカー配列に依存して活性において示されたが、活性において有意な減少を示さなかった。
【図3】 図３は、ヒトβ－クロトーが過剰発現されるＨＥＫ２９３細胞系を使用して、ＲＧＥ（Ａｍｇｅｎ）、Ｆｃ－ＦＧＦ２１（Ｌｉｌｌｙ）およびＤＦＤ１のインビトロ活性を示すグラフである。ＤＦＤ１およびＲＧＥ（Ａｍｇｅｎ）は、同様の活性を有したが、Ｆｃ－ＦＧＦ２１（Ｌｉｌｌｙ）は、他のタンパク質よりも２倍高いインビトロ活性を有した。
【図4A】 図４Ａは、ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質であるＤＦＤ４のサイズ排除クロマトグラフィー分析の結果である。
【図4B】 図４Ｂは、ＥＩＲＰ変異が導入されたＦＧＦ２１変異体融合タンパク質であるＤＦＤ１３のサイズ排除クロマトグラフィー分析の結果である。
【図4C】 図４Ｃは、融合タンパク質の安定性に対するＦＧＦ２１のＥＩＲＰ変異の効果を立証するためにサイズ排除クロマトグラフィーを使用してＤＦＤ４およびＤＦＤ１３の提案された含有量の高分子量凝集体（ＨＭＷ％）を比較するグラフである。ＤＦＤ１３が、ＤＦＤ４と比較して、最初の段階および２週間以上後の時点で、低い割合の高分子量凝集体（ＨＭＷ％）と関連したことを立証し、ＥＩＲＰ変異の導入がＦＧＦ２１変異体融合タンパク質の安定性を改良し、それによりＨＭＷ％を有意に低下させることを示す。
【図5】 図５は、ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質の皮下投与後９６時間にわたる血液中のそれぞれのタンパク質の濃度を示す。データは平均値および標準偏差として示される。
【図6A】 図６Ａは、投与の時点から１４日までの食餌性肥満マウスモデルにおいてＤＦＤ１８の単一の投与後にグラム単位にて表された体重の変化を示すグラフである。ＤＦＤ１８は、優れた体重減少効果を示した。データは平均値および平均の標準誤差として示される。
【図6B】 図６Ｂは、投与の時点から１４日までの食餌性肥満マウスモデルにおいてＤＦＤ１８の単一の投与後に％単位にて表された体重の変化を示すグラフである。ＤＦＤ１８は、優れた体重減少効果を示した。データは平均値および平均の標準誤差として示される。
【図7】 図７は、ヒトＧＬＰ－１受容体が過剰発現されるＣＨＯ細胞系を使用して、ＧＬＰ－１変異体およびＧＬＰ－１のＣ－末端をＦｃ領域に連結するヒンジに依存して、融合タンパク質のインビトロＧＬＰ－１活性を示すグラフである。一般的に、ＧＬＰ－１（Ａ２Ｇ）配列を含む融合タンパク質（ＤＦＤ２３）は、他のＧＬＰ－１変異体配列を含む他の融合タンパク質よりも２から３倍低い活性を示した。ＧＬＰ－１活性において有意な差異は、ＧＬＰ－１（Ａ２Ｇ）配列以外の変異体配列を含む融合タンパク質間で示さなかった。
【図8A】 図８Ａは、ＤＦＤ５９、ＤＦＤ６９、ＤＦＤ１１２およびＤＦＤ１１４のＧＬＰ－１活性を示すグラフである。３つの融合タンパク質（ＤＦＤ６９、ＤＦＤ１１２およびＤＦＤ１１４）およびＦＧＦ２１を含まないＦｃ－融合ＧＬＰ－１変異体のインビトロＧＬＰ－１活性を、ヒトＧＬＰ－１受容体が過剰発現されるＣＨＯ細胞系を使用して、測定した。３つの融合タンパク質は、同様のＥＣ５０値を示し、Ｆｃ－融合ＧＬＰ－１変異体（ＤＦＤ５９）は、融合タンパク質よりも約２倍高い活性を示した。
【図8B】 図８Ｂは、ＤＦＤ６９、ＤＦＤ１１２、およびＤＦＤ１１４のＦＧＦ２１活性を示すグラフである。ＦＧＦ２１変異体に依存する融合タンパク質のインビトロ活性を、ヒトβ－クロトーが過剰発現されるＨＥＫ２９３細胞系を使用して、測定した。ＦＧＦ２１部分のインビトロ活性が３つの融合タンパク質において同様であったことを立証した。
【図9A】 図９Ａは、融合タンパク質ＤＦＤ６９、ＤＦＤ１１２、およびＤＦＤ１１４のＦＧＦ２１部分の、皮下投与後にわたる血清薬物濃度を示すグラフである。データは平均値および標準偏差として示される。
