特開 2023-27020 成人Ｔ細胞白血病細胞に特異的に結合する一本鎖抗体を導入したキメラ抗原受容体を含むナチュラルキラー細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023027020

(43)【公開日】2023-03-01

(54)【発明の名称】成人Ｔ細胞白血病細胞に特異的に結合する一本鎖抗体を導入したキメラ抗原受容体を含むナチュラルキラー細胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20230221BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230221BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20230221BHJP

   C07K 16/30 20060101ALI20230221BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20230221BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20230221BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z

C12N5/10 ZNA

C12N5/0783

C07K16/30

C07K19/00

C12N15/13

【審査請求】未請求

【請求項の数】5

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022128961

(22)【出願日】2022-08-12

(31)【優先権主張番号】P 2021132120

(32)【優先日】2021-08-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り ・小松克己氏および栗田英昭氏の両名へのメール送信 メールの送信日 令和４年７月１９日 公開者 隅田 泰生

(71)【出願人】

【識別番号】307011381

【氏名又は名称】株式会社スディックスバイオテック

(71)【出願人】

【識別番号】504258527

【氏名又は名称】国立大学法人 鹿児島大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】隅田 泰生

【テーマコード（参考）】

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93Y

4B065AA94X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4H045AA11

4H045BA10

4H045BA41

4H045DA50

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

【課題】成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）は、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）の感染により起こる白血病である。ＨＴＬＶ－１保因者の５％程度が３０～５０年の潜伏期間を経てＡＴＬを発症する。一旦発症すると、５年生存率が１０％以下の極めて予後の悪い血液がんである。日本のＨＴＬＶ－１保因者は、南九州を中心に全国で約１０８万人と推定され、毎年約１千人の患者が死亡している。標準的な治療法は未だに確立されておらず、新たな治療法の確立が求められている。
【解決手段】独自の糖鎖ナノテクノロジーとファージディスプレイ法を組み合わせて開発したＡＴＬ細胞特異的に結合する一本鎖抗体の遺伝子を、キメラ抗原受容体の一部として遺伝子導入したナチュラルキラー細胞を製造し、その方法も確立した。この細胞は遺伝子導入していないナチュラルキラー細胞では排除できないＡＴＬ細胞を効率よく死滅させ、ＡＴＬの免疫細胞療法に利用できる。
【選択図】図３

【特許請求の範囲】

【請求項1】

成人Ｔ細胞白血病細胞に特異的に結合する一本鎖抗体を抗原認識部位として導入したキメラ抗原受容体を含む、ナチュラルキラー細胞。

【請求項2】

前記一本鎖抗体は、成人Ｔ細胞白血病細胞の細胞表層糖鎖に特異的に結合する一本鎖抗体である、請求項１に記載のナチュラルキラー細胞。

【請求項3】

前記キメラ抗原受容体は、
（ａ）イムノグロブリン重鎖シグナルペプチド、
（ｂ）Ｃ末端にＭｙｃ－ｔａｇを有する、成人Ｔ細胞白血病細胞の細胞表層糖鎖に特異的に結合する一本鎖抗体、
（ｃ）ＣＤ２８由来ヒンジ及び膜貫通タンパク質ドメイン、
（ｄ）シグナル伝達のための４－１ＢＢ細胞内タンパク質ドメイン、および、
（ｅ）シグナル伝達のためのＣＤ３ζＴ細胞受容体ドメイン、
を含み、かつ、前記（ａ）～（ｅ）が、Ｎ末端からＣ末端にかけて、この順に発現するキメラ抗原受容体である、請求項１に記載のナチュラルキラー細胞。

【請求項4】

配列番号７、８または９として示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、キメラ抗原受容体。

【請求項5】

請求項４に記載のキメラ抗原受容体をコードする、配列番号１０、１１または１２として示される塩基配列。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、成人Ｔ細胞白血病細胞に特異的に結合する一本鎖抗体を導入したキメラ抗原受容体および当該キメラ抗原受容体を導入したナチュラルキラー細胞に関する。

【背景技術】

【0002】

糖鎖は、生体内に普遍的に存在する生体分子で、糖タンパク質や糖脂質、プロテオグリカンのような複合糖質の形で存在する。細胞表層の糖鎖は、糖鎖－タンパク質間や糖鎖－糖鎖同士の相互作用を介して、細胞接着や情報伝達、ウイルスや細菌の感染などに関与し、生体内で極めて多様な生理機能を担う。

【0003】

糖鎖の構造や発現量は、炎症や疾患などの細胞内外の環境変化に応じて、動的に変化することが知られている。細胞のがん化においては、特定の糖鎖の過剰発現や欠損が起きたり、一部が欠損した不完全な構造の糖鎖が出現したりすることがある。また、正常細胞には存在しない糖鎖構造が発現することもあり、がんの進展に伴って、様々な糖鎖の発現変化が起こることが知られている。したがって、がんの進行度や転移性、患者の予後などが予測できると期待されており、疾患特異的に発現する糖鎖をバイオマーカーに利用するための研究が活発に行われている。

【0004】

疾患特異的な糖鎖は、がんマーカーとしての利用だけでなく、分子標的薬開発のための標的分子としても利用されている。疾患特異的な糖鎖に対する分子標的薬は、新たな診断薬や医薬品の開発にも繋がることから、近年盛んに研究されている。一方、抗糖鎖抗体の作製においては、（i）疾患特異的な糖鎖構造の同定が非常に難しいこと、（ii）糖鎖の抗原性が低く、実験動物に免疫してハイブリドーマを得る従来の手法では抗体の作製が難しいこと、（iii）糖鎖の抗原性を向上させるために、糖脂質への誘導や抗原性タンパク質との複合化などが必要なことなど、技術的に様々な課題があり、簡便且つ効率的に特異性の高い抗糖鎖抗体を作製可能な新たな手法の確立が求められている。

【0005】

一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、抗体の抗原結合部位を含む領域であるＦａｂの重鎖（ＶＨ）と軽鎖（ＶＬ）から構成される抗体の一種であり、リンカーペプチドによりＶＨとＶＬ同士がつながった構造を持つ。目的のｓｃＦｖを探索・単離する有効な手法としてファージディスプレイ法があり、ウイルスの一種であるバクテリオファージ表面にｓｃＦｖを提示させ、多数のライブラリーの中から特定の抗原に結合するｓｃＦｖ提示ファージを効率的に選別・濃縮することが出来る。得られたｓｃＦｖ提示ファージは、大腸菌のタンパク質発現系を用いて、可溶性のｓｃＦｖを発現させることができ、産生されたｓｃＦｖは、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）等のエピトープタグを用いたアフィニティー精製により、簡便に精製することが出来る。さらには、ＩｇＧ抗体へと誘導出来るため、特異性の高いヒト由来抗体を作製する技術として大きな注目を集めている。

【0006】

発明者は、効率的に疾患特異的な糖鎖に対する抗体を得る手法を確立するために、ファージライブラリー法と独自のシュガーチップ技術（特許文献１、２、非特許文献１、２）を用いて、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）に対する抗糖鎖抗体の開発を行ってきた。即ち、ＡＴＬ患者より樹立した細胞株であるＳ１Ｔ細胞表層のＯ－型糖鎖を遊離させ、独自のリンカー化合物と複合化後、ファイバー型シュガーチップを作製し、Ｓ１Ｔ細胞表層のＯ－型糖鎖に結合するｓｃＦｖ提示ファージを選別することで、ＡＴＬ細胞に強く結合するｓｃＦｖ（Ｓ１ＴＳＣＦＲ３－１）を得ることに成功している（特許文献３、非特許文献３）。

【0007】

しかし、大腸菌のタンパク質発現系を用いてファージミドからｓｃＦｖを調製すると、約１ヶ月後には、細胞への結合性を観察できなくなるため、構造安定性に欠けることが課題であった。また、Ｓ１ＴＳＣＦＲ３－１が結合する糖鎖の構造を、有機化学的に合成されたＯ－型糖鎖部分二糖構造のライブラリーを固定化したシュガーチップを用いて解析したところ、高硫酸化されたグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）鎖の複数の構造に結合性を示し、その特異性が十分に高くないことも課題であった。

