特開 2023-27418 糖化ヘモグロビンの電気化学測定方法およびそれに用いる測定キット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023027418

(43)【公開日】2023-03-02

(54)【発明の名称】糖化ヘモグロビンの電気化学測定方法およびそれに用いる測定キット

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/72 20060101AFI20230222BHJP

   G01N 33/573 20060101ALI20230222BHJP

   G01N 33/48 20060101ALI20230222BHJP

   G01N 33/483 20060101ALI20230222BHJP

   G01N 27/416 20060101ALI20230222BHJP

   G01N 27/327 20060101ALI20230222BHJP

【ＦＩ】

G01N33/72 A

G01N33/573 A

G01N33/48 B

G01N33/483 F

G01N27/416 336G

G01N27/327 353R

【審査請求】未請求

【請求項の数】4

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2019224694

(22)【出願日】2019-12-12

(71)【出願人】

【識別番号】314005768

【氏名又は名称】ＰＨＣホールディングス株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100132263

【弁理士】

【氏名又は名称】江間 晴彦

(72)【発明者】

【氏名】松田 香織

(72)【発明者】

【氏名】羽田 圭吾

(72)【発明者】

【氏名】遠藤 太志

【テーマコード（参考）】

2G045

【Ｆターム（参考）】

2G045AA02

2G045AA13

2G045AA25

2G045BA13

2G045BB25

2G045BB29

2G045CA02

2G045CA25

2G045DA31

2G045DA45

2G045DA48

2G045DA51

2G045FB03

2G045FB06

2G045GC20

2G045HA09

2G045HA14

2G045JA07

(57)【要約】

【課題】総ヘモグロビン濃度の検出感度を向上させることで高精度の測定が可能な、糖化ヘモグロビンの電気化学測定方法およびそれに用いる糖化ヘモグロビン用測定キットを提供すること。
【解決手段】本発明の糖化ヘモグロビンの電気化学測定方法は、界面活性剤と、以下の一般式（Ｉ）で示されるピラゾール化合物と、タンパク質分解酵素とを含む前処理液を用意する工程と、血液検体に前記前処理液を接触させて被検液を調製する工程と、前記被検液に含まれる糖化ヘモグロビン濃度と総ヘモグロビン濃度を測定する工程と、を含む。ここで、一般式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、それぞれ独立に、水素原子または炭素数１～４のアルキル基である。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

界面活性剤と、以下の一般式（Ｉ）で示されるピラゾール化合物と、タンパク質分解酵素とを含む前処理液を用意する工程と、
血液検体に前記前処理液を接触させて被検液を調製する工程と、
前記被検液に含まれる糖化ヘモグロビン濃度と総ヘモグロビン濃度を測定する工程と、を含む、糖化ヘモグロビンの電気化学測定方法。

【化1】

ここで、一般式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、それぞれ独立に、水素原子または炭素数１～４のアルキル基である。

【請求項2】

前記界面活性剤は、Ｎ－アシルアミノ酸塩である、請求項１に記載の電気化学測定方法。

【請求項3】

前記タンパク質分解酵素は、アクチナーゼＥである、請求項１または２に記載の電気化学測定方法。

【請求項4】

界面活性剤とタンパク質分解酵素を含む前処理液を用意する工程と、血液検体に前記前処理液を接触させて被検液を調製する工程と、前記被検液に含まれる糖化ヘモグロビン濃度と総ヘモグロビン濃度を測定する工程と、を含む糖化ヘモグロビンの電気化学測定方法に用いる糖化ヘモグロビン用測定キットであって、
前記前処理液への添加剤として、以下の一般式（Ｉ）で示されるピラゾール化合物を含む、糖化ヘモグロビン用測定キット。

【化2】

ここで、一般式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、それぞれ独立に、水素原子または炭素数１～４のアルキル基である。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、糖化ヘモグロビンの電気化学測定方法およびそれに用いる測定キットに関する。

