▶ ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023002715
(43)【公開日】2023-01-10
(54)【発明の名称】糖原病を処置するための組換えウイルスベクター
(51)【国際特許分類】
C12N 15/864 20060101AFI20221227BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20221227BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20221227BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20221227BHJP
A61P 3/08 20060101ALI20221227BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20221227BHJP
【ＦＩ】
C12N15/864 100Z
C12N15/867 Z ZNA
C12N7/01
A61K35/76
A61P3/08
A61K48/00
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022169032
(22)【出願日】2022-10-21
(62)【分割の表示】P 2019540667の分割
【原出願日】2018-01-30
(31)【優先権主張番号】62/451,963
(32)【優先日】2017-01-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】508285606
【氏名又は名称】ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ジャニス ジェイ． チョウ
(57)【要約】 （修正有）
【課題】糖原病を処置するための組換えウイルスベクターを提供する。
【解決手段】本明細書では、糖原病、特にＧＳＤ－Ｉｂの処置のための遺伝子治療適用に使用することができる、組換え核酸分子、ＡＡＶおよびレンチウイルスベクターなどの組換えベクター、ならびに組換えＡＡＶおよび組換えレンチウイルスなどの組換えウイルスが記載されている。本明細書では、ヒトグルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６ＰＣ）プロモーター／エンハンサー（ＧＰＥ）配列に作動可能に連結した、ヒトグルコース－６－リン酸トランスポーター（Ｇ６ＰＴ）コード配列を含む組換え核酸分子が提供される。本明細書ではまた、ミニマルＧ６ＰＴプロモーター／エンハンサー（ｍｉＧＴ）配列に作動可能に連結した、ヒトＧ６ＰＴコード配列を含む組換え核酸分子が提供される。
【選択図】図５－１
【解決手段】本明細書では、糖原病、特にＧＳＤ－Ｉｂの処置のための遺伝子治療適用に使用することができる、組換え核酸分子、ＡＡＶおよびレンチウイルスベクターなどの組換えベクター、ならびに組換えＡＡＶおよび組換えレンチウイルスなどの組換えウイルスが記載されている。本明細書では、ヒトグルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６ＰＣ）プロモーター／エンハンサー（ＧＰＥ）配列に作動可能に連結した、ヒトグルコース－６－リン酸トランスポーター（Ｇ６ＰＴ）コード配列を含む組換え核酸分子が提供される。本明細書ではまた、ミニマルＧ６ＰＴプロモーター／エンハンサー（ｍｉＧＴ）配列に作動可能に連結した、ヒトＧ６ＰＴコード配列を含む組換え核酸分子が提供される。
【選択図】図５－１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１７年１月３０日に出願された米国仮出願第６２／４５１，９６３号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
この出願は、２０１７年１月３０日に出願された米国仮出願第６２／４５１，９６３号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【0002】
本開示は、糖原病、特に糖原病Ｉｂ型の処置のための遺伝子治療用ベクターに関する。
【背景技術】
【0003】
糖原病Ｉｂ型（ＧＳＤ－Ｉｂ、ＭＩＭ２３２２２０）は、グルコース－６－リン酸（Ｇ６Ｐ）を細胞質から小胞体（ＥＲ）の内腔に移行させる、遍在的に発現しているＧ６Ｐトランスポーター（Ｇ６ＰＴまたはＳＬＣ３７Ａ４）の欠損によって引き起こされる（Ｃｈｏｕら、Ｃｕｒｒ Ｍｏｌ Ｍｅｄ、２巻：１２１～１４３頁、２００２年；Ｃｈｏｕら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、６巻：６７６～６８８頁、２０１０年）。ＥＲ内では、Ｇ６Ｐは、肝臓／腎臓／腸に限定されたグルコース－６－ホスファターゼ－α（Ｇ６Ｐａｓｅ－αもしくはＧ６ＰＣ）、または遍在的に発現しているＧ６Ｐａｓｅ－βのいずれかによって、グルコースとリン酸に加水分解される。Ｇ６ＰＴとＧ６Ｐａｓｅは機能的に共依存しており、Ｇ６ＰＴ／Ｇ６Ｐａｓｅ複合体を形成する。Ｇ６ＰＴ／Ｇ６Ｐａｓｅ－α複合体は、食間血中グルコースの恒常性を維持する。いずれかのタンパク質の欠損は、空腹時低血糖症、肝腫大、腎腫大、高脂血症、高尿酸血症、乳酸血症、および成長遅延により特徴付けられる異常な代謝表現型をもたらす。Ｇ６ＰＴ／Ｇ６Ｐａｓｅ－β複合体は、好中球／マクロファージの恒常性と機能を維持し、いずれかのタンパク質の欠損は、好中球減少症と骨髄機能障害を引き起こす（Ｃｈｏｕら、Ｃｕｒｒ Ｍｏｌ Ｍｅｄ、２巻：１２１～１４３頁、２００２年；Ｃｈｏｕら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、６巻：６７６～６８８頁、２０１０年）。したがって、ＧＳＤ－Ｉｂは代謝だけでなく、グルコース恒常性の障害、好中球減少症、および骨髄機能障害によって特徴付けられる免疫障害でもある。処置されないとＧＳＤ－Ｉｂは、年少において致死的である。顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）療法（Ｖｉｓｓｅｒら、Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ、１３７巻：１８７～１９１頁、２０００年；Ｖｉｓｓｅｒら、Ｅｕｒ Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ、１６１巻（補遺１）：Ｓ８３～Ｓ８７頁、２００２年）を伴う、食事療法（Ｇｒｅｅｎｅら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、２９４巻：４２３～４２５頁、１９７６年；Ｃｈｅｎら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３１０巻：１７１～１７５頁、１９８４年）の厳格な遵守により、ＧＳＤ－Ｉｂ患者はほぼ正常な成長と思春期の発達を達成することができた。しかしながら、現在の治療法では、２５歳を超えるＧＳＤ－Ｉ患者の７５％で発生する肝細胞腺腫（ＨＣＡ）の長期合併症に対処することができない（Ｃｈｏｕら、Ｃｕｒｒ Ｍｏｌ Ｍｅｄ、２巻：１２１～１４３頁、２００２年；Ｃｈｏｕら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、６巻：６７６～６８８頁、２０１０年；Ｒａｋｅら、Ｅｕｒ Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ、１６１巻（補遺１）：Ｓ２０～Ｓ３４頁、２００２年；Ｆｒａｎｃｏら、Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ、２８巻：１５３～１６２頁、２００５年）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Ｃｈｏｕら、Ｃｕｒｒ Ｍｏｌ Ｍｅｄ（２００２年）２巻：１２１～１４３頁
【非特許文献2】Ｃｈｏｕら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（２０１０年）６巻：６７６～６８８頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
本明細書では、糖原病、特にＧＳＤ－Ｉｂの処置のための遺伝子治療適用に使用することができる、組換え核酸分子、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたはレンチウイルスベクターなどの組換えベクター、および組換えウイルスが開示されている。
本明細書では、ヒトグルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６ＰＣ）プロモーター／エンハンサー（ＧＰＥ）配列、またはミニマルグルコース－６－リン酸トランスポーター（Ｇ６ＰＴ）プロモーター／エンハンサー（ｍｉＧＴ）配列のいずれかに作動可能に連結した、ヒトＧ６ＰＴコード配列を含む組換え核酸分子が提供される。
本明細書では、ヒトグルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６ＰＣ）プロモーター／エンハンサー（ＧＰＥ）配列、またはミニマルグルコース－６－リン酸トランスポーター（Ｇ６ＰＴ）プロモーター／エンハンサー（ｍｉＧＴ）配列のいずれかに作動可能に連結した、ヒトＧ６ＰＴコード配列を含む組換え核酸分子が提供される。
【0006】
本明細書では、本明細書に開示される組換え核酸分子を含むベクターも提供される。一部の実施形態では、ベクターはＡＡＶベクターである。他の実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクターである。本明細書に開示される組換え核酸分子またはベクターを含む単離された宿主細胞がさらに提供される。例えば、単離された宿主細胞は、ＡＡＶまたはレンチウイルスの増殖に適した細胞であり得る。
【0007】
本明細書に開示される組換え核酸分子を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）または組換えレンチウイルスがさらに提供される。本明細書に開示されるｒＡＡＶまたは組換えレンチウイルスおよび薬学的に許容される担体を含む組成物も提供される。
【0008】
本明細書では、糖原病と診断された被験体を処置する方法も提供される。一部の実施形態では、方法は、ＧＳＤ－Ｉｂを有する被験体を選択することと、治療有効量の、本明細書に開示される組換えウイルスまたは組成物を被験体に投与することとを含む。
【0009】
本開示の前述および他の目的、特徴、および利点は、添付の図面を参照して進める以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1-1】図１Ａ～１Ｅは、６週齢の野生型およびｒＡＡＶ処置したＧ６ｐｔ－／－マウスの表現型分析を示す図である。（図１Ａ）肝臓のミクロソームのＧ６Ｐ取り込み活性。データは、野生型（＋／＋、ｎ＝８）、ＧＰＥ（ｎ＝１２）、およびｍｉＧＴ（ｎ＝１２）マウスから得られた。（図１Ｂ）血中グルコースレベル。（図１Ｃ）マウスの体重（ＢＷ）、肝臓重量（ＬＷ）、およびＬＷ／ＢＷ。データは、野生型（＋／＋、ｎ＝２４）、ＧＰＥ（ｎ＝１３）、およびｍｉＧＴ（ｎ＝１５）マウスから得られた。（図１Ｄ）白血球のパーセントとして表される血中好中球数。データは、野生型（＋／＋、ｎ＝１６）、ＧＰＥ（ｎ＝６）、およびｍｉＧＴ（ｎ＝７）マウスから得られた。（図１Ｅ）２００ｎｇ／ｍＬのホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）に応答する骨髄好中球の呼吸バースト活性および１０－６Ｍのｆ－Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ（ｆＭＬＰ）に応答するカルシウムフラックス活性。データは、野生型（＋／＋、ｎ＝３）、ＧＰＥ（ｎ＝２）、およびｍｉＧＴ（ｎ＝２）マウスから得られた。データは、平均±ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５。
【図1-2】図１Ａ～１Ｅは、６週齢の野生型およびｒＡＡＶ処置したＧ６ｐｔ－／－マウスの表現型分析を示す図である。（図１Ａ）肝臓のミクロソームのＧ６Ｐ取り込み活性。データは、野生型（＋／＋、ｎ＝８）、ＧＰＥ（ｎ＝１２）、およびｍｉＧＴ（ｎ＝１２）マウスから得られた。（図１Ｂ）血中グルコースレベル。（図１Ｃ）マウスの体重（ＢＷ）、肝臓重量（ＬＷ）、およびＬＷ／ＢＷ。データは、野生型（＋／＋、ｎ＝２４）、ＧＰＥ（ｎ＝１３）、およびｍｉＧＴ（ｎ＝１５）マウスから得られた。（図１Ｄ）白血球のパーセントとして表される血中好中球数。データは、野生型（＋／＋、ｎ＝１６）、ＧＰＥ（ｎ＝６）、およびｍｉＧＴ（ｎ＝７）マウスから得られた。（図１Ｅ）２００ｎｇ／ｍＬのホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）に応答する骨髄好中球の呼吸バースト活性および１０－６Ｍのｆ－Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ（ｆＭＬＰ）に応答するカルシウムフラックス活性。データは、野生型（＋／＋、ｎ＝３）、ＧＰＥ（ｎ＝２）、およびｍｉＧＴ（ｎ＝２）マウスから得られた。データは、平均±ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５。
【0011】
【図2】図２Ａ～２Ｃは、６０～７８週齢の野生型およびｒＡＡＶ処置したＧ６ｐｔ－／－マウスの生化学的分析を示す図である。（図２Ａ）ｒＡＡＶ処置したＧ６ｐｔ－／－マウスにおける肝臓のミクロソームのＧ６Ｐ取り込み活性が、指定された週齢（Ｗ）で示される。マウスは、遺伝子構築物とウイルス投与量に基づいて群分けされた：ＧＰＥ（ｎ＝６）、ＧＰＥ－ｌｏｗ（ｎ＝９）、およびｍｉＧＴ（ｎ＝１５）マウス。正常な肝臓のＧ６ＰＴ活性の４４～６２％（Ｇ６ＰＴ／４４－６２％、ｎ＝６）および３～２２％（Ｇ６ＰＴ／３－２２％、ｎ＝２４）を発現するマウスに関して、２つの主要な亜群が出現した。Ｇ６ＰＴ／４４－６２％マウスにはＧＰＥマウスが含まれ、Ｇ６ＰＴ／３－２２％マウス（ｎ＝２４）にはＧＰＥ－ｌｏｗおよびｍｉＧＴマウスが含まれていた。６０～７８週齢の野生型マウス（ｎ＝３０）における肝臓のミクロソームのＧ６Ｐ取り込み活性は、平均して１２３±６単位（ｐｍｏｌ／分／ｍｇ）であった。（図２Ｂ）肝臓のミクロソームのＧ６Ｐ取り込み活性およびそのベクターゲノムコピー数との関連性。（図２Ｃ）６０～７８週齢の野生型（＋／＋、ｎ＝３０）、Ｇ６ＰＴ／４４－６２％（ｎ＝６）、およびＧ６ＰＴ／３－２２％（ｎ＝２４）マウスの、肝臓のＧ６ｐｃのｍＲＮＡ発現およびミクロソームのＧ６Ｐａｓｅ－α酵素活性。データは、平均±ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５。
【0012】
【図3-1】図３Ａ～３Ｅは、６０～７８週齢の野生型およびｒＡＡＶ処置したＧ６ｐｔ－／－マウスの表現型分析および空腹時血中グルコース耐性プロファイルを示す図である。データは、野生型（＋／＋、ｎ＝３０）、Ｇ６ＰＴ／４４－６２％（ｎ＝６）、ならびにＧ６ＰＴ／３－２２％（ＧＰＥ－ｌｏｗ、ｎ＝９およびｍｉＧＴ、ｎ＝１５）マウスから分析された。（図３Ａ）血中グルコース、コレステロール、トリグリセリド、尿酸、および乳酸のレベル。（図３Ｂ）ＢＷおよび体脂肪の値。（図３Ｃ）ＬＷ／ＢＷの比。（図３Ｄ）Ｈ＆Ｅ染色肝臓切片および肝臓のグリコーゲン含有量。各プレートは個々のマウスを表し、各処置について２匹のマウスが示されている。ＧＰＥ－ｌｏｗおよびｍｉＧＴマウスにおける２つの代表的なＨ＆Ｅ染色されたＨＣＡが示されている。スケールバー＝２００μｍ。矢印はＨＣＡを示す。（図３Ｅ）グルコース耐性試験プロファイル。データは、平均±ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５。
【図3-2】図３Ａ～３Ｅは、６０～７８週齢の野生型およびｒＡＡＶ処置したＧ６ｐｔ－／－マウスの表現型分析および空腹時血中グルコース耐性プロファイルを示す図である。データは、野生型（＋／＋、ｎ＝３０）、Ｇ６ＰＴ／４４－６２％（ｎ＝６）、ならびにＧ６ＰＴ／３－２２％（ＧＰＥ－ｌｏｗ、ｎ＝９およびｍｉＧＴ、ｎ＝１５）マウスから分析された。（図３Ａ）血中グルコース、コレステロール、トリグリセリド、尿酸、および乳酸のレベル。（図３Ｂ）ＢＷおよび体脂肪の値。（図３Ｃ）ＬＷ／ＢＷの比。（図３Ｄ）Ｈ＆Ｅ染色肝臓切片および肝臓のグリコーゲン含有量。各プレートは個々のマウスを表し、各処置について２匹のマウスが示されている。ＧＰＥ－ｌｏｗおよびｍｉＧＴマウスにおける２つの代表的なＨ＆Ｅ染色されたＨＣＡが示されている。スケールバー＝２００μｍ。矢印はＨＣＡを示す。（図３Ｅ）グルコース耐性試験プロファイル。データは、平均±ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５。
【0013】
【図4-1】図４Ａ～４Ｆは、６０～７８週齢の野生型およびｒＡＡＶ処置したＧ６ｐｔ－／－マウスの表現型、グルコース耐性、インスリン耐性、および抗Ｇ６ＰＴ抗体分析を示す図である。データは、野生型（＋／＋、ｎ＝３０）、Ｇ６ＰＴ／４４－６２％（ｎ＝６）、ならびにＧ６ＰＴ／３－２２％（ＧＰＥ－ｌｏｗ、ｎ＝９およびｍｉＧＴ、ｎ＝１５）マウスから分析された。（図４Ａ）空腹時グルコース耐性プロファイルおよび２４時間空腹時の血中グルコースレベル。（図４Ｂ）肝臓のグルコースレベル。（図４Ｃ）肝臓の乳酸塩とトリグリセリドの含有量。（図４Ｄ）２４時間空腹時の血中インスリンレベル。（図４Ｅ）インスリン耐性試験プロファイル。値は、ゼロ時における各群のそれぞれのレベルのパーセントとして報告される。（図４Ｆ）ヒトＧ６ＰＴに対する抗体。Ａｄ－ｈｕｍａｎ（ｈ）Ｇ６ＰＴ感染ＣＯＳ－１細胞のミクロソームタンパク質を、単一の１２％ポリアクリルアミド－ＳＤＳゲルで電気泳動し、ＰＶＤＦメンブレンに転写した。ゲル上の個々のレーンを表すメンブレンストリップを、適切なマウス血清と共に個別にインキュベートした。マウスＧ６ＰＴも認識するポリクローナル抗ヒトＧ６ＰＴ抗体を陽性対照として使用した。レーン１、２、１３、１４：抗ｈＧ６ＰＴ抗血清、レーン３、５、７、９、１１、１５、１７、１９、２１：野生型マウスの血清試料（１：５０希釈）、またはＧ６ＰＴ／４４－６２％（レーン４、６、８）、ＧＰＥ－ｌｏｗ（レーン１０、１２、１６）、およびｍｉＧＴ（レーン１８、２０、２２）マウスの血清試料（１：５０希釈）。データは、平均±ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５。
【図4-2】図４Ａ～４Ｆは、６０～７８週齢の野生型およびｒＡＡＶ処置したＧ６ｐｔ－／－マウスの表現型、グルコース耐性、インスリン耐性、および抗Ｇ６ＰＴ抗体分析を示す図である。データは、野生型（＋／＋、ｎ＝３０）、Ｇ６ＰＴ／４４－６２％（ｎ＝６）、ならびにＧ６ＰＴ／３－２２％（ＧＰＥ－ｌｏｗ、ｎ＝９およびｍｉＧＴ、ｎ＝１５）マウスから分析された。（図４Ａ）空腹時グルコース耐性プロファイルおよび２４時間空腹時の血中グルコースレベル。（図４Ｂ）肝臓のグルコースレベル。（図４Ｃ）肝臓の乳酸塩とトリグリセリドの含有量。（図４Ｄ）２４時間空腹時の血中インスリンレベル。（図４Ｅ）インスリン耐性試験プロファイル。値は、ゼロ時における各群のそれぞれのレベルのパーセントとして報告される。（図４Ｆ）ヒトＧ６ＰＴに対する抗体。Ａｄ－ｈｕｍａｎ（ｈ）Ｇ６ＰＴ感染ＣＯＳ－１細胞のミクロソームタンパク質を、単一の１２％ポリアクリルアミド－ＳＤＳゲルで電気泳動し、ＰＶＤＦメンブレンに転写した。ゲル上の個々のレーンを表すメンブレンストリップを、適切なマウス血清と共に個別にインキュベートした。マウスＧ６ＰＴも認識するポリクローナル抗ヒトＧ６ＰＴ抗体を陽性対照として使用した。レーン１、２、１３、１４：抗ｈＧ６ＰＴ抗血清、レーン３、５、７、９、１１、１５、１７、１９、２１：野生型マウスの血清試料（１：５０希釈）、またはＧ６ＰＴ／４４－６２％（レーン４、６、８）、ＧＰＥ－ｌｏｗ（レーン１０、１２、１６）、およびｍｉＧＴ（レーン１８、２０、２２）マウスの血清試料（１：５０希釈）。データは、平均±ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５。
【0014】
【図5-1】図５Ａ～５Ｅは、６０～７８週齢の野生型およびｒＡＡＶ処置したＧ６ｐｔ－／－マウスにおける肝臓の炭水化物応答エレメント結合タンパク質（ＣｈＲＥＢＰ）シグナル伝達の分析を示す図である。定量的ＲＴ－ＰＣＲおよび肝臓のＧ６Ｐレベルについて、データは、６０～７８週齢の野生型（ｎ＝３０）、Ｇ６ＰＴ／４４－６２％（ｎ＝６）、ならびにＧ６ＰＴ／３－２２％（ＧＰＥ－ｌｏｗ、ｎ＝９およびｍｉＧＴ、ｎ＝１５）マウスに対して、平均±ＳＥＭを表す。（図５Ａ）肝臓のＧ６Ｐレベル。（図５Ｂ）リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによるＣｈＲＥＢＰのｍＲＮＡの定量化。（図５Ｃ）肝臓のＣｈＲＥＢＰ核局在化の免疫組織化学分析およびＣｈＲＥＢＰ核移行細胞の定量化。スケールバー＝５０μｍ。データは、野生型（＋／＋、ｎ＝７）、Ｇ６ＰＴ／４４－６２％（ｎ＝４）、およびＧ６ＰＴ／３－２２％（ｎ＝１５）マウスに対して、平均±ＳＥＭを表す。（図５Ｄ）リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによるＡｃｃ１、Ｆａｓｎ、およびＳｃｄ１のｍＲＮＡの定量化。（図５Ｅ）野生型（＋／＋、ｎ＝１７）、Ｇ６ＰＴ／４４－６２％（ｎ＝５）、およびＧ６ＰＴ／３－２２％（ｎ＝１２）マウスにおける、ＡＣＣ１、ＦＡＳＮ、およびＳＣＤ１、β－アクチンのウエスタンブロット解析、ならびにデンシトメトリーによるタンパク質レベルの定量化。データは、平均±ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５。