【0008】

一方、ｓｃＦｖのわずかな立体構造の変化（立体構造のゆらぎ）により、抗原結合部位となる相補性決定領域（ＣＤＲ）の立体構造がゆらぐため、糖鎖への特異性が低下することが考えられた。したがって、これらを改善することで、ｓｃＦｖの安定性と糖鎖特異性を改善できると考えた。

【0009】

そこで、ｓｃＦｖの安定性を改善するために、ｐＥＴ発現システムを用いた遺伝子組み換えにより、エピトープタグの一部であるＭｙｃエピトープタグの一部を除去したｓｃＦｖを調製した。また、バイオインフォマティクスにより、抗原結合部位となるＣＤＲのアミノ酸配列は改変せず、構造安定性に寄与するフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を改変したｓｃＦｖを設計し、遺伝子組み換えと大腸菌による発現システムを使用して、安定性を向上させたｓｃＦｖを製造することができた（特許文献４）。

【0010】

成人Ｔ細胞白血病（以下「ＡＴＬ」という。）は、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（以下「ＨＴＬＶ－１」という。）が起因する白血病である。潜伏期間は３０～５０年で、ＨＴＬＶ－１保因者の生涯発症率は２．５～５％程度だが、一旦発症すると、５年生存率が約１０％と極めて予後の悪い血液がんである。

【0011】

日本のＨＴＬＶ－１保因者は、南九州を中心に全国で約１０８万人と推定され、毎年約１千人の患者が死亡する。ＡＴＬの治療では、同種造血幹細胞移植や複数の抗がん剤を組み合わせた化学療法が中心に行われる。しかし、同種造血幹細胞移植は、５０歳以下の体力のある患者に制限される。体力の衰えた患者にはミニ移植が行われるが、再発率が高い。化学療法においても治療抵抗性を示すことが多く、一旦症状が改善しても再発率が非常に高いため、薬物療法のみでは長期生存が難しい。したがって、新たな有効な治療法の開発が求められている。

【0012】

ＡＴＬ、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞型リンパ腫、ホジキンリンパ腫または、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫といった膜タンパク質のＣＣＲ４のｍＲＮＡを産生する悪性腫瘍を有する対象を処置するための方法として、抗ＣＣＲ４一本鎖抗体をキメラ抗原受容体（以下「ＣＡＲ」という）の一部として担持させたＴ細胞（以下「ＣＡＲ－Ｔ」という）が報告されている（特許文献５）。また、血液悪性腫瘍に対するＣＡＲの構成およびその使用方法として、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、およびＣＤ５２抗原に対する抗原認識ドメインを有するキメラ抗原レセプターポリペプチドを担持させたＣＡＲ－Ｔ細胞およびＣＡＲ－ナチュラルキラー（以下「ＮＫ」という）細胞が報告されている（特許文献６）。

【0013】

日本では、２０１９年にＣＡＲ－Ｔ細胞療法が臨床承認され、再発又は難治性Ｂ細胞性急性リンパ芽球性白血病を対象とした治療が行われている。

【0014】

ＣＡＲ－Ｔ細胞療法では、Ｔ細胞の活性化に伴うサイトカイン放出症候群や、異なるドナー由来のＴ細胞を用いた場合に移植対片宿主病を引き起こすことが課題である（非特許文献４、非特許文献５）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0015】

【特許文献1】特許第４８０２３０９号

【特許文献2】特許第５２７８９９２号

【特許文献3】特開２０１４－１００１１６

【特許文献4】特開２０１９－１９９４７２

【特許文献5】特表２０１９－５３６４６９

【特許文献6】特開２０２１－７８５１４

【非特許文献】

【0016】

【非特許文献1】Ｗａｋａｏ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．１８：２４９９－２５０４（２００８）

【非特許文献2】Ｗａｋａｏ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１７：１０８６－１０９１（２０１７）

【非特許文献3】Ｍｕｃｈｉｍａ Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６３：２８１－２９１（２０１８）

【非特許文献4】Ｋａｔｓｕｙａ Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１２６：２５７０－２５７７（２０１５）

【非特許文献5】Ｏｅｌｓｎｅｒ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ. １９：２３５－２４９（２０１７）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0017】

上記のような状況にあって、本発明の一実施形態は、ＡＴＬ細胞に対する優れた特異性を有し、かつ、安全性の高い免疫細胞を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0018】

免疫細胞の一種であるＮＫ細胞は、Ｔ細胞と異なり、活性化に伴う炎症性サイトカインの放出がほぼなく、炎症性サイトカインによって起こるサイトカイン放出症候群を引き起こしにくい。また、異なるドナー由来のＮＫ細胞またはＮＫ細胞に由来する細胞株を治療時に摂取した場合であっても、移植対片宿主病を引き起こさない。そのため、ＣＡＲを導入したＮＫ（以下「ＣＡＲ－ＮＫ」という。）細胞を用いれば、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法で問題となるサイトカイン放出症候群といった副反応を誘発せずに、安全性の高い免疫細胞療法を提供することが期待できる。

【0019】

したがって、本発明の一実施形態は、ＡＴＬ細胞に特異的に結合する一本鎖抗体を抗原認識部位として導入したキメラ抗原受容体および当該キメラ抗原受容体を含むナチュラルキラー細胞に関する。

【0020】

また、本発明の一実施形態は、配列番号７、８または９として示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、キメラ抗原受容体に関する。

【発明の効果】

【0021】

本発明の一実施形態に係るＣＡＲ－ＮＫ細胞によれば、（Ｉ）ＡＴＬ細胞に特異的に結合する一本鎖抗体を抗原認識部位として導入したＣＡＲを含むため、ＡＴＬ細胞に対する優れた特異性を有し、かつ、（ＩＩ）前記ＣＡＲが、ＮＫ細胞に導入されているため、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法で問題となる、移植対片宿主病、および、サイトカイン放出症候群といった、臓器不全や死に至ることもある副反応を誘発せずに、直接腫瘍細胞を排除できる、安全性が高いＣＡＲ－ＮＫ細胞を提供できる。このような特異性および安全性に優れる免疫細胞である、本発明の一実施形態に係るＣＡＲ－ＮＫ細胞は、ＡＴＬの免疫細胞療法に好適に利用できると期待できる。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】ＮＫ－９２ ＭＩ細胞に導入するＣＡＲ遺伝子の概略図である（ＳＦＦＶ： ｓｐｌｅｅｎ ｆｏｃｕｓ－ｆｏｒｍｉｎｇ ｖｉｒｕｓ由来プロモーター領域、 ＳＰ： ＣＤ８－ｌｅａｄｅｒ シグナルペプチド、Ｓ１ＴＳＣＦＲ３－１： ｓｃＦｖ、 Ｌ： リンカー部、 Ｍ： Ｍｙｃ－ｔａｇ、 ＣＤ２８ｈ： ヒンジ領域、ＣＤ２８ ＴＭ： 膜貫通タンパク質ドメイン、４－１ＢＢ： 細胞内タンパク質ドメイン、ＣＤ３ζ： Ｔ細胞受容体ドメイン、ＣＭＶ： ｃｙｔｏｍｅｇａｒｏｖｉｒｕｓ由来プロモーター領域、ＥＧＦＰ： 蛍光性タンパク質）。

【図2】ＮＫ－９２ ＭＩ細胞に導入する３種のＣＡＲタンパク質の概略図である。

【図3】ＮＫ－９２ ＭＩ細胞およびＳ１ＴＳＣＦＲ３－１を導入したＣＡＲを含むＮＫ－９２ ＭＩ細胞（ＦＲ３－１－ＣＡＲ－ＮＫ－９２ ＭＩ細胞）のＳ１Ｔ細胞に対する細胞傷害性の検証結果を示す図である（エフェクター細胞：ＮＫ－９２ ＭＩ細胞もしくはＦＲ３－１－ＣＡＲ－ＮＫ－９２ ＭＩ細胞、ターゲット細胞：Ｓ１Ｔ細胞）。