【背景技術】

【0002】

医療分野や臨床検査分野等の種々の分野で、生体試料内の検出対象物質を測定するためにバイオセンサが用いられている。バイオセンサの一例として、電気化学的測定法を用いたバイオセンサが知られている。このバイオセンサは、絶縁性基材上に作用極、対極および参照極を形成し、これらの電極に接して酵素と電子受容体（以下、メディエータという）とを含む酵素反応層（試薬部ともいう）を形成している。このようなバイオセンサによれば、原理的には、測定対象物質を基質とする酵素を選択することによって、様々な物質の測定が可能である。例えば、酵素にグルコースオキシダーゼを選択することで、試料液中のグルコース濃度を測定するグルコースセンサが実用化されている。

【0003】

一方、近年、糖尿病診断の指標として、糖化ヘモグロビンや糖化アルブミン等の糖化タンパク質の測定が広く行われている。例えば、ヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃと略す）は糖化ヘモグロビンの１つであり、ＨｂＡ１ｃ値は、赤血球中のヘモグロビンのうち、糖と結合しているヘモグロビンの割合を示す検査値である。ＨｂＡ１ｃ値は、過去１～２ヶ月の平均的な血糖値を反映するため、血液中のグルコース量と比較すると、検査前の食事の影響を受けにくく、糖尿病を管理する指標として重要である。ＨｂＡ１ｃ値は、光学的分光方法を用いて、ＨＰＬＣ法や免疫法により測定されている。その測定に際し、前処理として、血液検体に界面活性剤を含む溶血試薬を作用させる溶血処理が通常行われている（例えば、特許文献１）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開２００７－１６３１８２号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

電気化学測定方法を用いて糖化ヘモグロビン、例えばＨｂＡ１ｃの測定を行う場合、血液検体に溶血試薬とタンパク質分解酵素を作用させて被検液を調製し、その被検液について、ＨｂＡ１ｃ濃度と総ヘモグロビン濃度を電気化学的に測定する。しかしながら、本発明者らは、鋭意検討する過程で、溶血試薬に用いる界面活性剤が、総ヘモグロビン濃度の検出感度を低下させることを見出した。前処理では、血液検体を、例えば１００倍程度に希釈するため、被検液中の総ヘモグロビン濃度はμＭオーダーとなる。このような低濃度の総ヘモグロビン濃度を測定するためには、総ヘモグロビン濃度の検出感度をさらに向上させることが必要とされている。

【0006】

そこで、本発明は、総ヘモグロビン濃度の検出感度を向上させることで高精度の測定が可能な、糖化ヘモグロビンの電気化学測定方法およびそれに用いる糖化ヘモグロビン用測定キットを提供することを目的とした。

【課題を解決するための手段】

【0007】

上記課題を解決するため、本発明の糖化ヘモグロビンの電気化学測定方法は、界面活性剤と、以下の一般式（Ｉ）で示されるピラゾール化合物と、タンパク質分解酵素とを含む前処理液を用意する工程と、血液検体に前記前処理液を接触させて被検液を調製する工程と、前記被検液に含まれる糖化ヘモグロビン濃度と総ヘモグロビン濃度を測定する工程と、を含むことを特徴とする。

【0008】

【化1】

ここで、一般式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、それぞれ独立に、水素原子または炭素数１～４のアルキル基である。

【0009】

また、本発明の糖化ヘモグロビン用測定キットは、界面活性剤とタンパク質分解酵素を含む前処理液を用意する工程と、血液検体に前記前処理液を接触させて被検液を調製する工程と、前記被検液に含まれる糖化ヘモグロビン濃度と総ヘモグロビン濃度を測定する工程と、を含む糖化ヘモグロビンの電気化学測定方法に用いる糖化ヘモグロビン用測定キットであって、前記前処理液への添加剤として、以下の一般式（Ｉ）で示されるピラゾール化合物を含むことを特徴とする。