【図5-2】図５Ａ～５Ｅは、６０～７８週齢の野生型およびｒＡＡＶ処置したＧ６ｐｔ－／－マウスにおける肝臓の炭水化物応答エレメント結合タンパク質（ＣｈＲＥＢＰ）シグナル伝達の分析を示す図である。定量的ＲＴ－ＰＣＲおよび肝臓のＧ６Ｐレベルについて、データは、６０～７８週齢の野生型（ｎ＝３０）、Ｇ６ＰＴ／４４－６２％（ｎ＝６）、ならびにＧ６ＰＴ／３－２２％（ＧＰＥ－ｌｏｗ、ｎ＝９およびｍｉＧＴ、ｎ＝１５）マウスに対して、平均±ＳＥＭを表す。（図５Ａ）肝臓のＧ６Ｐレベル。（図５Ｂ）リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによるＣｈＲＥＢＰのｍＲＮＡの定量化。（図５Ｃ）肝臓のＣｈＲＥＢＰ核局在化の免疫組織化学分析およびＣｈＲＥＢＰ核移行細胞の定量化。スケールバー＝５０μｍ。データは、野生型（＋／＋、ｎ＝７）、Ｇ６ＰＴ／４４－６２％（ｎ＝４）、およびＧ６ＰＴ／３－２２％（ｎ＝１５）マウスに対して、平均±ＳＥＭを表す。（図５Ｄ）リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによるＡｃｃ１、Ｆａｓｎ、およびＳｃｄ１のｍＲＮＡの定量化。（図５Ｅ）野生型（＋／＋、ｎ＝１７）、Ｇ６ＰＴ／４４－６２％（ｎ＝５）、およびＧ６ＰＴ／３－２２％（ｎ＝１２）マウスにおける、ＡＣＣ１、ＦＡＳＮ、およびＳＣＤ１、β－アクチンのウエスタンブロット解析、ならびにデンシトメトリーによるタンパク質レベルの定量化。データは、平均±ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５。
【0015】
【図6】図６Ａ～６Ｂは、６０～７８週齢の野生型およびｒＡＡＶ処置したＧ６ｐｔ－／－マウスにおける肝臓のＡｋｔおよびＦＧＦ２１の分析を示す図である。定量的ＲＴ－ＰＣＲについて、データは、６０～７８週齢の野生型（ｎ＝３０）、Ｇ６ＰＴ／４４－６２％（ｎ＝６）、ならびにＧ６ＰＴ／３－２２％（ＧＰＥ－ｌｏｗ、ｎ＝９およびｍｉＧＴ、ｎ＝１５）マウスに対して、平均±ＳＥＭを表す。（図６Ａ）野生型（＋／＋、ｎ＝１７）、Ｇ６ＰＴ／４４－６２％（ｎ＝５）、およびＧ６ＰＴ／３－２２％（ｎ＝１２）マウスにおける、ＡｋｔのｍＲＮＡの定量化、Ａｋｔ、ｐ－Ａｋｔ－Ｓ４７３、ｐ－Ａｋｔ－Ｔ３０８、およびβ－アクチンのウエスタンブロット解析、ならびにデンシトメトリーによるタンパク質レベルの定量化。（図６Ｂ）野生型（＋／＋、ｎ＝１７）、Ｇ６ＰＴ／４４－６２％（ｎ＝５）、およびＧ６ＰＴ／３－２２％（ｎ＝１２）マウスにおける、ＦＧＦ２１のｍＲＮＡの定量化、ＦＧＦ２１、β－アクチンのウエスタンブロット解析、およびデンシトメトリーによるタンパク質レベルの定量化。データは、平均±ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５。
【0016】
【図7】図７Ａ～７Ｂは、肝臓のサーチュイン１（ＳＩＲＴ１）およびＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）のシグナル伝達の分析を示す図である。（図７Ａ）６０～７８週齢の野生型（＋／＋、ｎ＝１７）、Ｇ６ＰＴ／４４－６２％（ｎ＝５）、およびＧ６ＰＴ／３－２２％（ｎ＝１２）マウスにおける、デンシトメトリーによるタンパク質レベルの定量化を伴うＳＩＲＴ１、ｐ－ＡＭＰＫ－Ｔ１７２、ＡＭＰＫ、およびβ－アクチンのウエスタンブロット解析。（図７Ｂ）野生型（ｎ＝１７）、Ｇ６ＰＴ／４４－６２％（ｎ＝５）、およびＧ６ＰＴ／３－２２％（ｎ＝１２）マウスにおける肝臓のＮＡＤ＋レベル。データは、平均±ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５。
【0017】
【図8】図８Ａ～８Ｂは、肝臓のシグナル伝達性転写因子３（ＳＴＡＴ３）および核因子カッパＢ（ＮＦκＢ）のシグナル伝達の分析を示す図である。（図８Ａ）６０～７８週齢の野生型（＋／＋、ｎ＝３０）、Ｇ６ＰＴ／４４－６２％（ｎ＝６）、およびＧ６ＰＴ／３－２２％（ｎ＝２４）マウスにおける、ｑＰＣＲによる、Ｓｔａｔ３およびＮｆｋｂのｍＲＮＡの定量化。（図８Ｂ）野生型（＋／＋、ｎ＝１７）、Ｇ６ＰＴ／４４－６２％（ｎ＝５）、およびＧ６ＰＴ／３－２２％（ｎ＝１２）マウスにおける、デンシトメトリーによるタンパク質レベルの定量化を伴うＳＴＡＴ３－Ｙ７０５、ＳＴＡＴ３、Ａｃ－ＮＦκＢ－ｐ６５－Ｋ３１０、およびβ－アクチンのウエスタンブロット解析。データは、平均±ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５。
【0018】
【0019】
【発明を実施するための形態】
【0020】
配列表
添付の配列表に列挙されている核酸配列およびアミノ酸配列は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ． １．８２２で定義されているように、ヌクレオチド塩基の標準文字略語、およびアミノ酸の３文字コードを使用して示されている。各核酸配列の１本の鎖のみが示されているが、相補鎖は、表示された鎖への言及によって包含されていると理解されたい。配列表は、１月２２日に作成された１８．０ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出され、参照により本明細書に組み込まれる。添付の配列表：
添付の配列表に列挙されている核酸配列およびアミノ酸配列は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ． １．８２２で定義されているように、ヌクレオチド塩基の標準文字略語、およびアミノ酸の３文字コードを使用して示されている。各核酸配列の１本の鎖のみが示されているが、相補鎖は、表示された鎖への言及によって包含されていると理解されたい。配列表は、１月２２日に作成された１８．０ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出され、参照により本明細書に組み込まれる。添付の配列表：
【0021】
配列番号１は、以下の特徴を有するｐＴＲ－ＧＰＥ－ヒトＧ６ＰＴのヌクレオチド配列である：
ＩＴＲ－ヌクレオチド１７～１６３
Ｇ６ＰＣプロモーター／エンハンサー（ＧＰＥ）－ヌクレオチド１８２～３０４５
イントロン－ヌクレオチド３１８５～３３２１
Ｇ６ＰＴコード配列－ヌクレオチド３３６６～４６５５
ＩＴＲ－ヌクレオチド４８６８～５００３。
ＩＴＲ－ヌクレオチド１７～１６３
Ｇ６ＰＣプロモーター／エンハンサー（ＧＰＥ）－ヌクレオチド１８２～３０４５
イントロン－ヌクレオチド３１８５～３３２１
Ｇ６ＰＴコード配列－ヌクレオチド３３６６～４６５５
ＩＴＲ－ヌクレオチド４８６８～５００３。
【0022】
配列番号２は、以下の特徴を有するｐＴＲ－ｍｉＧＴ－ヒトＧ６ＰＴのヌクレオチド配列である：
ＩＴＲ－ヌクレオチド１７～１６３
ｍｉＧＴ－ヌクレオチド１８２～７９２
イントロン－ヌクレオチド９２４～１５６０
Ｇ６ＰＴコード配列－ヌクレオチド１１０５～１９３８
ＩＴＲ－ヌクレオチド２１７１～２３１６。
ＩＴＲ－ヌクレオチド１７～１６３
ｍｉＧＴ－ヌクレオチド１８２～７９２
イントロン－ヌクレオチド９２４～１５６０
Ｇ６ＰＴコード配列－ヌクレオチド１１０５～１９３８
ＩＴＲ－ヌクレオチド２１７１～２３１６。
【0023】
詳細な説明
Ｉ．略称
Ｉ．略称
【表1-1】
【表1-2】
【0024】
ＩＩ．用語と方法
別段の記載がない限り、技術用語は、従来の使用法に従って使用される。分子生物学の一般的な用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ Ｖ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓにより出版、１９９４年（ＩＳＢＮ ０－１９－８５４２８７－９）；Ｋｅｎｄｒｅｗら（編）、Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．により出版、１９９４年（ＩＳＢＮ ０－６３２－０２１８２－９）；およびＲｏｂｅｒｔ Ａ． Ｍｅｙｅｒｓ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．により出版、１９９５年（ＩＳＢＮ １－５６０８１－５６９－８）において見出すことができる。
本開示の様々な実施形態の検討を容易にするために、以下の特定の用語の説明が提供される：
別段の記載がない限り、技術用語は、従来の使用法に従って使用される。分子生物学の一般的な用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ Ｖ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓにより出版、１９９４年（ＩＳＢＮ ０－１９－８５４２８７－９）；Ｋｅｎｄｒｅｗら（編）、Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．により出版、１９９４年（ＩＳＢＮ ０－６３２－０２１８２－９）；およびＲｏｂｅｒｔ Ａ． Ｍｅｙｅｒｓ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．により出版、１９９５年（ＩＳＢＮ １－５６０８１－５６９－８）において見出すことができる。
本開示の様々な実施形態の検討を容易にするために、以下の特定の用語の説明が提供される：
【0025】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）：エンベロープを持たない複製欠損の小型ウイルスで、ヒトおよび他のいくつかの霊長類に感染する。ＡＡＶは、疾患を引き起こすことが知られておらず、非常に軽度の免疫応答を誘発する。ＡＡＶを利用する遺伝子治療用ベクターは、分裂細胞と静止細胞の両方に感染することができ、宿主細胞のゲノムに組み込まれることなく染色体外状態で持続し得る。これらの特徴により、ＡＡＶは遺伝子治療のための魅力的なウイルスベクターとなる。現在、ＡＡＶには１１種類の血清型（ＡＡＶ１～１１）が認められている。
【0026】
投与／投与する：任意の有効な経路により、被験体に治療薬（例えば、組換えＡＡＶ）などの薬剤を提供する、または与えること。例示的な投与経路には、注射（皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、静脈内、または腎静脈の注射など）、経口、管内、舌下、直腸、経皮、鼻腔内、膣、および吸入の経路が含まれるが、これらに限定されない。
【0027】
エンハンサー：プロモーターの活性を増加させることにより、転写率を増加させる核酸配列。
【0028】
グルコース－６－ホスファターゼ触媒サブユニット（Ｇ６ＰＣ）：グルコース－６－ホスファターゼ－α（Ｇ６Ｐａｓｅ－α）をコードするヒト第１７染色体長椀ｑ２１に位置する遺伝子。Ｇ６Ｐａｓｅ－αは、それを小胞体に固定する９つのヘリックスを有する３５７アミノ酸の疎水性タンパク質である（Ｃｈｏｕら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、６巻：６７６～６８８頁、２０１０年）。Ｇ６Ｐａｓｅ－αタンパク質は、グルコース新生とグリコーゲン分解の最終段階においてグルコース６－リン酸のグルコースとホスフェートへの加水分解を触媒し、グルコース恒常性の重要な酵素である。Ｇ６ＰＣ遺伝子の有害な変異は、肝臓と腎臓におけるグリコーゲンと脂肪の蓄積に関連する重度の空腹時低血糖症によって特徴付けられる代謝障害である、糖原病Ｉａ型（ＧＳＤ－Ｉａ）を引き起こす。
【0029】
グルコース－６－リン酸トランスポーター（Ｇ６ＰＴ）：ヒト第１１染色体長椀ｑ２３．３に位置する遺伝子。Ｇ６ＰＴ遺伝子は、グルコース恒常性を維持するために、細胞質からＥＲの内腔へのグルコース－６－リン酸の輸送を調節するタンパク質をコードする。Ｇ６ＰＴ遺伝子の変異は、糖原病Ｉｂ型に関連する。Ｇ６ＰＴはまた、溶質輸送体ファミリー３７メンバー４（ＳＬＣ３７Ａ４）としても公知である。
【0030】
糖原病（ＧＳＤ）：筋肉、肝臓、および他の組織内のグリコーゲン合成または分解のプロセスの欠陥に起因する疾患群。ＧＳＤは遺伝的または後天的のいずれかであり得る。遺伝的ＧＳＤは、これらのプロセスに関与するいずれかの先天性代謝異常によって引き起こされる。現在、１１の認定された糖原病が存在する（ＧＳＤ Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型、ＶＩＩ型、ＩＸ型、ＸＩ型、ＸＩＩ型、およびＸＩＩＩ型）。ＧＳＤ－Ｉは、２つの常染色体劣性障害、ＧＳＤ－ＩａおよびＧＳＤ－Ｉｂからなる（Ｃｈｏｕら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、６巻：６７６～６８８頁、２０１０年）。ＧＳＤ－Ｉａは、グルコース－６－ホスファターゼ－αの欠損に起因する。グルコース－６－リン酸トランスポーター（Ｇ６ＰＴ）の欠損がＧＳＤ－Ｉｂの原因である。
【0031】
糖原病Ｉｂ型（ＧＳＤ－Ｉｂ）：Ｇ６Ｐを細胞質からＥＲ内腔に移行させる遍在的に発現する小胞体（ＥＲ）タンパク質である、グルコース－６－リン酸トランスポーター（Ｇ６ＰＴ）の欠損によって引き起こされる常染色体劣性障害。ＧＳＤ－Ｉｂは、代謝障害と免疫障害の両方である。ＧＳＤ－Ｉｂ代謝異常には、空腹時低血糖症、肝腫大、腎腫大、高脂血症、高尿酸血症、乳酸血症、および成長遅延が含まれる。ＧＳＤ－Ｉｂの代謝異常を大幅に緩和するＧＳＤ－Ｉｂの食事療法は利用可能であるが、患者は肝細胞腺腫／肝細胞癌および腎疾患などのＧＳＤ－Ｉｂの長期合併症に苦しみ続ける。ＧＳＤ－Ｉｂの免疫学的異常には、好中球減少症および骨髄機能障害が含まれる。ＧＳＤ－Ｉｂ患者の好中球は、走化性、カルシウム動員、呼吸バースト、および食作用活性の機能障害を示す。結果として、細菌感染症の再発が一般的に見られ、好中球減少症を示す患者の７７％までが、特発性クローン病と見分けがつかない炎症性腸疾患（ＩＢＤ）も発症する（Ｖｉｓｓｅｒら、Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ、１３７巻：１８７～１９１頁、２０００年；Ｄｉｅｃｋｇｒａｅｆｅら、Ｅｕｒ Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ、１６１巻：Ｓ８８～Ｓ９２頁、２００２年）。本明細書で使用するとき、「ＧＳＤ－Ｉｂを処置すること」は、ＧＳＤ－ＩｂまたはＧＳＤ－Ｉｂに関連する病態の１つまたは複数の徴候または症状を改善する治療的介入を指す。したがって、「ＧＳＤ－Ｉｂを処置すること」には、低血糖症、肝腫大、腎腫大、高脂血症、高尿酸血症、乳酸血症（ｌａｃｔｉｃ ａｃａｄｅｍｉａ）、成長遅延、好中球減少症、骨髄機能不全、およびＩＢＤなどが含まれるが、これらに限定されないＧＳＤ－Ｉｂに関連する代謝または免疫の機能障害を処置することが含まれ得る。
【0032】
イントロン：タンパク質のコード情報を含有しない遺伝子内のＤＮＡのストレッチ。イントロンはメッセンジャーＲＮＡの翻訳の前に除去される。
【0033】
末端逆位配列（ＩＴＲ）：効率的な複製に必要なアデノ随伴ウイルスのゲノム内の対称的な核酸配列。ＩＴＲ配列は、ＡＡＶのＤＮＡゲノムの両端に位置する。ＩＴＲは、ウイルスＤＮＡ合成の複製起点として機能し、ＡＡＶ組込みベクターを生成するための必須のｃｉｓ成分である。
【0034】
単離された：「単離された」生体成分（核酸分子、タンパク質、ウイルス、または細胞など）は、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質、ならびに細胞などの、生物の細胞もしくは組織内の他の生体成分から、またはその成分が天然で生じる生物自体から実質的に分離または精製されている。「単離された」核酸分子およびタンパク質には、標準的な精製方法により精製されたものが含まれる。この用語はまた、宿主細胞における組換え発現により調製された核酸分子およびタンパク質、ならびに化学合成された核酸分子およびタンパク質をも包含する。
【0035】
レンチウイルス：長いインキュベーション期間および非分裂細胞に感染する能力によって特徴付けられるレトロウイルスの属。レンチウイルスは、長期にわたる安定した遺伝子発現を提供する能力、および非分裂細胞に感染する能力のために、魅力的な遺伝子治療用ベクターである。レンチウイルスの例には、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、およびウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）が含まれる。
【0036】
作動可能に連結した：第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的な関係を有して配置されるとき、第１の核酸配列は第２の核酸配列と作動可能に連結している。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結している。一般に、作動可能に連結したＤＮＡ配列は連続しており、２つのタンパク質コード領域を結合する必要がある場合、同一のリーディングフレーム内にある。
【0037】
薬学的に許容される担体：本開示において有用な薬学的に許容される担体（ビヒクル）は従来のものである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅ． Ｗ． Ｍａｒｔｉｎによる、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、第１５版（１９７５年）は、１つまたは複数の治療用化合物、分子、または薬剤の薬学的送達に適した組成物および製剤について記載している。
【0038】
一般に、担体の性質は、採用されている特定の投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は通常、ビヒクルとして水、生理食塩水、平衡塩溶液、水性デキストロース、グリセロールなどの薬学的および生理学的に許容される流体を含む注射可能な流体を含む。固体組成物（例えば、散剤、丸剤、錠剤、またはカプセル形態）の場合、従来の非毒性固体担体には、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムが含まれ得る。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤などの少量の非毒性補助物質、例えば酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含有することができる。
【0039】
疾患を予防、治療、または改善すること：疾患（ＧＳＤ－Ｉｂなど）を「予防すること」は、疾患の完全な発症を阻害することを指す。「処置すること」は、疾患または病態が発症し始めた後に、その徴候または症状を改善する治療的介入を指す。「改善すること」は、疾患の徴候または症状の数または重症度の軽減を指す。
【0040】
プロモーター：核酸（例えば、遺伝子）の転写を指示／開始するＤＮＡの領域。プロモーターには、転写開始部位の近くの必要な核酸配列が含まれる。通常、プロモーターは、それらが転写する遺伝子の近くに位置する。プロモーターはまた、転写の開始部位から数千塩基対も離れて位置することができる遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントを、必要に応じて含む。
【0041】
精製された：「精製された」という用語は絶対的な純度を必要とせず、むしろ、相対的な用語として意図されている。したがって、例えば、精製されたペプチド、タンパク質、ウイルス、または他の活性化合物は、天然で結合したタンパク質および他の汚染物質から全体または一部が単離されたものである。ある特定の実施形態では、「実質的に精製された」という用語は、細胞、細胞培地、または他の粗調製物から単離され、初期調製物の様々な成分、例えば、タンパク質、細胞残屑、および他の成分を除去するために、分画に供されたペプチド、タンパク質、ウイルス、または他の活性化合物を指す。
【0042】
組換え：組換え核酸分子は、天然に存在しない配列を有するか、組み換えなかったなら分離されていた２つの配列のセグメントの人工的な組合せにより作製された配列を有するものである。この人工的な組合せは、化学合成によって、または単離した核酸分子のセグメントの人工的な操作によって、例えば、遺伝子操作技術によって達成できる。
【0043】
同様に、組換えウイルスは、天然に存在しない配列、または異なる起源の少なくとも２つの配列の人工的な組合せによって作製された配列（ゲノム配列など）を含むウイルスである。「組換え」という用語には、天然の核酸分子、タンパク質、またはウイルスの一部の付加、置換、または欠失によってのみ改変された核酸、タンパク質、およびウイルスも含まれる。本明細書で使用するとき、「組換えＡＡＶ」は、組換え核酸分子（Ｇ６ＰＴをコードする組換え核酸分子など）がパッケージされているＡＡＶ粒子を指す。
【0044】
配列同一性：２つもしくはそれよりも多い核酸配列間、または２つもしくはそれよりも多いアミノ酸配列間の同一性または類似性は、配列間の同一性または類似性の点で表される。配列同一性は、同一性の百分率で測定することができ、百分率が高いほど、配列がより同一となる。配列類似性は、類似性の百分率で測定することができ（保存的なアミノ酸置換を考慮する）、百分率が高いほど、配列がより類似となる。核酸またはアミノ酸配列の相同体またはオルソログは、標準的な方法を使用して整列させたとき、比較的高い程度の配列同一性／配列類似性を有する。