【図4】急性期のＡＴＬ患者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対するｓｃＦｖ（Ｓ１ＴＳＣＦＲ３－１）の結合活性についての検討結果を示す図である。

【図5】ＡＴＬ患者由来のＰＢＭＣに対する、本発明の一実施形態に係るＣＡＲ－ＮＫ細胞の細胞傷害性の検討結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0023】

本発明の一実施形態に係るＮＫ細胞（以下、「本ＮＫ細胞」という）は、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）細胞に特異的に結合するｓｃＦｖを抗原認識部位として導入した（有する）ＣＡＲを含む、ＮＫ細胞である。本ＮＫ細胞は、ＣＡＲを導入したＮＫ細胞（ＣＡＲ－ＮＫ）であるとも言える。

【0024】

ＣＡＲは、抗原を特異的に認識する抗体の抗原認識部位とＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の細胞内ドメインから構成され、抗原の認識により、強力な免疫応答を誘導するため、免疫細胞療法に導入されている。

【0025】

本ＮＫ細胞は、上記のように、ＡＴＬ細胞に特異的に結合するｓｃＦｖを抗原認識部位として導入したＣＡＲを含むため、ＡＴＬ細胞に対して、特異的かつ強力な免疫応答が誘導される。その結果、本ＮＫ細胞は、ＡＴＬ細胞に対して強い細胞傷害性を発揮できるため、ＡＴＬの免疫細胞療法に好適に利用できると期待できる。

【0026】

本ＮＫ細胞が含むＣＡＲを構成するｓｃＦｖは、ＡＴＬ細胞に特異的に結合できる限り特に限定されないが、ＡＴＬ細胞に対する特異性に優れ、健常細胞に対する細胞障害性が低いことから、ＡＴＬ細胞の細胞表層糖鎖に特異的に結合するｓｃＦｖであることが好ましい。

【0027】

ＡＴＬ細胞の細胞表層糖鎖に特異的に結合するｓｃＦｖとしては、本発明者らが開発した、ＡＴＬ細胞表層の糖鎖に特異的に結合する（抗原とする）ｓｃＦｖを好適に利用することができる。より具体的に、本ＮＫ細胞が含むＣＡＲに導入されるｓｃＦｖは、以下のいずれかであることが好ましい：
（１）配列番号１、２または３に示されるアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ。
（２）配列番号１、２または３に示されるアミノ酸配列から１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＡＴＬ細胞表層の糖鎖に特異的に結合するｓｃＦｖ。
（３）配列番号１、２または３に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＡＴＬ細胞表層の糖鎖に特異的に結合するｓｃＦｖ。
（４）配列番号４、５または６に示される塩基配列にコードされるｓｃＦｖ。
（５）配列番号４、５または６に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされるｓｃＦｖであって、かつＡＴＬ細胞表層の糖鎖に特異的に結合するｓｃＦｖ。
（６）配列番号４、５または６に示される塩基配列と９０％以上の同一性を有するポリヌクレオチドにコードされるｓｃＦｖであって、かつＡＴＬ細胞表層の糖鎖に特異的に結合するｓｃＦｖ。
（７）配列番号４、５または６に示される塩基配列において、１または複数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列にコードされるｓｃＦｖであって、かつＡＴＬ細胞表層の糖鎖に特異的に結合するｓｃＦｖ。

【0028】

（１）に関して、配列番号１、２または３で示されるアミノ酸配列は、本発明者らによって特定された、ＡＴＬ細胞表層の糖鎖に特異的に結合する３種類のｓｃＦｖのアミノ酸配列である。配列番号１はＳ１ＴＳＣＦＲ３－１のアミノ酸配列に、配列番号２はＴＭ－２のアミノ酸配列に、配列番号３はＴＭ－５のアミノ酸配列に、それぞれ対応する。（２）および（３）は、（１）のバリアントを表している。（４）は、対応する塩基配列により特定された、ＡＴＬ細胞表層の糖鎖に特異的に結合するｓｃＦｖ（Ｓ１ＴＳＣＦＲ３－１、ＴＭ－２またはＴＭ－５）である。（ａ）～（７）は、（４）のバリアントの塩基配列により特定された、ＡＴＬ細胞表層の糖鎖に特異的に結合するｓｃＦｖである。

【0029】

前記（２）に関して、アミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加される数の上限は、例えば、２５個、２０個、１５個、１０個、５個、３個、２個または１個でありうる。

【0030】

前記（３）に関して、アミノ酸配列の同一性は、例えば、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％である。なお、アミノ酸配列の同一性は、例えば、BLASTXを利用して決定することができる。

【0031】

前記（５）に関して、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、６×ＳＳＣの塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、５０～６０℃にて１６時間ハイブリダイゼーションを行い、０．１×ＳＳＣの塩濃度の溶液中で洗浄した後に、ハイブリダイズする条件を言う。

【0032】

前記（６）に関して、塩基配列の同一性は、例えば、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１００％である。

【0033】

前記（７）に関して、塩基が置換、欠失、挿入および／または付加される数の上限は、例えば、７５個、５０個、３７個、２５個、１５個、１０個、８個、５個、３個、２個または１個でありうる。

【0034】

本発明の一実施形態において、ＡＴＬ細胞特異的な結合性を有するｓｃＦｖを抗原認識部位に有するＣＡＲを導入するＮＫ細胞としては、特に限定されず、患者由来ＮＫ細胞、または、ＮＫ細胞の細胞株である、ＮＫ－９２ ＭＩ細胞、ＮＫ－９２細胞、もしくは、ＫＨＹＧ－１細胞などにも導入可能である。中でも、安定して安価に培養が可能であることから、ＮＫ細胞としては、細胞株を使用することが好ましい。

【0035】

本発明の一実施形態において、ＣＡＲ遺伝子をＮＫ細胞に導入する方法は特に限定されないが、例えば、非増殖性ウイルスベクター（レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクターなど）、増殖性ウイルスベクター（腫瘍溶解性ウイルスベクターなど）、非ウイルスベクター（プラスミド、Ｎａｋｅｄ ＤＮＡを内包するリポソームなど）、または、バクテリアベクター等のＣＡＲ遺伝子を有する各種のベクターを用いて導入することができる。

【0036】

以下、本発明の一実施形態に係るＣＡＲ（「本ＣＡＲ」ともいう）および本ＮＫ細胞の一例について、図１および図２を用いてより具体的に説明するが、本ＣＡＲおよび本ＮＫ細胞は、係る態様に限定されるものではない。

【0037】

図１は、設計した、ＣＡＲコンストラクト遺伝子の概略図を、ｓｃＦｖがＳ１ＴＳＣＦＲ３－１である場合について示すものであり、図２は発現するＣＡＲタンパク質の概略図である。

【0038】

設計したＣＡＲコンストラクトは、イムノグロブリン重鎖シグナルペプチド－抗原認識部位（ｓｃＦｖ）－リンカー部－ヒンジ領域－膜貫通タンパク質ドメイン－細胞内タンパク質ドメイン－Ｔ細胞受容体ドメインから構成される。イムノグロブリン重鎖シグナルペプチドは、細胞内で発現したＣＡＲを細胞表層に輸送するシグナルペプチドであり、例えば、ＣＤ８－ｌｅａｄｅｒタンパク質を用いることができる。

【0039】

抗原認識部位には、ＡＴＬ細胞に特異的に結合する一本鎖抗体を、好ましくは、本発明者らが開発した、ＡＴＬ細胞表層の糖鎖を抗原とするｓｃＦｖ（Ｓ１ＴＳＣＦＲ３－１、ＴＭ－２またはＴＭ－５）を用いることができる。また、このｓｃＦｖ領域には、ＣＡＲの検出を容易にするため、エピトープタグの一つであるＭｙｃ－ｔａｇを連結させてもよい。