【0010】

【化2】

ここで、一般式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、それぞれ独立に、水素原子または炭素数１～４のアルキル基である。

【発明の効果】

【0011】

本発明の電気化学測定方法によれば、総ヘモグロビン濃度の検出感度を向上させることで糖化ヘモグロビンのより高精度の測定が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】本発明の実施例１における総ヘモグロビン濃度と測定電流値の間の関係を示すグラフの一例である。

【図2】本発明の実施例１における総ヘモグロビン濃度と測定電流値の間の関係を示すグラフの別の例である。

【図3】本発明の実施例１における総ヘモグロビン濃度と測定電流値の間の関係を示すグラフの別の例である。

【図4】本発明の実施例１における総ヘモグロビン濃度と測定電流値の間の関係を示すグラフの別の例である。

【図5】本発明の実施例１における総ヘモグロビン濃度と測定電流値の間の関係を示すグラフの別の例である。

【図6】本発明の実施例１における総ヘモグロビン濃度と測定電流値の間の関係を示すグラフの別の例である。

【図7】本発明の実施例１における総ヘモグロビン濃度と測定電流値の間の関係を示すグラフの別の例である。

【図8】本発明の実施例１における総ヘモグロビン濃度と測定電流値の間の関係を示すグラフの別の例である。

【図9】本発明の実施例１における総ヘモグロビン濃度と測定電流値の間の関係を示すグラフの別の例である。

【図10】本発明の実施例１における総ヘモグロビン濃度と測定電流値の間の関係を示すグラフの別の例である。

【図11】本発明の実施例２における総ヘモグロビン濃度と測定電流値の間の関係を示すグラフの一例である。

【図12】界面活性剤が存在する場合と存在しない場合の、総ヘモグロビン濃度と測定電流値の間の関係を示すグラフの一例である。

【図13】実施の形態１に用いる電気化学式バイオセンサＡの構造の一例を示す斜視図である。

【図14】図１３の電気化学式バイオセンサＡの分解斜視図である。

【発明を実施するための形態】

【0013】

以下、図面等を参照することで本発明の実施の形態について詳細に説明する。

【0014】

実施の形態１
本実施の形態は、糖化ヘモグロビンの電気化学測定方法に関するものであり、該電気化学測定方法は、界面活性剤と、以下の一般式（Ｉ）で示されるピラゾール化合物と、タンパク質分解酵素とを含む前処理液を用意する工程と、血液検体に前記前処理液を接触させて被検液を調製する工程と、前記被検液に含まれる糖化ヘモグロビン濃度と総ヘモグロビン濃度を測定する工程と、を含むことを特徴とするものである。

【0015】

【化3】

ここで、一般式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、それぞれ独立に、水素原子または炭素数１～４のアルキル基である。

【0016】

本実施の形態に係る電気化学測定方法が測定対象とする糖化ヘモグロビンの例としては、ＨｂＡ１ｃを挙げることができる。

【0017】

本実施の形態に係る電気化学測定方法で用いる前処理液は、界面活性剤と、以下の一般式（Ｉ）で示されるピラゾール化合物と、タンパク質分解酵素とを含んでいる。界面活性剤は、血液検体の溶血処理を行い赤血球からヘモグロビンを溶出させる溶血試薬である。また、タンパク質分解酵素は、溶出したヘモグロビンを分解する。

