特開 2023-2680 パラミクソウイルスおよび／またはニューモウイルスのＦタンパク質を表示する自己アセンブリするタンパク質ナノ構造およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023002680

(43)【公開日】2023-01-10

(54)【発明の名称】パラミクソウイルスおよび／またはニューモウイルスのＦタンパク質を表示する自己アセンブリするタンパク質ナノ構造およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20221227BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20221227BHJP

   C07K 14/115 20060101ALI20221227BHJP

   C12N 15/45 20060101ALI20221227BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20221227BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20221227BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20221227BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20221227BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20221227BHJP

   C07K 1/02 20060101ALI20221227BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20221227BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20221227BHJP

   A61K 39/155 20060101ALI20221227BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20221227BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20221227BHJP

   A61K 47/65 20170101ALI20221227BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20221227BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20221227BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z

C07K19/00 ZNA

C07K14/115

C12N15/45

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C07K1/02

A61K9/14

A61K39/12

A61K39/155

A61K39/39

A61K47/64

A61K47/65

A61P31/14

A61P37/04

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022167524

(22)【出願日】2022-10-19

(62)【分割の表示】P 2019554692の分割

【原出願日】2018-04-03

(31)【優先権主張番号】62/481,331

(32)【優先日】2017-04-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．プルロニック

(71)【出願人】

【識別番号】514104933

【氏名又は名称】ユニヴァーシティ オブ ワシントン

(71)【出願人】

【識別番号】511012938

【氏名又は名称】インスティテュート フォー リサーチ イン バイオメディシン

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】キング，ネイル，ピー．

(72)【発明者】

【氏名】ベイカー，デイビッド

(72)【発明者】

【氏名】ニッカーソン，ブルーク

(72)【発明者】

【氏名】スチュワート，ランス，ジョセフ

(72)【発明者】

【氏名】ペレス，ローラン

(72)【発明者】

【氏名】ランザベッキア，アントニオ

(72)【発明者】

【氏名】マーカンダリ，ジェシカ

(57)【要約】      （修正有）

【課題】ナノ構造およびその使用を提供する。
【解決手段】ナノ構造が、（ａ）複数の第１のアセンブリであって、各々の第１のアセンブリが複数の同一の第１のポリペプチドを含む、複数の第１のアセンブリ；（ｂ）複数の第２のアセンブリであって、各々の第２のアセンブリが複数の同一の第２のポリペプチドを含み、第２のポリペプチドが第１のポリペプチドと異なる、複数の第２のアセンブリを含み；複数の第１のアセンブリが複数の第２のアセンブリと非共有結合的に相互作用してナノ構造を形成し；ナノ構造が、１つまたは複数のパラミクソウイルスおよび／もしくはニューモウイルスのＦタンパク質、またはその抗原フラグメントの複数のコピーをナノ構造の外面に表示している、ナノ構造およびその使用を提供する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ナノ構造であって、
（ａ）複数の第１のアセンブリであって、各々の第１のアセンブリが複数の同一の第１のポリペプチドを含む、複数の第１のアセンブリ；
（ｂ）複数の第２のアセンブリであって、各々の第２のアセンブリが複数の同一の第２のポリペプチドを含み、前記第２のポリペプチドが前記第１のポリペプチドと異なる、複数の第２のアセンブリ；
を含み、
前記複数の第１のアセンブリが前記複数の第２のアセンブリと非共有結合的に相互作用してナノ構造を形成し；
前記ナノ構造が、１つまたは複数のパラミクソウイルスおよび／もしくはニューモウイルスのＦタンパク質、またはその抗原フラグメントの複数のコピーを前記ナノ構造の外面に表示している、ナノ構造。

【請求項2】

（ａ）前記第１のポリペプチドが、配列番号１～５１からなる群から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｂ）前記第２のポリペプチドが、配列番号１～５１からなる群から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１に記載のナノ構造。

【請求項3】

前記１つまたは複数のパラミクソウイルスおよび／もしくはニューモウイルスのＦタンパク質、またはその抗原フラグメントが、配列番号５３、６１～６８、および１０１からなる群から選択されるポリペプチドに対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１または２に記載のナノ構造。

【請求項4】

前記１つまたは複数のパラミクソウイルスおよび／もしくはニューモウイルスのＦタンパク質、またはその抗原フラグメントが、配列番号５３および６１～６４からなる群から選択されるＲＳＶ Ｆタンパク質またはその変異体に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含み、前記ポリペプチドは、以下の残基：６７Ｉ、１４９Ｃ、４５８Ｃ、４６Ｇ、４６５Ｑ、２１５Ｐ、９２Ｄ、および４８７Ｑのうちの１つまたは複数を含む、請求項１または２に記載のナノ構造。

【請求項5】

前記１つまたは複数のパラミクソウイルスおよび／もしくはニューモウイルスのＦタンパク質、またはその抗原フラグメントが、配列番号６５～６８および１０１からなる群から選択されるＭＰＶ Ｆタンパク質またはその変異体に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが、以下の残基：１１３Ｃ、１２０Ｃ、３３９Ｃ、１６０Ｆ、１７７Ｌ、１８５Ｐ、および４２６Ｃのうちの１つまたは複数を含む、請求項１または２に記載のナノ構造。

【請求項6】

前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドは、以下の対：
配列番号１および配列番号２（Ｉ５３－３４ＡおよびＩ５３－３４Ｂ）；
配列番号３および配列番号４（Ｉ５３－４０ＡおよびＩ５３－４０Ｂ）；
配列番号３および配列番号２４（Ｉ５３－４０ＡおよびＩ５３－４０Ｂ．１）；
配列番号２３および配列番号４（Ｉ５３－４０Ａ．１およびＩ５３－４０Ｂ）；
配列番号３５および配列番号３６（Ｉ５３－４０Ａ属およびＩ５３－４０Ｂ属）；
配列番号５および配列番号６（Ｉ５３－４７ＡおよびＩ５３－４７Ｂ）；
配列番号５および配列番号２７（Ｉ５３－４７ＡおよびＩ５３－４７Ｂ．１）；
配列番号５および配列番号２８（Ｉ５３－４７ＡおよびＩ５３－４７Ｂ．１ＮｅｇＴ２）；
配列番号２５および配列番号６（Ｉ５３－４７Ａ．１およびＩ５３－４７Ｂ）；
配列番号２５および配列番号２７（Ｉ５３－４７Ａ．１およびＩ５３－４７Ｂ．１）；
配列番号２５および配列番号２８（Ｉ５３－４７Ａ．１およびＩ５３－４７Ｂ．１ＮｅｇＴ２）；
配列番号２６および配列番号６（Ｉ５３－４７Ａ．１ＮｅｇＴ２およびＩ５３－４７Ｂ）；
配列番号２６および配列番号２７（Ｉ５３－４７Ａ．１ＮｅｇＴ２およびＩ５３－４７Ｂ．１）；
配列番号２６および配列番号２８（Ｉ５３－４７Ａ．１ＮｅｇＴ２およびＩ５３－４７Ｂ．１ＮｅｇＴ２）；
配列番号３７および配列番号３８（Ｉ５３－４７Ａ属およびＩ５３－４７Ｂ属）；
配列番号７および配列番号８（Ｉ５３－５０ＡおよびＩ５３－５０Ｂ）；
配列番号７および配列番号３２（Ｉ５３－５０ＡおよびＩ５３－５０Ｂ．１）；
配列番号７および配列番号３３（Ｉ５３－５０ＡおよびＩ５３－５０Ｂ．１ＮｅｇＴ２）；
配列番号７および配列番号３４（Ｉ５３－５０ＡおよびＩ５３－５０Ｂ．４ＰｏｓＴ１）；
配列番号２９および配列番号８（Ｉ５３－５０Ａ．１およびＩ５３－５０Ｂ）；
配列番号２９および配列番号３２（Ｉ５３－５０Ａ．１およびＩ５３－５０Ｂ．１）；
配列番号２９および配列番号３３（Ｉ５３－５０Ａ．１およびＩ５３－５０Ｂ．１ＮｅｇＴ２）；
配列番号２９および配列番号３４（Ｉ５３－５０Ａ．１およびＩ５３－５０Ｂ．４ＰｏｓＴ１）；
配列番号３０および配列番号８（Ｉ５３－５０Ａ．１ＮｅｇＴ２およびＩ５３－５０Ｂ）；
配列番号３０および配列番号３２（Ｉ５３－５０Ａ．１ＮｅｇＴ２およびＩ５３－５０Ｂ．１）；
配列番号３０および配列番号３３（Ｉ５３－５０Ａ．１ＮｅｇＴ２およびＩ５３－５０Ｂ．１ＮｅｇＴ２）；
配列番号３０および配列番号３４（Ｉ５３－５０Ａ．１ＮｅｇＴ２およびＩ５３－５０Ｂ．４ＰｏｓＴ１）；
配列番号３１および配列番号８（Ｉ５３－５０Ａ．１ＰｏｓＴ１およびＩ５３－５０Ｂ）；
配列番号３１および配列番号３２（Ｉ５３－５０Ａ．１ＰｏｓＴ１およびＩ５３－５０Ｂ．１）；
配列番号３１および配列番号３３（Ｉ５３－５０Ａ．１ＰｏｓＴ１およびＩ５３－５０Ｂ．１ＮｅｇＴ２）；
配列番号３１および配列番号３４（Ｉ５３－５０Ａ．１ＰｏｓＴ１およびＩ５３－５０Ｂ．４ＰｏｓＴ１）；
配列番号３９および配列番号４０（Ｉ５３－５０Ａ属およびＩ５３－５０Ｂ属）；
配列番号９および配列番号１０（Ｉ５３－５１ＡおよびＩ５３－５１Ｂ）；
配列番号１１および配列番号１２（Ｉ５２－０３ＡおよびＩ５２－０３Ｂ）；
配列番号１３および配列番号１４（Ｉ５２－３２ＡおよびＩ５２－３２Ｂ）；
配列番号１５および配列番号１６（Ｉ５２－３３ＡおよびＩ５２－３３Ｂ）
配列番号１７および配列番号１８（Ｉ３２－０６ＡおよびＩ３２－０６Ｂ）；
配列番号１９および配列番号２０（Ｉ３２－１９ＡおよびＩ３２－１９Ｂ）；
配列番号２１および配列番号２２（Ｉ３２－２８ＡおよびＩ３２－２８Ｂ）；
配列番号２３および配列番号２４（Ｉ５３－４０Ａ．１およびＩ５３－４０Ｂ．１）；
配列番号４１および配列番号４２（Ｔ３２－２８ＡおよびＴ３２－２８Ｂ）；
配列番号４３および配列番号４４（Ｔ３３－０９ＡおよびＴ３３－０９Ｂ）；
配列番号４５および配列番号４６（Ｔ３３－１５ＡおよびＴ３３－１５Ｂ）；
配列番号４７および配列番号４８（Ｔ３３－２１ＡおよびＴ３３－２１Ｂ）；
配列番号４９および配列番号５０（Ｔ３３－２８ＡおよびＴ３２－２８Ｂ）；および
配列番号５１および配列番号４４（Ｔ３３－３１ＢおよびＴ３３－０９Ｂ（Ｔ３３－３１Ｂとも呼ばれる））から選択されるアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載のナノ構造。

【請求項7】

前記第１のポリペプチドが、Ｔ３３－３１Ａ（配列番号５１）のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含み、前記第２のポリペプチドが、Ｔ３３－０９Ｂ／Ｔ３３－３１Ｂ（配列番号４４）のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載のナノ構造。

【請求項8】

前記第１のポリペプチドが、Ｔ３３－１５Ｂ（配列番号４６）のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含み、前記第２のポリペプチドが、Ｔ３３－１５Ａ（配列番号４５）のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載のナノ構造。

【請求項9】

前記第１のポリペプチドが、Ｉ５３－５０Ａ（配列番号７）、Ｉ５３－５０Ａ．１（配列番号２９）、Ｉ５３－５０Ａ．１ＮｅｇＴ２（配列番号３０）、およびＩ５３－５０Ａ．１ＰｏｓＴ１（配列番号３１）からなる群から選択されるアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含み、前記第２のポリペプチドが、Ｉ５３－５０Ｂ（配列番号８）、Ｉ５３－５０Ｂ．１（配列番号３２）、Ｉ５３－５０Ｂ．１ＮｅｇＴ２（配列番号３３）、およびＩ５３－５０Ｂ．４ＰｏｓＴ１（配列番号３４）からなる群から選択されるアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載のナノ構造。

【請求項10】

前記第１のポリペプチドが、Ｉ３２－２８Ａ（配列番号２１）のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含み、前記第２のポリペプチドが、Ｉ３２－２８Ｂ（配列番号２２）のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載のナノ構造。

【請求項11】

前記１つまたは複数のパラミクソウイルスおよび／もしくはニューモウイルスのＦタンパク質、またはその抗原フラグメントが、前記第１のポリペプチドとの融合タンパク質として発現される、請求項１～１０のいずれか１項に記載のナノ構造。

【請求項12】

前記複数の第１のアセンブリの各々が同一の融合タンパク質を含む、請求項１１に記載のナノ構造。

【請求項13】

前記複数の第１のアセンブリが、合計で２つ以上のパラミクソウイルスおよび／もしくはニューモウイルスのＦタンパク質、またはその抗原フラグメントを含む、請求項１１に記載のナノ構造。

【請求項14】

前記第１のポリペプチドのサブセットのみが、Ｆタンパク質またはその抗原フラグメントとの融合タンパク質を含む、請求項１１または１２に記載のナノ構造。

【請求項15】

各々の第１のアセンブリが、前記第１のポリペプチドのホモ三量体を含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載のナノ構造。

【請求項16】

前記１つまたは複数のパラミクソウイルスおよび／もしくはニューモウイルスのＦタンパク質、またはその抗原フラグメントが、ＤＳ－Ｃａｖ１（配列番号５３）のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載のナノ構造。

【請求項17】

各々の融合タンパク質が、前記第１のポリペプチドと前記１つまたは複数のパラミクソウイルスおよび／もしくはニューモウイルスのＦタンパク質、またはその抗原フラグメントとの間に配置されたアミノ酸リンカーを含む、請求項１１～１６のいずれか１項に記載のナノ構造。

【請求項18】

前記アミノ酸リンカー配列が、１つまたは複数の三量体化ドメインを含む、請求項１７に記載のナノ構造。

【請求項19】

前記アミノ酸リンカー配列が、アミノ酸配列ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（配列番号５４）を含む、請求項１７または１８に記載のナノ構造。

【請求項20】

前記アミノ酸リンカー配列がＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーを含む、請求項１７に記載のナノ構造。

【請求項21】

前記融合タンパク質が、配列番号６９～１００からなる群から選択されるアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１１～２０のいずれか１項に記載のナノ構造。

【請求項22】

（ａ）各々の融合タンパク質がＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｔ３３－３１Ａ（配列番号６９）またはＤＳ－Ｃａｖ１－Ｔ３３－３１Ａ（配列番号７０）であるとき、各々の第２のポリペプチドはＴ３３－３１Ｂ（配列番号４４）であり；
（ｂ）各々の融合タンパク質がＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｔ３３－１５Ｂ（配列番号７１）またはＤＳ－Ｃａｖ１－Ｔ３３－１５Ｂ（配列番号７２）であるとき、各々の第２のポリペプチドはＴ３３－１５Ａ（配列番号４５）であり；
（ｃ）各々の融合タンパク質がＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｉ５３－５０Ａ（配列番号７３）またはＤＳ－Ｃａｖ１－Ｉ５３－５０Ａ（配列番号７４）であるとき、各々の第２のポリペプチドはＩ５３－５０Ｂ（配列番号８）、Ｉ５３－５０Ｂ．１（配列番号３２）、Ｉ５３－５０Ｂ．１ＮｅｇＴ２（配列番号３３）、またはＩ５３－５０Ｂ．４ＰｏｓＴ１（配列番号３４）であり；あるいは
（ｄ）各々の融合タンパク質がＤＳ－Ｃａｖ１－Ｉ３２－２８Ａ（配列番号７５）であるとき、各々の第２のポリペプチドはＩ３２－２８Ｂ（配列番号２２）である、請求項２１に記載のナノ構造。

【請求項23】

各々の第１のポリペプチドが、アミノ酸リンカーを介して配列番号７（Ｉ５３－５０Ａ）に連結したＤＳ－Ｃａｖ１（配列番号５３）の融合タンパク質を含む、請求項１６に記載のナノ構造。

【請求項24】

前記アミノ酸リンカーが、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーおよび／またはヘリックス伸張ドメインを含む、請求項２３に記載のナノ構造。

【請求項25】

各々の融合タンパク質が、配列番号６９～７７および８１～９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１１～２４のいずれか１項に記載のナノ構造。

【請求項26】

各々の融合タンパク質が、配列番号７６（Ｆ１０）のアミノ酸配列を含む、請求項２３～２４のいずれか１項に記載のナノ構造。

【請求項27】

各々の第２のポリペプチドが、Ｉ５３－５０Ｂ（配列番号８）、Ｉ５３－５０Ｂ．１（配列番号３２）、Ｉ５３－５０Ｂ．１ＮｅｇＴ２（配列番号３３）、またはＩ５３－５０Ｂ．４ＰｏｓＴ１（配列番号３４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２３～２５のいずれか１項に記載のナノ構造。

【請求項28】

各々の第２のポリペプチドが、Ｉ５３－５０Ｂ．４ＰｏｓＴ１（配列番号３４）のアミノ酸配列を含む、請求項２３～２７のいずれか１項に記載のナノ構造。

【請求項29】

前記ナノ構造が、
（ａ）融合前Ｆ特異的抗体（モノクローナル抗体Ｄ２５が含まれるが、これに限定されない）に結合し；
（ｂ）対称構造（正二十面体構造が含まれるが、これに限定されない）を形成し；
（ｃ）５０℃で安定であり；かつ／または
（ｄ）２．２５Ｍ塩酸グアニジン中で安定である、請求項１～２８のいずれか１項に記載のナノ構造。

【請求項30】

請求項１１～２９のいずれか１項に引用された第１のポリペプチド融合タンパク質をコードする、組換え核酸。

【請求項31】

プロモーターに作動可能に連結された請求項３０に記載の組換え核酸を含む、組換え発現ベクター。

【請求項32】

請求項３１に記載の組換え発現ベクターを含む、組換え宿主細胞。

【請求項33】

請求項１～２９のいずれか１項に記載の第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを発現することができる１つまたは複数の組換え発現ベクターを含む、組換え宿主細胞。

【請求項34】

請求項１～２９のいずれか１項に記載のナノ構造を含む免疫原性組成物、および薬学的に許容され得る担体。

【請求項35】

アジュバントをさらに含む、請求項３４に記載の免疫原性組成物。

【請求項36】

被験体においてパラミクソウイルスおよび／またはニューモウイルスのＦタンパク質に対する免疫応答を生じさせる方法であって、それを必要とする前記被験体に、有効量の請求項１～２９および３４～３５のいずれか１項に記載のナノ構造または免疫原性組成物を投与して免疫応答を生じさせる工程を含む、方法。

【請求項37】

被験体においてパラミクソウイルスおよび／またはニューモウイルスの感染を治療または制限する方法であって、それを必要とする前記被験体に、有効量の請求項１～２９および３４～３５のいずれか１項に記載のナノ構造または免疫原性組成物を投与し、それにより、前記被験体におけるパラミクソウイルスおよび／またはニューモウイルスの感染を治療または予防する工程を含む、方法。

【請求項38】

前記投与により前記被験体におけるパラミクソウイルスおよび／またはニューモウイルスの中和抗体が産生される、請求項３６または３７に記載の方法。

【請求項39】

前記中和抗体が、少なくとも１，０００の力価（１／ＩＤ_５０）で前記被験体の血清中に存在する、請求項３９に記載の方法。

【請求項40】

ｉｎ ｖｉｔｒｏで請求項１～２９のいずれか１項に記載のナノ構造をアセンブリさせるプロセスであって、２つ以上のナノ構造の構成成分を水性条件で混合して、前記所望のナノ構造の自発的アセンブリを駆動する工程を含む、プロセス。

【請求項41】

前記混合する工程が、各々がＦタンパク質またはその抗原フラグメント（「Ｆタンパク質」）を含む第１のポリペプチド（三量体の第１のポリペプチドなど）を含む第１のアセンブリを、第２のポリペプチドを含む適切な第２のアセンブリと、第１のポリペプチド：第２のポリペプチドのモル比およそ１：１にて、前記第１のアセンブリおよび前記第２のアセンブリが相互作用して前記ナノ構造を形成するのに適切な条件下および時間で混合する工程を含む、請求項４０に記載のプロセス。

【請求項42】

前記混合する工程が、全数未満の第１のポリペプチド（例えば、７５％、５０％、２５％など）がＦタンパク質を含んでいる第１のポリペプチド（三量体の第１のポリペプチドなど）を含む第１のアセンブリを、第２のポリペプチドを含む適切な第２のアセンブリと、第１のポリペプチド：第２のポリペプチドのモル比およそ１：１にて、前記第１のアセンブリおよび前記第２のアセンブリが相互作用して前記ナノ構造を形成するのに適切な条件下および時間で混合する工程を含む、請求項４０に記載のプロセス。

【請求項43】

前記混合する工程が、各々がＦタンパク質を含む第１のポリペプチド（三量体の第１のポリペプチドなど）を含む第１のアセンブリであって、前記第１のポリペプチド全体で複数の異なるＦタンパク質（例えば、２、３、４、またはそれを超える）を含む、第１のポリペプチドを、第２のポリペプチドを含む適切な第２のアセンブリと、第１のポリペプチド：第２のポリペプチドのモル比およそ１：１にて、前記第１のアセンブリおよび前記第２のアセンブリが相互作用して複数のＦタンパク質またはその抗原フラグメントを含む前記ナノ構造を形成するのに適切な条件下および時間で混合する工程を含む、請求項４０に記載のプロセス。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
本出願は、２０１７年４月４日提出の米国特許仮出願第６２／４８１３３１号（その全体が本明細書中で参考として援用される）の優先権を主張する。

【背景技術】

【0002】

背景
タンパク質の高秩序の対称超分子複合体への分子自己アセンブリおよび共アセンブリは、原子スケールで物質をパターン形成する的確かつ強力な手段である。近年、バイオマテリアル、特に、核酸から構成される自己組織化バイオマテリアルの開発が進んでいる。ＤＮＡは、例えば、ナノスケールの形状およびパターン、分子コンテナ、および三次元の巨視的結晶を作製するために使用されている。自己アセンブリするタンパク質の設計方法の進歩についてはやや遅れているものの、タンパク質の機能性および物理的性質は、高度な機能性材料を開発するための基本単位として魅力的である。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0003】

発明の概要
１つの態様では、ナノ構造であって、
（ａ）複数の第１のアセンブリであって、各々の第１のアセンブリが複数の同一の第１のポリペプチドを含む、複数の第１のアセンブリ；
（ｂ）複数の第２のアセンブリであって、各々の第２のアセンブリが複数の同一の第２のポリペプチドを含み、第２のポリペプチドが第１のポリペプチドと異なる、複数の第２のアセンブリ；
を含み、
複数の第１のアセンブリが複数の第２のアセンブリと非共有結合的に相互作用してナノ構造を形成し；
ナノ構造が、１つまたは複数のパラミクソウイルスおよび／もしくはニューモウイルスのＦタンパク質、またはその抗原フラグメントの複数のコピーをナノ構造の外面に表示している、ナノ構造を提供する。

【0004】

１つの実施形態では、（ａ）第１のポリペプチドが、配列番号１～５１からなる群から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｂ）第２のポリペプチドが、配列番号１～５１からなる群から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。

【0005】

別の実施形態では、１つまたは複数のパラミクソウイルスおよび／もしくはニューモウイルスのＦタンパク質、またはその抗原フラグメントは、配列番号５３、６１～６８、および１０１からなる群から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。