【図9B】 図９Ｂは、融合タンパク質ＤＦＤ５９、ＤＦＤ６９、ＤＦＤ１１２、およびＤＦＤ１１４のＧＬＰ－１部分の、皮下投与後にわたる血清薬物濃度を示すグラフである。データは平均値および標準偏差として示される。
【図10A】 図１０Ａは、２週間、４日間の間隔で食餌性肥満マウスモデルにおいてＤＦＤ１１４、ＤＦＤ１１２、ＤＦＤ７４またはＤＦＤ７２の反復皮下投与後の血清トリグリセリド（ＴＧ）における変化を示すグラフである。融合タンパク質およびＦＧＦ２１変異体融合タンパク質の投与は、コントロールグループと比較して、血清脂質低下効果を示した。データは平均値および平均の標準誤差として示される。統計分析は、一元配置分散分析後のＤｕｎｎｅｔの多重比較検定によって行われた（＊＊＊：Ｐ＜０．００１ ｖｓ． ビヒクルコントロール）。
【図10B】 図１０Ｂは、２週間、４日間の間隔で食餌性肥満マウスモデルにおいてＤＦＤ１１４、ＤＦＤ１１２、ＤＦＤ７４またはＤＦＤ７２の反復皮下投与後の血清総コレステロール（ＴＣ）における変化を示すグラフである。融合タンパク質およびＦＧＦ２１変異体融合タンパク質の投与は、コントロールグループと比較して、血清脂質低下効果を示した（＊＊＊：Ｐ＜０．００１ ｖｓ． ビヒクルコントロール）。
【図10C】 図１０Ｃは、２週間、４日間の間隔で食餌性肥満マウスモデルにおいてＤＦＤ１１４、ＤＦＤ１１２、ＤＦＤ７４またはＤＦＤ７２の反復皮下投与後の肝臓におけるトリグリセリド（ＴＧ）における変化を示すグラフである。ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質の投与は、コントロールグループと比較して、肝臓における脂質低下効果を示した（＊：Ｐ＜０．０５、＊＊＊： Ｐ＜０．００１ ｖｓ． ビヒクルコントロール）。
【図11】 図１１は、２週間、４日間の間隔で食餌性肥満マウスモデルにおいてＤＦＤ１１４またはＤＦＤ１１２の反復皮下投与によって得られた肝臓の組織病理学的写真を示す。融合タンパク質の投与は、コントロールグループと比較して、肝臓脂肪症－低下効果を示した。
【図12A】 図１２Ａは、４週間、２日間の間隔でメチオニンコリン欠乏（ＭＣＤ）食餌誘発性非アルコール性脂肪性肝炎マウスモデルにおいてＤＦＤ１１２およびＤＦＤ７２の反復皮下投与後のＡＬＴレベルにおける変化を示すグラフである。ＡＬＴレベルは、コントロールグループと比較して、融合タンパク質－処置グループにおいて用量依存的に減少し、ＡＬＴレベルは、ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質－処置グループにおいても減少した。データは平均値および平均の標準誤差として示される。統計分析は、一元配置分散分析後のＤｕｎｎｅｔの多重比較検定によって行われた（＃＃＃：Ｐ＜０．００１ ｖｓ． ＭＣＳコントロール、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊： Ｐ＜０．００１ ｖｓ． ＭＣＤコントロール）。
【図12B】 図１２Ｂは、４週間、２日間の間隔でメチオニンコリン欠乏（ＭＣＤ）食餌誘発性非アルコール性脂肪性肝炎マウスモデルにおいてＤＦＤ１１２およびＤＦＤ７２の反復皮下投与後のＡＳＴレベルにおける変化を示すグラフである。ＡＳＴレベルは、コントロールグループと比較して、融合タンパク質－処置グループにおいて用量依存的に減少し、ＡＳＴレベルは、ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質－処置グループにおいても減少した（＃＃＃：Ｐ＜０．００１ ｖｓ． ＭＣＳコントロール、＊＊：Ｐ＜０．０１ ｖｓ． ＭＣＤコントロール）。