【0018】

界面活性剤は特に限定されず、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、両性界面活性剤およびノニオン性界面活性剤のいずれかを用いることができる。カチオン性界面活性剤としては、アルキルアミン塩型や第４級アンモニウム塩型を挙げることができる。第４級アンモニウム塩型としては、ベンジルドデシルジメチルアンモニウム二水和物、デシルトリメチルアンモニウムクロリド、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド等を挙げることができる。また、アニオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテルカルボン酸塩、Ｎ－アシルアミノ酸塩や、アルカンスルホン酸塩等のスルホン酸塩型や、ドデシル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸酸塩等のアルキル硫酸エステル型、アルキルリン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸塩等のリン酸エステル型を挙げることができる。また、両性界面活性剤としては、ドデシルジメチル（３－スルホプロピル）アンモニウムヒドロキシド分子内塩、３－[（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]プロパンスルホネート等のスルホベタイン型を挙げることができる。また、ノニオン性界面活性剤としては、グリセリン脂肪酸エステル等のエステル型、４－（１，１，３，３－テトラメチルブチル）フェニル‐ポリエチレングリコール（ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）等のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルを含むエーテル型、ポリオキシエチレンソルビタンモノラルレート（Ｔｗｅｅｎ）等の脂肪族ポリオキシエチレンソルビタンを含むエステルエーテル型、アルカノールアミド型、ドデシルマルトシド等のグルコシド型を挙げることができる。特に限定されるものではないが、上記の一般式（Ｉ）で示されるピラゾール化合物との組み合わせで好ましい界面活性剤は、Ｎ－アシルアミノ酸塩である。また、前処理液中の界面活性剤の濃度は、１～１０重量％、好ましくは２．５～５重量％である。ここで、Ｎ－アシルアミノ酸塩（アルカノイルアミノ酸塩ともいう）のアシル基は、炭素数８～２４の直鎖または分岐鎖の脂肪族アシル基であり、例えば、オクタノイル基、デカノイル基、ドデカノイル基、ミリストイル基、パルミトイル基、ステアロイル基等を挙げることができる。また、Ｎ－アシルアミノ酸塩のアミノ基は、例えば、グリシン、サルコシン、アラニン、グルタミン酸等を挙げることができる。また、Ｎ－アシルアミノ酸塩の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩を挙げることができる。好ましいＮ－アシルアミノ酸塩としては、アルカノイルサルコシン塩を挙げることができる。アルカノイルサルコシン塩の具体例としては、Ｎ－ドデカノイルサルコシンナトリウムやＮ－ミリストイルサルコシンナトリウム等を挙げることができる。

【0019】

タンパク質分解酵素としては、タンパク質分解活性やペプチド分解活性を有するものであれば特に限定されないが、糖化ジペプチドを効率よく遊離させるものが好ましい。このようなタンパク質分解酵素としては、プロテアーゼ、トリプシン、パパイン等を挙げることができる。例えば、アクチナーゼＥ（科研製薬社製）等を挙げることができる。用いるタンパク質分解酵素の濃度は、血液検体中の糖化ヘモグロビンの量や処理条件により異なるが、例えば、アクチナーゼＥでは、前処理液中、１００～１００００Ｕ／ｍＬ、好ましくは１０００～５０００Ｕ／ｍＬである。

【0020】

なお、前処理液のｐＨは、タンパク質分解酵素に適したｐＨであれば特に制限されないが、ｐＨ５．５～１０に調整することが好ましい。緩衝液には、例えば、リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を用いることができる。緩衝液の濃度も特に制限されないが、５～３００ｍＭが好ましい。

【0021】

また、上記の一般式（Ｉ）で示されるピラゾール化合物としては、３－エチルピラゾール、４－メチルピラゾール、３，５－ジメチルピラゾール、３，４，５－トリメチルピラゾール等を挙げることができるが、ピラゾールが好ましい。溶血試薬中のピラゾール化合物の濃度は、１０～８０重量％、好ましくは４０～８０重量％である。１０重量％より少ないと総ヘモグロビン濃度の検出感度を向上させる効果が充分ではなく、８０重量％より多くしても検出感度はそれほど向上しないからである。ここで、本発明において、総ヘモグロビン濃度の検出感度とは、後述の電気化学式バイオセンサによる検出電流値と総ヘモグロビン濃度から得られる回帰直線の傾きの大小で規定され、傾きが大きいほど検出感度が高いものとする。