【0006】

種々の実施形態では：
（ａ）第１のポリペプチドは、Ｔ３３－３１Ａ（配列番号５１）のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含み、第２のポリペプチドは、Ｔ３３－０９Ｂ／Ｔ３３－３１Ｂ（配列番号４４）のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含むか；
（ｂ）第１のポリペプチドは、Ｔ３３－１５Ｂ（配列番号４６）のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含み、第２のポリペプチドは、Ｔ３３－１５Ａ（配列番号４５）のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含むか；
（ｃ）第１のポリペプチドは、Ｉ５３－５０Ａ（配列番号７）、Ｉ５３－５０Ａ．１（配列番号２９）、Ｉ５３－５０Ａ．１ＮｅｇＴ２（配列番号３０）、およびＩ５３－５０Ａ．１ＰｏｓＴ１（配列番号３１）からなる群から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有し、第２のポリペプチドは、Ｉ５３－５０Ｂ（配列番号８）、Ｉ５３－５０Ｂ．１（配列番号３２）、Ｉ５３－５０Ｂ．１ＮｅｇＴ２（配列番号３３）、およびＩ５３－５０Ｂ．４ＰｏｓＴ１（配列番号３４）からなる群から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するか；あるいは
（ｄ）第１のポリペプチドは、Ｉ３２－２８Ａ（配列番号２１）のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含み、第２のポリペプチドは、Ｉ３２－２８Ｂ（配列番号２２）のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。

【0007】

１つの実施形態では、１つまたは複数のパラミクソウイルスおよび／もしくはニューモウイルスのＦタンパク質、またはその抗原フラグメントは、第１のポリペプチドとの融合タンパク質として発現される。１つのかかる実施形態では、複数の第１のアセンブリの各々は、同一の第１のポリペプチドを含み；別のかかる実施形態では、複数の第１のアセンブリは、合計で２つ以上のパラミクソウイルスおよび／もしくはニューモウイルスのＦタンパク質、またはその抗原フラグメントを含む。別の実施形態では、第１のポリペプチドのサブセットのみが、Ｆタンパク質またはその抗原フラグメントとの融合タンパク質を含む。さらなる実施形態では、各々の第１のアセンブリは、第１のポリペプチドのホモ三量体を含む。

【0008】

別の実施形態では、融合タンパク質は、第１のポリペプチドとパラミクソウイルスおよび／もしくはニューモウイルスのＦタンパク質、またはその抗原フラグメントとの間に配置されたアミノ酸リンカーを含む。１つのかかる実施形態では、融合タンパク質は、第１のポリペプチドとパラミクソウイルスＦタンパク質またはその抗原フラグメントとの間に配置されたアミノ酸リンカーを含む。１つの実施形態では、アミノ酸リンカー配列は、１つまたは複数の三量体化ドメインを含み；別の実施形態では、アミノ酸リンカー配列は、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーを含む。

【0009】

種々の実施形態では、第１のポリペプチドは、ＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｔ３３－３１Ａ（配列番号６９）、ＤＳ－Ｃａｖ１－Ｔ３３－３１Ａ（配列番号７０）、ＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｔ３３－１５Ｂ（配列番号７１）、ＤＳ－Ｃａｖ１－Ｔ３３－１５Ｂ（配列番号７２）、ＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｉ５３－５０Ａ（配列番号７３）、ＤＳ－Ｃａｖ１－Ｉ５３－５０Ａ（配列番号７４）、およびＤＳ－Ｃａｖ１－Ｉ３２－２８Ａ（配列番号７５）からなる群から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する第１のポリペプチドを含むか、それらからなる。他の実施形態では、
（ａ）各々の第１のポリペプチドが、ＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｔ３３－３１Ａ（配列番号６９）またはＤＳ－Ｃａｖ１－Ｔ３３－３１Ａ（配列番号７０）のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するとき、各々の第２のポリペプチドは、Ｔ３３－３１Ｂ（配列番号４４）のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するか；
（ｂ）各々の第１のポリペプチドが、ＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｔ３３－１５Ｂ（配列番号７１）またはＤＳ－Ｃａｖ１－Ｔ３３－１５Ｂ（配列番号７２）のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するとき、各々の第２のポリペプチドは、Ｔ３３－１５Ａ（配列番号４５）のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するか；
（ｃ）各々の第１のポリペプチドが、ＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｉ５３－５０Ａ（配列番号７３）またはＤＳ－Ｃａｖ１－Ｉ５３－５０Ａ（配列番号７４）のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するとき、各々の第２のポリペプチドは、Ｉ５３－５０Ｂ（配列番号８）、Ｉ５３－５０Ｂ．１（配列番号３２）、Ｉ５３－５０Ｂ．１ＮｅｇＴ２（配列番号３３）、またはＩ５３－５０Ｂ．４ＰｏｓＴ１（配列番号３４）からなる群から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するか；あるいは
（ｄ）各々の第１のポリペプチドが、ＤＳ－Ｃａｖ１－Ｉ３２－２８Ａ（配列番号７５）のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するとき、各々の第２のポリペプチドは、Ｉ３２－２８Ｂのアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する。

【0010】

１つの実施形態では、１つまたは複数のパラミクソウイルスおよび／もしくはニューモウイルスのＦタンパク質、またはその抗原フラグメントは、ＤＳ－Ｃａｖ１（配列番号５３）のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。１つのかかる実施形態では、各々の第１のポリペプチドは、配列番号７（Ｉ５３－５０Ａ）のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドに、アミノ酸リンカーを介して連結したＤＳ－Ｃａｖ１のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドの融合ポリペプチドを含む。別の実施形態では、アミノ酸リンカーは、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーを含む。さらなる実施形態では、各々の融合タンパク質は、配列番号６９～１００からなる群から選択されるアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。特定の実施形態では、各々の融合タンパク質は、配列番号７６（Ｆ１０）のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。他の実施形態では、各々の第２のポリペプチドは、Ｉ５３－５０Ｂ（配列番号８）、Ｉ５３－５０Ｂ．１（配列番号３２）、Ｉ５３－５０Ｂ．１ＮｅｇＴ２（配列番号３３）、またはＩ５３－５０Ｂ．４ＰｏｓＴ１（配列番号３４）からなる群から選択されるアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。特定の実施形態では、各々の第２のポリペプチドは、Ｉ５３－５０Ｂ．４ＰｏｓＴ１（配列番号３４）のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。

【0011】

他の態様では、第１のポリペプチド融合物を発現する組換え発現核酸、プロモーターに連結された組換え核酸を含む組換え発現ベクター、および組換え発現ベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。

【0012】

本明細書中に開示の任意の実施形態または実施形態の組み合わせのナノ構造を含む免疫原性組成物、および薬学的に許容され得る担体も提供する。１つの実施形態では、免疫原性組成物は、アジュバントをさらに含み得る。

【0013】

他の態様では、被験体においてＲＳＶ Ｆタンパク質に対する免疫応答を生じさせるか、被験体においてＲＳＶ感染を処置するか制限する方法であって、有効量の本明細書中に開示の実施形態または実施形態の組み合わせのナノ構造または免疫原性組成物を、それを必要とする被験体に投与して、被験体において免疫応答を生じさせるか、ＲＳＶ感染を処置または予防する工程を含む方法を提供する。

【0014】

本明細書中に開示の任意の実施形態または実施形態の組み合わせのナノ構造をアセンブリさせるプロセスであって、２つ以上のナノ構造の構成成分を水性条件で混合して、所望のナノ構造の自発的アセンブリを駆動する工程を含むプロセスも提供する。

【0015】

図面の簡単な説明
本発明の前述の態様およびそれに伴う利点の多くは、添付の図面と併せて以下の詳細な説明を参照することによってより深く理解されるようになるにつれて、より容易に認識されるようになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】ｉｎ ｖｉｔｒｏアセンブリによる抗原保有ナノ構造の産生の概要図を示す。所与のナノ構造の２つの構成成分または基本単位を発現させて個別に精製することができ、この精製された構成成分をｉｎ ｖｉｔｒｏで混合することによってナノ構造のアセンブリを開始させることが可能である（ｉｎ ｖｉｔｒｏアセンブリと呼ばれるプロセス）。いくつかの実施形態では、ナノ構造の２つの構成成分を異なる発現宿主（例えば、ヒトＨＥＫ２９３Ｆ細胞または細菌大腸菌細胞）内で発現させることができる。図は、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞内で産生された抗原－ナノ構造三量体融合タンパク質および大腸菌内で産生されたナノ構造五量体タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏアセンブリを介した２０の三量体抗原（６０の抗原サブユニット）を保有する１２０－サブユニットのナノ構造のアセンブリを模式的に示す。

【図2】組織培養上清中に分泌されたＤＳ－Ｃａｖ１、ＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｔ３３－３１Ａ、およびＤＳ－Ｃａｖ１－Ｔ３３－３１Ａ融合タンパク質の検出を示すグラフを示す。ＤＳ－Ｃａｖ１（上）、ＤＳ－Ｃａｖ－１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｔ３３－３１Ａ／Ｔ３３－３１Ｂ（左下）、およびＤＳ－Ｃａｖ－１－Ｔ３３－３１Ａ／Ｔ３３－３１Ｂ（右下）を発現する細胞由来の組織培養上清に対してＥＬＩＳＡアッセイを行った。ＲＳＶ Ｆに結合する４つの異なるモノクローナル抗体を、上清中のＤＳ－Ｃａｖ１またはＤＳ－Ｃａｖ１融合タンパク質の存在を評価するために使用した。結果により、十分に折り畳まれたＲＳＶ Ｆ抗原を含むタンパク質の分泌が確認される。

【図3】ＤＳ－Ｃａｖ１－Ｉ５３－５０Ａのサイズ排除クロマトグラフィを示す。固定金属アフィニティクロマトグラフィによって組織培養上清から精製されたタンパク質を、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（商標）６ １０／３００ＧＬサイズ排除カラムに適用した。タンパク質は、単一の単分散種として溶出された。

【図4】ｉｎ ｖｉｔｒｏでアセンブリしたＤＳ－Ｃａｖ１－Ｉ５３－５０ナノ構造のサイズ排除クロマトグラフィを示す。精製されたＤＳ－Ｃａｖ１－Ｉ５３－５０Ａタンパク質およびＩ５３－５０Ｂ．４ＰＴ１タンパク質をおよそ１：１のモル比で混合し、４℃で一晩インキュベートし、次いで、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－５００ １６／６０ ＨＲサイズ排除カラムにアプライした。アセンブリしたナノ構造は、６５ｍＬあたりに単一の単分散ピークとして溶出され、一方で、過剰なＤＳ－Ｃａｖ１－Ｉ５３－５０Ａ三量体成分は９０ｍＬあたりに溶出された。

【図5】ｉｎ ｖｉｔｒｏでアセンブリしたＤＳ－Ｃａｖ１－Ｉ５３－５０ナノ構造の陰性染色による顕微鏡写真および二次元クラスの平均を示す。サイズ排除クロマトグラフィによって精製したｉｎ ｖｉｔｒｏでアセンブリしたＤＳ－Ｃａｖ１－Ｉ５３－５０ナノ構造を、陰性染色電子顕微鏡法によって画像化した（上）。多数のナノ構造を平均することにより、ナノ構造のＩ５３－５０部分が高秩序かつ一貫しており、一方で、表示された抗原の精密な三次元の位置が、ＤＳ－Ｃａｖ１－Ｉ５３－５０Ａ融合タンパク質のＤＳ－Ｃａｖ１ドメインとＩ５３－５０Ａドメインとの間のリンカーの可動性に起因してわずかに変動することを示す二次元クラスの平均（下）が得られた。

【図6】ＤＳ－Ｃａｖ１－Ｉ５３－５０ナノ構造の抗原性を示す一連のグラフを示す。４つのＲＳＶ Ｆ特異的モノクローナル抗体（融合前特異的抗体ＭＰＥ８、Ｄ２５、およびＲＳＤ５が含まれる）を使用したＥＬＩＳＡによる精製されたＤＳ－Ｃａｖ１－Ｉ５３－５０ナノ構造の分析（Ａ）は、ＤＳ－Ｃａｖ１抗原が、ＤＳ－Ｃａｖ１－Ｉ５３－５０ナノ構造上に多価で表示されたときに正確に折り畳まれて融合前の状態が維持されることを示した。この所見は、複数のＲＳＶ Ｆ特異的抗体を使用した表面プラズモン共鳴の測定値によって確認され（Ｂ～Ｃ）、三量体ＤＳ－Ｃａｖ１と比較したときにＤＳ－Ｃａｖ１の多価表示により抗体の解離速度が低下するアビディティー効果が得られることがさらに示唆された。

【図7】ＤＳ－Ｃａｖ１－Ｉ５３－５０ナノ構造で免疫化されたマウス由来のＤＳ－Ｃａｖ１特異的血清抗体価を示すグラフである。マウス群を、さらなる抗原である三量体ＤＳ－Ｃａｖ１を欠くＩ５３－５０ナノ構造または結合価が３３％、６６％、または１００％でＤＳ－Ｃａｖ１抗原を保有するＩ５３－５０ナノ構造で免疫化した。ＤＳ－Ｃａｖ１特異的血清抗体価を、ＥＬＩＳＡによってＤＳ－Ｃａｖ１でコーティングしたプレートに対して測定した。各マウスについての血清抗体価を円としてプットし、プロットした各群内の幾何平均を水平線として付した。

【図8】ＤＳ－Ｃａｖ１－Ｉ５３－５０ナノ構造での免疫化によって誘発された血清中和活性を示すグラフである。マウス群を、さらなる抗原である三量体ＤＳ－Ｃａｖ１を欠くＩ５３－５０ナノ構造または結合価が３３％、６６％、または１００％でＤＳ－Ｃａｖ１抗原を保有するＩ５３－５０ナノ構造で免疫化した。各マウスについての中和力価を円としてプットし、プロットした各群内の幾何平均を水平線として付した。

【図9】ＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ Ｉ５３－５０ナノ構造での免疫化によって誘発された霊長類免疫系における免疫原性を示すグラフである。アカゲザルに、遊離ＤＳ－Ｃａｖ１三量体または結合価１００％でＤＳ－Ｃａｖ１を示すＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｉ５３－５０ナノ構造のいずれかを０週目および４週目に注射した。両方の場合において、ＤＳ－Ｃａｖ１抗原の用量は５０μｇであり、免疫原を、ＭＦ５９様スクアレン系水中油型乳濁液アジュバントＳＷＥを用いて製剤化した。６週目および１６週目に動物から得た血清を、抗ＤＳ－Ｃａｖ１抗体価（Ａ）およびＲＳＶ－中和抗体価（Ｂ）について評価した。

【図10】Ｉ５３－５０Ａに融合したときおよび／または正二十面体ナノ構造にさらにアセンブリしたときのＤＳ－Ｃａｖ１の物理的安定性を示すグラフである。等濃度のＤＳ－Ｃａｖ１を含む三量体ＤＳ－Ｃａｖ１、三量体ＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｉ５３－５０Ａ、およびＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｉ５３－５０ナノ構造の試料を、４つのアリコートに分割し、２０、５０、７０、または８０℃で１時間インキュベートした。室温に冷却後、Ｄ２５結合を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によってアッセイした。

【図11】ナノ構造の物理的安定性を示すグラフである。トリプトファン自家蛍光によってモニタリングされる塩酸グアニジン（ＧｄｎＨＣｌ）の化学的変性を、三量体ＤＳ－Ｃａｖ１（Ａ～Ｂ）、ＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｉ５３－５０Ａ（Ｃ～Ｄ）、ＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｉ５３－５０（Ｅ～Ｆ）、Ｉ５３－５０（Ｇ～Ｈ）、およびＩ５３－５０Ａ（Ｉ～Ｊ）の物理的安定性を評価するための第２の抗体非依存性技術として使用した。データは、Ｉ５３－５０Ａナノ構造の構成成分に遺伝的に融合したときのＤＳ－Ｃａｖ１抗原の優れた物理的安定性を示している。

【発明を実施するための形態】

【0017】

発明の詳細な説明
引用された全ての参考文献は、その全体が本明細書中で参考として援用される。本出願内で、別段に記述しない限りは、利用した技術を、以下などのいくつかの周知の参考文献のいずれかに見出すことができる：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８５，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，１９９１． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、“Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ” ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｈｃｅｒ，ｅｄ．，（１９９０）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら．１９９０．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，２^ｎｄ Ｅｄ．（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ．１９８７． Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ．１０９－１２８，ｅｄ．Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、およびＡｍｂｉｏｎ １９９８ Ｃａｔａｌｏｇ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）。

【0018】

本明細書中で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈上他の意味を明確に示さない限り、複数形が含まれる。本明細書中で使用される「および」を、具体的に他の意味を示さない限り、「または」と互換的に使用する。

【0019】

本明細書中で使用する場合、アミノ酸残基を、以下のように省略する： アラニン（Ａｌａ；Ａ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、およびバリン（Ｖａｌ；Ｖ）。

【0020】

本明細書中で使用する場合、「約」は、引用したパラメーターの±５％を意味する。

【0021】

文脈上他の意味を明確に示さない限り、本発明の任意の態様の全ての実施形態を組み合わせて使用することができる。

【0022】

文脈上明白に他の意味に解釈すべき場合を除き、説明および特許請求の範囲を通して、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などは、排他的または網羅的な意味とは対照的な包括的な意味で解釈されるものとする；換言すると、「～が含まれるが、これに限定されない」を意味する。単数または複数を使用する用語には、それぞれ、複数および単数も含まれる。さらに、用語「本明細書中」、「上記」、「下記」、および類似の意味の用語は、本出願で使用するとき、本出願の特定の部分ではなく、本出願全体を指すものとする。

【0023】

本開示の実施形態の説明は、網羅的であることや、開示された正確な形態に本開示が制限されることを意図しない。本開示の特定の実施形態およびその例は、例示のみを目的として本明細書中に記載されているが、当業者が認識するように、本開示の範囲内で種々の等価な修正が可能である。

【0024】

第１の態様では、本開示は、ナノ構造であって、
（ａ）複数の第１のアセンブリであって、各々の第１のアセンブリが複数の同一の第１のポリペプチドを含む、複数の第１のアセンブリ；
（ｂ）複数の第２のアセンブリであって、各々の第２のアセンブリが複数の同一の第２のポリペプチドを含み、第２のポリペプチドが第１のポリペプチドと異なる、複数の第２のアセンブリ；
を含み、
複数の第１のアセンブリが複数の第２のアセンブリと非共有結合的に相互作用してナノ構造を形成し；
ナノ構造が、１つまたは複数のパラミクソウイルスおよび／もしくはニューモウイルスのＦタンパク質、またはその抗原フラグメントの複数のコピーをナノ構造の外面に表示している、ナノ構造を提供する。

【0025】

ナノ構造の外面にパラミクソウイルスおよび／またはニューモウイルスのＦタンパク質を多価で表示する自己アセンブリするポリペプチドナノ構造を本明細書中に開示する。第１のおよび第２のポリペプチドの対の複数のコピーが自己アセンブリして、正二十面体ナノ構造などのナノ構造を形成することができる。ナノ構造は、第１のアセンブリおよび第２のアセンブリをナノ構造（正二十面体対称を有するナノ構造など）に配向させる対称的に反復した非天然の非共有結合性ポリペプチド－ポリペプチド界面を含む。

【0026】

本発明のナノ構造は、天然に存在しないという点で合成である。第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、任意の適切な手段（組換え産生または化学合成が含まれる）によって産生することができる天然に存在しないタンパク質である。複数の第１のポリペプチドの各メンバーは、相互に同一であり（しかしながら、第１のポリペプチドが１つまたは複数のパラミクソウイルスおよび／もしくはニューモウイルスのＦタンパク質、またはその抗原フラグメントとの融合ポリペプチドとして存在する場合、Ｆタンパク質またはその抗原フラグメントは、一方の第１のポリペプチドと他方とが異なり得る）、複数の第２のポリペプチドの各メンバーは相互に同一である。第１のタンパク質および第２のタンパク質は異なる。第１のおよび第２のポリペプチドについての一次アミノ酸配列の特定の要件を持たない。米国特許出願公開第２０１６０１２２３９２号およびＰＣＴ出願公開ＷＯ２０１４／１２４３０１号は、合成ナノ構造を設計する方法であって、ナノ構造が第１のおよび第２のポリペプチドの特定の一次アミノ酸配列に依存しない方法を記載している。

【0027】

複数の（２、３、４、５、６、またはそれを超える）第１のポリペプチドが自己アセンブリして第１のアセンブリを形成し、複数の（２、３、４、５、６、またはそれを超える）第２のポリペプチドが自己アセンブリして第２のアセンブリを形成する。次いで、複数のこれらの第１のおよび第２のアセンブリが設計された界面を介して非共有結合的に自己アセンブリしてナノ構造が産生される。

【0028】

第１のアセンブリ中の第１のポリペプチドの数は、第２のアセンブリ中の第２のポリペプチドの数と同一でも異なっていてもよい。１つの例示的な実施形態では、第１のアセンブリは第１のポリペプチドの三量体を含み、第２のアセンブリは第２のポリペプチドの二量体を含む。さらなる例示的な実施形態では、第１のアセンブリは第１のポリペプチドの三量体を含み、第２のアセンブリは第２のポリペプチドの三量体を含む。さらなる例示的な実施形態では、第１のアセンブリは第１のポリペプチドの三量体を含み、第２のアセンブリは第２のポリペプチドの五量体を含む。

【0029】

第１のおよび第２のポリペプチドは、得られるナノ構造の所与の目的に適した任意の長さであり得る。１つの実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、典型的には３０～２５０アミノ酸長であり；第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドの長さは、同一でも異なっていてもよい。種々のさらなる実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、３０～２２５、３０～２００、３０～１７５、５０～２５０、５０～２２５、５０～２００、５０～１７５、７５～２５０、７５～２２５、７５～２００、７５～１７５、１００～２５０、１００～２２５、１００～２００、１００～１７５、１２５～２５０、１２５～２２５、１２５～２００、１２５～１７５、１５０～２５０、１５０～２２５、１５０～２００、および１５０～１７５アミノ酸長である。

【0030】

配列番号１～５１の単離されたポリペプチドを、対で自己アセンブリして正二十面体ナノ構造などのナノ構造を形成することができるように設計した。この設計は、ナノ構造を形成するためにアセンブリすることができるポリペプチド対の各メンバーに適切な界面残基の設計であった。そのように形成されたナノ構造は、第１のアセンブリおよび第２のアセンブリをナノ構造（正二十面体対称を有するナノ構造など）に配向させる対称的に反復した非天然の非共有結合性ポリペプチド－ポリペプチド界面を含む。したがって、１つの実施形態では、第１のおよび第２のポリペプチドは、配列番号１～５１の群から選択される。いずれの場合にも、Ｎ末端メチオニン残基は任意選択である。

【0031】

【表1】

Ｉ５３－４０Ａ属（配列番号３５）
（Ｍ）ＴＫＫＶＧＩＶＤＴＴＦＡＲＶＤＭＡＳＡＡＩＬＴＬＫＭＥＳＰＮＩＫＩＩＲＫＴＶＰＧＩＫＤＬＰＶＡＣＫＫＬＬＥＥＥＧＣＤＩＶＭＡＬＧＭＰＧＫ（Ａ／Ｋ）ＥＫＤＫＶＣＡＨＥＡＳＬＧＬＭＬＡＱＬＭＴＮＫＨＩＩＥＶＦＶＨＥＤＥＡＫＤＤＡＥＬＫＩＬＡＡＲＲＡＩＥＨＡＬＮＶＹＹＬＬＦＫＰＥＹＬＴＲＭＡＧＫＧＬＲＱＧＦＥＤＡＧＰＡＲＥ

Ｉ５３－４０Ｂ属（配列番号３６）
（Ｍ）（Ｓ／Ｄ）（Ｔ／Ｄ）ＩＮＮＱＬＫ（Ａ／Ｒ）ＬＫＶＩＰＶＩＡＩＤＮＡＥＤＩＩＰＬＧＫＶＬＡＥＮＧＬＰＡＡＥＩＴＦＲＳＳＡＡＶＫＡＩＭＬＬＲＳＡＱＰＥＭＬＩＧＡＧＴＩＬＮＧＶＱＡＬＡＡＫＥＡＧＡ（Ｔ／Ｄ）ＦＶＶＳＰＧＦＮＰＮＴＶＲＡＣＱＩＩＧＩＤＩＶＰＧＶＮＮＰＳＴＶＥ（Ａ／Ｑ）ＡＬＥＭＧＬＴＴＬＫＦＦＰＡＥＡＳＧＧＩＳＭＶＫＳＬＶＧＰＹＧＤＩＲＬＭＰＴＧＧＩＴＰ（Ｓ／Ｄ）ＮＩＤＮＹＬＡＩＰＱＶＬＡＣＧＧＴＷＭＶＤＫＫＬＶ（Ｔ／Ｒ）ＮＧＥＷＤＥＩＡＲＬＴＲＥＩＶＥＱＶＮＰ