【0045】
比較のための配列の整列方法は、当該技術分野で周知である。様々なプログラムおよび整列のアルゴリズムは以下に記載される：ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ．、２巻：４８２頁、１９８１年；ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、４８巻：４４３頁、１９７０年；ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８５巻：２４４４頁、１９８８年；ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、Ｇｅｎｅ、７３巻：２３７～４４頁、１９８８年；ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ、５巻：１５１～３頁、１９８９年；Ｃｏｒｐｅｔら、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１６巻：１０８８１～９０頁、１９８８年；Ｈｕａｎｇら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｓ． ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、８巻、１５５～６５頁、１９９２年；ならびにＰｅａｒｓｏｎら、Ｍｅｔｈ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏ．、２４巻：３０７～３１頁、１９９４年。Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２１５巻：４０３～１０頁、１９９０年は、配列整列方法と相同性計算の詳細な検討事項を提示する。
【0046】
ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２１５巻：４０３～１０頁、１９９０年）は、シーケンス分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘと関連して使用するために、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）を含むいくつかの供給源またはインターネット上で利用可能である。さらなる情報は、ＮＣＢＩのウェブサイトで見つけることができる。
【0047】
血清型：特徴的な抗原のセットによって区別される、密接に関連する微生物（ウイルスなど）の群。
【0048】
被験体：生きている多細胞脊椎生物、ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含むカテゴリー。
【0049】
合成：実験室で人工的な手段によって産生されること、例えば、合成核酸は、実験室で化学的に合成することができる。
【0050】
治療有効量：薬剤で処置されている被験体または細胞において所望の効果を達成するのに十分な特定の医薬品または治療薬（例えば、組換えＡＡＶ）の量。薬剤の有効量は、処置されている被験体または細胞、および治療用組成物の投与方法を含むがこれらに限定されないいくつかの要因に依存するだろう。
【0051】
ベクター：ベクターは、ベクターが宿主細胞内で複製および／または組み込まれる能力を乱すことなく、外来核酸の挿入を可能にする核酸分子である。ベクターは、複製起点などの宿主細胞内での複製を可能にする核酸配列を含むことができる。ベクターはまた、１つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子および他の遺伝子エレメントを含んでもよい。発現ベクターは、挿入された遺伝子または複数の遺伝子の転写と翻訳を可能にするために必要な制御配列を含有するベクターである。本明細書の一部の実施形態では、ベクターはレンチウイルスベクターまたはＡＡＶベクターである。
【0052】
別途説明されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語は全て、本開示の所属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という単数形の用語には、文脈が他を明確に示さない限り、複数の指示対象が含まれる。「ＡまたはＢを含むこと」とは、ＡもしくはＢ、またはＡおよびＢを含むことを意味する。さらに、核酸またはポリペプチドに与えられた全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量または分子質量値が近似であり、説明のために提供されていることを理解されたい。本明細書において記載されているものと類似または同等の方法および材料を本開示の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。矛盾する場合、用語の説明を含む本明細書が優位となるであろう。さらに、材料、方法、および例は、例示にすぎず、限定を意図しない。
【0053】
ＩＩＩ．導入
ＧＳＤ－Ｉｂ（Ｇ６ｐｔ－／－）マウスは、ヒトＧＳＤ－Ｉｂに特徴的な代謝機能障害と骨髄機能障害の両方を示す（Ｃｈｅｎら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ、１２巻：２５４７～２５５８頁、２００３年）。処置せずに放置すると、Ｇ６ｐｔ－／－マウスは離乳を生き延びることもめったになく、ヒト患者に見られる年少の致死性を反映する。これまで研究では、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター／ＣＭＶエンハンサーによって指示されてヒトＧ６ＰＴを発現する偽型ＡＡＶ２／８ベクターの全身投与が、Ｇ６ＰＴ導入遺伝子を主に肝臓に送達することが示されている。そうすることで、マウスのＧＳＤ－Ｉｂの代謝異常を正常化する。しかしながら、５１～７２週間生存した５匹の処置したＧ６ｐｔ－／－マウスのうち、２匹（４０％）が多発性ＨＣＡを発症し、１匹は悪性転換を経た（Ｙｉｕら、Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ、５１巻：９０９～９１７頁、２００９年）。
ＧＳＤ－Ｉｂ（Ｇ６ｐｔ－／－）マウスは、ヒトＧＳＤ－Ｉｂに特徴的な代謝機能障害と骨髄機能障害の両方を示す（Ｃｈｅｎら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ、１２巻：２５４７～２５５８頁、２００３年）。処置せずに放置すると、Ｇ６ｐｔ－／－マウスは離乳を生き延びることもめったになく、ヒト患者に見られる年少の致死性を反映する。これまで研究では、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター／ＣＭＶエンハンサーによって指示されてヒトＧ６ＰＴを発現する偽型ＡＡＶ２／８ベクターの全身投与が、Ｇ６ＰＴ導入遺伝子を主に肝臓に送達することが示されている。そうすることで、マウスのＧＳＤ－Ｉｂの代謝異常を正常化する。しかしながら、５１～７２週間生存した５匹の処置したＧ６ｐｔ－／－マウスのうち、２匹（４０％）が多発性ＨＣＡを発症し、１匹は悪性転換を経た（Ｙｉｕら、Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ、５１巻：９０９～９１７頁、２００９年）。
【0054】
研究は、導入遺伝子プロモーターの選択が、ターゲティング効率、組織特異的発現、および免疫応答または治療法に対する耐性のレベルに影響を与え得ることを示している（Ｚｉｅｇｌｅｒら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、１５巻：４９２～５００頁、２００７年；Ｆｒａｎｃｏら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、１２巻：８７６～８８４頁、２００５年）。実際に、Ｇ６Ｐａｓｅ－α酵素活性の欠損により引き起こされる関連疾患ＧＳＤ－Ｉａでは、天然の２．８ｋｂヒトＧ６ＰＣプロモーター／エンハンサー（ＧＰＥ）によって指示されるＧ６Ｐａｓｅ－α発現ｒＡＡＶベクターでは、ＨＣＡの証拠はなく、マウスＧＳＤ－Ｉａの代謝異常の持続的な修正をもたらす（Ｌｅｅら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、５６巻：１７１９～１７２９頁、２０１２年；Ｋｉｍら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ、２４巻：５１１５～５１２５頁、２０１５年）。さらに、糖新生組織特異的ＧＰＥは、ＣＢＡプロモーター／ＣＭＶエンハンサーで観察された体液性応答を誘発しない（Ｙｉｕら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、１８巻：１０７６～１０８４頁、２０１０年）。
【0055】
本明細書に開示されるベクターは、Ｇ６ＰＴコード配列の＋１ヌクレオチドの上流のヌクレオチド－６１０～－１からなる、ＧＰＥまたはミニマルＧ６ＰＴプロモーター／エンハンサー（ｍｉＧＴ）のいずれかを使用する（ＨｉｒａｉｗａおよびＣｈｏｕ、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、２０巻：４４７～４５３頁、２００１年）。本明細書に記載する研究では、それぞれヒトＧ６ＰＣおよびＧ６ＰＴプロモーター／エンハンサーによって指示されるｒＡＡＶ８ベクターである、ｒＡＡＶ－ＧＰＥ－Ｇ６ＰＴおよびｒＡＡＶ－ｍｉＧＴ－Ｇ６ＰＴを使用して、Ｇ６ｐｔ－／－マウスにおける肝臓指向性遺伝子治療の安全性と有効性を調べた。腫瘍形成を防ぐために必要な肝臓のＧ６ＰＴ活性の閾値もまた調べた。６０～７８週間の研究では、両方のベクターがＧ６ＰＴ導入遺伝子を肝臓に送達し、マウスＧＳＤ－Ｉｂの代謝異常を修正したが、ｒＡＡＶ－ＧＰＥ－Ｇ６ＰＴベクターがより高い有効性を有したことが示された。回復したＧ６ＰＴ活性のレベルを制御する用量滴定を使用して、正常な肝臓のＧ６ＰＴ活性の３～６２％を発現するｒＡＡＶ処置したＧ６ｐｔ－／－マウスは、グルコース恒常性を維持し、長い絶食に耐え、抗Ｇ６ＰＴ抗体を誘発しなかったことが示された。しかしながら、正常な肝臓のＧ６ＰＴ活性の６％未満が回復したＧ６ｐｔ－／－マウスは、肝腫瘍を発症するリスクがあった。本明細書では、野生型の活性の６２％までの肝臓のＧ６ＰＴ発現の回復が、野生型マウスで見られる加齢に伴う肥満症およびインスリン抵抗性の発症からの保護をもたらしたことも示されている。
【0056】
ＩＶ．いくつかの実施形態の概要
本明細書では、糖原病、特にＧＳＤ－Ｉｂの処置のための遺伝子治療適用に使用することができる、組換え核酸分子、ＡＡＶおよびレンチウイルスベクターなどの組換えベクター、ならびに組換えＡＡＶおよび組換えレンチウイルスなどの組換えウイルスが記載されている。
本明細書では、糖原病、特にＧＳＤ－Ｉｂの処置のための遺伝子治療適用に使用することができる、組換え核酸分子、ＡＡＶおよびレンチウイルスベクターなどの組換えベクター、ならびに組換えＡＡＶおよび組換えレンチウイルスなどの組換えウイルスが記載されている。
【0057】
本明細書では、ヒトグルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６ＰＣ）プロモーター／エンハンサー（ＧＰＥ）配列に作動可能に連結した、ヒトグルコース－６－リン酸トランスポーター（Ｇ６ＰＴ）コード配列を含む組換え核酸分子が提供される。一部の実施形態では、ヒトＧ６ＰＴコード配列は、配列番号１のヌクレオチド３３６６～４６５５に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。一部の例では、ヒトＧ６ＰＴコード配列は、配列番号１のヌクレオチド３３６６～４６５５を含むかまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＧＰＥ配列は、配列番号１のヌクレオチド１８２～３０４５に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。一部の例では、ＧＰＥ配列は、配列番号１のヌクレオチド１８２～３０４５を含むかまたはそれからなる。特定の例では、組換え核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド１８２～４６５５、または配列番号１のヌクレオチド１７～５００３に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。具体的な例では、組換え核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド１８２～４６５５、または配列番号１のヌクレオチド１７～５００３を含むかまたはそれからなる。他の特定の例では、組換え核酸分子は、配列番号１に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。具体的な非限定的な例では、組換え核酸分子は、配列番号１を含むかまたはそれからなる。
【0058】
本明細書ではまた、ミニマルＧ６ＰＴプロモーター／エンハンサー（ｍｉＧＴ）配列に作動可能に連結した、ヒトＧ６ＰＴコード配列を含む組換え核酸分子が提供される。一部の実施形態では、ヒトＧ６ＰＴコード配列は、配列番号２のヌクレオチド１１０５～１９３８に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。一部の例では、ヒトＧ６ＰＴコード配列は、配列番号２のヌクレオチド１１０５～１９３８を含むかまたはそれからなる。一部の実施形態では、ｍｉＧＴ配列は、配列番号２のヌクレオチド１８２～７９２に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。一部の例では、ｍｉＧＴ配列は、配列番号２のヌクレオチド１８２～７９２を含むかまたはそれからなる。特定の例では、組換え核酸分子は、配列番号２のヌクレオチド１８２～１９３８、または配列番号２のヌクレオチド１７～２３１６に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。具体的な例では、組換え核酸分子は、配列番号２のヌクレオチド１８２～１９３８、または配列番号２のヌクレオチド１７～２３１６を含むかまたはそれからなる。他の特定の例では、組換え核酸分子は、配列番号２に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。具体的な非限定的な例では、組換え核酸分子は、配列番号２を含むかまたはそれからなる。
【0059】
本明細書では、本明細書に開示される組換え核酸分子を含むベクターがさらに提供される。一部の実施形態では、ベクターはＡＡＶベクターである。ＡＡＶ血清型は、被験体への導入遺伝子の送達に適した任意の血清型であり得る。一部の例では、ＡＡＶベクターは血清型８のＡＡＶ（ＡＡＶ８）である。他の例では、ＡＡＶベクターは、血清型１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、または１２のベクター（すなわち、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、またはＡＡＶ１２）である。さらに他の例では、ＡＡＶベクターは、２つまたはそれよりも多いＡＡＶ血清型のハイブリッドである（例えば、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８、またはＡＡＶ２／９であるがこれらに限定されない）。ＡＡＶ血清型の選択は、遺伝子治療の標的となる細胞型（複数可）に部分的に依存する。ＧＳＤ－Ｉｂの処置では、肝臓と腎臓が主要な標的臓器である。他の実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクターである。一部の例では、レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＣＡＥＶ、またはＥＩＡＶベクターである。
【0060】
本明細書では、本明細書に開示される組換え核酸分子またはベクターを含む単離された宿主細胞も提供される。例えば、単離された宿主細胞は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）または組換えレンチウイルスの産生に適した細胞（または細胞株）であり得る。一部の例では、宿主細胞は、ＨＥＫ－２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＲＤ、ＨＴ－１０８０、Ａ５４９、ＣＯＳ－１、Ｃｏｓ－７、ＡＲＰＥ－１９、またはＭＲＣ－５細胞などの哺乳動物細胞である。
【0061】
本明細書に開示される組換え核酸分子を含むｒＡＡＶがさらに提供される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶ８および／またはｒＡＡＶ２である。しかしながら、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、もしくはＡＡＶ１２などの任意の他の適切なＡＡＶ血清型、または２つもしくはそれよりも多いＡＡＶ血清型のハイブリッド（例えば、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８、もしくはＡＡＶ２／９であるが、これらに限定されない）であってよい。本明細書に開示されるｒＡＡＶおよび薬学的に許容される担体を含む組成物も本開示により提供される。一部の実施形態では、組成物は、静脈内または筋肉内投与のために製剤化される。ｒＡＡＶの投与に適した医薬製剤は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２／０２１９５２８号に見出すことができる。
【0062】
本明細書に開示される組換え核酸分子を含む組換えレンチウイルスも提供される。一部の実施形態では、レンチウイルスは、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＣＡＥＶ、またはＥＩＡＶである。特定の例では、レンチウイルスはＨＩＶ－１である。本明細書に開示される組換えレンチウイルスおよび薬学的に許容される担体を含む組成物も本開示により提供される。一部の実施形態では、組成物は、静脈内または筋肉内投与のために製剤化される。他の実施形態では、組換えレンチウイルスは、骨髄細胞へのｅｘ ｖｉｖｏ投与などのｅｘ ｖｉｖｏ投与のために製剤化される。
【0063】
糖原病と診断された被験体を処置する方法であって、ＧＳＤ－Ｉｂを有する被験体を選択することと、治療有効量の、本明細書に開示されるｒＡＡＶもしくは組換えレンチウイルス（または、ｒＡＡＶもしくは組換えレンチウイルスを含む組成物）を被験体に投与することとを含む方法がさらに提供される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶまたは組換えレンチウイルスは静脈内投与される。他の実施形態では、組換えウイルスは逆行性腎静脈注入により投与される（例えば、Ｒｏｃｃａら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、２１巻：６１８～６２８頁、２０１４年を参照されたい）。
【0064】
一部の実施形態では、処置される被験体は、ＧＳＤ－Ｉｂに関連する１つまたは複数の代謝異常を示す。一部の例では、被験体は、空腹時低血糖症、肝腫大、腎腫大、高脂血症、高尿酸血症、乳酸血症、および／または成長遅延に罹患している。一部の実施形態では、処置される被験体は、ＧＳＤ－Ｉｂに関連する１つまたは複数の免疫異常を示す。一部の例では、被験体は好中球減少症、骨髄機能障害、再発性細菌感染症および／または炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を示す。
【0065】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、約１×１０１１～約１×１０１４ウイルス粒子（ｖｐ）／ｋｇの用量で投与される。一部の例では、ｒＡＡＶは、約１×１０１２～約１×１０１４ｖｐ／ｋｇの用量で投与される。他の例では、ｒＡＡＶは、約５×１０１２～約５×１０１３ｖｐ／ｋｇの用量で投与される。具体的な非限定的な例では、ｒＡＡＶは、少なくとも約１×１０１１ｖｐ／ｋｇ、少なくとも約５×１０１１ｖｐ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１２ｖｐ／ｋｇ、少なくとも約５×１０１２ｖｐ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１３ｖｐ／ｋｇ、少なくとも約５×１０１３ｖｐ／ｋｇ、または少なくとも約１×１０１４ｖｐ／ｋｇの用量で投与される。他の非限定的な例では、ｒＡＡＶは約５×１０１１ｖｐ／ｋｇ以下、約１×１０１２ｖｐ／ｋｇ以下、約５×１０１２ｖｐ／ｋｇ以下、約１×１０１３ｖｐ／ｋｇ以下、約５×１０１３ｖｐ／ｋｇ以下、または約１×１０１４ｖｐ／ｋｇ以下の用量で投与される。具体的な非限定的な例では、ｒＡＡＶは、約０．７×１０１３ｖｐ／ｋｇ、２×１０１３ｖｐ／ｋｇ、１．４×１０１３ｖｐ／ｋｇ、または４×１０１３ｖｐ／ｋｇの用量で投与される。ｒＡＡＶは、所望の治療結果に必要な場合、単回用量または複数回用量（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０回用量）で投与することができる。
【0066】
本明細書では、ＧＳＤ－Ｉｂと診断された被験体の骨髄機能不全などの免疫異常を処置する方法も提供される。一部の実施形態では、方法は、被験体から骨髄細胞を採取することと、ｅｘ ｖｉｖｏで骨髄細胞に本明細書に開示される組換えウイルスを形質導入することと、形質導入された骨髄細胞を被験体に注入することとを含む。一部の例では、組換えウイルスは組換えレンチウイルスである。