【0022】

また、被検液に含まれる糖化ヘモグロビン濃度と総ヘモグロビン濃度は、電気化学式バイオセンサを用いて測定することができる。電気化学式バイオセンサとしては、例えば、少なくとも、絶縁性基材と、絶縁性基材上に形成され、１対の作用極と対極からなる第１電極対および１対の作用極と対極からなる第２電極対と、第１電極対に接してあるいはその近傍に配置され、検出酵素を含む第１試薬部と、第２電極対に接してあるいはその近傍に配置され、メディエータを含む第２試薬部と、を有するものを用いることができる。

【0023】

図１３は本実施の形態に用いる電気化学式バイオセンサの一例を示す斜視図であり、図１４はその分解斜視図である。電気化学式バイオセンサＡは、導電部４を有する絶縁性基材１とカバー２とが、スペーサ３を介して積層されている。図１３では、Ｘ方向を長手方向とし、Ｙ方向を幅方向とする長矩形片形状を有する例を示している。

【0024】

対向する一対の主面を有する絶縁性基材１の一方の主面には導電部４が形成されている。導電部４は、導電性部分であり、第１電極対４１と第２電極対４２、絶縁性基材１の一端部に形成された端子部４３、第１電極対４１および第２電極対４２と端子部４３とを接続するリード部４４を有している。第１電極対４１は、長手方向に配置され、互いに導通する一対の作用極４１ａ，４１ａと、平面視で各作用極４１ａを挟むように微小空隙を介して各作用極４１ａと対向する一対の対極４１ｂ、４１ｂを２対、有している。また、第２電極対４２は、第１電極対４１と離間するように長手方向に配置された作用極４２ａと、平面視で作用極４２ａを挟むように微小空隙を介して作用極４２ａと対向する一対の対極４２ｂ、４２ｂを有している。一対の作用極４１ａ，４１ａはリード４４ａを介して端子４３ａに接続され、２対の対極４１ｂ，４１ｂはリード４４ｄを介して端子４３ｄに接続され、作用極４２ａはリード４４ｂを介して端子４３ｂに接続され、一対の対極４２ｂ、４２ｂはリード４４ｃを介して端子４３ｃに接続されている。なお、図１４では、第１試薬部と第２試薬部を除いた構造を示しているが、第１試薬部は第１電極対に接してあるいはその近傍に配置され、第２試薬部は第２電極対に接してあるいはその近傍に配置される。第１電極対４１と第２電極対４２の２つの電極対は、被検液中の異なる２種の被検出物質を測定する場合に用いることができる。２種の被検出物質を測定する場合としては、例えば、ＨｂＡ１ｃ値を測定する場合であり、第１電極対４１でＨｂＡ１ｃの濃度を測定し、第２電極対４２でＨｂの濃度を測定することができる。

【0025】

スペーサ３には、少なくとも１つの開口部があればよいが、電気化学式バイオセンサＡは長手方向に沿って互いに離間して形成された２つの開口部３ａ，３ｂを有している。また、スペーサ３は、端子部４３が露出するように、絶縁性基材１よりも長さを短くしている。また、カバー２は、長手方向の一端部に開口部２ａ、他端部に開口部２ｃを有するとともに、開口部２ａと開口部２ｃとの中間部に開口部２ｂを有している。また、カバー２も、スペーサ３の場合と同様に、端子部４３が露出するように、絶縁性基材１よりも長さを短くしている。ここで、スペーサ３の開口部とカバー２の開口部とは、スペーサ３とカバー２とを積層した時に、カバー２の中央部の開口部２ｂが、スペーサ３の開口部３ａの中央側端部と開口部３ｂの中央側端部の両方と一部が重なるように配置され、またカバー２の一端部の開口２ａがスペーサ３の開口部３ａの側端部と少なくとも一部が重なり、カバー２の他端部の開口２ｃがスペーサ３の開口部３ｂの側端部と少なくとも一部が重なるように配置される。なお、カバー２の中央部の開口部２ｂは、被検液の導入開口として用いることができる。開口部２ｂに被検液を滴下すると、被検液は第１試薬部と第２試薬部と接し、被検液と第１試薬部および第２試薬部との反応が進行する。