Ｉ５３－４７Ａ属（配列番号３７）
（Ｍ）ＰＩＦＴＬＮＴＮＩＫＡ（Ｔ／Ｄ）ＤＶＰＳＤＦＬＳＬＴＳＲＬＶＧＬＩＬＳ（Ｋ／Ｅ）ＰＧＳＹＶＡＶＨＩＮＴＤＱＱＬＳＦＧＧＳＴＮＰＡＡＦＧＴＬＭＳＩＧＧＩＥＰ（Ｓ／Ｄ）ＫＮ（Ｒ／Ｅ）ＤＨＳＡＶＬＦＤＨＬＮＡＭＬＧＩＰＫＮＲＭＹＩＨＦＶ（Ｎ／Ｄ）Ｌ（Ｎ／Ｄ）ＧＤＤＶＧＷＮＧＴＴＦ

Ｉ５３－４７Ｂ属（配列番号３８）
（Ｍ）ＮＱＨＳＨＫＤ（Ｙ／Ｈ）ＥＴＶＲＩＡＶＶＲＡＲＷＨＡＤＩＶＤＡＣＶＥＡＦＥＩＡＭＡＡＩＧＧＤＲＦＡＶＤＶＦＤＶＰＧＡＹＥＩＰＬＨＡＲＴＬＡＥＴＧＲＹＧＡＶＬＧＴＡＦＶＶ（Ｎ／Ｄ）ＧＧＩＹ（Ｒ／Ｄ）ＨＥＦＶＡＳＡＶＩＤＧＭＭＮＶＱＬ（Ｓ／Ｄ）ＴＧＶＰＶＬＳＡＶＬＴＰＨ（Ｒ／Ｅ）Ｙ（Ｒ／Ｅ）ＤＳ（Ａ／Ｄ）Ｅ（Ｈ／Ｄ）Ｈ（Ｒ／Ｅ）ＦＦＡＡＨＦＡＶＫＧＶＥＡＡＲＡＣＩＥＩＬ（Ａ／Ｎ）ＡＲＥＫＩＡＡ

Ｉ５３－５０Ａ属（配列番号３９）
（Ｍ）ＫＭＥＥＬＦＫＫＨＫＩＶＡＶＬＲＡＮＳＶＥＥＡＩＥＫＡＶＡＶＦＡＧＧＶＨＬＩＥＩＴＦＴＶＰＤＡＤＴＶＩＫＡＬＳＶＬＫＥＫＧＡＩＩＧＡＧＴＶＴＳＶＥＱＣＲＫＡＶＥＳＧＡＥＦＩＶＳＰＨＬＤＥＥＩＳＱＦＣＫＥＫＧＶＦＹＭＰＧＶＭＴＰＴＥＬＶＫＡＭＫＬＧＨ（Ｔ／Ｄ）ＩＬＫＬＦＰＧＥＶＶＧＰ（Ｑ／Ｅ）ＦＶ（Ｋ／Ｅ）ＡＭＫＧＰＦＰＮＶＫＦＶＰＴＧＧＶ（Ｎ／Ｄ）ＬＤ（Ｎ／Ｄ）ＶＣ（Ｅ／Ｋ）ＷＦ（Ｋ／Ｄ）ＡＧＶＬＡＶＧＶＧ（Ｓ／Ｋ／Ｄ）ＡＬＶ（Ｋ／Ｅ）Ｇ（Ｔ／Ｄ／Ｋ）ＰＤＥＶＲＥ（Ｋ／Ｄ）ＡＫ（Ａ／Ｅ／Ｋ）ＦＶ（Ｅ／Ｋ）（Ｋ／Ｅ）ＩＲＧＣＴＥ

Ｉ５３－５０Ｂ属（配列番号４０）
（Ｍ）ＮＱＨＳＨＫＤ（Ｙ／Ｈ）ＥＴＶＲＩＡＶＶＲＡＲＷＨＡＥＩＶＤＡＣＶＳＡＦＥＡＡＭ（Ａ／Ｒ）ＤＩＧＧＤＲＦＡＶＤＶＦＤＶＰＧＡＹＥＩＰＬＨＡＲＴＬＡＥＴＧＲＹＧＡＶＬＧＴＡＦＶＶ（Ｎ／Ｄ）ＧＧＩＹ（Ｒ／Ｄ）ＨＥＦＶＡＳＡＶＩ（Ｄ／Ｎ）ＧＭＭＮＶＱＬ（Ｓ／Ｄ／Ｎ）ＴＧＶＰＶＬＳＡＶＬＴＰＨ（Ｒ／Ｅ／Ｎ）Ｙ（Ｒ／Ｄ／Ｅ）（Ｄ／Ｋ）Ｓ（Ｄ／Ｋ）Ａ（Ｈ／Ｄ）ＴＬＬＦＬＡＬＦＡＶＫＧＭＥＡＡＲＡＣＶＥＩＬＡＡＲＥＫＩＡＡ

Ｔ３２－２８Ａ（配列番号４１）
（Ｍ）ＧＥＶＰＩＧＤＰＫＥＬＮＧＭＥＩＡＡＶＹＬＱＰＩＥＭＥＰＲＧＩＤＬＡＡＳＬＡＤＩＨＬＥＡＤＩＨＡＬＫＮＮＰＮＧＦＰＥＧＦＷＭＰＹＬＴＩＡＹＡＬＡＮＡＤＴＧＡＩＫＴＧＴＬＭＰＭＶＡＤＤＧＰＨＹＧＡＮＩＡＭＥＫＤＫＫＧＧＦＧＶＧＴＹＡＬＴＦＬＩＳＮＰＥＫＱＧＦＧＲＨＶＤＥＥＴＧＶＧＫＷＦＥＰＦＶＶＴＹＦＦＫＹＴＧＴＰＫ

Ｔ３２－２８Ｂ（配列番号４２）
（Ｍ）ＳＱＡＩＧＩＬＥＬＴＳＩＡＫＧＭＥＬＧＤＡＭＬＫＳＡＮＶＤＬＬＶＳＫＴＩＳＰＧＫＦＬＬＭＬＧＧＤＩＧＡＩＱＱＡＩＥＴＧＴＳＱＡＧＥＭＬＶＤＳＬＶＬＡＮＩＨＰＳＶＬＰＡＩＳＧＬＮＳＶＤＫＲＱＡＶＧＩＶＥＴＷＳＶＡＡＣＩＳＡＡＤＬＡＶＫＧＳＮＶＴＬＶＲＶＨＭＡＦＧＩＧＧＫＣＹＭＶＶＡＧＤＶＬＤＶＡＡＡＶＡＴＡＳＬＡＡＧＡＫＧＬＬＶＹＡＳＩＩＰＲＰＨＥＡＭＷＲＱＭＶＥＧ

Ｔ３３－０９Ａ（配列番号４３）
（Ｍ）ＥＥＶＶＬＩＴＶＰＳＡＬＶＡＶＫＩＡＨＡＬＶＥＥＲＬＡＡＣＶＮＩＶＰＧＬＴＳＩＹＲＷＱＧＳＶＶＳＤＨＥＬＬＬＬＶＫＴＴＴＨＡＦＰＫＬＫＥＲＶＫＡＬＨＰＹＴＶＰＥＩＶＡＬＰＩＡＥＧＮＲＥＹＬＤＷＬＲＥＮＴＧ

Ｔ３３－０９Ｂ（配列番号４４）
（Ｍ）ＶＲＧＩＲＧＡＩＴＶＥＥＤＴＰＡＡＩＬＡＡＴＩＥＬＬＬＫＭＬＥＡＮＧＩＱＳＹＥＥＬＡＡＶＩＦＴＶＴＥＤＬＴＳＡＦＰＡＥＡＡＲＬＩＧＭＨＲＶＰＬＬＳＡＲＥＶＰＶＰＧＳＬＰＲＶＩＲＶＬＡＬＷＮＴＤＴＰＱＤＲＶＲＨＶＹＬＮＥＡＶＲＬＲＰＤＬＥＳＡＱ

Ｔ３３－１５Ａ（配列番号４５）
（Ｍ）ＳＫＡＫＩＧＩＶＴＶＳＤＲＡＳＡＧＩＴＡＤＩＳＧＫＡＩＩＬＡＬＮＬＹＬＴＳＥＷＥＰＩＹＱＶＩＰＤＥＱＤＶＩＥＴＴＬＩＫＭＡＤＥＱＤＣＣＬＩＶＴＴＧＧＴＧＰＡＫＲＤＶＴＰＥＡＴＥＡＶＣＤＲＭＭＰＧＦＧＥＬＭＲＡＥＳＬＫＥＶＰＴＡＩＬＳＲＱＴＡＧＬＲＧＤＳＬＩＶＮＬＰＧＤＰＡＳＩＳＤＣＬＬＡＶＦＰＡＩＰＹＣＩＤＬＭＥＧＰＹＬＥＣＮＥＡＭＩＫＰＦＲＰＫＡＫ

Ｔ３３－１５Ｂ（配列番号４６）
（Ｍ）ＶＲＧＩＲＧＡＩＴＶＮＳＤＴＰＴＳＩＩＩＡＴＩＬＬＬＥＫＭＬＥＡＮＧＩＱＳＹＥＥＬＡＡＶＩＦＴＶＴＥＤＬＴＳＡＦＰＡＥＡＡＲＱＩＧＭＨＲＶＰＬＬＳＡＲＥＶＰＶＰＧＳＬＰＲＶＩＲＶＬＡＬＷＮＴＤＴＰＱＤＲＶＲＨＶＹＬＳＥＡＶＲＬＲＰＤＬＥＳＡＱ

Ｔ３３－２１Ａ（配列番号４７）
（Ｍ）ＲＩＴＴＫＶＧＤＫＧＳＴＲＬＦＧＧＥＥＶＷＫＤＳＰＩＩＥＡＮＧＴＬＤＥＬＴＳＦＩＧＥＡＫＨＹＶＤＥＥＭＫＧＩＬＥＥＩＱＮＤＩＹＫＩＭＧＥＩＧＳＫＧＫＩＥＧＩＳＥＥＲＩＡＷＬＬＫＬＩＬＲＹＭＥＭＶＮＬＫＳＦＶＬＰＧＧＴＬＥＳＡＫＬＤＶＣＲＴＩＡＲＲＡＬＲＫＶＬＴＶＴＲＥＦＧＩＧＡＥＡＡＡＹＬＬＡＬＳＤＬＬＦＬＬＡＲＶＩＥＩＥＫＮＫＬＫＥＶＲＳ

Ｔ３３－２１Ｂ（配列番号４８）
（Ｍ）ＰＨＬＶＩＥＡＴＡＮＬＲＬＥＴＳＰＧＥＬＬＥＱＡＮＫＡＬＦＡＳＧＱＦＧＥＡＤＩＫＳＲＦＶＴＬＥＡＹＲＱＧＴＡＡＶＥＲＡＹＬＨＡＣＬＳＩＬＤＧＲＤＩＡＴＲＴＬＬＧＡＳＬＣＡＶＬＡＥＡＶＡＧＧＧＥＥＧＶＱＶＳＶＥＶＲＥＭＥＲＬＳＹＡＫＲＶＶＡＲＱＲ

Ｔ３３－２８Ａ（配列番号４９）
（Ｍ）ＥＳＶＮＴＳＦＬＳＰＳＬＶＴＩＲＤＦＤＮＧＱＦＡＶＬＲＩＧＲＴＧＦＰＡＤＫＧＤＩＤＬＣＬＤＫＭＩＧＶＲＡＡＱＩＦＬＧＤＤＴＥＤＧＦＫＧＰＨＩＲＩＲＣＶＤＩＤＤＫＨＴＹＮＡＭＶＹＶＤＬＩＶＧＴＧＡＳＥＶＥＲＥＴＡＥＥＥＡＫＬＡＬＲＶＡＬＱＶＤＩＡＤＥＨＳＣＶＴＱＦＥＭＫＬＲＥＥＬＬＳＳＤＳＦＨＰＤＫＤＥＹＹＫＤＦＬ

Ｔ３３－２８Ｂ（配列番号５０）
（Ｍ）ＰＶＩＱＴＦＶＳＴＰＬＤＨＨＫＲＬＬＬＡＩＩＹＲＩＶＴＲＶＶＬＧＫＰＥＤＬＶＭＭＴＦＨＤＳＴＰＭＨＦＦＧＳＴＤＰＶＡＣＶＲＶＥＡＬＧＧＹＧＰＳＥＰＥＫＶＴＳＩＶＴＡＡＩＴＡＶＣＧＩＶＡＤＲＩＦＶＬＹＦＳＰＬＨＣＧＷＮＧＴＮＦ

Ｔ３３－３１Ａ（配列番号５１）
（Ｍ）ＥＥＶＶＬＩＴＶＰＳＡＬＶＡＶＫＩＡＨＡＬＶＥＥＲＬＡＡＣＶＮＩＶＰＧＬＴＳＩＹＲＥＥＧＳＶＶＳＤＨＥＬＬＬＬＶＫＴＴＴＤＡＦＰＫＬＫＥＲＶＫＥＬＨＰＹＥＶＰＥＩＶＡＬＰＩＡＥＧＮＲＥＹＬＤＷＬＲＥＮＴＧ

【0032】

表１は、第１のおよび第２のポリペプチドのアミノ酸配列を提供する；表１の右側のカラムは、各々の例示的なポリペプチド中の、得られたアセンブリしたナノ構造の界面に存在すると同定された残基（すなわち、「同定された界面残基」）の番号を同定している。認められるように、配列番号１～３４の例示的なポリペプチドの界面残基の番号は、４～１３の範囲である。種々の実施形態では、第１のおよび第２のポリペプチドは、配列番号１～３４からなる群から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列に対して、その長さにわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３の同定された界面位置（所与のポリペプチドについての界面残基の番号に依存する）で同一であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、第１のおよび第２のポリペプチドは、配列番号１～５１からなる群から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列に対して、その長さにわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり、少なくとも２０％、２５％、３３％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、または１００％の同定された界面位置で同一であるアミノ酸配列を含む。

【0033】

一般にタンパク質の場合と同様に、ポリペプチドは、後続アセンブリをナノ構造に分裂させることなく設計された配列ではいくらかの変動（特に、かかる変動が保存的アミノ酸置換を含む場合）に耐えると予想される。本明細書中で使用する場合、「保存的アミノ酸置換」は、以下を意味する：疎水性アミノ酸（Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｓｅｅ、Ｓｍｅ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ）を他の疎水性アミノ酸のみと置換することができる；嵩高い側鎖を有する疎水性アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）を嵩高い側鎖を有する他の疎水性アミノ酸のみと置換することができる；正電荷の側鎖を有するアミノ酸（Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）を、正電荷の側鎖を有する他のアミノ酸のみと置換することができる；負電荷の側鎖を有するアミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）を、負電荷の側鎖を有する他のアミノ酸のみと置換することができる；極性無電荷側鎖を有するアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ）を、極性無電荷側鎖を有する他のアミノ酸のみと置換することができる。

【0034】

表２は、配列番号１～３４と表示された本発明の各々の例示的なポリペプチドについての表面アミノ酸残基番号を列挙している。したがって、種々の実施形態では、本発明のポリペプチド中の１つまたは複数の（少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７ ２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、またはそれを超える）これらの表面残基を改変することができる。括弧内の残基は任意選択である。

【0035】

【表2】

【0036】

本発明のナノ構造の種々の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、以下の対、またはその改変バージョン（すなわち、本発明のポリペプチドについて開示の許容可能な改変：つまり、配列番号で示すアミノ酸配列に対して、その長さにわたって少なくとも７５％ ８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であり、かつ／または少なくとも１つの同定された界面位置で同一であるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド）：
配列番号１および配列番号２（Ｉ５３－３４ＡおよびＩ５３－３４Ｂ）；
配列番号３および配列番号４（Ｉ５３－４０ＡおよびＩ５３－４０Ｂ）；
配列番号３および配列番号２４（Ｉ５３－４０ＡおよびＩ５３－４０Ｂ．１）；
配列番号２３および配列番号４（Ｉ５３－４０Ａ．１およびＩ５３－４０Ｂ）；
配列番号３５および配列番号３６（Ｉ５３－４０Ａ属およびＩ５３－４０Ｂ属）；
配列番号５および配列番号６（Ｉ５３－４７ＡおよびＩ５３－４７Ｂ）；
配列番号５および配列番号２７（Ｉ５３－４７ＡおよびＩ５３－４７Ｂ．１）；
配列番号５および配列番号２８（Ｉ５３－４７ＡおよびＩ５３－４７Ｂ．１ＮｅｇＴ２）；
配列番号２５および配列番号６（Ｉ５３－４７Ａ．１およびＩ５３－４７Ｂ）；
配列番号２５および配列番号２７（Ｉ５３－４７Ａ．１およびＩ５３－４７Ｂ．１）；
配列番号２５および配列番号２８（Ｉ５３－４７Ａ．１およびＩ５３－４７Ｂ．１ＮｅｇＴ２）；
配列番号２６および配列番号６（Ｉ５３－４７Ａ．１ＮｅｇＴ２およびＩ５３－４７Ｂ）；
配列番号２６および配列番号２７（Ｉ５３－４７Ａ．１ＮｅｇＴ２およびＩ５３－４７Ｂ．１）；
配列番号２６および配列番号２８（Ｉ５３－４７Ａ．１ＮｅｇＴ２およびＩ５３－４７Ｂ．１ＮｅｇＴ２）；
配列番号３７および配列番号３８（Ｉ５３－４７Ａ属およびＩ５３－４７Ｂ属）；
配列番号７および配列番号８（Ｉ５３－５０ＡおよびＩ５３－５０Ｂ）；
配列番号７および配列番号３２（Ｉ５３－５０ＡおよびＩ５３－５０Ｂ．１）；
配列番号７および配列番号３３（Ｉ５３－５０ＡおよびＩ５３－５０Ｂ．１ＮｅｇＴ２）；
配列番号７および配列番号３４（Ｉ５３－５０ＡおよびＩ５３－５０Ｂ．４ＰｏｓＴ１）；
配列番号２９および配列番号８（Ｉ５３－５０Ａ．１およびＩ５３－５０Ｂ）；
配列番号２９および配列番号３２（Ｉ５３－５０Ａ．１およびＩ５３－５０Ｂ．１）；
配列番号２９および配列番号３３（Ｉ５３－５０Ａ．１およびＩ５３－５０Ｂ．１ＮｅｇＴ２）；
配列番号２９および配列番号３４（Ｉ５３－５０Ａ．１およびＩ５３－５０Ｂ．４ＰｏｓＴ１）；
配列番号３０および配列番号８（Ｉ５３－５０Ａ．１ＮｅｇＴ２およびＩ５３－５０Ｂ）；
配列番号３０および配列番号３２（Ｉ５３－５０Ａ．１ＮｅｇＴ２およびＩ５３－５０Ｂ．１）；
配列番号３０および配列番号３３（Ｉ５３－５０Ａ．１ＮｅｇＴ２およびＩ５３－５０Ｂ．１ＮｅｇＴ２）；
配列番号３０および配列番号３４（Ｉ５３－５０Ａ．１ＮｅｇＴ２およびＩ５３－５０Ｂ．４ＰｏｓＴ１）；
配列番号３１および配列番号８（Ｉ５３－５０Ａ．１ＰｏｓＴ１およびＩ５３－５０Ｂ）；
配列番号３１および配列番号３２（Ｉ５３－５０Ａ．１ＰｏｓＴ１およびＩ５３－５０Ｂ．１）；
配列番号３１および配列番号３３（Ｉ５３－５０Ａ．１ＰｏｓＴ１およびＩ５３－５０Ｂ．１ＮｅｇＴ２）；
配列番号３１および配列番号３４（Ｉ５３－５０Ａ．１ＰｏｓＴ１およびＩ５３－５０Ｂ．４ＰｏｓＴ１）；
配列番号３９および配列番号４０（Ｉ５３－５０Ａ属およびＩ５３－５０Ｂ属）；
配列番号９および配列番号１０（Ｉ５３－５１ＡおよびＩ５３－５１Ｂ）；
配列番号１１および配列番号１２（Ｉ５２－０３ＡおよびＩ５２－０３Ｂ）；
配列番号１３および配列番号１４（Ｉ５２－３２ＡおよびＩ５２－３２Ｂ）；
配列番号１５および配列番号１６（Ｉ５２－３３ＡおよびＩ５２－３３Ｂ）
配列番号１７および配列番号１８（Ｉ３２－０６ＡおよびＩ３２－０６Ｂ）；
配列番号１９および配列番号２０（Ｉ３２－１９ＡおよびＩ３２－１９Ｂ）；
配列番号２１および配列番号２２（Ｉ３２－２８ＡおよびＩ３２－２８Ｂ）；
配列番号２３および配列番号２４（Ｉ５３－４０Ａ．１およびＩ５３－４０Ｂ．１）；
配列番号４１および配列番号４２（Ｔ３２－２８ＡおよびＴ３２－２８Ｂ）；
配列番号４３および配列番号４４（Ｔ３３－０９ＡおよびＴ３３－０９Ｂ）；
配列番号４５および配列番号４６（Ｔ３３－１５ＡおよびＴ３３－１５Ｂ）；
配列番号４７および配列番号４８（Ｔ３３－２１ＡおよびＴ３３－２１Ｂ）；
配列番号４９および配列番号５０（Ｔ３３－２８ＡおよびＴ３２－２８Ｂ）；ならびに
配列番号５１および配列番号４４（Ｔ３３－３１ＡおよびＴ３３－０９Ｂ（Ｔ３３－３１Ｂとも呼ばれる））から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。

【0037】

１つの実施形態では、１つまたは複数のパラミクソウイルスおよび／もしくはニューモウイルスのＦタンパク質、またはその抗原フラグメントは、第１のおよび／または第２のポリペプチドとの融合タンパク質として発現される。これらの実施形態では、１つまたは複数のパラミクソウイルスおよび／もしくはニューモウイルスのＦタンパク質、またはその抗原フラグメントが融合タンパク質のＮ末端に存在することが好ましく、この立体配置により、常に、ナノ構造の外面の１つまたは複数のパラミクソウイルスおよび／もしくはニューモウイルスのＦタンパク質、またはその抗原フラグメントの提示を容易にすることができる。このように融合タンパク質のＮ末端にパラミクソウイルスおよび／またはニューモウイルスのＦタンパク質が存在することが好ましいのは、Ｆタンパク質三量体の一端（「底部」）にパラミクソウイルスおよび／またはニューモウイルスのＦタンパク質のＣ末端が存在するからである；このポイントに遺伝子融合物が存在することにより、大部分のＦタンパク質構造はナノ構造外面に表示され、接近可能であろう。さらなる実施形態では、ナノ構造は、少なくとも２つのドメイン－パラミクソウイルスおよび／もしくはニューモウイルスのＦタンパク質、またはその抗原フラグメント、ならびに三量体アセンブリドメイン（すなわち、各々の第１のアセンブリは、第１のポリペプチドのホモ三量体である）を含む融合タンパク質の１つまたは複数のコピー－および第２のオリゴマーブロックの１つまたは複数のコピー（すなわち、各々の第２のアセンブリは第２のポリペプチドの２つ以上のコピーのオリゴマーである）を含む。別の実施形態では、第１のまたは第２のポリペプチドを、１つまたは複数のパラミクソウイルスおよび／もしくはニューモウイルスのＦタンパク質、またはその抗原フラグメントが、第１のおよび／または第２のポリペプチドに共有結合するように改変することができる。１つの非限定的な例では、第１のおよび／または第２のポリペプチドを、１つまたは複数のパラミクソウイルスおよび／もしくはニューモウイルスのＦタンパク質、またはその抗原フラグメントの連結を容易にするように定義した位置に種々のシステイン残基を導入することなどによって改変することができる。

【0038】

他の実施形態では、１つまたは複数のパラミクソウイルスおよび／もしくはニューモウイルスのＦタンパク質、またはその抗原フラグメントは、任意の適切な技術（共有結合による化学的な架橋（任意の適切な架橋技術による）および非共有結合（人為的静電相互作用が含まれる）が含まれるが、これらに限定されない）によって第１のまたは第２のポリペプチドに付着している。