【0067】
Ｖ．遺伝子治療適用のための組換えＡＡＶ
ＡＡＶは、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科およびＤｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ属に属している。ＡＡＶは、直線状の一本鎖ＤＮＡゲノムをパッケージ化した、エンベロープを持たない小型ウイルスである。ＡＡＶのＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方が、同じ頻度でＡＡＶカプシドにパッケージされている。
ＡＡＶは、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科およびＤｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ属に属している。ＡＡＶは、直線状の一本鎖ＤＮＡゲノムをパッケージ化した、エンベロープを持たない小型ウイルスである。ＡＡＶのＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方が、同じ頻度でＡＡＶカプシドにパッケージされている。
【0068】
ＡＡＶゲノムは、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に隣接する２つの末端逆位配列（ＩＴＲ）によって特徴付けられる。例えば、ＡＡＶ２ゲノムでは、ＩＴＲの最初の１２５ヌクレオチドはパリンドロームであり、パリンドロームはそれ自体に折り畳まれて塩基対形成を最大化し、Ｔ字型のヘアピン構造を形成する。Ｄ配列と呼ばれるＩＴＲの他の２０塩基は、対を形成しないままである。ＩＴＲは、ＡＡＶのＤＮＡ複製に重要なｃｉｓ作用性配列であり、ＩＴＲは複製起点であり、ＤＮＡポリメラーゼによる第２の鎖の合成のプライマーとして機能する。この合成中に形成される二本鎖ＤＮＡは、複製型モノマーと呼ばれ、２回目の自己プライミング複製に使用され、複製型ダイマーを形成する。これらの二本鎖中間体は、鎖置換機序を介してプロセシングされ、パッケージングに使用される一本鎖ＤＮＡと転写に使用される二本鎖ＤＮＡをもたらす。ＩＴＲ内には、Ｒｅｐ結合エレメントと末端解離部位（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｉｔｅ、ＴＲＳ）がある。これらの特徴は、二本鎖中間体をプロセシングするために、ＡＡＶ複製中にウイルス調節タンパク質Ｒｅｐによって使用される。ＡＡＶ複製における役割に加えて、ＩＴＲはＡＡＶゲノムパッケージング、転写、非許容条件下での負の調節、および部位特異的組込みにも不可欠である（ＤａｙａおよびＢｅｒｎｓ、Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ、２１巻（４号）：５８３～５９３頁、２００８年）。
【0069】
ＡＡＶの左ＯＲＦには、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０の４つのタンパク質をコードするＲｅｐ遺伝子が含有される。右ＯＲＦには、３つのウイルスカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３）を生じるＣａｐ遺伝子が含有される。ＡＡＶカプシドには、正二十面体対称に配置された６０個のウイルスカプシドタンパク質が含有される。ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、１：１：１０のモル比で存在する（ＤａｙａおよびＢｅｒｎｓ、Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ、２１巻（４号）：５８３～５９３頁、２００８年）。
【0070】
ＡＡＶは現在、遺伝子治療で最も頻繁に使用されるウイルスの１つである。ＡＡＶはヒトや他のいくつかの霊長類種に感染するが、疾患を引き起こすことは知られておらず、非常に軽度の免疫応答を誘発する。ＡＡＶを利用する遺伝子治療用ベクターは、分裂細胞と静止細胞の両方に感染することができ、宿主細胞のゲノムに組み込まれることなく染色体外状態で持続し得る。ＡＡＶの有利な特徴のために、本開示は、本明細書に開示される組換え核酸分子および方法のためのＡＡＶの使用を企図する。
【0071】
ＡＡＶは、標的細胞に結合して進入する能力、核に入る能力、長期間核内で発現する能力、および低毒性を含む、遺伝子治療用ベクターのためにいくつかの望ましい特徴を有する。しかしながら、ＡＡＶゲノムのサイズが小さいため、組み込むことができる異種ＤＮＡのサイズが制限される。この問題を最小限に抑えるために、Ｒｅｐおよび組込み効率エレメント（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｅｌｅｍｅｎｔ、ＩＥＥ）をコードしないＡＡＶベクターが構築されている。ＩＴＲはパッケージングに必要なｃｉｓシグナルであるため、保持される（ＤａｙａおよびＢｅｒｎｓ、Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ、２１巻（４号）：５８３～５９３頁、２００８年）。
【0072】
遺伝子治療に適したｒＡＡＶを産生するための方法は当該技術分野において周知であり（例えば、米国特許出願第２０１２／０１００６０６号；同第２０１２／０１３５５１５号；同第２０１１／０２２９９７１号；および同第２０１３／００７２５４８号；ならびにＧｈｏｓｈら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、１３巻（４号）：３２１～３２９頁、２００６年を参照されたい）、本明細書に開示される組換え核酸分子および方法と共に利用することができる。
【0073】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、凍結乾燥調製物として提供され、即時または将来の使用のために、ビリオン安定化組成物に希釈されている（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１２／０２１９５２８を参照されたい）。代替的に、ｒＡＡＶは、産生直後に提供される。
【0074】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶ組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含有する。そのような賦形剤には、それ自体が組成物を投与された個体に有害な抗体の産生を誘発せず、過度の毒性なしに投与され得る任意の薬学的作用物質が含まれる。薬学的に許容される賦形剤には、水、食塩水、グリセロール、およびエタノールなどの液体が含まれるが、これらに限定されない。薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩、および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩もそれに含まれ得る。さらに、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質が、そのようなビヒクルに存在してもよい。
【0075】
一般に、賦形剤は、製剤化手順、パッケージング、保管および輸送などから、ｒＡＡＶの損失を最小限に抑えるために、ｒＡＡＶビリオンに保護効果をもたらす。分解条件からｒＡＡＶ粒子を保護するために使用される賦形剤には、界面活性剤、タンパク質、例えばオボアルブミンおよびウシ血清アルブミン、アミノ酸、例えばグリシン、多価および二価アルコール、例えば、様々な分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えば、ＰＥＧ－２００、ＰＥＧ－４００、ＰＥＧ－６００、ＰＥＧ－１０００、ＰＥＧ－１４５０、ＰＥＧ－３３５０、ＰＥＧ－６０００、ＰＥＧ－８０００、およびそれらの値の間の任意の分子量のもの、プロピレングリコール（ＰＧ）、糖アルコール、例えば炭水化物、例えばソルビトールが含まれるがこれらに限定されない。界面活性剤は、存在するとき、陰イオン性、陽イオン性、双性イオン性、または非イオン性界面活性剤であり得る。一部の実施形態では、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である。一部の例では、非イオン性界面活性剤は、ソルビタンエステル、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ＴＷＥＥＮ－２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（ＴＷＥＥＮ－４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（ＴＷＥＥＮ－６０）、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート（ＴＷＥＥＮ－６５）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ＴＷＥＥＮ－８０）、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート（ＴＷＥＥＮ－８５）である。具体的な例では、界面活性剤は、ＴＷＥＥＮ－２０および／またはＴＷＥＥＮ－８０である。
【0076】
ＶＩ．遺伝子治療適用のためのレンチウイルスベクター
レンチウイルスは、長いインキュベーション期間および非分裂細胞に感染する能力によって特徴付けられるレトロウイルスの属である。レンチウイルスは複雑なレトロウイルスであり、一般的なレトロウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖに加えて、調節機能または構造機能を持つ他の遺伝子を含有する。複雑さが増しているため、潜伏感染の過程におけるように、ウイルスはそのライフサイクルを調整することができる。レンチウイルスの例には、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＳＩＶ、ＢＩＶ、ＣＡＥＶ、およびＥＩＡＶが含まれる。
レンチウイルスは、長いインキュベーション期間および非分裂細胞に感染する能力によって特徴付けられるレトロウイルスの属である。レンチウイルスは複雑なレトロウイルスであり、一般的なレトロウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖに加えて、調節機能または構造機能を持つ他の遺伝子を含有する。複雑さが増しているため、潜伏感染の過程におけるように、ウイルスはそのライフサイクルを調整することができる。レンチウイルスの例には、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＳＩＶ、ＢＩＶ、ＣＡＥＶ、およびＥＩＡＶが含まれる。
【0077】
レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ病原性遺伝子を多重に減衰させることによって生成され、例えば、遺伝子ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、およびｎｅｆを欠失させて、レンチウイルスベクターを、ヒト用の遺伝子治療用ベクターとして安全なものとした。レンチウイルスベクターは、遺伝子治療にいくつかの利点を提供する。それらは、標的細胞の染色体に安定して組み込まれ（これは長期発現に必要である）、ウイルス遺伝子を移入せず、そのため、細胞傷害性Ｔリンパ球によって破壊される可能性がある形質導入細胞の生成の問題を回避する。さらに、レンチウイルスベクターは比較的大きなクローニング能力を持ち、ほとんどの想定される臨床応用に十分である。さらに、レンチウイルスは（他のレトロウイルスとは対照的に）非分裂細胞に形質導入することができる。これは、いくつかの組織タイプ、特に造血細胞、脳、肝臓、肺、および筋肉の遺伝子治療の文脈において非常に重要である。例えば、ＨＩＶ－１由来のベクターは、ニューロン、肝細胞、および筋細胞などの細胞への導入遺伝子の効率的なｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏの送達、組込み、および安定した発現を可能にする（Ｂｌｏｍｅｒら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、７１巻：６６４１～６６４９頁、１９９７年；Ｋａｆｒｉら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ、１７巻：３１４～３１７頁、１９９７年；Ｎａｌｄｉｎｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７２巻：２６３～２６７頁、１９９６年；Ｎａｌｄｉｎｉら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、９巻：４５７～４６３頁、１９９８年）。
【0078】
レンチウイルスゲノムおよびプロウイルスＤＮＡは、レトロウイルスに見出される３つの遺伝子：ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを有し、これらは２つの長い末端反復（ＬＴＲ）配列に隣接している。ｇａｇ遺伝子は内部構造（マトリックス、カプシド、およびヌクレオカプシド）タンパク質をコードし、ｐｏｌ遺伝子はＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）、プロテアーゼおよびインテグラーゼをコードし、ｅｎｖ遺伝子はウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする。５’および３’ＬＴＲはビリオンＲＮＡの転写およびポリアデニル化を促進するのに役立つ。ＬＴＲはウイルス複製に必要な全ての他のｃｉｓ作用配列を含有する。レンチウイルスは、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、ｎｅｆ、およびｖｐｘを含む追加の遺伝子も有する。
５’ＬＴＲには、ゲノムの逆転写（ｔＲＮＡプライマー結合部位）およびウイルスＲＮＡの粒子への効率的カプシド形成（Ｐｓｉ部位）に必要な配列が隣接している。カプシド形成（またはレトロウイルスＲＮＡの感染性ビリオンへのパッケージング）に必要な配列がウイルスゲノムから欠けている場合、ｃｉｓ欠陥はゲノムＲＮＡのカプシド形成を妨げる。しかしながら、得られた変異体は依然として全てのビリオンタンパク質の合成を指示することができる。
多数の種々のレンチウイルスベクター、パッケージング細胞株、およびレンチウイルス遺伝子治療用ベクターを生成する方法は、当技術分野で公知である（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＥｓｃｏｒｓおよびＢｒｅｃｋｐｏｔ、Ａｒｃｈ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｈｅｒ Ｅｘｐ、５８巻（２号）：１０７～１１９頁、２０１０年；Ｎａｌｄｉｎｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７２巻：２６３～２６７頁、１９９６年；Ｎａｌｄｉｎｉら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９３巻：１１３８２～１１３８８頁、１９９６年；Ｎａｌｄｉｎｉら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、９巻：４５７～４６３頁、１９９８年；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１５巻：８７１～８７５頁、１９９７年；Ｄｕｌｌら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、７２巻：８４６３～８４７１頁、１９９８年；Ｒａｍｅｚａｎｉら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、２巻：４５８～４６９頁、２０００年；ならびに米国特許第５，９９４，１３６号、同第６，０１３，５１６号、同第６，１６５，７８２号、同第６，２０７，４５５号、同第６，２１８，１８１号、同第６，２１８，１８６号、同第６，２７７，６３３号、同第７，９０１，６７１号、同第８，５５１，７７３号、同第８，７０９，７９９号、および同第８，７４８，１６９号を参照されたい）。したがって、当業者は、本明細書に開示される組換え核酸分子に適したレンチウイルスベクターを選択することができる。
５’ＬＴＲには、ゲノムの逆転写（ｔＲＮＡプライマー結合部位）およびウイルスＲＮＡの粒子への効率的カプシド形成（Ｐｓｉ部位）に必要な配列が隣接している。カプシド形成（またはレトロウイルスＲＮＡの感染性ビリオンへのパッケージング）に必要な配列がウイルスゲノムから欠けている場合、ｃｉｓ欠陥はゲノムＲＮＡのカプシド形成を妨げる。しかしながら、得られた変異体は依然として全てのビリオンタンパク質の合成を指示することができる。
多数の種々のレンチウイルスベクター、パッケージング細胞株、およびレンチウイルス遺伝子治療用ベクターを生成する方法は、当技術分野で公知である（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＥｓｃｏｒｓおよびＢｒｅｃｋｐｏｔ、Ａｒｃｈ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｈｅｒ Ｅｘｐ、５８巻（２号）：１０７～１１９頁、２０１０年；Ｎａｌｄｉｎｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７２巻：２６３～２６７頁、１９９６年；Ｎａｌｄｉｎｉら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９３巻：１１３８２～１１３８８頁、１９９６年；Ｎａｌｄｉｎｉら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、９巻：４５７～４６３頁、１９９８年；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１５巻：８７１～８７５頁、１９９７年；Ｄｕｌｌら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、７２巻：８４６３～８４７１頁、１９９８年；Ｒａｍｅｚａｎｉら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、２巻：４５８～４６９頁、２０００年；ならびに米国特許第５，９９４，１３６号、同第６，０１３，５１６号、同第６，１６５，７８２号、同第６，２０７，４５５号、同第６，２１８，１８１号、同第６，２１８，１８６号、同第６，２７７，６３３号、同第７，９０１，６７１号、同第８，５５１，７７３号、同第８，７０９，７９９号、および同第８，７４８，１６９号を参照されたい）。したがって、当業者は、本明細書に開示される組換え核酸分子に適したレンチウイルスベクターを選択することができる。
【0079】
本明細書では、本明細書に開示される核酸分子またはベクターを含む単離された細胞も提供される。例えば、単離された細胞は、パッケージング細胞株などのレンチウイルス遺伝子治療ベクターの産生に適した細胞（または細胞株）であり得る。例示的な細胞株には、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、およびＰＥＲＣ．６細胞が含まれる。
【0080】
一部の実施形態では、組換えレンチウイルス組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含有する。そのような賦形剤には、それ自体が組成物を投与された個体に有害な抗体の産生を誘発せず、過度の毒性なしに投与され得る任意の薬学的作用物質が含まれる。薬学的に許容される賦形剤には、水、食塩水、グリセロール、およびエタノールなどの液体が含まれるが、これらに限定されない。薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩、および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩もそれに含まれ得る。さらに、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質が、そのようなビヒクルに存在してもよい。
【0081】
一般に、賦形剤は、製剤化手順、パッケージング、保管および輸送などから、組換えウイルスの損失を最小限に抑えるために、ビリオンに保護効果をもたらす。分解条件からウイルス粒子を保護するために使用される賦形剤には、界面活性剤、タンパク質、例えばオボアルブミンおよびウシ血清アルブミン、アミノ酸、例えばグリシン、多価および二価アルコール、例えば、様々な分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えば、ＰＥＧ－２００、ＰＥＧ－４００、ＰＥＧ－６００、ＰＥＧ－１０００、ＰＥＧ－１４５０、ＰＥＧ－３３５０、ＰＥＧ－６０００、ＰＥＧ－８０００、およびそれらの値の間の任意の分子量のもの、プロピレングリコール（ＰＧ）、糖アルコール、例えば炭水化物、例えばソルビトールが含まれるがこれらに限定されない。界面活性剤は、存在するとき、陰イオン性、陽イオン性、双性イオン性、または非イオン性界面活性剤であり得る。一部の実施形態では、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である。一部の例では、非イオン性界面活性剤は、ソルビタンエステル、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ＴＷＥＥＮ－２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（ＴＷＥＥＮ－４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（ＴＷＥＥＮ－６０）、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート（ＴＷＥＥＮ－６５）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ＴＷＥＥＮ－８０）、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート（ＴＷＥＥＮ－８５）である。具体的な例では、界面活性剤は、ＴＷＥＥＮ－２０および／またはＴＷＥＥＮ－８０である。