【図12C】 図１２Ｃは、４週間、２日間の間隔でメチオニンコリン欠乏（ＭＣＤ）食餌誘発性非アルコール性脂肪性肝炎マウスモデルにおいてＤＦＤ１１２およびＤＦＤ７２の反復皮下投与後の炎症レベルにおける変化を示すグラフである。炎症レベルは、コントロールグループと比較して、融合タンパク質－処置グループにおいて用量依存的に減少し、炎症レベルは、ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質－処置グループにおいても減少した（＃＃＃：Ｐ＜０．００１ ｖｓ． ＭＣＳコントロール、＊＊＊：Ｐ＜０．００１ ｖｓ． ＭＣＤコントロール）。
【図13A】 図１３Ａは、４週間、２日間の間隔でＭＣＤ食餌誘発性非アルコール性脂肪性肝炎マウスモデルにおいてＤＦＤ１１２およびＤＦＤ７２の反復皮下投与後の肝臓における線維症関連指標であるアルファ平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）における変化を示すグラフである。α－ＳＭＡの発現は、メチオニンコリン標準（ＭＣＳ）コントロールグループと比較して、ＭＣＤコントロールグループにおいて増加した。他方では、融合タンパク質－処置グループおよびＦＧＦ２１変異体融合タンパク質－処置グループにおけるα－ＳＭＡレベルは、コントロールグループと比較して、減少した。データは平均値および平均の標準誤差として示される。統計分析は、一元配置分散分析後のＤｕｎｎｅｔの多重比較検定によって行われた（＃＃＃：Ｐ＜０．００１ ｖｓ． ＭＣＳコントロール、＊＊＊：Ｐ＜０．００１ ｖｓ． ＭＣＤコントロール）。
【図13B】 図１３Ｂは、４週間、２日間の間隔でＭＣＤ食餌誘発性非アルコール性脂肪性肝炎マウスモデルにおいてＤＦＤ１１２およびＤＦＤ７２の反復皮下投与後の肝臓における線維症関連指標である形質転換増殖因子－ベータ（ＴＧＦ－β）における変化を示すグラフである。ＴＧＦ－βの発現は、ＭＣＳコントロールグループと比較して、ＭＣＤコントロールグループにおいて増加した。他方では、融合タンパク質－処置グループおよびＦＧＦ２１変異体融合タンパク質－処置グループにおけるＴＧＦ－βレベルは、コントロールグループと比較して、減少した（＃＃＃：Ｐ＜０．００１ ｖｓ． ＭＣＳコントロール、＊＊＊：Ｐ＜０．００１ ｖｓ． ＭＣＤコントロール）。
【図13C】 図１３Ｃは、４週間、２日間の間隔でＭＣＤ食餌誘発性非アルコール性脂肪性肝炎マウスモデルにおいてＤＦＤ１１２およびＤＦＤ７２の反復皮下投与後の肝臓における線維症関連指標であるＰｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ染色の結果を示すグラフである。コラーゲンの量は、ＭＣＳコントロールグループと比較して、ＭＣＤコントロールグループにおいて増加した。他方では、融合タンパク質－処置グループおよびＦＧＦ２１変異体融合タンパク質－処置グループにおけるＰｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ Ｒｅｄレベルは、コントロールグループと比較して、減少した（＃＃＃：Ｐ＜０．００１ ｖｓ． ＭＣＳコントロール、＊＊：Ｐ＜０．０１ ｖｓ． ＭＣＤコントロール）。
【図14】 図１４は、肝臓の組織病理学的写真を示す。肝臓組織における脂肪は有意に低下した。
【図15A】 図１５Ａは、８週間、２日間の間隔で食餌性肥満および非アルコール性脂肪性肝炎マウスモデルにおいてＤＦＤ１１２の反復皮下投与後の血液生化学的指標であるＡＬＴレベルにおける変化を示すグラフである。融合タンパク質が投与されたとき、血清ＡＬＴ低下効果が、コントロールグループと比較して観察された。データは平均値および平均の標準誤差として示される。統計分析は、一元配置分散分析後のＤｕｎｎｅｔの多重比較検定によって行われた（＊＊＊：Ｐ＜０．００１）。