【0040】

ヒンジ領域、膜貫通タンパク質ドメインにはＣＤ２８タンパク質を用いることができ、膜貫通タンパク質ドメインには４－１ＢＢシグナル伝達タンパク質を用いることができる。また、Ｔ細胞受容体ドメインには、ＣＤ３ζタンパク質を用いることができる。また、設計したＣＡＲは、ＳＦＦＶ（ｓｐｌｅｅｎ ｆｏｃｕｓ－ｆｏｒｍｉｎｇ ｖｉｒｕｓ）プロモーターを転写開始領域にもつ。

【0041】

本発明の一実施形態に係るキメラ抗原受容体としては、以下の配列番号７、８または９に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むキメラ抗原受容体を好適に使用することができる。すなわち、本発明の一実施形態において、以下の配列番号７、８または９に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むキメラ抗原受容体を提供する。

【0042】

ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＭＡＥＶＱＬＬＱＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＳＷＮＧＧＮＩＤＹＡＤＳＶＲＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＤＳＬＲＡＥＤＴＡＬＹＹＣＡＫＡＰＧＭＬＩＹＹＳＹＭＤＶＷＧＫＧＴＭＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＰＶＬＴＱＰＰＳＶＳＶＳＰＧＱＴＡＲＩＴＣＳＧＤＲＬＰＲＱＹＶＹＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＬＬＩＹＫＤＩＥＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＴＳＧＴＴＶＴＬＴＩＮＧＶＱＡＥＤＥＡＤＹＳＣＱＳＡＤＳＳＥＴＹＰＶＦＧＧＧＴＫＶＴＶＬＧＡＡＡＧＧＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号７）。

【0043】

配列番号７で示される配列中、（ａ）１～２１位の配列は、イムノグロブリン重鎖シグナルペプチドである、ＣＤ８－Ｌｅａｄｅｒのアミノ酸配列に対応し、（ｂ）２２～２６９位の配列は、ＡＴＬ細胞特異的な結合性を有するｓｃＦｖ（Ｓ１ＴＳＣＦＲ３－１）のアミノ酸配列に対応し、２７０～２７４位の配列はリンカー部に対応し、２７５～２８４位の配列は、Ｍｙｃ－ｔａｇのアミノ酸配列に対応し、（ｃ）２８５～３２４位の配列は、ＣＤ２８由来のヒンジのアミノ酸配列に、３２５～３５１位の配列は、ＣＤ２８由来膜貫通タンパク質ドメインのアミノ酸配列にそれぞれ対応し、（ｄ）３５２～３９３位の配列は、４－１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列に対応し、（ｅ）３９４～５０４位の配列は、ＣＤ３ζ Ｔ細胞受容体ドメインのアミノ酸配列に対応する。

【0044】

ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＧＳＭＡＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＷＮＧＧＮＩＤＹＡＤＳＶＲＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＡＰＧＭＬＩＹＹＳＹＭＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＰＶＬＴＱＰＰＳＶＳＶＡＰＧＱＴＡＲＩＴＣＳＧＤＲＬＰＲＱＹＶＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＩＹＫＤＩＥＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＧＶＥＡＧＤＥＡＤＹＹＣＱＳＡＤＳＳＥＴＹＰＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＡＡＡＴＧＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号８）。

【0045】

配列番号８で示される配列中、（ａ）１～２１位の配列は、イムノグロブリン重鎖シグナルペプチドである、ＣＤ８－Ｌｅａｄｅｒのアミノ酸配列に対応し、２２～２３位の配列はリンカー部に対応し、（ｂ）２４～２７１位の配列は、ＡＴＬ細胞特異的な結合性を有するｓｃＦｖ（ＴＭ－２）のアミノ酸配列に対応し、２７２～２７６位の配列はリンカー部に対応し、２７７～２８６位の配列は、Ｍｙｃ－ｔａｇのアミノ酸配列に対応し、（ｃ）２８７～３２６位の配列は、ＣＤ２８由来のヒンジのアミノ酸配列に、３２７～３５３位の配列は、ＣＤ２８由来膜貫通タンパク質ドメインのアミノ酸配列にそれぞれ対応し、（ｄ）３５４～３９５位の配列は、４－１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列に対応し、（ｅ）３９６～５０６位の配列は、ＣＤ３ζ Ｔ細胞受容体ドメインのアミノ酸配列に対応する。

【0046】

ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＧＳＭＡＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＷＮＧＧＮＩＤＹＡＤＳＶＲＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＡＰＧＭＬＩＹＹＳＹＭＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＰＶＬＴＱＰＰＳＶＳＶＳＰＧＱＴＡＲＩＴＣＳＧＤＲＬＰＲＱＹＶＹＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＩＹＫＤＩＥＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＧＴＱＡＧＤＥＡＤＹＹＣＱＳＡＤＳＳＥＴＹＰＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＡＡＡＴＧＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号９）。

【0047】

配列番号９で示される配列中、（ａ）１～２１位の配列は、イムノグロブリン重鎖シグナルペプチドである、ＣＤ８－Ｌｅａｄｅｒのアミノ酸配列に対応し、２２～２３位の配列はリンカー部に対応し、（ｂ）２４～２７１位の配列は、ＡＴＬ細胞特異的な結合性を有するｓｃＦｖ（ＴＭ－５）のアミノ酸配列に対応し、２７２～２７６位の配列はリンカー部に対応し、２７７～２８６位の配列は、Ｍｙｃ－ｔａｇのアミノ酸配列に対応し、（ｃ）２８７～３２６位の配列は、ＣＤ２８由来のヒンジのアミノ酸配列に、３２７～３５３位の配列は、ＣＤ２８由来膜貫通タンパク質ドメインのアミノ酸配列にそれぞれ対応し、（ｄ）３５４～３９５位の配列は、４－１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列に対応し、（ｅ）３９６～５０６位の配列は、ＣＤ３ζ Ｔ細胞受容体ドメインのアミノ酸配列に対応する。

【0048】

本発明の一実施形態に係るキメラ抗原受容体としては、以下の配列番号１０、１１または１２に示される塩基配列によりコードされるポリペプチドを含むキメラ抗原受容体を好適に使用することができる。すなわち、本発明の一実施形態において、本キメラ抗原受容体をコードする、以下の配列番号１０、１１または１２に示される塩基配列を提供する。