【0082】
以下の実施例は、ある特定の特徴および／または実施形態を説明するために提供される。これらの実施例は、開示を、記載された特定の特徴または実施形態に限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例0083】
（実施例１：材料および方法）
この実施例は、実施例２に記載される研究のための材料および実験手順を記載する。
この実施例は、実施例２に記載される研究のための材料および実験手順を記載する。
【0084】
ｒＡＡＶベクターの構築およびＧ６ｐｔ－／－マウスの注入
２．８ｋｂのヒトＧ６ＰＣプロモーター／エンハンサーの制御下のヒトＧ６ＰＴを含有するｐＴＲ－ＧＰＥ－Ｇ６ＰＴプラスミドは、ｐＴＲ－ＧＰＥ－Ｇ６ＰＣ（Ｙｉｕら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、１８巻：１０７６～１０８４頁、２０１０年）中の５’のＳｂｆＩと３’のＮｏｔＩ部位でのヒトＧ６ＰＣを、５’のＮｓｉＩと３’のＮｏｔＩ部位でのヒトＧ６ＰＴのｃＤＮＡで置き換えることによって構築した。ヒトＧ６ＰＴミニマルプロモーター／エンハンサーの制御下のヒトＧ６ＰＴを含有するｐＴＲ－ｍｉＧＴ－Ｇ６ＰＴプラスミドは、ｐＴＲ－ＧＰＥ－Ｇ６ＰＴ中の５’のＫｐｎＩと３’のＨｉｎｄＩＩＩ部位でのＧＰＥを、５’のＫｐｎＩと３’のＨｉｎｄＩＩＩ部位でのｍｉＧＴで置き換えることによって構築した。両方のプラスミドはＤＮＡシーケンシングによって検証した。ｒＡＡＶ－ＧＰＥ－Ｇ６ＰＴおよびｒＡＡＶ－ｍｉＧＴ－Ｇ６ＰＴベクターは、それぞれ、ｐＴＲ－ＧＰＥ－Ｇ６ＰＣおよびｐＴＲ－ｍｉＧＴ－Ｇ６ＰＴから作製した。遺伝子治療では、各ベクターをＧ６ｐｔ－／－マウスに２回用量で、新生仔では側頭静脈から、４週齢では後眼窩洞（ｒｅｔｒｏ－ｏｒｂｉｔａｌ ｓｉｎｕｓ）から投与した。区別できない表現型を持つ年齢を合わせたＧ６ｐｔ＋／＋／Ｇ６ｐｔ＋／－マウスを対照として使用した（まとめて野生型または対照マウスと呼ぶ）。
２．８ｋｂのヒトＧ６ＰＣプロモーター／エンハンサーの制御下のヒトＧ６ＰＴを含有するｐＴＲ－ＧＰＥ－Ｇ６ＰＴプラスミドは、ｐＴＲ－ＧＰＥ－Ｇ６ＰＣ（Ｙｉｕら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、１８巻：１０７６～１０８４頁、２０１０年）中の５’のＳｂｆＩと３’のＮｏｔＩ部位でのヒトＧ６ＰＣを、５’のＮｓｉＩと３’のＮｏｔＩ部位でのヒトＧ６ＰＴのｃＤＮＡで置き換えることによって構築した。ヒトＧ６ＰＴミニマルプロモーター／エンハンサーの制御下のヒトＧ６ＰＴを含有するｐＴＲ－ｍｉＧＴ－Ｇ６ＰＴプラスミドは、ｐＴＲ－ＧＰＥ－Ｇ６ＰＴ中の５’のＫｐｎＩと３’のＨｉｎｄＩＩＩ部位でのＧＰＥを、５’のＫｐｎＩと３’のＨｉｎｄＩＩＩ部位でのｍｉＧＴで置き換えることによって構築した。両方のプラスミドはＤＮＡシーケンシングによって検証した。ｒＡＡＶ－ＧＰＥ－Ｇ６ＰＴおよびｒＡＡＶ－ｍｉＧＴ－Ｇ６ＰＴベクターは、それぞれ、ｐＴＲ－ＧＰＥ－Ｇ６ＰＣおよびｐＴＲ－ｍｉＧＴ－Ｇ６ＰＴから作製した。遺伝子治療では、各ベクターをＧ６ｐｔ－／－マウスに２回用量で、新生仔では側頭静脈から、４週齢では後眼窩洞（ｒｅｔｒｏ－ｏｒｂｉｔａｌ ｓｉｎｕｓ）から投与した。区別できない表現型を持つ年齢を合わせたＧ６ｐｔ＋／＋／Ｇ６ｐｔ＋／－マウスを対照として使用した（まとめて野生型または対照マウスと呼ぶ）。
【0085】
ミクロソームのＧ６Ｐ取り込みおよびホスホヒドロラーゼアッセイ
ミクロソーム調製物、Ｇ６Ｐ取り込み、およびホスホヒドロラーゼ測定は、これまでに記載された（Ｃｈｅｎら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ、１２巻：２５４７～２５５８頁、２００３年；Ｌｅｉら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ、１３巻：２０３～２０９頁、１９９６年）ように実施した。Ｇ６Ｐ取り込みアッセイでは、肝臓から分離されたミクロソームを、５０ｍＭのカコジル酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５、２５０ｍＭのスクロース、および０．２ｍＭの［Ｕ－１４Ｃ］Ｇ６Ｐ（５０μＣｉ／μｍｏｌ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有する反応混合物（１００μｌ）中、３０℃で３分間インキュベートした。ニトロセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を通して濾過することにより、反応を停止した。Ｇ６Ｐの取り込みを無効にするために０．２％デオキシコレートで透過処理したミクロソームを、陰性対照として使用した。Ｇ６ＰＴ活性の１単位は、ミクロソームタンパク質１ｍｇあたり１分あたり１ｐｍｏｌのＧ６Ｐの取り込みを表す。
ミクロソーム調製物、Ｇ６Ｐ取り込み、およびホスホヒドロラーゼ測定は、これまでに記載された（Ｃｈｅｎら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ、１２巻：２５４７～２５５８頁、２００３年；Ｌｅｉら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ、１３巻：２０３～２０９頁、１９９６年）ように実施した。Ｇ６Ｐ取り込みアッセイでは、肝臓から分離されたミクロソームを、５０ｍＭのカコジル酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５、２５０ｍＭのスクロース、および０．２ｍＭの［Ｕ－１４Ｃ］Ｇ６Ｐ（５０μＣｉ／μｍｏｌ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有する反応混合物（１００μｌ）中、３０℃で３分間インキュベートした。ニトロセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を通して濾過することにより、反応を停止した。Ｇ６Ｐの取り込みを無効にするために０．２％デオキシコレートで透過処理したミクロソームを、陰性対照として使用した。Ｇ６ＰＴ活性の１単位は、ミクロソームタンパク質１ｍｇあたり１分あたり１ｐｍｏｌのＧ６Ｐの取り込みを表す。
【0086】
ホスホヒドロラーゼアッセイでは、５０ｍＭのカコジル酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５、２ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＧ６Ｐ、および適切な量のミクロソーム調製物を含有する反応混合物（５０μｌ）を３０℃で１０分間インキュベートした。破壊されたミクロソーム膜は、４℃で２０分間、０．２％デオキシコレート中で無傷の膜をインキュベートすることにより調製した。非特異的ホスファターゼ活性は、破壊されたミクロソーム調製物をｐＨ５において３７℃で１０分間プレインキュベートして、酸に不安定なＧ６Ｐａｓｅ－αを不活性化することにより推定した。
【0087】
骨髄好中球のフローサイトメトリーおよび機能分析
ヘパリン化マウス末梢血細胞は、赤血球を枯渇させ、Ｌｙｓｉｓ／Ｆｉｘ緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で固定した。得られた白血球をＦＩＴＣコンジュゲートマウスモノクローナルＧｒ－１抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）およびＰＥコンジュゲートＣＤ１１ｂ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し、Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅ Ｍｉｎｉ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してフローサイトメトリーにより分析した。
ヘパリン化マウス末梢血細胞は、赤血球を枯渇させ、Ｌｙｓｉｓ／Ｆｉｘ緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で固定した。得られた白血球をＦＩＴＣコンジュゲートマウスモノクローナルＧｒ－１抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）およびＰＥコンジュゲートＣＤ１１ｂ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し、Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅ Ｍｉｎｉ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してフローサイトメトリーにより分析した。
【0088】
６週齢の野生型およびｒＡＡＶ処置したＧ６ｐｔ－／－マウスの大腿骨および脛骨から骨髄細胞を単離し、Ｇｒ－１マイクロビーズキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）と共にＭＡＣＳ分離カラムシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して骨髄細胞から好中球を精製した。骨髄好中球の呼吸バーストは、これまでに記載された（Ｊｕｎら、Ｂｌｏｏｄ、１１６巻：２７８３～２７９２頁、２０１０年）ように、ＬＵＭＩＭＡＸ（商標）スーパーオキシドアニオン検出キット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）およびＶｉｃｔｏｒ Ｌｉｇｈｔ １４２０発光カウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ＆Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆｏｒｋ、ＵＴ）を使用して、ルミナル（ｌｕｍｉｎａｌ）増幅化学発光によってモニターした。ＬＵＭＩＭＡＸ（商標）ＳＯＡアッセイ媒体中の好中球を、２００ｎｇ／ｍｌのホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で活性化した。１０－６Ｍのｆ－Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ（ｆＭＬＰ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に応答した骨髄好中球のカルシウムフラックスは、これまでに記載された（Ｊｕｎら、Ｂｌｏｏｄ、１１６巻：２７８３～２７９２頁、２０１０年）ように、ＦＬＩＰＥＲカルシウム３アッセイキットコンポーネントＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して測定し、３７℃に設定されたＦｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ ＩＩ蛍光計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で分析した。
【0089】
表現型分析
Ｂｒｕｋｅｒ ｍｉｎｉｓｐｅｃ ＮＭＲアナライザー（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、体組成を評価した。マウスのＨＣＡ結節の存在は、肝臓ごとに５つまたはそれよりも多い、別々の切片を使用して、肝生検試料の組織学的分析によって確認した。グルコース、コレステロール、トリグリセリド、乳酸塩、および尿酸塩の血中レベルと、グルコース、トリグリセリド、乳酸塩、およびＧ６Ｐの肝臓のレベルを、これまでに記載された（Ｌｅｅら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、５６巻：１７１９～１７２９頁、２０１２年；Ｋｉｍら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ、２４巻：５１１５～５１２５頁、２０１５年）ように、決定した。
Ｂｒｕｋｅｒ ｍｉｎｉｓｐｅｃ ＮＭＲアナライザー（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、体組成を評価した。マウスのＨＣＡ結節の存在は、肝臓ごとに５つまたはそれよりも多い、別々の切片を使用して、肝生検試料の組織学的分析によって確認した。グルコース、コレステロール、トリグリセリド、乳酸塩、および尿酸塩の血中レベルと、グルコース、トリグリセリド、乳酸塩、およびＧ６Ｐの肝臓のレベルを、これまでに記載された（Ｌｅｅら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、５６巻：１７１９～１７２９頁、２０１２年；Ｋｉｍら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ、２４巻：５１１５～５１２５頁、２０１５年）ように、決定した。
【0090】
マウスのグルコース耐性試験は、採血前の６時間の絶食、それに続く２ｍｇ／ｇ体重のグルコース溶液の腹腔内注射、および２時間の尾静脈からの繰り返し採血からなった（Ｌｅｅら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、５６巻：１７１９～１７２９頁、２０１２年）。マウスのインスリン耐性試験は、採血前の４時間の絶食、それに続く０．２５ＩＵ／ｋｇのインスリンの腹腔内注射、および１時間の尾静脈からの繰り返し採血からなった（Ｋｉｍら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ、２４巻：５１１５～５１２５頁、２０１５年）。
【0091】
定量的リアルタイムＲＴ－ＰＣＲおよびウエスタンブロット解析
ｍＲＮＡ発現は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＴａｑＭａｎプローブ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用したＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７３００リアルタイムＰＣＲシステムでのリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより定量化した。データはＲｐｌ１９のＲＮＡに対して正規化した。ウエスタンブロット画像は、ＬＩ－ＣＯＲ ＯｄｙｓｓｅｙスキャナーとＩｍａｇｅ ｓｔｕｄｉｏ ３．１ソフトウェア（Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）を使用して検出した。使用されたマウスモノクローナル抗体は、β－アクチン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）であった。使用されたウサギモノクローナル抗体は、ｐ－Ａｋｔ－Ｓ４７３およびｐ－Ａｋｔ－Ｔ３０８（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）；ならびにＦＧＦ２１（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）であった。使用されたウサギポリクローナル抗体は、ＣｈＲＥＢＰ（Ｎｏｖｕｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ）；Ａｋｔ、ＡＣＣ、およびＳＣＤ－１（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）；ならびにＦＡＳＮ（Ａｂｃａｍ）であった。ＩｍａｇｅＪ １．５１ａソフトウェア（ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を使用したデンシトメトリーによりタンパク質発現を定量化した。
ｍＲＮＡ発現は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＴａｑＭａｎプローブ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用したＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７３００リアルタイムＰＣＲシステムでのリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより定量化した。データはＲｐｌ１９のＲＮＡに対して正規化した。ウエスタンブロット画像は、ＬＩ－ＣＯＲ ＯｄｙｓｓｅｙスキャナーとＩｍａｇｅ ｓｔｕｄｉｏ ３．１ソフトウェア（Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）を使用して検出した。使用されたマウスモノクローナル抗体は、β－アクチン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）であった。使用されたウサギモノクローナル抗体は、ｐ－Ａｋｔ－Ｓ４７３およびｐ－Ａｋｔ－Ｔ３０８（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）；ならびにＦＧＦ２１（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）であった。使用されたウサギポリクローナル抗体は、ＣｈＲＥＢＰ（Ｎｏｖｕｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ）；Ａｋｔ、ＡＣＣ、およびＳＣＤ－１（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）；ならびにＦＡＳＮ（Ａｂｃａｍ）であった。ＩｍａｇｅＪ １．５１ａソフトウェア（ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を使用したデンシトメトリーによりタンパク質発現を定量化した。
【0092】
ＣｈＲＥＢＰ核局在化の分析
マウスの肝臓切片でのＣｈＲＥＢＰ核局在化は、これまでに記載された（Ｋｉｍら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ、２４巻：５１１５～５１２５頁、２０１５年）ように、実施した。マウス肝臓パラフィン切片（厚さ１０μｍ）をメタノール中の０．３％過酸化水素で処理して内因性ペルオキシダーゼをクエンチし、次いでアビジン／ビオチンブロッキングキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）でブロッキングした。ＣｈＲＥＢＰ検出のために、肝臓切片を、逐次的に、ＣｈＲＥＢＰに対するウサギ抗体とビオチン化抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とでインキュベートした。得られた複合体は、ＤＡＢ基質（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用したＡＢＣキットで検出した。切片をヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で対比染色し、４０倍／０．５０ＮＡ対物レンズ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ、Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を備えたＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐ２ ｐｌｕｓ顕微鏡を使用して視覚化した。Ｎｉｋｏｎ ＤＳ－ＦｉｌデジタルカメラとＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｆ３．０イメージングソフトウェア（株式会社ニコン、東京、日本）を使用して画像を取得した。ＣｈＲＥＢＰ陽性核を含有する、１０のランダムに選択された視野における細胞の百分率を記録した。