【0026】

前処理において、タンパク質分解酵素によりヘモグロビンが分解されるが、その際糖化ヘモグロビンは糖化部分が切り出されて、糖化ジペプチドが生成する。第１電極対の作用極には糖化ジペプチドと特異的に反応する検出酵素が担持されており、糖化ジペプチドはその検出酵素により酸化され、過酸化水素が生成する。第１電極対の作用極と対極との間に所定の電圧を印加すると、過酸化水素濃度に応じた電流値が検出される。過酸化水素濃度は、糖化ジペプチドの濃度と相関するため、過酸化水素濃度に応じた電流値を検出することで糖化ヘモグロビンの濃度を測定することができる。一方、第２電極対には、ヘモグロビンと反応するメディエータが担持されている。メディエータは酸化還元体であり、ヘモグロビンを酸化することで、自身は還元体となり、第２電極対の作用極と対極との間に所定の電圧を印加すると、還元体濃度に応じた電流値が検出される。還元体濃度は、総ヘモグロビン濃度と相関するため、還元体濃度に応じた電流値を検出することで総ヘモグロビン濃度を測定することができる。

【0027】

検出酵素としては、糖化ジペプチド（例えば、フルクトシルバリルヒスチジン）を酸化して過酸化水素を生成させるものを用いることができる。具体的には、フルクトシルペプチドオキシダーゼを挙げることができる。検出酵素の量は、例えば、センサ１個当り、もしくは１回の測定当り、例えば、０．０１～１００Ｕ、好ましくは０．０５～１０Ｕである。

【0028】

メディエータは、特に限定されるものではないが、金属錯体（例えば、オスミウム錯体、ルテニウム錯体、鉄錯体等）、キノン化合物（例えば、ベンゾキノン、ナフトキノン、フェナントレンキノン、フェナントロリンキノン、アントラキノン、及びそれらの誘導体等）、フェナジン化合物、ビオロゲン化合物、フェノチアジン化合物、及びフェノール化合物が挙げられる。より具体的にはフェリシアン化カリウム、ヘキサアンミンルテニウム、フェロセン、ポリ（１－ビニルイミダゾール）－ビス（ビピリジン）クロロオスミウム、ヒドロキノン、２－メチル－１，４－ベンゾキノン、１，２－ナフトキノン－４－スルホン酸塩、９，１０－フェナントレンキノン－２－スルホン酸塩、９，１０－フェナントレンキノン－２，７－ジスルホン酸塩、１，１０－フェナントロリン－５，６－ジオン、アントラキノン－２－スルホン酸塩、１－メトキシ－５－メチルフェナジニウムメチルサルフェート、メチルビオロゲン、ベンジルビオロゲン、メチレンブルー、メチレングリーン、２－アミノフェノール、２－アミノ－４－メチルフェノール、及び２，４－ジアミノフェノールからなる群から選ばれる１種以上が用いられる。メディエータの配合量は、特に制限されず、１回の測定当り若しくは生体物質検出用センサ１個当り、例えば、０．１ｐｍｏｌ～１００μｍｏｌであり、好ましくは、１０ｐｍｏｌ～１０μｍｏｌであり、より好ましくは、５０ｐｍｏｌ～１μｍｏｌである。

【0029】

本実施の形態によれば、前処理液が界面活性剤を含んでいても、総ヘモグロビン濃度の検出感度を向上させることができる。これにより、糖化ヘモグロビンのより高精度の測定が可能となる。