【0049】

ＡＴＧＧＣＣＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＣＣＧＣＣＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＣＴＴＧＣＴＧＣＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＣＣＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＣＡＧＧＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＡＴＧＡＴＴＡＴＧＣＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＧＣＡＡＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＧＴＡＴＴＡＧＴＴＧＧＡＡＴＧＧＴＧＧＴＡＡＣＡＴＡＧＡＣＴＡＴＧＣＧＧＡＣＴＣＴＧＴＧＡＧＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＴＣＣＣＴＣＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＧＡＣＡＧＴＣＴＧＡＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＴＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＡＡＧＣＣＣＣＣＧＧＡＡＴＧＣＴＴＡＴＣＴＡＣＴＡＣＴＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＡＡＡＧＧＧＡＣＡＡＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＴＴＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＴＣＡＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＧＣＡＧＣＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＣＣＣＣＴＣＧＧＴＧＴＣＡＧＴＧＴＣＣＣＣＡＧＧＡＣＡＧＡＣＧＧＣＣＡＧＧＡＴＣＡＣＣＴＧＣＴＣＴＧＧＡＧＡＴＣＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＴＡＴＧＴＴＴＡＴＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＴＴＴＴＡＣＴＡＡＴＡＴＡＴＡＡＧＧＡＴＡＴＴＧＡＧＡＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＧＡＧＣＧＡＴＴＣＴＣＣＧＧＣＴＣＣＡＣＴＴＣＡＧＧＧＡＣＡＡＣＡＧＴＣＡＣＧＴＴＧＡＣＣＡＴＣＡＡＴＧＧＡＧＴＣＣＡＧＧＣＧＧＡＡＧＡＣＧＡＧＧＣＴＧＡＣＴＡＴＴＣＣＴＧＴＣＡＡＴＣＡＧＣＧＧＡＣＡＧＴＡＧＴＧＡＡＡＣＴＴＡＴＣＣＧＧＴＧＴＴＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＡＧＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＡＡＡＣＴＣＡＴＣＴＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＴＣＴＧＡＴＴＧＡＡＧＴＴＡＴＧＴＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＡＣＣＴＡＧＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＴＡＴＣＣＡＴＧＴＧＡＡＡＧＧＧＡＡＡＣＡＣＣＴＴＴＧＴＣＣＡＡＧＴＣＣＣＣＴＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧＣＣＣＴＴＴＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＴＴＧＣＴＡＴＡＧＣＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＡＡＣＧＧＧＧＣＡＧＡＡＡＧＡＡＡＣＴＣＣＴＧＴＡＴＡＴＡＴＴＣＡＡＡＣＡＡＣＣＡＴＴＴＡＴＧＡＧＡＣＣＡＧＴＡＣＡＡＡＣＴＡＣＴＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＴＡＧＣＴＧＣＣＧＡＴＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＴＧＴＧＡＡＣＴＧＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＣＴＡＴＡＡＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＣＴＡＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＧＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＣＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＴＡＡＧＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＴＧＡＧＡＴＴＧＧＧＡＴＧＡＡＡＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＧＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＡＣＧＡＴＧＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＧＧＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧＣ（配列番号１０）。

【0050】

配列番号１０で示される配列中、（ａ’）１～６３位の配列は、ＣＤ８－Ｌｅａｄｅｒを含むアミノ酸配列をコードする塩基配列に対応し、（ｂ’）６４～８０７位の配列は、ＡＴＬ細胞特異的な結合性を有するｓｃＦｖを含むアミノ酸配列をコードする塩基配列に、８０８～８２２位の配列はリンカー部に対応し、８２３～８５２位の配列は、Ｍｙｃ－ｔａｇを含むアミノ酸配列をコードする塩基配列にそれぞれ対応し、（ｃ’）８５３～９６９位の配列は、ＣＤ２８由来ヒンジのアミノ酸配列をコードする塩基配列に、９７０～１０５０位の配列は、ＣＤ２８由来膜貫通タンパク質ドメインのアミノ酸配列をコードする塩基配列にそれぞれ対応し、（ｄ’）１０５１～１１７６位の配列は、４－１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列をコードする塩基配列に対応し、（ｅ’）１１７７～１５１２位の配列は、ＣＤ３ζ Ｔ細胞受容体ドメインのアミノ酸配列をコードする塩基配列に対応する。

【0051】

ＡＴＧＧＣＣＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＣＣＧＣＣＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＣＴＴＧＣＴＧＣＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＣＧＧＴＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＡＴＧＡＴＴＡＴＧＣＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＧＣＡＡＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＴＡＴＴＡＧＴＴＧＧＡＡＴＧＧＴＧＧＴＡＡＣＡＴＡＧＡＣＴＡＴＧＣＧＧＡＣＴＣＴＧＴＧＡＧＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＴＣＴＡＡＧＡＡＣＡＣＴＣＴＣＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＴＡＧＴＣＴＧＡＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＡＡＧＣＣＣＣＣＧＧＡＡＴＧＣＴＴＡＴＣＴＡＣＴＡＣＴＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＡＣＴＴＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＴＴＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＴＣＡＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＧＣＡＧＣＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＣＣＣＣＴＣＧＧＴＧＴＣＡＧＴＧＧＣＴＣＣＡＧＧＡＣＡＧＡＣＧＧＣＣＡＧＧＡＴＣＡＣＣＴＧＣＴＣＴＧＧＡＧＡＴＣＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＴＡＴＧＴＴＣＡＴＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＴＴＴＴＡＧＴＴＡＴＡＴＡＴＡＡＧＧＡＴＡＴＴＧＡＧＡＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＧＡＧＣＧＡＴＴＣＴＣＣＧＧＣＴＣＣＡＡＴＴＣＡＧＧＧＡＡＴＡＣＡＧＣＴＡＣＧＴＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＴＧＧＡＧＴＣＧＡＡＧＣＧＧＧＴＧＡＣＧＡＧＧＣＴＧＡＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＣＡＡＴＣＡＧＣＧＧＡＣＡＧＴＡＧＴＧＡＡＡＣＴＴＡＴＣＣＧＧＴＧＴＴＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＡＧＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＣＣＧＧＴＧＡＡＣＡＡＡＡＡＣＴＣＡＴＣＴＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＴＣＴＧＡＴＴＧＡＡＧＴＴＡＴＧＴＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＡＣＣＴＡＧＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＴＡＴＣＣＡＴＧＴＧＡＡＡＧＧＧＡＡＡＣＡＣＣＴＴＴＧＴＣＣＡＡＧＴＣＣＣＣＴＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧＣＣＣＴＴＴＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＴＴＧＣＴＡＴＡＧＣＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＡＡＣＧＧＧＧＣＡＧＡＡＡＧＡＡＡＣＴＣＣＴＧＴＡＴＡＴＡＴＴＣＡＡＡＣＡＡＣＣＡＴＴＴＡＴＧＡＧＡＣＣＡＧＴＡＣＡＡＡＣＴＡＣＴＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＴＡＧＣＴＧＣＣＧＡＴＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＴＧＴＧＡＡＣＴＧＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＣＴＡＴＡＡＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＣＴＡＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＧＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＣＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＴＡＡＧＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＴＧＡＧＡＴＴＧＧＧＡＴＧＡＡＡＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＧＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＡＣＧＡＴＧＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＧＧＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧＣ（配列番号１１）。

【0052】

配列番号１１で示される配列中、（ａ’）１～６３位の配列は、ＣＤ８－Ｌｅａｄｅｒを含むアミノ酸配列をコードする塩基配列に、６４～６９位の配列は、リンカーのアミノ酸配列をコードする塩基配列にそれぞれ対応し、（ｂ’）７０～８１３位の配列は、ＡＴＬ細胞特異的な結合性を有するｓｃＦｖ（ＴＭ－２）を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列に、８１４～８２８位の配列はリンカー部に対応し、８２９～８５８位の配列は、Ｍｙｃ－ｔａｇを含むアミノ酸配列をコードする塩基配列にそれぞれ対応し、（ｃ’）８５９～９７５位の配列は、ＣＤ２８由来ヒンジのアミノ酸配列をコードする塩基配列に、９７６～１０５６位の配列は、ＣＤ２８由来膜貫通タンパク質ドメインのアミノ酸配列をコードする塩基配列にそれぞれ対応し、（ｄ’）１０５７～１１８２位の配列は、４－１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列をコードする塩基配列に対応し、（ｅ’）１１８３～１５１８位の配列は、ＣＤ３ζ Ｔ細胞受容体ドメインのアミノ酸配列をコードする塩基配列に対応する。