マウスの肝臓切片でのＣｈＲＥＢＰ核局在化は、これまでに記載された（Ｋｉｍら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ、２４巻：５１１５～５１２５頁、２０１５年）ように、実施した。マウス肝臓パラフィン切片（厚さ１０μｍ）をメタノール中の０．３％過酸化水素で処理して内因性ペルオキシダーゼをクエンチし、次いでアビジン／ビオチンブロッキングキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）でブロッキングした。ＣｈＲＥＢＰ検出のために、肝臓切片を、逐次的に、ＣｈＲＥＢＰに対するウサギ抗体とビオチン化抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とでインキュベートした。得られた複合体は、ＤＡＢ基質（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用したＡＢＣキットで検出した。切片をヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で対比染色し、４０倍／０．５０ＮＡ対物レンズ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ、Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を備えたＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐ２ ｐｌｕｓ顕微鏡を使用して視覚化した。Ｎｉｋｏｎ ＤＳ－ＦｉｌデジタルカメラとＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｆ３．０イメージングソフトウェア（株式会社ニコン、東京、日本）を使用して画像を取得した。ＣｈＲＥＢＰ陽性核を含有する、１０のランダムに選択された視野における細胞の百分率を記録した。
【0093】
統計学的分析
対応のないｔ検定は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｐｒｏｇｒａｍバージョン４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して実行した。値は、ｐ＜０．０５で統計学的に有意とみなした。
対応のないｔ検定は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｐｒｏｇｒａｍバージョン４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して実行した。値は、ｐ＜０．０５で統計学的に有意とみなした。
【0094】
（実施例２：糖原病１ｂ型に対する肝臓指向性遺伝子治療）
この実施例では、Ｇ６ＰＣまたはＧ６ＰＴプロモーター／エンハンサーのいずれかによって指示される組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを使用して、Ｇ６ｐｔ－／－マウスにおけるＧ６ＰＴ遺伝子治療の有効性を調べる研究について記載する。両方のベクターがマウスＧＳＤ－Ｉｂの肝臓のＧ６ＰＴ欠損を修正したが、Ｇ６ＰＣプロモーター／エンハンサーがより有効であった。ｒＡＡＶ構築物の用量滴定を使用した７８週間にわたる研究で、正常な肝臓のＧ６ＰＴ活性の３～６２％を発現するＧ６ｐｔ－／－マウスは、正常化された肝臓表現型を示した。正常な肝臓のＧ６ＰＴ活性の６％未満を発現する１２匹のマウスのうち２匹がＨＣＡを発症した。全ての処置したマウスは、野生型マウスよりも痩せており、インスリンに対してより感受性であった。正常な肝臓のＧ６ＰＴ活性の３～２２％を発現するマウスは、４４～６２％を発現するマウスよりも高いインスリン感受性を示した。インスリン感受性のレベルは、肝臓の炭水化物応答エレメント結合タンパク質シグナル伝達活性化の大きさと相関していた。これらの研究は、腫瘍形成を防ぐために必要な肝臓のＧ６ＰＴ活性の閾値を確立し、正常な肝臓のＧ６ＰＴ活性の３～６２％を発現するマウスがグルコース恒常性を維持し、加齢に伴う肥満症とインスリン抵抗性から保護されることを示した。
この実施例では、Ｇ６ＰＣまたはＧ６ＰＴプロモーター／エンハンサーのいずれかによって指示される組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを使用して、Ｇ６ｐｔ－／－マウスにおけるＧ６ＰＴ遺伝子治療の有効性を調べる研究について記載する。両方のベクターがマウスＧＳＤ－Ｉｂの肝臓のＧ６ＰＴ欠損を修正したが、Ｇ６ＰＣプロモーター／エンハンサーがより有効であった。ｒＡＡＶ構築物の用量滴定を使用した７８週間にわたる研究で、正常な肝臓のＧ６ＰＴ活性の３～６２％を発現するＧ６ｐｔ－／－マウスは、正常化された肝臓表現型を示した。正常な肝臓のＧ６ＰＴ活性の６％未満を発現する１２匹のマウスのうち２匹がＨＣＡを発症した。全ての処置したマウスは、野生型マウスよりも痩せており、インスリンに対してより感受性であった。正常な肝臓のＧ６ＰＴ活性の３～２２％を発現するマウスは、４４～６２％を発現するマウスよりも高いインスリン感受性を示した。インスリン感受性のレベルは、肝臓の炭水化物応答エレメント結合タンパク質シグナル伝達活性化の大きさと相関していた。これらの研究は、腫瘍形成を防ぐために必要な肝臓のＧ６ＰＴ活性の閾値を確立し、正常な肝臓のＧ６ＰＴ活性の３～６２％を発現するマウスがグルコース恒常性を維持し、加齢に伴う肥満症とインスリン抵抗性から保護されることを示した。
【0095】
ｒＡＡＶ注入はＧ６ＰＴ導入遺伝子を肝臓に送達する
ＧＳＤ－Ｉｂマウスは頻繁に低血糖発作に苦しみ、低血糖症を制御するためのグルコース療法にもかかわらず、離乳後に生存するマウスは１０％未満である（Ｃｈｅｎら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ、１２巻：２５４７～２５５８頁、２００３年）。遺伝子治療の場合、各ベクターをＧ６ｐｔ－／－マウスに新生仔に１回と４週齢に１回との２回用量で投与し、早期治療を提供することと、肝臓質量の発達的増加を可能にすることの両方を行った。最初に、２つのＧ６ＰＴ発現ベクター：２．８ｋｂのＧ６ＰＣプロモーター／エンハンサー（Ｙｉｕら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、１８巻：１０７６～１０８４頁、２０１０年；Ｌｅｅら、Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ、１１０巻：２７５～２８０頁、２０１３年）によって指示される一本鎖ベクターである、ｒＡＡＶ－ＧＰＥ－Ｇ６ＰＴと、類似の１．６２ｋｂのＧ６ＰＴプロモーター／エンハンサーによって指示される一本鎖Ｇ６ＰＴ発現ベクターである、ｒＡＡＶ－ＧＴ－Ｇ６ＰＴを調べた。ｒＡＡＶ－ＧＰＥ－Ｇ６ＰＴで観察された有効性とは対照的に（後述）、ｒＡＡＶ－ＧＴ－Ｇ６ＰＴ注入はＧ６ｐｔ－／－マウスの生存を維持できず、注入された４０匹のＧ６ｐｔ－／－マウスのうち４匹のみが１２週齢まで生存した。さらなるプロモーター解析に続いて、代替のＧ６ＰＴプロモーター、６１０ｂｐのＧ６ＰＴプロモーター／エンハンサーによって指示されるｒＡＡＶ－ｍｉＧＴ－Ｇ６ＰＴが含まれる別のＧ６ＰＴ発現ベクターを構築し、ＡＡＶウイルスの適切なパッケージングを確保するための二本鎖ベクターが得られた。このベクター構築物は、律速である、形質導入中の一本鎖ベクターゲノムから二本鎖ベクターゲノムへの変換を迂回することから生じる（Ｆｉｓｈｅｒら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、７０巻：５２０～５３２頁、１９９６年）、増大した形質導入効率からも恩恵を受けることも予想されていた（ＭｃＣａｒｔｙ、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、１６巻、１６４８～１６５６頁、２００８年）。予備実験は、ｒＡＡＶ－ＧＰＥ－Ｇ６ＰＴベクターもまた、ｒＡＡＶ－ｍｉＧＴ－Ｇ６ＰＴベクターよりも有効であることを示した。したがって、この研究では、Ｇ６ｐｔ－／－マウスに投与される２つのベクターの投与量を調整して、肝臓のＧ６ＰＴ活性の同等な回復レベルを得た。
ＧＳＤ－Ｉｂマウスは頻繁に低血糖発作に苦しみ、低血糖症を制御するためのグルコース療法にもかかわらず、離乳後に生存するマウスは１０％未満である（Ｃｈｅｎら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ、１２巻：２５４７～２５５８頁、２００３年）。遺伝子治療の場合、各ベクターをＧ６ｐｔ－／－マウスに新生仔に１回と４週齢に１回との２回用量で投与し、早期治療を提供することと、肝臓質量の発達的増加を可能にすることの両方を行った。最初に、２つのＧ６ＰＴ発現ベクター：２．８ｋｂのＧ６ＰＣプロモーター／エンハンサー（Ｙｉｕら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、１８巻：１０７６～１０８４頁、２０１０年；Ｌｅｅら、Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ、１１０巻：２７５～２８０頁、２０１３年）によって指示される一本鎖ベクターである、ｒＡＡＶ－ＧＰＥ－Ｇ６ＰＴと、類似の１．６２ｋｂのＧ６ＰＴプロモーター／エンハンサーによって指示される一本鎖Ｇ６ＰＴ発現ベクターである、ｒＡＡＶ－ＧＴ－Ｇ６ＰＴを調べた。ｒＡＡＶ－ＧＰＥ－Ｇ６ＰＴで観察された有効性とは対照的に（後述）、ｒＡＡＶ－ＧＴ－Ｇ６ＰＴ注入はＧ６ｐｔ－／－マウスの生存を維持できず、注入された４０匹のＧ６ｐｔ－／－マウスのうち４匹のみが１２週齢まで生存した。さらなるプロモーター解析に続いて、代替のＧ６ＰＴプロモーター、６１０ｂｐのＧ６ＰＴプロモーター／エンハンサーによって指示されるｒＡＡＶ－ｍｉＧＴ－Ｇ６ＰＴが含まれる別のＧ６ＰＴ発現ベクターを構築し、ＡＡＶウイルスの適切なパッケージングを確保するための二本鎖ベクターが得られた。このベクター構築物は、律速である、形質導入中の一本鎖ベクターゲノムから二本鎖ベクターゲノムへの変換を迂回することから生じる（Ｆｉｓｈｅｒら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、７０巻：５２０～５３２頁、１９９６年）、増大した形質導入効率からも恩恵を受けることも予想されていた（ＭｃＣａｒｔｙ、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、１６巻、１６４８～１６５６頁、２００８年）。予備実験は、ｒＡＡＶ－ＧＰＥ－Ｇ６ＰＴベクターもまた、ｒＡＡＶ－ｍｉＧＴ－Ｇ６ＰＴベクターよりも有効であることを示した。したがって、この研究では、Ｇ６ｐｔ－／－マウスに投与される２つのベクターの投与量を調整して、肝臓のＧ６ＰＴ活性の同等な回復レベルを得た。
【0096】
ＧＳＤ－Ｉｂマウスは若くして死亡するため、早期の治療的介入が必要である。しかしながら、形質導入された新生仔の肝臓の急速な成長中に起きるベクターの希釈のため、マウスを有効に処置するために２回の連続用量が必要であった。ｒＡＡＶ－ＧＰＥ－Ｇ６ＰＴについて、最初の（新生仔）用量は０．７×１０１３ウイルス粒子（ｖｐ）／ｋｇであり、続けて４週齢で２×１０１３ｖｐ／ｋｇの２回目の用量であった。これらのマウスは、「ＧＰＥ」マウスと呼ばれた。ｒＡＡＶ－ｍｉＧＴ－Ｇ６ＰＴについて、両方の用量は、ＧＰＥマウスのものよりも２倍高かった。これらのマウスは、「ｍｉＧＴ」マウスと呼ばれた。両方のベクターは、Ｇ６ＰＴ導入遺伝子をＧ６ｐｔ－／－マウスの肝臓に送達し、それらの生存を著しく改善した。６週齢マウスから単離された肝臓のミクロソーム（治療法あたりｎ＝１２）は、野生型の肝臓のＧ６Ｐ取り込み活性（１５２±５単位）のそれぞれ６０％（ＧＰＥ）および３０％（ｍｉＧＴ）のＧ６Ｐ取り込み活性を有し（図１Ａ）、ｒＡＡＶ－ＧＰＥ－Ｇ６ＰＴベクターが、用量（ｖｐ／ｋｇ）に基づいてｒＡＡＶ－ｍｉＧＴ－Ｇ６ＰＴベクターよりもおよそ４倍多い活性を発現することを示していた。注目すべきことに、ＧＰＥとｍｉＧＴの両方のマウスは、２４時間の絶食に耐えることができた（図１Ｂ）。ＧＰＥの２４時間絶食した血中グルコースレベルは、野生型マウスのものと比べて一貫して低かったが、統計学的に差異はなかった。同様に、ｍｉＧＴマウスの２４時間絶食した血中グルコースレベルもまた低かったが、なおも正常の範囲内であった（図１Ｂ）。ＧＰＥとｍｉＧＴマウスの両方は、野生型の対照の同腹仔よりも有意に痩せていた（図１Ｃ）。ＧＰＥマウスの肝臓重量（ＬＷ）は野生型マウスのものと同様であったが、ｍｉＧＴマウスの肝臓重量は有意に高かった（図１Ｃ）。ｒＡＡＶ処置したマウスは痩せていたため、両方のマウス群における、ＬＷの体重に対する比（ＬＷ：ＢＷ）は野生型の同腹仔のものよりも高かった（図１Ｃ）。ＧＳＤ－Ｉｂはまた、好中球減少症および好中球機能障害によっても特徴付けられる（Ｃｈｏｕら、Ｃｕｒｒ Ｍｏｌ Ｍｅｄ、２巻：１２１～１４３頁、２００２年；Ｃｈｏｕら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、６巻：６７６～６８８頁、２０１０年）。ｒＡＡＶ－ＣＢＡ／ＣＭＶ－Ｇ６ＰＴ注入が、Ｇ６ｐｔ－／－マウスの好中球減少症を２週間にわたり一時的に補正することが、これまでに示されていた（Ｙｉｕら、Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ、５１巻：９０９～９１７頁、２００９年）。この研究では、６週齢のＧＰＥおよびｍｉＧＴマウスは、好中球減少症（図１Ｄ）および好中球機能障害（図１Ｅ）を示し続けた。この知見は、ＡＡＶ２／８血清型の異なる細胞指向性を反映している可能性が最も高い。
【0097】
ｒＡＡＶ注入は長期の肝臓のＧ６ＰＴ発現を指示する
Ｇ６ｐｔ－／－マウスのグルコース恒常性を維持し、ＨＣＡの発症を防ぐために必要なｒＡＡＶベクターの投与量を７８週間にわたる研究で調べた。ｒＡＡＶ－ＧＰＥ－Ｇ６ＰＴの研究の場合、全ての新生仔マウス（ｎ＝１５）は０．７×１０１３ｖｐ／ｋｇを投与され、続けて４週齢で２×１０１３ｖｐ／ｋｇ（ＧＰＥマウス、ｎ＝６）または０．７×１０１３ｖｐ／ｋｇ（ＧＰＥ－ｌｏｗマウス、ｎ＝９）を投与された。ｒＡＡＶ－ｍｉＧＴ－Ｇ６ＰＴの研究の場合、全ての新生仔マウス（ｎ＝１５）は、１．４×１０１３ｖｐ／ｋｇを新生仔で投与され、次いで４週齢で４×１０１３ｖｐ／ｋｇを投与され、これらは、「ｍｉＧＴ」マウスと呼ばれた。肝臓のＧ６ＰＴ活性は、２４時間の絶食後に屠殺された野生型およびｒＡＡＶ処置したマウスで調べた。６０～７８週齢の野生型マウスの場合、平均的な肝臓のミクロソームのＧ６Ｐ取り込み活性は、１２３±６単位（またはｐｍｏｌ／分／ｍｇ）（１００％正常の肝臓のＧ６ＰＴ活性に相当）であった。ＧＰＥマウスは、野生型の肝臓のＧ６ＰＴ活性の４４～６２％を再構成するために滴定され、Ｇ６ＰＴ／４４－６２％マウスと命名された（図２Ａ）。ＧＰＥ－ｌｏｗおよびｍｉＧＴマウスは、野生型の肝臓のＧ６ＰＴ活性の３～２２％を有し、Ｇ６ＰＴ／３－２２％マウスと命名された（図２Ａ）。６０～７８週齢の野生型またはＧ６ＰＴ／４４－６２％マウスのいずれにもＨＣＡは存在しなかった（図２Ａ）。２４匹のＧ６ＰＴ／３－２２％マウスのうち、１２匹が７単位以下のミクロソームのＧ６Ｐ取り込み活性（または正常な肝臓のＧ６ＰＴ活性の５．７％以下）を有した。非腫瘍肝組織でそれぞれ正常な肝臓のＧ６Ｐ取り込み活性の５．７％および３．２％を有する１匹のＧＰＥ－ｌｏｗおよび１匹のｍｉＧＴマウスがＨＣＡを発症した（図２Ａ）。これは、正常な肝臓のＧ６ＰＴ活性の５．７％がＧＳＤ－ＩｂのＨＣＡ形成の閾値にあることを示唆する。肝臓のＧ６Ｐ取り込み活性の増加は、肝臓のベクターゲノムコピー数の増加と相関するように思われた（図２Ｂ）。要約すると、正常な肝臓のＧ６ＰＴ活性の６％未満が回復したｒＡＡＶ処置したＧ６ｐｔ－／－マウスは、ＨＣＡを発症するリスクがある。
Ｇ６ｐｔ－／－マウスのグルコース恒常性を維持し、ＨＣＡの発症を防ぐために必要なｒＡＡＶベクターの投与量を７８週間にわたる研究で調べた。ｒＡＡＶ－ＧＰＥ－Ｇ６ＰＴの研究の場合、全ての新生仔マウス（ｎ＝１５）は０．７×１０１３ｖｐ／ｋｇを投与され、続けて４週齢で２×１０１３ｖｐ／ｋｇ（ＧＰＥマウス、ｎ＝６）または０．７×１０１３ｖｐ／ｋｇ（ＧＰＥ－ｌｏｗマウス、ｎ＝９）を投与された。ｒＡＡＶ－ｍｉＧＴ－Ｇ６ＰＴの研究の場合、全ての新生仔マウス（ｎ＝１５）は、１．４×１０１３ｖｐ／ｋｇを新生仔で投与され、次いで４週齢で４×１０１３ｖｐ／ｋｇを投与され、これらは、「ｍｉＧＴ」マウスと呼ばれた。肝臓のＧ６ＰＴ活性は、２４時間の絶食後に屠殺された野生型およびｒＡＡＶ処置したマウスで調べた。６０～７８週齢の野生型マウスの場合、平均的な肝臓のミクロソームのＧ６Ｐ取り込み活性は、１２３±６単位（またはｐｍｏｌ／分／ｍｇ）（１００％正常の肝臓のＧ６ＰＴ活性に相当）であった。ＧＰＥマウスは、野生型の肝臓のＧ６ＰＴ活性の４４～６２％を再構成するために滴定され、Ｇ６ＰＴ／４４－６２％マウスと命名された（図２Ａ）。ＧＰＥ－ｌｏｗおよびｍｉＧＴマウスは、野生型の肝臓のＧ６ＰＴ活性の３～２２％を有し、Ｇ６ＰＴ／３－２２％マウスと命名された（図２Ａ）。６０～７８週齢の野生型またはＧ６ＰＴ／４４－６２％マウスのいずれにもＨＣＡは存在しなかった（図２Ａ）。２４匹のＧ６ＰＴ／３－２２％マウスのうち、１２匹が７単位以下のミクロソームのＧ６Ｐ取り込み活性（または正常な肝臓のＧ６ＰＴ活性の５．７％以下）を有した。非腫瘍肝組織でそれぞれ正常な肝臓のＧ６Ｐ取り込み活性の５．７％および３．２％を有する１匹のＧＰＥ－ｌｏｗおよび１匹のｍｉＧＴマウスがＨＣＡを発症した（図２Ａ）。これは、正常な肝臓のＧ６ＰＴ活性の５．７％がＧＳＤ－ＩｂのＨＣＡ形成の閾値にあることを示唆する。肝臓のＧ６Ｐ取り込み活性の増加は、肝臓のベクターゲノムコピー数の増加と相関するように思われた（図２Ｂ）。要約すると、正常な肝臓のＧ６ＰＴ活性の６％未満が回復したｒＡＡＶ処置したＧ６ｐｔ－／－マウスは、ＨＣＡを発症するリスクがある。
【0098】
絶食中、肝臓でのグルコース新生とグリコーゲン分解の最終段階で、Ｇ６ＰＴ／Ｇ６Ｐａｓｅ－α複合体によるＧ６Ｐのグルコースへの加水分解により、血中グルコース恒常性が維持される（Ｃｈｏｕら、Ｃｕｒｒ Ｍｏｌ Ｍｅｄ、２巻：１２１～１４３頁、２００２年；Ｃｈｏｕら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、６巻：６７６～６８８頁、２０１０年）。肝臓のＧ６ｐｃのｍＲＮＡのレベルは、野生型マウスと比較して、全てのｒＡＡＶ処置したＧ６ｐｔ－／－マウスで増加したことが示された（図２Ｃ）。並行して、全てのｒＡＡＶ処置したマウスにおける肝臓のＧ６Ｐａｓｅ－α酵素活性のレベルは、野生型対照のものよりも１．４倍から２．７倍増加した（図２Ｃ）。Ｇ６ＰＴを介した肝臓のミクロソームのＧ６Ｐ取り込み活性は、内因性グルコース産生の律速段階である（Ａｒｉｏｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２５１巻：６７８４～６９０頁、１９７６年）が、Ｇ６Ｐａｓｅ－α活性に共依存している（Ｌｅｉら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ、１３巻：２０３～２０９頁、１９９６年）。これまでに、本発明者らは、Ｇ６Ｐａｓｅ－αを欠損しているが野生型Ｇ６ＰＴを発現するＧＳＤ－Ｉａマウスから調製された肝臓のミクロソームが、野生型の肝臓のミクロソームと比較して著しく低いＧ６Ｐ取り込み活性を示すことを示していた（Ｌｅｉら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ、１３巻：２０３～２０９頁、１９９６年）。Ｇ６Ｐａｓｅ－α活性が遺伝子導入により回復させた場合、その表現型を逆転させることができる（Ｚｉｎｇｏｎｅら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７５巻：８２８～８３２頁、２０００年）。ｒＡＡＶ処置したＧ６ｐｔ－／－マウスでは、肝臓のＧ６Ｐａｓｅ－α活性の増加は肝臓のミクロソームのＧ６Ｐ取り込み活性と逆相関した（図２Ａと２Ｃを比較されたい）。
【0099】
ｒＡＡＶ注入はＧＳＤ－Ｉｂの代謝異常を修正する
ＧＳＤ－Ｉｂは、低血糖症、高脂血症、高尿酸血症、および乳酸血症によって特徴付けられる（Ｃｈｏｕら、Ｃｕｒｒ Ｍｏｌ Ｍｅｄ、２巻：１２１～１４３頁、２００２年；Ｃｈｏｕら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、６巻：６７６～６８８頁、２０１０年）。６０～７８週齢のｒＡＡＶ処置したＧ６ｐｔ－／－マウスはいずれも低血糖発作に苦しんでいなかった。Ｇ６ＰＴ／４４－６２％および野生型マウスの基礎血中グルコースレベルは区別できなかった（図３Ａ）。正常血糖を維持するＧ６ＰＴ／３－２２％マウスの能力にもかかわらず、それらの基礎血中グルコースレベルは野生型マウスよりも有意に低かった（図３Ａ）。遺伝子治療により、全ての処置したマウスの血清コレステロール、トリグリセリド、尿酸、および乳酸プロファイルが正常化された（図３Ａ）。処置したＧ６ｐｔ－／－マウスの平均ＢＷおよび体脂肪（図３Ｂ）値は、年齢を合わせた対照マウスのものよりも有意に低く、処置したマウスが加齢に伴う肥満症から保護されたことを示唆した。ＧＳＤ－Ｉｂはまた、肝腫大によっても特徴付けられる（Ｃｈｏｕら、Ｃｕｒｒ Ｍｏｌ Ｍｅｄ、２巻：１２１～１４３頁、２００２年；Ｃｈｏｕら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、６巻：６７６～６８８頁、２０１０年）。肝臓の体重に対する比は、Ｇ６ＰＴ／４４－６２％と野生型マウスの間で同様であったが、Ｇ６ＰＴ／３－２２％マウスは肝腫大を示し続けた（図３Ｃ）。