【0039】

三量体アセンブリドメイン
三量体パラミクソウイルスおよび／もしくはニューモウイルスのＦタンパク質、またはその抗原フラグメントを含む三量体アセンブリの１つの実施形態では、パラミクソウイルスおよび／もしくはニューモウイルスのＦタンパク質、またはその抗原フラグメントは、第１のポリペプチドに遺伝的に融合され、それにより三量体アセンブリに自己アセンブリする。三量体アセンブリは、第１のポリペプチドの３つのコピーを自己会合させて三量体基本単位を形成するように誘導するタンパク質－タンパク質界面を含む。第１のポリペプチドの各々のコピーは、第２のアセンブリドメイン上の相補的な表面が暴露した界面と相互作用する表面が暴露した界面をさらに含む。Ｋｉｎｇら（Ｎａｔｕｒｅ ５１０，１０３－１０８，２０１４）、Ｂａｌｅら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３，３８９－３９４，２０１６）、および特許公開ＷＯ２０１４１２４３０１Ａ１号およびＵＳ２０１６０１２２３９２Ａ１号に記載のように、三量体アセンブリドメインと第２のアセンブリドメインとの間の相補的なタンパク質－タンパク質界面は、三量体アセンブリドメインの複数のコピーおよび第２のアセンブリドメインの標的ナノ構造へのアセンブリを駆動する。いくつかの実施形態では、ナノ構造の三量体アセンブリドメインの各々のコピーは、遺伝子融合物としてパラミクソウイルスおよび／もしくはニューモウイルスのＦタンパク質、またはその抗原フラグメントを保有し；これらのナノ構造は、完全な結合価でＦタンパク質を表示する。他の実施形態では、本発明のナノ構造は、遺伝子融合物としてパラミクソウイルスおよび／もしくはニューモウイルスのＦタンパク質、またはその抗原フラグメントを保有する三量体アセンブリドメインの１つまたは複数のコピーならびに遺伝子融合物としてＦタンパク質を保有しない１つまたは複数の三量体アセンブリドメインを含み；これらのナノ構造は、部分的結合価でＦタンパク質を表示する。三量体アセンブリドメインは、三量体を形成し、第２のアセンブリドメインと相互作用して標的ナノ構造へのアセンブリを駆動する任意のポリペプチド配列であり得る。

【0040】

１つの特定の実施形態では、第１のポリペプチドは、Ｔ３３－３１Ａ（配列番号５１）のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含み、第２のポリペプチドは、Ｔ３３－０９Ｂ／Ｔ３３－３１Ｂ（配列番号４４）のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む（括弧内の残基は、任意選択である）

Ｔ３３－３１Ａ（配列番号５１）
（Ｍ）ＥＥＶＶＬＩＴＶＰＳＡＬＶＡＶＫＩＡＨＡＬＶＥＥＲＬＡＡＣＶＮＩＶＰＧＬＴＳＩＹＲＥＥＧＳＶＶＳＤＨＥＬＬＬＬＶＫＴＴＴＤＡＦＰＫＬＫＥＲＶＫＥＬＨＰＹＥＶＰＥＩＶＡＬＰＩＡＥＧＮＲＥＹＬＤＷＬＲＥＮＴＧ

＞Ｔ３３－３１Ｂ（配列番号４４）
（Ｍ）ＶＲＧＩＲＧＡＩＴＶＥＥＤＴＰＡＡＩＬＡＡＴＩＥＬＬＬＫＭＬＥＡＮＧＩＱＳＹＥＥＬＡＡＶＩＦＴＶＴＥＤＬＴＳＡＦＰＡＥＡＡＲＬＩＧＭＨＲＶＰＬＬＳＡＲＥＶＰＶＰＧＳＬＰＲＶＩＲＶＬＡＬＷＮＴＤＴＰＱＤＲＶＲＨＶＹＬＮＥＡＶＲＬＲＰＤＬＥＳＡＱ

【0041】

別の特定の実施形態では、第１のポリペプチドは、Ｔ３３－１５Ａ（配列番号４５）のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含み、第２のポリペプチドは、Ｔ３３－１５Ｂ（配列番号４６）のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。

【0042】

種々のさらなる特定の実施形態では、第１のポリペプチドは、Ｉ５３－５０Ａ（配列番号７）、Ｉ５３－５０Ａ．１（配列番号２９）、Ｉ５３－５０Ａ．１ＮｅｇＴ２（配列番号３０）、およびＩ５３－５０Ａ．１ＰｏｓＴ１（配列番号３１）からなる群から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含み、第２のポリペプチドは、Ｉ５３－５０Ｂ（配列番号８）、Ｉ５３－５０Ｂ．１（配列番号３２）、Ｉ５３－５０Ｂ．１ＮｅｇＴ２（配列番号３３）、およびＩ５３－５０Ｂ．４ＰｏｓＴ１（配列番号３４）からなる群から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。

【0043】

別の特定の実施形態では、第１のポリペプチドは、Ｉ３２－２８Ａ（配列番号２１）のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含み、第２のポリペプチドは、Ｉ３２－２８Ｂ（配列番号２２）のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。

【0044】

本発明のナノ構造は、１つまたは複数のパラミクソウイルスおよび／もしくはニューモウイルスのＦタンパク質、またはその抗原フラグメントの複数の（すなわち、２、３、またはそれを超える）コピーを、ナノ構造の外面に表示している。例示的なパラミクソウイルスおよび／またはニューモウイルスには、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）およびヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）が含まれるが、これらに限定されない（Ｃ．Ｌ．Ａｆｏｎｓｏら，Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒｄｅｒ Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ：ｕｐｄａｔｅ ２０１６．Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１６１，２３５１－２３６０（２０１６））。

【0045】

本明細書中で使用する場合、「ナノ構造の外面に」は、１つまたは複数のパラミクソウイルスおよび／もしくはニューモウイルスのＦタンパク質、またはその抗原フラグメントの抗原部分が、Ｂ細胞受容体、抗体、または抗体フラグメントによる結合のために接近可能でなければならず、ナノ構造内に埋没していてはならないことを意味する。

【0046】

１つまたは複数のパラミクソウイルスおよび／もしくはニューモウイルスのＦタンパク質、またはその抗原フラグメントは、パラミクソウイルスおよび／またはニューモウイルスのＦタンパク質に結合する抗体を生成する免疫応答を誘導することができる任意の適切な未変性Ｆタンパク質、融合後抗原、または融合前（ｐｒｅＦ）抗原、またはその変異体を含み得る。ナノ構造は、１つを超えるＦタンパク質を表示することができる；したがって、いくつかの実施形態では、１つまたは複数のパラミクソウイルスおよび／もしくはニューモウイルスのＦタンパク質、またはその抗原フラグメントは、１、２、３、４、またはそれを超えるＦタンパク質またはその抗原フラグメントを含む。１つの実施形態では、１つまたは複数のパラミクソウイルスおよび／もしくはニューモウイルスのＦタンパク質、またはその抗原フラグメントは、米国特許出願公開第２０１６／００４６６７５Ａ１号に定義の通りであり得る。いくつかの実施形態では、米国特許出願公開第２０１６／００４６６７５号に開示のように、１つまたは複数のパラミクソウイルスおよび／もしくはニューモウイルスのＦタンパク質、またはその抗原フラグメントは、配列番号１～３５０、３７０～３８２、３８９～６９３、６９８～１０２６、１４２９～１４４２、１４５６～１４６８、および１４７４～１４７８からなる群から選択される。他の実施形態では、１つまたは複数のパラミクソウイルスおよび／もしくはニューモウイルスのＦタンパク質、またはその抗原フラグメントは、ＷＯ２０１２１５８６１３号、ＵＳ２０１６０１０２１２３号、ＵＳ２０１４０１４１０３７号、ＷＯ２０１４０７９８４２号、ＷＯ２０１４１６０４６３号、ＵＳ２０１４０２７１６９９号、ＥＰ２９７０３９３号、ＷＯ２０１４１７４０１８号、ＵＳ２０１４０２７１６９９号、ＵＳ２０１６０１７６９３２号、ＵＳ２０１６０１２２３９８号、ＷＯ２０１７０４０３８７号、ＷＯ２０１７１０９６２９号、ＷＯ２０１７１７２８９０号、ＷＯ２０１７２０７４７７号、Ｋｒａｒｕｐら（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ６：８１４３、およびＷＯ２０１７２０７４８０号に定義の通りであり得る。

【0047】

特定の実施形態では、１つまたは複数のパラミクソウイルスおよび／もしくはニューモウイルスのＦタンパク質、またはその抗原フラグメントは、以下に示すＤＳ－Ｃａｖ１のアミノ酸配列に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む（括弧内の残基は任意選択である；分泌中に括弧内のＮ末端残基がタンパク質から切断される－成熟Ｎ末端がＱＮＩＴＥＥＦ・・・（配列番号５２）から開始されることに留意のこと）。ＤＳ－Ｃａｖ１は、融合前安定化形態の融合（Ｆ）糖タンパク質を含み、この糖タンパク質は、マウスおよびマカクにおいて、融合後ＲＳＶ Ｆと比較して呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対して改善された防御応答を誘発する（ＭｃＬｅｌｌａｎら（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４２：５９２－８）。

ＤＳ－Ｃａｖ１（配列番号５３）：
（ＭＥＬＬＩＬＫＡＮＡＩＴＴＩＬＴＡＶＴＦＣＦＡＳＧ）ＱＮＩＴＥＥＦＹＱＳＴＣＳＡＶＳＫＧＹＬＳＡＬＲＴＧＷＹＴＳＶＩＴＩＥＬＳＮＩＫＥＮＫＣＮＧＴＤＡＫＶＫＬＩＫＱＥＬＤＫＹＫＮＡＶＴＥＬＱＬＬＭＱＳＴＰＡＴＮＮＲＡＲＲＥＬＰＲＦＭＮＹＴＬＮＮＡＫＫＴＮＶＴＬＳＫＫＲＫＲＲＦＬＧＦＬＬＧＶＧＳＡＩＡＳＧＶＡＶＣＫＶＬＨＬＥＧＥＶＮＫＩＫＳＡＬＬＳＴＮＫＡＶＶＳＬＳＮＧＶＳＶＬＴＦＫＶＬＤＬＫＮＹＩＤＫＱＬＬＰＩＬＮＫＱＳＣＳＩＳＮＩＥＴＶＩＥＦＱＱＫＮＮＲＬＬＥＩＴＲＥＦＳＶＮＡＧＶＴＴＰＶＳＴＹＭＬＴＮＳＥＬＬＳＬＩＮＤＭＰＩＴＮＤＱＫＫＬＭＳＮＮＶＱＩＶＲＱＱＳＹＳＩＭＣＩＩＫＥＥＶＬＡＹＶＶＱＬＰＬＹＧＶＩＤＴＰＣＷＫＬＨＴＳＰＬＣＴＴＮＴＫＥＧＳＮＩＣＬＴＲＴＤＲＧＷＹＣＤＮＡＧＳＶＳＦＦＰＱＡＥＴＣＫＶＱＳＮＲＶＦＣＤＴＭＮＳＬＴＬＰＳＥＶＮＬＣＮＶＤＩＦＮＰＫＹＤＣＫＩＭＴＳＫＴＤＶＳＳＳＶＩＴＳＬＧＡＩＶＳＣＹＧＫＴＫＣＴＡＳＮＫＮＲＧＩＩＫＴＦＳＮＧＣＤＹＶＳＮＫＧＶＤＴＶＳＶＧＮＴＬＹＹＶＮＫＱＥＧＫＳＬＹＶＫＧＥＰＩＩＮＦＹＤＰＬＶＦＰＳＤＥＦＤＡＳＩＳＱＶＮＥＫＩＮＱＳＬＡＦＩＲ（ＫＳＤＥＬＬ）

【0048】

他の実施形態では、Ｆタンパク質は、以下から選択されるポリペプチドに対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含み得る：

ＲＳＶ Ｆ
ｓｃ９－１０ ＤＳ－Ｃａｖ１ Ａ１４９Ｃ Ｙ４５８Ｃ（配列番号６１）
（ＭＥＬＬＩＬＫＡＮＡＩＴＴＩＬＴＡＶＴＦＣＦＡＳＧ）ＱＮＩＴＥＥＦＹＱＳＴＣＳＡＶＳＫＧＹＬＳＡＬＲＴＧＷＹＴＳＶＩＴＩＥＬＳＮＩＫＥＮＫＣＮＧＴＤＡＫＶＫＬＩＫＱＥＬＤＫＹＫＮＡＶＴＥＬＱＬＬＭＱＳＴＰＡＴＧＳＧＳＡＩＣＳＧＶＡＶＣＫＶＬＨＬＥＧＥＶＮＫＩＫＳＡＬＬＳＴＮＫＡＶＶＳＬＳＮＧＶＳＶＬＴＦＫＶＬＤＬＫＮＹＩＤＫＱＬＬＰＩＬＮＫＱＳＣＳＩＳＮＩＥＴＶＩＥＦＱＱＫＮＮＲＬＬＥＩＴＲＥＦＳＶＮＡＧＶＴＴＰＶＳＴＹＭＬＴＮＳＥＬＬＳＬＩＮＤＭＰＩＴＮＤＱＫＫＬＭＳＮＮＶＱＩＶＲＱＱＳＹＳＩＭＣＩＩＫＥＥＶＬＡＹＶＶＱＬＰＬＹＧＶＩＤＴＰＣＷＫＬＨＴＳＰＬＣＴＴＮＴＫＥＧＳＮＩＣＬＴＲＴＤＲＧＷＹＣＤＮＡＧＳＶＳＦＦＰＱＡＥＴＣＫＶＱＳＮＲＶＦＣＤＴＭＮＳＲＴＬＰＳＥＶＮＬＣＮＶＤＩＦＮＰＫＹＤＣＫＩＭＴＳＫＴＤＶＳＳＳＶＩＴＳＬＧＡＩＶＳＣＹＧＫＴＫＣＴＡＳＮＫＮＲＧＩＩＫＴＦＳＮＧＣＤＹＶＳＮＫＧＶＤＴＶＳＶＧＮＴＬＹＣＶＮＫＱＥＧＫＳＬＹＶＫＧＥＰＩＩＮＦＹＤＰＬＶＦＰＳＤＥＦＤＡＳＩＳＱＶＮＥＫＩＮＱＳＬＡＦＩＲ（ＫＳＤＥＬＬ）

ｓｃ９－１０ ＤＳ－Ｃａｖ１ Ａ１４９Ｃ Ｙ４５８Ｃ Ｓ４６Ｇ Ｋ４６５Ｑ Ｓ２１５Ｐ Ｅ９２Ｄ（配列番号６２）
（ＭＥＬＬＩＬＫＡＮＡＩＴＴＩＬＴＡＶＴＦＣＦＡＳＧ）ＱＮＩＴＥＥＦＹＱＳＴＣＳＡＶＳＫＧＹＬＧＡＬＲＴＧＷＹＴＳＶＩＴＩＥＬＳＮＩＫＥＮＫＣＮＧＴＤＡＫＶＫＬＩＫＱＥＬＤＫＹＫＮＡＶＴＤＬＱＬＬＭＱＳＴＰＡＴＧＳＧＳＡＩＣＳＧＶＡＶＣＫＶＬＨＬＥＧＥＶＮＫＩＫＳＡＬＬＳＴＮＫＡＶＶＳＬＳＮＧＶＳＶＬＴＦＫＶＬＤＬＫＮＹＩＤＫＱＬＬＰＩＬＮＫＱＳＣＳＩＰＮＩＥＴＶＩＥＦＱＱＫＮＮＲＬＬＥＩＴＲＥＦＳＶＮＡＧＶＴＴＰＶＳＴＹＭＬＴＮＳＥＬＬＳＬＩＮＤＭＰＩＴＮＤＱＫＫＬＭＳＮＮＶＱＩＶＲＱＱＳＹＳＩＭＣＩＩＫＥＥＶＬＡＹＶＶＱＬＰＬＹＧＶＩＤＴＰＣＷＫＬＨＴＳＰＬＣＴＴＮＴＫＥＧＳＮＩＣＬＴＲＴＤＲＧＷＹＣＤＮＡＧＳＶＳＦＦＰＱＡＥＴＣＫＶＱＳＮＲＶＦＣＤＴＭＮＳＲＴＬＰＳＥＶＮＬＣＮＶＤＩＦＮＰＫＹＤＣＫＩＭＴＳＫＴＤＶＳＳＳＶＩＴＳＬＧＡＩＶＳＣＹＧＫＴＫＣＴＡＳＮＫＮＲＧＩＩＫＴＦＳＮＧＣＤＹＶＳＮＫＧＶＤＴＶＳＶＧＮＴＬＹＣＶＮＫＱＥＧＱＳＬＹＶＫＧＥＰＩＩＮＦＹＤＰＬＶＦＰＳＤＥＦＤＡＳＩＳＱＶＮＥＫＩＮＱＳＬＡＦＩＲ（ＫＳＤＥＬＬ）

【0049】

配列番号６１～６２は、第２世代の安定化ＤＳ－Ｃａｖ１免疫原を示す；ＤＳ－Ｃａｖ１に対する変異が記述されており、本開示が上記の配列番号６１または６２中の単一の記述されたアミノ酸置換、または２つ以上の記述されたアミノ酸置換が異なるＤＳ－Ｃａｖ１変異体の使用を意図することに留意すべきである。他の実施形態では、Ｆタンパク質は、以下のうちの１つまたは複数を含むことができ、その各々が、上記の配列番号６１または６２中の１、２、またはそれを超える記述したアミノ酸置換をさらに含み得る：

ＲＳＶ Ｆ ＳＣ－ＤＭ（Ｎ６７Ｉ、Ｓ２１５Ｐ）（配列番号６３）
（ＭＥＬＬＩＬＫＡＮＡＩＴＴＩＬＴＡＶＴＦＣＦＡＳＧ）ＱＮＩＴＥＥＦＹＱＳＴＣＳＡＶＳＫＧＹＬＳＡＬＲＴＧＷＹＴＳＶＩＴＩＥＬＳＮＩＫＫＩＫＣＮＧＴＤＡＫＩＫＬＩＫＱＥＬＤＫＹＫＮＡＶＴＥＬＱＬＬＭＱＳＴＰＡＴＮＮＱＡＲＧＳＧＳＧＲＳＬＧＦＬＬＧＶＧＳＡＩＡＳＧＶＡＶＳＫＶＬＨＬＥＧＥＶＮＫＩＫＳＡＬＬＳＴＮＫＡＶＶＳＬＳＮＧＶＳＶＬＴＳＫＶＬＤＬＫＮＹＩＤＫＱＬＬＰＩＶＮＫＱＳＣＳＩＰＮＩＥＴＶＩＥＦＱＱＫＮＮＲＬＬＥＩＴＲＥＦＳＶＮＡＧＶＴＴＰＶＳＴＹＭＬＴＮＳＥＬＬＳＬＩＮＤＭＰＩＴＮＤＱＫＫＬＭＳＮＮＶＱＩＶＲＱＱＳＹＳＩＭＳＩＩＫＥＥＶＬＡＹＶＶＱＬＰＬＹＧＶＩＤＴＰＣＷＫＬＨＴＳＰＬＣＴＴＮＴＫＥＧＳＮＩＣＬＴＲＴＤＲＧＷＹＣＤＮＡＧＳＶＳＦＦＰＱＡＥＴＣＫＶＱＳＮＲＶＦＣＤＴＭＮＳＬＴＬＰＳＥＶＮＬＣＮＶＤＩＦＮＰＫＹＤＣＫＩＭＴＳＫＴＤＶＳＳＳＶＩＴＳＬＧＡＩＶＳＣＹＧＫＴＫＣＴＡＳＮＫＮＲＧＩＩＫＴＦＳＮＧＣＤＹＶＳＮＫＧＶＤＴＶＳＶＧＮＴＬＹＹＶＮＫＱＥＧＫＳＬＹＶＫＧＥＰＩＩＮＦＹＤＰＬＶＦＰＳＤＥＦＤＡＳＩＳＱＶＮＥＫＩＮＱＳＬＡＦＩＲ（ＫＳＤＥＬＬＳＡＩＧＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ）

ＳＣ－ＴＭ（Ｎ６７Ｉ、Ｓ２１５Ｐ、およびＥ４８７Ｑ）（配列番号６４）
（ＭＥＬＬＩＬＫＡＮＡＩＴＴＩＬＴＡＶＴＦＣＦＡＳＧ）ＱＮＩＴＥＥＦＹＱＳＴＣＳＡＶＳＫＧＹＬＳＡＬＲＴＧＷＹＴＳＶＩＴＩＥＬＳＮＩＫＫＩＫＣＮＧＴＤＡＫＩＫＬＩＫＱＥＬＤＫＹＫＮＡＶＴＥＬＱＬＬＭＱＳＴＰＡＴＮＮＱＡＲＧＳＧＳＧＲＳＬＧＦＬＬＧＶＧＳＡＩＡＳＧＶＡＶＳＫＶＬＨＬＥＧＥＶＮＫＩＫＳＡＬＬＳＴＮＫＡＶＶＳＬＳＮＧＶＳＶＬＴＳＫＶＬＤＬＫＮＹＩＤＫＱＬＬＰＩＶＮＫＱＳＣＳＩＰＮＩＥＴＶＩＥＦＱＱＫＮＮＲＬＬＥＩＴＲＥＦＳＶＮＡＧＶＴＴＰＶＳＴＹＭＬＴＮＳＥＬＬＳＬＩＮＤＭＰＩＴＮＤＱＫＫＬＭＳＮＮＶＱＩＶＲＱＱＳＹＳＩＭＳＩＩＫＥＥＶＬＡＹＶＶＱＬＰＬＹＧＶＩＤＴＰＣＷＫＬＨＴＳＰＬＣＴＴＮＴＫＥＧＳＮＩＣＬＴＲＴＤＲＧＷＹＣＤＮＡＧＳＶＳＦＦＰＱＡＥＴＣＫＶＱＳＮＲＶＦＣＤＴＭＮＳＬＴＬＰＳＥＶＮＬＣＮＶＤＩＦＮＰＫＹＤＣＫＩＭＴＳＫＴＤＶＳＳＳＶＩＴＳＬＧＡＩＶＳＣＹＧＫＴＫＣＴＡＳＮＫＮＲＧＩＩＫＴＦＳＮＧＣＤＹＶＳＮＫＧＶＤＴＶＳＶＧＮＴＬＹＹＶＮＫＱＥＧＫＳＬＹＶＫＧＥＰＩＩＮＦＹＤＰＬＶＦＰＳＤＱＦＤＡＳＩＳＱＶＮＥＫＩＮＱＳＬＡＦＩＲ（ＫＳＤＥＬＬＳＡＩＧＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ）

ＨＭＰＶ Ｆタンパク質、ＣＡＮ９７－８３（Ａ２）株（配列番号６５）
（ＭＳＷＫＶＶＩＩＦＳＬＬＩＴＰＱＨＧ）ＬＫＥＳＹＬＥＥＳＣＳＴＩＴＥＧＹＬＳＶＬＲＴＧＷＹＴＮＶＦＴＬＥＶＧＤＶＥＮＬＴＣＳＤＧＰＳＬＩＫＴＥＬＤＬＴＫＳＡＬＲＥＬＫＴＶＳＡＤＱＬＡＲＥＥＱＩＥＮＰＲＱＳＲＦＶＬＧＡＩＡＬＧＶＡＴＡＡＡＶＴＡＧＶＡＩＡＫＴＩＲＬＥＳＥＶＴＡＩＫＮＡＬＫＴＴＮＥＡＶＳＴＬＧＮＧＶＲＶＬＡＴＡＶＲＥＬＫＤＦＶＳＫＮＬＴＲＡＩＮＫＮＫＣＤＩＤＤＬＫＭＡＶＳＦＳＱＦＮＲＲＦＬＮＶＶＲＱＦＳＤＮＡＧＩＴＰＡＩＳＬＤＬＭＴＤＡＥＬＡＲＡＶＳＮＭＰＴＳＡＧＱＩＫＬＭＬＥＮＲＡＭＶＲＲＫＧＦＧＩＬＩＧＶＹＧＳＳＶＩＹＭＶＱＬＰＩＦＧＶＩＤＴＰＣＷＩＶＫＡＡＰＳＣＳＧＫＫＧＮＹＡＣＬＬＲＥＤＱＧＷＹＣＱＮＡＧＳＴＶＹＹＰＮＥＫＤＣＥＴＲＧＤＨＶＦＣＤＴＡＡＧＩＮＶＡＥＱＳＫＥＣＮＩＮＩＳＴＴＮＹＰＣＫＶＳＴＧＲＨＰＩＳＭＶＡＬＳＰＬＧＡＬＶＡＣＹＫＧＶＳＣＳＩＧＳＮＲＶＧＩＩＫＱＬＮＫＧＣＳＹＩＴＮＱＤＡＤＴＶＴＩＤＮＴＶＹＱＬＳＫＶＥＧＥＱＨＶＩＫＧＲＰＶＳＳＳＦＤＰＩＫＦＰＥＤＱＦＮＶＡＬＤＱＶＦＥＮＩＥＮＳＱＡＬＶＤＱＳＮＲＩＬＳＳＡＥＫＧＮＴＧ