【0053】

ＡＴＧＧＣＣＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＣＣＧＣＣＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＣＴＴＧＣＴＧＣＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＣＧＧＴＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＡＴＧＡＴＴＡＴＧＣＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＧＣＡＡＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＴＡＴＴＡＧＴＴＧＧＡＡＴＧＧＴＧＧＴＡＡＣＡＴＡＧＡＣＴＡＴＧＣＧＧＡＣＴＣＴＧＴＧＡＧＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＴＣＴＡＡＧＡＡＣＡＣＴＣＴＣＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＴＡＧＴＣＴＧＡＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＡＡＧＣＣＣＣＣＧＧＡＡＴＧＣＴＴＡＴＣＴＡＣＴＡＣＴＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＡＣＴＴＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＴＴＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＴＣＡＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＧＣＡＧＣＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＣＣＣＣＴＣＧＧＴＧＴＣＡＧＴＧＡＧＴＣＣＡＧＧＡＣＡＧＡＣＧＧＣＣＡＧＧＡＴＣＡＣＣＴＧＣＴＣＴＧＧＡＧＡＴＣＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＴＡＴＧＴＴＴＡＴＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＴＴＴＴＡＧＴＴＡＴＡＴＡＴＡＡＧＧＡＴＡＴＴＧＡＧＡＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＧＡＧＣＧＡＴＴＣＴＣＣＧＧＣＴＣＣＡＡＴＴＣＡＧＧＧＡＡＴＡＣＡＧＣＴＡＣＧＴＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＡＧＣＧＧＧＴＧＡＣＧＡＧＧＣＴＧＡＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＣＡＡＴＣＡＧＣＧＧＡＣＡＧＴＡＧＴＧＡＡＡＣＴＴＡＴＣＣＧＧＴＧＴＴＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＡＧＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＣＣＧＧＴＧＡＡＣＡＡＡＡＡＣＴＣＡＴＣＴＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＴＣＴＧＡＴＴＧＡＡＧＴＴＡＴＧＴＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＡＣＣＴＡＧＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＴＡＴＣＣＡＴＧＴＧＡＡＡＧＧＧＡＡＡＣＡＣＣＴＴＴＧＴＣＣＡＡＧＴＣＣＣＣＴＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧＣＣＣＴＴＴＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＴＴＧＣＴＡＴＡＧＣＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＡＡＣＧＧＧＧＣＡＧＡＡＡＧＡＡＡＣＴＣＣＴＧＴＡＴＡＴＡＴＴＣＡＡＡＣＡＡＣＣＡＴＴＴＡＴＧＡＧＡＣＣＡＧＴＡＣＡＡＡＣＴＡＣＴＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＴＡＧＣＴＧＣＣＧＡＴＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＴＧＴＧＡＡＣＴＧＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＣＴＡＴＡＡＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＣＴＡＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＧＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＣＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＴＡＡＧＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＴＧＡＧＡＴＴＧＧＧＡＴＧＡＡＡＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＧＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＡＣＧＡＴＧＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＧＧＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧＣ（配列番号１２）。

【0054】

配列番号１２で示される配列中、（ａ’）１～６３位の配列は、ＣＤ８－Ｌｅａｄｅｒを含むアミノ酸配列をコードする塩基配列に、６４～６９位の配列は、リンカーのアミノ酸配列をコードする塩基配列にそれぞれ対応し、（ｂ’）７０～８１３位の配列は、ＡＴＬ細胞特異的な結合性を有するｓｃＦｖ（ＴＭ－５）を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列に、８１４～８２８位の配列はリンカー部に対応し、８２９～８５８位の配列は、Ｍｙｃ－ｔａｇを含むアミノ酸配列をコードする塩基配列にそれぞれ対応し、（ｃ’）８５９～９７５位の配列は、ＣＤ２８由来ヒンジのアミノ酸配列をコードする塩基配列に、９７６～１０５６位の配列は、ＣＤ２８由来膜貫通タンパク質ドメインのアミノ酸配列をコードする塩基配列にそれぞれ対応し、（ｄ’）１０５７～１１８２位の配列は、４－１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列をコードする塩基配列に対応し、（ｅ’）１１８３～１５１８位の配列は、ＣＤ３ζ Ｔ細胞受容体ドメインのアミノ酸配列をコードする塩基配列に対応する。

【0055】

ＣＡＲコンストラクト遺伝子の組み込まれたレンチウイルスベクターは、ＣＡＲ遺伝子とは別に、蛍光性タンパク質であるＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）を発現する遺伝子も有していてもよい。ＥＧＦＰは、ＣＭＶ（ｃｙｔｏｍｅｇａｒｏｖｉｒｕｓ）プロモーターを転写開始領域にもつ。ＥＧＦＰ遺伝子を有する場合、ＣＡＲ遺伝子導入細胞は、ＥＧＦＰ遺伝子も共に遺伝子導入されるため、ＥＧＦＰの発現による蛍光の有無から、ＣＡＲの導入が予測可能となる。

【0056】

ＮＫ－９２ ＭＩ細胞へのＣＡＲ遺伝子の導入は、本発明者らが開発したＡＴＬ細胞に対し特異的に結合するｓｃＦｖをＣＡＲの抗原認識部位として遺伝子的に組み込んだレンチウイルスベクターを用いることが好ましい。レンチウイルスベクターをパッケージングしたリコンビナントレンチウイルスを用いることで、ウイルスの感染を介したＮＫ－９２ ＭＩ細胞内へのＣＡＲ遺伝子の輸送と、ＮＫ－９２ ＭＩ細胞遺伝子へのＣＡＲ遺伝子の導入を達成することができる。

【0057】

設計したレンチウイルスベクターをパッケージングしたリコンビナントレンチウイルスは、例えば、ベクタービルダー社より購入することができる。ＣＡＲ遺伝子の導入に際しては、例えば、１×１０^５個のＮＫ－９２ ＭＩ細胞に３×１０^７ ＴＵのレンチウイルスを接種させることでウイルスを感染させることができる。また、レンチウイルスを播種したＮＫ－９２ ＭＩ細胞は、例えば、ＭＥＭα培地（１２．５％ ウシ胎児血清， １％ ペニシリンストレプトマイシン含有）を用い、３７℃、５％二酸化炭素ガス雰囲気下で培養することができる。

【0058】

レンチウイルスベクターとして、ＣＡＲとは別に、蛍光性タンパク質であるＥＧＦＰも発現する遺伝子を有するレンチウイルスベクターを用いる場合、ＣＡＲ遺伝子導入ＮＫ－９２ ＭＩ細胞は、ＥＧＦＰをＣＡＲと共に発現する。そのため、ＣＡＲ導入細胞は、ＥＧＦＰの蛍光を指標にセルソーターで分離することができる。分離した細胞は、例えば、ＭＥＭα培地（１２．５％ ウシ胎児血清， １％ ペニシリンストレプトマイシン含有）を用いて、３７℃、５％二酸化炭素ガス雰囲気下で培養することで、高発現率のＣＡＲ－ＮＫ－９２ ＭＩ 細胞を得ることができる。

【0059】

ＣＡＲ－ＮＫ－９２ ＭＩ 細胞の細胞傷害性は、例えば、ＡＴＬ患者のＴ細胞から樹立したＳ１Ｔ細胞や、非ＡＴＬリンパ球癌細胞のＭＯＬＴ－４細胞とＣＡＲ－ＮＫ－９２ ＭＩ 細胞を共培養し、フローサイトメトリー解析により評価することができる。

【0060】

本発明者らが開発した、ＡＴＬ患者のＴ細胞から樹立したＳ１Ｔ細胞やＭＴ－２細胞には結合するが、ＭＯＬＴ４細胞など非ＡＴＬリンパ球癌細胞には結合しないｓｃＦｖ（Ｓ１ＴＳＣＦＲ３－１、ＴＭ－２およびＴＭ－５）は、糖鎖ナノテクノロジーとファージディスプレイ法、さらに遺伝子工学を組み合わせて確立することができる。

