特開2023-26539IP Force 特許公報全文掲載

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技術分野

関連出願の相互参照 本出願は、２０１７年１月１１日に出願された米国特許出願第６２／４４４，９８７号の優先権を主張し、その各々の内容が参照により本明細書に組み入れられる。

要約特許出願時に添付された[要約書]

【課題】Ｒ－スポンジン（ＲＳＰＯ）サロゲート組成物及びそれを使用するための方法を提供すること。
【解決手段】本発明のＲＳＰＯサロゲートは、（ｉ）ＲＩＮＧフィンガータンパク質４３（ＲＮＦ４３）またはジンク及びＲＩＮＧフィンガータンパク質３（ＺＮＲＦ３）のための特異的結合ドメインと、（ｉｉ）細胞標的化ドメインとを含み、より具体的には、ＲＮＦ４３またはＺＮＲＦ３のための特異的結合ドメインは抗体断片であり、細胞標的化ドメインはサイトカインである。
【選択図】なし

この発明についての権利主張の範囲[特許請求の範囲]

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この特許公報に記載されている図面[図面の簡単な説明]から抜粋

【図1】 サロゲートＲＳＰＯタンパク質の例。
【図2】 抗体のスクリーニング。ＲＮＦ４３またはＺＮＲＦ３に特異的なｓｃＦｖ抗体断片を生成するため、ナイーブなヒトｓｃＦｖコンストラクトの酵母ディスプレイライブラリーから結合物質が選択された。
【図3】 ＺＮＲＦ３に特異的に結合するＺ６ ｓｃＦｖをヒトＩＬ２と融合させることにより、候補サロゲートＲＳＰＯを生成した。
【図4】 Ｚ６－ＩＬ２融合体を昆虫細胞内で発現させ、ニッケル及びゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した。Ｚ６－ＩＬ２は、ゲル濾過カラムから単分散ピークとして溶離しており、このことは当該タンパク質が凝集せず、好ましい生化学的挙動を有することを示している。
【図5-1】 サロゲートＲＳＰＯの生物学的効果。
【図5-2】 サロゲートＲＳＰＯの生物学的効果。
【図6】 さらなるサロゲートＲＳＰＯコンストラクト。
【図7】 Ｒ－スポンジンシグナリング機構。ＲＳＰＯの不在下では、ＺＮＲＦ３はＦｚｄ受容体の膜クリアランスを推進して、Ｗｎｔシグナリングをネガティブに制御する。ＲＳＰＯ媒介によるＲＮＦ４３及びＺＮＲＦ３のＥＣＤと、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５、またはＬＧＲ６との架橋は、ＲＮＦ４３／ＺＮＲＦ３を隔離してＦｚｄ表面レベルを回復し、それによってＷｎｔ活性を増強する。サロゲートＲＳＰＯは、ＲＮＦ４３またはＺＮＲＦ３と、リガンド結合の際にエンドサイトーシスを経ることが知られている組織特異的マーカーとを架橋することにより、野生型ＲＳＰＯの機能を模倣する。
【図8A-C】 ＲＮＦ４３及びＺＮＲＦ３に特異的なｓｃＦｖの特性決定。（Ａ）酵母ディスプレイされたＲ５及びＺ６ ｓｃＦｖとＲＮＦ４３及びＺＮＲＦ３との結合をそれぞれ示す、フローサイトメトリードットプロット。Ｒ５またはＺ６発現酵母を１ｕＭ濃度のＲＮＦ４３またはＺＮＲＦ３で染色し、ｃ－Ｍｙｃエピトープに対する抗体で表面発現を検出した。（Ｂ）Ｒ５－ＩＬ２及びＺ６－ＩＬ２サロゲートＲＳＰＯのコンストラクト設計。（Ｃ）及び（Ｄ）。ＳＰＲを使用して、Ｒ５－ＩＬ２またはＺ６－ＩＬ２と、ＲＮＦ４３及びＺＮＲＦ３との結合をそれぞれ測定した。解離定数は、１：１結合モデルに対するフィッティング値から得た。
【図8D】 ＲＮＦ４３及びＺＮＲＦ３に特異的なｓｃＦｖの特性決定。（Ａ）酵母ディスプレイされたＲ５及びＺ６ ｓｃＦｖとＲＮＦ４３及びＺＮＲＦ３との結合をそれぞれ示す、フローサイトメトリードットプロット。Ｒ５またはＺ６発現酵母を１ｕＭ濃度のＲＮＦ４３またはＺＮＲＦ３で染色し、ｃ－Ｍｙｃエピトープに対する抗体で表面発現を検出した。（Ｂ）Ｒ５－ＩＬ２及びＺ６－ＩＬ２サロゲートＲＳＰＯのコンストラクト設計。（Ｃ）及び（Ｄ）。ＳＰＲを使用して、Ｒ５－ＩＬ２またはＺ６－ＩＬ２と、ＲＮＦ４３及びＺＮＲＦ３との結合をそれぞれ測定した。解離定数は、１：１結合モデルに対するフィッティング値から得た。
【図9A】 サロゲートＲＳＰＯによるＷｎｔシグナリング増強。ＣＤ２５発現細胞におけるサロゲートＲＳＰＯのＷｎｔ活性増強を測定するルシフェラーゼレポーターアッセイ。レンチウイルスによりＣＤ２５を形質導入したＨＥＫ ＳＴＦ ２９３Ｔ細胞を、２０％のＷｎｔ３ａ条件培地の存在下で、様々な組換えタンパク質と共にインキュベートした。
【図9B】 Ａと同じ条件下で、非感染（ＣＤ２５陰性）ＨＥＫ ＳＴＦ ２９３Ｔ細胞を用いてレポーターアッセイを実施した。
【図10】 サロゲートＲＳＰＯによる腸管オルガノイド成長への刺激。ＣＤ２５を発現するようにレンチウイルスにより形質導入したＬＧＲ５＋ヒト結腸オルガノイドの成長を刺激する能力について、サロゲートＲＳＰＯを試験した。培地が欠如したＲＳＰＯ２に５００ｎＭ濃度の指示タンパク質を追加し、オルガノイドの成長を顕微鏡（上）及び蛍光（棒グラフ、下）によりモニターした。右側の棒グラフは、左側のグラフの着色領域を拡大したパネルである。
【図11】 ゲル濾過カラムからの単分散ピークとして溶出するＲ５－ＩＬ２及びＺ６－ＩＬ２タンパク質。Ｒ５－ＩＬ２（左）及びＺ６－ＩＬ２（右）のＵＶ２８０吸光度のゲル濾過プロファイルからのＵＶ２８０吸光度を示している。

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