Ａ１１３Ｃ、Ａ３３９Ｃ、Ｔ１６０Ｆ、Ｉ１７７Ｌを有するＨＭＰＶＦ（配列番号６６）
（ＭＳＷＫＶＶＩＩＦＳＬＬＩＴＰＱＨＧ）ＬＫＥＳＹＬＥＥＳＣＳＴＩＴＥＧＹＬＳＶＬＲＴＧＷＹＴＮＶＦＴＬＥＶＧＤＶＥＮＬＴＣＳＤＧＰＳＬＩＫＴＥＬＤＬＴＫＳＡＬＲＥＬＫＴＶＳＡＤＱＬＡＲＥＥＱＩＥＮＰＲＱＳＲＦＶＬＧＡＩＡＬＧＶＣＴＡＡＡＶＴＡＧＶＡＩＡＫＴＩＲＬＥＳＥＶＴＡＩＫＮＡＬＫＴＴＮＥＡＶＳＴＬＧＮＧＶＲＶＬＡＦＡＶＲＥＬＫＤＦＶＳＫＮＬＴＲＡＬＮＫＮＫＣＤＩＤＤＬＫＭＡＶＳＦＳＱＦＮＲＲＦＬＮＶＶＲＱＦＳＤＮＡＧＩＴＰＡＩＳＬＤＬＭＴＤＡＥＬＡＲＡＶＳＮＭＰＴＳＡＧＱＩＫＬＭＬＥＮＲＡＭＶＲＲＫＧＦＧＩＬＩＧＶＹＧＳＳＶＩＹＭＶＱＬＰＩＦＧＶＩＤＴＰＣＷＩＶＫＡＡＰＳＣＳＧＫＫＧＮＹＡＣＬＬＲＥＤＱＧＷＹＣＱＮＡＧＳＴＶＹＹＰＮＥＫＤＣＥＴＲＧＤＨＶＦＣＤＴＡＣＧＩＮＶＡＥＱＳＫＥＣＮＩＮＩＳＴＴＮＹＰＣＫＶＳＴＧＲＨＰＩＳＭＶＡＬＳＰＬＧＡＬＶＡＣＹＫＧＶＳＣＳＩＧＳＮＲＶＧＩＩＫＱＬＮＫＧＣＳＹＩＴＮＱＤＡＤＴＶＴＩＤＮＴＶＹＱＬＳＫＶＥＧＥＱＨＶＩＫＧＲＰＶＳＳＳＦＤＰＩＫＦＰＥＤＱＦＮＶＡＬＤＱＶＦＥＮＩＥＮＳＱＡＬＶＤＱＳＮＲＩＬＳＳＡＥＫＧＮＴＧ

Ａ１１３Ｃ、Ａ１２０Ｃ、Ａ３３９Ｃ、Ｔ１６０Ｆ、Ｉ１７７Ｌ、およびＱ４２６Ｃを有するＨＭＰＶ Ｆ（配列番号６７）
（ＭＳＷＫＶＶＩＩＦＳＬＬＩＴＰＱＨＧ）ＬＫＥＳＹＬＥＥＳＣＳＴＩＴＥＧＹＬＳＶＬＲＴＧＷＹＴＮＶＦＴＬＥＶＧＤＶＥＮＬＴＣＳＤＧＰＳＬＩＫＴＥＬＤＬＴＫＳＡＬＲＥＬＫＴＶＳＡＤＱＬＡＲＥＥＱＩＥＮＰＲＱＳＲＦＶＬＧＡＩＡＬＧＶＣＴＡＡＡＶＴＣＧＶＡＩＡＫＴＩＲＬＥＳＥＶＴＡＩＫＮＡＬＫＴＴＮＥＡＶＳＴＬＧＮＧＶＲＶＬＡＦＡＶＲＥＬＫＤＦＶＳＫＮＬＴＲＡＬＮＫＮＫＣＤＩＤＤＬＫＭＡＶＳＦＳＱＦＮＲＲＦＬＮＶＶＲＱＦＳＤＮＡＧＩＴＰＡＩＳＬＤＬＭＴＤＡＥＬＡＲＡＶＳＮＭＰＴＳＡＧＱＩＫＬＭＬＥＮＲＡＭＶＲＲＫＧＦＧＩＬＩＧＶＹＧＳＳＶＩＹＭＶＱＬＰＩＦＧＶＩＤＴＰＣＷＩＶＫＡＡＰＳＣＳＧＫＫＧＮＹＡＣＬＬＲＥＤＱＧＷＹＣＱＮＡＧＳＴＶＹＹＰＮＥＫＤＣＥＴＲＧＤＨＶＦＣＤＴＡＣＧＩＮＶＡＥＱＳＫＥＣＮＩＮＩＳＴＴＮＹＰＣＫＶＳＴＧＲＨＰＩＳＭＶＡＬＳＰＬＧＡＬＶＡＣＹＫＧＶＳＣＳＩＧＳＮＲＶＧＩＩＫＱＬＮＫＧＣＳＹＩＴＮＱＤＡＤＴＶＴＩＤＮＴＶＹＣＬＳＫＶＥＧＥＱＨＶＩＫＧＲＰＶＳＳＳＦＤＰＩＫＦＰＥＤＱＦＮＶＡＬＤＱＶＦＥＮＩＥＮＳＱＡＬＶＤＱＳＮＲＩＬＳＳＡＥＫＧＮＴＧ

ＨＭＰＶ Ｆ＞ＡＡＫ６２９６８．２融合タンパク質［ヒトメタニューモウイルス］（配列番号１０１）
（ＭＳＷＫＶＶＩＩＦＳＬＬＩＴＰＱＨＧ）ＬＫＥＳＹＬＥＥＳＣＳＴＩＴＥＧＹＬＳＶＬＲＴＧＷＹＴＮＶＦＴＬＥＶＧＤＶＥＮＬＴＣＡＤＧＰＳＬＩＫＴＥＬＤＬＴＫＳＡＬＲＥＬＲＴＶＳＡＤＱＬＡＲＥＥＱＩＥＮＰＲＱＳＲＦＶＬＧＡＩＡＬＧＶＡＴＡＡＡＶＴＡＧＶＡＩＡＫＴＩＲＬＥＳＥＶＴＡＩＫＮＡＬＫＫＴＮＥＡＶＳＴＬＧＮＧＶＲＶＬＡＴＡＶＲＥＬＫＤＦＶＳＫＮＬＴＲＡＩＮＫＮＫＣＤＩＡＤＬＫＭＡＶＳＦＳＱＦＮＲＲＦＬＮＶＶＲＱＦＳＤＮＡＧＩＴＰＡＩＳＬＤＬＭＴＤＡＥＬＡＲＡＶＳＮＭＰＴＳＡＧＱＩＫＬＭＬＥＮＲＡＭＶＲＲＫＧＦＧＦＬＩＧＶＹＧＳＳＶＩＹＭＶＱＬＰＩＦＧＶＩＤＴＰＣＷＩＶＫＡＡＰＳＣＳＧＫＫＧＮＹＡＣＬＬＲＥＤＱＧＷＹＣＱＮＡＧＳＴＶＹＹＰＮＥＫＤＣＥＴＲＧＤＨＶＦＣＤＴＡＡＧＩＮＶＡＥＱＳＫＥＣＮＩＮＩＳＴＴＮＹＰＣＫＶＳＴＧＲＨＰＩＳＭＶＡＬＳＰＬＧＡＬＶＡＣＹＫＧＶＳＣＳＩＧＳＮＲＶＧＩＩＫＱＬＮＫＧＣＳＹＩＴＮＱＤＡＤＴＶＴＩＤＮＴＶＹＱＬＳＫＶＥＧＥＱＨＶＩＫＧＲＰＶＳＳＳＦＤＰＶＫＦＰＥＤＱＦＮＶＡＬＤＱＶＦＥＳＩＥＮＳＱＡＬＶＤＱＳＮＲＩＬＳＳＡＥＫＧＮＴＧ

１１５－ＢＶ（Ａ１８５Ｐ）（配列番号６８）
（ＭＳＷＫＶＶＩＩＦＳＬＬＩＴＰＱＨＧ）ＬＫＥＳＹＬＥＥＳＣＳＴＩＴＥＧＹＬＳＶＬＲＴＧＷＹＴＮＶＦＴＬＥＶＧＤＶＥＮＬＴＣＡＤＧＰＳＬＩＫＴＥＬＤＬＴＫＳＡＬＲＥＬＲＴＶＳＡＤＱＬＡＲＥＥＱＩＥＮＰＲＲＲＲＦＶＬＧＡＩＡＬＧＶＡＴＡＡＡＶＴＡＧＶＡＩＡＫＴＩＲＬＥＳＥＶＴＡＩＫＮＡＬＫＫＴＮＥＡＶＳＴＬＧＮＧＶＲＶＬＡＴＡＶＲＥＬＫＤＦＶＳＫＮＬＴＲＡＩＮＫＮＫＣＤＩＰＤＬＫＭＡＶＳＦＳＱＦＮＲＲＦＬＮＶＶＲＱＦＳＤＮＡＧＩＴＰＡＩＳＬＤＬＭＴＤＡＥＬＡＲＡＶＳＮＭＰＴＳＡＧＱＩＫＬＭＬＥＮＲＡＭＶＲＲＫＧＦＧＩＬＩＧＶＹＧＳＳＶＩＹＭＶＱＬＰＩＦＧＶＩＤＴＰＣＷＩＶＫＡＡＰＳＣＳＥＫＫＧＮＹＡＣＬＬＲＥＤＱＧＷＹＣＱＮＡＧＳＴＶＹＹＰＮＥＫＤＣＥＴＲＧＤＨＶＦＣＤＴＡＡＧＩＮＶＡＥＱＳＫＥＣＮＩＮＩＳＴＴＮＹＰＣＫＶＳＴＧＲＨＰＩＳＭＶＡＬＳＰＬＧＡＬＶＡＣＹＫＧＶＳＣＳＩＧＳＮＲＶＧＩＩＫＱＬＮＫＧＣＳＹＩＴＮＱＤＡＤＴＶＴＩＤＮＴＶＹＱＬＳＫＶＥＧＥＱＨＶＩＫＧＲＰＶＳＳＳＦＤＰＶＫＦＰＥＤＱＦＮＶＡＬＤＱＶＦＥＳＩＥＮＳＱＡＬＶＤＱＳＮＲＩＬＳＳＡＥＫＧＮＴ（ＳＧＲＥＮＬＹＦＱＧＧＧＧＳＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬＧＧＩＥＧＲＨＨＨＨＨＨ）

【0050】

他の実施形態では、１つまたは複数のパラミクソウイルスおよび／もしくはニューモウイルスのＦタンパク質、またはその抗原フラグメントは、配列番号５３および６１～６４からなる群から選択されるＲＳＶ Ｆタンパク質またはその変異体に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含むことができ、ポリペプチドは、以下の残基：６７Ｉ、１４９Ｃ、４５８Ｃ、４６Ｇ、４６５Ｑ、２１５Ｐ、９２Ｄ、および４８７Ｑのうちの１つまたは複数を含む。

【0051】

他の実施形態では、１つまたは複数のパラミクソウイルスおよび／もしくはニューモウイルスのＦタンパク質、またはその抗原フラグメントは、配列番号６５～６８および１０１からなる群から選択されるＭＰＶ Ｆタンパク質またはその変異体に対してその全長に沿って少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含むことができ、ポリペプチドは、以下の残基：１１３Ｃ、１２０Ｃ、３３９Ｃ、１６０Ｆ、１７７Ｌ、１８５Ｐ、および４２６Ｃのうちの１つまたは複数を含む。

【0052】

Ｆタンパク質と三量体アセンブリドメインとの間のリンカーおよび幾何学的要件
本発明のナノ構造では、Ｆタンパク質および三量体アセンブリドメインを、これらの両方が単一のポリペプチド中に存在するように遺伝子融合することができる。好ましくは、Ｆタンパク質と三量体アセンブリドメインとの間の連結により、Ｆタンパク質またはその抗原フラグメントが本発明のナノ構造の外面に表示される。そのようなものとして、三量体アセンブリドメインの接続点は、任意のＦタンパク質の非存在下で三量体アセンブリドメインおよび第２のアセンブリドメインによって形成されたナノ構造の外面に存在すべきである。当業者によって理解されるように、多種多様のポリペプチド配列を使用して、パラミクソウイルスおよび／もしくはニューモウイルスのＦタンパク質、またはその抗原フラグメントならびに三量体アセンブリドメインを連結することができる。これらのポリペプチド配列を、リンカーと呼ぶ。任意の適切なリンカーを使用することができる；適切なリンカーとしての機能を果たすためのアミノ酸配列の要件は存在しない。Ｆタンパク質またはその抗原フラグメントが本発明のナノ構造の外面に表示されることを可能にする要件を超えるリンカーがＦタンパク質またはその抗原フラグメントの三量体アセンブリドメインへの強固な相対的配向を強いる要件は存在しない。いくつかの実施形態では、リンカーは、三量体の形態のＦタンパク質の安定化を補助するさらなる三量体化ドメイン（例えば、Ｔ４フィブリチンのｆｏｌｄｏｎドメイン）を含む。

【0053】

Ｔ４フィブリチンｆｏｌｄｏｎドメイン（リンカー領域中任意選択）（配列番号５４）
ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ
他の実施形態では、リンカーは、任意の適切な長さのＧｌｙ－Ｓｅｒリンカー（すなわち、グリシン残基およびセリン残基からなるリンカー）を含み得る。種々の実施形態では、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれを超えるアミノ酸長であり得る。種々の実施形態では、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーは、ＧＳＧＧＳＧＳＧＳＧＧＳＧＳＧ（配列番号５５）、ＧＧＳＧＧＳＧＳ（配列番号５６）、またはＧＳＧＧＳＧＳＧ（配列番号５７）のアミノ酸配列を含み得るか、これらのアミノ酸配列からなり得る。

【0054】

さらなる実施形態では、リンカーは、１つまたは複数のパラミクソウイルスおよび／もしくはニューモウイルスのＦタンパク質、またはその抗原フラグメントとの融合ポリペプチドとして発現されたときに、第１のポリペプチドのＮ末端ヘリックスを伸張するように機能を果たし得るヘリックス伸張ドメインを含むことができ、そのため、リンカーはナノ構造表面の外面に配置される。ヘリックス伸張は、本明細書中に記載の他のリンカー成分と組み合わせて存在しても、存在しなくても良い。ヘリックス伸張は、任意の適切な長さ（すなわち、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれを超えるアミノ酸）であってよく、任意の適切な一次アミノ酸配列を含み得る。１つの実施形態では、ヘリックス伸張は、アミノ酸配列ＥＫＡＡＫＡＥＥＡＡＲ（配列番号５８）を含み得るか、このアミノ酸配列からなり得る。

【0055】

したがって、Ｆタンパク質が第１のポリペプチドとの融合タンパク質として存在し、リンカーが使用される種々の非限定的な実施形態では、Ｆタンパク質－リンカー配列は、以下（これらの非限定的な実施形態においてＦタンパク質としてＤＳ－Ｃａｖ１によって例示される）を含み得る。括弧内の残基は任意選択であり、アミノ酸配列ＭＥＬＬＩＬＫＡＮＡＩＴＴＩＬＴＡＶＴＦＣＦＡＳＧ（配列番号５９）は、プロセシング中に切断されるＮ末端ＤＳ－Ｃａｖ１シグナルペプチドを示す。

ＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ（配列番号６０）：
（ＭＥＬＬＩＬＫＡＮＡＩＴＴＩＬＴＡＶＴＦＣＦＡＳＧ）ＱＮＩＴＥＥＦＹＱＳＴＣＳＡＶＳＫＧＹＬＳＡＬＲＴＧＷＹＴＳＶＩＴＩＥＬＳＮＩＫＥＮＫＣＮＧＴＤＡＫＶＫＬＩＫＱＥＬＤＫＹＫＮＡＶＴＥＬＱＬＬＭＱＳＴＰＡＴＮＮＲＡＲＲＥＬＰＲＦＭＮＹＴＬＮＮＡＫＫＴＮＶＴＬＳＫＫＲＫＲＲＦＬＧＦＬＬＧＶＧＳＡＩＡＳＧＶＡＶＣＫＶＬＨＬＥＧＥＶＮＫＩＫＳＡＬＬＳＴＮＫＡＶＶＳＬＳＮＧＶＳＶＬＴＦＫＶＬＤＬＫＮＹＩＤＫＱＬＬＰＩＬＮＫＱＳＣＳＩＳＮＩＥＴＶＩＥＦＱＱＫＮＮＲＬＬＥＩＴＲＥＦＳＶＮＡＧＶＴＴＰＶＳＴＹＭＬＴＮＳＥＬＬＳＬＩＮＤＭＰＩＴＮＤＱＫＫＬＭＳＮＮＶＱＩＶＲＱＱＳＹＳＩＭＣＩＩＫＥＥＶＬＡＹＶＶＱＬＰＬＹＧＶＩＤＴＰＣＷＫＬＨＴＳＰＬＣＴＴＮＴＫＥＧＳＮＩＣＬＴＲＴＤＲＧＷＹＣＤＮＡＧＳＶＳＦＦＰＱＡＥＴＣＫＶＱＳＮＲＶＦＣＤＴＭＮＳＬＴＬＰＳＥＶＮＬＣＮＶＤＩＦＮＰＫＹＤＣＫＩＭＴＳＫＴＤＶＳＳＳＶＩＴＳＬＧＡＩＶＳＣＹＧＫＴＫＣＴＡＳＮＫＮＲＧＩＩＫＴＦＳＮＧＣＤＹＶＳＮＫＧＶＤＴＶＳＶＧＮＴＬＹＹＶＮＫＱＥＧＫＳＬＹＶＫＧＥＰＩＩＮＦＹＤＰＬＶＦＰＳＤＥＦＤＡＳＩＳＱＶＮＥＫＩＮＱＳＬＡＦＩＲＫＳＤＥＬＬＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ

【0056】

種々のさらなる実施形態では、第１のポリペプチドは、Ｆタンパク質に融合した第１のポリペプチドの融合ポリペプチドを含むか、この融合ポリペプチドからなり、融合タンパク質は、以下から選択される配列を有する（括弧内は任意選択の残基）：

ＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｔ３３－３１Ａ（配列番号６９）
（ＭＥＬＬＩＬＫＡＮＶＩＡＴＩＬＴＡＶＴＦＣＦＡＳＳ）ＱＮＩＴＥＥＦＹＱＳＴＣＳＡＶＳＫＧＹＬＳＡＬＲＴＧＷＹＴＳＶＩＴＩＥＬＳＮＩＫＥＮＫＣＮＧＴＤＡＫＶＫＬＩＫＱＥＬＤＫＹＫＮＡＶＴＥＬＱＬＬＭＱＳＴＰＡＴＮＮＲＡＲＲＥＬＰＲＦＭＮＹＴＬＮＮＡＫＫＴＮＶＴＬＳＫＫＲＫＲＲＦＬＧＦＬＬＧＶＧＳＡＩＡＳＧＶＡＶＣＫＶＬＨＬＥＧＥＶＮＫＩＫＳＡＬＬＳＴＮＫＡＶＶＳＬＳＮＧＶＳＶＬＴＦＫＶＬＤＬＫＮＹＩＤＫＱＬＬＰＩＬＮＫＱＳＣＳＩＳＮＩＥＴＶＩＥＦＱＱＫＮＮＲＬＬＥＩＴＲＥＦＳＶＮＡＧＶＴＴＰＶＳＴＹＭＬＴＮＳＥＬＬＳＬＩＮＤＭＰＩＴＮＤＱＫＫＬＭＳＮＮＶＱＩＶＲＱＱＳＹＳＩＭＣＩＩＫＥＥＶＬＡＹＶＶＱＬＰＬＹＧＶＩＤＴＰＣＷＫＬＨＴＳＰＬＣＴＴＮＴＫＥＧＳＮＩＣＬＴＲＴＤＲＧＷＹＣＤＮＡＧＳＶＳＦＦＰＱＡＥＴＣＫＶＱＳＮＲＶＦＣＤＴＭＮＳＬＴＬＰＳＥＶＮＬＣＮＶＤＩＦＮＰＫＹＤＣＫＩＭＴＳＫＴＤＶＳＳＳＶＩＴＳＬＧＡＩＶＳＣＹＧＫＴＫＣＴＡＳＮＫＮＲＧＩＩＫＴＦＳＮＧＣＤＹＶＳＮＫＧＶＤＴＶＳＶＧＮＴＬＹＹＶＮＫＱＥＧＫＳＬＹＶＫＧＥＰＩＩＮＦＹＤＰＬＶＦＰＳＤＥＦＤＡＳＩＳＱＶＮＥＫＩＮＱＳＬＡＦＩＲＫＳＤＥＬＬＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬＧＧＳＭＥＥＶＶＬＩＴＶＰＳＡＬＶＡＶＫＩＡＨＡＬＶＥＥＲＬＡＡＣＶＮＩＶＰＧＬＴＳＩＹＲＥＥＧＳＶＶＳＤＨＥＬＬＬＬＶＫＴＴＴＤＡＦＰＫＬＫＥＲＶＫＥＬＨＰＹＥＶＰＥＩＶＡＬＰＩＡＥＧＮＲＥＹＬＤＷＬＲＥＮＴＧ

ＤＳ－Ｃａｖ１－Ｔ３３－３１Ａ（配列番号７０）
（ＭＥＬＬＩＬＫＡＮＶＩＡＴＩＬＴＡＶＴＦＣＦＡＳＳ）ＱＮＩＴＥＥＦＹＱＳＴＣＳＡＶＳＫＧＹＬＳＡＬＲＴＧＷＹＴＳＶＩＴＩＥＬＳＮＩＫＥＮＫＣＮＧＴＤＡＫＶＫＬＩＫＱＥＬＤＫＹＫＮＡＶＴＥＬＱＬＬＭＱＳＴＰＡＴＮＮＲＡＲＲＥＬＰＲＦＭＮＹＴＬＮＮＡＫＫＴＮＶＴＬＳＫＫＲＫＲＲＦＬＧＦＬＬＧＶＧＳＡＩＡＳＧＶＡＶＣＫＶＬＨＬＥＧＥＶＮＫＩＫＳＡＬＬＳＴＮＫＡＶＶＳＬＳＮＧＶＳＶＬＴＦＫＶＬＤＬＫＮＹＩＤＫＱＬＬＰＩＬＮＫＱＳＣＳＩＳＮＩＥＴＶＩＥＦＱＱＫＮＮＲＬＬＥＩＴＲＥＦＳＶＮＡＧＶＴＴＰＶＳＴＹＭＬＴＮＳＥＬＬＳＬＩＮＤＭＰＩＴＮＤＱＫＫＬＭＳＮＮＶＱＩＶＲＱＱＳＹＳＩＭＣＩＩＫＥＥＶＬＡＹＶＶＱＬＰＬＹＧＶＩＤＴＰＣＷＫＬＨＴＳＰＬＣＴＴＮＴＫＥＧＳＮＩＣＬＴＲＴＤＲＧＷＹＣＤＮＡＧＳＶＳＦＦＰＱＡＥＴＣＫＶＱＳＮＲＶＦＣＤＴＭＮＳＬＴＬＰＳＥＶＮＬＣＮＶＤＩＦＮＰＫＹＤＣＫＩＭＴＳＫＴＤＶＳＳＳＶＩＴＳＬＧＡＩＶＳＣＹＧＫＴＫＣＴＡＳＮＫＮＲＧＩＩＫＴＦＳＮＧＣＤＹＶＳＮＫＧＶＤＴＶＳＶＧＮＴＬＹＹＶＮＫＱＥＧＫＳＬＹＶＫＧＥＰＩＩＮＦＹＤＰＬＶＦＰＳＤＥＦＤＡＳＩＳＱＶＮＥＫＩＮＱＳＬＡＦＩＲＫＳＤＥＬＬＧＧＳＭＥＥＶＶＬＩＴＶＰＳＡＬＶＡＶＫＩＡＨＡＬＶＥＥＲＬＡＡＣＶＮＩＶＰＧＬＴＳＩＹＲＥＥＧＳＶＶＳＤＨＥＬＬＬＬＶＫＴＴＴＤＡＦＰＫＬＫＥＲＶＫＥＬＨＰＹＥＶＰＥＩＶＡＬＰＩＡＥＧＮＲＥＹＬＤＷＬＲＥＮＴＧ

ＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｔ３３－１５Ｂ（配列番号７１）
（ＭＥＬＬＩＬＫＡＮＶＩＡＴＩＬＴＡＶＴＦＣＦＡＳＳ）ＱＮＩＴＥＥＦＹＱＳＴＣＳＡＶＳＫＧＹＬＳＡＬＲＴＧＷＹＴＳＶＩＴＩＥＬＳＮＩＫＥＮＫＣＮＧＴＤＡＫＶＫＬＩＫＱＥＬＤＫＹＫＮＡＶＴＥＬＱＬＬＭＱＳＴＰＡＴＮＮＲＡＲＲＥＬＰＲＦＭＮＹＴＬＮＮＡＫＫＴＮＶＴＬＳＫＫＲＫＲＲＦＬＧＦＬＬＧＶＧＳＡＩＡＳＧＶＡＶＣＫＶＬＨＬＥＧＥＶＮＫＩＫＳＡＬＬＳＴＮＫＡＶＶＳＬＳＮＧＶＳＶＬＴＦＫＶＬＤＬＫＮＹＩＤＫＱＬＬＰＩＬＮＫＱＳＣＳＩＳＮＩＥＴＶＩＥＦＱＱＫＮＮＲＬＬＥＩＴＲＥＦＳＶＮＡＧＶＴＴＰＶＳＴＹＭＬＴＮＳＥＬＬＳＬＩＮＤＭＰＩＴＮＤＱＫＫＬＭＳＮＮＶＱＩＶＲＱＱＳＹＳＩＭＣＩＩＫＥＥＶＬＡＹＶＶＱＬＰＬＹＧＶＩＤＴＰＣＷＫＬＨＴＳＰＬＣＴＴＮＴＫＥＧＳＮＩＣＬＴＲＴＤＲＧＷＹＣＤＮＡＧＳＶＳＦＦＰＱＡＥＴＣＫＶＱＳＮＲＶＦＣＤＴＭＮＳＬＴＬＰＳＥＶＮＬＣＮＶＤＩＦＮＰＫＹＤＣＫＩＭＴＳＫＴＤＶＳＳＳＶＩＴＳＬＧＡＩＶＳＣＹＧＫＴＫＣＴＡＳＮＫＮＲＧＩＩＫＴＦＳＮＧＣＤＹＶＳＮＫＧＶＤＴＶＳＶＧＮＴＬＹＹＶＮＫＱＥＧＫＳＬＹＶＫＧＥＰＩＩＮＦＹＤＰＬＶＦＰＳＤＥＦＤＡＳＩＳＱＶＮＥＫＩＮＱＳＬＡＦＩＲＫＳＤＥＬＬＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬＧＧＳＭＶＲＧＩＲＧＡＩＴＶＮＳＤＴＰＴＳＩＩＩＡＴＩＬＬＬＥＫＭＬＥＡＮＧＩＱＳＹＥＥＬＡＡＶＩＦＴＶＴＥＤＬＴＳＡＦＰＡＥＡＡＲＱＩＧＭＨＲＶＰＬＬＳＡＲＥＶＰＶＰＧＳＬＰＲＶＩＲＶＬＡＬＷＮＴＤＴＰＱＤＲＶＲＨＶＹＬＳＥＡＶＲＬＲＰＤＬＥＳＡＱ

ＤＳ－Ｃａｖ１－Ｔ３３－１５Ｂ（配列番号７２）
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ＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｉ５３－５０Ａ（配列番号７３）
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ＤＳ－Ｃａｖ１－Ｉ５３－５０Ａ（配列番号７４）
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ＤＳ－Ｃａｖ１－Ｉ３２－２８Ａ（配列番号７５）
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ＤＳ－Ｃａｖ１－８ＧＳ－ＨｅｌＥｘｔ－Ｉ５３－５０Ａ（Ｆ１０）（配列番号７６）
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ＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－１５ＧＳ－ＨｅｌＥｘｔ－Ｉ５３－５０Ａ（Ｆ１４）（配列番号７７）
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ＨＭＰＶ Ｆ ｗｔ＿ＣＡＮ９７－８３株－Ｉ５３－５０Ａ（配列番号７８）
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ＨＭＰＶ Ｆ Ａ１１３Ｃ＿Ａ３３９Ｃ＿Ｔ１６０Ｆ＿Ｉ１７７Ｌ＿Ａ１２０Ｃ、Ｑ４２６Ｃ変異－Ｉ５３－５０Ａ（配列番号８０）
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ｓｃ－ＤＳ２－Ｉ５３－５０Ａ（配列番号８１）
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ｔｃ－ＤＳ２－Ｉ５３－５０Ａ（配列番号８２）
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ＤＳ－Ｃａｖ１－１２ＧＳ－ＨｅｌＥｘｔ－Ｉ５３－５０Ａ（Ｆ１１）（配列番号８３）
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ＤＳ－Ｃａｖ１－１６ＧＳ－ＨｅｌＥｘｔ－Ｉ５３－５０Ａ（Ｆ１２）（配列番号８４）
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ＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－１０ＧＳ－ＨｅｌＥｘｔ－Ｉ５３－５０Ａ（Ｆ１３（配列番号８５）
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ＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－２０ＧＳ－ＨｅｌＥｘｔ－Ｉ５３－５０Ａ（Ｆ１５）（配列番号８６）
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ｓｃ９－１０ ＤＳ－Ｃａｖ１ Ａ１４９Ｃ Ｙ４５８Ｃ Ｓ４６Ｇ Ｋ４６５Ｑ Ｓ２１５Ｐ Ｅ９２Ｄ－Ｉ５３－５０Ａ－Ｆ１０実施形態（配列番号９０）
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ＳＣ－ＤＭ（Ｎ６７Ｉ、Ｓ２１５Ｐ）－ｆｏｌｄｏｎ－Ｉ５３－５０Ａ実施形態（配列番号９１）
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ＳＣ－ＤＭ（Ｎ６７Ｉ、Ｓ２１５Ｐ）－Ｉ５３－５０Ａ－Ｆ１０実施形態（配列番号９２）
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ＳＣ－ＴＭ（Ｎ６７Ｉ、Ｓ２１５Ｐ、およびＥ４８７Ｑ）－ｆｏｌｄｏｎ－Ｉ５３－５０Ａ実施形態（配列番号９３）
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ＳＣ－ＴＭ（Ｎ６７Ｉ、Ｓ２１５Ｐ、およびＥ４８７Ｑ）－Ｉ５３－５０Ａ－Ｆ１０実施形態（配列番号９４）
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Ａ１１３Ｃ、Ａ３３９Ｃ、Ｔ１６０Ｆ、Ｉ１７７Ｌ－ｆｏｌｄｏｎ－Ｉ５３－５０Ａ実施形態を有するＨＭＰＶ－Ｆ（配列番号９５）
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Ａ１１３Ｃ、Ａ３３９Ｃ、Ｔ１６０Ｆ、Ｉ１７７Ｌ－Ｉ５３－５０Ａ Ｆ１０実施形態を有するＨＭＰＶ－Ｆ（配列番号９６）
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Ａ１１３Ｃ、Ａ１２０Ｃ、Ａ３３９Ｃ、Ｔ１６０Ｆ、Ｉ１７７Ｌ、およびＱ４２６Ｃ－ｆｏｌｄｏｎ－Ｉ５３－５０Ａ実施形態を有するＨＭＰＶ－Ｆ（配列番号９７）
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Ａ１１３Ｃ、Ａ１２０Ｃ、Ａ３３９Ｃ、Ｔ１６０Ｆ、Ｉ１７７Ｌ、およびＱ４２６Ｃ－Ｆ１０実施形態を有するＨＭＰＶ－Ｆ（配列番号９８）
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ＨＭＰＶ－Ｆ １１５－ＢＶ（Ａ１８５Ｐ）－ｆｏｌｄｏｎ－Ｉ５３－５０Ａ実施形態（配列番号９９）
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ＨＭＰＶ－Ｆ １１５－ＢＶ（Ａ１８５Ｐ）－Ｉ５３－５０Ａ－Ｆ１０実施形態（配列番号１００）
（ＭＳＷＫＶＶＩＩＦＳＬＬＩＴＰＱＨＧ）ＬＫＥＳＹＬＥＥＳＣＳＴＩＴＥＧＹＬＳＶＬＲＴＧＷＹＴＮＶＦＴＬＥＶＧＤＶＥＮＬＴＣＡＤＧＰＳＬＩＫＴＥＬＤＬＴＫＳＡＬＲＥＬＲＴＶＳＡＤＱＬＡＲＥＥＱＩＥＮＰＲＲＲＲＦＶＬＧＡＩＡＬＧＶＡＴＡＡＡＶＴＡＧＶＡＩＡＫＴＩＲＬＥＳＥＶＴＡＩＫＮＡＬＫＫＴＮＥＡＶＳＴＬＧＮＧＶＲＶＬＡＴＡＶＲＥＬＫＤＦＶＳＫＮＬＴＲＡＩＮＫＮＫＣＤＩＰＤＬＫＭＡＶＳＦＳＱＦＮＲＲＦＬＮＶＶＲＱＦＳＤＮＡＧＩＴＰＡＩＳＬＤＬＭＴＤＡＥＬＡＲＡＶＳＮＭＰＴＳＡＧＱＩＫＬＭＬＥＮＲＡＭＶＲＲＫＧＦＧＩＬＩＧＶＹＧＳＳＶＩＹＭＶＱＬＰＩＦＧＶＩＤＴＰＣＷＩＶＫＡＡＰＳＣＳＥＫＫＧＮＹＡＣＬＬＲＥＤＱＧＷＹＣＱＮＡＧＳＴＶＹＹＰＮＥＫＤＣＥＴＲＧＤＨＶＦＣＤＴＡＡＧＩＮＶＡＥＱＳＫＥＣＮＩＮＩＳＴＴＮＹＰＣＫＶＳＴＧＲＨＰＩＳＭＶＡＬＳＰＬＧＡＬＶＡＣＹＫＧＶＳＣＳＩＧＳＮＲＶＧＩＩＫＱＬＮＫＧＣＳＹＩＴＮＱＤＡＤＴＶＴＩＤＮＴＶＹＱＬＳＫＶＥＧＥＱＨＶＩＫＧＲＰＶＳＳＳＦＤＰＶＫＦＰＥＤＱＦＮＶＡＬＤＱＶＦＥＳＩＥＮＳＱＡＬＶＤＱＳＮＲＩＬＳＳＡＥＫＧＮＴＧＳＧＧＳＧＳＧＥＫＡＡＫＡＥＥＡＡＲＫＭＥＥＬＦＫＫＨＫＩＶＡＶＬＲＡＮＳＶＥＥＡＩＥＫＡＶＡＶＦＡＧＧＶＨＬＩＥＩＴＦＴＶＰＤＡＤＴＶＩＫＡＬＳＶＬＫＥＫＧＡＩＩＧＡＧＴＶＴＳＶＥＱＣＲＫＡＶＥＳＧＡＥＦＩＶＳＰＨＬＤＥＥＩＳＱＦＣＫＥＫＧＶＦＹＭＰＧＶＭＴＰＴＥＬＶＫＡＭＫＬＧＨＴＩＬＫＬＦＰＧＥＶＶＧＰＱＦＶＫＡＭＫＧＰＦＰＮＶＫＦＶＰＴＧＧＶＮＬＤＮＶＣＥＷＦＫＡＧＶＬＡＶＧＶＧＳＡＬＶＫＧＴＰＤＥＶＲＥＫＡＫＡＦＶＥＫＩＲＧＣＴＥ

【0057】

第２のアセンブリ
本発明のナノ構造は、三量体の第１のアセンブリの複数のコピーおよび第２のアセンブリの複数のコピーを含み得る。第２のアセンブリは、第２のポリペプチドの複数のコピーが自己会合して第２のアセンブリを形成するのを誘導するタンパク質－タンパク質界面を含む。第２のアセンブリの複数のオリゴマー状態は、ナノ構造形成と適合し得る（二量体（２コピー）、三量体（３コピー）、四量体（４コピー）、五量体（５コピー）、六量体（６コピー）、またはそれを超えるオリゴマー状態が含まれる）。第２のアセンブリの各々のコピーは、三量体アセンブリドメイン上の相補的な表面が暴露した界面と相互作用する表面が暴露した界面をさらに含む。Ｋｉｎｇら、Ｂａｌｅら、ならびに特許公開ＷＯ２０１４１２４３０１Ａ１号およびＵＳ２０１６０１２２３９２Ａ１号に記載のように、三量体アセンブリドメインと第２のアセンブリドメインとの間の相補的な界面は、三量体アセンブリドメインおよび第２のアセンブリドメインの複数のコピーの標的ナノ構造へのアセンブリを駆動する。種々の特定の実施形態では、
（ａ）各々の第１のポリペプチドがＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｔ３３－３１Ａ（配列番号６９）またはＤＳ－Ｃａｖ１－Ｔ３３－３１Ａ（配列番号７０）であるとき、各々の第２のポリペプチドはＴ３３－３１Ｂ（配列番号４４）であり；
（ｂ）各々の第１のポリペプチドがＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｔ３３－１５Ｂ（配列番号７１）またはＤＳ－Ｃａｖ１－Ｔ３３－１５Ｂ（配列番号７２）であるとき、各々の第２のポリペプチドはＴ３３－１５Ａ（配列番号４５）であり；
（ｃ）各々の第１のポリペプチドがＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｉ５３－５０Ａ（配列番号７３）またはＤＳ－Ｃａｖ１－Ｉ５３－５０Ａ（配列番号７４）であるとき、各々の第２のポリペプチドはＩ５３－５０Ｂ（配列番号８）、Ｉ５３－５０Ｂ．１（配列番号３２）、Ｉ５３－５０Ｂ．１ＮｅｇＴ２（配列番号３３）、またはＩ５３－５０Ｂ．４ＰｏｓＴ１（配列番号３４）であり；
（ｄ）各々の第１のポリペプチドがＤＳ－Ｃａｖ１－Ｉ３２－２８Ａ（配列番号７５）であるとき、各々の第２のポリペプチドはＩ３２－２８Ｂである。

【0058】

２つの構成成分のｉｎ ｖｉｔｒｏアセンブリによる完全な結合価のナノ構造のアセンブリ
いくつかの実施形態では、ナノ構造の各々の三量体の第１のアセンブリは、遺伝子融合物として同一のＦタンパク質を保有する；これらのナノ構造は、完全な（１００％）結合価でＦタンパク質を表示する。かかるナノ構造は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアセンブリと呼ばれるプロセスにおいて精製された第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドから産生される。Ｆタンパク質を含む精製された三量体の第１のポリペプチドを、適切な第２のポリペプチドと、水性条件下にておよそ１：１のモル比で混合する（図１を参照のこと）。第２のアセンブリは、標的ナノ構造のアセンブリを駆動するために三量体の第１のアセンブリと相互作用する。標的ナノ構造の首尾の良いアセンブリを、タンパク質またはタンパク質アセンブリの物理的サイズを査定するために使用される一般的な生物学的方法または生物物理学的方法（サイズ排除クロマトグラフィ、未変性（非変性）ゲル電気泳動、動的光散乱、多角度光散乱、分析用超遠心法、陰性染色電子顕微鏡法、低温電子顕微鏡法、またはＸ線結晶学が含まれるが、これらに限定されない）によるｉｎ ｖｉｔｒｏアセンブリ反応の分析によって確認することができる。必要ならば、アセンブリしたナノ構造を、その物理的サイズによってタンパク質を単離するために一般的に使用される分取技術（サイズ排除クロマトグラフィ、分取超遠心分離、接線流濾過、または分取ゲル電気泳動が含まれるが、これらに限定されない）を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏアセンブリ反応物中に存在する他の種または分子から精製することができる。ナノ構造中のＦタンパク質の存在を、水溶液中のタンパク質分子の同一性を決定するために一般に使用される技術（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、質量分析、タンパク質配列決定、またはアミノ酸分析が含まれるが、これらに限定されない）によって査定することができる。粒子外面のＦタンパク質の接近可能性およびその高次構造または抗原性を、抗原の存在および高次構造を検出するために一般に使用される技術（モノクローナル抗体、高次構造特異的モノクローナル抗体、または抗原に特異的な抗血清による結合が含まれるが、これらに限定されない）によって査定することができる。

【0059】

部分的結合価のナノ構造のｉｎ ｖｉｔｒｏアセンブリ
他の実施形態では、本発明のナノ構造は、遺伝子融合物としてＦタンパク質を保有する三量体の第１のアセンブリの１つまたは複数のコピーおよび遺伝子融合物としてＦタンパク質を保有しない１つまたは複数の三量体の第１のアセンブリを含む；これらのナノ構造は、部分的結合価でＦタンパク質を表示する。これらの部分的結合価のナノ構造は、遺伝子融合物としてＦタンパク質を保有する三量体の第１のアセンブリの割合が、得られるナノ構造中の抗原の所望の結合価に等しい第１のポリペプチドの混合物を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏアセンブリによって産生される。ｉｎ ｖｉｔｒｏアセンブリ反応は、典型的には、全ての第１のポリペプチドおよび全ての第２のポリペプチドをおよそ１：１のモル比で含む。非限定的な例として、第１のポリペプチドの半分が遺伝子融合物としてＦタンパク質を保有する三量体アセンブリの混合物を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏアセンブリ反応を行うことにより、結合価が５０％のＦタンパク質を有するアセンブリしたナノ構造が得られるであろう。すなわち、ナノ構造上にＦタンパク質表示が可能な部位が５０％を占めるであろう。非限定的な例として、ナノ構造が正二十面体対称を有する１２０サブユニットアセンブリである場合、ナノ構造は、合計２０の三量体基本単位を含み、結合価５０％のナノ構造は、可能な２０のＦタンパク質三量体のうちの１０を表示する。このようにして、ｉｎ ｖｉｔｒｏアセンブリ反応におけるＦタンパク質を保有する第１のポリペプチドのＦタンパク質を欠く第１のポリペプチドに対する比を使用して、得られるナノ構造のＦタンパク質の結合価を正確に調整することができる。この様式で調整することができるのは平均結合価であり；混合物中の個別のナノ構造の結合価は平均付近を中心として分布しているということが当業者に理解されるであろう。かかる部分的結合価のナノ構造の首尾の良いアセンブリを、完全な結合価のナノ構造を評価するための上記の技術を使用して査定することができ、必要ならば、部分的結合価のナノ構造を、完全な結合価のナノ構造の精製について記載の方法を使用して精製することができる。所与の試料中のＦタンパク質を保有する第１のポリペプチドの平均結合価を、完全な結合価のナノ構造中のＦタンパク質の存在を評価するための上記の技術を使用した定量分析によって査定することができる。

【0060】

複数のＦタンパク質を同時表示するナノ構造のｉｎ ｖｉｔｒｏアセンブリ
他の実施形態では、本発明のナノ構造は、遺伝子融合物として異なるＦタンパク質を保有する２つ以上の別個の第１のポリペプチドを含み；これらのナノ構造は、同一のナノ構造上に複数の異なるＦタンパク質を同時に表示する。これらの多抗原ナノ構造は、各々の第１のポリペプチドが遺伝子融合物として２つ以上の別個のＦタンパク質のうちの１つを保有する第１のポリペプチドの混合物を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏアセンブリを行うことによって産生される。混合物中の各々の第１のポリペプチドの割合は、得られるナノ構造中の各々のＦタンパク質の平均結合価を決定づける。ｉｎ ｖｉｔｒｏアセンブリ反応は、典型的には、全ての三量体の第１のポリペプチドの全ての第２のポリペプチドに対するモル比がおよそ１：１である。所与の試料中の各々のＦタンパク質を保有する第１のポリペプチドの存在および平均結合価を、完全な結合価のナノ構造中のＦタンパク質の存在を評価するための上記の技術を使用した定量分析によって査定することができる。

【0061】

種々の実施形態では、ナノ構造は、直径が約２０ナノメートル（ｎｍ）～約４０ｎｍであり、内腔の横幅が約１５ｎｍ～約３２ｎｍであり、タンパク質シェルの孔径が最長寸法で約１ｎｍ～約１４ｎｍである。

【0062】

１つの実施形態では、ナノ構造は、正二十面体対称を有する。この実施形態では、ナノ構造は、６０コピーの第１のポリペプチドおよび６０コピーの第２のポリペプチドを含み得る。１つのかかる実施形態では、各々の第１のアセンブリ中の同一の第１のポリペプチド数は、各々の第２のアセンブリ中の同一の第２のポリペプチド数と異なる。例えば、１つの実施形態では、ナノ構造は、１２の第１のアセンブリおよび２０の第２のアセンブリを含み；この実施形態では、各々の第１のアセンブリは、例えば、５コピーの同一の第１のポリペプチドを含むことができ、各々の第２のアセンブリは、例えば、３コピーの同一の第２のポリペプチドを含むことができる。別の実施形態では、ナノ構造は、１２の第１のアセンブリおよび３０の第２のアセンブリを含み；この実施形態では、各々の第１のアセンブリは、例えば、５コピーの同一の第１のポリペプチドを含むことができ、各々の第２のアセンブリは、例えば、２コピーの同一の第２のポリペプチドを含むことができる。さらなる実施形態では、ナノ構造は、２０の第１のアセンブリおよび３０の第２のアセンブリを含み；この実施形態では、各々の第１のアセンブリは、例えば、３コピーの同一の第１のポリペプチドを含むことができ、各々の第２のアセンブリは、例えば、２コピーの同一の第２のポリペプチドを含むことができる。これらの実施形態の全ては、規則的な正二十面体対称を有する合成ナノ材料を形成することができる。種々のさらなる実施形態では、第１のおよび第２のポリペプチドのオリゴマー状態は、以下の通りである：
Ｉ５３－３４Ａ：三量体＋Ｉ５３－３４Ｂ：五量体；
Ｉ５３－４０Ａ：五量体＋Ｉ５３－４０Ｂ：三量体；
Ｉ５３－４７Ａ：三量体＋Ｉ５３－４７Ｂ：五量体；
Ｉ５３－５０Ａ：三量体＋Ｉ５３－５０Ｂ：五量体；
Ｉ５３－５１Ａ：三量体＋Ｉ５３－５１Ｂ：五量体；
Ｉ３２－０６Ａ：二量体＋Ｉ３２－０６Ｂ：三量体；
Ｉ３２－１９Ａ：三量体＋Ｉ３２－１９Ｂ：二量体；
Ｉ３２－２８Ａ：三量体＋Ｉ３２－２８Ｂ：二量体；
Ｉ５２－０３Ａ：五量体＋Ｉ５２－０３Ｂ：二量体；
Ｉ５２－３２Ａ：二量体＋Ｉ５２－３２Ｂ：五量体；および
Ｉ５２－３３Ａ：五量体＋Ｉ５２－３３Ｂ：二量体

【0063】

別の実施形態では、本発明の任意の実施形態または実施形態の組み合わせのナノ構造は、１つまたは複数の以下の特徴を有し、各々、以下の実施例で証明されている：
（ａ）融合前Ｆ特異的抗体（モノクローナル抗体Ｄ２５が含まれるが、これに限定されない）に結合すること；
（ｂ）対称構造（正二十面体構造が含まれるが、これに限定されない）を形成すること；
（ｃ）５０℃で安定であること；および／または
（ｄ）２．２５Ｍ塩酸グアニジン中で安定であること。

【0064】

別の態様では、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする単離された核酸を提供する。単離された核酸配列は、ＲＮＡまたはＤＮＡを含み得る。本明細書中で使用する場合、「単離された核酸」は、ゲノム中またはｃＤＮＡ配列中の通常では取り囲んでいる核酸配列から取り出されている核酸である。かかる単離された核酸配列は、コードされたタンパク質の発現および／または精製を促進するのに有用なさらなる配列（ｐｏｌｙＡ配列、改変Ｋｏｚａｋ配列、およびエピトープタグをコードする配列、移行シグナル、および分泌シグナル、核局在シグナル、および原形質膜局在化シグナルが含まれるが、これらに限定されない）を含み得る。本明細書中の技術に基づいて、どのような核酸配列が本発明のタンパク質をコードするのかについては当業者に明らかであろう。