【0061】

本発明には、以下の態様が含まれる。
〈１〉成人Ｔ細胞白血病細胞に特異的に結合する一本鎖抗体を抗原認識部位として導入したキメラ抗原受容体を含む、ナチュラルキラー細胞。
〈２〉前記一本鎖抗体は、成人Ｔ細胞白血病細胞の細胞表層糖鎖に特異的に結合する一本鎖抗体である、〈１〉に記載のナチュラルキラー細胞。
〈３〉前記キメラ抗原受容体は、
（ａ）イムノグロブリン重鎖シグナルペプチド、
（ｂ）Ｃ末端にＭｙｃ－ｔａｇを有する、成人Ｔ細胞白血病細胞の細胞表層糖鎖に特異的に結合する一本鎖抗体、
（ｃ）ＣＤ２８由来ヒンジ及び膜貫通タンパク質ドメイン、
（ｄ）シグナル伝達のための４－１ＢＢ細胞内タンパク質ドメイン、および、
（ｅ）シグナル伝達のためのＣＤ３ζＴ細胞受容体ドメイン、
を含み、かつ、前記（ａ）～（ｅ）が、Ｎ末端からＣ末端にかけて、この順に発現するキメラ抗原受容体である、〈１〉に記載のナチュラルキラー細胞。
〈４〉配列番号７、８または９として示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、キメラ抗原受容体。
〈５〉〈４〉に記載のキメラ抗原受容体をコードする、配列番号１０、１１または１２として示される塩基配列。また、本発明には、以下の態様も含まれる。
〈１’〉がん細胞への細胞傷害性を増強し、低副反応性を特徴とするＡＴＬ細胞に特異的に結合する一本鎖抗体をＣＡＲの抗原認識部位として導入したＮＫ細胞。
〈２’〉がん細胞の細胞表層糖鎖に対する一本鎖抗体をＣＡＲの抗原認識部位として導入することを特徴とする〈１’〉に記載のＡＴＬ細胞に特異的に結合する一本鎖抗体をＣＡＲの抗原認識部位として導入したＮＫ細胞。
〈３’〉（ａ）イムノグロブリン重鎖シグナルペプチド
（ｂ）請求項１に記載の成人Ｔ細胞白血病細胞の細胞表層糖鎖に対する一本鎖抗体であって、Ｃ末端にＭｙｃ－ｔａｇを有する一本鎖抗体
（ｃ）ＣＤ２８由来ヒンジ及び膜貫通タンパク質ドメイン
（ｄ）シグナル伝達のための４－１ＢＢ細胞内タンパク質ドメイン
（ｅ）シグナル伝達のためのＣＤ３ζＴ細胞受容体ドメイン
を含むキメラ抗原受容体であり、（ａ）～（ｅ）が、Ｎ末端からＣ末端の順に発現するＣＡＲ。
〈４’〉配列番号７として示されるアミノ酸配列を含む〈３’〉に記載のＣＡＲ。
〈５’〉配列番号１０として示される〈３’〉に記載のＣＡＲを発現させる塩基配列。

【実施例0062】

〔実施例１〕
実施例１では、ＡＴＬ細胞に特異的な結合性を有するｓｃＦｖをＣＡＲの抗原結合部位として導入したＣＡＲ－ＮＫ細胞を開発し、その細胞傷害性について検討した。

【0063】

ＮＫ細胞には、ＮＫ－９２ ＭＩ細胞を用い、図２に示す構造を有する配列番号７で示されるポリペプチド（Ｓ１ＴＳＣＦＲ３－１）を含むＣＡＲをコードする、配列番号１０で示される塩基配列を含む遺伝子（ＣＡＲ遺伝子）を、レンチウイルスベクターを用いてＮＫ－９２ ＭＩ細胞に導入した。なお、前記レンチウイルスベクターは、ＣＡＲとは別に、蛍光性タンパク質であるＥＧＦＰも発現する遺伝子を有していた。遺伝子導入率の高い細胞を、ＣＡＲとは別に細胞内で発現する蛍光性タンパク質の蛍光強度を指標に、セルソーターで分離・回収することで、ｓｃＦｖ（Ｓ１ＴＳＣＦＲ３－１）を含むＣＡＲ遺伝子を導入したＮＫ－９２ ＭＩ細胞（以下、ＦＲ３－１－ＣＡＲ－ＮＫ－９２ ＭＩ細胞という）を得た。

【0064】

Ｓ１Ｔ細胞およびＭＯＬＴ－４細胞をターゲット細胞として、得られたＦＲ３－１－ＣＡＲ－ＮＫ－９２ ＭＩ細胞をエフェクター細胞としてそれぞれ用いて、得られたＦＲ３－１－ＣＡＲ－ＮＫ－９２ ＭＩ細胞の細胞傷害性を評価した。結果を図３に示す。図３より明らかなように、ＦＲ３－１－ＣＡＲ－ＮＫ－９２ ＭＩ細胞とＳ１Ｔ細胞を１：１の比率で２４時間共培養し、フローサイトメトリー解析を行ったところ、９０％以上のＳ１Ｔ細胞が死滅した。

【0065】

また、ＣＡＲを導入していないＮＫ－９２ ＭＩ細胞とＳ１Ｔ細胞との共培養では、１０％程度の細胞傷害性しか示さなかった。

【0066】

一方、図示はしないが、ＭＯＬＴ－４細胞の場合、ＣＡＲの導入前後で細胞傷害性は同程度であり、どちらも６５％程度の細胞傷害性であった。

【0067】

以上から、ＮＫ－９２ ＭＩ細胞へのＳ１ＴＳＣＦＲ３－１を含むＣＡＲの導入は、ＮＫ－９２ ＭＩ細胞の細胞傷害性を失うことなく、ＡＴＬ細胞に対する特異性および細胞傷害性を増強可能であることが示唆された。

【0068】

〔実施例２〕
急性期のＡＴＬ患者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対するｓｃＦｖの結合活性について検討した。実験の具体的な手順は、以下の通りであった。
１．凍結状態の急性期のＡＴＬ患者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を湯浴（３７℃）で半融解させ、予め３７℃に温めたＰＢＳ（９ｍＬ）に加え、完全に融解させた。
２．得られたＰＢＭＣ溶液を遠心分離（５００×ｇ、５ｍｉｎ）後、培養上清を除去し、ＰＢＳで懸濁することで、細胞懸濁液中の細胞数が１×１０^６個／ｍＬとなるように調整した。
３．得られた細胞懸濁液をマイクロチューブに１ｍＬずつ分注し、遠心分離（５００×ｇ、５ｍｉｎ）後、上清を除去した。
４．５０μＬのｓｃＦｖ（Ｓ１ＴＳＣＦＲ３－１、１０μｇ／ｍＬ）および、５０μＬのａｎｔｉ－ｈｕｍａｎＳｙｎＣＡＭ （ＴＳＬＣ－１／ＣＡＤＭ１）モノクローナル抗体（以下、「ｍＡｂ」ともいう）（×１／１０００）を、前記マイクロチューブに加えた。また、一部のマイクロチューブについては、ｓｃＦｖを添加せず、ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎＳｙｎＣＡＭ （ＴＳＬＣ－１／ＣＡＤＭ１）ｍＡｂのみを添加し、コントロールとした。
５．操作４で得たマイクロチューブを、４℃で３０分間静置した。
６．静置後、４００μＬのＦＡＣＳ Ｂｕｆｆｅｒ（１％ ＢＳＡ含有ＰＢＳ）をマイクロチューブに加え、遠心分離（５００×ｇ、５ｍｉｎ）後、上清を除去した。
７．５０μＬのＡｎｔｉ－Ｈｉｓ－ｔａｇ ｍＡｂ（×１／１０００）、および、５０μＬのＳｈｅｅｐ ａｎｔｉ－ｃｈｉｃｋｅｎ ＩｇＹのＢｉｏｔｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（５μｇ／ｍＬ）をマイクロチューブに加えた。
８．操作７で得たマイクロチューブを、４℃で３０分間静置した。
９．静置後、４００μＬのＦＡＣＳ Ｂｕｆｆｅｒ（１％ ＢＳＡ含有ＰＢＳ）をマイクロチューブに加え、遠心分離（５００×ｇ、５ｍｉｎ）後、上清を除去した。
１０．５０μＬのＧｏａｔ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｏ ６４７ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ４ ａｂ（×１／２０）もしくはＧｏａｔ ＣＦ６３３ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ）（×１／１０００）および、５０μＬのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎＲ－ＰＥ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（×１／１０００）をマイクロチューブに加えた。
１１．操作１０で得たマイクロチューブを、４℃で３０分間静置した。
１２．静置後、４００μＬのＦＡＣＳ Ｂｕｆｆｅｒ（１％ ＢＳＡ含有ＰＢＳ）を加え、遠心分離（５００×ｇ、５ｍｉｎ）後、上清を除去した。
１３．１０００μＬのＦＡＣＳ Ｂｕｆｆｅｒ（１％ ＢＳＡ含有ＰＢＳ）を加え、得られた溶液を試料として、フローサイトメトリー解析（励起波長 ４８８および６３３ ｎｍ、発光波長 ５７５および６７５ ｎｍ）を行った。