【図15B】 図１５Ｂは、８週間、２日間の間隔で食餌性肥満および非アルコール性脂肪性肝炎マウスモデルにおいてＤＦＤ１１２の反復皮下投与後のＡＳＴレベルにおける変化を示すグラフである。融合タンパク質が投与されたとき、血清ＡＳＴ低下効果が、コントロールグループと比較して観察された（＊＊＊：Ｐ＜０．００１）。
【図15C】 図１５Ｃは、８週間、２日間の間隔で食餌性肥満および非アルコール性脂肪性肝炎マウスモデルにおいてＤＦＤ１１２の反復皮下投与後のＴＧにおける変化を示すグラフである。融合タンパク質が投与されたとき、血清ＴＧ低下効果が、コントロールグループと比較して観察された（＊：Ｐ＜０．０５、＊＊＊：Ｐ＜０．００１）。
【図15D】 図１５Ｄは、８週間、２日間の間隔で食餌性肥満および非アルコール性脂肪性肝炎マウスモデルにおいてＤＦＤ１１２の反復皮下投与後のＴＣレベルにおける変化を示すグラフである。融合タンパク質が投与されたとき、血清ＴＣ低下効果が、コントロールグループと比較して観察された（＊＊＊：Ｐ＜０．００１）。
【図16A】 図１６Ａは、８週間、２日間の間隔で食餌性肥満および非アルコール性脂肪性肝炎マウスモデルにおいてＤＦＤ１１２の反復皮下投与後の肝臓における投与前および投与後間のＮＡＦＬＤ活性スコア（ＮＡＳ）における変化を示すグラフを提供する。融合タンパク質が投与されたとき、投与後ＮＡＦＬＤ活性スコアは、投与前スコアと比較して減少した。
【図16B】 図１６Ｂは、８週間、２日間の間隔で食餌性肥満および非アルコール性脂肪性肝炎マウスモデルにおいてＤＦＤ１１２の反復皮下投与後の肝臓における投与前および投与後間の肝臓線維症スコアにおける変化を示すグラフを提供する。融合タンパク質が投与されたとき、投与後肝臓線維症スコアは、投与前スコアと比較して減少した。
【図17A】 図１７Ａは、８週間、２日間の間隔でチオアセトアミド（ＴＡＡ）－誘発性肝線維症ラットモデルにおいてＤＦＤ１１２の反復皮下投与後の血液生化学的指標であるＡＬＰレベルにおける変化を示すグラフである。融合タンパク質が投与されたとき、血清ＡＬＰ低下効果が、ＴＡＡコントロールグループと比較して観察された。データは平均値および平均の標準誤差として示される。統計分析は、一元配置分散分析後のＤｕｎｎｅｔの多重比較検定によって行われた（＃＃＃：Ｐ＜０．００１ ｖｓ． 正常コントロール、＊＊：Ｐ＜０．０１ ｖｓ． ＴＡＡコントロール）。
【図17B】 図１７Ｂは、８週間、２日間の間隔でチオアセトアミド（ＴＡＡ）－誘発性肝線維症ラットモデルにおいてＤＦＤ１１２の反復皮下投与後の血液生化学的指標であるＧＧＴレベルにおける変化を示すグラフである。融合タンパク質が投与されたとき、血清ＧＧＴ低下効果が、ＴＡＡコントロールグループと比較して観察された（＃＃＃：Ｐ＜０．００１ ｖｓ． 正常コントロール、＊：Ｐ＜０．０５ ｖｓ． ＴＡＡコントロール）。
【図17C】 図１７Ｃは、８週間、２日間の間隔でチオアセトアミド（ＴＡＡ）－誘発性肝線維症ラットモデルにおいてＤＦＤ１１２の反復皮下投与後の血液生化学的指標であるＴ－ＢＩＬレベルにおける変化を示すグラフである。融合タンパク質が投与されたとき、血清Ｔ－ＢＩＬ低下効果が、コントロールグループと比較して観察された（＃＃：Ｐ＜０．０１ ｖｓ． 正常コントロール、＊：Ｐ＜０．０５ ｖｓ． ＴＡＡコントロール）。
【図17D】 図１７Ｄは、８週間、２日間の間隔でチオアセトアミド（ＴＡＡ）－誘発性肝線維症ラットモデルにおいてＤＦＤ１１２の反復皮下投与後の肝臓における線維症領域における変化を示すグラフである。融合タンパク質が投与されたとき、線維症領域低下効果が、コントロールグループと比較して観察された（＃＃＃：Ｐ＜０．００１ ｖｓ． 正常コントロール、＊＊＊：Ｐ＜０．００１ ｖｓ． ＴＡＡコントロール）。

選択図 図13A出願人が指定した本件の代表的な図

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