【0065】

さらなる態様では、本発明は、適切な調節配列に作動可能に連結された本発明の任意の実施形態または実施形態の組み合わせの単離された核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。「組換え発現ベクター」には、遺伝子産物を発現させることができる任意の調節配列に核酸コード領域または核酸コード遺伝子を作動可能に連結しているベクターが含まれる。本発明の核酸配列に作動可能に連結された「調節配列」は、核酸分子を発現させることができる核酸配列である。調節配列は、これらがその発現を指示するように機能する限り、核酸配列に隣接する必要はない。したがって、例えば、翻訳されないが転写される介在配列がプロモーター配列と核酸配列との間に存在することができ、プロモーター配列は、依然としてコード配列に「作動可能に連結された」と見なすことができる。他のかかる調節配列には、ポリアデニル化シグナル、終止シグナル、およびリボソーム結合部位が含まれるが、これらに限定されない。かかる発現ベクターは、当該分野で公知の任意のタイプのものであり得る（プラスミドおよびウイルス系発現ベクターが含まれるが、これらに限定されない）。哺乳動物系における開示された核酸配列の発現を駆動するために使用される調節配列は、構成性（種々のプロモーター（ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、アクチン、ＥＦが含まれるが、これらに限定されない）のいずれかによって駆動される）または誘導性（いくつかの誘導性プロモーター（テトラサイクリン応答性、エクジソン応答性、ステロイド応答性のプロモーターが含まれるが、これらに限定されない）のいずれかによって駆動される）であり得る。原核細胞のトランスフェクションで用いる発現ベクターの構築も当該分野で周知であり、したがって、標準的な技術によって実施することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ．１０９－１２８，ｅｄ．Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）およびＡｍｂｉｏｎ １９９８カタログ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を参照のこと）。発現ベクターは、エピソームとしてか、宿主染色体ＤＮＡ内への組込みによって宿主細胞内で複製可能でなければならない。好ましい実施形態では、発現ベクターはプラスミドを含む。しかし、本発明は、ウイルスベクターなどの等価な機能を果たす他の発現ベクターが含まれることが意図される。

【0066】

別の態様では、本発明は、本明細書中に開示の組換え発現ベクターでトランスフェクトされている宿主細胞を提供し、宿主細胞は、原核細胞または真核細胞のいずれか（哺乳動物細胞など）であり得る。細胞を、一過性または安定してトランスフェクトすることができる。原核細胞および真核細胞への発現ベクターのかかるトランスフェクションを、当該分野で公知の任意の技術（標準的な細菌形質転換、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、またはリポソーム媒介、ＤＥＡＥ デキストラン媒介、ポリカチオン媒介、またはウイルス媒介のトランスフェクションが含まれるが、これらに限定されない）によって行うことができる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，２ｎｄ Ｅｄ．（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ．１９８７．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照のこと）。本発明のポリペプチドの産生方法は、本発明のさらなる部分である。この方法は、（ａ）ポリペプチドを発現させる条件下で本発明のこの態様の宿主を培養する工程、および（ｂ）任意選択的に、発現したポリペプチドを回収する工程を含む。

【0067】

さらなる態様では、本発明は、有効量の本発明の任意の実施形態または実施形態の組み合わせのナノ構造を含む免疫原性組成物、および薬学的に許容され得る担体を提供する。組成物は、（ａ）溶解保護剤；（ｂ）界面活性剤；（ｃ）増量剤；（ｄ）張性調整剤；（ｅ）安定剤；（ｆ）防腐剤、および／または（ｇ）緩衝液を含み得る。

【0068】

いくつかの実施形態では、医薬組成物中の緩衝液は、トリス緩衝液、ヒスチジン緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、または酢酸緩衝液である。組成物は、溶解保護剤（例えば、スクロース、ソルビトール、またはトレハロース）も含み得る。一定の実施形態では、組成物は、防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、ベンゼトニウム、クロロヘキシジン、フェノール、ｍ－クレゾール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロロブタノール、ｏ－クレゾール、ｐ－クレゾール、クロロクレゾール、硝酸フェニル水銀（ＩＩ）、チロメサール、安息香酸、およびこれらの種々の混合物）を含む。他の実施形態では、組成物は、グリシンのような増量剤を含む。さらに他の実施形態では、組成物は、界面活性剤（例えば、ポリソルベート－２０、ポリソルベート－４０、ポリソルベート－６０、ポリソルベート－６５、ポリソルベート－８０ ポリソルベート－８５、ポロクサマー－１８８、ソルビタンモノラウラート、ソルビタンモノパルミタート、ソルビタンモノステアラート、ソルビタンモノオレアート、ソルビタントリラウラート、ソルビタントリステアラート、ソルビタントリオレアート（ｓｏｒｂｉｔａｎ ｔｒｉｏｌｅａｓｔｅ）、またはその組み合わせ）を含む。組成物は、張性調整剤（例えば、製剤をヒトの血液と実質的に等張または等浸透圧にする化合物）も含み得る。例示的な張性調整剤には、スクロース、ソルビトール、グリシン、メチオニン、マンニトール、デキストロース、イノシトール、塩化ナトリウム、アルギニン、および塩酸アルギニンが含まれる。他の実施形態では、組成物は、安定剤（例えば、凍結乾燥形態または液体の形態のナノ構造の化学的および／または物理的な不安定性を実質的に防止または低下させる分子）をさらに含む。例示的な安定剤には、スクロース、ソルビトール、グリシン、イノシトール、塩化ナトリウム、メチオニン、アルギニン、および塩酸アルギニンが含まれる。

【0069】

ナノ構造は、組成物中の唯一の活性薬剤であり得るか、組成物は、意図する用途に適切な１つまたは複数の他の薬剤（一般的に免疫系を刺激して全体的な免疫応答を改善するアジュバントが含まれるが、これに限定されない）をさらに含み得る。任意の適切なアジュバントを使用することができる。用語「アジュバント」は、抗原に対する免疫応答を増強する化合物または混合物を指す。例示的なアジュバントには、Ａｄｊｕ－Ｐｈｏｓ（商標）、Ａｄｊｕｍｅｒ（商標）、アルブミン－ヘパリン微粒子、藻類グルカン、アルガムリン、ミョウバン、抗原製剤、ＡＳ－２アジュバント、自家樹状細胞、自家ＰＢＭＣ、アブリジン（商標）、Ｂ７－２、ＢＡＫ、ＢＡＹ Ｒ１００５、ブピバカイン、ブピバカイン－ＨＣｌ、ＢＷＺＬ、カルシトリオール、リン酸カルシウムゲル、ＣＣＲ５ペプチド、ＣＦＡ、コレラホロ毒素（ＣＴ）およびコレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、コレラ毒素Ａ１－サブユニット－タンパク質Ａ Ｄ－フラグメント融合タンパク質、ＣｐＧ、ＣＲＬ１００５、サイトカイン含有リポソーム、Ｄ－ムラパルミチン、ＤＤＡ、ＤＨＥＡ、ジフテリアトキソイド、ＤＬ－ＰＧＬ、ＤＭＰＣ、ＤＭＰＧ、ＤＯＣ／ミョウバン複合体、鶏痘、フロイント完全アジュバント、γイヌリン、Ｇｅｒｂｕアジュバント、ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＭＤＰ、ｈＧＭ－ＣＳＦ、ｈＩＬ－１２（Ｎ２２２Ｌ）、ｈＴＮＦ－α、ＩＦＡ、ＩＦＮ－γ含有ｐｃＤＮＡ３、ＩＬ－１２ ＤＮＡ、ＩＬ－１２プラスミド、ＩＬ－１２／ＧＭＣＳＦ プラスミド（Ｓｙｋｅｓ）、ＩＬ－２含有ｐｃＤＮＡ３、ＩＬ－２／Ｉｇプラスミド、ＩＬ－２／Ｉｇタンパク質、ＩＬ－４、ＩＬ－４含有ｐｃＤＮＡ３、Ｉｍｉａｕｉｍｏｄ（商標）、ＩｍｍＴｈｅｒ（商標）、共刺激分子に対する抗体を含む免疫リポソーム、インターフェロン－γ、インターロイキン－１β、インターロイキン－１２、インターロイキン－２、インターロイキン－７、ＩＳＣＯＭ（商標）、Ｉｓｃｏｐｒｅｐ７．０．３（商標）、キーホールリンペットヘモシアニン、脂質系アジュバント、リポソーム、ロキソリビン、ＬＴ（Ｒ１９２Ｇ）、ＬＴ－ＯＡまたはＬＴ Ｏｒａｌアジュバント、ＬＴ－Ｒ１９２Ｇ、ＬＴＫ６３、ＬＴＫ７２、ＭＦ５９、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ ５１、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ ７２０、ＭＰＬ．ＴＭ．、ＭＰＬ－ＳＥ、ＭＴＰ－ＰＥ、ＭＴＰ－ＰＥリポソーム、ムラメチド、ムラパルミチン、ＮＡＧＯ、ｎＣＴ未変性コレラ毒素、非イオン性界面活性剤小胞、コレラ毒素ｍＣＴ－Ｅ１１２Ｋの非毒性変異体Ｅ１１２Ｋ、ｐ－ヒドロキシ安息香酸メチルエステル、ｐＣＩＬ－１０、ｐＣＩＬ１２、ｐＣＭＶｍＣＡＴ１、ｐＣＭＶＮ、Ｐｅｐｔｏｍｅｒ－ＮＰ、Ｐｌｅｕｒａｎ、ＰＬＧ、ＰＬＧＡ、ＰＧＡ、およびＰＬＡ、プルロニックＬ１２１、ＰＭＭＡ、ＰＯＤＤＳ（商標）、Ｐｏｌｙ ｒＡ：Ｐｏｌｙ ｒＵ、ポリソルベート８０、タンパク質コクレアート、ＱＳ－２１、ＱｕａｄｒｉＡサポニン、Ｑｕｉｌ－Ａ、ＲｅｈｙｄｒａｇｅｌＨＰＡ、ＲｅｈｙｄｒａｇｅｌＬＶ、ＲＩＢＩ、Ｒｉｂｉｌｉｋｅアジュバントシステム（ＭＰＬ、ＴＭＤ、ＣＷＳ）、Ｓ－２８４６３、ＳＡＦ－１、Ｓｃｌａｖｏペプチド、Ｓｅｎｄａｉプロテオリポソーム、Ｓｅｎｄａｉ含有脂質マトリックス、Ｓｐａｎ８５、Ｓｐｅｃｏｌ、スクアラン１、スクアレン２、ステアリルチロシン、破傷風トキソイド（ＴＴ）、Ｔｈｅｒａｍｉｄｅ（商標）、トレオニルムラミルジペプチド（ＴＭＤＰ）、Ｔｙ粒子、およびＷａｌｔｅｒ Ｒｅｅｄリポソームが含まれるが、これらに限定されない。アジュバントの選択は、治療される被験体に依存する。好ましくは、薬学的に許容され得るアジュバントを使用する。

【0070】

別の態様では、本発明は、被験体においてパラミクソウイルスおよび／またはニューモウイルスのＦタンパク質に対する免疫応答を生じさせる方法であって、有効量の本発明の任意の実施形態または実施形態の組み合わせの免疫原性組成物を被験体に投与して免疫応答を生じさせる工程を含む方法を提供する。さらなる態様では、本発明は、被験体におけるパラミクソウイルスおよび／またはニューモウイルス感染を治療または予防する方法であって、有効量の本発明の任意の実施形態または実施形態の組み合わせの免疫原性組成物を被験体に投与し、それにより、被験体におけるパラミクソウイルスおよび／またはニューモウイルス感染を治療または予防する工程を含む方法を提供する。

【0071】

１つの実施形態では、パラミクソウイルスおよび／またはニューモウイルスは、呼吸器合胞体ウイルスを含む。「呼吸器合胞体ウイルス」および「ＲＳＶ」は、特に小児において呼吸器疾患を引き起こす一本鎖マイナス鎖ＲＮＡウイルスを指す。方法がＲＳＶ感染の処置を含むとき、免疫原性組成物を、既にＲＳＶに感染しており、そして／または被験体がＲＳＶに感染している可能性が高いことを示す症状（下気道感染、上気道感染、細気管支炎、肺炎、発熱、倦怠、食欲減退、再発性喘鳴、および喘息が含まれるが、これらに限定されない）を患っている被験体に投与する。本明細書中で使用する場合、「治療する」または「治療」には、以下のうちの１つまたは複数の達成が含まれるがこれらに限定されない：（ａ）被験体におけるパラミクソウイルスおよび／またはニューモウイルス力価の低下；（ｂ）被験体におけるパラミクソウイルスおよび／またはニューモウイルス力価の任意の増加の制限；（ｃ）パラミクソウイルスおよび／またはニューモウイルスの症状の重症度の軽減；（ｄ）感染後のパラミクソウイルスおよび／またはニューモウイルスの症状の発生の制限または防止；（ｅ）パラミクソウイルスおよび／またはニューモウイルスの症状の悪化の抑制；（ｆ）以前にパラミクソウイルスおよび／またはニューモウイルス感染の症状があった被験体におけるパラミクソウイルスおよび／またはニューモウイルスの症状の再発の制限または防止；および／または（母系免疫後の）パラミクソウイルスおよび／またはニューモウイルス抗体の乳児への母系伝達の促進。

【0072】

方法がパラミクソウイルスおよび／またはニューモウイルス感染の制限を含むとき、免疫原性組成物を、パラミクソウイルスおよび／またはニューモウイルスの感染が知られていないが、暴露リスクがあり得る被験体に予防的に投与する。本明細書中で使用する場合、「制限」は、ＲＳＶ感染リスクのある被験体におけるＲＳＶ感染を制限することを意味する。特にリスクの高い群には、１８歳未満の小児（特に、３歳以下の乳児）、６５歳を超える成人、および任意のタイプの免疫不全を罹患している個体が含まれる。

【0073】

本明細書中で使用する場合、「有効量」は、ＲＳＶ感染の処置および／または制限に有効な免疫原性組成物の量を指す。免疫原性組成物を、典型的には、医薬組成物（上に開示の医薬組成物など）として製剤化し、従来の薬学的に許容され得る担体、アジュバント、およびビヒクルを含む投薬単位製剤において任意の適切な経路（経口、非経口（ｐａｒｅｎｔａｌｌｙ）、吸入噴霧、直腸、または局所が含まれる）を介して投与することができる。本明細書中で使用される非経口という用語には、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、胸骨内、腱内、脊髄内、頭蓋内、胸腔内、注入技術、または腹腔内が含まれる。ポリペプチド組成物を、適切な組織（血液など）に導入されるミクロスフェア、リポソーム、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、または他の微粒子送達系もしくは徐放製剤を介して投与することもできる。投薬レジメンを、最適な望ましい応答（例えば、治療反応または予防反応）が得られるように調整することができる。適切な投薬範囲は、例えば、０．１ｕｇ／ｋｇ体重～１００ｍｇ／ｋｇ体重のＦタンパク質またはその抗原フラグメントであり得る。組成物を、単回ボーラスで送達させることができるか、主治医が決定する場合、１回超（例えば、２、３、４、５、またはそれを超える回数）で投与してもよい。

【0074】

１つの実施形態では、投与により、被験体内にパラミクソウイルスおよび／またはニューモウイルス中和抗体が産生される。別の実施形態では、中和抗体は、少なくとも１，０００の力価（１／ＩＤ_５０）で被験体の血清中に存在する；他の実施形態では、中和抗体は、２，０００または５，０００の力価で被験体の血清中に存在する。

【0075】

実施例
方法：
Ｆタンパク質および三量体アセンブリドメインを含む三量体基本単位の発現およびスクリーニング
ＤＳ－Ｃａｖ１融合物を含むか欠く三量体基本単位のためのヒトコドン最適化配列を、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔから取り寄せた。単一構成成分のナノ構造（すなわち、Ｉ３－０１）の基本単位を、１つのＣＭＶプロモーターを含むｐｃＤＮＡ３．１ベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にクローン化し、一方で、２構成成分のナノ構造（例えば、Ｉ５３－５０）の基本単位を、ＣＭＶプロモーターおよびＥＦ－１αプロモーターの両方を含むｐＢｕｄＣＥ４．１（商標）ベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にクローン化した。組換えタンパク質を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用したＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の一過性トランスフェクションによって発現させた。細胞培養物を、トランスフェクションの５日後に遠心分離によって回収した。分泌されたタンパク質を、細胞上清の直接コーティングを使用したＥＬＩＳＡまたはサンドイッチＥＬＩＳＡのいずれかによって分析した。簡潔に述べれば、９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレート（Ｎｕｎｃ）に、直接ＥＬＩＳＡについては細胞上清をコーティングし、サンドイッチＥＬＩＳＡについてはマウス抗Ｈｉｓタグモノクローナル抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をコーティングした。分泌されたタンパク質を、ヒトパリビズマブ、ＭＰＥ８、ＲＳＤ５、およびＤ２５モノクローナル抗体を使用して検出した。トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞を固定し、ＢＤｃｙｔｏｆｉｘ／ｃｙｔｏｐｅｒｍ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して透過処理し、ヒトパリビズマブ、ＭＰＥ８、およびＤ２５モノクローナル抗体とインキュベートし、アレクサフルオル６４７抱合抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で染色した。染色された細胞を、ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で計数した。ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェアを使用して解析した。細胞株を、マイコプラズマ汚染について定常的に試験した。

【0076】

ＤＳ－Ｃａｖ１－Ｉ５３－５０Ａの発現および精製
レンチウイルスを、直鎖２５ｋＤａポリエチレンイミン（ＰＥＩ；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した２９３Ｔ（ＡＴＣＣ）細胞の一過性トランスフェクションによって産生した。簡潔に述べれば、４×１０^６細胞を、１０ｃｍ組織培養プレート上にプレートした。２４時間後、３μｇのｐｓＰＡＸ２、１．５μｇのｐＭＤ２Ｇ（それぞれ、Ａｄｄｇｅｎｅ（商標）プラスミド番号１２２６０および番号１２２５９）、および６μｇのレンチウイルスベクタープラスミドを、５００μｌ希釈剤（５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ＝７．０５）および４２μｌのＰＥＩ（１ｍｇ／ｍｌ）で混合し、１５分間インキュベートした。次いで、ＤＮＡ／ＰＥＩ複合体をプレートに滴下した。トランスフェクションの４８時間後にレンチウイルスを回収し、８０００ｇで１８時間の低速遠心分離によって１００倍に濃縮した。１０×１０^６細胞を含む１０ｍＬ成長培地を含む１２５ｍＬ振盪フラスコ中で標的細胞株を形質導入した。１００ｕＬの１００×レンチウイルスをフラスコに添加し、細胞を、３７℃で振盪（２２５ｒｐｍ）しながら、８％ＣＯ_２中で４～６時間インキュベートした。４～６時間後に２０ｍＬの成長培地を振盪フラスコに添加した。

【0077】

形質導入した細胞を、最終培養サイズが４Ｌに到達するまで、１×１０^６細胞／ｍｌの密度まで１日おきに拡大させた。１７日間の全てのインキュベーション後、最終細胞濃度（約５×１０^６細胞／ｍＬ）および生存度（約９０％生存可能）の測定後に培地を回収した。培養上清を低速遠心分離によって回収して、上清から細胞を取り出した。ＮａＣｌおよびＮａＮ_３を、それぞれ２５０ｍＭおよび０．０２％の最終濃度まで添加した。上清を、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって１つの５ｍＬ ＨｉｓＴｒａｐ（商標）ＦＦ Ｃｒｕｄｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｓｃｉｅｎｃｅｓ）に５ｍｌ／分でロードした。ニッケル溶出をＨｉＬｏａｄ（商標）１６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｓｃｉｅｎｃｅｓ）に適用して、サイズ排除クロマトグラフィによって標的タンパク質をさらに精製した。サイズ排除によって精製された標的タンパク質を、液体窒素中で急速凍結し、－８０℃で保存した。

【0078】

ＤＳ－Ｃａｖ１保有ナノ構造のｉｎ ｖｉｔｒｏアセンブリ
結合価１００％の粒子（正二十面体ナノ構造あたり２０のＤＳ－Ｃａｖ１三量体）を、それぞれ５０μＭのＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｉ５３－５０Ａ三量体およびＩ５３－５０Ｂ．４ＰＴ１五量体を混合し、ロッキングしながら４℃で一晩インキュベートすることによって調製した。場合によっては、ＧＥ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－５００ ＨＲ １６／６０カラムを使用した２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロールを含む緩衝液中でのｉｎ ｖｉｔｒｏアセンブリ反応物中に残存した過剰成分からアセンブリしたナノ構造を精製した。試料の負荷およびＳＥＣ画分を、還元剤の存在下および非存在下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。ピーク画分をプールし、ＧＥ Ｖｉｖａｓｐｉｎ（商標）２０ ３０ｋＤａ ＭＷＣＯ遠心濾過器を使用して濃縮し、Ａｇｉｌｅｎｔ ８４５４分光光度計を使用して定量した。

【0079】

結合価６６％の粒子（正二十面体ナノ構造あたり約１４のＤＳ－Ｃａｖ１三量体）を、それぞれ５０、２５、および７５μＭのＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｉ５３－５０Ａ三量体、Ｉ５３－５０Ａ三量体、およびＩ５３－５０Ｂ．４ＰｏｓＴ１五量体の混合によって調製した。結合価３３％の粒子（正二十面体ナノ構造あたり約７のＤＳ－Ｃａｖ１三量体）を、それぞれ２５、５０、７５μＭのＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｉ５３－５０Ａ三量体、Ｉ５３－５０Ａ三量体、およびＩ５３－５０Ｂ．４ＰｏｓＴ１五量体の混合によって調製した。ｉｎ ｖｉｔｒｏアセンブリ反応物を、ロッキングしながら４℃で一晩インキュベートした。場合によっては、ＧＥ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（商標）Ｓ－５００ ＨＲ１６／６０カラムを使用した２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロールを含む緩衝液中でのｉｎ ｖｉｔｒｏアセンブリ反応物中に残存した過剰成分からアセンブリしたナノ構造を精製した。試料の負荷およびＳＥＣ画分を、還元剤の存在下および非存在下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。ピーク画分をプールし、ＧＥ Ｖｉｖａｓｐｉｎ（商標）２０ ３０ｋＤａ ＭＷＣＯ遠心濾過器を使用して濃縮し、約２１，０００ｇにて４℃で１０分間の遠心分離後にＡｇｉｌｅｎｔ８４５４分光光度計を使用して定量した。次いで、試料を、低温貯蔵用チューブに１ｍＬアリコートにて、結合価３３％の粒子については１．１ｍｇ／ｍＬ、結合価６６％の粒子については０．６ｍｇ／ｍＬを移し、液体窒素中で急速冷凍し、－８０℃で保存した。

【0080】

ＤＳ－Ｃａｖ１保有ナノ構造電子顕微鏡法
２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロールを使用して０．０１ｍｇ／ｍＬまで希釈することによってネガティブ染色ＥＭのための試料を調製し、３．５μＬをグロー放電した銅製の炭素コーティングしたグリッド上で２０秒間インキュベートした後、Ｗｈａｔｍａｎ Ｎｏ．１濾紙片を用いて液体を吸い取った。試料の吸い取りから数秒以内に、３．５μＬの染色液の液滴（２％ｗ／ｖギ酸ウラニル）を沈着させ、直ちに吸い取り、次いで、第２サイクルの染色／ブロッティングを行った。

【0081】

円二色性（ＣＤ）分光偏光分析
Ｆタンパク質（０．５ｍｇ ｍｌ^－１）由来のＣＤスペクトルを、Ｃｈｉｒａｓｃａｎ（商標）分光偏光計（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ）にて、バンド幅１ｎｍ、ステップサイズ０．５ｎｍ、および１秒／ステップで波長範囲１９５～２６０ｎｍにわたって記録した。遠紫外域のスペクトルには３スキャンの平均が必要であり、このスペクトルを、緩衝液を用いて行ったブランクスペクトルから差し引いた。各温度で１分間の平衡後に１℃間隔でスキャンすることによって熱変性をモニタリングした。データを、単純一次曲線に対してフィッティングした。ΔＡ２２２の値を、２０℃で記録した値の百分率としてｙ軸上に示した。

【0082】

酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
抗体または血清の特異的結合を試験するために、９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレート（Ｎｕｎｃ）に、Ｆタンパク質および三量体アセンブリドメインまたは２μｇ ｍｌ^－１の以下の精製したタンパク質を含む三量体基本単位を発現する細胞由来の組織培養上清の系列希釈物でコーティングした：ｆｏｌｄｏｎを有するＤｓ－Ｃａｖ１、三量体の第１のポリペプチドに融合したＤｓ－Ｃａｖ１、またはＤＳ－Ｃａｖ１を表示するナノ構造。プレートを、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングし、滴定した抗体（Ｄ２５、ＭＰＥ８、パリビズマブ、ＲＳＤ５）またはマウス血清とインキュベートし、その後にＡＰ抱合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，２０４０－０４）またはヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１０３０－０４）とインキュベートした。次いで、プレートを、ＰＢＳ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で洗浄し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０および基質（ｐ－ＮＰＰ、Ｓｉｇｍａ）を添加し、プレートを４０５ｎｍで読み取った。