【0069】

フローサイトメトリーによる解析結果を図４に示す。図４左図（コントロール）と、図４右図との比較より明らかなように、Ｓ１ＴＳＣＦＲ３－１は、急性期のＡＴＬ患者由来のＰＢＭＣに対して強い結合性を有することが示された。

【0070】

〔実施例３〕
ＡＴＬ患者由来のＰＢＭＣに対するＣＡＲ－ＮＫ細胞の細胞傷害性について検討した。実験の具体的な手順は、以下の通りであった。
１．実施例１で作製したＦＲ３－１－ＣＡＲ－ＮＫ－９２ ＭＩ細胞を培養液から回収し、遠心分離（３００×ｇ、５ｍｉｎ）した。
２．培養上清を除去し、ＰＢＳで懸濁することで、細胞懸濁液中の細胞数が１×１０^６個／３０μＬとなるように調整した。
３．得られた細胞懸濁液に、１μＬのＣａｌｃｅｉｎ ＡＭ（０．５％ ＤＭＳＯ 含有ＰＢＳ）を、５００μＬのＰＢＳで希釈して作製した細胞染色液１５μＬを加えた。
４．操作３で得た溶液を、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で、３０分間静置した。
５．静置後、１０００μＬのＰＢＳを加え、遠心分離（３００×ｇ、５ｍｉｎ）後、上清を除去した。
６．さらに、１０００μＬのＰＢＳを加え、遠心分離（３００×ｇ、５ｍｉｎ）後、上清を除去した。
７．１０００μＬのＰＢＳを加え、共培養用の細胞懸濁液を調製した。
８．３×１０^６個のエフェクター細胞（ＣＡＲ－ＮＫ細胞（ＣＡＲ－ＮＫ）もしくはＣａｌｃｅｉｎ染色したＮＫ－９２ ＭＩ細胞（ＮＫ））、および、１×１０^６個のターゲット細胞（ＡＴＬ患者由来ＰＢＭＣ）を、２４ｗｅｌｌプレートに播種した。また、コントロールとして、ＣＡＲ－ＮＫおよびＮＫのいずれのエフェクター細胞も播種せず、ターゲット細胞のみを播種したサンプルも作成した。
９．８の操作で播種したエフェクター細胞およびターゲット細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で、６時間共培養した。
１０．共培養後、各ｗｅｌｌから細胞懸濁液をマイクロチューブに回収し、遠心分離（５００×ｇ、５ｍｉｎ）後、上清を除去した。
１１．操作１０のマイクロチューブに１００μＬのヨウ化プロピジウムのＰＢＳ溶液（１μｇ／ｍＬ）を加え、細胞を懸濁した。
１２．操作１１で得たマイクロチューブを、室温、遮光下で１５分間静置した。
１３．静置後、１０００μＬのＰＢＳを加え、フローサイトメトリー解析（励起波長 ４８８ ｎｍ、発光波長 ６７５ ｎｍ）を行った。

【0071】

フローサイトメトリーによる解析結果を図５に示す。図５より明らかなように、ＣＡＲ－ＮＫ細胞を導入したＰＢＭＣは、コントロール（ＮＫ、ＣＡＲ－ＮＫなし）、および、ＮＫ（ＣＡＲを導入していないＮＫ）のみを導入したＰＢＭＣと比して、細胞生存率が有意に低い（ｐ＜０．００１）ことが分かる。この結果より、本発明の一実施形態に係るＣＡＲ－ＮＫ細胞は、ＡＴＬ患者由来のＰＢＭＣに対して高い細胞傷害性を有することが示された。

【0072】

〔まとめ〕
ＡＴＬは一度発症すると、５年生存率が１０％程度であり、非常に予後の悪い疾患である。治療法は確立されておらず、国内においては年間約一千人がＡＴＬにより死亡している。

【0073】

本発明により開発した、ＡＴＬ細胞に特異的な結合性を有するｓｃＦｖを抗原認識部位に有するＮＫ細胞である、ＣＡＲ－ＮＫ－９２ ＭＩ細胞は、ＣＡＲを導入していないＮＫ－９２ ＭＩ細胞では不十分であった、ＡＴＬ細胞に対する細胞傷害性を向上した。つまり、本発明の一実施形態に係るＣＡＲ－ＮＫ細胞は、ＡＴＬ患者に用いた場合、ＡＴＬ患者のＡＴＬ細胞を死滅させることが出来る可能性があり、ＡＴＬに対する治療が可能となると考えられる。

【0074】

本発明により開発したＣＡＲ－ＮＫ－９２ ＭＩ細胞は、ＡＴＬに対する免疫細胞療法の開発を可能とするものである。

【0075】

現在、国内で臨床利用される免疫細胞療法では、患者由来のＴ細胞に抗ＣＤ１９抗体をＣＡＲの抗原認識部位として導入したＣＡＲ－Ｔ細胞が用いられる（製品名：キムリア）。
しかしながら、その薬価は３０００万円を超え、非常に高額なものである。

【0076】

ＣＡＲ－Ｔ細胞では、患者ごとにＴ細胞のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が異なるため、他の患者由来のＴ細胞や細胞株を用いた場合、投与したＣＡＲ－Ｔ細胞が異物として免疫機能に認識されるため、移植対片宿主病（ＧＶＨＤ）を引き起こす。したがって、実際に患者に投与するＣＡＲ－Ｔ細胞には、ドナー由来のＴ細胞を単離して利用する必要があり、ＣＡＲ－Ｔ細胞の調整に、時間と費用がかかる。

【0077】

しかし、ＮＫ細胞は、異なる患者のＮＫ細胞や細胞株を別の患者に投与してもＧＶＨＤを引き起こさないことが知られている。したがって、本発明により開発したＣＡＲ－ＮＫ－９２ ＭＩ細胞は、ＧＶＨＤを引き起こさずに、ＡＴＬに対し安全な免疫細胞療法が可能である。

【0078】

さらに、本発明の一実施形態に係るＮＫ－９２ ＭＩ細胞は、細胞株であるため、開発したＣＡＲ－ＮＫ－９２ ＭＩ細胞は安定して安価に培養が可能である。したがって、現在臨床利用されているＴ細胞ベースの免疫細胞療法よりも、安全かつ安価に利用可能であると予想される。治療効果の高い免疫細胞療法を低コスト化可能な点で、産業面にも貢献できると考えられる。

【産業上の利用可能性】

【0079】

本発明の一実施形態に係る、ＡＴＬ細胞特異的な結合性を有するｓｃＦｖを抗原認識部位に有するＣＡＲ－ＮＫ細胞は、ＡＴＬに対する新たな治療法として安全かつ効果的な免疫細胞療法の開発を導く。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

2023027020000001.xml