ＧＳＤ－Ｉｂは、低血糖症、高脂血症、高尿酸血症、および乳酸血症によって特徴付けられる（Ｃｈｏｕら、Ｃｕｒｒ Ｍｏｌ Ｍｅｄ、２巻：１２１～１４３頁、２００２年；Ｃｈｏｕら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、６巻：６７６～６８８頁、２０１０年）。６０～７８週齢のｒＡＡＶ処置したＧ６ｐｔ－／－マウスはいずれも低血糖発作に苦しんでいなかった。Ｇ６ＰＴ／４４－６２％および野生型マウスの基礎血中グルコースレベルは区別できなかった（図３Ａ）。正常血糖を維持するＧ６ＰＴ／３－２２％マウスの能力にもかかわらず、それらの基礎血中グルコースレベルは野生型マウスよりも有意に低かった（図３Ａ）。遺伝子治療により、全ての処置したマウスの血清コレステロール、トリグリセリド、尿酸、および乳酸プロファイルが正常化された（図３Ａ）。処置したＧ６ｐｔ－／－マウスの平均ＢＷおよび体脂肪（図３Ｂ）値は、年齢を合わせた対照マウスのものよりも有意に低く、処置したマウスが加齢に伴う肥満症から保護されたことを示唆した。ＧＳＤ－Ｉｂはまた、肝腫大によっても特徴付けられる（Ｃｈｏｕら、Ｃｕｒｒ Ｍｏｌ Ｍｅｄ、２巻：１２１～１４３頁、２００２年；Ｃｈｏｕら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、６巻：６７６～６８８頁、２０１０年）。肝臓の体重に対する比は、Ｇ６ＰＴ／４４－６２％と野生型マウスの間で同様であったが、Ｇ６ＰＴ／３－２２％マウスは肝腫大を示し続けた（図３Ｃ）。
【0100】
肝腫大およびＨＣＡの例は別として、肝組織の組織学は、２匹のＨＣＡ担持マウスの非腫瘍領域でさえ顕著ではなかった（図３Ｄ）。正常な肝臓のＧ６ＰＴ活性の５．７％を発現するＧＰＥ－ｌｏｗマウスで直径１ｃｍの１つのＨＣＡ結節が同定され、正常な肝臓のＧ６ＰＴ活性の３．２％を発現するｍｉＧＴマウスで直径１、０．７、０．３、および０．３ｃｍの４つのＨＣＡ結節が同定された。ＨＣＡは、ＨＣＡと非ＨＣＡ組織の両方におけるグリコーゲン貯蔵の増加により十分に限定されていた（図３Ｄ）。Ｇ６ＰＴ／４４－６２％および野生型マウスの肝臓のグリコーゲン含有量は統計学的に同様であったが、Ｇ６ＰＴ／３－２２％マウスはグリコーゲン貯蔵の著しい増加を示した（図３Ｄ）。全ての処置したマウスの血中グルコース耐性プロファイルは、野生型の同腹仔のものと区別がつかなかった（図３Ｅ）。
【0101】
Ｇ６ＰＴ／４４－６２％および野生型マウスの空腹時血中グルコースプロファイルは区別できなかった（図４Ａ）。ＧＰＥ－ｌｏｗおよびｍｉＧＴマウスの空腹時血中グルコースプロファイルは、対照マウスのものに匹敵していたが、血中グルコースレベルは一貫して低かった（図４Ａ）。要約すると、正常な肝臓のＧ６ＰＴ活性の３％を超えて発現するＧ６ｐｔ－／－マウスは、ＧＳＤ－Ｉｂに特徴的な空腹時低血糖症にもはや罹患していなかった。
【0102】
ｒＡＡＶ処置したＧ６ｐｔ－／－マウスの生化学的表現型
機能的なＧ６ＰＴを欠損するＧ６ｐｔ－／－マウスは、Ｇ６ＰＴ／Ｇ６Ｐａｓｅ－α複合体を介して内因性グルコースを産生することができない。ｒＡＡＶ処置したＧ６ｐｔ－／－マウスは全て、長期の絶食に耐えることができた。実際、２４時間の絶食後、Ｇ６ＰＴ／４４－６２％およびＧ６ＰＴ／３－２２％マウスの肝臓の遊離グルコースレベルは、それぞれ野生型の肝臓のグルコースレベル（２０４±６ｎｍｏｌｅ／ｍｇ）の７６％および５８％であった（図４Ｂ）。さらに、肝臓の乳酸塩レベルは、全てのｒＡＡＶ処置したマウスで有意に増加したが、Ｇ６ＰＴ／３－２２％マウスではより顕著であった。肝臓のトリグリセリド含有量はＧ６ＰＴ／４４－６２％と野生型マウスの間で同様であったが、Ｇ６ＰＴ／３－２２％マウスの肝臓のトリグリセリドレベルは対照と比較して有意に増加した（図４Ｃ）。
機能的なＧ６ＰＴを欠損するＧ６ｐｔ－／－マウスは、Ｇ６ＰＴ／Ｇ６Ｐａｓｅ－α複合体を介して内因性グルコースを産生することができない。ｒＡＡＶ処置したＧ６ｐｔ－／－マウスは全て、長期の絶食に耐えることができた。実際、２４時間の絶食後、Ｇ６ＰＴ／４４－６２％およびＧ６ＰＴ／３－２２％マウスの肝臓の遊離グルコースレベルは、それぞれ野生型の肝臓のグルコースレベル（２０４±６ｎｍｏｌｅ／ｍｇ）の７６％および５８％であった（図４Ｂ）。さらに、肝臓の乳酸塩レベルは、全てのｒＡＡＶ処置したマウスで有意に増加したが、Ｇ６ＰＴ／３－２２％マウスではより顕著であった。肝臓のトリグリセリド含有量はＧ６ＰＴ／４４－６２％と野生型マウスの間で同様であったが、Ｇ６ＰＴ／３－２２％マウスの肝臓のトリグリセリドレベルは対照と比較して有意に増加した（図４Ｃ）。
【0103】
６０～７８週齢の野生型マウスの空腹時血中インスリンレベルは１．１５±０．０７ｎｇ／ｍｌであった（図４Ｄ）。血中インスリンレベルは、全てのｒＡＡＶ処置したＧ６ｐｔ－／－マウスで有意に低く（図４Ｄ）、これは、老齢の野生型マウスのレベルよりも１０～２０週齢の若い成体マウスのレベルに近かった（ＦｌａｔｔおよびＢａｉｌｅｙ、Ｈｏｒｍ Ｍｅｔａｂ Ｒｅｓ、１３巻、５５６～５６０頁、１９８１年）。ｒＡＡＶ処置したＧ６ｐｔ－／－マウスは、インスリン感受性の増加を示し、０．２５ＩＵ／ｋｇの低減させたインスリン用量を選択して、血中インスリン耐性プロファイルをモニターした。腹腔内インスリン注射後、老齢の野生型の血中グルコースレベルは低下せず（図４Ｅ）、インスリン感受性の加齢に伴う低下を反映している（Ｂａｒｚｉｌａｉら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、６１巻、１３１５～１３２２頁、２０１２年）。全ての処置したマウスは、野生型マウスと比較してインスリン感受性の増加を示したが、インスリン感受性の増加はＧ６ＰＴ／３－２２％マウスでより顕著であった（図４Ｅ）。
【0104】
注入マウスでヒトＧ６ＰＴに対する体液性応答が発生するかどうかを決定するために、６０～７８週齢の野生型およびｒＡＡＶ処置したＧ６ｐｔ－／－マウスから採取した血清（１：５０希釈）を使用してウエスタンブロット解析を実施した。マウスＧ６ＰＴをも認識するポリクローナル抗ヒトＧ６ＰＴ抗体（Ｃｈｅｎら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ、１１巻：３１９９～３２０７頁、２００２年）を陽性対照として使用した（レーン１、２、１３、１４）。対照およびｒＡＡＶ処置したＧ６ｐｔ－／－マウスの血清では、Ｇ６ＰＴに対する抗体は検出されなかった（図４Ｆ）。
【0105】
肝臓のＣｈＲＥＢＰシグナル伝達の活性化
研究は、肝臓の炭水化物応答エレメント結合タンパク質（ＣｈＲＥＢＰ）を過剰発現するマウスは、対照と比較して改善されたグルコース耐性を示すことを示した（Ｂｅｎｈａｍｅｄら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、１２２巻、２１７６～２１９４頁、２０１２年）。ＣｈＲＥＢＰシグナル伝達の活性化は、ｒＡＡＶ処置したＧＳＤ－Ｉａマウスを加齢に伴うインスリン抵抗性の発症から保護する１つの経路であることが示された（Ｋｉｍら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ、２４巻：５１１５～５１２５頁、２０１５年）。ＣｈＲＥＢＰシグナル伝達は、ＣｈＲＥＢＰ核移行を促進するＧ６Ｐによって活性化され得る（Ｆｉｌｈｏｕｌａｕｄら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ、２４巻、２５７～２６８頁、２０１３年）。このｒＡＡＶ処置したＧ６ｐｔ－／－マウスの研究では、Ｇ６ＰＴ／４４－６２％およびＧ６ＰＴ／３－２２％マウスの肝臓のＧ６Ｐレベルは、それぞれ対照マウスより１．９倍および３．１倍高かった（図５Ａ）。これには、全てのｒＡＡＶ処置したＧ６ｐｔ－／－マウスにおける肝臓のＣｈｒｅｂｐ転写物の増加が伴った（図５Ｂ）。野生型マウスと比較して、肝臓の核ＣｈＲＥＢＰタンパク質含有量はＧ６ＰＴ／３－２２％マウスで著しく増加したが、肝臓の核ＣｈＲＥＢＰタンパク質含有量の増加はＧ６ＰＴ／４４－６２％マウスでは統計学的に有意ではなかった（図５Ｃ）。一貫して、ＣｈＲＥＢＰによって調節される肝臓の遺伝子（Ｂｅｎｈａｍｅｄら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、１２２巻、２１７６～２１９４頁、２０１２年；Ｆｉｌｈｏｕｌａｕｄら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ、２４巻、２５７～２６８頁、２０１３年）、アセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼアイソフォーム－１（ＡＣＣ１）、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳＮ）、およびステアロイル－ＣｏＡデサチュラーゼ１（ＳＣＤ１）のｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルは、Ｇ６ＰＴ／３－２２％マウスでは著しく増加したが、Ｇ６ＰＴ／４４－６２％マウスでは中程度および一貫性のない増加しかなかった（図５Ｄおよび５Ｅ）。
研究は、肝臓の炭水化物応答エレメント結合タンパク質（ＣｈＲＥＢＰ）を過剰発現するマウスは、対照と比較して改善されたグルコース耐性を示すことを示した（Ｂｅｎｈａｍｅｄら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、１２２巻、２１７６～２１９４頁、２０１２年）。ＣｈＲＥＢＰシグナル伝達の活性化は、ｒＡＡＶ処置したＧＳＤ－Ｉａマウスを加齢に伴うインスリン抵抗性の発症から保護する１つの経路であることが示された（Ｋｉｍら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ、２４巻：５１１５～５１２５頁、２０１５年）。ＣｈＲＥＢＰシグナル伝達は、ＣｈＲＥＢＰ核移行を促進するＧ６Ｐによって活性化され得る（Ｆｉｌｈｏｕｌａｕｄら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ、２４巻、２５７～２６８頁、２０１３年）。このｒＡＡＶ処置したＧ６ｐｔ－／－マウスの研究では、Ｇ６ＰＴ／４４－６２％およびＧ６ＰＴ／３－２２％マウスの肝臓のＧ６Ｐレベルは、それぞれ対照マウスより１．９倍および３．１倍高かった（図５Ａ）。これには、全てのｒＡＡＶ処置したＧ６ｐｔ－／－マウスにおける肝臓のＣｈｒｅｂｐ転写物の増加が伴った（図５Ｂ）。野生型マウスと比較して、肝臓の核ＣｈＲＥＢＰタンパク質含有量はＧ６ＰＴ／３－２２％マウスで著しく増加したが、肝臓の核ＣｈＲＥＢＰタンパク質含有量の増加はＧ６ＰＴ／４４－６２％マウスでは統計学的に有意ではなかった（図５Ｃ）。一貫して、ＣｈＲＥＢＰによって調節される肝臓の遺伝子（Ｂｅｎｈａｍｅｄら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、１２２巻、２１７６～２１９４頁、２０１２年；Ｆｉｌｈｏｕｌａｕｄら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ、２４巻、２５７～２６８頁、２０１３年）、アセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼアイソフォーム－１（ＡＣＣ１）、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳＮ）、およびステアロイル－ＣｏＡデサチュラーゼ１（ＳＣＤ１）のｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルは、Ｇ６ＰＴ／３－２２％マウスでは著しく増加したが、Ｇ６ＰＴ／４４－６２％マウスでは中程度および一貫性のない増加しかなかった（図５Ｄおよび５Ｅ）。
【0106】
研究は、ＳＣＤ１の増加を伴う肝臓のＣｈＲＥＢＰを過剰発現するマウスがプロテインキナーゼＢ／Ａｋｔのリン酸化および活性化と相関するインスリンシグナル伝達の改善を示すことを示した（Ｂｅｎｈａｍｅｄら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、１２２巻、２１７６～２１９４頁、２０１２年）。肝臓のＡｋｔのｍＲＮＡおよび総Ａｋｔタンパク質は、野生型およびｒＡＡＶ処置したＧ６ｐｔ－／－マウスの間で同様であった（図６Ａ）。ＣｈＲＥＢＰタンパク質の核移行の肝臓レベルの増加と並行して、Ａｋｔの活性なリン酸化型（ＤａｎｉｅｌｐｏｕｒおよびＳｏｎｇ、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ、１７巻、５９～７４頁、２００６年）、ｐ－Ａｋｔ－Ｓ４７３ならびにｐ－Ａｋｔ－Ｔ３０８の肝臓レベルが、野生型とＧ６ＰＴ／４４－６２％マウスとで統計学的に同様であった。しかしながら、Ｇ６ＰＴ／３－２２％マウスの場合、Ａｋｔタンパク質レベルは野生型のままである一方、ｐ－Ａｋｔ－Ｓ４７３およびｐ－Ａｋｔ－Ｔ３０８は２．１倍および１．５倍高かった（図６Ａ）。
【0107】
ＦＧＦ２１はエネルギー恒常性とインスリン感受性の主要な調節因子であり（ＦｉｓｈｅｒおよびＭａｒａｔｏｓ－Ｆｌｉｅｒ、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ、７８巻、２２３～２４１頁、２０１６年）、ＣｈＲＥＢＰの標的である（Ｉｉｚｕｋａら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、５８３巻、２８８２～２８８６頁、２００９年）。ＦＧＦ２１の投与により、げっ歯類と非ヒト霊長類の両方で、肝臓脂肪症を逆転し、肥満症に対抗し、インスリン抵抗性が緩和される（ＦｉｓｈｅｒおよびＭａｒａｔｏｓ－Ｆｌｉｅｒ、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ、７８巻、２２３～２４１頁、２０１６年）。再び、ＣｈＲＥＢＰタンパク質の核移行の肝臓レベルの増加と一致して、ＦＧＦ２１転写物およびタンパク質の肝臓レベルは、対照と比較してＧ６ＰＴ／３－２２％マウスでのみ顕著に高かった（図６Ｂ）。
【0108】
治療適用
これまでの遺伝子治療研究は、ＣＢＡプロモーター／ＣＭＶエンハンサーによって指示されるＧ６ＰＴ発現ｒＡＡＶ２／８ベクターが導入遺伝子を肝臓に送達し、マウスＧＳＤ－Ｉｂの代謝補正を達成したことを示した（Ｙｉｕら、Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ、５１巻：９０９～９１７頁、２００９年）。その研究は有望であったが、５２～７２週齢のＧ６ｐｔ－／－マウスで回復した肝臓のＧ６ＰＴ活性は低く、正常な肝臓のＧ６ＰＴ活性の平均およそ３％であり、５匹の形質導入マウスのうち２匹が多発性ＨＣＡを発症し、１匹が悪性転換となった（Ｙｉｕら、Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ、５１巻：９０９～９１７頁、２００９年）。肝臓疾患のこれまでの研究はまた、組織特異的プロモーター／エンハンサーエレメントの使用が発現効率を改善し、長期導入遺伝子発現を低下させる免疫応答のレベルを低下させることを示した（Ｚｉｅｇｌｅｒら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、１５巻：４９２～５００頁、２００７年；Ｆｒａｎｃｏら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、１２巻：８７６～８８４頁、２００５年）。糖新生組織特異的Ｇ６ＰＣプロモーター／エンハンサーは、マウスＧＳＤ－Ｉａでの持続的な肝臓のＧ６Ｐａｓｅ－α発現の指示においてＣＢＡ／ＣＭＡよりも顕著に有効であること、およびＣＢＡ／ＣＭＡエレメントを含有するベクターによって誘発される炎症性免疫応答が肝臓の導入遺伝子発現を低下させたことが示されている（Ｙｉｕら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、１８巻：１０７６～１０８４頁、２０１０年）。本明細書に開示される研究では、Ｇ６ＰＣプロモーター／エンハンサー（ＧＰＥ）（Ｌｅｅら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、５６巻：１７１９～１７２９頁、２０１２年；Ｋｉｍら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ、２４巻：５１１５～５１２５頁、２０１５年；Ｙｉｕら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、１８巻：１０７６～１０８４頁、２０１０年）によって指示される一本鎖ｒＡＡＶベクターである、ｒＡＡＶ－ＧＰＥ－Ｇ６ＰＴと、天然のＧ６ＰＴプロモーター／エンハンサー（ｍｉＧＴ）（ＨｉｒａｉｗａおよびＣｈｏｕ、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、２０巻：４４７～４５３頁、２００１年）によって指示される二本鎖ｒＡＡＶベクターである、ｒＡＡＶ－ｍｉＧＴ－Ｇ６ＰＴとの有効性を比較した。両方のベクターが持続的な肝臓のＧ６ＰＴ発現を指示したが、Ｇ６ＰＣプロモーター／エンハンサーを使用するベクターは、天然のＧ６ＰＴプロモーター／エンハンサーを使用するベクターよりも、用量に基づくと、導入遺伝子発現がおよそ４倍効率的であった。正常な肝臓のＧ６ＰＴ活性の３～６２％を発現するｒＡＡＶ処置したＧ６ｐｔ－／－マウスは、７８週間まで正常に成長し、正常化された代謝表現型を示し、検出可能な抗Ｇ６ＰＴ抗体を有さず、加齢に伴う肥満症とインスリン抵抗性から保護されたこともまた示された。重要なことに、本明細書に開示される研究は、正常な肝臓のＧ６ＰＴ活性の６％未満が回復したＧ６ｐｔ－／－マウスが肝腫瘍を発症するリスクがあることを示し、腫瘍形成を防ぐために必要な肝臓のＧ６ＰＴ活性の閾値が確立された。
これまでの遺伝子治療研究は、ＣＢＡプロモーター／ＣＭＶエンハンサーによって指示されるＧ６ＰＴ発現ｒＡＡＶ２／８ベクターが導入遺伝子を肝臓に送達し、マウスＧＳＤ－Ｉｂの代謝補正を達成したことを示した（Ｙｉｕら、Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ、５１巻：９０９～９１７頁、２００９年）。その研究は有望であったが、５２～７２週齢のＧ６ｐｔ－／－マウスで回復した肝臓のＧ６ＰＴ活性は低く、正常な肝臓のＧ６ＰＴ活性の平均およそ３％であり、５匹の形質導入マウスのうち２匹が多発性ＨＣＡを発症し、１匹が悪性転換となった（Ｙｉｕら、Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ、５１巻：９０９～９１７頁、２００９年）。肝臓疾患のこれまでの研究はまた、組織特異的プロモーター／エンハンサーエレメントの使用が発現効率を改善し、長期導入遺伝子発現を低下させる免疫応答のレベルを低下させることを示した（Ｚｉｅｇｌｅｒら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、１５巻：４９２～５００頁、２００７年；Ｆｒａｎｃｏら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、１２巻：８７６～８８４頁、２００５年）。糖新生組織特異的Ｇ６ＰＣプロモーター／エンハンサーは、マウスＧＳＤ－Ｉａでの持続的な肝臓のＧ６Ｐａｓｅ－α発現の指示においてＣＢＡ／ＣＭＡよりも顕著に有効であること、およびＣＢＡ／ＣＭＡエレメントを含有するベクターによって誘発される炎症性免疫応答が肝臓の導入遺伝子発現を低下させたことが示されている（Ｙｉｕら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、１８巻：１０７６～１０８４頁、２０１０年）。本明細書に開示される研究では、Ｇ６ＰＣプロモーター／エンハンサー（ＧＰＥ）（Ｌｅｅら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、５６巻：１７１９～１７２９頁、２０１２年；Ｋｉｍら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ、２４巻：５１１５～５１２５頁、２０１５年；Ｙｉｕら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、１８巻：１０７６～１０８４頁、２０１０年）によって指示される一本鎖ｒＡＡＶベクターである、ｒＡＡＶ－ＧＰＥ－Ｇ６ＰＴと、天然のＧ６ＰＴプロモーター／エンハンサー（ｍｉＧＴ）（ＨｉｒａｉｗａおよびＣｈｏｕ、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、２０巻：４４７～４５３頁、２００１年）によって指示される二本鎖ｒＡＡＶベクターである、ｒＡＡＶ－ｍｉＧＴ－Ｇ６ＰＴとの有効性を比較した。両方のベクターが持続的な肝臓のＧ６ＰＴ発現を指示したが、Ｇ６ＰＣプロモーター／エンハンサーを使用するベクターは、天然のＧ６ＰＴプロモーター／エンハンサーを使用するベクターよりも、用量に基づくと、導入遺伝子発現がおよそ４倍効率的であった。正常な肝臓のＧ６ＰＴ活性の３～６２％を発現するｒＡＡＶ処置したＧ６ｐｔ－／－マウスは、７８週間まで正常に成長し、正常化された代謝表現型を示し、検出可能な抗Ｇ６ＰＴ抗体を有さず、加齢に伴う肥満症とインスリン抵抗性から保護されたこともまた示された。重要なことに、本明細書に開示される研究は、正常な肝臓のＧ６ＰＴ活性の６％未満が回復したＧ６ｐｔ－／－マウスが肝腫瘍を発症するリスクがあることを示し、腫瘍形成を防ぐために必要な肝臓のＧ６ＰＴ活性の閾値が確立された。
【0109】