【0083】

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）
ＰｒｏｔｅＯＮ（商標）ＸＰＲ－３６装置（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にて２５℃のＰＢＳ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０中で実験した。１０００反応単位（ＲＵ）でのアミンカップリングによってＤ２５ｍＡｂをＧＬＭセンサーチップ表面上に固定し、タンパク質を含まないブランク表面を、基準として使用するために同一のカップリング条件下で作製した。モノクローナル抗体（Ｄ２５、ＭＰＥ８、パリビズマブ、および１３１－２ａ）を、流速１００μｌ／分、濃度５０ｎＭで異なるセンサーチャネル中に注入した。データを、Ｐｒｏｔｅｏｎソフトウェアを使用して処理し、データの局所フィッティング前にブランク表面および緩衝液のみの注入を差し引くことによって二重に参照した。

【0084】

ワクチン接種および血清学的分析
６～９週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＥＮＶＩＧＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｉｔａｌｙ）から入手した。全タンパク質を、製造者の説明書に従ってＡｄｄａＶａｘ（商標）アジュバント（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を用いて製剤化した。０、１４、および２８日目に、５０％ＡｄｄａＶａｘ（商標）を含むＰＢＳ中の５μｇのＤＳ－Ｃａｖ１抗原等価物に相当する総タンパク質用量を用いてマウスの皮下（ｓ．ｃ）に免疫化した。２４日目および４０日目にマウスから採血した。回収した血清を使用して、結合力価および中和力価を測定した。結合力価を、３μｇ／ｍｌのＤＳ－Ｃａｖ１、Ｉ５３－５０ナノ構造、またはＩ５３－５０ナノ構造サブユニットのコーティングによって測定した。

【0085】

ウイルス中和アッセイおよび顕微鏡分析
血清によるＲＳＶ感染の中和を、マイクロ中和フローサイトメトリー系アッセイを使用して測定した。血清の系列希釈物を、ＲＳＶと３７℃で１時間プレインキュベートし、９６ウェル平底プレート中に１００００ ＨＥｐ－２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２３（商標））細胞／ウェルまで添加した（ＭＯＩは１）。２４時間後、細胞を洗浄し、剥離し、２％ホルムアルデヒドで固定した。ＧＦＰ陽性細胞の百分率を、自動化プラットフォームと連結したＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔを使用した高処理ＦＡＣＳによって測定した。組織培養阻止希釈（ＴＣＩＤ）での５０％感染中和（ＴＣＩＤ_５０）を、Ｐｒｉｓｍ ７（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用した非線形回帰によって計算した。

【0086】

非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の免疫化
アカゲザルを、０週目および４週目に、ＭＦ５９様アジュバントＳＷＥで製剤化した三量体ＤＳ－Ｃａｖ１（５０μｇ；ｎ＝４）またはＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｉ５３－５０ナノ構造（９６μｇ、５０μｇの表示されたＤＳ－Ｃａｖ１を含む；ｎ＝５）でｉ．ｍ．（右四頭筋）にて免疫化した。血清学的分析のために、６週目および１６週目に血清を得た。

【0087】

Ｄ２５への相対的結合によるＤＳ－Ｃａｖ１保有ナノ構造の安定性
ＰｒｏｔｅＯＮ（商標）ＸＰＲ－３６装置（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にて２０℃のＰＢＳ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０（Ｓｉｇｍａ）中で実験した。１００ｎＭ Ｄ２５抗体をアミンカップリング（ＥＤＣ／ＮＨＳ化学）によってＧＬＭセンサーチップ表面上に固定し、抗体を含まないブランク表面を、基準として使用するために同一のカップリング条件下で作製した。異なる温度（２０、５０、７０、または８０℃）で１時間熱ストレスを与えた分析タンパク質（可溶性ＤＳ－Ｃａｖ１、可溶性ＤＳ－Ｃａｖ１－Ｉ５３－５０Ａ、およびＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｉ５３－５０ナノ構造）を、流速１００μｌ／分、濃度５０ｎＭで異なるセンサーチャネル中に注入した。データを、Ｐｒｏｔｅｏｎソフトウェアを使用して処理し、データの局所フィッティング前にブランク表面および緩衝液のみの注入を差し引くことによって二重に参照した。

【0088】

ナノ構造関連タンパク質の化学的変性
三量体ＤＳ－Ｃａｖ１、ＤＳ－Ｃａｖ１－Ｉ５３－５０Ａ、ＤＳ－Ｃａｖ１－Ｉ５３－５０、Ｉ５３－５０、三量体Ｉ５３－５０Ａ、または五量体Ｉ５３－５０Ｂ．４ＰＴ１を、０Ｍから６．５Ｍまでの範囲で０．２５Ｍずつ増加する種々の濃度の塩酸グアニジンを有する２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロールで最終濃度２．５μＭまで希釈した。試料を三連で調製し、周囲温度で１６時間インキュベートした。Ｃａｒｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ蛍光分光光度計にて、自家蛍光を、各々のタンパク質および各々の複製の各々の塩酸グアニジン濃度のために測定した。Ｐｅｌｔｉｅｒコントローラをセルホルダー中で使用して、全実験を通して２５℃に維持した。１０ｍｍセル（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｃｕｖｅｔｔｅ、部品番号６６１００２１６００）を使用して、２９０ｎｍで励起し、３１０ｎｍから５１０ｎｍまでの発光をバンド幅１ｎｍにて速度６０ｎｍ／分でスキャニングした蛍光スペクトルを収集した。

【0089】

統計解析
試料サイズを予め決定するために統計学的方法を使用しなかった。データを、Ｐｒｉｓｍ ６（ＧｒａｐｈＰａｄ（商標）ソフトウェア）にて２群比較のための両側ノンパラメトリックマン・ホイットニーＵ検定または３群以上を比較するときのクラスカル・ウォリス検定（およびＤｕｎｎのポストテスト）を使用して解析した。

【0090】

結果
Ｆタンパク質および三量体アセンブリドメインを含む三量体基本単位
各々が三量体アセンブリドメインに遺伝子融合したＦタンパク質を含むいくつかの三量体基本単位は、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞から分泌されたことが見出され、ＥＬＩＳＡアッセイにおける融合前特異的モノクローナル抗体結合によって判断したところ、そのＦタンパク質は、十分に折り畳まれた融合前高次構造であった。図２は、ＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ、ＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｔ３３－３１Ａ、およびＤＳ－Ｃａｖ１－Ｔ３３－３１Ａを発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞の上清を分析したＥＬＩＳＡデータの例を示す。いくつかの他の三量体基本単位により、十分に折り畳まれた融合前Ｆタンパク質が検出可能に分泌された。

【0091】

ＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｉ５３－５０Ａの発現および精製
ＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｉ５３－５０Ａをコードするレンチウイルスベクターを使用して、大量発現のためにＨＥＫ２９３Ｆ細胞を形質導入した。分泌されたタンパク質を、固定金属アフィニティクロマトグラフィおよびサイズ排除クロマトグラフィによって組織培養上清から精製した。サイズ排除クロマトグラム（図３）は、精製したタンパク質が単一の単分散種を形成することを示した。

【0092】

Ｉ５３－５０Ｂ．４ＰＴ１の発現および精製
Ｉ５３－５０Ｂ．４ＰＴ１（正二十面体Ｉ５３－５０系ナノ構造のアセンブリを駆動するためにＩ５３－５０ＡまたはＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｉ５３－５０Ａ内の三量体アセンブリドメインと相互作用する第２のアセンブリドメインを含む五量体タンパク質）を、Ｂａｌｅらおよび特許公開ＵＳ２０１６０１２２３９２Ａ１号に記載のように発現および精製した。

【0093】

ＤＳ－Ｃａｖ１保有Ｉ５３－５０ナノ構造のｉｎ ｖｉｔｒｏアセンブリおよび特徴づけ
Ｉ５３－５０は、Ｂａｌｅらが最近記載しているように、２０の三量体（Ｉ５３－５０Ａ）および１２の五量体（Ｉ５３－５０Ｂ）の基本単位を含む正二十面体対称を有する１２０サブユニットの２構成成分のナノ構造である。Ｉ５３－５０ＡのＮ末端は、Ｉ５３－５０ナノ構造の外面に露出しており、それにより、Ｉ５３－５３０ＡのＮ末端への遺伝子融合によるナノ構造外面への抗原の表示が可能である。精製されたＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｉ５３－５０ＡおよびＩ５３－５０Ｂ．４ＰＴ１をｉｎ ｖｉｔｒｏでアセンブリして、２つの精製されたタンパク質を種々のモル比で混合することによってナノ構造外面に種々の量のＤＳ－Ｃａｖ１を表示する１２０サブユニットの正二十面体ナノ構造を形成した。個別の調製物において、結合価が１００％（２０の三量体）、６６％（約１４の三量体）、および３３％（約７の三量体）でＤＳ－Ｃａｖ１を表示するナノ構造を、上記のように調製した。一晩のインキュベーション後のｉｎ ｖｉｔｒｏアセンブリ反応物中に存在する種を、いくつかの技術（サイズ排除クロマトグラフィ－多角度光散乱（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）、動的光散乱、およびＵＶ／可視分光法が含まれる）によって査定した。アセンブリした１２０サブユニットのナノ構造を、サイズ排除クロマトグラフィを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏアセンブリ反応物から精製した（結合価１００％のナノ構造を使用して得たクロマトグラムの例を、図４に示す）。精製したナノ構造が陰性染色電子顕微鏡法によって特徴づけられ、これにより、ＤＳ－Ｃａｖ１がコア正二十面体Ｉ５３－５０アセンブリから外向きに突出したスパイクとして明確に視認可能である単分散粒子領域が明らかとなった（結合価１００％の粒子を使用して得た顕微鏡写真の例を、図５に示す）。融合前高次構造に特異的なモノクローナル抗体を使用したＥＬＩＳＡアッセイにおいて、上記のようにナノ構造外面に表示されたＤＳ－Ｃａｖ１が十分に折り畳まれており、抗原性がインタクトであることが確認された（図６）。モノクローナル抗体結合の動態を評価する表面プラズモン共鳴実験により、結合価１００％のＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｉ５３－５０ナノ構造からの抗体の解離がＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ三量体からの解離より遅いことが明らかとなり、これは、ナノ構造外面上のＤＳ－Ｃａｖ１の多価提示に由来するアビディティー効果に起因する可能性が高い（図６）。まとめると、これらの実験から、ＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｉ５３－５０ナノ構造が、十分に折り畳まれた、抗原性がインタクトなＤＳ－Ｃａｖ１三量体をその外面に表示している単分散正二十面体ナノ構造を形成することが確認された。これらの所見は、動物におけるＤＳ－Ｃａｖ１に対する体液性免疫応答を誘導するための免疫原としてのＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｉ５３－５０ナノ構造の有用性を評価する実験を行う動機づけとなった。

【0094】

ＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｉ５３－５０ナノ構造の免疫原性
結合価が３３％、６６％、および１００％でＤＳ－Ｃａｖ１を表示するＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｉ５３－５０ナノ構造を、上記のプライム・ブーストストラテジーを使用してマウスに注射した。さらなるマウス群に、ナノ構造によるＤＳ－Ｃａｖ１に対して誘導された体液性免疫応答のベンチマークとしての三量体ＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎまたはＤＳ－Ｃａｖ１特異的応答のネガティブコントロールとしてのＤＳ－Ｃａｖ１を表示しないＩ５３－５０ナノ構造を注射した。注射後の規定の時点でのマウスから抽出した血清のＥＬＩＳＡアッセイを使用して、注射した動物の血清中に存在するＤＳ－Ｃａｖ１特異的抗体価を測定した（図７）。予想通り、ＤＳ－Ｃａｖ１を表示しないＩ５３－５０ナノ構造を注射した動物由来の血清は、ＤＳ－Ｃａｖ１に特異的な抗体を含まなかった。以前の結果（ＭｃＣｌｅｌｌａｎら）に従って、三量体ＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎは、ＤＳ－Ｃａｖ１特異的抗体を誘導した。結合価が３３％、６６％、および１００％のＤＳ－Ｃａｖ１ナノ構造は全て、三量体ＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎよりも高いＤＳ－Ｃａｖ１特異的抗体価を誘導し、この抗体価は、ＤＳ－Ｃａｖ１結合価が増加するにつれて増加した。ＤＳ－Ｃａｖ１特異的力価は、ＤＳ－Ｃａｖ１と比較して結合価が１００％のＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｉ５３－５０ナノ構造を注射したマウスにおいて平均しておよそ２．５倍高かった。これらの結果は、パラミクソウイルスＦタンパク質が自己アセンブリしたタンパク質ナノ構造上に多価で表示されている免疫原が、動物に注射されたときにより高い体液性免疫応答を誘導することができることを証明している。

【0095】

上記の一連の免疫原を注射したマウス由来の血清も、ＨＥｐ－２細胞における標準的な中和アッセイを使用して中和抗体価の存在について評価した（図８）。血清中和抗体価の傾向は、ＤＳ－Ｃａｖ１特異的結合抗体価で認められる傾向との相関が高かった。ＤＳ－Ｃａｖ１を表示しないＩ５３－５０ナノ構造を注射された動物由来の血清はウイルスを中和せず、これは、これらの血清中にＤＳ－Ｃａｖ１特異的抗体を欠くことと一致していた。三量体ＤＳ－Ｃａｖ－１－ｆｏｌｄｏｎを注射された動物由来の血清は、平均力価（１／ＩＤ_５０）３，０３０でウイルスを中和した。結合価が３３％、６６％、および１００％のＤＳ－Ｃａｖ１－Ｉ５３－５０ナノ構造は、三量体ＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎより高い中和抗体価を誘導し、それぞれの平均力価は９，４００、２０，０００、および３０，５００であった。これらの結果は、パラミクソウイルスＦタンパク質が自己アセンブリするタンパク質ナノ構造上に多価で表示される免疫原によって誘導されるより高い体液性応答によってウイルスがより有効に中和されることを証明している。

【0096】

霊長類免疫系におけるその免疫原性を評価するために、ＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｉ５３－５０ナノ構造をアカゲザルにも注射した。この動物に、０週目および４週目に、遊離ＤＳ－Ｃａｖ１三量体または結合価１００％でＤＳ－Ｃａｖ１を表示するＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｉ５３－５０ナノ構造のいずれかを筋肉内注射した。両方の場合、ＤＳ－Ｃａｖ１抗原の用量は５０μｇであり、免疫原を、ＭＦ５９様のスクアレン系水中油型乳濁液アジュバントＳＷＥを用いて製剤化した。６週目および１６週目の動物から得た血清を、抗ＤＳ－Ｃａｖ１抗体価およびＲＳＶ－中和抗体価について評価した（図９）。結果は、マウスで得た結果を反映していた。１６週目に、ＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｉ５３－５０ナノ構造を注射した動物における平均抗ＤＳ－Ｃａｖ１抗体価は、三量体ＤＳ－Ｃａｖ１を注射した動物と比較して４倍であった。１６週目のＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｉ５３－５０ナノ構造を注射した動物における平均ＲＳＶ－中和抗体価は、三量体ＤＳ－Ｃａｖ１を注射した動物と比較して１６倍であった。これらの結果は、霊長類免疫系において、パラミクソウイルスＦタンパク質が自己アセンブリするタンパク質ナノ構造上に多価で表示される免疫原が三量体パラミクソウイルスＦタンパク質のみよりも頑強な体液性免疫応答（高レベルのウイルス中和抗体が含まれる）を誘導することを証明している。

【0097】

Ｉ５３－５０Ａへの融合によるＤＳ－Ｃａｖ１の物理的安定化
融合前Ｆの重要な抗原特性を考慮して、本発明者らは、Ｉ５３－５０Ａに融合したときおよび／または正二十面体ナノ構造にさらにアセンブリしたときのＤＳ－Ｃａｖ１の物理的安定性を測定するための２つの直交性アプローチを使用した。第１のアッセイは、温度ストレス後の融合前特異的ｍＡｂ（Ｄ２５）による結合の持続時間を測定した（融合前Ｆ安定性を特徴づけるために以前に使用されていたアプローチ）（ＭｃＬｅｌｌａｎら、２０１３；Ｊｏｙｃｅら、２０１６；Ｋｒａｒｕｐら、２０１５）。等濃度（５０ｎＭ）のＤＳ－Ｃａｖ１を含む三量体ＤＳ－Ｃａｖ１、三量体ＤＳ－Ｃａｖ１－Ｉ５３－５０Ａ、およびＤＳ－Ｃａｖ１－Ｉ５３－５０ナノ構造の試料を、４つのアリコートに分割し、２０、５０、７０、または８０℃で１時間インキュベートした。室温に冷却後、Ｄ２５結合を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によってアッセイした。本発明者らは、ＤＳ－Ｃａｖ１について以前に報告されているように（ＭｃＬｅｌｌａｎら，２０１３；Ｊｏｙｃｅら，２０１６）、全ての試料は２０℃および５０℃でＤ２５に等しく結合したが、８０℃で１時間後にはＤ２５に対する反応性のほとんどが失われることを見出した（図１０）。興味深いことに、Ｄ２５も７０℃で１時間インキュベートした三量体ＤＳ－Ｃａｖ１に結合することはできなかったが、三量体ＤＳ－Ｃａｖ１－Ｉ５３－５０ＡおよびＤＳ－Ｃａｖ１－Ｉ５３－５０ナノ構造は、そのそれぞれの結合シグナルの５０％および８０％を保持していた（図１０）。ＤＳ－Ｃａｖ１－Ｉ５３－５０ナノ構造の多価性が三量体ＤＳ－Ｃａｖ１との直接的な定量的比較を複雑にしているが、これらの結果は、Ｉ５３－５０Ａ三量体への遺伝子融合がＤＳ－Ｃａｖ１の融合前高次構造をさらに安定化していることを示し、この安定性の増加がアセンブリしたナノ構造免疫原の状況において維持されていることを示唆している。

【0098】

本発明者らは、トリプトファン自家蛍光によってモニタリングされる塩酸グアニジン（ＧｄｎＨＣｌ）の化学的変性を、物理的安定性を評価するための第２の抗体非依存性技術として使用した。０～６．５Ｍ ＧｄｎＨＣｌ中でインキュベートしたＤＳ－Ｃａｖ１からの蛍光発光の分析により、タンパク質が２つのわずかに異なる移行（一方は０．２５Ｍと２．２５Ｍとの間のＧｄｎＨＣｌ、他方は２．２５Ｍと５．７５Ｍとの間のＧｄｎＨＣｌ）を受けることが明らかとなった（図１１）。対照的に、三量体ＤＳ－Ｃａｖ１－Ｉ５３－５０Ａについては、２．２５Ｍと６．２５Ｍとの間のＧｄｎＨＣｌで生じる単一の移行のみが明らかである（図１１）。ＤＳ－Ｃａｖ１について認められたより低い［ＧｄｎＨＣｌ］での移行が三量体ＤＳ－Ｃａｖ１－Ｉ５３－５０Ａに存在しないのか、あるいは、より高い［ＧｄｎＨＣｌ］に単にシフトしたのかについては現時点では明らかではない。しかし、ＤＳ－Ｃａｖ１の未変性の高次構造が三量体Ｉ５３－５０Ａへの遺伝子融合によって安定化されたことは明らかであり、これは温度ストレス後のＤ２５結合の測定によって得られた結果を反映している。ＤＳ－Ｃａｖ１－Ｉ５３－５０ナノ構造およびＩ５３－５０ナノ構造のみ（融合ＤＳ－Ｃａｖ１を欠く）のデータを比較すると、正二十面体ナノ構造へのアセンブリの際に安定化が維持されることを示していた（図１１）。この効果は、Ｉ５３－５０Ａ三量体の極度の安定性に由来する可能性が高い。Ｉ５３－５０Ａは、超好熱性細菌Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａのＫＤＰＧアルドラーゼから誘導され、非常に高い（＞５．７５Ｍ）ＧｄｎＨＣｌ濃度で蛍光が変化し始めるだけであった（図１１）。

【0099】

本発明者らは、ＧＳの反復数およびＦｏｌｄｏｎ部分などの安定化ドメインの必要性を査定するために、さらなる構築物を作製した。
配列情報

【0100】

【表3】

【0101】

研究は、少量一過性トランスフェクションにおける発現収量に基づいた。関連構築物を発現することができるプラスミドを、ＮＥＢ５α大腸菌細胞に形質転換し、ＬＢ＋カルベニシリン寒天プレート上で選択した。１ｍＬ培養物を、ＴＢ培地への細菌コロニーの播種および５０ｕｇ／ｍＬカルベニシリンでの再度の選択によって調製した。Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐキットをそのプロトコールに従って使用して、大腸菌培養物からプラスミドを精製した。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、ペニシリン（１００ｕ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を補足したＥｘｐｉ２９３（商標）発現培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中にて１２５ｒｐｍで振盪しながら８％ＣＯ_２、３７℃で培養した。

【0102】

トランスフェクションの前日に、細胞を２Ｅ６細胞／ｍＬの濃度で播種した。トランスフェクション当日に、細胞を、細胞生存度を判定するためのトリパンブルーを含むＣｏｕｎｔｅｓｓ ＩＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって計数した。細胞濃度を２．５Ｅ６細胞／ｍＬに調整し、細胞を、無処理１２ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に体積１ｍＬでプレートした。製造者の説明書に従ってＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、各々のウェルあたり１μｇのＤＮＡプラスミドをトランスフェクトした。エンハンサー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒのＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）トランスフェクションキットの構成要素）を、トランスフェクションの１８時間後に添加した。トランスフェクションの５日後に１ｍＬの培養物を回収し、１，５００×ｇにて４℃で５分間の遠心分離によって上清から細胞をペレット化した。ＰＶＤＦ膜を備えた０．４５μＭ濾過器によって上清を濾過した。

【0103】

ＤＳ－Ｃａｖ１－Ｉ５３－５０Ａ構築物を含む濾過した上清を変性させ、２－メルカプトエタノールを含む２×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中にて９５℃で１０分間ボイルした。試料画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、次いで、ニトロセルロースメンブレンに移し、パリビズマブで探索後、ＨＲＰに抱合した抗ヒト二次抗体で探索した。ブロットを、Ｃｌａｒｉｔｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＥＣＬブロッティング基質（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して画像化した。

【0104】

ＤＳ－Ｃａｖ１－Ｉ５３－５０Ａ構築物を含む濾過した上清を、２倍希釈系列でＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）９６ウェルプレートに結合させた。融合前高次構造特異的抗体Ｄ２５、その後にＨＲＰに抱合した二次抗ヒト抗体を使用して、ＤＳ－Ｃａｖ１－Ｉ５３－５０Ａを検出した。タンパク質収量を基質ＴＭＢによる比色分析によって判定し、４５０ｎｍの吸光度を収集した。

【0105】

融合前特異的ｍＡｂ Ｄ２５の発現収量および結合（データ示さず）は、全ての構築物が十分に発現し、融合前高次構造にあることを示す。当業者は、異種三量体化ドメイン（ｆｏｌｄｏｎなど）が融合前Ｆ構築物の適切な発現および折り畳みに必要であると予想していたであろう。本発明者らの結果は、Ｉ５３－５０Ａナノ構造の構成成分がｆｏｌｄｏｎのような三量体化ドメインを使用せずにＤＳ－Ｃａｖ１の発現および適切な折り畳みを支持することができることを示す。これらの構築物へのＤ２５の結合は、構築物の抗原性がインタクトであり、ＤＳ－Ｃａｖ１－ｆｏｌｄｏｎ－Ｉ５３－５０融合ポリペプチドを含むナノ構造に類似する強力な免疫応答（抗体の中和が含まれる）を誘導すると予想されることを示唆している。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6a】

【図6b】

【図6c】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11-1】

【図11-2】

【図11-3】

【図11-4】

【図11-5】

【配列表】

2023002680000001.app

【手続補正書】

【提出日】2022-10-24

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】変更

【補正の内容】

【配列表】

2023002680000001.xml

【手続補正書】

【提出日】2022-11-15

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

実質的に明細書に記載されているナノ構造、組成物または方法。