【0030】

実施の形態２
本実施の形態は、実施の形態１に係る糖化ヘモグロビンの電気化学測定方法に用いる糖化ヘモグロビン用測定キットに関するものであり、界面活性剤とタンパク質分解酵素を含む前処理液を用意する工程と、血液検体に前記前処理液を接触させて被検液を調製する工程と、前記被検液に含まれる糖化ヘモグロビン濃度と総ヘモグロビン濃度を測定する工程と、を含む糖化ヘモグロビンの電気化学測定方法に用いる糖化ヘモグロビン用測定キットであって、前記前処理液への添加剤として、以下の一般式（Ｉ）で示されるピラゾール化合物を含むことを特徴とするものである。

【0031】

【化4】

ここで、一般式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、それぞれ独立に、水素原子または炭素数１～４のアルキル基である。

【0032】

本測定キットの構成例としては、例えば、電気化学式バイオセンサ、緩衝液、タンパク質分解酵素、界面活性剤、および一般式（Ｉ）で示されるピラゾール化合物等を挙げることができる。

【0033】

本実施の形態によれば、測定キットが、ピラゾール化合物を含んでいるので、ピラゾール化合物を含まない場合に比べて、総ヘモグロビン濃度の検出感度を向上させることができる。これにより、糖化ヘモグロビンのより高精度の測定が可能となる。

【実施例0034】

以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0035】

実施例１
本実施例では、電気化学式バイオセンサを用いて、種々の界面活性剤の存在下、ピラゾール化合物の総ヘモグロビン濃度の検出感度への影響を検討した。

【0036】

（実験方法）
＜電気化学式バイオセンサの第２試薬部の組成＞
フェリシアン化カリウム ２重量％
タウリン １重量％
アクパーナ ０．０６重量％
ＭＶＥ／ＭＶＡ ０．０２重量％
ヨード １８０μＭ
ドデシルマルトシド ０．００５重量％
ここで、フェリシアン化カリウムは（和光純薬社製）、タウリンは（和光純薬社製）、アクパーナはポリアクリル酸部分中和物（住友精化社製）、ＭＶＥ／ＭＶＡは（三晶社製）、ヨードは（東京化成社製）、ドデシルマルトシドはノニオン性界面活性剤（同仁化学社製）である。

【0037】

＜前処理液の組成＞
リン酸緩衝液（ＰＢ）（ｐＨ６．５） ５ｍＭ
アクチナーゼＥ １２００Ｕ／ｍＬ
界面活性剤 ２．５重量％
ピラゾール ４０ｍＭ

【0038】

ピラゾールは、（東京化成社製）を用いた。また、アクチナーゼＥは、科研製薬社製を用いた。界面活性剤は、以下のものを用いた。
・アニオン性界面活性剤
ドデシル硫酸ナトリウム（略号：ＳＤＳ）（和光純薬社製）
Ｎ－ラウロイルサルコシン（略号：ＮＤＤＳ）（和光純薬社製）
・カチオン性界面活性剤
ベンジルドデシルジメチルアンモニウム二水和物（東京化成社製）
デシルトリメチルアンモニウムクロリド（東京化成社製）
テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド（略号：ＴＴＡＢ）（東京化成社製）
・ノニオン性界面活性剤
４－（１，１，３，３－テトラメチルブチル）フェニル‐ポリエチレングリコール（ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）（和光純薬社製）
ポリオキシエチレンソルビタンモノラルレート（Ｔｗｅｅｎ）（和光純薬社製）
N-ドデシル-β-D-マルトシド（同仁化学社製）
・両性界面活性剤
ドデシルジメチル（３－スルホプロピル）アンモニウムヒドロキシド分子内塩（東京化成社製）
３－[（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]プロパンスルホネート（略号：ＣＨＡＰＳ）（同人化学社製）