短い絶食に耐えることができないＧＳＤ－Ｉｂ患者（Ｃｈｏｕら、Ｃｕｒｒ Ｍｏｌ Ｍｅｄ、２巻：１２１～１４３頁、２００２年；Ｃｈｏｕら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、６巻：６７６～６８８頁、２０１０年）およびマウス（Ｃｈｅｎら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ、１２巻：２５４７～２５５８頁、２００３年）と対照的に、正常な肝臓のＧ６ＰＴ活性の３～６２％を発現するマウスは２４時間の絶食を維持することができた。細胞質Ｇ６Ｐの加水分解は、Ｇ６ＰＴ／Ｇ６Ｐａｓｅ－α複合体におけるＧ６ＰＴとＧ６Ｐａｓｅ－αの機能的共依存に依存する（Ｃｈｏｕら、Ｃｕｒｒ Ｍｏｌ Ｍｅｄ、２巻：１２１～１４３頁、２００２年）。Ｇ６Ｐａｓｅ－αを欠損するマウスＧＳＤ－Ｉａの遺伝子治療研究では、正常な肝臓のＧ６Ｐａｓｅ－α活性の３～６３％が再構成されるとき、肝臓のＧ６ＰＴのｍＲＮＡのレベルが野生型の２．２倍に上昇することが示された（Ｌｅｅら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、５６巻：１７１９～１７２９頁、２０１２年）。Ｇ６ＰＴ／Ｇ６Ｐａｓｅ－α複合体におけるＧ６ＰＴとＧ６Ｐａｓｅ－αの機能的共依存性と合致して、本研究は、Ｇ６ＰＴ活性が正常の肝臓の活性の４４～６２％および３～２２％までそれぞれ再構成されるとき、Ｇ６Ｐａｓｅ－αの発現が、１．４～２．８倍増加したことを実証した。処置したＧＳＤ－Ｉｂマウスは、対照の同腹仔の平均５８～７６％の肝臓の内因性グルコースを産生し、長期の絶食中にグルコース恒常性を維持することができた。したがって、Ｇ６Ｐａｓｅ－αとＧ６ＰＴの発現レベルが調節され、その結果、一方の減少が他方の増加によって相殺される機能的フィードバック機序が存在するように思われる。これは、Ｉ型ＧＳＤで発生するＧ６ＰＴ／Ｇ６Ｐａｓｅ－α複合体の全体的な減少を部分的に補完する。これは、食間血中グルコースの恒常性を維持するＧ６ＰＴ／Ｇ６Ｐａｓｅ－α複合体の２つの成分の機能的共依存性の性質の理解を広げる。
【0110】
ＧＳＤ－Ｉｂの異常な代謝の肝臓表現型は、空腹時低血糖症、肝腫大、高脂血症、高尿酸血症、および乳酸血症によって特徴付けられる（Ｃｈｏｕら、Ｃｕｒｒ Ｍｏｌ Ｍｅｄ、２巻：１２１～１４３頁、２００２年；Ｃｈｏｕら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、６巻：６７６～６８８頁、２０１０年）。Ｇ６ＰＴ／３－２２％マウスは、正常化された代謝の肝臓表現型を示したが、肝腫大を示し続けた。そのマウスでは、基礎および２４時間空腹時の血中グルコースレベルの低下と共に、肝臓のグリコーゲンおよびトリグリセリドの含有量もまた増加した。一方、Ｇ６ＰＴ／４４－６２％マウスは、正常なレベルの血中グルコースおよび代謝物、正常なレベルの肝臓グリコーゲンおよびトリグリセリド、正常なＬＷ／ＢＷ、ならびに正常なグルコース耐性および空腹時グルコース耐性プロファイルを含む、野生型マウスのものと区別できない代謝の肝臓表現型を示した。しかしながら、脂肪を獲得し、加齢と共にインスリン感受性を失う野生型マウスとは異なり、全ての処置したマウスは加齢に伴う肥満症およびインスリン抵抗性から保護されたが、３～２２％の再構成された肝臓のＧ６ＰＴ活性を持つＧＳＤ－Ｉｂマウスは、４４～６２％の再構成された肝臓のＧ６ＰＴ活性を持つマウスよりもインスリン感受性が高かった。
【0111】
研究により、肝臓のＣｈＲＥＢＰを過剰発現するマウスは、Ａｋｔの活性化と、飽和脂肪酸を有益な一不飽和脂肪酸に変換するＳＣＤ１の発現の増加により、グルコースおよび脂質代謝が改善することを示すことが示されている（Ｂｅｎｈａｍｅｄら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、１２２巻、２１７６～２１９４頁、２０１２年；ＦｌｏｗｅｒｓおよびＮｔａｍｂｉ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｌｉｐｉｄｏｌ、１９巻：２４８～２５６頁、２００８年）。さらに、インスリン感受性を改善し、肝臓脂肪症を改善し、エネルギー消費を増大させるＦＧＦ２１（ＦｉｓｈｅｒおよびＭａｒａｔｏｓ－Ｆｌｉｅｒ、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ、７８巻、２２３～２４１頁、２０１６年）は、ＣｈＲＥＢＰの標的である（Ｉｉｚｕｋａら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、５８３巻、２８８２～２８８６頁、２００９年）。本明細書に開示される研究は、６０～７８週齢のＧ６ＰＴ／３－２２％マウスで肝臓のＣｈＲＥＢＰシグナル伝達が、ＦＧＦ２１、ＳＣＤ１、活性なｐ－Ａｋｔ－Ｓ４７３およびｐ－Ａｋｔ－Ｔ３０８のレベルの増加と共に、ＣｈＲＥＢＰタンパク質の核移行の増加によって明らかであるように、活性化されていることを実証し、Ｇ６ＰＴ／３－２２％マウスの改善された代謝表現型の根底にある１つの機序を提示する。ＧＳＤ－Ｉｂは常染色体劣性障害である。したがって、Ｇ６ＰＴ／４４－６２％マウスが野生型マウスのものと区別できない代謝の肝臓表現型を示したことは驚くことではない。実際、Ｇ６ＰＴ／４４－６２％および野生型マウスでのＣｈＲＥＢＰシグナル伝達は、同様であるように見えた。これを支持して、核移行ＣｈＲＥＢＰタンパク質、活性化形態のＡｋｔ、ならびにＳＣＤ１およびＦＧＦ２１のレベルを含むＣｈＲＥＢＰシグナル伝達経路の成分は、Ｇ６ＰＴ／４４－６２％と野生型マウスの間で統計学的に同様であった。これは、より低いレベルの正常な肝臓Ｇ６ＰＴ活性を発現するＧ６ＰＴ／３－２２％マウスと比較して、これらのマウスのインスリン感受性の低下を説明している可能性がある。Ｇ６ＰＴ／３－２２％マウスがＧ６ＰＴ／４４－６２％マウスよりも改善された代謝表現型を示したという事実は、肝臓のＧ６ＰＴ活性の準最適レベルが有益である可能性があることを示唆する。これは、ＧＳＤ－Ｉａマウスで見られる同様の観察を反映する（Ａｎｔｉｎｏｚｚｉら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｎｕｔｒ、１９巻、：５１１～５４４頁、１９９９年；Ｃｌｏｒｅら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、４９巻：９６９～９７４頁、２０００年）。これは、ＧＳＤ－Ｉａマウスで見られた同様の観察を反映しており（Ｋｉｍら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ、２４巻：５１１５～５１２５頁、２０１５年）、肝臓のＧ６Ｐａｓｅ－α／Ｇ６ＰＴ活性の増加と糖尿病の関係（Ａｎｔｉｎｏｚｚｉら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｎｕｔｒ、１９巻：５１１～５４４頁、１９９９年；Ｃｌｏｒｅら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、４９巻：９６９～９７４頁、２０００年）を考えると、おそらく驚くことではない。
【0112】
要約すると、本明細書に開示される研究は、正常な肝臓のＧ６ＰＴ活性の少なくとも３％を発現するよう滴定されたＧ６ＰＴ遺伝子治療を受けたＧ６ｐｔ－／－マウスがグルコース恒常性を維持し、加齢に伴うインスリン抵抗性と肥満症から保護されることを実証した。さらに、処置したマウスの有益な代謝表現型の原因である根底にある１つの機序が、肝臓のＣｈＲＥＢＰシグナル伝達経路の活性化から生じることが示される。さらに、正常な肝臓のＧ６ＰＴ活性の６％未満を保有する肝細胞は、悪性転換のリスクがある。これらの研究は、ＧＳＤ－Ｉｂの代謝性疾患の肝臓指向性遺伝子治療において顕著な治療上の利益をもたらすために、正常なＧ６ＰＴ活性の完全な回復は必要とされないことを示している。
【0113】
（実施例３：Ｇ６ＰＴトランスジェニックマウスのシグナル伝達経路の分析）
ｒＡＡＶ８を介したＧ６ＰＴ導入遺伝子の発現は、主に肝臓を標的とし、腎臓と腸では導入遺伝子の発現はほとんど観察されなかった。その結果、処置したマウスの腎臓および腸はＧ６ｐｔ－ｎｕｌｌのままであり、内因性グルコース産生ができないままであった。腎臓および腸からの内因性グルコース産生がない場合、Ｇ６ＰＴ／３－２２％マウスは、対照の同腹仔のものの平均５８％の低下した肝臓のグルコースレベルを産生し（図４Ｂ）、Ｇ６ＰＴ／３－２２％マウスは、カロリー制限下で生存する動物を模倣することを示唆する。
ｒＡＡＶ８を介したＧ６ＰＴ導入遺伝子の発現は、主に肝臓を標的とし、腎臓と腸では導入遺伝子の発現はほとんど観察されなかった。その結果、処置したマウスの腎臓および腸はＧ６ｐｔ－ｎｕｌｌのままであり、内因性グルコース産生ができないままであった。腎臓および腸からの内因性グルコース産生がない場合、Ｇ６ＰＴ／３－２２％マウスは、対照の同腹仔のものの平均５８％の低下した肝臓のグルコースレベルを産生し（図４Ｂ）、Ｇ６ＰＴ／３－２２％マウスは、カロリー制限下で生存する動物を模倣することを示唆する。
【0114】
ＡＭＰＫ（ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ）およびＳＩＲＴ１（サーチュイン１）は、エネルギー代謝の調節に関与するカロリー制限の２つの調節因子である（Ｒｕｄｅｒｍａｎら、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ、２９８巻：Ｅ７５１～７６０頁、２０１０年）。ＡＭＰＫは、がんを促進する転写因子であるシグナル伝達性転写因子３（ＳＴＡＴ３）のインターロイキン６を介したリン酸化および活性化を阻害する（ＨｅおよびＫａｒｉｎ、Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ、２１巻：１５９～１６８頁、２０１１年）。ＳＩＲＴ１は、転写レベルで、または細胞ＮＡＤ＋レベルの増加に応答して活性化し得るＮＡＤ＋依存性デアセチラーゼである（Ｍｏｕｃｈｉｒｏｕｄら、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、４８巻：３９７～４０８頁、２０１３年）。ＳＩＲＴ１は、核因子κＢ（ＮＦκＢ）のｐ６５サブユニットの残基Ｋ３１０を脱アセチル化し、炎症を調節し、炎症関連がんを促進する転写因子であるＮＦκＢの活性を抑制する（ＨｅおよびＫａｒｉｎ、Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ、２１巻：１５９～１６８頁、２０１１年）。ＳＴＡＴ３とＮＦκＢによるシグナル伝達は高度に相互接続されている（Ｙｕら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ、９巻：７９８～８０９頁、２００９年）。それらは一緒になって、腫瘍の増殖、生存、および浸潤に関与する多くの遺伝子を調節する。したがって、Ｇ６ＰＴ／４４－６２％およびＧ６ＰＴ／３－２２％マウスでのＡＭＰＫ、ＳＩＲＴ１、ＳＴＡＴ３、およびＮＦκＢによるシグナル伝達を調べた。
【0115】
野生型マウスと比較して、総ＡＭＰＫおよび活性なｐ－ＡＭＰＫ－Ｔ１７２の肝臓レベルはＧ６ＰＴ／３－２２％マウスで顕著に増加したが、Ｇ６ＰＴ／４４－６２％マウスではそうではなく（図７Ａ）、ＡＭＰＫシグナル伝達の活性化は、主にＧ６ＰＴ／３－２２％マウスで起こることを示唆した。ＳＩＲＴ１タンパク質レベルは野生型とｒＡＡＶ処置したマウスの間で同様であったが（図７Ａ）、肝臓のＮＡＤ＋濃度はＧ６ＰＴ／３－２２％マウスで顕著に増加し、Ｇ６ＰＴ／４４－６２％マウスでは程度が低かった（図７Ｂ）。この結果は、肝臓のＳＩＲＴ１活性が主にＧ６ＰＴ／３－２２％マウスで活性化されることを示唆する。まとめると、ＡＭＰＫ／ＳＩＲＴ１シグナル伝達が活性化されたＧ６ＰＴ／３－２２％マウスは、野生型とＧ６ＰＴ／４４－６２％マウスの両方と比較して、健康な加齢表現型を示した。
【0116】
次いで、ＳＴＡＴ３およびＮＦκＢの発現を調べた。両方とも、ＡＭＰＫ－ＳＩＲＴ１シグナル伝達経路によって調節される。ＳＴＡＴ３およびＮＦκＢ－ｐ６５の転写物とＳＴＡＴ３タンパク質の肝臓レベルは、ｒＡＡＶ処置したＧ６ｐｔ－／－と野生型マウスの間で統計学的に差異がなかった（図８Ａ～８Ｂ）。活性なｐ－ＳＴＡＴ３－Ｙ７０５および活性なａｃ－ＮＦκＢ－ｐ６５－Ｋ３１０の肝臓レベルはＧ６ＰＴ／４４－６２％と野生型マウスの間で同様であったが、ｐ－ＳＴＡＴ３－Ｙ７０５およびａｃ－ＮＦκＢ－ｐ６５－Ｋ３１０の肝臓レベルは、Ｇ６ＰＴ／４４－６２％と野生型マウスの両方と比較して、Ｇ６ＰＴ／３－２２％マウスで有意に低下していた（図８Ｂ）。これは、Ｇ６ＰＴ／３－２２％マウスが、炎症性および腫瘍形成応答が低下した肝臓環境も示したことを示唆している。
【0117】
ＳＩＲＴ１は腫瘍転移の負の調節因子でもあり、腫瘍抑制因子であるＥ－カドヘリンの発現を増加させ、Ｎ－カドヘリンを含む間葉系マーカーの発現を減少させる（Ｃｈｅｎら、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ、１３巻：２５４頁、２０１４年）。Ｅ－カドヘリンは、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を調節する細胞間接着分子であり、Ｅ－カドヘリン発現の減少は転移の開始をもたらす（Ｃａｎｅｌら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ、１２６巻（２部）：３９３～４０１頁、２０１３年）。野生型マウスと比較して、Ｅ－カドヘリンの肝臓タンパク質レベルは、主にＧ６ＰＴ／３－２２％マウスで著しく増加した（図９）。Ｇ６ＰＴ／３－２２％の肝臓は、Ｎ－カドヘリンとＥＭＴ誘導転写因子Ｓｌｕｇのタンパク質レベルの減少を示した（図９）。同様に、Ｇ６ＰＴ／３－２２％マウスは、腫瘍形成応答が低下した肝臓環境を示した。
【0118】
Ｇ６ＰＴ／３－２２％マウスの改善された代謝表現型は、さらなるカロリー制限応答遺伝子が誘導されている可能性があることを示唆する。カロリー制限応答遺伝子であるＦＧＦ２１は、Ｇ６ＰＴ／３－２２％マウスで増加していることが示された（図６Ｂ）。別のカロリー制限応答遺伝子である腫瘍抑制因子β－クロトーのｍＲＮＡとタンパク質の肝臓レベル（Ｙｅら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、８巻：ｅ５５６１５頁、２０１３年）は、対照と比較して、Ｇ６ＰＴ／３－２２％マウスにおいて顕著に増加した（図１０Ａ～１０Ｂ）。
【0119】
要約すると、Ｇ６ＰＴ／３－２２％マウスの改善された代謝表現型の原因である根底になる機序は、肝臓のＡＭＰＫ／ＳＩＲＴ１およびＦＧＦ２１／β－クロトーのシグナル伝達経路の活性化、ならびに肝臓のＳＴＡＴ３／ＮＦκＢを介した炎症性および腫瘍形成のシグナル伝達経路の下方制御と相関する。マウスでの肝臓のＧ６ＰＴ活性の中程度の低下が、炎症性および腫瘍形成応答が低下した肝臓環境をもたらすという知見は、肝臓腫瘍形成におけるＧ６ＰＴの役割の生物学および病因への洞察をもたらす。
【0120】
本開示の原理が適用され得る多くの可能な実施形態を考慮して、例示された実施形態は本開示の単なる好ましい例であり、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではないことが認識されるべきである。むしろ、本開示の範囲は以下の特許請求の範囲によって規定される。したがって、本発明者らはこれらの特許請求の範囲の範囲と趣旨の範囲内に入る全てのものを特許請求する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
配列番号１のヌクレオチド１８２～４６５５、または配列番号２のヌクレオチド１８２～１９３８を含む、組換え核酸分子。
(項目２)
配列番号１のヌクレオチド１７～５００３を含む、項目１に記載の組換え核酸分子。
(項目３)
配列番号１を含む、項目１または項目２に記載の組換え核酸分子。
(項目４)
配列番号２のヌクレオチド１７～２３１６を含む、項目１に記載の組換え核酸分子。
(項目５)
配列番号２を含む、項目１または項目４に記載の組換え核酸分子。
(項目６)
項目１～５のいずれか１項に記載の組換え核酸分子を含むベクター。
(項目７)
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、項目６に記載のベクター。
(項目８)
前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）のベクターまたは血清型９（ＡＡＶ９）のベクターである、項目７に記載のベクター。
(項目９)
項目１～５のいずれか１項に記載の組換え核酸分子を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）。
(項目１０)
ｒＡＡＶ８またはｒＡＡＶ９である、項目９に記載のｒＡＡＶ。
(項目１１)
レンチウイルスベクターである、項目６に記載のベクター。
(項目１２)
前記レンチウイルスベクターが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ベクターである、項目１１に記載のベクター。
(項目１３)
項目１～５のいずれか１項に記載の組換え核酸分子を含む組換えレンチウイルス。
(項目１４)
組換えＨＩＶである、項目１３に記載の組換えレンチウイルス。
(項目１５)
薬学的に許容される担体中に、項目９もしくは項目１０に記載のｒＡＡＶ、または項目１３もしくは項目１４に記載の組換えレンチウイルスを含む組成物。
(項目１６)
静脈内投与のために製剤化された、項目１５に記載の組成物。
(項目１７)
糖原病と診断された被験体を処置する方法であって、糖原病Ｉｂ型（ＧＳＤ－Ｉｂ）を有する被験体を選択することと、治療有効量の、項目９もしくは項目１０に記載のｒＡＡＶ、項目１３もしくは項目１４に記載の組換えレンチウイルス、または項目１５もしくは項目１６に記載の組成物を前記被験体に投与することとを含む、方法。
(項目１８)
前記ｒＡＡＶが、静脈内投与される、項目１７に記載の方法。
(項目１９)
１用量あたり約１×１０１１～約１×１０１４ウイルス粒子（ｖｐ）／ｋｇの前記ｒＡＡＶを投与することを含む、項目１７または項目１８に記載の方法。
(項目２０)
１用量あたり約１×１０１２～約１×１０１４ｖｐ／ｋｇの前記ｒＡＡＶを投与することを含む、項目１９に記載の方法。
(項目２１)
１用量あたり約５×１０１２～約５×１０１３ｖｐ／ｋｇの前記ｒＡＡＶを投与することを含む、項目２０に記載の方法。
(項目２２)
前記ｒＡＡＶを投与することが、単回用量のｒＡＡＶの投与を含む、項目１７～２１のいずれか１項に記載の方法。
(項目２３)
前記ｒＡＡＶを投与することが、複数回用量のｒＡＡＶの投与を含む、項目１７～２１のいずれか１項に記載の方法。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
配列番号１のヌクレオチド１８２～４６５５、または配列番号２のヌクレオチド１８２～１９３８を含む、組換え核酸分子。
(項目２)
配列番号１のヌクレオチド１７～５００３を含む、項目１に記載の組換え核酸分子。
(項目３)
配列番号１を含む、項目１または項目２に記載の組換え核酸分子。
(項目４)
配列番号２のヌクレオチド１７～２３１６を含む、項目１に記載の組換え核酸分子。
(項目５)
配列番号２を含む、項目１または項目４に記載の組換え核酸分子。
(項目６)
項目１～５のいずれか１項に記載の組換え核酸分子を含むベクター。
(項目７)
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、項目６に記載のベクター。
(項目８)
前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）のベクターまたは血清型９（ＡＡＶ９）のベクターである、項目７に記載のベクター。
(項目９)
項目１～５のいずれか１項に記載の組換え核酸分子を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）。
(項目１０)
ｒＡＡＶ８またはｒＡＡＶ９である、項目９に記載のｒＡＡＶ。
(項目１１)
レンチウイルスベクターである、項目６に記載のベクター。
(項目１２)
前記レンチウイルスベクターが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ベクターである、項目１１に記載のベクター。
(項目１３)
項目１～５のいずれか１項に記載の組換え核酸分子を含む組換えレンチウイルス。
(項目１４)
組換えＨＩＶである、項目１３に記載の組換えレンチウイルス。
(項目１５)
薬学的に許容される担体中に、項目９もしくは項目１０に記載のｒＡＡＶ、または項目１３もしくは項目１４に記載の組換えレンチウイルスを含む組成物。
(項目１６)
静脈内投与のために製剤化された、項目１５に記載の組成物。
(項目１７)
糖原病と診断された被験体を処置する方法であって、糖原病Ｉｂ型（ＧＳＤ－Ｉｂ）を有する被験体を選択することと、治療有効量の、項目９もしくは項目１０に記載のｒＡＡＶ、項目１３もしくは項目１４に記載の組換えレンチウイルス、または項目１５もしくは項目１６に記載の組成物を前記被験体に投与することとを含む、方法。
(項目１８)
前記ｒＡＡＶが、静脈内投与される、項目１７に記載の方法。
(項目１９)
１用量あたり約１×１０１１～約１×１０１４ウイルス粒子（ｖｐ）／ｋｇの前記ｒＡＡＶを投与することを含む、項目１７または項目１８に記載の方法。
(項目２０)
１用量あたり約１×１０１２～約１×１０１４ｖｐ／ｋｇの前記ｒＡＡＶを投与することを含む、項目１９に記載の方法。
(項目２１)
１用量あたり約５×１０１２～約５×１０１３ｖｐ／ｋｇの前記ｒＡＡＶを投与することを含む、項目２０に記載の方法。
(項目２２)
前記ｒＡＡＶを投与することが、単回用量のｒＡＡＶの投与を含む、項目１７～２１のいずれか１項に記載の方法。
(項目２３)
前記ｒＡＡＶを投与することが、複数回用量のｒＡＡＶの投与を含む、項目１７～２１のいずれか１項に記載の方法。
【図1-1】
【図1-2】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図5-1】
【図5-2】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】
【外国語明細書】