【0039】

血液検体が２５倍希釈されるように、血液検体に前処理液を混合し、被検液を調製した。被検液を電気化学式バイオセンサに点着し、電気化学測定を行った。電気化学測定は、電気化学式バイオセンサをビー・エー・エス社製ポテンショスタットに接続し、第２電極対の作用極－対極間に０．４Ｖの電圧を印加し、１５秒経過後の電流値を測定した。総ヘモグロビン濃度を０～１２０μＭの範囲で変化させた。総ヘモグロビン濃度と測定電流値の回帰直線（以下、検量線という）の傾きを算出し、ピラゾールが存在しない場合の検量線の傾きより大きい場合を、総ヘモグロビン濃度の検出感度が向上したと判定した。

【0040】

（結果）
図１２は、ＳＤＳが存在する場合と存在しない場合の、検量線の一例である。前処理液にＳＤＳが存在すると、存在しない場合に比べて検量線の傾きが小さくなり、検出感度が低下した。なお、総ヘモグロビン濃度は０～２７８２．９５μＭの範囲で測定した。一方、図１～図１０に、前処理液がピラゾールを含む場合の検量線の測定結果を示す。前処理液にピラゾールが存在すると、用いた界面活性剤すべてにおいて、検出感度が向上した。以下の表１に検量線の傾きの値を示す。

【0041】

【表1】

【0042】

実施例２
本実施例では、ピラゾール濃度を変化させて、総ヘモグロビン濃度の検出感度への影響を検討した。用いた前処理液の組成は、以下の通りである。

【0043】

＜前処理液の組成＞
リン酸緩衝液（ＰＢ）（ｐＨ６．５） １３５ｍＭ
アクチナーゼＥ １２００Ｕ／ｍＬ
界面活性剤ＮＤＤＳ １重量％
グルタミン酸ナトリウム ３００ｍＭ
ピラゾール １０、４０、８０、１２０、２００ｍＭ

【0044】

（結果）
図１１は、ピラゾール濃度を変化させた時の、検量線の測定結果である。ピラゾール濃度の増加とともに検出感度は向上し、８０ｍＭ以上ではほぼ一定となった。

【0045】

比較例１
本比較例では、ピラゾールに代えて一般式（Ｉ）で示されるピラゾール以外の複素５員環化合物（以下、比較添加剤という）を用いた。用いた前処理液の組成は以下の通りである。

【0046】

＜前処理液の組成＞
リン酸緩衝液（ＰＢ）（ｐＨ６．５） １３５ｍＭ
アクチナーゼＥ １２００Ｕ／ｍＬ
界面活性剤ＮＤＤＳ １重量％
グルタミン酸ナトリウム ３００ｍＭ
９，１０－フェナントレンキノン－２－スルホン酸ナトリウム（ＰＱＳＡ） １２ｍＭ
比較添加剤 １０、３０ｍＭ

【0047】

比較添加剤は、以下のものを用いた。
・イミダゾール類
イミダゾール（東京化成社製）
エチルイミダゾール（東京化成社製）
１－ブチルイミダゾール（東京化成社製）
・アミノメチルピラゾール（シグマアルドリッチ社製）
・トリアゾール（東京化成社製）
・４－アミノ－１，２，４－トリアゾール（シグマアルドリッチ社製）
・１Ｈ－テトラゾール（シグマアルドリッチ社製）
なお、アミノメチルピラゾールとトリアゾールの濃度は、１０、４０ｍＭである。また、４－アミノ－１，２，４－トリアゾールと１Ｈ－テトラゾールの場合、濃度は４０ｍＭであり、ＰＱＳＡは添加しなかった。

【0048】

（結果）
用いた比較添加剤のいずれの場合も、これら比較添加剤を添加しない場合と比較して、検量線の傾きはほとんど変化せず、検出感度の向上は認められなかった。

【符号の説明】

【0049】

１ 絶縁性基材
２ カバー
２ａ，２ｂ，２ｃ カバー開口部
３ スペーサ
３ａ，３ｂ スペーサ開口部
４ 導電部
４１ 第１電極対
４１ａ 作用極
４１ｂ 対極
４２ 第２電極対
４２ａ 作用極
４２ｂ 対極
４３ 端子部
４４ リード部

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】